DE69429925T2 - METHODE ZUR BINDUNG VON MATERIAL AN DAS Beta-AMYLOID-PEPTID - Google Patents

METHODE ZUR BINDUNG VON MATERIAL AN DAS Beta-AMYLOID-PEPTID

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf Alzheimer Krankheit und bezieht sich insbesondere auf Verfahren zum Binden antigener Verbindungen an das β-Amyloidpeptid, festgestellt in den senilen Plaques von Alzheimer Krankheit.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die senilen Amyloidplaques und congophilen angiopathischen Läsionen, festgestellt im Überfluß im Gehirn von Patienten mit Alzheimer Krankheit, sind abnormale extrazelluläre Strukturen. Die biochemische Zusammensetzung dieser Strukturen ist umfassend untersucht worden, um besser ihre mögliche Rolle in der Pathogenese dieser Wahnsinnskrankheit zu verstehen. Das reife Amyloidplaque ist eine komplexe Struktur, bestehend aus einem Zentralkern von Amyloidfibrillen, umgeben von dystrophen Neuriten, axonalen Enden und Dendriten, Mikroglia und faserförmigen Astrozyten. Der Amyloidkern des senilen Amyloidplaques, und welcher Blutgefäße umrundet unter Erzeugen der congophilen Angiopathie, ist ein Peptid von 39 bis 43 Aminosäuren, bezeichnet als das β-Amyloid (βA) Peptid, das Aβ Peptid, das A4 Protein oder das βA4 Peptid. βA Peptid wird in dem Gehirn bei Alzheimer Krankheit, Down Syndrom, erbbedingter cerebraler Hämorrhagie des Holländisches Typs und in hohem Alter festgestellt. Siehe beispielsweise K. Kosik Science 256, 780-783 (1992).
  • E. Kline et al., PCT Anmeldung WO 91/16819 beschreibt ein Verfahren zum Behandeln von Alzheimer Krankheit durch Verabreichen des β-Amyloidpeptids selbst oder eines aktiven Fragments davon. H. Potter, PCT Anmeldung WO 92/03474, beschreibt ein therapeutisches Verfahren zum Behandeln von Individuen, wie Alzheimer Krankheit Patienten, unter Verhüten der Bildung eines α-Antichymotrypsin-β- Amyloidpeptidkomplexes durch Verabreichen eines synthetisches Peptids, umfassend ein Fragment des β- Amyloidpeptids, an die Person.
  • Das βA Peptid wird hergestellt durch das abnormale proteolytische Verarbeiten eines größeren Proteins, das Amyloidvorläuferprotein (APP). APP selbst ist in dem senilen Amyloidplaque identifiziert worden, und zusätzliche Proteine, die an senile Amyloidplaques und angiopathische Läsionen lokalisiert worden sind, schließen Apolipoprotein E, alpha-1-Antichymotrypsin, Komplementfaktoren C1q und C3q, APP und IgG ein. Siehe beispielsweise W. Strittmatter er al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993); Abraham et al., Cell, 52, 487 (1988), Eikelenboom et al., Acta Neuropathol., 57, 239 (1982); McGeer et al., Canad. J. Neuro. Sci., 16, 516 (1989), Beyreuther et al., Brain Pathol., 1, 241 (1991); Ishii et al., Acta Neuropathol. 36, 243 (1976). Die Mechanismen, durch die diese Proteine in dem extrazellulären Raum aggregieren unter Assoziieren mit dem senilen Amyloidplaque und congophiler angiopathischer Läsion, sind nicht bekannt. Somit besteht ein fortdauerndes Verlangen nach neuen Wegen zum Untersuchen und Bekämpfen dieser Krankheit.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Offenbart ist ein Verfahren zum Binden einer Verbindung an β-Amyloidpeptide. Das Verfahren basiert auf der Feststellung, daß die Gelenkregion von Antikörpern an das β-Amyloidpeptid bindet. Das Verfahren umfaßt die Stufen von in Kontakt bringen eines Linkerantikörpers mit einer Gelenkregion (und vorzugsweise mindestens einer Antigenbindungsstelle) an das β-Amyloidpeptid, so daß die Gelenkregion an das β-Amyloidpeptid bindet. Eine zu liefernde Verbindung wird an den Antikörper vor, während oder nach der in Kontakt bringen Stufe gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fc Rezeptorbindungsregion des Linkerantikörpers gelöscht.
  • Wo die zu liefernde Verbindung eine antigene Verbindung ist, wird der Linkerantikörper mit der freien Kombinationsstelle gebunden, der Antikörper wird so ausgewählt, daß er spezifisch an die zu liefernde Verbindung an der Kombinationsstelle bindet, und die antigene Verbindung wird an die Antigenbindungsstelle (vor, gleichzeitig mit oder nach der in Kontakt bringen Stufe) gebunden, so daß die antigene Verbindung an das β-Amyloidpeptid gebunden wird.
  • Das Verfahren ist unter anderen Dingen geeignet für histologische und diagnostische Untersuchung von Gehirngewebe von Alzheimer Krankheit oder Gehirngewebe eines Patienten, von dem vermutet wird, daß er mit Alzheimer Krankheit belastet ist, sowohl in vitro wie in vivo.
  • Die vorhergehenden und andere Ziele und Aspekte der gegenwärtigen Erfindung werden detailliert in der im nachfolgenden aufgeführten Beschreibung dargestellt.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 zeigt Binden von IgG und IgG Domänen an immobilisiertes βA(1-28) und an immobilisiertes Ethanolamin. Feld 1: affinitätsgereinigtes IgG; Feld 2: Fab; Feld 3: Fc; Feld 4: Fab; Feld 5: F(ab)'&sub2;. IgG und IgG Domänen wurden direkt auf ein Polyacrylamidgel (Beladung) aufgebracht oder wurden inkubiert mit βA(1-28) oder mit Ethanolamin (Eth), zuvor an Immobilon AV Membranscheiben immobilisiert. Die Membranen wurden dann mit PBS und Guanidinhydrochlorid gewaschen, dann in Laemmli Puffer gekocht und die eluierten Proteine der Elekrophorese ausgesetzt, auf Immobilon P übertragen und, wie beschrieben, sichtbar gemacht.
  • Fig. 2A zeigt Binden von affinitätsgereinigtem F(ab)'&sub2; an βA(1-28) Peptid, folgend verschiedenen Waschungen. Affinitätsgereinigtes F(ab)'&sub2; wurde mit entweder βA(1-28) oder Ethanolamin, zuvor an Immobilon AV Membranscheiben immobilisiert, inkubiert. Die Membranen wurden dann mit 3,0 ml PBS (Feld 1) gewaschen, gefolgt von 700 ul 5% SDS (Feld 2), 700 ul 4M Harnstoff (Feld 3) oder 6 M Guanidinhydrochlorid (Feld 4). Proteine wurden dann durch Sieden in Laemmli Puffer eluiert, Elektrophorese ausgesetzt und Immunoglobulin sichtbar gemacht, wie beschrieben.
  • Fig. 2B zeigt Binden von affinitätsgereinigtem CSF IgG an βA(1-28) Peptid, folgend verschiedenen Waschungen. CSF, das IgG enthält, wurde inkubiert mit entweder βA(1-28) oder Ethanolamin, zuvor immobilisiert an Immobilon AV Scheiben, und dann, wie für Fig. 2a beschrieben, behandelt.
  • Fig. 3 zeigt Binden von gereinigtem IgG an βA Peptide und an andere Peptide. Affinitätsgereinigtes IgG wurde inkubiert mit βA(1-28), βA(1-28), βA(1-40), H. M, Peptid, E. H. Peptid oder Ethanolamin, zuvor an Immobilon AV Membranscheiben immobilisiert. Die Membranen wurden dann mit PBS und 6 M Guanidinhydrochlorid gewaschen. Behaltene Proteine wurden dann durch Sieden in Laemmli Puffer eluiert, Elektrophorese ausgesetzt und Immunglobulin sichtbar gemacht.
  • Fig. 4 zeigt Binden von CSF Albumin an immobilisiertes βA (Feld 1), an immobilisiertes βA(1- 28) nach Vorinkubation mit Anti-Albumin IgG (Feld 4) und an immobilisiertes βA(1-28) nach Vorinkubation mit Anti-Ferritin IgG (Feld 5). Hirnflüssigkeit wurde mit immobilisiertem βA oder mit immobilisiertem Ethanolamin (Eth) inkubiert. Als Kontrollen wurden Anti-Albumin IgG allein (Feld 2) und Anti-Ferritin IgG allein (Feld 3)(ohne Hirnflüssigkeit) mit den Immobilon AV Membranscheiben inkubiert. Die Membranen wurden in PBS und 6 M Guanidin gewaschen, und behaltene Proteine wurden durch Sieden in Laemmli Puffer eluiert. Nach Elektrophorese und Western Transfer wurde Albumin mit dem Anti-Albumin Antikörper nachgewiesen.
  • Fig. 5 zeigt Binden von CSF Albumin an immobilisiertes βA(1-28) (Bahnen 1 und 4), an Anti- Albumin IgG, zuvor an immobilisiertes βA(1-28) gebunden (Bahnen 2 und 5), oder an Anti-Ferritin IgG, zuvor an immobilisiertes βA gebunden (Bahnen 3 und 6). Anti-Albumin IgG oder Anti-Ferritin IgG wurde mit βA Peptid, immobilisiert an Immobilon AV Scheiben, inkubiert, und die Scheiben wurden mit PBS gewaschen. Die Scheiben wurden dann mit Hirnflüssigkeit inkubiert und mit PBS (Bahnen 1, 2, 3) oder mit PBS und 6 M Guanidinhydrochlorid (Bahnen 4, 5, 6) gewaschen. Proteine, behalten von jeder Membran, wurden dann durch Sieden in Laemmli Puffer eluiert, und Albumin wurde mit Anti-Albumin Antikörper nach Elektrophorese und Western Transfer nachgewiesen.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Zum Untersuchen des Bindens verschiedener Proteine an das βA Peptid verwendeten die gegenwärtigen Erfinder einen zuvor entwickelten in vitro Assay, bei dem βA Peptid oder Fragmente davon kovalent an eine Membranmatrix immobilisiert sind. Siehe Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993). Unter Verwenden dieses Assays ist das Binden von Apolipoprotein E und Amyloidvorläuferprotein (APP) an synthetisches βA Peptid zuvor charakterisiert worden (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993); Strittmatter et al., Exper. Neurol. 122, 327 (1993).
  • Die gegenwärtige Erfindung basiert auf den Feststellungen, daß (1) IgG direkt und anziehend βA Amyloid bindet, (2) es die Domäne zwischen Aminosäuren 12-28 von βA ist, die IgG bindet, und (3) βA Peptid die Gelenkregion der Immunglobulin schweren Kette bindet, wodurch die Fähigkeit des Immunglobulins, Antigen zu binden, bewahrt wird. Der Ausdruck "Gelenkregion" wird hier verwendet, den Bereich der schweren Kette des Immunglobulin G Moleküls anzugeben, der zwischen den ersten und zweiten konstanten. Regiondomänen (CH1 und CH2) liegt. Siehe beispielsweise Goodman, Immunoglobulin Structure and Function, In: Stites and Terr (Herausgeber), Basic and Clinical Immunology, 7. Auflage, 1991, Appleton & Lange, Seite 110. Das Binden von IgG und βA wurde befunden, Dissoziation durch entweder Natriumdodecylsulfat oder Guanidinhydrochlorid zu widerstehen. Diese Feststellungen zeigen an, daß Proteine, die nicht direkt an βA Peptid binden, nichtsdestoweniger an das senile Amyloidplaque und die angiopathische Läsion durch Wechselwirkung mit IgG gebunden werden können.
  • Das senile Amyloidplaque und congophile angiopathische Läsion sind komplexe Strukturen, die viele Proteine enthalten; die Rekrutierung von Proteinen über die IgG-βA Peptidkopplung kann wichtig bei der Pathogenese der Krankheit sein. Die Amyloidkaskadenhypothese, diskutiert von Hardy & Higgins, Science, 256, 184 (1992) setzt voraus, daß Ablagerung von Amyloid β Protein das begründende Mittel von Alzheimer Pathologie ist, und daß die neurofibrillären Gewirre, Zellverlust, vaskuläre Schädigung und Dementia als ein direktes Ergebnis dieser Ablagerung folgen. Das Binden von IgG an βA liefert einen Sandwich Mechanismus für die Ablagerung anderer Plaquebestandteile bei Alzheimer Krankheit.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Amyloidplaque" oder "seniles Plaque" auf die extrazellulären Amyloidablagerungen, die ein charakteristisches Merkmal von Alzheimer Krankheit sind, und die aus einem Zentralkern von Amyloidfibrillen, umgeben von dystrophen Neuriten, axonalen Enden und Dendriten, Mikroglia und faserförmigen Astrozyten bestehen. Siehe D. Selkoe Neuron 6, 487-498 (1991). Der Amyloidplaque umgibt Blutgefäße unter Erzeugen der bei Alzheimer Krankheit festgestellten congophilen Angiopathie.
  • Die Feststellung, daß IgG fähig ist, beides zu binden, sein spezifisches Antigen und βA Peptid, stellt einen Mechanismus dar, durch den Proteine, die nicht direkt βA binden, an diese Strukturen über IgG gebunden werden können, und liefert ein Verfahren, nachweisbar die pathologischen Läsionen zu markieren, die bei Alzheimer Krankheit festgestellt werden. Derartiges Markieren kann beim Färben anatomischer Proben verwendet werden und beim Nachweisen pathologischer Läsion in situ. Allgemein, die gegenwärtige Erfindung liefert ein Mittel zum Liefern oder Binden einer antigenen Verbindung an das βA Peptid für irgendeinen Zweck, ob therapeutisch oder diagnostisch.
  • Irgendein Antikörper kann beim Durchführen der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden, so lange, wie er eine Gelenkregion, fähig zum Binden an das βA Peptid, hat. Die Bezeichnung "Antikörper" wie hier verwendet, bezieht sich auf alle Arten von Immunglobulinen, einschließlich IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, einschließlich der Fragmente davon. Die Bezeichnung "Immunglobulin" schließt die Unterarten dieser Immunglobuline ein, wie IgG&sub1;, IgG&sub2;, IgG&sub3;, IgG&sub4;, etc. Von diesen Immunglobulinen sind IgM und IgG bevorzugt, und IgG ist besonders bevorzugt. Die Antikörper können von irgendeiner Spezies von Ursprung sein, einschließlich (beispielsweise) Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd oder Mensch, oder können chimäre Antikörper sein. Siehe beispielsweise M. Walker et at, Molec. Immunol. 26, 403-11 (1989). Die Antikörper können monoklonale Antikörper sein. Derartige monoklonale Antikörper werden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken hergestellt. Die Bezeichnung "Antikörper", wie hier verwendet, schließt Antikörperfragmente ein, die die Fähigkeit behalten, an ein Zielantigen zu binden, beispielsweise F(ab')&sub2; Fragmente, und die entsprechenden Fragmente, erhalten von Antikörpern anders als IgG, behalten eine Gelenkregion und können bei der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden. Derartige Fragmente werden auch mittels bekannter Techniken hergestellt.
  • Die monoklonalen Antikörper können rekombinante monoklonale Antikörper sein, hergestellt gemäß den Verfahren, offenbart in Reading U.S. Patent Nr. 4 474 893 oder Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4 816 567. Die Antikörper können auch chemisch konstruiert werden durch spezifische Antikörper, hergestellt gemäß den Verfahren, offenbart ist Segel et al., U.S. Patent Nr. 4 676 980.
  • Monoklonale Antikörper können chimäre Antikörper sein, hergestellt in Übereinstimmung mit bekannten Techniken. Beispielsweise können chimäre monoklonale Antikörper Komplementarität bestimmende, Region-aufgepropfte Antikörper (oder "CDR-aufgepfropfte Antikörper") oder "humanisierte" Antikörper, hergestellt in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, sein. Siehe beispielsweise H. Waldmann, PCT Anmeldung WO 93/01289; M. Clark, PCT Application WO 92/16562; M. Bendig et al., PCT Anmeldung WO 92/15683; K. Tan, PCT Anmeldung WO 92/15699.
  • Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung Antigen-bindender Teil" eines Antikörpers den Teil des Antikörpers, der ein Antigen bindet, zu dem der Antikörper spezifisch ist. Eine bevorzugte. Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt Verwenden eines Fragments von IgG, das die Fc Region gelöscht hat, wie beispielsweise das F(ab)'&sub2; Fragment.
  • Wo es gewünscht ist, eine Verbindung zu binden, die nicht antigen zu dem Antikörper ist, jene Verbindung an das βA Peptid zu binden, kann jene Verbindung an den Antikörper durch direktes Mittel (beispielsweise kovalent) oder indirektes Mittel (beispielsweise über einen Chelator) mittels einer geeigneten Technik gebunden werden, wie das Iodogen Verfahren oder mit N-Succinimidyl-3-(tri-n- butylstanyl)benzoat (das "ATE Verfahren"), wie den Fachleuten offenkundig ist. Siehe beispielsweise M. Zalutsky und A. Narula, Appl. Radiat. Isot. 38, 1051 (1987).
  • Die an das βA Peptid zu bindende Verbindung kann eine nachweisbare Gruppe sein. Geeignete nachweisbare Gruppen schließen beispielsweise Radiomarkierungen (beispielsweise ³&sup5;S, ¹²&sup5;I, ¹³¹I), Enzymmarkierungen (beispielsweise Meerettichperoxidase, alkalische Phosphatasen) und Fluoreszenzmarkierungen (beispielsweise Fluorescein), wie in Übereinstimmung mit bekannten Techniken verwendet, ein.
  • Linkerantikörper, verwendet, die gegenwärtige Erfindung durchzuführen, mit oder ohne die daran gebundene zu liefernde Verbindung können in lyophylisierter Form in einem sterilen aseptischen Behälter zur Verfügung gestellt werden oder können in einer pharmazeutischen Formulierung zur Verfügung gestellt werden, wie in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie steriles Pyrogen-freies Wasser oder sterile Pyrogen-freie physiologische Kochsalzlösung.
  • Die Stufe des in Kontakt bringens des Linkerantikörpers mit dem β-Amyloidpeptid kann mithilfe irgendeines geeigneten Mittels durchgeführt werden. Das β-Amyloidpeptid kann in Nervengewebe innewohnen, und die in Kontakt bringen Stufe wird in Nervengewebe durchgeführt. Das Nervengewebe kann oder kann nicht in einem Patienten innewohnen, abhängig davon, ob das Verfahren für histologische, diagnostische oder therapeutische Zwecke durchgeführt wird. Wo die Technik auf einer Gewebeprobe für histologische Zwecke (beispielsweise Färben der congophilen Angiopathie) durchgeführt wird, kann sie durch in Kontakt bringen des Gewebes mit einer Lösung, typischerweise einer wäßrigen Lösung, enthaltend den Antikörper (beispielsweise durch Waschen des Gewebes mit der Lösung oder durch Eintauchen des Gewebes in die Lösung), durchgeführt werden.
  • Die Stufe von Binden der an den Antikörper zu liefernden Verbindung kann vor, während (d. h. gleichzeitig mit) oder nach der Stufe von in Kontakt bringen des Antikörpers mit dem β-Amyloidpeptid durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben. Die Bindungsstufe kann durch irgendeines der Mittel zum Durchführen der in Kontakt bringen Stufe, wie zuvor beschrieben, durchgeführt werden.
  • Für Verabreichung an eine Person wird der Antikörper im allgemeinen, vor Verabreichung mit einer nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz (beispielsweise normale physiologische Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung) gemischt und wird unter Verwenden eines angemessenen Verfahrens verabreicht, beispielsweise intravenöse oder intra-arterielle Verabreichung, Einspritzung in die Hirnflüssigkeit. Zusätzlich sind entweder intrathekale Verabreichung oder Einspritzung in die Halsschlagader vorteilhaft für Therapie von in dem Gehirn angeordneten Tumoren.
  • Dosierung des Antikörpers hängt unter anderen Dingen von dem Verabreichungsweg, der Natur der an das βA Peptid gebundenen Verbindung, etc. ab. Beispielsweise wird die Dosierung typischerweise etwa 1 bis 10 Mikrogramm pro Kilogramm Personenkörpergewicht sein.
  • Der Mechanismus, durch den die Gelenkregion von IgG βA Peptid bindet, stellt auch die Gelegenheit dar, Verfahren zu ersinnen, spezifisch und selektiv diese Wechselwirkung blockieren, und Verfahren zum Liefern von therapeutischen Molekülen an das Amyloidplaque. Ein therapeutisches Proteinmolekül wird zu dem Amyloidplaque geliefert durch Erhöhen von IgG, spezifisch für das therapeutische Molekül, dann Binden des therapeutischen Moleküls an das Immunglobulin (oder ein Fragment davon) und Liefern dieser Konstruktion zu dem Bereich von pathologischer βA Peptidablagerung. Alternativ könnte das Immunglobulin zuerst mit dem βA Peptid in Kontakt gebracht werden und dann dem therapeutischen Molekül ausgesetzt werden, oder diese Stufen können gleichzeitig durchgeführt werden. Konjugate von IgG und therapeutische Proteinmoleküle können hergestellt werden unter Verwenden einer Mannigfaltigkeit von bifunktionellen Proteinkopplungsmitteln, wie in der Technik bekannt.
  • Die gegenwärtige Erfindung ist auch zum Blockieren der pathologischen Ablagerung von Proteinen geeignet, die an das β-Amyloidpeptid über IgG binden, zur Verfügung stellen eines Verfahrens zum Bekämpfen von Krankheiten, in denen abnormale Proteinablagerung auf βA Peptid auftritt. Ein derartiges Verfahren würde einschließen Inhibieren des Bindens von IgG an βA Peptid durch in Kontakt bringen mit dem βA Peptid ein Fragment von IgG, fähig an das βA Peptid zu binden, aber unfähig zum Binden anderer Proteine, beispielsweise ein Fragment von IgG, umfassend die Gelenkregion, aber dem es an dem Antigen-bindenden Teil des Antikörpers fehlt.
  • Die gegenwärtige Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen in bezug auf die Fähigkeit, die IgG-βA Peptidwechselwirkung zu blockieren. Allgemein, ein Durchmusterungsverfahren schließt ein zur Verfügung stellen einer wäßrigen Lösung, enthaltend βA Peptid oder ein Fragment davon, Hinzufügen zu dieser wäßrigen Lösung eine Testverbindung, von der man vermutet, IgG Binden zu inhibieren, dann Hinzufügen von IgG zu der wäßrigen Lösung und dann Nachweisen des Vorhandenseins von Fehlen von gebundenem IgG. Eine andere Ausführungsform dieses Verfahrens würde eine βA Peptidkonstruktion, immobilisiert auf einem festen Träger, wie zuvor beschrieben, verwenden (siehe Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993); auch offenbart in schwebender Patentanmeldung SN 07/959, 251, angemeldet 13. Oktober 1992). Nachweis von gebundenem IgG kann durchgeführt werden unter Verwenden von Antikörpern mit angefügten Nachweisgruppen oder durch irgendein geeignetes Mittel, wie Färben, Affinitätsbinden, konkurrierender Bindungsassay, etc., wie in der Technik bekannt sind. Das β-Amyloidpeptidfragment, verwendet in den zuvor beschriebenen in vitro Assays, könnte umfassen βA(1-28) oder βA(12-28), obwohl andere Fragmente, die IgG binden, auch verwendet werden können.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt unter Veranschaulichen der gegenwärtigen Erfindung und sollten nicht als beschränkend davon konstruiert sein. In diesen Beispielen bedeutet PBS phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung; CSF bedeutet Hirnflüssigkeit; SDS bedeutet Natriumdodecylsulfat; M bedeutet molar; mM bedeutet millimolar; mg bedeutet Milligramm; ug bedeutet Mikrogramm,; ng bedeutet Nanogramm; ml bedeutet Milliliter; ul bedeutet Mikroliter; und ºC bedeutet Grad Celsius.
    • BEISPIEL 1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Affinitätsgereinigte Human IgG und IgG Fragmente (Fab, Fc und F(ab)'&sub2;) wurden von Cappel- Organon Teknika, Durham, N. C. gekauft. Peroxidase-konjugierte Ziegen-Antikörper zu Human IgG (schwere und leichte Ketten) wurden von Pierce, Rockford, IL. gekauft. Schaf-Anti-Human-Serum- Albumin (HSA) IgG, Schaf-Anti-Ferritin IgG und Peroxidase-konjugiertes Schaf IgG gegen Humansenimalbumin wurden von The Binding Site, Ltd., San Diego, CA. gekauft. βA Peptide (βA(1-40), βA(125) und βA(12-28) wurden von Bachem, Torrance, Kalifornien, US erhalten. Die Synthese von Peptiden E. H. ("Gleich-Hydro", wie im nachfolgenden erklärt) und H. M. ("Hydro-Schein, wie im nachfolgenden erklärt) sind zuvor beschrieben worden (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993)). Humanhirnflüssigkeit (CSF) von diagnostischen Lumbalpunktionen wurde von der Kathleen Bryan Brain Bank am Duke University Medical Center, Durham, NC. erhalten.
  • βA Peptide, andere Peptide oder Ethanolamin wurden kovalent an 13 mm Immobilon AV Affinitätsmembran-(Millipore) Scheiben, wie zuvor beschrieben, mit 100 ug Peptid gebunden. Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993). Die Membran ist eine chemisch aktivierte hydrophile mikroporöse Membran, die kovalent Peptide und Proteine durch Amino- und Thiolgruppen immobilisiert.
    • BEISPIEL 2 BINDEN VON IGG AN IMMOBILISIERTE PEPTIDE
  • Zum Charakterisieren des Bindens von Immunglobulinen an ausgewählte immobilisierte Peptide wurden affinitätsgereinigte Human IgG (0,3 ng), Fab (0,45 ng), Fc (0,15 ng) oder F(ab)'&sub2;(0,45 ng) in 150 ul PBS, pH 7,4 mit immobilisiertem βA(1-28) Peptid, anderen Peptiden oder mit Ethanolamin bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Membranen wurden in einem Millexfilterhalter (Millipore) mit 3,0 ml PBS gewaschen, gefolgt von 700 ul 10% Natriumdodecylsulfat (SDS). Behaltene Proteine wurden dann von den Membranen durch Sieden 5 Minuten in 150 ul Laemmli mit β-Mercaptoethanol eluiert. 45 ul von jeder Probe wurden auf ein 12% Polyacrylamidgel geladen. Elektrophorese und Western Transfer wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993)). Die Western Transfermembran wurde mit 40 ml Blotto (5% getrocknete Milch in Tris gepufferter physiologischer Kochsalzlösung pH 7,6) mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur eine Stunde lang blockiert. Die Membran wurde mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörper, der sowohl schwere wie leichte Ketten erkennt (verdünnt 1 : 4000 in Blotto), bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Membran wurde viermal mit 20 ml Blotto gespült und wurde dann dreimal mit 40 ml Blotto fünf Minuten lang gewaschen. Antikörper wurde sichtbar gemacht unter Verwenden eines Verstärkungschemilumineszenznachweiskits (Amersham) und Aussetzen der Membran Hyperfilm (Amersham), wie zuvor beschrieben (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1977 (1993)).
  • Ergebnisse: Gereinigtes IgG wurde befunden, direkt an βA(1-28) Peptid zu binden, und Binden erforderte die Gelenkregion der schweren Kette. Wie in Fig. 1, Feld 1 gezeigt, bindet gereinigtes IgG an immobilisiertes βA(1-28) Peptid und bindet nicht an die Ethanolamin-blockierte Kontrollmembran. Verschiedene Domänen des Immunglobulinmoleküls wurden in bezug auf Binden an immobilisiertes βA Peptid untersucht. Fab (Felder 2 und 4) und Fc (Feld 3) binden nicht an βA(1-28) Peptid. F(ab)'&sub2;, enthaltend die Gelenkregion der schweren Kette, band an immobilisiertes βA(1-28) Peptid (Feld 5). Zum weiteren Charakterisieren der Avidität von βA Peptid Binden wurde F(ab)'&sub2; mit immobilisiertem βA(1-28) oder mit immobilisiertem Ethanolamin (Fig. 2A) inkubiert, mit PBS (Bahn 1) gewaschen und dann gefolgt von 10% SDS (Bahn 2), 4 M Harnstoff (Bahn 3) oder 6M Guanidinhydrochlorid (Bahn 4). Das F(ab)'&sub2;, das an βA(1-28) band, wurde nicht durch Harnstoff eluiert und wurde nur teilweise durch SDS oder Guanidinhydrochlorid eluiert. Ähnliche Ergebnissse wurden mit IgG in CSF, gezeigt in Fig. 2B, erhalten. Inkubation von Hirnflüssigkeit, die IgG enthält, mit immobilisiertem βA(1-28) oder mit immobilisiertem Ethanolamin und gewaschen unter den Bedingungen, gezeigt in Fig. 2A, zeigte, daß Hirnflüssigkeit (CSF) IgG begierig βA(1-28) band. In einer vorhergehenden Untersuchung untersuchte Pardridge et al. (1987) Humanhirnflüssigkeit in bezug auf Protein, immunreaktiv mit einem Antikörper gegen synthetisches βA(12-28), und zeigte daß CSF. IgG durch diesen Antikörper identifiziert wurde, entweder Kreuzreaktivität oder das Vorhandensein von βA Ppetid auf IgG vorschlagend.
  • Sowohl IgG wie F(ab)'&sub2; binden mit hoher Avidität an βA Peptid voller Länge (βA&sub1;&submin;&sub4;&sub0;). Wie in Fig. 3 veranschaulicht, band affinitätsgereinigtes IgG an βA(1-28), βA(1-28) und βA(12-28). Somit erfordert das Binden Aminosäuren 12-28 von βA. Peptid H. M. ("Hydro-Schein" Peptid) ist ein 17 Aminosäurenpeptid mit einem Hydropathieprofil ähnlich zu βA(12-28), aber mit verschiedenen Aminosäuren, während Peptid E. H. ("Gleich-Hydro" Peptid) ein 17 Aminosäurenpeptid ist, das die gleichen Aminosäuren wie βA(12-28) aber mit einer ausgebreiteten Sequenz enthält (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 90, 1977 (1993)). IgG band an Peptid H. M. aber band nur minimal an Peptid E. H. Fig. 3. Ähnliche Ergebnisse wurden mit gereinigtem F(ab)'&sub2; (Daten nicht gezeigt) erhalten. Das Fehlen von Binden von IgG und F(ab)'&sub2; an die ausgebreitete Aminosäurensequenz von Peptid E. H. schlägt einen bestimmten Grad von Spezifität von Wechselwirkung vor. Weil IgG und F(ab)'&sub2; an Peptid H. M. banden, das das gleiche hydropathische Profil wie βA(1228) hat, kann Binden spezifische sterische, hydrophobe oder Ladungswechselwirkungen erfordern.
  • Diese Untersuchungen zeigen, daß IgG direkt und begierig an βA Peptid bindet, daß die Gelenkregion der schweren Kette für Binden benötigt wird, und daß Binden Aminosäuren 12-28 von βA benötigt. Mit βA, gebunden an die Gelenkdomäne, bleibt der Antigen-Bindungsteil von IgG frei, mit anderen Antigenen in Wechselwirkung zu treten.
    • BEISPIEL 3 BINDEN VON IGG-ANTIGEN PAAREN AN βA PEPTID
  • Untersuchungen, die das Binden von IgG an sowohl Antigen wie βA(1-28) untersuchen, wurden durch Inkubieren von 1,0 ul Hirnflüssigkeit (die Albumin enthält) mit entweder 0,5 mg Schaf-Anti- Human-Serum-Albumin-(Anti-HSA) Antikörper oder Schaf-Antiferritin-Antikörper (Kontrolle) in 150 ul PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Mischungen wurden dann 30 Minuten mit entweder immobilisiertem βA(1-28) Peptid oder immobilisiertem Ethanolamin (Kontrolle) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden zuerst mit 3,0 ml PBS gewaschen, gefolgt von 1,0 ml 6 M Guanidinhydrochlorid und 2,0 ml PBS. Die behaltenen Proteine wurden dann durch Sieden fünf Minuten in 150 ul Laemmli Puffer eluiert. Proteine wurden dann Elektrophorese ausgesetzt und auf Immobilon P Membran übertragen, wie zuvor beschrieben. Die Western Transfer Membran wurde mit Peroxidasekonjugiertem Schaf Anti-HSA Antikörper (1 : 10 000 Verdünnung in Blotto) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach Waschen der Membranen, wie zuvor beschrieben, wurde immunmarkiertes Albumin durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Alle Experimente, gezeigt in Fig. 4 und 5, sind mindestens einmal wiederholt worden (Duplikatdaten nicht gezeigt).
  • Um zu testen, ob IgG ein Antigen an das senile Plaque liefern kann durch erstes Binden seines spezifischen Antigens und dann Binden an βA Peptid, wurde die Fähigkeit von Albumin, direkt an Peptid zu binden und indirekt an βA Peptid durch Anti-Albumin IgG zu binden, untersucht. Wie in Fig. 4, Feld 1 gezeigt, wurde Albumin in Hirnflüssigkeit schwach an beides, immobilisiertes βA Peptid oder an Ethanolamin-gebundene Kontrollmembranen, gebunden. Hirnflüssigkeit wurde dann zuerst mit entweder einem Anti-Albumin IgG oder mit einem Anti-Ferritin IgG (als eine Kontrolle) inkubiert und wurde dann mit immobilisiertem βA Peptid inkubiert. Vor Inkubation mit Anti-Albumin erhöhte IgG bemerkenswert die Menge von Albumin, gebunden an das immobilisierte βA Peptid (Fig. 4, Feld 4) im Unterschied zu Vorinkubation mit der Anti-Ferritin IgG Kontrolle (Fig. 4, Feld 5). Keiner der Antikörper war in bezug auf Albumin (Fig. 4, Felder 2 und 3) immunreaktiv, und beide Antikörper banden gleich gut an immobilisiertes βA Peptid (Daten nicht gezeigt).
  • Diese Untersuchungen zeigen, daß Albumin, das schwach an βA Peptid bindet, auf βA Peptid über IgG zielgerichtete werden kann.
    • BEISPIEL 4 BINDEN VON ANTIGEN AN IGG-βA PEPTIDPAARE
  • Die folgenden Experimente zeigen, daß IgG, gebunden an βA(1-28) Peptid, Antigen noch erkennen und binden kann. Sowohl Anti-Albumin IgG wie Anti-Ferritin IgG wurden zuerst an immobilisiertes βA(1- 28) Peptid gebunden, und wurden dann mit Hirnflüssigkeit inkubiert. Das Anti-Albumin IgG fuhr fort, Albumin zu binden (Fig. 5, Bahnen 2 und 5), wohingegen der Anti-Ferritin Antikörper es nicht tat (Fig. 5, Bahn 3 und 6). Das Binden von Albumin an βA Peptid über spezifisches IgG wurde selbst nach Waschung mit 6 M Guanidinhydrochlorid (Fig. 5, Bahn 5) beibehalten.
  • Daten in Fig. 4 und 5 zeigen, daß IgG fähig zu hoher Aviditätsbindung an Antigen und an βA Peptid gleichzeitig ist, und daß die temporale Sequenz von Wechselwirkung nicht wichtig ist.

Claims (20)

1. Verwendung eines Linkerantikörpers mit einer Gelenkregion, fähig zum Binden an Amyloidpeptid, und einer Bindungsstelle, fähig zum Binden einer Verbindung, ausgewählt aus einer nachweisbaren Gruppe oder therapeutischem Molekül, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Diagnose oder Behandlung von Alzheimer Krankheit.
2. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Fc Rezeptorregion des Linkerantikörpers gelöscht ist.
3. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei der Linkerantikörper ein Antikörper F(ab')&sub2; Fragment ist.
4. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine nachweisbare Gruppe ist.
5. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus der Gruppe, bestehend aus Radiomarkierungen, Enzymmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen und therapeutischen Molekülen, ausgewählt ist.
6. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Bindungsstufe vor der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird.
7. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Bindungsstufe nach der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird.
8. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die Bindungsstufe gleichzeitig mit der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird
9. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei das β-Amyloidpeptid in Nervengewebe innewohnt, und die in Kontakt bringen Stufe wird in Nervengewebe durchgeführt.
10. Verwendung eines Linkerantikörpers nach Anspruch 1, wobei die in Kontakt bringen Stufe in vitro durchgeführt wird.
11. In vitro Verfahren zum Binden einer Verbindung an das β-Amyloidpeptid, umfassend:
in Kontakt bringen eines Linkerantikörpers mit einer Gelenkregion an β-Amyloidpeptid, so daß die Gelenkregion an das β-Amyloidpeptid bindet, und
Binden der Verbindung an den Antikörper, so daß die Verbindung an das β-Amyloidpeptid gebunden wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Fc Rezeptorregion des Linkerantikörpers gelöscht wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Linkerantikörper ein Antikörper F(ab')&sub2; Fragment ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindung eine nachweisbare Gruppe ist.
15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindung aus der Gruppe, bestehend aus Radiomarkierungen, Enzymmarkierungen und Fluoreszenzmarkierungen, ausgewählt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bindungsstufe vor der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bindungsstufe nach der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bindungsstufe gleichzeitig mit der in Kontakt bringen Stufe durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das β-Amyloidpeptid in Nervengewebe innewohnt, und die in Kontakt bringen Stufe in Nervengewebe durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren ein diagnostisches Verfahren ist.
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