ES2293047T3

ES2293047T3 - Sustratos basados en notch solubles para gamma secretasa y procedimientos y composiciones para usarlos.

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Publication number: ES2293047T3
Application number: ES03775599T
Authority: ES
Inventors: Kenneth Bruce Rank; Satish Kumar Sharma
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2002-11-26
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2023-11-17
Also published as: EP1567647A1; AU2003283619A1; KR20050085177A; CN1717485A; HRP20050461A2; WO2004048578A1; NO20052552D0; ATE374824T1; JP2006508653A; CA2505764A1; US20110098227A1; EP1567647B1; RU2005115973A; DE60316718T2; DE60316718D1; NO20052552L

Abstract

Una proteína de fusión soluble que comprende proteína Notch recombinante fusionada al extremo C terminal de una secuencia de proteína NusA.

Description

Sustratos basados en Notch solubles para \gamma secretasa y procedimientos y composiciones para usarlos.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a nuevos sustratos solubles para la \gamma-secretasa. Más particularmente, la invención proporciona un polipéptido de fusión soluble con un segmento Notch que contiene los sitios de escisión dependiente de \gamma-secretasa (\gamma y \varepsilon) fusionado con una proteína NusA. Se describen procedimientos y composiciones para obtener y usar una proteína de fusión de este tipo.

Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (EA) provoca demencia progresiva con la formación consiguiente de placas amiloides, ovillos neurofibrilares, gliosis y pérdida neuronal. La enfermedad se produce tanto en formas genéticas como en formas esporádicas cuyas características de transcurso clínico y patológicas son bastante similares. Se han descubierto hasta la fecha tres genes que, cuando están mutados, provocan una forma autosómica dominante de EA. Estos genes codifican el precursor de la proteína amiloide (APP) y dos proteínas, presenilina 1 (PS 1) y presenilina 2 (PS 2), que están relacionadas estructural y funcionalmente. Se han observado mutaciones en cualquiera de las tres proteínas que potencian el procesamiento proteolítico de APP a través de una ruta intracelular que produce el péptido beta amiloide (péptido A\beta, algunas veces denominado A beta), un péptido de 40-42 aminoácidos que es el componente principal de la placa amiloide en EA (Younkin, Brain Pathol. 1(4):253-62, 1991; Haass, J, Neurosci. 11 (12):3783-93, 1991).

La desregulación de las rutas intracelulares para el procesamiento proteolítico puede ser central para la fisiopatología de la EA. En el caso de la formación de placas, las mutaciones en AAP, PS1 o PS2 alteran consistentemente el procesamiento proteolítico de APP para aumentar la formación de A\beta 1-42, una forma del péptido A\beta que parece ser particularmente amiloidogénica, y por lo tanto muy importante en la EA. El APP se localiza en la estructura de membrana secretora incluyendo la superficie celular, y tiene un dominio transmembrana cerca del extremo C terminal (Figura 1). Los ejemplos de isotipos específicos del APP que actualmente se sabe que existen en seres humanos incluyen el polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang y col., (1987), Nature 325: 733-736 que se denomina el APP "normal"; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte y col. (1988), Nature, 331:525-527 (1998) y Tanzi y col. (1988), Nature, 331: 528-530; y el polipéptido de 770 amino ácidos descrito por Kitaguchi y col., Nature, 331:530:532 (1988).

El péptido A\beta procede de una región del APP adyacente y que contiene una porción del dominio transmembrana (véase la Figura 1). Normalmente, el procesamiento del APP en el sitio de la \alpha-secretasa escinde la región central de la secuencia de A\beta adyacente a la membrana y libera el dominio soluble, extracelular del APP de la superficie celular. Este procesamiento del APP por la \alpha-secretasa produce APP-\alpha soluble, que no se cree que contribuya a la EA. Sin embargo, el procesamiento patológico del APP en los sitios de la \beta y \gamma-secretasa, que se localizan en posición N-terminal y C-terminal respecto al sitio de la \alpha-secretasa, libera el péptido A\beta. El sitio de escisión de la \beta-secretasa se localiza a 28 restos de la superficie luminal de la membrana plasmática y el sitio de escisión de la \gamma-secretasa del APP se localiza en la región transmembrana. El procesamiento en los sitios de la \beta- y \gamma-secretasa puede tener lugar en el retículo endoplásmico (en neuronas) y en la ruta endosómica/lisosomal después de la reinternalización del APP de la superficie celular (en todas las células).

Por lo tanto, las actividades enzimáticas de las enzimas \beta- y \gamma-secretasa son objetivos para el descubrimiento de fármacos (Olson y col., Curr. Opin. Drug Discovery & Develop. 4:390-401, 2001). Estas dos enzimas actúan conjuntamente para escindir el APP, que se escinde inicialmente por la \beta-secretasa para producir un fragmento C-terminal (CT) unido a la membrana denominado CT-100, que a su vez sirve como un sustrato para la \gamma-secretasa asociada a la membrana. La escisión intramembrana del CT-100 por la \gamma-secretasa dependiente de presenilina 1 (PS 1) da como resultado la producción de A\beta 1-40 y 1-42. Además, hay otro suceso de escisión (denominado escisión de tipo gamma- o épsilon-secretasa) que escinde cerca del resto 721 del APP aproximadamente a 2-5 restos en el interior del límite de la membrana citoplásmica para generar una serie de fragmentos de APP C-terminales estables
(Figura 1).

Notch-1 pertenece a la familia Notch de receptores de la superficie celular que juegan un papel extendido en la asignación de destinos celulares. En los últimos años se ha postulado que el procesamiento de APP es similar al procesamiento del receptor de la superficie celular Notch 1 (Wolfe y col., J. Biol. Chem. 276:5413-5416, 2001). De hecho, se ha demostrado que el APP y el Notch-1 son sustratos competitivos para la supuesta \gamma-secretasa endógena. Notch-1 es una proteína integral de la membrana que se procesa proteolíticamente dentro de su ectodominio después de la activación medida por ligando. Después de la unión del ligando, Notch-1 se somete a escisiones por la \gamma-secretasa intramembranosa dependiente de presenilina (Okochi, EMBO J. 2 5408-5416, 2002). La primera tiene lugar en el sitio 1731/1732 (esto es parecido a la escisión por la \gamma-secretasa de tipo A\beta) y la segunda en el sitio 1743/1744 (esto es parecido a la escisión \varepsilon en la generación del APP y se denomina en ocasiones escisión S3 de Notch; representada en la figura 1 como una escisión "\varepsilon"). Es la escisión \varepsilon en la unión 1743/1744 de Notch la que sucede hacia el final del dominio transmembrana para liberar el dominio intracelular de Notch 1 (NICD). El NICD librado se transloca hacia el núcleo, donde interacciona con una proteína de unión a ADN denominada CSL (este acrónimo representa tres nombres separados dados a esta proteína en sistemas diferentes: CBF1/RBP-J en mamíferos, supresor de Hairless [Su(H)] en Drosophila y Xenopus; y Lag-1 en C. Elegans). El complejo formado entre NICD y CSL modifica la transcripción de genes diana. El NICD se requiere para la ruta de señalización crítica en el desarrollo embrionario (Schroeter 1998; Hupert 2000).

La actividad \gamma-secretasa dependiente de presenilina se requiere para procesar el receptor Notch hasta NICD (De Stropper., y col., Nature 398:518-522,1999). Se ha informado que, en las células, el Notch-1 y el APP son sustratos competitivos para la escisión por la \gamma-secretasa dependiente de PS1 (Berezovska y col., J. Biol. Chem. 276:30018-30023, 2001). Como tales, los inhibidores de \gamma-secretasa diseñados para inhibir la producción de A\beta patogénico también inhiben la señalización Notch. Esto tiene implicaciones significativas para el posible uso de inhibidores de la \gamma-secretasa como fármacos en el tratamiento de la EA. La inhibición del procesamiento del Notch-1 en el adulto conduciría a inmunodeficiencia y anemia debida a la importante función del Notch-1 en la hematopoyesis. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar compuestos que inhiban específicamente la escisión del APP CT-100 pero que no inhiban la escisión de Notch. Estos compuestos servirían como agentes terapéuticos para la intervención de la EA sin producir los efectos nocivos de la inhibición de la producción de NICD.

Petit y col., Nat Cell Biol (2001) May; 3(5): 507-11 describen inhibidores p no peptídicos de \gamma-secretasa y también ensayos basados en células que tiene en cuenta la escisión por la presenilina de Notch marcado con myc.

Karlstrom y col (JBC Vol 277, Nº 9, páginas 6763-6766) describen un ensayo cuantitativo para la escisión mediada por la \gamma-secretasa de la proteína precursora de amiloide del Alzheimer (APP) usando una forma C-99 de APP en la que se ha incorporado un dominio de unión a ADN Gal4/transactivación de VP16.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para identificar compuestos que no inhiban la escisión de Notch mediada por la \gamma-secretasa. Estos procedimientos y composiciones evitan el problema de la inhibición de la producción de NICD que se ocupa de la inhibición no específica de la inhibición de la \gamma-secretasa. La presente invención, por lo tanto, permite la identificación de agentes terapéuticos para la intervención de la EA sin producir los efectos nocivos de la inhibición de la producción de NICD.

Un primer aspecto de la presente invención proporciona una proteína de fusión soluble que comprende una proteína Notch recombinante fusionada al extremo C terminal de una secuencia de proteína NusA. Preferentemente, la proteína Notch comprende el dominio transmembrana de la proteína Notch. Sin embargo, la proteína Notch puede contener más o menos de la proteína Notch de longitud completa que el dominio transmembrana siempre que la proteína Notch contenga el sitio de escisión S3 de Notch. La proteína Notch para una realización específica comprende la secuencia de ID SEC Nº 4 y se codifica por una secuencia de ácido nucleico de ID SEC Nº 3. La proteína Notch recombinante debe ser una que comprenda el sitio de escisión S3 (es decir, el sitio de escisión \varepsilon) de Notch. La proteína Notch recombinante puede ser una proteína Notch de vertebrados o un proteína Notch de invertebrados. En ciertas realizaciones, la proteína Notch recombinante procede de la proteína Notch de ratón que tiene la secuencia de ID SEC Nº 5 (número de entrada al banco de genes Z11886). Realizaciones más particulares contemplan el uso de una proteína Notch recombinante que comprende los aminoácidos 1703 a 1860 de la proteína Notch de ratón. Cualquiera de las proteínas de fusión solubles de la presente invención pueden comprender adicionalmente una etiqueta His C-terminal y/o o una etiqueta Flag C-terminal. Por supuesto, también se podría usar toda o una parte de una secuencia Notch humana, por ejemplo, la secuencia de ID SEC Nº 6 [número de entrada al banco de genes M73980].

La presente invención contempla adicionalmente polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión descrita en este documento. Una secuencia polinucleotídica ejemplar que codifica tal proteína de fusión es una que comprende una secuencia indicada en la ID SEC Nº 1. Esta secuencia polinucleotídica codifica una proteína de fusión de la ID SEC Nº 2. Además, en este documento también se contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El vector de expresión preferentemente es uno en el que el polinucleótido está unido de forma funcional a un promotor para promover la expresión de la proteína codificada por el polinucleótido en una célula huésped.

En la presente invención también se incluyen células huésped recombinantes transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector de expresión descrito en este documento. La invención contempla un procedimiento para producir un sustrato para un ensayo de \gamma-secretasa que comprende cultivar tal una célula huésped recombinante de un modo que permita la expresión de la proteína de fusión. El procedimiento puede comprender adicionalmente purificar el polipéptido. En un procedimiento de este tipo, la célula huésped puede ser cualquier célula huésped con capacidad de producción de proteínas recombinantes incluyendo una célula huésped de mamífero, una célula huésped bacteriana y una célula huésped de levadura. En realizaciones ejemplares, la célula huésped es una célula Hela, una línea celular de riñón embrionario humano 293, un fibroblasto o una célula CHO.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para producir una proteína Notch solubilizada, comprendiendo el procedimiento preparar una proteína de fusión en la que la proteína Notch esta fusionada al extremo C terminal de una proteína NusA. Mas específicamente, el procedimiento comprende una producción recombinante de la proteína de fusión, que implica preparar una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína Notch que contiene los aminoácidos del sitio de escisión S3 de Notch unida al extremo C terminal de una proteína NusA; transformar una célula huésped con la construcción de expresión en condiciones que faciliten la expresión de la proteína de fusión; y dejar crecer la célula huésped transformada en un cultivo. El procedimiento puede comprender adicionalmente aislar la proteína de fusión del huésped transformado en cultivo. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende producir la proteína de fusión por síntesis química de proteínas. En tales procedimientos, la proteína Notch comprende preferentemente los aminoácidos 1703 a 1860 de la proteína Notch de ratón.

En este documento también se contempla un procedimiento in vitro para ensayar la escisión \varepsilon mediada por la \gamma-secretasa (1743/1744) de la proteína Notch que comprende poner en contacto una primera composición que comprende un complejo de \gamma-secretasa de mamífero o un fragmento biológicamente activo del mismo, con una segunda composición que comprende una proteína de fusión de la invención; y medir la escisión de la proteína de fusión.

El complejo de \gamma-secretasa del procedimiento anterior puede comprender una fracción de membrana purificada y aislada a partir de células de mamífero o células transformadas o transfectadas con construcciones de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el complejo de \gamma-secretasa. En el procedimiento anterior, la proteína de fusión es una proteína Notch solubilizada preparada según los procedimientos discutidos en este documento.

La invención contempla específicamente composiciones que comprenden moduladores de \gamma-secretasa identificados por los procedimientos de detección selectiva descritos en este documento. La presente invención también comprende un procedimiento para modular la actividad de la \gamma-secretasa in vivo, que comprende una etapa de administración de un modulador identificado por los procedimientos de detección selectiva descritos en este documento que es un modulador de la \gamma-secretasa selectivo para inhibir la escisión mediada por la \gamma-secretasa de APP en comparación con la escisión mediada por la \gamma-secretasa de la proteína Notch, en un mamífero, en una cantidad eficaz para modular la actividad de la \gamma-secretasa en las células del mamífero.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más moduladores identificados por la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se contempla un procedimiento para tratar una enfermedad o dolencia caracterizada por una actividad de \gamma-secretasa anormal, que comprende administrar a un sujeto que necesita un tratamiento una composición farmacéutica de la invención. Se contempla particularmente el uso de los moduladores identificados en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan solamente a modo de ilustración, ya que se harán evidentes diversos cambios y modificaciones en el alcance de la invención a los expertos en la materia a partir de esta descripción
detallada.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para ilustrar adicionalmente aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor con referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en este documento.

Figura 1. Comparación de sitios de escisión de tipo \gamma-secretasa. Se muestra la secuencia que rodea a los dominios transmembrana del APP (ID SEC Nº 10), Notch-1 (ID SEC Nº 12) y B-catedrina ID SEC Nº 11). También se muestran los sitios de escisión de \gamma-secretasa en APP para producir A\beta 1-40 y 1-42, así como los sitios de escisión \varepsilon (\varepsilon) o de tipo \gamma-secretasa para los tres sustratos.

Figura 2. Secuencias de aminoácidos que rodean al sitio de escisión de tipo \gamma-secretasa en Notch-1. Esta secuencia (1703-1860; ID SEC Nº 13) se eligió para la expresión en E. coli. El dominio transmembrana se indica por subrayado y el sitio de escisión 1743/1744 se indica en caracteres en negrita y subrayados. La escisión de esta secuencia Notch daría como resultado un fragmento NICD que contiene los aminoácidos 1744-1860.

Figura 3. a) Construcciones clonadas para la expresión de Notch en E. coli. Se muestran cuatro construcciones, conteniendo todas ellas la secuencia de aminoácidos 1703-1860 de Notch-1. No se observó expresión cuando se uso una secuencia líder de caspasa, Ubiquitina o el dominio N-Terminal de tau como etiqueta N-terminal para ayudar a dirigir la expresión. Cuando se fusionó Notch (1703-1860) a la proteína NusA, se observó expresión soluble en E. coli. b) Un esquema de la construcción Notch F clonada en pET 43.1a. Esta construcción también contiene etiquetas Flag y 8His C-terminales.

Figura 4. Aislamiento IMAC de fusión NusA-Notch. En la parte superior se muestra un esquema de la proteína de fusión. Se pueden encontrar detalles de la expresión y purificación de NusA-Notch en la sección de Materiales y Procedimientos. La flecha indica la banda de expresión de la proteína de fusión en el gel SDS-PAGE a 10%. Carril 1, lisado de E. coli bruto; carril 2, sobrenadante de E. coli, carril 3, flujo IMAC, carril 4, lavado CON imidazol 50 mM; carriles 5-9, fracciones de elución de imidazol 300 mM; carril 10, marcador de peso molecular de BenchMark.

Figura 5. Transferencia de Western que muestra la escisión de la fusión NusA-Notch usando \gamma-secretasa solubilizada. Los detalles del experimento están en el Ejemplo 1. En resumen, se incubó la fusión NusA-Notch durante toda la noche con \gamma-secretasa solubilizada en presencia y ausencia de concentraciones variadas de DAPT (PH-56868). Las muestras se sometieron a electroforesis, se transfirieron y se sondaron con anticuerpo Val 1744 específico para la escisión en Val 1744.

Figura 6. La detección de la escisión especifica de Notch por ELISA. Se muestra un esquema del ELISA de sándwich usado para detectar la escisión de la fusión NusA-Notch por \gamma-secretasa solubilizada. La escisión específica se detecta usando el anticuerpo Val 1744.

Figura 7. Escisión de la proteína de fusión NusA-Notch por \gamma-secretasa detectada por ELISA. Se incubó sustrato de NusA-Notch (0,9 \muM) en ausencia o presencia de 68 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada (enzima) y se realizó el ELISA según la sección de Materiales y Procedimientos. Los datos representan la media de seis experimentos.

Figura 8. Caracterización de la escisión de Notch por ELISA. Se realizó el ELISA como se describe en la sección de Materiales y Procedimientos. Cuando se variaba la concentración de sustrato Notch, se incubó una concentración de 0,11 a 3,6 \muM de NusA-Notch con 68 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada y los datos se representaron usando un ajuste de curvas de Michaelis-Menton. Cuado se varió la concentración enzimática, se incubaron de 2,1 a 68 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada con sustrato Notch 0,9 \muM. Los datos representan la media de 3 experimentos y se representaron usando GraFit 4.0. Había una señal de aproximadamente factor 5: efecto de fondo (el efecto de fondo usando enzima sola es insignificante).

Figura 9. Inhibición de escisión de Notch por compuestos que se sabe que inhiben la escisión in vitro de CT-100 por la \gamma-secretasa. Se muestran los perfiles de inhibición para DAPT (PHA-568638) y fenquilamina (PHA-512088), medidos usando el ELISA de escisión de Notch. También se muestran los valores de CI50 relativos.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La EA es un importante trastorno relacionado con la edad asociado con demencia progresiva y con patología caracterizada por atrofia cortical y deposición de placas seniles y ovillos neurofibrilares. Un componente primario de las placas es el péptido de 40-42 aminoácidos de longitud, A\beta, derivado de una región del APP adyacente a y que contiene una porción del dominio transmembrana del APP de longitud completa. Este péptido patogénico se genera como resultado de un procesamiento secuencial debido a las actividades de \beta y \gamma-secretasas. Por lo tanto, las actividades enzimáticas de estas dos enzimas secretasas son objetivos de la investigación de fármacos (Olson y col., Curr. Opin. Drug Discovery & Develop. 4:390-401, 2001).

Se ha demostrado que el procesamiento del receptor de superficie celular Notch es similar al procesamiento del APP (Wolf y col. J. Biol. Chem. 276:5413-5416, 2001). La figura 1 muestra una comparación de los sitios de escisión de tipo \gamma-secretasa en APP y Notch. Como se muestra, el sitio de escisión en el APP esta en el centro del dominio transmembrana, mientras que Notch se escinde muy cerca del extremo C terminal-terminal de su dominio transmembrana. Se ha informado recientemente de un sitio de escisión \varepsilon similar (Marambaud y col., EMBO J., 21:1948-1956, 2002) en la catedrina E (Figura 1). La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de 1703-1860 de la proteína Notch incluyendo el sitio de escisión S3 en Notch (Steiner y col., J. Mol. Neurosci. 17:193-198, 2001). La escisión especifica en la unión 1743/1744 produciría el dominio intracelular de Notch V1744-D1860 (NICD), un fragmento del NICD observado en células transfectadas con construcciones Notch m\DeltaE (1704 a 2183) que carecen de los sitios de escisión S1 y S2 (Kopan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1683-1688, 1996). Aunque se ha informado sobre una construcción Notch (Val 1700-Glu 1809) (Esler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 2720-2725, 2002), no se ha descrito la escisión específica por la \gamma-secretasa en la unión 1743-1744 in vitro. La escisión específica en la unión 1743-1744 se puede determinar fácilmente mediante el uso del anticuerpo Val-1744 (Cell Signaling Technology). Este anticuerpo es específico para Notch escindido y no tiene reacciones cruzadas con la proteína Notch no escindida.

Por lo tanto, en las células, además de escindir el fragmento CT-100 producido por la acción de la \beta-secretasa, la \gamma-secretasa dependiente de PS1 también escinde en el sitio \varepsilon 1743-1744 para producir NICD. Este NICD escindido se transfiere al núcleo y está implicado en la señalización. La inhibición terapéutica de la actividad de la \gamma-secretasa designada para aliviar la EA, también da como resultado una inhibición de la producción de NICD. La presente invención proporciona por primera vez procedimientos y composiciones para identificar agentes terapéuticos que no inhiban la producción de NICD a partir de Notch -1.

Los procedimientos de la presente invención proporcionan ensayos in vitro para escisión y el uso de tales ensayos en la evaluación secundaria de inhibidores de \gamma-secretasa. Estos ensayos emplean un sustrato Notch soluble para la \gamma-secretasa que comprende una proteína de fusión soluble que comprende una proteína Notch recombinante fusionada al extremo C terminal de una secuencia proteica de NusA. Los ensayos de la presente invención se pueden realizar como ensayos directos ELISA in vitro y/o transferencias de Western para la escisión de la proteína Notch por la \gamma-secretasa. Los procedimientos de la presente invención proporcionan la producción y purificación de un sustrato de proteína Notch recombinante soluble (Asn 1703-Asp 1860) expresado en una línea celular adecuada, por ejemplo, E. coli, como una proteína de fusión con NusA modificada por ingeniería genética hasta una secuencia de proteína Notch (véase la figura 6).

Usando el sustrato de proteína de fusión purificado de la presente invención, los inventores demostraron escisión especifica en el sitio 1743-1744 en Notch usando una \gamma-secretasa solubilizada procedente de células HeLa. Como se describe en los ejemplos detallados, la proteína Notch escindida se puede detectar usando un anticuerpo específico para Val- 1744. Los inventores validaron este ensayo y demostraron que la escisión de la proteína Notch se inhibía de una manera dependiente de la dosis por DAPT, un inhibidor potente bien conocido de la \gamma-secretasa. Se desarrolló un ELISA basado en anticuerpos anti-Val-1744. Se proporcionó una validación adicional del ensayo Notch in vitro por medio de la inhibición de la escisión por inhibidores de la \gamma-secretasa. Opcionalmente, un inhibidor o un modulador se define como un compuesto que disminuye A\beta a través de la \gamma-secretasa.

I. Sustrato Notch para ensayar Notch in vitro

El sustrato Notch para usar en los ensayos de la presente invención es una proteína de fusión soluble de un polipéptido Notch con una proteína Nus. La proteína de fusión se puede marcar o modificar de otro modo para facilitar la purificación del péptido, la detección de la propia proteína de fusión Notch, o una detección de producto de escisión de la proteína de fusión Notch después de la acción de la \gamma-secretasa. La producción de la proteína de fusión y las modificaciones ejemplares se describen a continuación en este documento con detalle.

En un aspecto preferido de la presente invención, el sustrato Notch que contiene los aminoácidos N1703-D1860 de la proteína Notch-1 de ratón (número de entrada de secuencia de ADN Z11886; véase la figura 2) se une por el extremo N terminal al extremo C terminal de NusA. Se contempla que el polipéptido de fusión se puede producir por producción de proteínas recombinantes o, de hecho, por síntesis de péptidos automatizada como se discute en otras partes de la memoria descriptiva. El dominio transmembrana de la figura 2 abarca desde el aminoácido 1723 al 1744 (véase la figura 1). La \gamma-secretasa escinde Notch en la escisión \varepsilon entre los aminoácidos 1743 y 1744. Esta escisión también se denomina sitio de escisión S3 y genera NICD (es decir, un péptido que abarca los aminoácidos V1744-D1860).

Además de esta proteína de fusión nueva, la presente invención contempla la generación de adicciones terminales, también denominadas proteínas de fusión o polipéptidos de fusión, del sustrato de proteína de fusión Notch-NusA descrito anteriormente o identificado según la presente invención. Además, aunque las realizaciones preferidas de la presente invención muestran un péptido de fusión Notch-NusA que comprende N1703-D1860 de Notch-1 de ratón, se debe entender que la proteína Notch puede proceder de cualquier fuente. Esta fuente puede ser de mamífero o de no mamífero. Por lo tanto, aunque se prefiere que Notch-1 proceda de una fuente humana, de ratón, rata u otra fuente de mamífero, se contempla que en ciertas realizaciones el Notch-1 puede derivar de, por ejemplo, C. elegans, Xenopus, Drosophila, y otras fuentes de invertebrados.

Además se contempla que cualquier derivado de Notch-1 que contenga los sitios de escisión de \gamma-secretasa 1731/1732 (sitio \gamma) y el sitio 1743-1744 (escisión \varepsilon) será útil en el sustrato de proteína de fusión de la presente invención. En Notch-1, el sitio de escisión de \gamma-secretasa que libera NICD se localiza en el sitio 1743-1744 de Notch. Se contempla que la distancia entre el sitio de escisión y el inicio de una NusA es de aproximadamente 500 aminoácidos para imitar las propiedades estéricas del dominio de escisión por la \gamma-secretasa de Notch. Esta distancia se puede generar por la proteína NusA se puede crear mediante un engarce peptídico heterólogo. Preferentemente, esta región es de la proteína NusA. El componente de dominio de proteína NusA del polipéptido de fusión Notch/NusA, puede ser esencialmente cualquier parte de la proteína NusA que permita que la fusión Notch/NusA se mantenga soluble y, por lo tanto, susceptible de un ensayo in vitro.

La NusA se ha usado previamente para producir la expresión soluble de proteínas en E. coli (véase, por ejemplo, Wilkinson y col., Bio/Technology 9, 443-448, 1991; Davis y col., Biotechnol Bioeng., 65(4):382-8, 1999). En este documento, una proteína NusA que comprende la secuencia de la ID SEC Nº 17 (codificada por una secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 16 se fusiona a Notch. Sin embargo, los expertos en la materia pueden emplear una secuencia de NusA diferente de la secuencia representada en la ID SEC Nº 17 y seguir produciendo una proteína de fusión Notch-NusA soluble de la presente invención. Por ejemplo, un experto en la materia puede usar una proteína NusA que comprenda 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o mas de homología de secuencia con la secuencia de ID SEC Nº 17. Alternativamente, los expertos en la materia pueden emplear un fragmento contiguo menor de NusA derivado de la ID SEC Nº 17, por ejemplo el fragmento puede ser 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 475, 500, 510, 520, 530, 540, 550 o mas aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 17.

Los principios generales para diseñar y hacer proteínas de fusión son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las fusiones emplean normalmente secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína o un péptido en un huésped heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación del polipéptido de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en o cerca de la unión de fusión facilitara la retirada de polipéptido extraño después de la purificación. La producción recombinante de estas fusiones se describe con más detalle a lo largo de esta memoria descriptiva. Otras fusiones útiles incluyen la unión de dominios funcionales, tales como sitios activos para enzimas, dominios de glicosilación, señales de dirección celular o regiones transmembrana.

Mas particularmente, la presente invención contempla un polipéptido de fusión en el que hay un primer componente que comprende la proteína Notch que contiene los sitios de escisión 1731/1732 (escisión \gamma) y 1743/1744 (escisión \varepsilon) unidos a un segundo componente que comprende toda o una parte de la proteína NusA. En realizaciones adicionales, el polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un tercer componente que comprende un producto génico de información. En otras realizaciones adicionales, los polipéptidos de fusión pueden comprender adicionalmente un componente de secuencia etiquetado. Un polipéptido de fusión particular que se contempla es uno que comprende un producto de un gen de información en un lado de una parte de NusA, un tramo de secuencia que contiene la proteína Notch con los sitios de escisión de la \gamma-secretasa y una secuencia etiquetada en el otro lado de la proteína Notch. El producto de gen de información usado en los polipéptidos de fusión de la presente invención puede ser cualquier proteína de información usada comúnmente por los expertos en la materia. Las proteínas de información ejemplares incluyen, pero sin limitación, luciferasa; fosfatasa alcalina secretada (SPAE); \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa; proteína fluorescente verde y cloranfenicol acetil transferasa.

Otras realizaciones particulares contemplan adicionalmente una secuencia etiquetada como un cuarto componente de los polipéptidos de fusión de la presente invención. Hay diversos sistemas de expresión de proteínas de fusión disponibles en el mercado que se pueden usar para proporcionar una secuencia etiquetada en este contexto de la presente invención. Los sistemas particularmente útiles incluyen, pero sin limitación, el sistema de glutatión S-transferasa (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de proteína de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estos sistemas son capaces de producir polipéptidos recombinantes que llevan solamente un pequeño número de aminoácidos terminales, que probablemente no afecten a la actividad biológicamente relevante de la proteína de fusión recombinante. Por ejemplo, el sistema Flag y el sistema 6xHis solamente añaden secuencias cortas, sabiéndose que ambos son poco antigénicos y que no afectan de forma adversa al plegamiento del polipéptido hasta su conformación nativa. Otra fusión N-terminal que se contempla que es útil es la fusión de un dipéptido Met Lys en la región N-terminal de la proteína o los péptidos. Tal fusión puede producir aumentos beneficiosos en la expresión y/o actividad de la proteína. Las secuencias etiquetadas específicas que se contemplan para usar en la presente invención incluyen la secuencia de etiqueta FLAG C-terminal DYKDDDDK (ID SEC Nº 14). Además, las secuencias etiquetadas también pueden contener una etiqueta 8His para producir una etiqueta FLAG/8His unida a la proteína de fusión (DYKDDDDKHHHHHHHH, ID SEC Nº 15).

Un ejemplo de una proteína de fusión preferida de la presente invención es una en la que NusA se fusiona a una proteína Notch-1 de ratón parcial o de longitud completa que comprende los sitios de escisión de \gamma-secretasa 1731/1732 y 1743/1744 junto con una cola corta C-terminal etiquetada con FLAG/8His. La secuencia de un polipéptido de fusión ejemplar comprende los aminoácidos 1703-1860 de Notch de ratón (es decir, representado en la ID SEC Nº 13) fusionados a una proteína NusA. Este polipéptido de fusión ejemplar tiene la secuencia de ID SEC Nº 2. Para controlar la escisión de esta construcción quimérica por la \gamma-secretasa, se emplean anticuerpos anti-Val 1744 contra el producto de escisión Notch que contiene el resto Val-1744 para determinar la presencia y concentración del fragmento Val-1744 generado como resultado de la escisión de Notch. Se pueden emplear anticuerpos anti-Flag para detectar el extremo C terminal de la construcción quimérica. Sin embargo, se debe señalar que la construcción quimérica también puede emplear una proteína de información tal como una fosfatasa alcalina, por ejemplo, en el extremo C terminal en vez de la etiqueta Flag. Tal proteína de información se liberaría como resultado de la escisión de Notch y se detectaría usando ensayos bien conocidos por los expertos en la materia.

Además de proporcionar polipéptidos de fusión como ya se ha descrito, la invención proporciona proteínas de fusión de Notch que se modifican adicionalmente para incorporar, por ejemplo, una etiqueta u otro resto detectable.

Por ejemplo, los sustratos de la proteína de fusión Notch/NusA comprenden etiquetas inactivadas internamente que dan como resultado una mayor detectabilidad después de la escisión del sustrato Notch. Los sustratos de la proteína de fusión Notch/NusA se pueden modificar para tener unido un fluoróforo pareado y un inactivador incluyendo, pero sin limitación, 7-amino, 4-metil cumarina y 2,4-dinitrofenol, respectivamente, de forma que la escisión del péptido por la \gamma-secretasa tenga como resultado una mayor fluorescencia debido a la separación física del fluoróforo y el inactivador, que se unen en lados opuestos del enlace escindible por la \gamma-secretasa. Otros fluoróforos pareados e inactivadores incluyen tetrametilrodamina y QSY-5 (Molecular Probes, Inc.). En una variante de este ensayo, se puede poner biotina u otra etiqueta adecuada en un extremo del péptido para anclar el péptido a una placa de ensayo de sustrato y se puede poner un fluoróforo en el otro extremo de la proteína de fusión. Los fluoróforos útiles incluyen los enumerados anteriormente, así como etiquetas de Europio tales como W8044 (EG&Wallac, Inc). Otra etiqueta preferida que se puede usar es verde Oregón, que se puede unir a un resto Cys. La escisión de la proteína de fusión por \gamma-secretasa liberará el fluoróforo u otra etiqueta de la placa, permitiendo que los compuestos se ensayen respecto a la inhibición de la escisión proteolítica como se muestra por un aumento de la fluorescencia retenida. Los ensayos colorimétricos preferidos de la actividad proteolítica de la \gamma-secretasa utilizan otras proteínas de fusión Notch/NusA en las que los aminoácidos que comprenden el sitito de reconocimiento de la \gamma-secretasa para la escisión están unidos a o-nitrofenol a través de un enlace amida, de tal forma que la escisión de la proteína de fusión por la \gamma-secretasa tenga como resultado un aumento en la densidad óptica después de alterar el tampón de ensayo hasta un pH alcalino.

Además, la proteínas de fusión Notch/NusA se pueden marcar usando marcadores bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, se contemplan particularmente marcadores de biotina. El uso de estos marcadores se conoce bien por los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 3.817.837, la patente de Estados Unidos Nº 3.850.752; la patente de Estados Unidos Nº 3.996.345 y la patente de Estados Unidos Nº 4.277.437. Otros marcadores que serán útiles incluyen, ero sin limitación, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes y marcadores quimioluminiscentes. Las patentes de Estados Unidos concernientes al uso de tales marcadores incluyen, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 3.817.837; la patente de Estados Unidos Nº 3.850.752; la patente de Estados Unidos Nº 3.939.350; la patente de Estados Unidos Nº 3.996.345. Cualquiera de las composiciones de proteína de fusión Notch/NusA de la presente invención puede comprender una, dos o más de cualquiera de estos marcadores.

II. Composiciones de \gamma-secretasa

Además de las proteínas de fusión de Notch nuevas, la presente invención se refiere a procedimientos para usar tales proteínas de fusión de Notch en diversos ensayos de \gamma-secretasa. La presente sección proporciona una discusión para generar reacciones que contienen proteínas que tienen una actividad \gamma-secretasa.

Mientras que la identidad exacta de la \gamma-secretasa sigue siendo desconocida, hay una fuerte evidencia de que la \gamma-secretasa puede ser presenilina 1. Independientemente del hecho de que la secuencia de la proteína \gamma-secretasa aún no se haya identificado, los expertos en la materia son conscientes de los procedimientos y composiciones para aislar fracciones celulares que comprenden \gamma-secretasa. Por ejemplo, Li y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6138-6143, 2000) describieron procedimientos y composiciones para producir una preparación de membrana que contiene una actividad \gamma-secretasa solubilizada. Tal procedimiento es útil en la presente función para proporcionar una fracción purificada que contenga una \gamma-secretasa. Una vez que se ha producido esta fracción, se contempla que se puede usar en los ensayos de la presente invención. Además, las nuevas proteínas de fusión de la presente invención también se pueden usar para aislar y purificar adicionalmente la \gamma-secretasa de dicha fracción de membrana usando, por ejemplo, técnicas de separación cromatográfica por afinidad.

La fracción de \gamma-secretasa se aísla generalmente de cualquier célula que exprese una actividad \gamma-secretasa. Por ejemplo, se pueden usar células HeLa3. Las células se rompen usando, por ejemplo, una prensa French u otra técnica de destrucción celular, incluyendo, pero sin limitación, técnicas de congelación-descongelación (por ejemplo, sometiendo las células a ciclos entre hielo seco y un baño de agua a 37ºC); procedimientos de cizalla de sólidos usando una prensa Hughes o French; lisis con detergente (por ejemplo, en soluciones de detergente no iónico tales como Tween, Triton, NP-40, etc.); lisis en solución hipotónica (por ejemplo, agua, tampón cítrico); procedimientos de cizalla de líquidos (homogeneizador, microfluidizador de chorro); o sonicación (ultrasonidos). Después de la lisis celular, los restos y núcleos celulares se pueden retirar por sedimentación usando centrifugación. La fracción de membrana se precipita, por ejemplo, a 100.000 g durante 60 minutos y la fracción de membrana se puede solubilizar adicionalmente usando detergente. Por ejemplo, en el proceso de solubilización enseñado por Li y col. supra, el sedimento de la fracción de membrana de la etapa de centrifugación a 100.000 g se resuspende en tampón y se trata con CHAPSO a 1% durante 60 minutos a 4ºC y si se centrifuga durante 60 minutos. Este procedimiento de solubilización de detergente es tal que el sobrenadante de la fracción de 100.000 g contiene la \gamma-secretasa solubilizada.

La fracción solubilizada anterior se usa en los ensayos de \gamma-secretasa descritos en este documento.

III. Producción y purificación de proteína o péptido

La presente invención proporciona sustratos de proteína Notch soluble para usar en la identificación de moduladores de \gamma-secretasa que sean específicos para la escisión de APP pero que no inhiban la escisión de Notch. Tales sustratos se pueden producir por procedimientos de síntesis de péptidos automatizados convencionales o por expresión recombinante.

A. Producción de péptidos sintéticos

Los péptidos o incluso los polipéptidos de fusión de longitud completa de la invención se pueden sintetizar en solución o sobre un soporte de sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automáticos están disponibles en el mercado y se pueden usar según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam y col., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, 1983; Merrifield, Science, 232:341-347, 1986; y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284, 1979, incorporados cada uno en este documento como referencia. Los sustratos de las nuevas proteínas de fusión de Notch de la invención comprenden los sitios de escisión de \gamma-secretasa 1731/1732 y 1743/1744 que son susceptibles de escisión por la \gamma-secretasa que se pueden sintetizar fácilmente y detectar selectivamente después en ensayos de detección selectiva de \gamma-secretasa.

En procedimientos particularmente preferidos, las proteínas de fusión de la presente invención se sintetizaron por tecnología en fase sólida empleando un modelo 433A de Applied Biosystems Inc. La pureza de cualquier proteína de fusión de Notch dada, generada por síntesis de péptidos automatizada o por procedimientos recombinantes, se puede determinar usando análisis de HPLC de fase inversa. La autenticidad química de cada péptido se puede establecer por cualquier procedimiento bien conocido por los expertos en la materia. En realizaciones preferidas, la autenticidad se establece por espectrometría de masas.

Adicionalmente, las proteínas de fusión se pueden cuantificar usando análisis de aminoácidos en los que se realizan hidrólisis por microondas. Tales análisis pueden usar un horno de microondas tal como el horno microondas MDS 2000 de CEM Corporation. El péptido (aproximadamente 2 mg de proteína) se pone en contacto con HCl 6 N (Pierce Constant Boiling, por ejemplo, aproximadamente 4 ml) con fenol a aproximadamente 0,5% (volumen a volumen) (Mallinckrodt). Antes de la hidrólisis, las muestras se evalúan y lavan de forma alterna con N2. La hidrólisis de proteínas se realiza usando un procedimiento de dos etapas. Durante la primera etapa, las proteínas de fusión se someten a una temperatura de reacción de aproximadamente 100ºC y se mantienen a esa temperatura durante un minuto. Inmediatamente después de esta etapa, la temperatura se aumenta hasta 150ºC y se mantiene a esa temperatura durante aproximadamente 25 minutos. Después del enfriamiento, las muestras se secan y se derivatizan aminoácidos de las muestras de proteínas de fusión hidrolizadas usando carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo para obtener ureas estables que emiten fluorescencia a 395 nm (Waters AccQ.Tag Chemistry Package). Las muestras se pueden analizar por HPLC de fase inversa y se puede conseguir la cuantificación usando un integrador potenciado.

B. Producción de proteínas recombinantes

Como una alternativa a la síntesis de péptidos automatizada, se puede emplear tecnología de ADN recombinante en la que una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, se utiliza para transformar o transfectar una célula huésped apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión como se describe a continuación en este documento. Se prefieren especialmente los procedimientos recombinantes para producir polipéptidos más largos que comprenden secuencias peptídicas de la invención.

A partir de la descripción de los sustratos de las nuevas proteínas de fusión de Notch de la presente invención, es posible producir los polipéptidos de fusión mediante técnicas recombinantes. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión/sistemas de huésped para contener y expresar la secuencia que codifica el péptido o el polipéptido de fusión. Éstos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plasmídicos o cosmídicos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Las células de mamífero que son útiles en producciones de proteínas recombinantes incluyen, pero sin limitación, células VERO, células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tal como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y células 293. A continuación se describen en este documento protocolos ejemplares para la expresión recombinante de las proteínas de fusión de Notch en bacterias, levaduras y otros invertebrados.

Los vectores de expresión para usar en huéspedes procariotas comprenden generalmente uno o más genes marcadores que se pueden seleccionar fenotípicamente. Tales genes codifican generalmente, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requisito auxotrófico. Una amplia variedad de tales vectores ya está disponible en fuentes comerciales. Los ejemplos incluyen vectores pSPORT, vectores pGEM (Promega), vectores pPROEX (LTI, Bethesda, MD), vectores Bluescript (Stratagene), vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Quiagen). La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de Notch dada se amplifica por PCR y se clona en dicho vector, por ejemplo pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ) diseñado para producir una proteína de fusión que comprenda glutatión-S-transferasa (GST), codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR se pueden generar para incluir, por ejemplo, un sitio de escisión apropiado. Es de esperar que el tratamiento de la proteína de fusión recombinante con trombina o factor Xa (Pharmacia, Piscataway, NJ) escinda la proteína de fusión, liberando el sustrato o polipéptido que contiene el sustrato de la parte GST. La construcción de pGEX-3X/péptido de fusión se utiliza para transformar células E. coli XL-1 I Blue (Stratagene, La Jolla CA), y se aíslan y se dejan crecer los transformantes individuales. Se purifica ADN plasmídico de los transformantes individuales y se secuencia parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del péptido o polipéptido deseados que codifica el inserto de ácido nucleico en la orientación apropiada.

La inducción de la proteína de fusión de sustrato/GST se consigue por el crecimiento del cultivo transformado XL-1 Blue a 37ºC en medio LB (suplementado con carbenicilina) hasta una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm de 0,4, seguido de una incubación adicional durante 4 horas en presencia de isopropil*-D-Tiogalactopiranósido 0,5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

La proteína de fusión GST, que se espera que se produzca como un cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, se puede purificar del siguiente modo. Las células se recogen por centrifugación; se lavan en NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se clarifica por sonicación, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. El sedimento que contiene proteína de fusión se resuspende en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM, se pone sobre glicerol a 50%, y se centrifuga durante 30 minutos a 6000 X g. El sedimento se resuspende en solución salina tamponada con fosfato (PBS) convencional libre de Mg++ y Ca++. La proteína de fusión se purifica adicionalmente fraccionando el sedimento resuspendido en gel de poliacrilamida y SDS desnaturalizante (Sambrook y col. eds. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). El gel se sumerge en KCl 0,4 M para visualizar la proteína, que se escinde y se somete a electroelución en un tampón de corrimiento en gel sin SDS. Si la proteína de fusión GST/Notch se produce en bacterias como una proteína soluble, se puede purificar usando el módulo de purificación de GST (Pharmacia Biotech).

La proteína de fusión se puede someter a digestión con trombina para escindir la GST del polipéptido de fusión de Notch maduro. La reacción de digestión (20-40 \mug de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) en 0,5 ml de PBS) se incuba durante 16-48 horas a temperatura ambiente y se carga en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los productos de reacción. El gel se sumerge en KCl 0,4 M para visualizar las bandas de proteínas. La identidad de la banda de proteína correspondiente al peso molecular esperado del polipéptido de fusión se puede confirmar por un análisis de la secuencia de aminoácidos parcial usando un secuenciador automático (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, CA).

Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica el sustrato previsto que contiene el polipéptido de fusión se puede clonar en un plásmido que contiene un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder (véase, por ejemplo, Better y col., Science, 240: 1041-43, 1988). La secuencia de esta construcción se puede confirmar por secuenciación automática. El plásmido después se utiliza para transformar a E. coli usando procedimientos convencionales empleando incubación de CaCl2 y tratamiento de choque térmico de las bacterias (Sambrook y col., supra). Las bacterias transformadas se dejan crecer en medio LB suplementado con carbenicilina, y la producción de la proteína expresada se induce por crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder realizará la secreción de la proteína de fusión basada en Notch madura y se escindirá durante la secreción.

La proteína recombinante secretada se purifica del medio de cultivo bacteriano mediante el procedimiento que se describe a lo largo de este documento.

De forma similar, se pueden emplear células huésped de levadura de géneros que incluyen Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces para generar el péptido recombinante. Los huéspedes de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris. Los vectores de levadura contendrán a menudo una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2T, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región de promotor, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción, y un gen marcador selectivo. También se pueden usar vectores que se pueden reaplicar en levadura y en E. coli (denominados vectores lanzadera). Además de las características que se han mencionado anteriormente de los vectores de levadura, un vector lanzadera también incluirá secuencias para la replicación y selección en E. coli. La secreción directa de los polipéptidos expresados en huéspedes de levadura se puede conseguir por la inclusión de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder del factor l de levadura en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el sustrato.

Generalmente, un sustrato dado se puede expresar de forma recombinante en levadura usando un sistema de expresión disponible en el mercado, por ejemplo, el sistema de expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia previa a un pro-alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto se dirige por la alcohol oxidasa (AOX1) después de la inducción por metanol.

El sustrato recombinante secretado se purifica del medio de crecimiento de levadura, por ejemplo, por los procedimientos usados para purificar el sustrato de los sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero.

Alternativamente, un ADN sintético que codifica el sustrato nuevo de la invención se puede clonar en el vector de expresión de baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA; Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)). Este vector que contiene sustrato se usa después según las instrucciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio sin proteína sF9 y para producir proteína recombinante. La proteína o el péptido se purifica y se concentra en el medio usando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) y columnas de tamizado molecular secuenciales (Amicon, Beverly, MA), y se resuspende en PBS. El análisis SDS-PAGE muestra una única banda y confirma el tamaño de la proteína, y la secuenciación de Edman en un secuenciador de péptidos Porton 2090 confirma su secuencia N-terminal.

Alternativamente, el sustrato de la proteína de fusión de Notch se puede expresar en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para la expresión de proteínas se conocen bien por los expertos en la materia. En uno de esos sistemas, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodopetera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia que codifica al sustrato se clona en una región no esencial del virus, tal como el gel de la poliedrina, y se pone bajo control del promotor de poliedrina. La inserción satisfactoria del sustrato dará como resultado que el gen de la poliedrina se inactive y producirá virus recombinantes carentes de proteína de revestimiento. Los virus recombinantes se usan después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el sustrato (Smith y col., J Virol 46:584, 1983; Engelhard EK y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-7, 1994).

Los sistemas huéspedes de mamífero para la expresión de proteínas recombinantes también son bien conocidos por los expertos en la materia. Se pueden elegir cepas de células huésped para una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir determinadas modificaciones postraduccionales que serán útiles para proporcionar actividad de la proteína. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional escinde una forma "prepro" de la proteína también puede ser importante para la inserción, plegamiento y/o función correctas. Diferentes células huésped tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 y similares tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para estas actividades post-traduccionales y se pueden seleccionar para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

Es preferible que las células transformadas se usen para la producción a largo plazo y de alto rendimiento y de esta manera, es deseable una expresión estable. Una vez que tales células se transforman con vectores que contienen marcadores selectivos junto con el casete de expresión deseado, las células se dejan crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El marcador selectivo se diseña para conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células con expresión satisfactoria de las secuencias introducidas. Grupos resistentes de células transformadas de manera estable pueden hacerse proliferar usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para la célula.

Se pueden usar varios sistemas de selección para recuperar las células que se han transformado para la producción de proteína recombinante. Tales sistemas de selección incluyen, pero sin limitación, genes de la timidina quinasa de HSV, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, se puede usar la resistencia anti-metabolito como base para la selección de dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo que confiere resistencia al aminoglicósido G418; ALS que confiere resistencia a clorosulfurón; e hygro que confiere resistencia a higromicina. Los genes selectivos adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, que permite a las células utilizar indol en vez de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en vez de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de los transformantes incluyen antocianinas, b-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina.

C. Mutagénesis específica de sitio

La mutagénesis específica de sitio es otra técnica útil en la preparación de un péptido sustrato de la \gamma-secretasa individual y, más particularmente, de polipéptidos de fusión que comprenden como un componente una de las proteínas de fusión sustrato de la \gamma-secretasa de la presente invención. Esta técnica emplea mutagénesis específica del ADN subyacente (que codifica la secuencia de aminoácidos que es el objetivo de la modificación). La técnica proporciona además una capacidad rápida para preparar y ensayar variantes de secuencia, que incorporan una o más de las anteriores consideraciones, introduciendo uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutantes por medio del uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador con suficiente tamaño y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable a ambos lados de la unión de deleción que se atraviesa. Normalmente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 restos a ambos lados de la unión de la secuencia que se altera.

La técnica emplea normalmente un vector de bacteriófago que existe en forma de hebra única y de doble hebra. Los vectores típicos útiles en mutagénesis dirigidas incluyen vectores tales como el fago M13. Estos vectores de fago están disponibles en el mercado y su uso se conoce generalmente por los expertos en la materia. Los plásmidos de hebra doble también se emplean rutinariamente en mutagénesis dirigida, que elimina la etapa de transferir el gen de interés desde un fago a un plásmido.

En general, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza obteniendo en primer lugar un vector de hebra única, o fusionando dos hebras de un vector de doble hebra que incluye en su secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína deseada. Un cebador oligonucleotídico que lleva la secuencia mutada deseada se prepara sintéticamente. Ese cebador se templa después con la preparación de ADN de hebra única, teniendo en cuenta el grado de no coincidencia cuando se seleccionan las condiciones de hibridación (templado), y se somete a enzimas de polimerización de ADN tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que lleva mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia original no mutada y la segunda hebra lleva la mutación deseada. Este vector de heterodúplex se usa después para transformar células apropiadas, tales como células E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposición de secuencia mutada.

Por supuesto, el enfoque que se ha descrito anteriormente para mutagénesis dirigidas al sitio no es el único procedimiento para generar especies de péptidos mutantes potencialmente útiles y, como tal, no debe considerarse limitante. La presente invención también contempla otros procedimientos para conseguir mutagénesis tales como, por ejemplo, tratar los vectores recombinantes que llevan el gen de interés con agentes mutágenos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia.

D. Purificación de proteína

Será deseable purificar las proteínas de fusión de la presente invención. Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la materia. Estas técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento bruto del medio celular hasta fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Habiendo separado los péptidos o polipéptidos de la invención de otras proteínas, los polipéptidos o péptidos de fusión de interés se pueden purificar adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir la purificación parcial o completa (o purificación hasta la homogeneidad). Son procedimientos analíticos adecuados particularmente para la preparación de un péptido puro cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida; y enfoque isoeléctrico. Un procedimiento particularmente eficaz para purificar proteínas de fusión es la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) o incluso cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En realizaciones particularmente preferidas, la fusión NusA-Notch se aisló usando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).

La IMAC se usa en primer lugar en la purificación de proteínas recombinantes etiquetadas con polihistidina. En la presente invención, el extremo C terminal de la proteína de fusión comprende una etiqueta de polihistidina, permitiendo de este modo la purificación por esta potente técnica. Esta purificación se basa en la tendencia natural de la histidina para quelar metales divalentes. La colocación del ion metálico en un soporte cromatográfico permite la purificación de las proteínas etiquetadas con histidina. Este es un procedimiento altamente eficaz que se ha empleado por los expertos en la materia para una variedad de procedimientos de purificación de proteína. Las condiciones ejemplares de una realización preferida para aislar la proteína de la presente invención se describen en el ejemplo 1. Sin embargo, se debe entender que los expertos en la materia podrían variar las condiciones y los medios y seguir consiguiendo la purificación según la presente invención. Para este fin, los expertos en la materia se remiten a la patente de Estados Unidos Nº 4.431.546 que describe detalladamente procedimientos de separación cromatográfica de afinidad en metales de sustancias biológicas o relacionadas de una mezcla. Los medios cromatográficos descritos en la patente que se menciona anteriormente comprenden materiales de unión que tienen un ligando que contiene al menos uno de los grupos antraquinona, ftalocianina o azo aromático, en presencia de al menos un ion metálico seleccionado del grupo Ca2+, Sr2+, Ba2+, Al3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ o Zn2+ Se describen medios y condiciones adicionales, por ejemplo, en http://www.affiland.com/imac/nta.htm y http//www.affiland.com/imac/pdc.htm.

Determinados aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, a la purificación sustancial de un polipéptido, proteína o péptido codificado. La expresión "polipéptido, proteína o péptido purificado", como se usa en este documento, pretende referirse a una composición aislada de otros componentes, en la que el polipéptido, la proteína o el péptido se purifica hasta cualquier grado relativo a los componentes celulares o sintéticos usados para generar la proteína. Un polipéptido, proteína o péptido purificado, por lo tanto, también se refiere a un polipéptido, una proteína o un péptido libre del entorno en el que puede tener su origen natural.

Generalmente, "purificado" se referirá a un polipéptido, proteína o composición peptídica que se ha sometido a fraccionamiento para retirar diversos componentes adicionales, y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa la expresión "purificada sustancialmente", esta denominación se referirá a una composición en la que el polipéptido, la proteína o el péptido constituye el componente principal de la composición, tal como constituyendo aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente, 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición.

Los expertos en la materia conocerán diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación del polipéptido, la proteína o el péptido a la luz de la presente descripción. Éstos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos en una fracción por análisis SDS/PAGE. Un procedimiento preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial, y de este modo calcular el grado de pureza, evaluada en este documento por un "número de factor de purificación".

Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y de si el polipéptido, la proteína o el péptido expresado muestra o no una actividad detectable.

Los expertos en la materia conocerán bien diversas técnicas adecuadas para usar en la purificación de proteínas. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares o por desnaturalización por calor, seguido de centrifugación; etapas de cromatografía tales como intercambio iónico, exclusión molecular, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad, enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de la realización de las diversas etapas de purificación se puede cambiar, o que ciertas etapas se pueden omitir, y seguir dando como resultado un procedimiento adecuado para la preparación de un polipéptido, una proteína o un péptido sustancialmente
purificado.

No hay ningún requisito general para que el polipéptido, la proteína o el péptido se proporcionen siempre en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas realizaciones. Se puede conseguir la purificación parcial usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se apreciará que una cromatografía en columna de intercambio de cationes realizada usando un aparato de HPLC generalmente dará como resultado una purificación de "factor" mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los procedimientos que muestran un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o al mantener la actividad de una proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, en ocasiones significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977). Por lo tanto, se apreciará que en diferentes condiciones de electroforesis, los pesos moleculares aparentes de productos de expresión purificados o parcialmente purificados pueden variar.

IV. Construcciones de expresión para usar en la producción de los sustratos de la invención

En la presente invención, puede ser necesario expresar las proteínas de la fusión de Notch de la presente invención. Para conseguir tal expresión, la presente invención empleará vectores que comprenden moléculas polinucleotídicas para codificar las proteínas de fusión de Notch de la presente invención, así como células huésped transformadas con tales vectores. Tales moléculas polinucleotídicas se pueden unir a un vector, que incluye generalmente un marcador selectivo y un originen de replicación, para la propagación en un huésped. Estos elementos de las construcciones de expresión usadas en la presente invención se describen a continuación en este documento con más detalle.

Los vectores de expresión incluyen ADN que codifica cualquiera de los substratos de \gamma-secretasa de péptido o de polipéptido de fusión dados descritos anteriormente o a continuación, unidos de forma funcional a secuencias reguladoras de la transcripción o de la traducción adecuadas, tales como las derivadas de un gen de mamífero, microbiano, viral o de insecto. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores o potenciadores, sitios de unión ribosómicos de ARNm y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción.

Las expresiones "vector de expresión", "construcción de expresión" o "casete de expresión" se usan de forma indistinta a lo largo de esta memoria descriptiva y se indican para incluir cualquier tipo de construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica un producto génico en el que puede transcribirse parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico.

La selección de un vector de expresión adecuado para la expresión de los polipéptidos de fusión de la invención dependerá, por supuesto, de la célula huésped específica que se usa, y se conoce por los expertos en la materia. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen pcDNA3 (Invitrogen) y pSVL (Pharmacia Biotech). Un vector preferido para la expresión en la presente invención es pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Los vectores de expresión para usar en células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de la transcripción y la traducción derivadas de genomas virales. Las secuencias de promotor usadas comúnmente y las secuencias de potenciador que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero sin limitación, las derivadas del citomegalovirus humano (CMV), Adenovirus 2, virus del polioma, y virus de simio 40 (SV40). Se describen procedimientos para la construcción de vectores de expresión de mamífero, por ejemplo, en Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983); Cosman y col. (Mol. Immunol. 23:935, 1986); Cosman y col. (Nature 312:768, 1984); en el documento EP-A-0367566; y en el documento WO 91/18982.

La construcción de expresión comprenderá una región de ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión de Notch particulares de la presente invención. Las regiones codificantes para usar en la construcción de tales vectores de expresión deben codificar al menos la escisión de \gamma-secretasa de las proteínas de fusión descritas en este documento aunque se contempla que se pueden codificar polipéptidos mayores siempre que uno de los péptidos generados comprenda sitios de escisión de la \gamma-secretasa 1731/1732 y 1743/1744 que son susceptibles de escisión por la \gamma-secretasa.

En ciertos aspectos de la presente invención, la construcción de expresión puede comprender adicionalmente un marcador selectivo que permita la detección de la expresión del polipéptido o el péptido. Habitualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación y en la selección de transformantes, por ejemplo, neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, zeocina e histidinol. Alternativamente, se pueden emplear enzimas tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple (eucariótica), b-galactosidasa, luciferasa o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (procariótica). También se pueden emplear marcadores inmunológicos. Por ejemplo, se pueden emplear etiquetas de epítopo tales como el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), HA y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Adicionalmente, también se pueden usar el sistema de glutatión S-transferasa (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), o el sistema de proteína de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA). No se cree que sea importante el marcador selectivo empleado, siempre que pueda expresarse de forma simultánea con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Se conocen bien ejemplos adicionales de marcadores selectivos por los expertos en la materia. Son marcadores selectivos particularmente preferidos que se pueden emplear en la presente invención la resistencia a neomicina o un marcador GFP.

La expresión requiere que se proporcionen señales apropiadas en los vectores. La presente sección incluye una discusión de diversos elementos reguladores, tales como potenciadores/promotores de fuentes virales y de mamífero que se pueden usar para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de interés en células huésped. También se definen elementos diseñados para optimizar la estabilidad y la capacidad de traducción de ARN mensajero en células huésped. También se proporcionan las condiciones para usar varios marcadores de selección de fármaco dominantes para establecer clones celulares estables permanentes que expresen los productos, como un elemento que asocia la expresión de los marcadores de selección de fármaco a la expresión del fenotipo mutante.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica el péptido dado o el ácido nucleico que codifica un marcador selectivo está bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la máquina sintética de la célula, o la máquina sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen.

Las secuencias de nucleótidos se unen de forma funcional cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica la proteína de fusión de Notch. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos de promotor se une de forma funcional a una secuencia de ADN dada si la secuencia de nucleótidos del promotor dirige la transcripción de la secuencia. De forma similar, la frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la localización y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen.

El término promotor se usará en este documento para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se agrupan alrededor del sitio de iniciación de la ARN polimerasa II. Muchos de los conocimientos de cómo se organizan los promotores se obtiene de los análisis de varios promotores virales, incluyendo dos de la timidina quinasa de HSV (tk) y unidades de transcripción temprana de SV40. Estos estudios, aumentados por trabajos más reciente, han demostrado que los promotores se componen de módulos funcionales discretos, constituido cada uno por aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para el activador transcripcional o proteínas represoras.

Al menos un módulo en cada promotor funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tales como el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto superpuesto al sitio de inicio ayuda a fijar el sitio de inicio.

Otros elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Normalmente, éstos se localizan en la región de 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios promotores también contienen elementos funcionales cadena abajo del sitio de inicio. La separación entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de forma que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven unos respecto a otros. En el promotor de tk, la separación entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece ser que los elementos individuales pueden funcionar cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.

No se cree que sea importante el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés, siempre que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula diana. Por lo tanto, cuando se dirige a una célula humana, es preferible colocar la región que codifica el ácido nucleico adyacente a y bajo el control de un promotor que pueda expresarse en una célula humana. En términos generales, un promotor de este tipo puede incluir un promotor humano o viral.

En diversas realizaciones, se pueden usar el promotor del gen temprano de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la \beta-actina, el promotor de insulina de rata, el promotor de la fosfoglicerol quinasa y el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, que son todos promotores bien conocidos y fácilmente disponibles para los expertos en la materia, para obtener una expresión de alto nivel de la secuencia codificante de interés. También se contempla el uso de otros promotores virales o de células de mamífero o de bacteriófagos que son bien conocidos en la técnica para conseguir la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un fin dado. Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, pueden optimizarse el nivel y el patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección o transformación.

La selección de un promotor que se regula en respuesta a una señal fisiológica o sintética específica puede permitir la expresión inducible del producto génico. Están disponibles varios sistemas de promotor inducibles para la producción de vectores virales. Uno de tales sistemas es el sistema ecdysone (Invitrogen, Carlsbad, CA), que está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión muy regulado que no permite que haya prácticamente expresión basal del transgén, pero proporciona una inducibilidad en un factor mayor de 200.

Otro sistema inducible útil es el sistema de Tet-OffTM o Tet-OnTM (Clontech, Palo Alto, CA) desarrollado originariamente por Gossen y Bujard (Gossan y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 15; 89(12):5547-51, 1992; Gossen y col., Science, 268(5218):1766-9, 1995).

En células de mamífero, el promotor temprano inmediato de CMV se usa a menudo para proporcionar una activación transcripcional fuerte. También se han usado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles disminuidos de expresión del transgén. Los promotores retrovirales tales como los LTR de MLV o MMTV se contemplan como útiles en la presente invención. Otros promotores virales que se puede usar incluyen SV40, RSVLTR, HIV-1 y BIV-2LTR, promotores de adenovirus tales como de la región E1A, E2A o MLP, LTR de AAV, virus del mosaico de la coliflor, TK-HSV y virus del sarcoma aviar.

En algunas realizaciones, los promotores regulables pueden resultar útiles. Tales promotores incluyen, por ejemplo, los que se pueden regular por hormonas o citoquinas. Los promotores regulables por hormonas incluyen MMTV, MT-1, ecdysone y RuBisco, así como otros promotores regulados por hormonas tales como los que responden a hormonas tiroideas, de la pituitarias y adrenales.

Otro elemento regulador contemplado para usar en la presente invención es un potenciador. Éstos son elementos genéticos que aumentan la transcripción desde un promotor localizado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Los potenciadores se organizan de forma similar a los promotores. Es decir, se componen de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales. La diferencia básica entre los potenciadores y los promotores es funcional. Una región de potenciador en su conjunto tiene que poder estimular la transcripción a distancia; esto no ocurre necesariamente en una región de promotor o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor tiene que tener uno o más elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y los potenciadores a menudo se solapan y son contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización molecular muy similar. Los potenciadores útiles en la presente invención son bien conocidos para los expertos en la materia y dependerán del sistema de expresión particular que se emplee (Scharf D y col., (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62; Bittner y col., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544).

Cuando una construcción de expresión emplea un inserto de ADNc, normalmente se desea incluir una secuencia señal de poliadenilación para realizar la poliadenilación apropiada del transcrito del gen. Cualquier secuencia señal de poliadenilación reconocida por las células de la especie de animal transgénico seleccionada es adecuada para la práctica de la invención, tal como la hormona de crecimiento humana o bovina y las señales de poliadenilación de SV40.

También se contempla como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensajero y para minimizar la lectura del casete en otras secuencias. La región de terminación que se emplea en primer lugar será una seleccionada por comodidad, ya que las regiones de terminación para las aplicaciones tales como las contempladas por la presente invención parecen ser relativamente intercambiables. La región de terminación puede ser nativa con el inicio transcripcional, puede ser nativa a la secuencia de ADN de interés, o puede derivar de otra fuente.

En determinadas realizaciones de la invención, se contempla el uso del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para crear mensajeros multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden evitar el modelo de detección selectiva de ribosomas de la traducción dependiente del capuchón metilado 5' y empezar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, Nature, 334: 320-325, 1988). Se han descrito los elementos IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (poliovirus y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988 supra), así como un IRES de un mensajero de mamífero (Macejak y Samow, Nature, 353:90-94, 1991). Los elementos IRES se pueden unir a fases de lectura abierta heterólogas. Se pueden transcribir múltiples fases de lectura abierta juntas, estando separada cada una por un IRES, creando mensajeros policistrónicos. Gracias al elemento IRES, cada fase de lectura abierta es accesible a los ribosomas para una traducción eficaz. Se pueden expresar eficazmente múltiples genes usando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensajero.

Cualquier fase de lectura abierta heteróloga se puede unir a elementos IRES. Esto incluye genes para proteínas secretadas, proteínas de múltiples subunidades, codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares o unidas a la membrana y marcadores selectivos. De este modo, la expresión de varias proteínas se puede crear por ingeniería genética de forma simultánea en una célula con una única construcción y un único marcador selectivo.

V. Uso de los sustratos en ensayos de \gamma-secretasa

En realizaciones específicas, la presente invención implica ensayos para controlar la actividad y/o la función de la \gamma-secretasa y, más específicamente, la actividad de la \gamma-secretasa y/o la función de la \gamma-secretasa. Estos ensayos implicarán incubar en solución un complejo de \gamma-secretasa (o polipéptido purificado) con un sustrato adecuado de la presente invención, usando la escisión de la proteína de fusión de Notch como una medida de la actividad proteolítica de la \gamma-secretasa.

A. Formatos de ensayo

En realizaciones específicas, la invención se refiere a un procedimiento para la identificación de agentes que modulen la actividad de la \gamma-secretasa humana. Un aspecto de estos ensayos es controlar la actividad de escisión de Notch de la \gamma-secretasa en el sitio de escisión \varepsilon 1743/1744 en presencia y ausencia del supuesto compuesto o agente modulador. Por ejemplo, un procedimiento de este tipo para determinar la escisión de Notch comprendería generalmente las etapas de:

(a) poner en contacto cualquiera de las proteínas de fusión Notch/NusA de la presente invención in vitro con una composición que comprende una actividad \gamma-secretasa; y

(b) determinar la escisión de la proteína de fusión Notch/NusA en el sitio de escisión de \gamma-secretasa de Notch por dicha \gamma-secretasa.

La composición que comprende la actividad \gamma-secretasa generalmente será cualquier composición aislada que comprenda una actividad \gamma-secretasa. Como tal, la composición puede ser una fracción de membrana aislada de una célula (una célula natural que tiene actividad \gamma-secretasa, o una célula huésped recombinante que se ha producido por ingeniería genética para expresar una actividad de este tipo). Alternativamente, la composición puede comprender una proteína \gamma-secretasa aislada y purificada, sustancialmente libre de otras proteínas.

Para identificar los moduladores de la actividad de escisión de Notch de la \gamma-secretasa, las etapas anteriores (a) y (b) se realizan en presencia y ausencia del modulador candidato, y la actividad moduladora del modulador se evalúa comparando la actividad de escisión de Notch de la \gamma-secretasa en la presencia del agente de ensayo con la actividad en la ausencia del agente de ensayo para identificar un agente que module tal escisión por la \gamma-secretasa. Cualquier alteración en la cantidad o el grado de escisión de Notch la presencia del modulador candidato es un indicio de una alteración de la actividad \gamma-secretasa en la presencia del agente de ensayo e identifica un agente que es un modulador de la actividad \gamma-secretasa.

Los agentes que provocan un aumento de la escisión respecto al control (sin agente de ensayo) se puntúan como agonistas o estimuladores de la actividad proteolítica de la \gamma-secretasa, mientras que los agentes que reducen la escisión en A\beta 1-40 y/o A\beta 1-42 se puntúan como inhibidores. Los inhibidores de la \gamma-secretasa son de interés especial porque los inhibidores de la actividad \gamma-secretasa tienen indicaciones terapéuticas y profilácticas para el tratamiento y prevención de la EA o sus síntomas o la progresión.

Debido a que es deseable encontrar compuestos de ensayo que inhiban preferentemente la escisión mediada por la gamma-secretasa de un APP o CT-100 en comparación con la escisión de una proteína de fusión de la invención, los compuestos de ensayo se pueden evaluar para determinar su capacidad para modular la escisión de APP en paralelo o antes de utilizar los ensayos de la invención. Los procedimientos para medir la escisión de APP o CT-100 mediada por la gamma-secretasa son bien conocidos en la técnica. Como un ejemplo, el documento WO/01/83811 muestra los sustratos y ensayos in-vitro útiles para la medición de la escisión de APP o CT-100. El documento WO/01/83811 enseña un sustrato de gamma-secretasa que comprende una Met (M) M terminal, APP597-695 y una etiqueta Flag y procedimientos y condiciones para su escisión y detección de los productos de escisión (M-A\beta40 y M-A\beta40).

Son más preferidos los inhibidores que inhiben la escisión de APP/CT-100 en A\beta 1-40 y/o A\beta 1-42, pero no inhiben la actividad de escisión de Notch medida de la \gamma-secretasa.

La \gamma-secretasa puede ser un polipéptido de \gamma-secretasa purificado o fragmentos complejos o biológicamente activos, análogos o variantes de la misma. En realizaciones preferidas, la \gamma-secretasa deriva de una fracción de membrana de una célula que muestra actividad \gamma-secretasa. Preferentemente, tal fracción de membrana contiene todos los componentes necesarios para el complejo de \gamma-secretasa. También se pueden usar en ensayos ortólogos no humanos de \gamma-secretasa humana.

Los ensayos de la presente invención se diseñan para realizarse con polipéptido de \gamma-secretasa en un sistema sin células. Por ejemplo, en un sistema sin células, la etapa de puesta en contacto puede realizarse mezclando la enzima \gamma-secretasa o una fracción de membrana que contiene esa enzima con el péptido o el sustrato de proteína de la invención, en presencia o en ausencia del agente de ensayo. Para obtener resultados últimos, el sustrato de la \gamma-secretasa y la enzima preferentemente se purifican sustancialmente, se mezclan en cantidades definidas y controladas y se mezclan en tampones apropiados que optimizan la actividad enzimática y/o imitan condiciones fisiológicas.

La etapa determinante puede implicar una medición de un fragmento N-terminal, un fragmento C-terminal, o ambos, o puede implicar la medición de otro parámetro indicativo de escisión. Por ejemplo, el sustrato basado en Notch u otro sustrato de \gamma-secretasa puede contener un marcador inactivado que se hace más detectable solamente después de la escisión para separar el marcador del resto de inactivación. Alternativamente, el sustrato basado en Notch u otro sustrato de la \gamma-secretasa se puede fijar por el extremo N terminal-terminal o C-terminal a un soporte sólido. En esta disposición, la escisión se puede medir mediante la liberación del soporte sólido de un fragmento de escisión. La liberación se puede medir por el aumento del marcador en el medio o por reducción del marcador unido al soporte sólido. Alternativamente, la liberación se puede medir por captura cuantitativa de péptido liberado (por ejemplo, con un anticuerpo).

En una realización preferida de la presente invención, la proteína Notch escindida se detecta usando un anticuerpo específico para Val-1744. En realizaciones incluso más preferidas, la proteína Notch escindida se detecta usando un ELISA desarrollado basándose en el anticuerpo anti-Val 1744 y anticuerpos anti-Flag. Los anticuerpos anti-Val 1744 se usan para detectar un fragmento de la escisión, mientras que los anticuerpos anti-Flag detectan el fragmento (C-terminal) de la proteína Notch que se produce por la acción de la enzima \gamma-secretasa. Este ensayo se describe con más detalle en los ejemplos.

Ejemplos

Por supuesto, el anterior ensayo solamente es ejemplar y también se pueden usar otros ensayos. Por ejemplo, el ensayo anterior se puede realizar del siguiente modo. Se bloquean placas de microtitulación de 384 pocillos con BSA, se incuban enzima \gamma-secretasa y una concentración 50 \muM del compuesto inhibidor de la \gamma-secretasa a ensayar durante 1 hora y se inicia la reacción mediante la adición de sustrato de proteína de fusión Notch/NusA. En las condiciones de ensayo finales, el volumen es 30 \mul/pocillo; compuesto 50 \muM; 15 ng de enzima/pocillo; sustrato 250 nM; DMSO a 5% y TWEEN-20 a 0,01%. El ensayo se incuba durante toda la noche a temperatura ambiente y la reacción se finaliza por la adición de Tris-HCl, pH 8,3. Se retira una alícuota que contiene 6,25 pmoles de sustrato y se captura el sustrato escindido y/o no escindido en una placa revestida de estreptavidina. La placa se lava tres veces y se añade tampón. El ensayo de captura se controla por medio de la lectura de la emisión de fluorescencia del verde oregón en un LJL Analyst (Ex 485/Em 530).

Otro ensayo que se puede usar en este documento es un ensayo de polarización de florescencia. La polarización de fluorescencia es un ensayo sensible, fácil y no destructivo que se puede explotar para controlar los efectos de los agentes candidatos sobre el complejo de \gamma-secretasa de la presente invención. Se puede usar para controlar la interacción de estos sustratos con la enzima \gamma-secretasa. En condiciones controladas, las mediciones de polarización de florescencia pueden revelar el grado de "volteo molecular" de una molécula fluorescente en solución. Por ejemplo, sería de esperar que una molécula pequeña con un volumen molecular compacto cambie rápidamente. Si se irradia con luz polarizada, el movimiento rápido de la molécula en solución da como resultado una gran despolarización de la luz, y produce una lectura de valor de polarización "bajo". En las mismas condiciones, el mayor volumen molecular de una molécula grande o un complejo grande ralentizaría la el proceso de rotación molecular (volteo). Como resultado, la menor polarización de la luz polarizada plana incidente daría como resultado un mayor valor de polarización.

Por marcaje de un pequeño ligando con una sonda fluorescente, se pueden medir cambios en la polarización de fluorescencia resultantes de la interacción del ligando con otro componente del sistema. Tal procedimiento se puede aplicar para medir la fuerza de la interacción entre una enzima (\gamma-secretasa) y un sustrato enzimático fluorescente.

En un ensayo de polarización por fluorescencia ejemplar, en placas negras de baja afinidad prebloqueadas se incuban la enzima y el compuesto inhibidor/modulador durante 30 minutos y la reacción se inicia por la adición de sustrato 150 nM (por ejemplo, una proteína de fusión de Notch/NusA marcada con fluorescencia de la presente invención) hasta un volumen final de 30 \mul/pocillo. La placa se incuba después a temperatura ambiente durante 15 minutos y se mide la polarización fluorescente en un LJL Acquest (Ex 485/Em 530).

La presente invención contempla un aspecto de la presente invención que sería útil para aislar y caracterizar la \gamma-secretasa. Este aspecto contempla un ensayo de unión para detectar compuestos que se unen al sitio activo o a un sitio alostérico de la enzima. Para tales determinaciones, pueden usarse derivados no hidrolizables de sustratos Notch de la presente invención. Por ejemplo, la presencia de un derivado de estatina en la unión del enlace que se tiene que escindir da como resultado el Notch de la presente invención no hidrolizable en el sitio de escisión. Los sustratos se pueden modificar adicionalmente con adición de una etiqueta fluorescente apropiada, por ejemplo, BODIPY FL para facilitar la detección.

Un sustrato de la presente invención se puede marcar con un marcador fluorescente y usarse para desarrollar un ensayo de unión de polarización por fluorescencia para la \gamma-secretasa. La constante de disociación de equilibrio (KD) para la interacción entre la enzima y el sustrato se determina midiendo los cambios de polarización por fluorescencia que se producen como resultado de la titulación del sustrato con la enzima.

Para determinar la KD para la interacción de un sustrato de la presente invención con la \gamma-secretasa, se pueden combinar diversas cantidades de \gamma-secretasa con sustrato fluorescente 3,1 nM e incubarse a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la incubación, se determina la polarización de fluorescencia usando un LJL Analyst (formato de 96 pocillos) en un Pan Vera Beacon (formato de cubeta única). Se realiza un ensayo ejemplar en acetato sódico 25 mM, glicerol a 20%, pH 4,75. Una representación gráfica de los datos obtenidos que proporciona los valores de polarización en el eje vertical y la concentración de enzima en el eje horizontal proporciona la isoterma de unión para la determinación de la KD para la interacción de la enzima con el sustrato. Los datos se pueden analizar después usando la relación Px=PF+(PB-PF)*[E]/(KD+[E]), donde P=un valor de polarización, x=muestra, F=inhibidor libre, B=inhibidor unido, E=\gamma-secretasa (Fluorescence Polarization Applications Guide, 1998; Pan Vera, Madison, VI) para obtener la KD. Este ensayo puede usarse para investigar compuestos que se unen al sitio activo de la enzima o alostéricamente.

Se entenderá que las mediciones de la actividad en presencia y ausencia de un agente de ensayo se pueden realizar en paralelo, o secuencialmente, en cualquier orden. Además, puede no ser necesario repetir las mediciones de control (es decir, las mediciones de la escisión en ausencia de un agente de ensayo) en paralelo respecto a cada agente de ensayo, una vez que se haya obtenido una línea base fiable de actividad enzimática para las condiciones de reacción particulares. Se puede usar el conocimiento obtenido de la actividad enzimática de la \gamma-secretasa respecto a un sustrato particular (por ejemplo, las composiciones Notch de la presente invención o una composición derivada de APP) en ausencia de inhibidores como base para realizar la etapa de comparación.

B. Sustancias candidatas

Como se usa en este documento, la expresión "sustancia candidata" o "sustancia de ensayo" se refiere a cualquier molécula que sea capaz de modular la actividad de la \gamma-secretasa, y preferentemente la actividad de la \gamma-secretasa humana. La sustancia candidata puede ser una proteína o un fragmento de la misma, un inhibidor de molécula pequeña, o incluso una molécula de ácido nucleico. Puede resultar que los compuestos farmacológicos más útiles para la identificación a través de la aplicación del ensayo de detección selectiva sean compuestos que se identifican por detección selectiva de grandes bibliotecas de compuestos o que se relacionan estructuralmente con otros moduladores conocidos del procesamiento de APP, el procesamiento de Notch o ambos. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.448.229, incorporada en este documento como referencia, describe una clase específica de compuestos que inhiben la \gamma-secretasa sin afectar a la señalización de Notch, y por lo tanto, encuentran utilidad en el tratamiento o prevención de la EA. Los compuestos tales como los que se describen en la patente de Estados Unidos Nº 6.448.229 se pueden verificar usando los ensayos de la presente invención. Además, estos compuestos pueden servir como materiales de partida en el diseño racional de fármacos para identificar moduladores candidatos adicionales para usar en la presente invención. Otros agentes inhibidores que se podrían usar para tal diseño racional de fármacos incluyen, pero sin limitación, DAPT (PHA-568638) y fenquilamina (PHA-512088).

Las sustancias candidatas pueden incluir fragmentos o partes de compuestos de origen natural o se pueden encontrar solamente como combinaciones activas de compuestos conocidos que de otra manera son inactivos. Sin embargo, antes del ensayo de tales compuestos en modelos humanos o animales, será necesario ensayar una variedad de candidatos para determinar cuáles tienen potencial.

En consecuencia, la sustancia candidata puede incluir fragmentos o partes de compuestos de origen natural o se pueden encontrar como combinaciones activas de compuestos conocidos que de otra manera son inactivos. En consecuencia, la presente invención proporciona ensayos de detección selectiva para identificar agentes que estimulan o inhiben el procesamiento celular de APP mediado por la \gamma-secretasa preferentemente respecto a la estimulación o inhibición de Notch por esa enzima. Se propone que compuestos aislados de fuentes naturales, tales como fuentes animales, bacterianas, fúngicas, plantas, incluyendo hojas y corteza, y muestras marinas se pueden ensayar como candidatos para la presencia de agentes farmacéuticos potencialmente útiles.

Se entenderá que los agentes farmacológicos a detectar selectivamente también podrían derivar o sintetizarse a partir de composiciones químicas o compuestos hechos por el ser humano. Por lo tanto, se entiende que el modulador identificado por la presente invención puede ser un polipéptido, polinucleótido, inhibidor de molécula pequeña o cualquier otro compuesto químico inorgánico u orgánico que se puede diseñar por medio del diseño racional de fármacos a partir de estimuladores o inhibidores conocidos de la actividad \gamma-secretasa y/o el procesamiento
de APP.

Los ensayos de detección selectiva de los candidatos son sencillos de preparar y de realizar. Por lo tanto, para ensayar un modulador, después de obtener una fracción de membrana celular que comprende una \gamma-secretasa funcional (por ejemplo, una fracción de membrana celular que contiene un complejo de \gamma-secretasa solubilizado), se mezclará una sustancia candidata con tal composición de \gamma-secretasa en presencia de los nuevos sustratos de la presente invención, en condiciones que permitan que se produzca actividad \gamma-secretasa medible, por medio de la escisión del sustrato. De esta manera, se puede medir la capacidad de la sustancia candidata para estimular la actividad de la \gamma-secretasa en la ausencia de la sustancia candidata. De forma similar, en ensayos para inhibidores después de obtener una fracción de membrana celular que expresa una \gamma-secretasa funcional, la sustancia candidata se mezcla con esta fracción. De esta forma, se puede detectar la capacidad de la sustancia inhibidora candidata para disminuir, eliminar o reducir de otra manera un efecto biológico mediado por la \gamma-secretasa.

Las "cantidades eficaces" de la sustancia en determinadas circunstancias son las cantidades eficaces para alterar de forma reproducible una actividad \gamma-secretasa de escisión de CT-100 dada o de procesamiento de APP. Estas cantidades eficaces son las que alteran el grado o la cantidad de escisión del APP CT-100 pero no alteran la escisión de las proteínas de fusión de Notch de la presente invención en el sitio de escisión de la \gamma-secretasa en comparación con la escisión observada en la ausencia de la sustancia candidata. Los compuestos que serán particularmente útiles como agentes terapéuticos y/o para caracterización adicional, son los compuestos que inhiben preferentemente la escisión de APP por la \gamma-secretasa en comparación con la escisión de Notch. Por "inhibir preferentemente" se entiende que el agente tiene más de un efecto inhibidor sobre la escisión de APP mediada por la \gamma-secretasa que sobre Notch. Aunque sería preferible que el agente fuera uno que no tuviera efecto inhibidor sobre la escisión de Notch, puede ser aceptable cierta inhibición de la escisión de Notch siempre que sea menor que la escisión de APP observada por la enzima \gamma-secretasa de tipo silvestre.

Los ensayos que se han descrito anteriormente que emplean los sustratos de \gamma-secretasa nuevos de la invención son susceptibles a numerosos procedimientos de detección selectiva de alto rendimiento (HTS) (Para una revisión, véase Jayawickreme y Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634, 1997). También se contemplan los ensayos HTS automáticos y miniaturizados como se describe, por ejemplo, en Houston y Banks Curr. Biotechnol. 8:734-740, 1997.

Hay varias bibliotecas diferentes usadas para la identificación de moduladores de molécula pequeña, incluyendo bibliotecas químicas, bibliotecas de productos naturales y bibliotecas combinatorias que comprenden péptidos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas, aleatorias o diseñadas. Las bibliotecas químicas consisten en análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que se identifican como aciertos o pistas por detección selectiva de productos naturales o por detección selectiva contra un objetivo terapéutico potencial. Las bibliotecas de productos naturales son colecciones de productos procedentes de microorganismos, animales, plantas, insectos u organismos marinos que se usan para crear mezclas de detección selectiva, por ejemplo, por fermentación y extracción de caldos de suelo, plantas u organismos marinos. Las bibliotecas de productos naturales incluyen polipéptidos, péptidos no ribosomales y variantes no naturales de los mismos. Para una revisión, véase Science 282:63-68, 1998.

Las bibliotecas combinatorias se componen de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos como una mezcla. Son relativamente fáciles de preparar por procedimientos de síntesis automática tradicionales, clonación por PCR u otros procedimientos sintéticos. Serán de particular interés las bibliotecas que incluyen péptidos, proteínas, peptidomiméticos, colecciones sintéticas multiparalelas, bibliotecas recombinatorias y polipeptídicas. Como revisión de bibliotecas combinatorias y bibliotecas creadas a partir de las mismas, véase Myers Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707, 1997. Un modulador identificado por el uso de diversas bibliotecas descritas se puede optimizar después para modular la actividad de la \gamma-secretasa por, por ejemplo, diseño racional de fármacos.

Por supuesto, se entenderá que todos los procedimientos de detección selectiva de la presente invención son útiles en sí mismos sin tener en cuenta el hecho de que pueden no encontrarse candidatos eficaces. La invención proporciona procedimientos para la detección selectiva de tales candidatos, no solamente procedimientos para encon-
trarlos.

C. Ensayos in-vivo

La presente invención también comprende el uso de diversos modelos animales. Una vez que los moduladores se han detectado selectivamente en un entorno in vitro como se ha descrito anteriormente, se puede usar cualquier modelo no humano de procesamiento de APP y/o EA para determinar los efectos in vivo de los moduladores. Esto dará como resultado una oportunidad excelente para examinar la función de la \gamma-secretasa en un sistema animal completo en el que normalmente se expresa.

El tratamiento de animales con compuestos de ensayo que se han identificado como moduladores de la \gamma-secretasa implicará la administración del compuesto, en una forma apropiada, al animal. La administración será por cualquier vía que se pueda utilizar para fines clínicos o no clínicos, incluyendo, pero sin limitación, la vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser por instilación intratraqueal, instilación bronquial, inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Se contemplan específicamente la inyección intravenosa sistémica, administración regional a través de la sangre, líquido cefalorraquídeo (CSF) o suministro linfático e inyección intratumoral.

La determinación de la eficacia de un compuesto in vivo puede implicar una variedad de diferentes criterios. Tales criterios incluyen, pero sin limitación, supervivencia, aumento del nivel de actividad, y aumento de ingesta de alimentos. Otros procedimientos de evaluación incluyen el examen patológico, especialmente de tejido cerebral, para buscar indicios de actividad \gamma-secretasa alterada, tal como una reducción de la producción de beta amiloide o placas beta amiloides y una reducción de la atrofia del cerebro.

D. Fabricación de medicamentos

Los ensayos de la invención identificarán moduladores de la \gamma-secretasa que representan agentes terapéuticos candidatos para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por niveles aberrantes de actividad \gamma-secretasa, incluyendo EA. Por lo tanto, después de identificar los agentes moduladores, los procedimientos de la invención incluyen opcionalmente la etapa o etapas adicionales de fabricar/sintetizar los agentes, y de formular el agente en una composición usando diluyentes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas se describen con más detalle a continuación.

VI. Composiciones farmacéuticas

Los moduladores del procesamiento de Notch o del procesamiento de APP, y/o de la escisión por la \gamma-secretasa identificada por la presente invención pueden formularse finalmente en composiciones farmacéuticas, es decir, en una forma apropiada para aplicaciones in vivo. Generalmente, esto comprenderá preparar composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser perjudiciales para seres humanos o animales.

Generalmente se deseará emplear sales y tampones apropiados para obtener las composiciones moduladoras identificadas estables y permitir su entrada en células diana. La frase "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas o indeseadas de otra manera, cuando se administran a un animal o a un ser humano. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los moduladores identificados por la presente invención, se contempla su uso en
composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones moduladoras de la presente invención incluyen preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención será por cualquier vía común, siempre que el tejido diana esté disponible por esa vía. Las composiciones farmacéuticas se pueden introducir en el sujeto por cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, por administración intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por ejemplo, liberación a lo largo del tiempo); por administración oral, sublingual, nasal, anal, vaginal o transdérmica, o por implante quirúrgico en un sitio en particular, por ejemplo, incluido debajo de la cápsula esplénica, cerebro o en la córnea. El tratamiento puede consistir en una dosis única o una pluralidad de dosis durante un período de tiempo.

Los compuestos moduladores identificados usando la presente invención se pueden preparar para administración como soluciones de la base libre o de sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma tiene que ser estéril y tiene que ser fluida en la medida en que pueda administrarse fácilmente con una jeringa. Tiene que ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se tiene que conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede realizar por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan por la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes que se han enumerado anteriormente, cuando sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan por la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los ingredientes adicionales requeridos de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y técnicas de liofilización que dan como resultado un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada a esterilidad previamente de la misma.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes bacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar en las composiciones ingredientes activos suplementarios.

Para la administración oral, los moduladores identificados por la presente invención se pueden incorporar con excipientes y usarse en forma de enjuagues bucales y dentífricos no ingeribles. Un enjuague bucal se puede preparar incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, tal como una solución de borato sódico (solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo se puede incorporar en un enjuague antiséptico que contiene borato sódico, glicerina y bicarbonato potásico. El ingrediente activo también puede dispersarse en el dentífrico, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El ingrediente activo se puede añadir en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También se pueden obtener sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran de forma fácil en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para la administración parenteral en solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada si es necesario y el diluyente líquido en primer lugar se debe hacer isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

"Dosis unitaria" se define como una cantidad discreta de una composición terapéutica dispersada en un vehículo adecuado. Por ejemplo, la administración parenteral se puede realizar con una embolada inicial seguida de infusión continua para mantener los niveles terapéuticos circulantes del fármaco. Los expertos en la materia optimizarán fácilmente las dosificaciones y regímenes de administración eficaces como se determina por la buena práctica médica y el estado clínico del paciente individual. Más particularmente, la dosis se debe seleccionar para disminuir, inhibir, reducir o eliminar de otra forma la formación del péptido A\beta y, más particularmente, la formación de placas en el cerebro de un sujeto que muestra EA. A este efecto, los expertos en la materia serán capaces de emplear modelos animales de EA (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.877.399; en la patente de Estados Unidos Nº 5. 5.387.742; y en la patente de Estados Unidos Nº 5.811.633) para optimizar los protocolos de administración de dosis y predecir las cantidades relevantes de agentes farmacéuticos requeridas para la intervención de la EA en un sujeto humano.

La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y las vías de administración. La formulación farmacéutica óptima se determinará por un experto en la materia dependiendo de la vía de administración y la dosificación deseada. Véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042) páginas 1435-1712), incorporado en este documento por referencia. Tales formulaciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, una dosis adecuada se puede calcular de acuerdo con el peso corporal, las áreas de superficie corporal o el tamaño de los órganos. El ajuste adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis de tratamiento apropiada se realiza de forma rutinaria por los expertos en la materia sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información y los ensayos de dosificación descritos en este documento así como los datos farmacocinéticos observados en ensayos clínicos animales o humanos.

Se pueden obtener dosificaciones apropiadas por medio del uso de ensayos establecidos para determinar los niveles sanguíneos junto con datos de dosis-respuesta relevantes. El régimen de dosificación final se determinará por el médico a cargo del caso, considerando factores que modifiquen la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la gravedad de la lesión y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el momento de administración y otros factores clínicos. Cuando se realicen estudios, se obtendrá información adicional respecto a los niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento para enfermedades y dolencias específicas.

Se apreciará que las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de tratamiento de la invención pueden ser útiles en ámbitos de la medicina humana y la medicina veterinaria. Por lo tanto, el sujeto que se tiene que tratar puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano u otro animal. Para propósitos veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja incluyendo vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de compañía tales como perros y gatos, animales exóticos y/o de zoológico, animales de laboratorio incluyendo ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsteres, y aves tales como pollos, pavos, patos y gansos.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán, en vista de la presente descripción, que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y seguir obteniéndose un resultado similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 Materiales y procedimientos

El presente ejemplo proporciona una enseñanza de las técnicas generales, reactivos y ensayos empleados para obtener los resultados discutidos en este documento. Los compuestos químicos de laboratorio generales se obtuvieron en Sigma Chemical Co (St. Louis, Mo). El vector pET 43.1a era de Novagen (Madison, WI) y las enzimas de restricción eran de Invitrogen (Carlsbad, Ca). Los oligonucleótidos eran de Sigma Genosys (The Woodlands, Tx). El anticuerpo Val-1744 era de Cell Signaling Technology (Beverly, Ma). Los compuestos PHA/ONU se obtuvieron de la colección de compuestos de Pharmacia (New Yérsey, USA).

Clonación de Sustrato Notch: Se clonó un sustrato Notch que contenía los aminoácidos N1703-D1860 de la proteína Notch-1 de ratón (número de entrada de secuencia de ADN Z11886) en el vector pET 43.1a como un inserto Eco/Hindi en fase con un ácido nucleico que codificaba NusA. La construcción de expresión para codificar la proteína de fusión NusA/Notch tenía una secuencia de ID SEC Nº: 1. Esta construcción contenía etiquetas 8His y Flag C-terminales generadas por medio de PCR para dar la extensión (DYKDDDDKHHHHHHHH, ID SEC Nº 15) después del aminoácido 1860 de Notch. El ADN se utilizó para transformar células E. coli competentes BL21 (DE3) (Stratagene) y los clones se detectaron selectivamente respecto a la presencia del inserto correcto usando un kit de minipreparación de ADN Concert (Gibco/BRL). Se observó que el Notch-F6 contenía la secuencia correcta de
ADN de ID SEC Nº 1.

Expresión y purificación de proteína de fusión Notch/NusA. Se transformó E. coli con el clon Notch-F6 y se inoculó en LB/Amp y se dejó crecer durante toda la noche a 37ºC en un incubador de agitación. Al día siguiente día, se usaron 35 ml del cultivo de una noche para inocular 2 litros de LB/Amp. Las células E. coli se dejaron crecer a 37ºC en un incubador de agitación hasta que la A600 alcanzó 0,4 y después se indujeron con IPTG 1 mM durante 3 horas y se centrifugaron. Se resuspendieron sedimentos de dos litros del cultivo en 5 ml/g de sedimento de Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM incluyendo inhibidores de proteasa y se procesaron tres veces con una prensa French para obtener un extracto bruto. El pH del extracto se ajustó a 8,0 usando Tris 2 M y se centrifugó a 11.000 g durante 45 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de cromatografía IMAC de níquel de 4 ml equilibrada en Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM y con inhibidores de proteasa. Se lavó la columna con el mismo tampón seguido de tampón que contenía imidazol 50 mM. La proteína de fusión NusA-Notch se eluyó con tampón que contenía imidazol 300 mM y se recogieron fracciones de 8,0 ml y se analizaron por A280 y SDS-PAGE. Las fracciones que contenían NusA-Notch se agruparon y se dializaron en Pipes 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM.

Escisión de Notch como se determina por análisis de transferencia de Western. Se incubó la fusión NusA-Notch (1,7 \muM) con 70 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada en Pipes 50 mM, pH 7,0, CHAPSO a 0,25% en un volumen total de 50 \mul durante toda la noche a 37ºC. Se añadió DAPT (PHA-568638) a concentraciones variables. Las reacciones se detuvieron con la adición de 12,5 \mul de tampón de Laemmli 5X (Laemmli 1970) y se sometieron a electroforesis 30 \mul de la mezcla en SDS-PAGE a 15%. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa usando un aparato de transferencia semiseco (Millipore) y se bloquearon durante 2 horas usando BSA al 4% en PBS/Tween-20 a 0,5%. Se añadió anticuerpo VAL-1744 a la solución de bloqueo a una dilución 1:1000 y se incubó durante 1 hora. La membrana se lavó tres veces con PBS/Tween-20 a 0,5% seguido de incubación con una IgG-HRP anti-conejo (dilución 1:5000 en BSA a 4% en PBS/Tween-20 a 0,5%). La membrana se lavó de nuevo tres veces y se desarrolló usando reactivos ECL (Amersham, Piscataway, New Jersey).

Escisión de Notch in vitro por ELISA. También se evaluó la escisión de Notch usando una técnica ELISA. Antes de preparar la reacción, el número requerido de pocillos en una placa de semiárea de 96 pocillos (Costar) se revistieron con 50 \mul de anticuerpo Val-1744 diluido 1:200 en NaHCO3 0,1 M, PH 8,2. Las placas se incubaron durante toda la noche a 4ºC. La reacción de escisión de Notch se preparó del siguiente modo. Se incubó NusA-Notch (0,9 \muM) con 70 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada en Pipes 50 mM, pH 7,0, CHAPSO a 0,25% en un volumen total de 25 \mul durante toda la noche a 37ºC. Al día siguiente, la plata revestida con anticuerpo Val-1744 se lavó 3 veces con PBS/Tween-20 a 0,05% y se bloqueó usando BSA a 4% en PBS/Tween-20 a 0,05% durante 1 hora. La mezcla de la reacción de escisión se diluyó 14 veces usando BSA a 4% en PBS/Tween-20 a 0,05% y se cultivaron en placas 50 \mul por triplicado y se incubaron durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 a 0,05% y se añadieron 50 \mul de anticuerpo anti-FLAG-HRP (Sigma, St. Louis, Mo) usados a una dilución 1:60000 en BSA a 4%/PBS/Tween-20 a 0,5%. Este anticuerpo se incubó durante 45 minutos y la plata se lavó tres veces con PBS/Tween-20 a 0,5%. Se mezcló el reactivo TMB (Kirkegaard & Perry) 1:1 y se añadieron 50 \mul a los pocillos. Se permitió que se desarrollara color durante una hora, se añadieron 50 \mul de H3PO4 1 M y las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placas SpectraMax Plus. Cuando se varió la concentración de sustrato Notch, se usaron concentraciones de 0,11 a 3,6 \muM de NusA-Notch. Cuando se varió la concentración enzimática, se usaron de 2,1 a 68 \mug/ml de \gamma-secretasa solubilizada.

Inhibición de escisión de Notch. Los inhibidores (1 \mul) se añadieron a la reacción de escisión como concentraciones 25x en DMSO a 50% antes de la adición de la enzima. Se ajustaron los blancos y los controles sin inhibidor para contener la misma concentración final de DMSO. Se calcularon las CI50 para los inhibidores usando el modelo logístico de 4 parámetros en el programa GraFit 4.0.

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Ejemplo 2 Resultados y discusión

Para producir un sustrato Notch soluble, los inventores prepararon varias construcciones en E. coli (Figura 3a). Éstos incluyen el uso del líder de la caspasa, ubiquitina, tau N-terminal y la etiqueta Nus. Se observó expresión soluble solamente con la fusión Nus (Wilkinson y col., Bio/Technology 9:443-448, 1991). La figura 3b muestra detalles de clonación para esta construcción. Para facilitar la purificación y el desarrollo del ensayo, se pusieron por ingeniería genética una etiqueta His y una Flag en el extremo C terminal de Notch.

Cuando la proteína de fusión de Notch etiquetada con Nus se expresó en E. coli, se observó un alto nivel de expresión de la proteína de fusión correspondiente a una banda de 90 kDa en una SDS-PAGE (Figura 4, Carril 1), un tamaño esperado de la proteína de fusión. Cuando se centrifugó el lisado total, la proteína de fusión quedó en la fracción soluble (Figura 4, carril 2). La proteína de fusión que contenía Notch se purificó de la fracción soluble por IMAC usando níquel como el ion metálico inmovilizado. La figura 4 (carriles 5-9) muestras diversas fracciones eluidas de la columna IMAC por imidazol 300 mM. Estas fracciones se agruparon, se dializaron y después se usaron como fuente del sustrato para la escisión por la \gamma-secretasa.

La técnica para seguir una escisión específica en la proteína Notch se basa en la especificidad del anticuerpo Val-1744 (Cell Signaling Technology). Es específica para Notch escindida y no reacciona de manera cruzada con la proteína Notch no escindida. Como se muestra en la figura 5 (carril 3), la proteína Notch escindida se detectó en una transferencia de Western con un anticuerpo que es específico para Val-1744. Como se muestra en el carril 1, no se observó reactividad cruzada con la proteína de fusión de Notch no escindida. Además, esta escisión específica de la proteína Notch inhibió de una manera dependiente de la dosis por DAPT (Dovey y col., J Neurochem. 76:173-181, 2001), un inhibidor potente bien conocido de la \gamma-secretasa (carriles 4-8, figura 5).

Para determinar si hay una escisión adicional en la proteína Notch, la reacción de escisión también se controló por una transferencia de Western usando el anticuerpo de Flag C-terminal. De las tres bandas inmunorreactivas, solamente un producto de escisión se podía inhibir por DAPT. En conjunto, estos resultados sugieren que la escisión mediada por la \gamma-secretasa in vitro parece dar como resultado una escisión específica en el 1743/1744, lo cual es congruente con estudios basados en células que muestran la producción de NICD a partir de Notch (Kopan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1683-1688; Schroeter y col., Nature, 393:382-386, 1998).

Los resultados anteriores demostraron que la proteína de fusión Notch es susceptible a una escisión específica mediada por la \gamma-secretasa que se puede detectar en una transferencia de Western por un anticuerpo monoclonal Val-1744 altamente específico. Como las transferencias de Western no son cuantitativas, es difícil evaluar los compuestos para la inhibición Notch y comparar las potencias de inhibición con ELISA de A\beta.

La figura 6 muestra una estrategia para el desarrollo de un ELISA cuantitativo para la escisión de Notch por comparación de la potencia inhibidora de compuestos con el ELISA basado en CT-100. Se basa en un ELISA de tipo sándwich que usa los anticuerpos altamente específicos anti-Val 1744 y anti-Flag para capturar el extremo N terminal y C del fragmento NICD de la proteína de fusión de Notch en la presencia de la \gamma-secretasa. Este ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 1 bajo el encabezado "Escisión de Notch in vitro por ELISA". Esencialmente, en este ELISA de tipo sándwich, la placa de microtitulación se reviste con anticuerpo Val-1744. Mientras tanto se realiza la reacción de escisión de NusA-Notch en la que se incuba NusA-Notch con \gamma-secretasa. La placa revestida con anticuerpo Val-1744 se lava con tampón y se bloquea con BSA. La mezcla de reacción de escisión se añade después a la placa de microtitulación y se incuba durante un periodo de tiempo apropiado a temperatura ambiente. Las placas se lavan, se añade anticuerpo anti-FLAG-HRP (Sigma, St. Louis, Mo) y se incuba de nuevo durante un tiempo apropiado. Se añade el sustrato cromogénico para HRP, reactivo TMB (Kirkegaard & Perry) y el color, una vez desarrollado, se lee a 450 nm en un lector de placas SpectraMax Plus. La figura 7 muestra la escisión de la proteína de fusión NusA-Notch como se detecta por ELISA. Se observó una relación entre señal e interferencias de factor 5 en el ELISA.

La actividad enzimática de la \gamma-secretasa solubilizada para la escisión de Notch se caracterizó adicionalmente en el ELISA en condiciones experimentales definidas. La figura 8A muestra la dependencia del sustrato de la formación del producto. La reacción obedece a cinéticas de Michaelis-Menten y la Km aparente para la hidrólisis del sustrato de la proteína de fusión de Notch por actividad de \gamma-secretasa solubilizada es de aproximadamente 0,7 \muM en condiciones definidas. La actividad de escisión de Notch observada también fue lineal con la concentración de proteína de la preparación de membrana solubilizada que contenía actividad \gamma-secretasa (figura 8B).

Se obtuvo una confirmación adicional de la escisión de Notch mediada por \gamma-secretasa en el ELISA por estudios de inhibición que usan inhibidores específicos de esta enzima de los que se ha informado en la bibliografía. Se ha informado de un inhibidor potente de \gamma-secretasa, denominado DAPT (Dovey y col., J. Neurochem. 76:173-181, 2001). Como se muestra en la figura 9, DAPT (PHA-568638) inhibe la escisión de Notch en una manera dependiente de la dosis, con una CI50 = 2,4 nM. Por otro lado, se ha notificado que la fenquilamina sulfonamida (PHA-512088) (Rishton y col., J. Med. Chem. 43:2297-2299, 2000) inhibe la actividad \gamma-secretasa en el intervalo \muM inferior en el ensayo in vitro de CT-100. Como se muestra en la figura 9, el PHA-512088 inhibió la escisión de Notch mediada por la \gamma-secretasa con una CI50 de 0,7 \muM en el ELISA en condiciones definidas. Tal como se muestra, los inhibidores (PHA-568638; PHA-512088) en el intervalo nM inferior a \muM inferior funcionan muy bien en el ensayo. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la actividad enzimática in vitro que produce un fragmento NICD a partir de un sustrato de proteína de fusión de Notch se debe a la \gamma-secretasa.

Recientemente, se ha informado de ensayos basados en células para seguir la escisión de APP y Notch en paralelo (Karlstrom y col., J. Biol. Chem. 277-6763-6766, 2002). Sin embargo, la presente invención, por primera vez demuestra un ELISA cuantitativo in vitro para seguir la escisión de Notch específica G1743-V1744) por la \gamma-secretasa. La presente invención, por primera vez, demuestra que la actividad \gamma-secretasa de células HeLa escinde específicamente la proteína Notch en la unión 1743-1744.

Todas las composiciones y/o procedimientos descritos y reivindicados en este documento se pueden realizar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y procedimientos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que se pueden aplicar variaciones en las composiciones y/o procedimientos y en las etapas o en la secuencia de las etapas del procedimiento descrito en este documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que los agentes descritos en este documento pueden sustituirse por ciertos agentes relacionados química y fisiológicamente, consiguiéndose resultados iguales o similares. Se considera que todos los sustitutos y las modificaciones similares evidentes para los expertos en la materia están dentro del alcance de la invención, como se define por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Sharma y col.

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<120> SUSTRATOS BASADOS EN NOTCH SOLUBLES PARA GAMMA SECRETASA Y PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA USARLOS

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<130> 28341/01130

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<160> 17

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 2190

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ADN que codifica la fusión sintética de notch y nus

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<400> 1

1

100

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<210> 2

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<211> 729

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de proteína de fusión sintética de notch y nus

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<400> 2

2

3

4

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<210> 3

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<211> 525

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ADN de notch de tipo silvestre

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<400> 3

5

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<210> 4

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de proteína notch de tipo silvestre

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<400> 4

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6

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<210> 5

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<211> 2531

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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7

8

9

10

11

12

13

14

15

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<210> 6

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<211> 2444

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (891)..(891)

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<223> Xaa = Cualquier aminoácido o un aminoácido desconocido

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (1763)..(1763)

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<223> Xaa = Cualquier aminoácido o un aminoácido desconocido

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<220>

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<221> misc-feature

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<222> (1787)..(1787)

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<223> Xaa = Cualquier aminoácido o un aminoácido desconocido

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<400> 6

16

18

19

20

21

22

23

24

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<210> 7

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<211>

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<212>

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<213>

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<220>

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<223>

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

delecionado

\hfill

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<210> 8

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<211>

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<212>

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<213>

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<220>

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<223>

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

delecionado

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211>

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<212>

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<213>

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<220>

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<223>

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

delecionado

\hfill

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<210> 10

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos que rodea a los dominios transmembrana de APP

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<400> 10

25

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<210> 11

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que rodea a los dominios transmembrana de E-catedrina

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<400> 11

26

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<210> 12

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que rodea a los dominios transmembrana de Notch-1

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<400> 12

27

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<210> 13

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<211> 158

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que rodea a los dominios transmembrana de Notch-1

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<400> 13

28

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<210> 14

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de etiqueta C-terminal

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<400> 14

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

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<210> 15

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Etiqueta Flag/8 his

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<400> 15

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His His His}

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<210> 16

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<211> 1665

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Ácido nucleico que codifica NusA

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<400> 16

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29

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30

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<210> 17

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<211> 555

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de proteína que codifica NusA

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<400> 17

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31

32

33

Claims

1. Una proteína de fusión soluble que comprende proteína Notch recombinante fusionada al extremo C terminal de una secuencia de proteína NusA.

2. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Notch recombinante comprende el sitio de escisión S3 de Notch.

3. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Notch recombinante es una proteína Notch de vertebrados.

4. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Notch recombinante es una proteína Notch de invertebrados.

5. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Notch recombinante deriva de la proteína Notch de ratón que tiene la secuencia de ID SEC Nº 5.

6. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Notch recombinante comprende los aminoácidos 1703 a 1860 de la proteína Notch de ratón. Reivindicaciones adicionales a añadir al Druckexemplar.

7. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 6, en la que dicha proteína Notch recombinante comprende los aminoácidos 1703 a 1860 de la proteína Notch de ratón indicada en la ID SEC Nº 5, y en la que dicha secuencia de proteína NusA comprende la ID SEC Nº 17.

8. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 7, en la que dicha proteína Notch recombinante consiste esencialmente en los aminoácidos 1703 a 1860 de la proteína Notch de ratón indicada en la ID SEC Nº 5, y en la que dicha secuencia de proteína NusA consiste esencialmente en la ID SEC Nº 17.

9. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 8, codificada por la secuencia de nucleótidos indicada en la ID SEC Nº 1.

10. La proteína de fusión soluble de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente una etiqueta His C-terminal.

11. La proteína de fusión soluble de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente una etiqueta Flag C-terminal.

12. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende una secuencia indicada en la ID SEC Nº 1.

14. Un procedimiento in vitro para ensayar la escisión \varepsilon mediada por \gamma-secretasa (1743/1744) de la proteína Notch, que comprende:

a. poner en contacto una primera composición que comprende un complejo de \gamma-secretasa de mamífero o un fragmento biológicamente activo del mismo, con una segunda composición que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y

b. medir la escisión de la proteína de fusión.

15. Un procedimiento in vitro para detectar selectivamente moduladores de escisión \varepsilon mediada por \gamma-secretasa (1743/1744) de la proteína Notch, que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una primera composición que comprende un complejo de \gamma-secretasa de mamífero o fragmento biológicamente activo del mismo, con una segunda composición que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en presencia y en ausencia de un supuesto compuesto modulador;

(b) medir la escisión de la proteína de fusión en presencia y en ausencia del supuesto compuesto modulador, y

(c) identificar moduladores que modulen la escisión medida por \gamma-secretasa de dicha proteína de fusión;

en el que el supuesto compuesto modulador produce una diferencia en la escisión por la \gamma-secretasa en la etapa (b).

16. Un kit para realizar un ensayo de \gamma-secretasa que comprende un sustrato de \gamma-secretasa que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

17. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido NusA fusionado a un polipéptido Notch que comprende una identidad de secuencia comprendida entre 90 y 95% con una secuencia de NusA de la ID SEC Nº 17, en la que el polipéptido Notch comprende el dominio transmembrana de Notch y en la que la proteína de fusión es soluble en una solución acuosa.

18. Un procedimiento para detectar selectivamente un inhibidor selectivo del procesamiento por la \gamma-secretasa de la proteína precursora de amiloide (APP), que comprende:

a) proporcionar un compuesto de ensayo que inhiba la escisión mediada por la \gamma-secretasa de un polipéptido que comprende un sitio de gamma-secretasa de APP; y

b) medir la escisión por la gamma-secretasa de una proteína de fusión según la reivindicación 1 en presencia y ausencia del compuesto de ensayo;

en el que un compuesto de ensayo que inhibe preferentemente la escisión por la gamma-secretasa de dicho polipéptido en comparación con la escisión de dicha proteína de fusión es un inhibidor selectivo del procesamiento por la gamma-secretasa de APP.