JP2002501385A - 可溶性ラミニン受容体前駆体及びその相互作用を阻止するための方法 - Google Patents
可溶性ラミニン受容体前駆体及びその相互作用を阻止するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、可溶性ラミニン受容体前駆体(LRP)又はその変性体からなる薬剤組成物に関する。また、本発明は、LRP及びPrPsc又はPrPcの相互作用を阻止する化合物からなる薬剤組成物に関する。前記組成物は、PrPscの存在に関わる疾患の治療を可能とする。加えて、本発明は、バキュロウイルス系におけるLRPの組み換え産物又はいずれかのタンパク質の種類に対する発現ベクターを提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
ラミニン受容体前駆体及びPrPsc又はPrPcの相互作用を阻止する可溶性ラミニン
受容体前駆体又は化合物からなる薬剤組成物
本発明は、可溶性ラミニン受容体前駆体(LRP)又はその変性体からなる薬剤組
成物に関する。また、本発明は、LRP及びPrPsc又はPrPc間の相互作用を阻止する
化合物からなる薬剤組成物に関する。前記組成物は、PrPscの存在に関わる疾患
を治療することを可能とする。加えて、本発明は、バキュロウイルス系における
LRPの組み換えによる生産又はいずれかの種類のタンパク質に対する発現ベクタ
ーを提供する。
プリオンタンパク質は、例えば、ウシ海綿状脳症(BSE)、クロイツフェルト・
ヤコブ症候群(CJD)、スクレピー(Prusiner、1991)などの感染性海綿状脳症の病
因に中心的役割を果たしていると考えられている。この特有なグループの神経変
性障害は、染色体のプリオンタンパク質遺伝子における既知の突然変異のために
遺伝的に受け継がれることが可能であり、これらの神経変性障害は、突発的に生
ずる可能性もあるし、また感染した生物の器官から出た伝染性粒子による感染に
よって、引き起こされる可能性がある(Weissmann等1994参照)。BSE仲介物のマウ
スに対する感染性についての現在の研究によっては、PrPscは種の適合に含まれ
る可能性があるが、非同定仲介物が、実際にBSEを感染させるかもしれないと提
案されているが、遺伝性を仲介するものは、何らかの核酸の不存在下で宿主で複
製可能な感染性タンパク質(PrPsc)であると考えられている(Prusiner等，1982、
Alper等，1967、Griffith 1967)。正常な宿主をコードするPrPcの病原性のアイ
ソフォームであるPrPscは、宿主PrPcをPrPscに変えて、その結果、例えば、海綿
状空胞形成、星状細胞の増殖、ニューロン細胞の不足など、脳における病理上の
変化を引き起こす。
PrPc及びPrPscは、一時構造に関しては同じであるが(Stahl等，1993)、CD及び
FTIR分光測定によっては、これらが異なる２次構造を持つことが示された(Meyer
等，1986年、Pan等，1993年)。PrPcは、βシート構造の含有量が非常
に低く、PrPScは、βシート構造の含有量が高い。さらに、PrPcは、プロテイナ
ーゼＫによって完全に加水分解することができ、一方PrPscは、プロテイナーゼ
Ｋ耐性感染性のコアPrP27-30(Caughey等、1991、Prusiner等、1981;1983;1984)
に消化される。SsPrP27-30として呼ばれたタンパク質プロテイナーゼＫ感受性、
可溶性、及びおそらく非感染性のPrP27-30の変形型を、ヒト血小板において同定
されたが(ペリニ等、1996)、該変形型は、プロテイナーゼＫ耐性PrP27-30の前駆
体としても役割を果たすかもしれない。
PrPcのPrPScへの転換は、α-ヘリックスからβシートへのポリペプチドの構造
の再配列を含むと考えられる。この転換メカニズムを説明するために２つのモデ
ルが現在用いられている。ヘテロダイマーモデル(Prusiner等、1982年)によると
、一つの外因性PrPSc分子が宿主PrPcと接触すると、PrPScホモダイマーに再び折
りたたまれたPrPSc−PrPcヘテロダイマーが生じる。対照的に、核生成依存重合
化モデル(Lansbury and Caughey、1995)は、感染力は、重合化の種として役割を
果たし得るPrPScオリゴマーの属性であることを提案している。
細胞のプリオンタンパク質PrPcの生理的役割を、一連のノックアウト実験で研
究したが、議論の余地ある結果となった。研究者の大部分は、PrP−ノックアウ
トマウスの行動又は再現性において変化を全く認めなかった(Borchelt and Siso
dia，1996)。さらに最近のPrPo/oマウスを用いた研究によっては、GABAA受容体
が仲介する効率的かつ速い阻害を含むシナプスの機能においてPrPcが重要な役割
を有することを示唆し(Collinge等、1996)、一方別の研究では、海馬においてシ
ナプスの機能障害が全く見出されなかった(Lledo等、1996)。PrPo/oマウス系統
での表現型の観察におけるこれらの矛盾は、遺伝的に背景が異質であり(Borchel
t and Sisodia,1996)また動物の年齢に差があるためであるかもしれない。要約
すれば、PrPcの生理的な役割は不明確のままである。しかしながら、prn-p遺伝
子を欠くPrPo/oマウスは野生型マウスとは対照的に、マウスPrPScの感染に
ような疾患の進展に本質的なものであることを証明している。さらに最近の研究
では、PrPcは、スクレピー誘導神経毒性に対して必要であり(Brandner等、1996)
、中枢神経系内にスクレピーが拡散するのに必要とされる(Brandner等、1996b)
こ
とが証明された。
今までのところ、PrPScの増殖において含まれる可能性のあるプリオンタンパ
ク質の受容体又は共受容体は、同定することができなかった。加えて、PrPScの
存在に関わる上述の疾患を治療する方法も存在しない。
それゆえ、本発明に内在する技術的課題は、PrPScの存在に関わる疾患を治療
するために使用することができる化合物を提供することである。
前記技術的課題の解決は、特許請求の範囲で特徴づけられた具体例を提供する
ことによって達成される。
ラミニン受容体前駆体(LRP)が特異的にPrPc及びPrPScと相互作用することが、
意外にも予期せず見出された。
PrPcの通常の生物的機能を説明し、プリオン複製に含まれる新たな細胞因子を
調べるために、イースト菌二ハイブリッドスクリーンを開始し、PrPcの特異的イ
ンタラクターとしてHsp60族の分子シャペロンを同定することができた(Edenhofe
r等、1996)。このスクリーンのさらに詳細なインタラクター分析において、GST
に融合したPrPc(PrP23-231)又はPrPScのインタラクターとして６７Kdaラミニン
受容体前駆体(LRP)を同定した。LRP/PrP相互作用部位をマップ化した。この相互
作用の特異性は、プリオンタンパク質(PrP)の１つとラミニン受容体前駆体(LRP)
とを同時に発現させるものであり、この特異性は、それぞれ組み換えバキュロウ
イルスで同時感染させた昆虫及び哺乳類の動物あるいはプラスミドを同時に取り
込ませた昆虫及び哺乳類の細胞において確かめられた。
LRP/PrP相互作用は、PrPScの増殖の際に含まれている可能性があり、それゆえ、
この相互作用を阻止することによって、PrPScの存在に関わる疾患を治療するこ
とができる。
本発明のおいて、プリオンタンパク質PrPcと67kDaラミニン受容体前駆体(LRP)
との特異的な相互作用が最初の時期に報告された。この受容体は、バイトタンパ
ク質としてLexA-GST::PrPc融合体を使用する、イースト菌二複合体系において同
定された。それぞれアミノ末端で43、45、46、89、130及び156アミノ酸を欠く67
kDaのラミニン受容体前駆体（LRP、寄託No.IO-2029）(23個のアミノ酸を含む後
者のものは、ラミニン受容体前駆体と相同性はなかった。)をコ
ード化する、６つの異なるcDNAを分離した。この相互作用の特異性は、LexA-GST
::PrPc、LexA-GST、LexA、LexA-CTF2及びLexA-バイコイド(Gyuris等、1993)をコ
ード化するバイトプラスミド(Wendler等、1994)を使用して、再形質転換試験に
より確かめた。LexA-GST::PrPcだけがLRPと結合する一方、どの擬似餌も受容体
と相互作用しなかった。LexA-GST::PrPcバイトの発現をPrP特異的抗体を用いて
確認した。LexA-GST::PrPcを用いたレプレッサー測定は、PrPcはLexA結合領域の
結合特性を変えないことを証明した。
PrPに対するLRP結合部位をマップ化するために、ラミニン受容体前駆体のアミ
ノ末端で43アミノ酸から179アミノ酸までを欠くプレイプラスミドをLexA-GST::P
rPcで再形質転換した。餌LRP△157はPrPと相互作用する一方、LRP△180はプリオ
ンタンパク質に結合しなかったことは、ラミニン結合領域(アミノ酸161〜アミノ
酸180；Castronovo等、1991)及びPrP結合領域は同一であることを証明した。
別の真核生物細胞系においてPrP/LRP相互作用を確認するために、LRP(アミノ
酸44からアミノ酸295)を、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞においてGSTと
の融合体として発現させた。gp67のシグナル配列がＮ末端に存在したが、おそら
くLRPのアミノ酸86とアミノ酸101との間に算定される短い膜移行領域が存在する
ために、GST::LPRは培地に分泌せず、細胞に連結した形で合成された。LRP特異
的に抗体によって特異的に認識されるGST::LRPは、分子量が67kDaであると判明
した。GST::LRPに対するポリクローナル抗体は組み換えLRPを認識したが、GSTに
対して多少の背景反応性を示した。融合タンパク質のトロンビン切断後、SDSゲ
ル分析によっては、受容体は37kDaの分子量及びGSTは27kDaの分子量であること
を確認した。67kDaラミニン受容体前駆体の遺伝子を同定することを試み、ラミ
ニン受容体前駆体をコード化するcDNAを最初に分離した(Yow等、1988)。しかし
ながら、cDNAを37kDaのタンパク質に対してコード化する一方、受容体を、固体
腫瘍から67kDaのタンパク質として分離した(Malinoff and Wicha、1993；Lesot
等、1983；Rao等、1983)。パルス−チェイス実験は37kDaの受容体が67kDaの受容
体の前駆体である可能性を示唆した(Castronovo等、1991b)。ホモダイマー化(La
ndowski等、1995)及び既
知の因子の存在(Castronovo等、1991b)によって、ラミニン受容体前駆体の37/67
kDaの多形性を説明することができる。
ラミニン結合タンパク質のいくつかのクラスは、インテグリン(Albelda and Buc
k、1990)及びガラクトシド結合ラクチンを含め、記載されている。非インテグリ
ン結合67kDaの高親和性ラミニン受容体前駆体(LRP)は、ラミニン(Mecham等、198
9)のみならずまたエラスチン(Hinek等、1988)の近傍にも結合する。GSTに融合し
た組み換えLRPのラミニン結合能を証明するために、ラミニンの存在下で結合性
の評価を行なった。ラミニンは、細胞吸着、分化、運動及び成長(Hunter等1989)
を仲介する細胞外液マトリックス(ECM)の糖蛋白質を表す。ラミニンをネズミEng
elbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘍及びParietal york sac(PYS)悪性腫瘍細胞から分
離した。(Mecham、1991参照)。結合性評価のために、典型的なクロス構造をなす
ジスルフィド結合で連結されたＡ即ちα(440kDa)、B1即ちβ、及びB2即ちγ(各2
20kDa)の３つのポリペプチド鎖からなるEHSラミニンを使用した(Beck等1990；Bu
rgeson等、1994)。受容体に結合する特異的なEHS-ラミニンをGST::LRPの存在下
で証明する一方、GSTとの結合は生じなかった。ラミニン/LRP相互作用は、FLAG:
:rPrP27-30と競合し(データを示さない)、ラミニン及びPrPとがLRP上の同じ結合
部位を分け合うというマッピング結果をＳ．セレビッシア(S.cerevisiae)におい
て確認することができる。
GST::LRP及びプリオンタンパク質を含む昆虫細胞での同時感染測定のために、
細胞形態のハムスタープリオンタンパク質PrPc(PrP23-231)を合成し、プロテイ
ナーゼＫ耐性PrP27-30の可溶性型(sPrP27−30)(Caughey等、1991年、Prusiner等
、1981年、1983年、1984年)をFLAGペプチドへ融合した。両方の組み換えタンパ
ク質を培地に分泌させ、抗Flag抗体親和性クロマトグラフィーによって精製し、
PrP特異的抗体によって確認した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)
によって決定した分子量は、それぞれrPrPcとrPrP27-30について27kDaと17kDaで
あったが、これらはGST融合タンパク質からトロンビン切断によって生成したrPr
Pc(Weiss等、1995)及びrPrP27-30(Weiss等、1996)に対応する。Ｓ．セレビッシ
アに観察されたLRP/PrP相互作用を確認するために、Sf9細胞において同時感染を
行なった。昆虫細胞におけるラミニン受容体前駆体とプ
リオンタンパク質PrPとの特異的相互作用とによって、イースト菌で観察されたP
rP/LRP相互作用が確認される。
更に、哺乳類の細胞においてPrP/LRP相互作用を確認するために、FLAG::rPrPc
及び真正LRPをCos-７細胞において一時的に発現させた。LRPは、３７kDaの分子
量と判明し、ポリクローナル抗LRP抗体によって認識した。FLAGに融合したrPrPc
は予想した分子量２７kDaを示し、ポリクローナルPrP特異的な抗体によっても認
識した。両方のタンパク質間の相互作用がCos-７細胞において立証され、イース
ト菌、昆虫、Cos-７細胞を含め一連の異なる真核細胞においてLRPがPrPと相互作
用することが証明された。
ラミニン受容体前駆体ファミリーは、広範囲の真核細胞において高程度保存さ
れており(Wewer等、1986、Keppel等1991、Garcia-Hernandez等1994)、また最近
イースト菌に存在することが報告され(Demianova等、1996)、さらに始生代ゲノ
ムによってコード化することができる。受容体は、CHO又はBHKなどの哺乳類の細
胞のシンドビスウイルスに対する受容体として機能し(Wang等、1992)、かつ蚊細
胞由来のベネズエラ脳炎ウイルスに対する受容体として機能する(Ludwig等1996)
。TSEsの病気又はPrPcの生物学的機能においてPrPc/LRP相互作用が機能的に関連
しているので、ラミニン受容体前駆体がヒト脳に存在すると予想するであろう。
それゆえ、多数のヒト組織においてLRP特異的mRNAが存在するかどうか試験した
。この分析によって、LRP-mRNAが心臓及び脳を含むいくつかの組織に偏在して分
布することが示された。およそ1.4kbのラミニン受容体前駆体mRNAの大きさは、
ヒト、ラット及びマウスの細胞に見出されるものと一致する(Rao等1989)。加え
て、67kDaLRPがニューロン細胞に存在することが証明された(Kleinmann等1988；
Douville等1988)。さらに、ラミニンそれ自体ニューロン細胞の成長に強烈な影
響を与える。LRPは、哺乳類の細胞の表面上でシンドビルウイルス及びVEEウイル
スに対する受容体として機能する。細胞のプリオンタンパク質PrPcもグリコシル
フォスフアチジリノシトールアンカーによって固定されたニューロン細胞の表面
上に位置する(GPI;Stahi等、1987)。それゆえ、PrPcとLRPとの直接相互作用は、
脳のニューロン細胞の表面上であると考えられる。ラミニン受容体前駆体が、ス
クラピー感染N2a細胞(Sc
N2a)において過剰に発現されるかどうかを更に証明するために、N2a及びScN2a細
胞のLRP特異的抗体との粗溶解物を分析した。LRPはN2a細胞の粗溶解物中に存在
したが、ScN2a細胞の粗溶解物中におけるLRPのレベルはN2aと比較して２倍高く
、LRP発現がスクラピー感染後、N2a細胞上に調整されることを示している。最近
、PrP27-30の可溶性型をヒト血小板中で同定したことが報告された(Perini等、1
996)。sPrP27-30は、スクラピー感染プリオンの調整における主要な生産物であ
るプロテインキナーゼＫ耐性PrP27-30の前駆体として機能する(Prusiner等、198
1、1983、1984)。血小板中でもで考えられるPrP/LRP相互作用を作るラミニン受
容体前駆体もヒト血小板において同定された(Tandon等、1991)。
上の結果から、LRPはPrPScの増殖に必要とされると結論付けることができる。
LRPの機能のモデルを以下のセクションで議論する。
PrPcは、rERで合成され、ER、ゴルジ体、分泌孔を経由して原形質膜を通過し
細胞表面へ分泌される。PrPcは、グリコシル−フォスファチジル−イノシトール
(GPI)アンカーによって固定されたニューロン及び他の細胞の表面に位置する(St
ahI等、1987)。細胞をフォスフォリパーゼC(PIPLC)で処理することによって、ア
ンカーのジアシルグリセロール部分を除去し、PrPcを細胞表面から放出する(Leh
mann及びHarris、1996)。しかしながら、PrPcの突然変異体は、PIPLC処理後、膜
に結合したままであり、PrPcは、別の未知のファクターと相互作用できることを
示唆した(Lehmann and Harris、1996)。PrPcは、細胞表面からクラスリン被膜ピ
ット(shyng等、1994，1995)、キャベオラエ又はエンドサイトーシス(Taraboulos
等、1995及びVey等,1996)を経由して吸収されるようになる。
しかしながら、PrPcのPrPscへの変換の起こる位置(分泌経路/細胞表面/エンド
サイトシス経路)は、不明確のままである。PrPscは、神経細胞又は血液脳遮断壁
を経由してTSEが感染した個体の脳に到達する。PrPscは、周囲細胞から神経細胞
へ、骨髄を含め脾臓、末梢神経系(PNS)及び中枢神経系(CNS)を含むリンパ系(プ
リオン増殖に対して必須であると証明されたＢリンパ球等(Klein等、1997))の細
胞によって移送されることができる。これらの細胞は、PrPscとLRPを介して結合
可能である。PrPscは、ラミニン受容体前駆体等のHarrisによって示唆された
ような未知の受容体の存在下又は不存在下において細胞表面でPrPcと結合するこ
とができる。PrPc/PrPScの結合はラミニン受容体前駆体が存在するかどうかに依
存することができる。PrPc及びPrPScの膜の通過は、別々に又は複合態様でラミ
ニン受容体前駆体によって仲介されることもできる。両方のPrP分子は、複合又
は別々の態様でクラトリン被膜ピット(Shyng等1994、1995)、エンドサイトーシ
ス又はカベオラエ(Taraboulos等、1995;Vey等、1996)によって取り込まれ得る。
ヘテロダイマー複合体は、初期のエンドソーム、輸送媒体、エンドリソソームに
おいて形成される。リソソーム(Caughey等、1992;Taraboulos等、1992)は、大部
分はPrPScを含むと考えられている(Caughey等、1991)。PrPcは、エンドソーム、
エンドリソソーム、リソソームにおいてなおGPIアンカーされていると考えられ
ている。
突然変異体PrPsからPrPScが生成されるいくつかの初期の工程が、ER又はゴル
ジ体で生じる可能性があるという証拠がある(Lehmann及びHarris、1996)。突然
変異体PrPは、GPIアンカーに加えて膜通過領域又は付加した受容体を経由して細
胞膜に付着することができるであろう(Lehmann and Harris、1996)。LRPがBHK細
胞等の哺乳類の細胞でシンドウイルスに対する受容体として機能することが証明
されたので(Wang等、1992)、LRPは、細胞表面上に位置すると思われる。最近、
ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)も蚊細胞の表面上のLRPを使用することが示さ
れた。それゆえ、LRP及びPrPcは、細胞表面との同じ位置に共に分け合うことが
できる。
加えて、本発明においては、LRPがスクレピーに感染した神経芽細胞において
過剰に発現することが観察された。PrPScがLRPへ結合することによって、第２メ
ッセンジャー(おそらくCAMP結合)又は別の機構を経由してLRP発現の誘導するこ
とができるのであろう。あるいは、PrPScは、LRPが分解するのを防止すると考え
られる。高濃度のLRPは、おそらくLRPがPrPSc又はPrPc又は両方と相互作用する
ことによって、PrP増殖に関与すると思われる(図７)。それゆえ、可溶性LRPを使
用して前記相互作用を阻害することか、PrPScを捕捉することによって、PrPScの
存在に関わる疾患を治療することができる。
したがって、本発明は、PrPSc、PrPcあるいはそれらの断片に結合可能な可溶
性LRP、ムテイン、融合タンパク質、塩類、官能性誘導体、又はその断片を含む
薬剤組成物に関する。前記組成物は、PrPScの存在に関係する疾患の治療に有益
であるということができる。
LRPの可溶性部分は、Yow等、1988(図３及び４、6396頁及び6397頁参照)に開示
されたアミノ酸配列のアミノ酸No.101からNo.295の領域からなるLRPの細胞外領
域に相当する。しかしながら、上記薬剤組成物を調整するためにYow等に開示さ
れたアミノ酸配列を有するLRPの可溶性部分だけでなく、加えて、まだPrPSc、Pr
Pcに結合可能な前記可溶性LRPのムテイン、その融合タンパク質、塩類、官能性
誘導体又は断片も使用することができることは当業者にとって明白である。
ここで使用するように、「ムテイン」の語は、可溶性LRPの類似体であって、Y
ow等、1988に開示された可溶性LRPの１以上のアミノ酸残基を、結果物の活性を
大幅に変化することなく、異なるアミノ酸残基によって置換するか、削除するか
、又は一以上のアミノ酸残基を加えたものである。これらムテインは、既知の合
成法及び/又は特定部位の突然変異誘発技術又はそのために適当な他の既知の技
術によって、調製することができる。
「融合タンパク質」の語は、本発明によれば可溶性LRPを含むポリペプチドを
いうか、体液に長い滞留時間を有する別のタンパク質と融合した可溶性LPRのム
テインをいう。それゆえ、可溶性LRPは免疫グロブリン等の別のタンパク質、ポ
リペプチド又はその断片に融合することが可能である。
ここで「塩類」の語は、可溶性LRP、そのムテイン及びその融合タンパク質の
カルボキシル基の塩及びアミノ基の酸に付加した塩の両方をいう。カルボキシル
基の塩は、当該技術で既知の手段によって形成可能であり、例えば、ナトリウム
、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛などの無機塩、例えば、チエタノール
アミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイン等のアミンで形成され
た塩などの有機塩基の塩を含む。酸付加塩は、例えば、塩酸又は硫酸などの無機
酸の塩、例えば、酢酸又はシュウ酸などの有機酸の塩、を含む。
ここで使用する「官能性誘導体」は、可溶性LRP及びその融合タンパク質及び
ムテインの誘導体をいい、これらの誘導体は、当該技術で既知の手段によって、
残基の側鎖又はＮ若しくはC-末端基として生ずる官能基から調製することができ
、それらが薬学的に許容である限り、即ち、タンパク質の活性が壊されず、誘導
体を含む組成物に毒性を与えない限り本発明に含まれる。これら誘導体は、例え
ば、抗原性部位をマスクし、かつ体液中の可溶性LRPの滞留時間を延長すること
が可能なポリエチレングリコール側鎖を含んでもよい。他の誘導体としては、カ
ルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第１級若しくは第２級アミンと
の反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分で形成されるアミノ酸残基の
遊離アミノ基のN-アシル誘導体(例えば、アルカノイル又はカルボサイクリック
アロイル基等)又はアシル部分で形成される遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導
体(例えば、セリル又はチロニル残基のもの)を含む。
「可溶性LRPの断片」、その融合タンパク質及びそのムテインとして、もし、分
画が同じ生物学的活性及び/又は薬学的な活性を有するなら、タンパク質分子単
独か結合分子を有するタンパク質のポリペプチド鎖又はそれに結合した残基、例
えば、糖又はリン酸残基、それら自身によるタンパク質分子又は糖残基の凝集体
等のポリペプチド鎖の断片であれば含まれる。
文献に記載されている標準的な検査法を使用することによって、当業者は上記
化合物がPrPsc、PrPc又はそれらの断片に結合できるかどうか容易に判断するこ
とができる。
ここで「PrPsc又はPrPcの断片」の語は、LRPに結合することができるタンパク
質のいずれかのポリペプチド鎖の断片を意味する。
上記薬剤組成物は、活性成分の可溶性LRPが薬学的に認容できる希釈剤、キャ
リア又は賦形剤と混合する周知の手順のいずれかによって得ることができる。こ
のような薬剤組成物の実際の投薬量と投与方法は、専門医によって決定されるで
あろう。
加えて、本発明は、LRPとPrPsc、PrPc又はそれらの断片との相互作用を阻止す
る化合物と、選択的に適当な希釈剤、キャリア及び/又は賦形剤を含む薬剤組成
物に関する。このような化合物は、例えば、以下に述べるスクリーニング法によ
って同定することができる。
好ましい実施態様において、前記化合物は、抗体、好ましくはモノクローナル
抗体又はそれらの断片であって、PrPsc、PrPc又はそれらの断片がもはや結合不
可能な態様でLRPの表面のエピトープに結合する抗体等である。あるいは、抗体
は、PrPsc、PrPc又はそれらの断片に結合し、それゆえ、LRP/PrP相互作用を阻止
する。
該抗体又はそれらの断片は、標準的な手順にしたがって調製することができる
。例えば、LRPの可溶性部分に対する抗体は、血清由来(ポリクローナル)又はモ
ノクローナルとすることができる。例えば、モノクローナル抗体は、免疫した動
物由来の抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合し、所望の抗体を生産する生成した
ハイブリドーマ細胞系を選択するハイブリドーマ法を使用して得られる。あるい
は、合成ペプチドは、Yow等1988に記載したアミノ酸配列を使用して得ることが
できる。更に別の方法として、例えばcDNA又はその断片等のDNAをクローン化し
て、発現させ、生じたポリペプチドを回収して、免疫源として使用することがで
きる。これらの抗体は、LRPの機能を阻害するのに役立つ。特に有益なのは、LRP
のPrP結合領域(アミノ酸161〜180)へ結合する抗体である。
更に好ましい実施態様において、LRPとPrPsc又はPrPcとの相互作用を阻止する
前記化合物は、以下のものを含む。
(１)ペプチドライブラリーによってコード化したペプチド、
(２)cDNAライブラリーによってコード化したタンパク質、例えば、脳組織又は他
の適当な器官由来のもの
(３)有機又は無機の化学的合成成分で核酸を含む。
上記化合物の中でLRPとPrPsc又はPrPcとの間の相互作用を阻害するものは、例
えば、逆二複合体系によって同定することができる。LeannaとHannink、1996を
変更したこの逆二複合体系(図８)は、LRP/PrP相互作用を阻止する化合物を同定
するための直接的な方法を示す。逆Gal4/LexA二複合体系は、DNA結合領域Gal4/L
exAに融合するPrP及びGal4活性領域又はB42の酸性活性領域と融合するLRPとの結
合に対して選択する遺伝的な選択スキームである。Gal4/LexA/PrP及びGal4D:LRP
/B42：LRPが結合することによって、Gal１/LexAプロモーター領域へGal4/B42領
域を局在化し、CYH2を発現させる。CHX含有プレートで生育したCHX耐性cyh２イ
ースト菌株の生存率は、「バイト
(bait)」及び「プレイ(prey)」位置においてPrPc及びLRP融合タンパク質が結合し
ていないかどうかに依存する。阻害剤は、培地に加えた化合物又はイースト菌株
にさらに形質転換したペプチドcDNAライブラリーから発現したペプチドを意味す
ることができる。追加の選択マーカー(例えば、His)は、cDNAライブラリーの存
在下に選択することが必要である。このシステムは、以下の実施例１により詳細
に説明する。
別の方法は、哺乳類の二複合体系(CLONETECH Laboratories Inc.、USAより入
手)を、LRP/PrP相互作用を妨害する治療のためのスクリーンに使用することがで
きる(図9)。PrPは、Gal4(バイトプラスミド)のDNA結合領域に融合することがで
きる。LRPは、プレイ位置(プレイプラスミド)のヘルペスウイルストランスアク
チベータであるVP16に融合することができる。バイトとプレイが相互作用すると
、アデノウイルスE1b遺伝子の最小プロモーター由来のRNAポリメラーゼによって
CATレポータ遺伝子(レポータプラスミドにより供給)の転写を活性化するであろ
う。あるいは、ルシフェラーゼをレポータ遺伝子として使用して検定の感度を挙
げることができる。
例えば、ネオマイシン(G418の存在下で生育細胞となる)などの選択マーカーを
使用して哺乳類の細胞に共に導入することが可能な化合物を、ペプチドライブラ
リーを使用して選別することができる。化合物は、容易に培地に加えることがで
きる。イースト菌系と対照的に、哺乳類の細胞は、細胞壁を欠くので、化合物の
摂取/取入れは、イースト菌に比較して非常により効率的である。加えて、哺乳
類の細胞は、高度のグリコシル化、リン酸化反応及び他の翻訳前修飾を有する最
も高い系統発生系を表す。化合物の毒性を、哺乳類の系において同時に検定する
一方、イースト菌二複合体系におけるLRP/PrP相互作用に対してなされて成分の
毒性は、哺乳類系で再検定しなければならない。
加えて、スクリーニング検定を簡素化することに関して、イースト菌系及び哺
乳類系を変更することができる。LRP及びPrPcをコード化するcDNAを導く共通の
方向又は逆の方向のいずれかの方向のバイト位置にクローン化して単一プラスミ
ド由来の両方のタンパク質を発現させることができる。ペプチド又は他の推定可
能なPrP/LRP妨害成分をコード化するcDNAライブラリーをプレイ位置に
クローン化することができるので、追加のプラスミドを、それぞれイースト菌又
は哺乳類の細胞に形質転換又は導入する必要がない。
したがって、本発明はまた、上述した方法によって同定した化合物を含む薬剤
組成物に関する。
上記薬剤組成物は、PrPScの存在に関連する疾患の治療のために役立てること
ができる。そのような疾患の例は、スクレピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェ
ルト・ヤコブ症候群、致命的な遺伝性不眠症、慢性消耗性疾患、フィーライン海
綿状脳症(FSE)などの感染性海綿状脳症である。
さらに、PrPScの存在に関連する疾患は、LRPの合成を阻止すること、例えば、
LRPをコード化し、mRNAと結合/mRNAを切断することができるアンチセンスRNA又
はリボザイムを適用し、それによって、LRPの翻訳と発現を阻害することによっ
て治療することができる。
当業者に周知の方法、例えば、以下の実施例９に記載する技術によって、細胞
の形質転換及び発現ベクターの構築を含め適当なアンチセンスRNA又はリボザイ
ムを適用することができる。
それゆえ、本発明はまた、LRPの発現を阻止するアンチセンスRNA又はリボザイ
ムからなる薬剤組成物に関する。
加えて、本発明は、バキュロウイルス系pFLAG::BACにおいてLRP又は他の種類
のタンパク質を組み換え生産するための発現ベクターを提供する。タンパク質は
、タンパク質のアミノ末端でFLAGタグを用いて融合する際に合成されるであろう
。FLAGタグは、特異的プロテアーゼエンテロキナーゼを使用して切断することが
できる。組み換えタンパク質は、単一配列gp67が存在することにより培地に分泌
されるであろう。バキュロウイルス系は、枝別れの多い糖鎖を形成することがで
きないことが知られているが、バキュロウイルス系におけるFLAGによる融合の際
発現されたいずれかの種のタンパク質も、リン酸化、グリコシル化することがで
きる。FLAGは、融合タンパク質の溶解度及び安定性を高めるであろう。このベク
ターは、図13に示す構造及び図14に示す核酸配列又は実質的にこの配列を有する
。
ここで使用する「実質的に」の語は、(i)バキュロウイルス系における複製能
力、
(ii)異質タンパク質の発現能力、(iii)培地におけるタンパク質の分泌を可能と
する能力及び/又は(iv)可溶性及び安定性状態で異質タンパク質の提供する能力
に関してベクターの生物学的性質を大幅に変更することなく、図14に示す核酸配
列の１以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換するか、又は削除するか
、又は一以上のヌクレオチドを付加した核酸配列を意味する。図14に示す配列を
実質的に有する核酸配列は、前記配列に対して、少なくとも90％、好ましくは少
なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも98％もっとも好ましくは少なくとも
99％の相同性を有する。このような配列は、既知の合成法及び/又は部位特異的
突然変異誘発法又はそのために適当な他の既知の技術によって調整することがで
きる。このような配列を有するベクターの生物学的性質(i)及び(iv)は通常の方
法を使用して当業者によって検定することができる。
図の説明図１：Ｓ．セルビッシア(S．cerevisiae)でのイースト菌二複合体系におけるPrP c67kDaLRP相互作用の同定
レポータープラスミドpSH18-34を含むイースト菌細胞を、LRP(アミノ酸44-295
)コード化cDNAをコード化するプレイプラスミドpJG4-5Δ43及びバイトプラスミ
ドpSH2-1-GST::rPrPc(列１)、pSH2-1-GST(列２)、pSH2-1(列３)、pSH2-1-CTF-2(
列４;Wendler等、1994)、及びpEG202-bicoid(列５;Gyuris等、1993)で共に形質
転換した。５つの各形質転換体をTEに再懸濁させ、Ｘゲルを捕足するか(a)ロイ
シンも不足させた(b)のガラクトースプレートに点在させた。プレートを３日間3
0℃でインキュベーションした。
図２：イースト菌二複合体系におけるPrP/LRP相互作用部位のマップ化
レポータープラスミドpSH18-34を含むイースト菌細胞を、バイトプラスミドpS
H2-1-GST-PrPcアミノ末端で、45，45、46、89，130，156アミノ酸(後者は、ラミ
ニン受容体前駆体に相同性のない23アミノ酸を含む)及び179アミノ酸(ラミニン
結合領域を欠く)を欠くアミノ末端切除型ラミニン受容体前駆体をコード化する
プレイプラスミドpJG4-5Δ43(列1)、pJG4-5Δ45(列2)、pJG4-5Δ46(列3)、pJG4
−5Δ89(列4)、pJG4-5Δ130(列5)、pJG4-5Δ156(列6)及びpJG4-5Δ179(列7)によ
って同時形質転換した。５つの各形質転換体をTE中に再懸濁させ、Ｘゲ
ル補充プレートに点在させて30℃で３日間インキュベーションした。
図３：バキュロウイルス感染昆虫細胞(Sf9)におけるGSTに融合した組み換えLR Pの分析
(a)上清からのタンパク質分画(レーン１)及びAcSG2T-LRPで感染した1.5×107S
f9細胞の細胞ペレット(レーン2)をグルタチオンセファロースクロマトグラフィ
ーによって精製して、12.5％SDSゲルで分析した。(b)ポリクローナルLRP特異的
抗体を使用する(a)のウエスタンブロット分析。(c)Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)
ラミニンと組み換えLRPとの相互作用の分析。17.5pMolEHSラミニンと共に、50μ
lの各グルタチオンセファロースビーズ(レーン1)、37pMolGSTと一緒にしたもの(
レーン2)、または37pMolGST::LRP(レーン3)をインキュベーションした。複合体
を12.5％TCM緩衝液で分析し、一晩中4℃で反応させてビーズをその後４回TCMで
洗浄して、AgNO3で染色したSDS-PA-ゲル上で分析した。個々の各マーカータンパ
ク質(レインボーマーカーRPN756;レーンM)を２μgずつとEHS-ラミニン３μg(レ
ーン4)を供給した。
図４：(a)多数のヒト組織のノーザンブロット分析、及び(b)及び(c)N2a/ScN2a 細胞の粗溶解物のウエスタンブロット分析
ヒト心臓(レーン1)、脳(レーン2)、胎盤(レーン3)、肺(レーン4)、肝臓(レー
ン5)、骨格筋(レーン6)、腎臓(レーン7)及び膵臓(レーン8)から分離した全mRNA
をナイロン膜上に固定して、ヒト67kDa高親和性ラミニン受容体前駆体cDNAの550
bpに相当する放射性元素でラベルしたDNA断片で探索した。(底部)上記全mRNAを
放射性元素でラベルしたβアクチンプローブで測定した。
(b)LRP特異的抗体を使用してN2a及びScN2a細胞からの粗溶解物のウエスタンブ
ロット分析(Dr.Starkey、Montana,USA、によって提供された抗LBP(ラミニン−結
合タンパク質)抗体、８．Antibodies以下参照)。N2a及びScN2a細胞からの各粗溶
解物25μl(レーン2、レーン3)及び組み換えGST::LRPの500ngをSDS-PAGEで分析し
、PVDF膜に点在させてLRP特異的抗体によって展開した。
(c)以下に述べるように調製したLRP特異的抗体を使用してN2a及びScN2a細胞か
らの粗溶解物のウエスタンブロット分析(２６頁、８．Antibodies)。N2a及びScN2
a細胞からの各粗溶解物20μl(レーン2、レーン3)を12.5％SDS-PAA
ゲルで分析し、ニトロセルロース膜に点在させて、(a)LRP特異的抗体及び(b)モ
ノクローナル抗βアクチン抗体で展開させた。個々のマーカータンパク質(レイ
ンボーマーカーRPN756、Amersham；レーン1)2μgを供給した。
図５バキュロウイルス感染昆虫細胞(Sf9)において同時感染検定によるPrP/LRP 相互作用の分析
(a)バキュロウィルス感染昆虫細胞からのFLAG::rPrP23-231(rPrPc)及びFLAG::rP
rP90-231の分泌。FLAG-BAG::rPrP23-231及びFLAG-BAG::rPrP90-231(rPrP27-30)
感染昆虫細胞(1.5×１０7)の上清からのタンパク質抽出物を抗FLAG抗体アフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製した。FLAG::rPrP23-231(rPrPc)(レーン
1)及びFLAG::rPrP90-231(rPrP27-30)(レーン2)の各500ngを、ポリクローナル抗P
rP抗体により展開させウエスタンブロットによって分析した。(b)Sf9細胞を、FL
AG-BAC::rPrP23-231及びAcSG2T::LRP(レーン3)、FLAG-BAC::rPrP23-231及びAcSG
2T(レーン1)、FLAG-BAG::rPrP90-231(rPrP27-30)及びAcSG2T(レーン4)及びFLAG-
BAC::rPrP90-231(rPrP27-30)及びAcSG2T(レーン2)で同時に感染させた。それぞ
れFLAG::rPrP23-231及びFLAG::rPrP90-231とに相互に作用するGST及びGST融合タ
ンパク質を分離し、抗FLAG抗体アフィニティクロマトグラフィーによって精製し
、ポリクローナルGST抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。
図６Cos-7細胞における同時感染検定によるPrP/LRP相互作用の分析
(a)Cos-7細胞におけるハムスター由来のFLAG;;rPrP23-231の発現。レーン１:
一時的に感染させたCos-7細胞から精製したFLAG::rPrP23-231の500ngをPrP特異
的抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。(b)同時感染検定。
レーン２:Cos-7細胞をpFLAG-CMV-2::rPrP23-231及びpcDNA3::LRPで同時感染させ
た。Cos-7細胞をpFLAG-CMV-２::rPrP23-231(レーン１)又はpcDNA3::LRP(レーン3
)で感染させた。PcDNA3::LRP感染細胞からの粗溶解物をLRP特異的抗体を用いて
ウエスタンブロットによって分析した。FLAG::rPrP23-231と相互作用するLRPを
、抗FLAG抗体クロマトグラフィーによって分離し精製して、ポリクローナルLRP
抗体を使用してイムノブロット
によって分析した。
図７：プリオンタンパク質PrPc及び/又はPrPScに対する受容体としてのLRPの 機能モデル
ドメイン又はクラトリン被膜ピット等のカベオラエを経由するPrPc及びひいて
はPrPScのエンドサイトーシスは、ラミニン受容体前駆体(LRP)に仲介され得る。
PrPcのPrPScへの変換は、細胞のエンドリソソーム又はリソソームで生じると考
えられる。分子シャペロンがそのプロセスに含まれると考えられる。PrPの複製
は、神経芽腫細胞等の脳細胞においてだけでなく、脾臓及び膵臓細胞などの器官
の他の細胞においても生じる可能性がある。Ｂリンパ球は、PrPScを神経細胞へ
移送するのに重要な役割を演ずると考えられている。
図８：LRP/PrPc相互作用を妨害する成分をスクリーニングするための逆二複合 体系の概略図 図９：LRP/PrPc相互作用を妨害する成分をスクリーニングするための逆二複合 体系の概略図 図１０：原形質膜における６７kDa高親和性ラミニン受容体前駆体の位置決め
受容体のＮ末端は細胞の細胞質に位置していると考えられる(Castronova等、1
991)。LRPのアミノ酸88とアミノ酸101との間に短い膜通過領域も提案されている
(Mohane and Argos、1986)。LRPのカルボキシル末端は、細胞外に位置すると考
えられている。PrP結合領域に対応するLRPのアミノ酸161とアミノ酸180との間に
短いラミニン結合領域が同定されている(Rieger等、1997及びCastronovo等、199
1)。
図１１：相同性組み換えによるLRP遺伝子座の所期破壊及びアンチセンスRNA産 出のための抗ＬＲＰ遺伝子導入
置換ベクターの構造(A)、１つのLRP遺伝子座の仮説上の遺伝子構造(B)、挿入
したアンチセンスLRPカセットを有する突然変異座(C)。置換ベクターにおいて、
エクソンの部分は、ネオマイシン耐性カセット(NEO)に隣接する誘導プロモータ
ー(金属結合性タンパク質プロモーター、テトラサイクリン感受性プロモーター)
の制御下でアンチセンスLRPカセットによって置き換えられるであろう。負の選
択マーカーチミジンキナーゼ(TK)は相同性領域の１つの部位に付加される
であろう。スプリンカーを線形ベクターにくくり、エンドヌクレアーゼによるベ
クターの分解を防止すべきである。サザンブロット分析のためのプローブが示さ
れている(プローブＡ、アンチLRPプローブ、ネオプローブ)。制限酵素(RE B、RE
C、RE D)分析後に、組み換えES細胞クローンと予想される断片の相同性を同定
するためのPCRプライマーを示してある。Pind＝誘導プロモーター。
図１２：LRPノックアウトマウスの発生
(A)初期未分化胚芽細胞の内部細胞集団から分離したES細胞を置換ベクターに
取り込んで、LRP遺伝子のある対立遺伝子上に突然変異させたES細胞クローンを
生産した。
(B)相同組み換えES細胞クローンを桑実胚凝集又は胚盤胞注入によってマウス胚
へ移送した。分裂したLRP遺伝子の細菌系に組み込まれたかについて被膜着色及
びノーザンブロット分析によって、キメラを検定した。同型接合体マウスを異型
接合体のマウスと同系交配することにより得た。省略形ICMは内部細胞集団、ES
は胚幹、LIFは白血病阻害因子である。
図１３：ベクターpFLAG：BACの構造
地図は、ポリヘドリンプロモーター、gp67のシグナル配列、ポリリンカー、複
製起点、及びアンピシリン耐性を与える遺伝子の位置を示す。
図１４：制限部位を有するpFLAG:BACの核酸配列 図１５：バキュロウイルス系におけるシリアンゴールデンハムスター由来のFL AGタッグしたHsp60及びGSTタッグしたプリオンタンパク質の同時発現
細胞溶解物を12.5％SDSゲルで分析した。FLAG::Hsp60発現の場合(レーン1)及
びGSTコントロールの同時発現の場合(レーン2)と比較したとき、GST::haPrPc23-
231(レーン3)及びGST::haPrP90-231(レーン4)を用いた同時発現した場合をモノ
クローナル抗FLAGM2抗体を使用したウエスタンブロットにより、FLAG::Hsp60の
レベルが減少したことを示す。
図１６：スクラピー(C506M3株)感染マウス、BSE(4PB1株)感染マウス及び非感 染マウスからの脳及び脾臓ホモジネートのウエスタンブロット分析
スクラピー感染マウス(レーン2)、BSE感染マウス(レーン6)及び非感染マウス(
それぞれレーン3及び7)の脳からのホモジネートを各20μl、スクラピー感染マ
ウス(レーン4)、BSE感染マウス(レーン8)及び非感染マウス(それぞれ、レーン5
及び9)の脾臓から粗溶解物各20μlを12.5％PAAゲルで分析して、(a)LRP特異的抗
体及び(b)モノクローナル抗βアクチン抗体で展開させた。個々のマーカータン
パク質(レインボーマーカーRPN756、Amersham；(a、b)レーン1)2μgを供給した
。Sc、BSE及びＮは、それぞれスクラピー、BSE及び非感染を示す。
図１７：スクレピー(263K株)感染ハムスター及び非感染ハムスター由来の脳、 脾臓、膵臓、肝臓及び骨格筋のホモジネートのウエスタンブロット分析
スクレピー感染ハムスター由来の脳(レーン2)、脾臓(レーン4)、膵臓(レーン6)
、肝臓(レーン8)及び骨格筋(レーン10)のホモジネートを各20μl(0.5mgの組織に
相当)、非感染ハムスター由来の脳(レーン3)、脾臓(レーン5)、膵臓(レーン7)、
肝臓(レーン9)及び骨格筋(レーン11)のホモジネートの各20μlを、12．5％SDSPA
Aゲルで分析して、LRP特異的抗体(a)、モノクローナル抗Ｂアクチン抗体(b、左
パネル)及びモノクローナル抗アクチン抗体(b、右パネル)で展開した。個々のマ
ーカータンパク質(レインボーマーカーRPN756、Amersham；(a、bレーン1))2μg
を供給した。Sc及びＮは、それぞれ、スクラピー及び非感染物を示す。
図１６及び１７に示す結果を、以下の表１に要約した。
図１８：神経芽腫細胞の表面上でのLRPの位置決定
（詳細は実施例１０参照）
図１９：ネズミ神経芽腫細胞(N2a)によるウシ由来の組み換えプリオンタンパ ク質の摂取
N2a細胞を、バキュロウイルス系で発現したGSTに融合したウシPrPと共にイン
キュベーションした。細胞を、PrP特異的抗体(3B5)と共にインキュベーションし
た(A)。倍率400倍。LRP特異的抗体(Rieger等、1997)を予備インキュベーション
した後、組み換えウシPrPを細胞へ加え、その後PrP特異的抗体(3B5)を加えた(B)
。倍率630倍。
本発明を以下の実施例によって説明する。別に指摘する場合を除き、実施例で
述べた方法は、分子生物学において広く用いられている標準的で、十分確立され
た方法であることに注目すべきである。したがって、これらの方法が十分に説明
されている様々な刊行物を参照する。さらに、製造者について詳細事項が与えら
れている場合、関連する方法は、製造者のプロトコールに従うと理解されるべき
である。
以下に記載する実施例で使用する一般的な方法。
１．リプレッション検定
バイトプラスミドpSH-GST-PrPc、pSH-2-1-CTF-2及びpEG202バイコイドを、LacZ
レポーター遺伝子のオペレータ領域にLexA結合部位を固定するレポータープラス
ミドpJK101(Gyuris等、1993)を用いて個々に同時形質転換した。核において正確
に折り畳みかつ輸送する場合、LexA融合タンパク質は、レポータ遺伝子を切り離
し、その結果、コロニーの白色を生じる。バイトタンパク質の発現の制御。pSH-
GST-PrPc又はpSH-GSTで形質転換したイースト菌培養を２日間、３０℃でインキ
ュベーションした。細胞を、サンプル緩衝液で溶解し、ハムスターPrP特異的抗
体を使用してSDS-PAGE及び免疫ブロットによって分析した。
２．プラスミド構築物
別に述べた場合を除き、前述したようにクローニング手順を行なった(Sambrook
等1989)。
(i)pAcSG2T::LRPの構築。cDNAをコード化するLRP(ヒト67kDa高親和性ラミニン受
容体前駆体のアミノ酸44〜アミノ酸295、寄託no.IO2029)をプレイプラスミドpJG
4-5111.93からPCRによって増幅し、それぞれ5'及び3'末端にBamHI及び3'EcoRI制
限部位を導入した。768bP断片を、これら２つの制限部位によってバキュロウイ
ルス取込みベクターpAcSG2T（Wang等、1995）にクローン化し、pAcSG2T::LRPを
生じた。これは、ジデオキシ配列法によって確認された。
(ii)pFLAG-BAGの構築。gp67単一配列のカルボキシル末端(Whiteford等、1989)に
続くSpel(5')及びBamHI(3')制限部位に挟まれたFLAGタグ(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-
Asp-Asp-Lys)をコード化するDNA断片を、オリゴデオキシリボヌクレ
を使用してpAcGP67B(Pharmingen)からPCR増幅した。139bpDNA断片を、
pACGP67BへSpeI及びBamHI制限部位を介しサブクローン化し、バキュロウイルス
転移ベクターpFLAG::BAC(9780bp)を生じた。これは、ジデオキシ配列法によって
証明した。
(iii)pFLAG-BAC::rPrP23-231(rPrPc)の構築。rPrP23-231(rPrPc)カセット(648bp
)を、それぞれ5'及び3'末端でBamHI及びEcoRIによってpAcSG2T::PrPc23-231(Wei
ss等、1995)から切り出し、pFLAG-BACにサブクローン化して、pFLAG-BAC::rPrP2
3-231(rPrPc)(10406bp)を生じた。これは、ジデオキシ配列法によって確認した
。
(iv)pFLAG-BAC::rPrP90-231(rPrP27-30)の構築。rPrP90-231(rPrP27-30)(447bp)
をコード化するcDNAをpAcSG2T::rPrP27-30（Weiss等、1996）からBamHI（5'）及
びEcoRI（3'）を用いて制限し、pFLAG-BACにサブクローン化した。生じた転移ベ
クターPFLAG-BAC::rPrP90-231（rPrP27-30）(10205bp)をジデオキシ配列法によ
って確認した。
(v)pcDNA3::LRPの構築。cDNAをコード化するLRP(ヒト67kDa高親和性ラミニン受
容体前駆体のアミノ酸44〜アミノ酸295、寄託no.IO2029)を発現プラスミドpAcSG
2T::LRPからPCRによって増幅し、5'末端及び3'末端でそれぞれBamHI及びEcoRI制
限部位を導入した。844bp断片を、これら２つの制限部位によって哺乳類発現ベ
クターpcDNA3にクローン化して、pcDNA3::LRPが生じた。これは、ジデオキシ配
列法によって確認された。
(vi)pFLAG-CMV−2：rPrP23−231（rPrPc）の構築。HindIII（5'）及びSaul（3'
）制限部位によって挟まれたhaPrP23-231のＮ末端部分をコード化する97bpDNA断
片を、pAcSG2T::rPrP23-231（Weiss等、1995）からPCR増幅した。haPrP23-231の
カルボキシル末端をコード化する558bpDNA断片をSauI（5'）及びEcoRI（3'）に
よってpAcSG2T::rPrP23.231（Weiss等、1995）から切り出した。両方の断片を、
HindIII及びEcoRIによってpFLAG-CMV-2（Eastman Kodak Co.）にクローン化して
、その結果、哺乳類発現ベクターpHAG-CMV-2::rPrP23-231（5302bp）を生じた。
３．昆虫細胞及びウイルス培養
スポドプテラフルジペーダ(spodopfera freugiperda)(Sf9細胞)の培養及び組み
換えバキュロウイルスによる感染を前述したように行なった(King and Possee,1
992；O'Reilly等、1992)。pAcSG2T-LRP、pFLAG-BAC::rPrP23-231(rPrPc)及びpFL
AG-BAC::rPrP90-231(rPrP27-30)をそれぞれ2μgと、線状のバキュロウイルスDNA
を5μgとを使用して、最近GST::PrPc及びGST::rPrP27-30に対して報告されたよ
うに(Weiss等、1995,1996)、同時感染を行なった。精製したプラークを使用して
、SDS-PAGE及びウエスタンブロットによってGST::LRP、FLAG::rPrP23-231(FLAG:
:rPrPc)及びFLAG::rPrP90-231(FLAG::rPrP27-30)を発現させるためにスクリーニ
ングした。組み換えウイルス株をプラークを取り出し、次いでFCSの不存在下でS
F900IIにおいて付着Sf9培地を再感染することによって増幅した。幾分経過後、
組み換えウイルス株は、107〜108PFU/mlに達した。組み換えタンパク質の合成の
ための感染を前述したように行なった(Weiss等、1995、1996)。タンパク質合成
及びウイルス株増幅を行なうためにについても１の多数感染法(MOI)を使用した
。タンパク質合成をするために、FLAG::rPrPを含む培地又はGST::LRPを含む細胞
を72h p.iで収集した。ウイルス株を調製するために、上清を４から７日p.iで採
取した。
４．Sf9細胞の同時感染試験
バキュロウイルス感染細胞から分泌したFLAGタグしたrPrP23-231(rPrPc)(図5a、
レーン1)及びFLAG::rPrP90-231(rPrP27-30)(図3a、レーン2)は、それぞれ分子量
27kDa及び17kDaを示す。GST::LRPは、FLAGタグしたrPrPc(図5b、レーン1)及びFL
AG::rPrP27-30(図3b、レーン3)とで同時感染させGST特異的抗体を用いた場合の
み検出することができる。しかしながら、GST単一では、FLAGタグしたrPrPc(図3
b、レーン2)及びFLAG::rPrP27-30(図3b、レーン4)又はFLAGタブしたコントロー
ル、即ち、Srcキナーゼp59hck(データーに示さず)を用いて同時感染した場合に
は検出できない。
５．哺乳類の細胞培養、感染及び同時感染の試験
Cos-7細胞(ATCC♯CRL16512)をD10培地(製造者、Seromedに推奨されるよう
に１０％の子ウシ胎児血清、１％のグルタミン、100μg/mlのペニシリン、100μ
g/mlのストレプトマイシンを含むDulbecco−Modified Eagle培地)中に単層培培
地として維持した。１×107個の単層細胞を、提供者のプロトコール(Gibco BRL)
にしたがってリポフェクタミン感染法を使用して、それぞれ各８μgのpcDNA3:;L
RP及びpFLAG-CMV-2::rPrP23-231によって、別々に又は同時に短期間で感染させ
た。感染コントロールとして、単層培地中の１×107個のCos-7細胞を、ロース肉
腫レトロウイルス(RSV LTR)によって促進しAAV ITR配列近傍の核局在LacZを含む
pAAVRnlacZ(chiorini等、1995)によって短期間で感染させた。LRP及び/又はFlAG
::rPrPcを発現する細胞を、0.1％トリトンX-100を含む300μlのPBSに感染後48時
間溶解した。溶解物を、SDS-PAGE及びウエスタンブロットによって直接分析する
か、pFLAG-CMV-2::rPrP23-231による感染検定又は同時感染検定の場合には、0.1
％トリトンX-100を含むPBSで予め平衡化した抗FLAG抗体結合アガロース(Estman
Kodak)の1:1スラリー100μgで4℃で一晩中インキュベーションした。次いで、ビ
ーズをPBSで洗浄し、抗LRP抗体を用いてSDS-PAGE及び免疫ブロットによって分析
した。
６．GST::LRPの精製
AcSG2T::LRP感染Sf9細胞からGST::LRPを精製するために、細胞を、遠心分離(700
×ｇ、4℃で10分間）によって72-h-p.i.採取し、PBSd(Weiss等、1995)で洗浄し
、0.1％トリトン-X-100を加えたPBSdで再懸濁した。細胞を15000×gで10分間4℃
で遠心分離によって溶解して、上清のタンパク質をグルタチオンセファロースビ
ーズ(Pharmaciaによって提供された、PBSdで平衡化したもの)の1:1スラリー500
μl(1.5×107個の細胞当たり)を加えて固定化した。一晩中4℃で攪拌した後、ビ
ーズを10カラム体積のPBSdで４回洗浄し、4℃でPBSd中1:1スラリーとして保存し
た。GST::LRPを18.3mM還元グルタチオンと競合させ一晩中4℃で攪拌することに
よってグルタチオンセファロースビーズから溶出した。可溶性タンパク質を遠心
分離によってビーズから分離し、SDS-PAGE及び免疫ブロットによって分析した。
所望により、グルタチオンを透析によって取り除くことができる。FLAGタッグし
たタンパク質を精製するのに述べたように、培地か
ら組み換えGST::LRPを精製した。
７．昆虫細胞由来のFLAG::rPrP23-231(rPrPc)、FLAG::rPrP90-231(rPrP27-30)及
びFLAG::Hsp60の精製
FLAG-BAC::rPrP23-231又はFLAG-BAC::rPrP90-231のどちらかからFLAG::rPrP23-2
31及びFLAG::rPrP90-231を精製するために感染Sf9細胞を上述したように採取し
溶解した。1.5×107個の細胞の上清からのFLAGタグしたタンパク質を抗FLAGM2親
和性ゲルの1:1スラリー200μgを加えて一晩中4℃で固定化した。ビーズをPBSdで
４回洗浄し、SDS-PAGE及び免疫ブロットによって直接分析した(タンパク質の分
析即ちタンパク質-タンパク質の相互作用を証明するため)。可溶性FLAG::rPrPc
及びFLAG::rPrP27-30を、50nモルFLAGペプチド(Kodak)との競合により抗FLAG親
和性カラムからタンパク質を溶出することによって得た。
同様の方法を使用し、FLAG::Hsp60を得た。図15に示すように(レーン1)、タン
パク質は、均質で、SDS-PAGE上を単一のバンド(61kD)として移動した。
８．抗体
抗GST-LRP抗体を生産するために、グルタチオンセファロースビーズ上に固定化
したGST::LRPの1:1スラリー1ml又は可溶性GST::LRP600μlを、0.85％NaClに加え
、全体積2.6mlとした。MPL+TDM+CWSアジュバンド系(RIBIアジュバンド)をこれら
の溶液2.0mlで再構成した。予備免疫血清の調製後、２匹の白兎(Charles River
New Zealand；ZRL:kbl(nzw)br)を、固定化した可溶性GST::LRP1mlで４倍希釈で
皮下尾部に免疫接種した。28日後、上述したような固定化した可溶性GST::LRPを
用いて動物の免疫性を促進させた。14日経過後、上述したように該ウサギに３回
目の免疫接種をした。11日経過後、該動物から200mlの血液を採血して、１時間3
7℃で凝固させ、一晩中4℃でインキュベーションした。凝固血液を10分間4℃で
それぞれ9000rpm(GSAローター中)及び10500rpmで２回遠心分離した。75mlの抗血
清を-20℃で保存した。タンパク質Ａセファロースカラム(Pierce)に結合するこ
とによって抗体を精製した。
精製したポリクローナル抗LBP抗体(LRPに相当するラミニン結合タンパク質)は
、Dr．J.R.Starkey、Montanaによって快よく提供されたものである。シリアンゴ
ールデンハムスタープリオンタンパク質のアミノ酸95〜110からなる領域に相当
するペプチドに対するポリクローナルウサギ抗体は、Dr.M.Groschup、
Cruz Biotech、USAから納品した。抗EHSラミニン抗体をSigmaから購入した。
９．動物
試験マウススクラピー(C506M3株)又はBSE(4PB1株)(Lasmezas等、1996)を脳内又
は腹膜内に接種したC57BL/6マウスを病気の最後の段階で頚部破壊によって殺し
た。異なる器官を直ちに取り出し、液体窒素で冷凍し該器官を分析するまで-80
℃に維持した。同様の手順を、スクレピー263K株を脳内に接種したシリアンゴー
ルデンハムスターにも適用した。動物。試験マウススクラビー(C506M3株)又はBS
E(4PB1株)21(Lasmezas等、1996)を脳内又は腹膜内に接種した動物C57BL/6マウス
を病気の最後の段階で頚部破壊によって殺した。異なる器官を直ちに取り出し、
液体窒素で冷凍し、該器官を分析するまで-80℃に維持した。同様の手順を、ス
クレピー263K株を脳内に接種したシリアンゴールデンハムスターに適用した。
１０．スクラピー及びBSE感染動物と非感染動物由来の組織ホモジネートの調製
脳(1つの半球の全体)、脾臓、膵臓及び肝臓の複数片及び骨格筋をリボリサー(登
録商標)(Hybaid)によってグルコース等張液中に20％(w/v)となるようにホモジネ
ートした。SDSサンプル緩衝液280μlを40μlのホモジネートに加えて、95℃で５
分間加熱し、15000RPMで15分間遠心分離した。20μl（全タンパク質の0.5mg）を
ウエスタンブロットによって分析した。
１１．SDS PAGE及び免疫ブロット
タンパク質サンプルを前述したようなPhastsystemで作動する12.5％のSDS Phast
ゲル(Pharmacia)(Heukeshoven等、1988)又は製造者のプロトコール(Hoefer)にし
たがうMighty Smallゲルで分析した。電気泳動後、Phastゲルの場合には、ゲル
をポリビニルジフロロ膜(PVDF)に40分間70℃でブロットし、又Mighty Smallゲル
の場合にはSemiphorユニット（Hoefer）でゲルを、ブロットした。Phastゲルを
、展開ユニット(Pharmacia)において自動的に銀で染色するか、上述のクマシー
ブリリアントブルーで染色した。ブロットしたものを、ポリクローナル抗LRP/抗
PrP抗体とともに1:100/1:800希釈度でインキュベーションした。インキュベーシ
ョン工程を前述したように行なった(Edenhofer等、1996)。抗体検出を化学ルミ
ネッセンスによって行なった(ECL系、Amersham)。
１２．ラミニン結合測定
単独のグルタチオンセファロースビーズかGST又はGST::LRPに結合したもののど
ちか50μlを、25mMトリス塩酸pH7.4，4℃、5mMMgCl2、5mMCaCl2を含むTCM緩衝液
で平衡化した。EngelBreth-Holms-Swarm(EHS)ラミニン(Boehringer Mannheim；3
.5μg;17.5pMol)をTCM緩衝液に添加した後、反応を4℃で一晩中行い、次いでビ
ーズをTCMで４回洗浄して、抗ラミニン抗体(Sigma)を用いてウエスタンブロット
によって分析した。
１３．ノーザンブロット分析
550bpのDNAプローブをAsuII及びEcoRIを用いてpJG-I.91の制限によって生成した
。プローブをランダムラベルキット(Gibco)を使用して32Pラベルして、市販のヒ
ト複合組織ノーザンブロット(Clontech)を用いて雑種形成した。コントロールと
して放射性βアクチンプローブを雑種形成した。提供者に推奨されたように雑種
形成をExpressHybシステムを用いて68℃で行ない、ブロットを洗浄した。ブロッ
トを２つの強化スクリーンで２日間露光した。
実施例１:イースト菌二複合体系を使用することによるPrPへ特異的に結合する化
合物としてのLRPの同定
pSH2-1/pEG202-GST、pSH2-1/pEG202−PrPc、pSH2-1 p EG202-GST-PrPc、pSH2-1-
PrPc-GSTの構築はEdenhofer等1996に記載されている。バイトタンパク質として
、出願人は、GST-PrPcへ融合した領域と結合しているLexAを使用して、前述した
ように(Edenhofer等、1996)pJG4-5の酸性トランスアクチベーション領域B42へ融
合したHela cDNAライブラリーをスクリーニングした。潜在的に陽性のEGY48形質
転換体を、pJG4-5でDNA挿入物のgalプロモーターのためにガラクトース存在下で
Ura、His、Trp、Leu上に生育させることによって選別した。陽性のクローンを5-
ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノサイド(Xゲル)を補ったガ
ラクトースプレート上に点在させることによって陽性クローンをβガラクトシタ
ーゼ生産に対して探索した。陽性のクローンのcDNAを回収し、前述したように大
腸菌KC８で形質転換して、配列化した。コントロール試験のために、プラスミド
pSH2-1、pSH2-1-GST、pSH2-1-GST::rPrPc、pSH2-1-CTF-2(Wendler等、1994)及び
pEG202-bicoid(Gyuris等、1993)をEGY48で再形質転換し、形質転換体をβガラク
トシダーゼ生産及びそれらのLeu+表現型に対して試験した。少なくとも５つの形
質転換体を対応するプレートに点在させて30℃で３日間インキュベーションした
。
イースト菌株EGY48をLexAに融合するGST::PrPcをコード化するpSH-GST-PrPc構
築物で形質転換し、前述したように(Edenhofer等、1996)固有活性を試験した。
バイトタンパク質GST::PrPcの発現をLexAの抑制活性によって正確に確認した。
コントロールバイトLexA-bicoid及びLexA-Gal4も、抑制測定において陽性であっ
た(データーは示さず)。分子量約53kDaのlexA-GST::PrPcの発現を、ポリクロー
ナルPrP特異的抗体で展開したウエスタンブロットによって確認した(データに示
さず)。PrP特異的抗体はpSH-GST及びpSH形質転換したイースト菌細胞の場合のい
ずれのタンパク質も認識しなかった(データに示さず)。ガラクトース誘導可能な
プロモーターによって制御されているHela-cDNAライブラリーを含め、pSH-GST−
PrPc、レポータープラスミドpSH18-34及びプレイプラスミドpJG4-5によってS・
セレビシアを同時形質転換した。約６×105個の形質転換体全てを貯え、分画を
グルコース補充培地を加えることによって誘導した。Leuを欠くガラクトースプ
レート上を誘導された培地で覆うと、約2000
個のコロニーを生じた。βガラクトシターゼ表現型についてそれらのうち300個
をスクリーニングした。大腸菌KC8株において再度形質転換後、55クローンのpJG
4-5プラスミドを回収して、配列化した。９個のクローン(約20％に相当する)は
、Ｎ末端で43、45、46、89、130及び156アミノ酸を欠くＮ末端切断型67kDa高親
和性ラミニン受容体前駆体(LRP)をコード化した。いくつかの再形質転換試験に
よって、PrP-LRP相互作用の特異性が証明された。ラミニン受容体前駆体(アミノ
酸44-295)をコード化するpJG4-5プラスミドIII.93及びpSH-GST::PrPcで同時に形
質転換することによっては、青色コロニーで、ロイシン栄養要求性の相補性を生
じた(図１、列１)。LexA-GST(図１、列２)をコード化するコントロールプラスミ
ドpSH-GST及びLexA(図１、列３)をコード化するコントロールプラスミドpSHはど
のレポータ系も活性化しなかった。２つの「擬似餌」Lex-CTF2(図1、列4)及びLe
xA-bicoid(図1、列5)も、S・セレビッシアにおけるPrPcラミニン受容体前駆体相
互作用の特異性を確認する両方のレポーター測定(図1、列5)において陰性を示し
た。
実施例２：S・セルビッシアにおけるPrP-LRP結合部位のマッピング
PrP-LRP相互作用部位のマッピングを、アミノ末端で43、45、46、89、130、156
アミノ酸(ラミニン受容体前駆体に相同でない23アミノ酸を含む)及び179アミノ
酸(ラミニン結合領域を欠く)を欠くアミノ末端切断型ラミニン受容体前駆体をコ
ード化するプラスミドpJG4-5Δ43、pJG4-5Δ45、pJG4-5Δ46、pJG4-5Δ489、pJG
4-5Δ130、pJG4-5Δ156、pJG4-5Δ179を用いていくつかの再形質転換試験により
研究した。pJG4-5Δ43からpJG4-5Δ156までが、上述した二複合体系から分離し
た。pJG4-5Δ179は、AvaIによりpJG-I.91を一部消化し、次いでEcoRIによって消
化することにより構築した。420bpEcoRI(５‘)を欠く約7kbの生成DNA断片-AvaI(
3’)DNA断片を、緩和し再びくくりpJG4-5Δ179を生じた。
Ｎ末端切り取り型のレセプターLRPΔ43からLRPΔ156までは、青色コロニーに
生じた(図２、列1-6)。しかしながら、LRPΔ179の形質転換は、陰性のＸゲル表
現型(図7、列7)となり、ラミニン及びPrPcが、LRP上の同一の結合部位(アミノ酸
161〜アミノ酸180)を分け合うことを立証した。
実施例３：昆虫細胞において合成された組み換えLRPは、Engelbreth-Holm-Swa
rm(EHS)ラミニンに結合する。
AcSG2T::LRP感染Sf9細胞から分離したGST::LRP(図3A、レーン2)は、分子量67kDa
で移動し、これは、非常に攻撃性がある腫瘍細胞(Yow等、1988、Rao等、1989)に
おいて発現した組み換えLRPから観察されるGSTの27kDa(Weiss等、1995,1996)プ
ラス37kDaから予想される。オートグラフィッカカリフォルニカgp67シグナル配
列(Whitford等、1989)を、融合タンパク質のアミノ末端で構築されたという事実
にもかかわらず、GST::LRPの分泌は観察されなかった(図3A、レーン1)。、ポリ
クローナル特異的抗体が、GSTに融合するラミニン受容体前駆体を特異的に認識
したが、これは、組み換えLRPが免疫学的に活性であることを証明するものであ
る。組み換えラミニン受容体前駆体のラミニンに対する結合能を更に証明するた
めに固定化したGST::LRPをEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘍から得たラミニンの
存在下でインキュベーションした。ラミニンは、ジスルフィド結合によって結合
した２つのポリペプチド鎖B1及びB2(それぞれ220kDa、図3C、レーン4)からなり
、ポリペプチド鎖A(440kDa、図4、レーン4)と共に特有の非対称クロス構造を形
成する。ラミニンが結合しているかどうかは、固定化したGST::LRP(図3C、レー
ン3)を用いて、抗EHSラミニン抗体の存在下でのみ検出することができる。結合
は、固定化したGST(図3C、レーン2)又は非充填ビーズ(図3C、レーン1)の存在下
では生じなかった。
実施例４：LRP mRNAは、脳を含めいくつかのヒト器官に存在する。
様々な組織におけるヒトLRPをコード化するmRNAを同定するために、ヒト複合組
織のノーザンブロットを、ラミニン受容体前駆体をコード化する領域に相補的な
DNAプローブを用いて選別した。ラベルした断片をヒト複合組織mRNAブロットに
対してハイブリダイゼーションすることによっては、LRPをコード化するmRNAは
、心臓(図4、レーン1)、胎盤(レーン3)、肺(レーン4)、肝臓(レーン5)、骨格筋(
レーン6)、膵臓(レーン8)及び脳(レーン2)に偏在して分布することが明らかとな
った。対照的に、腎臓でのLRP-mRNAレベルは非常に弱かった(レーン7)。
実施例５：LRPは、ScN2a細胞において過剰に発現する。
Dr．Starkey(上述の８参照)由来のLRP特異的抗体を用いて粗大溶解物をウエスタ
ンブロット分析することによって、67kDaのLRPがN2a細胞の粗大溶解物に存在す
るが、スクレピー感染N2a細胞(ScN2a)(図４Ｂ、レーン3)において過剰発現する
ことが判明した。真正LRPは、PrPの27kDa及び組み換えPrPの37kDaのために昆虫
細胞由来の組み換えGST::LRP(図４Ｂ、レーン1)と同じ分子量を示す。ScN2a細胞
中にLRPが存在することは、レセプターがスクレピー増殖に含まれるという上述
の説を支持するものである。さらに、LRP発現は、組織に依存している。上記表
１及び図16及び17参照。
PrP/LRP相互作用の病原菌との関連性を調べるために、スクラピー感染及び非
感染ネズミ神経芽細胞のLRPレベルを、上記８で述べたように調製したLRP特異的
抗体を用いて分析した。図4c(a)は、LRPレベルが、非感染N2a細胞(レーン1)に比
較してスクラピー感染N2a細胞(レーン2)において２倍に増加したことを示す。タ
ンパク質バンドの強度を光学的スキャニング法により決定した。βアクチンのレ
ベル(42kDa；コントロール)は、N2a細胞(図4c(b)、レーン2)と比較してScN2a(図
4c(b)、レーン3)において安定性を維持した。ScN2a細胞におけるLRPレベルが増
加したことは、LRPがスクレピー感染に関係しているという説を支持するもので
ある。
さらに、スクレピー(C506M3)又はBSE(4PB1)株のいずれかを脳内に接種した末
端C57BL/6マウスの脳及び脾臓におけるLRPタンパク質レベルを調査した。LRPレ
ベルは、非感染マウス(それぞれレーン３及び５)と比較してスクラピー感染マウ
ス(図16a、それぞれレーン２及び４)の脳と脾臓において２倍増加する一方、LRP
量の著しい変化は、BSE感染マウスのいずれの器官においても観察されなかった(
それぞれ、図16aレーン6,7,8及び9)。βアクチン(42kDa)のレベルは、スクレピ
ー/BSE感染動物において変化しなかった(図16b)。PrPSc蓄積量は、マウスBSE型
と比較してマウススクラピー型において４倍高かった。それゆえ、LRP濃度は、P
rPScと相関に関連があるように思われる。さらに、このことは、脳内に接種した
マウスに観察されるPrPSc蓄積量の50％だけを示す腹膜内接種スクラピーマウス
の脳及び脾臓のおいてLRP濃度の増加が観察されなかったという事実によって、
支持される。
LRPレベル及びPrPSc蓄積の直接的な相関関係を確認するために、出願人は、高
レベルの大脳内PrPScについてのモデルである型の263Kスクレピー株を接種した
シリアンハムスターの異なる器官におけるLRP量を調査した。LRPレベルは、非感
染コントロールハムスター(それぞれレーン３及び７)と比較してスクレピー感染
ハムスターの脳において５倍増加(図17a、レーン2)し、膵臓のおいて４倍増加(
レーン6)した。LRPは脾臓(レーン5)において少し発現し、そのレベルは、スクレ
ピ一感染ハムスター(レーン4)におけるこの器官において少しだけ(1.5倍)増加し
た。これらのデータは、PrPSc及び感染性が脳において極めて高く対照的に脾臓
において低くい、263K株の高い神経浸潤性と一致した。プリオン疾患の発生にお
ける役割は良く理解されていないが、膵臓は特にランゲルハンス島内に位置する
PrPSc及び病理学上の変化を示す。
対照的に、骨格筋においてLRPは発現せず(レーン10及び11)、非感染ハムスタ
ー(レーン9)と比較してスクレピー感染ハムスター(レーン8)の肝臓においても変
化はしなかった。βアクチン又はアクチン(42kDa)レベルは、それぞれ、非感染
ハムスターと比較してスクレピー感染の脳、脾臓、膵臓、肝臓及び骨格筋におい
て変化はなかった(図17b)。要約すれば、LRPレベルは、脳、脾臓及び膵臓などの
、感染性及びPrPSc蓄積を示す器官においてのみ増加する。
表１スクレピー/BSE感染細胞及び組織と非感染細胞及び組織におけるLRPレベル
の増加* ＊選択的スキャニング法によって計算した値
実施例６：rPrP23-231(rPrPc)及びrPrP90-231(rPrP27-30)は、組み換えバキ
ュロウイルスで同時感染させる昆虫細胞においてLRPと相互作用する。
バキュロウイルス感染昆虫細胞から分泌したFIAGタグしたPrPc(図５Ａ、レー
ン1)及びFLAG::rPrP90-231(図5A、レーン2)は、それぞれ27kDa及び17kDaの分子
量であることを明らかにした。同時感染測定は、GST::LRPはFLAG-BAC::rPrP23-2
31(図5B、レーン3)又はFLAG::BAC::rPrP90-231(図５Ｂ、レーン4)でAcSG2T:LRP
を同時感染によって唯一検出することができることを証明する。GST発現AcSG2T
はFLAG-BAC::rPrP23-231(図5B、レーン2)又はFLAG::BAC::rPrP90-231(図5B、レ
ーン4)と同時感染したとき、相互作用は生じい、別のコントロールとしてGST::L
RPは、GST(データに示さず)と融合したSrcキナーゼp59hck(Danhauser-Riedl等、
1996)との相互作用をしなかったが、これは、昆虫細胞におけるrPrP23-231及びr
PrP90-231のLRPとの特異的相互作用を証明した。
実施例７:rPrP23-231(rPrPc)はCos-7細胞における真正LRPと相互作用する。
哺乳類の細胞におけるLRP/PrP相互作用を更に確認するために、発明者は、真
正LRP及びPrPcをコード化するプラスミドによってCos-7細胞を同時感染させた。
LRP特異的抗体によって認識された組み換えLRPは、LRP-cDNAから発現した遺伝子
産物(Yow等、1988)から予想されるように37kDaの分子量(図6B、レーン3)を示し
た。FLAG::haPrP23-231は27kDaのタンパク質として合成され(図６Ａ、レーン1)
及びPrP特異的抗体によって認識された。LRP及びrPrP23-231との同時感染測定は
、両方のタンパク質の同時発現後にのみLRPの存在を証明した（図6B、レーン2)
。PpcDNA3-LRPの非存在下では、相互作用は生じない(レーン1)。要約すれば、67
kDaラミニン受容体前駆体とプリオンタンパク質との相互作用は、イースト菌、
昆虫細胞、哺乳類の細胞において証明された。
実施例８：LRPノックアウトマウスはPrPSc感染に耐性である。
LRPのPrPScに対するレセプターとしての機能をLRPノックアウトマウスを使用し
て測定することができる。LRPは、マルチコピー遺伝子属に属するので(Bignon等
、1991；Douville and Carbonetto、1992、Fernandez等、1991)、
クアウト法を使用することは不可能である。それゆえ、追加の座に切り替える必
要がある。これは、アンチセンス法と従来のノックアウト法を合わせることによ
って行なうことができる。この手法は、ある分裂したLRP遺伝子を用いてマウス
に導入することができる。さらに活性LRP遺伝子のmRNAは、誘導されたアンチセ
ンスmRNAによって不活性にすることができる。
LRPノックアウトマウスの生成における第一段階は、λFicIITMベクターでクロ
ーン化したゲノムマウスライブラリー(129SV)においてLRP遺伝子の１つの相同物
をスクリーニングすることである。LRPを使用して、特異的DNAプローブは、LRR
遺伝子のゲノム構造の同定することができるが、このゲノム構造をサブクローン
化し、マップ化して、かつ配列化する。第２段階は、置換ベクターの構築を含む
(図11)。LRP遺伝子の複数の個所を切断してネオマイシン耐性をコード化する遺
伝子によって置換して、は、金属結合性タンパク質プロモーター又はテトラサイ
クリン感受性プロモーター(Gossen and Bujard、1992)などの誘導プロモーター
の制御下で、アンチセンスLRP配列を含むアンチLRPカセットに隣接して選別を行
なう。LRP遺伝子の両側で相同性のある領域に位置するチミジンキナーゼ遺伝子
は、マイナス選別することができる。置換ベクターは、エレクトロポーションに
よってネズミ胎児幹細胞(ES)へ転移される（図12A)。G418及びガンシクロバーが
存在することによって、潜在的に相同性組み換え体を与えるクローンを生じる。
PCR及びサザンブロット分析によりプラス選別クローンのスクリーニングは、１
つの対立遺伝子上で１つのLRP遺伝子に突然変異したコロニーの同定を可能とす
る(図11,12A)。
相同性組み換えES細胞クローンを、桑実胚凝集及び胚盤胞注入によって胎児桑
実胚又は未分化胚細胞に移送する。キメラを被膜色によって同定し、アグーチ被
膜色(相同性組み換え胎児幹細胞が集合するのを同定する目的)及びサザンブロッ
トによって細菌系集約に対して試験した。異型接合体マウスを交雑雑種し、１つ
の分裂LRP遺伝子を用いて相同性LRPJ-/-マウスを生産する。追加のLRP遺伝子を
不活性化するために、それぞれ亜鉛又はテトラサイクリンをマウスに与えること
によって金属結合性タンパク質又はテトラサイクリン感受性プロモーター(Gosse
n and Bujard，1992)を活性化する。アンチセンスLRPmRNAは、追加の生成したLR
PmRNAと結合する。この手法は、異なる展開段階で行なうことが
でき、ノーザンブロット分析、ウエスタンブロット分析及びFACS分析によって証
明することができる。
LRP-/-マウスの表現型の特徴
LRP-/-マウスの表現型は、行動、脳や他の器官の組織学的試験及び神経学的研
究を含め特徴づけることができる。
表現型の特徴
マウスを、神経学的徴候を含め臨床上の異常が発生したかどうかを全寿命に渡っ
てモニターする。加えて、マウスの運動神経を客観的に評価するため、マウスの
行動をロータ上で試験する。行動特性に関して、適当な試験によって、LRPマウ
スの学習能力を評価し、同じゲノム背景を所有するWTマウスと比較した(例えば
、水泳航法及びＹ迷路識別テスト)。
脳及び他の器官の総体的異常があるかどうかを検出するために解剖調査を行な
い、従来の技術とヘマトキシン-エオシン染色を使用して組織的検討を行なう。
しかしながら、重要な試験は、マウス及び牛のPrPScリッチの感染性分画でLRP-/-
マウスを接種することである。
prpSc検出手順(Lasmezas等、1997)。PrPScで感染させたマウスを前mortem段階で
頚部骨折により殺し、脳を直ちに取り出した。１つの脳半球(小脳を含む)を、液
体窒素で冷凍して、PrP分析のために-80℃で貯蔵した。他の脳半球を病理学試験
のために固定した。PrPScを精製するために、全脳半球を５％グルコース溶液中
で10％(w/v)に均質化した。手短に言えば、プロテイナーゼK(PK)を１０μg/ml使
用し、PMSFで消化を阻止する。10％のサルコシルと10mMのトリス塩酸pH7.4を加
えた後、サンプルを15分間室温でインキュベーションする。それから、サンプル
を10％サッカロースクッションにおいて245000gで４時間20℃で遠心分離する(Be
ckmann TL100遠心分離機)。ペレットを、ラエミー緩衝液に再懸濁しポリクロー
ナル抗マウスPrP抗体を使用してウエスタンブロットによって分析する。LRPマウ
スのPrPScでの接種は、マウスがPrPSc感染に対して耐性があることを示す。
実施例９:アンチセンスRNA技術による神経芽細胞腫細胞(N2a)におけるLRP遺伝
子の不活性化
(a)導入
LRPの発現をアンチセンスLRPmRNAの存在下で下方に調整することができる。選択
的リボゾーム手法も考えられる。まず、LRPの下方調整量を、スクラピー感染細
胞対非感染性神経芽細胞腫細胞(N2a)を使用して細胞培養システムにおいて、測
定することができる。スクラピー感染N2a細胞は、アンチセンス/リボザイム構築
物の存在下で当然それらの感染性を失い、神経芽細胞腫細胞はアンチセンスLRPm
RNA/リボザイムRNAの存在下ではもはやPrPScに感染されないであろう。第二に、
同様の遺伝子導入ベクターを卵母細胞にマイクロインジェクションすることがで
きる(卵子に受精させる)。マイクロインジェクション後、生残卵子を偽妊娠育成
用母体の卵管へ移すことが可能である。結果は、LRPのレベルの減少を示すか、
もはやLRPを発現せず、スクレピー感染に対して完全な耐性を引き起こす。
アンチセンス及びリボザイム引き出し法の２例を以下に示す。マウス卵母細胞
及び初期胚における転写されたRNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの試験
管内マイクロインジェクションを、遺伝子の有益性と機能の損失を研究するため
に行なった(Kola and Sumarsono等、1996)。アデノウイルスVAI小RNAを、リボザ
イムの細胞移送のキャリアーとして使用した(Prislei等、1997)。
(b)方法論
アンチセンスLRP発現ベクターpCI-neo−asLRPの構築
マウス37kDaLRP ORFの位置-65から+901までのcDNAを構築物を、２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用してN2a神経芽細胞腫細胞から分離した全RNAからRT
-PCRによって生成した。生じた970bpDNA断片を、NheI(5')及びSmal(3')制限部位
を使用して、pCI-neo哺乳類発現ベクター(Promega)中にアンチセンス方向にサブ
クローン化した。正しく挿入されたことを制限分析法及びジデオキシ配列法によ
って確かめた。
細胞培養と遺伝子導入
スクレピー感染(ScN2a)及び非感染マウス神経芽細胞腫細胞(N2a)を、10％FCS
、１％グルタミン、100μg/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンで補
充したDullbeccoの変性Eagle培地(DMEM)(Sigma)で維持した。細胞を上記の
条件の下で70％混合させて25cm2培養容器で生育し、無血清培地で14時間100μg
のリポフェクタミン(Life Technoloies)及び16μgのプラスミドDNApCl-neo-asLR
Pを用いて遺伝子導入した。48時間後、培地に400μg/mlのG418(Life Technologi
es)を含む培地で補給した。ノーザンブロット分析によるアンチセンスLRP発現の
ために、G418耐性コロニーを展開させスクリーニングした。さらに、LRPレベル
をSDS-PAGE及びウエスタンブロットによって決定した。
マウス卵母細胞へのマイクロインジェクション
pCl-ネオ-asLRPの制限加水分解
卵母細胞におけるマイクロインジェクションより前に、細菌DNA配列をpCI-neo
-asLRPから取り出さなければならない。そのためにプラスミドをCMVプロモータ
ーの上流とネオマイシン遺伝子の下流でそれぞれBgIII及びBamHIを用いて切断し
た。DNA断片をTAE緩衝ゲル電気泳動によって精製し、標準手順によってゲルから
抽出した。フェノール抽出とエタノール析出後、DNAを、TE緩衝液(5mMトリス塩
酸、pH7.4、0.2mM EDTA、pH7.4)中に再懸濁し、0.2μmフィルターで濾過し、DNA
濃度を決定した。DNAを、TE緩衝液で3〜5ng/mlの濃度に希釈して、使用するまで
20mlの分画を凍結保存した。
排卵と交配
メスB6D2GF1マウスの排卵を、PMSG(妊娠メス血清性腺刺激ホルモン)の8IU(国
際単位)の腹腔内注入によって誘導した。48時間後、hCG(ヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモンの7IUを腹腔内に注入した。次いで、メスマウスを、交配のために同一株
の養殖用オスと共に持ち込んだ。動物を、一晩中一緒にした。
24時間後、プラグコントロールを行なうことによって、交配の成功を確かめた
。その後、メスマウスを殺し、管を用意した。丘細胞を取り除くために、丘細胞
中の受精卵を洗浄しヒアロニターゼで処理した。受精卵を培地に保持した。
卵母細胞のDNAのマイクロインジェクション
分離した制限断片(上述したような)を、マイクロマニュプレーターを使用して
マウス受精卵の前核に注入した。3〜5μgのDNAを、90〜240個の受精卵に注入し
た。マイクロインジェクションの後、生き残った受精卵を偽妊娠育成用母体の卵
管へ移した。
結果(アンチセンス/リボザイムカセットの存在を、PCRによって分析した)は、
アンチセンスLRP RNAを発現し、LRPのレベルが減少することを示すか、完全にLR
Pが発現しなかった。これらの動物は、スクレピー感染に対して部分的に又は全
体的に耐性であった。
実施例１０：神経芽細胞腫細胞の表面のLRP及びPrPの位置測定。
スクレピー感染及び非感染N2aマウス神経芽細胞腫細胞及び骨肉腫(HOS)細胞を
10％のFCS、１％のグルタミン、100μg/mlのペニシリン、及び100μg/mlのスト
レプトマイシンを補充したDMEM培地(Gibco)で単層培地のまま維持した。細胞を1
0mm直径のカバーグラス上に半合流を与え、付着のために一晩中生育した。細胞
を、リン酸緩衝食塩水(PBS)の４％パラフォルムアルデヒドで、20分間4℃で固定
化した。固定化した細胞を３回PBSで洗浄した。細胞染色のために、細胞を、PBS
中の0.1％トリトンX-100で10分間4℃で浸透させた。PBSで３回濯いだ後、カバー
グラスをPBS中の10％FCSで１時間室温で遮断して、PBSで一度洗浄した。LRPの検
出のために細胞を１時間室温でモノクローナル抗体LRP特異的抗体と共にインキ
ュベーションして、PBS中の10％FCSにおいて1:200に希釈した。コントロールをP
BS中の10％FCSでプレ免疫血清とインキュベーションした。その後、細胞をPBS中
で３回濯いで、PBS中で10％のFCSで1:100に希釈したフルオレセインイソチオシ
アネート(FITC)結合抗マウス第二抗体(Jackson ImmunoResearch Lab.)を、45分
間室温で適用した。それから、カバーグラスを３回ＰＢＳで洗浄し、封入剤(Sig
ma)に取り付けた。細胞を免疫フルオレッセンス顕微鏡で見た。倍率は、400〜63
0倍であった。
生成したネズミ神経芽細胞腫細胞(N2a、図18)及びヒト骨肉腫(HOS)細胞をLRP
特異的抗体、次いで第二FITC結合抗マウス第二抗体を使用してインキュベーショ
ンした。細胞表面の濃い円は、LRPが神経細胞の表面に位置することを示す。PrPc
は、グリコシルフォスファジチルイノシトール(GPI)(Rogers等、1991)によって
固定された神経(又は他のスクラピー感染性の)細胞の表面にも現れる。細胞のフ
ォスフォリパーゼc(PIPL-c)での処理は、細胞のGIPアンカー(Caughe and Raymon
d、1991)を切断することによって細胞表面からPrPcを除くが、いくつかの研究者
らは、形質転換体PrPを細胞表面に固定する役割をするPrPcの膜
内外領域(TM)が存在(Harris and Lehmann、1996)することを証明した。それゆえ
、LRP及びPrPは両方とも、スクラピー感染細胞の表面に位置する。
実施例１１：ネズミ神経芽細胞腫細胞(N2a)によるヒト及びウシからの組み換
えPrPの摂取
組み換えプリオンタンパク質のインキュベーション試験のために、細胞を、培地
1ml当たり3μｇの組み換えGST::huPrP、GST::bovPrP及びGSTと共に一晩中インキ
ュバーションした。阻害実験のために、細胞を培地に1:100希釈したLRP特異的抗
体で２時間予めインキュベーションした。一晩中インキュベーション後、前述し
たように。細胞を固定化し、浸透させて免疫染色した。組み換えタンパク質を検
出するために、ポリクローナル抗GST(Santa Cruz Biotechnologies)又は抗PrP3B
5プライマリー抗体(PBSの10％FCSで1:100に希釈)を使用した。第二抗体として、
Texas Red又はFITC結合抗ウサギ抗体(Jackson ImmunoResearch)を使用した。
図19(左パネル）は、N2a細胞によってGSTに融合したウシPrPの摂取を証明して
いる。小さい点は、PrP特異的抗体(3B5)によって検出したN2a細胞表面のウシPrP
を示す。細胞をLRP特異的抗体で予めインキュベッションしたとき摂取をやめ(Ri
eger等、1997)(図19、右パネル)、LRPがN2aによるプリオンタンパク質の摂取に
責任があることを証明した。それゆえ、LRP特異的抗体を、治療道具として使用
し、LRPによるプリオンタンパク質の摂取を防止することができる。
ヒトプリオンタンパク質を使用したとき、同様の結果を得た。GST単独では、
細胞と結合せず、GST::PrP融合タンパク質のPrP部分はN2a細胞の摂取に責任があ
ることを証明した。
参照文献のリスト
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１２月８日（１９９９．１２．８）
【補正内容】
明細書の発明の名称を「可溶性ラミニン受容体前駆体及びその相互作用を阻止す
るための方法」に補正する。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月１４日（２００１．５．１４）
【補正内容】
１．明細書の請求の範囲を下記の通りに捕正する。
「 請求の範囲
１．PrPsc、PrPc又はそれらの断片に結合可能な、可溶性ラミニン受容体前駆体(
LRP)、ムテイン、融合タンパク質、塩類、官能性誘導体又はその断片を含み、か
つ選択的に適当な希釈剤、キャリア及び/又は賦形剤を含む薬剤組成物。
２．LRP及びPrPsc、PrPc又はそれらの断片との相互作用を阻止する化合物を含み
、かつ選択的に適当な希釈剤、キャリア及び/又は賦形剤を含む薬剤組成物。
３．LRP及びPrPsc，PrPc又はそれらの断片に結合する抗体若しくはその断片又は
核酸。
４．請求項３の化合物の１つからなる薬剤組成物。
５．LRPの発現を減少させ又は阻害するアンチセンスRNA又はリボザイムからなる
薬剤組成物。
６．PrPscの存在に関連する疾患を治療するための請求項1,2,4又は5のいずれか
１項に記載の薬剤組成物。
７．疾患が感染性海綿状脳症である請求項６記載の薬剤組成物。
８．感染性海綿状脳症が、スクレピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤ
コブ症候群、致命的な遺伝性不眠症、慢性消耗性疾患、フィーライン海綿状脳症
(FSE)である請求項７の薬剤性組成物。
９．薬剤組成物を調製するための請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の使用方
法。
１０．請求項6〜8のいずれか１項に記載の疾患を治療するための薬剤組成物を調
製するための請求項９に記載の使用方法。
１１．図14に示す核酸配列又は実質的に前記配列を有する発現ベクターpFLAG-BA
C。
１２．pAcSG2T::PrPc23-231からBamHI及びEcoRIにより5'末端及び3‘末端でポリ
リンカー配列の挿入物として摘出したrPrP23-231カセット(648bp)をさらに含む
請求項11のベクター。
１３．pACSG2T::rPrP27-30からBamHI及びEcoRIにより5'末端及び3‘末
端でポリリンカー配列の挿入物として摘出したrPrP90-231カセット(447bp)をさ
らに含む請求項11のベクター。
１４．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を診断する方法であって、前記方法が、以下 の工程、即ち、試験すべきサンプルにおける感染性海綿状脳症に対するマーカー タンパク質の過剰発現を決定する工程からなることを特徴とする方法。 １５．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を診断する方法であって、前記方法は、 （ａ）試験すべきサンプルにおける感染性海綿状脳症に対するマーカータンパク 質の発現を決定し、かつ、 ( ｂ)得た値と対照例とを比較する工程とからなり、発現レベルにおける増加が、 感染性海綿状脳症の発生の表示であることを特徴とする方法。 １６．サンプルが、脳、脾臓、膵臓、肝臓又は筋肉由来のホモジネートであるこ とを特徴とする請求項１４又は１５項に記載の方法。 １７．マーカータンパク質が、ラミニン受容体（LR）又はラミニン受容体前駆体 （LRP）であることを特徴とする請求項１４〜１６までのいずれか１項に記載の 方法。 １８．マーカータンパク質が、ヒトラミニン受容体(LR)又はヒトラミニン受容体 前駆体(LRP)であることを特徴とする請求項１４〜１７までのいずれか１項に記 載の方法。 １９．マーカータンパク質が、ウシラミニン受容体(LR)又はウシラミニン受容体 前駆体(LRP)であることを特徴とする請求項１４〜１７までのいずれか１項に記 載の方法。 ２０．マーカータンパク質が、羊ラミニン受容体(LR)又は羊ラミニン受容体前駆 体(LRP)であることを特徴とする請求項１４〜１７までのいずれか１項に記載の 方法。 ２１．マーカータンパク質が、ネコラミニン受容体(LR)又はネコラミニン受容体 前駆体(LRP)であることを特徴とする請求項１４〜１７までのいずれか１項に記 載の方法。 ２２．マーカータンパク質が、標準的免疫検定によって決定されることを特徴と する請求項１４〜２１項のいずれか１項に記載の方法。 ２３．前記標準的免疫検定がウエスタンブロッティング検定であることを特徴と する請求項２２記載の方法。 ２４．サンプルを、ラミニン受容体(LR)又はラミニン受容体前駆体(LRP)に特異 的な抗体とインキュベーションすることを特徴とする請求項１４〜２１項のいず れか１項に記載の方法。 ２５．TSEに対するマーカーとしてラミニン受容体又はラミニン受容体前駆体の 変更された表現型を、標準的な分子生物学的方法によって決定することを特徴と する請求項１４〜２１項に記載の方法。 ２６．前記サンプルを、ウシ、ヒト、羊、又はネコ動物からなる群から選択され る組織から取り出したことを特徴とする請求項１４〜２５項のいずれか１項に記 載の方法。 ２７．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を検出するための診断用試験キットであって 、TSEに対するマーカータンパク質としてラミニン受容体(LR)及び／又はラミニ ン受容体前駆体(LRP)の変化した表現型を、請求項１４から２６までのいずれか １項に記載の方法によって検出するためのラミニン受容体前駆体(LRP)及び／又 はラミニン受容体(LR)に特異的な抗体を含有することを特徴とする。 ２８．前記抗体が、ウシ、ヒト、及び/又はネコのラミニン受容体(LR)及び/又は ラミニン受容体前駆体(LRP)に対する抗体である請求項２７記載の試験キット。 ２９．前記抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７又は ２８記載の試験キット。 ３０．前記抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７又は ２８記載の試験キット。 ３１．試験において、正のコントロールとしてバキュロウイルス系において合成 されたGST及び負のコントロールとしてバキュロウイルス系において合成された 組み換えGSTへ融合した組み換えラミニン受容体前駆体(GST::LRP)を含むことを 特徴とする請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の試験キット。 ３２．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を検出するための診断用試験キットであって 、ストリンジェントな条件下で、ラミニン受容体前駆体(LRP)及び／又はラミニ ン受容体(LR)をコードする核酸とハイブリダイズする能力のある核酸と、請求項 ２ ７〜３１項による製法を行うための他の必要な成分とを含むことを特徴とする診 断用試験キット。 ３３．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の診断用の組成物を調製するためにラミニン 受容体(LR)及び/又はラミニン受容体前駆体(LRP)と結合することが可能な抗体の 使用方法。 ３４．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の診断用の組成物を調製するために、ストリ ンジェントな状況下でラミニン受容体前駆体(LRP)及び/又はラミニン受容体(LR) をコードする核酸とハイブリダイゼーションすることが可能な核酸の使用方法。 ３５．感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の出現が、ラミニン受容体前駆体(LRP)及び/ 又はラミニン受容体(LR)の過剰発現によって表示されることを特徴とする請求項 ３３又は３４項のいずれか１項に記載の使用方法。」
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．PrPsc、PrPc又はそれらの断片に結合可能な、可溶性ラミニン受容体前駆体( LRP)、ムテイン、融合タンパク質、塩類、官能性誘導体又はその断片を含み、か つ選択的に適当な希釈剤、キャリア及び/又は賦形剤を含む薬剤組成物。 ２．LRP及びPrPsc、PrPc又はそれらの断片との相互作用を阻止する化合物を含み 、かつ選択的に適当な希釈剤、キャリア及び/又は賦形剤を含む薬剤組成物。 ３．LRP及びPrPsc、PrPc又はそれらの断片に結合する抗体若しくはその断片又は 核酸。 ４．請求項３の化合物の１つからなる薬剤組成物。 ５．LRPの発現を減少させ又は阻害するアンチセンスRNA又はリボザイムからなる 薬剤組成物。 ６．PrPscの存在に関連する疾患を治療するための請求項1,2,4又は5のいずれか １項に記載の薬剤組成物。 ７．疾患が感染性海綿状脳症である請求項６記載の薬剤組成物。 ８．感染性海綿状脳症が、スクレピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤ コブ症候群、致命的な遺伝性不眠症、慢性消耗性疾患、フィーライン海綿状脳症 (FSE)である請求項７の薬剤性組成物。 ９．薬剤組成物を調製するための請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の使用方 法。 １０．請求項6〜8のいずれか１項に記載の疾患を治療するための薬剤組成物を調 製するための請求項９に記載の使用方法。 １１．図14に示す核酸配列又は実質的に前記配列を有する発現ベクターpFLAG-BA C。 １２．pAcSG2T::PrPc23-231からBamHI及びEcoRIにより5'末端及び３‘末 端でポリリンカー配列の挿入物として摘出したrPrP23-231カセット(648bp)をさ らに含む請求項11のベクター。 １３．pACSG2T::rPrP27-30からBamHI及びEcoRIにより5'末端及び３‘末端でポリ リンカー配列の挿入物として摘出したrPrP90-231カセット(447bp)をさらに含む 請求項11のベクター。
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