JP2021523367A - インビボ受容体占有率を決定するためのアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、目的の薬物の受容体への結合をモニターし、測定するためのアッセイに関する。このアッセイにおいて、前記目的の化合物を投与した対象から採取した血液試料を、クエンチャーを含む溶解溶液とインキュベートする。次いで、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、溶解させた血液試料から単離する。前記単離された薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を消化させて、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドを調製する。前記サロゲートペプチドの量を決定する。受容体占有率は、薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって決定することができる。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる２０１８年５月１０日提出の米国仮出願番号第６２／６６９，４４２号の優先権を請求する。

本発明の技術分野
本発明は、血液溶解物中の共有結合した化合物によるリアルタイムインビボ受容体占有率を直接測定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、臨床薬の開発のための薬力学的バイオマーカーとしてのリアルタイムインビボＢＴＫ受容体占有率の測定に関する。

本発明の背景技術
創薬と開発は、長期かつ高リスクのプロセスである。成功した新しい薬を開発するための平均コストは、早期の発見と開発プロセス間の数えきれない薬物候補の失敗について２６０億ドルとも推定され、臨床試験に入る薬物候補の全生存率は、１２％未満と推定されている（PhRMA Report, "Biopharmaceutical Research & Development: The Process Behind New Medicines", 2015）。これらの薬物候補の失敗を生じる主な問題は、後期開発段階、特に、概念実証（第ＩＩ期）臨床試験間における臨床的有効性が不十分であるか、または欠如することに関するものであった（Kola, I., et. al., J. Nature Reviews. Drug Discovery 2004, 3, 711-715; Arrowsmith, J., Nature Reviews. Drug Discovery 2011, 10, 87; Morgan, P., et. al., Drug Discovery Today 2012, 17, 419-424）。

開発中の多くの小分子薬物と生物製剤は、免疫系を調節するように設計されている。そのため、これらの薬物候補は、その所望される応答を得るために非常に低い用量レベルが必要とされることが多い。それゆえ、これらの薬物候補の薬物動態（ＰＫ）および薬物力学（ＰＤ）的特性の早期理解は、臨床試験のための適切な用量範囲を決定するために不可欠である（Topalian, S. L., et. al., The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2443-2454; Brahmer, J. R., et. al., The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2455-2465; Tolcher, A. W., et. al., Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology 2009, 27, 5800-5807; Hua, F., et. al., Journal of Clinical Pharmacology 2014, 54, 14-22; Rutgeerts, P. J., et. al., Gut 2013, 62, 1122-1130）。薬物開発段階中に臨床的有効性を向上させ、コストを減少させるために、ＰＤプロファイルの定量的測定は、臨床試験の合理的な設計のためのＰＫプロファイルと同様に重要である。これは、特にＰＤプロファイルが複数の用量で変化する場合に重要である。

受容体占有（ＲＯ）アッセイは、分子のその受容体タンパク質（または標的）への結合を測定し、ＰＤプロファイルを作成するために使用できる定量的データを供する（Liang, M., et. al., Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127）。ＲＯの測定は、前臨床動物モデルおよび臨床試験においてメカニズムに関連する有効性に不可欠な測定である。実際に、ＲＯは、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験において用量漸増を決定するために特に有用である。

ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）は、Ｂ細胞受容体、Ｆｃ受容体−およびＲＡＮＫＬ経路を介したシグナル伝達および活性化において重要な役割を果たす（Seiler, T., et. al., Expert Opin Investig Drugs 2017, 26, 909-915; Whang, J. A., et. al., Drug Discovery Today 2014, 19, 1200-1204）。抗体に基づく薬物において、前記ＲＯは、通常、遊離受容体の測定のための標的分子と競合する抗体およびその合計受容体の測定のための非競合抗体を用いてフローサイトメトリーによってモニターされる（Liang, M, et. al., Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127; Woska, J. R., Jr., et. al., Journal of immunological methods 2003, 277, 101-115）。しかしながら、小分子アンタゴニストにおいて、フローサイトメトリーによる占有された受容体を直接検出するための抗体試薬は存在していない。これまで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるイブルチニブのＢＴＫ ＲＯは、遊離（占有されていない）ＢＴＫの活性な占有部位に結合する蛍光結合プローブを用い、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび蛍光ゲルスキャンニングを用いて検出することによって調べられた（Honigberg, L. A.; J. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107, 13075-13080）。蛍光結合プローブに基づくアッセイは、遊離ＢＴＫの量を測定することのみができ、ウェスタンブロットを用いるさらなるアッセイが合計ＢＴＫを測定するために必要とされている。臨床試験で生じる試料は大量であるため、２つのアッセイ基盤の使用は実用的ではない。さらに、前記方法は、結合していない測定と合計測定との間の直接的な比較可能性を欠き、高いアッセイバリエーションを生じる。

最近、ビオチン化共有結合プローブを用いたＥＬＩＳＡに基づくＢＴＫ ＲＯアッセイが、アカラブルチニブおよびＣＣ−２９２の臨床試験で報告され、利用されている（Barf, T., et.al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2017; Evans, E. K., et. al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2013, 346, 219-22）。この方法では、遊離ＢＴＫのみが検出され、薬物が結合したＢＴＫ（ＤＢ−ＢＴＫ）が洗い流される。合計ＢＴＫ濃度は、合計ＢＴＫレベルが試料中に一定のままであるものと推定し、投薬前の試料を用いて決定される。

あるいは、遊離および合計ＢＴＫのための別の時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）に基づくアッセイは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＢＴＫ占有率を推定するために用いることができる（２０１６年１０月２３〜２６日開催の第７回Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ（ＡＣｏＰ７）（ワシントン州、ベルビュー）におけるＬｕｔｚ，Ｊ．Ｄ．Ｎらのポスター発表）。しかしながら、前記遊離および合計ＢＴＫは、同一試料において同時ではなく別々に測定され、合計ＢＴＫレベルは、試料間で顕著に変動することが見出された（上記のHonigberg, L. A.）。それゆえ、前記ＥＬＩＳＡまたはＴＲ−ＦＲＥＴに基づく方法は、方法の選択から生じる固有の変動によって制限される。

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイは、その優れたアッセイ選択性および多重化能力のため、タンパク質の定量における可能性を示している（Neubert, H., et. al., Bioanalysis 2014, 6, 1731-1733）。特に、免疫捕捉エンリッチメント（immunocapture enrichment）、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を組み合わせた「ハイブリッド」ＬＢＡ−ＬＣ−ＭＳアッセイは、優れた検出選択性でタンパク質バイオマーカーまたは治療薬を測定するための強力な技術基盤となっている（Stevenson, L., et. al., Bioanalysis 2013, 5, 2903-2918）。前記ＬＣ−ＭＳアッセイの主な利点は、同一試料においてＤＢ−ＢＴＫおよび遊離ＢＴＫの両方を同時に定量化するためのその能力である。それゆえ、前記ＲＯ測定は、試料またはランの変動性によって非常に影響を受けにくい。

しかしながら、ＬＣ−ＭＳアッセイの開発は、多くの難題を有する。第一に、薬物を投与した動物またはヒトに由来する血液試料は、過剰量の薬物を含みうるものであり、生体外で遊離受容体と反応して薬物結合受容体を形成し、その結果、ＲＯの過大評価となる。第二に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、通常、ＥＬＩＳＡアッセイより感度が低い。

本発明は、目的の薬物の受容体への結合をモニターし、測定するためのアッセイに関する。このアッセイにおいて、目的の化合物を投与した対象から採取した血液試料を、クエンチャーを含む溶解溶液とインキュベートする。次いで、前記薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、前記溶解された血液試料から単離する。前記単離された薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を消化させて、サロゲート薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したペプチドを調製する。前記サロゲートペプチドの量を決定する。受容体占有率は、薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって決定することができる。

本発明の１の実施態様において、目的の化合物は、前記受容体に共有結合する。

本発明の別の実施態様において、前記クエンチャーは、目的の化合物と競合して、前記目的の化合物と同一部位で前記受容体と不可逆的に結合する。

本発明の別の実施態様において、前記クエンチャーを、前記目的の化合物のモル過剰レベルで前記緩衝液に加える。本発明の別の実施態様において、前記クエンチャーを、内在の受容体濃度に基づいて、１０５〜１０００倍過剰量で前記緩衝液に加える。

本発明の別の実施態様において、クエンチャーを含む溶解溶液を、血液試料を採取した後即時に加える。本発明の別の実施態様において、クエンチャーを含む溶解溶液を、血液試料採取後５分以内に加える。

本発明の別の実施態様において、前記薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、免疫捕捉工程を用いて単離する。本発明の別の実施態様において、前記受容体は、固形担体（例えば、磁気ビーズ、アガロースビーズまたはカラム充填物質）上に固定された捕捉薬剤に特異的に結合し、それにより捕捉抗体にあまり強く結合しない他の内在性タンパク質およびペプチドから分離される［Fung, E.N. et al., Bioanalysis 2016, 8, 847-856］。

本発明の別の実施態様において、前記薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、消化工程前に免疫捕捉基質から除去する。

本発明の別の実施態様において、前記薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、免疫捕捉基質と結合させたままで消化させる。

本発明の別の実施態様において、消化工程で用いられるプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される。プロテアーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼが挙げられる。

本発明の別の実施態様において、前記薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドを、１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランにより同時に測定する。

本発明の別の実施態様において、受容体占有率は、薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって算出する。

本発明の１の実施態様において、受容体占有率は、１）受容体に不可逆的に結合する目的の化合物を投与した対象から血液を採取し、２）前記採取した血液に、前記目的の化合物と同一部位に不可逆的に結合するクエンチャー化合物を含む溶解溶液を即時加え、３）薬物およびクエンチャーが結合した受容体を、免疫捕捉工程を用いて、溶解されクエンチされた血液試料から単離し、４）前記単離された薬物およびクエンチャーが結合した受容体を、免疫捕捉基質にさらに結合させながら消化させ、５）薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの量を、１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランで同時に測定し、次いで６）薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって受容体占有率を決定することで測定する。

上記実施態様の１の好ましい態様において、受容体は、ＢＴＫであり、目的の化合物は、図１Ａで示され、ならびに対応するクエンチャーは、図１Ｂで示される。

上記実施態様の別の好ましい態様において、前記免疫捕捉基質は、ストレプトアビジンＴ１捕捉ビーズである。

上記実施態様の別の好ましい態様において、ｍＡｂクローン＃ＭＡＢ５８０７またはｍＡｂクローン＃ＭＡＢ Ｄ３Ｈ５は、免疫捕捉基質に結合した抗ＢＴＫ抗体である。

上記実施態様の別の好ましい態様において、単離されたクエンチャーが結合し、かつ薬物が結合したＢＴＫは、免疫捕捉ビーズとさらに結合させながらトリプシンで消化させる。

上記実施態様の別の好ましい態様において、ＢＴＫ受容体占有率は、薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって算出する。

本発明の１の実施態様において、ＢＴＫ受容体占有率は、１）図１Ａで示される化合物を投与した対象から血液を採取し、２）図１Ｂで示されるクエンチャー化合物を含む溶解溶液を即時加え、３）薬物およびクエンチャーが結合したＢＴＫを、免疫捕捉工程を用いて単離し、４）前記単離された薬物およびクエンチャーが結合したＢＴＫを、免疫捕捉ビーズとさらに結合させながらトリプシンで消化させ、５）薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの量を、１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランで同時に測定し、次いで６）薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによってＢＴＫ受容体占有率を決定することで測定する。

図１Ａおよび１Ｂは、Ａ）化合物Ａ；Ｂ）クエンチャー化合物の構造を示す。 図２は、ヒトおよびサル（アカゲザル／カニクイザル）にそれぞれ由来するＢＴＫタンパク質の配列アラインメントを示す。囲み部分は、解析に用いたトリプシンペプチドを示す。前記アミノ酸配列内において、Ｃｙｓ４８１（矢印を付けた）は、化合物Ａ（ＤＢ−ＢＴＫ）またはクエンチャー化合物（ＱＢ−ＢＴＫ）のいずれかに結合する。図１Ａまたは１Ｂの化合物に結合するトリプシンペプチドＱＲＰＩＦＩＩＴＥＹＭＡＮＧＣＬＬＮＹＬＲ（配列番号１、表１で示される）を定量のために用いた。 図３は、免疫捕捉ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＢＴＫ ＲＯアッセイの模式図を示す。用いたサロゲートペプチドは、薬物が結合したペプチド（ＤＢ−ＱＲＰ）およびクエンチャーが結合したペプチド（ＱＢ−ＱＲＰ）である。 図４は、異なる製造業者による捕捉抗体（■ ｍＡｂ−Ｄ３Ｈ５、□ ｍＡｂ−ＭＡＢ５８０７）が、ヒト血液中の内在性ＢＴＫと組み換えＢＴＫ（標準物質として使用）との間で異なる免疫捕捉能力を有することを示す。 図５Ａ〜５Ｄは、ＤＢ−ＢＴＫ（５Ａおよび５Ｂ）およびＱＢ−ＢＴＫ（５Ｃおよび５Ｄ）から調製したサロゲートペプチドの５０℃（５Ａおよび５Ｃ）または６０℃（５Ｂおよび５Ｄ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ応答におけるトリプシン濃度、消化時間の効果を示す。サロゲートペプチドのＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰを、ＴｈｅｒｍｏのＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計を用いてＬＣ−ＨＲＭＳにより測定した。前記試験を各条件につき３回行った。 図５Ａ〜５Ｄは、ＤＢ−ＢＴＫ（５Ａおよび５Ｂ）およびＱＢ−ＢＴＫ（５Ｃおよび５Ｄ）から調製したサロゲートペプチドの５０℃（５Ａおよび５Ｃ）または６０℃（５Ｂおよび５Ｄ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ応答におけるトリプシン濃度、消化時間の効果を示す。サロゲートペプチドのＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰを、ＴｈｅｒｍｏのＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計を用いてＬＣ−ＨＲＭＳにより測定した。前記試験を各条件につき３回行った。 図５Ａ〜５Ｄは、ＤＢ−ＢＴＫ（５Ａおよび５Ｂ）およびＱＢ−ＢＴＫ（５Ｃおよび５Ｄ）から調製したサロゲートペプチドの５０℃（５Ａおよび５Ｃ）または６０℃（５Ｂおよび５Ｄ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ応答におけるトリプシン濃度、消化時間の効果を示す。サロゲートペプチドのＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰを、ＴｈｅｒｍｏのＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計を用いてＬＣ−ＨＲＭＳにより測定した。前記試験を各条件につき３回行った。 図５Ａ〜５Ｄは、ＤＢ−ＢＴＫ（５Ａおよび５Ｂ）およびＱＢ−ＢＴＫ（５Ｃおよび５Ｄ）から調製したサロゲートペプチドの５０℃（５Ａおよび５Ｃ）または６０℃（５Ｂおよび５Ｄ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ応答におけるトリプシン濃度、消化時間の効果を示す。サロゲートペプチドのＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰを、ＴｈｅｒｍｏのＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析計を用いてＬＣ−ＨＲＭＳにより測定した。前記試験を各条件につき３回行った。 図６は、ＤＢ−ＢＴＫ（■）およびＱＢ−ＢＴＫ（□）の両方についての各電荷段階におけるシグナル応答の比較を示す。 図７Ａ〜７Ｃは、ＳｃｉｅｘのＴｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ５５００質量分光計から得られた（７Ａ）ＤＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６７．４における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；（７Ｂ）ＱＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６２．５における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；ならびに（７Ｃ）ＳＩＬ−ＱＢ−ＱＲＰペプチド（内部標準）に対してｍ／ｚ ９６５．９における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトルを示す。 図７Ａ〜７Ｃは、ＳｃｉｅｘのＴｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ５５００質量分光計から得られた（７Ａ）ＤＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６７．４における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；（７Ｂ）ＱＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６２．５における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；ならびに（７Ｃ）ＳＩＬ−ＱＢ−ＱＲＰペプチド（内部標準）に対してｍ／ｚ ９６５．９における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトルを示す。 図７Ａ〜７Ｃは、ＳｃｉｅｘのＴｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ５５００質量分光計から得られた（７Ａ）ＤＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６７．４における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；（７Ｂ）ＱＢ−ＱＲＰペプチドに対してｍ／ｚ ９６２．５における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル；ならびに（７Ｃ）ＳＩＬ−ＱＢ−ＱＲＰペプチド（内部標準）に対してｍ／ｚ ９６５．９における［Ｍ＋３Ｈ］３＋のエレクトロスプレー陽イオンＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトルを示す。 図８Ａ〜８Ｆは、ＤＢ−ＱＲＰ（ＤＢ−ＢＴＫのためのサロゲートペプチド）（８Ａ〜８Ｃ）およびＱＢ−ＱＲＰ（ＱＢ−ＢＴＫのためのサロゲートペプチド）（８Ｄ〜８Ｆ）、ならびにそれらの内部標準（ＩＳ）のための多重反応モニタリング（ＭＲＭ）クロマトグラムを示す；（８Ａおよび８Ｄ）ブランクサル血液溶解物（内在性ＢＴＫの存在をクエンチャーまたは薬物それぞれにより前もって処理することによって排除した）から得られた分析物のクロマトグラム；（８Ｂおよび８Ｅ）ＬＬＯＱおよびそのＩＳにおける分析物を含むサル血液溶解物から得られた分析物のクロマトグラム；（８Ｃおよび８Ｆ）ＩＳのみを含むサル血液溶解物から得られたＩＳのクロマトグラム。（ｃおよびｆ）［１３Ｃ９，１５Ｎ］−ＱＢ−ＱＲＰは、ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰのためのＩＳとして使用した。 図８Ａ〜８Ｆは、ＤＢ−ＱＲＰ（ＤＢ−ＢＴＫのためのサロゲートペプチド）（８Ａ〜８Ｃ）およびＱＢ−ＱＲＰ（ＱＢ−ＢＴＫのためのサロゲートペプチド）（８Ｄ〜８Ｆ）、ならびにそれらの内部標準（ＩＳ）のための多重反応モニタリング（ＭＲＭ）クロマトグラムを示す；（８Ａおよび８Ｄ）ブランクサル血液溶解物（内在性ＢＴＫの存在をクエンチャーまたは薬物それぞれにより前もって処理することによって排除した）から得られた分析物のクロマトグラム；（８Ｂおよび８Ｅ）ＬＬＯＱおよびそのＩＳにおける分析物を含むサル血液溶解物から得られた分析物のクロマトグラム；（８Ｃおよび８Ｆ）ＩＳのみを含むサル血液溶解物から得られたＩＳのクロマトグラム。（ｃおよびｆ）［１３Ｃ９，１５Ｎ］−ＱＢ−ＱＲＰは、ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰのためのＩＳとして使用した。 図９Ａ〜９Ｄは、図１Ａで示される化合物（ＢＭＳ−９８６１９５）を０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量で投与したサル＃５１４９、＃５１５１、および＃５１６９から得られたＰＫおよびＰＤ結果を示す。血液試料をＰＫ評価のために１日目に１、３、５、７、および２４時間で採取し（９Ａおよび９Ｂで示されるデータ）、ＰＤ評価のために投薬前、１、３、５、７、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で採取した（９Ｃおよび９Ｄで示されるデータ）（実施例２を参照のこと）。 図９Ａ〜９Ｄは、図１Ａで示される化合物（ＢＭＳ−９８６１９５）を０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量で投与したサル＃５１４９、＃５１５１、および＃５１６９から得られたＰＫおよびＰＤ結果を示す。血液試料をＰＫ評価のために１日目に１、３、５、７、および２４時間で採取し（９Ａおよび９Ｂで示されるデータ）、ＰＤ評価のために投薬前、１、３、５、７、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で採取した（９Ｃおよび９Ｄで示されるデータ）（実施例２を参照のこと）。 図９Ａ〜９Ｄは、図１Ａで示される化合物（ＢＭＳ−９８６１９５）を０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量で投与したサル＃５１４９、＃５１５１、および＃５１６９から得られたＰＫおよびＰＤ結果を示す。血液試料をＰＫ評価のために１日目に１、３、５、７、および２４時間で採取し（９Ａおよび９Ｂで示されるデータ）、ＰＤ評価のために投薬前、１、３、５、７、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で採取した（９Ｃおよび９Ｄで示されるデータ）（実施例２を参照のこと）。 図９Ａ〜９Ｄは、図１Ａで示される化合物（ＢＭＳ−９８６１９５）を０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量で投与したサル＃５１４９、＃５１５１、および＃５１６９から得られたＰＫおよびＰＤ結果を示す。血液試料をＰＫ評価のために１日目に１、３、５、７、および２４時間で採取し（９Ａおよび９Ｂで示されるデータ）、ＰＤ評価のために投薬前、１、３、５、７、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で採取した（９Ｃおよび９Ｄで示されるデータ）（実施例２を参照のこと）。

ＥＦＳ−ＷＥＢにより電子的に提出した配列表の参照
本出願とともに提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル12728WOPCT_ST25.txt（サイズ：１６ｋｂ、２０１９年４月８日作成）の電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の好ましい実施態様の下記の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解されうる。

本明細書で用いられるように、用語「不可逆的に結合」は、活性部位への共有結合を形成することによって、あるいは、単に、関連する時間基準で実質的に０であるように極めて強く結合することによって受容体に持続的に結合する化合物のタイプを意味する。

本明細書で用いられるように、用語「目的の化合物」および「薬物」は、交換可能に用いられ、目的の標的に結合する分子を意味する。

本明細書で用いられるように、用語「標的」および「受容体」は、ＲＯアッセイに着目して指し示す場合に交換可能に用いられる。

本明細書で用いられるように、用語「即時に」は、クエンチャー分子を含む溶解溶液を血液試料に加える時、血液試料が採取された後できるだけ早いことを意味する。あるいは、クエンチャー分子を含む溶解溶液は、血液試料が採取された後最初の５分以内に加えられる。

本発明は、インビボ受容体占有アッセイ、より具体的には、インビボブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）受容体占有（ＲＯ）アッセイの開発を記載する。測定感度は、結合または遊離の標的が５％以下でありうる非常に高いか、または非常に低い占有レベルでＲＯを決定することが重要である。

本発明は、ａ）目的の化合物で治療した対象から血液試料を採取し、ｂ）受容体特異的なクエンチャーを含む溶解溶液を前記血液試料に加え、ｃ）目的の受容体を単離し、ｄ）前記単離された受容体を消化させてサロゲートペプチドを調製し、ｅ）前記サロゲートペプチドの量を測定し、次いで薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの量と比較することによって受容体占有率を決定する工程を含む方法である。

目的の化合物を投与した対象から血液試料を採取すること
本発明の１の実施態様において、前記目的の化合物は、前記受容体の少なくとも１つのアミノ酸に不可逆的に結合する。目的の化合物の一例は、ＢＴＫに不可逆的に結合する図１Ａで示される化合物である。

受容体特異的なクエンチャーを含む溶解溶液を血液試料に加えること
受容体占有（ＲＯ）アッセイ開発の選択および感度に影響を与える多くの試行が行われた。特に、血液試料中の遊離の薬物および遊離の受容体の存在は、溶解工程の間に生体外で薬物が結合した受容体を生成しうるため、ＲＯの過大評価を生じうる。溶解工程の間に受容体特異的なクエンチャーを加えることは、遊離の受容体を、クエンチャーが結合した（ＱＢ）受容体に急速に変換し、それにより生体外において薬物が結合した受容体の形成を妨げることが知見された。

１の実施態様において、前記ＲＯアッセイは、血液試料をクエンチャーの存在下で溶解させて、内在性受容体を、クエンチャーが結合した受容体に変換し、それにより内在性薬物が結合した受容体の形成を妨げることを含む。

本発明の１の実施態様において、前記クエンチャーは、目的の化合物と同一のアミノ酸に不可逆的に結合する。好ましくは、前記クエンチャーは、受容体への結合において目的の化合物と競合する。本発明の別の実施態様において、前記クエンチャーは、溶解溶液に目的の化合物に対して過剰モルで加える。本発明の別の実施態様において、前記クエンチャーを含む溶解溶液は、血液試料を採取した後即時に加える。

当業者は、細胞溶解溶液を認識しうる。市販されている細胞溶解緩衝液には、ＮＰ−４０溶解緩衝液（ＴｈｅｒｏｍＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ａｂｂｅｘａ）、ＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｏｍＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、細胞溶解緩衝液（１０ｘ）（カタログ番号：９８０３，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が含まれる。前記溶解緩衝液は、細胞を非変性条件下で溶解するために用いられる。

クエンチャー化合物の一例は、ＢＴＫに不可逆的に結合する図１Ｂで示される化合物である。

薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を、細胞溶解溶液から単離すること
免疫捕捉は、標的タンパク質および捕捉薬剤の特有の免疫親和力を利用する高度に選択的な試料浄化方法である（Stevenson, L., et. al., Bioanalysis 2013, 5, 2903-2918）。内在性標的のために高い免疫捕捉効率を有する適切な捕捉抗体を選択することは、そのアッセイを成功させるために重要である。市販品として入手できない特異的な抗体の場合、それらの標的タンパク質に特異的な抗体を調製する方法は、当業者に公知である。

免疫捕捉効率を評価するために、抗体を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合する標的を用いてスクリーニングする。抗体は、薬物が結合する標的とクエンチャーが結合する標的の両方に対する高い親和性に基づいて選択される。例えば、ＢＴＫに特異的な抗体を選択するために、市販品として入手可能なｍＡｂクローン＃ＭＡＢ５８０７およびｍＡｂクローン＃Ｄ３Ｈ５の免疫捕捉能力を評価した。驚くべきことに、前記ｍＡｂクローン＃ＭＡＢ５８０７は、内在性ＢＴＫ、ＤＢ−ＢＴＫ、またはＱＢ−ＢＴＫを必要とされる感度で検出できなかったが、組み換えＢＴＫ、ＤＢ−ＢＴＫ、またはＱＢ−ＢＴＫに対して高い親和性を示す。図４に示されるように、内在性ＢＴＫからのＬＣ−ＭＳ反応は、ｍＡｂクローン＃５８０７を用いた場合に非常に低かったが、もう一方のクローンのｍＡｂクローン＃Ｄ３Ｈ５は、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した組み換えＢＴＫに対して中程度の反応を付与し、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した内在性ＢＴＫに対してより高い反応を付与した。最終的な目的は、ヒト血液中で薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した内在性ＢＴＫを決定することであったため、クローン＃Ｄ３Ｈ５をＢＴＫ ＲＯアッセイで使用するために選択した。

薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体サロゲートペプチドを調製すること
ＲＯアッセイで使用するために調製した受容体サロゲートペプチドは、目的の化合物の結合部位を含んでいる必要がある。また、前記サロゲートペプチドは、ＬＣ−ＭＳ検出に感度を有する必要がある。

本発明の１の実施態様において、単離された薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される１つまたはそれ以上のプロテアーゼで消化させる。許容可能なプロテアーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼが挙げられる。

表１は、様々なプロテアーゼで消化させたときに調製したサロゲートペプチドを記載する。
表１．様々なプロテアーゼで処理した場合に調製したＢＴＫペプチド

薬物が結合した標的およびクエンチャーが結合した標的の定量化は、代表的なサロゲートペプチドのＭＳ反応に基づくものであるため、これらのサロゲートペプチドの消化収率は、検出感度に極めて影響を与えうる。

本発明の１の実施態様において、消化工程は、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体の免疫捕捉基質からの溶解前または溶解後に行われる。好ましくは、前記消化工程は、標的が免疫捕捉基質に結合している間に行われる。例えば、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したＢＴＫを、免疫捕捉ビーズにさらに結合させながらトリプシン消化で処理した。

サロゲートペプチドの量を測定すること
本発明の１の実施態様において、受容体占有率は、クエンチャーが結合し、かつ薬物が結合したサロゲートペプチドを、１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランで同時に測定することによって決定することができる。

最初の方法開発期間中、反応物から調製したＤＢ−ＢＴＫおよびＱＢ−ＢＴＫは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）を用いて分析した。サロゲートペプチドから予測される正確な質量を用いることにより、全てのサロゲートペプチドを同定した。各電荷段階のシグナル存在数（signal abundance）を図６に示す。前記データは、ＤＢ−ＢＴＫおよびＱＢ−ＢＴＫの両方が３つの電荷段階において最も高い反応を付与し、それゆえ、前記［Ｍ＋３Ｈ］３＋イオンを、ＭＲＭ検出のための親イオンとしてＤＢ−ＱＲＰ（ＤＢ−ＢＴＫのサロゲートペプチド）およびＱＢ−ＱＲＰ（ＱＢ−ＢＴＫのサロゲートペプチド）の両方のために用いたことを示す。図７Ａ〜７Ｃに示されるように、数種類のプロダクトイオンをＭＳ／ＭＳスペクトルで示した。ｙ２イオン（ｍ／ｚ〜２８８）およびｂ６イオン（ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰについてｍ／ｚ〜７５５、ＩＳについてｍ／ｚ〜７６５）に対応するプロダクトイオンは、ｂ６イオンより良好なｙ２イオンでＭＲＭ検出のための優れた強度を示す。ｍ／ｚ〜２８８におけるｙ２イオンは、ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰのＭＲＭチャンネルで示される干渉ピーク（interference peak）を有するため、ｂ６イオンをＭＲＭ検出のためのプロダクトイオンとして使用した。

ブランクサル血液溶解物、ＤＢ−ＢＴＫについて０．２５０ｎＭおよびＱＢ−ＢＴＫについて０．１２５ｎＭのＬＬＯＱ濃度においてＤＢ−ＢＴＫおよびＱＢ−ＢＴＫが添加されたブランクサル血液溶解物からのＤＢ−ＱＲＰ、ＱＢ−ＱＲＰ、およびＩＳの典型的なＭＲＭクロマトグラムを図８ａ、８ｂ、８ｄ、および８ｅで示す。ＩＳのみを含むブランクサル血液溶解物からの［１３Ｃ９，１５Ｎ］−ＱＢ−ＱＲＰの典型的なＭＲＭマスクロマトグラムを図８ｃおよび８ｆで示す。コントロールブランクサル血液溶解物を分析した時のＤＢ−ＱＲＰ、ＱＢ−ＱＲＰ、またはＩＳのいずれの保持時間またはイオンチャネルにおいて前記ブランクサル溶解物からの顕著な干渉ピークは見出されなかった。ＤＢ−ＱＲＰ、ＱＢ−ＱＲＰ、およびそれらのＩＳは、５．０２、４．８７、および４．８７分の保持時間それぞれでＵＨＰＬＣカラムから溶出した。

定量化の下限値
ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰのための定量化の下限値（ＬＬＯＱ）は、標準曲線における両方の分析物について最も低い濃度である０．２５０ｎＭおよび０．１２５ｎＭであった。図８ｂおよび８ｅに示されるように、ＬＬＯＱ濃度レベルにおけるＤＢ−ＱＲＰまたはＱＢ−ＱＲＰのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は、少なくとも３またはそれ以上高かった。

標準曲線ならびにＱＣの正確性および精度
血液溶解物中のＢＴＫ ＲＯを定量化するための方法の検証について、全ての標準曲線を、ＤＢ−ＢＴＫについて０．２５０〜１２．５ｎＭ、およびＱＢ−ＢＴＫについて０．１２５〜１２．５ｎＭの範囲の標準曲線を用いて１／ｘ加重二次（weighted quadratic）回帰モデルに適合させた。各ランにおいて、較正標準の少なくとも３分の２については、それらの設定値（nominal values）から逆算された濃度の偏差が、±２０．０％以内（ＬＬＯＱレベルにおける±２５．０％）であった。表２〜３に示されるように、それらの設定値から逆算された濃度の偏差は、３回の正確および精度の高いランについて、ＤＢ−ＢＴＫでは、±１１．１％以内であり、ＱＢ−ＢＴＫでは、±１９．８％であった。前記正確性および精度は、品質管理サンプルを用いて評価した。
表２．ＤＢ−ＢＴＫアッセイのための標準曲線サンプルの精度および正確性から得られたデータ概要

表３．ＱＢ−ＢＴＫアッセイのための標準曲線サンプルの精度および正確性から得られたデータ概要

表４．アッセイ適格性（assay qualification）：２５、５０、および９０％のＢＴＫ占有率を含むサル血液溶解物から得られた品質管理データ

表４に示されるように、測定ＢＴＫ ＲＯ％と理論ＢＴＫ ＲＯ％との差異は、６個のＱＣ＿２５％ ＲＯ試料のうち１個および６個のＱＣ＿５０％ ＲＯ試料のうち１個を除いて、３回全てのランに対する全てのＱＣについて±５％以内であった。

ＣＶ％およびＤｅｖ％は、−１６．２％のＤｅｖ％であった１回のＱＣ＿２５％ ＲＯを除いて、３回のラン全てにおける全てのＱＣについて１０％以内であった（表５）。これらの結果により、前記方法は、サル血液溶解物におけるＢＴＫ ＲＯ％の分析について精度が高く正確であったことが示された。
表５．２５、５０、および９０％のＢＴＫ占有率を含むサル血液溶解物から得られた品質管理データ概要（ｎ＝６）

安定性試験
サル血液溶解物におけるＤＢ−ＢＴＫおよびＱＢ−ＢＴＫについて示された安定性を表６にまとめる。この結果により、ＤＢ−ＢＴＫおよびＱＢ−ＢＴＫの安定性は、ＤＢ−ＢＴＫまたはＱＢ−ＢＴＫの絶対濃度が、−８０℃での２回の凍結融解サイクル後、ＲＴで２４時間保存後、または−８０℃で２２４日間後に減少するにも関わらず、測定ＢＴＫ ＲＯ％と理論ＢＴＫ ＲＯ％との差が、全てのＱＣについて±５％であったため、ＢＴＫ ＲＯ％において影響がないか、最小限の影響であることが示された。
表６．２５％および９０％のＢＴＫ ＲＯ％における品質管理サンプルの安定性試験

免疫捕捉ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ受容体占有アッセイの使用
ＲＯ測定は、前臨床動物モデルおよび臨床試験においてメカニズムに関連する有効性のために不可欠な測定である。実用上、ＲＯは、最初のヒト（ＦＩＨ）試験において用量漸増を決定する際に特に有用である。

実施例１
薬物が結合したＢＴＫ（ＤＢ−ＢＴＫ）およびクエンチャーが結合したＢＴＫ（ＱＢ−ＢＴＫ）標準物および品質管理サンプルの調製
試薬と材料
図１Ａおよび１Ｂで示される薬物およびクエンチャー化合物は、各々、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ニュージャージー州、プリンストン）における研究開発により合成した。ビオチン化ウサギ抗ＢＴＫモノクローナル抗体（ロット番号：Ｄ３Ｈ５，カタログ番号：１２６２４）および１０ｘ緩衝液（カタログ番号：９８０３）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、ダンバーズ）から入手した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅストレプトアビジンＴ１ビーズ（カタログ番号：６５６０２）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州、カールスバッド）から入手した。組み換えＢＴＫタンパク質（カタログ番号：ＰＶ３５８７）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州、カールスバッド）から入手した。前記プロテアーゼ阻害剤（カタログ番号：５３９１３４）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（マサチューセッツ州、ビレリカ）から入手した。アッセイで用いた内部標準（ＩＳ）の［１３Ｃ９，１５Ｎ］−ＱＢ−ＱＲＰ（Ｎ末端およびＣ末端の両方に隣接アミノ酸を含む）（表８）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）（米国ニュージャージー州、プリンストン）における化学合成部門で合成した。サルＡＣＤ−Ａ全血は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（ニューヨーク州、ウェストベリー）から入手した。全ての他の試薬は、分析級のものであった。ＭａｇｎａＢｏｔ ９６マグネット分離デバイス（カタログ番号：Ｖ８１５１）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィスコンシン州、マディソン）から入手した。

薬物が結合したＢＴＫ（ＤＢ−ＢＴＫ）のための標準試料の調製
組み換えＢＴＫ（５．９μＭ，２００μＬ）を４００μＬのＰＢＳと合わせ、次いでアセトニトリル中の１．０ｍｇ／ｍＬの薬物溶液（図１Ａで示される化合物）の１５μＬ（２７０１μＭの薬物，１５μＬ）を添加した。次に、該溶液をＲＴで１時間インキュベートし、１９１９ｎＭのＤＢ−ＢＴＫ濃度とした。ＤＢ−ＢＴＫ濃度は、遊離ＢＴＫのＤＢ−ＢＴＫへの変換が過剰量の薬物の存在下で〜１００％であったため、反応で用いられる合計遊離ＢＴＫ量を基準にした。

クエンチャーが結合したＢＴＫ（ＱＢ−ＢＴＫ）のための標準試料の調製
組み換えＢＴＫ（５．９μＭ，２００μＬ）を４００μＬのＰＢＳと合わせ、次いでアセトニトリル中の１．０ｍｇ／ｍＬのクエンチャー溶液（図１Ｂで示される化合物）の１５μＬ（２８０６μＭのクエンチャー，１５μＬ）を添加した。該溶液をＲＴで１時間インキュベートし、１９１９ｎＭのＱＢ−ＢＴＫ濃度とした。ＱＢ−ＢＴＫ濃度は、遊離ＢＴＫのＱＢ−ＢＴＫへの変換が過剰量の薬物の存在下で〜１００％であったため、反応で用いられる合計遊離ＢＴＫ量を基準にした。

クエンチャーを含む溶解緩衝液混合物（０．０１３３ｘプロテアーゼ阻害剤および１．５μＭのクエンチャー溶液を含む２ｘ緩衝液）の調製
１５ｍＬの１０ｘ溶解緩衝液を含む１つのバイアルを、ＤＭＳＯ中の１．０ｍＬのプロテアーゼ阻害剤および８０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのクエンチャー溶液（図１Ｂで示される化合物）と混合した。次いで、該溶液を、７５ｍＬの合計体積とするために５９ｍＬの脱イオン化水で希釈した。

薬物を含む溶解緩衝液混合物（０．０１３３ｘプロテアーゼ阻害剤および１．５μＭの薬物溶液を含む２ｘ緩衝液）の調製
１５ｍＬの１０ｘ溶解緩衝液を含む１つのバイアルを、ＤＭＳＯ中の１．０ｍＬのプロテアーゼ阻害剤および８３μＬの０．５ｍｇ／ｍＬの薬物溶液（図１Ａで示される化合物）と混合した。次いで、該溶液を、７５ｍＬの合計体積とするために５９ｍＬの脱イオン化水で希釈した。

サル血液からの溶解物＋４３３（１００％ ＱＢ−ＢＴＫ）の調製
サルＡＣＤ−Ａ全血（３．５ｍＬ）を、１．５μＭのクエンチャー（図１Ｂで示される化合物）を含む７ｍＬの溶解緩衝液と合わせた。該試料を室温で１時間振盪した。

サル血液からの溶解物＋１９５（１００％ ＤＢ−ＢＴＫ）の調製
サルＡＣＤ−Ａ全血（３．５ｍＬ）を、１．５μＭの薬物（図１Ａで示される化合物）を含む７ｍＬの溶解緩衝液と合わせた。該試料を室温で１時間振盪した。

内在性ＢＴＫを含む血液溶解物を用いた品質管理サンプル（ＱＣ）の調製
ＢＴＫ ＲＯ ＱＣは、異なる割合の溶解物＋４３３および溶解物＋１９５を混合することによって調製する。２５％、５０％、および９０％のＢＴＫ ＲＯ％である低ＱＣ（ＬＱＣ）、中間ＱＣ（ＭＱＣ）、および高ＱＣ（ＨＱＣ）は、表７で示されるように、それぞれ、２２５０／７５０、１５００／１５００、および３００／２７００（ｖ／ｖ）の溶解物＋４３３／溶解物＋１９５を混合することによって調製した。
表７．内在性ＢＴＫを含むサル血液溶解物を用いた品質管理サンプルの調製

ａ溶解物＋４３３は、サル溶解物をクエンチャー溶液で前処理することによって得た（図１Ｂ）。
ｂ溶解物＋１９５は、サル溶解物を薬物溶液で前処理することによって得た（図１Ａ）。

ＤＢ−ＢＴＫ（ＢＴＫ＋１９５）標準曲線の調製（サル血液溶解物＋４３３を使用する）
ＤＢ−ＢＴＫの０．２５０、０．５００、１．００、２．００、５．００、１０．０、および１２．５ｎＭにおける較正標準（ＳＴＤ）を、ＤＢ−ＢＴＫ保存溶液（緩衝液中で１９１９ｎＭ）の各希釈によって０％のＤＢ−ＢＴＫを含むサル血液溶解物中で調製した。調製中、ＤＢ−ＢＴＫの２００および２０ｎＭの中間希釈物を、１９１９ｎＭのＤＢ−ＢＴＫ保存溶液を血液溶解物＋４３３で希釈することによって調製し、次いで最終ＳＴＤ試料にさらに希釈した。設定濃度は血液体積に基づき、血液溶解物中の実際の濃度は、３の希釈因子により各々の１／３であった。

ＱＢ−ＢＴＫ（ＢＴＫ＋４３３）標準曲線の調製（サル血液溶解物＋１９５を使用する）
ＱＢ−ＢＴＫの０．１２５、０．２５０、０．５００、１．００、２．００、５．００、１０．０、および１２．５ｎＭにおける較正標準（ＳＴＤ）を、ＱＢ−ＢＴＫ保存溶液（緩衝液中で１９１９ｎＭ）の各希釈によって０％のＱＢ−ＢＴＫを含むサル血液溶解物中で調製した。調製中、ＱＢ−ＢＴＫの２００および２０ｎＭの中間希釈物を、１９１９ｎＭのＱＢ−ＢＴＫ保存溶液を血液溶解物＋１９５で希釈することによって調製し、次いで最終ＳＴＤ試料にさらに希釈した。設定濃度は血液体積に基づき、血液溶解物中の実際の濃度は、３の希釈因子により各々の１/３であった。

抗ＢＴＫビオチン化抗体を有するストレプトアビジンＴ１捕捉ビーズの調製
免疫沈澱のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅストレプトアビジンＴ１ビーズの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。ビオチン化ｍＡｂの結合能は、２０μｇ ｍＡｂ／ｍｇビーズであった。合計２５ｍＬのストレプトアビジンＴ１ビーズを、各２．５ｍＬの１０個のチューブに分注した。該試料を３ｍＬのＰＢＳＴ溶液で洗浄した。ＤｙｎａＭａｇ（登録商標）−５マグネットを用いて該マグネットビーズを液体試料マトリックスから分離した。最後の洗浄液を捨て、該ビーズを各チューブ中の２．５ｍＬのＰＢＳＴで再懸濁し、次いで０．５００ｍＬのビオチン化抗ＢＴＫ抗体（１ｍｇ／ｍＬ，ロット番号：Ｄ３Ｈ５）を加えた。１０個のチューブ中の試料（０．５００ｍＬ）をＲＴで１時間インキュベートした。該ビーズを該溶液から分離し、各チューブ中のビーズを３ｍＬのＰＢＳＴで洗浄した。該チューブ中のビーズを２．５ｍＬのＰＢＳＴで再懸濁した。最終抗ＢＴＫ抗体濃度は、０．２μｇ／μＬのビーズであった。該試料を次の使用のために４℃で保存した。

血液溶解物からの薬物が結合したＢＴＫ（ＤＢ−ＢＴＫ）およびクエンチャーが結合したＢＴＫ（ＱＢ−ＢＴＫ）エンリッチメント（Enrichment）のための免疫捕捉
コントロールサル血液溶解物、較正標準、品質管理サンプル、またはサル試験試料についての３０００μＬの血液溶解物試料の一定分量を室温で遠心分離した。ビーズ上の抗ＢＴＫ捕捉抗体（０．２μｇｍＡｂ／μＬビーズで６０μＬ）を、遠心分離した試料の上澄み物に加え、該試料をＲＴで１２０分間インキュベートし、続いて遠心分離した。該上澄み物を除去し、ＰＢＳＴを該ビーズ試料に加えた。該試料をＴＥＣＡＮ液体ハンドラー上のＬｏｗＢｉｎｄ ９６ウェルプレートに移し、ＭａｇｎａＢｏｔ ９６マグネット分離デバイスの上に置いた。該ビーズを８００μＬのＰＢＳＴで２回洗浄し、続いて５００μＬの２５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）で洗浄した。洗浄緩衝液を除去し、ＬｏｗＢｉｎｄ ９６ウェルプレート中のビーズを下記に記載されるようなトリプシン消化に用いた。

トリプシン消化
（１００μＬの２５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）を加えた）ブランク溶解物を除き、ＩＳ（２５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）中の１００μＬの０．５μｇ／ｍＬ ＳＩＬ−ＱＢ−ＱＲＰ）を、９６ウェルプレート中のビーズに加え、２５μＬの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を各試料に加えた。該試料を、２５μＬの新たに調製した１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中で１６０ｎｇ／μＬのトリプシン溶液を加えることによって消化し、５０℃で３０分間インキュベートし、次いで２０μＬの５０％／５０％のＭｅＯＨ／ギ酸（ｖ／ｖ）でクエンチした。該試料を短くボルテックスし、次いでＭａｇｎａＢｏｔ ９６デバイスの上に置き、該上澄み物を新たな９６ウェルプレートに移し、続いて４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。該試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。

ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
アッセイ適格性および試料分析のために、Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州、フォスターシティ）からのＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００質量分光計をＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ取得のために用いた。

下記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件を、アッセイ適格性およびＰＤ試料分析のために用いた。処理した試料それぞれについて、該消化物の５０μＬ体積を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システム（モデルＬＣ−３０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（メリーランド州、コロンビア））に入れた。下記に記載のＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件を、サル血液溶解物中の占有されクエンチされたＢＴＫの定量化のために特に用いた。Ｗａｔｅｒｓ ＣＯＲＴＥＣＳ（登録商標）ＵＰＬＣ Ｃ１８＋カラム（２．１×１００ｍｍ，１．６μｍ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州、ミルフォード））を、ＤＢ−ＱＲＰおよびＱＢ−ＱＲＰペプチドの分析のために用いた。移動相Ａは、水中の０．１％ ギ酸から構成され；移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ ギ酸であった。ＵＨＰＬＣ分離は、グラジエント溶離液（１５％ Ｂで開始し、０．５分間保持し、続いてＢ％を２．５分で１５％から３０％に変化させ、さらにＢ％を４．９分で３０％から４５％に変化させ、次いでＢ％を０．１分で４５％から９０％に増加させ、１分間保持し、続いてＢ％を０．１分で９５％から１５％に減少させ、１．０分間保持し、１０．０分で停止した）を用いて行った。流速は０．６００ｍＬ／分であり、カラム温度は６０℃であった。バルブ設定を切り替え、ＵＨＰＬＣ溶離液を、３．０〜６．５分の時間でＡＢ Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州、フォスターシティ）から入手したターボイオンスプレー源（turbo ion spray source）を備えたＴｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００（登録商標）質量分光計に入れた。該質量分光計は、下記設定で陽性エレクトロスプレーイオン化モードにおいて操作した：Ｃｕｒｔａｉｎガス，３０ユニット；ＣＡＤガス，９ユニット；ガス１，６５ユニット；ガス２，６５ユニット；正の４０００Ｖのターボイオンスプレー電圧および６００℃のターボプローブ温度。該質量分光計は、ＱＢ−ＱＲＰ、ＤＢ−ＱＲＰ、およびＳＩＬ−ＱＢ−ＱＲＰ（ＩＳ）のそれぞれについてｍ／ｚ ９６２．４９３＞７５５．４０、９６７．１７４＞７５５．４０、および９６５．８２５＞７６５．５０のトランジション（transition）でＭＲＭモードにおいて操作した（表８）。生データを、クロマトグラムのピーク積分のためにＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェア（バージョン１．６．２，ＡＢ ＳＣＩＥＸ）を用いて処理し、処理した結果を、較正標準の回帰およびＱＣおよび他の試料の濃度計算のためにＷａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（登録商標）（バージョン７．４，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に転送した。アッセイ性能に関する統計学的データ（ＡＮＯＶＡ）を、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（登録商標）を用いて算出した。

表８．サロゲートペプチドおよびそれらの安定な放射性同位体で標識した内部標準についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出のために用いたＭＲＭトランジション

ａこのサロゲートペプチドは、トリプシンペプチドの２１アミノ酸の最初の３アミノ酸の記号に基づいてＱＲＰと命名する。ＤＢ−ＱＲＰ＝薬物が結合したＱＲＰペプチド；ＱＢ−ＱＲＰ＝クエンチャーが結合したＱＲＰペプチド。
ｂＦ＊の記号は、［１３Ｃ９，１５Ｎ］−フェニルアラニンを表す。下線のペプチド部分は、トリプシンペプチドであり、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイでモニターした。

アッセイ適格性
正確性および精度によるアッセイ適格性を、さらなる安定性試験（ＢＴＫ ＲＯ ＱＣの凍結融解、ＲＴおよび長期安定性を含む）とともに行う。方法の直線性は、全ての適格性の実行において７つのＤＢ−ＢＴＫ（０．２５０ｎＭ〜１２．５ｎＭ）または８つのＱＢ−ＢＴＫ（０．１２５ｎＭ〜１２．５ｎＭ）転正曲線点を用いて評価した。１／ｘ加重による二次回帰モデルを定量化のために用いた。受容基準は下記のとおりであった：実施それぞれにおいて、較正標準の少なくとも３分の２について、それらの設定チから逆算した濃度の偏差が±２０．０％以内であった（ＬＬＯＱレベルの±２５．０％）。ＢＴＫ ＲＯ ＱＣのためには、各レベルのＱＣの少なくとも５０％について、測定ＢＴＫ ＲＯ％と理論ＢＴＫ ＲＯ％との差異が±５％以内であるべきである。例えば、ＢＴＫ ＲＯ ＱＣ＿２５％について、測定ＢＴＫ ＲＯ％は、２５．０±５．０％以内であるべきである。前記アッセイ選択性は、ブランク血液溶解物のみであるＱＣ０（ＩＳのみを含むブランク溶解物）を用いて評価した。

実施例２
サルＰＤ試験への適用
確率されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイと比較したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＢＴＫ ＲＯアッセイの有用性およびロバスト性を評価するために、図１Ａで示される化合物の単回漸増用量試験を行った。カニクイザルに、薬物化合物１Ａを０．１、０．２、および０．５ｍｇ／ｋｇのＰＯで投与した。血液試料は、実施例３に記載のＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）によるＢＴＫ ＲＯアッセイを用いるＰＫ評価のために１日目に１、３、５、７、および２４時間で採取し、ＰＤ評価のために投与前、１、３、５、７、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間に採取した。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＢＴＫ ＲＯアッセイのためのＰＤ試料
ＰＤ試料の採取前に、２ｘ溶解緩衝液を０．０１３３ｘプロテアーゼ阻害剤および１．５μＭのクエンチャー（図１Ｂで示される化合物）溶液とともに含む下記の溶解緩衝混合液を調製した：１５ｍＬの１０ｘ溶解緩衝液を含む１つのバイアルに、１．０ｍＬのプロテアーゼ阻害剤および８０μＬのＤＭＳＯ中の０．５ｍｇ／ｍＬのクエンチャー化合物１Ｂを混合した。次いで、該溶液を７５ｍＬの合計体積とするために５９ｍＬの脱イオン水で希釈した。

上述したように、２ｍＬの血液試料を前記設定時点で採取した。１．５ｍＬの採取した血液を３ｍＬの溶解緩衝混合液（クエンチャー化合物１Ｂを含む）に溶解した。混合直後に、該試料を室温で１時間振盪した。該血液溶解試料を採取後すぐに−７０℃またはそれ以下で保存した。該試料は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイによる免疫捕捉のために使用した。

実施例３
ＬＢＡによるＢＴＫ ＲＯアッセイ
サルＡＣＤ−Ａで処理した全血を、投薬後の設定時点で採取し、９６ウェルのＶ底の２ｍＬプレート（Ｃｏｓｔａｒ，カタログ＃３９６０）に加え、次いでプロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カタログ＃５３９１３４）およびビオチン化プローブ（ＢＭＴ−１０５１８６）を含む２ｘ溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，カタログ＃９８０３）で溶解した。該溶解物を、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｎｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）カタログ＃１５１２８）に移し、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、抗ＢＴＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，カタログ＃８５４７，ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ ＢＳＡ中で１：１０００希釈）を加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。該プレートを洗浄し、続いてヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体（インビトロジェン，Ｇ２１２３４）をＰＢＳ＋０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ ＢＳＡ中において１：２，５００希釈で加えた。該ＥＬＩＳＡを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ，カタログ＃Ｔ０４４０）を加えて発色させ、２．０Ｎ 硫酸を加えて停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を読み、試験試料のＢＴＫ不活性の相対％を、溶解前の完全なＢＴＫ不活性を考慮に入れるために、２μＭ ＢＭＴ−１２６８６７で前処理した血液に由来するクエンチされた溶解物と混合した通常のサル血液に由来する異なる比率の溶解物を含む試料の標準曲線から算出した。

ＬＣ−ＭＳによる薬物動態分析
０．５ｍＬのサル血液を、ＰＫ評価のために設定時点で採取した。各血液試料を遠心分離して血漿を分離した。１０μＬの１２５μＭ クエンチャー溶液（図１Ｂで示される化合物）を２００μＬの血漿にすぐに加えた。混合後、該試料を−２０℃で保存し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。

Claims (7)

1. 受容体占有率を測定するためのアッセイ方法であって、
   ａ．受容体に不可逆的に結合する目的の化合物で治療した対象から血液試料を採取し、
   ｂ．クエンチャーを含む溶解溶液を前記血液試料に加え、
   ｃ．目的の受容体を単離し、
   ｄ．前記単離された受容体を消化させてサロゲートペプチドを調製し、
   ｅ．前記サロゲートペプチドの量を測定し、次いで薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって薬物の受容体占有率を決定する
   工程を含む、アッセイ方法。
2. 目的の受容体に共有結合する目的の薬物を投与した対象における薬物の受容体占有率を決定するためのアッセイ方法であって、
   ａ．前記目的の薬物で治療した対象から血液試料を採取し、
   ｂ．前記目的の薬物と同一の受容体部位に不可逆的に結合するクエンチャーを含む溶解溶液を、前記血液試料に加え、
   ｃ．薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を免疫捕捉により単離し、
   ｄ．前記単離された薬物が結合し、かつクエンチャーが結合した受容体を消化させて、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドを調製し、
   ｅ．前記サロゲートペプチドの量を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、次いで薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって薬物に結合した受容体の量を決定する
   工程を含む、アッセイ方法。
3. 前記目的の薬物が、図１Ａで示されている、請求項２に記載のアッセイ方法。
4. 前記工程（ｂ）のクエンチャーが、図１Ｂで示されている、請求項２に記載のアッセイ方法。
5. 前記消化工程（ｄ）が、トリプシン消化である、請求項１または２に記載のアッセイ方法。
6. 前記サロゲートペプチドの量が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定される、請求項１に記載のアッセイ方法。
7. 図１Ａで示される薬物を投与した対象におけるＢＴＫ受容体占有率を測定するための方法であって、
   ａ．前記薬物を投与した対象から血液試料を採取し、
   ｂ．図１Ｂで示されるクエンチャーを含む溶解溶液を前記血液試料に加え、
   ｃ．薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したＢＴＫを、ストレプトアビジンＴ１ビーズに結合させた抗ＢＴＫビオチン化抗体を用いて単離し、
   ｄ．前記単離された薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したＢＴＫ抗体複合体をトリプシンで消化させて、サロゲートペプチドを調製し、
   ｅ．前記サロゲートペプチドの量を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラフィーを用いて測定し、次いで薬物が結合したサロゲートペプチドの量を、薬物が結合し、かつクエンチャーが結合したサロゲートペプチドの総量と比較することによって薬物に結合したＢＴＫの量を決定する
   工程を含む、方法。

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