KR20110049781A

KR20110049781A - 신경변성 질환에 대한 진단적/예후적 지표로서 글루타미닐 사이클라제

Info

Publication number: KR20110049781A
Application number: KR1020117002132A
Authority: KR
Inventors: 한스-울리히 데무트; 슈테판 쉴링; 마틴 클라인슈미트; 얀스-울리히 라펠트; 아스트리트 켈렌; 모니크 보낙
Original assignee: 프로비오드룩 아게
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2011-05-12
Also published as: EA201100253A1; CA2731933A1; NZ590658A; US20170097365A1; IL210266A; WO2010012828A3; ZA201100177B; AU2009275869B2; CN103983787A; BRPI0916601B1; JP2011529571A; JP5677297B2; MX2011001093A; SG193148A1; US20150247180A1; IL210266A0; CN102112880A; CN102112880B; US20100028918A1; BRPI0916601A2

Abstract

본 발명은 진단적/예후적 지표로서 글루타미닐 사이클라제 (QC)를 사용하여 알츠하이머병 (AD), 경증 인지장애 (MCI), 및 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS)과 같은 신경변성 질환을 예견하거나, 진단하거나, 예측하는 방법에 관한 것이다. QC에 결합하는 항체의 용도 및 상기 진단 방법을 수행하기 위한 키트도 또한 제공된다.

Description

신경변성 질환에 대한 진단적/예후적 지표로서 글루타미닐 사이클라제{GLUTAMINYL CYCLASE AS A DIAGNOSTIC/PROGNOSTIC INDICATOR FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES}

본 발명은 진단적/예후적 지표로서 글루타미닐 사이클라제 (QC)를 사용하여 알츠하이머병 (AD), 경증 인지장애 (MCI), 및 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS)과 같은 신경변성 질환을 예견하거나, 진단하거나, 예측하는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병 (Alzheimer Disease; AD)은 치매를 야기하는 신경변성 질환이다. 용어 "알츠하이머병" 및 "알츠하이머의병 (Alzheimer's Disease)"은 둘 다 본 기술분야에서 이용되며, 이들 용어는 동등하고 여기 및 다른 어느 곳에서나 상호 교환하여 사용된다. AD의 최초 검출로부터 종료 시까지의 기간은 몇 년에서 15년까지의 범위일 수 있으며, 이 기간 중에 환자는 정신적 기능 및 신체 기능의 조절 둘 다의 상실을 점진적으로 겪게 된다. 질병의 진행에는 상당한 가변성이 있다. 대부분의 환자는 점진적이며 끊임이 없는 진행 (연간 30 포인트 폴스타인 미니-정신 상태 스코어 (Folstein mini-mental state score)에서 평균 3 내지 4 포인트를 잃는다)을 하는 반면에, AD 증례 중의 대략 30%는 몇 년 동안 지속하는 장기간의 안정한 초기 플라토상 (plateau phase)을 갖는다 [Haxby J. V., et al., Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychol 14:575-592, 1992]. 환자의 서브그룹은 몇 년에 걸친 전격성의 빠르게 진행하는 내리막 과정을 갖는다 [Mann, U., et al., Heterogeneity in Alzheimer's disease: Progression rate segregated by distinct neuropsycho-logical and cerebral metabolic profiles, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:956-959, 1992]. 다른 환자 (코호트 (cohorts)의 약 10%)는 매년 단지 점진적인 감퇴만을 나타내면서 느린 진행을 유지한다 [Grossi, D., et al., Senile dementias, II International Symposium (pp. 97-99), Paris: John Libbey Eurotext, 1988]. 이러한 이질성의 병리학적, 화학적 및 분자 근거는 아직 결정되지 않았다. AD 진행의 가변성에 대한 인식은 중요한 임상적 식견을 나타내며, "비정형적 (atypical)" 증례에 의해서 나타나는 진단적 곤란성을 설명할 수 있다. 특정의 증례에서는 AD 질환의 가족형 발현이 있지만, AD 증례의 대부분은 비-가족형인 것으로 보이며, 최근까지 (이하 참조) 질환에 대한 간단한 생물학적 마커는 결정되지 않았다.

AD를 진단하기 위해서 사용된 현행 방법은 사후 환자로부터 수득된 뇌척수액 (CSF) 또는 뇌조직의 분석을 수반한다. 따라서, 현재 고려되고 있는 마커 중에는 사후 알츠하이머 뇌에서 발견되는 특징을 설명하는 단백질과 관련된 것이 있다. 신경원섬유 엉킴은 주로, 세포골격 단백질인 과포스포릴화된 타우 (tau) 단백질로 구성된다. 신경염성 플라크는 대부분이 더 큰 전구체 단백질의 단백분해적 분열로부터 유도된 42-아미노산 펩타이드 (Aβ₄₂)인 아밀로이드 단백질의 코어 (core)를 함유한다. 동일한 전구체로부터 유도된 이 단백질의 또 다른 형태는 단지 40 아미노산 (Aβ₄₀)을 함유한다. 이 단백질의 침착물은 AD 희생자의 뇌에서 발견된다. 그러나, 타우 및 전술한 베타 아밀로이드 펩타이드에서의 변화는 진단적 가치를 제공할 만큼 충분한 빈도 및 크기로 나타나지 않으며, 따라서 이들 단백질을 기초로 한 혈액시험은 AD와 꽤 상관관계가 있는 것으로 보이지 않는다. C-말단 가변성 이외에도, N-말단 변형된 Aβ 펩타이드가 풍부하다 [Saido, T.C. et al., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Russo, C. et al., Presenilin-1 mutations in Alzheimer's disease. Nature 405, 531-532 (2000); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)]. Aβ 펩타이드의 대부분은 2 개의 아미노산에 의해서 N-말단 절단을 겪어서 글루타메이트 잔기를 노출시키고, 이것은 이어서 피로글루타메이트 (pE)로 폐환되어 Aβ3(pE)-42 펩타이드를 생성하는 것으로 보인다 [Saido, T.C. et al., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)]. 대신으로, pE는 BACE1에 의한 β'-분열에 이어서 형성되어 Aβ N11(pE)-42를 제공할 수 있다 [Naslund, J. et al. Relative abundance of Alzheimer Aβ amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8378-8382 (1994); Liu, K. et al. Characterization of Aβ11-40/42 peptide deposition in Alzheimer's disease and young Down's syndrome brains: implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 112, 163-174 (2006)]. 특히, Aβ N3(pE)-42는 산발적 및 가족형 AD에서 Aβ 침착물의 주요 구성성분인 것으로 나타났다 [Saido, T.C. et al., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Miravalle, L. et al. Amino-terminally truncated Aβ peptide species are the main component of cotton wool plaques. Biochemistry 44, 10810-10821 (2005)].

Aβ N3pE-42 펩타이드는 Aβ 1-40/1-42 펩타이드와 공존하며 [Saido, T.C. et al., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)], 다수의 관찰결과를 기초로 하여 AD의 병인론에서 현저한 역할을 할 수 있었다. 예를 들어, Aβ N3pE-42 펩타이드의 독특한 신경독성은 개략적으로 기술되었으며 [Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002)], N-절단된 Aβ 펩타이드의 pE-변형은 Aβ-분해성 엔도펩티다제 뿐만 아니라 대부분의 아미노펩티다제에 의한 분해에 대한 저항성을 부여한다 [Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C. Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)]. 글루탐산의 pE로의 폐환은 N-말단 전하를 상실하여 비변형된 Aβ 펩타이드에 비해서 Aβ N3pE의 가속화된 응집을 야기한다 [He, W. & Barrow, C.J. The Aβ 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length Aβ. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)]. 따라서, Aβ N3pE-42 형성의 감소는 이들을 분해에 대해서 더 영향을 받도록 만들어서 펩타이드를 불안정화시킬 것이며, 이것은 다시 더 고분자량 Aβ 응집체의 형성을 방지하고, 뉴론 생존을 증진시킬 것이다.

그러나, 오랫동안 Aβ 펩타이드의 pE-변형이 어떻게 일어나는지는 알려지지 않았다. 본 출원인은 글루타미닐 사이클라제 (QC)는 온화한 산성 조건 하에서 Aβ N3pE-42 형성을 촉진시킬 수 있고, 특정의 QC 억제제는 시험관내에서의 Aβ N3pE-42 생성을 방지하며, 따라서 글루타미닐 사이클라제의 억제는 알츠하이머병의 원인적 치료를 위한 신규의 치료학적 개념인 것을 발견하였다 [Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett . 563, 191-196 (2004); Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys . Acta 1764, 1618-1625 (2006); Schilling et al. Inhibition of glutaminyl cyclase - a novel therapeutic concept for the causative treatment of Alzheimer's disease. Nature Medicine 14, 1106-1111 (2008)].

현재, 기존의 AD에 대한, 또는 비록 정상적인 인지반응을 나타내지만 필연적으로 또는 필시 AD를 발현할 것인 대상체에 대한 만족스러운 진단적 마커는 없는 것으로 보인다.

노화-연관된 인지 감퇴 (AACD) 및 경증 인지 장애 (MCI)는 치매의 단기형 (short)에 속하는 인지 감퇴를 경험한 개체를 확인하기 위해서 사용된 용어이다. 이들 용어는 MCI가 더 최근에 채택된 용어이지만 동등하며, 본 출원 전체에 걸쳐서 상호 교환하여 사용된다. 이 진단을 위한 기준의 만족도 (World Health Organization)는 점진적이며, 적어도 6 개월 동안 존재하는 인지 기능에 있어서의 감퇴에 대한 개인 또는 가족에 의한 보고를 필요로 한다. 어떤 인지 영역에 걸쳐서는 어려움이 있을 수 있으며 (비록 증례의 대부분에서 기억은 손상되지만), 이들은 연령 및 교육 기준이 비교적 건강한 개체가 이용할 수 있는 것인 정량적 인지 평가 (즉, 환자는 그 자신의 연령의 정상적인 대상체와 비교된다)에 따른 비정상적인 수행능력에 의해서 뒷받침되어야 한다. 수행능력은 이러한 시험에서의 적절한 집단에 대한 평균값보다 적어도 1 SD 이하여야 한다. 치매도 상당한 우울증 또는 약물 효과도 존재하지 않을 수 있다. 대뇌 인지 기능부전을 야기하는 것으로 알려진 대뇌 또는 전신적 질환 또는 상태가 존재하지 않을 수 있다. 본 출원인의 경험상, 임상적 치매 평가 척도 (clinical dementia rating scale)에서 CDR.5 ("의심스러운 치매")로 분류되고, 이들 배제조건을 충족한 모든 환자는 또한 AACD/MCI에 대한 기준을 충족시켰다. 알츠하이머 환자의 약 1/3은 그들의 더 전면적인 인지 감퇴에 선행하는 격리된 기억 결함의 분명하게 정의할 수 있는 기간을 가졌다 [Haxby J. V., et al., Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychology 14:575-592, 1992]. 기억력 이외에도 다른 영역을 조사하는 AACD/MCI 기준을 사용하면, 확인할 수 있는 전구증상을 갖는 백분율은 더 클 것 같다. 다행히도, 모든 AACD/MCI 개체가 감퇴라는 것으로 보이지는 않는다. 이들 대상체 중의 상당한 수는 시험 시에 안정하고, 비-진행형인 기억 결함을 나타내는 것으로 보인다.

AD, MCI 또는 NDS의 발현을 예측하거나, 이들의 진행을 모니터링하기 위한 시도는 제한된 성공을 가져왔다. 본 출원의 발명자들에 의해서, 대조 대상체에서의 기준량을 벗어나는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 QC의 양은 신경학적 질병 상태와 양의 상관관계를 가질 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, QC의 존재와 질병 상태의 상관관계는 상술한 신경변성 질환 중의 하나를 앓고 있는 환자에게서 진단을 위한 양성의 더 직접적인 시험을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 진단적 마커로서 QC를 사용하여 AD, MCI 및 NDS를 예견, 진단 또는 예측하기 위한 쉽게 투여된 생물학적 샘플 시험을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 AD 또는 MCI를 앓고 있는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 글루타미닐 사이클라제 (QC)의 양이 정상적인 (즉, 건강한) 대조 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 QC의 양에 비해 증가한다는 발견을 기초로 한다. QC의 양이 이들 신경학적 질환과 정상적인 대조군 사이에서 상이하다는 증거는 대상체에서 AD, MCI 또는 NDS를 진단하기 위한 시험의 개발을 위한 근거를 형성한다. 그 리하여, 환자 샘플에서 QC의 양을 측정함으로써 본 발명의 AD, MCI 또는 NDS를 진단하는 방법은 이들 신경변성 질환을 앓고 있는 환자에 대한 현행의 임상적 진단 평가를 크게 개선시킬 것이다.

정상적인 대조군의 경우와 비교하여 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내에 존재하는 QC의 양에 있어서의 새로 발견된 차이를 기초로 하여, QC의 양의 강력한 상관관계는 신경변성 질환의 추정되는 진단으로 이루어질 수 있다. 대조 샘플에 비해서 QC의 양에 있어서의 통계학적으로 유의적인 증가는 환자가 AD, NDS 또는 MCI를 갖는다는 것을 합리적으로 예견하는 것이다. 정상적인 연령-부합된 집단으로부터 단리된 대조 QC 샘플의 특징적인 QC의 양에 의해서 결정된 것으로서 QC의 정상적인 양은 환자가 AD, MCI 또는 NDS와 같은 신경변성 질환을 갖지 않음을 나타낸다. 정상적인 대조군에 비해 생물학적 샘플 내에서 QC의 증가하거나 감소한 양에 근거한 신경변성 질환의 양성 지표는 일반적으로 특정한 질환의 최종적인 결정을 하는데 있어서 다른 인자들과 함께 고려된다. 따라서, 시험하는 대상체의 증가하거나 감소한 QC 레벨은 통상적으로 신경변성 질환의 결정적 진단을 내리는데 있어서 AD, MCI 또는 NDS-관련된 상태의 인정되는 다른 임상적 증상과 함께 고려될 것이다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 관점에 따르면

(a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내에서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;

(b) 생물학적 샘플 내의 QC의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC의 양은 AD 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,

대상체에서 추정되는 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 생물학적 샘플은 혈청, 혈장, 뇨 또는 뇌척수액과 같은 체액 샘플이다. 더욱 바람직하게는, 체액 샘플은 혈장이다.

본 발명의 추가의 구체예에 따르면, QC의 양은 QC 단백질 레벨 또는 QC mRNA 레벨을 기초로 하여 검출된다.

대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서 검출되거나 정량된 QC의 양은 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서나 성취될 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어, 면역비탁시험, 면역형광, 면역확산, 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 웨스턴 블럿 (Western Blot), 단백질 활성시험, 또는 QC mRNA 레벨의 결정을 위해서는 노던 블럿 (Northern Blot) 또는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 분석, 예를 들어, 실시간 PCR에 의한 것이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한 유용한 것은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량분석법 (MS) 및 가스 크로마토그래피 (GC) 뿐만 아니라 가스 크로마토그래피-질량분석법 (GC-MS), 액체 크로마토그래피-질량분석법 (LC-MS) 및 액체-크로마토그래피-탠덤 질량분석법 (LC-MS/MS) 시스템을 포함한 이들의 다양한 배치이다.

바람직하게는, 생물학적 샘플 내의 QC의 양은 면역학적 검정 형식에서 QC에 결합하는 항체를 사용하여 검출된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면

(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고;

(b) 상기 생물학적 샘플을 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체와 접촉시키고;

(c) 항체와 QC가 면역 컴플렉스를 형성하도록 허용하고;

(d) 상기 생물학적 샘플 내의 QC의 양의 지표로서 형성된 면역 컴플렉스의 양을 검출하고;

(e) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하며, 여기에서, 정상 대조군에 비해 증가 또는 감소한 검출된 양은 신경변성 질환의 양성 지표인 것을 포함하여, 대상체에서 신경변성 질환을 진단하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 추가의 관점에 따르면, QC에 결합하는 항체 및 정상 대조군의 특징적인 QC의 양의 설정된 표준을 포함하는 것으로, 대상체가 신경변성 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하기 위한 진단 키트가 제공된다.

도 1: 도 1(a)는 정량적 RT-PCR을 이용한 QC 전사물 레벨의 분석을 나타낸다. 인간 뇌 신피질 샘플 (브로드만 (Brodmann) 영역 22)로부터의 전체 RNA를 지시된 바와 같은 상이한 브라크 (Braak) 단계의 정상적으로 노화된 AD 뇌로부터 단리하였다. QC 전사물 레벨은 하우스키핑 (house-keeping) 전사물 농도에 대해 표준화하였다. 도 1(b)는 QC mRNA 분석을 위해서 사용된 것과 동일한 증례 및 뇌 부분으로부터의 QC에 대한 웨스턴-블럿 분석을 나타낸다. 가용성 단백질의 추출은 조직 중량에 대해서 표준화하였다. 도 1(c)는 인간 뇌 신피질 샘플의 SDS- 및 포름산 추출물의 ELISA 분석을 이용한 동일한 증례 및 뇌 부분으로부터의 Aβ N3(pE)-42 (Aβ₃₍ _pE _)-42) 및 Aβ 1-42 (Aβ_1-42) 농도의 정량화를 나타낸다. Aβ 1-42 펩타이드에서의 훨씬 더 온화한 증가에 비해 초기 AD 단계에서의 Aβ N3(pE)-42 펩타이드의 활발한 증가를 주목하여야 한다. 도 1(d)는 정상적으로 노화한 대상체 및 다양한 AD 단계로부터의 브로드만 영역 22에서 항체 4G8에 의한 총 Aβ 펩타이드, 및 Aβ N3(pE)-42 펩타이드의 면역조직화학적 검출을 나타낸다. 희박한 Aβ 플라크가 정상 노화군에서 검출되었지만, 이들 침착물은 Aβ N3(pE)-42 면역반응성이 없다. 그러나, 모든 AD 단계에서 Aβ 플라크의 대부분은 Aβ N3(pE)-42 펩타이드를 함유한다.
도 2는 자극된 THP-1 세포에서 QC 및 CCL2의 유전자 발현율의 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 THP-1 세포의 조절 배지 내에서 특이적 QC 활성의 측정 결과를 나타낸다.
아밀로이드 펩타이드 및 케모킨의 서열

발명의 구체예의 설명

본 발명은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 QC의 양을 직접적으로 검출하고, QC의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC의 양과 비교함으로써 신경변성 질환을 진단하기 위한 효율적이고 빠른 시험관내 방법을 제공한다. 대상체의 생물학적 샘플에서 QC의 증가된 양은 AD 또는 MCI 또는 NDS의 양성 지표이다. 따라서, 본 발명에 기술된 바와 같이, QC는 정상 대조군에 비해 AD, NDS 또는 MCI 환자의 생물학적 샘플에서 일관되게 상당히 증가하는 것이 입증되었다. 그리하여, 환자 샘플에서 QC의 양을 검출 또는 정량화함으로써 AD, MCI 또는 NDS를 진단하는 본 발명의 방법은 이들 신경변성 질환을 앓고 있는 환자에 대한 현행 임상적 진단 평가를 크게 개선시킬 것이다.

따라서, 생물학적 마커로서 QC를 사용하여 대상체가 AD, MCI 또는 NDS를 앓고 있는지 여부를 평가하는 방법이 제공된다.

글루타미닐 사이클라제 또는 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제 (QC, EC 2.3.2.5)는 암모니아의 유리 하에서 N-말단 글루타미닐 잔기의 피로글루탐산 (5-옥소-프롤린, pGu*)으로의 분자내 폐환, 및 물의 유리 하에서 N-말단 글루타밀 잔기의 피로글루탐산으로의 분자내 폐환을 촉진시킨다.

QC는 1963년에 열대식물인 카리카 파파야 (Carica papaya)의 라텍스로부터 메서 (Messer)에 의해서 최초로 분리되었다 [Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299]. 24년 후에 상응하는 효소적 활성이 동물 뇌하수체에서 발견되었다 [Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. and Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632]. 포유동물 QC의 경우에, QC에 의한 Gln의 pGlu로의 전환은 TRH 및 GnRH의 전구체에 대해서 볼 수 있었다 [Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. and Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632]. 또한, QC의 초기 국재화 실험은 소 시상하부하수체로에서 촉매작용에 의한 그의 추정적 생성물과의 공동-국재화로 펩타이드 호르몬 성숙에서의 제안된 기능을 더 개선하는 것을 밝혀내었다 [Bockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453]. 반대로, 식물 QC의 생리학적 기능은 덜 명백하다. 카리카 파파야로부터의 효소의 경우에는 병원성 미생물에 대한 식물 방어체계에서의 역할이 제안되었다 [E1 Moussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570]. 다른 식물로부터의 추정적 QC는 최근에 서열 비교에 의해서 확인되었다 [Dahl, S. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36]. 그러나, 이들 효소의 생리학적 기능은 아직 불명확하다.

식물 및 동물로부터 공지된 QC는 기질의 N-말단 위치에서의 L-글루타민에 대한 철저한 특이성을 나타내며, 이들의 역학적 행동은 미카엘리스-멘텐 방정식 (Michaelis-Menten equation)에 따르는 것으로 확인되었다 [Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. et al. 1998 Anal Biochem 175, 131-138; Gololobov, M. Y. et al. 1996 Bio Chem Hoppe Seyler 377, 3950398]. 그러나, 카리카 파파야로부터 유래하는 QC의 일차 구조와 포유동물로부터 유래하는 고도로 보존된 QC의 일차 구조의 비교는 어떠한 서열 상동성도 나타내지 않았다 [Dahl, S. W. et al. (2000) Protein Expr Purif 20, 27-36]. 식물 QC는 새로운 효소 패밀리에 속하는 것으로 보이는 반면에 [Dahl, S. W. et al. (2000) Protein Expr Purif 20, 27-36], 포유동물 QC는 박테리아 아미노펩티다제에 대해서 현저한 서열 상동성을 갖는 것으로 확인되었으며 [Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250], 이것은 식물 및 동물로부터의 QC가 상이한 진화적 기원을 갖는다는 결론을 유도한다.

고스트라노바 (Gostranova) 등은 글루타미닐 사이클라제 활성이 다발성 경화증 환자 및 대조군에서 뇌척수액의 특징적 세부 특징인 것을 발견하였다 [Gostranova et al., Clin Chim Acta. 2008 389 (1-2), pp. 152-159].

QC의 다양한 이소형태인 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제-유사 단백질 (QPCTLs)이 관찰되었다 [WO 2008/034891]. 이들 신규의 단백질, 예를 들어, 인간으로부터의 QPCTL (isoQC로 또한 명명함) (GenBank 수탁번호 MM-017659)은 글루타미닐 사이클라제에 대해서 상당한 서열 유사성을 갖는다.

QC 또는 인간 이소QC와 같은 단백질의 다수의 이소형태는 또한 선택적 RNA 스플리싱 (alternative RNA splicing), 해독-후 단백분해적 처리 및 세포 타입-특이적 글리코실화를 포함한 다양한 기전에 의해서 단일 유전자로부터 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "글루타미닐 사이클라제", "QC" 및 "이소QC"는 그의 천연적 형태인 QC 뿐만 아니라 그의 모든 이소형태를 나타낸다.

본 발명의 사용에 바람직한 것은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 및 5의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 인간 QC 또는 그의 이소형태이다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 더욱 바람직한 것은 SEQ ID NO. 2, 또는 더 더욱 바람직한 것은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 인간 QPCTL이다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 더 더욱 바람직한 것은 SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 인간 QPCTL의 스플리스 형태 (splice form)이다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 가장 바람직한 것은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 QC이다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 관점에 따르면

(a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;

(b) 생물학적 샘플 내의 QC의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC의 양은 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,

생물학적 샘플 내의 QC의 증가된 양은 예를 들어, Aβ N3pE-42 및/또는 Aβ N3pE-40 및/또는 Aβ N3pE-38과 같은 N-말단적으로 절단되고 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 펩타이드의 증가된 양과 상관관계가 있을 수 있다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해서 입증되었다.

따라서, 본 발명의 추가의 관점에 따르면

(b) Aβ N3pE-X의 양을 더 검출하고;

(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 Aβ N3pE-X의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 Aβ N3pE-X의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC 및 Aβ N3pE-X의 양은 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표이며, 또한 X는 38, 40 및 42로부터 선택된 정수인 것을 포함하여,

바람직한 구체예에서, X는 42이다.

추가의 바람직한 구체예에서, X는 40이다.

또한 바람직한 구체예에서, X는 38이다.

추가로 바람직한 것은 N-말단적으로 절단되고 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드의 단일 형태뿐만 아니라 Aβ N3pE-42 및/또는 Aβ N3pE-40 및/또는 Aβ N3pE-38의 조합도 QC와 함께 검출되는 방법이다.

추가로 바람직한 것은 N-말단적으로 절단되고 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드의 단일 형태뿐만 아니라 Aβ N3pE-42 및/또는 Aβ N3pE-40 및/또는 Aβ N3pE-38 및/또는 pGluABri 또는 pGluADan과 같은 가족형 알츠하이머 치매에서 나타나는 펩타이드의 조합도 QC와 함께 검출되는 방법이다.

"pGlu-Aβ" 또는 "Aβ N3pE"는 Aβ의 아미노산 서열 내의 3 위치에서의 글루탐산 잔기에서 시작하며, 여기에서 상기 글루탐산 잔기는 폐환되어 피로글루탐산 잔기를 형성하는 Aβ의 N-말단적으로 절단된 형태를 나타낸다. 특히, 본 발명에서 사용된 것으로서 pGlu-Aβ는 pGlu-Aβ 3-38, pGlu-Aβ 3-40, pGlu-Aβ 3-42를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 아밀로이드 병리학에 수반되거나 그와 연관된 단편을 의미한다.

생물학적 샘플 내의 QC의 증가된 양은 예를 들어, CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 및 프랙트알카인과 같은 케모킨의 증가된 양과 상관관계가 있을 수 있다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해서 추가로 입증되었다.

따라서, 본 발명의 추가의 관점에 따르면

(b) 케모킨의 양을 더 검출하고;

(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 케모킨의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 케모킨의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 QC 및 케모킨의 증가한 양은 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,

대상체에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 방법이 제공된다.

바람직한 구체예에서, 상기 케모킨은 포유동물 기원의 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 케모킨은 인간 케모킨이다. 가장 바람직하게는, 상기 케모킨은 인간 CCL2이다.

추가의 바람직한 구체예에서, 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 상술한 방법 중의 어느 것이라도 또한 시험관내로의 대상체의 생물학적 샘플 내에서 수행될 수 있다.

용어 "대상체"는 AD, MCI 또는 NDS와 같은 신경변성 질환을 앓고 있거나, 앓고 있는 것으로 의심되는 포유동물을 나타낸다. 바람직하게는, "대상체"는 인간을 나타낸다.

용어 "생물학적 샘플"은 말초혈액, 혈장, 림프구, 뇌척수액, 뇨, 타액, 상피, 섬유아세포, 또는 QC 단백질을 포함하는 어떤 다른 샘플을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 생물학적 샘플의 모든 공급원을 나타낸다.

바람직한 구체예에서, QC의 양은 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득된 체액 샘플에서 검출된다. 용어 "체액"은 QC를 포함하는 혈액, 림프, 뇨 및 뇌척수액 (CSF)을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 인체에 존재하는 모든 유체를 나타낸다. 혈액 샘플은 혈장 샘플 또는 혈청 샘플, 또는 이들 샘플로부터 유도된 분획을 포함할 수 있다. 샘플은 사용하기 전에, 혈액으로부터 혈장을 제조하거나, 점성 유체를 희석하는 등과 같이 처리할 수 있다. 바람직하게는, 혈장 샘플은 EDTA와 같은 항응고제로 처리된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, QC의 양은 대상체로부터 채취된 혈액 샘플, 더욱 바람직하게는 혈장 샘플 내에서 검출된다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하고; 혈장 샘플 내의 QC의 양을 검출하고; 혈장 샘플 내의 QC의 검출된 양을 정상 대조군으로부터 수득한 혈장 샘플 내의 QC의 양을 비교하는 단계를 포함하는 상술한 바와 같은 방법에 관한 것이며, 이에 의해 정상 대조군에 비해 증가된 QC의 양은 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표이다. QC의 증가된 양은 AD, NDS 및 MCI와 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이들의 진단을 도와주는데 유용하다.

QC (또는 그의 이소형태)의 "증가한 양"은 대상체의 샘플에서 검출된 QC의 양이 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 실험 오차의 범위를 넘어서 정상 대조군의 특징적인 QC의 평균량보다 더 큰 것을 의미한다. 바람직하게는, 대상체의 샘플에서 검출된 QC의 양은 정상 대조군의 특징적인 QC의 상기한 평균량보다 10% 더 크다. 더욱 바람직하게는, 대상체의 샘플에서 검출된 QC (또는 그의 이소형태)의 양은 정상 대조군의 특징적인 QC의 상기한 평균량보다 25% 더 크거나, 더 더욱 바람직하게는 50% 또는 75% 더 크다. 가장 바람직하게는, 대상체의 샘플에서 검출된 QC (또는 그의 이소형태)의 양은 정상 대조군의 특징적인 QC의 상기한 평균량보다 몇 배 더 크며, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 배수만큼 더 크다.

"정상 대조군"은 대상체로부터 수득된 동일한 타입의 생물학적 샘플, 예를 들어, 적어도 하나의 정상적인 연령-부합된 대조군으로부터, 또는 또 다른 시점에 환자로부터 수득된 것이다. 구체예에서, 정상 대조군은 더 초기에 환자로부터 채취된 것이다. 정상적인 연령-부합된 집단으로부터의 정상적인 대저 샘플은 그의 가족에게서 AD, MCI 또는 NDS의 병력이 없는 건강한 연령 부합된 대조군의 적절한 집단 샘플로부터 단리되어야 한다. 예를 들어, 적절한 대조 집단 샘플 크기에 의해서 결정되는 바와 같은 QC의 대조 레벨보다 더 큰 혈장 QC 레벨은 AD, NDS 또는 MCI의 지표이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 진단할 대상체로부터의 샘플이 정상적인 연령-부합된 대조군에 대비하여 평가되며, 대상체의 단백질 샘플 내의 QC의 양에 있어서의 상당한 증가 또는 감소는 소정의 시험에서 사용된 대조군에 대한 비교를 기초로 하여 결정된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 추가의 구체예에 따르면, QC 또는 그의 이소형태의 양은 상기 QC 또는 그의 이소형태의 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨을 기초로 하여 검출된다.

대상체의 생물학적 샘플 내에서 검출되거나 정량된 QC의 양은 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서나 성취될 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어, 면역비탁시험, 면역형광, 면역확산, 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 웨스턴 블럿, 단백질 활성시험, 또는 QC mRNA 레벨의 결정을 위해서는 노던 블럿 또는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 분석, 예를 들어, 실시간 PCR에 의한 것이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한 유용한 것은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량분석법 (MS) 및 가스 크로마토그래피 (GC) 뿐만 아니라, 몇 가지 예를 들어 가스 크로마토그래피-질량분석법 (GC-MS), 액체 크로마토그래피-질량분석법 (LC-MS) 및 액체-크로마토그래피-탠덤 질량분석법 (LC-MS/MS) 시스템을 포함한 이들의 다양한 배치이다.

QC의 검출은 펩타이드를 검출하기 위한 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 성취될 수 있지만, 항체, 항체 단편, 재조합 항체 등을 사용하는 면역학적 검출기술을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, QC의 이러한 검출은 QC 또는 그의 이소형태에 특이적으로 결합하여 면역 컴플렉스를 형성하는 항체뿐만 아니라 면역 컴플렉스의 형성을 검출하는 시약의 사용을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 하나 또는 그 이상의 항체를 이용하는 특히 적합한 검출기술에는 면역비탁시험, 면역형광, 면역확산, ELISA, RIA 등이 포함된다.

이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 재검토를 위해서는 할로우 (Harlow)와 레인 (Lane) [Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988] 및 옐톤 (Yelton) 등 [Yelton D. E. and Scharff M. D. Monoclonal Antibodies: a powerful new tool in biology and medicine. Ann. Rev. Biochem. 50:657-680, 1981]의 문헌을 참고로 하며, 이들은 모두 본 발명에 참고로 포함된다. 모노클로날 항체에 대해서는 코흘러 (Kohler)와 밀스타인 (Milstein)의 문헌 [Kohler G. and Milstein C, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256:495-497, 1975]을 참고로 하며, 이는 본 발명에 참고로 포함된다. 본 발명의 항체는 어떤 이소타입의 것, 예를 들어, IgG 또는 IgA이며, 폴리클로날 항체는 단일 이소타입 또는 이소타입의 혼합물이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 안티-QC 항체는 모노클로날 항체이다. 안티-QC 항체는 광범하게 상업적으로 이용할 수 있지만, 본 발명에 기술된 다양한 면역학적 검정에서 사용하기 위한 항체는 표준 방법에 따라 생산될 수 있다.

추가로, 모노클로날 안티-QC 항체는 그의 천연 형태인 QC 뿐만 아니라 그의 이소형태 중의 어떤 것이라도 인식할 수 있다. 따라서, 그의 이소형태를 포함한 QC를 특이적으로 인식하는 어떤 모노클로날 항체라도 QC의 정량화를 위한 상기 방법에서 사용될 수 있다.

바람직한 것은 QC를 특이적으로 인식하지만, QC의 이소형태와의 교차반응성은 낮거나 더욱 바람직하게는 교차반응성이 없는 모노클로날 항체이다. 대신으로 바람직한 것은 QC의 특정한 이소형태를 특이적으로 인식하지만, QC와의 교차반응성은 낮거나 더욱 바람직하게는 교차반응성이 없는 모노클로날 항체이다.

적합한 안티-QC 항체는 예를 들어, 아브노바 (Abnova, Taipei City, Taiwan)로부터 상업적으로 이용할 수 있는 것, 예를 들어, 마우스 폴리클로날 항체 (Cat. #H00025797-B01P) 및 토끼 폴리클로날 항체 (Cat. #H00025797-D01P)이다.

적합한 안티-QPCTL 항체는 예를 들어, 아브노바로부터 상업적으로 이용할 수 있는 마우스 폴리클로날 항체 (Abnova, Taipei City, Taiwan, Cat. #H00054814-B01P)이다.

Fab, F(ab)₂, ssFv (단일쇄 가변 단편), 및 항체의 가변 부분을 보유하는 그 밖의 다른 항체-유사 구조물과 같은 이들 모노클로날 항체로부터 유도된 단편도 이들이 원래의 결합특성을 보유한다면 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 단편은 통상적으로, 예를 들어, 파파인, 펩신 또는 다른 프로테아제에 의한 항체의 효소적 분해에 의해서 생성된다. 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 다양한 용도를 위해서 변형될 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 재조합체, 예를 들어, 키메릭 (예를 들어, 인간 불변 부분과 결합된 쥐 기원의 가변 부분에 의해서 구성됨), 인간화 (동물, 예를 들어, 쥐 기원의 고가변 부분과 함께 인간 면역글로불린 불변 골격), 및/또는 단일쇄 항체일 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 QC 또는 그의 이소형태에 대해 특이적인 항체는 적절한 라벨에 의해서 표지되고, 라벨의 존재를 기초로 하여 생물학적 샘플 내에서 확인될 수 있다. 라벨은 이것이 QC에 결합되는 경우에 항체의 검출을 허용한다. 라벨의 예로는 방사성 동위원소 (예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광성 라벨 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타니드 인광체), 발광성 라벨, 효소 라벨 (예를 들어, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼라인 포스파타제), 화학발광체, 및 비오티닐 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

상기 논의된 항체를 컨쥬게이트하거나 표지하는 방법은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 수행될 수 있다 [참조: 예를 들어, Inman, "Methods in Enzymology", Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; 및 Wilchek and Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem. 171:1-32, 1988].

진단적 이용의 경우에, 안티-QC 항체는 유리 상태이거나 튜브 (tube), 비드 (bead) 또는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 어떤 다른 지지체와 같은 고체 지지체 상에 고정화된다. 고정화는 직접 또는 간접적인 방법을 사용하여 달성된다. "직접적 방법"에는 수동 흡착 (비-공유적 결합) 또는 지지체와 시약 사이의 공유적 결합이 포함된다. "간접적 방법"이란 시약과 상호작용하는 항-시약 화합물을 우선 고체 지지체에 부착시키는 것을 의미한다. 간접적 방법은 또한 예를 들어, 비타민과 같은 분자가 고체상에 고정화된 시약 및 상응하는 수용체 상에 그래프트되는 경우의 리간드-수용체 시스템을 이용할 수 있다. 이것은 비오틴-스트렙타비딘 시스템으로 설명된다.

본 기술분야에서 숙련된 전문가는 면역 컴플렉스가 생물학적 샘플 내의 QC와 항체 사이에서 형성되며, 비결합된 물질은 어떤 것이라도 컴플렉스를 검출하기 전에 제거된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 혈액, 혈장, 림프구, 뇌척수액, 뇨, 타액, 상피 및 섬유아세포와 같은 생물학적 샘플 내의 QC의 양을 정량화하기 위해서 사용되는 것으로 이해된다.

본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 이러한 항체 결합의 측정은 면역비탁시험 (응집반응), 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA) 및 방사선면역측정법 (RIA)를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 매우 다양한 면역학적 검정 형식을 사용하여 수행될 수 있다 [참조: 예를 들어, "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, N. Y. 및 Ausubel et al. (eds) (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N. Y.; 이들은 둘 다 본 발명에 참고로 포함된다]. 검출은 비색법 또는 방사성 방법, 또는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 다른 통상적인 모든 방법에 의해서 수행될 수 있다. 본 기술분야에서 공지된 다른 표준 기술은 이들의 내용이 본 발명에 참고로 포함된 문헌 ["Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, New York 1980 and Campbell et al.; "Methods of Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; 미국 특허 제4,366,241; 4,376,110; 4,517288; 및 4,837168호]에 기술되어 있다. 일반적 면역학적 검정의 재검토를 위해서는 또한 문헌 ["Methods In Cell Biology", Vol. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); "Basic And Clinical Immunology" 7^th Edition, Stites & Terr, eds. (1991)]을 참고로 한다.

QC를 검출하는 이러한 시험방법은 본 기술분야에서 설명된 바와 같은 직접적, 간접적, 경쟁적 또는 비경쟁적 면역학적 검정방법일 수 있다 [참조: 예를 들어, "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, N. Y.; Ausubel et al. (eds) (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N. Y.; 및 Oellirich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904, 본 발명에 참고로 포함된다].

비경쟁적 면역학적 검정방법은 QC의 양을 직접적으로 검출하는 시험방법이다. "샌드위치 (sandwich)" 시험방법에서는, 예를 들어, 안티-QC 항체를 이들이 고정화되는 고체 기질에 직접적으로 결합시킬 수 있다. 그 후, 이들 고정화된 항체는 생물학적 샘플 내에 존재하는 QC를 포획한다. 이렇게 고정화된 QC는 라벨을 갖는 제2 인간 QC 항체와 같은 표지물질에 의해서 결합된다.

경쟁적 면역학적 검정방법에서는, 생물학적 샘플 내에 존재하는 항원의 양이 샘플에 표지된 항원의 기지의 양을 첨가하고, 항체와 결합된 표지된 항원의 양을 검출함으로써 간접적으로 측정된다. 예를 들어, 이 경우에는 표지된 QC의 기지의 양을 생물학적 샘플에 첨가한 다음에, 샘플을 항-QC 항체와 접촉시킨다. 항-QC 항체에 결합된 표지된 QC의 양은 생물학적 샘플 내의 QC의 농도에 반비례한다. 이것은 검출된 표지된 QC의 양이 크면 클수록 더 적은 양의 QC가 표지된 QC와 경쟁하기 위하여 생물학적 샘플 내에서 이용될 수 있었기 때문이다.

대상체에서 AD, MCI 또는 NDS를 진단하는 시험을 수행하기 위한 진단 키트가 또한 제공된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은, QC 및 그의 이소형태에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체뿐만 아니라 항체-QC 결합 면역 컴플렉스의 검출에 필요한 시약을 포함하는 진단 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 키트는 QC 및 그의 이소형태를 특이적으로 인식하는 단일 항체를 포함한다. 다른 한편으로, 키트는 QC 및 그의 이소형태를 특이적으로 인식하는 일차 항체에 더하여 시그날-생산 라벨과 컨쥬게이트하고 일차 항체에, 또는 일차 항체가 결합하는 위치와는 다른 부위에서 결합할 수 있는 이차 항체를 포함할 수 있다. 이차 항체에 결합된 시그날-생산 라벨은 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제와 같은 효소일 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 키트는 완충제, 고체 지지체, 용액 등과 같이 시험을 수행하기 위한 다른 시약을 더 포함할 수 있다. 키트는 또한, 진단 시험에서 하나 또는 그 이상의 항체를 사용하여 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 함유할 수 있다.

실시예

실시예 1: 생체내에서 Aβ N3pE -42의 형성 및 QC 발현

광범한 QC 분포는 해마 및 피질에서 상당량의 발현과 함께 포유동물 뇌에서 검출되었다. AD에서의 QC 발현이 Aβ N3pE-42의 생성과 상관관계가 있을 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, QC mRNA 및 단백질 농도를 사후 인간 뇌 신피질 샘플에서 분석하였다 (도 1a, b). 흥미롭게도, 본 발명자들은 정상 노화군에 비해 AD 뇌 샘플에서 QC mRNA 및 단백질의 상향조절을 발견하였다. 더구나, Aβ N3pE-42의 상당한 농도가 비-치매 개체와는 달리 AD 환자로부터의 샘플에서 검출되었으며, 이것은 Aβ N3pE-42의 생성에 있어서의 QC의 역할을 뒷받침한다 (도 1c). 다른 한편으로, ELISA 분석은 정상적으로 노화된 대조 대상체에서 높은 Aβ x-42 농도 및 초기 AD 단계에서 훨씬 더 작은 증가를 밝혀내었다 (도 1c). 이러한 관찰결과는 총 Aβ (4G8) 또는 특이적으로 Aβ N3pE-42를 검출하는 항체를 이용하는 면역조직화학에 의해서 확증되었다 (도 1d). Aβ에 대한 뚜렷한 면역반응성은 모든 그룹으로부터의 뇌 절편에서 검출되었다. 반대로, Aβ N3pE-42 염색은 정상적인 노화군에서는 부재하였지만, Aβ N3pE-42-면역반응성 플라크 부하가 거의 전체 Aβ 플라크 밀도만큼 높은 AD 뇌 조직에 대해서는 특이적이었다.

재료 및 방법

인간 뇌 조직

본 연구에서 사용된 모든 증례에 대한 AD의 명확한 진단은 해마 형성 및 신피질 영역에서 신경원섬유 엉킴 및 신경염성 플라크의 존재를 근거로 하였으며, NINDS (National Institue of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke) 및 ADRDA (Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)의 기준을 충족시켰다. 동일한 증례로부터의 피질 조직 (브로드만 영역 22)이 QC mRNA 농도, QC 단백질 및 Aβ N3pE-42의 정량화를 위해서 사용되었다. 전체적으로, 10 대조 증례, 및 브라크 단계 I-II 및 V-VI 각각에 대한 10 AD 증례를 분석하였다. 그룹들은 성별 및 연령에 대해 부합시켰다 (대조군: 평균 72세±6.6세; AD I-II: 평균 73세±3.1세; AD V-VI: 평균 77세±6.6세). 평균 사후 간격 (PMI)은 그룹들 사이에서 유사하였으며, 26 내지 96 시간의 범위였다. PMI의 기간은 웨스턴 블럿 분석에 의한 QC의 검출에도 ELISA에 의한 Aβ의 정량화에도 관련이 없었다. qRT-PCR에 의한 QC mRNA 검출의 경우에는 PMI가 48 시간 이하인 조직 샘플만이 포함되었다.

QC mRNA 정량화 및 QC 웨스턴 블럿 분석

조직 샘플은 1.4 ㎜ 세라믹 비드를 갖는 균질화기 퍼셀리스 (Percellys)를 이용하여 균질화시켰다 (5000 rpm, 30 sec, peqlab). RNA는 제조자의 설명서에 따라 뉴클레오스핀 (NucleoSpin) RNA II 키트 (Macherey Nagel)를 사용하여 단리되었다. 일정한 100 ng의 RNA를 랜덤 프라이머 (Roche) 및 슈퍼스크립트 (Superscript) II (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 실시간 PCR은 QPCT를 위한 콴티텍트 프라이머 에세이 (QuantiTect Primer Assay)(QT00013881, Qiagen)와 더불어 콴티텍트 (QuantiTect) SYBR 그린 (Green) RT-PCT 키트 (Qiagen)를 사용하는 로토젠3000 (Rotorgene3000) (Corbett Research) 내에서 수행되었다. QC의 절대량은 외부 QC 표준 DNA (pcDNA3 벡터 내에 클로닝된 전체 길이 QC)의 6 개의 희석액을 이중으로 사용하여 측정되었다. PCR의 확인을 위해서, 생성물 용융 곡선을 생성시켰으며, 단일 앰플리콘 (amplicon)은 아가로즈 겔 전기영동에 의해서 확인되었다. 절대량은 정량화 모드의 로토젠 (Rotorgene) 소프트웨어 버전 4.6으로 측정하였다. 표준화는 2 개의 가장 안정적으로 발현된 하우스키핑 유전자 HPRT 및 GAPDH (geNorm)에 대해서 수행되었다. 웨스턴-블럿 분석을 위해서, 뇌 샘플 (50 ㎎)을 10 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.5% 트리톤 X-100 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 (1 ㎖) 중에서 균질화시켰다. 조직은 다운스 (Downs)-균질화기 내에서 몇 번의 작동시킴으로써 균질화시키고, 3×10s의 초음파 쇼크에 적용하였다. 생성된 균질물을 20000×g에서 25 분 동안 원심분리시킴으로써 청정화하였다. 각각의 샘플의 총 12 ㎍ 단백질을 트리스-글리신 SDS-PAGE에서 분리시켰다. QC는 재조합 인간 QC에 대해 야기된, 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 검출되었다. 가시화를 위해서, 블럿 막을 5% (w/v) 분유를 함유하는 TBS-T 중에서 호스래디쉬 퍼옥시다제와 컨쥬게이트된 이차 항체 (Cell Signaling)와 함께 배양하고, 이어서 제조자의 프로토콜에 따라 슈퍼시그날 웨스트 피코 시스템 (SuperSignal West Pico System; Pierce)을 사용하여 발현시켰다.

실시예 2: 자극된 THP -1 세포에서 QC 및 CCL2 의 유전자 발현율의 측정

인간 단핵구성 백혈병 세포주 THP-1 세포를 5% CO₂ 및 95% 공기 가습 대기 하에 37℃에서 10% FCS (=FBS, 태자 소혈청 (Invitrogen)) 및 60 ㎍/㎖ 겐타마이신 (Invitrogen)을 함유하는 RPMI-1640 (Rosewell Park Memorial Institute Medium 1640 (Invitrogen)) 중에서 현탁 (5×10⁵ 세포/㎖ 배지) 배양하였다.

QC 및 CCL2의 자극효과를 조사하기 위해서, 2×10⁶ 세포를 24 웰 플레이트 (Greiner) 내에서 다양한 농도의 리포폴리사카라이드 (LPS; Sigma)를 함유하는 FCS가 없는 1 ㎖ 배양 배지 내에 접종하였다. 24 시간 배양 후에, 배지를 원심분리 (5 분, 300×g)에 의해서 세포로부터 제거하였다.

RNA 분리는 뉴클레오-스핀 (Nucleo-Spin®) RNA II 키트 (Macherey & Nagel)를 사용하여 수행하고, 이어서 RNA 농도를 측정하였다. 인비트로겐 (Invitrogen)으로부터의 슈퍼스크립트 (SuperScript™) II 역전사효소 키트 (Reverse Transcriptase Kit)를 사용하여 1 ㎍ RNA를 cDNA로 전사시켰다.

QC 및 CCL2의 유전자 발현율은 실시간 사이클러 (cycler) 로토-젠 (Rotor-Gene™) 3000을 사용한 정량적 PCR을 통해서 측정하였다. 작동 소프트웨어의 비교방법을 사용하여 비자극된 대조군과 비교하여 자극된 프로브의 유전자 발현율의 변화를 나타낼 수 있었다. 표준화는 기준 유전자 (reference gene) YWHAZ (티로신 3-모노옥시게나제/트립토판 5-모노옥시게나제 활성화 단백질)에 대하여 수행되었다. 결과는 도 2에 나타낸다.

실시예 3: THP -1 세포의 조절배지 내에서 특이적 QC 활성의 측정

5×10⁶ THP-1 세포를 25 ㎠ 현탁 플라스크 (Greiner) 내에서 페놀 레드가 없고 FCS를 함유하지 않는 5 ㎖ RPMI-1640 (Invitrogen) 내에 접종하고, 다양한 농도의 LPS (Sigma)로 자극하였다. 37℃ 및 5% CO₂ 하에서 24 시간 배양한 후에, 세포를 배지로부터 분리시키고, 배지를 MWCO (분자량 컷오프) 10 kDa의 유-튜브 농축기 (U-Tube™ Concentrators) 6-10 (Merck, Novagen)을 사용하여 원심분리 (4000×g)시킴으로써 250 ㎕의 최종 용적으로 감소시켰다. 브래드포드 (Bradford) 방법에 의한 단백질 농도의 분석을 수행하였다. 특이적 QC 활성의 측정은 사내 (in-house) 확립된 HPLC 방법을 사용하여 실현하였다. 결과는 표 3에 나타낸다.

실시예 4: QC 활성의 측정

형광측정 시험

모든 측정은 30℃에서 마이크로플레이트용 바이오에세이 리더 (BioAssay Reader) HTS-7000Plus (Perkin Elmer)를 사용하여 수행되었다. QC 활성은 H-Gln-bNA를 사용하여 형광측정에 의해 평가하였다. 샘플은 250 ㎕의 최종 용적으로, 20 mM EDTA 및 적절하게 희석된 QC의 분취량을 함유하는 0.2 M 트리스/HCl, pH 8.0 중의 0.2 mM 형광발생 기질, 0.25 U 피로글루타밀 아미노펩티다제 (Unizyme, Horsholm, Denmark)로 구성되었다. 여기/방출 파장은 320/410 ㎚였다. 시험 반응은 글루타미닐 사이클라제의 첨가에 의해서 개시되었다. QC 활성은 시험 조건 하에서 b-나프틸아민의 표준 곡선으로부터 결정되었다. 1 유니트는 기술된 조건 하에서 분당 H-Gln-bNA로부터 1 μmol pGlu-bNA의 형성을 촉진시키는 QC의 양으로 정의된다.

두 번째 형광측정 시험에서, QC 활성은 기질로서 H-Gln-AMC를 사용하여 측정되었다. 반응은 마이크로플레이트용 노보스타 리더 (NOVOStar reader) (BMG labtechnologies)를 이용하여 30℃에서 수행되었다. 샘플은 250 ㎕의 최종 용적으로, 5 mM EDTA 및 적절하게 희석된 QC의 분취량을 함유하는 0.05 M 트리스/HCl, pH 8.0 중의 다양한 농도의 형광발생 기질, 0.1 U 피로글루타밀 아미노펩티다제 (Qiagen)로 구성되었다. 여기/방출 파장은 380/460 ㎚였다. 시험 반응은 글루타미닐 사이클라제의 첨가에 의해서 개시되었다. QC 활성은 시험 조건 하에서 7-아미노-4-메틸쿠마린의 표준 곡선으로부터 결정되었다. 역학적 데이터는 크래핏 (GraFit) 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

QC 의 분광광도 시험

이 시험에서, QC 활성은 보조효소로서 글루타메이트 데하이드로게나제를 이용하여 이전의 불연속적 시험 [Bateman, R.C. 1989 J Neurosci Methods 30, 23-28]을 게조시킴으로써 유도된 연속적 방법을 사용하여 분광광도에 의해서 분석하였다. 샘플은 250 ㎕의 최종 용적으로, 각각의 QC 기질, 0.3 mM NADH, 14 mM a-케토글루타르산 및 30 U/㎖ 글루타메이트 데하이드로게나제로 구성되었다. 반응은 QC의 첨가에 의해서 시작되었으며, 8-15 분 동안 340 ㎚에서 흡광도의 감소를 모니터링함으로써 추적하였다.

초기 속도를 평가하고, 효소 활성은 시험 조건 하에서 암모니아의 표준 곡선으로부터 결정되었다. 모든 샘플은 마이크로플레이트용 스펙트라플루오 플러스 (SPECTRAFluor Plus) 또는 선라이즈 (Sunrise) (둘 다 TECAN으로부터) 리더를 사용하여 30℃에서 측정되었다. 역학적 데이터는 크래핏 (GraFit) 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

<110> Probiodrug AG <120> Glutaminyl cyclase as a diagnostic/prognostic indicator for neurodegenerative diseases <130> IPA100871 <150> US 61/085,154 <151> 2008-07-31 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 361 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gly Gly Arg His Arg Arg Val Val Gly Thr Leu His Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ala Leu Pro Trp Ala Ser Arg Gly Val Ser Pro Ser 20 25 30 Ala Ser Ala Trp Pro Glu Glu Lys Asn Tyr His Gln Pro Ala Ile Leu 35 40 45 Asn Ser Ser Ala Leu Arg Gln Ile Ala Glu Gly Thr Ser Ile Ser Glu 50 55 60 Met Trp Gln Asn Asp Leu Gln Pro Leu Leu Ile Glu Arg Tyr Pro Gly 65 70 75 80 Ser Pro Gly Ser Tyr Ala Ala Arg Gln His Ile Met Gln Arg Ile Gln 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Asp Trp Val Leu Glu Ile Asp Thr Phe Leu Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ile Ile Ser Thr Leu Asn 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Arg His Leu Val Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys 130 135 140 Tyr Phe Ser His Trp Asn Asn Arg Val Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser 145 150 155 160 Ala Val Pro Cys Ala Met Met Leu Glu Leu Ala Arg Ala Leu Asp Lys 165 170 175 Lys Leu Leu Ser Leu Lys Thr Val Ser Asp Ser Lys Pro Asp Leu Ser 180 185 190 Leu Gln Leu Ile Phe Phe Asp Gly Glu Glu Ala Phe Leu His Trp Ser 195 200 205 Pro Gln Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Ala Lys Met Ala 210 215 220 Ser Thr Pro His Pro Pro Gly Ala Arg Gly Thr Ser Gln Leu His Gly 225 230 235 240 Met Asp Leu Leu Val Leu Leu Asp Leu Ile Gly Ala Pro Asn Pro Thr 245 250 255 Phe Pro Asn Phe Phe Pro Asn Ser Ala Arg Trp Phe Glu Arg Leu Gln 260 265 270 Ala Ile Glu His Glu Leu His Glu Leu Gly Leu Leu Lys Asp His Ser 275 280 285 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Gln Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly Val Ile Gln 290 295 300 Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu 305 310 315 320 Ile Pro Ser Pro Phe Pro Glu Val Trp His Thr Met Asp Asp Asn Glu 325 330 335 Glu Asn Leu Asp Glu Ser Thr Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ile Leu Gln 340 345 350 Val Phe Val Leu Glu Tyr Leu His Leu 355 360 <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg 1 5 10 15 Gly Leu Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg 20 25 30 Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe 35 40 45 Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu 50 55 60 Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg 65 70 75 80 Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr 85 90 95 Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn 100 105 110 Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala 115 120 125 Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly 130 135 140 Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala 145 150 155 160 Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala 180 185 190 Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala 195 200 205 Lys Lys Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly 210 215 220 Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser 225 230 235 240 Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro 245 250 255 Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly 260 265 270 Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp 275 280 285 Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu 290 295 300 Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro 305 310 315 320 Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val 325 330 335 Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr 340 345 350 Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu 355 360 365 Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380 <210> 3 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr 20 25 30 Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg 35 40 45 Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg 50 55 60 Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80 Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln 85 90 95 Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp 100 105 110 His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val 115 120 125 Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His 130 135 140 Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser 145 150 155 160 Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu 165 170 175 Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys 180 185 190 Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu 195 200 205 Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His 210 215 220 Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg 225 230 235 240 Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro 245 250 255 Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His 260 265 270 Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln 275 280 285 Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly 290 295 300 Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val 305 310 315 320 Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala 325 330 335 Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg 340 345 350 Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 355 360 <210> 4 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Trp Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser Gly 50 55 60 Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val 65 70 75 80 Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg Arg Val Val Gly 85 90 95 Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu 100 105 110 Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe 115 120 125 Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp His Val Glu Leu 130 135 140 Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val Asp Phe Gly Asn 145 150 155 160 Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His Leu Thr Leu Ala 165 170 175 Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser Thr Pro Phe Val 180 185 190 Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ala 195 200 205 Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys Gln Ala Ala Pro 210 215 220 Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu 225 230 235 240 Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Leu 245 250 255 Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile 260 265 270 Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe 275 280 285 Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg Ser 290 295 300 Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro Gln 305 310 315 320 Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu Asp 325 330 335 Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu Ile 340 345 350 Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu Val 355 360 365 Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala Val 370 375 380 Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val Glu 385 390 395 400 Arg Thr Val Arg Glu Lys Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln Ala 405 410 415 Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser Leu 420 425 430 Cys Tyr Asn Trp Lys Thr Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys His 435 440 445 Pro Ser Arg Thr Gly Lys Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser Gln Arg Asn 450 455 460 Lys Asn Leu Leu Pro Pro Gln Arg Thr Leu Gly Pro Lys Val Cys Arg 465 470 475 480 Asp <210> 5 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu 20 25 30 Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser 35 40 45 Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu 50 55 60 Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu 65 70 75 80 Ala Arg Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp 85 90 95 Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro 100 105 110 Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu 115 120 125 Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser 130 135 140 Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His 145 150 155 160 Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu 165 170 175 Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg 180 185 190 Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His 195 200 205 Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln 210 215 220 Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu 225 230 235 240 Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala 245 250 255 Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr 260 265 270 Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu 275 280 285 Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val Glu Arg Thr Val Arg Glu Lys 290 295 300 Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu 305 310 315 320 Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser Leu Cys Tyr Asn Trp Lys Thr 325 330 335 Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys His Pro Ser Arg Thr Gly Lys 340 345 350 Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser 355 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val 35 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly 35 <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala 1 5 10 15 Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser Arg Thr Val Lys Lys Asn Ile Ile Glu 20 25 30 Glu Asn <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala 1 5 10 15 Val Glu Thr Leu Ile Cys Phe Asn Leu Phe Leu Asn Ser Gln Glu Lys 20 25 30 His Tyr <210> 14 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 15 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile 1 5 10 15 Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr 20 25 30 Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu 65 70 75 <210> 16 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr 20 25 30 Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro 65 70 75 <210> 17 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Ile Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val Gln Ser Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln Gly Leu Glu Ile Glu Met Phe His Met Gly Phe Gln Asp 20 25 30 Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser Arg Ile Gln Cys Ser Arg 35 40 45 Phe Ile Gly Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys Thr Arg Pro Gly Ile 50 55 60 Ile Phe Ile Ser Lys Arg Gly Phe Gln Val Cys Ala Asn Pro Ser Asp 65 70 75 80 Arg Arg Val Gln Arg Cys Ile Glu Arg Leu Glu Gln Asn Ser Gln Pro 85 90 95 Arg Thr Tyr Lys Gln 100 <210> 18 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys 35 40 45 Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys 50 55 60 His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr 65 70 75 <210> 19 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Phe Ile Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met Met Ser Lys Leu Pro 1 5 10 15 Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys 20 25 30 Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser 35 40 45 Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu 50 55 60 Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val 65 70 75 80 Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser Ile 85 90 <210> 20 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg 20 25 30 Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg 35 40 45 Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr 50 55 60 Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr 65 70 75 80 Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser 85 90 95 Gln <210> 21 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr 1 5 10 15 Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala 20 25 30 Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu 35 40 45 Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His 50 55 60 Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gly Thr Phe Glu 65 70 75 80 Lys Gln Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr Pro Ala Ala Gly Gly 85 90 95 Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser 100 105 110 Ser Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ser Gln Glu Ala Gln Arg Ala Leu Gly 115 120 125 Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Pro Pro Thr Pro Lys Ala Gln Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu 145 150 155 160 Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser 165 170 175 Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser 180 185 190 Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser 195 200 205 Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro 245 250 255 Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr 260 265 270 Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu 275 280 285 Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile 290 295 300 Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala Ala Thr Arg Arg Gln Ala Val Gly 305 310 315 320 Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Gly Val Ala Met Phe 325 330 335 Thr Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg Lys Met Ala Gly Glu Met 340 345 350 Ala Glu Gly Leu Arg Tyr Ile Pro Arg Ser Cys Gly Ser Asn Ser Tyr 355 360 365 Val Leu Val Pro Val 370 <210> 22 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly 1 5 10 15 Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser 20 25 30 Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His 35 40 45 Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met 50 55 60 Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn 65 70 75 80 Thr Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser 85 90 95 Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser 100 105 110 Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu 115 120 125

Claims

(a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) 생물학적 샘플 내의 QC의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,
대상체에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 방법.
(a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) Aβ N3pE-X의 양을 더 검출하고;
(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 Aβ N3pE-X의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 Aβ N3pE-X의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC 및 Aβ N3pE-X의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표이며, 여기에서 X는 38, 40 및 42로부터 선택된 정수인 것을 포함하여,
대상체에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 방법.
(a) 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) 케모킨의 양을 더 검출하고;
(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 케모킨의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 케모킨의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC 및 케모킨의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,
대상체에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, 상기 QC가 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 인간 QC 또는 그의 이소형태인 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, 상기 QC가 SEQ ID NO: 1의 인간 QC인 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈청, 혈장, 뇨 또는 뇌척수액인 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈장인 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 면역비탁시험, 면역형광, 면역확산, 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 웨스턴 블럿, 단백질 활성시험, 노던 블럿, PCR, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량분석법 (MS), 가스 크로마토그래피 (GC), GC-MS, LC-MS, 또는 LC-MS/MS에 의해서 검출되는 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, QC 또는 그의 이소형태의 양이 상기 QC 또는 그의 이소형태의 단백질 레벨을 근거로 하여 검출되는 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 QC 또는 그의 이소형태에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 방법.
전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 QC 또는 그의 이소형태의 효소 활성을 측정함으로써 검출되는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나에 있어서, QC 또는 그의 이소형태의 양이 상기 QC 또는 그의 이소형태의 mRNA 레벨을 근거로 하여 검출되는 방법.
제2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, X가 42인 방법.
제 2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, X가 40인 방법.
제2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, X가 38인 방법.
제2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, N-말단적으로 절단되고 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드의 단일 형태뿐만 아니라 Aβ N3pE-42 및/또는 Aβ N3pE-40 및/또는 Aβ N3pE-38, 및 pGluABri 및/또는 pGluADan의 조합도 QC와 함께 검출되는 방법.
제3항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, 상기 케모킨이 CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 및 프랙트알카인으로부터 선택되는 방법.
제3항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, 상기 케모킨이 CCL2인 방법.
(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고;
(b) 상기 생물학적 샘플을 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체와 접촉시키고;
(c) 항체와 QC가 면역 컴플렉스를 형성하도록 하고;
(d) 상기 생물학적 샘플 내의 QC의 양의 지표로서 형성된 면역 컴플렉스의 양을 검출하고;
(e) 검출된 양을 정상 대조군으로부터의 샘플과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 증가 또는 감소한 검출된 양이 신경변성 질환의 양성 지표인 것을 포함하여, 대상체에서 신경변성 질환을 진단하는 방법.
제19항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 AD에 대한 양성 지표인 방법.
제19항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 MCI의 양성 지표인 방법.
제19항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 NDS의 양성 지표인 방법.
(a) 생물학적 샘플 내의 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) 상기 생물학적 샘플 내의 QC의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,
대상체로부터의 생물학적 샘플에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 시험관내 방법.
(a) 생물학적 샘플 내의 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) Aβ N3pE-X의 양을 더 검출하고;
(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 Aβ N3pE-X의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 Aβ N3pE-X의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC 및 Aβ N3pE-X의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표이며, 또한 X가 38, 40 및 42로부터 선택된 정수인 것을 포함하여,
대상체로부터의 생물학적 샘플에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 시험관내 방법.
(a) 생물학적 샘플 내의 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태의 양을 검출하고;
(b) 케모킨의 양을 더 검출하고;
(c) 생물학적 샘플 내의 QC 및 케모킨의 검출된 양을 정상 대조군의 특징적인 QC 및 케모킨의 양과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 상기 생물학적 샘플 내에서 증가한 QC 및 케모킨의 양이 AD, NDS 또는 MCI의 양성 지표인 것을 포함하여,
대상체의 생물학적 샘플에서 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군에서의 신경변성 (NDS) 또는 경증 인지장애 (MCI)를 진단하는 시험관내 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 하나에 있어서, 상기 QC가 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 인간 QC 또는 그의 이소형태인 시험관내 방법.
제23항 내지 제26항 중 어느 하나에 있어서, 상기 QC가 SEQ ID NO: 1의 인간 QC인 시험관내 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈청, 혈장, 뇨 또는 뇌척수액인 시험관내 방법.
제23항 내지 제28항 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈장인 시험관내 방법.
제23항 내지 제29항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 면역비탁시험, 면역형광, 면역확산, 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 웨스턴 블럿, 단백질 활성시험, 노던 블럿, PCR, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량분석법 (MS), 가스 크로마토그래피 (GC), GC-MS, LC-MS, 또는 LC-MS/MS에 의해서 검출되는 시험관내 방법.
제23항 내지 제30항 중 어느 하나에 있어서, QC 또는 그의 이소형태의 양이 상기 QC 또는 그의 이소형태의 단백질 레벨을 근거로 하여 검출되는 시험관내 방법.
제23항 내지 제31항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 QC 또는 그의 이소형태에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출되는 시험관내 방법.
제23항 내지 제30항 중 어느 하나에 있어서, QC의 양이 QC 또는 그의 이소형태의 효소 활성을 측정함으로써 검출되는 시험관내 방법.
제23항 내지 제30항 중 어느 하나에 있어서, QC 또는 그의 이소형태의 양이 상기 QC 또는 그의 이소형태의 mRNA 레벨을 근거로 하여 검출되는 시험관내 방법.
제24항, 및 제26항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, X가 42인 시험관내 방법.
제24항, 및 제26항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, X가 40인 시험관내 방법.
제24항, 및 제26항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, X가 38인 시험관내 방법.
제24항, 및 제26항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, N-말단적으로 절단되고 피로글루타메이트화된 아밀로이드 베타 펩타이드의 단일 형태뿐만 아니라 Aβ N3pE-42 및/또는 Aβ N3pE-40 및/또는 Aβ N3pE-38 및/또는 pGluABri 및/또는 pGluADan의 조합도 QC와 함께 검출되는 시험관내 방법.
제25항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, 케모킨이 CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 및 프랙트알카인으로부터 선택되는 시험관내 방법.
제25항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, 케모킨이 CCL2인 시험관내 방법.
(a) 생물학적 샘플을 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체와 접촉시키고;
(b) 항체와 QC가 면역 컴플렉스를 형성하도록 허용하고;
(c) 상기 생물학적 샘플 내의 QC의 양의 지표로서 형성된 면역 컴플렉스의 양을 검출하고;
(d) 검출된 양을 정상 대조군으로부터의 샘플과 비교하며, 여기에서 정상 대조군에 비해 증가 또는 감소한 검출된 양은 신경변성 질환의 양성 지표인 것을 포함하여, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 신경변성 질환을 진단하는 시험관내 방법.
제41항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 AD에 대한 양성 지표인 시험관내 방법.
제41항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 MCI의 양성 지표인 시험관내 방법.
제41항에 있어서, 정상 대조군에 비해 증가한 검출된 양이 NDS의 양성 지표인 시험관내 방법.
QC에 결합하는 항체 및 정상 대조군의 특징적인 QC의 양의 설정된 표준을 포함하는, 신경변성 질환 진단용 키트.
대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체와 접촉시켜 샘플 내의 QC의 양을 측정하는 것을 포함하여, 신경변성 질환을 진단하기 위하여 생물학적 마커로서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체를 사용하는 방법.
대상체에서 신경변성 질환을 진단하기 위한, 생물학적 마커로서 글루타미닐 사이클라제 (QC) 또는 그의 이소형태에 결합하는 항체의 용도.
제45항 내지 제47항 중 어느 하나에 있어서, 신경변성 질환이 AD인 키트, 방법 또는 용도.
제45항 내지 제47항 중 어느 하나에 있어서, 신경변성 질환이 MCI인 키트, 방법 또는 용도.
제45항 내지 제47항 중 어느 하나에 있어서, 신경변성 질환이 NDS인 키트, 방법 또는 용도.