PL198079B1 - Sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu ß-amyloidowego i/lub peptydem ß-amyloidowym i sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu ß-amyloidowego i/lub peptydem ß-amyloidowym - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania lub izolacji zwi azków zdolnych do hamowania oddzia lywania pomi edzy presenilin a a prekursorem peptydu ß-amyloidowego i/lub peptydem ß-amyloidowym, znamienny tym, ze przeprowadza si e co najmniej jeden etap znakowania presenilin i/lub APP, lub ich fragmentów, oraz etap detekcji hamowania oddzia lywania pomi edzy peptydem A ß 1-42 a N-ko ncem presenilin albo pomi edzy kompletnymi bia lkami APP a presenilinami. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym i sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym, a w szczególności pomiędzy peptydem Αβ_1-42 a N-końcem PS2.

Peptyd amyloidowy Ap, obejmujący 37-42 aminokwasów, jest głównym składnikiem białkowym płytek starczych charakterystycznych dla choroby Alzheimera. Peptyd ten powstaje poprzez przecięcie jego prekursora, białka prekursorowego peptydu amyloidowego (APP). Mutacje w genie APP są odpowiedzialne za pewne przedwczesne formy rodzinnej postaci choroby Alzheimera. Tymczasem, większość tych form jest związana z obecnością mutacji w dwóch genach, presenilinie PS1 (początkowo nazwanej S 182) i PS2 (początkowo STM2), zidentyfikowanych klonowaniem pozycyjnym (Hardy, 1997). Są to formy dominujące a wszystkie te anomalie odpowiadają mutacjom typu „zmiany sensu” z wyjątkiem jednej pociągającej za sobą delecję jednego egzonu. Preseniliny są hydrofobowymi białkami błonowymi o masie cząsteczkowej około 45-50 kDa, wykazującymi 67% wzajemnej identyczności. Są one homologami dwóch białek C. elegans, SPE4 i Sel-12, w sposób pośredni związanych odpowiednio, z transportem wewnątrzkomórkowym i sygnalizacją receptorów Notch. Tymczasem, funkcja fizjologiczna presenilin nie jest jeszcze poznana. Udział w chorobie Alzheimera dwóch tak podobnych białek, pozostawia do myślenia, że preseniliny biorą udział w istotnej fizjologicznej etiologii tej patologii.

Białko PS1 zawiera 467 aminokwasów, zaś PS2 z 448. Obydwa wykazują strukturę białka błonowego z 6-8 potencjalnymi domenami transbłonowymi. Każda z presenilin podlega in vivo precyzyjnemu proteolitycznemu cięciu prowadząc do dwóch fragmentów ogólnie nazwanych fragmentami N- i C-końcowymi (Thinakaran i wsp., 1996). Cięcie to zostało zlokalizowane pomiędzy resztami 291 i 299 PS1 (Podlisny i wsp., 1997) oraz w homologicznym regionie PS2. Określenie „N-końcowy (N-ter) fragment ogólnie dotyczy fragmentu od pozycji 1 do około 291 PS1 a określenie „C-końcowy fragment ogólnie odnosi się do pozostałej części. Chociaż dokładna topologia presenilin w błonach lipidowych nie została jasno określona, proponuje się, że ich N- i C-końce, podobnie jak duża pętla hydrofilowa znajdują się w kompartmencie cytozolowym (Doan i wsp, 1996, patrz schemat fig. 1).

Wykazano zatem, że formy zmutowane presenilin indukują wzrost produkcji długiego peptydu amyloidowego Ap1-42 w porównaniu do Ap1-40 jednakowo u pacjentów-nosicieli (Scheuner i wspl., 1996), jak i w komórkach stransfekowanych (Borchelt i wspl., 1996) lub w transgenicznych myszach (Duff i wsp. 1996). Peptyd amyloidowy Ap, który tworzy płytki starcze, lezje charakterystyczne dla patologii, ma różne formy otrzymywane na drodze katabolizmu białka prekursorowego amyloidu, APP. W szczególności, opisano dwie istotne formy peptydu amyloidowego, jedną o czterdziestu resztach, Ap40 oraz drugą, posiadającą dwie dodatkowe reszty na C-końcu, Ap42. In vitro, peptyd Ap wykazuje silne właściwości agregacji, wykorzystywane przez formę Ap42, ta ostatnia wydaje się efektywnie tworzyć pierwsze agregaty wykrywalne w patologii. Z drugiej strony, forma Ap42 jest specyficznie produkowana u ludzi po urazie czaszki, który stanowi jeden z najlepiej ustalonych czynników ryzyka środowiskowego choroby Alzheimera. Co więcej, wszystkie formy genetyczne przedwczesnej choroby związane są z mutacjami zarówno w APP (istnieje ich sześć) jak i w presenilinach 1 i 2, które prowadzą do wzrostu stosunku Ap42/Ap40. Wszystkie te czynniki wydają się wskazywać na Ap42 jako kluczowy czynnik w patologii choroby. Zarówno dla form genetycznych, jak i sporadycznych choroby, wyjaśnienie mechanizmu jej rozwoju stało się podstawowym pytaniem.

W istocie, doniesiono o tworzeniu się w błonie komórkowej kompleksu pomiędzy prekursorem peptydu p-amyloidowego i PS1 lub PS2 (Weidemann i wsp. 1997, Xia i wsp., 1997). Tymczasem nieznana jest prawdziwa istota zdarzeń odpowiedzialnych za produkcję peptydu p-amyloidowego i nie wykazano żadnego związku pomiędzy przypuszczalną rolą tych kompleksów a produkcją peptydu p-amyloidowego Ap42. Niemniej należy zaznaczyć, że peptyd Ap42, ale nie Ap40, wydaje się być zlokalizowany w retikulum endoplazmatycznym komórek neuronalnych (Hartmann i wsp., 1997).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu p-amyloidowego i/lub peptydem p-amyloidowym, polegający na tym, że przeprowadza się co najmniej jeden etap znakowania presenilin i/lub APP, lub ich fragmentów, oraz etap detekcji hamowania oddziaływania pomiędzy peptydem

Ap1-42 a N-końcem presenilin albo pomiędzy kompletnymi białkami APP a presenilinami.

PL 198 079 B1

Korzystnie wyizolowane tym sposobem związki są zdolne do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy peptydem Αβ_1-42 a N-końcem preseniliny PS2.

Korzystnie przeprowadza się następujące etapy, w których :

- peptyd Αβ_1-42 absorbuje się wstępnie na błonie nitrocelulozowej przez inkubację;

- ekstrakt bakteryjny zawierający całość lub cześć preseniliny (PS1 lub PS2), a zwłaszcza N-koniec, dodaje się następnie i inkubuje z testowaną cząsteczką lub mieszaniną zawierającą różne testowane cząsteczki;

- wykrywa się oddziaływanie preseniliny z peptydem Ae_1-42 na filtrze nitrocelulozowym z użyciem białek znakujących preseniliny, przy czym pożądane cząsteczki hamują oddziaływanie i zmniejszają tym samym intensywność sygnału białek znakujących.

Korzystniej jako jedno z markerowych białek stosuje się białko wiążące S-tag, sprzężone z alkaliczną fosfatazą.

Korzystnie przeprowadza się następujące etapy, w których:

- peptyd Ae_1-42 inkubuje się wstępnie na płytce zawierającej studzienki (format 96-studzienkowy lub większy);

- dodaje się następnie N-koniec oczyszczonej rekombinowanej preseniliny dla inkubacji z testowaną cząsteczką lub mieszaniną zawierającą różne testowane cząsteczki;

- po przemyciu, wykrywa się oddziaływanie presenilin z peptydem Ae_1-42 na płytce z użyciem białek znakujących preseniliny, przy czym utratę oddziaływania pomiędzy presenilinami a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym wykrywa się spektrofotometrycznie, po dodaniu substratu kolorymetrycznego.

Korzystniej jako jedno z markerowych białek stosuje się białko wiążące S-tag, sprzężone z alkaliczną fosfatazą a wykrywanie braku oddziaływania przeprowadza się przy 450 nm.

Korzystnie przeprowadza się następujące etapy, w których:

- kontaktuje się cząsteczkę lub mieszaninę zawierającą różne cząsteczki ze zsyntetyzowanym peptydem Ae_1-42 z biotyną i „ramieniem” 3 β-alanin (lub 3 lizyn) na jego N-końcu (powyżej pozycji 1);

- powstającą mieszaninę reakcyjną inkubuje się z oczyszczonym i wyznakowanym przy pomocy pierwszego fluoroforu N-końcem preseniliny;

- dodaje się streptawidynę sprzężoną z drugim fluoroforem, podatnym na wzbudzenie przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu pozwalając na wykorzystanie przeniesienia fluorescencji występującego gdy te dwa fluorofory są w bliskiej odległości od siebie;

- wykrywa się nowe związki hamujące oddziaływanie fluorometrycznie przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu i/lub przez pomiar zmniejszenia sygnału przy długości fali emisji drugiego fluoroforu.

Korzystniej jako pierwszy fluorofor stosuje się kryptat Europium a jako drugi fluorofor stosuje się XL665.

Jeszcze korzystniej wykrywanie utraty oddziaływania przeprowadza się przy 620 nm i/lub przez pomiar zmniejszenia sygnału przy 665 nm.

Korzystnie przeprowadza się następujące etapy, w których:

- kontaktuje się mieszaninę a) lizatów komórkowych zawierających całość lub cześć presenilin (PS1 lub PS2) a w szczególności N-koniec, b) lizatów komórkowych zawierających APP, przy czym lizaty otrzymuje się z komórek zakażonych wirusami, a w szczególności bakulowirusami i c) testowaną cząsteczkę lub mieszaninę zawierającą różne testowane cząsteczki;

- przeprowadza się koimmunoprecypitację rozpuszczonych białek odpowiadających presenilinom lub APP lub peptydowi Ae przy użyciu odpowiednich przeciwciał;

- wykrywa się utratę koimmunoprecypitacji presenilin i APP przy użyciu testu hybrydyzacji typu Western ze znakowanymi przeciwciałami, co wskazuje na to, że badane cząsteczki wykazują pożądane właściwości hamowania.

Korzystnie wykrywa się oddziaływanie pomiędzy peptydem Ae_1-42 a N-końcem PS2.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym, a w szczególności pomiędzy peptydem Ae_1-42 a N-końcem PS2, polegający na tym, że przeprowadza się co najmniej jeden etap przeniesienia fluorescencji pomiędzy dwoma fluoroforami związanymi z powyższymi cząsteczkami oraz wykrywa się oddziaływanie przez pomiar fluorometryczny.

Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest wykrywanie lub izolacja polipeptydów zdolnych do hamowania, co najmniej częściowego, oddziaływań pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 z jednej strony a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym z drugiej strony. Sposoby

PL 198 079 B1 według wynalazku mogą być między innymi zastosowane do testów in vitro do wykrywania cząsteczek, a w szczególności małych cząsteczek zdolnych do hamowania tego oddziaływania.

Zgodnie z wynalazkiem zidentyfikowano i scharakteryzowano szczególne regiony preseniliny 1 (PS1) i preseniliny 2 (PS2), jak również szczególne regiony prekursora peptydu β-amyloidowego (APP) uwikłane w tworzenie się kompleksów APP/PS1 i APP/PS2.

Zgodnie z wynalazkiem w szczególności uwidoczniono zdolność N-końcowego regionu hydrofilowego (aminokwasy 1-87) PS2 do rozpoznawania różnych domen APP. Poza tym, wykazano podobne właściwości dla regionu N-końcowego PS1 (fragment 1-213). Równocześnie, wykazano zdolności polipeptydów pochodzących ze zdefiniowanych powyżej regionów presenilin do hamowania tworzenia się kompleksów pomiędzy APP i presenilinami. Zgodnie z wynalazkiem preseniliny zasadniczo odpowiadają presenilinie 1 (PS1) i/lub presenilinie 2(PS2).

Zgodnie z wynalazkiem wykazano również szczególną, nieoczekiwaną lokalizację komórkową oddziałujących ze sobą regionów w odniesieniu do błon lipidowych. W szczególności wynika z tego fakt, że takie interakcje mogą mieć miejsce nie tylko na poziomie błonowym, ale również na poziomie światła retikulum endoplazmatycznego i przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Jest to nieoczekiwane w zakresie, gdzie obszar N-końcowy PS (biorący udział w oddziaływaniu) jest ogólnie uznawany jako zlokalizowany w cytoplaźmie w warunkach standardowych.

Charakterystyka domen oddziaływania APP z presenilinami oraz wykazanie różnych lokalizacji komórkowych tych oddziaływań pozwala na zaplanowanie przygotowania nowych przydatnych farmaceutycznie polipeptydów zdolnych do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym.

Zgodnie z wynalazkiem zdolność do hamowania interakcji jest rozumiana jako obecność polipeptydów i/lub ligandów i/lub cząsteczek wykrytych za pomocą sposobu według wynalazku, wystarczająca do co najmniej częściowego hamowania wspomnianej interakcji pomiędzy preseniliną i/lub jej częścią N-końcową oraz prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym z preferencją dla peptydu Ae_1-42.

W przykładach wykazano, że hamowanie tej interakcji przez jeden z polipeptydów prowadzi do zmniejszenia produkcji wewnątrzkomórkowego peptydu amyloidowego Ae_1-42. Obecność tej konsekwencji funkcjonalnej przewiduje się dla wszystkich polipeptydów i/lub ligandów i/lub cząsteczek wykrytych za pomocą sposobu według wynalazku. Zahamowanie tej interakcji a zatem zahamowanie produkcji Ae_1-42 stanowi w konsekwencji cel terapii z wyboru w chorobach, w których bierze udział ta forma peptydu amyloidowego.

Zgodnie z zalecanym wykonaniem, polipeptydy te obejmują co najmniej części preseniliny 2 (PS2) pozwalającej na oddziaływanie z prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym. W zalecanym wykonaniu, w opisanych polipeptydach część PS2 odpowiada hydrofilowemu fragmentowi N-końcowemu PS2. W szczególności peptydy te mogą obejmować całość lub część sekwencji odpowiadającej sekwencji SEQ ID nr 1 lub pochodnej tej sekwencji.

Według innego wykonania, polipeptydy mogą obejmować co najmniej część PS1 pozwalającą na oddziaływanie z prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem amyloidowym. W zalecanym wykonaniu, polipeptydy te mogą obejmować całość lub część sekwencji SEQ ID nr 2 lub pochodnej tej sekwencji.

Według innego wykonania, polipeptydy mogą obejmować co najmniej wspólne regiony homologiczne odpowiadające sekwencjom SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2.

Według innego wykonania, polipeptydy te mogą obejmować co najmniej część prekursora peptydu β-amyloidowego (APP). W szczególnym wykonaniu, polipeptydy te mogą obejmować APP poza regionem odpowiadającym peptydowi β-amyloidowemu. W jeszcze dogodniejszym wykonaniu, w polipeptydach tych część prekursora peptydu β-amyloidowego obejmuje całość lub część sekwencji wybranej spośród sekwencji odpowiadającej fragmentowi 1-596 sekwencji SEQ ID nr 3 lub pochodnej tej sekwencji.

W znaczeniu niniejszego wynalazku, termin pochodna sekwencja polipeptydowa oznacza dowolne sekwencje polipeptydowe różniące się od sekwencji polipeptydowych odpowiadających sekwencjom zawartym w SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, lub fragmentom oznaczonym SEQ ID nr 3, otrzymanym przez liczne modyfikacje natury genetycznej i/lub chemicznej oraz posiadają-cym zdolność do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym. Przez modyfikacje natury genetycznej i/lub chemicznej należy rozumieć dowolne mutacje, substytucje, delecje, addycje i/lub

PL 198 079 B1 modyfikacje jednej lub wielu reszt. Takie pochodne mogą być wytworzone dla różnych celów: takich, które znacząco zwiększają powinowactwo peptydu do jego miejsca interakcji, poprawiają poziom jego produkcji, zwiększają odporność na proteazy, zwiększają wydajność terapeutyczną lub redukują skutki uboczne oraz zapewniają nowe właściwości farmakokinetyczne i/lub biologiczne.

Zgodnie z wynalazkiem jednocześnie dostarcza się związki niepeptydowe lub nie wyłącznie peptydowe użyteczne farmaceutycznie. W istocie, możliwym jest, począwszy od motywów peptydowych tu opisanych, wytworzenie cząsteczek hamujących, co najmniej częściowo, oddziaływanie pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym, które nie są wyłącznie peptydami i są zgodne z zastosowaniem farmaceutycznym. Opisane powyżej polipeptydy mogą mieć zastosowanie do wytwarzania aktywnych farmakologicznie cząsteczek niepeptydowych lub cząstek nie w całości peptydowych, poprzez określenie elementów strukturalnych peptydów, które są ważne dla ich aktywności i odtworzenia tych elementów przez struktury niepeptydowe lub nie wyłącznie peptydowe. Tego rodzaju związki mogą być zawarte w kompozycjach farmaceutycznych.

Zgodnie z wynalazkiem polipeptydy powinny zawierać sekwencje umożliwiające precyzyjną lokalizację komórkową, aby zahamować oddziaływanie pomiędzy presenilinami a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym. Zalecane są polipeptydy pochodne SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2, zawierające sekwencje lokalizacji pozakomórkowej a w jeszcze bardziej zalecanym wykonaniu polipeptyd zawierający N-końce PS 1 lub PS 2. Spośród tych sekwencji można podać sekwencje peptydów sygnałowych takich jak: peptyd sygnałowy IgkB, peptyd sygnałowy APP, peptydy sygnałowe podjednostek mięśniowego i ośrodkowego receptora nikotynowego.

Spośród szczególnie interesujących polipeptydów należy wymienić polipeptyd zawierający pierwsze 87 reszt N-końca PS2 i peptyd sygnałowy IgkB.

Zgodnie z wynalazkiem wykorzystana może być również dowolna sekwencja nukleotydowa kodująca peptyd zdolny do co najmniej częściowego zahamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 a prekursorem peptydu β-amyloidowego i /lub peptydem β-amyloidowym. W szczególnym wykonaniu może dotyczyć sekwencji nukleotydowej zawierającej całość lub część sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 1 lub pochodnej tej sekwencji. Zgodnie z innym wykonaniem, sekwencja nukleotydowa może zawierać całość lub część sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 2 lub pochodnej tej sekwencji. W szczególnym wykonaniu sekwencja nukleotydowa może zawierać wspólne strefy homologiczne z sekwencjami nukleotydowymi SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2. Zgodnie z innym wykonaniem, taka sekwencja nukleotydowa odpowiada fragmentowi 1-596 (kwasy nukleinowe 1 do 1788) sekwencji SEQ ID nr 3, lub sekwencji pochodnej.

W znaczeniu niniejszego wynalazku, termin pochodna sekwencja nukleotydowa oznacza dowolną sekwencję różniącą się od rozważanej sekwencji w znaczeniu degeneracji kodu genetycznego, otrzymaną przez jedną lub liczne modyfikacje natury genetycznej i/lub chemicznej, jak również dowolne sekwencje hybrydyzujące z tymi sekwencjami lub ich fragmentami oraz kodujące opisany polipeptyd. Przez modyfikację natury genetycznej i/lub chemicznej należy rozumieć dowolne mutacje, substytucje, delecje, addycje i/lub modyfikacje jednej lub licznych reszt. Określenie pochodna dotyczy zarówno sekwencji homologicznych do rozważanej sekwencji, pochodzących z innych źródeł komórkowych, w szczególności komórek pochodzących od człowieka lub innych organizmów. Takie sekwencje homologiczne mogą być otrzymane poprzez testy hybrydyzacji. Hybrydyzacje mogą być zrealizowane począwszy od banku kwasów nukleinowych, stosując jako sondę sekwencję natywną lub jej fragment, w zmiennych warunkach hybrydyzacji (Maniatis i wsp.1982).

Zgodnie z wynalazkiem sekwencje nukleotydowe mogę być pochodzenia sztucznego bądź nie. Dotyczy to sekwencji genomowych, cDNA, RNA, sekwencji hybrydowych lub sekwencji syntetycznych lub półsyntetycznych. Te sekwencje mogą być otrzymane przykładowo poprzez przeszukiwanie banków DNA (banku cDNA lub DNA genomowego) za pomocą sond opracowanych na podstawie przedstawionych powyżej sekwencji. Takie banki mogą być opracowane na podstawie komórek o różnym pochodzeniu klasycznymi technikami biologii molekularnej znanymi fachowcom. Opisane sekwencje nukleotydowe mogą być również przygotowane przez syntezę chemiczną lub również metodami mieszanymi obejmującymi modyfikację chemiczną lub enzymatyczną sekwencji otrzymanych poprzez przeszukiwanie banków.

Sposoby wykonania polipeptydów obejmuje etapy, w których hoduje się komórki zawierające opisane sekwencje nukleotydowe, w warunkach ekspresji wspomnianej sekwencji i odzyskuje się wytworzony produkt polipeptydowy. W tym przypadku, część kodująca wspomniany polipeptyd jest

PL 198 079 B1 ogólnie umieszczona pod kontrolą sygnałów pozwalających na jej ekspresję w komórce gospodarza. Wybór tych sygnałów (promotory, terminatory, sekwencje liderowe dla sekrecji, itd.) może różnić się w zależności od zastosowanej komórki gospodarza. Z drugiej strony, sekwencje nukleotydowe mogą stanowić część wektora mającego replikację autonomiczną lub integralną. W szczególności, wektory mające replikację autonomiczną mogą być przygotowane przy zastosowaniu sekwencji mających replikację autonomiczną w wybranym gospodarzu. Jeśli chodzi o wektory integralne, mogą być one przygotowane, na przykład, przy zastosowaniu sekwencji homologicznych do pewnych regionów genomu gospodarza co pozwala, na drodze rekombinacji homologicznej na integrację wektora.

Opisanymi sekwencjami nukleotydowymi można transformować komórki gospodarza niosące opisaną sekwencję nukleotydową. Komórki gospodarza stosowane do produkcji takich polipeptydów na drodze rekombinacji mogą być zarówno komórkami eukariotycznymi jak i prokariotycznymi. Spośród odpowiednich gospodarzy eukariotycznych, można zacytować komórki zwierzęce, drożdże lub grzyby. W szczególności, odnosząc się do drożdży należałoby zacytować drożdże z rodzaju Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, lub Hansenula. Odnosząc się do komórek zwierzęcych, należałoby zacytować komórki COS, CHO, C127, ludzkiej neuroblastomy, itp. Spośród grzybów można podać w szczególności Aspergillus ssp. lub Trichoderma ssp. Jako gospodarzy prokariotycznych, zaleca się stosowanie następujących bakterii: E.coli, Bacillus, lub Streptomyces.

W szczególnym wykonaniu, komórki gospodarza mogą dogodnie stanowić szczepy drożdży rekombinowanych pod względem ekspresji opisanych kwasów nukleinowych, jak również produkcji otrzymanych z nich białek.

W szczególności, komórki gospodarza mogą zawierać co najmniej jedną sekwencję lub fragment sekwencji wybranej spośród sekwencji SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, lub oznaczonych fragmentów SEQ ID nr 3 dla celów wytwarzania tu opisanych polipeptydów.

Opisane sekwencje nukleotydowe mogą być stosowane w zakresie terapii genowej, w szczególności po dodaniu peptydu sygnałowego do pochodnych SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2, w celu produkcji in vivo i transferu polipeptydów zdolnych do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 i prekursorem peptydu p-amyloidowego lub peptydu p-amyloidowego. W istocie, nieoczekiwanie, wykazano, że peptyd sygnałowy jest niezbędny do skierowania do retikulum endoplazmatycznego opisanych tu polipeptydów i przekazania również peptydom pochodnym sekwencji SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2 aktywności biologicznej w celu zahamowania oddziaływania pomiędzy presenilinami i prekursorem peptydu p-amyloidowego i/lub peptydu p-amyloidowego.

W innym wykonaniu, opisane sekwencje nukleotydowe można stosować do konstrukcji kasety ekspresyjnej, stosowanej w wektorach ekspresyjnych. W szczególności, kaseta ekspresyjna służy do produkcji opisanych tu polipeptydów.

Opisane polipeptydy można otrzymać poprzez ekspresję w komórce gospodarza sekwencji nukleotydowej, którą opisano powyżej, włączonej bądź nie do rekombinowanego DNA, przy zastosowaniu technik znanych fachowcom lub kombinacji tych technik.

W szczególności, opisane tu sekwencje nukleotydowe mogą stanowić część wektora stosowanego do wprowadzenia in vivo, ex vivo i/lub in vitro ekspresji zastrzeżonych polipeptydów. Zastosowany wektor może mieć różne pochodzenia stąd zdolny jest do transformowania komórek zwierzęcych, z preferencją dla ludzkich komórek nerwowych. Dotyczy to wektorów wirusowych, niewirusowych lub wektora plazmidowego. W szczególnym wykonaniu, zastosować można wektor wirusowy, który może być otrzymany z adenowirusa, retrovirusa, wirusa związanego z adenowirusem (adenowirusopochodnego)(AAV), wirusa herpesowego, wirusa cytomegalii (CMV), wirusa krowianki, itd. Wektory otrzymane z adenowirusa, retrowirusa, zostały opisane w literaturze [Akli i wsp. Nature Genetics 3 (1993) 224, Stratford-Perricaudet i wsp. Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero i wsp. Gene 101 (1991) 195, Le Gal la Salle i wsp. Science 259 (1993) 988, Roemer ei Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211, Dobson i wsp. Neuron 5 (1990) 353, Chiocca i wsp., New Biol. 2 (1990) 739, Miyanohara i wsp. New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18088].

Sekwencja nukleotydowa, opisana wcześniej i kodująca opisany tu polipeptyd może być zawarta i włączona do genomu dowolnych rekombinowanych wirusów.

Dogodnie taki wirus rekombinowany jest wirusem defektywnym. Określenie „wirus defektywny” oznacza wirusa niezdolnego do replikacji w komórce docelowej. Ogólnie, genom wirusa defektywnego zastosowanego w ramach niniejszego wynalazku jest zatem pozbawiony co najmniej sekwencji niezbędnych dla replikacji wspomnianego wirusa w zakażonej komórce. Regiony te mogą być wyelimiPL 198 079 B1 nowane (całość lub część), stawać się niefunkcjonalne, być podstawione innymi sekwencjami a zwł aszcza opisanym kwasem nukleinowym. Dogodnie, wirus defektywny zachowuje sekwencje swojego genomu, które są niezbędne do enkapsydacji cząstek wirusa.

W szczególności zalecane jest zastosowanie sekwencji nukleotydowych tu opisanych w formie zinkorporowanej do rekombinowanego, defektywnego adenowirusa, AVV lub retrowirusa. W zalecanym sposobie wykonania można stosować adenowirusa.

Istnieje szereg różnych serotypów adenowirusa, zatem ich struktura i właściwości różnią się nieco. Spośród tych serotypów zalecanych jest wykorzystanie ludzkich adenowirusów typu 2 lub 5 (Ad 2 lub Ad 5) bądź adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (patrz publikacja W094/26914). Spośród adenowirusów pochodzenia zwierzęcego można wymienić adenowirusy pochodzenia psiego, bydlęcego, mysiego (przykład: Mavl, Beard i wsp. Virology 75 (1990) 81), owczego, świńskiego, ptasiego lub również małpiego (przykład: SAV). Dogodnie, adenowirus pochodzenia zwierzęcego jest psim adenowirusem, w szczególności adenowirusem CAV2 [na przykład szczep manhattan lub A26/61 (ATCC YR-800)]. Dogodnie, wykorzystuje się w ramach niniejszego wynalazku adenowirusy pochodzenia ludzkiego, psiego lub mieszanego. W szczególności, w genomie adenowirusów co najmniej region E1 jest niefunkcjonalny. Rozważany gen wirusowy może być utrzymany jako niefunkcjonalny dowolnymi technikami znanymi fachowcom, a zwłaszcza poprzez całkowitą supresję, substytucję, delecję częściową lub addycję jednej lub licznych zasad w rozważanych genach. Inne regiony mogą również ulec modyfikacji, a zwłaszcza region E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) i L5 (W095/02697). Zgodnie z zalecanym sposobem, adenowirus może zawierać delecję w regionach E1 i E4. W innym zalecanym sposobie wykonania może zawierać delecję w regionie E1 do którego wstawiono region E4 i sekwencje kodującą. W opisanych tu wirusach, delecja w regionie E1 dogodnie dotyczy nukleotydów 455 do 3329 w sekwencji adenowirusa Ad5. W innym zalecanym wykonaniu, egzogenną sekwencję kwasu nukleinowego można wstawić w regionie delecji w regionie E1.

Rekombinowane wirusy defektywne mogą być przygotowane poprzez rekombinację homologiczną pomiędzy wirusem defektywnym i plazmidem niosącym między innymi sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej (Levrero i wsp. Gene 101 (1991) 195, Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Do rekombinacji homologicznej dochodzi po kotransfekcji wirusa i plazmidu w odpowiedniej linii komórkowej. Linia komórkowa powinna być dogodnie: (i) transformowana wspomnianymi elementami, i (ii), nieść ze sobą sekwencje zdolne do komplementacji części wirusa defektywnego, dogodnie w formie zintegrowanej dla uniknięcia ryzyka zwią zanego z rekombinacją. Tytułem przykładowej linii wykorzystywanej do przygotowania rekombinowanych defektywnych adenowirusów można wspomnieć ludzką linię zarodkową komórek nerki 293 (Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), która zawiera w szczególności zintegrowaną do genomu lewą część genomu adenowirusa Ad5 (12 %). Tytułem przykładu linii stosowanej do przygotowania rekombinowanych defektywnych retrowirusów można wspomnieć linię CRIP (Danos ei Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Następnie, wirusy ulegające powieleniu, są odzyskiwane i oczyszczane klasycznymi technikami biologii molekularnej.

Opisane rekombinowane wirusy defektywne mogą zawierając heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą opisany polipeptyd.

Zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać przeciwciała lub fragmenty przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych, metodami znanymi fachowcom. W szczególności przeciwciała mogą być wytwarzane przez immunizację zwierzęcia polipeptydem, którego sekwencja została wybrana spośród sekwencji SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 lub oznaczonymi fragmentami sekwencji SEQ ID nr 3, a następnie pobranie krwi i izolację przeciwciał. Te przeciwciała mogą być również wytworzone poprzez przygotowanie hybrydom technikami znanymi fachowcom. Takie przeciwciała lub fragmenty przeciwciał mogą być zastosowane zwłaszcza do co najmniej częściowego zahamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego.

Sposób według wynalazku może być stosowany jako test przesiewowy dla cząsteczek w celu zidentyfikowania związków hamujących oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym.

Test opiera się na wykryciu zahamowania ogólnego sposobu oddziaływania pomiędzy presenilinami (1 lub 2 ) a APP lub peptydem Ae i szczególnego sposobu oddziaływania pomiędzy peptydem

Ae_1-42 i N-końcem PS2. Dokładniej, z użyciem markerów białkowych związanych z presenilinami lub ich fragmentami i odpowiednim systemom wykrywania, w szczególności immunoprecypitacji, zasto8

PL 198 079 B1 sowaniu chromoforów lub fluoroforów, możliwym jest wykrycie zahamowania oddziaływania pomiędzy wspomnianymi wcześniej białkami lub ich fragmentami. Taki sposób składa się zatem z co najmniej jednego etapu znakowania presenilin i/lub APP, bądź ich fragmentów i etapu detekcji zahamowania interakcji albo pomiędzy peptydem Άβ_1-42 i N-końcem presenilin, a korzystnie PS2, albo pomiędzy całkowitym białkiem APP i presenilinami.

W jednym z wykonań sposobu według wynalazku, wykrycie i/lub identyfikację takich związków dokonuje się w następujących etapach:

- peptyd Άβ_1-42 jest najpierw absorbowany na błonie nitrocelulozowej poprzez inkubację

- ekstrakt bakteryjny zawierający całość lub część pre-seniliny (PS1 lub PS2), a korzystnie N-koniec, jest następnie dodawany i inkubowany z cząsteczką lub mieszaniną zawierającą różne cząsteczki testowane

- po przemyciach, wykrywane jest oddziaływanie presenilin z peptydem Άβ_1-42 na filtrze nitrocelulozowym przy pomocy markerów białkowych presenilin. Poszukiwane cząsteczki hamują oddziaływanie i zmniejszają tym samym intensywność sygnału markerów białkowych

Zalecane markery białkowe są to a) białko fuzyjne z S-tag, skoniugowane z fosfatazą alkaliczną lub fluoroforem, lub b) przeciwciała anty-PSNT, to znaczy wzbudzone przeciwko N-końcowi preseniliny.

W innym wykonaniu sposobu według wynalazku, poszukiwanie nowych związków przeprowadza się dogodnie wg następującej procedury:

- peptyd Άβ_1-42 jest wcześniej inkubowany na płytkach zawierających dołki (format 96-dołkowych lub większy)

- dodawany jest następnie, w celu inkubacji, N-koniec oczyszczonej rekombinowanej preseniliny z cząsteczką lub mieszanina zawierającą różne cząsteczki do testowania

- po przemyciach, wykrywane jest oddziaływanie presenilin z peptydem Άβ_1-42 na płytce przy pomocy markerów białkowych presenilin. Utrata oddziaływania pomiędzy presenilinami i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego jest wykrywana spektrofotometrycznie.

W szczególnym przypadku stosowania w roli markera białkowego białka fuzyjne z S-tag skoniugowanego z fosfatazą alkaliczna, po wywołaniu z kalorymetrycznym substratem, sygnał jest wykrywany przy 450 nm.

W zalecanym wykonaniu sposobu według wynalazku, wykrycie i/lub izolacja związków zdolnych do co najmniej częściowego modyfikowania lub hamowania oddziaływania ogólnie pomiędzy preseniliną 1 lub 2 i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym, zaś w szczególnym przypadku pomiędzy peptydem Aβ_1-42 i N-końcem PS2 dokonywane jest zgodnie z następującymi etapami:

- kontaktuje się cząsteczkę lub mieszaninę zawierającą różne cząsteczki z zsyntetyzowanym peptydem Aβ_1-42 z biotyną i „ramieniem” z 3 β-alanin (lub 3 lizyn) na jego N-końcu (powyżej pozycji 1).

- tę mieszaninę reakcyjną inkubuje się z oczyszczonym i wyznakowanym przy pomocy pierwszego fluoroforu N-końcem preseniliny. Korzystnie, fluoroforem jest kryptat Europium.

- dodaje się jest streptawidynę (która wiąże się z biotyną peptydu biot-Άβι^) skoniugowaną z drugim fluoroforem, zdolnym do wzbudzenia przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu tak, aby wykorzystywał przeniesienie fluorescencji jeśli te dwa fluorofory znajdą się w bliskiej odległości.

- wykrywa się nowe związki hamujące oddziaływania fluorometrycznie przy długości emisji pierwszego fluoroforu i/lub zmniejszenie sygnału przy długości fali emisji drugiego fluoroforu.

W szczególnym wykonaniu, jako drugi fluorofor stosuje się XL665, będący sieciowaną allofikocyjaniną w celu zwiększenia fluorescencji przy 665 nm (CisBiointernational). Utrata oddziaływania jest zatem wykrywana fluorometrycznie przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu i poprzez zmniejszenie sygnału XL665, którego długość fali emisji wynosi 665 nm.

Sposób jest całkowicie zalecany ponieważ pozwala na bezpośrednie wykrycie oddziaływania pomiędzy presenilinami i APP i/lub peptydem Aβ w fazie wodnej i homogennej a w konsekwencji prowadzi do wykrycia cząsteczek hamujących wspomniane oddziaływanie. W istocie, sposób ten opiera się na przeniesieniu fluorescencji pomiędzy dwoma fluoroforami jeśli znajdą się one w bliskiej odległości fizycznej (a zatem w przypadku oddziaływania pomiędzy Aβ_1-42 i rekombinowanym białkiem). Zgodnie z zalecanym wariantem sposobu, pierwszym fluoroforem jest kryptat Europium, niesiony przez znakowane białko rekombinowane (wzbudzenie przy 337 nm) reagujący za streptawidynąXL665 związaną z peptydem biot- Λβ, a w szczególności peptydem biot- Ap_1-42. Dogodnie, znakowane białko stanowi N-koniec jednej lub drugiej preseniliny (PSNT-K). Utrata fluorescencji przy 665 nm i wzrost fluorescencji przy 620 nm, charakterystyczny dla kryptatu Europium wskazuje na zahamowaPL 198 079 B1 nie oddziaływania pomiędzy presenilinami lub ich N-końcami i APP i/lub peptydem Aβ przez badane cząsteczki.

W wariancie tego sposobu, cząsteczka lub mieszanina zawierająca różne cząsteczki może najpierw osiągnąć kontakt z N-końcem oczyszczonej, wyznakowanej przy pomocy kryptatu Europium (PSNT-K) preseniliny, następnie peptydem Aβ_1-40 lub Aβ_1-42 niosącym biotynę i „ramię” 3β-alanin (lub 3 lizyn) na ich N-końcu. Wykrycie nowych cząsteczek zdolnych do co najmniej częściowego modyfikowania lub hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną 1 lub preseniliną 2 i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego będzie również wykonane po dodaniu streptawidyny znakowanej XL665, spektrofluorometrycznie zgodnie z poprzedzającym sposobem, w szczególności poprzez odczytanie fluorescencji przy 665 nm.

Zgodnie z ostatnim wykonaniem sposób wykrywania związków hamujących oddziaływanie ogólnie pomiędzy presenilinami (1 lub 2) i APP lub peptydem Aβ a zwłaszcza pomiędzy peptydem Aβ_1-42 i N-końcem PS2 składa się z następujących etapów:

- doprowadza się do kontaktu mieszaninę a) lizatów komórkowych zawierających całość lub cześć presenilin (PS1 lub PS2) a korzystnie N-koniec, b) lizatów komórkowych zawierających APP, lizatów otrzymanych wychodząc z komórek zakażonych wirusem a w szczególności przez bakulowirusa i c) cząsteczki lub mieszaniny zawierającej różne testowane cząsteczki.

- dokonuje się koimmunoprecypitacji przy pomocy odpowiednich przeciwciał, dobrze znanych fachowcom (rozpuszczalnych białek, odpowiadających presenilinom lub APP lub peptydowi Aβ)

- utrata koimmunoprecypitacji presenilin i APP jest wykrywana testem hybrydyzacji typu Western ze znakowanymi przeciwciałami wskazującymi, na to, że badane cząsteczki mają poszukiwane zdolności hamowania.

W szczególnym wykonaniu, opisane sposoby według wynalazku są adaptowane do wykrywania i/lub izolacji ligandów, agonistów lub antagonistów oddziaływania pomiędzy presenilinami i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego.

Opisane tu polipeptydy mogą być zastosowane do wykrywa-nią ligandów polipeptydów, ale przede wszystkim ligandów presenilin, prekursora peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego, a w szczególności peptydu Aβ_1-42 i/lub N-końca PS2, tak aby związki były zdolne do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy presenilina i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym.

Ligand lub modulator zidentyfikowany i /lub otrzymany zgodnie z opisanymi tu sposobami może być zastosowany jako produkt medyczny. Ligandy lub modulatory, ze względu na ich zdolność do wpływania na poziomie oddziaływania pomiędzy presenilinami i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu β-amyloidowego, mogą zatem modulować produkcję peptydu amyloidowego Aβ_1-42 i pozwalać na leczenie pewnych dolegliwości neurologicznych, a zwłaszcza choroby Alzheimera.

Inne sposoby według wynalazku mogą być zastosowane w teście oddziaływania pomiędzy preseniliną i prekursorem peptydu β-amyloidowego lub peptydem β-amyloidowym, a zwłaszcza pomiędzy peptydem Aβ_1-42 i N-końcem PS2, składającym się co najmniej z jednego etapu przeniesienia fluorescencji pomiędzy dwoma fluoroforami związanymi z poprzedzającymi cząsteczkami i etapu wykrywania oddziaływania, przez pomiar spektrofluorormetryczny. Jak wcześniej wspomniano, test ten może być również wykorzystywany do wykrywania cząsteczek hamujących wspomniane oddziaływanie, zgodnie z opisem sposobu detekcji zahamowania oddziaływania.

Opisane polipeptydy mogą być zawarte w kompozycji farmaceutycznej jako czynnik aktywny.

Takie kompozycje mogą zawierać jako aktywny składnik co najmniej przeciwciało lub fragment przeciwciała, które tu opisano, i/lub antysensowne oligonukleotydy, i/lub opisany tu ligand, lub co najmniej jedną sekwencję nukleotydową.

W opisanych kompozycjach farmaceutycznych opisane powyżej peptydy, przeciwciała, ligandy i sekwencje nukleotydowe mogą być połączone ze sobą lub z innymi składnikami aktywnymi.

Opisane sekwencje nukleotydowe mogą być włączone do re-kombinowanego wektora wirusowego lub niewirusowego, stanowiącego składnik kompozycji.

Opisane kompozycje farmaceutyczne mogą być zastosowane do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym. W szczególności dotyczy to kompozycji farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, na przykład choroby Alzheimera.

Opisane tu polipeptydy mogą być zastosowane do co najmniej częściowego zahamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną i prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydu

PL 198 079 B1 p-amyloidowego oraz zastosowań sposobu wykorzystania tych polipeptydów do wykorzystania do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, a zwłaszcza choroby Alzheimera.

Do opisanego zastosowania zalecane jest aby polipeptydy lub cząsteczka zdolna do co najmniej częściowego zahamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną i prekursorem peptydu p-amyloidowego i/lub peptydu p-amyloidowego, odpowiadające sekwencje kwasu nukleinowego lub ewentualnie opisane wektory, były związane z jednym lub wieloma dopuszczalnymi nośnikami farmaceutycznymi do podawania drogą doustną, dootrzewnową, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, dooczną, przez-skórną itd. Dogodnie, są one stosowane w formie doustnej. Przewidywana jest jednak również forma do wstrzykiwań a w szczególności może być w izolowanych sterylnych roztworach soli fizjologicznej (fosforan monosodowy, disodowy, chlorek sodu, potasu, wapnia lub magnezu, itd., lub mieszaniny tych soli), lub suche kompozycje a zwłaszcza liofilizowane, które po dodaniu, w zależności od sytuacji, sterylnej wody lub soli fizjologicznej umożliwiają powstanie roztworów do wstrzykiwania.

Dawki wektora, a zwłaszcza wirusa stosowanego do podawania, mogą być dostosowane w zależności od innych parametrów, a w szczególności w zależności od rozważanego miejsca podania (narząd, tkanka nerwowa lub mięśniowa), ilości zastrzyków, mającego ulec ekspresji genu, lub również długości badanego leczenia. W zakresie ogólnym, rekombinowane opisane adenowirusy są formułowane i podawane w formie dawek zawierających pomiędzy 10⁴ a 10¹⁴ pfu, a dogodnie 10⁶ do 10¹⁰ pfu. Termin pfu (plaque forming unit) odpowiada mocy infekcyjnej roztworu wirusa i jest definiowany poprzez zakażenie odpowiedniej kultury komórkowej, i pomiar, generalnie po 15 dniach, liczby łysinek zainfekowanych komórek. Techniki określenia miana pfu roztworu wirusa są dobrze udokumentowane w literaturze.

Opisane rozwiązanie oferuje efektywny środek do leczenia chorób, w których istotne jest oddziaływanie pomiędzy preseniliną i prekursorem peptydu p-amyloidowego i/lub peptydu p-amyloidowego, a w szczególności do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, a zwłaszcza choroby Alzheimera.

Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo przedstawiony przy pomocy poniższych przykładów, które mają na celu zilustrowanie wynalazku a nie jego ograniczenie.

Lista figur

Figura 1: A)Schemat skróconych konstruktów PS2

B)Ekspresja w komórkach COS 1

Figura 2: Oddziaływanie form skróconych PS2 z APP

Figura 3: A)Oddziaływanie wydzielanego N-końca PS2 (SecPS2NT), ale nie jego formy cytoplazmatycznej (myc-PS2NT) i zewnątrzkomórkowego APP.

B) Wykrywanie oddziaływania dla SecPS2NT /APP, ale nie dla PS2NT /APP w środowisku zewnątrzkomórkowym.

Figura 4: Oddziaływanie PS2 ze skróconymi formami APP :

A) Oddziaływanie PS2 z forma SPA4CT APP ale nie z domeną cytoplazmatyczną APP (MC45F).

B) Oddziaływanie PS2 z formą C100 APP

Figura 5: Oddziaływanie PS1 i PS1DC2 z APP i jej krótkimi formami:

A) Oddziaływanie PS1 z formą całościową APP i forma skróconą SPA4CT

B) Oddziaływanie formy skróconej (PS1 ΔC2) z APP

Figura 6: Oddziaływanie PS1 i APP w komórkach owadzich.

A) Immunoprecypitaty antyhistydyna (znacznik dla PS1), wykrywanie APP

B) Immunoprecypitaty anty-PSl, wykrywanie APP

C) Odwrócone immunoprecypitaty anty-APP, wykrywanie PS1.

Figura 7: Oddziaływanie formy wydzielniczej PS2NT z peptydem Ap w środowisku zewnątrzkomórkowym.

Figura 8: Rekonstytucja oddziaływania Ap/PS2Nt in vitro na filtrze nitrocellulozowym

A) Zależność od dawki w funkcji stężenia PS2Nt

B) Zależność od dawki w funkcji stężenia Ap.

Figura 9: Oddziaływanie in vitro kompletnych form PS1 i APP.

A) Immunoprecypitaty anty-Histydyna

B) Immunoprecypitaty anty-PSl

PL 198 079 B1

Figura 10: Zastąpienie N-końca PS2 poprzedzonego peptydem sygnałowym (SecPS2NT) w interakcji pomiędzy PS1 i fragmentem SPA4CT

Figura 11: Oddziaływanie PS2 NT z peptydem Aβ_1-42 in vitro: wykrywanie testem na 96dołkowych płytkach (ELISA)

Figura 12: Oddziaływanie PS2NT z peptydem Aβ_1-42 in vitro: wykrywane testem transferu fluorescencji HTRF (homogenous time-resolved fluorescence).

Figura 13: Blokada interakcji APP/PS1 z SecPS2NT prowadzi do zahamowania produkcji wewnątrzkomórkowego peptydu amyloidowego Aβ_1-42

A) Wykrywanie, że blokada oddziaływania APP/PS1 z SecPS2NT prowadzi do zahamowania produkcji wewnątrzkomórkowego peptydu amyloidowego Άβ^.

B) Kontrola, że ekspresja SecPS2NT nie ma wpływu na ekspresję różnych transgenów

Figura 14: Wykrywanie interakcji PS2 z endogennym APP komórek COS przy pomocy traktowania farmakologicznego laktocystyną

Figura 15: Oddziaływanie PS2 i PS2 NT z drugim regionem APP, różnym od peptydu Άβ.

Materiały i metody A) Materiały

1. Konstrukty z ekspresją presenilin

Otrzymywanie wektora ekspresyjnego (wektor gospodarza, pcDNA3, InVitrogen) w komórkach ssaczych dla białek ludzkich PS1 i PS2 zostało wcześniej opisane (Pradier i wsp., 1996). Wytworzono szereg następujących po sobie mutacji na C-końcu (patrz fig. 1A). Numeracje rozpoczęto od kodonu inicjacyjnego PS2 jako pozycji 1.

Fragment restrykcyjny HindIII wektora PS2 (od 5' niekodującego kodonu, pozycja -55 do miejsca wewnętrznego w pozycji 1080) został oczyszczony i poddany ligacji z linearyzowanym HindIII wektorem pcDNAS, a następnie traktowany fosfatazą alkaliczną. Wyprodukowano również skrócony PS2 (PS2ΔC1) składający się z N-końca do reszty 361 plus 7 reszt z 3' końca, który zawiera zatem 6 pierwszych domen transbłonowych i dużą część pętli hydrofilowej (fig. 1A).

PS2ΔC2 został skonstruowany poprzez trawienie plazmidu PS2 z użyciem Pstl (miejsce wewnętrzne w pozycji 679) i ligoacją z fragmentem Pstl odpowiadającym niekodującej 3' części wektora PS2. Skrócone białko PS2ΔC2 zawarte pomiędzy resztą 1 a 228 plus 18 dodatkowych reszt niesionych na 3' końcu. Zawiera ono cztery pierwsze domeny transbłonowe PS2.

Podobny konstrukt wykonano dla PS2 niosącego mutację N141I, PS2ΔC2*.

Fragment restrykcyjny Hindlll (-55)/MscI(590) konstruktu PS2ΔC2 został następnie sklonowany do wektora pcDNA3 traktowanego HindIII, i którego koniec ApaI zakotwiczono na tempo. Konstrukt PS2ΔC3 obejmuje N-koniec do reszty 198 plus 2 dodatkowe reszty zawierające trzy pierwsze domeny trans-membranowe PS2.

Fragment restrykcyjny PS2ΔC2, Hindlll (-55)/Ncol (504) z tępymi końcami Ncol poprzez traktowanie fragmentem Klenowa polimerazy DNA został powtórnie umiejscowiony w tym samym wektorze pcDNAS HindIII/(ApaI tępy koniec) dla konstrukcji PS2ΔC4 obejmującej aż do reszty 168 PS2 plus 3 reszty dodatkowe.

Konstrukt hydrofilowego N-końca PS2 został otrzymany poprzez powielenie sekwencji PS2 za pomocą oligonukleotydów ext5':

5' -CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC-3' (SEQ ID nr 4) (zaznaczając pogrubionym drukiem inicjacyjny ATG oraz wprowadzając miejsce restrykcyjne EcoRI, podkreślone) i ext3':

5'-CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG-3' (SEQ ID nr 5) (wprowadzając kodon stop po reszcie 90 PS2, jak również miejsce restrykcyjne Xhol, podkreślone).

Po klonowaniu do wektora pCRII metodą klonowania TA cloning (InVitrogen), zgodność fragmentu z PGR została potwierdzona poprzez sekwencjonowanie. Ten fragment (EcoRI/XhoI) został następnie wprowadzony do wektora pcDNAS w ramce odczytu sekwencji odpowiadającej epitopowi myc na jego N-końcu: mycPS2Nter.

Aby nie zmienić topologii PS2, taki sam fragment Nter został wprowadzony do wektora pSectagB, w ramce odczytu peptydu sygnałowego IgkB dla pokierowania sekrecją białka pS2Nter.

C-koniec PS2 został skonstruowany przy pomocy fragmentu restrykcyjnego HindIII (1080)/Pstl (niekodujący koniec 3') subklonowany w wektorze pSecTagB HindIII/Pstl, SecPS2Cter zawierającym reszty od 361 do C-końca lub w wektorze pcDNA-Smyc w fazie z epitopem myc.

PL 198 079 B1

Podobnie otrzymano skrócony konstrukt PS1. Wektor pcD-NA3-PS1 został strawiony PflmI (miejsce w pozycji 636 sekwencji kodującej PS1) i Xhol na niekodującym końcu 3' sekwencji PS1. Miejsca te zostały przekształcone do tępych końców przy użyciu polimerazy T4 DNA. Fragment wektora, po oczyszczeniu na żelu agarozowym, został ponownie zligowany z samym sobą w celu otrzymania wektora ekspresyjnego skróconej PS1 zawierającej N-koniec PS1 aż do reszty Ile213 (za piątą domeną transbłonową) plus 12 reszt dodatkowych. Konstrukt ten odpowiada chimerze. ΔC2 i jest nazwany PS1 ΔC2.

2. Konstrukty z ekspresją APP

2.1. Konstrukty APP

Różne konstrukty całego APP (izoforma 695) i SPA4CT (100 ostatnich reszt APP (aminokwasy od 597 do 695) poprzedzających peptyd sygnałowy insercji do błony) zostały uprzednio opisane (Dyrks i wsp. 1993). Wektory do ekspresji C100 i domeny cytoplazmatycznej APP, zostały otrzymane według następującego sposobu: odpowiednie cDNA zostało otrzymane poprzez enzymatyczną amplifikację DNA (PCR (Polymerase Chain Reaction)) stosując następujące oligonukleotydy jako syntetyczne startery:

Dla C100 : oligonukleotydy 8172 i 8181, dla domeny cytoplazmatycznej APP: oligonukleotydy 8171 i 8181.

Oligo 8172 5' CAAAGATCTGATGCAGAATTCCGACAT 3'(SEQ ID nr 6) zawierający:

- miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BglII (podkreślone)

- sekwencję kodującą aminokwasy 597-602 APP (pogrubione) [numeracja APP o 695 aminokwasach]

Oligo 8181 5' caagcggccgctcatcccttgtcatcgtcgtccttgtagtctccgttctgcatctgctc 3' (SEQ ID nr 7) zawierający :

- miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Notl (podkreślone)

- sekwencję komplementarną do sekwencji kodującej aminokwasy 691-695 FAPP (pogrubione) [numeracja APP od 695 aminokwasów]

-sekwencję komplementarną do sekwencji Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys odpowiadającą epitopowi FLAG (kursywą).

Oligo 8171 5'CAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC 3'(SEQ ID nr 8), zawierająca :

- miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BglII (podkreślone)

- sekwencję kodującą aminokwasy 650-655 FAPP (pogrubione) [numeracja APP od 695 aminokwasów]

Produkty amplifikacji enzymatycznej DNA zostały wklonowane do wektora pCRII. Sekwencja nukleotydowa została potwierdzona metodą specyficznych końców DNA.

cDNA są następnie wprowadzane przez ligację do plazmidu ekspresyjnego otrzymanego z plazmidu pSV2 i zawierającego w tej samej ramce odczytu, epitop MYC.

2.2. Konstrukcja rozpuszczalnych form APP: α-sAPP i β-sAPP.

cDNA odpowiadające wydzielniczym formom APP kończące się w miejscach cięcia α- i β- zostały otrzymane przy pomocy PCR.

Oligonukleotyd 1:

5'-ccatcgatggctaCATCTTCACTTCAGAG-3' (SEQ ID nr 9) wprowadzający:

- kodon stop (podkreślona komplementarna sekwencja odwrócona) za pozycją 1788 APP odpowiadającą miejscu cięcia β.

-i miejsce restrykcyjne ClaI.

Oligonukleotyd 2:

5'-ccatcgatggctaTTTTTGATGATGAACTTC-3' (SEQ ID nr 10) wprowadzająca:

- kodon stop (podkreślona odwrócona sekwencja komplementarna) za pozycją 1836 APP odpowiadającą miejscu cięcia α.

- i miejsce restrykcyjne ClaI.

Oligonukleotyd 3:

5'-CCGTGGAGCTCCTCCCG-3'(SEQ ID nr 11), wspólny dla obu form, odpowiadający obszarowi 1583 do 1600 APP zawierającemu wewnętrzne miejsce restrykcyjne APP SacI (podkreślone).

cDNA APP zostało zamplifikowane PCR-em przy użyciu par oligonokleotydów oligo3-oligo1 i oligo3-oligo2 dla β-sAPP i α-sAPP odpowiednio. Produkty amplifikacji zostały subklonowane jak poprzednio do pCRII a sekwencje zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Dla każdej sekwencji, fragment restrykcyjny SacI-Clal został oczyszczony i ponownie sklonowany do wektora ekspresyjnego

PL 198 079 B1

APP (patrz powyżej), również strawionego SacI-Clal dla zastąpienia części C-końcowej APP przez fragmenty C-końcowe p-sAPP i α-sAPP, odpowiednio i odtworzenia kompletnego białka.

3. Konstrukty bakulowirusowe.

Otrzymano bakulowirusowy wektor transferowy kodujący ludzkie białko PS1 wychodząc od wektora ekspresyjnego dla komórek ludzkich (Pradier i wsp., 1996). cDNA kodujące białko PS1 zostało wyizolowane poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi Xhol i Notl, następnie sklonowane do plazmidu transferowego pAcHTLB (białko fuzyjne z 6 histydynami) i pAcSG2 (białko natywne). Rekombinanty bakulowirusowe zostały otrzymane według protokołu producenta (Pharmingen), który składał się z kotransfekcji 2x10⁶ komórek owadzich (sf9) 1 μg plazmidu transferowego zawierającego pożądany gen oraz 0,5 μg DNA wirusowego (Baculogold). Po 5 dniach w 27°C, komórki zdrapywano, następnie wirowano a supernatant używano jako wyjściowej zawiesiny wirusa do powielania i określenia miana wirusa; ekspresja białka jest wykrywana testem hybrydyzacji typu western na osadzie komórkowym.

Otrzymywanie bakulowirusa produkującego ludzką APP (695) zostało wcześniej opisane (Essalmani i wsp., 1996).

Dla zbadania ekspresji PS1 i APP komórki sf9 były koinfekowane przy M.O.I. wynoszącej 2 bakulowirusami z ekspresją ludzkiej APP (695), białka ludzkiej preseniliny 1 (PS1), lub PS1 z końcem 6 histydyn na N-końcu (6HisPSl), lub białkiem kontrolnym z Pseudomas putrida XylE mającym koniec 6 histydyn na N-końcu (6HisXylE), a następnie rozpuszczane buforem 10 mM Tris, 130 mM NaCl, 1% Triton X100, 1% NP40, pH 7.5.

Rozpuszczone białka są immunoprecypitowane przeciwciałem antyhistydyna (A), anty-PS1 (1805) (B), lub antyAPP (22C11) (C). Obecność APP lub PS1 jest wykrywana testem hybrydyzacji typu Western z przeciwciałami antyAPP aCT43(A), 22C1 1(B), lub przeciwciałem antyPSl 95/23(C).

Rozpuszczalne frakcje zawierające APP, PS1 lub 6HisPS1 są mieszane, a następnie immunoprecypitowane w obecności przeciwciał antyhistydynowych lub antyPS1 przez noc w 4°C. Koimmunoprecypitacja APP jest wykrywana po wykonaniu testu western błot z użyciem przeciwciał aCT43 lub 22C11.

4. Plazmidy

W wynalazku zastosowano następujące plazmidy:

- pcDNA jest plazmidem komercyjnym (InVitrogen) użytym do klonowania i ekspresji w komórkach ssaczych sekwencji PS1 i PS2 oraz ich form skróconych.

- pCRII jest plazmidem komercyjnym (InVitrogen), użytym do klonowania fragmentów z PCRu

- pSecTagB jest plazmidem komercyjnym (InVitrogen), użytym do klonowania i ekspresji w komórkach ssaczych cDNA, v do którego dodano sekwencje sygnałowe wydzielania (peptyd sygnałowy Ig K).

- pSV2 jest plazmidem komercyjnym (Pharmingen), użytym do klonowania i ekspresji cDNA w komórkach ssaczych.

- pAcHTLB jest plazmidem komercyjnym (Pharmingen), do insercji epitopu (His)6 w cDNA i rekombinacji homologicznej z bakulowirusem.

- pAcSG2 jest plazmidem komercyjnym (Pharmingen), do rekombinacji homologicznej z bakulowirusem.

- pET29a jest plazmidem komercyjnym (Novagene), do ekspresji cDNA w bakteriach.

B) Metody

1. Transfekcja komórek

Metoda opracowana dla komórek COS 1 lub komórek CHO obejmuje zastosowanie lipofektantu w stosunku 1 do 8 (w/w) w odniesieniu do DNA i peptydu syntetycznego H1(sekwencja: KTPKKAKKPKTPKKAKKP) w jednakowym stosunku w celu optymalizacji upakowania DNA i wydajności transformacji. Metoda ta polega na neutralizacji ładunku grup fosforanowych DNA poprzez pozytywne ładunki lipofektantu.

Komórki COS 1 są hodowane w inkubatorze w 37°C, 95% wilgotności i 5% CO2 w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającym 4,5 g/l glukozy (Gibco-BRL), uzupełnionym 3% glutaminy, 1/5 penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy cielęcej.

W przeddzień transfekcji komórki są umieszczane przy gęstości 2,5 10⁶ komórek na 100 mm płytce. W dniu transfekcji komórki są dwukrotnie przemywane PBS (zbuforowna fosforanami sól fizjologiczna) i jeden raz OptiMEM (skład opatentowany; Gibco-BRL) dla zaadaptowania co najmniej przez min. w inkubatorze.

PL 198 079 B1

Na równoważne naczynie 100 mm, dodawane jest w całości 8 μg plazmidowego DNA w 300μl OptiMEM i 64 μg peptydu syntetycznego (H1). Po intensywnym wytrząsaniu przez 10 sekund i odczekaniu 5 minut dodawana jest lipofektamina (32 gl, stanowi 64 μg) rozpuszczona w 300 μl OptiMEM. Całość jest kolejno wytrząsana i pozostawiona na 30 minut. Dodawane jest pięć mililitrów OptiMEM na probówkę i wytrząsana mieszanina jest umieszczana na komórkach (z których wcześniej odciągnięto podłoże). Komórki są następnie umieszczane w inkubatorze na 4 godziny, po których mieszanina jest zastępowana podłożem kompletnym.

2. Liza komórek i oznaczanie białek

Komórki są najczęściej lizowane 48 godzin po transfekcji (przy maksymalnym poziomie ekspresji). Bufor lizujący zawiera 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 1% Triton XI 00, 1% NP40 oraz mieszaninę inhibitorów proteaz (Complete^®, Boehringer-Mannheim). Na każdą płytkę, po wypłukaniu PBS, dodawane jest 800 gl zimnego buforu. Lizaty są poddawane sonikacji, po której następuje mieszanie na mieszadle magnetycznym w 4°C przez noc. Osad od supernatantu jest rozdzielany poprzez wirowanie 30 minut przy 15000 rpm. Rozpuszczone białka są następnie oznaczane według zestawu BCA (Pierce) aby móc znormalizować następujące eksperymenty.

2. Immunoprecypitacja

Przeciwciała skierowane przeciwko peptydowi N-końcowemu PS2, 95041, (Blanchard i wsp., 1997) i przeciwko dwudziestu pierwszym aminokwasom PS1 (Duffi wsp., 1996) zostały otrzymane u królika poprzez immunizację syntetycznymi peptydami. Do immunoprecypitacji 100 gg białka rozpuszczono w 400 gl zmodyfikowanego RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.0, 1% Triton X100 obj/obj, 1% NP40 obj/obj). Do trzydziestu mikrolitrów zawiesiny białka A Sepharose (0,1% wag./obj. w roztworze PBS) dodawano 3 (4,1 przeciwciał. Zawiesiny były delikatnie mieszane na wytrząsarce rotacyjnej w 4°C przez noc. Kompleks białko A-Sepharose jest 3 razy przemywany 0,5 ml zmodyfikowanego RIPA i raz 0,5 ml buforu do przemywania „Wash C” (10 mM Tris pH 7,5).

4. Immunotransfer

Próbki (lizaty komórkowe) są denaturowane w jednakowej objętości buforu obciążającego (125 mM Tris pH 6,8, 4% wag./obj. SDS, 20% glicerol, 0,02% bromofenol blue, 50 mM ditiotreitol) w 95°C przez 5 minut. Do analizy ekspresji presenilin, próbki są denaturowane w obecności 8 M mocznika w 37°C w celu uniknięcia właściwej agregacji presenilin w 95°C.

Próbki są nanoszone na żele Tris-Glicyna (Novex), o różnym stężeniu akrylamidu zależnie od rozdzielanych mas cząsteczkowych. Równocześnie nakładany jest marker masy cząsteczkowej (Broad Range, BioRad). Migracja ma miejsce przez około 2 godziny przy stałych 100 Voltach w buforze końcowym 1 X SDS (Novex). Następnie żel jest przenoszony na filtr nitrocelulozowy lub PVDF (bufor końcowy do transferu IX (Novex) z 10% metanolem) przez 2 godzimy przy stałych 150 mA.

Po transferze, filtr jest blokowany przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 50 ml PBS-T (PBS z 0,5% Tween) zawierającym 2% odtłuszczone mleko (Merck). Przeciwciała pierwszorzędowe (rozcieńczone w stężeniu optymalnym w stosunku 1/1000 lub 1/5000, w PBS-T z dodatkiem lub bez 2% odtłuszczonego mleka) są umieszczane przez noc w 4°C. Po krótkim przepłukaniu w PBS-T, filtr jest inkubowany 45 minut w obecności drugorzędowego przeciwciała (anty-mysie lub anty-królicze IgG, w zależności od przypadku, skoniugowane z peroksydazą chrzanową) rozcieńczone 1/5000 w buforze zwanym „ECL (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween ). Filtr jest następnie 4 razy przemywany przez 15 min. w buforze „ECL”.

Filtr może być wywołany odczynnikiem ECL (Amersham), składającym się z dwóch buforów do wymieszania w jednakowej objętości tuż przed użyciem. Stosowane są różne czasy ekspozycji błony fotograficznej (Hyperfilm ECL; Amersham), po których następuje wywołanie.

5. Wiązanie in vitro PS2 NT z peptydem Aβ-amyloidowym.

5.1. Produkcja rekombinowanego białak PS2 NT w bakteriach.

Celem stworzenia bakteryjnego wektora ekspresyjnego PS2NT (aminokwasy 1 do 87), cDNA PS2 zostało zamplifikowane PCR-em z oligonukleotydami

3':(CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG) i

5' (CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC). Powstający fragment został sklonowany do pCRIl a sekwencja potwierdzona. Fragment ten został następnie subklonowany do wektora pET29a (Novagene) w ramce odczytu sekwencji znacznika S-tag. Białko było produkowane w bakteriach BL21 po indukcji IPTG przez 5 godz., bakterie były odzyskiwane przez wirowanie (10 min. przy 6000 obrotów/min.) a osad komórkowy zawieszany w buforze RIPA (objętość wyliczona poprzez pomnożenie OD hodowli po indukcji przez objętość hodowli i podzielona przez 23). Bakterie

PL 198 079 B1 były lizowane poprzez sonikację a lizat wirowany przy 13000 obr./min. przez 20 min. w 4°C. Supernatant (ekstrakt całkowity) został użyty do badania wiązania.

Rekombinowane białko PS2NT zostało również oczyszczone z ekstraktu całkowitego przy użyciu złoża niklowego (znacznik poly-His był w wektorze pET29a) jak opisał producent (Novagene).

5.2. Test wiązania PS2NT/ A042 na błonie nitrocelulozowej

Syntetyczny peptyd Ae (w roztworze) został umieszczony na błonie nitrocelulozowej (Schleicher and Schuell) stosując 96-dołkowy aparat do dot-blotów. Po naniesieniu, filtr był blokowany (wobec niespecyficznych miejsc wiązania białek), przy czym z żelatynowego odczynnika do blokowania (Novagen) 10 razy rozcieńczonym w TBST. Po blokowaniu, filtr był umieszczany na aparacie do dot-blotów a ekstrakt bakteryjny PS2NT dodawany do studzienek i inkubowany przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Jako kontroli użyto w duplikacie ekstraktu bakteryjnego zawierającego pusty plazmid pET29. Filtr był następnie przemywany jednokrotnie buforem RIPA, następnie wyjmowany z aparatu i trzykrotnie przemywany PBST (15 min. na każde płukanie). Detekcja znacznika S-tag była następnie wykonywana jak opisano w protokole producenta (Novagene)z substratem kolorymetrycznym. Ilościowa ocena reakcji kalorymetrycznej (precypitatu) była wykonywana poprzez optyczny skaning filtra i ocenę intensywności w każdej studzience programem Tina 2.1 (Raytest).

5.3. Test oddziaływania PS2NT/ Ae42 w formacie ELISA

Syntetyczny peptyd Ae (1-40 i 1-42) (100 gl, 2 μg/ml) jest inkubowany przez noc na 96-dołkowej płytce celem związania z plastikiem. Płytki są płukane dwa razy PBS a miejsca niespecyficznego wiązania są wysycane przez inkubację 5% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej w PBS. Oczyszczone białko rekombinowane według protokołu opisanego w 5.1), PS2NT, rozpuszczone w buforze (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,5% Triton X-100, 0.5% NP40) jest dodawane i inkubowane przez 4 godz., w temperaturze pokojowej. Po dwóch płukaniach w 0,5% PBS-Tween, białko PS2NT zatrzymane na płytce (przez oddziaływanie z peptydem Ae) jest wykrywane przez inkubację z białkiem wiążącym się z S-Tag skoniugowanym z fosfatazą alkaliczną jak poprzednio. Detekcja sygnału jest dokonywana w spektrofotometrze przy 450 nm.

5.4. Test oddziaływania PS2NT/A61-42 w formacie HTRF (Homo-geneous Time-Resolved Fluorescence).

Oczyszczone białko PS2NT (produkowane według protokołu opisanego w 5.1) zostało wyznakowane przy pomocy fluoroforu kryptatu Europium (PS2NT-K). Peptydy Ae1-40 i Ae1-42 zostały zsyntetyzowane z biotyną i wystającym „ramieniem” z 3 alanin (lub 3 lizyn) na ich N-końcu (powyżej pozycji 1 peptydów Ae) oraz dwoma argininami (R) na ich C-końcu, celem ułatwienia syntezy peptydów biot-3K-Ae40_RR i biot-3K-Ae42_RR.

Reakcja oddziaływania PS2NT-K z biot-Ae40RR lub biot-Ae42RR jest dokonywana w buforze 10 mM HEPES, pH=7,2, zawierającym 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA i 3 mM CHAPS (detergent). Znakowane białko PS2NT (stęż. końcowe 6 nM, stanowiące 40 gl początkowego 15 nM roztworu) jest inkubowane z peptydem biot-Ae40_RR lub biot-Ae42_RR (stęż. końcowe 2 gM, stanowiące 40 gl początkowego 5 gM roztworu i 20 gl buforu) przez 10 min., po którym następuje dodanie streptawidyny znakowanej XL665 (XL665 jest sieciowaną allofikocyjaniną, CisBio International) w stężeniu 8 gg/ml (stanowiące 100 gl początkowego roztworu 16 gg/ml) w buforze 100 mM HEPES pH=7,0 zawierającym 400 mM KF, 133 mM EDTA i 1lg/l BSA. Reakcja jest inkubowana w temperaturze pokojowej przez 4 godz. a płytki są sczytywane przez licznik Packard Discovery mierzący stopień emisji kryptatu Europium przy 620 nm po wzbudzeniu przy 337 nm i druga część emisji XL665 przy 665 nm po przeniesieniu fluorescencji przy 620 nm przez kryptat Europium XL665. Tworzenie kompleksu XL665-streptawidyna/biot-Ae42/PS2NT-kryptat prowadzi do przeniesienia fluorescencji z kryptatu na XL665, która jest mierzona przy 665 nm przez licznik. Przy braku tworzenia się kompleksu XL665-streptawidyna/biot-Ae42/PS2NT-kryptat kryptat Europium fluoryzuje przy 620nm.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Oddziaływanie pomiędzy APP i PS2 oraz mapowanie strefy oddziaływania na PS2.

Przykład ten ma na celu określenie obszaru oddziaływania PS2 oraz wykazanie oddziaływania wspomnianego regionu i APP.

Oddziaływanie pomiędzy białkami APP i PS2 w komórkach ssaczych jest przykładowo przedstawione na fig 2. Lizat komórek COS stransfekowanych PS2 i APP został poddany immunoprecypitacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko N-końcowi PS2 (95041, Blanchard i wsp., 1997). Immunoprecypitat jest następnie analizowany poprzez immunotransfer z przeciwciałami przeciwko APP. APP jest wyraźnie wykrywany w immunoprecypitatach z komórek kotransfekowanych APP i PS2, ale nie przy braku PS2 (fig. 2, ścieżka 6 w stosunku do ścieżki 7) jak opisano poprzednio (We16

PL 198 079 B1 idemann i wsp., 1997). Dla określenia strefy oddziaływania pomiędzy tymi dwoma białkami, skonstruowano liczne formy skrócone PS2. Aby zachować topologię błonową PS2 ogólnie dotyczącą N-końca białek błonowych, wyprodukowano formy stopniowo skracane od C-końca PS2, kończące się za różnymi domenami transbłonowymi TM6 (PS2ΔC1), TM4 (PS2ΔC2), TM3 (PS2ΔC3) i TM2 (PS2ΔC4), schemat na fig. 1A. Hydrofilowy N-koniec (87 reszt) PS2 został również skonstruowany w formie cytoplazmatycznej (sekwencja natywna) lub w formie wydzielniczej poprzez wstawienie peptydu sygnałowego łańcucha Igk. Ekspresja tych różnych form została przykładowo przedstawiona na fig. 1B, i wykryta przy pomocy przeciwciał anty-PS2 (95041). Konstrukty posiadające domeny hydrofobowe stanowiły w większości prążki odpowiadające formom monomerycznym o oczekiwanej masie cząsteczkowej (tworzące w tym przypadku bliskie dublety), formom dimerycznym i agregatom o wysokiej masie cząsteczkowej typowej dla PS2 (fig. 1B, ścieżki 3-5). W szczególności dla kompletnej PS2, wykrywane są na tej figurze jedynie agregaty podczas gdy forma monomeryczna nie jest wykrywana (ścieżka 6). Dwa konstrukty hydrofilowego N-końca PS2: mycPS2NT i SecPS2NT dają prążki o oczekiwanych masach cząsteczkowych (fig. 1B, ścieżki 1 i 2). Konstrukt SecPS2Nt jest również wydzielany do podłoża zewnątrzkomórkowego (fig. 3B, ścieżka 2) podczas gdy konstrukt mycPS2Nt jest cytoplazmatyczny.

Konstrukty zostały pojedynczo kotransfekowane APP. Frakcja lizatów komórkowych rozpuszczalnych w detergencie została koimmunoprecypitowana z przeciwciałami skierowanymi przeciwko N-końcowi PS2 a immunoprecypitaty analizowane na immunoblotach. Podobnie jak całkowita PS2, APP jest wykrywany w immunoprecypitatach ze wszystkimi skróconymi formami PS2, PS2ΔC2 do PS2ΔC4 (fig. 2, ścieżki 3-5) demonstrując oddziaływanie pomiędzy APP i formami zawierającymi N-koniec PS2. To oddziaływanie z APP jest zachowane przy konstrukcji wydzielniczej formy N-końca PS2 (fig. 2, ścieżka 2) demonstrując, że zakotwiczenie PS2Nt w błonie lipidowej nie jest niezbędne dla tego oddziaływania. Przeciwnie, forma cytoplazmatyczna mycPS2NT nie oddziałuje z APP (fig. 2, ścieżka 1).

Doświadczenie z odwróconą immunoprecypitacją przez przeciwciała anty-APP i wykrycie przez przeciwciała N-końca PS2 pozwoliło potwierdzić oddziaływanie pomiędzy APP i SecPS2Nt w różnych warunkach eksperymentalnych.

W podłożu hodowlanym komórek kotransfekowanych APP i SecPS2Nt, oddziaływanie pomiędzy tymi dwoma białkami zostało również wykazane przez koimmunoprecypitację (fig. 3A, ścieżka 4 i fig. 3B, ścieżka 3). Forma mycPS2NT nie oddziałuje z APP w podłożu (fig. 5B, ścieżka 2). Obecność tego oddziaływania w podłożu pokazuje, że kompleks APP/PS2Nt jest relatywnie stabilny w trakcie procedury wydzielania.

P r z y k ł a d 2. Oddziaływanie pomiędzy APP i PS2 oraz mapowanie strefy oddziaływania na APP.

Celem tego przykładu jest określenie obszaru oddziaływania na APP i wykazanie oddziaływania wspomnianego regionu z preseniliną 2.

W tym celu, zastosowano skrócone formy APP celem eliminacji obszaru oddziaływania na APP. Zastosowano konstrukt niosący ostatnie 100 reszt APP pod kontrolą lub nie peptydu wydzielniczego (SPA4CT i e100, Dyrks i wsp.,1993) i konstrukt zawierający jedynie domenę cytoplazmatyczną (ostatnie 45 reszt APP) a ich obecność wykrywano za pomocą przeciwciał skierowanych wobec domeny cytoplazmatycznej APP (aCT43, Stephens i Austen, 1996). W komórkach kotransfekowanych PS2 oddziaływanie SPA4CT, ale nie domeny cytoplazmatycznej APP, z SP2 zostało wykazane (fig. 4A, porównaj ścieżki 4 i 5). Oddziaływanie PS2 z konstruktem C100 (bez sygnału sekrecji) mogło również być wykazane (fig. 4B, ścieżka 7). Również przy połączeniu domeny cytoplazmatycznej APP z błoną w chimerycznym konstrukcie z receptorem alfa IL2, nie obserwowano żadnego oddziaływania z PS2. Przykład ten pokazuje, że istnieje oddziaływanie z SPA4CT (reszty 597 do 695 APP), ale nie z domeną cytoplazmatyczną (reszty 651 do 695) wskazujące zatem, że na APP region Ap (reszty 597 do 637) i pozostałość segmentu transbłonowego (aż do reszty 650) są wystarczające do oddziaływania z PS2.

P r z y k ł a d 3. Oddziaływanie PS2 z APP i początkowe mapowanie

Przykład ten ma na celu określenie obszaru oddziaływania na PS1 i potwierdzenie oddziaływania pomiędzy wspomnianym regionem i APP.

Przez analogię do wyników otrzymanych dla PS2 (przykłady 1 i 2), badanie oddziaływania PS1 z APP zostało wykonane w tym samym systemie komórkowym COS1. Po koimmunoprecypitacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko 20 ostatnim resztom aminokwasowym PS1 (Duffet i wsp.,

1996), w precypitatach można wykryć SPA4CT, C-końcowy fragment APP (fig. 5A, ścieżka 4). APP może również oddziaływać z PS1. Również forma skrócona PS1, PS1 ,-\C2(1-213), oddziałuje z APP

PL 198 079 B1 (fig. 5B. ścieżka 4). Te pierwsze dane pozwalają nam wziąć pod uwagę, że regiony oddziaływania pomiędzy APP i PS1 powinny sąsiadować z tymi poprzednio przedstawionymi dla PS2.

Aby potwierdzić ważność i ogólność oddziaływania PS1/APP, zastosowano inny system komórkowy, w którym komórki owadzie zostały zainfekowane rekombinowanymi bakulowirusami produkującymi PS1, z lub bez znacznika His6 oraz APP (patrz materiały i metody). Badanie lizatów komórkowych umożliwiło wykrycie APP w immunoprecypitatach antyHis6 (dla PS1-His6, fig. 6A, ścieżka 4) lub antyPS1 (dla PS1 z lub bez His6, fig. 6B, ścieżki 4 i 5) podczas gdy komórki są koinfekowane dwoma typami rekombinowanych wirusów, ale nie jeśli jedynie jedno białko jest produkowane (odpowiednio, ścieżki 1, 2 i 3). Przeciwnie, w immunoprecypitatch anty-APP, wykrywane są białka PS1-His6 i PS1 (fig. 6C, ścieżki 4 i 5) w podwójnych zakażeniach. Doświadczenie to pozwoliło potwierdzić oddziaływanie w odwrotnym układzie z innymi przeciwciałami.

P r z y k ł a d 4. Oddziaływanie Aβ i PS2 w komórkach

Biorąc pod uwagę, że obszar oddziaływania pomiędzy APP i PS2 to znaleziony w APP obszar zawierający peptyd amyloidowy (od 595 do 635) a w PS2 jest to jego hydrofilowa domena N-końcowa, wykazano na tym przykładzie, że ostatnia domena bezpośrednio oddziałuje z peptydem amyloidowym ^β) produkowanym przez komórki. Ekspresja SPA4CT (odpowiadającego ostatnim 100 resztom APP poprzedzającym peptyd sygnałowy) w komórkach COS prowadzi do silnej produkcji peptydu amyloidowego, częściowo ponieważ SPA4CT jest uważany za biologiczny prekursor Λβ. Komórki COS zostały stransfekowane jedynie SPA4CT, SPA4CT i SecPS2Nt lub jedynie SecPS2Nt. Odpowiednie środowisko pozakomórkowe uległo immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał anty-PS2 a peptyd Aβ został wykryty dzięki specyficznemu przeciwciału W02 (Nida i wsp. (1996) J. Biol. Chem.271, 22908914) (fig. 7). Peptyd Aβ został zidentyfikowany jedynie dla komórek kotransfekowanych SecPS2Nt i SPA4CT jako prążek o słabej intensywności (fig. 7, ścieżka 1) lecz nie dla indywidualnych kontroli (ścieżki 2 i 3). Ponadto, wykrywany jest również w sposób specyficzny dodatkowy prążek około 40 kDa dla komórek podwójnie stranfekowanych. Po przemyciu filtra i wykryciu przeciwciałami antyPS2, wydaje się, że prążek o podobnej masie cząsteczkowej jest również PS2-immunoreaktywny (fig. 7, ścieżka 4). Prążek ten jest również, jak oczekiwano, obecny w komórkach stransfekowanych SecPS2Nt. Również w komórkach podwójnie stransfekowanych, prążek ten stanowi stabilny w SDS-sie kompleks pomiędzy SecPS2Nt i Λβ, co potwierdza oddziaływanie pomiędzy tymi dwoma cząstkami. Niewielka różnica wykrytej masy peptydu Aβ (4kDa) wyjaśniałaby brak różnicy wykrywanej wielkości komórek transfekowanych jedynie SecPS2Nt. Wyniki tych eksperymentów pozwalają wywnioskować, że forma wydzielnicza PS2 (secPS2Nt) oddziałuje in vitro z peptydem Ap (reszty 597-637 APP695).

P r z y k ł a d 5. Odtworzenie oddziaływania Aβ i PS2Nt w teście in vitro na błonach nitrocelulozowych.

Przykład ten ma na celu pokazanie odtworzenia oddziaływania PS2Nt-APP(Aβ) in vitro.

Aby potwierdzić oddziaływanie pomiędzy peptydem Aβ i PS2Nt (N-koniec PS2), opracowano test wiązania in vitro. Skonstruowano i wyprodukowano w bakteriach białko fuzyjne PS2Nt niosące peptyd znacznikowy/marker S(S-tag) na jego N-końcu. Peptydy Aβ_1-40 ⁱ APl-42 zostały umieszczone na błonach nitrocelulozowych, kolejno inkubowanych w obecności ekstraktów bakterii produkujących białko PS2Nt. S-tag został następnie wykryty reakcją kolorymetryczną poprzez białko wiążące się z S-tag skoniugowane z fosfatazą alkaliczną. Białko S-tag-PS2Nt dobrze się wiąże w tych testach z peptydami Aβ in vitro (fig. 5A). Jako kontrolę inkubowano w duplikacie w obecności ekstraktu bakterii produkujących tylko peptyd S, który zostaje związany z peptydem Aβ (formy 1-40 i 1-42) na poziomie wiązań niespecyficznych. Seryjne rozcieńczenia ekstraktów bakteryjnych pozwoliły ustalić, że wiązanie jest zależne od dawki i wysycalne. W tym eksperymencie wiązanie wydaje się być ważniejsze dla Aβ_1-42 niż dla Aβ_1-40, jednak z pewną zmiennością. Na przykład, wiązanie PS2Nt jest zależne od ilości Aβ nałożonego na błonę, podczas gdy Aβ_1-42 i Aβ_1-40 wykazują jednakowe właściwości wiązania.

Ten przykład wykazuje zatem odtworzenie oddziaływania PS2Nt-APP(A) in vitro pomiędzy syntetycznym Aβ a PS2NT pochodzenia bakteryjnego. Biorąc pod uwagę, że mutacje patologiczne PS2 prowadzą do zwiększenia stosunku Aβ_1-42/Aβ_1-40 produkowanego w licznych systemach oraz że z drugiej strony dochodzi do fizycznego oddziaływania pomiędzy PS2 i APP, wydaje się, że to fizyczne oddziaływanie może brać udział w produkcji peptydu Aβ_1-42. W taki sposób zahamowanie tego oddziaływania stanowi ekstremalnie oryginalne podejście terapeutyczne w chorobie Alzheimera.

P r z y k ł a d 6. Test oddziaływania Aβ 42/PS2NT w formacie 96-dołkowym (typ ELISA). Figura 11.

Przykład 5, dostarcza wyników przedstawiających bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy peptydem Aβ i białkiem PS2NT na błonie nitrocelulozowej. Celem tego przykładu jest potwierdzenie in18

PL 198 079 B1 formacji z przykładu 5 i opisanie wykrywania interakcji w formacie 96-studzienkowej płytki. Peptyd Aβ (AP4O lub Aβ₄2) jest wiązany przez inkubację na 96-dołkowych plastikowych płytkach. Płytki są następnie inkubowane z rekombinowanym białkiem PS2NT. Po przepłukaniach detekcja oddziaływania (AP/PS2NT) odbywa się poprzez wiązanie się w studzienkach białka wiążącego S-tag i wykrywaniu kolorymetrycznym. PS2NT wiąże się w sposób zależny od dawki z peptydem Aβ_1-42 (fig. 11), ale nie z peptydem Aβ_1-40 lub z peptydem o odwróconej sekwencji Aβ_1-40 ani innym peptydem amyloidogennym, amyliną. Ilości peptydów Aβ_1-42 lub Aβ_1-40 związanych na płytkach są identyczne jak potwierdzono przez immunodetekcję). Stała wiązania PS2NT Aβ₄2 wynosi 0,18 μM. Specyficzność PS2NT dla formy Ap₄₂ peptydu w porównaniu do Aβ₄₀ nie była jedynie sugerowana w przykładzie 5. Ten przykład ustanawia tę specyficzność, która jest doskonale powtarzalna w niniejszym teście.

Ten format testu oddziaływania Aβ42/PS2NT pozwala zatem łatwo przetrawić test przesiewowy dla cząsteczek, które hamują to oddziaływanie.

P r z y k ł a d 7. Test interakcji Aβ42/PS2NT w formacie HTRF

W przykładach 5 i 6, bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy peptydem Aβ₄₂ i białkiem PS2NT zostało przedstawione częściowo na błonie nitrocelulozowej a częściowo na płytkach 96-studzienkowych (typu ELISA).

Celem tego przykładu jest potwierdzenie informacji i opisanie wykazywania oddziaływania w fazie wodnej/homogennej przy zastosowaniu techniki przeniesienia fluorescencji.

Zasada testu opisana w Materiałach i metodach (5.4) opiera się na przeniesieniu fluorescencji. Rekombinowane białko PS2NT znakowane kryptatem Europium (PS2NT-K) oddziałuje w peptydem biot- Aβ42 jak to pokazuje figura 12 (prążek N°3). Sygnał ten jest zmniejszony a zatem oddziaływanie PS2NT-K/biot-Aβ42 jest przesunięte przez nadmiar niewyznakowanego PS2NT (IC₅₀=400 nM). Wykrywany sygnał fluorescencji jest stabilny w czasie: od 4 godz. w temperaturze pokojowej do 24 godz. w 4°C (zgodnie z wybranymi warunkami, opisanymi w materiałach i metodach).

To oddziaływanie jest zależne od dawki dla peptydu biot-Aβ42 (strefa liniowości sygnału od 0 do 2,5 μM) i dla PS2NT-K (strefa liniowości sygnału od 0 do 7,5 nM). Jak to pokazano na figurze 12, prążek N°5, nie ma oddziaływania PS2NT-K z peptydem biot-Aβ40 niosącym dodatkowy element specyficzności. Specyficzność PS2NT dla formy Aβ42 peptydu w odniesieniu do Aβ40, która nie została zasugerowana w przykładzie 5, jest zatem potwierdzona w przykładzie 6 i niniejszym przykładzie.

Test oddziaływania HTRF pomiędzy PS2NT i Aβ42 (odzwierciedlający oddziaływanie APP/PS w komórkach) pozwala zatem na identyfikację cząstek chemicznych, które hamują to oddziaływanie poprzez wysokowydajne przeszukiwanie.

P r z y k ł a d 8. Odtworzenie oddziaływania APP/PS1 in vitro

Celem tego przykładu jest pokazanie, że oddziaływanie pomiędzy kompletnymi białkami APP i PS1 może być odtworzone z użyciem różnych lizatów komórkowych zmieszanych jedynie w celu wykazania oddziaływania.

Zastosowano bakulowirusowy system ekspresji pozwalający na produkcje olbrzymich ilości rekombinowanych białek. Użyto lizatów komórkowych pojedynczo zakażonych każdym z trzech wirusów jako źródła białek APP, PS1 i PS1-His6. Rozpuszczalne frakcje zawierające APP, PS1 lub 6HisPS1 są mieszane, a następnie immunoprecypitowane w obecności przeciwciał antyhistydynowych lub anty-PS1 przez noc w 4°C. APP jest wyraźnie wykrywany w immunoprecypitatach (fig. 9A, ścieżki 3 i fig. 9B, ścieżka 3) demonstrując, że oddziaływanie APP z PS1-His lub PS1 jest odtwarzane in vitro przez inkubację dwóch białek. APP sam wydaje się być słabo precypitowany przez przeciwciała anty-PS1 (fig. 9B, ścieżka 1), ale nie z przeciwciałami anty-His, potwierdzając specyficzność oddziaływania w tym przypadku. Rezultaty te pozwalają opracować test oddziaływania in vitro dwóch kompletnych białek - APP i PS1.

P r z y k ł a d 9. SecPS2Nt hamuje oddziaływanie APP i PS1 w stransfekowanych komórkach.

W następujących przykładach przedstawiono, że APP oddziałuje z PS1 w sposób przypominający PS2. Dla tej ostatniej konstrukt SecPS2Nt wystarcza do oddziaływania z APP. Przykład ten ma na celu ocenę czy wiązanie SecPS2Nt z APP może blokować oddziaływanie z PS1 w sposób krzyżowy (hetero-logiczny). W systemie COS1, SPA4CT (odpowiadający ostatnim 100 resztom APP poprzedzonym przez peptyd sygnałowy) może być wykryty w immunoprecypitatach anty-PS1 z komórek produkujących SPA4CT i PS1wt lub mutanta PS1, PS1* (fig. 10A, ścieżki 1 i 2). Oprócz tego, podczas gdy SecPS2NT jest jednakowo kotransfekowany, sygnał SPA4CT niemalże znika w immunoprecypitatach anty-PS1 (fig. 10A, ścieżki 3 i 4). Po immunoprecypitacji anty-PS1, supernatanty (frakcja niezwiązana z białkiem A-sepharose) są poddawane kolejnej immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-PS2.

PL 198 079 B1

SPA4CT jest wyraźnie wykrywany w komórkach kotransfekowanych PS1 i SecPS2Nt (fig. 10B, ścieżki 3 i 4) pokazując, że w tych komórkach po związaniu, SecPS2Nt, zastępuje wiązanie SPA4CT do PS1. To doświadczenie pozwala nam zatem na stwierdzenie, że SecPS2Nt jest cząsteczką zdolną nie tylko do wiązania się z APP, ale również do zastępowania wiązania APP z PS1 i prawdopodobnie PS2. SecPS2Nt może zatem służyć w komórkach jako mimetyk do blokowania oddziaływania APP z dwiema presenilinami, PS1 i PS2. W istocie, wyniki mapowania oddziaływania PS1/APP, potwierdzają, że obszary oddziaływania są podobne do tych w PS2.

P r z y k ł a d 10. Blokowanie oddziaływania APP/PS1 prowadzi do zahamowania produkcji wewnątrzkomórkowego peptydu amyloidowego Άβ42

Poprzedni przykład wykazał, że ekspresja SecPS2NT może blokować oddziaływanie pomiędzy APP i PS1 lub zmutowanym PS1. Obecny przykład analizuje konsekwencje tego zahamowania dla produkcji peptydu amyloidowego, w szczególności jego dwóch form Άβ40 i Άβ42. W istocie, opisano uprzednio w literaturze, że mutacje patologiczne presenilin (PS1 lub PS2) prowadziły do wzrostu stosunku długiej formy peptydu Άβ, formy Άβ42, do formy Άβ40, stosunek Άβ42/Άβ40 (Borchelt i wsp. 1996 i dla przeglądu Hardy, 1997).

SPA4CT został koeksprymowany z PS1 wt (fig. 13A, ścieżki 1 i 3) lub z mutantem PS1 (fig. 13A, ścieżki 2 i 4) albo w nieobecności (ścieżki 1 i 2) albo w obecności SecPS2NT (ścieżki 3 i 4). Lizaty komórkowe i warunki środowiska były analizowane pod względem produkcji peptydu amyloidowego. Formy Άβ40 i Άβ42 były analizowane poprzez irtlmunoprecypitację z przeciwciałami specyficznie rozpoznającymi C-końce Άβ40 (FCA3340) lub Άβ42 (FCA3542, Barelli i wsp., 1997) a immunoprecypitaty analizowane immunoblotem z przeciwciałami rozpoznającymi dwie formy. W lizatach komórkowych, ekspresja mutanta PS1 prowadziła do sporego wzrostu produkcji Άβ42 (1,5 do 2 razy) i jej form multimerycznych w stosunku do PS1wt i jak oczekiwano, niewielkich zmian w poziomie Άβ40 (porównaj fig. 13Ά, ścieżka 1 i 2, panele Άβ42 i Άβ40 dla lizatów komórkowych). W obecności SecPS2NT, poziom Άβ42 (i multimerów) jest znacząco zredukowany (fig. 13 Ά, ścieżki 3 i 4) tak samo dla PS1wt, jak i mutanta PS1. W środowisku zewnątrzkomórkowym, poziom Άβ42 wydaje się również zmniejszony, ale w mniej istotny sposób. Nie ma zmiany poziomów peptydu amyloidowego Άβ40 w różnych warunkach wykazując, że wpływ na Άβ42 jest specyficzny i nie wynika z ogólnej zmiany poziomu ekspresji. Zostało to potwierdzone poprzez analizę ekspresji różnych transfekowanych genów: SPA4CT, SecPS2NT i PS1 (fig. 13B). W tym przykładzie, wykazano zatem, że zahamowania oddziaływania PS1/APP dominującym genetycznie SecPS2NT prowadzi do zmniejszonego poziomu produkcji wewnątrzkomórkowego Άβ42 tak samo dla zmutowanego PS1 jak i PS1wt. W porównaniu do zasadniczej roli przypisywanej Άβ42 w rozwoju choroby Alzheimera, przykład ten dostarcza dowodu, że zahamowanie oddziaływania APP/PS stanowi więc istotny cel terapeutyczny zarówno dla form genetycznych, jak i form sporadycznych choroby.

P r z y k ł a d 11. Detekcja oddziaływania PS2 z endogennym APP z komórek COS za pomocą środków farmaceutycznych.

Przykład ten ma na celu wykazanie, że wyniki otrzymane w poprzednich przykładach (wyniki w komórkach, odpowiadające nadekspresji dwóch oddziałujących partnerów APP i PS (PS1 lub PS2)) są jednakowo ważne dla białek nie ulegających nadekspresji lub endogennych. W istocie, silna nadekspresja dwóch białek może prowadzić do artefaktu oddziaływania. W tym przykładzie badano wykrywanie oddziaływania w warunkach nie prowadzących do jednoczesnej nadekspresji dwóch partnerów.

Komórki COS produkują APP na drodze endogennej, chociaż na niskim poziomie. Komórki COS zostały zatem stransfekowane jedynie PS2. Lizaty komórkowe zostały zanalizowane przez immunoprecypitację z przeciwciałami skierowanymi przeciwko peptydowi N-końca PS2 i wykryte poprzez immunublotting z przeciwciałami anty-APP, W02. Najwyższy panel figury 14, pokazuje, że transfekcja za pomocą jedynie PS2 nie pozwala na wykrycie oddziaływania z endogennym APP przez koimmunoprecypitację (fig.14, ścieżka 1). Ponadto, skoro oddziaływanie APP/PS prowadzi do produkcji peptydu amyloidowego Aβ42 (poprzedni przykład), zatem w katabolizmie APP na poziomie retikulum endoplazmatycznego, brać udział może proteasom, który jest systemem proteolitycznej degradacji w tym przedziale komórkowym. Wpływ laktocystyny, selektywnego inhibitora proteasomu został przeanalizowany. Po inkubacji komórek stransfekowanych PS2 w obecności laktocystyny, endogenny APP może być wyraźnie zidentyfikowany w immunoprecypitatach PS2 (fig. 14, ścieżka 5, prążek o 110 kDa). To oddziaływanie z endogennym APP posiada te same charakterystyki co poprzednio, stąd może zostać najprawdopodobniej zastąpione dominującym genetycznie SecPS2NT (fig. 14, ścieżki 6 i 7) w sposób zależny od dawki. W istocie, ścieżka 7 pokazuje, że przy średniej ilości SecPS2NT, prążek

PL 198 079 B1 o słabej intensywności odpowiadający endogennemu APP jest zawsze widoczny. Przy większej ilości SecPS2NT (ścieżka 6), prążek odpowiadający endogennemu APP staje się bardzo słaby i wykazuje charakterystykę w zależności od dawki. Słaby sygnał jest zawsze widoczny (prążek o około 110 kDa) i musi występować w kompleksie pomiędzy APP SecPS2NT, który jest szybko wydzielany (ponieważ SecPS2NT nie ma już kotwiczącej domeny transbłonowej) a zatem nie akumuluje się wewnątrzkomórkowe.

Figura 14 (panel środkowy i niższy) pokazuje, że traktowanie laktocystyną nie wpływa na poziom całkowitego komórkowego APP, tak samo dla komórkowego jak i dla wydzielanego. W istocie, prążki odpowiadające poziomowi ekspresji APP są prawie stałe w intensywności. Specyfika wpływu laktocystyny została wykazana poprzez zmniejszenie ilości APP oddziałującego z PS2.

Na tych wynikach można wykazać, że oddziaływanie APP/PS2 może być wykrywane z endogennym APP z komórek COS jeśli został zahamowany proteasom. Poza tym, wyniki te pokazują, że oddziaływanie APP/PS2 może zostać wykryte w warunkach mniej sztucznych. Tym czasem to oddziaływanie jest bardzo labilne. Również, aby otrzymać bardziej znaczącą detekcję, przeprowadzano ją w obecności albo z inhibitorem degradacji proteolitycznej albo z nadekspresją dwóch ligandów w poprzednich przykładach. Przykład ten wykazał zatem, że wyniki otrzymane w poprzednich przykładach z nadekspresją w komórkach dwóch oddziałujących ligandów (APP i PS1 lub PS2) są jednakowo ważne dla białek nie ulegających nadekspresji lub białek endogennych.

P r z y k ł a d 12. PS2 oddziałuje z drugim segmentem APP, innym niż Ap.

Ten przykład ma na celu wykazanie, że inny segment APP oddziałuje z PS2.

Poprzednio wykazano, że SecPS2NT oddziałuje w środowisku zewnątrzkomórkowym z wydzielniczymi formami APP (fig. 3A, ścieżka 4). Formy wydzielnicze APP są uwalnianie po przecięciu albo w miejscu P (pozycja 595), odpowiadającemu początkowi peptydu Ap, albo w miejscu a (pozycja 612) w środku peptydu. Te wyniki sugerują, że PS2NT oddziałuje również z regionem N-końcowym APP różnym od Ap. Formy skrócone APP zostały skonstruowane poprzez insercję kodonu stop w miejsce p (p -sAPP) i α (α-sAPP) i przetestowane. Pełna PS2 i SecPS2NT efektywnie oddziałują z α-sAPP (fig. 15, ścieżki 3 i 5) i p -sAPP (fig. 15, ścieżki 4 i 6). Wyniki te ustalają, że segment APP zawarty pomiędzy pozycjami 1 a 595 (a zatem inny niż Ap) jest jednakowo zdolny do oddziaływania z PS2 i PS2NT. Wyniki te pozwalają oprócz tego potwierdzić interakcję PS2NT/APP mogącą mieć miejsce w nieobecności zakotwiczenia w błonie dwóch partnerów oraz w przedziale wewnętrznym (lub zewnątrzkomórkowym) komórki.

Bibliografia

- Doan i wsp. (1996) Protein topology of presenilin 1. Neuron 17:1023-1030.

- Thinakaran i wsp., (1996) Endoproteolysis of Presenilin 1 and accumulation of processed derivatives in vivo. Neuron 17:181 -190.

- Podlisny i wsp., (1997) Presenilin proteins undergo heterogeneous endoproteolysis between Thr291 and Ala299 and occur as stable N- and C-terminal fragments in normal and Alzheimer brain tissue. Neurobioiogy of Disease 3:325-337.

- Pradier, L., Czech, C., Mercken, L., Revah, F. and Imperato, A. (1996) Biochemical characterization of presenilins (S 182 and STM2) proteins. Neurobiol. Aging 17: S137

- Scheuner i wsp. (1996) Secreted amyloid b-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimers disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease. Nature Med. 2:864-870.

- Dyrks, T., Dyrks, E., Muonning, U., Urmoneit, B., Turner, J. and Beyreuther, K. (1993) Generation of bA4 from the amyloid protein precursor and fragment thereof. FEBS Lett. 335:89-93.

- Weidemann, A., Paliga, K., Dϋrrwang, U., Czech, C., Evin, G., Masters, C., & Beyreuther, K. (1997). Formation of sta-ble complexes between two Alzheimer^ disease gene products: Presenilin-2 and b-Amyloid precursor protein. Nature Medicine 3: 328-332

- Blanchard, V., Czech, C., Bonici, B., Clavel, N., Gohin, M., Dalet, K., Revah, F., Pradier, L., Imperato, A. and S. Moussaoui. (1997) Immunohistochemical analysis of presenilin 2 expression in the mouse brain: distribution pattern and co-localization with presenilin 1 protein. Brain Res. 758:209-217.

- Borchelt, D.R., Thinakaran, G., Eckman, C., Lee, M.K.,Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C.-M, Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H.H., Wang, R., Seeger, M., Leve, A.I., Gandy, S.E., Copeland, N.G., Jenkins, N., Price, D.L., Younkin, S.G. and Sisodia (1996) Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abl-42/1-40 ratio in vitro and in vivo. Neuron 17: 1005-1013

PL 198 079 B1

- Duff, K., Eckman, C., Mercken, L., Zehr, C., Yu, X., Prada, C-M, Pereztur, J. Hutton, M., Buee, L., Harigaya, Y., Yager, D., Morgan D., Gordon, M.N., Holcomb, L., Refolo, L., Zenk, B, Hardy, J. and Younkin, S. (1996) Increased amy-Ioid-b42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature, 383: 710-713.

- Hardy, J. (1997) Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease. Trend in Neurosci. 20:154-159.

- Stephens, D.J. and B.M.Austen (1996) Metabolites of the b-amyloid precursor protein generated by b-secretase localize to the Trans-Golgi Network and late endosome in 293 cells. J.Neurosci. res. 46:211-225.

- Essalmani, R., Guillaume, J.-M., Mercken, L. and Octave, J.-N. (1996). Baculovirus-inected cells do nor produce the amyloid peptide of Alzheimer's disease from its precursor. FEBS Lett. 389:157-161.

- Barelli i wsp., (1997), Characterization of new polyclonal antibodies specific for 40 and 42 amino acid-long amyloid e peptides: their use to examine the cell biology of presenilins and the immunochemistry of sporadic Alzheimer's disease and cerebral amyloid angioplasthy cases. Molecular Medicine 3:695-707.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE GŁÓWNE :

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Aventhis Pharma S.A.

(B) (B) ULICA: 20 Avenue Raymond Aron (C) MIASTO: Antony (E) PAŃSTWO: Francja (F) KOD POCZTOWY: 92165 (H) TELEFAK: 01.55.71.72.91 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

Sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym i sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym (iii) LICZBA SEKWENCJI: 11 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) RODZAJ NOCENIKA: Dyskietka (B) RODZAJ KOMPUTERA: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release 1.0, Yersion 1.30 (OEB) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 261 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1... 261 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 1

ATG Met 1

CTC ACA

TTC Phe

ATG Met 5

GCC Ala

TCT Ser

GAC Asp

AGC Ser

GAG Glu 10

GAA Glu

GAA Glu

GTG Val

TGT Cys

GAT Asp 15

GAG Glu

48

Leu

Thr

CGG

ACG

TCC

CTA

ATG

TCG

GCC

GAG

AGC

CCC

ACG

CCG

CGC

TCC

TGC

CAG

96

Arg

Thr

Ser

Leu

Met

Ser

Ala

Glu

Ser

Pro

Thr

Pro

Arg

Ser

Cys

Gin

20

25

30

GAG

GGC

AGG

CAG

GGC

CCA

GAG

GAT

GGA

GAG

AAT

ACT

GCC

CAG

TGG

AGA

144

Glu

Gly

Arg

Gin

Gly

Pro

Glu

Asp

Gly

Glu

Asn

Thr

Ala

Gin

Trp

Arg

35

40

45

PL 198 079 B1

AGC Ser

CAG Gin 50

GAG Glu

AAC Asn

GAG Glu

GAG Glu

GAC Asp 55

GGT Gly

GAG Glu

GAG Glu

GAC Asp

CCT Pro 60

GAC Asp

CGC Arg

TAT Tyr

GTC Val

192

TGT

AGT

GGG

GTT

CCC

GGG

CGG

CCG

CCA

GGC

CTG

GAG

GAA

GAG

CTG

ACC

240

Cys

Ser

Gly

Val

Pro

Gly

Arg

Pro

Pro

Gly

Leu

Glu

Glu

Glu

Leu

Thr

65

70

75

80

CTC

AAA

TAC

GGA

GCG

AAG

CAT

261

Leu

Lys

Tyr

Gly

Ala 85

Lys

His

(2)	INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NR	2:
	(ił	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
		(A) DŁUGOŚĆ: 243 par zasad
		(B) TYP: nukleotydowy
		(C) NICIOWOŚĆ: podwójna
		(D) TOPOLOGIA: liniowa
	(ii:	) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe)
	(iii) HIPOTETYCZNA: NIE
	(iv)	) ANTYSENSOWNA: NIE
	(ix) CHARAKTERYSTYKA:
		(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:!...	243
	(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	NR	2:
ATG	ACA	GAG TTA CCT GCA CCG TTG	TCC	TAC	TTC	CAG	AAT	GCA	CAG	ATG	48
Met	Thr	Glu Leu Pro Ala Pro Leu	Ser	Tyr	Phe	Gin	Asn	Ala	Gin	Met
1		5		10					15
TCT	GAG	GAC AAC CAC CTG AGC AAT	ACT	GTA	CGT	AGC	CAG	AAT	GAC	AAT	96
Ser	Glu	Asp Asn His Leu Ser Asn	Thr	Val	Arg	Ser	Gin	Asn	Asp	Asn
		20	25					30
AGA	GAA	CGG CAG GAG CAC AAC GAC	AGA	CGG	AGC	CTT	GGC	CAC	CCT	GAG	144
Arg	Glu	Arg Gin Glu His Asn Asp	Arg	Arg	Ser	Leu	Gly	His	Pro	Glu
		35 40					45
CCA	TTA	TCT AAT GGA CGA CCC CAG	GGT	AAC	TCC	CGG	CAG	GTG	GTG	GAG	192
Pro	Leu	Ser Asn Gly Arg Pro Gin	Gly	Asn	Ser	Arg	Gin	Val	Val	Glu
	50	55				60
CAA	GAT	GAG GAA GAA GAT GAG GAG	CTG	ACA	TTG	AAA	TAT	GGC	GCC	AAG	240
Gin	Asp	Glu Glu Glu Asp Glu Glu	Leu	Thr	Leu	Lys	Tyr	Gly	Ala	Lys
65		70			75					80

CAT 243

His (2J INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NR 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 198 079 B1

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 2088 par zasad TYP: nukleotydowy NICIOWOŚĆ: podwójna TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI	: DNA (genomcrae)
(iii)	1 HIPOTETYCZNA:	NIE

(ίν) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:!...2083 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3

ATG Met 1

CTG Leu

CCC Pro

GGT Gly

TTG Leu 5

GCA Ala

CTG Leu

CTC Leu

CTG Leu

CTG Leu 10

GCC Ala

GCC Ala

TGG Trp

ACG Thr

GCT Ala 15

CGG Arg

48

GCG

CTG

GAG

GTA

CCC

ACT

GAT

GGT

AAT

GCT

GGC

CTG

CTG

GCT

GAA

CCC

96

Ala

Leu

Glu

Val 20

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn 25

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala 30

Glu

Pro

CAG

ATT

GCC

ATG

TTC

TGT

GGC

AGA

CTG

AAC

ATG

CAC

ATG

AAT

GTC

CAG

144

Gin

Ile

Ala 35

Met

Phe

Cys

Gly

Arg 40

Leu

Asn

Met

His

Met 45

Asn

Val

Gin

AAT

GGG

AAG

TGG

GAT

TCA

GAT

CCA

TCA

GGG

ACC

AAA

ACC

TGC

ATT

GAT

192

Asn

Gly 50

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp 55

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys 60

Thr

Cys

Ile

Asp

ACC

AAG

GAA

GGC

ATC

CTG

CAG

TAT

TGC

CAA

GAA

GTC

TAC

CCT

GAA

CTG

240

Thr 65

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu 70

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu 75

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu 80

CAG

ATC

ACC

AAT

GTG

GTA

GAA

GCC

AAC

CAA

CCA

GTG

ACC

ATC

CAG

AAC

288

Gin

Ile

Thr

Asn

Val 85

Val

Glu

Ala

Asn

Gin 90

Pro

Val

Thr

Ile

Gin 95

Asn

TGG

TGC

AAG

CGG

GGC

CGC

AAG

CAG

TGC

AAG

ACC

CAT

CCC

CAC

TTT

GTG

336

Ary 100

Lys

Gin

Cys 105

Thr

His

Pro

His 110

Phe

Val

i rp

oy'S

uy-s

\j±y

«.rg

r,yś

ATT

CCC

TAC

CGC

TGC

TTA

GTT

GGT

GAG

TTT

GTA

AGT

GAT

GCC

CTT

CTC

384

Ile

Pro

Tyr 115

Arg

Cys

Leu

Val

Gly 120

Glu

Phe

Val

Ser

Asp 125

Ala

Leu

Leu

GTT

CCT

GAC

AAG

TGC

AAA

TTC

TTA

CAC

CAG

GAG

AGG

ATG

GAT

GTT

TGC

432

Val

Pro 130

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe 135

Leu

His

Gin

Glu

Arg 140

Met

Asp

Val

Cys

GAA

ACT

CAT

CTT

GAC

TGG

CAC

ACC

GTC

GCC

AAA

GAG

ACA

TGC

AGT

GAG

48

Glu 145

Thr

His

Leu

His

Trp 150

His

Thr

Val

Ala

Lys 155

Glu

Thr

Cys

Ser

Glu 160

AAG

AGT

ACC

AAC

TTG

CAT

GAC

TAC

GGC

ATG

TTG

CTG

CCC

TGC

GGA

ATT

528

Lys

Ser

Thr

Asn

Leu

His

Asp

Tyr

Gly

Met

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly

Ile

165 170 175

PL 198 079 B1

GAC

AAG

TTC

CGA

GGG

GTA

GAG

TTT

GTG

TGT

TGC

CCA

CTG

GCT

GAA

GAA

576

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

Val

Glu

Phe

Val

Cys

Cys

Pro

Leu

Ala

Glu

Glu

180

185

190

AGT Ser

GAC Asp

AAT Asn 195

GTG Val

GAT Asp

TCT Ser

GCT Ala

GAT Asp 200

GCG Ala

GAG Glu

GAG Glu

GAT Asp

GAC Asp 205

TCG Ser

GAT Asp

GTC Val

624

TGG

TGG

GGC

GGA

GCA

GAC

ACA

GAC

TAT

GCA

GAT

GGG

AGT

GAA

GAC

AAA

672

Trp

Trp

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Asp

Lys

210

215

220

GTA

GTA

GAA

GTA

GCA

GAG

GAG

GAA

GAA

GTG

GCT

GAG

GTG

GAA

GAA

GAA

720

Val

val

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

225

230

235

240

GAA

GCC

GAT

GAT

GAC

GAG

GAC

GAT

GAG

GAT

GGT

GAT

GAG

GTA

GAG

GAA

768

Glu

Ala

Asp

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asp

Glu

val

Glu

Glu

245

250

255

GAG

GCT

GAG

GAA

CCC

TAC

GAA

GAA

GCC

ACA

GAG

AGA

ACC

ACC

AGC

ATT

816

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Thr

Ser

Ile

260

265

270

GCC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACA

GAG

TCT

GTG

GAA

GAG

GTG

GTT

CGA

864

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Glu

Val

Val

Arg

275

280

285

GTT

CCT

ACA

ACA

GCA

GCC

AGT

ACC

CCT

GAT

GCC

GTT

GAC

AAG

TAT

CTC

912

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

290

295

300

GAG

ACA

CCT

GGG

GAT

GAG

AAT

GAA

CAT

GCC

CAT

TTC

CAG

AAA

GCC

AAA

960

Glu

Thr

Pro

Gly

Asp

Glu

Asn

Glu

His

Ala

His

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

305

310

315

320

GAG

AGG

CTT

GAG

GCC

AAG

CAC

CGA

GAG

AGA

ATG

TCC

CAG

GTC

ATG

AGA

1008

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

His

Arg

Glu

Arg

Met

Ser

Gin

Val

Met

Arg

325

330

335

GAA

TGG

GAA

GAG

GCA

GAA

CGT

CAA

GCA

AAG

AAC

TTG

CCT

AAA

GCT

GAT

1056

Glu

Trp

Glu

Glu

Ala

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys

Ala

Asp

340

345

350

AAG

AAG

GCA

GTT

ATC

CAG

CAT

TTC

CAG

GAG

AAA

GTG

GAA

TCT

TTG

GAA

1104

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

355

360

365

CAG

GAA

GCA

GCC

AAC

GAG

AGA

CAG

CAG

CTG

GTG

GAG

ACA

CAC

ATG

GCC

1152

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

370

375

380

AGA

GTG

GAA

GCC

ATG

CTC

AAT

GAC

CGC

CGC

CGC

CTG

GCC

CTG

GAG

AAC

1200

Arg

Val

Glu

Ala

Met

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

385

390

395

400

TAC

ATC

ACC

GCT

CTG

CAG

GCT

GTT

CCT

CCT

CGG

CCT

CGT

CAC

GTG

TTC 1248

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Pro

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

405 410 415

PL 198 079 B1

AAT

ATG

CTA

AAG

AAG

TAT

GTC

CGC

GCA

GAA

CAG

AAG

GAC

AGA

CAG

CAC 1296

Asn

Met

Leu

Lys 420

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala 425

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg 430

Gin

His

ACC CTA AAG CAT

TTC GAG CAT

GTG CGC ATG GTG GAT CCC AAG AAA

GCC Ala

1344

Thr

Len Lys His 435

Phe Glu

His

Val Arg Met Val Asp 440

Pro 445

Lys Lys

GCT

CAG

ATC

CGG

TCC

CAG

GTT

ATG

ACA

CAC

CTC

CGT

GTG

ATT

TAT

GAG

1392

Al a

Gin

Ile

Arg

Ser

Gin

Val

Met

Thr

His

Leu

Arg

Val

Ile

Tyr

Glu

450

455

460

CGC

ATG

AAT

CAG

TCT

CTC

TCC

CTG

CTC

TAC

AAC

GTG

CCT

GCA

GTG

GCC

1440

Arg

Met

Asn

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ala

Val

Ala

465

470

475

480

GAG

GAG

ATT

CAG

GAT

GAA

GTT

GAT

GAG

CTG

CTT

CAG

AAA

GAG

CAA

AAC

1488

Glu

Glu

Ile

Gin

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin

Asn

485

490

495

TAT

TCA

GAT

GAC

GTC

TTG

GCC

AAC

ATG

ATT

AGT

GAA

CCA

AGG

ATC

AGT

1536

Tyr

Ser

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Asn

Met

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Ser

500

505

510

TAC

GGA

AAC

GAT

GCT

CTC

ATG

CCA

TCT

TTG

ACC

GAA

ACG

AAA

ACC

ACC

1584

Tyr

Gly

Asn

Asp

Ala

Leu

Met

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Lys

Thr

Thr

515

520

525

GTG

GAG

CTC

CTT

CCC

GTG

AAT

GGA

GAG

TTC

AGC

CTG

GAC

GAT

CTC

CAG

1632

Val

Glu

Leu

Leu

Pro

Val

Asn

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Asp

Leu

Gin

530

535

540

CCG

TGG

CAT

TCT

TTT

GGG

GCT

GAC

TCT

GTG

CCA

GCC

AAC

ACA

GAA

AAC

1680

Pro

Trp

His

Ser

Phe

Gly

Ala

Asp

Ser

Val

Pro

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn

545

550

555

560

GAA

GTT

GAG

CCT

GTT

GAT

GCC

CGC

CCT

GCT

GCC

GAC

CGA

GGA

CTG

ACC

1728

Glu

Val

Glu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu

Thr

565

570

575

ACT

CGA

CCA

GGT

TCT

GGG

TTG

ACA

AAT

ATC

AAG

ACG

GAG

GAG

ATC

TCT

1776

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

Gly

Leu

Thr

Asn

Ile

Lys

Thr

Glu

Glu

Ile

Ser

580

585

590

GAA

. GTG

AAG

ATG

GAT

GCA

GAA

. TTC

CGA

CAT

GAC

TCA

GGA

TAT

GAA

. GTT

1824

Glu

Val

Lys

Met

Asp

Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

595

600

605

CAT

CAT

CAA

AAA

. TTG

GTG

TTC

TTT

GCA

. GAA

. GAT

GTG

GGT

TCA

. AAC

AAA

1872

His

His

Gin

Lys

Leu

. Val

Phe

Phe

Ala

Glu

. Asp

Val

Gly

Ser

Asn

. Lys

610

615

620

GGT

GCA

ATC

ATT

GGA

CTC

ATG

GTG

GGC

GGT

GTT

GTC ATA

GCG

ACA

GTG

1920

Gly

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

Thr

Val

625

630

635

640

ATC

GTC

ATC

ACC

TTG

GTG

ATG

CTG

AAG

AAG

AAA

CAG TAC

ACA

TCC

ATT

1968

PL 198 079 B1

ile

Val

ile

Thr

Leu

Val

Met

Leu

Lys

Lys

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser

Ile

645

650

655

CAT

CAT

GGT

GTG

GTG

GAG

GTT

GAC

GCC

GCT

GTC

ACC CCA

GAG

GAG

CGC

2016

His

His

Gly

Val

Val

Glu

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

660

665

670

CAC

CTG

TCC

AAG

ATG

CAG

CAG

AAC

GGC

TAC

GAA

AAT

CCA

ACC

TAC

AAG

2064

His

Leu

Ser

Lys

Met

Gin

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

Asn

Pro

Thr

Tyr

Lys

675

680

685

TTC

TTT

GAG

CAG

ATG

CAG

AAC

TAG

2088

Phe

Phe

Glu

Gin

Met

Gin

Asn

690

695

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 4: oligo

N > ηπππ7\τζΦϋηνοπιννΆ ΟΓ ϋΖΤ/ΤΕ’ΚΤΓ’ TT . ζ j. j LriiniMin i ui\ i u i λ i\n hj υηπ u -j(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...38 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4:

CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NR 5: oligo (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 43 par zasad
(B)	TYP: nukleotydowy
(C)	NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP	CZĄSTECZKI: cDNA
(iii) HIPOTETYCZNA: NIE

(iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1... 43 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5:

PL 198 079 B1

CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 6: oligo 3172 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 27 par zasad TYP: nukleotydowy NICIOWOŚĆ: pojedyncza
TOPOLOGIA:	liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	: cDNA
(iii:	1 HIPOTETYCZNA:	NIE

(iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1 ... 27 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5:

CAAAGAT C T GAT GCAGAAT T CCGACAT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 7: oligo 8181 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) <C) (D)	DŁUGOŚĆ: 59 par zasad TYP: nukleotydowy
NICIOWOŚĆ: TOPOLOGIA:	poj edyncza liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	cDNA
(iii(	1 HIPOTETYCZNA:	NIE

(iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1... 59 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7:

CAAGCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 8: oligo 8171 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE

PL 198 079 B1 (ίχ) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:!...27 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 8:

CAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NR 9: oligo (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (□)	DŁUGOŚĆ: 29 par zasad TYP: nukleotydowy
NICIOWOŚĆ: TOPOLOGIA:	poj edyncza liniowa
ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	: cDNA
iii)	HI	POTETYCZNA:	NIE

(iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

{A} NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1...29 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 9: ccatcgatggctaCATCTTCACTTCAGAG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 10: oligo (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1... 31 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 10:

ccatcgatggctaTTTTTGATGATGAACTTC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 11: oligo (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad

PL 198 079 B1 (B) TYP: nukleotydowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: (B) UMIEJSCOWIENIE:1... 17 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 11:

CCGTGGAGCTCCTCCCG

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym, znamienny tym, że przeprowadza się co najmniej jeden etap znakowania presenilin i/lub APP, lub ich fragmentów, oraz etap detekcji hamowania oddziaływania pomiędzy peptydem Άβ_1-42 a N-końcem presenilin albo pomiędzy kompletnymi białkami APP a presenilinami.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyizolowane tym sposobem związki są zdolne do co najmniej częściowego hamowania oddziaływania pomiędzy peptydem Άβ_1-42 a N-końcem preseniliny PS2.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy, w których :

   - peptyd Άβ_1-42 absorbuje się wstępnie na błonie nitrocelulozowej przez inkubację;

   - ekstrakt bakteryjny zawierający całość lub cześć preseniliny (PS1 lub PS2), a zwłaszcza N-koniec, dodaje się następnie i inkubuje z testowaną cząsteczką lub mieszaniną zawierającą różne testowane cząsteczki;

   - wykrywa się oddziaływanie preseniliny z peptydem Άβ_1-42 na filtrze nitrocelulozowym z użyciem białek znakujących preseniliny, przy czym pożądane cząsteczki hamują oddziaływanie i zmniejszają tym samym intensywność sygnału białek znakujących.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako jedno z markerowych białek stosuje się białko wiążące S-tag, sprzężone z alkaliczną fosfatazą.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy, w których:

   - peptyd Άβ_1-42 inkubuje się wstępnie na płytce zawierającej studzienki (format 96-studzienkowy lub większy);

   - dodaje się następnie N-koniec oczyszczonej rekombinowanej preseniliny dla inkubacji z testowaną cząsteczką lub mieszaniną zawierającą różne testowane cząsteczki;

   - po przemyciu, wykrywa się oddziaływanie presenilin z peptydem Άβ_1-42 na płytce z użyciem białek znakujących preseniliny, przy czym utratę oddziaływania pomiędzy presenilinami a prekursorem peptydu β-amyloidowego i/lub peptydem β-amyloidowym wykrywa się spektrofotometrycznie, po dodaniu substratu kolorymetrycznego.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako jedno z markerowych białek stosuje się białko wiążące S-tag, sprzężone z alkaliczną fosfatazą a wykrywanie braku oddziaływania przeprowadza się przy 450 nm.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy, w których:

   - kontaktuje się cząsteczkę lub mieszaninę zawierającą różne cząsteczki ze zsyntetyzowanym peptydem Άβ_1-42 z biotyną i „ramieniem” 3 β-alanin (lub 3 lizyn) na jego N-końcu (powyżej pozycji 1);

   PL 198 079 B1

   - powstającą mieszaninę reakcyjną inkubuje się z oczyszczonym i wyznakowanym przy pomocy pierwszego fluoroforu N-końcem preseniliny;

   - dodaje się streptawidynę sprzężoną z drugim fluoroforem, podatnym na wzbudzenie przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu pozwalając na wykorzystanie przeniesienia fluorescencji występującego gdy te dwa fluorofory są w bliskiej odległości od siebie;

   - wykrywa się nowe związki hamujące oddziaływanie fluorometrycznie przy długości fali emisji pierwszego fluoroforu i/lub przez pomiar zmniejszenia sygnału przy długości fali emisji drugiego fluoroforu.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako pierwszy fluorofor stosuje się kryptat Europium a jako drugi fluorofor stosuje się XL665.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wykrywanie utraty oddziaływania przeprowadza się przy 620 nm i/lub przez pomiar zmniejszenia sygnału przy 665 nm.
10. 10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy, w których:

    - kontaktuje się mieszaninę a) lizatów komórkowych zawierających całość lub cześć presenilin (PS1 lub PS2) a w szczególności N-koniec, b) lizatów komórkowych zawierających APP, przy czym lizaty otrzymuje się z komórek zakażonych

    - wirusami, a w szczególności bakulowirusami i c) testowaną cząsteczkę lub mieszaninę zawierającą różne testowane cząsteczki;

    - przeprowadza się koimmunoprecypitację rozpuszczonych białek odpowiadających presenilinom lub APP lub peptydowi Ap przy użyciu odpowiednich przeciwciał;

    - wykrywa się utratę koimmunoprecypitacji presenilin i APP przy użyciu testu hybrydyzacji typu Western ze znakowanymi przeciwciałami, co wskazuje na to, że badane cząsteczki wykazują pożądane właściwości hamowania.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywa się oddziaływanie pomiędzy peptydem Ap1-42 a N-końcem PS2.
12. 12. Sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu p-amyloidowego i/lub peptydem p-amyloidowym, a w szczególności pomiędzy peptydem Ap1-42 a N-końcem PS2, znamienny tym, że przeprowadza się co najmniej jeden etap przeniesienia fluorescencji pomiędzy dwoma fluoroforami związanymi z powyższymi cząsteczkami oraz wykrywa się oddziaływanie przez pomiar fluorometryczny.