DE60123074T2

DE60123074T2 - Modulation von gamma-secretase aktivität

Info

Publication number: DE60123074T2
Application number: DE60123074T
Authority: DE
Inventors: Barbara Palo Alto Cordell; N. Jeffrey Mountain View HIGAKI; Mitchell Palo Alto MUTZ
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 2000-05-11
Filing date: 2001-05-09
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2021-05-10
Also published as: US20010055782A1; JP2003532413A; US6579689B2; DK1305406T3; DK1305406T4; EP1305406B1; EP1305406A2; ATE339496T1; DE60123074T3; EP1305406B2; AU2001261368A1; US20030211559A1; WO2001085924A2; DE60123074D1; WO2001085924A3

Description

Diese Anmeldung nimmt die Priorität der früher angemeldeten Provisional Patentanmeldung 60/203,506, die am 11. Mai 2000 angemeldet wurde, in Anspruch und fügt diese durch Referenz in ihrer Gesamtheit ein.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf das proteolytische Processing des β-Amyloid-Vorläufer-Proteins und weiter insbesondere auf Assays zur Bestimmung von Faktoren, die dieses Processing beeinflussen.
Hintergrund der Erfindung
Eine Anzahl von bedeutenden neurologischen Erkrankungen, einschließlich Alzheimersche Krankheit (AD), zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA) und Prion-vermittelte Erkrankungen werden durch die Ablagerung von aggregierten Proteinen, die als Amyloid bezeichnet werden, in das zentrale Nervensystem (CNS) charakterisiert (für Übersichtsarbeiten, siehe Glenner et al. (1989) J. Neurol. Sci. 94:1–28; Haan et al. (1990) Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305–310). Diese stark unlöslichen Aggregate setzen sich aus unverzweigten, fibrillären Proteinen mit dem gemeinsamen Charakteristikum einer β-Faltblatt-Konformation zusammen. Im CNS kann Amyloid in zerebralen und Hirnhaut-Blutgefäßen (zerebrovaskuläre Ablagerungen) und im Hirnparenchym (Plaques) vorhanden sein. Neuropathologische Studien in menschlichen und Tier-Modellen zeigen an, daß Zellen proximal zu Amyloid-Ablagerungen in ihren normalen Funktionen gestört werden (Mandybur (1989) Acta Neuropathol. 79:329–331; Kawai et al. (1993) Brain Res. 623:142–6; Martin et al. (1994) Am J. Pathol. 145:1348–1381; Kalaria et al. (1995) Neuroreport 6:477–80; Masliah et al. (1996) J. Neurosci 16:5795–5811). AD-Studien zeigen zusätzlich an, daß Amyloid-Fibrillen tatsächlich Neurodegeneration initiieren können (Lendon et al. (1997) J. Am. Med. Assoc. 277:825–31; Yankner (1996) Nat. Med. 2:850–2; Selkoe (1996) J. Biol. Chem. 271:18295–8; Hardy (1997) Trends Neurosci 20:154–9).
AD und CAA teilen biochemische und neuropathologische Marker, aber unterscheiden sich etwas in dem Ausmaß und der Lage der Amyloid-Ablagerungen, sowie in den Symptomen, die von den betroffenen Individuen gezeigt werden. Der neurodegenerative Prozeß von AD, der üblichsten Ursache für progressives intellektuelles Versagen in alten Menschen, wird charakterisiert durch die fortschreitende und irreversible Deafferentation des limbischen Systems, Assoziations-Neocortex und des basalen Vorderhirns, begleitet von neuritischen Plaques und Tangle-Bildung (für eine Übersicht siehe Terry et al. (1994) „Structural alteration in Alzheimer's disease." In: Alzheimer's disease (Terry et al. eds.), pp. 179–196. Raven Press, New York). Dystrophische Neuriten sowie reactive Astrozyten und Mikroglia sind mit diesen Amyloid-assoziierten Neuriten-Plaques assoziiert. Obwohl die neuritische Population in jedem gegebenen Plaque gemischt ist, setzen sich die Plaques im allgemeinen aus sphärischen Neuriten, die synaptische Proteine (APP, Typ I) enthalten, und Fusiform-Neuriten, die zytoskeletale Proteine und gepaarte helikale Filamente (PHF, Typ II) enthalten, zusammen.
CAA-Patienten zeigen verschiedene vaskuläre Symptome, von welchen die zerebrale parenchymale Blutung die am meisten dokumentierte ist. Die zerebrale parenchymale Blutung ist das Ergebnis von extensiver Amyloid-Ablagerung innerhalb der zerebralen Blutgefäße (Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154–9; Haan et al. (1990) Clin. Neurol. Neurosurg. 92:305–10; Terry et al., supra; Vinters (1987) Stroke 18:211–24; Itoh et al. (1993) J. Neurosurg. Sci. 116:135–41; Yamad et al. (1993) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 56:543–7; Greenberg et al. (1993) Neurology 43:2073–9; Levy et al. (1990) Science 248:1124–6). In einigen familiären CAA-Fällen wurde Demenz vor dem Ausbruch der Blutungen bemerkt, was die Möglichkeit vorschlägt, das zerebrovaskuläre Amyloid-Ablagerungen auch mit kognitiven Funktionen interferieren können.
Sowohl bei AD als auch bei CAA ist die Haupt-Amyloid-Komponente das Amyloid-Protein (Aβ). Das Aβ-Peptid, welches aus dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP) durch zwei mutmaßliche Sekretasen generiert wird, ist in geringen Spiegeln im normalen CNS-Blut vorhanden. Zwei hauptsächliche Varianten, Aβ₁_₄₀ und Aβ₁_₄₂ werden durch alternative Carboxy-terminale Trunkierung von APP produziert (Selkoe et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7341–7345; Selkoe, (1993) Trends Neurosci 16:403–409). Aβ₁_₄₂ ist das stärker fibrillogene und abundantere der beiden Peptide in den Amyloid-Ablagerungen, sowohl von AD als auch CAA. Zusätzlich zu den Amyloid-Ablagerungen in den oben beschriebenen AD- Fällen sind die meisten AD-Fälle auch mit Amyloid-Ablagerungen in den vaskulären Wänden assoziiert (Hardy (1997), supra; Haan et al. (1990), supra; Terry et al., supra; Vinters (1987), supra; Itoh et al. (1993), supra; Yamada et al. (1993), supra, Greenberg et al. (1993), supra; Levy et al. (1990), supra). Diese vaskulären Läsionen sind das Kennzeichen von CAA, welche in Abwesenheit von AD existieren kann.
Die Bildung von Aβ wird als ein pathogener Schlüssel-Prozeß in der Alzheimerschen Krankheit und verwandten neurodegenerativen Fehlsteuerungen betrachtet (in Übersicht dargestellt von Selkoe in Nature Suppl. 399: A23, 1999). Der genaue Mechanismus, durch welchen neuritische Plaques gebildet werden, und die Beziehung der Plaque-Bildung zu den AD-assoziierten und CAA-assoziierten neurodegenerativen Prozessen sind nicht eindeutig definiert. Jedoch zeigen Anzeichen, daß dysregulierte Expression und/oder Processing von APP-Genprodukten oder Derivaten dieser Genprodukt-Derivate in den pathophysiologischen Prozeß involviert sind, der zur Neurodegeneration und Plaque-Bildung führt. Zum Beispiel sind Missense-Mutationen in APP eng verbunden mit autosomal dominanten Formen von AD (Hardy (1994) Clin. Geriatr. Med. 10:239–247; Mann et al. (1992) Neurodegeneration 1:201-215). Die Rolle von APP bei neurodegenerativer Erkrankung wird weiter durch die Beobachtung impliziert, daß Personen mit dem Down-Syndrom, welche eine zusätzliche Kopie des humanen APP (hAPP)-Gens auf ihrem dritten Chromosom 21 tragen, eine Überexpression von hAPP (Goodison et al. (1993) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52:192–198; Oyama et al. (1994) J. Neurochem. 62:1062–1066) sowie eine prominente Tendenz zeigen, AD-Typ-Pathologie frühzeitig in ihrem Leben zu entwickeln. (Wisniewski et al. (1985) Ann. Neurol. 17:278–282). Mutationen in Aβ werden in Verbindung gebracht mit CAA assoziiert mit erblicher zerebraler Blutung mit Amyloidosis (Holländisch (HCHWA-D)(Levy et al. (1990), supra), in welcher Amyloid-Ablagerungen bevorzugt in der zerebrovaskularen Wand auftreten mit einigem Auftreten von difusen Plaques (Maat-Schieman et al. (1994) Acta Neuropathol. 88:371–8; Wattendorff et al. (1995) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 58:699-705). Eine Anzahl von hAPP-Punktmutationen, welche eng mit der Entwicklung von familiärer AD assoziiert sind, kodieren Aminosäure-Änderungen nahe einer der Seiten des Aβ-Peptides (für einen Überblick siehe zum Beispiel Lannfelt et al. (1994) Biochem. Soc Trans. 22:176–179; Clark et al. (1993) Arch. Neurol. 50:1164–1172). Letztendlich zeigen in vitro Studien an, daß aggregiertes Aβ Neurodegeneration induzieren kann (siehe z.B. Pike et al. (1995) J. Neurochem. 64:253–265).
APP ist ein glykosyliertes Einzelmembran-spannendes Protein, das in einer großen Vielzahl von Zellen in vielen Säugetier-Geweben exprimiert wird. Beispiele für spezifische Isotypen von APP, von denen derzeit bekannt ist, daß sie in Menschen existieren, sind das Polypeptid mit 695 Aminosäuren, daß von Kang et al. (1987) Nature 325:733–736, beschrieben wurde, welches als das „normale" APP bezeichnet wird. Ein Polypeptid mit 751 Aminosäuren wurde von Ponte et al. (1988) Nature 331:525–527 und Tanzi et al. (1988) Nature 331:528–530 beschrieben. Ein Isotyp von APP mit 770 Aminosäuren wird in Kitaguchi et al. (1988) Nature 331:530–532 beschrieben. Von einer Anzahl von spezifischen Varianten von APP wurde ebenso beschrieben, daß sie Punkt-Mutationen aufweisen, welche sich sowohl in der Position als auch im Phänotyp unterscheiden. Ein allgemeiner Überblick über solche Mutationen wird in Hardy (1992) Nature Genet. 1:233–234 zur Verfügung gestellt. Eine Mutation von besonderem Interesse wird als die „schwedische" Mutation bezeichnet, wo die normalen Reste Lys-Met in den Positionen 595 und 596 durch Asn-Leu ersetzt sind. Diese Mutation ist direkt stromab von der normalen γ-Sekretase-Spaltstelle von APP lokalisiert, welche zwischen den Resten 596 und 597 des 695-Isotyps auftritt.
APP wird post-translational prozessiert durch verschiedene proteolytische Stoffwechselwege, was zur Sekretion von verschiedenen Fragmenten oder zur intrazellulären Fragmentation und zum Abbau führt. F. Checler, J. Neurochem. 65:1431–1444 (1995). Die kombinierte Aktivität von γ-Sekretase und γ-Sekretase an APP setzt ein intaktes β-Amyloid-Peptid (Aβ) frei, welches ein Hauptbestandteil der Amyloid-Plaques ist. Aβ ist ein Peptid mit ungefähr 43 Aminosäuren, welches die Reste 597-640 des APP-Isotyps mit 695 Aminosäuren umfaßt. Die interne Spaltung von APP durch γ-Sekretase inhibiert die Freisetzung des Vollängen Aβ-Peptides. Obwohl das Ausmaß der pathogenen Beteiligung der Sekretase beim Fortschreiten von AD nicht vollständig aufgeklärt ist, ist von diesen proteolytischen Ereignissen bekannt, daß sie entweder Aβ-Bildung verstärken oder inhibieren, und daher angenommen wird, daß sie gute therapeutische Kandidaten für AD sind.
Obwohl eine Anzahl von Assays entwickelt wurde, um Sekretase-Aktivität zu untersuchen, hat jeder dieser Limitationen. Erhältliche zellfreie Assays, welche typischerweise synthetische Substrate verwenden, spiegeln die in vivo Situation nicht vollständig wieder. Auch wurden die Bedingungen für die Präparation und Durchführung der zellfreien Assays nicht so ausgelegt, daß sie den in vivo Zustand reflektieren. Gesamtzell-Assays sind, obwohl sie die physiologischen Zustände der Enzymaktivität akkurat widerspiegeln, schwieriger, weil die Mittel, die die enzymatische Aktivität beeinflussen, permeabel gegenüber der Zelle sowie den sub-zellulären Kompartimenten sein müssen.
Zahlreiche Berichte wurden angefertigt, die die Isolierung und Identifizierung von putativen γ-Sekretasen beschreiben (besprochen von Evin et al. in Amyloid 1: 263, 1994). Es wurde vorgeschlagen, daß PS1 γ-Sekretase ist (Wolfe et al. Nature 398: 513, 1999). Der Nachweis, der diesen Vorschlag unterstützt, ist indirekt, aber regte trotzdem beträchtliche Diskussion an (Wolfe et al. Biochem. 38 11223, 1999; Annaert & De Strooper TINS 22:439, 1999). Jedoch wurde von keiner dieser putativen γ-Sekretasen bewiesen, daß sie die authentische Aktivität sind, die in der Lage ist, Aβ zu produzieren. Die Fähigkeit, Aβ in vitro unter der Verwendung eines solubilisierten Säugetierzell-Extraktes zu produzieren, erlaubt die Reinigung und definitive Identifizierung von γ-Sekretase-Aktivität. Überdies hat dieser Assay den Vorteil, daß (1) er das native Substrat, das von dem β-Amyloid-Vorläufer-Protein, APP, und nicht synthetischen oder chimären APP-Substraten abgeleitet wurde, verwendet und (2) die γ-Sekretase-Aktivität durch das Verfolgen der Produktion von authentischem Aβ-Protein überwacht wird. Zusätzlich werden zwei hauptsächliche Aβ-Isoformen durch γ-Sekretase-Wirkung generiert, Aβ₄₀ und Aβ₄₂, welche Proteine von 40 beziehungsweise 42 Aminosäurenlänge repräsentieren. Es wurde debattiert, ob eine einzige enzymatische Aktivität für die Generierung aller Aβ-Isoformen verantwortlich ist oder ob verschiedene γ-Sekretasen existieren, wovon eine jeweils eine Aβ-Isoform generiert. Mit diesem solubilisierten System für γ-Sekretase-Aktivität kann dieses Anliegen aufgelöst werden. Die Generierung von spezifischen Aβ-Isoformen kann untersucht werden und die enzymatische Aktivität für jede gereinigte, wenn multiple Aktivitäten existieren. Wenn nur ein Enzym die Aβ-Isoformen produziert, wird dies im Reinigungsprozeß offensichtlich werden. Das Wissen um einzelne γ-Sekretasen im Vergleich zu multiplen γ-Sekretasen ist bedeutsam in Bezug auf die Entwicklung von Inhibitoren von γ-Sekretase und Aβ-Bildung. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, selektiv Aβ₄₂ zu inhibieren, weil von diesem gezeigt wurde, daß es pathogener ist in einer Anzahl von Kriterien (im Überblick dargestellt von Selkoe in J. Biol. Chem. 27l : 18295, 1996; Sotrey & Cappai in Neuropath. & Appl. Neurol. 25: 81, 1999). Weiterhin kann, weil die γ-Sekretase-Spaltstelle von APP in der Transmembranen Domain lokalisiert zu sein scheint, die Rolle von Lipiden oder einem Membran-ähnlichen Milieu ebenfalls mit diesem Assay-System untersucht werden.
Es ist aus einer Zahl von Berichten erwiesen, daß Presenilin-Proteine (PS 1 und PS2) in das γ-Sekretase-Processing von Aβ involviert sind. Zum Beispiel zeigen Zellen von einer PS1-Knock-out-Mäuse einen reduzierten Spiegel von Aβ-Protein und einen gleichzeitigen Anstieg in dem unmittelbaren Vorläufer von Aβ, der Carboxyl-terminalen 99 Reste-Domäne von APP (De Strooper et al. Nature 391: 387, 1998). PS2-Knock-out-Mäuse scheinen γ-Sekretase-Processing von Aβ nicht signifikant zu beeinflussen (Herreman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11872, 1999), obwohl andere Berichte für PS2 eine Rolle in der Aβ-Bildung vorschlagen (Jacobson et al. J. Biol. Chem. 274: 35233, 1999; Steiner et al. J. Biol. Chem. 274: 28669, 1999). Neure Nachweise schlagen vielmehr vor, daß PS 1, obwohl es für γ-Sekretase-Aktivität erforderlich ist, in Wirklichkeit nicht γ-Sekretase ist (Octave et al., J. Biol. Chem. 275: 1525–1528).
WO 98/15828 A offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von γ-Sekretase. Eine Zellinie, die β-APP exprimiert, wird in Kontakt mit einer Verbindung kultiviert, von der bekannt ist, daß sie γ-Sekretase-Aktivität inhibiert, was zur Akkumulierung von Carboxyl-terminalen β-APP-Fragmenten in der Zelle führt. Die bekannte γ-Sekretase-inhibierende Verbindung wird entfernt und durch eine Testsubstanz ersetzt. Die direkte inhibitorische γ-Sekretase-Aktivität der Testsubstanz wird durch Quantifizieren der Menge an β-APP Carboxyl-terminalen Fragmenten in der Zelle und/oder durch Quantifizieren der Menge an β-Amyloid-Peptid im Kulturmedium über die Zeit bestimmt.
Shpungin et al. offenbaren, daß die Superoxid (O₂)-bildende NADPH-Oxidase von ruhenden Makrophagen in einem zellfreien System durch bestimme anionische Amphile, wie zum Beispiel Natrium-Dodecylsulfat (SDS) aktiviert werden kann. Die Produktion von O₂ erfordert die Kooperation von Membran-assoziierten und zystoslischen („cystoslic") Komponenten. Die Membran-Komponente kann durch Octylglukosid solubilisiert werden, was zu einer hoch aktiven Oxidase-Präparation führt.
WO 01/16355 A offenbart eine Methode zur Identifizierung von spezifischen γ-Sekretase-Inhibitoren, welche für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden können, insbesondere eine Methode, welche in vitro ausgeführt werden kann. Es wird auch ein Test-Kit offenbart, welcher für die besagte Methode verwendet werden kann, zusätzlich zur Verwendung dieses Test-Kits oder der Methode zur Identifizierung von Substanzen, welche spezifisch γ-Sekretase inhibieren.
WO 0l/175435 A offenbart ein isoliertes, funktional aktives Protein, welches die Spaltung eines γ-Sekretase-Substrates katalysiert. Die funktionale Aktivität des isolierten Proteins schlägt vor, daß das isolierte Protein γ-Sekretase einschließt. Das isolierte γ-Sekretase-Protein kann mit PS1 assoziiert sein. Homogene Methoden zur Überwachung der Spaltung des β-Amyloid-Vorläufer-Proteins (βAPP) durch γ-Sekretase, wobei die Schritte der Isolation und Wiedergewinnung von Spaltprodukten, die isoliert wurden, auch beschrieben wird.
Im Stand der Technik besteht Bedarf für ein System, um die Moleküle zu identifizieren, die für die γ-Sekretase-Aktivität verantwortlich sind. Es besteht ebenso Bedarf für eine effiziente und produzierbare Methode für die Identifizierung von Inhibitoren/Modulatoren der γ- Sekretase-Aktivität, welche das Processing von APP beeinflussen. Es besteht ein besonderer Bedarf für einen Assay, welcher auf eine akkuratere Weise die in vivo Aktivität dieser enzymatischen Aktivität widerspiegelt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung stellt ein solubilisiertes γ-Sekretase-System und einen zellfreien Assay für die Identifizierung von Modulatoren des APP-Processing-Enzyms γ-Sekretase zur Verfügung. Gemäß der Erfindung wird daher eine isolierte Präparation zur Verfügung gestellt, die γ-Sekretase-Aktivität aufweist, umfassend eine Detergens-solubilisierte APP-γ-Sekretase-Mischung, wobei besagte Aktivität durch die Fähigkeit, Aβ in vitro zu produzieren, charakterisiert wird.
Die Erfindung stellt auch zur Verfügung:

– ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die durch eine Fähigkeit charakterisiert wird, γ-Sekretase-Aktivität zu verändern, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt: In Kontakt bringen einer γ-Sekretase-Mischung gemäß der Erfindung mit einer Kandidaten-Verbindung, und Bestimmen der Spiegel von APP/γ-Sekretase-proteolytischen Produkten; wobei die Spiegel der APP-proteolytischen Produkte indikativ für den Effekt der Verbindung auf die in vivo Sekretions-Aktivität sind; und
– ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die durch die Fähigkeit charakterisiert wird, γ-Sekretase-Aktivität zu verändern, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt: Zur Verfügung stellen einer APP/γ-Sekretase-Mischung der Erfindung; Entfernen der Hintergrund-Spiegel von APP/γ-Sekretase-proteolytischen Produkten aus besagter Mischung; In Kontakt bringen der Mischung mit einer Verbindung, und Bestimmen der Spiegel von APP/γ-Sekretase-proteolytischen Produkten, wobei der Spiegel der APP-proteolytischen Produkte indikativ für den Effekt der Verbindung auf die γ-Sekretase-Aktivität ist.

Das Verfahren der Erfindung wendet entweder eine Membran-Quelle von sowohl APP als auch γ-Sekretase oder individuelle Membran-Quellen für APP und Sekretase an, um eine solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität zur Verfügung zu stellen und um Faktoren zu bestimmen, die die enzymatische Aktivität verstärken oder verringern, was die Produktion von Aβ-Peptid beeinflußt. Die Zellmembranen, die in dem Assay verwendet werden, können von Zellen stammen, die ein endogenes APP exprimieren oder bevorzugter Weise von Zellen, die ein rekombinantes humanes APP exprimieren. Das APP kann Vollänge oder ein Fragment sein, daß in der Lage ist, proteolytisch durch γ-Sekretase gespalten zu werden, z.B. CT99. Zusätzlich dazu kann das APP, das in den Zellen exprimiert wird, eine oder mehrere Mutationen aufweisen, wie zum Beispiel eine Punktmutation, kleine Deletion, etc.
Solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität kann, wie hierin beschrieben, präpariert werden. Die isolierte solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität kann für eine Vielfalt von Zwecken verwendet werden, einschließlich der Generation von Aβ und der Identifizierung und Isolierung von einem Molekül/von Molekülen, die für die γ-Sekretase-Aktivität verantwortlich sind. Die Identifzierung und Charakterisierung der Moleküle, die für die γ-Sekretase-Aktivität verantwortlich sind, werden das rationale Design von Inhibitoren erlauben, welche direkt an der γ-Sekretase wirken, um Aβ-Bildung zu verhindern. Die solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität kann mit APP oder einem APP-proteolytischen Produkt isoliert werden, oder kann als eine Mischung zwischen isolierter γ-Sekretase-Aktivität und APP oder einem APP-proteolytischen Produkt rekonstituiert werden.
Unverarbeitete Membran-Präparationen, die γ-Sekretase-Aktivität aufweisen, werden hierin beschrieben. Diese Membran-Präparationen setzen sich mindestens aus der γ-Sekretase-Aktivität zusammen, aber können auch zahlreiche Membran-gebundene zelluläre Produkte aufweisen. Diese Membran-Präparationen sind insbesondere nützlich bei der Bestimmung des potentiellen Effektes von Mitteln, die die γ-Sekretase-Aktivität an anderen Membran-Molekülen beeinflussen.
Das Assay-Verfahren der Erfindung für die Identifizierung von Verbindungen, welche γ-Sekretase-Aktivität modulieren, schließt die Schritte ein von (1) Erhalten von Zell-Membranen von Zellen, die endogenes und/oder exogenes APP oder ein APP-proteolytisches Produkt (z.B. rekombinantes APP) exprimieren, (2) Entfernen der Hintergrund-γ-Sekretase-Produkten von APP (z.B. Aβ p3 und/oder γCTF), die in den Zellen zur Zeit der Präparation vorhanden sind; (3) Inkubieren der Membran-Präparationen mit einem Mittel, welches potentiell γ-Sekretase-Aktivität modifiziert und (4) Detektieren der proteolytischen Produkte der γ-Sekretase, z.B. γCTF, p3 und/oder Aβ. Die Detektion kann unter der Verwendung eines Aktikörpers erreicht werden, welcher selektiv die γ-Sekretase-Produkte erkennt, oder mittels anderer Verfahren, wie z.B. Isolierung und Charakterisierung der γ-Sekretase-Produkte. Die vorliegenden Assays können sehr kleine Anstiege im proteolytischen Produkt detektieren, wobei ein Assay sensitiv in einem Bereich von 0,5 bis 4 ng/ml Produkt für einen ELISA-Assay und in einem Bereich von 0,002–0,05 ng/ml unter der Verwendung von Western Blot-Analyse für das Produkt ist.
Die Membranen, die für die Isolierung von γ-Sekretase-Aktivität verwendet werden, können von Zellen erhalten werden, die ein Gen exprimieren, das gegenüber einem normalen, endogenen Gen verändert wurde. Z.B. können die Zellen ein APP exprimieren, das verändert wurde, um mehr oder weniger anfällig gegen Sekretase-Aktivität zu sein, z.B. Mutationen, um γ-Sekretase-Spaltung zu erhöhen. In einem anderen Beispiel können andere Gene, die in die γ-Sekretase-Aktivität involviert sind, wie z.B. die Preseniline, verändert werden, um Mittel zu identifizieren, die für diese Mutationen kompensieren. Speziell können Mutationen, von denen bekannt ist, daß sie in der Population auftreten, verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, die insbesondere nützlich bei der Behandlung von Subjekten sind, die solche Mutationen aufweisen.
Das Assay-Verfahren der Erfindung kann ein Mittel anwenden, welches γ-Sekretase-Aktivität erhöht, z.B. Cardiolipin oder andere Phospholipide, um die Sensitivität des Assays zu erhöhen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, therapeutische Mittel zu identifizieren, die die Aktivität von γ-Sekretase inhibieren, und damit die Produktion von Aβ und weiter spezifisch von Aβ₄₂ inhibieren. Solche Mittel sind nützlich, um die Bildung von neuritischen Plaques in Subjekten mit Bedarf für solche zu verhindern, z.B. Subjekte mit Risiko für familiäre AD.
Eine noch andere Aufgabe der Erfindung ist das Verfahren für die Isolierung von Komplexen oder Komponenten, die ein Mittel und die Moleküle, die in die γ-Sekretase-Aktivität involviert sind, umfassen. Dieses kann verwendet werden, um die spezifischen Moleküle, die in γ-Sekretase-Aktivität involviert sind, sowie die spezifischen Mutationen dieser Moleküle zu identifizieren. Die Isolation dieser Komplexe kann mittels Techniken, wie z.B. Co-Immunopräzipitation erreicht werden.
Ein Vorteil des Assays der Erfindung ist es, daß er die in vivo Veränderungen in der γ-Sekretase-Aktivität mit dem nativen APP-Substrat authentischer reflektiert im Vergleich zu anderen Assays, die Peptid- oder semi-synthetische Substrate verwenden. Die Membranen werden auch solubilisiert, was bei der Bequemlichkeit bei der Durchführung des Assays und bei der Rekonstitution und Reinigung der γ-Sekretase-Aktivität hilft.
Ein anderer Vorteil des Assays der Erfindung ist es, daß er effiziente Zuführung der potentiellen Mittel erlaubt, die die γ-Sekretase-Aktivität-Interaktion mit dem natürlichen Enzym beeinflussen, ohne die Probleme von Gesamtzell-Assays oder mikrosomalen Assays, z.B. Penetration quer durch die Zellmembran.
Ein noch Vorteil Vorteil ist es, daß die γ-Sekretase-Mittel-Komplexe, die in dem Assay der Erfindung produziert werden, einfacher als die γ-Sekretasen selbst gereinigt werden können, und daß daher der Assay nützlich für die Bestimmung der tatsächlichen Moleküle, die in die Proteolyse und/oder Sekretion der proteolytischen Produkte involviert sind, sein kann.
Ein noch weiterer Vorteil des Assays der Erfindung ist es, daß die γ-Sekretase-Aktivität durch eine direkte Messung der γ-Sekretase-proteolytischen Produkte bestimmt wird.
Ein noch weiterer Vorteil des Assays der Erfindung ist es, daß Komponenten, wie z.B. Phospholipide, addiert werden können, welche die γ-Sekretase-Aktivität verstärken und/oder γ-Sekretase-Produkte stabilisieren, z.B. Aβ, p3 und/oder γCTF.
Ein noch weiterer Vorteil des Assays der Erfindung ist es, daß der Assay zellfrei ist, und doch nicht auf eine subzelluläre Organelle angewiesen ist, wie es andere Assays, wie z.B. mikrosomale Assays, sind. Die beschriebenen Assays spiegeln daher die γ-Sekretase-Aktivität in allen Teilen der Zelle besser wieder, einschließlich des endoplasmatischen Retikulums des Golgi, etc.
Diese und andere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der Erfindung werden für den Fachmann auf dem Gebiet nach dem Lesen der Details der Erfindung, wie sie weiter unten vollständiger beschrieben ist, offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Säulendiagramm, welches den Effekt des pH-Wertes auf γ-Sekretase-Aktivität, die in dem Membran-Extrakt vorhanden ist, illustriert.
2 ist ein Säulendiagramm, welches die Hitze-Inaktivierung von löslicher γ-Sekretase-Aktivität illustriert.
3 ist ein Liniendiagramm, welches die Produktion von Aβ₄₀ durch die solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität illustriert.
4 ist ein Säulendiagramm, welches die Fähigkeit von Cardiolipin illustriert, die γ-Sekretase-Aktivität des Assays zu verstärken.
5 ist ein Säulendiagramm, welches die Aktivität von wiederhergestellter γ-Sekretase-Aktivität und CT100 illustriert.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Ehe die vorliegenden Assays beschrieben werden, ist zu verstehen, daß diese Erfindung nicht auf die bestimmte beschriebene Methodologie beschränkt sein soll, weil diese natürlich variieren kann. Es versteht sich auch, daß die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht limitierend gedacht ist, weil der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche limitiert wird.
Sofern es nicht anderweitig definiert ist, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die von einem Durchschnittsfachmann dieser Erfindung üblicherweise verstanden wird. Obwohl alle Methoden und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu denjenigen sind, die hierin beschrieben werden, bei der Praxis oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugen Methoden und Materialien nun beschrieben. Alle hierin erwähnten Publikationen werden hiermit durch Referenz eingefügt, um die Methoden und/oder Materialien in der Verbindung, mit der die Publikationen zitiert werden, zu offenbaren und zu beschreiben.
Die Publikationen, die hierin diskutiert werden, werden lediglich für deren Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Nichts hierin ist als eine Erlaubnis auszulegen, daß die vorliegende Erfindung nicht berechtigt ist, solche Veröffentlichung aufgrund von vorheriger Erfindung vorauszudatieren. Weiterhin können die Daten der Publikation, die zur Verfügung gestellt werden, verschieden zu den tatsächlichen Veröffentlichungsdaten sein, welche unabhängig bestätigt werden müßten.
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich „β-Amyloid-Vorläuferprotein" (APP) auf ein Polypeptid, das von einem Gen mit demselben Namen kodiert wird, daß in Menschen auf dem langen Arm von Chromosom 21 lokalisiert ist und daß eine β-Amyloid-Proteinregion innerhalb seiner Carboxyl-Region einschließt.
Der Begriff "β-Amyloid-Protein" (Aβ) bezieht sich auf alle β-Amyloid-Proteine, einschließlich des Peptides mit ungefähr 43 Aminosäuren, welches Reste 597–640 des Isotyps von APP mit 695 Aminosäuren, Reste 653–696 des 751-Isotyps und Reste 662–705 des 770- Isotyps umfaßt. Wie hierin beschrieben, wird das Protein unter der Verwendung des 695-Nummerierungssystems bezeichnet. Die Aβ-Proteine der Erfindung schließen jedes Protein ein, das ungefähr 40 bis ungefähr 44 Aminosäuren enthält, was bevorzugterweise die Reste 597–640 des Isotyps von APP mit 695 Aminosäuren, Aβ_1–40 oder Aβ_1–41 umfaßt (Selkoe et al., supra). Innerhalb der Offenbarung des Begriffs Aβ-Protein wird beabsichtigt, die zwei hauptsächlichen Aβ-Varianten, die hierin bezeichnet werden, und die 55 Aminoäuren-Segmente, einschließlich Aminosäuren 640–695 des Isotyps von APP mit 695 Aminosäuren, einzuschließen. Nach dieser Offenbarung werden Dritte vielleicht andere β-Amyloid-Proteine entdecken und es ist beabsichtigt, daß diese in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Der Begriff „APP-Sekretase", „Sekretase" und „Sekretase-Aktivität", wie hierin synonym verwendet, bezieht sich auf jedes proteolytische Enzym und/oder Aktivität, welche zur Sekretion von verschiedenen Fragmenten oder zur intrazellulären Fragmentation und Degradation von APP führt. Dies schließt α-Sekretase, β-Sekretase, γ-Sekretase und alle gleichartigen aber bis jetzt unidentifizierten Enzyme ein, welche die Proteolyse von entweder APP oder APP-proteolytischen Produkten, wie z.B. CT99 verursachen.
Der Begriff „γ-Sekretase" und „γ-Sekretase-Aktivität", wie hierin synonym verwendet, bezieht sich auf das Enzym oder die Enzyme, das/die für die Proteolyse von APP oder eines APP-proteolytischen Produktes (z.B. eines C-terminalen Fragmentes von APP, das die gesamte Aβ-Sequenz enthält) an der intramembranalen C-terminalen Spaltstelle von APP verantwortlich ist/sind, was zu den Produkten Aβ₄₀ oder Aβ₄₂ oder längeren oder kürzeren Aβ-Formen, z.B. Aβ₄₄ oder Aβ₃₈ führt.
Der Begriff „APP/γ-Sekretase-Mischung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das isolierte APP und γ-Sekretase als ein Komplex und/oder als eine Mischung der beiden Substanzen. Dieser Begriff beabsichtigt, Mischungen zu erfassen, die γ-Sekretase kombiniert mit Vollängen-APP, sowie γ-Sekretase kombiniert mit proteolytischen Produkten von APP, wie z.B. CT99 und CT83 und rekombinante Produkte, wie z.B. CT 100, aufweisen. Der Begriff kann sich auch auf APP/γ-Sekretase-Mischungen beziehen, die Presenilin 1 oder Presenilin 2-Proteine enthalten.
Der Begriff „CT99", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das APP-proteolytische Produkt, welches durch proteolytisches Processing von APP mit β-Sekretase produziert wird. Der Begriff „CT100", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein rekombinantes Proteinprodukt, welches alle Reste des CT99 nach einem initialen Methionin-Codon aufweist. Beide diese Produkte sind Substrate für γ-Sekretase und können in den Assays der Erfindung verwendet werden, um β-Sekretase-Aktivität zu detektieren. CT99 ist das wahre native Substrat für γ-Sekretase.
Der Begriff „APP-proteolytisches Produkt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedes der potentiellen Produkte, welches unter der Verwendung der APP-Sekretasen erhalten werden kann, einschließlich CT99 oder CT100, welches Produkte der β-Sekretase sind, und welches als ein Substrat verwendet werden kann, um γ-Sekretase-Aktivität zu detektieren; p3, welches ein Produkt von α-Sekretase und γ-Sekretase ist; Aβ, welches ein Produkt von β-Sekretase und γ-Sekretase ist; und γCTF, welches das Carboxy-terminale Produkt von γ-Sekretase ist. Bevorzugterweise misst die vorliegende Erfindung γ-Sekretase-Aktivität durch die Detektion eines γ-Sekretase-Produktes, wie z.B. p3, Aβ und γCTF.
Der Begriff „Alzheimersche Krankheit" (hierin abgekürzt als „AD"), wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Zustand, der mit der Bildung von neuritischen Plaques, umfassend β-Amyloid-Protein, primär im Hippocampus und dem zerebralen Cortex, sowie Beeinträchtigung sowohl beim Lernen als auch im Gedächtnis assoziiert ist. „AD", wie hierin verwendet, soll sowohl AD als auch AD-Typ-Pathologie umfassen.
Der Begriff "AD-Typ-Pathologie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Kombination von CNS-Veränderungen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, die Bildung von neuritischen Plaques, enthaltend β-Amyloid-Protein, im Hippocampus und dem zerebralen Cortex. Solche AD-Typ-Pathologien können einschließen, sind aber nicht notwendigerweise limitiert auf, Störungen, die mit der aberrierenden Expression und/oder Ablagerung von APP, Überexpression von APP, Expression von aberrierenden APP-Genprodukten und anderen mit AD assoziierten Phänomenen assoziiert sind. Beispiele für AD-Typ-Pathologien schießen ein, sind aber nicht notwendigerweise limitiert auf, AD-Typ-Pathologien assoziiert mit dem Downschen Syndrom, welches mit der Überexpression von APP assoziiert ist.
Der Begriff „Phänomen assoziiert mit der Alzheimerschen Erkrankung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein strukturelles, molekulares oder funktionales Ereignis, das mit AD assoziiert ist, insbesondere solch ein Ereignis, welches leicht in einem Tiermodell feststellbar ist. Solche Ereignisse schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Amyloid-Ablagerung, neuropathologische Entwicklungen, Lern- und Gedächtnisdefizite und andere AD-assoziierte Charakteristika.
Der Begriff „zerebrale Amyloid-Angiopathie" (abgekürzt hierin als CAA), wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Zustand, der mit der Bildung von Amyloid-Ablagerung innerhalb der zellulären Blutgefäße assoziiert ist, was durch zerebrale parenchymale Blutung kompliziert werden kann. CAA ist auch assoziiert mit einem erhöhten Risiko für Schlaganfall, sowie Entwicklung von Zerebellum- und subarachnoiden Blutungen (Vinters (1987) Stroke 18:31 1–423; Haan et al. (1994) Dementia 5:210–213; Itoh et al. (1993) J. Neurol. Sci. 116:135–414). CAA kann auch mit Demenz vor dem Beginn von Blutungen assoziiert werden. Die vaskulären Amyloid-Ablagerungen, die mit CAA assoziiert sind, können bei Abwesenheit von AD existieren, sind aber häufiger mit AD assoziiert.
Der Begriff „Phänomen assoziiert mit zerebraler Amyloid-Angiopathie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein molekulares, strukturelles oder funktionelles Ereignis, das mit ('AA assoziiert ist, insbesondere auf solch ein Ereignis, das leicht in einem Tiermodell feststellbar ist. Solche Ereignisse schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Amyloid-Ablagerung, zerebrale parenchymale Blutung und andere CAA-assoziierte Charakteristika.
Der Begriff „(β-Amyloid-Ablagerung" und „Aβ-Ablagerung", wie hier synonym verwendet, bezieht sich auf eine Ablagerung im Gehirn, die sich aus Aβ sowie aus anderen Substanzen zusammensetzt.
Mit „Antikörper" ist ein Immunoglobulin-Protein gemeint, welches in der Lage ist, ein Antigen zu binden. Antikörper, wie hierin verwendet, beabsichtigt, den gesamten Antikörper, sowie jedes der Antikörper-Fragmente (z.B. F(ab')₂, Fab', Fab. Fv) einzuschließen, die in der Lage sind, das Epitop, Antigen oder antigenische Fragment von Interesse zu binden.
Antikörper der Erfindung sind immunoreaktiv oder immunospezifisch für spezifische proteolytische Produkte des APP-Proteins und insbesondere für Produkte, die durch γ-Sekretase- Aktivität generiert werden, und binden an diese spezifisch und selektiv. Antikörper für jedes proteolytische Produkt sind bevorzugterweise immunospezifisch, d.h. im wesentlichen nicht kreuzreaktiv mit anderen proteolytischen Produkten von APP. Trotzdem umfaßt der Begriff „Antikörper" alle Typen von Antikörpern, sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, und produziert unter der Verwendung eines Peptid-Antigens.
Mit "gereinigter Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, welcher ausreichend frei von anderen Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden ist, welche mit ihm natürlicherweise assoziiert sind. Solch ein Antikörper „bindet bevorzugt" an ein proteolytisches APP-Proteinprodukt (oder an ein antigenisches Fragment davon), d.h. er erkennt und bindet im wesentlichen nicht an andere antigenisch nicht verwandte Moleküle. Ein gereinigter Antikörper der Erfindung ist bevorzugterweise immunoreaktiv mit und immunospezifisch für ein bestimmtes APP-Proteinprodukt (z.B. γCTF) und weiter bevorzugterweise wird er nicht mit anderen APP-Proteinprodukten reagieren.
Mit „antigenisches Fragment" eines APP-proteolytischen Produktes ist ein Teil eines solchen Proteins gemeint, welcher in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, der in dem Assay der Erfindung verwendet wird.
Mit „bindet spezifisch" ist hohe Avidität und/oder hohe Affinitätsbindung eines Antikörpers an ein spezifisches Polypeptid, d.h. Epitop eines APP-Proteinproduktes, gemeint. Die Bindung des Antikörpers an sein Epitop auf diesem spezifischen Polypeptid ist bevorzugterweise stärker als die Bindung desselben Antikörpers an jedes andere Epitop, insbesondere als an diejenigen Epitope, welche in Molekülen in Assoziation mit dem spezifischen Polypeptid von Interesse oder in derselben Probe wie das spezifische Polypeptid von Interesse anwesend sein können. Z.B. bindet der Antikörper stärker an das APP-Proteinprodukt als an andere Epitope, so daß durch Einstellung der Bindungsbedingungen der Antikörper fast exklusiv an das APP-Proteinprodukt bindet. Antikörper, welche spezifisch an ein Polypeptid von Interesse binden, können zur Bindung anderer Polypeptide auf einem schwachen, jedoch detektierbaren Niveau in der Lage sein (z.B. 10 % oder weniger als die Bindung, die für das Polypeptid von Interesse gezeigt wird). Solche schwache Bindung oder Hintergrund-Bindung ist leicht erkennbar von der spezifischen Antikörper-Bindung an die Verbindung oder das Polypeptid von Interesse, z.B. durch die Verwendung von geeigneten Kontrollen. Im Allgemeinen binden die Antikörper der Erfindung an ein bestimmtes APP-Protein-Produkt mit einer Bindungsaffinität von 10⁷M^–1 oder mehr, bevorzugterweise 10⁸ Mol/Liter oder mehr. Im Allgemeinen ist ein Antikörper mit einer Bindungsaffinität von 10⁶ M^–1 oder weniger nicht nützlich, da er an ein Antigen nicht in einem detektierbaren Niveau unter der Verwendung von konventioneller Methodologie, wie derzeit verwendet, bindet.
Mit „detektierbar markiertem Antikörper" ist ein Antikörper (oder Antikörperfragment, welches Bindungsspezifität behält) gemeint, welcher eine angehängte detektierbare Markierung aufweist. Die detektierbare Markierung wird normalerweise durch chemische Konjugation angehängt, aber wo die Markierung ein Polypeptid ist, könnte sie alternativ dazu mittels Genmanipulations-Techniken angeknüpft werden. Verfahren für die Produktion von detektierbar markierten Proteinen sind im Stand der Technik gut bekannt. Detektierbare Markierungen können aus einer Vielfalt von solchen Markierungen, die im Stand der Technik bekannt sind, ausgewählt werden, sind aber normalerweise: Radioisotope, Fluorophore, paramagnetische Markierungen, Enzyme (z.B. Meerrettich-Peroxidase) oder andere Reste oder Verbindungen, welche entweder ein detektierbares Signal emittieren (z.B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Farbe) oder ein detektierbares Signal nach dem Aussetzen der Markierung gegenüber seinem Substrat emittieren. Verschiedene detektierbare Markierungs-/Substrat-Paare (z.B. Meerrettich-Peroxidase/Diaminobenzidin, Avidin/Strepavidin, Luciferase/Luciferin), Verfahren zur Markierung von Antikörpern und Verfahren zur Verwendung markierter Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z.B. Harlow and Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)).
Der Begriff "Verbindung", wie hierin verwendet, beschreibt jedes Molekül, z.B. Protein, natürlich vorkommende Substanzen, synthetisiertes Protein oder kleine Molekül-Arzneimittel, mit der Fähigkeit zur Beeinflussung von Sekretase-Aktivität. Solche Verbindungen können verwendet werden, um die molekularen und klinischen Phänomene, die mit Amyloidassoziierten Erkrankungen und spezifisch AD, CAA und Prion-vermittelter Erkrankung assoziiert sind, zu behandeln.
Mit „effektiver Dosis" oder „Menge effektiv" ist eine Verabreichung einer Verbindung gemeint, die ausreichend ist, um die gewünschte physiologische und/oder psychologische Veränderung zur Verfügung zu stellen. Diese wird in Abhängigkeit vom Patienten, der Erkrankung und der Behandlung variieren. Die Dosis kann entweder eine therapeutische Dosis sein, in welchem Fall sie ausreichend die Spiegel von Amyloid-Plaques in dem Subjekt verändern sollte, um die Symptome der Erkrankung oder des Zustandes zu lindern oder zu verbessern, oder sie kann eine prophylaktische Dosis sein, welche ausreichend sein sollte, um die Akkumulation von Amyloid-Plaques auf ein ungewünschtes Niveau zu verhindern Die Begriffe „Behandlung", „behandeln" und ähnliches werden hierin verwendet, um im Allgemeinen das Erreichen eines gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Effektes zu bedeuten. Der Effekt kann prophylaktisch sein in Bezug auf die vollständige oder teilweise Verhinderung einer Erkrankung oder eines Symptoms davon und/oder kann therapeutisch sein in Bezug auf eine partielle oder vollständige Heilung einer Erkrankung und/oder eines nachteiligen Effektes, der der Erkrankung zurechenbar ist. „Behandlung", wie hierin verwendet, erfaßt jede Behandlung einer Erkrankung, in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, und schließt ein:

(a) Verhindern der Erkrankung vom Auftreten in einem Subjekt, welches für die Erkrankung prädisponiert, aber noch nicht damit diagnostiziert wurde;
(b) Inhibieren der Erkrankung, d.h. Hemmung Ihrer Entwicklung; oder
(c) Abbauen der Erkrankung, d.h. Verursachen von Regression der Erkrankung und/oder Verbesserung der Symptome. Die therapeutischen Mittel, die unter der Verwendung des Assays der Erfindung identifiziert werden können, sind insbesondere nützlich bei der Behandlung jeder Erkrankung, die mit der Ablagerung β-Amyloid assoziiert ist, einschließlich AD, erbliche zerebrale Blutung mit Amyloidosis und Prion-vermittelte Fehlstörungen und ähnliches.

Allgemeine Aspekte der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Präparation von solubilisierter γ-Sekretase-Aktivität zur Verfügung, welche die Fähigkeit beibehält, APP in vitro enzymatisch zu verarbeiten. Die γ-Sekretase-Aktivität wird als eine Mischung von APP oder eines APP-proteolytischen Produktes isoliert, wodurch die Integrität der Proteine, die für die γ-Sekretase-Aktivität verantwortlich sind, aufrecht erhalten wird. Alternativ dazu kann die γ-Sekretase-Aktivität isoliert werden und mit APP oder einem APP-proteolytischen Produkt rekonstituiert werden. Die APP/γ-Sekretase-Mischung kann direkt verwendet werden, um die Spiegel der Produktion von in Antwort auf verschiedene genetische Hintergründe und/oder addierte Verbindungen zu ermitteln. Die APP/γ-Sekretase-Mischung kann auch mit exogenem APP inkubiert werden, um hohe Spiegel an Aβ für verschiedene Verwendungen zu produzieren, wie z.B. in vitro Studien der Plaque-Bildung und Isoform-spezifische Antikörper-Produktion.
Die Fähigkeit, γ-Sekretase-Aktivität mit seinen natürlichen Substraten zu rekonstituieren, um Aβ-Protein in vitro zu generieren, wurde vordem nicht erreicht.
Die solubilisierten γ-Sekretase-Präparationen können auch verwendet werden, um das Molekül/die Moleküle, das/die verantwortlich für γ-Sekretase-Processing von APP ist/sind, zu identifizieren. Spezifisch wird die vorliegende Erfindung die Klarstellung die Rolle von PS1 und PS2 bei der Generation von Aβ erlauben. PS1 und PS2-Proteine können aus der solubilisierten Präparation entfernt werden oder PS1 oder PS2-Nullzellen können verwendet werden, um die solubilisierte β-Sekretase-Aktivität zu präparieren, wonach die Präparation auf Aβ-Produktion getestet werden kann. Alternativ dazu können die Präparationen mit einer Verbindung behandelt werden, welche an γ-Sekretase bindet, und γ-Sekretase kann über die Isolierung des Komplexes aus γ-Sekretase und Verbindung identifiziert werden.
Die solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität stellt einen Assay zur Detektion von γ-Sekretase-Processing von APP in einem zellfreien Assay zur Verfügung. Die γ-Sekretase-Aktivität kann mit isoliertem APP oder APP-proteolytischen Produkten, die aus Membranen produziert wurden, rekonstituiert werden und die Aktivität kann durch Messen der Spiegel der proteolytischen Produkte von APP, d.h. Aβ₄₀ und Aβ₄₂ bestimmt werden. Dieses Assay-System hat Vorteile gegenüber üblicheren Ansätzen, die verwendet werden, um Aβ-Inhibitoren zu identifizieren, welche intakte Zellen oder Mikrosomen involvieren. Der vorliegende Assay erlaubt das Testen des Effektes von verschiedenen Verbindungen auf das APP-Processing ohne Limitierungen, wie sie in konventionellen Gesamtzell- oder zellfreien (z.B. mikrosomalen) Assays gefunden werden. Z.B. erlauben die solubilisierten Präparationen des Assays der Erfindung einer Verbindung Zutritt zu den Molekülen, die in das Processing involviert sind, ohne die Probleme des Transportes quer durch eine Membran. Der Assay unter der Verwendung von solubilisierter γ-Sekretase kann eine viel höhere Konzentration der Aktivität von Interesse haben als eine Gesamtzell-Präparation, weil der Prozentsatz an γ-Sekretase viel höher ist, wodurch die Identifizierung subtilerer Effekte auf das APP-Processing erlaubt wird.
Darüber hinaus sind bei einem intakten Zell-Ansatz das spezifische Ziel und/oder der Mechanismus, durch welchen Aβ-Inhibitoren agieren, unbekannt oder wird vermutet. Dieser Assay bietet die Möglichkeit, spezifische Ziele, die in die Bildung des Carboxyl-Terminus von involviert sind, zu identifizieren und zu separieren. Die Entwicklung von Aβ- Inhibitoren würde in starkem Maße gefördert werden, indem man isolierte γ-Sekretase in einem semi-gereinigten oder in einem gereinigten Zustand hat, zusammen mit anderen Komponenten, die als kritisch identifiziert werden.
Präparation der solubilisierten γ-Sekretase-Aktivität
Die zellfreie γ-Sekretase-Aktivität der Erfindung kann unter der Verwendung einer Vielfalt von Säugetierzellen produziert werden, weil im wesentlichen alle Säugetierzellen, die untersucht wurden, gezeigt haben, daß sie Aβ-Protein generieren. Die Zellen, die verwendet wurden, um die Membran-Präparation zu erhalten, kann jede Zelle von Interesse sein, z.B. primäre Gliazellen, Säugetierzellen, die endogenes oder exogenes humanes APP exprimieren, humane 293-Zellen und ähnliches. Zellen, die transient oder stabil APP exprimieren, sowie nicht-transformierte Zellen können verwendet werden, um das aktive γ-Sekretase-Extrakt zu produzieren. Transfizierte Zellen können Wirkstoff-Selektion ausgesetzt werden, so daß eine stabile Linie, die hohe Spiegel an APP oder eines APP-Produktes exprimiert, isoliert werden kann. "Typischerweise tragen die kommerziell erhältlichen Expressions-Plasmide selektierbare Wirkstoffmarker, die für Säugetierzellen geeignet sind.
Die Zellen, die verwendet wurden, um die γ-Sekretase-Aktivität zu isolieren, können modifiziert werden, um bestimmte Proteine oder Isoformen von Proteinen zu exprimieren, die die Proteolyse von APP durch γ-Sekretase beeinflussen und/oder die Effizienz des Assays verstärken. Z.B. können Zellen, die spezifische Mutationen in APP aufweisen, verwendet werden, um den Effekt zu bestimmten, den diese Mutationen auf die Fähigkeit der γ-Sekretase-Proteolyse aufweisen können. Die „schwedische" Mutation von AP (K595N/M596L), welche das γ-Sekretase-Processing erhöht, ist eine natürlich vorkommende Mutation, welche in diesem Assay angewendet werden kann. Andere Punktmutationen nahe der γ-Sekretase-Spaltstelle, die mit erhöhtem Aβ₄₂ assoziiert sind, können auch verwendet werden.
In einem anderen Beispiel können Zellen, die Mutationen in einem Presenilin-Gen aufweisen, und insbesondere Presenilin 1, verwendet werden, um die γ-Sekretase-Aktivität zu isolieren, um den Effekt zu untersuchen, die dies auf γ-Sekretase-Aktivität hat. Dies kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob Preseniline tatsächlich verantwortlich für γ-Sekretase-Aktivität sind oder nicht.
In noch einem anderen Beispiel können Zellen, die transient oder stabil das β-Sekretase-Produkt von APP, den unmittelbaren Vorläufer von Aβ, exprimieren, bei der Isolation der γ-Sekretase-Aktivität verwendet werden. Der unmittelbare Vorläufer von Aβ umfaßt die 99 Carboxyl-terminalen Aminosäuren von APP, welcher als CT99 bezeichnet wird. Der CT99-Teil von APP enthält die Transmembran-Domäne und ist daher Membran-assoziiert. CT99 kann so manipuliert werden, daß es in hohen Spiegeln in Säugetierzellen exprimiert wird, was die Spiegel von Aβ, die in einem zellfreien Assay generiert werden, erhöht. Z.B. kann ein Expressions-Konstrukt hergestellt werden unter der Verwendung von Vektoren, wie z.B. pCDNA3.1 (In Vitrogen), welcher den Zytomegalovirus-Promotor verwendet, um die Expression der inserierten Sequenz anzutreiben. Da der CT99-Sequenz natürlicherweise ein Methionin-Rest voran geht, kann dieses als ein Startcodon dienen. Folglich können grundlegende Klonierungsmethoden verwendet werden, um CT100 (CT99 + das vorangehende Methionin) in ein Expressions-Plasmid einzuführen. Nachdem das rekombinante Plasmid konstruiert und verifiziert wurde, kann es in Säugetierzellen unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken, wie z.B. Lipofectamine Plus (Gibco BRL) oder Calciumphosphat-Präzipitation, eingeführt werden. Die transfizierten Zellen können 24 bis 72 Stunden nach der Einführung der DNA geerntet werden, zu einer Zeit, von der bestimmt wurde, daß sie optimale Spiegel an CT 100 liefert.
Der APP/γ-Sekretase-Komplex wird aus den Zell-Membranen präpariert, um dem endogenen oder exogenen APP-Protein Zutritt zur γ-Sekretase-Aktivität zu erlauben. Membran-Präparationen, die in dem Assay der Erfindung verwendet werden, können homogenisiert werden unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet zugänglich sind, wie z.B. Douncing, Verwendung eines mechanischen Gewebe-Homogenisators, Nadel-Scheren und Verwendung eines Kugellager-Gewebe-Homogenisators. Im allgemeinen werden Zellen isoliert und auf eine Weise aufgebrochen, um γ-Sekretase-Aktivität zu erhalten. Die Zellen, die für Membran-Präparation verwendet werden, können frisch erhalten sein, z.B. isoliert aus einer Patientenprobe, aus einem kultivierten System sein, z.B. einer unsterbliche Zellinie, oder Zellen sein, die in Langzeit-Lagerung vorhanden sind, z.B. bei – 70°C gelagerte Zellen. Nachdem die Membranen isoliert wurden, können sie direkt in dem Assay verwendet werden oder für zukünftige Verwendung gelagert werden, z.B. bei –80°C.
Nachdem eine rohe Zellmembran-Präparation generiert wurde, werden die Membranen optional behandelt, um die Hintergrund-APP-proteolytischen Produkte und nicht-spezifische Aktivität, die Aβ abbaut, zu entfernen. Z.B. können die Präparationen mit einem milden Detergens behandelt werden, um Hintergrund-Spiegel von APP-γ-Sekretase-proteolytischen Produkten zu entfernen. Ein beispielhaftes Detergens für die Verwendung mit dem vorliegend beschriebenen Assay schließt 0,02 bis 0,05% Saponin ein. Nachfolgend dieser anfänglichen Behandlung werden die pelletierten Membranen mit einem stärkeren Detergens solubilisiert, bevorzugterweise mit 0,5% CHAPS.
Nachdem die APP/γ-Sekretase-Mischung solubilisiert ist, wird sie optional teilweise gereinigt. Die Mischung kann unter der Verwendung jeder Methode gereinigt werden, die im Stand der Technik bekannt ist, aber bevorzugterweise wird sie unter der Verwendung von Chromatrographie, z.B. HiTrap Q-Chromatrographie, gereinigt. Andere Techniken, die verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Ionenaustausch-Chromatographien, wie z.B. DEAE; Größenausschluß-Chromatographie; HPLC, wie z.B. reverse Phase-HPLC; und andere Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein werden nach dem Lesen der folgenden Offenbarung.
Optional wird die APP/γ-Sekretase-Mischung vor der Verwendung einem Mittel ausgesetzt, das die γ-Sekretase-Aktivität verändert und/oder die detektierbaren APP-proteolytischen Produkte der γ-Sekretase stabilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform verstärkt das Mittel die Spiegel an γ-Sekretase-Aktivität, um eine verbesserte Detektion der Veränderungen in der γ-Sekretase-Aktivität zu erlauben. Beispielhafte Mittel für diese Verwendung schließen Cardiolipin und Alpha-Phospholipide, wie z.B. L-Alpha-Phosphatidylserin und L-Alpha-Phosphotidylcholin, ein. Andere Mittel, die die γ-Sekretase-Aktivität beeinflussen, können in der vorliegenden Erfindung ebenso verwendet werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet nach dein Lesen dieser Offenbarung offensichtlich sein wird.
Assay-Methodik
Die vorliegende Erfindung stellt eine Assay-Methodik für die Bestimmung von Verbindungen zur Verfügung, welche einen Einfluß auf APP-proteolytische Produkte haben und diese bevorzugterweise reduzieren, unter der Verwendung von Membran-Enzym-Mischungen. Solche Verbindungen können bei der Behandlung von Patienten, insbesondere Menschen, mit Amyloid-assoziierten Fehlsteuerungen verwendet werden. Der Assay schließt ein das In Kontakt bringen von APP/γ-Sekretase als individuelle Komponenten oder als eine Mischung mit einer Test-Verbindung und danach Bestimmen der Spiegel von APP-proteolytischen Produkten und insbesondere γCTF und Aβ. Wenn die Verbindung den Spiegel von APP-proteolytischen Produkten reduziert, wie z.B. im Vergleich mit einem zuvor bekannten Standard, dann ist die Verbindung ein Kandidat für die Behandlung von Patienten mit Amyloid-assoziierten Fehlsteuerungen. Das APP und die γ-Sekretase, welche mit der Verbindung in Kontakt gebracht werden, können mit Zell-Membranen assoziiert sein oder mit Membranen als eine Mischung isoliert sein, die aus Zellen, die APP und γ-Sekretase exprimieren, erhalten und rekonstituiert wurden. Obwohl verschiedene Typen von Zellen verwendet werden können, wird es bevorzugt, Zellen zu verwenden, welche rekombinant modifiziert wurden, um APP als eine Quelle für das Substrat für γ-Sekretase zu exprimierten.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung offenbart, die durch ihre Fähigkeit charakterisiert wird, γ-Sekretase-Aktivität zu verändern. Ein Assay-Verfahren für die Bestimmung von Verbindungen, die APP/γ-Sekretase-Aktivität beeinflussen, wird offenbart, welche umfaßt: (1) Präparation von APP und γ-Sekretase, anwesend auf oder erhalten von Zell-Membranen, die aus Zellen präpariert wurden, die APP und γ-Sekretase exprimieren; (2) Behandlung von APP plus γ-Sekretase mit einer Kandidaten-Verbindung in vitro und (3) Bestimmung des Effekts der Verbindung auf γ-Sekretase-Aktivität durch Messen der Spiegel von APP-proteolytischen Produkten. Es wird bevorzugt, den Assay gegen eine Kontrolle zu durchlaufen, z.B. wo keine Verbindung zu der APP-γ-Sekretase-Mischung addiert wird und/oder wo jeder Träger, der mit der Test-Verbindung addiert wird, zu einer Kultur addiert wird, um zu bestimmen, ob ein Träger allein APP-Proteolyse beeinflußt.
Vor der Verwendung der solubilisierten γ-Sekretase-Aktivität in dem Assay, werden bevorzugterweise Hintergrund-Spiegel der APP-proteolytischen Produkte entfernt, z.B. durch Behandlung mit einem Detergens. Alternativ dazu kann dieser Schritt durch genaue Bestimmung der Spiegel von APP-proteolytischen Produkten in einer bekannten Zellkultur von Zellen eliminiert werden, die APP exprimieren. Danach kann der bekannte Spiegel in dem Assay eingestellt werden, d.h. Anstiege oder Verringerungen relativ zu dem bekannten Hintergrund-Spiegel können durch Hinwegsubtrahieren des bekannten Hintergrund-Spiegels bestimmt werden. Um den Assay auf diese Weise durchzuführen, würde es natürlich notwendig sein, Zell-Membranen von einer statistisch signifikanten Anzahl von rekombinanten Zellen zu erhalten, welche einen bekannten Spiegel von APP exprimieren, und danach die Hintergrund-Spiegeln von APP-proteolytischen Produkten zu bestimmen, die in den Membranen dieser Zellen vorhanden sind.
Neue Verfahren werden zur Verfügung gestellt, welche Verbindungen anwenden, die bei der Veränderung von γ-Sekretase-Aktivitätsspiegeln wirksam sind. Verbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie γ-Sekretase-Aktivität inhibieren oder verstärken, können weiter in transgenen Mäusen untersucht werden, um zusätzliche physiologische Effekte und das Potential der Verbindung als ein therapeutisches Mittel zu bestimmen. Verbindungen, die positive Testergebnisse bei der Inhibierung ergeben, können in einer spezifischen Behandlungsmethode der Erfindung, wie unten beschrieben, verwendet werden.
Kandidaten-Verbindungen zur Verwendung mit den Assays der Erfindung
Kandidaten-Verbindungen können aus einer großen Vielfalt von Quellen erhalten werden, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Z.B. sind zahlreiche Mittel für Zufalls- und gerichtete Synthese einer großen Vielfalt von organischen Verbindungen und Biomolekülen erhältlich, einschließlich der Expression von randomisierten Oligonukleotiden und Oligopeptiden. Alternativ dazu sind Bibliotheken und natürliche Verbindungen in der Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- und tierischen Extrakten erhältlich oder können leicht produziert werden. Zusätzlich dazu können natürliche oder synthetisch produzierte Bibliotheken und Verbindungen leicht modifiziert werden durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel und können verwendet werden, um kombinatorische Bibliotheken zu produzieren. Bekannte pharmakologische Verbindungen können gerichteten oder chemischen Zufalls-Modifizierungen unterzogen werden, wie z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifizierung, etc., um strukturelle Analoga zu produzieren.
Verbindungen zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung können kleine organische Verbindungen sein, die ein Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als ungefähr 2.500 Dalton aufweisen. Kandidaten-Verbindungen umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Interaktion mit Proteinen notwendig sind, insbesondere Wasserstoff-Brückenbindung, und schließen typischerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppe ein, bevorzugterweise mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidaten-Verbindungen umfassen oft zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, substituiert mit einer oder mehrerer der obigen funktionellen Gruppen. Kandidaten-Verbindungen werden auch unter Biomolekülen gefunden, einschließlich, aber nicht limitiert auf: Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, strukturelle Analoga oder Kombinationen davon.
Detektion der proteolytischen Produkte nachfolgend der Behandlung mit der APP/γ-Sekretase-Mischung
Nachfolgend der Inkubation der APP/γ-Sekretase-Mischung mit der Test-Verbindung wird die Präparation auf die Spiegel an γ-Sekretase-proteolytischen Produkten von APP, z.B: γCTF, p3 und/oder Aβ untersucht. Die Detektion der APP/γ-Sekretase-proteolytischen Produkte kann unter der Verwendung einer Anzahl von Verfahren zur Bestimmung der Abwesenheit oder Anwesenheit oder veränderten Mengen von differentiell exprimiertem Polypeptid in der Testprobe erreicht werden. Z.B. kann die Detektion die Färbung der APP/γ-Sekretase-Mischung mit markierten Antikörpern verwenden, durchgeführt in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren. Im allgemeinen werden Antikörper, die spezifisch an ein differentiell exprimiertes Polypeptid der Erfindung binden, zu einer Probe addiert und für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreichend ist, um Bindung des Epitops zu ermöglichen, gewöhnlicherweise 30 Minuten. Der Antikörper kann detektierbar markiert sein für direkte Detektion (z.B. unter der Verwendung von Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, chemilumineszierenden Verbindungen und ähnlichen) oder kann in Zusammenhang mit einem Antikörper oder einem Reagenz einer zweiten Stufe verwendet werden, um Bindung zu detektieren (Biotin mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Avidin, ein sekundärer Antikörper konjugiert mit einer fluoreszierenden Verbindung, z.B. Flourescein, Rhodamin, Texas Rot, etc.). Die Abwesenheit oder Anwesenheit der Antikörper-Bindung kann durch verschiedene Methoden bestimmt werden, einschließlich Durchfluß-Zytometrie der dissoziierten Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillations-Zählung, kolorimetrische Assays, etc. Jegliche geeignete alternative Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Detektion von Spiegeln oder Mengen differentiell exprimierter Polypeptide können verwendet werden, z.B. Western Blot, Immunopräzipitation, Radioimmunoassay, etc.
Bevorzugterweise wird ein Enzym-verbundener Immunosorbent-Assay (ELISA) verwendet, um die Anwesenheit des APP γ-Sekretase-proteolytischen Produketes, γCTF, p3 und/oder Aβ, zu detektieren. Die Quantifizierung von multiplen Proben kann zeit effizienter gemacht werden durch Durchführung des Assays in einem ELISA-Format, in welchem verschiedene potentielle Mittel gegen Zell-Membran-Präparationen getestet werden und schnelle Quantifizierung durch spektrophotometrische oder kolorimetrische Detektion erreicht wird. Z.B. zeigt die Anwesenheit einer relativ geringen Menge von γCTF oder Aβ eine Verringerung der γ-Sekretase-Aktivität an. Solche Veränderungen in dem Spiegel von APP-proteolytischen Produkten können Leitverbindungen für das weitere Studium bei der Behandlung von Amyloid-assoziierten Fehlstörungen identifizieren.
Verbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie die γ-Sekretase-Aktivität beeinflussen, z.B. entweder Sekretase-Aktivität inhibieren oder verstärken, können weiter in transgenen Mäusen untersucht werden. Verbindungen, welche positive Testergebnisse in dem Assay der Erfinudung ergeben, können bei der beschriebenen Behandlung von Amyloid-assoziierten Erkrankungen, wie z.B. AD und CAA, verwendet werden.
Eine Verbindung, welche positive Ergebnisse in dem Assay, wie oben beschrieben, zeigte, kann in einem Verfahren zum Reduzieren der Spiegel von β-Amyloid-Plaque im Gehirngewebe eines Säugetierwirtes nützlich sein, durch Verabreichen solch einer Verbindung. Im allgemeinen werden solche Verbindungen den Spiegel von β-Amyloid-Plaque im Gehirngewebe durch Beeinflussung der in vivo Spiegel von γ-Sekretase reduzieren. Therapeutische Wirkungen können z.B. durch Verbindungen, die γ-Sekretase-Aktivität inhibieren oder verringern, gesehen werden. Eine prophylaktische Verwendung wird auch in Erwägung gezogen für Individuen mit Risiko für Alzheimersche Erkrankung, wie z.B. ältere Menschen und/oder Individuen, welche bekannte Mutationen tragen, die mit dieser Erkrankung verbunden sind. Individuen, die behandelt werden, können derzeit keine Symptome zeigen, aber waren Kopf- oder neuronalem Trauma ausgesetzt.
In solchen Verfahren kann die Verbindung dem Wirt unter Verwendung jeglicher geeigneter Mittel verabreicht werden, die in der Lage sind, zu der gewünschten Zielprotein-Aktivitätsmodulierung zu führen. Daher kann die Verbindung in eine Vielfalt von Formulierungen für therapeutische Verabreichung eingefügt werden. Weiter insbesondere können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch die Kombination mit geeigneten, pharmazeutisch-akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln formuliert werden und können in Präparationen in festen, semi-festen, flüssigen oder gasförmigen Formen formuliert werden, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulat, Salben, Lösungen, transdermale Pflaster, Suppositorien, Injektionen, Inhaliermittel und Aerosole.
Als solches kann die Verabreichung der Verbindungen auf verschiedenen Wegen erreicht werden, einschließlich orale, bukkale, rektale, parenterale, intraperitoneale, intravaginale, intradermale, transdermale, intratracheale, etc. Verabreichung.
In pharmazeutischen Dosierungsformen können die Verbindungen in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze verabreicht werden oder sie können auch allein oder in geeigneter Assoziation sowie in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen verwendet werden. Die folgenden Verfahren und Hilfsstoffe sind lediglich beispielhaft und auf keine Weise limitierend.
Für orale Präparationen können die Verbindungen allein oder in Kombination mit geeigneten Additiva verwendet werden, um Tabletten, Pulver, Granulat oder Kapseln herzustellen. Beispiele für Additiva sind gebräuchliche Additiva wie z.B. Laktose, Mannitol, Maisstärke oder Kartoffelstärke; Bindemittel, wie z.B. kristalline Zellulose, Zellulose-Derivate, Akazie, Maisstärke oder Gelatine; disintegrierende Mittel, wie z.B. Maisstärke, Kartoffelstärke oder Natriumcarboxymethylzellulose; Gleitmittel, wie z.B. Talkum oder Magnesiumstearat und wenn gewünscht, Verdünnungsmittel, puffernde Mitteln, befeuchtende Mittel, Konservierungsmittel und Geschmacksmittel.
Die Verbindungen können in Präparationen zur Injektion formuliert werden, indem sie in einem wäßrigen oder nicht-wäßrigen Lösungsmittel aufgelöst, suspendiert oder emulgiert werden, wie z.B. pflanzliche oder andere ähnliche Öle, synthetische aliphatische Säureglyceride, Ester von höhere aliphatischen Säuren oder Propylen-Glycol. Wenn gewünscht, können auch gewöhnliche Additiva, wie z.B. Solubilisatoren, isotonische Mittel, suspendierende Mittel, emulgierende Mittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel addiert werden. Die Konzentration der therapeutisch aktiven Verbindung in der Formulierung kann von ungefähr 0,5 bis 100 Gewichtsprozent variieren.
Die Verbindungen können in einer Aerosol-Formulierung verwendet werden, um mittels Inhalierung verabreicht zu werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in unter Druck gesetzte akzeptable Treibmittel formuliert werden, wie z.B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und ähnliches.
Weiterhin können die Verbindungen in Suppositorien durch Mischen einer Vielfalt von Basen, wie z.B. emulgierenden Basen oder wasserlöslichen Basen, hergestellt werden. Diese Verbindungen der vorliegenden Erfindung können rektal über ein Suppositorium verabreicht werden. Das Suppositorium kann Vehikel einschließen, wie z.B. Kakaobutter, Carbowaxe und Polyethylenglykole, welche bei Körpertemperatur schmelzen, bei Raumtemperatur aber noch verfestigt sind.
Einheitsdosierungsformen für orale und rektale Verabreichung, wie z.B. Sirupe, Elixiere und Suspensionen, können zur Verfügung gestellt werden, wobei jede Dosierungseinheit (z.B. ein Teelöffel voll, ein Eßlöffel voll, eine Tablette oder ein Suppositorium) eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, die einen oder mehrere Inhibitoren enthält. Gleichermaßen können Einheitsdosierungsformen für die Injektion oder intravenöse Verabreichung den Inhibitor/die Inhibitoren in einer Zusammensetzung als eine Lösung in sterilem Wasser, normaler Saline oder einem weiteren pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Die pharmazeutisch akzeptablen Hilfsmittel, wie z.B. Vehikel, Adjuvantien, Träger oder Verdünnungsmittel, sind für die Öffentlichkeit leicht zugänglich. Des weiteren sind pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, wie z.B. den pH-Wert einstellende und puffernde Mittel, Tonizitäts-einstellende Mittel, Stabilisatoren, Befeuchtungsmittel und ähnliches, der Öffentlichkeit leicht zugänglich.
Die Verbindungen werden dem Wirt in einem physiologisch akzeptablen Träger bei einer Dosierung von 5 mg bis 1.400 mg, weiter üblich von 100 mg bis 1.000 mg, bevorzugt 500 bis 700 für eine Dosis von 0,5 bis 20 mg/kg Gewicht addiert. Die Dosierung für Verbindungen, die die Sekretase-Aktivität verändern, wird so ausgewählt, daß die Sekretase-Aktivität um 10 bis 80 %, weiter bevorzugt 20 bis 70 % und sogar weiter bevorzugt 25–50 % verändert wird.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Es wurden Anstrengungen unternommen, Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur, etc.) sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler oder Abweichungen sollten berücksichtigt werden. Wenn nicht anderweitig angezeigt, sind Teile = Teile pro Gewicht, ist Molekulargewicht = das durchschnittliche Molekulargewicht, ist Temperatur in Grad Celsius (°C) angegeben und ist der Druck gleich oder nahe dem atmosphärischem Druck.
Beispiel 1: Präparation eines zellfreien Säugetier-γ-Sekretase-Systems
Eine γ-Sekretase-Präparation wurde aus Zellen produziert, die das C-terminale Spaltprodukt von APP exprimieren. Ein rekombinanter Vaccinia-Virus wurde aus der humanen βAPP751 cDNA konstruiert und es wurde von ihm gefunden, daß er hohe Spiegel an CT99 produziert (Wolf et al. EMBO J. 9:2079, 1990). Dieser rekombinante Virus, der hierin als VV99 bezeichnet wird, wurde wie folgt konstruiert. Zuerst wurden die Carboxy-terminalen 1 kb des βAPP-Gens mit DdeI und PvuII verdaut und es wurde ein 590 bp-Fragment unter der Verwendung von Gel-Elektrophorese und nachfolgender Gel-Reinigung isoliert. Eine 27 bp EcoRI-DdeI-Adapter-Sequenz wurde in den EcoRI-SmaI-verdauten Vaccinia-Virus-Vector pUV1 (Falkner et al. Nuc. Acids Res. 15:7192, 1987) kloniert. Der 27 bp Adapter veränderte die kodierende Region der viralen Sequenzen, so daß die erste Aminosäure der βAPP-Seguenz, die aus dem viralen Plasmid exprimiert wird, mit dem Aspartat in Position 653, d.h. der ersten Aminosäure von Aβ, korrespondiert. Das Start-Methionin wurde durch die kodierende Vaccinia- p11 Sequenz bereitgestellt. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde verwendet, um die CT99-Sequenz in das Vaccinia-Virus-Genom einzufügen unter der Verwendung von Methoden, die von Cochran et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 19, 1985) und Chakrabarti et al. (Mol. Cell Biol. 5: 3403, 1985) beschrieben wurden. Das VV99-Virus-Isolat wurde mehrere Male Planque-gereinigt, in Bestände („stocks") amplifiziert und auf die Anwesenheit der inserierten βAPP-Sequenz mittels Southern Blot-Analyse getestet. Western Blot-Analyse dokumentierte, daß VV99 das CT99 exprimierte (Wolf et al. ibid).
Um Membranen zu produzieren, die hohe Spiegel an CT99 enthalten, wurden ~ 10⁹ CV-1 Affen-Fibroblasten-Zellen mit VV99 für 48 Stunden infiziert. Nach dieser Zeitspanne wurden die Zellen geerntet, mit Saline gewaschen und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 1.200 U/min für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Zellpellet wurde in 25 ml 0,25 M Sucrose, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert, danach mit einem Dounce-Homogenisator unter der Verwendung eines eng anliegenden Pistills homogenisiert. Die Probe wurde bei 2.300 U/min für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Dieser Homogenisierungsschritt wurde wiederholt.
Die resultierenden Pellets, die Nuclei und große Trümmer enthalten, wurden verworfen und die post-nuklearen Überstände wurden kombiniert. Die Überstand-Fraktion wurde bei 100.000 × g für 30–60 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um die Membranen zu sammeln. Die Membranen wurden in Puffer gewaschen, der 0,2% Saponin, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA enthält, um kontaminierende proteolytische Aktivität zu entfernen, gefolgt von Zentrifugation bei 100.000 × g für 30 Minuten bei 4°C. Dieser Schritt wurde wiederholt. Membranen nach diesem Schritt können direkt für die Untersuchung der γ-Sekretase-Aktivität verwendet werden oder können weiterbehandelt werden, um solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität zur Verfügung zu stellen.
Die Saponin-gewaschene Membran-Fraktion wurde als nächstes mit 0,5 % CHAPS, präpariert in 10 mM Tris-HCl pH 7,5 mit 5mM EDTA, solubilisiert. Aliquote der Membran-enthaltenden γ-Sekretase-Aktivität wurden mit Detergens bei 0°C für 1 Stunde behandelt, wonach die behandelten Proben bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert wurden. Die resultierenden Überstände (lösliche Fraktionen) wurden auf Aβ-Produktion untersucht. 0,5 % CHAPS war erfolgreich bei der Solubilisierung und Erhaltung der γ-Sekretase-Aktivität.
Sowohl die Saponin-gewaschene Membran-Fraktion als auch die 0,5 % CHAPS-solubilisierte Fraktion, wie oben beschrieben, können als eine Quelle für CT99-Substrat und γ-Sekretase-Aktivität für den Assay verwendet werden. CT99-Stubstrat ist in beiden dieser Fraktionen vorhanden, wie durch Western Blot gezeigt, und kann, wenn es mit den geeigneten Enzymen inkubiert wird, in Aβ weiterverarbeitet werden (siehe Beispiele 2 und 3 unten). Sowohl die Saponin-gewaschene Fraktion als auch die CHAPS-solubilisierte Fraktion können bei –80°C ohne Aktivitätsverlust nach dem Auftauen gelagert werden.
Die γ-Sekretase-Aktivität, die in dem Membran-Extrakt vorhanden ist oder aus der Membran solubilisiert wurde, hatte ein pH-Optimum nahe Neutralität, wie in 1 gezeigt.
Unterdrückung von Aβ-Produktion wurde bei niedrigeren pH-Bedingungen, wie z.B. pH 4,0 oder 5,0, beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten pH 6,0 und 7,0 die höchste Produktion von Aβ, wobei der Extrakt mit pH 8,0 geringfügig niedrigere Spiegel ergab. Die solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität war auch Hitze-sensitiv, was anzeigt, daß es ein Protein/Proteine sind. Die Behandlung der Probe bei 100 °C für 10 oder 30 Minuten eliminierte im wesentlichen die gesamte Aβ-generierende Aktivität (2).
Beispiel 2: Produktion von Aβ durch ein zellfreies γ-Sekretase-System
Um Aβ-Protein in vitro zu produzieren, wurde ein Aliquot der Saponin-gewaschenen Fraktion oder ein Aliquot der 0,5 % CHAPS-behandelten löslichen Fraktion zuerst auf pH 7,0 eingestellt durch Herstellung einer 1:10 Verdünnung der Fraktion mit 1 M Tris-HCl pH 7,0 auf eine Endkonzentration von 100 mM Tris-HCl. Die neutralisierten Proben wurden bei 37°C für verschiedene Zeitspannen, typischerweise im Bereich von 0 (Kontrolle) bis 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben auf Aβ-Produktion wie folgt untersucht.
Die Wells einer 96-Mikrotiter-Platte wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl/Well einer 4 μg/ml Lösung von gereinigtem monoklonalen Antikörper 1702.1, verdünnt in Phosphatgepufferter Saline (PBS), beschichtet. Der monoklonale Antikörper 1702.1 erkennt spezifisch die Isoform Aβ₄₀. Die Platte wurde dreimal mit PBS, enthaltend 0,05 % Tween-20, gewaschen und die Wells wurden mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde bei 37°C behandelt, um nicht-spezifische Protein-Interaktionen zu blockieren. Die Platte wurde nachfolgend der Inkubation mit BSA gewaschen. Die Testprobe wurde auf 100 μl in PBS, 0.05 Tween-20, 0,1 % BSA verdünnt und zu jedem Well der Platte addiert. Die Platte wurde bei 4°C über Nacht oder bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Platte dreimal mit PBS, 0,05 % Tween-20 gewaschen. 100 μl eines biotinylierten zweiten Aß-monoklonalen Antikörpers 1101.1, verdünnt in PBS, 0,05 % Tween-20 und 0,1 % BSA, wird zu jedem Well addiert und die Platte wird bei 37°C inkubiert. Die Platte wird dreimal mit PBS, 0,05 % Tween-20 gewaschen und die Menge an sekundärem Antikörper 1101.1, die an das Well gebunden ist, wird mit HRP-konjugiertem Streptavidin (Zymed) unter der Verwendung eines Tetramethylbenzidin-Substrates (Sigma) detektiert. Die resultierende kolorimetrische Reaktion wird durch Lesen der Platte bei OD 450 nm quantifiziert. Die Menge an Aβ₄₀, die in der Testprobe anwesend ist, wird aus bekannten Mengen von synthetischem Aβ₄₀ Peptid-Standard, der in dem ELISA gelaufen wird, berechnet.
3 zeigt die Produktion von Aβ₄₀ durch das solubilisierte γ-Sekretase-Extrakt, das wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert wurde. 10 μl Aliquote von γ-Sekretase wurden bei 37°C für verschiedene Zeitspannen im Bereich von 0 bis 8 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben in Assay-Puffer (PBS, 0,05 % Tween-20, 0,1 % BSA) verdünnt und das anwesende Aβ₄₀ wurde mit dem ELISA quantifiziert. Eine lineare Produktion über die Testzeitspanne wurde beobachtet, was anzeigt, das Aβ₄₀ durch Inkubation der solubilisierten γ-Sekretase-Aktivität generiert wird.
Alternativ dazu kann Western Blot-Analyse verwendet werden, um Aβ-Generation durch die solubilisierte γ-Sekretase zu überwachen. Die Probe wurde in Laemmli-Puffer verdünnt und auf einem 16 % Tris-Trizin-Polyacylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine, die auf dem Gel separierten, wurden elektrophoretisch auf eine 0,2 Micron-Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Membran wurde dreimal in PBS gespült, in PBS eingetaucht und für 6 Minuten gekocht. Die behandelte Membran wurde in einem Western Blot Standard-Assay verwendet. Die Generation von Aβ wurde unter der Verwendung einer Western Blot-Analyse und einem Aβ-spezifischen monoklonalen Antikörper gezeigt (Ida et al. J. Biol. Chem. 271:22908, 1996). Immunopräzipitation von Aβ kann auch verwendet werden, um das Produkt zu detektieren.
Die 0,5 % CHAPS-solubilisierte γ-Sekretase-Aktivität kann durch die Addition von synthetischen Phospholipiden erhöht werden. Siehe 4. Die Steigerung der γ-Sekretase-Aktivität durch die Addition von 1 μM Cardiolipin (Sigma) ist nahezu äquivalent zu der Aktivität, die ursprünglich in den Membranen vor der Solubilisierung vorhanden war. Andere Phospholipide, wie z.B. Phosphotidylcholin, Phosphotidylserin und 1,2-Dipalmitoyl-5-glycerol-3-phosphocholin, wurden mit vergleichbaren Ergebnissen auch getestet.
Beispiel 3: Rekonstitution von γ-Sekretase-Aktivität mit CT100
Solubilisierte γ-Sekretase wurde aus Membranen von Wildtyp-Zellen, d.h. Zellen, die nicht genetisch manipuliert sind, für βAPP oder CT100-Expression, präpariert. Die γ-Sekretase-Aktivität wurde unabhängig präpariert, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, und mit gereinigtem CT100 kombiniert. Das CT100 wurde durch ein in vitro Transkriptions- und Translations-System (Ambion) aus einem geeigneten Expressions-Plasmid in prokaryotischen oder cukaryotischen Zellen produziert, die CT100 durch transiente oder stabile Transfektion exprimieren. Das CT100-Substrat kann unter der Verwendung dieser Methode radiomarkiert werden und/oder das CT100 kann einen Epitop-Tag an seinem Carboxyl-Terminus tragen, um die Reinigung unter der Verwendung von Immunoaffinitäts-Methoden zu ermöglichen.
Die γ-Sekretase wird mit dem CT100-Substrat gemischt und die rekonstituierte Mischung wird bei 37°C für verschiedene Zeitspannen inkubiert, um Aβ zu generieren, welches das detektierte proteolytische Produkt ist, das durch γ-Sekretase-Spaltung von CT100 produziert wird (5). Dies zeigt, daß die γ-Sekretase-Aktivität durch die Kombination von separaten Fraktionen, die enzymatische Aktivität und Substrat enthalten, rekonstituiert werden kann.

Claims

Isolierte Präparation, die γ-Sekretase-Aktivität aufweist, umfassend eine Detergenssolubilisierte APP/γ-Sekretase-Mischung, wobei besagte Aktivität durch die Fähigkeit, Aβ in vitro zu produzieren, charakterisiert wird.
Präparation nach Anspruch 1, wobei die Präparation weiterhin Phospholipide umfaßt.
Präparation nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Präparation isolierte γ-Sekretase-Aktivität, wieder hergestellt mit APP oder einem APP-proteolytischen Produkt, umfaßt.
Präparation nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die APP/γ-Sekretase-Mischung CT99 umfaßt.
Präparation nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die APP/γ-Sekretase-Mischung ein APP umfaßt, das eine Mutation aufweist, die die γ-Sekretase-Aktivität erhöht.
Präparation nach Anspruch 5, wobei die APP-Motation die „schwedische" Mutation von APP (K595N/M596L) ist.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die durch eine Fähigkeit charakterisiert wird, γ-Sekretase-Aktivität zu verändern, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt: In Kontakt bringen einer APP/γ-Sekretase-Mischung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer Kandidaten-Verbindung und Bestimmen der Spiegel von APP/γ-Sekretase-proteolytischen Produkten; wobei die Spiegel der APP-proteolytischen Produkte Indikativ für den Effekt der Verbindung auf die in vivo Sekretions-Aktivität sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Spiegel der APP-proteolytischen Produkte mit einem vorbestimmten Standard verglichen werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hintergrund-Spiegel der γ-Sekretase/APP-proteolytischen Produkte vor dem Kontakt mit der Kandidaten-Verbindung entfernt wurden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Spiegel der APP-proteolytischen Produkte unter Verwendung von Antikörpern bestimmt werden, die ein Protein erkennen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aβ, γCTF und p3.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die durch die Fähigkeit charakterisiert wird, γ -Sekretase-Aktivität zu verändern, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt: zur Verfügung stellen einer APP/γ-Sekretase-Mischung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6; Entfernen der Hintergrund-Spiegel von APP-γ-Sekretase-proteolytischen Produkten aus besagter Mischung; in Kontakt bringen der Mischung mit einer Verbindung und Bestimmen der Spiegel von APP-γ-Sekretase-proteolytischen Produkten, wobei der Spiegel der APP-proteolytischen Produkte indikativ für den Effekt der Verbindung auf die γ-Sekretase-Aktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die APP/γ-Sekretase-Mischung durch Isolation einer Membran-Präparation aus Zellen, die APP oder ein APP-proteolytisches Produkt exprimieren, zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Effekt der Verbindung durch Vergleichen des Effekts mit der Kontroll-APP/γ-Sekretase-Mischung, die nicht in Kontakt mit der Verbindung ist, bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, weiterhin umfassend in Kontakt bringen der Mischung mit exogenem APP oder APP-proteolytischem Produkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, weiterhin umfassend: Behandeln der Membran-Präparation mit einer Verbindung, um γ-Sekretase-Aktivität zu verändern.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Verbindung die γ-Sekretase-Aktivität erhöht und wobei die Verbindung ein Phospholipid ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Phospholipid Cardiolipin, L-alpha-Phosphatidylserin, L-apha-Phosphotidylcholin oder 1,2-Dipalmitoyl-5-glycerol-3-phosphocholin ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Membranen aus Zellen isoliert werden, die eine Mutation in einem Gen aufweisen, das in APP/γ-Sekretase-Processing involviert ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zellen eine Mutation in APP aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Zellen eine Mutation in einem Presenilin-Gen aufweisen.