JP2012510614A - オピオルフィン等の塩基性プロリンリッチ涙液遺伝子産物のバイオマーカーとしての使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象の病理状態又は治療効果の予測、診断、若しくはモニタリングを確立するするための、オピオルフィン（Opiorphin）等の塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（Basic Prolin-rich Lacrimal protein：ＢＰＬＰ）遺伝子産物、及び関連する使用法に関する。

Description

本発明は、オピオルフィン（Opiorphin）等の塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（Basic Prolin-rich Lacrimal protein：ＢＰＬＰ）遺伝子産物に関し、さらに詳しくは対象の病理状態又は治療効果の予測、診断、若しくはモニタリングのためのバイオマーカーとしての、ＢＰＬＰ遺伝子産物の使用、及び関連する使用法に関する。

包括的なポストゲノム的な生化学的及び薬理学的アプローチから得られた収束データは、哺乳動物中にＮＥＰ（中性エンドペプチダー ゼ、ネプリリシン（Neprilysin））やＡＰ−Ｎ（アミノペプチダーゼ−Ｎ）エクト−エンケファリナーゼの生理学的アンタゴニストが存在する証拠を提供する。これらの阻害剤はまずラットで解析（ＱＨＮＰＲペプチド）され、シアロルフィン（Sialorphin）と命名され（ＷＯ９０／０３９８１、ＷＯ９８／００９５６、ＷＯ０１／００２２１、ＷＯ０２／０４１４３４に記載されている）、さらに最近はヒトで解析され（ＱＲＦＳＲ−ペプチド）、オピオルフィン（Opiorphin）と称されている（ＷＯ０５／０９０３８６に記載されている）。

シアロルフィンは外分泌及び内分泌ペプチドシグナルである。これは疼痛知覚の阻害剤であり、内因性μ−及びδ−オピオイド受容体依存性エンケファリン作用性経路を強化することにより作用する。この発現は活性化性アンドロゲン制御下にあり、その分泌は、オスのラットで環境ストレスに対するアドレナリン作動性応答により誘発される（Rougeot et al., 1997, Am. J. Physiol. 273 (4pt2), R1309-1320）。

シアロルフィンは、無機イオン濃度に深く関係する臓器中の特異的標的部位を認識し、無機イオンのアンバランスに関連する代謝疾患（例えば、主に体液又は組織中の無機イオンのアンバランスにより引き起こされる骨、歯、腎臓、小腸、膵臓、胃粘膜、又は副甲状腺疾患）において治療的役割を有する。シアロルフィンは、副甲状腺機能亢進症若しくは副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、膵臓炎、顎下腺結石、腎結石、又は骨形成異常のような疾患を予防または治療するために使用される。従ってシアロルフィンは、副甲状腺機能亢進症若しくは副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、膵臓炎、顎下腺結石、腎結石、又は骨形成異常のような疾患を予防または治療するために使用される（ＷＯ９８／３７１００）。

シアロルフィンはまた、環境に対する自覚と注意の向上、環境に対する適応の向上、及び注意持続力の向上を提供し、そして攻撃性を強めることなく、環境に対して関心の向上、覚醒能力の向上を提供する（ＷＯ０１／００２２１）ことにより、ＤＳＭ疾患［例えば、"Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders" (DSM), American Psychiatric Assoc、特にDSM-III (1980)、DSM-III-R (1987)、DSM-IV (1994)、及びDSM-IV-TR (2000)］、例えば対人関係障害と行動障害であり、男性勃起不全（M.E.D.）や性的欲求低下障害（H.S.D.D.）の治療のために使用される。

シアロルフィンは、天然の調節物質として、特にＮＥＰやＡＰＮのような膜メタロペプチダーゼの阻害剤として作用する。従ってシアロルフィンは、アテローム性動脈硬化症、疼痛、腫瘍、癌、及び感染症のような疾患を予防または治療するために使用される（ＷＯ０２／０５１４３５）。

オピオルフィンは、シアロルフィンの機能性ヒトホモログと考えられている。これはＢＰＬＰタンパク質（「塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質」）から得られる（ＷＯ０５／０９０３８６、Rougeot et al.）。遺伝子ＢＰＬＰは主に、ヒト涙腺と顎下腺で発現される。

オピオルフィンは、２個のエンケファリン異化性エクト酵素であるヒト中性エクトエンドペプチダー ゼｈＮＥＰ（ＥＣ３．４．２４．１１）とヒトエクト−アミノペプチダーゼｈＡＰ−Ｎ（ＥＣ３．４．１１．２）を阻害するＱＲＦＳＲペプチドである。オピオルフィンは、内因性オピオイド依存性伝達を活性化することにより、化学的及び機械的疼痛モデルで強力な鎮痛活性を示す。オピオルフィンの疼痛抑制力は、急性の機械的疼痛の行動ラットモデル（ピン疼痛検査）でモルヒネと同等に有効である。オピオルフィンは内因性オピオイド依存性経路のエンケファリン関連活性化に関与し、これは気分関連状態と疼痛の制御に関係している。さらにそのインビボの性質のためにオピオルフィンは、疼痛寛解と情動障害の緩和の臨床管理のための新しい薬剤候補を開発するために利用できる、分子経路の開始剤候補として治療薬の可溶性を有する（Wisner et al., PNAS, 103(47): 17979-17984 (2006)）。オピオルフィンはまた、水−無機質アンバランス［骨、歯、腎臓、副甲状腺、膵臓、小腸、胃粘膜、又は唾液腺障害を含む］の予防または治療に使用される。疾患は、副甲状腺機能亢進症若しくは副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、膵臓炎、顎下腺結石、腎結石、又は骨形成異常でもよい（ＷＯ０５／０９０３８６）。

対象の治療の効率を含む病理状態の予測、診断、又はその進展を評価するために、疼痛症候群、水無機質アンバランス、及び社会関連障害のような病理状態のためのバイオマーカーに対するニーズが当該分野に存在する。

本発明は、対象の病理状態の予測、診断、又はモニタリングのための、ＢＰＬＰ遺伝子産物の使用を提供する。ＢＰＬＰ遺伝子産物はバイオマーカーとして使用される。

本発明は、ＢＰＬＰ遺伝子産物を使用する、対象の病理状態の予測、診断、又はモニタリングのための方法に関する。

本方法は、
ａ）対象から得られた生体試料中のＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルを測定する工程；
ｂ）工程ａ）で測定されたＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルをＢＰＬＰ遺伝子産物の基準値と比較する工程、とを含んでなり、
ここで、基準値と比較してＢＰＬＰ遺伝子産物の有意に高いか又は低いレベルは、病理状態の予測、診断、又は進行を示すものであることを特徴とする方法に関する。

本発明はまた、予測、診断、又はモニタリング検査のためのキットを提供する。該キットは、
・ＢＰＬＰ遺伝子産物を特異的に認識するための結合剤、
・該剤とＢＰＬＰ遺伝子産物との結合を検出するための試薬、及び
・場合により、陽性対照及び／又は陰性対照試料、
を含む。

ヒトオピオルフィンの定量のために使用される競合的ＥＬＩＳＡイムノアッセイを示す。 代表的なオピオルフィン−ＥＬＩＳＡ用量応答曲線を示す（Ｘ軸：対数スケールのＱＲＦＳＲペプチド濃度；Ｙ軸：標準ペプチドの存在下の特異的結合（Ｂ）パーセント／標準ペプチドの非存在下の特異的結合（Ｂ０）のパーセント）。 シアロルフィン（菱形）と比較したオピオルフィン（四角）のイムノアッセイの特異性を示す。 健常ヒトボランティアからの唾液中の代表的オピオルフィン−ＥＬＩＳＡ応答曲線を示す（黒四角：標準ＱＲＦＳＲペプチド（オピオルフィン）；菱形：唾液抽出物番号１ａ−２ａｖ（基礎分泌）；丸：唾液抽出物番号１ａ−２ａｐ（刺激分泌））。 男性の唾液（第１レーン：基礎分泌；第２レーン：刺激分泌；両群の差：マン・ホイットニー検定によりＰ＜０．００１）と、女性の唾液（第３レーン：基礎分泌；第４レーン：刺激分泌；クラスカル・ワリス検定（ＫＷＴ）分散分析による群間の統計解析：Ｐ＜０．０００１）中のオピオルフィンの定量を示す。刺激唾液分泌条件下の男性唾液と女性唾液間の差：マン・ホイットニー検定によりＰ＜０．００５。各ボックスは値の全分布を示し、中の線は中央値を示す。 男性の唾液と女性の唾液試料中のオピオルフィンの定量を示すが、図５の統計解析と比較して、統計検定から１つの女性試料を排除してある（第１レーン：基礎条件−男性；第２レーン：刺激分泌条件−男性；第３レーン：基礎条件−女性；第４レーン：刺激条件−女性）。クラスカル・ワリス検定（ＫＷＴ）分散分析による群間の統計解析：Ｐ＜０．０００１。マン・ホイットニー検定による２群間の統計解析：**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１。 ヒト血漿抽出物（番号１ａ−１１と１ａ−１２）のＨＰＬＣクロマトグラフィー溶出プロフィールとオピオルフィンＥＬＩＳＡ分析を示す。 抽出条件の関数としてのヒトボランティアからの精液中のオピオルフィンの定量を示す：０．１Ｎ ＨＣｌ又は１mM ＥＤＴＡと０．１ＮＨＣｌの非存在下又は存在下。（ＫＷＴによる群間の分散分析：Ｐ＝０．０００４；及びマン・ホイットニーＵ検定による２群間の差：**Ｐ＜０．０１）。 ヒトボランティアからの精液中のオピオルフィンの定量を示す（第１レーン：健常ボランティア；第２レーン：先天性両側形成不全を有するボランティア）。 ２個のヒト精子抽出物（番号３ａ−１３（健常）と３ｂ−０２（形成不全））のＨＰＬＣクロマトグラフィー溶出プロフィールとオピオルフィンＥＬＩＳＡ分析を示す。 健常ヒトボランティアからの尿中の代表的オピオルフィン−ＥＬＩＳＡ応答曲線を示す（四角：標準ＱＲＦＳＲペプチド（オピオルフィン）；菱形：尿抽出物番号１ａ−１４；丸：尿抽出物番号１ｂ−１５）。 健常ヒトボランティアからの涙中の代表的オピオルフィン−ＥＬＩＳＡ応答曲線を示す（四角：標準ＱＲＦＳＲペプチド（オピオルフィン）；菱形：涙抽出物番号１ａ−１０；丸：涙抽出物番号１ｂ−１５）。 ヒトボランティアからの涙中のオピオルフィンの定量を示す（第１レーン：女性；第２レーン：男性）。マン・ホイットニーＵ検定による両群間の差：**Ｐ＜０．０１。

内因性オピオイド神経ペプチド（すなわち、エンケファリン類）は、侵害受容伝達の陰性逆制御、ならびに注意、動機づけ、及び適応バランスを支配する脳構造体の活性の調節において役割を果たす。本発明者らは、驚くべきことに、塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（ＢＰＬＰ）遺伝子産物（例えばオピオルフィン）が、エンケファリナーゼ類による不活性化から、これらの内因性オピオイド神経ペプチドを防御するのに有用であることを見いだした。すなわち生理学的観点から、ＢＰＬＰ遺伝子産物（例えばオピオルフィン）は、ヒトのエンケファリナーゼ活性の生理学的制御物質として有利に有用である。さらに詳しくはＢＰＬＰ遺伝子産物（例えばオピオルフィン）は、疼痛知覚、情動バランス、及び社会関連行動を制御する経路の新しい調節物質として有利に有用である。

またＮＥＰ阻害剤としてのＢＰＬＰ遺伝子産物（例えばオピオルフィン）は、水無機質バランスを制御する経路の新しい調節物質として使用される。

本発明者らは、生理学的観点からＢＰＬＰ遺伝子産物は、病理状態の又は治療効果の予測、診断、又はモニタリングのための具体的な用途があり、様々な病的状態において予測、診断、又はモニタリング的価値の可能性を有する生物学的マーカーとして有用であることを、有利に見いだした。

さらに詳しくは、本発明者らは、驚くべきことに、種々の体液中のオピオルフィン分泌レベルが容易に検出かつ定量でき、オピオルフィンレベルが、対象の生理学的状態及び／又は症状（例えば、基礎状態対刺激状態、又は男性対女性）に依存して大きく変動することを見いだした。特に統計解析は、健常対象中のオピオルフィンの唾液分泌が、クエン酸による口腔粘膜刺激条件下では基礎状態と比較して大きく上昇することを示した。さらに唾液分泌の刺激条件下では、男性の唾液中のオピオルフィンレベルは同年齢の女性の唾液中のレベルより有意に高い。オピオルフィン分泌レベルのこれらの変動は、検出されるのに充分である。さらにオピオルフィンレベルは、ある集団（例えば、一定の年齢、性別、及び生理的状態）内で均一であることがわかった。さらにオピオルフィン分泌レベルは、唾液中のみではなく種々の他の体液中で検出することができる。

その結果、オピオルフィンレベルの測定は、対象の病理状態がオピオルフィン循環レベルの変化に関連しているかどうかを同定するために、及び／又は患者の治療法を計画するために、使用することができる。

１．ＢＰＬＰ遺伝子産物とその使用
従って本発明の態様は、例えば対象の病理状態又は治療効果の予測、診断、又はモニタリングにおけるバイオマーカーとして使用するための塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（ＢＰＬＰ）遺伝子産物を提供する。

具体的な実施態様において本発明は、対象の病理状態がオピオルフィンのようなＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していること（すなわち、病理状態が該ＢＰＬＰ遺伝子産物の異常産生及び／又は分泌により引き起こされるか、及び／又は該ＢＰＬＰ遺伝子産物の異常産生及び／又は分泌が病理状態の結果であること）を決定及び／又は確認することを目的とする。実際多くの病理状態は、病理状態に関与する種々の要因及び／又は欠陥により引き起こされることがある。従って病理状態の原因及び／又は結果を診断する必要がある。すなわち、正常人中のＢＰＬＰ遺伝子産物レベルである基準値と比較して、有意に高い又は低いレベルのＢＰＬＰ遺伝子産物が対象の生体試料中に見つかることを測定することは、対象がＢＰＬＰ遺伝子産物に関連する病理状態を患っていることを診断することを可能にする。すなわち本発明の方法と使用は、病理状態が、ＢＰＬＰ遺伝子産物の産生及び／又は分泌レベルの変化に関連しているかどうか、さらに詳しくはＢＰＬＰ遺伝子産物の分泌レベルの変化に関連しているかどうかを決定することを可能にする。オピオルフィンのようなＢＰＬＰ遺伝子産物がエンケファリン介在経路である役割を果たすことがわかっているため、本発明の方法と使用は、病理状態がエンケファリン介在経路中の欠陥に関連しているかどうかを診断することを可能にする。

従って本発明の態様は、病理状態が対象中のある塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（ＢＰＬＰ）と関連しているかどうかを決定及び／又は確認するために、例えばバイオマーカーとして使用されるＢＰＬＰ遺伝子産物を提供する。

本発明が企図するＢＰＬＰ遺伝子産物がタンパク質型又はヌクレオチド型を有してもよいことは、理解されるであろう。バイオマーカーとして使用される企図されるＢＰＬＰ遺伝子産物がヌクレオチド型を有する場合、そのようなヌクレオチド型は、特に限定されないがＢＰＬＰ ｍＲＮＡでもよい。バイオマーカーとして使用される企図されるＢＰＬＰ遺伝子産物がタンパク質型を有する場合、そのようなタンパク質型は、ＢＰＬＰタンパク質、ＢＰＬＰタンパク質に由来するペプチド、ＢＰＬＰ前駆体タンパク質からなるＢＰＬＰペプチド、又はＢＰＬＰペプチドの成熟産物でもよい。

好適な実施態様において本発明のＢＰＬＰ遺伝子産物は、ヒトＢＰＬＰタンパク質、又はそこから得られるペプチド若しくは成熟産物、又はその前駆体である。

最も好適な実施態様において本発明のＢＰＬＰ遺伝子産物はオピオルフィン、すなわちアミノ酸配列ＱＲＦＳＲ（配列番号３）を有するペンタペプチドである。

本発明により企図されるＢＰＬＰタンパク質は、例えばヒトＢＰＬＰ遺伝子にコードされる。ヒトＢＰＬＰ遺伝子は、Dickinson et al. (Curr Eye Res. 15(4), 377-386, 1996) によりクローン化され解析されたｃＤＮＡから予測される２０１アミノ酸（おそらく、分泌のシグナルペプチド有り）のポリペプチド配列をコードする。ＢＰＬＰ遺伝子は、ヒトの涙腺と顎下腺で発現される。配列番号１はＢＰＬＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を示し、配列番号２はＢＰＬＰアミノ酸配列を示す。

本発明により企図されるＢＰＬＰ遺伝子産物は、例えば前駆体タンパク質又はＢＰＬＰ前駆体タンパク質の成熟産物でもよい。

本明細書において「ＢＰＬＰの成熟産物」は、天然のマチュラーゼによる又はプロホルモン変換酵素による、又は関連するモノ若しくは対の塩基性アミノ酸切断酵素、例えばフリン、ＰＣコンベルターゼ、若しくはＰＡＣＥ４（Seidah et al., Intramolecular Chaperones and Protein Folding, 1995, 9:181-203）による、ＢＰＬＰ前駆体の特異的切断から得られるペプチドを意味する。プロホルモンコンベルターゼは不活性前駆体を活性ペプチドに変換し、例えばフリン、ＰＣコンベルターゼ、若しくはＰＡＣＥ４がある。成熟コンセンサス部位の配列は、好ましくは以下のコンセンサスに従う：［Ｈ／Ｒ／Ｋ］−Ｘ₃−［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］（ここで［Ｈ／Ｒ／Ｋ］は、アミノ酸がＨ、Ｒ、又はＫであり、Ｘ₃が３個のアミノ酸の鎖でありことを意味し、［Ｒ／Ｋ］は、アミノ酸がＲ又はＫであることを意味する）。プロホルモンコンベルターゼは当業者に公知であり、特にScamuffa et al. (2006 FASEB J. 20(12):1954-63) により記載されている。本発明に企図されるＢＰＬＰの成熟産物の１つは、アミノ酸配列ＱＲＦＳＲ（配列番号３）を有するペンタペプチドであるオピオルフィンである。

本発明に記載されるペプチドは、常法により液相又は固相のペプチド合成で、取り込むべき種々のアミノ酸を連続的に結合（液相ではＮ末端からＣ末端へ、又は固相ではＣ末端からＮ末端へ）することにより調製され、ここでＮ末端と反応性側鎖は通常の基によりあらかじめブロックされる。固相合成のためには、Merrifieldにより記載された方法が特に使用される。あるいはHoubenweyl in 1974の方法を使用してもよい。さらなる詳細については、ＷＯ９８／３７１００を参照されたい。本発明のペプチドはまた、遺伝子操作法を使用して得ることもできる。

２．ＢＰＬＰ遺伝子産物の使用法
本発明の別の態様において、ＢＰＬＰ遺伝子産物の使用法が提供される。さらに詳しくは本発明者らは、特に限定されないが、例えば口腔灼熱症候群（Burning Mouth Syndrome）（これは原因不明の慢性疼痛症候群である）を示す患者の唾液、例えばうつ病及び関連する社会不安障害又は神経障害性慢性疼痛を患う患者の血漿と尿、例えば勃起不全を患う患者の精液のような種々の体液中の生物学的マーカーとしてのＢＰＬＰ遺伝子産物（例えばオピオルフィン）の使用を提供する。

本発明のこの特定の態様は、対象の病理状態の予測、診断、又はモニタリング法により有利に達成される。予測又は予測検査は、対象で病理状態が発生する可能性の測定又は確認を意味する。診断又は診断検査は、対象の病理状態の測定又は確認を意味する。モニタリング検査は、対象の治療の効果を含む病理状態の進展の測定又は確認を意味する。病理状態、障害、疾患、又は病理状態から得られる症状は、健常対象と比較した健康の変化を意味する。

具体的な実施形態において本発明の方法は、対象の病理状態がＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認することを目的とする。

好適な実施態様において本発明の方法又は使用が性的疾患を予測、診断、又はモニタリングすること、又は対象の性的疾患がＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認することを目的とする。性的疾患には、男性勃起不全、持続勃起症、性的欲求低下若しくは性的亢進障害がある。

別の好適な実施態様において本発明の方法又は使用が、対人関係障害と行動障害を予測、診断、又はモニタリングすること、又は対象の対人関係障害と行動障害がＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認することを目的とする時は、髄液が使用される。対人関係障害と行動障害には、例えば回避性障害、意識障害、自閉症、覚醒障害、ホスピタリズム、対人関係障害、外界との関係の障害、分裂病質人格障害、統合失調症、うつ病、大うつ病症候群、環境への関心の低下、性に関連する社会的活動性障害、早漏と性的活動過多、パニック障害、胸痛や心的外傷後ストレス障害、注意欠陥（成人及び小児における）、活動過多（成人及び小児における）、注意欠如／活動過多（ＡＤＨＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）と気分障害がある。

さらに別の好適な実施態様において、本発明の方法又は使用が、口腔灼熱症候群又は顎関節疼痛障害を予測、診断、又はモニタリングすることを目的とする時、唾液が使用される。

血漿、血清、及び尿は、本明細書に記載の任意の病理状態を予測、診断、又はモニタリングするのに、及び本明細書に記載の病理状態がＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認するのに、有用である。

本明細書において患者又は対象は、その年齢、性、及び全身症状に無関係に、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトからなる。試験される体液が精液又は母乳である場合以外は、小児と幼児もまた包含される。評価される対象すなわち検査対象は無症候性でもよく、疾患若しくは症状が出る可能性があってもよく、又は疾患若しくは症状が症候性であってもよい。標的疾患の疑いがある対象又はすでに疾患又は症状又は病理状態の兆候を示す対象もまた検査される。本発明における対象は、好ましくはヒトである。

本発明の企図される方法は、
ａ）対象から得られる生体試料中の上記ＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルを測定する工程；
ｂ）工程ａ）で測定されたＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルをＢＰＬＰ遺伝子産物の基準値と比較する工程、とを含んでなり、
ここで、基準値と比較してＢＰＬＰ遺伝子産物の有意に高いか又は低いレベルは、病理状態の予測、診断、又は進行を示すものであることを特徴とする方法である。

本発明の方法はさらに、対象の治療処方を計画する工程を含む。例えば、対象で有意に高レベルのＢＰＬＰ遺伝子産物が見つかる場合、ＢＰＬＰ遺伝子産物阻害剤の使用に基づく治療が計画される。阻害剤は、例えばＢＰＬＰ遺伝子産物の分泌及び／又は産生又はその活性を阻害してもよい。その反対に対象で有意に低レベルのＢＰＬＰ遺伝子産物が見つかる場合、ＢＰＬＰ遺伝子産物アゴニストの使用に基づく治療が計画される。そのようなアゴニストには、例えば配列番号３又は４のペプチド、ＷＯ２００９／１２４９４８に記載のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣物がある。

予測又は診断のために、健常対象の代表的パネルから得られる値の統計解析により「基準値」が確定される。これは、試料の性質、対象の年齢及び／又は性、神経内分泌状態などに依存する。これは、対象中のＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルの尺度になるようにあらかじめ決定される。

モニタリングのために、上記段落に記載したように「基準値」を確定することができるか、又は若しくはさらに、すでに試験した対象から得られる値でもよい。

対照対象は健常対象であるか、又は対象の病理状態の進行を評価する必要がある場合、対象はすでに検査した対象でもよい。

本明細書において「生体試料」は対象由来の液体であり、例えば血清、血漿、血液、髄液、尿、母乳、涙、精液、唾液、又は組織抽出物、又は組織若しくは臓器生検、例えば脳、脊髄、骨組織、腎臓、前立腺、及び生殖器、胎盤、歯組織、胃の腺性粘膜、小腸、唾液腺組織、乳腺を含む。

ＢＰＬＰタンパク質成熟産物は、例えば酸−メタノール抽出及び／又はC18-SepPakカートリッジ抽出により、試料から抽出することができる。これは次に逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製される。試料が唾液、精液、涙、又は尿である時、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物は例えば酸−メタノール抽出により抽出することができる。試料が血漿又は母乳である時、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物は、好ましくはC18-SepPakカートリッジ抽出により抽出することができる。試料が血漿である時、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物は逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによりにより抽出することができる。

本明細書において用語「有意な」は、ｐ値が０．０５に等しいか又はそれより小さいことを意味する。ＢＰＬＰ遺伝子産物の発現又は産生の定量レベルは、例えばＢＰＬＰ ｍＲＮＡ、ＢＰＬＰ前駆体タンパク質、又はその成熟産物（例えばオピオルフィン−ペンタペプチド）をアッセイすることにより測定される。このようなアッセイ法は、試料中に存在するＢＰＬＰ遺伝子産物と選択的に相互作用することができる結合パートナーに生体試料を接触させることを含む。結合パートナーは抗体でもよく、これはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも、又は分子プローブでもよい。

抗体の産生方法は、本発明の診断、予測、又はモニタリング法に有用な抗体を産生するように容易に改変することができる。例えばＢＰＬＰ遺伝子産物の存在又は産生は、例えば標準的電気泳動法及び液相又は固相免疫診断法（競合、直接反応、又はサンドイッチ型のアッセイのようなイムノアッセイを含む）を使用して、ＢＰＬＰ遺伝子産物を特異的に認識する抗体を生体試料に接触させることにより検出することができる。このようなアッセイには、特に限定されないが、ウェスタンブロット、凝集試験、酵素標識及び介在イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（例えば放射ヨード化又はトリチウム化ＢＰＬＰタンパク質又はその任意の成熟産物を使用する）、免疫電気泳動、免疫沈降などがある。反応は一般に、暴露性標識物（例えば、蛍光、化学発光、放射活性、酵素標識物又は色素分子）、又は抗原とこれに反応した抗体との複合体の形成を検出する他の方法を含む。本発明の実施で使用できる固体支持体には、ニトロセルロース（例えば、膜型又はマイクロタイターウェル型）、ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどの支持体がある。すなわちある具体的な実施態様において、生体試料からの結合したＢＰＬＰ遺伝子産物の存在は、別の抗体を含む２次結合剤を使用して、これを当業者に公知の方法を使用して、検出可能な酵素標識物（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はウレアーゼ）に容易に結合して検出することができる。次に適切な酵素基質を使用して、検出可能なシグナル（例えば、発色性又は蛍光性シグナル）を生成することができる。別の関連する実施態様において、当業者に公知の方法を使用して、競合的ＥＬＩＳＡ法を実施することができる。上記アッセイ試薬（抗体を含む）は、上記イムノアッセイを実施するために、適切な説明書と他の必要な試薬とを有するキットで提供することができる。キットはまた、使用される具体的なイムノアッセイにより、適切なレベルや他のパッケージされた試薬及び材料（すなわち洗浄緩衝液など）を含有することもできる。これらのキットを使用して、標準的イムノアッセイ（例えば上記したもの）を実施することができる。

好適な実施態様においてＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルは、好ましくはポリクローナル抗ＱＲＦＳＲ抗体を含むイムノアッセイ（例えば競合的ＥＬＩＳＡ）により測定される。

競合的ＥＬＩＳＡアッセイを実施する方法は当業者に公知である。オピオルフィンを検出するのに、以下の工程を含む方法が特に有利で高感度であることがわかっている：

・マイクロタイタープレートを配列番号４のペプチドでコーティングし、ここで第１残基と第２残基との間に６−ポリエチレン又は１２−ポリエチレンリンカーが導入されている（例えば、２００μl/ウェル当たり４０ngの該ペプチド）、
・場合により、マイクロタイタープレートを例えば軽く攪拌しながら４℃で一晩インキュベートし、
・場合により、該マイクロタイタープレートを例えば２〜８回、好ましくは４〜５回洗浄し、
・場合により、飽和緩衝液を加え、該マイクロタイタープレートを例えば２〜８回、好ましくは４〜５回洗浄し、
・本発明のウサギポリクローナル抗ＱＲＦＳＲ抗体（例えば１／８０，０００）の存在下で、オピオルフィンを含有することが疑われる試料を加え、
・場合により、該マイクロタイタープレートを例えば２〜８回、好ましくは４〜５回洗浄し、
・標識抗ウサギ抗体を例えば１／３，０００（例えば、PierceのＩｇＧ−ＨＲＰ抗体）で加え、
・場合により、該マイクロタイタープレートを例えば２２℃で１時間インキュベートし、
・場合により、該マイクロタイタープレートを例えば２〜８回、好ましくは４〜５回洗浄し、
・標識抗ウサギ抗体を検出するのに適した発色基質（例えば、PierceのＨＲＰ発色基質）を加え、
・場合により、該マイクロタイタープレートを例えば２２℃で３０分インキュベートし、
・場合により、反応を停止（例えば、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて）させ、そして
・発色基質が発するシグナルを検出（例えば、４５０nmの波長で吸光度を測定することにより）し、こうしてオピオルフィンを含有することが疑われる該試料中のオピオルフィンを検出（及び／又は定量）する。

抗ＱＲＦＳＲ抗体は、例えば実施例に記載された方法を使用して得ることができる。配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合するポリクローナル抗体のそのような産生法は、以下の工程を含む：
ａ）オバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子に共有結合した配列番号４のペプチドを、非ヒト動物（例えばウサギ）に投与する工程、そして
ｂ）該ＱＲＦＳＲペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を選択する工程。

オバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子に共有結合した配列番号４のペプチドは、例えば配列番号５のペプチドに対応し、ここでオバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子は配列番号４のペプチドの第１の残基に共有結合している。

本発明はまた、そのような方法により得られる配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的結合しているポリクローナル抗体に関する（例えば３ＲＢＦ−ＳＡＢ抗体）。

本発明の主題はまた、配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを得る方法であり、以下の工程を含む：
・オバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子に共有結合した配列番号４のペプチドを、非ヒト動物（例えばウサギ）に投与する工程、
・この動物から免疫グロブリン分泌リンパ球を取り出す工程、
・該リンパ球をミエローマ細胞と融合させて、少なくとも１個の免疫グロブリン分泌ハイブリドーマを得る工程、
・配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合する該抗体を分泌するハイブリドーマを選択する工程、及び
・場合により該抗体を精製する工程。

これらの工程は通常のハイブリドーマ入手法の工程に対応し、その原理はKohler and Milstein（1975 Nature 256:495-497）に記載されている。
本発明の主題はまた、そのようなハイブリドーマと該ハイブリドーマにより分泌される抗体である。

ＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルはまたｍＲＮＡを用いて測定してもよい。ＢＰＬＰ遺伝子により発現されるｍＲＮＡ又はその断片と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが使用される。いったんＢＰＬＰ遺伝子配列又はｃＤＮＡ配列がわかれば、そのようなオリゴヌクレオチドの調製法を当業者は周知しているであろう。例えばハイブリダイゼーションは、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM ＥＤＴＡ、１％ ウシ血清アルブミン、及び超音波処理サケ精子ＤＮＡ（１００mg/mL）を含有する溶液を使用して行われる（US 6,916,607, Rosinski-Chupin et al.）。

第１に、ＢＰＬＰ遺伝子産物のレベルは健常対象の代表的パネル、又はその病理状態の進展がモニタリングされている対象で測定されて、ＢＰＬＰ遺伝子産物の「基準レベル」が得られる。

第２に、対象のＢＰＬＰ遺伝子産物のレベルが測定される。

第３に、これらのレベルが比較される。もしこれらが有意に異なる（ｐ＜０．０５）（低いか又は高い）なら、これは具体的な病理状態を予測、診断、又はモニタリングするのに有用かも知れない。

実施例に記載されているように、クエン酸による口腔粘膜刺激の条件下でオピオルフィンの唾液分泌は、基礎分泌（５９±１７ng/ml）と比較して男性（７３８±１４６）では有意に（ｐ＜０．００１，ｎ＝６〜１０）高く、女性（２４７±６８）では基礎分泌（６１±２３ng/ml）に対して有意に（ｐ＜０．０１，ｎ＝１０〜１３）高かった。

病理状態（例えば、特に限定されないが水無機質アンバランス、痛覚過敏又は痛覚低下合成、うつ状態、社会関連行動障害）を有する対象では、ＢＰＬＰ遺伝子産物のレベルは対照対象とは異なり、病理状態の兆候となるであろう。本発明の枠内で予測、診断、又はモニタリングされる病理状態は、以下でさらに説明される。

ＢＰＬＰ遺伝子産物の使用法は、治療効果の評価のためのマーカーとして使用できる。

症状の進展を測定するために及び／又は治療効果を測定するために、数日後、数週間後、又は数ヶ月後に対象の２回目の検査を行い、ＢＰＬＰ遺伝子産物の発現について対象を検査し、薬剤の効果又は症状の拡散をモニタリングすることが非常に有用であろう。その場合２回目の検査の結果は１回目の検査結果と比較することができ、一般に「健常」対象で得られた結果とも比較することができる。「対照対象」とは、同じ対象又は「健常対象」を意味する。

バイオマーカーとしてＢＰＬＰ遺伝子産物を使用する予測、診断、又はモニタリング検査のためのキットも提供される。キットは、ＢＰＬＰ遺伝子産物を特異的に認識するための結合剤（例えば抗体又は分子プローブ）と、この物質とＢＰＬＰ遺伝子産物との結合を検出するための試薬とを含んでよい。対照試料（陽性及び／又は陰性）も含まれる。

３．病理状態
ＮＥＰやＡＰＮのような膜メタロエクトペプチダーゼの活性を調節するＢＰＬＰ遺伝子産物は、多種類の病理状態を予測、診断、又はモニタリングするのに有用である。例えばＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００７００は、ＢＰＬＰ遺伝子産物が役割を果たす多くの疾患を教示する。

すなわち本発明の方法と使用は、疼痛、特に急性及び慢性疼痛、内臓炎症性及び神経性疼痛を予測、診断、又はモニタリングするのに有用である。特に本発明の方法と使用は、線維筋痛症、慢性腰痛、顎関節痛、口腔疼痛、及び内臓痛過敏を含む痛覚過敏を予測、診断、又はモニタリングするのに有用である。

水−無機質アンバランスの予測、診断、又はモニタリングも本発明の目的である。引用される標的疾患には、水−無機質アンバランスにより引き起こされる骨、歯、腎臓、副甲状腺、膵臓、小腸、胃粘膜、前立腺、及び唾液腺疾患がある。特に疾患は、副甲状腺機能亢進症若しくは低下症、骨粗鬆症、骨減少症、低リン酸塩血、膵炎、顎下腺結石、腎結石、及び骨形成異常症よりなる群から選択される。

対人関係障害と行動障害の予測、診断、又はモニタリングもまた関係がある。そのような種々の精神障害は、ＷＯ０２／０５１４３４に記載されている。特に本発明は、回避性障害、意識障害、自閉症、注意欠陥、多動性障害、覚醒障害、ホスピタリズム、対人関係と外界との関係の障害、分裂病質人格障害、統合失調症、うつ病、大うつ病症候群、環境への関心の低下、性に関連する社会的活動性障害、性的行動障害（早漏と性的活動過多を含む）、パニック障害、胸痛や心的外傷後ストレス障害に関する。

本発明の病理状態はまた、神経変性疾患も含む。「神経変性疾患」という用語は、脳や神経の機能不全を特徴とする症候を示す神経系（特に脳を含む）の疾患もしくは障害を意味し、例えば短期または長期の記憶力の衰えや欠陥、認知症、認知の欠陥、バランスと協調運動障害、及び感情や行動の欠陥がある。

さらに詳しくは、本発明は、アミロイドーシスに関連する神経変性障害に関する。このような疾患は、そのような症状を示す対象からの脳組織の組織（生検）試料がアミロイド班形成を示す時、「アミロイドーシスに関連している」。生きている対象から脳（特にヒトの脳）の生検試料を得ることが困難であるか又はまったく入手できないため、神経変性障害の症状とアミロイドーシスとの関連は、生検試料中のアミロイド沈着物（例えば班又はフィブリル）の存在以外の基準に基づく。

本発明の具体的な実施態様において神経変性障害はアルツハイマー病（Alzheimmer's disease）（ＡＤ）である。当該分野で公知の及び本発明の範囲内の他のそのような疾患には、特に限定されないが、散発性の脳アミロイド血管症、遺伝性脳アミロイド血管症、ダウン症候群、グアムのパーキンソン認知症、及び加齢に伴う無症候性のアミロイド血管症がある。

さらにＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６３９０は、オピオルフィンが精神刺激活性を有することを教示する。すなわち本発明の方法と使用は、ナルコレプシー、過眠症、覚醒低下、注意欠陥（成人および小児における）、活動過多（成人および小児における）、注意欠陥／活動過多障害（ＡＤＨＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、及び気分障害条件、例えばうつ病性症状とうつ病（"大うつ病性障害"）［後者は主要なうつ病（"大うつ病性障害、単一エピソード"）と抵抗性うつ病（"大うつ病性障害、再発性"）を含む］、バイポーラ病（Ｉ型及び／又はII型）、気分変調性障害と気分循環性障害よりなる群から選択される病理状態を予測、診断、又はモニタリングするのに使用することができる。

本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう。これらの例は本発明の広範囲の応用を例示するものであり、決してその範囲を限定するものではない。本発明の精神と範囲を逸脱することなく、多くの修飾と変更が可能であると考えられる。本発明の検査を実施するのに、本明細書に記載の方法や材料と類似のもの又は同等のものが使用できるが、好適な方法と材料が記載される。

材料と方法
Ａ．体液のサンプリング、保存、及び輸送
プロトコールは以下の通りである。
・生体試料を採取し（すなわち、対象の２〜５mlの唾液、３０mlの血液、２０mlの尿）、ペプチダーゼ阻害剤の混合物（ペファボリック ０．４mM、アプロチニン １０００KIU/ml、ＥＤＴＡ １mM、ベスタチン １５０μM、ロイペプチン １μM、ペプスタチン １μM）（Rougeot and al. Am J Physiol, 1997）を含有するあらかじめ冷却したポリプロピレン試験管（４、１５、又は５０ml）に集めた。精液のために、ペプチダーゼ阻害剤は抗凝固剤（ＥＤＴＡ）無しでアプロチニンとペファブロックに限定した（以前の評価試験に従って）、
・これらを４０００×ｇ、４℃で１５分遠心分離し、上清を採取した（すなわち、血液の血漿部分）、
・直ちにすべての試料を−８０℃に冷却した、そして
・これらをドライアイス容器中で検査室に輸送した。

Ｂ．オピオルフィンのための定量的イムノアッセイの開発
オピオルフィンのサイズ（６５０Da）が小さいことを考慮して、このペプチドの定量のために競合型のイムノアッセイを応用した：すなわち、測定すべき遊離の抗原と、オピオルフィンＱＲＦＳＲペプチド（試料中に、又は既知濃度の基準ペプチドに含有される）と、９６ウェルマイクロタイタープレートの支持体にコーティングされた抗原（一定量で限定量）との間の、「抗ＱＲＦＳＲペプチド」抗体（一定量で限定量）に対する競合（図１）。Ｙはシアロルフィンに対する抗体である。

一方同じ理由で、担体分子（一般的には、ヒト以外の様々な種からのタンパク質）に共有結合したＱＲＦＳＲペプチドの免疫原性を改善するために、動物（ウサギ）中のポリクローナル「抗ＱＲＦＳＲ」抗体の産生には抗原の注射が必要であった。使用した免疫原はオバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−ＹＱＲＦＳＲである（ＯＶＡ−（ＣＯ−ＮＨ）−ＹＱＲＦＳＲとも呼ぶ）（配列番号５）。

特異反応は、Pierceにより提供された普遍的システム［すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）に結合したウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対する精製した免疫グロブリン抗体（ＩｇＧ−ＩｇＭ）］を使用し、次に発色性ＴＭＢ特異基質（テトラメチルベンジジン）の最終添加により、発現させた。

Ｂ．１ オピオルフィンのための競合的ＥＬＩＳＡイムノアッセイのフォーマット：抗ＹＱＲＦＳＦ抗体、及びＹ−（ＰＥ）₁₂−ＱＲＦＳＲペプチドの固定化
マイクロタイタープレート（９６ウェル−ImmunoPlate、Nunc）のプラスチック支持体にペプチドをコーティングした。異なるＱＲＦＳＲペプチド誘導体を試験した。

・Ｙ−ＱＲＦＳＲペプチド（配列番号４）：Ｎ末端チロシン残基の存在はオピオルフィンペプチドの疎水性を上昇させ、従ってプラスチック支持体への受動的吸着を促進する、
・Ｙ−（ＰＥ）₆−ＱＲＦＳＲペプチドとＹ−（ＰＥ）₁₂−ＱＲＦＳＲペプチド（配列番号６）：チロシン残基とＱＦＲＳＲペプチド配列の間に導入した６−ポリエチレン又は１２−ポリエチレンリンカーの存在は、これをより柔軟にし、コーティング支持体から遠ざけ、疎水性にすることで、抗体への固定化ペプチドの近づき易さを促進する。予測されるように、配列ＱＦＲＳＲが支持体から遠さけられるほど、抗体によるその認識が促進される。プレートのコーティングのために選択されたオピオルフィン誘導体は、Ｙ−（ＰＥ）１２−ＱＲＦＳＲペプチドである。

ＯＶＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＹＱＲＦＳＲ免疫原を２羽のウサギに投与し、特異的免疫応答を正確にモニタリング後、特異的ポリクローナル抗ＱＲＦＳＲ抗体を作成した。オピオルフィンに対する親和性に基づいて選択したポリクローナル抗体を３ＲＢＦ−ＳＡＢと読んだ。

最適化したアッセイ条件は以下の通りである：
コーティング緩衝液：１００mMでｐＨ７．１のリン酸カリウム緩衝液。
飽和緩衝液：２０mM ｐＨ７．５のトリス緩衝液＋１５０mM ＮａＣｌ＋０．１％ ツイーン２０＋０．５％ゼラチン。
第１インキュベーション緩衝液（抗オピオルフィン抗体＋試料又は基準ペプチド）：２００mM ｐＨ７．５のトリス緩衝液＋１５０mM ＮａＣｌ＋０．１％ ツイーン２０＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
第２インキュベーション緩衝液（ＨＲＰに結合した抗ウサギＩｇＧ抗体）：２００mM ｐＨ７．５のトリス緩衝液＋１５０mM ＮａＣｌ＋０．１％ ツイーン２０＋０．１％ＢＳＡ。
洗浄緩衝液：純水＋０．１％ ツイーン２０。

以下の表１は、競合的ＥＬＩＳＡイムノアッセイの工程をより詳細に説明する。

Ｂ．２．オピオルフィンの競合的ＥＬＩＳＡイムノアッセイの性状解析
図２に例示するように、抗ＹＱＲＦＳＲ抗体３ＲＢＦ−ＳＡＢを使用するオピオルフィンの競合的ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、再現性のある高感度アッセイを実施することを可能にした：ＩＣ５０は３０±９ng/ml（ＳＤ、ｎ＝１８ 標準曲線）（３ng又は５pmol／アッセイ）であり、検出限界は２ng/mlのオピオルフィンＱＲＦＳＲペプチド（２００pg又は０．３pmol／アッセイ）であった。アッセイ間変動は１０％未満であった。さらに、機能的に関係するシアロルフィンＱＨＮＰＲペプチド（菱形）は最終濃度５００ng/mlでも抗体により認識されなかったため、このイムノアッセイはオピオルフィンに対して極めて特異性が高かった（図３）。

Ｃ．ヒト生体試料からのオピオルフィンの抽出
簡単に説明すると、４℃で解凍後、生体試料を以下の条件に従って処理した。

Ｃ．１．酸−メタノール抽出：４℃で４容量の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のメタノール液に対して１容量の試料
この第１の工程は、酸−メタノール条件下で変性される高分子量タンパク質（すなわちペプチダーゼ）の沈降と排除を実現した。メタノール相中の可溶性の低分子量分子（すなわちオピオルフィン）は、４℃で４７００rpmで３０分遠心分離することにより沈降物から分離され、−１１０℃で４８時間凍結乾燥された。

＊精液と血漿の場合、試料をあらかじめ最終濃度０．１ＮのＨＣｌで酸性化した（オピオルフィンと結合成分との可能性のあるイオン性相互作用の解離）。さらに精液の場合、試料をあらかじめ最終濃度１mMのＥＤＴＡで処理した（結合した陽イオン性金属からのオピオルフィンの解離、すなわち精液中でＺｎ＋＋は約１．５mMに濃縮された）。

唾液、涙、及び母乳、乾燥抽出物は１容量のＨ２Ｏ−ＨＰＬＣ（試料の初期容量に対応する）で復元し、遠心分離（４℃で４７００rpmで３０分）し、上清を、そのオピオルフィン含量についてＥＬＩＳＡで分析するまで−８０℃で保存した。

＊精液の場合、乾燥抽出物を、試料の初期容量と比較して０．２容量のＨ２Ｏ−ＨＰＬＣで復元した（最終濃度５×）。
＊尿の場合、乾燥抽出物を、試料の初期容量と比較して０．４容量のＨ２Ｏ−ＨＰＬＣで復元した（最終濃度２．５×）。

Ｃ２．C18-SepPakカートリッジ抽出（Waters）
酸性化した試料（ＨＣｌ、０．１Ｎ最終濃度）を、あらかじめ活性化したC18-SepPakカートリッジに適用した。Ｈ２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ（５ml）で洗浄後、多段階勾配（５％、２０％、４０％、６０％、１００％ メタノール−０．１％ ＴＦＡ）（各５ml）に従って成分を溶出した。連続画分を４℃で採取し、次に−１１０℃で４８時間凍結乾燥した。
＊この抽出−精製工程は、血漿と母乳の場合は決定的に重要である。

Ｃ．３．逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィー
上記操作で得られた抽出物を、ＴＦＡ ０．１％−Ｈ２Ｏ溶媒条件下でＣ１８／ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Luna 5μ Phenomenex-USA 又は ACE 3μ AIT-France（１５０Ｘ４．５mm））の上部に適用した。

０％〜８０％アセトニトリルの１ml／分の流速の３０分の線形勾配（Surveyor HPLC system, Thermo-scientific）で、種々の成分がその疎水性に従って溶出され単離された。各画分（１ml）を採取し、前記のように凍結乾燥し、ＥＬＩＳＡによりオピオルフィン含量を測定した。
＊このＨＰＬＣ精製工程は、血漿の場合は決定的に重要である。

結果
ヒトの体液中のオピオルフィン濃度プロフィール

実施例１
健常ヒトボランティアの唾液中のオピオルフィンの定量
代表的オピオルフィン競合的ＥＬＩＳＡアッセイを図４に示す。１ａ−２試料（白丸）の連続希釈物から得られた免疫反応曲線は、基準ＱＲＦＳＲペプチド（黒四角、横軸の濃度は対数スケール）に対応する用量応答曲線と平行であった。これは、唾液抽出物中に含まれていた天然のオピオルフィンペプチドが、純粋な合成ペプチドと同じ親和性で抗体に認識されたことを示す。

健常な成人男性から採取した唾液試料では、オピオルフィンは基礎条件下（白菱形、図４）で検出され、唾液分泌の刺激条件下（希釈したレモン液滴を口底上に適用）（白丸）ではより多く検出された。

健常男性から採取したヒト唾液試料の統計解析は、オピオルフィン濃度の中央値は基礎条件下で５０ng/ml（ｎ＝１０）であり、一方唾液分泌の化学的刺激条件下では８７０ng/ml（ｎ＝６）であることを示した。従って、男性のオピオルフィンの唾液分泌は、クエン酸による口腔粘膜刺激条件下では有意に上昇した（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定、図５）。

同年齢の健常女性から採取したヒト唾液試料では、オピオルフィン濃度の中央値は基礎条件下で５７ng/ml（ｎ＝１１）であり、刺激条件下では１４１ng/ml（ｎ＝１４）であった。女性では唾液のオピオルフィンレベルの大きな不均一性のために、基礎条件と刺激条件との差は有意ではなかった。しかし唾液分泌の化学的刺激条件下では、男性の唾液中のオピオルフィンレベルは女性の唾液中より有意に高かった（ｐ＜０．００５、マン・ホイットニーＵ検定、図５）。

興味深いことに、唾液腺を刺激する交感神経系の刺激条件下（ノルアドレナリン−ピロカルピンの注入）でのオスのラットのシアロルフィンの唾液分泌率は、口の神経末端の化学刺激条件下の男性のオピオルフィンと同様（１μg/ml）であった。一方、ヒトの唾液オピオルフィンの分泌率のように、オスのラットの唾液シアロルフィンの分泌率はメスのラットより有意に高かった（Rougeot et al, Eur. Biochem J. .1995）。

驚くべきことに、健常ボランティア女性の唾液オピオルフィンレベルで観察された大きな不均一性は、このうち一人（白丸、図５）が基礎条件（１０７２ng/ml）と刺激条件（１６３７ng/ml）の両方で高い唾液オピオルフィン濃度を有したという事実に関連していた。この試料に関連する臨床データは、この女性が甲状腺ホルモンで治療されたことを示した。従ってこの試料は、図６に示す最終的統計解析から除外した。

最後に、統計解析は、女性のオピオルフィン唾液分泌が、基礎条件と比較してクエン酸による口腔粘膜刺激条件下では有意に上昇していることを示した（ｐ＜０．０１、マン・ホイットニーＵ検定、図６）。

実施例２
健常ヒトボランティアの血漿中のオピオルフィンの定量
単純な酸−メタノール抽出法（唾液のように）の後に乾燥抽出物の５倍濃縮を行っても、主にＥＬＩＳＡイムノアッセイを妨害する血漿成分の存在のために、血漿中のオピオルフィンの検出を行うには不充分であった。従って、以下のプロトコールを適用した。

ヒト血漿の酸性化（ＨＣｌ、最終濃度０．１Ｎ）後、試料を「C18-SepPakカートリッジ抽出」章で記載したようにC18カートリッジ-SepPakで精製した。２０％及び４０％メタノールで溶出した画分中のマーカーオピオルフィンペプチド（ＱＲ［３Ｈ］ＦＳＲ）の回収率は、６８％±２％（ｎ＝４）であった。画分を凍結乾燥し、２５０μlのＨ２Ｏ−ＨＰＬＣ（初期の血漿容量１０mlに対して４０倍濃縮）で復元し、「逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィー」章で記載した方法に従ってＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけた。クロマトグラフィーシステム（ＡＣＥカラム）中の基準オピオルフィンペプチドの保持時間は２０±０．２分（ｎ＝４）であった。試料に対応する１５〜２６分／mlからのＨＰＬＣ画分を集め、凍結乾燥し、１２０μlのＨ２Ｏ−ＨＰＬＣで復元し、オピオルフィン含量をＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち１０mlのヒト血漿に対応する初期の試料容量と比較して、最終的な血漿試料を５３倍濃縮された。

図７に示すように、ヒト血漿抽出物（１ａ−１１と１ａ−１２）のＨＰＬＣ溶出プロフィールは、オピオルフィンが保持時間２０分で検出され、これは基準オピオルフィンペプチドの保持時間に正確に一致することを証明した。この確認工程は、４個のヒト血漿についてオピオルフィンの血漿レベルを確定することを可能にした。

興味深いことに、知覚反応のあるオスの成体ラットの循環シアロルフィンの生理学的範囲（１〜７ng/mlと確定された）（Rougeot and al. Am J Physiol, 1997）は、４個の試料について確定されたヒトのオピオルフィンの血漿濃度（約０．６〜２．７ng/ml）と同様であった。

実施例３
ヒトボランティアの精液中のオピオルフィンの定量
図８に示すように、酸−メタノール抽出前のＥＤＴＡ（最終濃度１mM）によるヒト精液試料の前処理は、抗オピオルフィン抗体によるオピオルフィン認識の決定的に重要工程であった。これは、精液中のオピオルフィンが精液中に含まれる陽イオンミネラル元素（すなわち、Ｚｎ＋＋イオン）（mM濃度範囲）を含み、生化学的前立腺マーカーを構成する分子複合体中に関連していることを示唆する。酸−メタノール抽出前に１個の試料に加えたマーカーオピオルフィンペプチドの回収率は７０％であった。

これらの抽出条件に従うと、ヒト精液中のオピオルフィンの生理学的濃度範囲は、１２．９±１．８ng/ml又は４３．６±１０．２（ＳＥＭ、ｎ＝１１）ng／射精容量と確定された（図９）。興味深いことにオピオルフィンはまた、精管と精嚢の異常に関連している（睾丸の精子形成が正常であっても不妊の場合を含む）先天性両側形成不全患者の精液中でも検出された。しかし、そのオピオルフィンレベル（４．９±１．０ng/ml、ｎ＝４）は、健常男性の精液のレベルより有意に低く、これらの患者の精液中のオピオルフィンの存在は、精液中のオピオルフィンの分泌がほとんど前立腺に由来することを示唆する。

Lunaカラムを使用するＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムでは、基準オピオルフィンペプチドの保持時間は２２〜２３分であった。これらのクロマトグラフィー条件下では、精子抽出物（３ａ−１３と３ｂ−０２、図１０）の分画とＥＬＩＳＡ分析は、免疫反応性精子オピオルフィンが主に保持時間２２〜２３分で溶出され、これは基準オピオルフィンペプチドの保持時間と充分に一致することを示した。すなわちヒト精液中の真正のオピオルフィンの存在が確認された。

実施例４
ヒトボランティアの尿中オピオルフィンの定量
尿試料（１ｂ−１５と１ａ−１４）の代表的オピオルフィン競合的ＥＬＩＳＡアッセイを図１１に示す。尿抽出物（黒丸と菱形）の連続希釈物から得られた免疫反応性は、基準ＱＲＦＳＲペプチド（黒四角）に対応する用量応答曲線と平行であった。これは、ヒト尿中に含まれていた天然のオピオルフィンペプチドが、純粋な合成ペプチドと同じ親和性で抗体に認識されたことを示す。

尿抽出物の存在下で既知濃度の合成ペプチドをインキュベーション後の免疫反応性オピオルフィンの平均回収パーセントは１００±１９％であり、ＥＬＩＳＡ検査で妨害性尿成分が存在しないことが確認された。

あるいは、尿抽出物（３ａ−１４）のＲＰ−ＨＰＬＣ分画とＥＬＩＳＡ分析は、免疫反応性オピオルフィンが、基準オピオルフィンペプチドの保持時間に一致する保持時間２１〜２２分で検出されたが、主要な免疫反応性ピークとして２８〜２９分の領域でも検出されることを示した。これは、尿中のオピオルフィンが会合して、より疎水性の高い分子複合体を形成することを示唆する。興味深いことにＥＤＴＡの非存在下では、精液抽出物で同じ種類のＨＰＬＣプロフィールが得られた。

ヒトの尿中のオピオルフィンの生理学的濃度範囲が、２個の試料について約１４〜２０ng/mlであることが確定された。

実施例５
ヒトボランティアからの涙中のオピオルフィンの定量

涙試料（１ｂ−１５と１ａ−１０）の代表的オピオルフィン競合的ＥＬＩＳＡアッセイを図１２に示す。１ｂ−１５涙抽出物（丸）の連続希釈物から得られた免疫反応性曲線は、基準ＱＲＦＳＲペプチド（黒四角、横軸の濃度は対数スケール）に対応する用量応答曲線と平行であった。これは、女性の涙中に含まれていた天然のオピオルフィンペプチドが、純粋な合成ペプチドと同じ親和性で抗体に認識されたことを示す。男性の涙（すなわち、１ａ−１０、図１２）のオピオルフィンレベルは、ほとんど検出限界以下であった（９個のうちの６個）。

健常女性から採取したヒト涙試料の統計解析は、オピオルフィン平均濃度が３１７±７９ng/ml（ｎ＝１４）であり、一方健常男性では４９±２５ng/ml（ｎ＝９）と評価されることを示した。涙中のオピオルフィンのレベルにおいて大きな不均一性が観察されたが、女性では男性より優位に上昇していた（ｐ＜０．０１、マン・ホイットニーＵ検定、図１３）。

涙抽出物（１ｂ−１４／１ｂ−０６／１ｂ−１５）のＲＰ−ＨＰＬＣ分画とＥＬＩＳＡ分析は、免疫反応性オピオルフィンが保持時間２０分で検出されるが、主要な免疫反応性ピークとして保持時間２６分と保持時間２９分でも検出されることを示した。

実施例６
ヒト母乳中のオピオルフィンの定量
７人の女性ボランティア（分娩後２〜５週）から採取した母乳試料中で大きなオピオルフィン免疫反応性が見いだされた。しかし母乳抽出物の大部分（メタノール抽出条件下で）について、連続希釈物から得られた免疫反応性曲線は標準ＱＲＦＳＲペプチドの用量応答曲線と平行ではなく、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを妨害する母乳成分の存在を示した。さらに母乳抽出物（２−０６）のＲＰ−ＨＰＬＣ分画とＥＬＩＳＡ分析は、免疫反応性オピオルフィンが保持時間２１分で検出されるが、保持時間２４〜２５分では主要な免疫反応性ピークとして、そして保持時間２８分でも検出されることを示した。すなわち、ＥＤＴＡの存在下での試料のSepPakカートリッジ抽出（ＥＬＩＳＡ妨害母乳成分を排除する精製法）後に、母乳中に真正のオピオルフィンが評価される。これらの抽出条件に従うと、ヒト母乳中のオピオルフィンの生理学的濃度範囲は２７±３ng/ml（１個の試料（２−０６）についてｎ＝９回の測定）であることが確定された。

配列

Claims (34)

1. 対象の病理状態の予測、診断、又はモニタリングのため、及び／又は対象の病理状態が塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（ＢＰＬＰ）遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認するための、塩基性プロリンリッチ涙液タンパク質（ＢＰＬＰ）遺伝子産物の使用。
2. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物がｍＲＮＡからなる、請求項１に記載の使用。
3. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物が、ＢＰＬＰタンパク質、ＢＰＬＰタンパク質に由来するペプチド、又はＢＰＬＰ前駆体タンパク質からなるＢＰＬＰペプチド、あるいは該ＢＰＬＰペプチドの成熟産物である、請求項１に記載の使用。
4. 前記ＢＰＬＰペプチドの成熟産物は配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンである、請求項３に記載の使用。
5. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物がバイオマーカーとして使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物のレベルが、対象の体液又は組織中で測定可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記体液が、血液、血漿、唾液、髄液、尿、涙、精液、及び母乳よりなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
8. 対象の病理状態の予測、診断、又はモニタリングのための方法であって、
   ａ）対象から得られた生体試料中のＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルを測定する工程；
   ｂ）工程ａ）で測定されたＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルをＢＰＬＰ遺伝子産物の基準値と比較する工程、とを含んでなり、
   ここで、基準値と比較してＢＰＬＰ遺伝子産物の有意に高い又は低いレベルが、病理状態の予測、診断、又はモニタリングの指標である、方法。
9. 前記診断が、病理状態が対象中のＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることを決定及び／又は確認することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
10. 基準値と比較してＢＰＬＰ遺伝子産物の有意に高い又は低いレベルが、病理状態が対象中のＢＰＬＰ遺伝子産物に関連していることの指標である、請求項９に記載の方法。
11. 対象の治療処方を計画する工程をさらに含んでなる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記試料が対象の体液又は組織である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記体液が、血液、血漿、唾液、尿、精液、涙、精液、及び母乳よりなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物がＢＰＬＰタンパク質成熟産物である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が、配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が、酸−メタノール抽出、及び／又はC18-SepPakカートリッジ抽出により抽出され、及び／又は逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製される、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記試料が唾液、精液、涙、又は尿であり、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が酸−メタノール抽出に抽出される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記試料が血漿又は母乳であり、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物がC18-SepPakカートリッジ抽出により抽出される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記試料が血漿であり、ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が、配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物の定量レベルがイムノアッセイを用いて測定される、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記イムノアッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記イムノアッセイがポリクローナル抗ＱＲＦＳＲ抗体を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
24. 前記ポリクローナル抗ＱＲＦＳＲ抗体が請求項３３に記載の抗体である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記試料が組織であり、ＢＰＬＰ遺伝子産物がｍＲＮＡである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
26. ・ＢＰＬＰ遺伝子産物を特異的に認識するための結合剤、
    ・該剤とＢＰＬＰ遺伝子産物との結合を検出するための試薬、及び
    ・場合により、陽性対照及び／又は陰性対照試料、
    を含んでなる、予測、診断、又はモニタリング検査のためのキット。
27. 前記ＢＰＬＰ遺伝子産物がＢＰＬＰタンパク質成熟産物である、請求項２６に記載のキット。
28. 前記ＢＰＬＰタンパク質成熟産物が、配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンである、請求項２６又は２７に記載のキット。
29. 前記結合剤が抗体又は分子プローブである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット。
30. 配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合するポリクローナル抗体の産生方法であって、
    ａ）オバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子に共有結合した配列番号４のペプチドを、非ヒト動物に投与する工程、そして
    ｂ）該ＱＲＦＳＲペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を選択する工程、
    を含んでなる方法。
31. 配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを得る方法であって、
    ａ）オバルブミン−（ＣＯ−ＮＨ）−分子に共有結合した配列番号４のペプチドを、非ヒト動物に投与する工程、
    ｂ）この動物から免疫グロブリン分泌リンパ球を取り出す工程、
    ｃ）該リンパ球をミエローマ細胞と融合させて、少なくとも１個の免疫グロブリン分泌ハイブリドーマを得る工程、
    ｄ）ＱＲＦＳＲペプチドに特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する工程、及び
    ｅ）場合により該抗体を単離する工程、
    を含んでなる方法。
32. 前記非ヒト動物がウサギである、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 請求項３０〜３２にいずれか１項の方法により得られる、配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンに特異的に結合する抗体。
34. オピオルフィンを含有することが可能な試料中の配列番号３のＱＲＦＳＲペプチドであるオピオルフィンを検出する方法であって、
    ａ）マイクロタイタープレートを配列番号４のペプチドでコーティングする工程であって、ここで第１残基と第２残基との間に６−ポリエチレン又は１２−ポリエチレンリンカーが導入されている、工程、
    ｂ）該試料と請求項３３のウサギポリクローナル抗体とを加える工程、
    ｃ）標識抗ウサギ抗体を加える工程、
    ｄ）標識抗ウサギ抗体を検出するのに適した発色基質を加える工程、及び
    ｅ）発色基質により生じるシグナルを検出する工程、
    を含み、これによりオピオルフィンを含有することが疑われる該試料中のオピオルフィンを検出する方法。

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