JP2003532413A - γ−セクレターゼ活性の変調 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、細胞-非使用γ−セクレターゼ活性を提供する。 【解決手段】本発明の方法は、β−アミロイドペプチド生成に影響を及ぼす酵素活性を増加又は減少することができる因子を決定するアッセイにおけるAPP/γ−セクレターゼ混合物の膜給源を利用する。このアッセイにおいて使用される細胞膜は、内在性APPを発現している細胞、好ましくは組換えAPPを発現している細胞に由来することができる。このAPPは、完全長又はγ−セクレターゼによりタンパク質分解性に切断されることが可能な断片であることができる。加えて、細胞において発現されたAPPは、1種又は複数の変異、例えば点変異、小さい欠失などを有することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (関連出願の相互参照) 本件出願は、2000年5月11日に出願された、先の仮特許出願第60/203,506号に
基づく優先権を主張し、かつその全体を引用により組込んでいる。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

(発明の技術分野) 本発明は、β−アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解性プロセシング
、より詳細に述べるとこのようなプロセシングに影響を及ぼす決定因子のアッセ
イに関する。

【０００３】

【従来の技術】

(発明の背景) アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド血管症(CAA)、及びプリオン-媒介型疾患
を含む多くの重要な神経疾患が、中枢神経系(CNS)におけるアミロイドと称され
る凝集されたタンパク質の沈着により特徴付けられている(総説については、Gle
nnerら、J. Neurol. Sci.、94:1-28 (1989)；Haanら、Clin. Neurol. Neurosurg
.、92(4):305-310 (1990)の論文を参照のこと)。これらの高度に不溶性の凝集物
は、共通のβ−プリーツシート型コンホメーションを特徴とする、分岐していな
い原線維タンパク質で構成される。CNSにおいて、アミロイドは、脳及び髄膜の
血管内(脳血管沈着)に及び脳実質内(斑)に存在し得る。ヒト及び動物モデルにお
ける神経病理学的研究は、アミロイド沈着に隣接する細胞はそれらの正常機能が
妨害されることを示している(Mandybur、Acta Neuropathol.、78:329-331 (1989
)；Kawaiら、Brain Res.、623:142-6 (1993)；Martinら、Am. J. Pathol.、145:
1348-1381 (1994)；Kalariaら、Neuroreport、6:477-80 (1995)；Masliahら、J.
Neurosci.、16:5795-5811 (1996)の論文)。更にAD研究は、アミロイド原線維が
実際に神経変性を開始し得ることを示している(Lendonら、J. Am. Med. Assoc.
、277:825-31 (1997)；Yankner、Nat. Med.、2:850-2 (1996)；Selkoe、J. Biol
. Chem.、271:18295-8 (1996)；Hardy、Trends Neurosci.、20:154-9 (1997))。

【０００４】 AD及びCAAは、生化学的及び神経病理学的マーカーは共有しているが、アミロ
イド沈着の程度及び位置に加え罹患した個体により示される症状が若干異なる。
高齢者の進行性知的障害(intellectual failure)の最も一般的原因であるADの神
経変性過程は、神経突起斑及びからまり形成を随伴する大脳辺縁系、連合野新皮
質、及び前脳基底部の進行性及び不可逆性求心路遮断により特徴付けられる(総
説については、Terryらの「Structural alteration in Alzheimer's disease」
、Alzheimer's disease(Terryら編集)、179-196頁、Raven Press社、ニューヨー
ク、(1994)を参照のこと)。ジストロフィー性神経突起、更には反応性星状細胞
及び小膠細胞が、これらのアミロイド-関連の神経突起斑に関係している。しか
し、いずれか所定の斑内の神経突起集団は混合され、これらの斑は、一般にシナ
プスタンパク質を含む球形神経突起APP(I型)、並びに細胞骨格タンパク質を含む
紡錘状神経突起及びペアをなす螺旋状フィラメント(PHF；II型)で構成される。

【０００５】 CAA患者は、様々な血管症候群を示し、その中で脳実質出血が最も良く説明さ
れている。脳実質出血は、脳血管内の広範なアミロイド沈着の結果である(Hardy
、Trends Neurosci.、20:154-9 (1997)；Haanら、Clin. Neurol. Neurosurg.、
92:305-10 (1990)；Terryら、前記；Vinters、Stroke、18:211-24 (1987)；Itoh
ら、J. Neurological Sci.、116:135-41 (1993)；Yamadaら、J. Neurol. Neuros
urg. Psychiatry、56:543-7 (1993)；Greenbergら、Neurolog、43:2073-9 (1993
)；Levyら、Science、248:1124-6 (1990)の論文)。いくつかのよく知られたCAA
症例において、痴呆が、出血が始まる前に注目されることがあり、このことは脳
血管アミロイド沈着が更に認知機能も妨害する可能性を示唆している。

【０００６】 AD及びCAAの両方において、主要なアミロイド成分は、アミロイドタンパク質(
Ａβ)である。アミロイド前駆体タンパク質(APP)から2種の推定セクレターゼに
より生成されるＡβペプチドは、正常なCNS及び血液中には低レベルで存在する
。2種の主要な変種であるＡβ_1-40及びＡβ_1-42は、APPの一方が選択されるカル
ボキシ末端短縮化により生成される(Selkoeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、8
5:7341-7345 (1988)；Selkoe、Trends Neurosci、16:403-409 (1993)の論文)。
Ａβ_1-42は、AD及びCAAの両方のアミロイド沈着において2種のペプチドがより原
線維形成性であり、より豊富である。前述のAD症例のアミロイド沈着に加え、ほ
とんどのAD症例が、血管壁のアミロイド沈着にも関連している(Hardy、(1997)前
記；Haanら、(1990)前記；Terryら、前記；Vinters、(1987)前記；Itohら、(199
3)前記；Yamadaら、(1993)前記；Greenbergら、(1993)前記；Levyら、(1990)前
記の論文)。これらの血管病変は、CAAの顕著な特徴であり、これはAD不在におい
て存在することができる。

【０００７】 Ａβの形成は、アルツハイマー病及びそれに関連した神経変性障害の重要な病
理進行過程であると見なされる(総説は、Selkoeの論文、Nature Suppl.、399:A2
3 (1999)参照)。神経突起斑が形成される正確な機構並びに斑形成のAD-関連、及
びCAA-関連の神経変性過程との関係は十分には定義されていない。しかしAPP遺
伝子産物又はこれらの遺伝子産物の誘導体の調節されない発現及び／又はプロセ
シングは、神経変性及び斑形成につながる病態生理学的過程に関連していること
の証拠が示されている。例えばAPPにおけるミスセンス変異は、ADの常染色体優
性型に緊密に連結されている(Hardy、Clin. Geriatr. Med.、10:239-247 (1994)
；Mannら、Neurodegeneration、1:201-215 (1992)の論文)。神経変性疾患におけ
るAPPの役割は、更にそれらの第3の第21染色体上にヒトAPP(hAPP)遺伝子の追加
のコピーを有するダウン症候群患者が、hAPPの過剰発現を示すという知見(Goodi
sonら、J. Neuropathol. Exp. Neurol.、52:192-198 (1993)；Oyamaら、J. Neur
ochem.、62:1062-1066 (1994)の論文)に加え、若い時期のAD-型病理発症の顕著
な傾向の知見(Wisniewskiら、Ann. Neurol.、17:278-282 (1985))により暗示さ
れている。Ａβにおける変異は、アミロイドーシスによる遺伝性脳出血に随伴し
たCAAに関連しており(Dutch (HCHWA-D)(Levyらの論文、(1990)前記)、ここでは
アミロイド沈着が、一部斑の拡散が生じている脳血管壁において優先的に生じる
(Maat-Schiemanら、Acta Neuropathol.、88:371-8 (1994)；Wattendorffら、J.
Neurol. Neurosurg. Psychiatry、58:699-705 (1995)の論文)。家族性ADの発症
に密に関連している多くのhAPP点変異は、Ａβペプチドのいずれかの側に近いア
ミノ酸変化をコードしている(総説については、例えばLannfeltら、Biochem. So
c. Trans.、22:176-179 (1994)；Clarkら、Arch. Neurol.、50:1164-1172 (1993
)の論文参照)。最後に、in vitro試験は、凝集したＡβが神経変性を誘導するこ
とを示している(例えばPikeらの論文、J. Neurochem.、64:253-265 (1995)参照)
。

【０００８】 APPは、多くの哺乳類組織の多種多様な細胞において発現されるグリコシル化
された一回膜貫通型タンパク質である。ヒトに存在することが現在わかっている
具体的APPアイソタイプの例は、Kangらの論文(Nature、325:733-736 (1987))に
説明された695個のアミノ酸ポリペプチドであり、これは「正常」APPと称される
。751個のアミノ酸ポリペプチドは、Ponteらの論文(Nature、331:525-527 (1988
))及びTanziらの論文(Nature、331:528- 530 (1988))に記されている。APPの770
個のアミノ酸アイソタイプは、Kitaguchiらの論文(Nature、331:530-532 (1988)
)に記されている。位置及び表現型の両方が異なることができる点変異を有する
多くのAPPの特異的変種も説明されている。このような変異の総説はHardyの論文
(Nature Genet.、1:233-234 (1992))に記されている。特に関心のある変異は、
「Swedish」変異と称され、これは595及び596位の正常なLys-Met残基が、Asn-Le
uにより置換されている。この変異は、695アイソタイプの残基596及び597の間に
生じる、正常なAPPの セクレターゼ切断部位のすぐ上流に位置している。

【０００９】 APPは、いくつかのタンパク質分解性経路により翻訳後プロセシングを受け、
様々な断片の分泌又は細胞内断片化及び分解を生じる(F. Checler、J. Neuroche
m.、65:1431-1444 (1995))。 セクレターゼ及びAPP上の セクレターゼの一緒
にした活性は、アミロイド斑の主要な構成要素である無傷のβ−アミロイドペプ
チド(Ａβ)を放出する。Ａβは、APPの695アミノ酸アイソタイプの残基597-640
を含む、およそ43個のアミノ酸ペプチドである。APPの セクレターゼによる内
部切断は、完全長Ａβペプチドの放出を阻害する。AD進行におけるセクレターゼ
の病理発生の関与の程度は完全には解明されていないが、これらのタンパク質分
解性事象は、Ａβ形成を促進又は阻害することがわかっており、その結果ADの良
好な治療的候補であると考えられている。

【００１０】 セクレターゼ活性を試験する多くのアッセイが開発されているが、これらには
各々限界がある。利用可能な細胞-非使用アッセイは、典型的には合成基質を利
用するが、これはin vivoの状況を完全には反映していない。更に調製物及び細
胞−非使用アッセイ実施の条件は、in vivo状態を反映するようにはデザインさ
れていない。正確に酵素活性の生理的状態を反映する細胞全体のアッセイは、酵
素活性に影響を及ぼす物質が、細胞に加え細胞下画分に対しても浸透性でなけれ
ばならないので、より困難である。

【００１１】 推定γ−セクレターゼの単離及び同定を説明する多くの報告がなされている(E
vinらの論文、Amyloid、1:263 (1994)において検証)。PS1がγ−セクレターゼで
あることが提唱されている(Wolfeらの論文、Nature、398:513 (1999))。この提
唱を裏付ける証拠は間接的なものであるが、それにもかかわらずかなりの議論を
呼んでいる(Wolfeら、Biochem.、38:11223 (1999)；Annaert及びDe Strooper、T
INS、22:439 (1999)の論文)。しかしこれらの推定γ−セクレターゼは、Ａβ生
成が可能な信頼できる活性であることは厳密には証明されていない。可溶化され
た哺乳類細胞抽出物を用い、Ａβをin vitroにおいて生成する能力は、γ−セク
レターゼ活性の精製及び信頼のおける同定を可能にする。更にこのアッセイは、
(1)これはβ−アミロイド前駆体タンパク質(APP)由来の未変性の基質を利用し、
合成又はキメラAPP基質は利用しないこと、及び(2)γ−セクレターゼ活性は、信
頼のおけるＡβタンパク質の生成を追跡することによりモニタリングされるとい
う利点を有する。加えて、2種の主要ＡβアイソフォームであるＡβ₄₀及びＡβ_{4 2} が、γ−セクレターゼ作用により生成され、これらは各々、40及び42個のアミ
ノ酸長タンパク質を表している。単独の酵素活性が全てのＡβアイソフォーム作
成に寄与しているかどうか、もしくは個別のγ−セクレターゼが存在し、ひとつ
が各Ａβアイソフォームを生成しているかどうかは議論の的である。γ−セクレ
ターゼ活性に関するこの可溶化されたシステムにより、この問題点は解明するこ
とができる。特異的Ａβアイソフォームの生成は評価することができ、かつ複数
の活性が存在する場合には、各々の酵素活性が精製される。わずかに1種類の酵
素が Ａβアイソフォームを生成するならば、このことはこの精製過程において
明らかであろう。単独対複数のγ−セクレターゼの知識は、γ−セクレターゼイ
ンヒビターの開発及びＡβ形成に関して重要である。特にＡβ₄₂を選択的に阻害
することは、多くの判定基準を使ってより病原性であることが示されているので
有利であろう(Selkoe、J. Biol. Chem.、271:18295 (1996)；Sotrey及びCappai
、Neuropath. & Appl. Neurol.、25:81 (1999)の論文において検証)。更にAPP上
のγ−セクレターゼ切断部位は膜貫通ドメインに位置するように思われるので、
脂質又は膜−様環境の役割も、このアッセイシステムにより評価することができ
る。

【００１２】 プレセニリンタンパク質(PS1及びPS2)が、Ａβのγ−セクレターゼプロセシン
グに関連していることは、多くの報告から明らかである。例えば、PS1ノックア
ウトマウス由来の細胞は、低下したレベルのＡβタンパク質及びAPPのカルボキ
シ-末端の99残基ドメインであるＡβに対する最初期(immediate)前駆体の付随す
る増加を示す(De Strooperらの論文、Nature、391:387 (1998))。PS2ノックアウ
トマウスは、γ−セクレターゼプロセシングのＡβに対する顕著な影響を明らか
にしない(Herremanらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:11872 (1999))
が、他の報告は、Ａβ形成におけるPS2の役割を示唆している(Jacobsenら、J. B
iol. Chem.、274:35233 (1999)；Steinerら、J. Biol. Chem.、274:28669 (1999
)の論文)。さらに最近になって、実際の証拠が、PS1は、γ−セクレターゼ活性
に必要であるが、事実上のγ−セクレターゼではないことを示している(Octave
らの論文、J. Biol. Chem.、275:1525-1528)。 従って、当該技術分野において、γ−セクレターゼ活性に寄与する分子を同定
するシステムが必要とされている。更に、APPプロセシングに影響を及ぼすγ−
セクレターゼ活性のインヒビター／モジュレーターを同定する効率的かつ再現可
能な方法も必要とされている。この酵素活性のin vivo活性をより現実的に反映
しているアッセイが特に必要である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】

(発明の概要) 本発明は、可溶化されたγ−セクレターゼシステム及びAPPプロセシング酵素
γ−セクレターゼのモジュレーターを同定する細胞−非使用アッセイを提供する
。

【００１４】

【課題を解決するための手段】

本発明の方法は、可溶化されたγ−セクレターゼ活性を提供しかつＡβペプチ
ド生成に影響を及ぼす酵素活性を増加又は減少し得る要因を決定するために、AP
P及びα−セクレターゼの両方の膜給源又はAPP及びセクレターゼの個別の膜給源
のいずれかを利用する。このアッセイにおいて使用した細胞膜は、内在性APPを
発現している細胞、好ましくは組換えヒトAPPを発現している細胞に由来するこ
とができる。APPは、完全長、又はCT99のようなγ−セクレターゼによりタンパ
ク質分解性に切断されることが可能な断片であることができる。加えて細胞にお
いて発現されたAPPは、点変異、小さい欠失などの、1種又は複数の変異を有する
ことができる。

【００１５】 ひとつの態様において、本発明は、可溶化されたγ−セクレターゼ活性を生成
する方法を提供する。単離された可溶化されたγ−セクレターゼ活性を、Ａβの
生成及びγ−セクレターゼ活性に寄与する分子(複数)の同定及び単離を含む、様
々な目的に使用することができる。γ−セクレターゼ活性に寄与する分子の同定
及び特徴決定は、Ａβ形成を防止するためにγ−セクレターゼに直接作用するイ
ンヒビターの理論的設計を可能にするであろう。可溶化されたγ−セクレターゼ
活性は、APP又はAPPタンパク質分解産物により単離することができ、もしくはこ
れは、単離されたγ−セクレターゼ活性及びAPP又はAPPタンパク質分解産物の間
で混合物として再構築することができる。

【００１６】 別の態様において、γ−セクレターゼ活性を有する粗膜調製物が提供される。
これらの膜調製物は、少なくともγ−セクレターゼ活性で構成されているが、多
くの他の膜−結合した細胞性生成物を有することもできる。これらの膜調製物は
、γ−セクレターゼ活性に影響する物質の他の膜分子に対する可能性のある作用
の決定において特に有用である。 更に別の態様において、本発明は、γ−セクレターゼ活性を変調する化合物を
同定するアッセイを提供する。本発明のアッセイ法は、1)内在性及び／又は外来
性APPもしくはAPPタンパク質分解産物(例えば、組換えAPP)を発現している細胞
から細胞膜を得る工程、2)調製時に細胞内に存在するAPPのバックグラウンドγ
−セクレターゼ産物(例えばＡβ、p3及び／又はγCTF)を除く工程；3)膜調製物
を、γ−セクレターゼ活性を修飾する可能性のある物質と共にインキュベーショ
ンする工程；及び、4)γ−セクレターゼタンパク質分解産物、例えば、γCTF、p
3及び／又はＡβを検出する工程を含む。検出は、γ−セクレターゼ産物を選択
的に認識する抗体を用いるか、もしくはγ−セクレターゼ産物の単離及び特徴決
定のような他の方法により、行うことができる。本アッセイは、ELISAアッセイ
について0.5〜4ng/ml生成物の範囲内、及び生成物のウェスタンブロット分析を
用いると0.002〜0.05ng/mlの範囲内のような、敏感なアッセイにより、タンパク
質分解産物の非常に小さい増加を検出することができる。

【００１７】 特定の態様において、γ−セクレターゼ活性の単離に使用される膜は、正常な
内在性遺伝子から変更された遺伝子を発現している細胞から得られる。例えば、
この細胞は、例えばγ−セクレターゼ切断を増加する変異のような、セクレター
ゼ活性に対しより多く又は少なく易傷であるように変更されたAPPを発現するこ
とができる。別の例において、γ−セクレターゼ活性に関連した別の遺伝子、例
えばプレセニリンを、これらの変異を補償することができる物質を同定するよう
に変更することができる。詳細に述べると、集団において生じることがわかって
いる変異を用い、このような変異を有する対象の治療に特に有用な物質を同定す
ることができる。

【００１８】 別の態様において、このアッセイは、アッセイ感度を上げるために、γ−セク
レターゼ活性を増大する物質、例えば、カルジオリピン又は他のリン脂質などを
利用する。 本発明の目的は、γ−セクレターゼの活性を阻害する治療的物質を同定し、そ
の結果Ａβ、より詳細に述べるとＡβ₄₂の生成を阻害することである。このよう
な物質は、例えば家族性ADのリスクのある対象のような、その必要のある対象に
おける神経突起斑の形成の防止において有用である。 更に別の本発明の目的は、γ−セクレターゼ活性に関連した物質及び分子で構
成された複合体又は成分を単離する方法である。これを用い、γ−セクレターゼ
活性に関連した特異的分子に加え、これらの分子の特異的変異を同定することが
できる。これらの複合体の単離は、同時免疫沈降のような技術により実現するこ
とができる。

【００１９】 本発明のアッセイのひとつの利点は、これが、未変性のAPP基質によるγ−セ
クレターゼ活性のin vivo変化を、ペプチド又は半合成の基質を使用する他のア
ッセイと比べ、より信頼がおけるように反映していることである。更に膜は、ア
ッセイの実行を容易にすること並びにγ−セクレターゼ活性の再構築及び精製を
補助するために可溶化される。 本発明のアッセイの別の利点は、例えば物質の細胞膜の貫通のような、細胞全
体のアッセイ又はミクロソームアッセイの問題点を伴うことなく、天然の酵素と
γ-セクレターゼ活性の相互作用に影響を及ぼす可能性のある物質の効率的送達
を可能にすることがである。

【００２０】 更に別の利点は、本発明のアッセイにおいて生成されたγ−セクレターゼ-物
質複合体は、γ−セクレターゼそれ自身よりもはるかに容易に精製され、その結
果このアッセイは、タンパク質分解及び／又はタンパク質分解産物の分泌に関連
した実際の分子を決定するために有用であることができることである。 更に別の本発明のアッセイの利点は、γ−セクレターゼ活性が、γ−セクレタ
ーゼタンパク質分解性産物の直接測定により決定されることである。 更に別の本発明のアッセイの利点は、γ−セクレターゼ活性を増強し並びに／
又はγ−セクレターゼ産物、例えばＡβ、p3及び／もしくはγCTFを安定化する
リン脂質のような成分を添加することができることである。 更に別の本発明のアッセイの利点は、このアッセイは細胞-非使用であり、か
つミクロソームアッセイのような他のアッセイのように、ひとつの細胞下小器官
に依存していないことである。従って説明されたアッセイは、小胞体、ゴルジな
どを含む、細胞の全ての部分におけるγ−セクレターゼ活性をより反映している
。 本発明のこれら及び他の目的、利点及び特徴は、下記のより完全に説明された
本発明の詳細を判読することにより、当業者には明らかになるであろう。

【発明の実施の形態】

(好ましい態様の詳細な説明) 本アッセイを説明する前に、本発明は、説明された特定の方法論に限定される
ものではなく、それ自体当然変動し得ることは理解されるべきである。本発明の
範囲は添付された「特許請求の範囲」によってのみ限定されるので、本願明細書
において使用された学術用語は、単に特定の態様を説明する目的のためであり、
限定することは意図されていないことも理解されるべきである。

【００２１】 特に定義しない限りは、本願明細書において使用された全ての技術及び科学用
語は、本発明が属する技術分野の業者により通常理解されるものと同じ意味を有
する。本願明細書に説明されたものと類似した又は同等の方法及び材料は、本発
明の実践又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をこ
こで説明する。本願明細書において言及された全ての刊行物は、その刊行物が引
用されたものに関連し方法及び／又は材料を明らかにしかつ説明するために、本
願明細書に参照として組入れられている。

【００２２】 本願明細書において考察した刊行物は、本願明細書の出願日に先立ち明らかに
なったもののみ提示している。ここにおいて、本発明が、先行する発明に関する
このような刊行物に先立ち権利を与えられないことを認めるために構成されるも
のではない。更に提示された刊行物の日付は、実際の刊行の日付とは異なること
があり、これは個別に確認することができる。

【００２３】 (定義) 本願明細書において使用される「β−アミロイド前駆体タンパク質」(APP)は
、ヒトにおいて第21染色体長腕に局在化された同じ名前の遺伝子によりコードさ
れており、かつそのカルボキシル領域内にβ−アミロイドタンパク質領域を含む
ポリペプチドを意味する。 本願明細書で使用される用語「β−アミロイドタンパク質」(Ａβ)は、APPの6
95アミノ酸アイソタイプの残基597-640、751アイソタイプの残基653-696、及び7
70アイソタイプの残基662-705を含む、およそ43個のアミノ酸ペプチドを含む、
全てのβ−アミロイドタンパク質を意味する。本願明細書に記されたように、こ
のタンパク質は、695の番号システムを用いて説明される。本発明のＡβタンパ
ク質は、好ましくは695アミノ酸アイソタイプAPPの残基597-640を含む約40〜約4
4個のアミノ酸を含むタンパク質であるＡβ_1-40又はＡβ_1-42を含む(Selkoeらの
論文、前記)。この説明において、用語Ａβタンパク質は、本願明細書において
言及されたふたつの主要なＡβ変種及びAPPの695アミノ酸アイソタイプのアミノ
酸640-695を含む55個のアミノ酸セグメントを含むことが意図されている。この
説明の後、恐らくその他のβ−アミロイドタンパク質が発見され、従ってこれら
も本発明の範囲内となることが意図されている。

【００２４】 本願明細書において互換性を持って使用される用語「APPセクレターゼ」、「
セクレターゼ」及び「セクレターゼ活性」は、様々な断片の分泌又はAPPの細胞
内断片化及び分解を生じるタンパク質分解性の酵素及び／又は活性を意味する。
これは、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ-セクレターゼ、及びこれと
同様であるかAPP又はCT99のようなAPPタンパク質分解産物のいずれかのタンパク
質分解を引き起すまだ同定されていない酵素を含む。

【００２５】 本願明細書において互換性を持って使用される用語「γ-セクレターゼ」及び
「γ−セクレターゼ活性」は、生成物Ａβ₄₀又はＡβ₄₂、又はより長い又はより
短いＡβ形、例えばＡβ₄₄又はＡβ₃₈を生じるような、APPの膜内C-末端切断部
位で APP又はAPPタンパク質分解産物(例えば全Ａβ配列を含むAPP のC-末端断片
)のタンパク質分解に寄与する1種又は複数の酵素を意味する。

【００２６】 本願明細書において使用される用語「APP/γ−セクレターゼ混合物」は、これ
ら2種の物質の複合体及び／又は混合物としての単離されたAPP及びγ−セクレタ
ーゼを意味する。この用語は、完全長APPと組合せたγ−セクレターゼを有する
混合物に加え、APPのタンパク質分解産物、例えばCT99及びCT83、並びにCT100の
ような組換え生成物と組合せたγ−セクレターゼを有する混合物に及ぶことが意
図されている。この用語は、プレセニリン1又はプレセニリン2タンパク質を 含むAPP/γ−セクレターゼ混合物も意味することができる。

【００２７】 本願明細書において使用される用語「CT99」は、β−セクレターゼによるAPP
のタンパク質分解性のプロセシングにより生成されたAPPタンパク質分解産物を
意味する。本願明細書において使用される用語「CT100」は、メチオニン開始コ
ドンの後にCT99の残基全てを有する組換えタンパク質産物を意味する。これらの
生成物は両方とも、γ−セクレターゼの基質であり、かつ本発明のアッセイにお
いてγ−セクレターゼ活性を検出するために使用することができる。CT99は、γ
−セクレターゼの真の未変性の基質である。

【００２８】 本願明細書において使用される用語「APPタンパク質分解産物」は、APPセクレ
ターゼを用いて得ることができる可能性のある生成物の各々を意味し、以下を含
む：CT99又はCT100、これはβ−セクレターゼの産物であり、γ−セクレターゼ
活性を検出するための基質として使用することができる；p3、これはα−セクレ
ターゼ及びγ−セクレターゼの産物である；Ａβ、これはβ−セクレターゼ及び
γ−セクレターゼの産物である；並びに、γCTF、これはγ−セクレターゼのカ
ルボキシ末端産物である。好ましくは本発明は、γ−セクレターゼ産物である、
p3、Ａβ及び紊TF等の検出を通じ、γ−セクレターゼ活性を測定する。

【００２９】 本願明細書において使用される用語「アルツハイマー病」(本願明細書におい
て「AD」と略される)は、主に海馬及び脳皮質中のβ−アミロイドタンパク質を
含有する神経突起斑の形成に加え、学習及び記憶の両方の欠陥に関連した状態を
意味する。本願明細書において使用される「AD」は、ADに加え、AD-型病理の両
方を包含することを意味する。 本願明細書において使用される用語「AD-型病理」は、海馬及び脳皮質中のβ
−アミロイドタンパク質を含有する神経突起斑の形成を含むが、これらに限定さ
れるものではない、CNSの変化の組合せを意味する。このようなAD-型病理は、AP
Pの異常な発現及び／又は沈着、APPの過剰発現、異常なAPP遺伝子産物の発現、
及び他のADに関連した現象に関連した障害を含むが、必ずしもこれらに限定され
るものではない。AD-型病理の例は、APPの過剰発現に関連しているダウン症候群
に関連したAD-型病理を含むが、必ずしもこれに限定されるものではない。

【００３０】 本願明細書において使用される用語「アルツハイマー病に関連した現象」は、
ADに関連した構造、分子、又は機能的事象、特に動物モデルにおいて容易に評価
可能である事象を意味する。このような事象は、アミロイド沈着、神経病理発生
、学習及び記憶の欠損、並びに他のAD-関連の特徴を含むが、これらに限定され
るものではない。 本願明細書において使用される用語「脳アミロイド血管症」(本願明細書にお
いてCAAと略す)は、脳実質出血に合併することがある脳血管内のアミロイド沈着
の形成に関連した状態を意味する。CAAは更に、脳卒中の増大したリスクに加え
、脳及びクモ膜下の出血の発生にも関連している(Vinters、Stroke、18:311-324
(1987)；Haanら、Dementia、5:210-213 (1994)；Itohら、J. Neurol. Sci.、11
6:135-414 (1993)の論文)。CAAは、出血の発生以前の痴呆にも関連することがで
きる。CAAに関連した血管アミロイド沈着は、ADが存在しない場合にも存在する
ことができるが、より頻繁にはADに関連している。

【００３１】 本願明細書において使用される用語「脳アミロイド血管症に関連した現象」は
、CAAに関連した分子、構造、又は機能的事象、特に動物モデルにおいて容易に
評価可能である事象を意味する。このような事象は、アミロイド沈着、脳実質出
血、及び他のCAA-関連の特徴を含むが、これらに限定されるものではない。 本願明細書において互換性を持って使用される用語「β−アミロイド沈着」及
び「Ａβ沈着」は、Ａβに加え他の物質で構成された脳内沈着を意味する。 「抗体」は、抗原と結合することが可能である免疫グロブリンタンパク質を意
味する。本願明細書において使用される「抗体」は、抗体全体に加え、関心のあ
るエピトープ、抗原又は抗原性断片に結合することが可能な抗体断片(例えば、F
(ab')₂、Fab'、Fab、Fv)を含むことを意味する。 本発明の抗体は、APPタンパク質の特異的タンパク質分解産物、特にγ−セク
レターゼ活性により生成された生成物について、免疫反応性又は免疫特異性であ
り、その結果これに特異的及び選択的に結合する。各タンパク質分解産物の抗体
は、好ましくは免疫特異性であり−すなわち、他のAPPタンパク質分解産物とは
実質的に交差反応性ではない。用語「抗体」は、全ての種類の抗体を包含してい
るが、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が、ペプチド抗原を用
いて産生される。

【００３２】 「精製された抗体」は、天然に会合されているその他のタンパク質、炭水化物
、及び脂質を十分に含まないものを意味する。このような抗体は、タンパク質分
解性のAPPタンパク質産物(又はそれらの抗原性断片)と「優先的に結合し」、す
なわち他の抗原性-無関係の分子とは実質的に認識も結合もしない。本発明の精
製された抗体は、特定のAPPタンパク質産物(例えばγCTF)と免疫反応性及び免疫
特異性であることが好ましく、より好ましくは他のAPPタンパク質産物とは反応
しない。

【００３３】 APPタンパク質分解産物の「抗原性断片」は、本発明のアッセイにおいて使用
した抗体に結合することが可能であるこのようなタンパク質の一部を意味する。 「特異的に結合する」とは、抗体の、特異的ポリペプチド、すなわちAPPタン
パク質産物のエピトープへの、高親和力及び／又は高親和性での結合を意味する
。この特異的ポリペプチド上のエピトープへの抗体の結合は、同じ抗体の他のエ
ピトープへの結合よりも強力であることが好ましく、特にそのようなものは関心
のある特異的ポリペプチドは、例えばAPPタンパク質産物へ、他のエピトープよ
りもより強力に結合し、その結果、結合条件を調節することにより、抗体はAPP
タンパク質産物へほとんど独占的に結合するので、会合した分子中、又は同じ試
料中に存在することができる。特に関心のあるポリペプチドへ結合する抗体は、
他のポリペプチドへ弱いが、検出可能なレベル(例えば、関心のあるポリペプチ
ドに対して示される結合の10％又は未満)で結合することが可能である。このよ
うな弱い結合、又はバックグラウンド結合は、例えば適当な対照を使用すること
により、関心のある化合物又はポリペプチドへ結合する特異的抗体から容易に識
別し得る。一般に本発明の抗体は、特定のAPPタンパク質産物へ10⁷M^-1又はそれ
以上で、好ましくは10⁸ mol/L又はそれ以上で結合する。一般に結合親和性が10⁶ M^-1又はそれ未満の抗体は、現在使用される通常の方法論を用いては、検出可能
なレベルでは抗原に結合しない点で有用ではない。

【００３４】 「検出可能に標識された抗体」は、結合された検出可能な標識物を有する抗体
(又は結合特異性を維持している抗体断片)を意味する。検出可能な標識物は、通
常化学共役により結合されるが、この標識物がポリペプチドである場合、これは
代わりに遺伝子操作技術により結合することができる。検出可能な標識されたタ
ンパク質の作成法は、当該技術分野において周知である。検出可能な標識物は、
当該技術分野において公知の様々なこのような標識物から選択することができる
が、通常は放射性同位元素、発蛍光団、常磁性標識物、酵素(例えば、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ)、又は検出可能なシグナルを放出するか(例えば、
放射能、蛍光、色)もしくは標識物のその基質への曝露後に検出可能なシグナル
を放出するかのいずれかであるその他の基もしくは化合物から選択することがで
きる。様々な検出可能な標識物／基質の対(例えばホースラディッシュペルオキ
シダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラー
ゼ／ルシフェリン)、抗体の標識法、及び標識された抗体の使用法は、当該技術
分野において周知である(例えば、Harlow及びLane編集の「Antibodies: A Labor
atory Manual」(1988)、 Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドス
プリングハーバー、NY))。

【００３５】 本願明細書において使用される用語「化合物」は、セクレターゼ活性に影響を
及ぼす能力を有する、例えば、タンパク質、天然の物質、合成されたタンパク質
又は小分子の医薬のようないずれかの分子を説明する。このような化合物は、ア
ミロイド-関連した障害、具体的にはAD、CAA、及びプリオン-媒介した障害に関
連した分子及び臨床的現象を治療するために使用することができる。 「有効用量」又は「有効量」は、望ましい生理的及び／又は精神的変化を提供
するのに十分な化合物の投与を意味する。これは、患者、疾患及び治療に応じて
変動するであろう。用量は、障害の症状又は状態の緩和又は改善のために対象に
おいてアミロイド斑のレベルを変更するのに十分な治療量、もしくは望ましくな
いレベルのアミロイド斑の蓄積を防止するのに十分な予防量のいずれかであるこ
とができる。

【００３６】 本願明細書において使用される用語「治療」、「治療する」などは、一般に望
ましい薬理学的及び／又は生理学的作用を得ることを意味する。この作用は、そ
の疾患又は症状を完全に又は部分的に予防する点で、予防的であることができ、
並びに／又は疾患及び／もしくは疾患に起因した有害作用を一部又は完全に治癒
する点で、治療的であることができる。本願明細書において使用される「治療」
は、哺乳類、特にヒトにおけるあらゆる治療に及び、かつ以下を含む： (a)疾患の素因はあるが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象における
疾患の発生を予防すること； (b)疾患を阻害する、すなわち、その発症を阻止すること；又は (c)疾患を緩和する、すなわち疾患の退行及び／又は症状の改善を引き起すこと
。本発明のアッセイを用いて同定することができる治療的物質は、AD、アミロイ
ドーシスによる遺伝性脳出血、及びプリオン-媒介型障害などを含む、β−アミ
ロイドの沈着に関連した疾患の治療において特に有用である。

【００３７】 (発明の一般的側面) 本発明は、γ−セクレターゼ又はin vitroにおいてAPPを酵素によりプロセシ
ングする能力を維持する可溶化されたγ−セクレターゼ活性のいずれかを含む膜
調製物を提供する。γ−セクレターゼ活性は、APP又はAPPタンパク質分解産物と
の混合物として単離されており、従ってγ−セクレターゼ活性に寄与するタンパ
ク質の完全性を維持している。あるいは、γ−セクレターゼ活性は、APP又はAPP
タンパク質分解産物と共に単離されかつ再構築され得る。APP/γ−セクレターゼ
混合物を直接使用し、様々な遺伝的バックグラウンド及び／又は添加された化合
物に対して反応したＡβの生成レベルを評価することができる。APP/γ−セクレ
ターゼ混合物は外来性APPと共にインキュベーションし、例えば斑形成及びアイ
ソフォーム特異的抗体産生のin vitro試験のような様々な用途のために、高レベ
ルのＡβを生成することができる。Ａβタンパク質をin vitro生成するためにγ
−セクレターゼ活性をその天然の基質と共に再構築する能力は、これまでは実現
されていない。

【００３８】 可溶化されたγ-セクレターゼ調製物は、APPのγ−セクレターゼプロセシング
に寄与する分子(複数)を同定するために使用することもできる。特に、本発明は
、Ａβの生成においてPS1及びPS2の役割の分類を可能にするであろう。PS1及びP
S2タンパク質は、可溶化された調製物から除去することができ、もしくはPS1又
はPS2ヌル細胞は、可溶化されたγ−セクレターゼ活性の調製に使用することが
でき、その後この調製物がＡβ生成について試験される。あるいは、この調製物
は、γ−セクレターゼ、及びγ−セクレターゼ/化合物複合体の単離により同定
されたγ−セクレターゼに結合する化合物により処理され得る。

【００３９】 可溶化されたγ−セクレターゼ活性は、細胞-非使用アッセイにおいてAPPのγ
−セクレターゼプロセシングを検出するアッセイを提供する。γ−セクレターゼ
活性は、単離されたAPP又は膜から生成されたAPPタンパク質分解産物と共に再構
築され、かつその活性を、APPのタンパク質分解産物、すなわち、Ａβ₄₀及びＡ
β₄₂のレベルを測定することにより、決定することができる。このアッセイシス
テムは、無傷の細胞又はミクロソームに関連するＡβインヒビターを同定するた
めに使用される一般的方法に勝る利点を有する。本アッセイは、従来型の細胞全
体又は細胞-非使用(例えば、ミクロソーム)アッセイにおいて認められた制限を
伴わずに、APPプロセシングに対する様々な化合物の作用を試験することを可能
にする。 例えば、本発明のアッセイの可溶化された調製物は、膜を横断する輸
送の問題点を伴わずに、プロセシングに関連した分子へ化合物がアクセスするこ
とを可能にする。可溶化されたγ−セクレターゼを使用するアッセイは、関心の
ある活性の細胞全体調製物よりも非常に高い濃度を有することができ、その理由
は、γ−セクレターゼの割合が非常に高く、その結果APPプロセシングに対する
より微妙な作用を同定することを可能にするからである。

【００４０】 更に、無傷の細胞法では、Ａβインヒビターが作用する特異的標的及び／又は
機構は不明であるか又は推定の域にある。このアッセイは、Ａβのカルボキシ-
末端の形成に関連した特異的標的を同定しかつ分離する能力を提供する。Ａβイ
ンヒビターの開発は、一般に重要と定められた他の成分と共に、半-精製又は精
製された状態で単離されたγ−セクレターゼを有することで、促進されるであろ
う。

【００４１】 (可溶化されたγ−セクレターゼ活性の調製) 本発明の細胞-非使用γ−セクレターゼ活性は、本質的に試験された全ての哺
乳類細胞はＡβタンパク質の生成を示しているので、様々な哺乳類細胞を用いて
作成することができる。膜調製物を得るために使用した細胞は、例えば初代神経
膠細胞、内在性又は外来性ヒトAPPを発現している哺乳類細胞、ヒト293細胞など
の関心のある細胞のいずれかであることができる。一過性に又は安定してAPPを
発現している細胞に加え、非形質転換細胞を用い、活性γ−セクレターゼ抽出物
を生成することができる。トランスフェクションされた細胞は、高レベルのAPP
又はAPP産物を発現している安定した細胞株を単離することができるので、薬物
選択を行うことができる。典型的には、市販の発現プラスミドは、哺乳類細胞に
適した選択可能な薬物マーカーを収容している。

【００４２】 γ-セクレターゼ活性の単離に使用された細胞は、APPのγ−セクレターゼによ
るタンパク質分解に影響し及び／又はアッセイ効率を増大することができるよう
なある種のタンパク質又はタンパク質アイソフォームを発現するように修飾する
ことができる。例えば、APPに特異的変異を有する細胞は、これらの変異がγ−
セクレターゼのタンパク質分解能に対し有する作用を決定することができる。γ
−セクレターゼプロセシングを増大するAPPの「Swedish」変異(K595N/M596L)は
、本アッセイに適応することができる天然の変異である。増大したＡβ₄₂生成に
関連したγ-セクレターゼ切断部位近傍のその他の点変異も使用することができ
る。

【００４３】 別の例において、プレセニリン遺伝子に、及び特にプレセニリン1に変異を有
する細胞を用い、γ−セクレターゼ活性を単離し、γ−セクレターゼ活性に対す
るこれが有する作用を試験することができる。これは、プレセニリンが事実上γ
−セクレターゼ活性に寄与しているかどうかを決定するために使用することがで
きる。 更に別の例において、Ａβの最初期前駆体である、一過性又は安定してAPPの
β−セクレターゼ産物を発現している細胞を、γ−セクレターゼ活性の単離にお
いて使用することができる。このＡβの最初期前駆体は、APPのカルボキシ-末端
の99個のアミノ酸で構成され、これはCT99と称される。APPのCT99位置は、膜貫
通ドメインを含み、その結果膜に会合されている。CT99は、細胞-非使用アッセ
イにより生成されたＡβレベルを増大する哺乳類細胞において高レベルで発現さ
れるように操作することができる。例えば、発現構築体を、挿入された配列の発
現を駆動するためにサイトメガロウイルスを利用するpCDNA3.1(InVitrogen社)の
ようなベクターを用い作出することができる。CT99配列は、天然にメチオニン残
基が先行しているので、これは開始コドンとして利用することができる。従って
、基本的クローニング法を用い、CT100(CT99＋先行するメチオニン)を発現プラ
スミドに導入することができる。一旦組換えプラスミドが構築されかつ証明され
たならば、これを、Lipofectamine Plus (Gibco BRL社)又はリン酸カルシウム沈
降法などの様々な技術を用い、哺乳類細胞へ導入することができる。トランスフ
ェクションされた細胞は、CT100の最適レベルを得るためにDNA導入後24〜72時間
の所定の時点で収集することができる。

【００４４】 APP/γ−セクレターゼ複合体は、γ−セクレターゼ活性を伴う内在性又は外来
性APPタンパク質を評価するために、細胞膜から調製することができる。本発明
のアッセイにおいて使用される膜調製物は、Dounceの使用(douncing)、機械的組
織用ホモジナイザーの使用、針剪断、及びボールベアリング組織ホモジナイザー
のような当業者が利用できる技術を用いて均質化することができる。一般に、細
胞は、γ-セクレターゼ活性を保存する方法で単離されかつ破壊される。膜調製
物に使用される細胞は、新鮮に得られ、例えば、患者検体から、不死化された細
胞株のような培養システムから、又は-70℃で貯蔵された細胞のような長期保存
された細胞から単離される。一旦膜が単離されると、これらは、直接使用するか
、もしくは将来の使用のために、例えば-80℃で保存することができる。

【００４５】 一旦粗細胞膜調製物が作成されると、膜は、バックグラウンドAPPタンパク質
分解産物及びＡβを分解する非-特異的タンパク質分解性の活性を取除くように
、任意に処理される。例えばこの調製物は、APPγ−セクレターゼタンパク質分
解産物のバックグラウンドレベルを除くために、穏やかな界面活性剤で処理する
ことができる。現在説明しているアッセイで使用するための界面活性剤の例は、
0.02〜0.05％サポニンである。この初期処理後、ペレット化された膜が、より強
力な界面活性剤、好ましくは0.5％CHAPSにより、可溶化される。

【００４６】 一旦可溶化されたAPP/γ−セクレターゼ混合物は、任意に部分的に精製される
。この混合物は、当該技術分野において公知の方法を用い精製することができる
が、好ましくはクロマトグラフィー、例えばHiTrap Qクロマトグラフィーを用い
精製することができる。その他の使用することができる技術は、下記を含むが、
これらに限定されるものではない：DEAEのようなイオン交換クロマトグラフィー
；サイズ排除クロマトグラフィー；逆相HPLCのようなHPLC、及び本願明細書を読
むことで当業者には明らかな他の方法である。

【００４７】 任意に、使用前に、APP/γ−セクレターゼ混合物は、γ−セクレターゼ活性を
変更し及び／又はγ−セクレターゼの検出可能なAPPタンパク質分解産物を安定
化する物質に曝露される。好ましい態様において、この物質は、γ−セクレター
ゼ活性の変化の改善された検出を可能にするために、γ−セクレターゼ活性のレ
ベルを増強する。この用途に関する物質の例は、カルジオリピン及びα−リン脂
質、例えばL-α-ホスファチジルセリン及びL-α-ホスファチジルコリンを含む。
本願明細書を読むことで当業者には明らかであるように、他のγ−セクレターゼ
活性に影響する物質も、本発明において使用することができる。

【００４８】 (アッセイ方法) 本発明は、膜-酵素混合物を用いAPPタンパク質分解産物に作用を有する、及び
好ましくはこれを低下する化合物を決定するアッセイ方法を提供する。このよう
な化合物を、アミロイド-関連障害を有する患者、特にヒトの治療において使用
することができる。このアッセイは、個別の成分としてまたは混合物としての A
PP/γ−セクレターゼの被験化合物との接触、並びにその後のAPPタンパク質分解
産物、及び特にγCTF及びＡβのレベルの決定に関する。その化合物が、例えば
これまでに公知の標準と比べ、APPタンパク質分解産物のレベルを低下する場合
は、従ってこの化合物は、アミロイド-関連障害を有する患者を治療するための
候補である。この化合物と接触されたAPP及びγ−セクレターゼは、細胞膜と会
合されるか、又はAPP及びγ−セクレターゼを発現している細胞から得られた混
合物として膜と共に単離される、かつ再構築され得る。異なる型の細胞が使用さ
れるが、γ−セクレターゼの基質の給源としてのAPPを発現するように組換えに
より修飾された細胞を使用することが好ましい。

【００４９】 本発明の一つの局面において、γ−セクレターゼ活性を変更する能力を特徴と
する化合物を同定する方法が明らかにされている。APPγ−セクレターゼ活性に
影響を及ぼす化合物を決定するアッセイ法は、以下を含むことが明らかにされて
いる： (1)APP及びγ−セクレターゼを発現している細胞から調製された細胞膜に存在す
る又はこれに由来するAPP及びγ−セクレターゼの調製物；(2)APP＋γ−セクレ
ターゼの候補化合物によるin vitro処理；及び(3)APPタンパク質分解産物のレベ
ルを測定することによる、該化合物のγ−セクレターゼ活性に対する作用の決定
。例えば化合物がAPP/γ−セクレターゼ混合物に添加されていない対照、及び／
又は被験化合物に添加された担体が、担体のみがAPPタンパク質分解に作用する
かどうかを決定するために培養物に添加されているような対照に対するアッセイ
を行うことは好ましい。

【００５０】 このアッセイにおける可溶化されたγ-セクレターゼ活性の使用前に、APPタン
パク質分解産物のバックグラウンドレベルが、例えば界面活性剤による処理によ
り、除かれることが好ましい。あるいはこの工程は、細胞がAPPを発現している
ことがわかっている細胞培養物中のAPPタンパク質分解産物のレベルの正確な決
定を省くことができる。その後この既知のレベルを、このアッセイについて調節
、すなわち、既知のバックグラウンドレベルに対して増加又は減少するように調
製することができ、既知のバックグラウンドレベルを減ずることにより決定する
ことができる。この方法でアッセイを行うためには、APPを既知のレベルで発現
している統計学的に有意な数の組換え細胞から細胞膜を入手し、その後これらの
細胞の膜中に存在するAPPタンパク質分解産物のバックグラウンドレベルを決定
することは当然必要である。

【００５１】 γ-セクレターゼ活性レベルを変更することにおいて有効である化合物を使用
する新規方法が提供される。γ−セクレターゼ活性を阻害又は増強することがわ
かっている化合物は、更に治療薬としての該化合物の追加の生理的作用及び効能
を決定するために、トランスジェニックマウスにおいてアッセイすることができ
る。阻害について陽性と考査する化合物は、以下に説明した本発明の処置の具体
的方法において使用することができる。

【００５２】 (本発明のアッセイで使用するための候補化合物) 候補化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な給源か
ら得ることができる。例えば、多くの手段をランダム化に利用され、かつランダ
ム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有
機化合物及び生体分子の合成を指示する。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物
の抽出物の形の天然の化合物ライブラリーを利用することができ、かつ容易に作
成される。加えて、天然又は合成により作成されたライブラリー及び化合物は、
従来の化学的、物理的及び生化学的手段により容易に修飾され、かつコンビナト
リアルライブラリーを作成するために使用することができる。公知の医薬化合物
に、構造アナログを生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミ
ド化など、直接又はランダムな化学修飾を施すことができる。

【００５３】 本発明の方法において使用する化合物は、50ダルトンより大きく約2,500ダル
トン未満の分子量を有する小さい有機化合物であることができる。候補化合物は
、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、かつ典
型的には、少なくともひとつのアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキ
シル基を、好ましくは少なくとも2個のこれらの官能性化学基を含む。候補化合
物は、1個又は複数の前記官能基で置換された環状炭素又はヘテロ環式構造及び
／又は芳香族又は多環芳香族構造を含むことが多い。候補化合物は、以下を含む
が、これらに限定されるものではない生体分子間にも見つけられる：ペプチド、
糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナロ
グ又は組合せ。

【００５４】 APP/γ-セクレターゼ混合物の処理後のタンパク質分解産物の検出 APP/γ−セクレターゼ混合物と被験化合物のインキュベーション後、この調製
物を、APPのγ−セクレターゼタンパク質分解産物、例えばγCTF、p3及び／又は
Ａβについてアッセイした。APP/γ−セクレターゼタンパク質分解産物の検出は
、被験試料中の示差的に発現されたポリペプチドの存在もしくは非存在又は変更
された量を決定する多くの方法のいずれかを用いて実現することができる。例え
ば、検出は、常法に従い実行される、APP/γ−セクレターゼ混合物の標識抗体に
よる染色を利用することができる。一般に、本発明の示差的に発現されたポリペ
プチドに特異的に結合する抗体が試料に添加され、エピトープに結合させるのに
十分な期間、通常30分間インキュベーションされる。この抗体は、直接検出(例
えば、放射性同位元素、酵素、発蛍光団、化学発光体などを使用)のために検出
できるように標識することができ、もしくは第二段階(second stage)抗体又は結
合を検出する試薬(例えば、ビオチンとホースラディッシュペルオキシダーゼ-共
役したアビジン、フルオレセイン、ローダミンン、テキサスレッドなどの蛍光化
合物と共役した二次抗体)との共役において使用することができる。抗体結合の
存在又は非存在は、解離した細胞のフローサイトメトリー、鏡検、ラジオグラフ
ィー、シンチレーション計数、比色アッセイなどを含む、様々な方法により決定
することができる。示差的に発現されたポリペプチドのレベル又は量の定性又は
定量検出のいずれか適当な代替法、例えばウェスタンブロット、免疫沈降、ラジ
オイムノアッセイなどを使用することができる。

【００５５】 好ましい態様において、APPγ−セクレターゼタンパク質分解産物、γCTF、p3
及び／又はＡβの存在を検出するために、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が
使用される。複数の試料の定量を、様々な可能性のある物質が細胞膜調製物に対
し試験されるELISA様式におけるアッセイの試行により時間効果的に行うことが
でき、かつ迅速な定量は、分光光度又は比色検出により実行される。例えば、比
較的低量のγCTF又はＡβの存在は、γ−セクレターゼ活性の低下の指標である
。このようなAPPタンパク質分解性のペプチド産物のレベルの変化は、アミロイ
ド-関連障害の治療において更に研究するためのリード化合物を同定することが
できる。

【００５６】 例えばセクレターゼ活性を阻害又は増強のいずれかで、γ-セクレターゼ活性
に影響を及ぼすことが認められた化合物は、更にトランスジェニックマウスにお
いてアッセイすることができる。本発明のアッセイにおいて陽性と考査する化合
物は、AD及びCAAのようなアミロイド-関連障害の説明された治療において使用す
ることができる。 (本発明の化合物を用いる治療法) 治療法は、前述のアッセイにおいて陽性結果を示した化合物を投与することに
より、哺乳類宿主の脳組織中のβ−アミロイド斑のレベルを低下する方法である
。一般に、このような化合物は、γ−セクレターゼのin vivoレベルに影響する
ことにより、脳組織中のβ−アミロイド斑のレベルを低下するであろう。治療効
果は、例えば、γ−セクレターゼ活性を阻害又は低下する化合物により認められ
る。予防的使用も、高齢者及び／又は公知のアルツハイマー病に連関された変異
を保持する個体のような、アルツハイマー病のリスクのある個人において企図さ
れている。治療された個体は、目下症状を示していないが、脳及び神経外傷を受
けた者である。

【００５７】 本方法において、この化合物は、所望の標的タンパク質活性変調を得ることが
可能な都合の良い手段を用い、宿主へ投与することができる。従って、この化合
物は、治療的投与のために様々な処方に混入することができる。より詳細に述べ
ると、本発明の化合物は、適当な、医薬として許容できる担体又は希釈剤との組
合せにより、医薬組成物に処方することができ、かつ錠剤、カプセル剤、散剤、
顆粒剤、軟膏剤、液剤、経皮貼付剤、座剤、注射剤、吸引剤、及びエアゾール剤
のような、固形、半固形、液体又は気体状の調製物に処方することができる。

【００５８】 このように、これらの化合物の投与は、経口、舌下、経直腸、非経口、腹腔内
、膣内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む、様々な方法で達成することがで
きる。 医薬剤形において、この化合物は、それらの医薬として許容できる塩の形で投
与することができ、又は単独で、もしくは他の医薬活性化合物と適当に会合、更
には組合せて使用することもできる。下記の方法及び賦形剤は単なる例であり、
いかなる意味でも限定しない。 経口調製物のために、これらの化合物は、単独で又は適当な添加剤と組合せて
使用され、錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤を製造することができる。添加剤
の例は、通常の添加剤、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチ又はジャガ
イモデンプン；結合剤、例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシアゴ
ム、コーンスターチ又はゼラチン；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモ
デンプン、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム；滑沢剤、例えばタルク
又はステアリン酸マグネシウム；及び、望ましいならば、希釈剤、緩衝剤、保湿
剤、保存剤及び矯味矯臭剤がある。

【００５９】 本発明の化合物は、植物油又は他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級
脂肪族酸エステル又はプロピレングリコールのような水性又は非水性の溶剤中に
それらを溶解、懸濁又は乳化することにより、注射用調製物を処方することがで
きる。望ましいならば、可溶化剤、イオン化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤及
び保存剤のような、通常の添加剤を添加することができる。この処方中の治療有
効化合物の濃度は、約0.5〜100質量％を変動することができる。

【００６０】 これらの化合物は、吸引により投与するためにエアゾール処方において使用す
ることもできる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒
素などの加圧が許容された噴射剤に処方することができる。 更にこれらの化合物は、乳化基剤又は水溶性基剤のような様々な基剤と混合す
ることにより、座剤に製造することができる。本発明の化合物は、座剤により経
直腸的に投与することができる。座剤は、ココアバター、カルボワックス及びポ
リエチレングリコールのような、体温では融解するが室温では凝固しているよう
なビヒクルを含むことができる。 シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤のような経口又は経直腸投与のための単
位剤形は、各用量単位(例えば、小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤又は座剤1錠)が
、予め定められた量の1種又は複数のインヒビターを含有する組成物を含むよう
に提供することができる。同様に、注射又は経静脈投与のための単位剤形は、滅
菌水、通常の生理食塩水又は他の医薬として許容できる担体中の液剤としての組
成物中に、インヒビター(複数)を含むことができる。

【００６１】 医薬として許容できる賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、担体又は希釈
剤は、公に容易に入手することができる。更に、医薬として許容できる助剤物質
、例えば、pH 調節及び緩衝する物質、張度調節物質、安定化剤、湿潤物質など
を、公に容易に入手することができる。 本化合物は、生理的に許容できる担体中で、0.5〜20mg/kg体重の投与量につい
て、5mg〜1400mg、より有用なのは100mg〜1000mg、好ましくは500〜700の剤型で
宿主へと添加される。セクレターゼ活性を変更する化合物の用量は、セクレター
ゼ活性が10〜80％、より好ましくは20〜70％及び更により好ましくは25〜50％変
更するように選択される。 (実施例) 下記実施例は、当業者に、いかにして本発明を製造しかつ使用するかの完全な
理解と説明を提供するように提起されており、本発明者らが本発明とみなすもの
の範囲を制限するものでも、本発明者らが下記実験が全てであるか、これらの実
験のみが行われたことを説明することを意図するものでもない。使用した数値(
例えば、量、温度など)に関して精度を確実にするように努力したが、若干の実
験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に記さない限りは、部は質量部であ
り、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏であり、かつ圧力は常圧または
その近傍である。

【００６２】

【実施例】実施例１：哺乳類細胞-非使用γ-セクレターゼシステムの調製 γ-セクレターゼ調製物は、APPのC-末端切断産物を発現している細胞から調製
した。組換えワクシニアウイルスを、ヒトβAPP751 cDNAから構築し、高レベル
のCT99を産生することがわかった(Wolfらの論文、EMBO J.、9:2079 (1990))。こ
の組換えウイルスはVV99と称されるが、これを以下のように調製した。最初に、
βAPP遺伝子のカルボキシ-末端1kbを、DdeI及びPvuIIで消化し、かつゲル電気泳
動及びそれに続くゲル精製を用い、590bp断片を単離した。27bpのEcoRI-DdeIア
ダプター(adaptor)配列を、EcoRI-SmaI消化したワクシニアウイルスベクターpUV
1にクローニングした(Falknerらの論文、Nuc. Acids Res.、15:7192 (1987))。
この27bpアダプターは、ウイルス配列のコード領域を変更し、その結果ウイルス
プラスミドから発現されたβAPP配列の第一のアミノ酸は、653位のアスパラギン
酸、すなわちＡβの第一のアミノ酸に相当していた。開始メチオニンは、ワクシ
ニアp11コード配列により供給した。Cochranらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、82:19 (1985))及びChakrabartiらの論文(Mol. Cell Biol.、5:3403 (1985)
)に記された方法を用い、得られた組換えプラスミドを、CT99配列をワクシニア
ウイルスゲノムに導入することに使用した。VV99ウイルス単離体は、数回精製さ
れたプラークであり、ストックとなるまで増幅し、かつ挿入されたβAPP配列の
存在についてサザンブロット分析により試験した。ウェスタンブロット分析は、
VV99はCT99を発現していることを報告している(Wolfらの論文、同書)。

【００６３】 高レベルのCT99を含む膜を生成するために、〜10⁹個のCV-1サル線維芽細胞を
、VV99で48時間感染した。この期間の後、これらの細胞を収集し、生理食塩水で
洗浄し、かつ4℃での1200rpmで10分間の低速遠心分離によりペレット化した。こ
の細胞ペレットを、0.25Mショ糖、10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTAの25ml中に
再懸濁し、その後緊密に嵌合したペストルを備えたDounceホモジナイザーにより
均質化した。この試料を、2300rpmで10分間4℃で遠心した。この均質化工程を繰
り返した。

【００６４】 得られた核及び大デブリを含むペレットを廃棄し、核除去後(post-nuclear)の
上清を一緒にした。この上清画分を、100,000 x gで30〜60分間4℃で遠心し、膜
を収集した。この膜を、0.2％サポニン、10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTAを含
有する緩衝液で洗浄し、タンパク質分解活性の夾雑を除去し、引き続き100,000
x gで30分間4℃で遠心した。この工程を繰り返した。この段階で膜は、直接γ−
セクレターゼ活性のアッセイに使用することができるか、もしくは更に処理し、
可溶化されたγ−セクレターゼ活性を提供してもよい。

【００６５】 次に、サポニン-洗浄した膜画分を、5mM EDTAを含む10mM Tris-HCl(pH7.5)中
に調製した0.5％CHAPSにより可溶化した。γ−セクレターゼ活性を含有する膜の
アリコートを、界面活性剤で0℃で1時間処理し、その後処理した試料を100,000
x gで1時間4℃で遠心した。得られた上清(可溶性画分)を、Ａβ生成についてア
ッセイした。0.5％CHAPSは、可溶化に成功し、かつγ−セクレターゼ活性を維持
していた。

【００６６】 前述のサポニン-洗浄した膜画分及び0.5％CHAPSで可溶化した画分の両方を、
アッセイのためのCT99基質及びγ−セクレターゼ活性の給源として使用すること
ができる。CT99基質は、ウェスタンブロットにより示されたように、これらの両
画分中に存在し、適当な酵素とインキュベーションした場合に、Ａβへプロセシ
ングされた(下記実施例２及び３参照のこと)。サポニン-洗浄画分及びCHAPS可溶
化画分の両方を、解凍時に活性を喪失することなく、-80℃で貯蔵することがで
きる。

【００６７】 図１に示したように、膜抽出物中に存在する又は膜から可溶化されたγ−セク
レターゼ活性は、至適pHはほぼ中性であった。Ａβ生成の抑制が、比較的低いpH
条件、例えばpH4.0又は5.0で認められた。対照的に、pH6.0及び7.0は、Ａβの最
大の生成を示し、pH8.0での抽出物は、わずかに低いレベルを示した。この可溶
化されたγ-セクレターゼ活性は、熱感受性でもあり、このことは、これがタン
パク質(複数)であることを示している。試料の100℃で10〜30分間の処理は、本
質的に全てのＡβ生成活性を喪失した(図２)。

【００６８】実施例２：細胞-非使用γ-セクレターゼシステムによるＡβの生成 Ａβタンパク質をin vitroにおいて生成するために、サポニン洗浄した画分の
アリコート又は0.5％CHAPS処理した可溶性画分のアリコートを、最初に画分と1M
Tris-HCl (pH7.0)の1:10希釈物を作成することによりpH7.0に調節し、最終濃度
を100mM Tris-HClとした。中和した試料を、異なる時間、典型的には0(対照)か
ら24時間の範囲で、37℃でインキュベーションした。インキュベーション後、こ
れらの試料を以下のようにＡβ生成についてアッセイした。

【００６９】 96ウェル-マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を溶媒と
する精製したモノクローナル抗体1702.1の4μg/ml溶液を100μl/ウェルとなるよ
うにし、4℃で一晩被覆した。この1702.1モノクローナル抗体は、Ａβ40アイソ
フォームを特異的に認識する。このプレートを、0.05％ Tween-20を含有するPBS
で3回洗浄し、これらのウェルを1％ウシ血清アルブミン(BSA)で37℃で1時間処理
し、非−特異的タンパク質相互作用をブロックした。このプレートを洗浄し、そ
の後BSAと共にインキュベーションした。被験試料を、0.05％Tween 20、0.1％BS
Aを含むPBS 100μlに希釈し、プレートの各ウェルに添加した。このプレートを
、4℃で一晩又は37℃で2時間インキュベーションした。

【００７０】 このインキュベーション後、プレートを0.05％ Tween 20を含むPBSで3回洗浄
した。100μlのビオチン化した二次Ａβモノクローナル抗体1101.1を、0.05％Tw
een20及び0.1％BSAを含有するPBS中に希釈し、各ウェルに添加し、かつこのプレ
ートを37℃で2時間インキュベーションした。プレートを、0.05％Tween20を含有
するPBSで3回洗浄し、かつウェルに結合した1101.1二次抗体の量を、テトラメチ
ルベンジジン基質(Sigma社)を使用し、HRP-共役したストレプトアビジン(Zymed
社)により検出した。得られた比色反応を、プレートOD^450nmで測定することによ
り定量した。被験試料中に存在するＡβ40の量は、ELISAで調べた合成Ａβ40 ペ
プチド標準のわかっている量から算出した。

【００７１】 図３は、実施例１に説明したように調製した可溶化されたγ-セクレターゼ抽
出物によるＡβ40の生成を示している。γ−セクレターゼの10μlアリコートを
、0〜8時間の間の様々な期間、 37℃でインキュベーションした。インキュベー
ション後、これらの試料を、アッセイ緩衝液(PBS、0.05％Tween20、0.1％BSA)中
に希釈し、存在するＡβ40を、ELISAにより定量した。前述の試験期間にわたり
、線形の生成が得られ、このことはＡβ40が可溶化されたγ−セクレターゼ活性
のインキュベーションにより生成されたことを示している。

【００７２】 あるいは、ウェスタンブロット分析を用い、可溶化されたγ-セクレターゼに
よるＡβ生成をモニタリングすることができる。この試料を、Laemmli緩衝液中
に希釈し、かつ16％Tris-トリシンポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。
ゲル上で分離したタンパク質は、電気泳動的に0.2μmのニトロセルロース膜に転
写した。この膜をPBSで3回洗浄し、PBSに浸漬し、かつ6分間煮沸した。処理した
膜を標準ウェスタンブロットアッセイにおいて用いた。Ａβの生成は、ウェスタ
ンブロット及びＡβ-特異的モノクローナル抗体を用いて示した(Idaらの論文、J
. Biol. Chem.、271:22908 (1996))。更にＡβの免疫沈降を用い、生成物を検出
した。

【００７３】 0.5％CHAPS可溶化された セクレターゼ活性は、合成リン脂質の添加により増
大することができた。図４参照のこと。1μMカルジオリピン(Sigma社)の添加に
よる セクレターゼ活性の増強は、可溶化前に膜に当初存在した活性とほぼ同等
であった。他のリン脂質、例えばホスファチジルコリン、及びホスファチジルセ
リン及び1,2-ジパルミトイル-5-グリセロール-3-ホスホコリンも試験し、同等の
結果を得た。

【００７４】実施例３：CT100によるγ-セクレターゼ活性の再構築 可溶化されたγ-セクレターゼは、野生型細胞、すなわちβAPP又はCT100発現
について遺伝的に操作していない細胞の膜から調製した。γ−セクレターゼ活性
は、先に実施例１に説明されたように、個別に調製し、精製したCT100と一緒に
した。CT100は、一過性又は安定したトランスフェクションによりCT100を発現し
ている原核又は真核細胞における適当な発現プラスミドからの、in vitro転写及
び翻訳システム(Ambion社)において生成した。CT100基質は、この方法を用い放
射標識することができし、及び／又はイムノアフィニティ法を用い精製を促進す
るために、CT100に、エピトープタグをそのカルボキシル-末端に持たせることが
できる。

【００７５】 γ-セクレターゼを、CT100基質と混合し、かつ再構築された混合物を、様々な
期間37℃でインキュベーションし、Ａβを生成し、これはCT100のγ−セクレタ
ーゼ切断から生成された検出されたタンパク質分解産物であった(図５)。これは
、 セクレターゼ活性が、酵素活性及び基質を含む個別の画分を組合せることに
より再構築され得ることを示している。 本発明は、それらの具体的態様を参照し説明されているが、当業者には、本発
明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、様々な変更を行うことができ、かつ同
等物と置き換えることができることは理解されなければならない。加えて、特定
の状況、物質、物質組成、方法、1又は複数処理工程は、本発明の目的、精神及
び範囲に適合するように、多くの変更を行うことができる。このような変更は全
て、本願明細書に添付された「特許請求の範囲」内であることが意図されている
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、膜抽出物中に存在するγ-セクレターゼ活性に対するpHの効果を示す
棒グラフである。

【図２】 図２は、可溶性γ-セクレターゼ活性の熱失活を示す棒グラフである。

【図３】 図３は、可溶性γ-セクレターゼ活性によるＡβ₄₀の生成を示す折れ線グラフ
である。

【図４】 図４は、このアッセイのγ-セクレターゼ活性を増強するカルジオリピンの能
力を示す棒グラフである。

【図５】 図５は、再構築されたγ-セクレターゼ活性及びCT100の活性を説明する棒グラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ムッツ ミッチェル アメリカ合衆国 94306 カルフォルニア 州 パロ アルト オベルリン ストリー ト 2298 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4B050 CC03 CC07 DD11 LL01 4B063 QA18 QQ36 QR48 QS02 QS33 4C084 AA17 ZA022 ZA162

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物を含有するγ−セクレター
   ゼ活性の単離された調製物であり、ここで該活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて
   Ａβを生成する能力を特徴とする、調製物。
2. 【請求項２】 調製物が、可溶化されたＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物を
   含有する、請求項１記載の調製物。
3. 【請求項３】 調製物が、会合したＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物を有す
   る膜を含む、請求項１記載の調製物。
4. 【請求項４】 調製物が、ＡＰＰ又はＡＰＰタンパク質分解産物により再構
   築された単離されたγ−セクレターゼ活性を含む、請求項１記載の調製物。
5. 【請求項５】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物が、ＣＴ９９を含む、請求
   項１記載の調製物。
6. 【請求項６】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物が、γ−セクレターゼ活性
   を増大する変異を有するＡＰＰを含む、請求項１記載の調製物。
7. 【請求項７】 ＡＰＰ変異が、ＡＰＰの「Ｓｗｅｄｉｓｈ」変異（Ｋ５９５
   Ｎ／Ｍ５９６Ｌ）である、請求項６記載の調製物。
8. 【請求項８】 γ−セクレターゼ活性を変更する能力を特徴とする化合物を
   同定する方法であり、この方法が： ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物を候補化合物と接触する工程；及び ＡＰＰ／γ−セクレターゼタンパク質分解産物のレベルを決定する工程を含み； ここで、ＡＰＰタンパク質分解産物のレベルが、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ分泌活
   性に対する効果の指標である、前記方法。
9. 【請求項９】 ＡＰＰタンパク質分解産物のレベルが、予め決定された標準
   レベルと比較される、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 γ−セレクターゼ／ＡＰＰタンパク質分解産物のバックグ
    ラウンドレベルが、候補化合物との接触前に除かれる、請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＡＰＰタンパク質分解産物のレベルが、Ａβ、γＣＴＦ、
    及びｐ３からなる群より選択されるタンパク質を認識する抗体を用い決定される
    、請求項８記載の方法。
12. 【請求項１２】 γ−セクレターゼ活性を変更する能力を特徴とする化合物
    を同定する方法であり、この方法が： ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物を提供する工程； 該混合物からＡＰＰ／γ−セクレターゼタンパク質分解産物のバックグラウンド
    レベルを除く工程； 該混合物を化合物と接触する工程；及び ＡＰＰγ−セクレターゼタンパク質分解産物のレベルを決定する工程を含み； ここで、ＡＰＰタンパク質分解産物のレベルが、化合物のγ−セクレターゼ活性
    に対する効果の指標である、前記方法。
13. 【請求項１３】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物が、ＡＰＰ又はＡＰＰタ
    ンパク質分解産物を発現している細胞からの膜調製物の単離により提供される、
    請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物が可溶化される、請求項
    １２記載の方法。
15. 【請求項１５】 ＡＰＰ／γ−セクレターゼ混合物が、ＡＰＰ又はＡＰＰタ
    ンパク質分解産物によるγ−セクレターゼ活性の再構築により提供される、請求
    項１２記載の方法。
16. 【請求項１６】 化合物の効果が、化合物と接触しない対照ＡＰＰ／γ−セ
    クレターゼ混合物との効果と比較することにより決定される、請求項１２記載の
    方法。
17. 【請求項１７】 更にこの混合物を、外来性ＡＰＰ又はＡＰＰタンパク質分
    解産物と接触する工程を含む、請求項１２記載の方法。
18. 【請求項１８】 更に、膜調製物を化合物で処理し、γ−セクレターゼ活性
    を変更する工程を含む、請求項１２記載の方法。
19. 【請求項１９】 化合物が、γ−セクレターゼ活性を増大し、ここで該化合
    物がリン脂質である、請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 リン脂質が、カルジオリピン、Ｌ−α−ホスファチジルセ
    リン、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、及び１，２−ジパルミトイル−５−グリ
    セロール−３−ホスホコリンからなる群より選択される、請求項１９記載の方法
    。
21. 【請求項２１】 膜が、ＡＰＰ／γ−セクレターゼプロセシングに関連した
    遺伝子に変異を有する細胞から単離される、請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 細胞がＡＰＰに変異を有する、請求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 細胞が、プレセニリン遺伝子に変異を有する、請求項２１
    記載の方法。
24. 【請求項２４】 請求項８記載の方法に従い単離された化合物を、ｉｎ ｖ
    ｉｖｏセクレターゼ活性を変更するのに十分量投与する工程を含む、対象におい
    てβ−アミロイド斑形成を低下する方法であり； ここで変更されたγ−セクレターゼ活性が、脳組織において、低下したＡＰＰ／
    γ−セクレターゼプロセシング及び低下したβ−アミロイドペプチドの放出を生
    じる、前記方法。
25. 【請求項２５】 化合物が、γ−セクレターゼ活性のインヒビターであり、
    ここで低下したγ−セクレターゼ活性が、ＡＰＰのＣ−末端タンパク質分解の減
    少したレベルを生じ；及び ここでγ−セクレターゼ活性が正常値よりも３０〜８０％低く、及びβ−アミロ
    イド放出レベルが正常値の２０〜８０％である、請求項２４記載の方法。
26. 【請求項２６】 患者がアルツハイマー症と診断されている、請求項２４記
    載の方法。
27. 【請求項２７】 患者が、アルツハイマー症のリスクがあり、ここで該化合
    物がβ−アミロイド斑形成を防止するために投与される、請求項２４記載の方法
    。
28. 【請求項２８】 β−アミロイド斑形成下の細胞を、請求項１記載の単離さ
    れた調製物と接触する工程、この細胞を一定期間及びβ−アミロイド斑形成が阻
    害されるような条件下で、単離された調製物との接触させ続ける工程を含む、β
    −アミロイド斑形成を阻害する方法。