FR2770217A1 - Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le precurseur du peptide b-amyloide et/ou le peptide b-amyloide - Google Patents

Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le precurseur du peptide b-amyloide et/ou le peptide b-amyloide Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 d'une part et le précurseur du peptide -amyloïde et/ ou le peptide (-amyloïde d'autre part.

Description

La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 d'une part et le précurseur du peptide ss-amyloide et/ou le peptide ss-amyloïde d'autre part.
Le peptide amyloide Ap, de 37 à 42 acides aminés, est le principal composant protéique des plaques séniles caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Ce peptide est produit par clivage de son précurseur, la protéine précurseur de peptide amyloïde (APP). Des mutations dans le géne de l'APP sont responsables de certaines formes familiales précoces de la maladie d'Alzheimer. Cependant la majorité de ces formes sont liées à la présence de mutations sur deux gènes, présénilines PS1 (initialement nommé Si 82) et PS2 (initialement STM2), récemment identifiés par clonage positionnel (Hardy, 1997). Ces formes sont dominantes et ces anomalies correspondent toutes à des mutations faux-sens à l'exception d'une entraînant la délétion d'un exon. Les présénilines sont des protéines hydrophobes membranaires d'environ 45-50 kDa de masse moléculaire et qui présentent 67% d'identité entre elles. Elles sont homologues à deux protéines de C. elegans, SPE4 et Selon12. qui sont impliquées de façon indirecte respectivement dans le transport intracellulaire et dans la signalisation des récepteurs Notch. Cependant, la fonction physiologique des présénilines est encore inconnue. L'implication dans la maladie d'Alzheimer, de deux protéines si voisines, laisse à penser que les présénilines contribuent à une voie physiologique essentielle dans l'étiologie de cette pathologie.
La protéine PSl comprend 467 acides aminé et PS2 448. Toutes deux présentent la structure d'une protéine membranaire avec de 6 à 8 domaines transmembranaires potentiels. Chacune des présénilines est sujette in vivo à un clivage protéolytique précis résultant en deux fragments généralement dénommés fragments N(amino)- et C(carboxy)-terminaux (Thinakaran et col., 1996). Ce clivage a été cartographié entre les résidus 291 et 299 de PS1 (Podlisny et col., 1997) et dans une région homologue de PS2. On entend donc en général par fragment N-terminal (N-ter), le fragment de la position 1 à approximativement 291 de PS1 et par fragment
C-terminal, le complément. Bien que la topologie exacte des présénilines dans les membranes lipidiques ne soit pas clairement établie, il est proposé que leurs extrémités N- et C-terminales, ainsi que la grande boucle hydrophile, soient présentes dans le compartiment cytosolique (Doan et col, 1996, voir schéma figure 1).
I1 a maintenant été démontré que les formes mutées des présénilines induisent l'augmentation de la production du peptide amyloide long Ass 1-42 par rapport à celle de Ass 1-40 autant chez les patients porteurs (Scheuner et col., 1996), qu'en cellules transfectées (Borchelt et coll., 1996) ou en souris transgéniques (Duff et coll; 1996). Le peptide amyloide Ass, qui forme les plaques séniles, lésions caractéristiques de la pathologie, et ses différentes formes sont dérivés du catabolisme de la protéine précurseur de l'amyloïde, APP. En particulier, deux formes essentielles du peptide amyloide ont été décrites, une de quarante résidus, Au40, et l'autre possédant deux résidus supplémentaires en son carboxy terminal, Au42. In vitro, le peptide A, présente de fortes propriétés d'agrégation qui sont accrues pour la forme Ass42 et ce dernier semble effectivement former les premiers agrégats détectables dans la pathologie. Par ailleurs, la forme Ass42 est spécifiquement produite après trauma crânien chez l'homme, lequel constitue un des facteurs de risques environnementaux les mieux établis de la maladie d'Alzheimer. De plus, les formes génétiques précoces de la maladie liées à des mutations autant sur 1'APP (il y en a six) que maintenant sur les présénilines 1 et 2, concourent toutes à une augmentation du ratio Ass42/Ass40. L'ensemble de ces facteurs semble désigner le Ass42 comme l'agent clé de la pathologie autant dans les formes génétiques que sporadiques de la maladie et l'élucidation de son mécanisme de formation est devenu une question fondamentale.
A cet égard, la formation de complexe entre le précurseur du peptide p- amyloïde et PS1 ou PS2 a été rapportée (Weidemann et al. 1997, Xia et al., 1997) cependant on ne connait pas la nature précise des évènements responsables de la production du peptide '3-amyloide et aucun lien n'a encore pu être établi entre le rôle possible de ces complexes et la production du peptide ss-amyloïde Au42. Il est néanmoins important de remarquer que le peptide Au42, mais non pas le Au40, semble être localisé dans le reticulum endoplasmique dans les cellules neuronales (Hartmann et al., 1997).
La présente invention résulte de l'identification et de la caractérisation par la demanderesse de régions particulières de la préséniline 1 (PSI) et de la préséniline 2 (PS2), ainsi que de régions particulières du précurseur du peptide p-amyloïde (APP) impliquées dans la formation de complexes APP/PS1 et APP/PS2.
La présente invention découle en particulier de la mise en évidence de la capacité de la région N-terminale hydrophile (acides aminés 1-87) de la PS2 à reconnaître différents domaines de APP. Elle découle en outre de la mise en évidence de propriétés similaires pour la région N-terminale de PSI (fragment 1-213). Elle résulte également de la démonstration de la capacité des polypeptides dérivés des régions des présénilines définies ci-avant à inhiber la formation des complexes entre l'APP et les présénilines.
La présente invention résulte en outre de la mise en évidence de la localisation cellulaire particulière de ces interactions. Elle découle plus particulièrement du fait que ces interactions peuvent prendre place non seulement au niveau membranaire mais également au niveau de la lumière du reticulum endoplasmique et dans le compartiment extracellulaire.
La caractérisation des domaines d'interaction de APP et des présénilines et la mise en évidence des différentes localisations cellulaires de ces interactions permettent d'envisager la préparation de nouveau polypeptides utilisables pharmaceutiquement.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide Q-amyloïde et/ou le peptide B-amyloïde.
Selon un mode particulier, les polypeptides selon l'invention comportent au moins une partie de la préséniline 2 (PS2) permettant l'interaction avec le précurseur du peptide p-amyloïde et/ou le peptide ss-amyloide. De manière préférée, les polypeptides selon l'invention sont caractérisés en ce que la partie de PS2 correspond au fragment N-terminal hydrophile de PS2. Plus préférentiellement les polypeptides selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence SEQ ID N"1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
Selon un autre mode de réalisation, les polypeptides selon l'invention comportent au moins une partie de PSI permettant l'interaction avec le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde. De manière préférée les polypeptides selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence SEQ ID N"2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
Selon un autre mode de réalisation les polypeptides selon l'invention comprennent au moins les régions d'homologie communes aux séquences SEQ IDNO1 et SEQ ID N"2.
Selon un autre mode de réalisation les polypeptides selon l'invention comportent au moins une partie du précurseur du peptide ss-amyloïde. De manière préférée les polypeptides sont caractérisés en ce que la partie du précurseur du peptide p-amyloïde comprend tout ou partie du fragment 1-650, de préférence tout ou partie du fragment 1-635 et de préférence encore tout ou partie du fragment 1-596. Plus préférentiellement, les polypeptides selon l'invention comportent tout ou partie d'une séquence choisie parmi la séquence correspondant au fragment 1-650 de la séquence
SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-635 de la séquence SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-596 de la séquence SEQ ID N"3, ou une séquence dérivée.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant des séquences présentées en séquence
SEQ ID N l ou SEQ ID N"2, ou les fragments désignés de la SEQ ID N"3, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer son niveau de production, celui d'augmenter sa résistance aux protéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet possible, à partir des motifs polypeptidiques décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules qui inhibent au moins partiellement l'interaction entre la préséniline I ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide p-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde , et qui soient non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, I'invention concerne l'utilisation de polypeptides tels que décrits ci-avant pour la préparation de molécules non peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ces polypeptides qui sont importants pour leur activité et reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
Selon un mode de réalisation particulier, les polypeptides selon l'invention peuvent également comprendre des séquences permettant une localisation cellulaire précise. Parmi ces séquences on peut citer les séquences de peptide signal telles que la séquence du peptide signal de IgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des sous-unités des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et centraux etc...
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un peptide capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde. Selon un mode particulier, il s'agit d'une séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N0 1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci. Selon un autre mode, il s'agit d'une séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N"2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci. De manière préférée, il s'agit d'une séquence nucléotidique comprenant les zones d'homologies communes aux séquences nucléotidiques SEQ ID N"1 et SEQ ID N"2. Selon un autre mode, il s'agit d'une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence correspondant au fragment 1- 650 (acides nucléiques 1 à 1944) de la séquence SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-635 (acides nucléiques I à 1914) de la séquence SEQ ID
N03, ou la séquence correspondant au fragment 1-596 (acides nucléiques 1 à 1788) de la séquence SEQ ID N"3, ou une séquence dérivée.
Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation (Maniatis et al.1982).
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides de l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonomes chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour l'expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences SEQ ID N01 ou SEQ ID N" 2, ou les fragments désignés de la SEQ ID N"3 pour la production des polypeptides selon l'invention.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et la production in vivo de polypeptides capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide p-amyloïde et/ou le peptide ss-amyloïde.
Selon autre mode de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques de l'invention sont utilisées pour la construction d'une cassette d'expression, utilisable dans un vecteur d'expression. En particulier, la cassette d'expression sert à la production des polypeptides selon l'invention.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, incorporée ou non dans un ADN recombinant, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur utile pour induire in vivo, ex vivo et/ou in vitro l'expression des polypeptides revendiqués. Le vecteur utilisé peut etre d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines. Il peut s'agir de vecteur viral, non viral ou d'un vecteur plasmidique. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut dériver des adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés (AAV), du virus de l'herpès, du cytomégalovirus (CMV), du virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224 , Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1(1990) 241 , EP 185 573,
Levrero et al., Gene 101(1991)195 , Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988
Roemer et Friedmann Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211 , Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353 , Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 , Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238 W091/18088].
La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant.
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif.
Le terme "virus défectif" désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention
Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
il est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés.
D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région El.
Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée.
La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N"1 ou SEQ ID N02 ou ou les fragments désignés de la SEQ
ID N"3, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline I ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide Q-amyloïde.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber au moins en partie l'interaction entre la préséniline 1 ou la préséniline 2 et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide ss-amyloïde. La mise en évidence et/ou d'isolement de tels composés est réalisé selon les étapes suivantes
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celleci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre les présenilines et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide ss-amyloïde.
La présente invention concerne également l'utilisation des polypeptides définis précédemment pour la mise en évidence de ligands des polypeptides ainsi que de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide ss-amyloide et/ou le peptide ss-amyloïde
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs de par leur capacité à interférer au niveau de l'interaction entre les présenilines et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide B-amyloïde peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologiques et notamment la maladie d'Alzheimer.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps tel que défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens, et/ou un ligand tel que défini ci-avant.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps, ligand et séquence nucléotidique définis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Elle a également pour objet les compositions dans lesquelles les séquences nucléotidiques selon l'invention sont incorporées dans un vecteur recombinant viral ou non viral.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide ss-amyloïde et/ou le peptide B-amyloïde. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des polypeptides décrits auparavant pour inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide
B) Dose-dépendance en fonction de la concentration de Ab.
Flgure 9: Interaction in vitro des formes complètes de PS 1 et APP.
Figure 10: Structure et topologie de l'APP695
Figure il : Interaction de PS2 et PS2 NT avec une deuxième région de l'APP,
différente du peptide Ass.
Matériels et méthodes
A/ MATERIELS
1.Constructions exprimant les Drésénilines.
L'obtention de vecteur d'expression (vecteur hote, pcDNA3,
In Vitrogen) en cellules mammiféres des protéines humaines PSI et PS2 a été
décrite précédemment (Pradier et col., 1996). Plusieurs délétions successives
par l'extrémité C-term de PS2 ont été générées (voir Fig I A). Les
numérotations sont faites à partir du codon d'initiation de PS2 comme
position 1.
Le fragment de restriction HindIII du vecteur PS2 (du 5' non
codant, position -55, au site interne à la position 1080) a été purifié et mis en
ligation avec le vecteur pcDNA3 linéarisé par HindlII et traité à la
phosphatase alkaline. La PS2 tronquée ainsi produite (PS2DC 1) s'étend de
l'extrémité N-terminale au résidu 361 plus 7 résidus apportés par l'extrémité
3' et comprend donc les six premiers domaines transmembranaires et une
large partie de la boucle hydrophile (FiglA).
PS2DC2 a été construit par digestion du plasmide PS2 par PstI (site
interne à position 679) et ligation avec le fragment PstI correspondant à la
partie 3'non-codante du vecteur PS2. La protéine tronquée PS2DC2 s'étend
de la position 1 au résidu 228 de PS2 plus 18 résidus supplémentaires apportés par l'extrémité 3' Elle inclut les quatre premiers domaines transmembranaires de PS2.
Une construction similaire a été effectuée pour PS2 portant la mutation N141I, PS2DC2*
Le fragment de restriction HindIII (-55)/MscI(590) de la construction PS2DC2 a ensuite été cloné dans le vecteur pcDNA3 traité
HindIII et dont l'extrémité ApaI a été rendue à bout franc. Cette construction
PS2DC3 s'étend de l'extrémité N-term au résidu 198 plus 2 résidus supplémentaires comprennant donc les trois premiers domaines transmembranaires de PS2.
Le fragment de restriction de PS2DC2, HindIII (-55)/NcoI(504) rendu à bout francs en son extrémité NcoI par traitement au fragment Klenow de l'ADN polymérase a été recloné dans le même vecteur pcDNA3
HindIII/(ApaI bout franc) pour construire PS2DC4 s'étendant jusqu'au résidu 168 de PS2 plus 3 résidus supplémentaires
La construction de l'extrémité N-terminale hydrophile de PS2 a été obtenue par amplification de la séquence PS2 avec les oligonucléotides ext5' 5' -CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC-3' (chevauchant l'ATG initial, en gras, et introduisant un site de restriction
EcoRI, souligné) et ext3' 5 ' -CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG- 3' (introduisant un codon stop aprés le résidu 90 de PS2 ainsi qu'un site de restriction XhoI, souligné). Après clonage dans le vecteur pCRII par la méthode TA cloning (InVitrogen), la conformité du fragment de PCR a été vérifié par séquençage. Ce fragment (EcoRI/XhoI) a ensuite été introduit dans un vecteur pcDNA3 en phase avec une séquence correspondant à l'épitope myc à son extrémité N-terminale: mycPS2Nter.
Pour ne pas préjuger de la topologie de PS2, le même fragment Nter a été recloné dans le vecteur pSectagB, en phase avec la séquence du peptide signal de IgkB pour diriger la sécrétion de la protéine pS2Nter: SecPS2-Nter.
L'extrémité C-term de PS2 a été construite de façon similaire à l'aide du fragment de restriction HindIII (1080)/PstI(en 3'non-codant) recloné dans le vecteur pSecTagB HindIII/PstI, SecPS2Cter s'étendant du résidu 361 à l'extrémité C-terminale, ou dans le vecteur pcDNA3myc en phase avec l'épitope myc.
De même, une construction tronquée de PS1 a été obtenue. Le vecteur pcDNA3-PS1 a été digéré par PflmI (site à la position 636 de la séquence nucléique codante de PS1) et XhoI dans le 3'non codant de la séquence de PSI. Ces sites ont été transformés à bout franc par traitement à la T4 ADN polyméase. Le fragment vecteur, purifié sur gel d'agarose, a été religé sur lui-meme pour fournir un vecteur d'exression d'une PSI tronquée s'étendant du N-ter de PS1 jusqu'au résidu Ile213 (après leSeme domaine transmembranaire) plus 12 résidus supplémentaires. Cette construction correspond à la chimère DC2 et est appelée PS 1 DC2 2.Constructions exprimant l'APP.
2.1 Constructions APP
Les différentes constructions APP complet (isoforme 695) et
SPA4CT (les 100 derniers résidus de l'APP précédés d'un petide signal pour insertion à la membrane) ont été décites précédemment (Dyrks et coll., 1993). Les vecteurs, pour l'expression de C100 et du domaine cytoplasmique de l'APP, ont été obtenus de la manière suivante : les cDNA correspondants ont été obtenus par amplification enzymatique de l'ADN (PCR = Polymerase
Chain Reaction) en utilisant, comrne amorce de synthèse, les oligonucléotides suivants: pour le C 100 : les oligonucléotides 8172 et 8181; pour le domaine cytoplasmique de l'APP: les oligonucléotides 81 71 et 8181.
Oligo 8172 5' CAAAGATCTGATGCACAATTCCGACAT 3' contenant:
- un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction BglII (souligné)
- la séquence codante pour les acides aminés 597-602 de l'APP (en gras) [numérotation APP de 695 acides aminés]
Oligo 8181 5' CAAGCGGCCGCTCATCC CTTGTCA TCGTCGTCCT
TGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTC 3' contenant:
- un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction NotI (souligné)
- la séquence complémentaire à la séquence codante pour les acides aminés 691-695 de l'APP (en gras) [numérotation APP de 695 acides aminés]
-la séquence complémentaire à la séquence Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp
Asp-Lys correspondant à l'épitope FLAG (en italique).
Oligo 8171 5' CAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC 3', contenant:
- un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction BglII (souligné)
- la séquence codante pour les acides aminés 650-655 de l'APP (en gras) [numérotation APP de 695 acides aminés]
Les produits de l'amplification enzymatique de 1'ADN ont été clonés dans le vecteur pCRH. La séquence nucléotidique a été vérifiée par la méthode des terminateurs spécifiques d'ADN.
Les cDNA sont ensuite introduits par ligation dans le plasmide d'expression dérivé du plasmide pSV2 et contenant, dans le meme cadre de lecture, un épitope MYC.
2.2.Construction des formes solubles de 1'APP: a-sAPP et B-sAPP.
Les ADNc correspondants aux formes sécrétées de l'APP se terminant aux sites a- et p- de clivage ont été obtenus par PCR.
L'oligonucléotide 1:
5 '-ccatcgatgctaCATCTTCACTTCAGAG-3' introduit: - un codon stop (séquence complémentaire inverse soulignée) après la position 1788 de 1'APP correspondant au site de clivage p.
-et un site de restriction ClaI.
L'oligonucléotide 2: 5'- ccatcgatgctaTTTTTGATGATGAACTTC -3' introduit: - un codon stop (séquence complémentaire inverse soulignée) aprés la position 1836 de l'APP correspondant au site de clivage a.
-et un site de restriction Clal.
L'oligonucléotide 3: 5'- CCGTGGAGCTCCTCCCG -3', commun pour les deux formes, correspond à la région 1583 à 1600 de 1'APP incluant le site de restriction interne de 1'APP SacI (souligné).
L'ADNc de 1'APP a été amplifié par PCR en utilisant les paires oligo3-oligol et oligo3-oligo2 pour ss-sAPP et a-sAPP respectivement. Les produits d'amplifications ont été sous-clonés comme précédemment en pCRII et les séquences vérifiées par séquençage. Pour chacun, le fragment de restriction SacI-ClaI ont été purifiés et reclonés dans le vecteur d'expression
APP (voir ci-dessus) digéré lui-aussi par SacI-ClaI pour remplacer la partie
C-terminale de l'APP par les fragments C-terminaux de ss-sAPP et o-sAPP respectivement et reconstituer les protéines complètes.
3.Constructions baculovirus.
L'obtention de vecteur de transfert pour baculovirus codant pour la protéine humaine PSI a été réalisé à partir de vecteur d'expression pour cellules de mammifères (Pradier et col, 1996). L'ADNc codant pour la protéine PSI a été extrait par une digestion par les enzymes de restriction
XhoI et NotI, puis cloné dans le plasmide de transfert pAcHTLB (protéine de fusion 6Histidines) et pAcSG2 ( protéine native). L'obtention de baculovius recombinants s'effectue selon le protocole du fournisseur (Pharmingen) et consiste à cotransfecter 2 X106 cellules d'insectes (sf9) avec I ptg de plasmide de transfert contenant le gène d'intérêt et 0.5 pg d'ADN viral (Baculogold). Après 5 jours à 27"C, les cellules sont grattées, puis centrifugées, le surnageant est utilisé comme stock viral pour l'amplification et la détermination du titre viral, l'expression de la protéine est visualisée par western blot sur le culot cellulaire.
L'obtention du baculovirus exprimant 1'APP Humain (695) a été décrite précédemment (Essalmani et col, 1996).
Pour l'étude de l'expression de PS1 et d'APP, les cellules sf9 sont coinfectées à une M.O.I de 2 par des baculovirus exprimant 1'APP humain (695), la protéine humaine Présiniline I (PSI), ou PS1 avec un tag 6 histidine en N terminal (6HisPS 1), ou la protéine de contrôle de pseudomas putrida XylE avec un tag 6 histidine en N terminal (6HisXylE), puis solubilisées par un tampon Tris l0mM, NaCl 130mM, Triton X100 1%, NP 40 1%, pH 7.5.
Les protéines solubilisées sont immunoprécipitées par un anticorps antiHistidine (A), antiPS1 (1805)(B), ou antiAPP (22cri1) (C). La présence de 1'APP ou de PSI a été révèlée par western blot avec l'anticorps antiAPP aCT43(A), 22C11(B),ou l'anticorps antiPS1 95/23(C).
Les fractions solubilisées contenant 1'APP, PSI ou 6HisPSl sont mélangées, puis immunoprécipitées en présence d'anticorps anti Histidines ou antiPSI pendant une nuit à 40C. La coimmunoprécipitation de 1'APP est révélée après western blot avec les anticorps aCT43 ou 22C 11.
5.Les plasmides
Les plasmides utilisés pour l'invention sont les suivants:
- pcDNA est un plasmide commercial (InVitrogen) utilisé pour le clonage et l'expression en cellules mammiféresdes séquences PS1 et PS2 et de leur formes tronquées.
- pCRII est un plasmide commercial (InVitrogen), utilisé pour le clonage de fragments de PCR
- pSecTagB est un plasmide commercial (InVitrogen), utilisé pour le clonage et l'expression en cellules mammiféres d'ADNc auxquels sont rajoutés le signal de sécrétion (peptide signal IgK).
- pSV2 est un plasmide commercial (Pharmacia), utilisé pour le clonage et l'expression en cellules mammiféres d'ADNc.
- pAcHTLB est un plasmide commercial (Pharmingen), pour l'insertion d'un épitope (His)6 à des ADNc et la recombinaison homologue avec des baculovirus.
- pAcSG2 est un plasmide commercial (Pharmingen), pour la recombinaison homologue avec des baculovirus.
- pET29a est un plasmide commercial (Novagene), pour l'expression d'ADNc en bactéries.
B/ METHODES
.1.Transfection de cellules
La méthode établie pour les cellules COSI ou les cellules CHO, consiste à utiliser un lipofectant dans un ratio de I pour 8 (poids/poids) par rapport à l'ADN et un peptide synthétique Hl (séquence:
KTPKKAKKPKTPKKAKKP) au meme ratio afin d'optimiser la compaction de l'ADN et l'efficacité de transfection. Cette méthode repose notamment sur la neutralisation des charges des phosphates de I'ADN par les charges positives du lipofectant.
Les cellules COSI sont cultivées en incubateur à 37"C, 95% d'humidité et 5 % de CO2 dans le milieu DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's Medium) contenant 4.5 g/l glucose (Gibco-BRL) supplementé avec 3 % de L-Glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine et 10 O/o de Sérum dc
Veau Foetal.
La veille de la transfection, les cellules sont ensemencées à une densité de 2.5 106 cellules par boite de 100 mm. Le jour de la transfection les cellules sont rincées 2 fois par du PBS (Phosphate Buffer Saline) et une fois en OptiMEM (composition brevetée; Gibco-BRL) pour une habituation d'au moins 15 minutes en incubateur.
Par équivalent-boite de 100 mm, 8 pg d'ADN plasmidique au total sont ajoutés à 300 Cll d'OptiMEM et 64 g de peptide H1. Après avoir vortexé vigoureusement pendant 10 secondes, on attend 5 minutes et la lipofectamine (32 p1, soit 64 pg) diluée dans 300 Cll d'OptiMEM est ajoutée au mélange précédent. L'ensemble est une nouvelle fois vortexé vigoureusement puis laissé 30 minutes reposer. Cinq millilitres d'OptiMEM sont ajoutés par tube et le mélange vortexé est placé sur les cellules (dont le milieu a été au préalable aspiré). Les cellules sont alors placées en incubateur pendant 4 heures, au terme desquelles le mélange est remplacé par du milieu complet.
2.Lvse des cellules et dosage des Protéines
Les cellules sont le plus souvent lysées 48 heures après la transfection (au maximum habituel d'expression). Le tampon de lyse contient 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM d'EDTA, 1 % de Triton X100, 1 % de
NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (CompleteO, Boehringer
Mannheim). Pour chaque plaque, après un rinçage au PBS, 800 pI du tampon froid sont ajoutés. Les lysats subissent alors une sonication suivie d'une agitation au barreau magnétique à 40C pendant une nuit. Une centrifugation de 30 minutes à 15000 tr/mn sépare le culot du surnageant. Les protéines solubles sont alors dosées selon le kit BCA (Pierce) afin de pouvoir normaliser les expériences suivantes.
3.1mmunoDrécipitations
Les anticorps dirigés contre le peptide du N-term de PS2, 95041, (Blanchard et coll., 1997) et contre les vingt premiers acides aminés de PSI (Duff et coll., 1996) ont été obtenus chez le lapin par immunisation avec des peptides synthétiques. Pour l'immuno-précipitation, 100 g de protéines sont dilués dans 400 p1 de RIPA modifié (150 mM NaCI, 50 mM Tris pH 8.0,1 % Triton X100 v/v, 1% NP40 v/v). Trente microlitres de suspension de protéine A Sépharose (0.1 % m/v en solution de PBS) et 3 p1 d'anticorps sont ajoutés. Les suspensions sont mélangées doucement sur un agitateur rotatif à 4"C pendant une nuit. Le complexe de protéine A Sépharose est lavé 3 fois avec 0.5 ml de RIPA modifié et une fois avec 0.5 ml de tampon de lavage Wash C (10 mM Tris pH 7.5).
4.Immunotransfert
Les échantillons (lysats de cellules) sont dénaturés dans un volume égal de tampon de dépôt (125 mM Tris pH 6.8, 4% m/v SDS, 20 % glycérol, 0.02 % Bromophénol Blue, 50 mM Dithiothreitol) à 95"C pendant 5 minutes. Pour l'analyse de l'expression des présénilines, les échantillons sont dénaturés en présence de 8 M urée et à 37 "C afin d'éviter l'agrégation propre aux présénilines à 95 OC.
Les échantillons sont déposés sur des gels Tris-Glycine (Novex), avec un pourcentage d'acrylamide différent selon le poids moléculaire à discriminer. Un marqueur de Poids Moléculaire est également déposé (Broad
Range, BioRad). La migration a lieu pendant environ 2 heures à 100 Volts constants dans du tampon SDS IX final (Novex). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (Tampon de transfert IX final (Novex) avec 10 % de méthanol) pendant 2 heures à 150 mA constants.
Après transfert, la membrane est bloquée pendant 2 heures à température ambiante dans 50 ml de PBS-T (PBS avec 0.5 % Tween) contenant 2 % de lait écrémé (Merck). L'anticorps primaire (dilué à la concentration optimale de l'ordre du 1/1000e au 1/5000e, dans du PBS-T avec ou sans 2 % de lait écrémé) est laissé sur une nuit à 4 "C. Après un bref rinçage en PBS-T, la membrane est incubée 45 minutes en présence du deuxième anticorps (IgG anti-souris ou anti-lapin selon le cas, couplé à la peroxydase de Raifort) dilué au 1/5000e dans un tampon dit ECL (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 0.1 %).
La membrane est alors rincée 4 fois 15 minutes dans le tampon ECL . Elle peut être révélée par le réactif ECL (Amersham) constitué de 2 tampons à mélanger extemporanément en volume égal. Différentes expositions d'un film photographique (Hyperfilm ECL ; Amersham) sont effectuées, suivies d'un développement.
5.Fixation in vitro de PS2 NT avec le peptide AD Amyloid
5.1 Production de la protéine recombinante PS2 NT en bactérie.
Pour la création d'un vecteur d'expression bactérien de PS2NT (amino acides 1 à 87), l'ADNc de PS2 a été amplifié par PCR avec les oligonucléotides 3': (CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG) et 5' (CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC > . Le fragment résultant a été cloné dans pCRII et la séquence confirmée. Ce fragment a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pET29a (Novagene) en phase avec la séquence de l'étiquette S-tag. La protéine a été produite en bactérie BL21 Après induction à l'IPTG pour 5h, les bactéries ont été récupérées par centrifugation (10 min à 6000tours/mn) et le culot cellulaire dissout en tampon RIPA (volume calculé en multipliant la DO de la culture après induction par le volume de culture divisé par 23). Les bactéries ont été lysées par sonication et le lysat centrifugé à 13000 tr/min pendant 20 min à 4"C. Le surnageant (extrait total) a été utilisé pour les études de fixation.
5.2 Test de fixation
Le peptide A synthétique a été déposé sur membrane de nitrocellulose (Schleicher and Schuell) en utilisant un appareil dot-blot 96 puits. Après dépôt, le filtre a été bloqué (envers les sites non-spécifiques de fixation de protéines) avec le réactif de bloc gélatine (Novagen) dilué au lOeme en TBST. Après bloquage, le filtre a été replacé sur l'appareil de dotblot et l'extrait bactérien PS2NT ajouté dans les puits pour une incubation de 2h à température ambiante. Comme contrôle, un extrait bactérien contenant le plasmide vide pET29 a était utilisé sur des puits en duplicat. Le filtre a ensuite été lavé une fois avec du tampon RIPA, puis retiré de l'appareil et lavé trois fois avec du PBST (1 5min pour chaque lavage). La détection de l'étiquette S-tag a ensuite été effectuée comme prescrit par le fournisseur effectuée par scanning optique du filtre et quantification de l'intensité dans chaque puit par le logiciel Tina 2.1 (Raytest).
EXEMPLES
Exemple 1. Interaction entre APP et PS2 et cartographie de la zone d'interaction sur PS2.
L'interaction entre les protéines APP et PS2 en cellules mammiféres est exemplifié dans la figure 2. Le lysat de cellules COS transfectées avec
PS2 et APP est soumis à une immunoprécipitation avec un anticorps dirigé contre le N-term de PS2 ( 95041, Blanchard et col., 1997).
L'immunoprecipitat est ensuite analysé par immunotransfert avec un anticorps contre l'APP. L'APP est clairement détecté dans les immunoprécipitats des cellules cotransfectées avec APP et PS2 mais pas en l'absence de PS2 (Fig2., piste 6 par rapport à piste 7) comme précedemment décrit (Weidemann et col., 1997). Pour cartographier la zone d'interaction entre ces deux protéines, plusieurs formes tronquées de PS2 ont été construites. Afin de conserver la topologie membranaire de PS2 déterminée en général par la partie N-term des protéines membranaires, des tronquations progressives de l'extrémité C-term de PS2 ont été produites se terminant apres différents domaines transmembranaires TM6 (PS2DC 1), TM4 (PS2DC2), TM3 (PS2DC3) et TM2 (PS2DC4), schéma FiglA. L'extrémité
N-term hydrophile (87 résidus) de PS2 a aussi été construite sous forme cytoplasmique (séquence native) ou sous forme sécrétée par l'insertion du peptide signal de la chaine Igk. L'expression de ces différentes formes est exemplifiée figure 1B, révélée à l'aide de l'anticorps anti-PS2 (95041). Les constructions possédant des domaines hydrophobes présentent en plus des bandes correspondant aux formes monomériques au poids moléculaires attendus (formant ici des doublets rapprochés), des formes dimériques et des aggrégats de haut poids moléculaires typiques de PS2 (FiglB, pistes 3-5). En particulier pour PS2 complète, seuls ces aggrégats sont détectables dans cette figure tandis que la forme monomérique n'est pas détectable (piste 6). Les deux constructions du N-term hydrophille de PS2: mycPS2Nt et SecPS2Nt donnent lieu aux bandes aux poids moléculaires attendus ( FiglB, pistes 1 et 2.). La construction SecPS2Nt est également sécrétée dans le milieu extracellulaire (Fig3, piste 2) tandis que la construction mycPS2Nt est, elle, cytoplasmique.
Ces constructions ont été cotransfectées individuellement avec l'APP. La fraction détergent-soluble des lysats cellulaires a été immunoprécipitée avec l'anticorps dirigé contre le N-term de PS2 et ces immunoprécipitats analysés par immunoblots. Comme avec la PS2 complète, 1'APP est détectable dans les immunoprécipitats avec toutes les formes tronquées de PS2, PS2DC2 à PS2DC4 (Fig2, pistes 3-5) démontrant l'interaction entre APP et les formes contenant le N-term de PS2. Cette interaction avec 1'APP est conservée avec la construction N-term de PS2 sous sa forme sécrétée (Fig2, piste 2) démontrant que l'ancrage de PS2Nt dans la membrane lipidique n'est pas nécessaire pour cette interaction. Par opposition, la forme cytoplasmique mycPS2NT n'interagit pas avec APP (Fig2,piste 1).
L'expérience inverse d'immunoprécipitation par un anticorps anti
APP et de la détection par l'anticorps N-term de PS2 a permis de confirmer l'interaction entre 1'APP et SecPS2Nt dans des conditions expérimentales différentes.
Dans le milieu de culture des cellules cotransfectées avec APP et
SecPS2Nt, une interaction entre ces deux protéine est également démontrée par coimmunoprécipitation (Fig3A, piste4 et Fig3B, piste3). La forme mycPS2NT n'interagit pas avec APP dans le milieu non plus (Fig3B, piste2).
La présence de cette interaction dans le milieu, démontre que le complexe
APP/PS2Nt est relativement stable au cours du processus de sécrétion.
Exemple 2. Interaction entre APP et PS2 et cartographie de la zone d'interaction sur APP.
Des formes tronquées de 1'APP ont été utilisées pour délimiter la zone d'interaction sur 1'APP. Une construction comportant les 100 demiers résidus de 1'APP sous le contrôle ou non d'un peptide de sécrétion (SPA4CT et C100, Dyrks et col.,1993) et une construction comportant seulement le domaine cytoplasmique (les 45 demiers résidus de l'APP) ont été utilisées et leur présence détectée à l'aide d'un anticorps dirigé contre le domaine cytoplasmique de 1'APP (CT43, Stephens et Austen, 1996). Dans les cellules cotransfectées avec PS2, une interaction de SPA4CT mais pas du domaine cytoplasmique de 1'APP avec PS2 a pu être mis en évidence (Fig4A, comparer piste 4 et 5). L'interaction de PS2 avec la construction C 100 (sans signal de sécrétion) a aussi pu être démontrée (Fig4B, piste 7). Même en associant le domaine cytoplasmique de 1'APP à la membrane dans une construction chimérique avec le récepteur alpha de l'IL2, aucune interaction avec PS2 n'a pu être observée. L'interaction avec SPA4CT mais pas avec le domaine cytoplasmique indique donc que sur 1'APP, la région du Ap et le reste du segment transmembranaire est suffisante pour l'interaction avec
PS2.
Exemple 3. Interaction de PS1 avec APP et cartographie initiale.
Par analogie aux résultats obtenus pour PS2 (exemples 1 et 2), l'étude de l'interaction de PSI avec APP a été réalisé dans le même système cellulaire COS 1, aprés coimmunoprécipitation avec un anticorps dirigé contre les 20 derniers acides aminés de PSl (Duff et col., 1996), le SPA4CT, le fragment C-terminal de 1'APP, peut être détecté dans les précipitats (Fig5A, piste4 ). L'APP aussi interagit avec PS1. De même, la forme tronquée de PS1, PS1DC2(1-213), interagit avec APP (Fig5B. piste4). Ces premières données nous permettent d'envisager que les régions d'interaction entre APP et PSI doivent être voisines de celles exemplifiées précédemment avec PS2.
Pour vérifier la validité et la généralité de cette interaction
PS1/APP, un système cellulaire différent a été utilisé, dans lequel les cellules d'insectes ont été infectées par des baculovirus recombinants exprimant la
PSI avec ou sans étiquette His6 et 1'APP ( c.f. Materiels et methodes).
L'étude des lysats cellulaires a permis de détecter 1'APP dans les immunoprécipitats antiHis6 (pour la PS1-His6, Fig6A, piste4) ou antiPS 1 (pour la PS1 avec ou sans His6, Fig6B, pistes 4 et 5) lorsque les cellules sont coinfectées avec les deux types de virus recombinants mais pas lorsqu'une seule des protéines est exprimée (pistes 1,2 et 3 correspondantes).
Inversement, dans les immunoprécipitats anti-APP, les protéines PSI-His6 et
PSI sont détectables (Fig6C, pistes 4 et 5) pour les doubles infections. Cette expérience permet de confirmer l'interaction dans le sens inverse avec des anticorps différents.
Exemple 4. Interaction de A5 et PS2 en cellules
Etant donné que la région d'interaction entre l'APP et la PS2 implique sur l'APP, une région incluant le peptide amyloide (de 595 à 635) et sur la PS2, son domaine N-term hydrophile, il est démonter dans cet exemple que cette dernière interagissait directement avec le peptide amyloïde (Ass) produit par des cellules. L'expression de SPA4CT (correspondant aux 100 derniers résidus de 1'APP précédés d'un petide signal) en cellules COS conduit à une forte production du peptide amyloide, en partie car SPA4CT est considéré comme le précurseur biologique du Ass. Les cellules COS ont été transfectées avec SPA4CT seul, SPA4CT et SecPS2Nt ou avec SecPS2Nt seul. Les milieux extracellulaires correspondant ont été immunoprécipités avec l'anticorps antiPS2 et le peptide Ass a été détecté grâce à l'a supplémentaire à approximativement 40 kDa est aussi détectée de façon spécifique pour les cellules doublement transfectées. Après lavage du filtre et détection avec l'anticoprs PS2, il apparait qu'une bande au même poids moléculaire est également PS2-immunoréactive (Fig7, piste 4). Cette bande est aussi présente pour les cellules transfectées avec SecPS2Nt comme attendu. Ainsi, dans les cellules doublement transfectées, cette bande représente un complexe SDS-stable entre SecPS2Nt et le Ass, pouvant confirmer l'interaction entre ces deux entités. La faible différence de masse apportée par le peptide Ass (4kDa) expliquerait qu'il n'y ait pas de différence de taille détectable avec les cellules transfectées avec SecPS2Nt seulement.
Les résultats de ces expérinces permettent de conclure que la forme sécéte de
PS2 (secPS2Nt) interagit in vitro avec le peptide Ass (595-635).
Exemple 5. Reconstitution de l'interaction de Ab et PS2Nt en test in vitro.
Pour confirmer l'interaction entre le peptide Ap et PS2Nt (extrémité
N-tenninale de PS2), un test de fixation in vitro a été développé. Une protéine de fusion PS2Nt portant le peptide marqueur S (S-tag) à son extrémité N-terminale a été exprimée en bactérie. Les peptides Ap1-40 et Ass 1-42 ont été déposés sur membranes de nitrocellulose qui ont été incubées en présence d'un extrait bactérien exprimant la protéine PS2Nt. Le S-tag a ensuite été révélé par la protéine fixatrice du S-tag couplé à l'alkaline phosphatase et par réaction colorimétrique. La protéine S-tag-PS2Nt se fixe bien sur les peptides Ass dans ce test in vitro (Fig8A). Comme contrôles, des duplicats ont été incubés en présence d'un extrait bactérien n'exprimant que le peptide S qui est utilisé comme niveau de fixation non-spécifique sur le peptide Ass (formes 1-40 et 1-42). Des dilutions sérielles de l'extrait bactérien permettent d'établir que cette fixation est dose-dépendante et saturable. Dans cette expérience, la fixation semble être plus importante sur le Ap1-42 que sur le AB1-40 avec cependant une certaine variabilité. Par exemples la fixation de PS2Nt est dépendante de la dose de Ass déposée sur la membrane, alors que Ass1-40 et Ass1-42 présentent des valeurs équivalentes de fixation.
Cet exemple fourni une confirmation de la reconstitution de l'interaction PS2Nt-APP(Ap) in vitro entre les formes Ap1-40 et Ap1-42 synthétiques d'origine bactérienne. Etant donné que les mutations pathologiques de PS2 conduisent à une augmentation du ratio Ass1-42/Ass140 produit dans de nombreux systèmes et que par ailleurs, il y a interaction physique entre PS2 et APP, il apparaît que cette interaction physique est impliquée dans la production du peptide AB1-42. Ainsi, l'inhibition de cette interaction constitue une approche thérapeutique extrémement originale pour la maladie d'Alzheimer.
Exemple 6. Reconstitution de l'interaction APP/PS1 in vitro
Le système d'expression baculovirus permettant l'expression de grandes quantités de protéines recombinantes, les lysats de cellules infectées par chacun des trois virus ont été utilisés comme source de protéines APP, PS1 et PSî-His6. Les fractions solubilisées contenant l'APP, PS1 ou 6HisPS 1 sont mélangées, puis immunoprécipitées en présence d'anticorps anti Histidines ou antiPSI pendant une nuit à 40C. L'APP est clairement détecté dans les immunoprécipitats (Fig 9A, piste3 et Fig9B, piste 3) démontrant que l'interaction APP avec PS1-His ou PS1 est reconstituée in vitro par incubation des deux protéines. L'APP seul semble être faiblement précipité par l'anticorps anti-PS1 (Fig9B, pistel) mais pas avec l'anticorps anti-His confirmant la spécificité de l'interaction dans ce cas-là. Ces résultats permettent la mise au point d'un test d'interaction in-vitro des deux protéines complétes APP et PS 1.
Exemple 7. SecPS2Nt bloque l'interaction de APP et PS1 en cellules transfectées.
Il a été démontré dans les exemples précédents que APP interagit avec PS I de façon semblable à PS2 et que pour cette dernière, la construction SecPS2Nt suffit à l'interaction avec APP. Cet exemple a pour but d'évaluer si la fixation de SecPS2Nt sur 1'APP peut bloquer l'interaction avec PSI de façon croisée (hétérologue). Dans le sytème COS1, le SPA4CT (correspondant aux 100 derniers résidus de 1'APP précédés d'un petide signal) peut être détecté dans les immunoprécipitats anti-PS1 des cellules exprimant SPA4CT et PS1 ou PSI mutant, PSI*,(FiglOA, pistes I et 2.). Par opposition, lorsque SecPS2NT est cotransfecté, le signal SPA4CT disparait quasiment dans les immunoprécipitats anti-PSI (Fig4A, pists 3 et 4). Après l'immunoprécipitation anti-PS I, les surnageants (fraction non-liée à la protéine A sépharose) ont subit une seconde immunoprécipitation avec l'anticorps anti-PS2. Le SPA4CT est clairement détecté dans les cellules cotransfectées avec PSI et SecPS2Nt (FiglOB, pistes 3 et 4) démontrant que dans ces cellules, SecPS2Nt en se fixant, a déplacé la fixation de SPA4CT sur PS1. Cette expérience nous permet donc de conclure que SecPS2Nt est une molécule capable non seulement de se fixer sur APP, mais aussi de déplacer la fixation de APP sur PS1 et vraisemblablement PS2. SecPS2Nt peut donc en cellules servir de leurre pour bloquer l'interaction APP avec les deux présénilines, PSI et PS2. En effet, les résultats de la cartographie de l'interaction PSI/APP, confirment que les zones d'interaction mises en jeu sont similaires à celles de PS2.
Exemple 8. PS2 interagit avec un deuxième segment de APP, autre que
Ass.
Il a été précédemment démontré que SecPS2NT interagit dans le milieu extracellulaire avec les formes sécrétées de APP (Fig3A, piste 4). Les formes sécétées de 1'APP sont libérées après clivage soit au site P (position 595), correspondant au début du peptide Ap, soit au site a (position 612) au sein même de ce peptide. Ces résultats suggèrent que PS2NT interagit aussi
APP ont été construites, par insertion d'un codon stop aux sites p (B-sAPP) et a (a-sAPP) et ont été testées. PS2 complet et SecPS2NT interagissent effectivement avec a-sAPP (Fig 11, pistes 3 et 5) et p-sAPP (Fig 11, pistes 4 et 6). Ces résultats établissent qu'un segment de APP compris entre la position 1 et 595 (et donc autre que le Ass) est également capable d'interagir avec PS2 et PS2NT. Ces résultats permettent en outre de confirmer que l'interaction PS2NT/APP peut avoir lieu en absence d'ancrage à la membrane des deux partenaires et dans le compartiment luminal (ou extracellulaire) de la cellule.
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Baculovirus-Infected Cells Do not Produce the Amyloid Peptide of Alzheimer's
Disease from its Precursor. FEBSLett. 389: 157-161.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
(B) RUE: 20 Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: Antony
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92165
< H) TELECOPIE: 01.55.71.72.91
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le precurseur du peptide beta-amyloide et ou le peptide beta-amyloide.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 261 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..261
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG CTC ACA TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAA GAA GTG TGT GAT GAG 48
Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu
1 5 10 15
CGG ACG TCC CTA ATG TCG GCC GAG AGC CCC ACG CCG CGC TCC TGC CAG 96
Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln
20 25 30
GAG GGC AGG CAG GGC CCA GAG GAT GGA GAG AAT ACT GCC CAG TGG AGA 144
Glu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg
35 40 45
AGC CAG GAG AAC GAG GAG GAC GGT GAG GAG GAC CCT GAC CGC TAT GTC 192
Ser Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val
50 55 60
TGT AGT GGG GTT CCC GGG CGG CCG CCA GGC CTG GAG GAA GAG CTG ACC 240
Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr
65 70 75 80
CTC AAA TAC GGA GCG AAG CAT 261
Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His
85
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 243 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..243
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG ACA GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC CAG AAT GCA CAG ATG 48
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met
1 5 10 15
TCT GAG GAC AAC CAC CTG AGC AAT ACT GTA CGT AGC CAG AAT GAC AAT 96
Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn Asp Asn
20 25 30
AGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CAC CCT GAG 144
Arg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu
35 40 45
CCA TTA TCT AAT GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG GTG GAG 192
Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu
50 55 60
CAA GAT GAG GAA GAA GAT GAG GAG CTG ACA TTG AAA TAT GGC GCC AAG 240 Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys
65 70 75 80
CAT 243
His
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2088 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..2088
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG 48
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 5 5 10 15
GCG CTC GAG GTA CCC ACT GAT GGT AAT GCT GCC CTG CTG GCT GAA CCC 96
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
CAG ATT GCC ATG TTC TGT GGC AGA CTG AAC ATG CAC ATG AAT GTC CAG 144
Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
35 40 45
AAT GGG AAG TGG GAT TCA GAT CCA TCA GGG ACC AAA ACC TGC ATT GAT 192
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
ACC AAG GAA GGC ATC CTG CAG TAT TGC CAA GAA GTC TAC CCT GAA CTG 240
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
CAG ATC ACC AAT GTG GTA GAA GCC AAC CAA CCA GTG ACC ATC CAG AAC 288 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
85 90 95
TGG TGC AAC CGC GGC CGC AAG CAG TGC AAG ACC CAT CCC CAC TTT GTG 336
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
100 105 110
ATT CCC TAC CGC TGC TTA GTT GGT GAG TTT GTA AGT GAT GCC CTT CTC 384
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
GTT CCT GAC AAG TGC AAA TTC TTA CAC CAG GAG AGG ATC GAT GTT TGC 432
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
GAA ACT CAT CTT CAC TCG CAC ACC GTC GCC AAA GAG ACA TGC AGT GAG 480
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160
AAG AGT ACC AAC TTG CAT GAC TAC GGC ATG TTG CTC CCC TGC GGA ATT 528
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
165 170 175
GAC AAG TTC CGA CGC GTA GAG TTT GTC TGT TGC CCA CTG GCT GAA GAA 576
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
AGT GAC AAT GTG GAT TCT GCT GAT GCG GAG GAG GAT GAC TCG GAT GTC 624
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
TCG TCG GGC GGA GCA GAC ACA GAC TAT GCA GAT CGC AGT GAA GAC AAA 672
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
GTA GTA GAA GTA GCA GAG GAG GAA GAA GTC GCT GAG GTG GAA GAA GAA 720
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240
GAA GCC GAT GAT GAC GAG GAC GAT GAG GAT GGT GAT GAG GTA GAG GAA 768
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
GAG GCT GAG GAA CCC TAC GAA GAA GCC ACA GAG AGA ACC ACC AGC ATT 816
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser île
260 265 270
GCC ACC ACC ACC ACC ACC ACC ACA GAG TCT CTC GAA GAG CTC GTT CGA 864
Ala Thr Thr Tllr Thr Thr Thr Thr Cl Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
GTT CCT ACA ACA GCA GCC AGT ACC CCT GAT GCC GTT GAC AAG TAT CTC 912
Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu
290 295 300
GAG ACA CCT CGC GAT GAG AAT GAA CAT GCC CAT TTC CAG AAA GCC AAA 960
Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys 305 310 315 320
GAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AGA ATG TCC CAG GTC ATG AGA 1008
Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg
325 330 335
GAA TGG GAA GAG GCA GAA CGT CAA GCA AAG AAC TTC CCT AAA GCT GAT 1056
Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp
340 345 350
AAG AAG GCA GTT ATC CAG CAT TTC CAG GAG AAA GTG GAA TCT TTC GAA 1104
Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu
355 360 365
CAG GAA GCA GCC AAC GAG AGA CAG CAG CTC GTG GAG ACA CAC ATG GCC 1152 Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala
370 375 380
AGA GTG GAA GCC ATG CTC AAT GAC CGC CGC CCC CTG GCC CTC GAG AAC 1200
Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn 385 390 395 400
TAC ATC ACC GCT CTG CAG GCT GTT CCT CCT CGC CCT CGT CAC GTG TTC 1248
Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe
405 410 415
AAT ATG CTA AAG AAC TAT GTC CGC GCA GAA CAG AAC GAC AGA CAG CAC
1296
Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His
420 425 430
ACC CTA AAG CAT TTC GAG CAT GTG CGC ATG GTC GAT CCC AAG AAA GCC
1344
Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala
435 440 445
GCT CAG ATC CGG TCC CAG GTT ATC ACA CAC CTC CGT GTG ATT TAT GAG 1392
Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu
450 455 460
CCC ATG AAT CAG TCT CTC TCC CTG CTC TAC AAC GTG CCT GCA CTC GCC 1440
Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala 465 470 475 480
GAG GAG ATT CAG GAT GAA GTT GAT GAG CTG CTT CAG AAA GAG CAA AAC 1488
Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn
485 490 495
TAT TCA GAT GAC GTC TTC GCC AAC ATC ATT AGT GAA CCA AGG ATC AGT 1536
Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met île Ser Glu Pro Arg Ile Ser
500 505 510
TAC GGA AAC GAT GCT CTC ATG CCA TCT TTC ACC GAA ACG AAA ACC ACC 1584
Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr
515 520 525
GTG GAG CTC CTT CCC GTG AAT GGA GAG TTC AGC CTC GAC GAT CTC CAG 1632
Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln
530 535 540
CCC TGG CAT TCT TTT CGC GCT GAC TCT GTC CCA GCC AAC ACA GAA AAC 1680
Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn 545 550 555 560
CAA GTT GAG CCT GTT GAT GCC CCC CCT GCT GCC GAC CGA GGA CTC ACC 1728
Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr
565 570 575
ACT CGA CCA GGT TCT CGC TTC ACA AAT ATC AAC ACG GAG GAG ATC TCT 1776
Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser
580 585 590
GAA GTG AAC ATC GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 1824
Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val
595 600 605
CAT CAT CAA AAA TTC GTC TTC TTT GCA GAA GAT GTC GGT TCA AAC AAA 1872
His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
610 615 620
GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATC CTC GGC GGT GTT GTC ATA CCC ACA GTC 1920
Gly Ala Ile Ile C1y Leu Met Val Gly C1y Val Val Ile Ala Thr Val 625 630 635 640
ATC GTC ATC ACC TTC GTG ATC CTC AAC AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 1968
Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile
645 650 655
CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CCC 2016
His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg
660 o 65 670
CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 2064
His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys
675 680 685
TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC TAG 2088
Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn *
690 695

Claims (38)

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide P-amyloïde et/ou le peptide ss-amyloïde.
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une partie de PS2 permettant l'interaction avec le précurseur du peptide Pamyloïde et/ou le peptide amyloïde
3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce que la partie de PS2 correspond au fragment N-terminal hydrophile de PS2.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N"1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
5. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une partie de PSI permettant l'interaction avec le précurseur du peptide P- amyloide et/ou le peptide P-amyloïde.
6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N"2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
7. Polypeptide selon l'une des revendication 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend au moins les régions d'homologie communes aux séquences SEQ ID N"1 et
SEQ ID N"2.
8. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une partie du précurseur du peptide P-amyloïde.
9. Polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce que la partie du précurseur du peptide P-amyloïde comprend tout ou partie du fragment 1-650, de préférence tout ou partie du fragment 1-635 et de préférence encore tout ou partie du fragment 1-596.
10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'une séquence choisie parmi la séquence correspondant au fragment 1-650 de la séquence SEQ ID N03, ou la séquence correspondant au fragment 1-635 de la séquence SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-596 de la séquence SEQ ID N03, ou une séquence dérivée.
11. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide ss-amyloide et/ou le peptide ss-amyloide obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 10 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
12. Polypeptide selon l'une des revendication 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence signal.
13. Polypeptide selon la revendication 12 caractérisé en ce que la séquence signal est choisie parmi séquence du peptide signal de IgkB le peptide signal de l'APP, les petides signal des sous-unités des récepteur nicotinique de l'acétylcholine musculaires et centraux.
14. Séquence nucléotidique codant pour un peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
15. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N"1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
16. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N"2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
17. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence comprenant essentiellement les zones d'homologies communes aux séquences nucléotidiques SEQ ID N"1 et SEQ ID N"2.
18. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence choisie parmi la séquence correspondant au fragment 1-650 (acides nucléiques 1 à 1944) de la séquence SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-635 (acides nucléiques 1 à 1914) de la séquence SEQ ID N"3, ou la séquence correspondant au fragment 1-596 (acides nucléiques 1 à 1788).de la séquence SEQ ID N03, ou une séquence dérivée.
19. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 14 à 18 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit.
20. Cellule hôte pour la production d'un peptide selon l'une des revendications I à 10, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 14 à 18.
21. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10 et en ce qu'il possède la faculté d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide P-amyloide et/ou le peptide ss-amyloïde.
22. Procédé de mise en évidence ou d'isolement de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide P-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée exprimant un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications I à 10 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
b - on détecte et/ou isole les molécules liées audit polypeptide.
23. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 10, susceptible d'etre obtenu selon le procédé de la revendication 22.
24. Virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 10.
25. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 14 à 18.
26. Vecteur selon la revendication 25 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
27. Vecteur selon la revendication 25 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
28. Vecteur selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication.
29. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 25 à 28.
30. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 12.
31. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 21 et/ou un ligand selon la revendication 23.
32. Composition selon l'une des revendications 29 à 31 destinée à inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide Pamyloïde et/ou le peptide P-amyloïde.
33. Composition selon l'une des revendications 29 à 32 destinée au traitement des maladies neurodégénératives.
34. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 13 pour inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide Pamyloïde et/ou le peptide ss-amyloïde
35. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 13 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégénératives et notamment de la maladie d'Alhzeimer.
36. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 13 pour la rnise en évidence de ligands des polypeptides et/ou de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une préséniline et le précurseur du peptide P-amyloïde et/ou le peptide P-amyloïde
37. Utilisation des sequences nucléotidiques selon les revendications 14 à 18 pour la construction d'une cassette d'expression utilisable dans un vecteur selon les revendications 25 à 28.
38. Cassette d'expression utilisable dans un vecteur défini selon les revendications 25 à 28 pour la production de polypeptides selon les revendications I à 13.
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