KR20060022289A - 인터류킨-22 에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

인터류킨-22 에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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기르트루이다 엠 벨단
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Abstract

인터류킨-22 (IL-22), 특히 인간 인터류킨-22 에 결합하는 항체 및 그의 항체 결합 분절, 및 IL-22-관련 면역 응답성 조절에서의 그의 용도가 개시된다. 본원에 개시된 항체는 IL-22-관련 면역 장애, 예를 들어 자가면역 장애 (예를 들어, 관절염) 의 진단, 방지 또는 치료에 유용하다.

Description

인터류킨-22 에 대한 항체 및 그의 용도{ANTIBODIES AGAINST INTERLEUKIN-22 AND USES THEREFOR}
본 발명은 인터류킨-22 (IL-22), 특히, 인간 IL-22 에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 분절, 및 IL-22-관련 활성 조절에서의 그의 용도에 관한 것이다. 본원에서 개시되는 상기 항체는 IL-22-관련 장애, 예컨대, 자가면역 장애 (예컨대, 관절염) 의 진단, 예방 및/또는 치료에서 유용하다.
인터류킨-22 (IL-22) 은 IL-10 에 서열 상동성을 나타내는 클래스 II 싸이토카인이다. 그의 발현은 IL-9 또는 ConA 에 의해 T 세포에서 상향조절된다 (Dumoutier L. 등, (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (18): 10144-9). 추가적인 연구는, IL-22 mRNA 의 발현이 LPS 투여에 응답하여 생체내에서 유도되며, 급성 단계 반응을 표시하는 파라미터를 조절한다는 것을 보여준다 (Dumoutier L. 등, (2000) 상기 문헌 ; Pittman D. 등, (2001) Genes and Immunity 2: 172). 종합하면, 상기 관찰들은 IL-22 가 염증에서 역할을 한다는 것을 시사한다 (Kotenko S. V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223-40).
IL-22 은 제 I 형 싸이토카인 수용체 패밀리 의 두 멤버인 IL-22R 및 IL-10R2 로 이루어진 수용체 복합체에 결합하는 것으로 여겨진다 (CRF2) (Xie M. H. 등, (2000) J. Biol. 275 (40): 31335-9; Kotenko S. V. 등, (2001) J. Biol Chem 276 (4): 2725-32). IL-22 수용체의 두 사슬은 모두 다수의 기관에서 본질적으로 발현된다. 상기 기관 유래의 상피 세포주는 시험관 내에서 IL-22 에 대하여 응답성이다 (Kotenko S. V. (2002) Cytokine & Growth Factor reviews 13 (3): 223-40). IL-22 은 JAK/STAT3 및 ERK 경로 뿐만 아니라 기타 MAPK 경로의 중간체의 활성화를 유도한다 (Dumoutier L. 등, (2000) 상기 문헌 ; Xie M. H. 등, (2000) 상기 문헌; Dumoutier L. 등, (2000) J Immunol 164 (4): 1814-9; Kotenko S. V. 등, (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725-32; Lejeune, D. 등, (2002) J. Biol. Chem. 277 (37): 33676-82).
CRF2 구성원은 IFNα/β, IFNγ, 응고 인자 VIIa, IL-10 및 IL-10 연관 단백질 IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 뿐만 아니라 최근 동정된 IFN-형 싸이토카인, IL-28 및 IL-29 에 대한 수용체이다 (Kotenko S. V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223-40; Kotenko, S. V. 등, (2000) Oncogene 19 (21): 2557-65; Sheppard, P. 등, (2003) Nature Immunology 4 (1) : 63-8; Kotenko, S. V. 등, (2003) Nature Immunology 4 (1) : 69-77). 상기 멤브레인 수용체에 더하여, CRF2 패밀리에는 또한 가용성 단백질, IL-22 결합 단백질 (IL-22BP) 이 포함되는데, 이는 IL-22 에 대해 특이적이며 그의 활성을 블로킹한다 (Dumoutier, L. 등, (2001) J Immunol 166 (12): 7090-5; Kotenko, S. V. 등, (2001) J. Immunol 166 (12): 7096-103; Xu, W. 등, (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511-6; Gruenberg, B. H. 등, (2001) Genes & Immunity 2 (6): 329-34; Wei C-C 등, (2003) Genes & Immunity 4: 204-211). IL-22 수용체 복합체가 IL-22 에 대해 특별하지만, 각각의 사슬 (즉, IL-22R 및 IL- 10R2) 은 IL-20, IL-24 (IL-22R/IL-20R2), IL28, IL29 (IFN-λRl/IL-10R2) 및 IL-10 (IL-10Rl/IL-10R2) 에 대한 기능적 수용체를 정의하는 기타 CRF2 구성원과 공유된다 (Dumoutier, L. 등, (2001) J. ImmunoL. 167 (7): 3545-9; Wang, M. 등, (2002) J. Biol. Chem. 277 (9): 7341-7; Parrish-Novak, J. 등, (2002) J. Biol Chem 277 (49): 47517-23; Kotenko, S. V. 등, (1997) EMBO J. 16 (19): 5894-903; Spencer, S. D. 등, (1998) J Exp Med 187 (4): 571-8).
CRF2-로 이루어진 수용체의 두 사슬 모두 신호 전달에 필요하다. 구성되는 수용체의 한 사슬 (예컨대, IFNγR1) 은 역사적으로 싸이토카인에 대한 그의 높은 친화성을 근거로 리간드 결합 사슬 (예컨대, IFNγR1) 로서 정의된다. 나머지 사슬 (예컨대, IFNγR2) 은 헬퍼 또는 악세사리 사슬로서 특징화되는데, 싸이토카인 단독에 대해서는 최소한의 친화성을 나타낸다 (Kotenko, S. V. 등, (2000) Oncogene 19 (21): 2557-65). 더욱 최근의 결과는 두 수용체 사슬이 적어도 IL-10 및 IL-22 에 대해서는 결합 친화성을 부여할 수 있음을 시사한다 (Xie M. H. 등, (2000) J. Biol. Chem. 275 (40): 31335-9; Kotenko S. V. 등, (2001) J. Biol. Chem. 276 (4): 2725-32; Logsdon, N. J. 등, (2002) J Interferon Cytokine Res 22 (11): 1099-112).
발명의 개요
본 출원은 적어도 부분적으로는 인터류킨-22 ("IL-22"), 특히, 인간 IL-22 에 대해 높은 친화성 및 특이성을 갖고 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 분절과 같은 IL-22 결합제를 제공한다. 본 발명의 상기 항체 및 그의 항원 결합 분절은 또한 본원에서 각각 "항-IL-22 항체" 및 "그의 분절" 로 지칭된다. 한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22 안타고니스트이며, 이에 따라 하나 이상의 IL-22-관련 활성을 감소, 무력화 (neutralize) 및/또는 길항한다. 예를 들어, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22, 예컨대, IL-22 의 에피토프에 결합하고, IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 예컨대, IL-22 수용체 ("IL-22R") 및 인터류킨-10 수용체 2 ("IL-1OR2") 또는 그의 서브유닛 (예컨대, 각각의 IL-22R 또는 IL-1OR2) 을 포함하는 복합체 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해한다. 이에 따라, 본 발명의 항체 및 그의 분절은 IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 또는 그의 서브유닛 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 하기 위해 사용될 수 있다.
추가로, 본 출원인은 IL-22 의 생체내 투여가 급성 단계 반응의 파라미터를 감소시키며, 무력화 항-IL-22 항체 이용에 의한 IL-22 활성의 감소가 마우스 콜라겐-유도성 관절염 (CIA) 모델에서의 염증 병후를 완화시킨다는 것을 보였다. IL-22 mRNA 의 발현은 염증을 일으킨 부위에서 상향조절된다. 이에 따라, IL-22 안타고니스트가 예컨대, 무력화 항-IL-22 항체 및 그의 분절의 생체내에서 면역 억제 유도를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22-관련 장애, 예컨대, 자가면역 장애 (예컨대, 다발 경화증, 관절염 장애, 예컨대 류마티스 관절염); 호흡기 장애 (예컨대, 천식, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD)); 염증 상태, 예컨대, 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 심혈관계의 염증 상태 (예컨대, 죽상동맥경화증), 신경계의 염증 상태 (예컨대, 알츠하이머 질환), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염) 의 진단, 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서, 한 국면에서, 본 발명은 IL-22, 특히, 포유류 IL-22, 예컨대, 인간 또는 쥐과동물 IL-22 와 상호작용, 예컨대 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 무력화 항체이며, 예컨대, 하나 이상의 IL-22-관련 활성, 예컨대, 다른 것들 중에서도 특히케모카인 분비 (예컨대, GRO1 분비); 급성 단계 반응, 키나아제, 예컨대, STAT 단백질 (예컨대, STAT-3 단백질) 의 인산화, 세포 증식 (예컨대, HEPG2 증식 및/또는 인산화) 를 감소 또는 저해한다. 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 1OE-7 M, 바람직하게는 10E-8, 10E-9, 10E-10, 더욱 바람직하게는, 10E-11 M 미만의 친화성 상수 (Kd) 를 가진 높은 친화성 또는 더 높은 친화성으로 IL-22 에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 약 60 nM 이상, 전형적으로는 약 5 nM 내지 200 pM 의 ED50 으로 또는 더 강하게 하나 이상의 IL-22-관련 활성을 무력화할 수 있다. 다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 10E3 내지 10E7 1/Ms, 전형적으로는 10E4 내지 10E6 l/Ms 범위인 반응속도로 IL-22 와 회합한다. 또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 10E-2 내지 10E-6 l/s, 전형적으로는 10E-3 내지 10E-6 l/s 의 범위인 해리 반응 속도를 갖는다. 한 구현예에서, 항-IL 22 항체 또는 그의 분절은 IL-22, 예컨대 인간 IL-22 와, ATCC 접근 번호 PTA-5255 의 하이브리도마 세포주가 제공하는 모노클로날 항체 Ab-04; 또는 ATCC 접근 번호 PTA-5254 의 하이브리도마 세포주가 제공하는 Ab-02 와 유사한 친화성 및/또는 반응속도로 결합한다. 항-IL-22 항체 또는 그의 분절의 친화성은, 예컨대, 바이오센서 기술 (Biacore) (하기 실시예 5 및 22 를 참조) 을 이용하여 시험할 수 있다. 항-IL-22 항체의 저해 활성 (ED50) 은, 예컨대, 본원에 기재된 HEPG2 세포의 STAT 인산화 검정 또는 BaF3 증식 검정을 이용하여 시험될 수 있다 (예컨대, 실시예 20-21 를 참조).
한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절 (예컨대, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 분절) 은 모노클로날 또는 단일 특이성 항체이다. 항체 또는 그의 분절은 또한 인간, 인간화, 키메라성, CDR-그라프트, 또는 시험관내 유래 항체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체는 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD 및 IgE; 더욱 특별하게는, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 갖는다. 또다른 구현예에서, 항체는 예컨대, 카파 또는 람다로부터 선택되는 경홰를 갖는다.
또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은, 특이적으로 IL-22, 특히, 포유류, 예컨대, 인간 IL-22 (예컨대, 서열 번호 2 의 아미노산을 가진 인간 IL-22, 또는 서열 번호 2 의 아미노산 약 34 ∼ 179 유래의 성숙한 인간 IL-22 서 열, 또는 이들과 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 가진 서열) 에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 IL-22 의 분절, 예컨대, 서열 번호 2 에 해당하는 아미노산 서열에 대해 10, 20, 50, 75, 100, 150 또는 170 개 이상의 연속적인 아미노산의 분절; 또는 이와 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 가진 서열에 특이적으로 결합한다. 한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 특이적으로 인간 IL-22 에 결합하며, 비-인간 종들의 IL-22, 예컨대, 쥐과동물 (예컨대, 마우스 또는) IL-22 와 실질적으로 상호작용하지 않는다. 다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 2 가지 이상 형태의 포유류 IL-22, 예컨대, 인간, 비-인간 영장류 (예컨대, 원숭이) 및 쥐과동물 (예컨대, 마우스 또는 래트) IL-22 에 결합한다.
한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은, IL-22, 예컨대, 특히, 포유류, 예컨대, 인간 또는 쥐과동물 IL-22 의 에피토프, 예컨대, 선형 또는 입체배좌의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 예컨대, IL-22 및 IL-22R ("IL-22/IL-22R"), IL-22 및 IL-10R2 ("IL-22/IL-1OR2"), 및 IL-22, IL-22R 및 IL-10R2 ("IL-22/IL-22R/IL-10R2") 로부터 선택되는 복합체에 결합한다. 한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22 및 IL-22R 의 복합체에 결합함으로써, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절, IL-22 및 IL-22R 의 복합체를 형성한다. 항-IL-22 항체 또는 그의 분절의 결합은 복합체의 안정성을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 복합체와 IL-10R2 의 상호작용을 방해할 수 있다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 IL-22 에 결합하여, IL-22 과 IL-22 수용체 복합체, 예컨대, IL-22R 및 IL-10R2 를 포함하는 복합체의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 한다. 다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22 에 결합하여, IL-22 과 IL-22 수용체 복합체의 서브유닛, 예컨대, 각각의 IL-22R 또는 IL-10R2 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 한다. 또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22 에 결합하여, IL-22 및 IL-22R 의 복합체 ("IL-22/IL-22R") 와 IL-1OR2 의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 한다. 또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22 에 결합하여, IL-22 및 IL-10R2 의 복합체 ("IL-22/IL-10R2") 와 IL-22R 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 한다.
또다른 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은, IL-22, 예컨대, 포유류 IL-22 (예컨대, 인간 또는 쥐과동물 IL-22) 에 대한 결합에 대하여 IL-22 결합 단백질 (IL-22BP), 예컨대, 포유류 IL-22BP (예컨대, 인간 또는 쥐과동물 IL-22BP) 과 경쟁한다.
IL-22R 에 대한 IL-22 의 결합을 방해하는 항-IL-22 항체의 비제한적 예시는, "Ab-04" 이다. "Ab-04" (본원에서는 래트 모노클로날 항체 "P3/2" 로도 지칭함) 은 인간 IL-22 에 결합하여, 하나 이상의 IL-22 활성을 무력화시킨다 (실시예 5, 16, 17, 20 및 21 을 참조). Ab-04 를 제공하는 하이브리도마 세포주는, 2003 년 6 월 5 일에 ATCC 에 기탁되어, ATCC 접근 번호 PTA-5255 로 정해졌다. 항-IL-22 항체의 또다른 비제한적 예시는, IL-10R2 에 대한 IL-22 의 결합을 방해하는 "Ab-02" 이다. "Ab-02" (본원에서는 래트 모노클로날 항체 "P3/3" 로도 지칭함) 는 마우스 및 인간 IL-22 이며, 하나 이상의 IL-22 활성을 무력화한다 (실시예 5, 16, 17, 20 및 21 참조). Ab-02 를 제공하는 하이브리도마 세포주는 2003 년 6 월 5 일에 ATCC 에 기탁되어, ATCC 접근 번호 PTA-5254 로 정해졌다.
한 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 IL-22, 예컨대, 쥐과동물 또는 인간 IL-22 에 특이적으로 결합하며, IL-22, 예컨대, IL-22 (예컨대, 인간 또는 쥐과동물 IL-22) 상의 표적 에피토프에 대한 2 차 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 2 차 항체는 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체 유래의 하나 이상의 항원 결합 영역, 예컨대 가변 영역을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체의 1, 2, 3 또는 4 개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체 유래의 1 또는 2 개 이상의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체 유래의 1 또는 2 개 이상의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 유래의 1, 2 또는 3 개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR's) 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역 유래의 1, 2 또는 3 개 이상의 CDR's 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체 또는 그의 분절은 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유래의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 CDR's 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 모노클로날 항체는 예컨대, PTA-5254 및 PTA-5255 에서 선택되는 하이브리도마에 의해 제공된다.
본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 또다른 기능성 분자, 예컨대, 또다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 분절) 로 분화 또는 연결될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 항체, 또는 항원 결합 부분은 기능적으로 하나 이상의 기타 분자 부분, 예컨대 다른 것들 중에서도 특히 항체 (예컨대, 이중특이성 또는 다중특이성 항체), 독소, 방사성동위원소, 세포독성 또는 세포정지제에 기능적으로 연결 (예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비-공유결합성 회합 등) 될 수 있다.
또다른 구현예에서, IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절), 또는 그의 약제학적 조성물을 단독으로 또는, 기타 약제, 예컨대 IL-22-관련 장애의 치료에 유용한 치료제와 조합하는 병용 요법으로 투여된다. IL-22-관련 장애의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 하기로부터 선택되는 하나 이상의 장애가 포함된다: 자가면역 장애, 예컨대, 관절염 (류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 낭창 관련 관절염 또는 강직 척추염 포함), 공피증, 전신 홍반 루푸스, 맥관염, 다발 경화증, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 중증근육무력증, 염증성 장질환 (IBD), 크론씨 병, 당뇨병 (제 I 형); 염증 상태, 예컨대, 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 심혈관계의 염증 상태 (예컨대, 죽상동맥경화증), 신경계의 염증 상태 (예컨대, 알츠하이머 질환), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염); 심혈관 장애, 예컨대, 콜레스테롤 대사 장애, 산소 자유 라디칼 손상, 허혈; 상처 치유와 연관된 장애; 호흡기 장애, 예컨대, 천식 및 COPD (예컨대, 낭성 섬유증); 패혈증; 이식 거부 및 알러지. 한 구현예에서, IL-22-관련 장애는, 관절염, 예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 강직 척추염으로부터 선택되는 장애; 호흡기 장애 (예컨대, 천식, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD); 또는 염증 상태, 예컨대, 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 심혈관계의 염증 상태 (예컨대, 죽상동맥경화증), 신경계의 염증 상태 (예컨대, 알츠하이머 질환), 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염), 및 위장관 기관의 염증 상태, 예컨대, 대장의 염증, 크론씨 병 및 IBD 로부터 선택된다.
병용 요법은, 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대, 본원에서 더욱 상세히 기재된 바와 같은 하나 이상의 싸이토카인 및 성장 인자 저해제, 면역억제제, 항염 증제 (예컨대, 전신 항염증제), 대사 저해제, 효소 저해제, 및/또는 세포 살상제 및/또는 세포정지제와 공동제형화되고/되거나 공통투여되는 하나 이상의 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 를 포함할 수 있다.
하나 이상의 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트, (예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 와 공동투여 및/또는 공동제형화될 수 있는 바람직한 추가적인 치료제의 예시에는, 이에 한정되지 않으나 하기가 포함된다: TNF 안타고니스트 (예컨대, 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체, 또는 그의 항원 결합 분절로서, TNF 에 결합하는 것; TNF 수용체의 가용성 분절, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, EnbrelTM), p55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; TNF 효소 안타고니스트, 예컨대, TNFα 변환 효소 (TACE) 저해제); IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21/IL-21R 의 안타고니스트; T 세포 및 B 세포 제거제 (예컨대, 항-CD4 또는 항-CD22 항체); 소분자 저해제, 예컨대, 메토트렉세이트 및 레플루노마이드; 시롤리무스 (라파마이신) 및 그의 유사체, 예컨대, CCI-779; Cox-2 및 cPLA2 저해제; NSAIDs ; p38 저해제, TPL-2, Mk-2 및 NFkb 저해제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 저해제 (예컨대, 소분자 저해제, 그에 대한 항체, 예컨대, P-셀렉틴에 대한 항체); 에스트로겐 수용체 베타 (ERB) 아고니스트 또는 ERB-NFkb 안타고니스트. 하나 이상의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절과 공동투여 및/또는 공 동제형화될 수 있는 바람직한 추가적인 치료제의 예시에는 하기가 포함된다: TNF 수용체, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체의 가용성 분절, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, EnbrelTM) ; 메토트렉세이트, 레프루노마이드 또는 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, 예컨대, CCI-779.
이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 IL-22 가, 예컨대, 전신 염증에 대항하여 조직 염증의 증폭자 또는 조절자로서 작용함으로써 그의 염증 효과를 국소적으로 발휘하는 것으로 여긴다. 따라서, 예컨대, 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 이용한 IL-22 활성의 저해는, 전신 항염증 방식보다 더욱 유효하며 조직 특이적인 항염증 활성을 제공할 수 있다. 더욱이, 예컨대, 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 이용한 국소적인 IL-22 활성의 저해는 전신 항염증 방식과의 조합에 유용한 후보를 제공할 수 있다.
또다른 국면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 및 하나 이상의 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트, (예컨대, 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 을 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 조성물, 예컨대, 약제학적 조성물은, 2 가지 이상의 상기 언급된 IL-22 결합제, 예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절의 조합을 포함한다. IL- 22 안타고니스트, 예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절, 및 약물, 예컨대, 치료제 (예컨대, 본원에 더 기재된 바와 같은 하나 이상의 싸이토카인 및 성장 인자 저 해제, 면역억제제, 항염증제 (예컨대, 전신 항염증제), 대사 저해제, 효소 저해제, 및/또는 세포살상제 또는 세포정지제) 와의 조합이 또한 본 발명의 범위에 속한다.
Ab-02 또는 Ab-04 에 의해 인식되는 IL-22, 예컨대, 인간 IL-22 의 에피토프는 또한 본 발명의 범위에 속한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서의 급성 단계 반응을 저감, 저해 또는 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법에는, 대상체에게 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 를, 대상체에서의 급성 단계 반응을 저감, 저해 또는 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 대상체는 예컨대, 호흡기 장애, 염증 장애 및 자가면역 장애를 포함하는 IL-22-관련 장애를 앓는 포유류, 예컨대 인간이다. 한 구현예에서, IL-22 결합제는 국소적으로, 예컨대, 국소, 피하 또는 일반적 순환 중에 있지 않은 기타 투여법으로 투여된다.
또다른 국면에서, 본 발명은 IL-22 와 IL-22 수용체 복합체, 또는 그의 서브유닛, 예컨대 각각 IL-22R 또는 IL-10R2 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 조절, 예컨대 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 임의로는 IL-22 및 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛 (예컨대, 가용성 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛, 또는 멤브레인-회합 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛, 예컨대, IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛을 발현하는 세포) 를 제공하는 단계; IL-22 를 상기 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛과, IL-22 및 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛 사이의 상호작용이 발생하도록 하는 조건 하에 접하게 하여 IL-22/IL-22 수용체 혼합물을 형성하는 단계; 및 상기 IL-22/IL-22 수용체 혼합물을 하나 이상의 IL-22 결합제, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절과 접촉시켜, 상호작용을 조절, 예컨대 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 하는 단계를 포함한다.
대상 방법은 배양 중인 시험관내 (예컨대, 무세포 시스템) 세포 상에, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외에 이용될 수 있다. 예를 들어, IL-22 수용체-발현 세포는 배양 배지 중에서 시험관내 배양될 수 있으며, 접촉 단계는 하나 이상의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 배양 배지에 첨가함으로써 유효하게 될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은, 예컨대 생체내 프로토콜의 일부 (예컨대, 치료 또는 예방) 로서 대상체에 존재하는 세포에 적용될 수 있다.
또다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서의 IL-22-관련 장애의 치료 (예컨대, 그의 치료, 억제, 완화, 지연 또는 방지, 또는 재발생 또는 재발 방지) 의 방법을 특징으로 한다. 상기 방법에는 하기가 포함된다: 대상체에 대한 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 를, IL-22-관련 장애 치료에 충분한 양으로 투여함. 한 구현예에서, IL-22 결합제는 국소적으로, 예컨대 국소, 피하 또는 일반적인 순환 중에 있지 않은 기타 투여법으로 투여된다.
IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그 의 분절) 는 단독으로, 또는 대상체에 본원에 기재된 바와 같은 기타 치료 방식과 조합되어 투여된다. 한 구현예에서, 대상체는 예컨대, 호흡기 장애, 염증 장애 및 자가면역 장애를 포함하는 IL-22 관련 장애를 앓는 포유류, 예컨대 인간이다.
IL-22-관련 장애의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 하나 이상의 하기로부터 선택되는 장애가 포함된다: 자가면역 장애, 예컨대, 관절염 (류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 낭창 관련 관절염 또는 강직 척추염 포함), 공피증, 전신 홍반 루푸스, 맥관염, 다발 경화증, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 중증근육무력증, 염증성 장질환 (IBD), 크론씨 병, 당뇨병 (제 I 형) ; 심혈관 장애, 예컨대, 콜레스테롤 대사 장애, 산소 자유 라디칼 손상, 허혈, 죽상동맥경화증; 상처 치유와 연관된 장애; 호흡기 장애, 예컨대, 천식 및 COPD (예컨대, 낭성 섬유증); 염증 장애, 피부 (예컨대, 건선), 간 (예컨대, 간염), 신장 (예컨대, 신장염) 및 췌장 (예컨대, 췌장염); 패혈증; 암 (예컨대, 고형 종양 또는 연조직 종양); 이식 거부 및 알러지. 한 구현예에서, 상기 IL-22-관련 장애는, 관절염 장애, 예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 강직 척추염 중 하나 이상으로부터 선택되는 장애 (바람직하게는, 류마티스 관절염); 호흡기 장애 (예컨대, 천식, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD); 및 염증 상태, 예컨대, 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염) 이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서의 관절염 (예컨대, 류마티스 관절 염) 과 관련된 하나 이상의 병후를 치료 (예컨대, 감소, 완화) 또는 방지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에 대한 IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트, (예컨대, IL-22 항체 또는 그의 분절) 의, 하나 이상의 관절염 병후를 치료 (예컨대, 감소, 완화) 또는 방지하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 IL-22 항체는 치료용으로 또는 예방용으로, 또는 두가지 모두를 위해 투여될 수 있다. IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 대상체에 단독으로, 또는 본원에 기재된 기타 치료 방식과 조합되어 투여될 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 IL-22 관련 장애를 앓는 포유류, 예컨대 인간이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 시험관내 시료 (예컨대, 생물학적 시료, 예컨대 혈청, 혈장, 조직, 생검) 에서의 IL-22 의 존재성 검출 방법을 제공한다. 대상 방법은 장애, 예컨대, 면역 세포 관련 장애의 진단을 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 시료 또는 대조군 시료와 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 접촉시키는 단계 ; 및 (ii) 항-IL-22 항체 또는 그의 분절과 시료 또는 대조군 시료 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계로서, 대조군 시료에 대해 시료 내 복합체 형성시 통계적으로 유의미한 변화가 시료 중 IL-22 의 존재성의 표시인 단계.
또다른 국면에서, 본 발명은 생체내 IL-22 의 존재성 검출 방법 (예컨대, 대상체에서의 생체내 영상화) 을 제공한다. 대상 방법은 장애, 예컨대 IL-22-관련 장애의 진단에 이용될 수 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 본 원에 기재된 바와 같은 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을, 대상체 또는 대조군 대상체에게, IL-22 에 대한 항체 또는 분절의 결합을 허용하는 조건 하에 투여하는 단계; 및 (ii) 항체 또는 분절과 IL-22 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계로서, 대조군 대상체에 대하여 대상체에서의 복합체 형성시 통계적으로 유의미한 변화가 IL-22 의 존재성의 표시인 단계.
바람직하게는, 항체 또는 그의 분절은 결합 또는 비결합 항체의 검출을 촉진하기 위해 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지한다. 적합한 검출가능한 물질에는, 각종 효소, 보조군 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다.
IL-22-발현 세포에 대한 약제, 예컨대 치료제 또는 세포 살상제의 전달 또는 표적화 방법이 또한 개시된다.
치료 및 진단 용도를 위한 본 발명의 IL-22 결합제, 예컨대 IL-22 안타고니스트 (예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절) 를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위에 속한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 이용될 수도 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌이 전부 참고문헌으로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 발명의 명세서가 기준이 될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 오직 설명을 위한 것이고, 제한의 의도는 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백하다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 쥐과동물 관절염 모델에 대한 생체내 IL-22 항체의 유효성 분석에 이용된 실험 프로토콜을 보여주는 도식이다.
도 2 는 치료용 투약계획을 이용한, IL-22 항체가 있는 관절염 마우스 또는 대조군의 처리에 따른 바디 스코어를 보여주는 그래프이다.
도 3 은 예방용 투약계획을 이용한, IL-22 항체가 있는 관절염 마우스 또는 대조군의 처리에 따른 바디 스코어를 보여주는 그래프이다.
도 4 는 IL-22 항체가 있는 심한 관절염 마우스 또는 대조군의 처리에 따른 바디 스코어를 보여주는 그래프이다.
도 5 는 IL-22 항체 또는 대조군에 따른 조직학적 등급을 나타내는 앞발의 상대적인 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 6A-6B 는 IL-22 과 IL-22R 및 IL-1OR2 사이의 상호작용의 선형 표시이다. 도 6A 는 바이오-IL-22 가 고정된 IL-22R-Fc 에 결합하며 IL-10R2-Fc 에 대해서는 검출되지 않음을 보여주는 선형 그래프이다. 역방향 결합 실험으로부터 도출된 결과는 도 6B 에 그래프로 도시했다. IL-10R2-Fc 이 아닌, 가용성 IL-22R-Fc 은, 고정된 바이오-IL-22 에 결합한다. 상기 결과는, IL-22 및 IL-22R 사이에 상대적으로 강한 상호작용이 있는 반면, IL-10R2-Fc 는 IL-22 에 대해 오직 약간의 친화성이 있음을 알려준다.
도 7A-7B 는 CHO 조건화 배지에서의 수용체 Fc 융합체의 특징을 보여준다. 도 7A 은 IL-22R-Fc, IL-10R2-Fc 또는 이들 두 가지의 수용체 Fc 를 발현하는 CHO 세포의 조건화된 배지를 SDS-PAGE 겔 상에서 환원 (+βME) 및 비환원 (-βME) 조건 하에서 분리하여 도시하는 웨스턴 블럿의 패널이다. 상기 SDS-PAGE 겔은 멤브레인에 블럿팅한 후, 인간 IgG Fc, IL-22R 또는 IL-10R2 에 대한 폴리클로날 항체로 프로브했다. 환원 조건 (+βME, 도 7A) 하에, IL-22R 및 IL10R2-Fc CHO 주는 분자량이 ∼60 kD 종인 IL-22R-Fc 및 ∼85 kD 종인 IL-10R2-Fc 를 가진 인간 Fc 융합 단백질을 분비한다. 도 7B 는 IL- 22R-Fc (■), IL-10R2-Fc (○) 또는 두가지를 모두 (▲) 발현하는 CHO 세포로부터 조건화된 배지를 이용한 ELISA 로부터의 결과를 도시하는 선형 그래프이다. ELISA 플레이트는 토끼 항-인간 IL-22R 항체로 코팅했다. 두 가지 동종이합체의 1:1 혼합물을 또한 대조군 (△) 으로서 첨가했다. 결합된 수용체는 바이오틴화 염소 항-인간 IL-10R2 항체를 이용한 후, 스트렙타비딘-HRP 를 이용하여 검출했다. 도 7A-7B 에 나타낸 결과는 수용체 Fc 융합체가 CHO 세포로부터 동종이합체 및 이종이합체로서 분비된다는 것을 알려준다. IL-22R/IL-10R2-Fc 공동발현 CHO 세포는 대부분 이종이합체 및 IL-10R2-Fc 동종이합체를 분비한다.
도 8A-8B 는 Fc 융합체 이종이합체 또는 무작위로 병치시킨 동종이합체로서의 IL-22R 및 IL-10R2 두가지 모두와 IL-22 의 상호작용의 선형 표시이다. 도 8A 에서, IL-22R-Fc (■), IL-10R2-Fc (○) 또는 IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 두 가 지 모두 (▲) 를 발현하는 CHO CM 유래의 50ng/ml 의 총 Fc 를 항-인간 IgG 코팅 웰 상에 포획했다. 이어서, 바이오-IL-22 를 여러가지 농도로 웰에 첨가했다. 결합된 바이오-IL-22 는 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 을 이용하여 검출했다. 도 8B 에서, 여러가지 농도의 IL-22R-Fc CM 및 무관한 Fc 단백질(■), IL-22R-Fc CM 및 IL-10R2CM (△) 또는 공동-발현 세포 유래의 IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc CM 및 대조군 Fc 단백질 (▲) 의 1:1 혼합물로부터의 총 Fc 를 항-인간 IgG 코팅 웰 상에 포획했다. 이어서, 바이오-IL-22 (30ng/ml) 를 웰에 첨가했다. 결합된 바이오-IL-22 를 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 를 이용해 탐지했다. 도 8A-8B 에 나타낸 결과는 IL-22 결합에서의 IL-10R2 의 역할 탐지를 위해 IL-22R 의 ECD 가 필요하다는 것을 나타낸다. IL-22 의 증강된 결합은 두 ECD 가 존재하는 경우 검출된다.
도 9A-9B 는 IL-10R2 및 IL-22/IL-22R 사이의 상호작용의 선형 표시이다. IL-10R2-Fc 동종이합체 첨가의 효과는 바이오-IL-22 의 첨가 전, 당시 또는 이후에 평가했다. 도 9A 는 항-인간 IgG 코팅 웰 상에 포획된 IL-22R-Fc 를 이용하는 ELISA 로부터 도출되는 결과를 도시하는 선형 그래프이다. 이어서, 바이오-IL-22 은 스트렙타비딘-HRP 을 이용하여 후속적으로 검출되었다 (파선). 여러가지 농도의 IL-10R2-Fc 및 바이오틴화 IL-22 를 또한 함께 첨가하고, 이어서 결합된 바이오-IL-22 를 검출했다 (◆). CM 유래의 여러가지 농도의 IL-10R2-Fc 를 또한 먼저 첨가한 후, 후속적으로 바이오-IL-22 를 웰에 첨가하고, 결합된 바이오-IL-22 를 검출했다 (◇). 도 9B 에서, CM 유래의 50 ng/ml 의 IL-22R-Fc 를 항 -인간 IgG 코팅된 웰 상에 포획했다. 이어서, 바이오-IL-22 를 웰에 첨가했다. 이어서, 결합된 바이오-IL-22 을 스트렙타비딘-HRP (실선) 를 이용하여 바로 직후 검출했다. 결합된 바이오-IL-22 는 또한 PBS-1 % BSA (파선) 또는 여러가지 농도의 IL-10R2-Fc (●) 와 1 시간 더 인큐베이션한 후 검출했다. 본원에서의 결과는, IL-10R2 가 IL-22 결합 증강시 그의 역할 이전에 EL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 필요로 한다는 것을 나타낸다.
도 1OA-10C 는 래트 모노클로날 항-인간 IL-22 항체 (Ab-02 또는 Ab-04) 를 이용한 IL-22 활성의 저해를 나타낸다. 도 10A 에서, 연속적으로 희석된 항체를 세포 배지 중에 고정된 농도의 IL-22 와 함께 예비인큐베이션했다. 항체로 복합체화된 IL-22 를 포함하는 상기 배지를 이어서 HEPG2 세포에 적용했다. 후속적으로, 세포 분해질을 제조하고, 겔 전기영동으로 단백질을 분리한 후, 블럿팅한 후, P-STAT3 에 특이적인 항체를 이용하여 프로빙했다. IL-22 단독으로 (+) 또는 IL-22 부재 하에 (-) 인큐베이션된 세포는 각각 양성 및 음성 대조군으로서 각각 포함되었다. 상기 항체들 모두는 세포 상에서의 IL-22 의 활성을 블로킹할 수 있으며: 항체의 농도를 증가시키면, P-STAT3 의 검출은 감소한다. 도 10B 에서, CM 유래의 50 ng/ml 의 IL-22R-Fc 를 항-인간 IgG 코팅 웰에 포획했다. 바이오틴화 IL-22 (30 ng/ml) 를 단독으로 (파선) 또는 여러가지 농도의 Ab-02 (●), Ab-04 (▲), 항-IL-10R2 (+) 또는 대조군 항체 (-) 와 30 분 동안 예비인큐베이션한 후, 고정된 IL-22R-Fc 이 있는 웰에 첨가했다. 결합된 바이오틴화 IL-22 는 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 를 이용하여 검출했다. (C) IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 를 모두 발현하는 CHO 세포 유래의 CM 중 50 ng/ml 를 IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 를 모두 발현하는 항-인간 IgG 코팅 세포 중에서 인큐베이션했다. 바이오틴화 IL-22 (5ng/ml) 는 단독으로 (파선) 또는 여러가지 농도의 Ab-02 (●), Ab-04 (▲), 항-IL-10R2 (+) 또는 대조군 항체 (-) 와 30 분 동안 예비인큐베이션한 후, 웰에 고정된 IL- 22R-Fc/IL-10R2-Fc 를 첨가했다. 결합된 바이오틴화 IL-22 를 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 을 이용하여 검출했다. 상기 결과는 Ab-02 및 Ab-04 두가지가 모두 IL-22 활성을 무력화하며, Ab-04 는 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 블로킹하며, Ab-02 는 IL-22 및 IL-10R2 상호작용을 블로킹한다는 것을 보여준다.
도 11A-11C 는 IL-22BP-Fc 를 이용한 IL-22 활성의 저해를 나타낸다. 도 11A 에서, CM 유래의 50 ng/ml 의 IL-22R-Fc 를 항-인간 IgG 코팅된 웰 상에서 포획했다. 바이오틴화 IL-22 (30 ng/ml) 는 단독으로 (파선) 또는 여러가지 농도의 IL-22BP-Fc () 와 30 분 동안 예비인큐베이션한 후, 고정된 IL-22R-Fc 이 있는 웰에 첨가했다. 결합된 바이오틴화 IL-22 는 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 를 이용해 검출했다. 배경은 사선으로 나타낸다. 도 11B 에서, IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 를 모두 발현하는 CHO 세포 유래의 CM 중 50 ng/ml 의 총 Fc 를 항-인간 IgG 코팅된 웰에서 인큐베이션했다. 바이오틴화 IL-22 (5 ng/ml) 는 단독으로 (파선) 또는 여러가지 농도의 IL-22BP-Fc () 과 30 분 동안 예비인큐베이션한 후, 고정된 IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc 이 있는 웰에 첨가했다. 결합된 바이오틴화 IL-22 를 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 를 이용해서 검출했다. 도 11C 에서, CM 중 50 ng/ml 의 IL-22BP-Fc 를 항-인간 IgG 코팅된 웰에서 인큐베이션했다. 바이오틴화 IL-22 (1 ng/ml) 는 단독으로 (파선) 또는 여러가지 농도의 Ab-02 (●) 또는 Ab-04 (▲) 또는 대조군 래트 항체 (-) 와 30 분 동안 예비인큐베이한 후, 고정된 IL-22BP-Fc 이 있는 웰에 첨가했다. 결합된 바이오틴화 IL-22 는 후속적으로 스트렙타비딘-HRP 를 이용하여 검출했다. 도 11A-11C 는 IL-22BP 가IL-22 활성을 Ab-04 와 유사한 양태로 저해하며, Ab-02 가 독특하다는 것을 보여준다.
도 12 는 IL-22/IL-22R/IL-10R2 수용체 복합체의 어셈블리를 도시하는 개요도이다. Ab-04 로 나타내는 IL-22 의 에피토프에 결합하며, 이들 결합은 항체는 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 차단한다. Ab-04 는 IL-22 결합 단백질 (IL-22BP) 과 유사한 수준으로 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 차단하는 것으로 여겨진다. Ab-02 로 나타내는 항체는 IL-22 의 에피토프에 결합하며, 이들 결합은 IL-22 및 IL1OR2 사이의 상호작용의 차단을 제공한다. Ab-02 는 IL-22/IL-22R 및 IL-10R2 사이의 복합체 형성을 감소 또는 차단하는 것으로 여겨진다.
도 13 은 래트 항-인간 IL-22 모노클로날 항체를 이용한 IL-22 활성의 저해를 도시하는 그래프이다. 고정된 농도의 IL-22 는 세포 배지 중의 여러가지 농도의 Ab-02 (●) 또는 Ab-04 (▲) 또는 대조군 항체 (-) 와 예비인큐베이션한 후, pSTAT-TA-Luc 벡터에 의해 일시적으로 트랜스펙션된 HepG2 세포에 첨가했다.
도 14 는 래트 항-인간 IL-22 모노클로날 항체 및 IL-22BP-Fc 를 이용한 IL-22 활성의 저해를 도시하는 그래프이다. 고정된 농도의 IL-22 는 세포 배지 중의 여러가지 농도의 Ab-04 (▲) 또는 IL-22BP-Fc (□) 와 예비인큐베이션한 후, pSTAT-TA-Luc 벡터에 의해 일시적으로 트랜스펙션된 HepG2 세포에 첨가했다.
도 15 는 래트 항-인간 IL-22 모노클로날 항체를 이용한 IL-22 활성의 저해를 도시하는 그래프이다. 고정된 농도의 IL-22 를 여러가지 농도의 세포 배지 중의 Ab-02 (●) 또는 Ab-04 (▲) 또는 대조군 항체 (-) 와 예비배양한 후, IL-22R 및 IL-1OR2 수용체를 모두 발현하는 BaF3 세포에 첨가했다.
인터류킨 22 ("IL-22") 는 선천성 및 적응성 면역 응답 동안 유도되는 싸이토카인이다. 대상체에 투여되는 경우, 이는 급성 단계 반응을 유도하여 염증의 메카니즘에서의 IL-22 에 대한 역할과 연계된다. IL-22 과 함께 시그널링 복합체를 형성하는 상기 수용체 사슬은 IL-22 수용체 ("IL-22R") 및 IL-10 수용체 2 ("IL-10R2") 이며, 이들은 제 II 형 싸이토카인 수용체 패밀리의 두 구성원이다. 한 구현예에서, 본 출원인은 바이오틴화 싸이토카인 및 수용체 세포외 도메인 (ECD) Fc 융합체 이량체를 이용하는 ELISA 기재 포맷에서 상기 단백질들 사이의 상호관계를 특징화했다. 본 출원인은 IL-22 가 IL-22R 의 ECS 에 대해 측정가능한 친화성을 가지며, IL-1OR2 단독에 대해서는 측정가능한 친화성을 갖지 않음을 보였다 (실시예 12). IL-22 는 Fc 이종이합체로서 제시되는 IL-22R/IL-1OR2 ECD 에 대해 실질적으로 더 큰 친화성을 갖는다 (실시예 13). 일시적인 첨가를 수반하는 추가적인 분석은, IL-10R2 가 IL-22 및 IL-22R 사이의 회합에 의해 창출되는 표면에 결합한다는 것을 시사한다. 본 출원인은 IL-10R2 ECD 가 그의 싸이토카인 수용체 복합체 내에서의 IL-22 이 회합을 안정화시키는 것으로 여긴다 (실시예 14 및 15). 다른 구현예에서, 항-IL-22 항체의 무력화는 그의 결합 특이성, 친화성 및 IL-22 무력화 활성의 견지에서 생성 및 특징화되었다 (실시예 5, 16, 17, 20, 21 및 22). 한 구현예에서, 래트 IL-22 항체 및 IL-22BP (분비된 IL-22-결합 단백질 및 그것의 천연 안타고니스트) 의 무력화는 모두, IL-22R ECD 인식에 직접적으로 필요할 수 있는 IL-22 에피토프를 정의한다. 또다른 구현예에서, 래트 모노클로날 항체는 IL-10R2 ECD 의 역할에 대해 중요한 분리된 IL-22 영역을 정의한다. 또한, 본 출원인은 IL-22 의 생체내 투여가 급성 단계 반응의 파라미터를 유도하며, 무력화 항-IL-22 항체의 이용으로 인한 IL-22 의 활성 감소는 마우스 콜라겐-유도성 관절염 (CIA) 모델에서 염증 병후를 완화한다는 것을 보였다 (실시예 9). IL-22 mRNA 의 발현은 염증이 발생한 부위에서 상향조절된다. 따라서, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 무력화 항-IL-22 항체 및 그의 분절은 생체내 면역 억제를 위해 이용될 수 있다.
따라서, 본 출원인은 IL-22, 특히, 인간 IL-22 에, 높은 친화성 및 특이성을 갖고 결합하는, 적어도 부분적인 항체 및 그의 항원 결합 분절을 제공한다. 한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 하나 이상의 IL-22-관련 활성을 감소, 저해 또는 길항한다. 예를 들어, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22, 예컨대 IL-22 의 에피토프에 결합하고, IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 예컨대, IL-22 수용체 ("IL-22R") 및 인터류킨-10 수용체 2 ("IL-1OR2"), 또는 그의 서브유닛 (예컨대, 각각의 IL-22R 또는 IL-1OR2) 을 포함하는 복합체 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 항체 및 그의 분절은 IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 또는 그의 서브유닛 사이의 상호작용, 예컨대 결합을 방해 (예컨대, 저해, 블로킹 또는 그렇지 않으면 감소) 하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절은 IL-22-관련 장애, 예컨대, 자가면역 장애, 예컨대, 관절염 장애 (예컨대, 류마티스 관절염); 호흡기 장애 (예컨대, 천식, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD); 염증 상태, 예컨대, 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염) 를 진단, 치료 또는 방지하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명이 더욱 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 특정 용어를 우선 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 정해진다.
본원에 사용된 용어 "인터류킨-22" 또는 "IL-22" 는 IL-10 에 대한 상동성을 나타내며, IL-9 또는 ConA 에 의해 T 세포에서 상향조절되는 클래스 2 싸이토카인을 의미한다 (Dumoutier L. 등, (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (18): 10144-9). IL-22 는 그의 발현이 LPS 에 의해 자극되나, IFN-γ 에 의해서는 현저하게 자극되지 않는 싸이토카인이다. IL-22 는, Th2, CD4+ 세포가 아닌, 활성화된 인간 및 마우스 Thl 에 의해서 주로 제조된다. IL-22 는 급성 단계 반응을 표시하는 파라미터를 조절하며 (Dumoutier L. 등, (2000) 상기 문헌 ; Pittman D. 등, (2001) Genes and Immunity 2: 172; WO 00/65027; Gabay, C. (1999) New England Jounial of Medicine 340 (6): 448-454) 염증을 표시하는 파라미터도 조절한다 (Kotenko S. V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223-40; WO 00/65027). IL-22 는 제 II 형 싸이토카인 수용체 패밀리 (CRF2) 의 두 구성원인 IL-22 수용체 (본원에서는 또한 "IL-22R" 로도 지칭됨) 및 IL-10 수용체 2 (본원에서는 또한 "IL-1OR2" 로도 지칭됨) 로 이루어진 수용체 복합체에 결합하는 것으로 여겨진다. 상기 두 수용체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다: Xie M. H. 등, (2000) J. Biol. Chem. 275 (40): 31335-9 (인간 IL-22R); Kotenko S. V. 등, (2001) J. Biol. Chem. 276 (4): 2725-32 (인간 IL-10R2). IL-22 수용체의 두 사슬은 모두 다수의 기관에서 성분을 이루어 발현한다. 상기 기관에서 유도된 상피 세포주는 시험관내에서 IL-22 에 응답성이다 (Kotenko S. V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223-40). IL-22 는 JAK/STAT3 및 ERK 경로 뿐만 아니라, 기타 MAPK 경로의 중간체의 활성화를 유도한다 ((Dumoutier L. 등, (2000) 상기 문헌 ; Xie M. H. 등, (2000) 상기 문헌 ; Dumoutier L. 등, (2000) J Immunol 164 (4): 1814-9); Kotenko S. V. 등, (2001) J. Biol. Chem. 276 (4): 2725-32; Lejeune, D. 등, (2002) J. Biol. Chem. 277 (37): 33676-82). 상기 참고문헌의 내용은 전부 참고문헌으로 본원에 포함된다.
따라서, 용어 "IL-22" 는 IL-22 수용체, 예컨대, IL-22R 또는 IL-10R2, 또는 이들의 복합체 (바람직하게는 포유류, 예컨대, 쥐과동물 또는 인간 기원) 와 상호작용, 예컨대 결합할 수 있고, 하기 중 한가지 특징을 가진 싸이토카인 (바람직하게는 포유류, 예컨대, 쥐과동물 또는 인간 기원)을 의미한다: (i) 자연 발생 포유류 IL-22 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그의 분절, 예컨대, 서열 번호 2 (인간) 또는 서열 번호 2 (쥐과 동물) 의 아미노산 서열 또는 그의 분절; (ii) 서열 번호 2 (인간) 또는 서열 번호 4 (쥐과동물) 로 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 분절과 예컨대 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 실질적으로 상동인 아미노산 서열; (iii) 자연 발생 포유류 IL-22 뉴클레오티드 서열 또는 그의 분절 (예컨대, 서열 번호 1 (인간) 또는 서열 번호 3 (쥐과동물) 또는 이들의 분절) 에 의해 코딩되는 아미노산 서열; (iv) 서열 번호 1 (인간) 또는 서열 번호 3 (쥐과동물) 로 나타내는 뉴클레오티드와 예컨대 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 분절에 의해 코딩되는 아미노산 서열; (v) 자연 발생 IL-22 뉴클레오티드 서열 또는 그의 분절, 예컨대 서열 번호 1 (인간) 또는 서열 번호 3 (쥐과동물) 또는 이들의 분절에 대한 퇴축 (degenerate) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는 (vi) 엄격한 조건, 예컨대, 매우 엄격한 조건 하에 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나에 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드 서열. 바람직하게는, IL-22 폴리펩티드는 하나 이상의 IL-22 관련 활성, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 활성을 갖는다.
인간 IL-22 cDNA 는 American Type culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, U. S. A. 20110-2209) 에 1999 년 4 월 28 일에, 부다페스트 조약에 의한 원기탁으로서 기탁되었으며, 접근 번호 ATCC 207231 를 부여받았다. 기탁된 물질의 공개적 이용가능성의 모든 제한사항은, 37 C. F. R. § 1.808 (b) 에 명시된 조건을 제외하고 특허 등록시 변경불가하게 해제될 것이며, 기탁 기간은 37 C. F. R. § 1.806 에 합치되어야 한다.
용어 " IL-22 관련 활성" 은, 이에 제한되지 않으나, 하기를 포함하는 IL-22 폴리펩티드, 예컨대, 성숙한 IL-22 폴리펩티드 (예컨대, 서열 번호 2 및 4, 각각에 나타낸 아미노산 서열을 가진 포유류, 예컨대 인간 또는 쥐과동물 IL-22) 의 하나 이상의 생물학적 활성을 의미한다: (1) IL-22 수용체 (예컨대, IL-22R 또는 IL-10R2 또는 이들의 복합체, 바람직하게는 포유류, 예컨대, 쥐과동물 또는 인간 기원의 것) 에 대한 상호작용, 예컨대 결합; (2) 하나 이상의 신호 전달 분자와의 회합; (3) 단백질 키나아제, 예컨대, JAK/STAT3, ERK 및 MAPK 의 인산화 및/또는 활성화 자극; (4) 예컨대, 신장, 간, 대장, 소장, 갑상선, 췌장, 피부 유래의 IL-22 응답성 세포, 예컨대 상피 세포의 조절, 예컨대 증식, 분화, 이펙터 세포 기능, 세포 용해 활성, 싸이토카인 또는 케모카인 분비 및/또는 생존의 자극 또는 저감; (5) 급성 단계 반응, 예컨대, 대사, 간, 조혈 (예컨대, 빈혈, 혈소판 증가) 의 하나 이상의 파라미터 또는 신경내분비 변화, 또는 변화 (예컨대, 급성 단계 단백질에서의 증가 또는 감소, 예컨대, 피브리노겐 및/또는 혈청 아밀로이드 A 의 증가, 또는 알부민의 감소) 의 조절; 및/또는 (6) 염증 상태의 하나 이상의 파라미터의 조절, 예컨대 싸이토카인-매개 염증전 작용 (예컨대, 발열 및/또는 프로스타글란딘 합성, 예를 들어 PEG2 합성) 의 조절, 세포성 면역 응답성의 조절, 예컨대 싸이토카인, 케모카인 (예를 들어, GRO1) 또는 림포카인 생산 및/또는 분비 (예를 들어, 염증전 싸이토카인의 생산 및/또는 분비) 의 조절.
용어 "급성 단계 반응" 은 당업계에 인지되어 있으며, 참고문헌으로는 예컨대, [Gabay, C. (1999) New England Jounal of Medicine 340 (6): 448-454)] 를 참조.
본원에 사용된 바와 같이, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 항체의 "치료 유효량" 은, 장애의 하나 이상의 병후의 치료, 정도 감소, 완화에서 대상체, 예컨대 인간 환자에 대한 단일 또는 다중 투여량 투여시, 또는 상기 치료 부재시 예상되는 대상체의 생존 연장에 유효한 약제의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 항체의 "예방 유효량" 은, 장애, 예컨대, 본원에 기재된 장애의 발병 또는 재발의 방지 또는 지연에서 대상체, 예컨대 인간 환자에 대한 단일 또는 다중 투여량 투여시 유효한 약제의 양을 의미한다.
용어 "유도", "저감", "저해", "강화", "상승", "증가", "감소" 등은, 예컨대 두 상태들 사이의 정량적인 상이점을 표시하며, 두 상태들 사이의 적어도 통계적으로 유의한 상이함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "IL-22 안타고니스트" 는 IL-22 폴리펩티드, 예컨대, 인간 IL-22 폴리펩티드, 또는 그의 분절의 하나 이상의 생물학적 활성을 저감, 저해 또는 그렇지 않으면 감소시키는 약제를 의미한다. 바람직하게는, 안타고니스트는 IL-22 폴리펩티드와 상호작용, 예컨대 결합한다. IL-22 안타고니스트를 이용한 길항작용은 IL-22-관련 생물학적 활성의 총체적인 제거를 의미한다. IL-22 안타고니스트에는, 이에 한정되지 않고, 인간 IL-22 단백질에 대한 항체; 인간 IL-22 에 대한 수용체 또는 기타 표적의 가용성 형태; 인간 IL-22 에 대한 수용체 또는 기타 표적에 대한 항체; 및 인간 IL-22 과 그의 수용체 또는 기타 표적의 상호작용을 저해 또는 방해하는 펩티드 및 소분자. 한 구현예에서, IL-22 안타고니스트는 Ab-02 와 유사한 결합 특성을 갖는다 (예컨대, 이는 동일 또는 유사한 에피토프에 결합한다). 또다른 구현예에서, IL-22 안타고니스트는 Ab-04 와 유사한 결합 특성을 갖는다 (예컨대, 이는 동일하거나 또는 유사한 에피토프에 결합한다).
본원에 사용된 바와 같이, "IL-22 아고니스트" 는 IL-22 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 강화, 유도 또는 그렇지 않으면 증강시키는 약제를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 는 하나 이상, 바람직하게는 2 개의 중쇄 (H) 가변 영역 (VH 로 약기한다) 및 하나 이상, 바람직하게는 2 개의 경쇄 (L) 가변 영역 (VL 로 약기한다) 을 포함하는 단백질을 의미한다. VH 및 VL 영역은 "상보성 결정 영역" ("CDR") 으로 일컬어지는 과가변성의 영역, 및 "프레임워크 영역" ("FR") 으로 일컬어지는 더욱 보존성인 영역으로 더 분류될 수 있다. 프레임워크 영역 및 "CDR" 의 범위는 정확하게 정의되었다 (참고 문헌은, Kabat, E. A., 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH 공보 제 91-3242 호, 및 Chothia, C. 등, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917, 이는 참고문헌으로 본원에 포함됨). 각각의 VH 및 VL 는 하기 순서에 따라 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 정리되는, 3 개의 CDR 및 4 개의 FR 로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
상기 항체는 추가로 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함함으로써, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 각각 형성할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 항체는 2 개의 면역글로불린 중쇄 및 2 개의 면역글로불린 경쇄의 4 량체이며, 여기서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린은 예컨대, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3 을 포함하여 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1 개의 도메인, CL 을 포함하여 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로는 면역계 (예컨대, 이펙터 세포) 의 각종 세포 및 고전적인 보체 시스템의 첫번째 구성원(Clq) 을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 중재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 인식되는 인간 면역글로불린 유전자에는, 카파, 람다, 알파 (IgA1 및 IgA2), 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 전장 면역글로불린 "경쇄" (약 25 Kd 또는 214 아미노산) 는 NH2-말단에서 가변 영역 유전자에 의해 코딩되며 (약 110 아미노산), 카파 및 람다 불변 영역은 COOH-말단에서 코딩된다. 전장 면역글로불린 "중쇄" (약 50 Kd 또는 446 아미노산) 는, 가변 영역 유전자에 의해 (약 116 아미노산), 기타 상기 언급된 불변 영역 유전자, 예컨대 감마 (약 330 아미노산을 코딩) 중 하나에 의해 유사하게 코딩된다.
본원에 사용된 바와 같이, "동종형" 은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대 IgM 또는 IgGI) 를 의미한다.
항체의, 용어 "항원 결합 분절" (또는 단순히 "항체 부분" 또는 "분절") 은, 본원에 사용된 바와 같이, 항원 (예컨대, CD3) 에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 분절을 의미한다. 항체의, 용어 "항원 결합 분절" 에 포함되는 결합 분절의 예시에는 하기가 포함된다: (i) Fab 분절, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1 가 분절; (ii) F(ab')2 분절, 경첩 부위 (hinge region) 에서 디설파이드 다리에 의해 연결되는 2 개의 Fab 분절을 포함하는 2 가 분절; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 분절; (iv) 항체의 단일 분지 (single arm) 의 VL 및 VH 로 이루어진 Fv 분절, (v) dAb 분절 (Ward 등, (1989) Nature 341: 544-546) 로서, VH 도메인으로 이루어진 것; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR). 더욱이, Fv 분절의 두 도메인, VL 및 VH 이 서로 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 이용하여, 1 가 분자 형성을 위해 VL 및 VH 가 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 합해질 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv) 로서 공지됨; 참고문헌은, 예컨대, Bird 등, (1988) Science 242: 423-426; and Huston 등, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). 상기 단일 사슬 항체는 또한 항체의, 용어 "항원 결합 분절" 에 속하는 것으로 의도한다. 상기 항체 분절들은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 분절은 온전한 항체와 동일한 방법으로 사용가능성에 대해 스크리닝된다.
용어 "조합하여" 는 본원 문맥에서 약제가 실질적으로 동시에, 일제적으로 또는 순차적으로 제공된다는 것을 의미한다. 순차적으로 제공되는 경우, 제 2 화합물의 투여시, 두 화합물들 중 첫번째의 것은 바람직하게는 치료 부위에서 여전히 유효 농도로 검출될 수 있다.
본원에 개시된 서열에 대한 유사 또는 상동 서열 (예컨대, 약 85% 이상의 서열 상동성) 은 본 출원의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열 상동성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로, 실질적인 상동성은 가닥의 상보물에 대한 선택적인 하이브리디제이션 조건 (예컨대, 매우 엄격한 하이브리디제이션 조건) 하에 하이브리다이즈한다. 상기 핵산은 전체 세포로서, 세포 분해질로서, 또는 특별히 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
두 서열들 사이의 "상동성" 또는 "서열 상동성" (두 용어는 본원에서 호한적으로 사용된다) 의 계산은 하기와 같이 수행한다. 서열들을 최적의 비교 목적에 대해 정렬한다 (예컨대, 최적의 정렬을 위해 첫번째 및 두번째 아미노산 또는 핵산 서열에 공간 (gap) 을 도입하고, 비교를 위해서는 비상동 서열을 무시할 수 있다). 바람직한 구현예에서, 비교 목적으로 정렬한 참고 서열의 길이는 참고 서열 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱더 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70&, 80%, 90%, 100% 이다. 이어서, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열 내의 위치가 제 2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 채워진 경우, 분자는 상기 위치에서 상동이다 (본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "상동성" 은 아미노산 또는 핵산 "동일성" 과 동등하다). 두 서열들 사이의 백분율 상동성은 두 서열의 최적 배치를 위해 도입되어야 하는 갭의 갯수, 각 갭의 길이를 고려하는, 서열들에 의해 공유되는 상동 위치의 갯수의 함수이다.
두 서열들 사이의 서열 비교 및 백분율 상동성의 결정은 수학적인 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현에서, 두 아미노산 서열 사이의 백분율 상동성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com 에서 입수가능) 에 포함되는 Needleman and Wunsch 알고리즘 ((1970) J. MoL. Biol. 48: 444-453) 을 이용하여 결정된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 두 뉴클레오티드 서열들 사이의 백분율 상동성은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com 에서 입수가능), NWSgapdna, CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80 의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 의 길이 가중치 를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com 에서 입수가능) 을 이용하여 결정된다. (분자가 본 발명의 서열 상동성 또는 동일성 한계 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 적용되어야 하는 파라미터에 대해 단정할 수 없을 때 사용되어야 하는) 특히 바람직한 파라미터는 갭 페널티가 12 이며, 갭 연장 페널티가 4 이며, 프레임변동 갭 페널티가 5 인 Blossum 62 스코어링 매트릭스이다. 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 백분율 상동성은, PAM120 가중치 나머지 테이블 (weight residue table), 12 의 갭 길이 페널티 및 4 의 갭 페널티를 이용하는, ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 에 포함되는 E. Meyers 및 W. Miller 의 알고리즘 ((1989) CABIOS, 4: 11-17) 을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격한 조건 하에 하이브리다이즈함" 은 하이브리디제이션 및 세척에 대한 조건을 기술한다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6] 에서 찾을 수 있다. 수성 및 비수성 방법은 상기 참고문헌에 기재되어 있으며, 어느 것이나 이용가능하다. 바람직한, 엄격한 하이브리디제이션 조건의 예시는, 약 45℃ 에서 6× 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중에서 하이브리디제이션한 후, 50℃ 에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS 에서 1 회 이상 세척하는 것이다. 엄격한 하이브리디제이션 조건의 또다른 예시는 약 45℃ 에서 6× SSC 중에 하이브리디제이션한 후, 55℃ 에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS 로 1 회 이상 세척하는 것이다. 엄격한 하이브리디제이션 조건의 추가적인 예시는 약 45℃ 에서 6× SSC 중에 하이브리디제이션한 후, 60℃ 에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS 로 1 회 이상 세척하는 것이다. 바람직하게는, 엄격한 하이브리디제이션 조건은 약 45℃ 에서 6× SSC 중에 하이브리디제이션한 후, 65℃ 에서 0.2 × SSC, 0.1% SDS 로 1 회 이상 세척하는 것이다. 특히 바람직한 매우 엄격한 조건 (및 본 발명의 하이브리디제이션 제한 내에 분자가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 적용해야 할 조건을 전문가가 확신하지 못하는 경우 이용되어야 하는 조건) 은 약 65℃ 에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS 이후, 65℃ 에서 0.2 × SSC, 1% SDS 로 1 회 이상 세척하는 것이다.
IL-22 폴리펩티드 및 안타고니스트, 예컨대, 그의 항체는 추가적인 보존성 또는 비필수적인 아미노산 치환기를 가질 수 있으며, 이는 그의 기능에 대하여 실질적인 영향을 갖지 않는 것으로 이해된다. "보존성 아미노산 치환" 은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되어 있다. 상기 패밀리에는, 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 이 포함된다.
IL-22 단백질, 분절 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
IL-22 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 하기에 제공되어 있다. 각각의 클론의 뉴클레오티드 서열은 또한 공지된 방법에 따라, 기탁된 클론의 서열에 의해 결정될 수 있다. 이어서, 도시된 아미노산 서열 (전장 및 성숙한 형태 모두) 은 상기 뉴클레오티드 서열로부터 결정될 수 있다. 특별한 클론에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 또한 적합한 숙주 세포에서의 클론의 발현, 단백질의 수집 및 그의 서열 결정에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "분비된" 단백질은, 적합한 숙주 세포에서 발현되는 경우, 그의 아미노산 서열 내의 시그널 서열로 인한 이동을 포함하여, 멤브레인을 가로지르거나 또는 통과하여 이동되는 것이다. "분비된" 단백질에는, 이에 한정되지 않고, 이들이 발현되는 세포로부터 전부 (예컨대, 가용성 단백질) 또는 부분적으로 (예컨대, 수용체) 분비된 단백질이 포함된다. "분비된" 단백질에는 또한, 이에 한정되지 않고, 소포체의 멤브레인을 가로질러 이동하는 단백질이 포함된다.
인간 IL-22 의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같이 제공되며 (서열 번호 1), 폴리(A) 테일을 포함한다. 개시된 뉴클레오티드 서열에는 오픈 리딩 프레임이 포함되며, 상기 언급된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 전장 IL-22 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 2 에서 보고했다. 성숙한 IL-22 의 아미노산 서열은 서열 번호 2 의 아미노산 34 ∼ 179 부근에 상응한다.
Figure 112005075809468-PCT00001
코딩되는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 하기에 나타낸다.
Figure 112005075809468-PCT00002
쥐과동물 IL-22 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 폴리펩티드의 서열은 하기에 제공된다:
Figure 112005075809468-PCT00003
상기 언급된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure 112005075809468-PCT00004
전장 미만의 임의의 형태의 IL-22 단백질은, IL-22 수용체에 결합하는 능력을 보유하는 한, 본 발명의 방법 및 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. IL-22 분절, 예컨대, 전장 미만의 IL-22 단백질은 숙주 세포 내에서 전장 IL-22 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상응하는 분절을 발현함으로써 제조될 수 있다. 이들 상응하는 폴리뉴클레오티드 분절은 또한 본 발명의 일부이다. 상기 기재된 바와 같이 개질된 폴리뉴클레오티드는, 적당한 원하는 결실 돌연변이의 구축, 부위-지정 돌연변이화 방법 또는 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 중합효소 연쇄 반응을 포함하는 표준 분자생물학 기술로 제조될 수 있다.
단백질의 분절은 선형 형태일 수 있거나, 또는 이들은 공지된 방법, 예를 들어 [H. U. Saragovi, 등, Bio/Technology 10, 773-778 (1992) 및 R. S. McDowell, 등, J. AmeR. Chem. SoC. 114, 9245-9253 (1992)] 에 기재된 바와 같은 공지된 방법을 이용하여 폐환될 수 있고, 이들 두 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 상기 분절은 단백질 결합 부위의 결합가 증가를 포함하는 여러가지 목적으로 면역글로불린과 같은 담체 분자에 융합될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 분절은 "링커" 서열을 통해 면역글로불린의 Fc 부분에 융합될 수 있다. 단백질의 2 가 형태에 있어서, 상기 융합은 IgG 분자의 Fc 부분에 대한 것일 수 있다. 기타 면역글로불린 동종형이 또한 상기 융합 생성에 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질-IgM 융합체가 본 발명의 단백질의 10 가 (decavalent) 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
IL-22 단백질 및 그의 분절에는, 개시된 단백질의 아미노산 서열 길이의 25% 이상 (더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상) 의 길이를 가지며, 개시된 단백질과 60% 이상의 서열 상동성 (더욱 바람직하게는 75% 이상의 상동성; 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 상동성) 을 가진 단백질이 포함되며, 여기서 서열 상동성은 서열 갭을 최소화하면서 중복 및 상동성을 최대화하기 위해 정렬하는 경우 단백질의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정된다. 본 발명에는 또한 임의의 개시된 단백질의 임의의 상기 분절에 대해 75% 이상의 서열 상동성 (더욱 바람직하게는 85% 이상의 상동성; 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성) 을 가진 바람직하게는 8 개 이상 (더욱 바람직하게는 20 개 이상, 가장 바람직하게는 30 개 이상) 의 연속된 아미노산을 포함하는 분절을 포함하는 단백질 및 단백질 분절이 포함된다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 단백질, 단백질 분절 및 재조합 단백질에는 하나 이상의 "EL-22 수용체-결합 모티브" 의 존재를 근거로 식별될 수 있는 것이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-22 수용체-결합 모티브" 에는 IL-22 의 그의 해당 수용체에 대한 결합에 중요한 아미노산 서열 또는 잔기가 포함된다. 바람직한 구현예에서, IL-22 단백질은 서열 번호 2 의 아미노산 약 50 - 60 개를 포함하는 IL-22 수용체-결합 모티브를 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-22 단백질은 서열 번호 2 의 아미노산 약 63 - 81 을 포함하는 IL-22 수용체-결합 모티브를 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-22 단백질은 서열 번호 2 의 아미노산 약 168-177 을 포함하는 IL-22 수용체-결합 모티브를 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL-22 단백질은 서열 번호 2 의 아미노산 50 - 60, 아미노산 63 - 81 및/또는 아미노산 약 168 - 177 중 하나 이상을 포함하는 IL-22 수용체-결합 모티브를 포함한다.
또다른 구현예에서, IL-22 수용체 결합 모티브는 서열 번호 2 의 아미노산 50 - 60, 서열 번호 2 의 아미노산 63 - 81, 및 서열 번호 2 의 아미노산 168 - 177 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 상동인 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 단백질, 단백질 분절 및 재조합 단백질에는 N-연결 글리코실화에 대한 1, 2, 3, 4 개 이상의 부위의 존재를 근거로 식별될 수 있는 것이 포함된다. 상기 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열의 정렬 및 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들의 식별에 의해 결정될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
IL-22 폴리뉴클레오티드는 [Kaufman 등, Nucleic Acids Res. 19,4485-4490 (1991)] 에 개시된 pMT2 또는 pED 발현 벡터와 같은 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어, 단백질을 재조합적으로 제공할 수 있도록 한다. 많은 적합한 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있다. 재조합 단백질의 일반적인 발현 방법도 또한 당업계에 공지되어 있으며, [R. Kaufman (1990) Methods in Enzymology 185, 537-566] 에서 예시되었다. 본원에서 정의된 바와 같은 "작동적으로 연결된" 은 벡터 또는 세포 내에, 라이게이션된 폴리뉴클레오티드/발현 조절 서열로 형질전환된 (트랜스펙션된) 숙주세포에 의해 단백질이 발현되도록 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열이 위치된 것을 의미한다.
용어 "벡터" 는, 본원에 사용된 바와 같이, 또다른 핵산을 그가 연결된 핵산으로 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드" 로, 추가적인 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥의 DNA 루프를 의미한다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터로, 여기에서는 추가적인 DNA 분절이 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제가 가능하다 (예컨대, 복제의 박테리아 기원을 가진 박테리아 벡터 및 유전자부체 (episomal) 포유류 벡터). 기타 벡터 (예컨대, 비유전자부체 (non-episomal) 포유류 벡터) 가 숙주 세포로의 통합시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈을 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지령할 수 있다. 상기 벡터들은 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게, "발현 벡터") 로 본원에서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 이용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서는, 플라스미드가 가장 널리 이용되는 벡터의 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터" 는 호환적으로 이용될 수 있다. 그러나, 본 발명에는 발현 벡터의 상기 기타 형태, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 추적 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-회합 바이러스) 가 포함되며, 이들은 동등한 기능을 제공한다.
용어 "조절 서열" 은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 트랜슬레이션을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 구성원 (예컨대, 폴리아데닐화 시그널) 을 포함한다. 상기 조절 서열은, 예를 들어 [Goeddel; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)] 에 기재되어 있다. 조절 서열의 선별을 포함하여, 발현 벡터의 고안이 형질전환될 숙주 세포, 원하는 단백질의 발현 수준 등에 좌우될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 포유류 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열에는 포유류 세포에서의 단백질 발현의 높은 수준을 지령하는 바이러스 구성원, 예컨대 FF-1a 프로모터 및 BGH 폴리 A, 싸이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도되는 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 바이러스 조절 구성요소의 추가적인 설명 및 그의 서열에 대해서는 예컨대, Stinski 에게 허여된 U. S. 특허 제 5,168,062 호, Bell 등에게 허여된 U. S. 특허 제 4,510,245 호 및 Schaffner 등에게 허여된 U.S. 특허 제 4,968,615 호를 참조한다 .
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예컨대, 복제의 기원) 및 선별가능한 마커 유전자와 같은 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예컨대, U. S. 특허 제 4,399,216 호, 제 4,634,665 호 및 제 5,179,017 호를 참조, 이들 모두 Axel 등에게 허여됨). 예를 들어, 전형적으로는 선별가능한 마커 유전자가, 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (dhfr-숙주세포에서 메토트렉세이트 선별/증폭에 이용) 및 네오 (neo) 유전자 (G418 선별을 위함) 가 포함된다.
다수의 유형의 세포가 IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질의 발현을 위한 적합한 숙주 세포로서 작용할 수 있다. 기능성 IL-22 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포 유형이 이용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포에는, 예를 들어 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, 기타 형질전환 영장류 세포주, 정상적인 배수체 (diploid) 세포, 1 차 조직의 시험관내 배양에서 유도된 세포주, 1 차 이식편, HeLa 세포, 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x 또는 C2C12 세포가 포함된다.
IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질은 또한 하나 이상의 곤충 발현 벡터 내에서 적합한 조절 서열에 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 작동적으로 연결하고 곤충 발현 시스템을 이용함으로써 제조될 수 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 대한 재료 및 방법은 예컨대, Invitrogen 사로부터의 키트 형태 [San Diego, CaliF. U.S.A. 소재 (MaxBacd3 키트)] 로 시판되어 입수가능하며, 상기 방법은 참고문헌으로 본원에 포함되는 [Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)] 에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. IL-22 단백질의 가용성 형태는 또한 상기 기재된 바와 같은 적당한 단리된 폴리뉴클레오티드를 이용하여 곤충 세포에서 제조될 수 있다.
대안적으로, IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질은 박테리아와 같은 원핵생물 또는 효모와 같은 하등 진핵생물에서 제조될 수 있다. 적합한 효모 균주에는, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 균주, 캔디다 (Candida), 또는 이종성 단백질을 발현할 수 있는 임의의 효모 균주가 포함된다.
적합한 박테리아 균주에는, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 이종성 단백질을 발현할 수 있는 임의의 박테리아 균주가 포함된다.
박테리아에서의 발현은 재조합 단백질이 혼입된 봉입체 (inclusion body) 의 형성을 초래할 수 있다. 따라서, 활성 또는 더욱 활성인 재료 제공을 위해 재조합 단백질의 리폴딩 (refolding) 이 필요할 수 있다. 박테리아 봉입체로부터 올바르게 폴딩된 이종성 단백질을 수득하기 위한 여러가지 방법이 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법들은 일반적으로 봉입체 유래 단백질의 가용화, 혼돈유발제 (chaotropic agent) 를 이용한 완전한 단백질 변성을 수반한다. 시스테인 잔기가 단백질의 1 차 아미노산 서열에 존재하는 경우, 이는 종종 디설파이드 결합의 올바른 형성을 가능하게 하는 환경 (산화환원계) 에서 리폴딩을 완수해야 한다. 리폴딩의 일반적인 방법은 [Kohno, MetH. Enzym., 185: 187-195 (1990)] 에 개시되어 있다. EP 0433225 및 공동 출원 중인 출원 U.S. Ser. 제 08/163,877 호는 기타 적당한 방법을 기재한다.
IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질은 또한 IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 체세포 또는 생식세포를 특징으로 하는 트랜스제닉 소, 염소, 돼지, 또는 양의 산물, 예를 들어 우유 성분으로서 발현될 수 있다.
IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질은 바람직하게는 원하는 단백질 발현에 필요한 배양 조건 하에 배양 형질 전환 숙주 세포를 성장시켜 제조될 수 있다. 수득된 발현 단백질은 이어서 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. IL-22 단백질 또는 그의 융합 단백질의 가용성 형태는 조건화된 배지로부터 정제될 수 있다. 본 발명의 IL-22 단백질의 멤브레인 결합 형태는 발현 세포로부터 전체 멤브레인 분획을 제조하고 멤브레인을 Triton X-100 과 같은 비이온성 계면활성제로 추출하여 정제할 수 있다.
IL-22 단백질은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-22 단백질은 시판되어 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 울트라여과 단위체를 이용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 후, 농축물은 겔 여과 매질과 같은 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 또는 폴리에틸렌이민 (PEI) 기를 가진 매트릭스 또는 기질을 이용할 수 있다. 매트릭스는 단백질 정제에 일반적으로 이용되는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 기타 유형의 것일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 이용될 수 있다. 적합한 양이온 교환자에는, 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 각종 불용성 매트릭스가 포함된다. 술포프로필기가 바람직하다 (예컨대, S-세파로스
Figure 112005075809468-PCT00005
) 칼럼). 배양 상청액에서의 IL-22 단백질 또는 융합 단백질의 정제는 또한 콘카발린 A-아가로스, Heparin-toyopeal
Figure 112005075809468-PCT00006
또는 Cibacrom blue 3GA Sepharose
Figure 112005075809468-PCT00007
칼럼과 같은 상기 친화성 수지 상에서의 하나 이상의 칼럼 단계; 또는 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 상기 수지를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피; 또는 면역친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예컨대 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 가진 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 가 IL-22 단백질의 추가적인 정제에 이용될 수 있다. IL-22 단백질에 대한 항체를 포함하는 친화성 칼럼이 또한 공지된 방법에 따른 정제에 이용될 수 있다. 기타 공지된 방법들과의 각종 조합 또는 병용되어 상기 정제 단계 중 일부 또는 전부가 또한 실질적으로 정제된 단리된 재조합 단백질을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 IL-22 단백질은 기타 포유류 단백질이 실제적으로 없도록 정제된다.
본 발명의 IL-22 단백질 또는 융합 단백질은 또한 IL-22 에 결합할 수 있는 약제 (예컨대, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 항-IL-22 항체) 에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다. 고정되거나 또는 그렇지 않은 원하는 결합 단백질을 이용하는 결합 검정은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본 발명의 IL-22 단백질을 이용하여 상기 목적을 위해 이용될 수 있다. 정제된 세포 기재 또는 단백질 기재 (세포 없음) 스크리닝 검정은 상기 약제를 식별하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, IL-22 단백질은 담체 상에 정제된 형태로 고정될 수 있고, 정제된 IL-22 단백질에 대한 결합 또는 잠재적인 리간드가 측정될 수 있다.
IL-22 폴리펩티드는 또한 공지된 통상적인 화학 합성법으로 제조될 수 있다. 합성 수단에 의한 본 발명의 단백질 구축 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 합성으로 구축된 단백질 서열은, 단백질의 1 차, 2 차 또는 3 차 구조 및/또는 입체 배좌 특징의 측면에서, 단백질 활성을 포함하는 그들이 가진 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 따라서, 이들은 치료 화합물의 스크리닝 및 항체 개발을 위한 면역학적 과정에서 생물학적으로 활성인 채로 또는 천연의 정제된 단백질에 대해 면역학적 치환으로서 이용될 수 있다.
항-IL-22 항체 및 의 항원 결합 분절
다른 구현예에서, IL-22 안타고니스트는 IL-22, 바람직하게는 포유류 (예컨대, 인간 또는 쥐과동물) IL-22 에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 분절이다. 한 구현예에서, 항-IL-22 항체 또는 그의 분절 (예컨대, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 분절) 은 모노클로날 또는 단일 특이성 항체이다. 항체 또는 그의 분절은 또한 인간 IL-22 에 대한 인간, 인간화, 키메라성 또는 시험관내 유래 항체이다.
IL-22 폴리펩티드는 또한 특이적으로 IL-22 폴리펩티드와 반응하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 수득하기 위한 동물 면역화에 이용될 수 있다. 상기 항체는 면역원으로서 온전한 IL-22 를 이용하거나, 또는 IL-22 의 분절을 이용하여 수득될 수 있다. IL-22 의 더 작은 분절이 또한 동물 면역화에 이용될 수 있다. 펩티드 면역원은 추가적으로 카르복실 말단에 시스테인 잔기를 포함할 수 있으며, 키홀 립펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH) 과 같은 합텐에 콘쥬게이션시킨다. 추가적인 펩티드 면역원은 티로신 잔기를 황화 티로신 잔기로 치환하여 생성될 수 있다. 상기 펩티드의 합성 방법은 예를 들어 [R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky, 등, FEBS Lett. 211,10 (1987)] 에서와 같이 당업계에 공지되어 있다. IL-22 단백질에 결합하는 무력화 또는 비-무력화 항체 (바람직하게는 모노클로날 항체) 가 또한 본원에 기재된 IL-22 관련 장애의 치료에 유용할 수 있다. 상기 무력화 모노클로날 항체는 IL-22 수용체, 예컨대, IL-22R 또는 IL-1OR2 또는 이들의 조합에 대한 IL-22 결합을 블로킹할 수 있다.
하기에 기재된 실시예 5 는 항-IL-22 항체의 제조를 더욱 상세하게 설명한다. IL-22R 에 대한 IL-22 결합을 방해하는 항-IL-22 항체의 비제한적 예시는 "Ab-04" 이다. Ab-04 (본원에서 래트 모노클로날 항체 "P3/2" 로도 언급됨) 는 인간 IL-22 에 결합하며, 인간 IL-22 활성을 무력화한다 (실시예 5, 16 및 17). Ab-04 를 생산하는 하이브리도마 세포주는 2003 년 6 월 5 일에 ATCC 에 기탁되었으며, ATCC 접근 번호 PTA-5255 로 정해졌다. IL-10R2 에 대한 IL-22 의 결합을 방해하는 항-IL-22 항체의 또다른 비제한적 예시는 "Ab-02" 이다. Ab-02 (본원에서 래트 모노클로날 항체 "P3/3" 로도 언급됨) 는 마우스 및 인간 IL-22 의 활성을 무력화한다 (실시예 5, 16 및 17 참조). Ab-02 를 제공하는 하이브리도마 세포주는 2003 년 6 월 5 일에 ATCC 에 기탁되었으며, ATCC 접근 번호 PTA-5254 로 정해졌다.
IL-22 에 대한 인간 모노클로날 항체 (mAbs) 는 마우스 시스템보다는, 인간 면역글로불린 유전자를 가진 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 관심대상의 항원으로 면역화된 상기 트랜스제닉 마우스 유래의 비세포 (spenocyte) 는 인간 단백질 유래의 에피토프에 대한 특이적인 친화성을 가진, 인간 mAbs 를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위해 사용된다 (참고문헌으로, 예컨대, Wood 등, 국제 출원 WO 91/00906; Kucherlapati 등, PCT 공보 WO 91/10741; Lonberg 등, 국제 출원 WO 92/03918; Kay 등, 국제 출원 92/03917; Lonberg, N. 등, 1994 Nature 368: 856-859; Green, L. L. 등, 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S. L. 등, 1994 ProC. NatL. AcaD. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman 등, 1993 Year Immunol 7: 33-40; Tuaillon 등, 1993 PNAS 90: 3720- 3724; Bruggeman 등, 1991 Eur J. Immunol 21: 1323-1326).
모노클로날 항체는 또한 재조합 DNA 기술의 당업자에게 공지된 기타 방법으로 제조될 수 있다. "조합 항체 디스플레이" 법으로 지칭되는 대안적인 방법은 특별한 항원 특이성을 가진 항체 분절을 식별 및 분리하기 위해 개발되었으며, 모노클로날 항체 제조를 위해 사용될 수 있다 (조합 항체 디스플레이의 설명에 대해서는, 예컨대, Sastry 등, 1989 PNAS 86 : 5728; Huse 등, 1989 Science 246: 1275; and Orlandi 등, 1989 PNAS 86: 3833). 상기 기재된 바와 같이 동물을 면역원으로 면역화시킨 후, B-세포 풀 (pool) 조절의 항체 레퍼토리가 클로닝된다. 올리고머 프라이머의 혼합물 및 PCR 을 이용하여 면역글로불린 분자의 다양한 군집의 가변 영역의 DNA 서열을 수득하기 위한 방법들이 공지되어 있다. 예를 들어, 5' 리더 (시그널 펩티드) 서열 및/또는 프레임워크 1 (FR1) 서열에 상응하는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머 뿐만 아니라 보존성 3' 불변 영역 프라이머에 대한 프라이머가, 다수의 쥐과동물 항체 유래의 중쇄 및 경쇄 영역의 PCR 증폭에 이용될 수 있다 (Larrick 등, 1991, Biotechniques 11: 152-156). 유사한 전략이 또한 인간 항체 유래의 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 증폭에 이용될 수 있다 (Larrick 등, 1991, Methods : Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110).
키메라성 면역글로불린 사슬을 포함하는 키메라성 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 예를 들어, 쥐과동물 (또는 기타 종들) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자는 제한 효소로 절단되어 쥐과동물 Fc 를 코딩하는 영역을 제거한 후, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동등한 부분을 치환한다 (참고문헌으로는, Robinson 등, 국제 특허 공보 PCT/US86/02269 ; Akira, 등, 유럽 특허 출원 제 184,187 호; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 제 171,496 호; Morrison 등, 유럽 특허 출원 제 173,494 호; Neuberger 등, 국제 출원 WO 86/01533; Cabilly 등, U. S. 특허 제 4,816,567 호; Cabilly 등, 유럽 특허 출원 125,023 ; Better 등, (1988 Science 240: 1041-1043); Liu 등, (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu 등, 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun 등, (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura 등, 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood 등, (1985) Nature 314: 446-449; 및 Shaw 등, 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559).
항체 또는 면역글로불린 사슬은 당업계에 공지된 방법으로 인간화될 수 있다. 인간화 면역글로불린 사슬을 포함하는 인간화 항체는 인간 Fv 가변 영역 유래의 동등한 서열로 결합되는 항원 내에 직접 결부되지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 치환하여 제조될 수 있다. 인간화 항체 제조를 위한 일반적인 방법은 [Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207; Oi 등, 1986, BioTechniques 4: 214, 및 Queen 등에게 허여된 US 5,585,089, US 5,693, 761 및 US 5,693, 762] 에 제공되며, 이들의 내용은 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다. 상기 방법에는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 유래의 면역글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열의 분리, 취급 및 발현이 포함된다. 상기 핵산의 공급원은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 미리 결정된 표적에 대한 항체를 제조하는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 이어서, 인간화 항체 또는 그의 분절을 코딩하는 재조합 DNA 가 적당한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
인간화 또는 CDR-그라프트 항체 분자 또는 면역글로불린은 CDR-그라프트 또는 CDR 치환에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 면역글로불린 사슬의 CDR 중 1 개, 2 개 또는 전부가 치환될 수 있다. 참고문헌으로는, 예컨대, U.S. 특허 제 5,225,539 호; Jones 등, 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan 등, 1988 Science 239: 1534; Beidler 등, 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060; Winter US 5,225, 539, 이들 내용은 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다. Winter 는 본 발명의 인간화 항체 제조에 이용될 수 있는 CDR-그라프트법을 기재하며 (UK 특허 출원 GB 2188638A, 1987 년 3 월 26 일 출원; Winter US 5,225, 539), 이들 내용은 전부 참고문헌으로 포함된다. 특별한 인간 항체의 CDR 전체는 비-인간 CDR 의 적어도 일부에 의해 치환될 수 있거나, 또는 오직 일부의 CDR 가 비-인간 CDR 로 치환될 수 있다. 다만 인간화 항체의 결합에 필요한 다수의 CDR 를 예정된 항원으로 대체하는 것이 필요하다.
항체의 기타 부분, 예컨대, 불변 영역을 예컨대 결실, 부가 또는 치환하여 개질된 모노클로날, 키메라성 및 인간화 항체는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 항체는 하기와 같이 개질될 수 있다: (i) 불변 영역의 결실; (ii) 불변 영역을, 또다른 불변 영역, 예컨대, 항체의 반감기, 안정성 또는 친화성 증가를 위한 불변 영역 또는 또다른 종 또는 항체 클래스 유래의 불변 영역으로 치환함; 또는 (iii) 예를 들어 다른 것들 중에서도 특히 다수의 글리코실화 부위, 이펙터 세포 관능, Fc 수용체 (FcR) 결합, 보체 결합을 변경시키기 위해 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 개질함.
항체 불변 영역의 변경 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변경된 관능, 예컨대 세포 상의 FcR, 또는 보체의 C1 구성원과 같은 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화성을 가진 항체는 항체의 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 치환하여 제조될 수 있다 (참고문헌으로는, 예컨대 EP 388,151 A1, US 5,624, 821 및 US 5,648, 260, 이들의 내용 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다). 쥐과동물, 또는 기타 종에 적용되는 경우 면역글로불린이 상기 관능을 감소 또는 제거하는 유사한 유형의 변경이 기재되어 있을 수 있다.
예를 들어, FcR (예컨대, Fc 감마 R1) 또는 Clq 결합에 대한 항체 (예컨대, IgG, 예컨대 인간 IgG) 의 Fc 영역의 친화성은, 특정 잔기(들)를 그의 측쇄 상에 적당한 관능을 가진 잔기(들)로 치환하거나, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트와 같은 하전된 관능기, 또는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판 또는 알라닌과 같은 방향족 비극성 잔기를 도입하여 변경할 수 있다 (참고문헌으로는, 예컨대, US 5,624,821).
약제학적 조성물
IL-22 결합제, 예컨대, IL-22 안타고니스트 (예컨대, 항-IL-22 항체 및 그의 항원 결합 분절) 는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합되는 경우 약제학적 조성물로서 이용될 수 있다. 상기 조성물은 IL-22-아고니스트 또는 안타고니스트 및 담체에 추가하여, 각종 희석제, 필러, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 당업계에 널리 공지된 기타 재료를 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는" 은 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 좌우된다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 기타 약제학적으로 허용된 담체에 더하여 미셀, 불용성 단층, 액정 또는 수용액 중의 박층 (lamellar layer) 으로서 응집된 형태로 존재하는 지질과 같은 친양쪽성제와 IL-22-안타고니스트를 조합한 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형물에 적합한 지질에는, 이에 한정되지 않으나, 모노글리세리드, 디글리세리드, 술파타이드, 리솔렉시틴, 포스포리피드, 사포닌, 담즙산 등이 포함된다. 상기 리포좀 제형물의 제조는 예를 들어 U.S. 특허 제 4,235,871 호; U.S. 특허 제 4,501,728 호; U.S. 특허 제 4,837,028 호; 및 U.S. 특허 제 4,737,323 호에서 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 문헌들은 전부 참고문헌으로 본원에 포함된다.
본 발명의 치료 방법 또는 용도의 실행시, 치료 유효량의 IL-22 안타고니스트가 대상체, 예컨대 포유류 (예컨대, 인간) 에게 투여된다. IL-22 안타고니스트는 본 발명의 방법에 따라 단독으로 또는 기타 치료제, 예컨대 하기에 더욱 상세히 기재된 항염증제와 병용하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 약제가 공동투여되는 경우, IL-22 안타고니스트는 제 2 의 약제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 담당 주치의는 기타 약제와 병용시 IL-22 안타고니스트 투여의 적절한 순서를 결정할 것이다.
약제학적 조성물에 사용되거나 또는 본 발명의 방법 수행을 위한 IL-22 안타고니스트의 투여는 경구 복용법, 흡입법, 또는 경피, 피하 또는 정맥내 주사와 같은 각종 통상적인 수단으로 수행될 수 있다. 환자에 대한 정맥내 투여가 바람직하다.
치료 유효량의 IL-22 안타고니스트를 경구투여하는 경우, 결합제는 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘릭서의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 추가적으로 젤라틴과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 약 5 내지 95% 결합제, 바람직하게는 약 25 내지 90% 결합제를 포함한다. 액체 형태로 투여되는 경우, 물, 기름, 동물 또는 식물 기원의 오일, 예컨대 낙화생유, 광유, 대두유 또는 참기름, 또는 합성 오일이 첨가될 수 있다. 약제학적 조성물의 액체 형태는 추가로 생리적 식염수, 덱스트로오스 또는 기타 녹말 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함할 수 있다. 액체 형태로 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 약 0.5 내지 90 중량% 의 결합제, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량% 의 결합제를 포함한다.
치료 유효량의 IL-22 안타고니스트는 정맥내, 경피 또는 피하 주사에 의해 투여되며, 결합제는 초순수성 (pyrogen-free) 의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태이다. 상기 비경구적으로 허용되며, pH, 등장성, 안정성 등이 적합한 단백질의 제조는 당업자의 재량이다. 정맥내, 경피 또는 피하 주사용의 바람직한 약제학적 조성물은, 결합제에 더하여 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로오스 주사액, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사액, 락테이트화 링거 주사액 또는 당업계에 공지된 기타 비히클을 포함해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 산화방지제 또는 당업자에게 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 IL-22 결합제의 양은 치료될 상태의 특성 및 심한 정도, 환자가 처한 사전 치료의 특성에 좌우된다. 궁극적으로, 담당 주치의가 각 환자를 치료하기 위한 결합제의 양을 결정할 것이다. 초기에, 담당 주치의는 낮은 투여량의 결합제를 투여하고 환자의 응답성을 관찰할 것이다. 환자에 대해 최적의 치료 효과가 수득될 때까지 더 많은 투여량의 결합제가 투여될 수 있으며, 그 시점에서 투여량은 일반적으로 더 증가하지 않는다. 본 발명의 실행에 이용되는 각종 약제학적 조성물이, 체중 kg 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg 의 IL-22 결합제를 포함해야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 정맥내 요법의 기간은 치료할 질환의 심한 정도 및 각 개인 환자의 상태 및 잠재적인 예측이 어려운 (idiosyncratic) 응답성에 따라 가변적일 수 있다. IL-22 결합제의 각각의 적용 기간은 연속적 정맥내 투여의 12 내지 24 시간의 범위가 될 것으로 여겨졌다. 궁극적으로, 담당 주치의는 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 정맥내 요법의 적당한 기간을 결정할 것이다.
IL-22 아고니스트 및 IL-22 안타고니스트 IL- 22 의 용도
IL-22 는 염증 전 작용, 예컨대 급성 단계 반응을 유도하는 염증 전 작용에 수반되는 싸이토카인이다. 하기 실시예에 상세하게 기재된 바와 같이, IL-22 는 염증성 싸이토카인 (예컨대, IL-1 및 TNFα), 및 IL-22 의 저해제로 인한 것과 연합하여 변화를 유도하여, 류마티스 관절염의 병후를 완화시킨다. 따라서, IL-22 및/또는 IL-22 의 수준을 증가시키거나 또는 IL-22 의 작용을 모방하는 약제 (및 본 발명의 기타 분자) 가 특정 임상 적용에서는 아고니스트로서 유용하며, 상기 분자의 안타고니스트는 기타 임상 상황, 특히 염증 상태의 변화가 요망되는 경우 유용하다. 아고니스트 또는 안타고니스트가 바람직한지 여부는 질환의 병리, 예컨대 연관된 세포 유형, 자극의 특성 및 세포수준의 미세한 환경에 좌우된다.
인간 IL-22 아고니스트에는, 이에 제한되지 않지만, 인간 IL-22 단백질 및 그의 분절, 결실 돌연변이체 및 부가 돌연변이체; 및 인간 IL-22 이 대상으로 되는 수용체 또는 기타 표적과 상호작용하는 펩티드 및 소분자 화합물이 포함된다. 인간 IL-22 안타고니스트에는, 이에 제한되지 않지만, 인간 IL-22 단백질에 대한 항체; 인간 IL-22 이 대상으로 되는 수용체 또는 기타 표적의 가용성 형태; 인간 IL-22 이 대상으로 되는 수용체 또는 기타 표적에 대한 항체; 및 인간 IL-22 와 그의 수용체 또는 기타 표적의 상호작용을 저해 또는 방해하는 펩티드 및 소분자 화합물이 포함된다.
한 국면에서, 본 발명은 세포, 예컨대, 상피 세포를 IL-22 안타고니스트 (예컨대, 항-IL-22 항체 또는 그의 항원 결합 분절) 와, 활성 저해에 충분한 양으로 접촉시켜 하나 이상의 IL-22-관련 활성을 저해하는 방법을 제공한다. IL-22 의 안타고니스트 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 무력화 항체) 는 또한 면역 IL-22-연합 활성의 저해가 요망되는 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 상태에는, 예컨대, 자가면역 장애 (예컨대, 관절염 장애), 호흡기 장애 또는 염증 상태가 포함된다. 본 출원인은 무력화 항-IL-22 항체 이용에 의한 IL-22 활성의 감소가 마우스 콜라겐-유도성 관절염 (CIA) 동물 모델 (실시예 9) 에서의 염증 병후를 완화한다는 것을 보였다. IL-22 mRNA 의 발현은 CIA 마우스의 앞발에서 상향조절된다 (실시예 10). 따라서, IL-22 안타고니스트가 대상체에서의 생체내 면역 억제, 예컨대 IL-22-관련 장애의 치료 또는 방지에 이용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 인간 동물에는, 비정상적인 IL-22 활성을 특징으로 하는 장애를 가진 인간 환자가 포함된다. 본 발명의 용어 "비-인간 동물" 에는 모든 척추동물, 예컨대, 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등이 포함된다.
치료 또는 방지될 수 있는 IL-22-관련 장애의 비제한적 예시에는, 이에 한정되지 않으나, 이식 거부, 자가면역 질환 (예를 들어, 당뇨병, 관절염 (류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 포함), 다발 경화증, 뇌척수염, 중증근육무력증, 전신 홍반 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 쇼렌씨 증후군, 크론씨 병, 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염결막염, 궤양대장염, 척추관절증, 강직 척추염, 내인성 천식, 알러지성 천식, 피부 홍반성 루푸스, 공피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 역전 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알러지성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌척수염, 특발성 양측 진행 감각신경성 난청 (idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss), 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발성 혈소판 감소증, 다발 연골염, 베게너씨 (Wegener's) 육아종증, 만성 활동 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발 스프루, 편평 태선, 그레이브스병, 사코이드증, 원발쓸개관 간경화증, 후면 포도막염 (uveitis posterior) 및 근접 폐섬유증 (interstitial lung fibrosis)); 호흡기 장애, 예컨대, 천식 또는 COPD; 염증 상태, 예컨대 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염); 이식편- 대-숙주 질환, 및 알러지, 예컨대, 아토피 알러지; 및 암 (예컨대, 고형성 또는 연조직 종양) 이 포함된다. 본 발명의 결합제를 이용하여 치료될 수 있는 바람직한 장애에는, 관절염 장애 (예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직 척추염 (바람직하게는, 류마티스 관절염)), 다발 경화증, 제 I 형 당뇨병, 루프스 (SLE), IBD, 크론씨 병, COPD, 천식, 맥관염, 알러지, 공피증 및 염증 상태, 예컨대 피부의 염증 상태 (예컨대, 건선), 간의 염증 상태 (예컨대, 간염), 신장의 염증 상태 (예컨대, 신장염) 및 췌장의 염증 상태 (예컨대, 췌장염) 가 포함된다.
또다른 구현예에서, IL-22 안타고니스트는 단독으로, 또는 본원에 기재된 기타 치료제 (예컨대, TNF 안타고니스트) 와 병용하여 다발성 골수종 및 관련된 B 림프성 암 치료에 이용될 수 있다 (Brenne, A. 등, (2002) Blood Vol. 99 (10): 3756-3762).
한 구현예에서, IL-22 안타고니스트, 예컨대, 그의 약제학적 조성물이 병용 요법으로, 예를 들어 면역 및 염증 장애와 같은 병리학적 상태 또는 장애 치료에 유용한 기타 약제, 예컨대 치료제와 병용되어 투여될 수 있다. 용어 "병용" 은 본문에서 약제들이 동시에든 순차적으로든 실질적으로 동시에 제공되는 것을 의미한다. 순차적으로 제공되는 경우, 제 2 화합물의 투여 완료시 두 화합물들 중 제 1 의 것이 바람직하게는 처리 부위에서 여전히 유효 농도로 검출가능하다.
예를 들어, 병용 요법은 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대, 하기에 더욱 상세히 설명될 하나 이상의 싸이토카인 및 성장 인자 저해제, 면역억제제, 항염증제, 대사 저해제, 효소 저해제 및/또는 세포독성 또는 세포정지제와 공동제형화 및/또는 공동투여되는, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 IL-22 안타고니스트, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 분절 (예컨대, IL-22 에 대한 키메라성, 인간화, 인간, 또는 시험관내 유래 항체 또는 그의 항원 결합 분절) 을 포함할 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 하나 이상의 IL-22 안타고니스트는 본원에 기재된 2 가지 이상의 치료제와 병용되어 사용될 수 있다.
상기 병용 요법은 유리하게는 투여되는 치료제의 더 낮은 투여량을 이용할 수 있어서, 각종 단독요법과 연관되어 발생할 수 있는 독성 또는 합병증을 피할 수 있다. 더욱이, 본원에서 개시된 치료제는 IL-22 수용체 경로와 상이한 경로 상에 작용하여, IL-22 안타고니스트의 효과를 증강 및/또는 상승시킬 것으로 예상된다. 이론에 구애되지 않고도, 본 출원인은, 예컨대 전신 염증에 대한 조직 염증의 증폭자 또는 조절자로서 작용하여 IL-22 가 그의 염증 유효성을 국소적으로 발휘할 수 있다고 여긴다. 본 출원인의 확신은 적어도 부분적으로는, 순환 면역 세포에서보다 조직 부위에 IL-22R 의 발현이 위치하는 것을 발견한 것을 근거로 한다.
따라서, 예컨대 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 이용하는 IL-22 활성의 저해는 본원에 기재된 전신성 항-염증 양상보다 더욱 유효한 조직-특이적인, 항염증 활성을 제공할 수 있다. 더욱이, 예컨대 본원에 기재된 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 이용한 국소적인 IL-22 활성의 저해는 본원에 기재된 전신 항-염증 양태와 병용하기 위한 유용한 후보자를 제공할 수 있다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 IL-22 안타고니스트는 기타 싸이토카인 또는 성장 인자 안타고니스트 (예컨대, 가용성 수용체, 펩티드 저해제, 소분자, 리간드 융합체); 또는 기타 표적 (예컨대, 기타 싸이토카인 또는 성장 인자에 결합하는 항체, 그의 수용체, 또는 기타 세포 표면) 에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 분절; 및 항-염증 싸이토카인 또는 그의 아고니스트와 공동제형화 및/또는 공동투여될 수 있다. 본원에 기재된 IL-22 안타고니스트와 병용될 수 있는 약제의 비제한적 예시에는, 이에 한정되지 않으나, 하나 이상의 인터류킨 (ILs) 의 안타고니스트 또는 그의 수용체, 예컨대, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18 및 IL-21/IL-21R 의 안타고니스트; 싸이토카인 또는 성장 인자의 안타고니스트 또는 그의 수용체, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF), LT, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 가 포함된다. IL-22 안타고니스트는 또한 예컨대, 세포 표면 분자에 대한 항체의 저해제, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, 또는 CD154 (gp39 또는 CD40L) 를 포함하는 이들의 리간드, 또는 LFA-1/ICAM-1 및 VLA-4/VCAM-1 와 병용될 수 있다 (Yusuf-Makagiansar H. 등, (2002) Med Res Rev 22 (2): 146-67). IL-22 안타고니스트와 병용될 수 있는 바람직한 안타고니스트에는 IL-1, IL-12, TNFα, IL-15, IL-17, IL-18 및 IL-21/EL-21R 의 안타고니스트가 포함된다.
상기 약제의 예시에는 IL-12 (바람직하게는 인간 IL-12) 에 결합하는 IL-12 안타고니스트, 예컨대 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체 (또는 그의 항원 결합 분절), 예컨대, WO 00/56772 (Genetics Institute/BASF) 에 개시된 항체; IL-12 수용체 저해제, 예컨대, 인간 IL-12 수용체에 대한 항체; 및 IL-22 수용체, 예컨대 인간 IL-12 수용체의 가용성 분절이 포함된다. IL-15 안타고니스트의 예시에는 IL-15 에 대한 항체 (또는 그의 항원 결합 분절) 또는 그의 수용체, 예컨대, 인간 IL-15 또는 그의 수용체에 대한 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체의 가용성 분절, 및 IL-15-결합 단백질이 포함된다. IL-18 안타고니스트의 예시에는 항체, 예컨대, IL-18 에 대한 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체 (또는 그의 항원 결합 분절) 및 IL-18 수용체의 가용성 분절, 및 IL-18 결합 단백질이 포함된다 (IL-18BP, Mallet 등, (2001) Circ. Res. 28). 안타고니스트의 예시에는 인터류킨-1-변환 효소 (ICE) 저해제, 예컨대 Vx740, IL-1 안타고니스트, 예컨대, IL-1RA (ANIKINRA, AMGEN), sILlRII (Immunex) 및 항-IL-1 수용체 항체 (또는 그의 항원 결합 분절) 가 포함된다.
TNF 안타고니스트의 예에는, TNF (예컨대, 인간 TNF a) 에 대한 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체 (또는 그의 항원 결합 분절), 예컨대 D2E7, (인간 TNFα 항체, 미국 6,258,562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (인간화 항-TNFα 항체; Celltech/Pharmacia), cA2 (키메라성 항-TNFα 항체; RemicadeTM, Centocor); 항-TNF 항체 분절 (예컨대, CPD870); TNF 수용체의 가용성 분절, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, EnbrelTM; Immunex; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44,235A] 참조), p55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질 (Lenercept)); 효소 안타고니스트, 예컨대, TNFα 변환 효소 (TACE) 저해제 (예컨대, 알파-술포닐 히드록삼산 유도체, WO 01/55112, 및 N-히드록시포름아미드 TACE 저해제 GW 3333, -005, 또는 -022); 및 TNF-bp/s-TNFR (가용성 TNF 결합 단백질; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol.- Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42] 참조) 가 포함된다. 바람직한 TNF 안타고니스트는, TNF 수용체의 가용성 분절, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG, 및 TNFα 변환 효소 (TACE) 저해제이다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 IL-22 안타고니스트를 하나 이상의 하기 물질과 조합하여 투여할 수 있다: IL-13 안타고니스트, 예컨대, 가용성 IL-13 수용체 (sIL-13) 및/또는 IL-13 에 대한 항체; IL-2 안타고니스트, 예컨대, DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2 (IL-2 융합 단백질; 세라겐(Seragen); 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36,1223] 참조), 및/또는 IL-2R 에 대한 항체, 예컨대, 항-Tac (인간화 항-IL-2R; Protein Design Labs, Cancer Res. 1990 Mar 1; 50 (5): 1495-502). 또 다른 조합에는, IL-21 안타고니스트와 비제거성(non-depleting) 항-CD4 저해제의 조합이 포함된다 (IDEC-CE9.1/SB 210396 (비제거성 영장류키메라성(primatized) 항-CD4 항체; IDEC/SmithKline). 또 다른 바람직한 조합에는, 항체, 가용성 수용체 또는 안타고니스트성 리간드를 포함하는 공동-자극 경로 CD80 (B7.1) 또는 CD86 (B7.2) 의 안타고니스트; 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL), 항-염증성 싸이토카인, 예컨대, IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; 재조합 IL-10 DNAX/Schering); IL-13 및 TGFβ, 및 이의 아고니스트 (예컨대, 아고니스트 항체) 가 포함된다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 IL-22 안타고니스트는, 하나 이상의 항-염증 약물, 면역억제제, 또는 대사성 또는 효소성 저해제와 공동-제형화(co-formulated) 및/또는 공동-투여될 수 있다. 본원에 기재된 IL-22 안타고니스트와 병용할 수 있는 약물 또는 저해제의 비제한적 예에는, 하나 이상의 하기 물질이 포함되나, 이에 한정되지 않는다: 비스테로이드성 항-염증 약물(들) (NSAID), 예컨대, 이부프로펜, 테니답(Tenidap; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280] 참조), 나프록센(Naproxen; 예컨대, [Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213] 참조), 멜록시캄(Meloxicam), 피록시캄(Piroxicam), 디클로페낙(Diclofenac), 및 인도메타신(Indomethacin); 설파살라진(Sulfasalazine; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281] 참조); 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론; 싸이토카인 억제성 항-염증 약물(들) (CSAID); 뉴클레오티드 생합성 저해제, 예컨대, 퓨린 생합성 저해제, 폴레이트 안타고니스트 (예컨대, 메토트렉세이트 (N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루탐산); 및 피리미딘 생합성 저해제, 예컨대, 디히드로오로테이트 탈수소효소 (DHODH) 저해제 (예컨대, 레플루노미드 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107] 참조). IL-22 안타고니스트와 병용되는 바람직한 치료제에는, NSAID, CSAID, (DHODH) 저해제 (예컨대, 레플루노미드), 및 폴레이트 안타고니스트 (예컨대, 메토트렉세이트) 가 포함된다.
부가적 저해제의 예에는, 하나 이상의 하기 물질이 포함된다: 코르티코스테로이드 (경구, 흡입 및 국소 주입); 면역억제제, 예컨대, 시클로스포린, 타크로리무스 (FK-506); 및 mTOR 저해제, 예컨대, 시롤리무스 (라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예컨대, 가용성 라파마이신 유도체 (예컨대, 에스테르 라파마이신 유도체, 예컨대, CCI-779 (Elit. L. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3 (8): 1249-53; Huang, S. 등. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3 (2): 295-304); 전염증성 싸이토카인에 의한 신호전달을 방해하는 제제, 예컨대 TNFα 또는 IL-1 (예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나아제 저해제); COX2 저해제, 예컨대, 셀레콕시브 및 이의 변형체, MK-966 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81] 참조); 포스포디에스테라아제 저해제, 예컨대, R973401 (포스포디에스테라아제 제 IV 형 저해제; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282] 참조); 포스포리파아제 저해제, 예컨대, 세포질 포스포리파아제 2 (cPLA2) 의 저해제 (예컨대, 트리플루오로메틸 케톤 유사체 (미국 6,350,892); 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 성장 인자 수용체의 저해제, 예컨대, VEGF 저해제 및/또는 VEGF-R 저해제; 및 혈관형성 저해제. IL-22 안타고니스트 면역억제제, 예컨대, 시클로스포린, 타크로리무스 (FK-506); 및 mTOR 저해제, 예컨대, 시롤리무스 (라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예컨대, 가용성 라파마이신 유도체 (예컨대, 에스테르 라파마이신 유도체, 예컨대, CCI-779; COX2 저해제, 예컨대, 셀레콕시브 및 이의 변형체; 및 포스포리파아제 저해제, 예컨대, 세포질 포스포리파아제 2 (cPLA2) 의 저해제 (예컨대, 트리플루오로메틸 케톤 유사체) 와 병용되는 바람직한 치료제.
IL-22 안타고니스트와 병용될 수 있는 치료제의 추가적 예에는 하나 이상의 하기 물질에 포함된다: 6-메르캅토퓨린 (6-MP); 아자티오프린 설파살라진; 메살라진; 올살라진 클로로퀴닌/히드록시클로로퀸; 펜실라민; 오로티오르날레이트(aurothiornalate) (근육내 및 경구); 아자티오프린; 코키신(cochicine); 베타-2 아드레노수용체 아고니스트 (살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄); 크잔틴 (테오필린, 아미노필린); 크로모글리세이트; 네도크로밀; 케토티펜; 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸; 마이코페놀레이트 모페틸; 아데노신 아고니스트; 항혈전제; 보체 억제제; 및 아드레날린성 제제(adrenergic agent).
기타 치료제와 조합된, 본원에 개시된 IL-22 안타고니스트의, 특이적 면역 장애의 치료 또는 예방을 위한 용도는 하기에 더 구체적으로 설명된다.
IL-22 안타고니스트와 조합할 수 있는, 관절염 장애 (예컨대, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염 및 건선성 관절염) 의 치료 또는 예방용 제제의 비제한적 예에는 하나 이상의 하기 물질이 포함된다: 본원에 기재된 IL-12 안타고니스트, NSAID; CSAID; TNF 의 것, 예컨대, 본원에 기재된 TNFα 안타고니스트; 본원에 기재된 비제거성 항-CD4 항체; 본원에 기재된 IL-2 안타고니스트; 항-염증 싸이토카인, 예컨대, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFa, 또는 그의 아고니스트; 본원에 기재된 IL-1 또는 IL-1 수용체 안타고니스트); 본원에 기재된 포스포디에스테라아제 저해제; 본원에 기재된 COX-2 저해제; 일로프로스트(Iloprost; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82] 참조); 메토트렉세이트; 탈리도미드 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282] 참조) 및 탈리도미드-관련 약물 (예컨대, 셀겐 (Celgen)); 레플루노미드; 플라스미노겐 활성화 저해제, 예컨대, 트라넥삼산(tranexamic acid); 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284)] 참조; 싸이토카인 저해제, 예컨대, T-614; 예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282)] 참조; 프로스타글란딘 E1 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282] 참조); 아자티오프린 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281] 참조); 인터류킨-1 변환 효소 (ICE) 저해제; zap-70 및/또는 lck 저해제 (타이로신 키나아제 zap-70 또는 lck 의 저해제); 본원에 기재된 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 저해제; 본원에 기재된 혈관생성 저해제; 코르티코스테로이드 항-염증 약물 (예컨대, SB203580); TNF-변환효소 저해제; 인터류킨-11 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296] 참조); 인터류킨-13 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308] 참조); 인터류킨-17 저해제 (예컨대, [Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S120] 참조); 금; 페니실라민; 클로로퀸; 히드록시클로로퀸; 클로람부실; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 전림프조사; 항-티모사이트 글로불린; CD5-톡신; 경구 투여되는 펩티드 및 콜라겐; 로벤자리트 디소듐(lobenzarit disodium); 싸이토카인 조절제 (CRA) HP228 및 HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인; 글리코스아미노글리칸 폴리설페이트; 미노사이클린; 항-IL2R 항체; 해양성 및 식물성 지질 (어류 및 식물 종자의 지방산; 예컨대, [DeLuca 등. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777] 참조); 오라노핀(auranofin); 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역 글로불린; 질류톤; 마이코페놀산 (RS-61443); 타크로리무스 (FK-506); 시롤리무스 (라파마이신); 아미프릴로스 (테라펙틴); 클라드리빈 (2-클로로데옥시아데노신); 및 아자리빈. 바람직한 조합에는, 메토트렉세이트 또는 레플루노미드, 및 중등도 또는 중증의 류마티스 관절염의 경우에는 시클로스포린와 조합된 하나 이상의 IL-21 안타고니스트가 포함된다.
관절염 장애의 치료를 위해 IL-22 안타고니스트와 병용되는 저해제의 바람직한 예에는, TNF 안타고니스트 (예컨대, TNF 에 결합하는 키메라성, 인간화, 인간 또는 시험관내 유래 항체, 또는 그의 항원 결합 분절; TNF 수용체의 가용성 분절, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, EnbrelTM), p55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; TNF 효소 안타고니스트, 예컨대, TNFα 변환 효소 (TACE) 저해제); IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21/IL-21R 의 안타고니스트; T 세포 및 B 세포 제거제 (예컨대, 항-CD4 또는 항-CD22 항체); 소분자 저해제, 예컨대, 메토트렉세이트 및 레플루노미드; 시롤리무스 (라파마이신) 및 그의 유사체, 예컨대, CCI-779; Cox-2 및 cPLA2 저해제; NSAID; p38 저해제, TPL-2, Mk-2 및 NFkb 저해제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 저해제 (예컨대, 소분자 저해제, 그에 대한 항체, 예컨대, P-셀렉틴에 대한 항체); 에스트로겐 수용체 베타 (ERB) 아고니스트 또는 ERB-NFkβ 안타고니스트가 포함된다. 하나 이상의 IL-22 안타고니스트와 공동투여 및/또는 공동제형화 가능한 가장 바람직한 추가적 치료제에는 하나 이상의 하기 물질이 포함된다: TNF 수용체의 가용성 분절, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, Enbrel™; 메토트렉세이트, 레플루노미드, 또는 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, 예컨대, CCI-779.
IL-22 안타고니스트와 병용할 수 있는, 다발 경화증의 치료 또는 예방용 제제의 비제한적 예에는 하기 물질이 포함된다: 인터페론, 예컨대, 인터페론-알파 (예컨대, AvonexTM; Biogen) 및 인터페론-1β (Betaseron™; Chiron/Berlex); Copolymer 1 (Cop-1; Copaxone™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 본원에 기재된 TNF 안타고니스트; 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 및 티자니딘. IL-22 안타고니스트와 병용가능한 추가적 안타고니스트에는, 기타 인간 싸이토카인 또는 성장 인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF, 및 PDGF 에 대한 항체 또는 이들의 안타고니스트가 포함된다. 본원에 기재된 IL-21 안타고니스트는, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이의 리간드와 같은 세포 표면 분자에 대한 항체와 병용될 수 있다. IL-22 안타고니스트 또한, 메토트렉세이트, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스테라아제 저해제, 아데노신 아고니스트, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 본원에 기재된 전염증성 싸이토카인에 의한 신호전달을 방해하는 제제, IL-Iβ 변환 효소 저해제 (예컨대, Vx740), 항-P7, PSGL, TACE 저해제, T-세포 신호전달 저해제, 예컨대 키나아제 저해제, 금속 로프로티나아제(loproteinase) 저해제, 설파살라진, 아자틀로프린(azathloprine), 6-메르캅토퓨린, 안지오텐신 변환 효소 저해제, 본원에 기재된 가용성 싸이토카인 수용체 및 그의 유도체, 및 항-염증 싸이토카인 (예컨대, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGF) 등의 제제와 병용될 수 있다.
IL-22 안타고니스트와 병용가능한, 다발 경화증의 치료제의 바람직한 예에는, 인터페론-β, 예컨대 IFNb-1α 및 IFNb-1β; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-I 저해제, TNF 저해제, CD40 리간드 및 CD80 에 대한 항체, IL-12 안타고니스트가 포함된다.
IL-22 안타고니스트와 병용가능한, 염증성 장질환 또는 크론씨 병의 치료 또는 예방용 제제의 비제한적 예에는 하기 물질이 포함된다: 부데노시드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-메르캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나아제(lipoxygenase) 저해제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 항산화제; 트롬복산 저해제; IL-1 수용체 안타고니스트; 항-IL-1 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타아제(elastase) 저해제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 본원에 기재된 TNF 안타고니스트; IL-4, IL-10, IL-13 및/또는 TGFß 싸이토카인 또는 그의 아고니스트 (예컨대, 아고니스트 항체); 인터류킨-11; 프레드니솔론의 글루쿠로니드- 또는 덱스트란-접합 전구약물, 덱사메타손 또는 부데소니드; ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 서방성(slow-release) 메살라진; 메토트렉세이트; 혈소판 활성화 인자(Platelet Activating Factor, PAF)의 안타고니스트; 시프로플록사신; 및 리그노케인(lignocaine).
한 구현예에서, IL-22 안타고니스트는, 조절성 면역 반응, 예컨대 이식 거부 또는 이식편대숙주 질환 (graft-v-host disease) 과 관련된 다른 표적에 대한 하나 이상의 항체와 병용할 수 있다. 본 발명의 IL-21/IL21R 안타고니스트와 병용가능한, 면역 반응의 치료 또는 예방용 제제의 비제한적 예에는 하기 물질이 포함된다: CD25 (인터류킨-2 수용체-α), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) 및/또는 CD86 (B7-2) 를 포함하는 (그러나 이제 한정되지 않음) 세포 표면 분자에 대한 항체. 또 다른 구현예에서, IL-22 안타고니스트는 하나 이상의 일반적 면역억제제, 예컨대 시클로스포린 A 또는 FK506 과 병용된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은, IL-22 안타고니스트와 기타 치료 화합물의 병용 투여를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 키트는 약학적 담체에 제형화된 하나 이상의 결합제, 및 적당한 경우 하나 이상의 별도의 약학적 제제에 제형화된 치료제를 포함한다.
진단 검정
생물학적 시료에서 IL-22 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 실험적 방법은, 시험 피검자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계 및 IL-22 단백질 또는 핵산의 존재를 생물학적 시료에서 검출할 수 있도록, IL-22 단백질을 코딩하는 IL-22 단백질 또는 핵산 (예를 들어, mRNA, 게놈 DNA) 을 검출할 수 있는 화합물 또는 제제와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. IL-22 mRNA 또는 게놈 DNA 검출에 바람직한 제제는 IL-22 mRNA 또는 게놈 DNA 에 하이브리다이즈할 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 핵산 프로브는, 예를 들어, 서열 번호: 1 의 핵산과 같은 전장 IL-22 핵산, 또는 엄격한 조건하에서 IL-22 mRNA 또는 게놈 DNA 에 특이적으로 하이브리다이즈하기에 충분한, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오티드 이상의 길이의 올리고뉴클레오티드와 같은 IL-22 핵산의 분절 또는 일부일 수 있다. 본 발명의 진단 검정에서 사용하기에 적합한 기타 프로브는 본원에 기술되어 있다.
IL-22 단백질을 검출하기에 바람직한 제제는 IL-22 단백질에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 또는 더욱 바람직하게는, 모노클로날일 수 있다. 손상되지 않은 항체, 또는 그의 분절 (예를 들면, Fab 또는 F(ab')2) 을 사용할 수 있다. 용어 "표지된"은, 프로브 또는 항체와 관련해, 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질을 커플링하여 (즉, 물리적으로 결합) 프로브 또는 항체의 직접적인 표지 뿐 아니라, 직접 표지된 또다른 제제와의 반응에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적인 표지의 예는 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 형광 표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출 및 바이오틴을 갖는 DNA 프로브의 말단-표지를 포함한다. 용어 "생물학적 시료" 은 피검자로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유액 뿐 아니라, 피검자내에 존재하는 조직, 세포 및 유액을 포함하는 것으로 의도된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내 뿐 아니라 생체내에서 생물학적 시료 중의 IL-22 mRNA, 단백질, 또는 게놈 DNA 를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-22 mRNA 의 검출을 위한 시험관내 기술은 노던(Northern) 하이브리다이즈 및 제자리 (in situ) 하이브리다이즈를 포함한다. IL-22 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISAs), 웨스턴 블럿(Western b10ts), 면역 침강 및 면역 형광법을 포함한다. IL-22 게놈 DNA 의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던(Southern) 하이브리다이즈를 포함한다. 게다가, IL-22 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 표지된 항-IL-22 항체를 피검자에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 피험자에서 그의 존재 또는 위치를 표준 이미지 기술에 의해 검출할 수 있는 방사능 마커로 표지될 수 있다.
하나의 구현예에서, 생물학적 시료는 시험 피험자로부터의 단백질 분자를 함유한다. 대안적으로, 생물학적 시료는 시험 피험자로부터의 mRNA 분자 또는 시험 피험자로부터의 게놈 DNA 분자를 함유할 수 있다. 바람직한 생물학적 시료는 피험자로부터 통상적인 방법으로 단리된 혈청 시료가다.
또다른 구현예에서는, 방법은 추가로 대조 피험자로부터의 대조군 생물학적 시료를 수득하는 단계, IL-22 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 존재를 생물학적 시료에서 검출하도록 대조군 시료를 IL-22 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA 를 검출할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시키는 단계, 및 시험 시료에서의 IL-22 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 존재성을 대조군 시료에서의 IL-22 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 존재성과 비교하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 생물학적 시료에서 IL-22 의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 시료에서 IL-22 단백질 또는 mRNA 를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제 (예를 들면 프로브 또는 항체); 시료내 IL-22 의 양을 검출할 수 있는 수단; 및 시료내에 IL-22 의 양을 기준치와 비교할 수 있는 수단을 포함할 수 있다. 화합물 또는 제제는 적합한 용기내에 포장될 수 있다. 키트는 추가로 IL-22 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한 키트를 사용하기 위한 지시사항을 포함한다.
스크리닝 검정
항체를 증가시키거나; 또다른 면역 반응을 도출하기 위해; 생물학적 유체에서 단백질 (또는 그의 수용체) 의 농도를 양적으로 측정하기 위해 설계된 검정에서 시약 (표지된 시약 포함) 으로서; 상응하는 단백질이 우선적으로 발현되는 (조직 분화 또는 발생의 특정 단계에서 또는 질병 상태에서 항시적으로) 조직에 대한 마커로서; 그리고 물론, 상관 관계의 수용체 또는 리간드를 단리하기 위해 고수율 스크리닝을 위한 다중 단백질의 패널에 포함되어 본원에 기술된 안타고니스트가 이용될 생물학적 활성 측정을 위한 검정에서 이용될 수 있다. 첨부된 예에서 기술된 방법은 펩타이드 또는 소분자 저해제 또는 결합 상호작용의 아고니스트에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다.
임의의 또는 모든 상기 연구 유용성은 연구 제품으로 상업화용 시약 등급 또는 키트 판형으로 개발될 수 있다.
상기 열거된 용도의 수행 방법은 당업자에 잘 공지된다. 그러한 방법을 기재하고 있는 참고문헌에는, ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch 및 T. Maniatis 공저, 1989, 및 "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. 및 A.R. Kimmel 공저, 1987] 이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 IL-22 및 항체의 활성은 기타 방법 중에서도 특히, 하기 방법으로 측정할 수 있다:
흉선세포 또는 비세포 세포독성에 대한 적합한 검정은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann 등, J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa 등, J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai 등, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai 등, J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Herrmann 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann 등, J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa 등, J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai 등, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bowman등, J. Virology 61: 1992-1998; Takai 등, J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli 등, Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Brown 등, J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994.
T-세포-의존형 면역글로불린 반응 및 동종형 전환에 대한 검정 (이들 중에서, T-세포 의존형 항체 반응을 조절하고, Th1/Th2 프로필에 영향을 미치는 단백질을 확인할 것임) 은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; 및 Assay for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. 및 Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. 제 1 판, 페이지 3.8.1-3.8.16, John Wiley 및 Sons, Toronto. 1994.
혼합된 림프구 반응 (MLR) 검정 (이들 중에서, 두드러지게 Th1 및 CTL 응답성을 유발하는 단백질을 확인할 것임) 은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai 등, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai 등, J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli 등, J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
수지상 세포-의존형 검정 (이들 중에서, 나이브(naive) T-세포를 활성화시키는 수지상 세포에 의해 발현되는 단백질을 확인할 것임) 은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Guery 등, J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba 등, Journal of Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia 등, Journal of Immunology 154: 5071-5079, 1995; Porgador 등, Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair 등, Journal of Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang 등, Science 264: 961-965, 1994; Macatonia 등, Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj 등, Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; 및 Inaba 등, Journal of Experimental Medicine 172: 631-640, 1990.
림프구 생존/사멸에 대한 검정 (이들 중에서, 초항원(superantigen) 유도 후 사멸을 막는 단백질 및 림프구 항상성을 조절하는 단백질을 확인할 것임) 은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Darzynkiewicz 등, Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca 등, Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca 등, Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh 등, Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai 등, Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca 등, International Journal of Onco10gy 1: 639-648, 1992.
T-세포 분화결정 및 발생의 초기 단계에 영향을 미치는 단백질에 대한 검정은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Antica 등, Blood 84: 111-117, 1994; Fine 등, Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy 등, Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki 등, Proc. Nat. Acad Sci. USA 88: 7548-7551, 1991.
상기 기술된 스크리닝 검정에 의해 확인되는 조절제는, 예를 들어, 그러한 제제로 처리의 효능, 독성 또는 부작용을 측정하기 위해 적합한 동물 모델에서 시험된다. 대안적으로, 조절제는 본원에 기술되는 하나 이상의 시험관내 또는 시험관내 검정에서 시험된다.
IL-22 아고니스트 또는 안타고니스트의 효과 검정
IL-22 아고니스트 또는 안타고니스트의 활성은 하기 방법에 의해 측정할 수 있다:
T-세포 또는 흉선세포 증식에 대한 검정에 대해서는, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai 등, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bertagnolli 등, J. Immunol. 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli 등, Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli, 등, J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman 등, J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.
비장 세포, 림프절 세포 또는 흉선세포의 싸이토카인 생성 및/또는 증식에 대한 검정에 대해서는, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. and Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; 및 Measurement of mouse and human Interferon y, Schreiber, R. D. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.
조혈 및 림프생성 세포의 증식 및 분화에 대한 검정에 대해서는, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. and Lipsky, P. E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries 등, J. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau 등, Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 6.6. 1-6.6. 5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human interleukin 11 - Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 6.15. 1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human interleukin 9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. 제 1 권 페이지. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto.
항원에 반응하는 T-세포 클론에 대한 검정 (이들 중에서, 증식 및 싸이토카인 생성을 측정함으로써 APC-T 세포 상호 작용 뿐 아니라 직접 T-세포 효과에 영향을 주는 단백질을 확인할 것임) 은, 이에 제한되지 않으나 하기에 기재되어 있다: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assay for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095, 1980; Weinberger 등, Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981; Takai 등, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai 등, J. Immunol. 140: 508-512, 1988.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 예증된다. 본 출원 전반에 언급된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 뿐 아니라 서열 목록이, 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예 1: 클론 " TIL - 22" 의 동정 및 특징
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 클론 "IL-22" 로 확인되었다. 클론 IL-22 를 이하 방법을 따라 단리하였다. 쥐과동물 EST 는 ConA 및 골수 유도성 수지상 세포로 활성화된 비세포로부터 제작된 쥐과동물 cDNA 라이브러리로부터 확인되었다. 분비된 단백질을 코딩하는 cDNA 에 선택적인 방법을 사용하여 EST 를 확인하였다 (참조 미국 특허 제 5,536,637 호). 쥐과동물 EST 서열은 동일한 cDNA 라이브러리로부터 전장 쥐과동물 클론을 단리하기 위해 사용되었다. 쥐과동물 클론의 서열 분석은 인터류킨-10 (IL-10) 과 유의하게 상동임을 밝혔다.
쥐과동물 클론의 인간 상동체를 단리하기 위하여, PCR 프라이머를 IL-10 에 상동을 보였던 쥐과동물 서열의 영역을 근거로 제작하였다. PHA/PMA-자극된 인간 PBMC 로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 증폭을 위해 상기 프라이머를 사용하여 유의한 크기의 PCR 생성물을 제조하였다. PCR 생성물의 서열 분석은 그것이 쥐과동물 cDNA 와 상동체임을 확인시켜 주었다. 일부 인간 클론의 서열로부터 올리고뉴클레오티드를 구축하여, PBMC 라이브러리로부터 전장 인간 클론을 단리하기 위해 사용하였다.
IL-22 는 분비된 단백질의 전체 코딩 서열을 포함하는 전장 인간 클론이다 (또한 본원에 "IL-22" 단백질이라 언급됨). 그의 아미노산 서열 분석은 hIL-10 과 약 23% 상동성을 갖는 것을 나타낸다. IL-10 의 추정되는 수용체-결합 모티프에 기초하여, 컴퓨터 모델링을 통해 유사한 기능을 가진 3 개 모티프가 IL-22 에서 제안되었다. 이들은 서열 번호: 2 의 잔기 50 내지 60, 잔기 63 내지 81, 및 잔기 168 내지 177 의 영역이다. 데이타베이스의 분석은 IL-22 가 또한 IL-10 또는 다른 종과 비슷한 상동 수치를 나타낸다는 것을 밝혔다.
상기 측정된 바와 같이 IL-22 의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1 에 보고되고, 폴리(A) 테일을 포함한다. 상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 IL-22 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호: 2 에 보고된다.
실시예 2: IL-22 단백질의 특성
적합한 발현 벡터에 IL-22 cDNA 를 CHO 세포에 트랜스펙션하여, 전장 IL-22 단백질을 안정하게 발현하고 분비하는 세포주를 제조하였다. 적합한 IL-22 발현 벡터를 사용하는 일시적으로 트랜스펙션된 COS 세포를 분석용 IL-22 단백질을 제조에 사용하였다. 시판되는 Lipofectamine 시약 (Gibco) 을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 흥미롭게도, IL-22 를 발현하는 COS 세포는 세포 배양 단층에 구멍을 형성하는 비균일 분리 (non-uniformly detach) 로 관찰되었다. 트랜스펙션된 COS 세포에 의해 조건화된 배지를 IL-22 단백질의 싸이토카인-유사 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 세포 분해물의 웨스턴 블럿 분석은, IL-22-발현 세포에 의한 배양액에 세포를 노출시켜, Stat-3 이 대식세포-유사 특성을 나타내는 신장 혈관간 조직-유도된 세포주에서 인산화 (활성화)되는 것을 나타낸다(MES-13; 참조, Dumoutier 등 (2000) J. of Immunology 164: 1814-1819). 게다 가 Stat-3 의 인산화는 IL-22 단백질로 처리된 비-트랜스펙션된 COS 세포에서 유도된다.
IL-22 단백질 (본원에 기술된 트랜스펙션된 COS 세포주로부터 유도됨) 의 전기영동 분석은, 발현된 단백질이 크기 범위내에 존재한다는 것을 나타낸다. 전기영동 전에 N-글리카네이즈를 COS-유도된 IL-22 단백질에 처리하여, 미처리된 IL-22 에서 보이는 최고 이동성 (예를 들면, 최저 분자량) 종류에 상응하는 단일 밴드를 제공한다. 이는 IL-22 의 아미노산 서열 (서열 번호: 2 의 아미노산 잔기 54-56, 68-70, 97-99, 및 176-178) 에서 확인된 추정 N-연결된 글리코실화 부위에 발생할 수 있는 것으로 제안된 글리코실화와 일치한다.
에드만(Edman) N-말단 서열 분석은 성숙 IL-22 단백질의 N-말단이 서열 번호: 2 의 위치 34 에서의 잔기 (알라닌) 로 시작되는 것임을 결정했다. 성숙 IL-22 단백질의 N-말단에 "6x 히스티딘" 친화성 택(tag) 및 FLAG 에피토프 택을 융합하여 발현 벡터를 제조한다. (첨부된 아미노산 택은 서열 번호: 5 에서 제시되고, 하기의 아미노산 서열:
Figure 112005075809468-PCT00008
을 갖는다). 상기 태깅된 구조체를, 안정하게 발현하는 CHO 세포주 및 일시적으로 발현하는 COS 세포주를 제작하는데 사용하였다. 택은, IL-22 를 검출하기 위한 (예를 들면, 항-6xhis 항체; 항-FLAG 항체), 그리고 배양액으로부터 단백질을 정제하기 위한 (Ni+2 수지 사용) 통상적인 수단으로 제공된다. IL-22-발현 COS 세포주로부터 상기 택에 의해 정제된 인간 IL-22 단백질은 MES-13 세포에서 Stat-3 활성화를 유도하기 위해 사용할 수 있다.
활성화된 Th1 및 Th2 세포에서 IL-22 mRNA 전사물의 비교 (예를 들어, Syrbe 등, (1999) Springer Seminars in Immunopathology, 21: 263-85 참조) 는 활성화된 Th2 세포보다 활성화된 Th1 세포에서 실질적으로 더 높은 수준의 IL-22 의 발현을 나타내었다. RNAse 보호 검정으로 IL-22 mRNA 의 분석을 수행하였다. 그러므로, IL-22 는 적응성 면역 반응 동안, 특이적으로 Th1 CD4+ T 세포에 의해 유도된다.
실시예 3: IL-22 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조 및 생체내 투여.
pED6dpc-2mIL-22 를 EcoRI 및 NotI 으로 절단하고, 1.1 kb mIL-22 cDNA 분절을, EcoRI 및 NotI 으로 절단하여 아데노바이러스 벡터 Adori 1-2 와 라이게이션하여 Adori 1-2 쥐과동물 IL-22 (mIL-22) 벡터를 유도하였다. pEGFP-N1 (C10NTECH Laboratories, Inc., Pa10 Alto, CA) 을 EcoRI 및 NotI 으로 절단하고, EGFP 를 Adori 1-1 의 EcoRI 및 NotI 위치에 삽입하여 Adori 1-1 녹색 형광 단백질 (GFP) 구축체를 유도하였다. 광범위 제한효소 절단 분석 및 플라스미드내 cDNA 삽입체의 서열분석에 의해 두가지 모든 구축체를 확인하였다. mIL-22 cDNA 및 EGFP 의 발현은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉각 초기 프로모터 (immediate early promoter) 및 인핸서로부터 유도된다.
인간 신장 배아 신장 세포주 293 내에서의 상동 재조합에 의해 Ad5 E1a 결실 (dl327) 재조합 아데노바이러스를 생성시켰다. 재조합 아데노바이러스 바이러 스를 단리하고, 이어서 293 세포상에 증폭시켰다. 3 회 주기의 동결 해동에 의해 감염된 293 세포로부터 바이러스를 방출시켰다. 바이러스를 세슘 클로라이드 원심분리 구배에 의해 추가로 2 회 정제하고, 4℃ 에서 인산 완충된 식염수 (PBS) (pH 7.2) 에 대해 투석하였다. 투석 후, 글리세롤을 10 % 의 농도로 첨가하였고, 사용할 때까지 바이러스를 -80℃ 에서 보관하였다. 바이러스를 도입된 유전자 (transgene) 의 발현, 293 세포상에 플라크 형성 단위 (입자/ml), 내독소 측정 및 바이러스의 PCR 분석 및 바이러스내의 IL-22 코딩 영역의 서열 분석에 의해 특징화하였다.
mIL-22 를 코딩하는 재조합 아데노바이러스의 5 X 1010 입자의 단일 투약을 7-8 주령의 암컷 C57BI/6 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 대조 마우스에 GFP 를 코딩하는 아데노바이러스 또는 PBS/10% 글리세롤를 제공하였다. 주입 후 다양한 시점에 각 실험군의 마우스를 희생시켰다. 혈핵학상 및 혈청 화학 분석을 위해 혈액을 심천공에 의해 수집하였다. 후방-안와동을 통해 혈액을 수집하고, 백분율을 혈액 도말상에 수행하였다. 조직을 수합하고, 포르말린 중에 고정하고, 조직 병리학을 위해 헤마토자일린 및 에오신으로 염색하였다.
실시예 4: IL-22 면역 효과
쥐과동물 IL-22 의 cDNA 를 마우스 내에 바이러스를 도입하여, IL-22 의 면역 효과를 후생동물 정황에서 조사하였다. 아데노바이러스 벡터를 8-주령의 C57/B6 암컷 마우스에 5 X 1010 바이러스 입자의 정맥내 또는 피하 주입에 의해 쥐 과동물 IL-22 의 cDNA 발현에 사용하였다. 시험 마우스를 주입 후 제 7 일 및 제 14 일에 희생시키고, 단지 완충액만 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 발현하는 아데노바이러스를 주입한 대조 마우스와 비교하였다. 제 7 일 및 제 14 일에, 절대적 및 상대적 흉선 질량이 바이러스 쥐과동물 IL-22 를 발현하는 마우스에서 뚜렷하게 감소하는 것을 주목하였다. 비장의 절대 평균 질량이 제 14 일에 감소하였고, 간 질량이 제 7 일에 약간 증가하였다. 제 7 일 및 제 14 일에 흉선의 전체적인 광범위한 위축 뿐 아니라 림프 방혈 (현미경으로 관찰됨) 이 명백하였다. 신장 질량의 증가 및 간의 증대가 또한 관찰되었다.
게다가, 제 7 일에 감소된 적혈구의 파라미터, 적혈구 수치, 헤모글로빈, 및 헤마토크릿(hematocrit) 을 포함하는 명백한 수많은 혈액학적 영향이 있었다. 상기 영향들은 취합되어 동물에서 빈혈을 나타내었다. 게다가, 호중성구의 증가 때문에 혈소판의 증가 뿐 아니라 백혈구 수치의 증가가 있다. 상기 관찰의 견지에서, 효과가 골수의 수치가 될 수 있다는 것을 표시하는 재생 반응의 증거가 없다. 이것의 가능한 원인은 신장 또는 소화관을 통한 소분자의 분실이다. 게다가, 제 7 일 및 제 14 일에 알부민(Albumin) 수치에서 약간의 감소가 있으나, 급성 단계 반응의 표시인 혈청 아밀로이드 A 및 피브리노겐 수치에서 증가가 있다. 간 RNA 의 분석은 SAA's, GRO1, OPN, LCN2, PRTN3 및 SOCS3 의 증가를 나타내었다 (하기 표 3 참조). 기타 임상적인 관찰은 체중의 감소, 최소 탈수의 징조, 요비중 증가, 소변 방출 감소 및 근위 세뇨관의 호염기성 백혈구의 유도를 포함하였다. 관찰된 호염기성 백혈구는 근위 세뇨관의 상피 세포에 존재하는 증가된 세 포 분열 및 증가된 rRNA 때문이다. IL-22 의 투여 후에 검출되는 변화는 급성 단계 반응을 유도하는 IL-22 의 능력과 일치한다 (예를 들어, Gabay, C. (1999) New England Journal of Medicine 340 (6): 448-454 참조).
실시예 5: 항-IL-22 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 제조 및 특성.
모노클로날 및 폴리클로날 항체를 또한 본 명세서에 기술된 통상적인 방법을 사용하여 제조하였다. 하기 표 1 은 결합 친화성, CIA 효능 및 모노클로날 항체 P3/1, P3/2, P3/3 및 P3/5 의 무력화 특이성 뿐 아니라, IL-22 에 직접 대항하는 닭 폴리클로날 항체를 예증한다. 항체 P3/1, P3/2, P3/3 및 P3/5 는 또한 본원에서 각각 Ab-01, Ab-04, Ab-02 및 Ab-03 으로 언급된다.
[표 1]: 항체 결합 특이성, 친화성 및 무력화 활성
래트 모노클로날 Abs 폴리클로날 Ab
IL-22 항체 P3/1 (Ab-Ol) P3/2 (Ab-04) P3/3 (Ab-02) P3/5 (Ab-03) 닭 폴리클로날
결합 특이성 마우스 인간 마우스/인간 마우스 마우스/인간
무력화 특이성 마우스 인간 마우스/인간 마우스 마우스/인간
Biacore 에 의한 IL-22 (nM) 에 대한 친화성 (KD) 0.54 1.51 68.1 0.1
ELISA 기반한 검정에서의 효과 IL22R ELISA 에서 향상; IL22R/IL10R2 에서 일부 억제 양쪽 모두 억제 IL22R ELISA 에서 향상; IL22R/IL10R2 에서 일부 억제 양쪽 모두 억제
CIA 효능 양호 NA 적정 NA
에피토프 Ab-02 와 구별 본원에서 기술된 Ab-04 에피토프 본원에서 기술된 Ab-02 에피토프 Ab-04 와 구별
마우스 또는 인간 h/f 태깅된 IL-22 마이크로티터(microtiter) 플레이트를 사용하는 ELISA 에 의해 결합 특이성을 측정하였다. 각 항체는 표 1 에서 제시된 바와 같이 마우스 또는 인간 IL-22 에 대해 강한 특이성을 나타내었다. 5 ng/ml 마우스 또는 인간 h/f 태깅된 IL-22 에 의해 매개되는 STAT3 인산화를 억제하기 위한 항체의 능력을 평가하여 무력화 특이성을 측정하였다. 결합된 쥐과동물 IL-22 를 사용하는 효소-연계 면역흡착 검정 (ELISA) 은 mAb P3/1 이 IL-22-Fc 에 대해 ∼2 nM 이며, H/F IL-22 에 대해 ∼10 nM 임에 근거하여 ∼5 nM ED50 을 갖는다는 것을 나타낸다. 게다가, 재조합 IL- 22 을 인식하는 것에 더해, P3/1 mAb 는 IL-22 레트로바이러스 벡터를 트렌스펙션한 T 세포로부터 분비되는 본래 IL-22 에 또한 결합한다. IL-22 항체 P3/1 은 ∼1 nM 의 ID50 을 갖고, 싸이토카인이 거의 포화 조건 (1 nM) 에서 존재할 경우, IL-22 활성을 억제하도록 화학량론적으로 작용한다고 밝혀졌다.
인간 IL-22 에 대한 래트 항체 Ab-02 및 Ab-04 의 결합 친화성 (KD) 을 Biacore 를 사용하여 각각 68.1 nM 및 1.51 nM 이라고 측정하였다. 비슷한 조건하에서, 인간 IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc 복합체 및 IL-22BP-Fc 에 대한 인간 IL-22 의 결합 친화성을 각각 1.48 nM 및 3.37 nM 이라고 측정하였다. 상기 결합 친화성 측정에 사용된 실험 조건은 하기 실시예 22 에서 더욱 상세히 기술된다.
실시예 6: IL-22 mRNA 및 수용체의 발현.
다양한 인간 및 마우스 조직에서, 반정량적인 역전사효소 핵산 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 으로 IL-22 및 그의 수용체의 발현을 시험하였다. 실험은 IL-22 메신저 RNA (mRNA) 가, 대조군 액틴에 대하여 정규화된 바와 같이 인간 고환, 폐, 전립선 및 말초 혈액 림프구 (PBL) 에서 매우 낮은 농도로 존재한다는 것을 밝 혔다. 게다가, 반정량적인 RT-PCR 은 IL-22 수용체가 인간 췌장에서 최고 농도이며, 간, 소장, 피부, 갑상선, 신장, 심복, 고환, 침샘, 부신 및 전립선에서 낮은 농도로 검출된다는 것을 보여준다. 대안적으로, 쥐과동물 IL-22 수용체는 신장 및 배아 e8.5 및 el9 에서 낮은 발현을 보이면서, 간, 소장, 근육, 피부 및 난소에서 최고 발현을 나타낸다.
실시예 7: IL-22 단백질에 대한 제자리 하이브리다이즈 및 사멸 ( apoptosis ) 염색
아데노바이러스 발현 IL-22 (AdIL-22) 또는 리포폴리사카리드 (LPS) 를 처리한 마우스의 IL-22 단백질 및 수용체 메신저 RNA (mRNA) 에 대한 제자리 하이브리다이즈를 수행하여, 하기를 도출했다:
[표 2]
A. IL-22 싸이토카인 mRNA 의 검출
조직
간 제 1 일: 간세포의 세포질에서 염색 약간 양성 제 3 일 및 제 14 일: 특이적인 염색없음 6 시간: 간세포의 세포질에서 염색 약간 양성
비장 제 1 일, 제 3 일 및 제 14 일: 세동맥 영역에서 약간 양성 음성
심장 N/A 음성
결장 N/A 음성
신장 1 일: 근위 및 원위 세뇨관 상피, 피질수질 접합부에서 헨리 고리(Henle's 10op), 보우만 주머니 (Bowman space) 의 일부 체벽 세포 및 몇몇 내피 세포의 세포질의 염색은 가벼운 양성이였다 4 일: 근위 및 원위 세뇨관 상피 및 피질수질 접합부에서 헨리 고리의 세포질의 염색 14 일: 근위 세뇨관 상피의 세포질의 염색 2 시간: 근위 및 원위 세뇨관 상피, 원위 세뇨관 상피에서 헨리 고리, 피질수질 접합부에서 헨리 고리, 피질수질 접합부의 체벽 세포의 세포질의 염색은 약하게 양성이였다 6 시간: 근위 및 원위 세뇨관 상피 및 피질수질 접합부에서 헨리 고리, 사구체 술 세포, 보우만 주머니 의 일부 체벽 세포 및 몇몇 내피 세포의 세포질의 염색은 약하게 내지 중간 양성이였다
췌장 N/A 2 시간 및 6 시간: 선세포의 세포질에서 염색은 약하게 양성
폐 N/A 2 시간 및 6 시간: 제 II 형 폐세포 및/또는 폐포내 대식 세포에서 염색은 약하게 내지 약간 염색되었다
위장 N/A 6 시간: 기저 주세포의 세포질에서 염색은 약하였다
십이지장 및 공장 N/A 2 시간 및 6 시간: 장세포 가장자리의 세포질의 염색은 구분하기에 중간 내지 확안한 정도였고, 장신경 망상세포에서 약하게 양성이다.
B. LPS-처리된 마우스에서 IL-22 수용체 mRNA 의 검출
조직 LPS-처리된 마우스
간 2 시간 및 6 시간: 간세포의 세포질에서 염색은 약간 내지 약했고, 핵 염색은 헵토사이트, 담관 상피 및 내피 세포에서 관찰되었다.
신장 2 시간 및 6 시간: 염색은 근위 및 원위 세뇨관 상피, 피질수질 접합부에서 헨리 고리, 사구체 술 세포, 보우만 주머니의 일부 체벽 세포 및 몇몇 내피 세포의 세포질 및 핵에서 약간 내지 중간이었다.
췌장 2 시간 및 6 시간: 선세포의 세포질에서 염색은 약간 양성
심장 6 시간: 핵 염색은 심근세포 및 상피 및 내피 세포에서 중간 양성이였다.
IL-22 수용체 mRNA 는 소장 및 대장, 위, 림프절, 비장, 및 폐에서 부가적으로 검출된다. IL-22 수용체의 발현은 부가적으로 LPS 와 같은, 선천적 면역 반 응의 조절자에 의해 상향 조절될 수 있다.
마지막으로, 정맥내에 mIL-22 단백질이 수용된 c57BL/6 마우스로부터 취해진 신장 세포의 TUNEL 검정은, 여러 근위 세뇨관에서 몇몇의 사멸 상피 세포를 나타내었다. 정맥내로 식염수를 받은 마우스 (대조군) 는 양성 염색을 나타내지 않았다.
상기 데이타는 선천적 면역 반응 동안에 싸이토카인 및 수용체 모두가 유도될 수 있고, 유도가 염증 상태 (LPS) 인 조직에 제한되는 것을 나타낸다. 적응성 면역 반응 동안에, IL-22 는 또한 Th1 CD4+ T 세포로부터 유도될 수 있다. 순환 백혈구가 수용체를 갖는 것으로 나타나지 않으므로, 상기 결과는 적응성 면역 반응의 하류 조직내 효과기로서 IL-22 기능이, 항상적으로 수용체의 조직 발현에 의해 강화되고, 염증의 선천성 유도체에 의해 추가로 상향조절 된다는 것을 암시한다.
실시예 8: 유전자 발현에서의 IL-22 매개된 변화
AdIL-22 또는 Ad-GFP 구축체를 감염시킨 마우스의 간 세포에서 유전자 발현의 수준을 조절하는 IL-22 의 능력을 조사하였다.
감염 후 제 1 일 및 제 3 일째에 냉동 마우스 간을 분쇄하고, Promega RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI) 을 사용하여 RNA 를 정제하였다. RNA 를 RNeasy 미니키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 총 RNA 를 RNeasy 미니키트 (Qiagen, Hidden, Germany) 를 사용하여 인간 PBMC 로부터 단리하였다.
총 RNA 를, 10 ㎍ 의 총 RNA 를 70 ℃ 에서 10 분간 100 pM T7/T24-태깅된 올리고-dT 프라이머 (Genetics Institute, Cambridge, MA 에서 합성됨) 로 변성시키고, 얼음에서 냉각시켜 하이브리다이즈를 위해 제조하였다. 첫번째 가닥 cDNA 합성을 하기 완충액 조건하에서 수행하였다: 1X 첫번째 가닥 완충액 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA.), 10 mM DTT (GIBCO/Invitrogen), 500 μM 의 각 dNTP (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)), 400 단위의 Superscript RT II (Invitrogen Life Technologies) 및 40 단위 RNAse 저해제 (Ambion, Austin, TX.). 반응을 47 ℃ 에서 1 시간 동안 진행하였다. 하기 제시된 시약을 최종 농도로 첨가하여 두번째 가닥 cDNA 를 합성하였다: 1X 두번째 가닥 완충액 (Invitrogen Life Technologies), 추가의 200 μM 의 각 dNTP (Invitrogen Life Technologies), 40 단위의 E. coli DNA 중합효소 I (Invitrogen Life Technologies), 2 단위 E. coli RNaseH (Invitrogen Life Technologies), 및 10 단위의 E. coli DNA 라이게이즈. 반응을 15.8 ℃ 에서 2 시간 동안 진행하였다. 반응의 마지막 5 분 동안, 6 단위의 T4 DNA 중합효소 (New England Biolabs, Beverly, MA) 를 첨가하였다.
수득된 이중 가닥 cDNA 를 하기와 같은 BioMag 카르복실 말단 입자를 사용하여 정제하였다: 0.2 mg 의 BioMag 입자 (Polysciences Inc., Warrington, PA) 를 0.5 M EDTA 로 3 번 세척하여 평형시키고, 0.5 M EDTA 중에 22.2 mg/ml 의 농도로 재현탁시켰다. 이중 가닥 cDNA 반응을 10% PEG/1.25 M NaCl 의 최종 농도로 희석시키고, 비드 현탁액을 0.614 mg/ml 의 최종 비드 농도로 첨가하였다. 반응 물을 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. cDNA/비드 복합체를 300 ㎕ 의 70 % 에탄올로 세척하였고, 에탄올을 제거하고, 튜브를 공기 건조하였다. cDNA 를 20 ㎕ 의 10 mM Tris-아세테이트 (pH 7.8) 를 첨가하여 용출했고, 2-5 분 동안 인큐베이션하고, cDNA 를 함유하는 상층액을 제거하였다.
10 ㎕ 의 정제된 이중 가닥 cDNA 를, 1X IVT 완충액 (Ambion, Austin, TX) 5,000 단위 T7 RNA 중합효소 (Epicentre Technologies, Madison, WI), 3 mM GTP, 1.5 mM ATP, 1.2 mM CTP 및 1.2 mM UTP (Amersham/Pharmacia,), 0.4 mM 각 bio-16 UTP 및 bio-11 CTP (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), 및 80 단위 RNase 저해제 (Ambion, Austin, TX) 를 포함한 시험관내 전사 (IVT) 용액에 첨가하였다. 37℃ 에서 16 시간 동안 반응을 진행하였다. 표지된 RNA 를 RNeasy (Qiagen) 를 사용하여 정제하였다. RNA 수율은 260 nm 에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
94 ℃ 에서 35 분 동안 40 mM Tris-아세테이트 (pH 8.0), 100 mM 칼륨 아세테이트, 및 30 mM 마그네슘 아세테이트 중에서 12 ㎍ 의 시험관내 전사 생성물을 분절하였다. 분절된, 표지된 RNA 프로브를, 최종 조성이 1X 2-N-모르폴리노에탄술폰산 (MES (완충액 (pH 6.5), 50 pM Bio948 (프로브 어레이 상에 지표 특징에 하이브리다이즈되는 대조군 바이오틴화 올리고 (Genetics Institute, Cambridge, MA), 100 ㎍/ml 청어 정자 DNA (Promega, Madison, WI), 500 ㎍/ml 아세틸화 BSA (Invitrogen Life Technologies) 및 1 ㎕/㎍ 표준 곡선 시약 (Proprietary reagent supplied by Gene 10gic, Gaithersburg, MD) 의 하이브리다이즈 완충액 중에 희석 시켰다. 상기 하이브리다이즈 용액을 45 ℃ 에서 밤새, 2 개 유리 비드 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 로 미리 하이브리다이즈시켰다. 하이브리다이즈 용액을 깨끗한 튜브로 제거하고, 95 ℃ 에서 1-2 분 동안 가열하고, 2 분 동안 높은 속도로 마이크로원심분리하여 불용성 데브리스를 침전시켰다. 올리고뉴클레오티드 어레이 카트리지 (쥐과동물 74Kv2, Affymetrix, Santa Clara, CA) 를 엄격하지 않은 세척 완충액 (0.9 M NaCl, 60 mM 나트륨 포스페이트, 6 mM EDTA 및 0.01% Tween20) 으로 미리 적시고, 45 ℃ 에서 회전하며 5-10 분 동안 인큐베이션하였다. 완충액을 카트리지로부터 제거하고, 어레이를 180 ㎕ 의 하이브리다이즈 용액으로 밤새 45 ℃ 에서 45-60 rpm 에서 회전하며 하이브리다이즈하였다. 밤새 인큐베이션 후에 하이브리다이즈 용액을 제거하고 카트리지를 엄격하지 않은 세척 완충액으로 채웠다. 어레이 카트리지를 25 ℃ 에서 유체 장소 (fluidics station) 를 사용하여 2 회 혼합/주기의 10 주기에 따라 엄격하지 않은 세척 완충액에 있어, 15 회 혼합/주기의 4 주기에 따라 엄격한 세척 완충액 (100 mM MES, 0.1 M Na+, 0.01 % Tween20 및 0.005 % 소포제) 으로 세척하였다. 이어서, 프로브 어레이를 25℃ 에서 SAPE 용액 (100 mM MES, 1 M Na+, 0.05 % Tween20, 0.005 % 소포제, 2 mg/ml 아세틸화 BSA (Invitrogen Life Technologies) 및 10 ㎍/ml R 피코에리트린 스트렙타비딘 (Molecular Probes, Eugene, OR)) 중에 10 분 동안 첫번째 염색을 하였다. 첫번째 염색 후, 프로브 어레이를 25℃ 에서 엄격하지 않은 세척 완충액으로 4 회 혼합/주기의 10 주기 동안 세척하였다. 이어서, 프로브 어 레이를 25℃ 에서 항체 용액 (100 mM MES, 1 M Na+, 0.05 % Tween 20, 0.005 % 소포제, 2 mg/ml 아세틸화 BSA (Invitrogen Life Technologies), 100 ㎍/ml Goat IgG (SIGMA, St. 10uis, MO) 및 3 ㎍/ml 바이오틴화 항-스트렙타비딘 항체 (염소) (Vector Laboratories) 중에서 10 분 동안 염색하였다. 두번째 염색 후, 프로브 어레이를 25℃ 에서 SAPE 용액 중에, 추가 10 분 동안 다시 염색하였다. 마직막으로, 프로브 어레이를 30℃ 에서 엄격하지 않은 세척 완충액으로 4 회 혼합/주기의 15 주기 동안 세척하였다.
어레이를 Affymetrix 유전자 칩 스캐너 (Affymetrix, Santa Clara, CA) 를 사용하여 스캔하였다. 스캐너는, 스캐닝 다중초점 현미경을 포함하고, 여기 공급원으로서 아르곤 이온 레이저를 사용하고, 방출은 광전자 배증관 튜브에 의해 검출하는 530 nm 밴드패스 필터 (fluorscein0 또는 560 롱패스 필터 (피코에리트린) 에서 광전자 배증관 튜브에 의해 검출된다.
mRNA 를 쥐과동물 74k (Mu74K) 칩 세트상에서 분석하였다. 데이타를 GENECHIP 4.0 소프트웨어를 사용하여 축소시켰다. 각각의 실험 시료를 2-열 분석에서 시간 대응 대조와 비교하였다. 데이터를 한 군에서 "존재" 라고 불리운 유전자에 대한 기준으로 골라내고, "증가" 또는 "감소" 로 지칭되지 않은 모든 유전자를 제거하였다.
3 마리 마우스 (AD-GIL-19 마우스 49, 51, 및 52) 에 대한 데이터는 하기에 제시된다. 제시된 것은 그의 발현이 각각의 동물에 대한 표시된 평균-배 변화 로 Ad-GFP 대조에 관련하여 변하는 것이다. Ad-IL-22 처리된 동물에서 관찰되는 유전자 발현 변화는 급성 단계 반응의 IL-22 에 의한 유도와 일치한다. 관찰된 변화는 또한 처리된 동물에서 염증 단계의 표시이다.
[표 3]
제 3 일 간-U74v2 Ad-GIL-19 마우스 Ad-GIL-19 마우스 Ad-GIL-19 마우스
마우스 수 49 51 52
식별자 유전자 이름 평균-배 변화 평균-배 변화 평균-배 변화
1300017C10RIK RIKEN cDNA 1300017C10 유전자 23.4 17.2 19.3
SAA-PS 혈청 아밀로이드 A, 위유전자(pseudogene) 24.6 13.9 24.3
SAA1 혈청 아밀로이드 A 1 11.9 9.7 12.3
SAA2 혈청 아밀로이드 A 2 10.0 8.9 10.3
PRTN3 프로티네이즈 3 15.2 14.3 17.1
SPP1 분비된 포스포단백질 1 10.2 7.8 10.7
LCN2 리포칼린 2 13.4 10.3 13.3
SAA3 혈청 아밀로이드 A 3 10.5 5.4 8.2
GR01 GR01 종양유전자 8.2 5.6 7.2
LY6D 림프구 항원 6 복합체, 로커스 D 6.0 5.5 4.9
GR01 GR01 종양유전자 7.0 5.6 7.2
RAD51L1 RAD51 과 같은 1 (S. 세레비시애) 4.4 3.7 3.8
GAS6 생장 저지 특질 6 4.1 3.5 4.8
SPI2-2 세린 프로티에이즈 저해제 2-2 3.7 2.8 3.8
GADD45G 생장 저지 및 DNA-손상 유도가능한 45 감마 3.9 2.7 3.4
CEBPD CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP), 델타 5.3 3.2 3.9
TNFRSF1A 종양 괴사 인자 수용체 대분류, 원 1a 3.6 2.6 3.0
CISH3 싸이토카인 유도가능한 SH2-함유 단백질 3 4.0 3.8
IL1R1 인터류킨 1 수용체, 제 I 형 5.2 2.6 5.6
SAP 혈청 아밀로이드 P-성분 3.1 2.5 3.3
PEX11A 퍼옥시말 생물 발생 인자 11a 4.2 3.2
2310031E04RIK EST 2.9 2.7 3.3
AA880891 EST 2.7 2.4 2.8
CD14 CD14 항원 3.4 2.3 2.6
MT1 메탈로티오네인 1 2.7 2.4 2.9
UNK_AW124835 EST 2.2 2.0
TM4SF7 막투과 4 수퍼패밀리 원 7 2.6 2.8 2.4
DNCLC1 디네인, 세포질, 경쇄 1 2.5 2.4 2.6
SAA4 혈청 아밀로이드 A 4 3.2 2.8
2410006H10RIK RIKEN cDNA 2410006H10 유전자 2.2 2.1 2.0
RBM3 RNA 결합 모티프 단백질 3 2.7 2.8 2.8
1300003D03RIK RIKEN cDNA 1300003D03 유전자 2.2 2.4
CEBPB CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP), 베타 2.0 2.3
MT2 메탈로티오네인 2 2.2 2.1 2.3
ORM2 오로소뮤코이드 2 1.7 1.7 2.0
VNN1 바닌 1 2.0 2.1
GTF2A2 일반 전사 인자 IIa, 2 (12kD 서브유닛) 2.2 2.4
ITIH4 상호 알파-트립신 저해제, 중쇄 4 1.8 1.9
ITIH3 상호 알파-트립신 저해제, 중쇄 3 1.8 1.7 1.9
NPN3 종양 진행 3 2.2 2.5
U62673 EST -2.4 -3.2
PAPSS2 3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 신테이즈 2 -2.0 -2.3
TEMT 티오에테르 S-메틸트랜스퍼레이즈 -2.2 -1.7
TTR 트랜스티레틴 -2.0 -1.8
CBG 코르티코스테로이드 결합 글로불린 -3.4 -2.8 -2.8
HSD11B1 히드록시스테로이드 11-베타 디히드로게네이즈 1 -2.1 -1.9
LIFR 백혈병 저해 인자 수용체 -2.5 -2.0 -1.7
LIFR 백혈병 저해 인자 수용체 -2.5 -2.0 -1.7
HPGD 히드록시프로스타글란딘 디히드로게네이즈 15 (NAD) -1.9 -2.5
CBG 코르티코스테로이드 결합 글로불린 -3.5 -2.8 -2.8
HAL 히스티딘 암모니아리아제 -2.2 -2.0 -2.1
CYP2F2 사이토크롬 P450, 2f2 -2.5 -2.3 -1.7
KEG1 신장 발현 유전자 1 -2.9 -2.2
AI266885 EST -4.7 -3.1 -2.4
오직 하나의 동물에 존재하는 것으로 언급됨
PAP 췌장염-관련 단백질 9.2
1300007C21RIK RIKEN cDNA 1300007C21 유전자 4.7
REG2 섬-유도된 마우스 상동 2 를 재생하는 래트 9.8
UNK_AE000664 EST 9.6
SERINE/THREONINE-단백질 Kl.. SERINE/THREONINE-단백질 Kl.. 2.1
1300007C21RIK RIKEN cDNA 1300007C21 유전자 3.8
CRAT 카르니틴 아세틸트랜스퍼레이즈 2.6
AS2 아릴술파테이즈 A 3.2
2310009M24RIK RIKEN cDNA 2310009M24 유전자 2.0
2310004B05RIK RIKEN cDNA 2310004B05 유전자 2.8
REG1 섬-유도된 마우스 상동체 1 을 재생하는 래트 2.3
AW048468 에스터레이즈 31 1.8
PAP 췌장염-관련 단백질 7.7
SULT-X1 술포트랜스퍼레이즈-관련 단백질 SULT-X1 -2.6
ES31 에스터레이즈 31 -1.8
AW538652 EST -1.9
GAMT 구아니디노아세테이트 메킬트랜스퍼레이즈 -2.0
SC5D 스테롤-C5-탈포화효소-1.9 (진균 ERG3, 델타-5-탈포화효소) 상동 (S. 세레비시애) -1.9
GHR 성장 호르몬 수용체 -3.0
AI839995 EST -1.8
0610025L15RIK RIKEN cDNA 0610025L15 유전자 -1.9
AGXT 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼레이즈 -2.5
PAH 페닐알라닌 히드록시레이즈 -2.0
IGFBP2 인슐린-형 성장 인자 결합 단백질 2 -2.5
AI647632 EST -2.1
AI647632 EST -2.1
G6PC 글루코스-6- 포스페이트, 촉매성 -2.2
CYP17 사이토크롬 P450, 17 -3.0
GSTA2 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈, 알파 2 (Yc2) -2.3
CYP26 사이토크롬 P450, 26, 레티노산 -9.0
THRSP 갑상선 포르몬 반응성 SPOT14 상동체 (Rattus) -2.7
FMO3 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 3 -2.6
실시예 9: 생체내 관절염 모델에서 항-IL-22 항체의 효과
콜라겐-유도 관절염 (CIA) 쥐과동물 모델에서 증상을 개선시키기 위한 P3/1 모노클로날 항체의 능력을 측정하였다. 수컷 DBA/1 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) 마우스를 모든 실험에 대해 사용하였다. DBA 마우스에 항체를 예방적 또는 치료적으로 투여하였다. 치료용 투약계획에서, 질병이 마우스 에서 연속 2 일 동안 관찰될 경우, 치료를 시작하였다.
관절염은 소 콜라겐 제 II 형 (Chondrex, Redmond, WA) 의 사용으로 유도되었다. 소 콜라겐 제 II 형 (Chondrex, Redmond, WA) 을 0.1 M 아세트산에 용해하고, 1 mg/ml Mycobacterium tubercu10sis (균주 H37RA) 를 함유하는 동일 부피의 CFA (Sigma) 중에 유화시켰다. 제 0 일에 100 ㎍ 의 소 콜라겐을 꼬리의 시작점에 피하 주입하였다. 제 21 일에, 마우스에, 꼬리의 시작점에 동일 부피의 프로인드 불완전 면역반응 항진제 (Incomplete Freund's adjuvant, Sigma) 와 혼합된, 0.1 M 아세트산 중에 200 ㎍ 의 소 콜라겐을 함유하는 용액을 피하 주입하였다. 원래의 동물은 콜라겐을 제외하고, 동일한 세트의 주입을 받았다. 투여 프로토콜은 하기 도 1 에 개략적으로 제시된다.
마우스는 질병 진행에 대해 1 주일에 3 회번 이상 관찰하였다. 개개의 팔다리를 하기 지수를 기준으로 임상 스코어를 지정했다: 0 = 정상; P = 손가락의 끝에 국지적 홍반에 의해 특징지어지는 전-관절염; 1 = 1-2 개의 부은 손가락을 동반하는 가시적 홍반; 2 = 발 붓기 및/또는 여러 개 손가락 붓기에 의해 특징지어지는 현저한 홍반; 3 = 발목 또는 손목 관절까지 확장된 광범위한 붓기; 4 = 팔다리 사용이 어려움 또는 관절 경직. 이에 따라, 임의의 제공된 마우스에 대한 모든 팔다리 점수의 합은 최고 16 의 총 바디 스코어를 산출했다.
질병의 다양한 단계에서, 동물을 안락사시키고, 조직을 수합하였고, 조직학을 위해 앞발을 10% 포르말린 또는 4% 파라포름알데히드 (pH 7.47) 로 고정하거나, 20% EDTA (pH 8.0) 로 칼슘을 제거하고, 제자리 (in situ) 하이브리다이즈를 위해 파라핀에 내입시켰다. 광현미경을 사용하여, 발을 5-등급 스코어링 (0-4) 으로 점수를 매겨, 관절염의 정도 및 정도를 특징화하였다. 염증 침윤을 판누스(pannus) 형성, 활액막의 섬유종, 관절 연골 미란 및/또는 연골하골 파괴와 같은 염증에 관련된 기타 변화에 더해 점수를 매기기 위해 사용하였다. 조직학적 스코어링은 개개의 발의 기록을 사용하여 하기와 같이 측정하였다: NAD=0 또는 비정상적인 것이 발견되지 않음; 1= 약간 내지 중간; 2: 약하게 내지 중간; 3: 확연함 및 4: 광범위함.
IL-22 항체의 치료학적 투여의 효과는 도 2 에 제시된다. 바디 스코어는 시간의 함수로 제시된다. 항-IL-22 항체를 투여한 마우스는 대조 인간 IgG 또는 PBS 를 투여한 마우스와 비교해 뚜렷하게 감소된 병후를 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
중성화 IL-22 항체의 예방 투여의 효과는 도 3 내지 5 에 제시된다. 바디 스코어는 항-IL-22 또는 대조군 항체의 투여 후, 시간의 함수로서 제시된다. 항-IL-22 항체를 투여한 마우스는 대조 래트 IgG 또는 PBS 를 투여한 마우스와 비교해 뚜렷하게 감소된 증상을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
바디 스코어를 또한 개별 예방용 투약계획에 적용된 마우스에서 측정하였다. 결과는 도 4 에 시간의 함수로 제시된다. 대조군 항체를 처리한 마우스는, 항-IL-22 를 처리한 마우스보다 뚜렷하게 더 높은 평균 총 바디 스코어를 나타내었다. 항-IL-22 항체를 투여한 마우스는 대조 래트 IgG1 또는 PBS 를 투여한 마우스와 비교해 뚜렷하게 감소된 증상을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
예방용 투약계획에 적용된 마우스의 발에서 질병의 진행을 도 5 에 제시한다. 제 36 일에 마우스를 희생시키고, 그들의 발에서 질병의 경중을 검사하였다. 발을 0 내지 4 의 조직학적 점수 (0 은 질병이 없음에 상응하고, 4 는 가장 심한 질병을 나타냄) 로 할당하였다. IL-22 항체를 주입한 래트에 대해, 60% 이상이 "0" 의 조직학적 점수를 가진 반면, 약 20% 의 마우스가 "1" 의 조직학적 점수를 가졌다. 약 15% 의 마우스가 "2" 의 조직학적 점수를 나타내었고, 약 10% 의 마우스가 "3" 의 조직학적 점수를 나타내었다. 적은 백분율의 마우스가 "4" 의 조직학적 점수를 나타내었다. 대조군 항체를 주입한 마우스에 대해, 약 30% 는 "0" 의 조직학적 점수를 나타내었고, 약 5% 의 마우스가 "1" 의 조직학적 점수를 나타내었다. 나머지 마우스는 더욱 심한 병리학적 점수를 나타내었다: 약 18 % 는 "2" 의 조직학적 점수를 나타낸 반면, 20% 는 "3" 의 병리학적 점수를 나타내었고, 나머지 마우스는 "4" 의 조직학적 점수를 나타내었다. 항-IL-22 항체를 투여한 마우스는 대조군 래트 IgG1 또는 PBS 를 투여한 마우스와 비교해 뚜렷하게 감소된 증상을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
상기 결과는, IL-22 항체의 예방적 또는 치료적 투여는 동물 시스템에서 관절염의 병후를 뚜렷하게 개선시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 10: IL-22 전사물의 제자리 하이브리다이즈
IL-22 및 IL-22 수용체 서열의 발현을 관절염 마우스의 발바닥 살의 다양한 세포 유형에서 측정하였다. 안티센스 IL-22 및 IL-22 쥐과동물 수용체 리보프로브(riboprobe) 를, 상응하는 전사물로부터 2 개의 독립적 PCR 생성물을 생성시켜 제조하였다. 올리고뉴클레오티드:
Figure 112005075809468-PCT00009
Figure 112005075809468-PCT00010
Figure 112005075809468-PCT00011
(서열 번호: 6) 및
Figure 112005075809468-PCT00012
(서열 번호: 5) 를 IL-22 수용체 센스 프로브를 생성하기 위해 사용하였고,
Figure 112005075809468-PCT00013
Figure 112005075809468-PCT00014
(서열 번호: 7) 및
Figure 112005075809468-PCT00015
Figure 112005075809468-PCT00016
Figure 112005075809468-PCT00017
(서열 번호: 8) 를 IL-22 수용체 안티센스 프로브를 생성하기 위해 사용하였다. 이후의 PCR 증폭 프로브를 T7 RNA 중합효소 및 시험관내 전사를 사용하여 생성하였다.
IL-22 서열에 대한 프로브를, 플라스미드중에 다음 서열을 위치시키고, 센스 또는 안티센스 전사물을 생성시키기 위해 T7 및 SP6 프로모터의 조절하에 서열을 위치시켜 제작하였다:
Figure 112005075809468-PCT00018
T7 RNA 중합효소 결합 부위를 올리고뉴클레오티드내에 혼입하여, 센스 리보프로브에 대한 PCR 생성물의 5'말단 또는 센스 리보프로브에 대한 PCR 생성물의 3'말단에 T7 결합 부위를 삽입하였다. 디곡시제닌(Digoxygenin) 표지된 프로브를, 제조사에 의해 기술된 바와 같이, DIG RNA 표지 혼합물 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 및 T7 RNA 중합효소 (Roche Diagnostics) 를 사용하여 제조하였다. CIA 쥐과동물 모델의 앞발에서 IL-22 수용체 mRNA-양성 세포는 대식 세포, 섬유아세포, 림프구의 생물형군, 활성화된 골아세포, 활액세포 및 상피세포였다. 대조군 앞발 또는 센스 프로브로 처리한 앞발에서 양성 염색은 없었다. mIL-22 mRNA 양성 세포는 호중성구, 대식세포, 섬유아세포 및 골아세포였다. 센스 프로브로 처리한 발 단면 및 mIL-22 mRNA 로 염색한 대조 마우스에서는 염색이 없었다. 제자리 하이브리다이즈는 관절염 마우스의 발에서 IL-22 수용체 및 싸이토카인 모두의 존재를 나타내었다.
실시예 11: 실시예 12-22 에 대한 실험 프로토콜
재조합 IL-22, IL-22R ECD , IL- IOR2 ECD 및 IL-22BP 융합 단백질
인간 IL-22 의 성숙 말단 (APISSHCRLD) 에 융합시킨 N 말단 His/Flag 택 (GSGHHHHHHGSGDYKDDDDK (Terpe, K. (2003) Applied Microbio10gy & Biotechno10gy 60 (5): 523-33) 을 코딩하는 포유류 발현 벡터를 메토트렉세이트에서 추가로 선별한 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포 내에 트랜스펙션하고, 재조합 싸이토카인을 이어서 모두를 표준 방법 (Terpe, K. (2003) 상기 문헌; Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 537-66; Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 487-511; Hochuli, E. (1988) Bio/Techno10gy 6: 1321-1325) 에 의한 배양액으로부터 정제하였다. ELISA 에서 사용하기 위해, 인간 IL-22 를, 제조사가 제시하는 바와 같이, EZ-Link™ Sulfo-NHS-바이오틴 키트 (Pierce, Rockford, IL) 를 사용하여 바이오틴화시켰다. 정제된 재조합 쥐과동물 IL-22 를 N 말단 HIS/FLAG 택 (GSGHHHHHHGDYKDDDDK) 및 쥐과동물 IL-22 의 성숙 N 말단 (LPVNTRCKL) 간에 융합을 코딩하는 발현 벡터를 사용하는 비교 방법에 의해 제조하였다. 싸이토카인을 아미노산 조성으로 유도되는 이론적 흥분 계수를 사용하여 A280 흡광도에 의해 정량화 하였다. 인간 및 쥐과동물 IL-22 를 환원제의 존재 또는 부재하에서 SDS-PAGE 겔 상에서 ∼30-40 kD 에 분리하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이는 광범위하게 글리코실레이션되었다; N-글리카네이즈를 처리할 경우, IL-22 는 ∼19 kD, 근처 또는, 그의 이론적 분자량으로 이동하였다 (데이터는 나타내지 않음).
소수성 플롯에 의해 정의되는 바와 같이, IL-22R 및 IL-1OR2 의 세포외 도메인, 및 IL22-BP 를 가변 결합 링커를 경유해 인간 IgG1 의 Fc 도메인에 대해 프레임에 맞게 융합시켰다. 인간 IL-22RECD (TLPDRTWT 는 C 말단 서열임 (Xie M.H. 등. (2000) J Biol Chem 275 (40): 31335-9; Kotenko S.V. 등. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725-32)), 인간 IL-10R2ECD (THDETVPS 는 C 말단 서열임 (Lutfalla, G. 등. (1993) Genomics 16 (2): 366-73)) 또는 링커 (AGSGSGSG) 에 융합된 인간 IL-22BP (EERCVEIP 는 C 말단 서열임 (Dumoutier, L. 등. (2001) J Immnunol 166 (12): 7090-5; Kotenko, S.V. 등. (2001) J Immnunol 166 (12): 7096-103; Xu, W. 등. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511- 6) 을 코딩한 후 인간 IgG1 Fc (상기 도메인의 N 말단 서열은 EPKSCDKT 로 시작함) 를 코딩하는 포유류 발현 벡터를 제작하였다. 각각의 상기 Fc 융합 동종이합체를 함유하는 배양액을 표준 방법론 (Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 537-66; Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 487-511) 에 의해 적합한 CHO 세포주로부터 제조하였다. IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 모두를 발현하는 배양액을, 안정한 IL-22R-Fc 발현 CHO 세포주내에 IL-10R2-Fc 융합체 발현 벡터의 일시적 트랜스펙션 또는 상기 융합 수용체의 공동-증폭에 의해 제조하였다. 배양액 (CM) 을 모든 Fc 융합 수용체의 공급원으로서 사용하였다.
CM 중의 총 Fc 융합체를, A280 에서의 그의 흡광도에 의해 정량되는, 코팅 항체로서 1 ㎍/㎖ 염소 항-인간 IgG (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL), 검출 항체로서 1/10,000 으로 희석된 염소 항-인간 IgG HRP (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) 및 표준물질로서 이들과 무관한 정제된 Fc 융합 단백질을 사용한, 항-인간 IgG 샌드위치 ELISA 로 정량하였다. 표준 ELISA 에 대한 상세한 프로토콜은 하기에 나타나 있다.
Fc 융합체 동종이합체 및 이종이합체의 무결성 (integrity) 및 조성을, 표준 SDS 아크릴아미드 겔 전기영동법 및 검출 시약으로서 염소 항-인간 IgG-HRP (Southern Biotech Associates, Inc., Birminghan, AL) 의 1: 5000 희석액, 1 ㎍/㎖ 토끼 항-IL-22R (ProSci, Poway, CA) 또는 0.2 ㎍/㎖ 염소 항-hIL-1OR2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 을 사용하여, β-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재 하에 평가하였다 (도 7A). IL-22R 및 IL-1OR2 항체는 각 동종이합체 각각의 사슬 및 이종이합체의 사슬을 검출할 것임에 유의한다.
IL-22R-Fc/IL-1OR2-Fc 이종이합체의 특이적 검출을 위해, 코팅 항체로서 0.5 ㎍/㎖ 토끼 항-hIL-22R (ProSci, Poway, CA) 및 검출자로서 0.5 ㎍/㎖ 바이오틴화 염소 항-hIL-10R2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 를 사용하여 샌드위치 ELISA 를 확립했다.
IL-22 항체
우선 쥐과동물 및 다음 인간 싸이토카인으로 LOU 래트 (Harlan, Harlan, MA) 를 면역시킴으로써, IL-22 에 대한 모노클로날 항체를 제조했다. 래트의 비장을 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) 와 융합시키고, 표준 기술 (Goding J. Production of Monoclonal Antibodies. In : Monoclonal Antibodies : Principles and Practices. 3rd ed. San Diego: Academic Press; 1996. p. 141-180) 을 사용하여 하이브리도마 세포주를 제조했다. 검출자로서 1 ㎍/㎖ hIL-22 코팅된 플레이트 및 1/5000 으로 희석된 HRP 콘쥬게이션 염소 항-래트 IgG (Pierce, Rockford, IL) 를 사용하여, 항-hIL-22 분비 라인을 처음으로 ELISA 로써 규명하였다. Ab-02 및 Ab-04 를 IL-22 항체 P3/3 및 P3/2 로서 각 각 이전에 기술하였다 (상기 실시예 5 참조). 항체를 표준 방법에 의해 복수 (ascite) 로부터 정제하였다. 몰농도로의 전환을 위해, 150 ng/㎖ 을 1 nM 항체로서 정의한다.
IL-22 싸이토카인 /수용체 Fc 결합 ELISA
IL-22 및 수용체 Fc 융합체 사이의 상호작용을 연구하기 위해 2 개의 표준 포맷을 사용하였다. 우선 CHO CM 유래의 수용체 Fc 를 항-hIgG 코트 (coat) 를 통해 고정시킨 ELISA 검정으로부터 도 6A, 8A-8B, 9A-9B, 1OB-10C 및 11A-11C 에 나타난 결과를 수득하였다. 평평한 바닥의, 96-웰 ELISA 플레이트 (Costar, Cambridge, MA) 를 0.1 M 탄산나트륨 완충액 (pH 9.6) 중에 1 ㎍/㎖ 로 있는 100 ㎕ 염소 항-인간 IgG 항체 (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) 로 4℃ 에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 0.05% Tween 20 (PBS-T) 을 함유하는 200 ㎕ 포스페이트-완충 식염수로 플레이트를 2 회 세척하고, PBS-T 중의 1% BSA (Sigma, St. Louis, MO) 100 ㎕ 로 1 시간 동안 블로킹시키고, 3 회 세척하였다. 한 시간의 후속한 인큐베이션에 이어서 (100 ㎕), 각각을 3 회 세척한 다음, 하기를 적용하였다 : 고정된 농도 또는 단계적으로 희석된 농도에 있는 주어진 수용체 융합체(들), 고정된 농도 또는 단계적으로 희석된 농도에 있는 바이오틴화 IL-22 (바이오-IL-22) 에 이어서, 스트렙타비딘-고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) 의 1/10,000 희석액. 세척의 마지막 세트가 끝난 후, TMB Microwell 퍼옥시다제 기질 (BioFX, Owings Mills, MD) 100 ㎕ 를 20 분 동안 첨가하고, 반응을 100 ㎕ 2N H2SO4 로 정지시켰다. 퍼옥시다제 생성물의 색상 검출을 Molecular Devices (Sunnyvale, CA) 마이크로플레이트 검독기에서 450 nm 에서 실행하였다.
수용체 Fc 및 바이오-IL-22 둘 다가 고정된 농도에 있는 상기 포맷의 특정 ELISA 검정을 위해, 바이오-IL-22 전에 또는 그것과 함께 (도 9A) 또는 바이오-IL-22 후에 (도 9B) IL-1OR2-Fc 를 다양한 농도로 첨가하였다. 지시된 수용체 Fc 및 바이오-IL-22 가 또한 고정된 농도로 있는 상기 포맷의 다른 ELISA 검정을 위해, 바이오-IL-22 로 30 분 동안 예비-인큐베이션한 후, 항체 (도 1OB-1OC, 11C) 또는 IL-22BP (도 11A-11B) 를 다양한 농도로 첨가하였다. IL-1OR2-Fc 의 IL-22/IL-22R 복합체로의 점증 (recruitment) 이 직접 검출되는 ELISA 검점을 위해 (데이터는 나타내지 않음, 도 9A 의 실험 디자인), 비-바이오틴화 IL-22 를 ELISA 에 첨가하고, 폴리클로날 염소 항-hIL-10R2 또는 마우스 모노클로날 항-hIL-1OR2 (R&D Systems, Inc, Minneapolis, MN) 중 하나를 검출자로서 사용하였다.
도 6B 는, 1 ㎍/㎖ 바이오틴화 IL-22 100 ㎕ 를 Reacti-Bind 96 웰 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 (Pierce, Rockford, IL) 에 1 시간 동안 첨가한, 반대 포맷으로 실행된 ELISA 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 세척 후, Fc 융합체 수용체를 1 시간 동안 플레이트에 다양한 농도로 첨가하고, 세척한 다음, 염소 항-인간 IgG-HRP 로 검출하였다. 도 6A 에서, IL-22R-Fc (■) 또는 IL-1OR2-Fc (○) 중 하나를 발현하는 CHO 세포로부터 조건화된 배지 (CM) 중에 있는 총 Fc 의 50 ng/㎖ 을 항-인간 IgG 코팅된 웰로 집어넣었다. 다음, 다양한 농도로 있는 바이오틴화 IL-22 (바이오-IL-22) 를 웰에 포획했다. 이어서, 결합된 바이오-IL-22 를 스트렙타비딘-HRP 를 사용하여 검출하였다. 도 6B 에서, 바이오-IL-22 (1 ㎍/㎖) 를 스트렙타비딘 플레이트로 집어넣었다. 다음, 희석된 CHO.CM 중에 있는 다양한 농도의 IL-22R-Fc (■) 또는 IL-1OR2-Fc (○) 중의 어느 하나를 웰에 첨가하였다. 결합된 수용체 Fc 를 염소 항-인간 IgG-HRP 를 사용하여 이어서 검출하였다.
항-IL-22 항체를 사용한 STAT3 인산화의 억제
4 x 105 세포/웰로 분주된 6 웰 조직 인큐베이션 플레이트 (Corning, Coming, NY) 를 사용하여, HepG2 세포 (ATCC, Rockville, MD) 를 10% 태아 소 혈청이 보충된 Dulbecco's modified essential medium (DMEM) 에서 인큐베이션하였다. 24 시간 후, 50 ng/㎖ 인간 IL-22 가 존재 또는 부재하는 신선한 배지를 25 분 동안 첨가하였다. 무력화 효능 (neutralization potency) 에 대한 항체 테스트의 경우, 싸이토카인 및 항체를 실온에서 30 분 동안 예비-인큐베이션하였다. 200 ㎕/웰로 세포 파쇄 완충액 (New England Biolabs, Beverly, MA) 을 첨가함으로써 세포를 파쇄하였다. 세포 분해물 중의 총 단백질 농도를 BCA 검정 (Pierce, Rockford, IL) 으로 측정하였다. 단백질 10 ㎍ 을 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 분리하고, 이어서 실온에서 하룻밤 동안 니트로셀룰로오스 막 (Amersham, Braunschweig, Germany) 내로 블럿팅하였다. 인 산화된 STAT3 를 p-stat3 Tyr705 항체 키트 (New England Biolabs, Beverly, MA) 를 사용하여 검출하였다. 제조업자 (Pierce, Rockford, IL) 에 의해 권고된 바와 같이 화학발광의 발현을 위해 ECL 검출 시스템을 사용하였다 .
실시예 12 : IL-22 는 IL-22R 에 결합하고, IL-10 R2 에 대해서는 검출가능한 친화성을 갖고 있지 않음.
IL-22R 및 IL-1OR2 의 세포외 도메인 (ECD) 으로의 IL-22 의 결합을 2 개의 ELISA 포맷을 사용해 평가하였다. 처음의 버전에서, 수용체-Fc 융합 단백질을 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상의 Fc 도메인을 통해 고정시켰다. 다음, 바이오틴화 IL-22 를 첨가하고, 스트렙타비딘-HRP 로 검출하였다. 도 6A 는, 바이오-IL-22 가 고정된 IL-22R-Fc 에 결합하고, IL-1OR2-Fc 에는 검출할 수 있는 정도로는 결합하지 않음을 나타내는 선형의 그래프이다. 반대의 포맷에서, 바이오-IL-22 를 우선 스트렙타비딘 코팅된-플레이트 상에 고정시켰다. 다음, 수용체-Fc 를 첨가하고, HRP-공액된, 항-hIgG 로 검출하였다. 도 6B 에서 나타낸 바와 같이, IL-1OR2-Fc 가 아니라, 가용성 IL-22R-Fc 가 고정된 바이오-IL-22 에 결합하였다. IL-1OR2-Fc 가 더 높은 농도 (3-10 ㎍/㎖; 데이터는 나타내지 않음) 로 상기 검정 포맷에 첨가된 경우, 약간의 신호의 상부 백그라운드 (비-특이적 Fc 융합체) 를 관찰하였고, 이는 IL-1OR2-Fc 가 고정된 바이오-IL-22 에 대해 매우 낮은 친화성을 가짐을 제안하였다. 요약하자면, ELISA 실험의 상기 처음의 세트는, IL-22 및 IL-22R 사이에 상대적으로 강한 상호작용이 있는 반면, IL-1OR2-Fc 는 IL-22 에 대해 단지 약간의 친화성만 가지고 있음을 지시한다.
실시예 13 : IL-22R- Fc 및 IL-10 R2 - Fc 동종이합체 및 이종이합체의 제조 및 특성화
IL-10R2 의 세포외 도메인이 IL-22R-Fc 와 병치 (juxtapose) 될 때 IL-22 에 결합하는지 평가하기 위해 하기 실험을 수행하였다. IL-10R2-Fc 는 어느 정도 잘 (∼10 ㎍/㎖) 분비되는 반면, IL-22R-Fc 는 증폭된 CHO 주로부터 불량하게 (∼50-100 ng/㎖) 분리되는 것을 관찰하였기 때문에, IL-1OR2-Fc 는 IL-22R-Fc 의 분비를 용이하게 할 수 있을 것이라고 믿어진다. IL-22R-Fc 를 발현하는 CHO 주를 IL-1OR2-Fc 발현 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 상기 플라스미드의 도입은 IL-22R-Fc 의 발현을 2-4 배 증가시켰다. 이어서, 안정한 주를 Fc 융합체 수용체 사슬 둘 다를 공동-발현하도록 확립하였다.
단량체성 IL-22RECD-Fc 및 IL-1OR2ECD-Fc 융합체가 각각 분자량 ∼60 kD 및 ∼85 kD 을 갖도록 결정하였다. 수용체 Fc 융합체의 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 CHO 세포로부터 감소된 및 비-감소된 조건화된 배지 (CM) 를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 다음, 인간 IgG Fc, IL-22R 또는 IL-10R2 중 어느 하나에 대한 폴리클로날 항체로 프로브시킨 막에 블럿팅하였다. 더욱 구체적으로, 도 7A 에서, IL-22R-Fc, IL-1OR2-Fc 또는 2 개의 수용체 Fc 중 어느 하나를 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지를 환원 (+βME) 및 비-환원 (-βME) 조건 모두에서 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 멤브레인 블럿에 옮겼다. 항-인간 IgG1, 항-hIL-22R 또는 항-hIL-1OR2 항체 중 어느 하나를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 블럿의 항-hIgG 검출을 위해, CM 중의 총 Fc 융합체 4 ng 을 각각의 레 인에 로딩하였다. 항-IL-22R 및 항-IL-1OR2 항체 검출을 위해, 공동-발현 CHO 로부터 CM 중의 총 Fc 융합체 16 ng 을 사용하였다. 도 7B 에서, IL-22R-Fc (■), IL-10R2-Fc (O) 또는 둘 다 (▲) 를 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화된 배지를 토끼 항-인간 IL-22R 항체로 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 2 개의 동종이합체의 1 : 1 혼합물을 대조군 (△) 으로서 또한 첨가하였다. 결합된 수용체를 바이오틴화 염소 항-인간 IL-10R2 항체에 이어 스트렙타비딘-HRP 를 사용하여 검출하였다.
환원 조건 (+ βME, 도 7A) 하에서, IL-22R 및 IL10R2-Fc CHO 주는 상이한 분자량을 갖는 인간 Fc 융합 단백질을 분비한다. 수용체 사슬-특이적 항체로의 검출은, ∼60 kD 종은 IL-22R-Fc 이고, 반면 ∼85 kD 종은 IL-1OR2-Fc 임을 확인시킨다. 상기 성숙한 수용체 융합 단백질 둘 다 이론학적 분자량 ∼51 kD 을 갖고 있다. 4 개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 위치가 있는 IL-22R-Fc 는, CHO 세포의 계대 동안 5 개의 잠재적인 N-연결된 위치가 있는 IL-10R2-Fc 보다 덜 확장적으로 글리코실화되는 것으로 예측된다. IL-1OR2-Fc 는 더욱 확장적인 후-번역 변형을 갖고 있는 것으로 보인다. 상기 분석은 또한 환원 조건 하에서, 공동-발현하는 CHO 세포가 Fc 융합체 두가지 모두를 분비하는 것을 보여준다. 항-hIgG 검출 패널 유래의 데이타는, IL-10R2-Fc 가 IL-22R-Fc 보다 더 높은 레벨로 발현한다는 것을 제안한다.
수용체 Fc 융합체 둘 다를 발현하는 CHO 세포는 IL-22R/IL-1OR2-Fc 이종이합체 및 IL-10R2-Fc 동종이합체를 지배적으로 분비한다. 상기 수용체 Fc 융합체 가 상이한 분자량을 갖고 있기 때문에, 비-환원성 SDS-PAGE (-βME, 도 7A) 에 의한 CM 의 분석은, 겔 상에서 2 개의 동종이합체 사이에 겔 상에서 분리하는 수용체 Fc 융합체 이종이합체의 검출을 가능하게 한다. 상기 조건 하에, 공동-발현하는 CHO 세포 유래의 CM 중에서 항-hIgG 와 함께 IL-22R/IL-1OR2-Fc 이종이합체 및 IL-1OR2-Fc 동종이합체 둘 다를 검출하였다. 반대로, IL-22R-Fc 동종이합체는 불량하게 검출된다. 비-환원성 조건 하에서, IL-22R 항체 검출 패널은, 공동-발현하는 CHO 가 IL-22R-Fc 동종이합체를 분비하나, 이종이합체보다는 실질적으로 덜 분비한다는 것을 증명한다. 종합해서, 도 7A 에 나타난 결과는, IL-22R/IL-1OR2-Fc 트랜스펙션된 CHO 가 공유결합 IL-22R/IL-1OR2-Fc 이종이합체 및 IL-10R2-Fc 동종이합체 및 매우 적은 IL-22R-Fc 동종이합체를 분비한다는 것을 나타낸다.
CHO 세포로부터의 CM 중에 이종이합체가 존재한다는 것을 이종이합체의 각각의 사슬에 특이적인 항체를 사용하여, 샌드위치 ELISA 에 의해 입증하였다. 조건화된 배지를 IL-22R 폴리클로날 항체로 코팅된 웰에 첨가한 다음, 결합된 단백질을 바이오틴화 IL-1OR2 폴리클로날 항체로 검출하였다. 상기 ELISA 포맷은 IL-22R 및 IL-1OR2 에피토프 사이에 안정한 회합이 있는 분자만을 검출할 것이다. IL-22R-Fc 또는 IL-1OR2-Fc 중 어느 하나만을 발현하는 CHO 로부터의 CM 또는 이들이 함께 혼합된 상기 CM 은 본 ELISA 포맷에서 검출가능한 신호를 나타내지 못했다. 신호는 IL-22R-Fc 및 IL-1OR2-Fc 를 공동-발현하는 CHO 세포로부터만 수득되었다. 상기 관찰은, 도 7A 의 데이타에 따라, Fc 융합체 수용체 둘 다를 발 현하는 CHO 세포는 IL-22RECD 및 IL-1OR2ECD Fc 단량체성 사슬 사이에 공유결합성 회합을 포함하는 이종이합체를 분비한다는 것을 증명한다.
요약하자면, 도 7A-7B 에 나타낸 결과는, 수용체 Fc 융합체가 동종이합체 및 이종이합체로서 CHO 세포로부터 분비된다는 것을 나타낸다. IL-22R/IL-1OR2-Fc 공동-발현 CHO 세포는 대부분 이종이합체 및 IL-10R2-Fc 동종이합체를 분비한다.
실시예 14 : IL-22 는 병치된 IL-22R/IL-1 OR2 수용체 Fc 사슬에 대한 증가된 결합을 나타냄.
다음, Fc 이종이합체로서 분비된 IL-22R 및 IL-10R2 의 ECD 에 대한 IL-22 의 결합을 평가하였다. 고정된 농도의, CM 으로부터의 총 Fc 융합 단백질을 우선 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에서 Fc 도메인을 통해 고정시켰다. 다음, 싸이토카인의 결합력을 검출자로서 다양한 농도의 바이오-IL-22 를 사용하여 평가하였다 (도 8A). 도 6A 에서와 같이, 각각 IL-22R-Fc 동종이합체는 신호를 나타내고, IL-1OR2-Fc 동종이합체는 검출할 만한 신호를 나타내지 않았다. 그러나, 가장 효과적인 바이오-IL-22 결합은 공동-발현하는 CHO 세포의 CM 으로부터 고정된 수용체 Fc 로 수득되었고 : 고정된 IL-22R-Fc 동종이합체에 필적할만한 신호에 대해서는 8 배 미만의 바이오-IL-22 가 필요하였다. IL-1OR2 Fc 동종이합체 성분의 IL-22 에 대한 결합은 상기 조건 하에서는 검출가능하지 않기 때문에 (도 6A, 8A), 공동-발현하는 CHO 의 CM 으로부터의 Fc 단백질에 의한 IL-22 의 증대된 결합은 IL-22R/IL-10R2-Fc 이종이합체 성분에 의한 것임이 틀림없다. 또, 매우 적은 IL-22R-Fc 동종이합체가 상기 공동-발현하는 CHO 세포에 의해 분비된다 (도 7A-7B). IL-22 에 결합하는 이종이합체의 더 강한 잠재성은, IL-22R-Fc 동종이합체에 비해 덜 고정된 이종이합체가 도 8A 의 실험 디자인에 사용된 사실에 의해 강조된다. 고정된 양의 총 Fc 가 웰에 첨가되기 때문에, 이종이합체를 함유하는 CM 은, IL-22R-Fc 동종이합체 CM 과는 달리 다른 Fc 성분에 의해 희석된다. IL-22R/IL-10R2-Fc 이종이합체는 최상의 결합 신호를 나타내며, 이는 IL-1OR2 의 ECD 에 대한 IL-22 결합 역할을 지시하는 것으로 결론지어졌다. IL-1OR2 동종이합체만 IL-22 에 결합할 수 없기 때문에, 상기 결과는 또한IL-22 를 결합하는 데 있어서 IL-1OR2 의 효과는 IL-22R 의 존재를 필요로 한다는 것을 지시한다.
무작위하게 나란히 놓여진 IL-22R 및 IL-10R2 ECD 는 또한 IL-22R-Fc 동종이합체보다 더욱 효율적으로 IL-22 에 결합할 수 있다. 도 3B 의 실험을 위해, 동량의 IL-22R-Fc 동종이합체 및 IL-1OR2-Fc 동종이합체 또는 무관한 Fc 동종이합체 중의 어느 하나를 함유하는 CM 의 1 : 1 혼합물을 제조하였다. 이종이합체를 함유하는 CM 뿐만 아니라, Fc 융합체의 혼합물을 단계 희석시킨 다음, 주어진 총 Fc 농도에서 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에 고정시켰다. 이어서, 검출자로서 고정된 농도의 바이오-IL-22 를 사용하여 싸이토카인의 결합력을 평가하였다. 도 8B 의 결과는 IL-22R-Fc 및 IL-1OR2-Fc 동종이합체의 혼합물이 IL-22R-Fc 및 관계없는 Fc 동종이합체의 혼합물보다 2-3 배 더 큰 효율을 가지고 바이오-IL-22 에 결합하는 것을 지시한다. 상기 관찰은, IL-22R 및 IL-1OR2 수용체 사슬이 상기 ELISA-기재된 포맷에서 그의 기능을 촉진하기 위해 IL-1OR2-Fc 에 공유 결합될 필요가 없다는 것을 지시한다. 적절한 물리적 병치가 2 개의 동종이합체를 함께 무작위 코팅하는 동안에 일어난다면, 바이오틴화 IL-22 의 증대된 결합이 IL-22R-Fc 및 무관한 Fc 동종이합체의 혼합물과 비교해 검출된다. 상기 증대된 신호는 더 높은 농도의 총 Fc 에서 더욱 분명해지며, IL-22R 및 IL-1OR2 ECD 는 서로 인접해서 나란히 놓일 경향이 더욱 있다. 반대로, 이종이합체의 수용체 Fc 사이의 공유 회합은 상기 수용체의 ECD 가 농도-독립적 병치를 하게 하고, 따라서 총 Fc 의 임의의 농도에서 가장 강한 신호를 나타낸다. 요약하자면, 도 8A-8B 에 나타낸 결과는 IL-22R 의 ECD 가 IL-22 결합에서 IL-1OR2 의 역할을 검출하는데 필요하다는 것을 나타낸다. IL-22 의 증대된 결합은 ECD 둘 다가 존재할 때 검출된다.
실시예 15 : IL-1 OR2 의 세포외 도메인 ( ECD ) 은 IL-22 및 IL-22R 의 세포외 도메인 사이의 초기 상호작용의 안정화에 영향을 줌.
IL-1OR2 의 IL-22 결합 기능은 IL-22R 의 존재를 필요로 한다 (도 8A-8B). IL-22 싸이토카인 수용체 복합체의 발달에서 추가의 IL-1OR2 의 일시적인 역할을 평가하기 위해, ELISA 포맷을 IL-22R-Fc 동종이합체 후에 IL-1OR2-Fc 동종이합체를 첨가함으로써 변형시켰다. IL-10R2-Fc 동종이합체를 첨가하는 효과는 이제 바이오-IL-22 의 첨가 전, 함께 또는 후에 평가될 수 있다. 더욱 구체적으로, 도 9A 에서, CM 으로부터의 IL-22R-Fc 50 ng/㎖ 을 항-인간 IgG 코팅된 웰에 넣었다. 다음, 웰을 100 ㎍/㎖ 인간 IgG 로 블로킹했다다. 다음, 바이오-IL-22 (30 ng/㎖) 를 웰에 첨가하였다. 이어서, 결합된 바이오-IL-22 를 스트렙타비딘-HRP 를 사용하여 검출하였다 (파선). 다양한 농도의 IL-1OR2-Fc 및 바이오틴화 IL-22 (30 ng/㎖) 를 또한 함께 첨가한 다음, 결합된 바이오-IL-22 를 검출하였다 (◆). 다양한 농도의, CM 으로부터의 IL-1OR2-Fc 를 또한 처음에 첨가하고, 인큐베이션하고, 플레이트를 세척한 다음, 이어서 30 ng/㎖ 바이오-IL-22 를 웰에 첨가하고, 결합된 바이오-IL-22 를 검출하였다 (◇). IL-1OR2-Fc 를 100 ㎍/㎖ hIgG 내에서 일련으로 희석시켰다. 도 9B 에서, CM 으로부터의 IL-22R-Fc 50 ng/㎖ 을 항-인간 IgG 코팅된 웰에 넣었다. 다음, 바이오-IL-22 (30ng/㎖) 를 웰에 첨가하였다. 다음, 결합된 바이오-IL-22 를 스트렙타비딘-HRP 를 사용하여 즉시 검출하였다 (실선). 결합된 바이오-IL-22 를 또한 PBS-1% BSA (파선) 또는 다양한 농도의 IL-1OR2-Fc (●) 중의 어느 하나와 함께 추가로 1 시간 동안 인큐베이션한 후 검출하였다.
도 9A 의 실험을 위해, 고정된 양의 IL-22R-Fc 융합체 동종이합체를 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에서 그의 Fc 를 통해 고정시켰다. 다음, 인간 IgG (100 ㎍/㎖) 를 첨가하여, 플레이트 상에서 여전히 이용가능한 항-인간 IgG 항체를 점령 또는 차단시켰다. 고정된 농도의 바이오-IL-22 는 IL-22 의 ECD 와 그의 상호작용을 통해 플레이트에 결합된 신호 (∼1.25) 를 나타내었다. 만약 hIgG 에서 단계 희석된 IL-1OR2-Fc 동종이합체를 바이오-IL-22 의 첨가 전에 첨가한다면, 플레이트에 이어서 결합된 바이오-IL-22 의 양에 영향을 주지 않는다. 상기 관찰은, IL-22R-Fc 및 IL-10R2-Fc 동종이합체의 ECD 가, IL-22 결합의 증대에 의해 이어서 검출되는 서로간의 안정한 회합에 단독으로는 영향을 줄 수 없음을 제 안한다. 더욱이, IL-10R2 는 그의 싸이토카인 결합 증대에 영향을 주기 위해, IL-22R 뿐만 아니라, IL-22 의 존재를 필요로 한다. 도 9A 의 실험에서, IL-10R2-Fc 가 바이오-IL-22 와 함께 첨가된다면, IL-22R 에 결합된 바이오-IL-22 의 양에서 IL-1OR2 투여량-의존적 증가가 있다. 또, IL-1OR2-Fc 의 첨가는, 바이오-IL-22 의 첨가 전에 고정된 IL-22R-Fc 와 함께 인큐베이션된다면, 증대에 영향을 줄 수 없다.
싸이토카인 결합에 있어 IL-10R2 의 효과에 대한 선행 필요 조건인 IL-22 (도 9A) 및 IL-22R (도 8) 둘 다를 고려해서, 상기 필요 조건이 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 충족시키는지직접 결정하였다. 도 9B 의 실험을 위해, 고정된 양의 IL-22R-Fc 융합체 동종이합체를 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에서 그의 Fc 를 통해 고정시켰다. 고정된 농도의 바이오-IL-22 의 첨가는 IL-22R 의 ECD 와 그의 상호작용을 통해 플레이트에 결합된 신호 (∼2.5) 를 나타내었다. 바이오-IL-22 신호를 즉시 검출하는 대신, 후속한 세척 및 추가의 인큐베이션 후에도 검출되었다. 처음 바이오-IL-22 및 그 후 1 % BSA 가 웰에서 인큐베이션되는 경우, 원래 신호의 0.6 (즉, 1.5/2.5) 이 검출되었고, 이는 바이오-IL-22 의 일부가 1% BSA 와 추가로 인큐베이션되는 동안에 고정된 IL-22R-Fc 동종이합체로부터 방출되었음을 지시하였다. 반대로, 처음에 바이오-IL-22 및 그 후 증가하는 농도의 IL-1OR2-Fc 동종이합체가 웰에 첨가되는 경우, 더 많은 바이오-IL-22 신호가 검출되고, 이는 바이오-IL-22 인큐베이션 후에 즉시 수득된 신호 레벨에 근접하는 것이다. 상기 결과는, IL-22 결합에 있어서 IL-1OR2 의 작용은 IL-22 및 IL-22R 사 이의 상호작용을 필요로 함을 나타낸다. IL-22 인큐베이션 후, IL-1OR2 를 웰에 첨가하면, IL-22R 단독인 경우보다 IL-22 에 대해 더 낮은 오프-레이트 (off-rate) 를 가진 복합체의 형성을 유도한다.
종합해서, 도 6, 8 및 9 에 나타난 결과는 IL-22R 및 IL-1OR2 수용체 사슬의 ECD 에 의한 IL-22 의 결합에 대한 일시적인 모델을 제안한다. IL-22 가 먼저IL-22R 에 결합한다. 다음, IL-1OR2 가 IL-22/IL-22R 에 결합하고, 싸이토카인 수용체 복합체 내에서 IL-22 를 추가로 안정화시킨다 (도 12 의 도식도에 요약).
실시예 16 : IL- 22 의 2 개의 상이한 표면은 IL-22R 및 IL-1 OR2 ECD 와의 각각의 상호작용에 필요함.
2 개의 래트 모노클로날 항체, Ab-02 및 Ab-04 가 발생되고, 인간 IL-22 에 결합하는 것으로 나타났다 (실시예 5). 상기 항체는 IL-22-의존적 신호 전달을 차단하는 그것의 능력에 대해 시험되었다. IL-22 는 IL-22R 및 IL-1OR2 수용체 사슬 둘 다를 발현하는 세포주 (예를 들어 HEPG2) 에서 STAT3 전사 요소의 인산화에 영향을 미친다 (Dumoutier L. 등. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (18): 10144-9). 상기 항체가 IL-22 를 무력화시킨다면, 더 적은 P-STAT3 가 세포의 분해물 내에서 검출되어야 할 것이다. 도 10A 의 실험을 위해, 일련으로 희석된 항체를 세포 배지 내에서 고정된 농도의 IL-22 와 함께 예비-인큐베이션시켰다. 다음, 항체와 복합체를 이룬 IL-22 를 포함하는 상기 배지를 HEPG2 세포에 적용시켰다. 이어서 세포 분해물을 제조하고, 단백질을 겔 전기영동에 의해 분리하고, 막에 옮기고, P-STAT3 에 특이적인 항체와 함께 인큐베이션하였다. 더욱 구체적으로, 인간 IL-22 (50 ng/㎖) 를 세포 배지 내에서 다양한 농도의 Ab-02 또는 Ab-04 와 함께 37℃ 에서 30 분 동안 예비-인큐베이션한 다음, 상기 배지를 HepG2 세포에 첨가하고, 상기 세포를 25 분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 세포 분해물을 항-포스포-STAT3 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. IL-22 단독과 함께 (+) 또는 IL-22 없이 (-) 인큐베이션된 세포를 각각 포지티브 및 네거티브 대조군으로 포함시켰다. 상기 항체 둘 다 세포 상에서 IL-22 의 활성을 막을 수 있으며 : 항체의 농도를 증가시킴에 따라, P-STAT3 의 검출은 감소한다. 그러나, 상기 항체는 그의 잠재성이 상이한데 : Ab-02 및 Ab-04 의 ND50 은 각각 ∼33 nM 및 ∼0.4 nM 이다. 요약하자면, 도 10A 에 나타난 결과는, 항체 둘 다 세포 내로 신호를 전달하는 상기 싸이토카인의 능력에 중요한 IL-22 상의 표면 (들) 에 결합함을 지시한다.
각각의 항체가 수용체 사슬과 그의 상호작용을 억제함으로써 IL-22 를 중화시킨다면, Ab-02 및 Ab-04 는 싸이토카인 수용체 상호작용에 필요한 IL-22 에피토프 (들) 를 정의한다. 항체가 어떻게 IL-22 결합에 영향을 미치는지 결정하기 위해 싸이토카인-수용체 결합 ELISA 에서 상기 항체를 평가하였다. 도 10B 의 실험을 위해, 고정된 양의 IL-22R-Fc 동종이합체를 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에서 그의 Fc 를 통해 고정시켰다. 고정된 농도의 바이오-IL-22 는 IL-22R 의 ECD 와 그것의 상호작용을 통해 플레이트에 결합되는 신호 (∼2.25) 를 나타낸다. 상기 2 가지 항체와 IL-22 의 예비-인큐베이션은, 후속적으로 IL-22R 에 결합하는 IL-22 의 능력에 정량적으로 상이한 영향을 갖는다. Ab-04 는 IL-22R 에 대한 IL-22 결합 (ND50=0.7 nM) 을 차단하는 반면, Ab-02 는 IL-22R 에 대한 IL-22 의 결합 (EC50=0.1 nM) 을 증대시킨다. 상기 ELISA 에서의 상기 항체에 대한 상이한 표현형은, 그것들이 상이한 IL-22 에피토프를 정의한다는 것을 나타낸다. Ab-04 에 의해 정의된 에피토프는 IL-22R 의 ECD 에 의한 IL-22 의 인지에 필요하거나 또는 항체가 IL-22R 에 의한 인접한 IL-22 에피토프의 인지를 입체적으로 방해한다.
IL-22R 동종이합체보다 IL-22R/IL-1OR2-Fc 이종이합체가 항-인간 IgG 코팅된 웰 상에서 고정될 때, IL-22 결합에 대한 그의 효과에 대해 상기 항체를 평가하기도 하였다 (도 10C). 도 10C 의 실험에서, 고정된 양의 바이오-IL-22 의 후속적인 첨가는 IL-22R 및 IL-1OR2 두가지 모두와 그의 상호작용을 통해 플레이트에 결합된 신호 (∼2.5) 를 나타내었다. 상기 경우에, 두 항체 모두 이종이합체성 Fc 융합체 수용체에 대한 IL-22 의 결합을 억제한다. 또, 상기 항체는 양적으로 상이하다. Ab-04 는 ND50=0.2 nM 로, 결합을 거의 완전히 억제한다. 반대로, Ab-02 는 ND50≥10 nM 로, 결합을 부분적으로 억제한다. 우리는, Ab-04 가 IL-22R (도 5B) 및 이종이합체 (도 10C) ELISA 둘 다에서 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 거의 완전히 차단한다고 결론지었다. 이종이합체 ELISA 에서 Ab-02 의 상대적으로 낮은 강도는 아마도 IL-22 에 대한 그의 상대적으로 불량한 친화성의 반영이다. Ab-02 가 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 차단하지 않 기 때문에 (도 1OB), 도 1OC 에 나타난 결과는, Ab-02 가, IL-22 결합의 IL-1OR2 의 안정화, 또는 IL-10R2 에 의한 인접 IL-22 에피토프의 인지를 입체장애적으로 방해하는 상기 에피토프로의 Ab-02 의 결합에 필요한, 별도의 에피토프를 정의한다는 것을 시사한다.
IL-22 가 IL-22R 및 수용체 Fc 이종이합체 모두에 결합하는 것을 억제하는 그의 능력에 대해 폴리클로날 IL-1OR2 항체도 평가하였다. 이전의 ELISA 에서, IL-10R2 가 존재하지 않는 경우, 상기 항체를 증량시켜 고정된 양의 바이오-IL-22 와 함께 첨가했는데, IL-22 및 IL-22R 동종이합체 사이의 상호작용에 현저한 영향을 주지 않았다 (도 10B). 반대로, IL-10R2 항체를 증량시켜 고정된 IL-22R/IL-1OR2-Fc 가 포함된 ELISA 에 IL-22 와 함께 첨가하는 경우, 상기 항체는 IL-22 가 이종이합체에 결합하는 것을 차단하였다 (ND50=3nM, 도 10C). 상기 유효성의 완전함은, 상기 폴리클로날 항체의 다양한 IL-1OR2 에피토프에 대한 결합이 또한 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 입체적 방해로써 방해한 것임을 나타낸다.
요약하자면, 도 10A-10C 에 나타난 결과는, Ab-02 및 Ab-04 은 각각 IL-22 와 그의 수용체 사슬과의 상호작용에 중요한 IL-22 상의 상이한 에피토프를 정의한다는 것을 시사한다. Ab-04 는, IL-22R 가 IL-22 를 처음 인지하는데 필요한 에피토프이다 (도 12). Ab-02 는 싸이토카인 수용체 복합체의 안정화에서 IL-1OR2 의 역할에 필요한 에피토프이다 (도 12). 래트 항-쥐과동물 IL-22 모노클 로날과의 비교 데이타는 mIL-22 상에서 유사한 에피토프를 정의한다 (데이터는 나타내지 않음). IL-1OR2 폴리클로날 항체에 의한 IL-22 결합의 억제는 싸이토카인 결합에 대한 IL-1OR2 의 중요성을 추가로 입증한다.
실시예 17 : IL-22BP 는 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용을 차단함.
IL-22 결합 단백질 (IL-22BP) 은 IL-22R 의 세포외 도메인에 낮은 상동성을 갖는 IL-22 에 대한 수용성 '수용체' 이다. 그것은 IL-22 에 의해 매개되는 신호 전달을 중화시킨다 (Dumoutier, L. 등. (2001) J Immunol 166 (12): 7090-5; Kotenko, S. V. 등. (2001) J Immunol 166 (12): 7096-103; Xu, W. 등. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511-6; Wei C-C 등. (2003) Genes & Immunity 4: 204-21117). IL-22BP-Fc 융합체를 분비하는 CHO 세포로부터 조건화된 배지를 싸이토카인 수용체 결합 ELISA 에 첨가하여, 이 천연 안타고니스트가 어떻게 IL-22 와 그의 수용체 사슬과의 상호작용을 차단하는지 결정하였다. 도 11A 및 11B 의 실험을 위해, IL-22R-Fc 동종이합체 또는 IL-22R/IL-1OR2-Fc 이종이합체 각각을 발현하는 세포로부터의 총 Fc 의 고정된 양을 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에서 그의 Fc 를 통해 고정시켰다. 고정된 농도의 바이오-IL-22 는 고정된 수용체 사슬과 그의 상호작용을 통해 플레이트에 결합된 신호를 나타내었다. IL-22BP-Fc 를 증량시켜 고정된 농도의 IL-22 와 함께 첨가되는 경우, IL-22BP-Fc 는 IL-22R (ND50= 4 nM; 도 11A) 및 이종이합체 (ND50= 2 nM; 도 6B) 두가지 모두에 대한 IL-22 의 결합을 거의 완전히 차단하였다. 이는, IL-22BP 가 IL-22R 에 의한 그의 인지에 필요한 IL-22 의 에피토프를 차단함으로서 결합을 억제한다는 것을 시사한다. 상기 관찰은 Ab-04 로 수득된 것들과 유사하다.
IL-22BP, Ab-04 및 Ab-02 가 IL-22 상에서 떨어져 있거나 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 결합 ELISA 를 IL-22BP-Fc 가 항-인간 IgG 코팅된 플레이트 상에 그의 Fc 를 통해 고정되도록 적용하였다 (도 11C). 고정된 농도의 바이오-IL-22 는 IL-22BP 와 그의 상호작용을 통해 플레이트에 결합된 신호를 나타내었다. 또한, Ab-04 또는 Ab-02 를 증량시켜 고정된 농도의 IL-22 와 함께 첨가하였다. Ab-04 는 IL-22 및 IL-22BP 사이의 상호작용을 완전히 차단하였고 (ND50=0.05nM), 이는 상기 2 가지 저해제가 동일하거나 또는 중복되는 IL-22 에피토프를 공유함을 지시한다. 반대로, Ab-02 는 IL-22 가 IL-22BP 를 인지하는 것을 부분적으로 그리고 약하게 차단하였고 (ND50= 100 nM), 이는 Ab-02 및 IL-22BP 가 IL-22 상에서 떨어져 있으나 중복되는 에피토프를 가짐을 나타낸다.
요약하자면, 도 11 에 나타난 결과는 IL-22BP 및 Ab-04 가 IL-22 상에서 IL-22R 로의 결합에 중요한 유사한 에피토프를 공유함을 지시한다. Ab-02 에 의해 정의된 IL-22 에피토프는 떨어져 있다.
실시예 18 : IL-22 는 IL-22R 및 IL-1 OR2 의 ECD 와 실질적으로 상호작용함.
IL-22 가 어떻게 그의 수용체 사슬과 상호작용하는지 알아보기 위해, 바이오틴화, N 말단 HIS/FLAG 태깅된 인간 IL-22 싸이토카인 및 IL-22RECD-및 IL-1OR2ECD-Fc 융합체를 ELISA-기재 포맷에 사용하였다. 도 12 의 도식 모델에서 요약된 바와 같이, IL-22 는 처음에 IL-22R 의 ECD 에 결합할 수 있다. 다음, IL-22/IL-22RECD 는 IL-1OR2 의 ECD 와 상호작용하여, IL-22 에 대해 더 높은 친화성을 갖는 싸이토카인 수용체 복합체를 형성하였다. 상기 복합체에 대한 IL-1OR2ECD 의 안정한 재순환이 직접 나타나지 않는 반면, 하기 관찰은 상기 모델을 지지한다.
IL-22 와 각각의 수용체 서브유닛과의 상호작용을 시험하고, IL-22 및 IL-22R 사이의 결합이 용이하게 검출될 수 있음을 발견하였다 (도 6A 및 6B 에서 각각 ED50 = 20 ng/㎖ IL-22 이고, ED50 = 6ng/㎖ IL-22R-Fc 임). 반대로, 고정된 IL-22 및 수용성 IL-10R2 사이에 단지 약한 친화성이 검출될 수 있었고, 이는 고농도의 IL-1OR2-Fc 를 필요로 하였다 (3-10 ㎍/㎖ ; 데이터는 나타내지 않음). 상기 결과는 [Logsdon, N. J. 등] 에 의한 최근 연구와 일치하며, 여기서 단량체성 IL-22 및 IL-22R 사이의 상호작용은 나노몰 범위 (Keq∼15 nM) 에서 검출되며, 반면 IL-22 및 IL-10R2 사이의 상호작용은 밀리몰 범위 (Keq∼1 mM) 에서 검출된다 (Logsdon, N. J. 등. (2002) J Interferon Cytokine Res 22 (11): 1099-112).
이론에 구애되지 않더라도, 본 출원인은, IL-22 및 IL-22R 의 세포외 도메인의 상호작용에 의해 정의된 에피토프에 대한 그의 친화성을 기반으로, IL-1OR2 의 ECD 가 후속적으로 처음의 IL-22R/IL-22RECD 복합체와 회합한다고 제안한다. 상기 IL-10R2ECD 의 일시적인 관계 (engagement) 는 수용체 복합체 내에서 싸이토카인을 안정화시키고, 효과적인 신호 전달을 유도한다 (도 12). 고정된 IL-22R ELISA 에서 수용성 IL-10R2 Fc 의 바이오틴화 IL-22 에 대한 사전의, 동시적인 (도 9A) 또는 후속적인 첨가 (도 9B) 와 관련한 실험은, IL-22 결합에 대한 IL-1OR2 의 효과가 이전의 IL-22/IL-22R 상호작용에 의존적임을 나타내었다 (도 9). 사용된 시스템에서, IL-1OR2-Fc 는 증대된 IL-22 결합에 영향을 주기 위해 IL-22 (도 6) 또는 IL-22R-Fc (도 9A) 둘 중 어느 하나와 먼저 회합할 수 없다. 상기 관찰은 친화성 측정과 일치하는데 [Logsdon 등. (2002), 상기 문헌], 오직 용액상 IL-10R2 에 대한 고정된 IL-22 의 친화성은 ∼1 mM (Keq) 인 반면, 용액상 IL-22R 및 IL-1OR2 둘 다에 대한 그의 친화성은 20 배를 초과한다 (∼45 μM).
상기 ELISA 시스템내에서 IL-22/IL-22R 복합체와 IL-10R2 서브유닛의 안정한 관계는 폴리클로날 또는 모노클로날 hIL-10R2 항체 중 어느 하나를 사용하여 직접 검출되지 않았다. 상기 항-hIL-10R2 시약 두가지 모두, 100 ㎍/㎖ 인간 IgG 의 존재하에서조차, 그리고 IL-22R 또는 IL-22 의 첨가에 무관하게, ELISA 플레이트에 대한 IL-1OR2-Fc 의 현저한 비-특이적 결합을 검출하였다. 상기 높은 백그라운드는 IL-1OR2 의 ELISA 플레이트에 대한 IL-22/IL-22R-의존성 회합으로부터 유래된 더 작은 신호를 가릴 수 있었다. 그렇더라도, hIgG 가 검정에 첨가될 때 불충분한 IL-22R-Fc 가 IL-22RECD 에 인접하여 병치되기 때문에, 싸이토카인이 후속적으로 첨가되면, IL-1OR2-Fc 의 상기 비-특이적 결합이 바이오-IL-22 로부터 유래된 신호를 증대시키지 않음을 주목한다 (도 9A).
이종이합체의 내용에서 IL-22R 의 IL-1OR2 로의 공유 병치는 본원에서 사용 된 시스템에서 IL-22 결합을 최적으로 검출하게 한다 (도 8A). 사실상, 상기 공유 회합은 일단 싸이토카인이 검정에 첨가되면, IL-1OR2ECD 가 IL-22/IL-22RECD 복합체에 거의 근접하게 존재하는 경향을 증가시킨다.
상기 이종이합체는 세포막 내의 IL-22R 및 IL-1OR2 수용체 서브유닛 사이의 잠재적인 예비-관계를 추상적으로 흉내낼 수 있다. [Krause 등. (2002) Molecular & Cellular Proteomics 1 (10) : 805-15] 에 의해 개발된 단일 세포 FRET 시스템에서의 연구는, 전체-기능적 IFN-γRI 및 IFN-γR2 수용체 사슬 사이의 예비-관계가 C 말단 GFP 및 BFP 융합을 통해 검출될 수 있고, 상기 시스템에서 IFN-γ 의 세포에 대한 결합과 함께, 싸이토카인-수용체 복합체의 당연한 올리고머화, FRET 신호는 감소하고, 이는 세포내 도메인이 키나제로서 분리하고, 수용체 사슬을 인산화시키고, 다운스트림 신호 캐스캐이드를 증폭시킨다는 것을 제안한다. 한 모델에서, 본원에서 기술된 ELISA 시스템 모델에서 연구된 일시적인 IL-22 싸이토카인 수용체 상호작용은 세포막 내에, 다른 유형의 Ⅱ 싸이토카인 수용체뿐만 아니라, 전-관계된 IL-22 수용체 사슬의 올리고머화를 필요로 하였다.
실시예 19 : IL-22 는 분리의 IL-22R 및 IL-1 OR2 결합 표면을 가짐.
래트 IL-22 항체, Ab-02 및 Ab-04 는 싸이토카인-수용체 복합체 및 후속하는 신호 전달의 제안된 일시적인 어셈블리를 필요로 하는 IL-22 에피토프 상에서 잠재적인 결합 부위를 수행하기에 유용한 툴로서 증명되었다 (도 12). 상기 항체의 효과의 연구는 2 가지 유형의 IL-22 안타고니스트의 특성화를 가능하게 한다. Ab-04 및 hIL-22BP-Fc 에 의해 예시되는 처음 유형은 IL-22 및 IL-22R 사이의 처음의 상호작용을 차단한다 (도 1OB 및 12). Ab-02 에 의해 예시되는 두번째 유형의 저해제는 IL-1OR2ECD 에 의해 IL-22/IL-22RECD 의 후속하는 인지를 차단한다 (도 10C 및 12). 상기 항체는 또한 IL-22 에 의해 매개된는 신호 전달을 차단한다 (도 10A).
IL-22 항체에 의해 정의된 에피토프가 수용체 결합 부위를 오버랩하거나 또는 항체의 결합 부위가 수용체 사슬에 의한 싸이토카인의 인지를 입체적으로 방해하는지, 상기 2 가지 유형의 항체는, IL-22 가 IL-22 및 IL-10R2 에 대한 분명한 수용체 결합 부위를 가짐을 확인시킨다. 본원에서 보고된 항체의 특성에 집중하면서, Ab-04 는 IL-22R 에 의한 IL-22 의 인지를 방해하는 IL-22 에피토프에 결합하고 ; 이는 Ab-02 의 경우에는 아니다. IL-22 와 IL-22R 의 관계는 Ab-02 에 의해 차단되지 않는다. 이는 IL-22R 의 ECD 와 상기 싸이토카인의 상호작용에 의해 영향을 받은 IL-22 에서의 구조적 변화를 Ab-02 가 인지해서인 것으로 여겨진다. Ab-02 가 싸이토카인 어셈블리에서 첫 단계를 차단하지 않는 반면, 그것은 두번째 단계 (즉, IL-10R2 의 ECD 에 의한 IL-22/IL-22R 의 인지) 를 차단할 수 있다. 따라서, Ab-04 및 Ab-02 는 IL-22 상에서 IL-22 및 IL-10R2 각각에 의해 분명한 결합 부위의 인지를 차단한다고 결론지어진다. IL-22 에 대한 자연-발생 안타고니스트 및 결합 단백질인 IL-22BP 는 Ab-04 로서 유사한 특성을 가지며, IL-22R 에 의한 IL-22 의 인지를 방해한다 (도 11A). IL-22 의 고정된 IL-22BP-Fc 로의 결합을 강하게 방해하는 Ab-04 의 능력은, Ab-04 및 IL-22BP 가 Ab-04 에 의해 정의되는 것과 다른 IL-22 상의 유사 에피토프를 공유한다는 결론을 추가로 지지한다.
요약하자면, 본원에 나타난 결과는 IL-22 가 일시적인 기작에서 그의 수용체 사슬을 방해한다고 제안한다. 우선, IL-22 는 Ab-04 및 IL-22BP-Fc 에 의해 예시되는 안타고니스트가 상기 상호작용을 방해하는 IL-22R 의 ECD 와 관계가 있다. 두번째는, IL-1OR2 의 ECD 는 IL-22 및 IL-22R 사이의 그 전의 상호작용에 의해 정의된 분명한 결합 부위에 결합한다. 이 후자의 상호작용은 Ab-02 에 의해 예시되는 안타고니스트에 의해 차단된다 (도 12).
실시예 20 : 래트 항-인간 IL-22 항체를 사용한 pSTAT 루시퍼라제 검정에서 IL-22 활성의 억제
실험 프로토콜 :
pSTAT-TA-루시퍼라제 벡터를 하기와 같이 구축하였다. STAT 반응 요소의 5 개의 복사본 (RN Pearse 등. (1993) PNAS 90: 4314-4318) 을 시판 (Clontech Cat. No.: PT3606-5) 으로부터 수득된 pTA-Luc 벡터 내로 클로닝하였다.
루시퍼라제 활성을 하기 pSTAT 루시퍼라제 검정을 사용하여 검출하였다 : 첫째날에, HepG2 세포를 전체적으로 트립신처리하고, P-100 접시 (Corning) 에 5x106 세포/P100 의 농도로 분주하였다. 둘째날에, 상기 세포를 하기 조건 하에 P100 플레이트 당 옮겼다 : 용액 1 : 20 ㎍ pSTAT-TA-Luc DNA + 0.5 ㎖ 혈청-없는 배지 (Gibco 사의 Opti-MEM); 및 용액 2 : 60 ㎕ Lipofectamin2000 (Gibco 사) + 0.5 ㎖ 혈청-없는 배지 (Gibco 사의 Opti-MEM). 용액 1 을 용액 2 에 부드럽게 첨가하고, 튜브를 수 회 뒤집어서 잘 혼합시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 20 분 동안 놓아 두었다. HepG2 세포에서 배지를 제거하고, 포스페이트 완충된 식염수 용액 (PBS) 으로 한 번 세척하였다. 혈청-없는 배지 (DME+PSG+HEPES) 9 ㎖/p100 를 P100 에 첨가하였다. DNA/Lipofectamin 2000 혼합물 (용액 1 + 용액 2) 을 세포에 적가했다. 혼합물을 부드럽게 휘젓고, 배양기에 다시 넣었다. 셋째날에, 세포를 트립신처리하고, 96-웰 세포 인큐베이션 평판 플레이트에, 하나의 96 웰 플레이트/p100, 1OO㎕/웰로 넣었다. 넷째날에, 항체 희석액 시리즈를 37℃ 에서 30 분 동안 DME+PSG+10% FBS 내에서 huIL-22 30ng/㎖ 으로 인큐베이션하였고 : 배지를 제거한 다음, 싸이토카인 혼합물을 세포 인큐베이션 플레이트에 첨가하였다. 세포를 37℃ 에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 96-웰 플레이트에 1x RLB 완충액 (Promega E3971) 50 ㎕/웰을 첨가하고, 균질하게 될 때까지 혼합하였다. 분해물 40㎕ 를 루시퍼라제 검정을 위해 화학 발광 96-웰 검정 플레이트 (Packard 또는 Wallac opaque 96-웰 플레이트) 에 옮겼다. 루시퍼라제 검정 시약 (Promega E1483) 100 ㎕ 를 첨가하였다. 발광을 발광계 (Wallax Micro Beta TriLux 섬광 계수기) 에서 등급을 매겼다.
본 실시예는 인간 IL22 결합 단백질 융합 Fc (huIL22BP-huFc) 의 융합 구축물과 비교해, 래트 항-인간 IL-22 항체, Ab-02 및 Ab-04 를 사용한 pSTAT 루시퍼라제 검정에서의 IL-22 활성의 억제를 기술한다. 도 13 은 래트 항-인간 IL-22 모노클로날 항체, Ab-02 및 Ab-04 을 사용한 IL-22 활성 억제를 표시한 그래프이다. 고정된 농도의 IL-22 를 다양한 농도의 Ab-02 (●) 또는 Ab-04 (▲) 또는 대조군 항체 (-) 와 함께 세포 배지 내에서 예비-인큐베이션한 다음, pSTAT-TA-Luc 벡터에 의해 일시적으로 트랜스펙션된 HepG2 세포에 첨가하였다. 6 시간 후, 세포를 파쇄하고, 동량의 세포 분해물을 루시퍼라제 기질과 함께 첨가하였다. 신호를 발광 검독기를 사용하여 검출하였다. IL-22 가 있게 (파선) 또는 없이 (점선) 인큐베이션된 세포를 각각 포지티브 및 네거티브 대조군으로 포함시켰다. Ab-02 에 대한 ED50 는 약 1OnM 이었다. Ab-04 에 대한 ED50 은 약 0.3nM 이었다.
도 14 는 래트 항-인간 IL-22 모노클로날 항체, Ab-04, 또는 IL-22BP-Fc 로의 IL-22 활성 억제를 묘사한 도이다. 고정된 농도의 IL-22 를 세포 배지 내에서 다양한 농도의 Ab-04 (▲) 또는 IL-22BP-Fc (□) 와 함께 예비-인큐베이션시킨 다음, pSTAT-TA-Luc 벡터에 의해 일시적으로 트랜스펙션된 HepG2 세포에 첨가하였다. 6 시간 후, 세포를 파쇄하고, 동량의 세포 분해물을 루시퍼라제 기질과 함께 각 샘플에 첨가하였다. 신호를 발광 검독기를 사용해 검출하였다. IL-22 가 있게 (파선) 또는 없이 (점선) 인큐베이션된 세포를 각각 포지티브 및 네거티브 대조군으로 포함시켰다. IL-22BP-Fc 에 대한 ED50 는 약 0.4nM 이었다.
실시예 21 : 래트 항-인간 IL-22 항체를 사용한 BaF3 증식 검정에서 IL-22 활성의 억제
실험 프로토콜 :
전장 IL-22R 및 IL-1OR2 를 코딩하는 DNA 분절을 GFP- RV (녹색 형광 단백질 리포터가 있는 레트로바이러스 벡터) 및 YFP-RV (황색 형광 단백질 리포터가 있는 레트로바이러스 벡터) 에 각각 클로닝해 넣었다. BaF3 세포를 IL-1OR2-YFP-RV 로 형질도입하고, FACS 에 의해 선별하였다. IL-1OR2 포지티브 BaF3 세포를 IL-22R-GFP RV 로 추가로 형질도입하고, FACS 에 의해 선별하였다. IL-1OR2/IL-22R 이중 포지티브 BaF3 세포를 하기 기술된 바와 같은 BaF3 증식 검정에서 사용하였다.
BAF3 세포를 세척하였다. 105/㎖ 에 있는 세포 현탁액을 RPMI1640 + PSG + 10% FBS 에서 제조하고, 세포 인큐베이션 플레이트 (VWR # 62402-929) 에 50㎕/웰로 분주하였다. 일련의 희석된 항체를 RPMI1640+PSG+10% FBS 중의 1.5ng/㎖ 인간 IL-22 와 함께 37℃ 에서 30 분 동안예비-인큐베이션하였다. 다음, 혼합물을 세포 인큐베이션 플레이트에 50㎕/웰로 첨가하였다. 세포를 37℃ 에서 5% CO2 에서 가습화된 배양기 내에서 48-72 시간 동안 인큐베이션하였다. 증식을 평가하기 위해, 인큐베이션된 플레이트를 배양기 밖으로 내놓고, 실온에서 냉각되도록 놔두었다. 재구성된 Cell-Tirer Glo 시약 약 1OO㎕/웰을 첨가하였다. 플레이트를 오비탈 진탕기 (orbital shaker) 상에서 2 분 동안 진탕하여, 세포의 완전한 파쇄를 확실히하였다. 발광을 Trilux (Wallax Micro Beta TriLux 섬광 계수기) 를 사용하여 1 초/웰로 검독하였다.
본 실시예는 래트 항-인간 IL-22 항체, Ab-02 및 Ab-04 를 사용한 BaF3 증식 검정에서 IL-22 활성의 억제를 기술한다 (도 15). 고정된 농도의 IL-22 를 세포 배지 내에서 다양한 농도의 Ab-02 (●) 또는 Ab-04 (▲) 또는 대조군 항체 (-) 와 함께 예비-인큐베이션한 다음, IL-22R 및 IL-1OR2 수용체 둘 다를 발현하는 BaF3 세포에 첨가하였다. 48-72 시간 후, 세포 증식을 Cell-Tirer Glo 시약에 의해 검출하였다. 신호를 발광 검독기를 사용해 검출하였다. Ab-02 및 Ab-04 에 대한 ED50 는 각각 약 40nM 및 0.2nM 이었다.
실시예 22 : BIAcore 에 의한, IL-22 에 대한 래트 Ab -02.04, IL- ZZBP - Fc , IL-22R 및 IL-22R/IL-1 OR2 의 결합의 반응속도법 분석
실험 프로토콜:
바이오센서 표면을 제조하기 위해, 정제된 염소 항-인간 IgG 친화성 (KPL 01-10-20); 단백질-A (Pierce 21184); 염소 항-래트 IgG 또는 시험 단백질을 아민 커플링을 사용하여 연구-등급 카르복시메틸 덱스트란 칩 (CM5) 에 직접 고정시켰다. 표면을 EDC/NHS 로 활성화시켰다. 포획 (capturing) 항체를 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 4.5) 중 50 ㎍/㎖ 의 농도에서 주입하고, 단백질-A 를 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 중 50 ㎍/㎖ 의 농도에서 주입하거나, 또는 시험 단백질을 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중 0.01-1 ㎍/㎖ 의 농도로 직접 주입하였다. 위저드 툴 (wizard tool) 을 사용하여 항-인간 또는 항-래트 IgG 에 대한 10.000 공명 단위 (RU), 단백질-A 에 대한 3000 (RU) 및 직접 고정된 시험 단백질에 대한 50-100 (RU) 로 고정화를 수행하였다. 잔존한 활성화된 군을 1.0 M 에탄올아민 (pH 8.0) 으로 블로킹하였다. 대조군으로서 최초의 유동 세포를 기준 표면으로서 사용하여 벌크한 굴절률, 매트릭스 효과 및 비-특이적 결합을 보정하고, 두번째, 세번째 및 네번째 유동 세포를 포획 분자로 코팅시켰다.
반응속도 분석을 위해, IL-22R-Fc, IL-lOR2-Fc, IL-22R-Fc/IL-1OR2-Fc 수용체 복합체 또는 IL-22BP-Fc 단백질을 함유하는 조건 배지를 항-인간 IgG 항체 또는 단백질 A 표면 상에 포획하였다. 래트 항체를 400 ng/㎖ 용액 60 ㎕ 를 주입함으로써 항-래트 IgG 항체 표면 상에 포획했다. Fc 융합 단백질 주입 완료 후 약 90 초 시점과 기준선 사이의 순수한 차이 (net difference) 를 결합된 리간드의 양을 나타내는 것으로 하였다. 300, 150, 100, 75, 50, 25, 12.5, 6.5, 및 O nM 농도에 있는 IL-22 의 용액을 3 분 동안 분 당 30 ㎕ 의 유속으로 3 회 주입하고, 시간이 작동하면서 결합된 물질의 양을 센서그람 (sensorgram) 으로서 기록하였다. 해리상을 동일한 유속에서 10 분 동안 HBS/EP 완충액에서 모니터링하고, 이어서 0.1% TFA 의 5 ㎕ 를 주입하고, pH 1.5 의 글리신 5 ㎕ 을 주입하여 완전히 활성인 포획 표면을 재생했다. 모든 반응속도 실험을 HBS/EP 완충액 내에서 22.5℃ 에서 수행하였다. 이중 참조를 사용하여 블랭크 및 완충 효과를 각 센서그람에 대해 제하였다.
반응속도 데이타를 1 : 1 모델로 적용된 BIAevaluation 소프트웨어 3.0.2 를 사용하여 분석하였다. 겉보기 해리 (kd) 및 회합 (ka) 비율 상수를 대역 해석법 (global analysis) 을 사용하여 센서그람의 적절한 구역으로부터 계산하였다. 수용체, 항체 및 IL-22 사이의 상호작용의 친화성 상수를 하기 식에 의해 분석속도율 상수로부터 계산하였다 : KD = kd/ka.
IL-22 에 대한 래트 항체 결합의 친화성을 상이한 래트 항체 제시를 이용해 BIAcore 에서 시험하였다 : 항-래트 IgG 항체로 BIAcore 칩 상에서 래트 항체를 직접 코팅하거나 또는 BIAcore 칩 상에 래트 항체를 포획함. 다음, 상이한 농도의 IL-22 를 완충액과 함께 칩 내로 주입하였다. 상호작용의 친화성 상수를 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 유사한 데이타를 상이한 실험으로부터 수득하였다.
IL-22 에 대한 IL-22R-Fc, IL-10R2-Fc, IL-22R-Fc/IL10R2-Fc 수용체 복합체 및 IL-22BP-Fc 의 결합 친화성을 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 함유하는 조건화된 배지를 사용하여 BIAcore 에서 시험하였다. 수용체-Fc 융합 단백질을 항-인간 IgG 항체에 의해 BIAcore 칩 상에서 포착하였다. 이어서, 상이한 농도의 IL-22 를 완충액과 함께 칩 내로 주입하였다. 상호작용의 친화성 상수를 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 유사한 데이타를 상이한 실험으로부터 수득하였다.
Ab-02 Ab-04 IL-22R-Fc IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc 복합체 IL-22BP-Fc
KD (nM) 68.1 1.51 41 1.48 3.37
* IL-1OR2-Fc 및 IL-22 사이의 상호작용은 너무 약해서 BIAcore 분석법에서 시험될 수 없었음.
하이브리도마 세포주의 기탁
Ab-02 및 Ab-04 를 생성하는 하이브리도마 세포주를 부다페스트 조약에 따라 원기탁으로서 [American Type culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, U. S. A. 20110-2209, on June 5,2003] 로 기탁하고, 각각 ATCC 접근 번호 PTA-5254 및 PTA-5255 를 받았다. 기탁된 물질의 공개적 이용가능성의 모든 제한사항은, 37 C. F. R. § 1.808 (b) 에 명시된 조건을 제외하고 특허 등록시 변경불가하게 해제될 것이며, 기탁 기간은 37 C. F. R. § 1.806 에 합치되어야 한다.
대등한 것들
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 발명의 구체적인 구현예와 대등한 많은 것들을 인지하고, 확인할 수 있을 것이다. 상기 해당하는 것들은 하기 청구의 범위에 포함된다.
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atgccccaaa gcgatttttt ttaaccaaaa ggaagatggg aagccaaact 720 ccatcatgat gggtggattc caaatgaacc cctgcgttag ttacaaagga aaccaatgcc 780 acttttgttt ataagaccag aaggtagact ttctaagcat agatatttat tgataacatt 840 tcattgtaac tggtgttcta tacacagaaa acaatttatt ttttaaataa ttgtcttttt 900 ccataaaaaa gattactttc cattccttta ggggaaaaaa cccctaaata gcttcatgtt 960 tccataatca gtactttata tttataaatg tatttattat tattataaga ctgcatttta 1020 tttatatcat tttattaata tggatttatt tatagaaaca tcattcgata ttgctacttg 1080 agtgtaaggc taatattgat atttatgaca ataattatag agctataaca tgtttatttg 1140 acctcaataa acacttggat atcctaaaaa aaaaaaaaaa aaagcggccg c 1191 <210> 2 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Ile <210> 3 <211> 1166 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gaattcggcc aaagaggcct acctaaacag gctctcctct cagttatcaa ctgttgacac 60 ttgtgcgatc tctgatggct gtcctgcaga aatctatgag tttttccctt atggggactt 120 tggccgccag ctgcctgctt ctcattgccc tgtgggccca ggaggcaaat gcgctgcccg 180 tcaacacccg gtgcaagctt gaggtgtcca acttccagca gccatacatc gtcaaccgca 240 cctttatgct ggccaaggag gccagccttg cagataacaa cacagatgtc cggctcatcg 300 gggagaaact gttccgagga gtcagtgcta aggatcagtg ctacctgatg aagcaggtgc 360 tcaacttcac cctggaagac gttctgctcc cccagtcaga caggttccag ccctacatgc 420 aggaggtggt gcctttcctg accaaactca gcaatcagct cagctcctgt cacatcagcg 480 gtgacgacca gaacatccag aagaatgtca gaaggctgaa ggagacagtg aaaaagcttg 540 gagagagtgg agagatcaag gcgattgggg aactggacct gctgtttatg tctctgagaa 600 atgcttgcgt ctgagcgaga agaagctaga aaacgaagaa ctgctccttc ctgccttcta 660 aaaagaacaa taagatccct gaatggactt ttttactaaa ggaaagtgag aagctaacgt 720 ccatcattat tagaagattt cacatgaaac ctggctcagt tgaaaaagaa aatagtgtca 780 agttgtccat gagaccagag gtagacttga taaccacaaa gattcattga caatatttta 840 ttgtcactga tgatacaaca gaaaaataat gtactttaaa aaattgtttg aaaggaggtt 900 acctctcatt cctttagaaa aaaagcttat gtaacttcat ttccataacc aatattttat 960 atatgtaagt ttatttatta taagtataca ttttatttat gtcagtttat taatatggat 1020 ttatttatag aaacattatc tgctattgat atttagtata aggcaaataa tatttatgac 1080 aataactatg gaaacaagat atcttaggct ttaataaaca catggatatc ataaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaagc ggccgc 1166 <210> 4 <211> 180 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> UNSURE <222> (180) <223> Wherein Xaa is any amino acid <400> 4 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn 20 25 30 Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln 115 120 125 Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn 130 135 140 Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Val Xaa 180 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for generation of sense probe <400> 5 aggatggaga catctgactg ccctacg 27 <210> 6 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for the generation of sense probe <400> 6 gactgataat acgactcact atagggcgaa caattttgac tccgatattg tccaag 56 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for generation of anti-sense probe <400> 7 acaattttga ctccgatatt gtccaag 27 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for generation of anti-sense probe <400> 8 gactgataat acgactcact atagggcgaa ggatggagac atctgactgc cctacg 56 <210> 9 <211> 191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for IL-22 sequences <400> 9 cagccataca tcgtcaaccg cacctttatg ctggccaagg aggccagcct tgcagataac 60 aacacagatg tccggctcat cggggagaaa ctgttccgag gagtcagtgc taaggatcag 120 tgctacctga tgaagcaggt gctcaacttc accctggaag acgttctgct cccccagtca 180 gacaggttcc a 191 <210> 10 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid tag <400> 10 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser 20 25 30 Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Ile Ser Ser His Cys 35 40 45 Arg

Claims (31)

  1. 인터류킨-22 (IL-22) 에 특이적으로 결합하며, IL-22 수용체 (IL-22R) 및 인터류킨-10 수용체 2 (IL-10R2) 를 포함하는 복합체에 대한 IL-22 의 결합을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절.
  2. 인터류킨-22 (IL-22) 에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 그의 분절이IL-22 수용체 (IL-22R) 에 대한 IL-22 의 결합을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절.
  3. 인터류킨-22 (IL-22) 에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 그의 분절이 인터류킨-10 수용체 2 (IL-1OR2) 에 대한 IL-22 의 결합을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절.
  4. 인터류킨-22 (IL-22) 에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 그의 분절이 인터류킨 IL-10 수용체 2 (IL-10R2) 에 대한 IL-22 및 IL-22 수용체 (IL-22R) 의 복합체의 결합을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절.
  5. 인터류킨-22 (IL-22) 에 특이적으로 결합하며, 상기 IL-22 에 대한 제 2 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하며, 상기 제 2 항체가 PTA-5254 및 PTA-5255 로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 제조되는 모노클로날 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 분절.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 상수 (Kd) 가 10E-9 이상인 친화성을 가진 항체 또는 그의 분절.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, HEPG2 에서의 STAT 인산화 또는 BaF3 세포의 증식을 무력화하는, ED50 가 약 5 nM 내지 200 pM 의 범위이거나 또는 더욱 강한 항체 또는 그의 분절.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10E4 내지 10E6 l/Ms 의 범위의 반응 속도로 IL-22 와 회합하며, 해리 반응 속도가 약 10E-3 내지 10E-6 l/s 의 범위인 항체 또는 그의 분절.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 가 서열 번호 2 의 아미노산 34 ∼ 179 와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, Stat-3 단백질의 인산화를 유도할 수 있는 항체 또는 그의 분절.
  10. 제 6 항에 있어서, IL-22 가 서열 번호 2 의 아미노산 34 ∼ 179 를 포함하는 항체 또는 그의 분절.
  11. 제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22, IL-22R 및 IL-1OR2 가 인간 기원인 항체 또는 그의 분절.
  12. 제 2 항에 있어서, IL-22 및 IL-22R 가 인간 기원인 항체 또는 그의 분절.
  13. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화, CDR-그라프트 또는 인간 항체인 항체 또는 그의 분절.
  14. PTA-5254 및 PTA-5255 로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 제조되는 모노클로날 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 분절을 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 싸이토카인 저해제, 성장 인자 저해제, 면역억제제, 항염증제, 대사 저해제, 효소 저해제, 세포 살상제 및 세포정지제로 이루어진 군으로부터 선택되는 또다른 치료제를 추가로 함유하는 약제학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 치료제가 TNF 안타고니스트, IL-12 안타고니스트, IL-15 안타고니스트, IL-17 안타고니스트, IL-18 안타고니스트, IL-21R 안타고니스트, T 세포 제거제, B 세포 제거제, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, Cox-2 저해제, cPLA2 저해제, NSAID 및 p38 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  18. IL-22 및 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛을 IL-22 및 IL-22 수용체 복합체 또는 그의 서브유닛 사이의 모든 상호작용이 일어나도록 하는 조건 하에 접촉시켜 IL-22/IL-22 수용체 혼합물을 형성하는 단계; 및 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 분절과 상기 IL-22/IL-22 수용체 혼합물을 접촉시켜 IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 또는 그의 서브유닛 사이의 상호작용을 방해하는 단계를 포함하는, IL-22 및 IL-22 수용체 복합체, 또는 그의 서브유닛 사이의 상호작용을 방해하는 방법.
  19. 대상체에게 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 분절을 IL-22-관련 장애의 치료 또는 방지에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 IL-22-관련 장애의 치료 또는 방지 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, IL-22-관련 장애가 자가면역 장애, 호흡기 장애 및 염증 상태로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, IL-22-관련 장애가 류마티스 관절염, 골관절염, 다발 경화증, 중증근육무력증, 크론씨 병, 염증성 장질환, 루프스, 당뇨, 건선, 천식, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD), 심혈관계 염증, 췌장염, 간염 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 자가면역 장애가 류마티스 관절염인 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 대상체에게 싸이토카인 저해제, 성장 인자 저해제, 면역억제제, 항염증제, 대사 저해제, 효소 저해제, 세포 살상제 및 세포정지제로 이루 어진 군으로부터 선택되는 또다른 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, TNF 안타고니스트, IL-12 안타고니스트, IL-15 안타고니스트, IL-17 안타고니스트, IL-18 안타고니스트, IL-21R 안타고니스트, T 세포 제거제, B 세포 제거제, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, Cox-2 저해제, cPLA2 저해제, NSAID 및 p38 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 대상체에게 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항-IL-22 항체 또는 그의 분절을 대상체에서의 급성 단계 반응을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 급성 단계 반응 감소 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 포유류가 인간이 방법.
  30. 대상체에서의 IL-22-관련 장애의 치료 또는 방지를 위한 의약 제조에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 분절의 용도.
  31. 대상체에서의 급성 단계 반응의 치료 또는 방지를 위한 의약 제조에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 분절의 용도.
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