JP4818917B2 - 腫瘍および罹患細胞のアポトーシスを誘発するための二重特異性抗体 - Google Patents

Description

関連出願

本出願は、2003年8月8日出願の米国仮出願番号第60/493,365号明細書に基づく優先権を主張するものであり、上記明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

発明の背景

発明の分野
本発明は、二重特異性抗体であって、その結合する罹患細胞の増殖を阻害しかつその優先的アポトーシスを誘発しうるものに関する。特に、本発明は、少なくとも二つの結合アームを有し、エフェクター細胞の補充を必要とせずに罹患細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘発するヘテロ接合体であって、第一の結合アームが第二の結合アームと異なる特異性を有し、第一および第二の結合アームが互いに接合されていない状態ではアポトーシス活性を持つ必要がない、ヘテロ接合体に関する。本発明はまた、本発明による二重特異性抗体を用いる罹患細胞の治療および診断方法に関する。

背景技術
様々な抗体が、(1)補体を結合(補体依存性細胞傷害、CDCと呼ばれる)、(2)エフェクター細胞を補充(抗体依存性細胞傷害、ADCCと呼ばれる)、または(3)アポトーシス誘発するというそれらの能力によって、それらが結合する癌細胞を破壊するのに有用であることが見出されてきた。

完全かつ未接合のモノクローナル抗体(MAb)においては、イン・ビボでの抗腫瘍活性が、上記した主要な作用機構の一つまたは組合せから生じることがある。CDCとADCCはいずれもMAbのFc部分を必要とし、ADCCの効果はエフェクター細胞上のFcγR(IgG Fc受容体)への結合親和性を増加させることによって増加することができる(Shinkawa, et al., J. Biol. Chemu. 278:3466-3473, 2003; Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2002; Davies et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001; およびUmana et al., Nature Biotechnol. 176-180, 1999)。

MAbのいくつかは、負のシグナルによってアポトーシスを誘発することができる(Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7509-7514, 1997;および米国特許第6,368,596 B1号明細書)。負のシグナルは、Ghetie et al.によって定義されるように、細胞サイクルの拘束またはアポトーシス(プログラミングされた細胞死)の誘発による細胞増殖の阻害である。これらの抗体の例としては、Levy, R. et al.によって報告された抗イディオタイプ抗体(J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 10:61-68, 1990)および抗CD19 MAb(Hamblin, T. J. et al., Br. J. Cancer 42:495-502, 1980)が挙げられる。

負のシグナルを調節するT細胞抗体の例としては、T細胞活性化関連抗原CD147に対する抗体が挙げられる。この抗体は、TCR刺激依存性再組織化およびマイクロドメインのクラスター化を防止することが報告されている。マイクロドメインの妨害に続いて、TCRを介したT細胞増殖が選択的に阻害される。Staffer, G. et al., J. Immunol. 171(4) 1707-1714, 2003を参照されたい。

このようなシグナル機構によってアポトーシスを誘発するMAbの潜在能力は、いくつかの因子、すなわち(1)それが結合する特異的細胞表面抗原、(2)そのような抗原を発現する細胞の性質、(3)抗体-抗原結合相互作用の強さ、および(4)抗体が抗原と交差反応する能力に依存しているものと思われる。

結合時に標的細胞上で測定可能なアポトーシス効果を全く示さない抗B細胞MAbは、抗CD19および抗CD22抗体(Chaouchi et al., J. Immunol. 154:3096-3104, 1995)、抗CD20抗体(Shan et al., Blood 91:1644-1652, 1998; Pedersen, et al., Blood 99:1314-1319, 2002; Cardarelli et al., Cancer Immunol. Immunother. 51:15-24, 2002、およびMimori et al., Leukemia 17:1164-1174, 2003)、抗CD24抗体(Suzuki et al., J. Immunol., 166:5567-5577, 2001)、および抗CAPATH-1(CD52)抗体(Rowan et al., Immunol. 95:427-36, 1998)について示されているように、架橋第二抗体と十分に凝集するときには細胞自殺を再現可能に刺激することができる。

アポトーシス効果をほとんどまたは全く示さない二価MAbは、Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7509-7514, 1997; Ghetie et al., Blood 97:1392-1398, 2001; および米国特許第6,368,596 B1号明細書に示されるように、化学的架橋によって四価のホモ二量体に転換されると強力な抗腫瘍薬となり得る。この活性はMAbが結合する細胞表面抗原によって変化し、Fc部分または第二抗体による追加架橋を必要としない。例えば、Ghetie et al.(1997および2001)は、抗CD19、抗CD20、抗CD21および抗CD22のようなホモ二量体化したモノクローナル抗体は、いくつかのイン・ビトロの腫瘍性B細胞系で、それらのモノマー対照物より優れた抗増殖およびアポトーシス誘発特性を有することを明らかにした。さらに、モノマーとは対照的にF(ab')₂またはIgGホモ二量体を投与したところ、腫瘍細胞は化学療法薬に一層感受性となり、イン・ビトロにおいて抗CD22免疫毒素との相乗作用を示した。米国特許第6,368,596 B1号明細書に開示されているように、IgGまたは他の誘導体のヘテロ二量体の使用は記載されているが、実施例または特許請求の範囲にはこのようなヘテロ二量体の使用は包含されていない。

Uhr et al.は、米国特許第5,686,072号明細書において、散在性のヒトDAUDIリンパ腫を有するSCID-DAUDIマウスにおける抗CD22および抗CD19免疫毒素の混合物の抗腫瘍活性が、有意に高められることを開示している。抗CD19による細胞増殖の阻害には、架橋が必要であり、CD19抗体のアフィニティーによって変化する。

また、三つ以上の機能的抗原結合部位(FabまたはScFv)を有し、Fc部分を有しまたは有しない、遺伝子工学処理を施した抗体を、IgGのホモ二量体を模倣する目的で構築したところ、さらなる架橋を必要とせずにアポトーシスを誘発することを示した(Miller et al., J. Immunol. 170:4854-4861, 2003、およびWO 01/77342 A1号明細書)。

ホモ二量体としてまたは第二抗体の連結によるさらなる架橋を必要とせずに、二価の抗Her2 MAb (MAb74)がアポトーシスを誘発することが報告されていることは注目される(米国特許第6,458,356 B1号明細書)。抗CD20 MAb (トシツモマブ(tositumomab)またはB1)は、さらなる架橋を必要とせずに、二価のIgGまたはF(ab')₂としてアポトーシスを誘発することができる(Cardarelli, et al., Cancer Immtunol. Immunother. 51: 15-24, 2002)。

Nakamura et al.は、Fcドメインと架橋することによりIgEの産生を阻害する抗CD23 Mab(P5E8)を報告している(Nakamura T. et al., Int. J. Immunopharmacol, 22(2):131-41, 2000)。p5E8および抗CD20キメラ抗体(C2B8またはリツキサン(rituxan))のヘテロ二量体は、CD20/CD23陽性リンパ腫細胞系であるDHL-4およびSKWの増殖を阻害し、アポトーシスを誘発することが報告された(Reff et al., Cancer Control, 9: 152-166,2002)。

抗Dr/CD2二重特異性抗体は、T記憶細胞を抗原提示細胞に架橋することができる。この二重特異性抗体は、抗体(MEDI-507)またはFc-CD2リガンド(Amevive)をCD2にターゲッティングしてT細胞のアポトーシスを生じさせることによって乾癬患者のCD2+記憶T細胞を殺すことができ、Fc架橋(NK細胞またマクロファージを介する)を必要とする。Zhang, Z. et al., Blood 102(1):284-8, 2003; Branco, L. et al., Transplantation 68(10):1588-96, 1999;およびKrueger, G. G. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 49(2S):S87-97, 2003を参照されたい。

二重特異性抗体(BsAb)は、その二つの結合アームで、2種類の異なる抗原を認識するようにデザインされている。腫瘍抗原やエフェクター分子をターゲッティングするBsAbは、前臨床および臨床研究のいずれでも、イン・ビボでの癌の検出および治療に良好に用いられてきた。例えば、抗腫瘍x抗ハプテンBsAbと、臨床的に有用な放射性同位体を標識した二価ハプテンとを用いるアフィニティーエンハンスメント・システム(AES)は、標的腫瘍での放射能の濃縮に極めて効果的であり、極めて高い腫瘍/非腫瘍比を有する。米国特許第5,256,395号明細書をを参照されたい。この特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。腫瘍抗原に結合するBsAb、および白血球の細胞表面上の誘発分子、例えば、NK細胞上のCD16 (FcγRIII)または細胞傷害性T細胞上のCD3は、標的腫瘍細胞のリーシスを媒介することができる。癌療法におけるBsAbの他の応用としては、標的抗原を発現する腫瘍細胞へ細胞傷害性薬剤または毒素を局在化させることが挙げられた。2種類のMAbのカクテルを異なる抗原に対して用いる治療的介入によって癌を治療することも意図されており、抗CD22ヒト化IgG1(hLL2)およびリツキシマブ(Rituximab)(抗CD20マウス-ヒトキメラ抗体)を用いる非ホジキンリンパ腫(NHL)の臨床試験で評価が行われ、有望な結果が得られている。しかしながら、同一標的細胞上の2種類の異なる抗原に結合するBAbの細胞傷害性は、本発明の発見までは明らかにされてこなかった。B細胞の悪性疾患および自己免疫疾患の治療を目的とした抗CD19、抗CD20、および抗CD22抗体の組合せから誘導される二重特異性または多重特異性構築物の使用が、WO 00/67795 A1号明細書、WO 00/74718 A1号明細書、および米国特許公表第20020041847号明細書および第20030133930号明細書に提案されており、上記特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

3種類のヒトバーキットリンパ腫細胞系(ラージ、ダウディ、およびラモス)に対する3種類のヒト化抗体、hLL2(抗CD22)、hLL1(抗CD74)およびhA20(抗CD20)の細胞障害効果を、CDCおよびADCCの可能性を除外する条件下で評価した(Qu, et al.,未発表実験結果)。これまでに得られた結果は、溶液における全IgGとして検討したときには3種類の抗体はいずれも測定可能な毒性を示さないことを示している。架橋抗体(ヤギ抗ヒトFc)の存在下、3種類総ての細胞系における増殖阻害およびアポトーシスをhLL1およびhA20について観察したが、hLL2については行わなかった。ELISAプレート上にhLL2を固定したところ、ラモス(他の2種類の細胞系は試験していない)の増殖阻害およびアポトーシスが誘導されたが、同様な条件下で他の2種類の抗体を固定したところ、細胞傷害性を示さなかった。

治療用の二重特異性結合タンパク質、好ましくはFc領域を持たず、しかも罹患細胞(例えば、腫瘍細胞または他の細胞)の増殖阻害をもたらしかつアポトーシスを誘発し、さらに一層好ましくはエフェクター細胞の補充を必要としないヘテロ接合体形態を提供することが求められている。また、比較的低用量で有効でありかつ細胞傷害性が減少し、アビディティーが増加し、良好なバイオアベイラビリティーを有するタイプの治療用の二重特異性抗体を提供することも依然として必要とされている。

発明の概要

本発明の一態様によれば、二つの結合アームを少なくとも含み、罹患細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘発し、エフェクター細胞の補充を必要としない、ヘテロ接合体が提供される。第一の結合アームは第二の結合アームと異なる特異性を有し、結合アームのそれぞれが互いに接合されていない状態では、アポトーシス活性を有する必要がない。結合アームは、抗体またはその断フラグメント片でよい。これらのアームは、化学接合によってまたは融合タンパク質として、連結していてもよい。ヘテロ接合体がアポトーシスを誘発する方法は用量依存的であり、ヘテロ接合体が互いに架橋することを包含しない。

本発明の他の態様によれば、ヘテロ接合体はイン・ビトロにおいて0.1μg/mL - 20μg/mLの用量範囲で用いることができ、成人患者では、これは約0.5mg/kg - 15mg/kgの用量範囲で用いることができる。

本発明の一態様によれば、第一および第二の結合アームは、CD2、CD3、CD8、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD45Ro、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、 HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas (CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-Bフィブロネクチン、テネイシン、PSMA、PSA、カルボニックアンヒドラーゼIX、およびIL-6をターゲットとする結合アームからなる群のいずれかから選択することができる。第一の結合アームは、リンパ腫または固形腫瘍と関連したヒト腫瘍ターゲットに特異的に結合する。

本発明においては、二価のFab' x Fab'構造を有する二重特異性抗体を意図している。これらのヘテロ接合体の例としては、抗CD22 x 抗CD20、抗CD20 x 抗HLA-DR、抗CD19 x 抗CD20、および抗CD20 x 抗CD80、抗CD2 x 抗CD25、抗CD8 x 抗CD25、および抗CD2 x 抗CD147が挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては、三つ以上の抗原に結合する多重特異性ヘテロ接合体の態様も包含する。

また、本明細書においては、二つの結合アームを少なくとも含むヘテロ接合体の治療上有効量を治療を、必要とする被検体に投与することを含んでなる疾患の治療方法であって、
(i)第一の結合アームが第二の結合アームと異なる特異性を有し、
(ii)ヘテロ接合体が罹患細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘発し、エフェクター細胞の補充を必要とせず、
(iii)第一および第二の結合アームが、互いに接合されていない状態では、アポトーシス活性を有する必要がない方法が提供される。

また、被検体における罹患細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘導することを含む改良された、疾患の治療方法であって、二つの結合アームを少なくとも含む、ヘテロ接合体を投与することを含んでなり、
(i)第一の結合アームが第二の結合アームとは異なる特異性を有し、
(ii)ヘテロ接合体が罹患細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘発し、エフェクター細胞の補充を必要とせず、
(iii)第一および第二の結合アームが互いに接合されていない状態では、アポトーシス活性を持つ必要がない、方法も提供される。

被検体は、ヒトまたは動物でよい。疾患は、例えば、B細胞関連疾患、T細胞関連疾患、免疫調節異常疾患(immune dysregulation disease)、急性または慢性炎症性疾患、固形癌、造血腫瘍、代謝病、神経変性疾患、または自己免疫疾患であることができる。具体例としては、癌、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫および皮膚癌が挙げられる。癌としては、皮膚癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、腎臓癌、副腎癌および肝臓癌が挙げられる。典型的なB細胞関連疾患としては、ヒトおよび動物の疾患が挙げられ、緩徐進行性のB細胞リンパ腫、侵襲性のB細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。T細胞関連疾患としては、ヒトまたは動物のT細胞白血病、皮膚乾癬、乾癬性関節炎または菌状息肉腫が挙げられる。

他の疾患としては、アミロイドーシスのような代謝病、アルツハイマー病のような神経変性疾患、および急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎(post-streptococcalnephritis）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgAネフロパシー、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ(tabes dorsalis）、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または繊維化性肺胞炎のような自己免疫疾患が挙げられる。

他の疾患としてはまた、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、慢性気管支炎、喘息、気腫、筋炎または多発性筋炎のような急性または慢性炎症性疾患、および移植片対宿主病、臓器移植片拒絶疾患、悪液質、アテローム性動脈硬化症および敗血症のような免疫調節異常疾患が挙げられる。

本発明の他の態様は、医薬として適当なキャリアーと、二つの結合アームを少なくとも含むヘテロ接合体の治療上有効量とを含んでなる医薬組成物であって、
(i) 第一の結合アームが第二の結合アームとは異なる特異性を有し、
(ii)ヘテロ接合体が罹患細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘発し、エフェクター細胞の補充を必要とせず、
(iii)第一および第二の結合アームが、互いに接合されていない状態ではアポトーシス活性を有する必要がない、医薬組成物である。

本明細書においてはまた、少なくとも二つの結合アームを含むヘテロ接合体の治療上有効量を、治療を必要とする被検体に投与することを含んでなる乾癬の治療方法であって、
(i)第一の結合アームが第二の結合アームとは異なる特異性を有し、
(ii)ヘテロ接合体が罹患細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘発し、エフェクター細胞の補充を必要とせず、
(iii)第一および第二の結合アームが、互いに接合されていない状態では、アポトーシス活性を有する必要がない、方法も意図される。

本発明による乾癬の治療に有用な典型的なヘテロ接合体は、二価のFab' x Fab'構造を有する二重特異性抗体である。これらのヘテロ接合体としては、抗CD2 x 抗CD25、抗CD8 x 抗CD25、および抗CD2 x 抗CD147が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の他の態様としては、薬学上許容可能なキャリアーおよび上記のようなヘテロ接合体を含んでなる診断組成物を、被検体に投与することを含んでなる疾患の診断方法が挙げられる。

発明の具体的説明

特に断らない限り、単数への言及は1以上を表す。
本発明は、腫瘍細胞の測定可能な増殖阻害およびアポトーシスを用量依存的に引き起こすヘテロ接合体を提供する。この効果は0.1μg/mL程度の濃度で検出することができ、当該技術分野で開示されたものに匹敵する。

本発明はまた、標的リンパ腫細胞でアポトーシスを誘発することが明確に示されているFab' x Fab'構造の形態の二価の二重特異性抗体抗CD22 x 抗CD20の使用を提供する。二価の二重特異性抗体は、その抗腫瘍増殖および抗アポトーシス効果がエフェクター細胞の補充を必要としない点で腫瘍アポトーシスを誘発することができる既知の二重特異性抗体(例えば、CD19 x CD3およびCD30 x CD16 (NK細胞)）とは異なる。

本発明の発明者らは、ヘテロ接合体の形態でありかついくつかのB細胞表面抗原に対する二重特異性抗体が、腫瘍細胞において増殖阻止とアポトーシスを誘発する機構を検討してきた。さらに重要なことには、本発明者らは、Fab' x Fab'形態の二価の二重特異性抗CD22 x 抗CD20抗体(hLL2 x hA20)を用いることによって標的リンパ腫細胞にアポトーシスを誘発することができることを明らかにした。hLL2 Fab'とhLL1 Fab' (hLL2 x hLL1)またはhA20 Fab'とhLL1 Fab' (hA20 x hLL1)を連結することによって調製した他の二重特異性接合体は、hLL2 x hA20に匹敵する細胞傷害性を示さなかった。

これらの二価の二重特異性抗体はまた、標的抗原を発現する罹患細胞に対して同様なアポトーシス効果を発揮することができる。例としては、B細胞、例えば、自己免疫疾患において刺激されたB細胞、T細胞、および急性および慢性炎症および移植片対宿主病、臓器移植片拒絶疾患、悪液質、敗血症などの免疫調節異常疾患に寄与するマクロファージおよび樹状細胞が挙げられる。アテローム性動脈硬化症も、潜在的な炎症工程を有すると考えられてきた。例えば、Chen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. Apr; 24(4):709-14 Epub Jan 29 2004; Lolis et al., Expert Opin Ther Targets. 7:153-64 (2003); Lue et al., Microbes Infect. Apr; 4:449-60 (2002)を参照されたい。

以下の説明では、本発明の理解を容易にするために、多数の用語を用い、下記の定義を提供する。
「アポトーシス」という用語は、DNAの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞の断片化、および/または膜小胞(アポトーシス体と呼ばれる)を特徴とするプログラミングされた細胞死を表す。例えば、ホスファチジルセリン(PS)トランスロケーションは、アネキシンV結合によって測定することができ、DNA断片化はDNAラダーリング、ヨウ化プロピジウム染色またはBrDUを用いるTUNEL分析法によって評価することができ、DNA断片化に加えて核/クロマチン縮合は、二倍体細胞(hypodiploid）の増加によって評価することができる。アポトーシスは、細胞のカスパーゼ酵素の量を測定する分析法によって測定することもできる。

「抗体依存性細胞傷害性」または「ADCC」は、Fc受容体(ナチュラルキラー細胞、好中球、およびマクロファージ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識した後、標的細胞のリーシスを引き起こす細胞性反応である。ADCCを伝達するための主要な細胞は、ナチュラルキラー細胞(FcγRIIIのみを発現する)および単球(FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する)である。造血細胞上でのFcR発現は、Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457-92, 1991の464頁の表3にまとめられている。

「補体依存性細胞傷害性」または「CDC」は、補体の存在下における標的のリーシスを表す。補体活性化経路は、補体系の第一成分(C1q)の、コグネイト（cognate）抗原と複合体形成した分子(例えば、抗体)への結合によって開始される。

「Fc受容体」および「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するのに用いられる。

「エフェクター細胞」は、(複数の)エフェクター細胞機能を行うことができる任意の種類の細胞を表す。結合ドメインポリペプチドが特異的に結合しうる本明細書に記載の多くの抗原のような多種多様な細胞表面抗原の差次的発現に基づいて、異なる特殊化した免疫機能を有するエフェクター細胞は、互いに識別することができることは周知である。エフェクター細胞としては、免疫系機能の一要素である活性を直接伝達することができる任意の細胞が挙げられ、天然でまたは遺伝子工学処理の結果としてそのような能力を有する細胞などが包含される。エフェクター細胞は、免疫グロブリン定常領域に対する受容体などのような免疫グロブリンに対する細胞表面受容体を含んでなり、該受容体としては、「Fc受容体」(FcR)と一般に呼ばれる受容体のクラスが挙げられる。ADCCを伝達することができる細胞は、エフェクター細胞の例である。他の例としては、ナチュラルキラー(NK)細胞、腫瘍浸潤性Tリンパ球(TIL)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、およびアレルギー応答機構を含む細胞などの顆粒球細胞が挙げられる。エフェクター細胞は、骨髄およびリンパ系統内の様々な分化段階における細胞を含む造血源の細胞であり、Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好塩基性球、好酸球、マスト細胞、血小板、赤血球、およびこれらの細胞の前駆体、前駆細胞(例えば、造血幹細胞)、静止、活性化および成熟形態などのように、1以上の種類の機能性細胞表面FcRを発現することができる(が、必要としない)。他のエフェクター細胞は、免疫機能を伝達することができる非造血源の細胞、例えば、内皮細胞、角質細胞、繊維芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、および他の細胞が挙げられる。また、免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性事象またはエンドサイトーシス、食細胞もしくはピノサイトーシス事象を伝達するかまたはアポトーシスを誘発するか、または微生物免疫を行うかもしくは微生物感染を中和する細胞、あるいはアレルギー、炎症、過敏症および/または自己免疫反応を伝達する細胞も包含することができる。

「ヘテロ接合体」という用語は、二つ以上の異なる種類の抗体を含んでなる接合体を表す。本発明によるヘテロ接合体は、罹患細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘発することができ、異なる標的エピトープに結合するかまたは互いに異なる特異性を有する少なくとも二つの結合アームを含んでなる。換言すれば、第一の結合アームは、第二の結合アームとは異なる特異性を有する。また、互いに接合されない状態では、第一および第二の結合アームは実質的にアポトーシスまたは増殖阻害活性を持たない。ヘテロ接合体は、二つの異なる標的エピトープまたは二つの異なる特異性を認識する場合には、二重特異性である。本発明によるヘテロ接合体は、二価の二重特異性構築物、三価の二重特異性構築物、三価の三重特異性構築物、四価の二重特異性構築物、または化学的にもしくは組換えにより調製される任意の他の考え得る多価の多重特異性構築物であることができる。

「ホモ接合体」という用語は、単一種のモノクローナル抗体を含んでなり、当該技術分野で記載されているように、腫瘍細胞の増殖を阻害しかつアポトーシスを誘導することができる接合体を表す。

本発明の典型的なヘテロ接合体としては、抗CD22 x 抗CD20、抗CD20 x 抗HLA-DR、抗CD19 x 抗CD20、抗CD74 x 抗CD22、抗CD74 x 抗CD20、および抗CD20 x 抗CD80、抗CD2 x 抗CD25、抗CD8 x 抗CD25、および抗CD2 x 抗CD147が挙げられるが、これらに限定されない。

「増殖を阻害する」抗体は、イン・ビトロおよび/またはイン・ビボで罹患細胞の増殖を阻害する抗体である。罹患細胞の増殖を阻害することによって、S期の細胞の比率は減少する。本発明による抗体によれば、好ましい増殖阻害率は20%を上回り、好ましくは、イン・ビトロで約0.5μg/mL - 20μg/mLの抗体濃度および約0.5mg/kg - 15mg/kgの成人患者の用量では50%を上回る。

「アポトーシスを誘導する」抗体は、上記の特性によって確立されているように、プログラミングされた細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、抗体が結合する抗原を発現する罹患細胞であり、この抗原を過剰発現するものであってもよい。本発明による抗体によれば、好ましいアポトーシス誘導率は15%を上回り、好ましくは、イン・ビトロで約0.5μg/mL - 20μg/mLの抗体濃度および約0.5mg/kg - 15mg/kgの成人患者の用量では50%を上回る。

hLL-2抗体は、ネズミLL2抗体(mLL-2)のCDR領域とヒト抗体から得られる様々な領域のフレームワーク配列とを組み合わせることによって調製された、ヒト化抗CD22抗体である。hLL-2の重および軽鎖可変領域の配列は、米国特許第5,789,554号明細書の図1に示されている。その図に示されるように、hLL-2のκ軽鎖はmLL-2由来の三つの軽鎖CDR領域とヒト抗体REIの四つのフレームワーク領域を含む。hLL-2の重鎖は、ヒト抗体NEWM由来の第四のフレームワーク領域と共に、ヒト抗体EU由来の三つのフレームワーク領域と組み合わせたmLL-2由来の三つの重鎖CDRを含む。

ヒト化抗hCD20 (hA20)抗体をコードする単一の軽鎖および2本の重鎖可変領域配列は、2002年2月14日出願の「抗CD20抗体およびおよびその融合タンパク質、および使用方法」という標題の米国仮出願番号第60/356,132号明細書、および2003年2月14日出願の米国特許出願連続番号第10/366,709号明細書に従ってデザインし、構築した(それぞれの特許出願明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる)。hA20は、抗CD20抗体であるA20のV_HおよびV_Ｋ遺伝子を含むが、これらは、それぞれプライマー対VH1BACK/VH1FORおよびV_Ｋ1BACK/V_Ｋ1FORを用いるRT-PCRによって得られたものである。Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833, 1989を参照されたい。ヒトREIフレームワーク配列をV_κに対して用い、EUとNEWMフレームワーク配列の組合せをV_Hについて用いた。出発のヒト抗体フレームワークと比較すると、CDR領域のそれぞれの鎖の外側には多数のアミノ酸変化がある。hA20の重鎖、hA20V_H1はヒトEUフレームワークから九つの変化を含み、hA20V_H2は三つの変化を含む。hA20V_H2は、ヒト抗体フレームワーク領域由来のアミノ酸をhA20V_H1より多く含むので、好ましい。hA20の軽鎖であるhA20V_κは、REIフレームワークから7つのアミノ酸変化を含む。

hLL-1抗体は、ネズミLL-1抗体(mLL-1)のCDR領域と、ヒト抗体から得た可変領域フレームワーク配列とを組み合わせることによって調製されるヒト化抗CD74抗体である。hLL-1の重および軽鎖可変領域の配列は、特許出願公表第20040115193号明細書に示されており、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

本明細書で用いられる「抗体」とは、完全長(すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子組換え法によって形成された)免疫グロブリン分子(例えば、IgG抗体)、または抗体断片のような免疫グロブリンの免疫学的に活性な(すなわち、特異的に結合する)部分を表す。「抗体」という用語は、「ヒト化」抗体、およびファージディスプレー、遺伝子および染色体トランスフェクション法、並びに他の手段によって産生することができる完全なヒト抗体も包含する。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)も包含する。

「免疫原性応答」または「抗原性応答」は、適当な細胞を化合物と接触させた後にこの化合物に対する体を産生する応答である。免疫原性応答を誘発するのに用いられる化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。免疫原性応答で産生される抗体は、応答を誘発するのに用いられる免疫原と特異的に結合する。

免疫原性応答を誘発するのに用いられる化合物は、免疫原または抗原と呼ばれる。「エピトープ」または「抗原決定基」は、このエピトープに対する特異的免疫応答を刺激する免疫原の表面上の領域である。タンパク質、特に変性タンパク質では、エピトープは、典型的には連続するアミノ酸配列によって定義され、表される。しかしながら、非変性タンパク質の場合には、エピトープは、タンパク質のアミノ酸配列における別の部分由来のアミノ酸同士が互いに緊密な物理的接触をするように、タンパク質の三次元折り畳みによって形成される活性部位のような構造も包含する。

「ハプテン」は、最初に免疫原性キャリヤー分子に結合しない限り免疫応答を誘発することができない小分子である。ハプテンはそれ自身は免疫応答を誘発することはできないが、これは、ハプテン-キャリヤー接合体に対する免疫原性応答中に生じた抗体によって特異的に結合される。

天然に存在する(野生型)抗体分子は、4本のポリペプチド鎖と、2本の同一重鎖と、2本の同一軽鎖とからなり、互いにジスルフィド結合によって共有結合しているY形分子である。いずれの種類のポリペプチド鎖も、同一クラスの抗体(すなわち、IgA、IgMなど)では変化しないかまたはごく僅かしか変化しない定常領域と可変領域とを有する。可変領域は特定の抗体に対して独特であり、エピトープの認識要素を含んでなる。両重および軽鎖のカルボキシ末端領域は、配列が保存され、定常領域(Cドメインとしても知られる)と呼ばれる。アミノ末端領域(Vドメインとしても知られる)は配列が可変であり、抗体特異性に関与している。抗体は、抗原を特異的に認識し、主としてそのVドメインにある6個の短い相補性決定領域(CDR)を介して抗原に結合する。

抗体のそれぞれの軽鎖は1本の重鎖と関連しており、これら2本の鎖は、それぞれの鎖のカルボキシ末端領域におけるシステイン残基間で形成されたジスルフィド架橋によって連結しており、ジスルフィド架橋は、抗原結合領域のその部分を構成するそれぞれの鎖のアミノ末端領域から遠位にある。抗体分子は、ヒンジ領域として知られる部分の2本の重鎖の間のジスルフィド橋によってさらに安定化しており、ヒンジ領域は、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド架橋が作られている位置よりも重鎖のカルボキシ末端に近くに位置する。ヒンジ領域は、抗体の抗原結合部分に柔軟性も提供している。

抗体の特異性は、軽および重鎖のアミノ末端領域に位置する可変領域によって決定される。軽鎖と関連重鎖との可変領域は、特異的エピトープを認識する「抗原結合ドメイン」を形成し、抗体は従って二つの抗原結合ドメインを有する。野生型抗体の抗原結合ドメインは、免疫原性タンパク質の同一エピトープに対するものであり、従って、単一の野生型抗体は2分子の免疫原性タンパク質を同時に結合することができる。従って、野生型抗体は単一特異的(すなわち、ユニーク抗原に対するものである)であり、かつ二価(すなわち、2分子の抗原を結合することができる)である。

「ポリクローナル抗体」は、多数のエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答において生じる。従って、ポリクローナル抗体の組成物(例えば、血清)は、タンパク質内の同一または異なるエピトープに対する様々な異なる抗体を包含する。ポリクローナル抗体の産生方法は、当該技術分野で知られている(例えば、「分子生物学の簡略プロトコール」第2版、Ausubel et al.監修、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1992年、Cooper et al.、第11章第III節、11-37 - 11-41頁を参照されたい)。

「抗ペプチド抗体」(「単一特異性抗体」としても知られる)は、これが由来するタンパク質の少数の(好ましくは一つの)単離エピトープに相当する短い(典型的には、5 - 20アミノ酸)に対する体液性応答において生じる。複数の抗ペプチド抗体としては、タンパク質の特異性部分、すなわち少なくとも一つの、好ましくは一つのみのエピトープを含むアミノ酸配列に対する様々な異なる抗体が挙げられる。抗ペプチド抗体の産生方法は、当該技術分野で知られている(例えば「分子生物学の簡略プロトコール」第2版、Ausubel et al.監修、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1992年、Cooper et al.、第11章第III節、11-42 - 11-46頁を参照されたい)。

「モノクローナル抗体」は、免疫原性タンパク質の単一特異性エピトープを認識する特異性抗体である。複数のモノクローナル抗体において、それぞれの抗体分子は、その複数のうちでは、他のものと同一である。モノクローナル抗体を単離するには、特定のモノクローナル抗体を発現し、ディスプレーしおよび/または分泌するクローン性細胞系を最初に同定するが、このクローン性細胞系は、本発明の抗体の一つの産生方法に用いることができる。クローン性細胞系およびそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製方法は、当該技術分野で知られている(例えば「分子生物学の簡略プロトコール」第2版、Ausubel et al.監修、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1992年、Fuller et al.、第11章第II節、11-22 - 11-36頁を参照されたい)。

「裸の抗体」は、毒素、または放射性核種に結合するためキレートとの接合のような修飾をさらに含むことがない完全な抗体分子である。裸の抗体のFc部分は、細胞リーシスを生じることができる機構を作動させる補体結合およびADCC(抗体依存性細胞傷害性)のようなエフェクター機能を提供する。例えば、Markrides,「補体系の治療阻害」, Pharmacol. Rev. 50:59-87, 1998を参照されたい。系によっては、抗体の治療作用は、Fc領域のエフェクター機能によって変化すると思われる(例えば、Golay et al.,「Bリンパ腫細胞のイン・ビトロでの抗CD20モノクローナル抗体リツキシマブに対する生物学的応答: CD55およびCD59は補体依存性細胞リーシスを調節する」, Blood 95:3900-3908, 2000を参照されたい)。

しかしながら、アポトーシスのような他の機構が作用することができるので、Fc部分は総ての場合の治療機能に求められるものではないと考えられる。さらに、Fc領域を含んでなる抗体はFc受容体を有する細胞によって吸収され、これによって標的細胞によって吸収される治療用抗体の量が減少し、非標的細胞に対する毒性を生じるので、Fc領域は用途によっては有害なことがある。Vaswani and Hamilton,「有望な治療薬としてのヒト化抗体」Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:105-119, 1998。

「抗体断片」は、F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、sFvなどのような完全抗体の部分である。構造とは関係なく、抗体断片は完全長抗体によって認識されるのと同一抗原と結合する。例えば、抗CD20モノクローナル抗体断片は、CD20のエピトープと結合する。「抗体断片」という用語は、特異抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のような作用を行う任意の合成または遺伝子工学処理を施したタンパク質をも包含する。例えば、抗体断片は、重および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽および重可変領域がペプチドリンカー(「scFvタンパク質」)によって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子、および超可変領域のようなアミノ酸残基からなる最小認識単位のような可変領域からなる単離断片を包含する。

野生型抗体の限定タンパク質分解によって産生した抗体断片は、タンパク質分解性抗体断片と呼ばれる。これらには、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない。
「F(ab')₂断片」は、抗体をタンパク質分解酵素、例えば、ペプシンまたはフシンに限定的に暴露することによって抗体から放出される。F(ab')₂断片は、2本のアームであって、それぞれが共通の抗原に対して指定され、特異的に結合する可変領域を含んでなるものを含んでなる。二つのFab'分子は、重鎖のヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合によって連結されており、Fab'分子は同一(二価)または異なる(二重特異性)エピトープに対るものであってもよい。

「Fab'断片」は、Fabとヒンジ領域を介する重鎖の追加部分を含んでなる単一の抗結合ドメインを含む。

「Fab'-SH断片」は、典型的にはF(ab')₂断片のH鎖間の(複数の)ジスルフィド結合によって互いに保持されているF(ab')₂断片から産生される。非制限的例のβ-メルカプトエチルアミンのような穏和な還元剤で処理することによって(複数の)ジスルフィド結合が開裂し、一つのF(ab')₂断片から二つのFab'断片が放出される。Fab'-SH断片は、一価でありかつ単一特異性である。

「Fab断片」(すなわち、抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合によって架橋した軽鎖と重鎖の一部とを含んでなる抗体断片)は、完全抗体のパパイン消化によって産生する。好適な方法は、樹脂上に固定したパパインを用いて、酵素を容易に除去して消化を停止することができるようにすることである。Fab断片は、F(ab')₂断片に存在するH鎖間に(複数の)ジスルフィド結合を持たない。

「一本鎖抗体」は、抗体断片の1種類である。一本鎖抗体という用語は、「scFv」または「sFv」と省略されることが多い。これらの抗体断片は、分子遺伝学および組換えDNA技術を用いて産生される。一本鎖抗体は、相互作用により抗原結合部位を形成するV_HおよびV_Lドメインを両方共含んでなるポリペプチド鎖からなる。V_HおよびV_Lドメインは、通常は10 - 25アミノ酸残基によって連結されている。

「一本鎖抗体」という用語は、二つの一本鎖抗体(そのそれぞれは異なるエピトープに対するものである)がジスルフィド結合によって互いに連結しているジスルフィド結合Fv(dsFv)、異なる特異性の二つの別個のscFvがペプチドリンカーによって連結されている二重特異性sFv、ダイアボディー(第一のsFvが第二のsFvのV_Lドメインと会合しかつ第一のsFvのV_Lドメインが第二のsFvのV_Hドメインと会合するときに形成される二量体化sFvであり、このダイアボディーの二つの抗原結合領域は、同一または異なるエピトープに対して指定することができる)、およびトリアボディー(ダイアボディーと同様の方法で形成されるが、三つの抗原結合ドメインが単一複合体に生じる三量体化sFvであって、三つの抗原結合ドメインは同一または異なるエピトープに対して指定することができる)が挙げられるが、これらに限定されない。

「相補性決定領域ペプチド」または「CDRペプチド」は、もう一つの形態の抗体断片である。CDRペプチド(「最小認識単位」としても知られる)は、単一相補性決定領域(CDR)に相当するペプチドであり、目的とする抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって調製することができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Larrick et al., Methods: A Conipanion to Methods in Enzymology 2:106, 1991を参照されたい。

「システイン修飾抗体」では、システインアミノ酸を遺伝子操作によって抗体の表面上に挿入しまたは置換し、この抗体を例えばジスルフィド橋によって別の分子に接合させるのに用いる。抗体に対するシステイン置換または挿入は報告されている(米国特許第5,219,996号明細書を参照されたい)。抗体の部位特異的接合に用いるため、Cys残基をIgG抗体の定常領域に導入する方法は、Stimmel et al.によって報告されている(J. Biol. Chem 275:330445-30450, 2000)。

「キメラ抗体」は、一つの種由来の抗体、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域(CDR)を含む組換えタンパク質であるが、この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のものに由来している。動物への応用については、キメラ抗体の定常ドメインはネコまたはイヌのような他の種のものに由来していてもよい。

キメラAbは、マウス軽可変および重可変ドメインをコードするcDNA断片をヒト抗体由来のCドメインをコードする断片に連結することによって構築される。Cドメインは抗原結合には寄与しないので、キメラ抗体は元のマウスAbと同一の抗原特異性を保持するが、配列はヒト抗体に近くなる。キメラAbはいくつかのマウス配列を含むが、それでも免疫原性であることがある。ヒト化Abは、抗原を認識するのに必要なマウスアミノ酸のみを含む。この産物は、ヒト抗体フレームワーク中にマウス相補性決定領域由来のアミノ酸を組み入れることによって構築される。

「ヒト化抗体」は、一つの種由来の抗体、好ましくは齧歯類抗体のCDRが齧歯類抗体の重および軽可変鎖からヒト重および軽可変ドメインに導入されている組換えタンパク質である。この抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインから誘導される。Gussow and Seemann,「モノクローナル抗体のヒト化」, Method Enzymol. 203:99-121, 1991、およびVaswani and Hamilton, Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:105-119, 1998を参照されたい。

「ヒト抗体」は、「遺伝子工学処理を施して」抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この手法では、ヒト重および軽鎖座の要素は内在性重鎖および軽鎖座の標的崩壊を含む胎児性幹細胞系から誘導されるマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994に記載されている。完全なヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法、並びにファージディスプレー法によって構築することもでき、それらは総て当該技術分野で知られている。免疫していないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからイン・ビトロでのヒト抗体およびその断片の産生については、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990を参照されたい。この手法では、抗体可変ドメイン遺伝子は、糸状ファージの主または副コートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片としてディスプレーされる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、それらの特性を示す抗体コードする遺伝子が選択される。この方法では、ファージは、B細胞の特性のいくつかに似ている。ファージディスプレーは様々なフォーマットで行うことができ、その総説については、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571, 1993を参照されたい。

ヒト抗体は、イン・ビトロで活性化したB細胞によって生成させることもできる。米国特許第5,567,610号明細書および第5,229,275号明細書を参照されたい。上記特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

「治療薬」は、抗体残基と別個に、同時にまたは連続して投与され、または抗体残基、すなわち抗体または抗体断片、または下位断片に接合している分子または原子であり、疾病の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体断片、薬剤、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。

「診断/検出薬」は、抗体残基、すなわち抗体または抗体断片、または下位断片に接合して投与される分子または原子であり、抗原を含む細胞の位置を確認することによって疾病の診断に有用である。有用な診断/検出薬としては、放射性同位体、色素(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体を用いる)、コントラスト剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴映像法(MRI)の増強剤(例えば、常磁性イオン)が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第6,331,175号明細書にはMRI法とMRI増強剤に接合した抗体調製が記載されており、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。好ましくは、診断/検出薬は、放射性同位体、磁気共鳴映像法に用いる増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分を放射性金属または常磁性イオンと共に装填するには、これをイオンを結合するための多数のキレート基が結合する長い尾を有する試薬と反応させる必要があることがある。このような尾は、ポリリシン、多糖類、または例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス-チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびこの目的に有用であることが知られている類似の基のようなキレート基が結合することができる側基を有する他の誘導体形成したまたは誘導体形成可能な鎖のようなポリマーであることができる。キレートは、標準的化学的方法を用いて抗体にカップリングされる。キレートは、通常は免疫反応性の損失を最小限にしかつ凝集および/または内部架橋を最小限にして分子に対する結合を形成することができる基によって抗体にカップリングされる。キレートを抗体に接合するための他の一層珍しい方法および試薬は、1989年4月25日にHawthorneに発行された「抗体接合体」という標題の米国特許第4,824,659号明細書に開示されており、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。特に有用な金属-キレートの組合せとしては、放射性画像化のための¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc、^94mTc、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁶Br、⁹⁷Zrのような一般的エネルギー範囲が60 - 4,000keVである診断用同位体と共に用いられる2-ベンジル-DTPA、およびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同一キレートが、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体形成したときには、本発明の抗体と共に用いるときには、MRIに有用である。NOTA、DOTAおよびTETAのような多環キレートは、様々な金属および放射性金属と共に、最も詳細には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と共に用いられる。このような金属-キレート複合体は、環の大きさを目的の金属に調整することによって極めて安定にすることができる。RAITについて²²³Raのような核種を安定に結合するのに重要な多環ポリエーテルのような他の環型キレートは、本発明に包含される。

「免疫接合体」は、少なくとも1個の治療および/または診断/検出薬に接合した抗体、融合タンパク質、またはその断片である。診断/検出薬は、放射性核種または非放射性核種、コントラスト剤(磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影または超音波用など)を含んでなることができ、放射性核種はγ線、β線、α線、オージェ電子、または陽電子放射性同位体であることができる。

「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子を含んでなるDNA分子である。典型的には、遺伝子発現は、構成的または誘導的プロモーター、組織特異性調節要素、およびエンハンサーなどのある種の調節要素の制御下で起こる。このような遺伝子は、調節要素に「作動可能に連結」しているといわれる。

「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む任意の原核細胞または真核細胞であることができる。この用語は、宿主細胞または複数の宿主細胞の複数の細胞の染色体またはゲノムに(複数の)クローン細胞を含むように遺伝子工学処理を施した原核または真核細胞、並びにトランスジェニック動物をも包含する。適当なポリに宿主細胞としては、Sp2/0-Ag14細胞およびNS0細胞のような骨髄腫細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ハイブリドーマ細胞系、および抗体発現に有用な他の哺乳類宿主細胞が挙げられる。また、MAbおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはWO 0063403 A2号明細書に開示されているヒト細胞系PER.C6であり、これは、CHO、COS、Vero、Hela、BHKおよびSP2細胞系のような通常の哺乳類細胞系と比較して2-200倍以上の組換えタンパク質を産生する。修飾免疫系を有する特殊なトランスジェニック動物は、完全なヒト抗体を作製するのに特に有用である。

本明細書で用いられる「抗体融合タンパク質」という用語は、同一または異なる特異性を有する2以上の同一または異なる天然抗体、一本鎖抗体または抗体断片が連結している組換えによって産生した抗原結合分子である。この融合タンパク質の結合価は、融合タンパク質が抗原またはエピトープに対して有する結合アームまたは部位の総数であり、すなわち、一価、二価、三価または多価を示している。抗体融合タンパク質の多価は、抗原への結合における多重相互作用を利用することによって抗原への結合のアビディティーを増加させることができることを意味する。特異性は、いくつの抗原またはエピトープを抗体融合タンパク質が結合することができるか、すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示している。これらの定義を用いると、天然抗体、例えば、IgGは2本の結合アームを有するので二価であるが、これは一つの抗原に結合するので単一特異性である。単一特異性の多価融合タンパク質は一つのエピトープに対して二つ以上の結合部位を有するが、同一抗原上の同一エピトープ、例えば、同一抗原と反応する二つの結合部位を有するダイアボディーとしか結合しない。融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価または多重特異性の組合せまたは同一抗体成分の複数のコピーを含んでなることができる。融合タンパク質は、さらに治療薬を含んでなることができる。このような融合タンパク質に適当な治療薬の例としては、免疫調節剤(「抗体-免疫調節剤融合タンパク質」)および毒素(「抗体-毒素融合タンパク質」)が挙げられる。一つの好ましい毒素は、リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)、好ましくは組換えRNアーゼを含んでなる。

「多重特異性抗体」は、異なる構造の少なくとも二つの標的、例えば、二つの異なる抗原、同一抗原上の二つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび/または抗原またはエピトープに同時に結合することができる抗体である。一つの特異性は、B細胞、T細胞、骨髄腫-、血漿-およびマスト-細胞抗原またはエピトープについてのものである。もう一つの特異性は、B細胞上のCD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、およびCD22のような同一細胞型上での異なる抗原に対するものである。一つの特異性は下記の抗原、すなわちCEA、TAG-72、MUC1、CSAP、VEGF、EGFRの一つに対するような結腸腫瘍細胞についてのものであり、他の特異性は、例えば、この試料リストの異なる抗原についてのものである。「多価」抗体は複数の結合アームを有し、結合アームによってターゲッティングされる部位によって単一特異性または多重特異性であることができる。多重特異性の多価抗体は二つ以上の結合部位を有する構築物であり、結合部位は異なる特異性のものである。例えば、二重特異性ダイアボディーでは、一つの結合部位は一つの抗原と反応し、他の結合部位は別の抗原と反応する。

多価多重特異性抗体誘導体は、グルタルアルデヒド結合から官能基間の一層特異的結合までの範囲の様々な通常の手順によって調製することができる。抗体および/または抗体断片は、好ましくは互いに直接またはリンカー残基を介して、抗体または断片上の1以上の官能基、例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基を介して共有結合する。グルタルアルデヒド以外の様々な通常のリンカー、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス(ヒドロキシスクシンイミド)エステル、カルボジイミド、マレイミドヒドロキシ-スクシンイミドエステルなどを用いることができる。リンカーの最適長さは、標的細胞の種類によって変化することができる。最も効果的なリンカーの大きさは、標的とIiの両方への反応性を試験(および確保)することによって経験的に決定することができる。このような免疫化学的手法は、周知である。

多価抗体を産生するための簡単な方法は、抗体または断片をグルタルアルデヒドの存在下にて混合することである。最初のシッフ塩基結合は、例えば、水素化ホウ素による第二アミンへの還元によって安定化することができる。ジイソチオシアネートまたはカルボジイミドを、非部位特異的リンカーとしてグルタルアルデヒドの変わりに用いることができる。

多価多重特異性抗体の最も簡単な形態は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、様々な通常の方法、例えば、全IgGまたは、好ましくはF(ab')₂断片の混合物のジスルフィド開裂および再構成、2種類以上のハイブリドーマの融合による二つ以上の特異性を有する抗体を産生するポリオーマの形成、および遺伝子工学処理により作製することができる。二重特異性抗体は、異なる抗体の還元的開裂によって生じるFab'断片の酸化的開裂によって調製された。これは、2種類の異なる抗体のペプシン消化によって産生した2種類の異なるF(ab')₂断片を混合する還元的開裂によってFab'断片の混合物を形成した後、ジスルフィド結合の酸化的再形成によって元のエピトープ(すなわち、標的およびIi)のそれぞれに特異的なFab'部分を含む二重特異性抗体などのF(ab')₂断片の混合物を産生することによって遊離に行われる。多価抗体の調製のための一般的手法は、例えば、Nisonhoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93:470, 1961; Hammerling et al., J. Exp. Med. 128:1461, 1968;および米国特許第4,331,647号明細書に見出すことができる。

一層選択的な結合は、マレイミド-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルのようなヘテロ二官能価リンカーを用いることによって得ることができる。このエステルと抗体または断片との反応によって抗体または断片上にアミン基が誘導され、次にこの誘導体を例えば、遊離スルフヒドリル基を有する抗体Fab断片(または例えば、トラウト試薬によってスルフヒドリル基を追加したより大きな断片または完全な抗体)と反応させることができる。このようなリンカーは、同一抗体の基を架橋するとは余り思われず、結合の選択性を改良する。

抗原結合部位から離れた部位における抗体または断片を連結するのが有利である。これは、例えば、上記のように開裂した鎖間スルフヒドリル基に対する結合によって行うことができる。もう一つの方法は、酸化した炭水化物部分を有する抗体と少なくとも1個の遊離アミン官能基を有する別の抗体とを反応させることを含む。これにより、最初のシッフ塩基(イミン)結合を生じ、これは好ましくは例えば、水素化ホウ素還元によって第二アミンに還元することによって安定化し、最終生成物を形成する。このような部位特異的結合は、小分子については米国特許第4,671,958号明細書に、大きめの分子については米国特許第4,699,784号明細書に開示されている。

標的特異性を有するF(ab')₂断片の鎖間ジスルフィド橋を、軽-重鎖結合を回避するように留意しながらシステインで徐々に還元してFab'-SH断片を形成する。(複数の)SH基は、過剰のビス-マレイミドリンカー(1,1'-(メチレンジ-4,1-フェニレン)ビス-マレイミド)で活性化される。

クアドローマ(quadroma)を介する二重特異性抗体の産生技術は、例えば、Milstein et al., Nature 305:537, 1983、およびPohl et al., Int. J. Cancer 54:413, 1993に記載されている。

最終的に、このような二重特異性抗体は、遺伝子工学処理によって産生させることができる。例えば、抗標的MAbの可変ドメインをコードするDNAを含むプラスミドを、目的とする抗体を分泌するハイブリドーマに導入することができる。遺伝子工学処理によって二重特異性抗体を産生するための一般的手法は、例えば、Songsivilai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:271, 1989、Traunecker et al., EMBO J. 10:3655, 1991、およびWeiner et al., J. Immunol. 147:4035, 1991に記載されている。

高次多価の多重特異性分子は、上記の方法で産生した二重特異性抗体に様々な抗体成分を加えることによって得ることができる。例えば、二重特異性抗体を2-イミノチオランと反応させて、上記のビス-マレイミド活性化手順を用いて標的抗原の同一または異なるエピトープに結合するもう一つの抗体誘導体に二重特異性抗体 カップリングするのに用いる1以上のスルフヒドリル基を導入することができる。多価抗体を産生するためのこれらの手法は、当業者には周知である。例えば、米国特許第4,925,648号明細書、およびGoldenberg, 国際公開WO 92/19273号明細書を参照されたい。上記特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

「二重特異性抗体」は、異なる構造の二つの標的に同時に結合することができる。二重特異性抗体(bsAb)および二重特異性抗体断片(bsFab)は、例えば、B細胞、T細胞、骨髄腫-、血漿-、およびマスト-細胞抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも1本のアームと、治療、または診断/検出薬を有するターゲッティング可能な接合体に特異的に結合する少なくとも1本の他のアームを有する。様々な二重特異性融合タンパク質は、分子工学技術を用いて産生させることができる。一形態では、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、一つの抗原に対する単一結合部位を有するscFvと第二の抗原についての単一結合部位を有するFab断片からなっている。もう一つの形態では、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原についての結合部位を有するIgGと第二の抗原についての二つの結合部位を有する二つのscFvとからなっている。

二重特異性抗体(bsAb)は、プレターゲッティングおよび治療目的に用いられてきた。二重特異性抗体の多くの使用に関する追加背景については、米国特許出願公表第2002/0006379 A1号明細書、第2003/011333 A1号明細書、および第2003/0133930 A1号明細書、および第2003/0103982 A1号明細書、米国特許第6,183,744 B1号明細書および第6,458,933 B1号明細書、およびWO 99/66951号明細書を参照されたい。これらの文献の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

bsAbは、当該技術分野で知られている手法によって調製することができ、例えば、抗CD22 腫瘍Abおよび抗CD20は、いずれも個別にペプシンでそれらのF(ab')₂に消化される。抗CD22-Ab-F(ab')₂はシステインで還元されてFab'モノマー単位を生成し、これはさらに架橋剤ビス(マレイミド)ヘキサンと反応させてFab'-マレイミド残基を生成する。抗CD20 Ab-F(ab')₂をシステインで還元して、精製して回収した抗CD20 Fab'-SHを抗CD22-Fab'-マレイミドと反応させて、Fab' x Fab'二重特異性Abを生じる。あるいは、抗CD20 Fab'-SH断片を抗CD22 F(ab')₂とカップリングさせてF(ab')₂ x Fab'構築物を生成し、または抗CD22 IgGと反応させてIgG x Fab'二重特異性構築物を生成することができる。一態様によれば、IgG x Fab'構築物は、抗CD20 Fab'チオール基を、過ヨウ素酸酸化を行った後市販のヒドラジド-マレイミド架橋剤と反応させることによって活性化した抗CD22 IgG重鎖炭水化物に結合することによって部位特異的に調製することもできる。用いる成分Abは、既知の手法によってキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は齧歯類抗体由来の可変ドメインと相補性決定領域を含む組換えタンパク質であるが、この抗体分子の残りはヒト抗体から誘導される。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメインに導入されている組換えタンパク質である。

CD8、CD25およびCD147に対する抗体を抗CD2抗体と組み合わせて、アポトーシスを誘発する潜在能力を有する記憶T細胞をターゲッティングするための二重特異性抗体を産生することができる。CD147は、Staffer, G. et al., J. Immunol. 171(4), 1707-1714, 2003に記載されている。

bsAbを産生するための他の最新の方法としては、さらにシステイン残基を有し、これが一層普通に見られる免疫グロブリンアイソタイプより強力に架橋する遺伝子工学処理を施した組換えAbが挙げられる。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997を参照されたい。もう一つの方法は、必要とされる二重特異性を有する2種類以上の異なる一本鎖抗体または抗体セグメントを架橋する組換え融合タンパク質に遺伝子工学処理を施すことである。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997を参照されたい。様々な二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて産生することができる。一形態によれば、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、一つの抗原に対する単一結合部位を有するscFvと第二の抗原についての単一結合部位を有するFab断片からなっている。もう一つの形態によれば、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原について二つの結合部位を有するIgGと第二の抗原についての二つの結合部位を有する二つのscFvとからなっている。

機能性の二重特異性一本鎖抗体(bscAb)はダイアボディーとも呼ばれ、組換え法を用いて哺乳類細胞で産生することができる。例えば、Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025, 1995を参照されたい。例えば、bscAbは、組換え法を用いて二つの一本鎖Fv断片をグリシン-セリンリンカーにより連結することによって産生される。目的とする二つの抗体のV軽鎖(V_L)とV重鎖(V_H)ドメインは、標準的PCR法を用いて単離される。それぞれのハイブリドーマから得られるV_LおよびV_H cDNAを次に2段階融合PCRで連結して、一本鎖断片を形成する。第一のPCR段階では(Gly₄-Ser₁)₃リンカーを導入し、第二段階ではV_LおよびV_Hアンプリコンを結合する。次に、それぞれの一本鎖分子を、細菌発現ベクターにクローニングする。増幅後、一本鎖分子の一方を切り取って、目的とする第二の一本鎖分子を含む他のベクターにサブクローニングする。生成するbscAb断片を、真核発現ベクターにサブクローニングする。機能性タンパク質発現は、このベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクションすることによって得ることができる。二重特異性融合タンパク質は、同様の方法で調製される。二重特異性一本鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に包含される。

二つ以上の一本鎖抗体または抗体断片を連結する二重特異性融合タンパク質は、同様の方法で産生される。

多量のbscAbおよび融合タンパク質は、Escherichia coli発現系を用いて産生することができる。例えば、Zhenping et al., Biotechnology, 14:192-196, 1996を参照されたい。機能性bscAbは、二つの「交差」scFv断片についてのV_LおよびV_Hドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在している二つのscFv断片のE. coliでの同時発現によって産生することができる。目的とする二つの抗体のV軽鎖(V_L)およびV重鎖(V_H)ドメインは、標準的PCR法を用いて単離される。次に、cDNAを細菌発現ベクターに連結して、目的とする第一の抗体のV_LドメインのC末端は、リンカーを介して第二の抗体のV_HドメインのN末端に連結される。同様に、目的とする第二の抗体のV_LドメインのC末端は、リンカーを介して第一の抗体のV_HドメインのN末端に連結される。生成するジシストロン性オペロンは、強力なプロモーター、例えば、リン酸基が状態によって誘発可能なE. coliアルカリホスファターゼプロモーターの転写制御下に置かれている。あるいは、一本鎖融合構築物は、lacプロモーターと、2%グリシンおよび1% Triton X-100からなる培地を用いてE. coliで良好に発現された。例えば、Yang et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2869-2874, 1998を参照されたい。E. coliの熱安定なエンテロトキシンIIシグナル配列を用いて、ペリプラズム空間に対するペプチドを指定する。分泌の後、2本のペプチド鎖は会合して、いずれの抗原結合特異性をも有する非共有ヘテロ二量体を形成する。bscAbは、当該技術分野で知られている標準的手順、例えば、スタフィロコッカスプロテインAクロマトグラフィーを用いて精製する。

機能性bscAbと融合タンパク質は、トランスジェニック家畜の乳に産生させることもできる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp. 63:141-147, 1998、米国特許第5,827,690号明細書を参照されたい。上記の方法で得られたbscAb断片を、哺乳類上皮細胞で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例としては、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα-ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ-ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入bscAbを、哺乳類特異性遺伝子由来のコグネイトゲノム配列によってその3'側に隣接させる。これにより、ポリアデニル化部位および転写産物安定化配列が提供される。次に、発現カセットを授精した哺乳類の卵に注入した後、これを雌性宿主の子宮に移植して、懐妊させる。誕生後、子孫をサザンブロット分析によって導入したDNAの存在についてスクリーニングする。トランスジェニック雌由来の乳を、当該技術分野で知られている標準的免疫学的方法を用いてbscAbの存在および機能性について分析する。bscAbは、当該技術分野で知られている標準的方法を用いて乳から精製することができる。乳におけるbscAbのトランスフェクション産生によって、多量のbscAbを得る効率的方法が提供される。

機能的bscAbおよび融合タンパク質は、トランスジェニック植物で産生させることもできる。例えば、Fiedler et al., Biotech., 13:1090-1093, 1995、Fiedler et al., Immunotechnology, 3:205-216, 1997を参照されたい。このような産生は、低コスト、大規模産出高、および安定な長期保管などいくつかの利点を提供する。上記の方法で得られたbscAb断片を、プロモーター配列を含みかつシグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローニングして、タンパク質を小胞体に対して指定する。様々なプロモーターを用いて、実施者が発現産物を植物内の特定の位置に指定することができる。例えば、タバコ植物における遍在発現は、強力なカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを用いて行うことができ、一方臓器特異的発現は、種子特異的レグミンB4プロモーターを介して達成される。発現カセットを、当該技術分野で知られている標準的方法に従って形質転換する。形質転換は、サザンブロット分析によって確認する。トランスジェニック植物を、当該技術分野で知られている標準的免疫学的方法を用いてbscAbの存在および機能性について分析する。bscAbは、当該技術分野で知られている標準的方法を用いて植物組織から精製することができる。

さらに、トランスジェニック植物は、bscAbおよび融合タンパク質の長期保管を容易にする。機能活性scFvタンパク質は、タバコ葉から室温で1週間保管した後に抽出されている。同様に、室温で1年間保管したトランスジェニックタバコ種子は、scFvタンパク質またはその抗原結合活性を全く損失しない。

機能性bscAbおよび融合タンパク質を、昆虫細胞で産生させることもできる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212:149-160, 1998を参照されたい。昆虫に基づく発現系は、多量の均質かつ適正に折り畳まれたbscAbを産生する手段を提供する。バキュロウイルスは昆虫細胞について広く用いられている発現系であり、組換え抗体分子に良好に応用されている。例えば、Miller, L.K, Ann. Rev. Microbiol., 42:177, 1988、Bei et al., J. Immunol. Methods, 186:245, 1995を参照されたい。あるいは、誘導可能な発現系を、誘導プロモーターの転写制御下でbscAb構築物を含む安定な昆虫細胞を生成することによって用いることができる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212:149-160, 1998を参照されたい。上記の方法で得られたbscAb断片を、ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターとヒトHLA-A2リーダー配列を含む発現ベクターにクローニングする。次に、この構築物を、キイロショウジョウバエのSC-2細胞にトランスフェクションする。これらの細胞を多量の銅、亜鉛またはカドミウムに暴露することによって、発現を誘発する。bscAbの存在および機能性を、当該技術分野で知られている標準的免疫学的方法を用いて決定する。精製したbscAbは、当該技術分野で知られている標準的方法を用いて得られる。

bsAbの構造をさらに変化させて、薬物動態、エフェクター機能、および結合親和性またはアビディティーを改良することができる。

本発明は、癌、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、または皮膚癌からなる群から選択される疾患を治療するための組成物および方法も提供する。癌は、皮膚癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、腎臓癌、副腎癌、または肝臓癌からなる群から選択することができる。B細胞関連疾患は、緩徐進行性のB細胞リンパ腫、侵襲性のB細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、または多発性骨髄腫であることがある。さらに、B細胞関連疾患は、ヒトまたは動物タイプの疾患であることができる。一方、T細胞関連疾患は、ヒトまたは動物T細胞白血病、皮膚乾癬、乾癬性関節炎または菌状息肉腫であることがある。代謝病は、アミロイドーシスであることができる。神経変性疾患は、アルツハイマー病であることができる。

腫瘍関連抗原は上記のような任意の種類の疾患と関連させることができ、CD2、CD3、CD8、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD45Ro、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met,PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3,MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas (CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、テネイシン、ED-Bフィブロネクチン、PSMA、PSA、カルボニックアンヒドラーゼIX、およびIL-6からなる群から選択することができる。

腫瘍関連マーカーは、Herberman (例えば、「癌の臨床生化学」Fleisher(監修)の「癌の免疫診断」、米国臨床化学者協会、1979年を参照されたい)によって、腫瘍胎児性抗原、胎盤抗原、発癌または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、臓器関連抗原、異所性ホルモンおよび通常抗原またはそれらの変異体など多数の種類に分類されている。ときには、腫瘍関連マーカーを有利に用いて、一層高い腫瘍特異性を有する抗体、例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)のβサブユニットまたは癌胎児性抗原(CEA)のγ領域であって、米国特許第4,361,644号明細書および第4,444,744号明細書に開示されているように非腫瘍物質に対する交差反応性が大幅に減少した抗体の産生を刺激するものを生じさせる。腫瘍脈管構造(例えば、VEGF、PIGF、およびED-Bフィブロネクチン)、 腫瘍壊死、膜受容体(例えば、葉酸受容体、EGFR)、膜貫通抗原(例えば、PSMA)、および腫瘍遺伝子産物のマーカーは、抗体または抗体断片に対する適当な腫瘍関連標的として働くこともできる。B細胞複合体抗原のような腫瘍細胞上で過剰発現する正常細胞成分並びにある種の腫瘍細胞によって発現されるサイトカインのマーカー(例えば、T細胞悪性腫瘍におけるIL-2受容体、およびある種の腫瘍細胞によって発現されかつ炎症過程に関係することが提案されている悪疫質にも伴うIL-6)も、本発明の抗体および抗体断片に対する適当な標的である。例えば、Trikha et al., Clin Cancer Res., 9:4653-65 (2003)を参照されたい。

腫瘍遺伝子のマーカーまたは産物に対する抗体、またはVEGF、PIGF、およびED-Bフィブロネクチンのような脈管形成因子に対する抗体も有用である。VEGF抗体は、米国特許第6,342,221号明細書、第5,965,132号明細書、および第6,004,554号明細書に記載されており、これらの特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。初期にはMariani et al. (Cancer 80:2378-84, 1997)によって癌胎児性フィブロネクチンと呼ばれていたED-Bフィブロネクチン抗体は、Santimaria, M. et al., Clin. Cancer Res. 9(2):571-579, 2003、WO 97/45544 A1号明細書、WO 03/055917 A2号明細書、WO 01/83816 A2号明細書、WO 01/62298 A2号明細書、WO 99/58570 A2号明細書、WO 01/62800 A1号明細書、および米国特許公表第20030045681A1号明細書に開示されており、上記文献の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。CD40に対する抗体のようなある種の免疫応答調節因子に対する抗体は、Todryk et al., J. Immunol. Meth. 248:139-147, 2001、およびTurner et al., J. Immunol. 166:89-94, 2001に記載されている。組合せ療法に適当な他の抗体としては、Epstein et al.に記載されている抗壊死抗体が挙げられ、例えば、米国特許第5,019,368号明細書、第5,882,626号明細書、および第6,017,514号明細書を参照されたい。関節炎性乾癬についてのT細胞マーカーの一例はCD45Roであり、Veale, D. J. et al.によってAnn. Rheum. Dis. 53(7):450-454, 1994に記載されている。

本発明は、急性または慢性炎症(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、慢性気管支炎、喘息、気腫、筋炎、または多発性筋炎)、または免疫調節異常疾患(immune dysregulation disease)(移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、悪液質、敗血症、アテローム性動脈硬化症など)のような自己免疫疾患または他の免疫疾患を治療するための組成物および方法も提供する。B細胞を標的とする抗体を用いる自己免疫疾患の免疫療法は、PCT出願公開WO 00/74718号明細書に記載されており、これは、米国仮出願番号第60/138,284号明細書に対して優先権を主張するものであり、上記特許出願明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。典型的な自己免疫疾患は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgAネフロパシー、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ(tabes dorsalis)、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬および繊維化性肺胞炎である。

これらの細胞表面マーカーの任意の二つを架橋することができるBsAbを考える。さらに、VEGFおよび他の脈管形成阻害抗体であって、いずれもそれら自身のまたは他の阻害抗体(例えば、P1GFおよびED-Bフィブロネクチン)との様々な組合せのものを含むbsAbも包含される。これらの細胞表面マーカーのいくつかはリンパ腫に限定されず、固形腫瘍にさらに共通していることが注目される。例えば、HER2の過剰発現は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、および腎臓癌などの様々なヒトの癌で起こり、CD24も非小細胞肺癌(Kristiansen, et al., Br. J. Cancer, 88:231-236, 2003)並びに卵巣癌(Kristiansen, et al., Am. J. Pathol. 161:1215-1221, 2002)と関連することが観察されている。CA-125が卵巣癌のマーカーとしても用いられることは周知であり(Niloff et al., Obstet Gynecol. 64:703-7 (1984)を参照されたい)、CSApも同様にCA-125に関連しており、卵巣癌並びに他の癌、特に結腸直腸癌の標的分子として用いることができるModrak et al.「CA125(MUC16)と相同性を有するMu-9(抗直腸特異性抗原-p)-反応性ペプチドの同定(Cancer Research (1994)に投稿)を参照されたい。

治療薬の例としては、抗体、抗体断片、化学療法薬などの薬剤、毒素、酵素、酵素阻害剤、ヌクレアーゼ、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、サイトカイン、キレート剤、ホウ素化合物、ウラニウム原子、光活性剤、および放射性核種が挙げられる。

有用な診断/検出剤としては、放射性同位体、色素(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体を用いる)、放射線不透過性材料(例えば、ヨウ素、バリウム、ガリウム、およびタリウム化合物など)、コントラスト剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴映像法(MRI)用の増強剤(例えば、常磁性イオン)が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第6,331,175号明細書には、MRI法およびMRI増強剤に接合した抗体の調製が記載されており、上記特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。好ましくは、診断/検出剤は、核映像化の手術中および内視鏡検出のための放射性同位体磁気共鳴映像法または超音波検査法で使用する増強剤、X線およびコンピューター断層撮影法用の放射線不透過性およびコントラスト剤、および内視鏡透視検査などの透視検査法用の蛍光化合物からなる群から選択される。

本発明の開示を目的とする化学療法薬としては、総ての既知化学療法薬が挙げられる。既知の化学療法薬としては、少なくとも、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写因子の拮抗物質または阻害剤、アルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位錯体、COX-2阻害剤、アポトーシス剤、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、または拮抗薬が挙げられる。さらに具体的には、化学療法薬は、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、またはアンドロゲンでよい。さらに一層具体的には、化学療法薬は、アクチノマイシン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブリオスタチン-1、ブスルファン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン(CPT-11)、カルボプラチン、クラドリビン、 シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、L-アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メドロプロゲステロンアセテート（medroprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトザントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、オキサリプラチン、フェニルブチレート、プレドニゾン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、SN-38、タモキシフェン、タキサン、タキソール、テストステロンプロピオネート、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、ビノレルビン、またはビンクリスチンでよい。

適当な化学療法薬は、「レミントンの薬科学」第19版(Mack Publishing Co. 1995)、および「グッドマンとギルマンの治療薬の薬理学的基礎」第7版(MacMillan Publishing Co. 1985)、並びにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬剤のような他の適当な化学療法薬は、当業者に知られている。

毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシンA、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、またはシュードモナス内毒素であることができる。

酵素も有用な治療薬であり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼからなる群から選択される。

本明細書で用いられる「免疫調節剤」という用語は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子(TNF)のようなリンホトキシン、およびインターロイキン(例えば、インターロイキン-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18およびIL-21)、コロニー刺激因子(例えば、顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF))、インターフェロン(例えば、インターフェロンα、βまたはγ)、「S1因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリトロポエチンおよびトロンボポエチンのような造血因子が挙げられる。適当な免疫調節剤残基の例としては、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロン-γ、TNF-αなどが挙げられる。あるいは、患者には、本発明の組成物と、別個に投与されるサイトカインを投与することができ、これは本発明の組成物の投与の前に、と同時にまたはの後に投与することができる。本発明の組成物を、免疫調節剤に接合させることもできる。

本発明の開示を目的とするサイトカインとしては、少なくともIL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロン-α、インターフェロン-β、およびインターフェロン-γなどの総ての既知サイトカインが挙げられる。これは、GM-CSF、G-CSF、エリトロポエチン、トロンボポエチンなどであってもよい。

さらに、DTPA、DOTA、TETA、またはNOTAのようなキレート剤、または蛍光分子のような検出可能な標識、または重金属または放射性核種のような細胞傷害剤を接合させることができる適当なペプチド。例えば、治療上有用な免疫接合体は、光活性剤または色素を抗体複合体に接合させることによって得ることができる。蛍光色素のような蛍光組成物、および可視光線に感受性のポルフィリンのような他の色原体または色素を用いて、適当な光線を病変に向けることによって病変部を検出し、治療が行われてきた。療法では、これは、光放射線、光線療法または光力学療法と呼ばれてきた(Jori et al.(監修),「腫瘍および他の疾患の光力学療法」(Libreria Progetto1985)、 van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986))。さらに、光線療法を行うために、モノクローナル抗体を光活性化色素とカップリングしてきた。Mew et al., J. Immunol. 130:1473, 1983、同上, Cancer Res. 45:4380, 1985、Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744, 1986、同上, Photochem. Photobiol. 46:83, 1987、Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471, 1989、Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422, 1989、Pelegrin et al., Cancer 67:2529, 1991。しかしながら、これらの初期の研究は、内視鏡療法の使用、特に抗体断片または下位断片の使用は包含しなかった。従って、本発明は、光活性剤または色素を含んでなる免疫接合体の治療での使用を意図する。従って、本発明の治療方法は、光活性剤または色素を含んでなる免疫接合体の治療使用を包含することができる。検出および治療の内視鏡法は、米国特許第4,932,412号明細書、第5,525,338号明細書、第5,716,595号明細書、第5,736,119号明細書、第5,922,302号明細書、第6,096,289号明細書、および第6,387,350号明細書に記載されており、上記特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

任意の有用な核種を、本発明の範囲内で用いることができる。特に好ましいものは、インジウム-111、またはイットリウム-90のようなそれぞれ有用な診断または治療特性を有する放射性核種である。他の有用な核種としては、F-18、P-32、Sc-47、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Zr-89、Tc-99m、Pd-109、Ag-111、In-111、I-123、I-125、I-131、Sm-153、Gd-155、Gd-157、Tb-161、Lu-177、Re-186、Re-188、Pt-197、Pb-212、Bi-212、Bi-213、Ra-223、Ac-225、As-72、As-77、At-211、Au-198、Au-199、Bi-212、Br-76B、C-11、Co-55Co、Dy-166、Er-169、F-18、Fe-52、Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-154-158、Ho-166、I-120、I-121、I-124、In-110、In-111、Ir-194、Lu-177、Mn-51、Mn-52、Mo-99、N-13、O-15、P-32、P-33、Pb-211、Pb-212、Pd-109、Pm-149、Pr-142、Pr-143、Rb-82、Re-189、Rh-105、Sc-47、Se-75、Sr-83、Sr-89、Tb-161、Tc-94、Tc-99、Y-86、Y-90、またはZr-89が挙げられるが、これらに限定されない。

例えば、適当な診断用放射性核種としては、In-110、In-111、Lu-177、F-18、Fe-52、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Zr-89、Tc-94m、Tc-94、Tc-99m、I-120、I-123、I-124、I-125、I-131、Gd-154-158、P-32、C-11、N-13、O-15、R4-186、Re-188、Mn-51、Mn-52m、Co-55、As72、Br-75、Br-76、Rb-82m、Zr-89およびSr-83が挙げられる。典型的な診断用放射性核種は、25-10,000keVの粒子および/または陽電子を放射する。

さらに、適当な治療用放射性核種としては、In-111、Lu-177、Bi-212、Bi-213、At-211、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Y-90、I-125、I-131、P-32、P-33、Sc-47、Ag-67、Ga-111、Pr-142、Sm-153、Tb-161、Dy-166、Ho-166、Re-186、Re-188、Re-189、Pb-212、Ra-223、Ac-225、Fe-59、Se-75、As-77、Sr-89、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Pr-143、Pm-149、Er-169、Ir-194、Au-198、Au-199、Ac-225、およびPb-211が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な治療用カチオンは、20-10,000keVの粒子および/または陽電子を放射する。

有用なβ-粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは20-5,000keVであり、さらに好ましくは100-4,000keVであり、最も好ましくは500-2,500keVである。オージェ放出粒子と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、およびIr-192である。有用なオージェ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは<1,000keVであり、さらに好ましくは<100keVであり、最も好ましくは<70keVである。α粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、およびFm-255が挙げられるが、これらに限定されない。有用なα粒子を放射する放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは2,000-10,000keVであり、さらに好ましくは3,000-8,000keVであり、最も好ましくは4,000-7,000keVである。

他の有用な治療薬としては、光力学療法の一部としてのもののような金属、および中性子捕捉法に基づく療法で重要なもののような核種が挙げられる。具体的には、亜鉛、アルミ、ガリウム、ルテニウムおよびパラジウムが光力学療法に有用であり、B-10、Gd-157およびU-235が中性子捕捉療法に有用である。

金属は、磁気共鳴映像化法などの診断薬にも有用である。これらの金属としては、ガドリニウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが挙げられるが、これらに限定されない。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを装填するには、これを、イオンを結合するための複数のキレート基が結合されている長い尾を有する試薬と反応させることが必要なことがある。このような尾は、ポリリシン、多糖類、または例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス-チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびこの目的に有用であることが知られている類似の基のようなキレート基が結合することができる側基を有する他の誘導体形成したまたは誘導体形成可能な鎖のようなポリマーであることができる。キレートは、標準的化学的方法を用いて抗体にカップリングされる。キレートは、通常は免疫反応性の損失を最小限にしかつ凝集および/または内部架橋を最小限にして分子に対する結合を形成することができる基によって抗体にカップリングされる。キレートを抗体に接合するための他の一層珍しい方法および試薬は、1989年4月25日にHawthorneに発行された「抗体接合体」という標題の米国特許第4,824,659号明細書に開示されており、その開示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。特に有用な金属-キレートの組合せとしては、一般的エネルギー範囲が20 - 2,000keVである診断用同位体と共に用いられる2-ベンジル-DTPA、およびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同一キレートが、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体形成したときには、本発明の抗体と共に用いるときには、MRIに有用である。NOTA、DOTAおよびTETAのような多環キレートは、様々な金属および放射性金属と共に、最も詳細には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と共に用いられる。このような金属-キレート複合体は、環の大きさを目的の金属に調整することによって極めて安定にすることができる。RAITについて²²³Raのような核種を安定に結合するのに重要な多環ポリエーテルのような他の環型キレートは、本発明に包含される。

治療上有用な免疫接合体は、光活性剤または色素を抗体複合体に接合することによって得ることができる。蛍光色素のような蛍光組成物、および可視光線に感受性のポルフィリンのような他の色原体または色素を用いて、適当な光線を病変に向けることによって病変部を検出し、治療が行われてきた。療法では、これは、光放射線、光線療法または光力学療法と呼ばれてきた(Jori et al.(監修),「腫瘍および他の疾患の光力学療法」(Libreria Progetto 1985)、 van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986))。さらに、光線療法を行うために、モノクローナル抗体を光活性化色素とカップリングしてきた。Mew et al., J. Immunol. 130:1473, 1983、同上, Cancer Res. 45:4380, 1985、Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744, 1986、同上, Photochem. Photobiol. 46:83, 1987、Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471, 1989、Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422, 1989、Pelegrin et al., Cancer 67:2529, 1991。しかしながら、これらの初期の研究は、内視鏡療法の使用、特に抗体断片または下位断片の使用は包含しなかった。従って、本発明は、光活性剤または色素を含んでなる免疫接合体の治療での使用を意図する。

本発明に適当な常磁性イオンとしては、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)およびエルビウム(III)が挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。

X線映像化のような他の文脈で有用なイオンとしては、ランタン(III)、金(III)、鉛(II)、および特にビスマス(III)が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、イソチオシアネート中間体を介して連結されることが多い。

放射線不透過性およびコントラスト材料は、X線の増強およびコンピューター断層撮影法に用いられ、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが挙げられる。特異的化合物としては、バリウム、ジアトリゾエート、エチオダイズドオイル(ethiodized oil)、クエン酸ガリウム、イオカルム酸(iocarmic acid)、イオセタム酸(iocetamic acid)、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、ヨーグラミド、ヨーヘキソール、ヨーパミドール、ヨーパン酸、ヨープロセム酸、ヨーセファム酸、ヨーセル酸、ヨースルファミドメグルミン、ヨーセメト酸、ヨータスル、ヨーテトル酸、ヨータラム酸、ヨートロクス酸、ヨーキサグル酸、ヨーキソトリズ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化第一タリウムが挙げられる。

「医薬組成物」とは、薬物を含んでなる組成物であってキャリヤーが薬学上許容可能なキャリヤーであるものを表し、一方、「獣医組成物」とは、キャリヤーが獣医学上許容可能なキャリヤーであるものである。「薬学上許容可能なキャリヤー」または「獣医学上許容可能なキャリヤー」は、生物学的にまたは別の点では望ましくないものではない任意の媒質または材料を包含し、すなわち、キャリヤーは生体に本発明の組成物または化合物と共に任意の望ましくない生物学的効果を引き起こしまたは有害なやり方で複合体またはその成分のいずれかまたは生体と共に相互作用することなく投与することができる。薬学上許容可能な試薬の例は、合衆国薬局方、ザ・ナショナル・フォーミュラリー、ユナイテド・ステーツ・ファーマコペイアル・コンベンション、インコーポレーテド、ロックビル、メリーランド州1990年に提供されており、「医薬投与形態および薬剤送達系」第7版, Ansel et al.監修, Lippincott Williams & Wilkins, 1999年に記載されているように、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

薬物(すなわち、ターゲッティング可能な構築物または複合体)は、患者に所望な効果を生じるのに十分な量で医薬組成物に包含される。本発明の医薬組成物は、さらに希釈剤および賦形剤のような他の化学的成分を含んでなることができる。「希釈剤」は、溶媒、好ましくは水性溶媒に希釈した化合物であり、溶媒への薬物の溶解を促進するものであり、薬物またはその成分の1以上の生物活性形態を安定化する働きをすることもできる。緩衝液に溶解した塩は、当該技術分野は希釈剤として用いられる。例えば、好ましい希釈剤は、リン酸塩緩衝食塩水(特に、薬学的投与を意図した組成物と共に)であり、これはヒト血液の塩の状態を模倣しているからである。緩衝剤塩は低濃度の溶液のpHを制御することができるので、緩衝希釈剤は生物活性ペプチドの生物活性をまれに改質することがある。

「賦形剤」とは、適当な特性、例えば適当なコンシステンシーを付与しまたは薬物を形成するために組成物に加えることができる任意の事実上不活性な物質である。適当な賦形剤およびキャリヤーとしては、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールなどの糖質、またはソルビトールセルロース製剤、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、寒天、ペクチン、キサンタン、ガム、グーアガム、イナゴマメガム、ヒアルロン酸、カゼインジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、ポリアクリレート、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)のような充填剤が挙げられる。所望ならば、崩壊剤を含むこともでき、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩である。他の適当な賦形剤およびキャリヤーとしては、ヒドロゲル、ゲル化可能なヒドロコロイド、およびキトサンが挙げられる。キトサン微小球およびマイクロカプセルは、キャリヤーとして用いることができる。WO 98/52547号明細書(胃へのターゲッティング化合物の微小球処方物を記載し、この処方物は、1種類以上の活性成分を含む内部コア(場合によっては、ゲル化ヒドロコロイドを含む)、(複数の)活性成分の放出速度を制御するため水不溶性ポリマー(例えば、エチルセルロース)から構成される膜、および生体吸着性カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性多糖類、カチオン性タンパク質、および/または合成カチオン性ポリマーから構成される外層を含んでなる。米国特許第4,895,724号明細書)を参照されたい。典型的には、キトサンは、適当な薬剤、例えばグルタルアルデヒド、グリオキサール、エピクロルヒドリン、およびスクシンアルデヒドを用いて架橋する。キトサンをキャリヤーとして用いる組成物は、ピル、錠剤、微小粒子、および微小球などの様々な投薬形態、例えば(複数の)活性成分の制御放出を行う形態に処方することができる。他の適当な生体吸着性カチオン性ポリマーとしては、酸性ゼラチン、ポリガラクトサミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンのようなポリアミノ酸、ポリ第四化合物、プロラミン、ポリイミン、ジエチルアミノエチルデキストラン(DEAE)、DEAE-イミン、DEAE-メタクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-デキストラン、DEAEセルロース、ポリ-p-アミノスチレン、ポリオキセタン、コポリメタクリレート、ポリアミドアミン、カチオン性澱粉、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン、およびポリビニルピリジンが挙げられる。

本発明のターゲッティング可能な構築物および複合体は、任意の適当な手法で処方することができる。ターゲッティング可能な構築物および複合体は、均一に(均質に)または不均一に(不均質に)キャリヤーに分散することができる。適当な処方物としては、乾燥および液体処方物が挙げられる。乾燥処方物としては、冷凍乾燥および凍結乾燥粉末であって、副鼻腔または肺へのエアゾール送達、または投与前に適当な希釈剤で再構成する前の長期間の保管に特に適しているものが挙げられる。他の好ましい乾燥処方物としては、本発明による医薬組成物を圧縮して経口投与に適する錠剤またはピル形態とし、混合して徐放性処方物とする。医薬組成物が経口投与を目的とするが、ターゲッティング可能な構築物または複合体を腸の上皮に送達しようとするときには、処方物を腸溶性コーティングでカプセル化して処方物を保護し、その中に含まれるターゲッティング可能な構築物および複合体の早期放出を防止するのが好ましい。当業者であれば理解されるように、本発明の医薬組成物は任意の適当な投薬形態にすることができる。ピルおよび錠剤は、このような投薬形態のものである。医薬組成物は、例えば圧縮、浸漬、パンコーティング、噴霧乾燥などによって任意の適当なカプセルまたは他のコーティング材料中にカプセル化することもできる。適当なカプセルとしては、ゼラチンおよび澱粉から作られているものが挙げられる。また、所望ならば、これらのカプセルを1種類以上の追加材料、例えば腸溶性コーティングでコーティングすることができる。液体処方物としては、水性処方物、ゲル、およびエマルションが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、モノクローナル抗体の生体、好ましくは動物、好ましくは哺乳類、鳥類、魚類、昆虫、または蜘蛛類への投与を容易にする。好ましい哺乳類としては、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、およびブタのような動物、およびヒト以外の霊長類が挙げられる。ヒトが特に好ましい。当該技術分野には、化合物を投与しまたは送達する多数の手法があり、経口、直腸(例えば、浣腸または座薬)、エアゾール(例えば、鼻または肺への送達)、非経口(例えば、静脈内、筋肉内、皮下)、および局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、十分な量の本発明の組成物または化合物を目的の効果を達成するために送達する。送達される組成物または化合物の特定の量は、達成すべき効果、組成物を送達する生物の種類、送達経路、投薬方法、および生物の年齢、健康および性別など多くの因子によって変化する。従って、所定の処方物に含まれる本発明の組成物または化合物の特定の投薬量は、通常の技術を有する当業者の裁量に任される。

当業者であれば、本発明による医薬組成物を特定の所望な生物学的成果を達成するための薬剤として投与し、これらの成果が(ワクチン接種などの)(複数の)治療または防御効果を包含することがあるときには、本発明による組成物または化合物を適当な薬学キャリヤーと合わせる必要があることを理解されるであろう。薬学キャリヤーの選択および治療または防御薬としての組成物または化合物の調製は、所期の用途および投与の様式によって変化する。治療薬の適当な処方物および投与法としては、経口、肺、鼻、口腔、目、皮膚、直腸、または膣への送達のためのものが挙げられるが、これらに限定されない。

用いられる送達様式によっては、状況によって変化する機能的なものを、様々な薬学上許容可能な形態で送達することができる。例えば、状況によって変化する機能的なものを、固形物、溶液、エマルション、分散液、ミセル、リポソームなどピル、カプセル、錠剤、座薬、エアゾール、点滴、またはスプレーに組込んだ形態で送達することができる。ピル、錠剤、座薬、エアゾール、粉末、小滴、またはスプレーは、複雑な多層構造を有しかつ大きな粒径範囲を有することができる。エアゾール、粉末、小滴およびスプレーの粒度は、小さなもの(1μm)から大きなもの(200μm)までの範囲とすることができる。

本発明による医薬組成物は、固形物、凍結乾燥粉末、溶液、エマルション、分散液、ミセル、リポソームなどの形態で用いることができ、生成する組成物が1種類以上の本発明のターゲッティング可能な構築物または複合体を活性成分として、腸溶性または非経口用途に適する有機または無機キャリヤーまたは賦形剤と混合して含む。活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、座薬、溶液、エマルション、懸濁液、および使用に適する任意の他の形態用の通常の非毒性の薬学上許容可能なキャリヤーと混合することができる。用いることができるキャリヤーとしては、グルコース、ラクトース、マンノース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉ペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシ澱粉、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモ澱粉、尿素、中鎖長のトリグリセリド、デキストラン、および固形物、半固形物または液体形態の製剤の製造に用いるのに適している他のキャリヤーを挙げることができる。さらに、助剤、安定剤、増粘剤、および着色料、および香料を用いることができる。安定化乾燥剤の例としては、好ましくは0.1%以上の濃度のトリウロースが挙げられる(例えば、米国特許第5,314, 695号明細書を参照されたい)。

個人の要望によって変化することがあるが、医薬組成物の有効量についての最適範囲は、当該技術分野の技術の範囲内で決定される。ヒトの用量は、動物の研究から外挿することができる(「レミントンの薬科学」第18版、Gennaro監修、Katocs et al.,第27章, Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルバニア州、1990年)。一般に、当業者が調整することができる医薬組成物の有効量を提供するのに必要な投薬量は、患者の年齢、健康、肉体条件、体重、疾患または障害の種類および程度、治療の頻度、同時治療(もし、行う場合には)の性質、および所望な(複数の)効果の性質および範囲によって変化する。例えば、「グッドマンとギルマンの治療薬の薬理学的基礎」第9版、Hardman et al.監修、Nies et al.,第3章、McGraw-Hill、ニューヨーク、ニューヨーク州、1996年を参照されたい。

治療組成物の用量は、治療を行う疾患の重篤度および感受性、数日間から数ヶ月間、または治癒しまたは疾患状態の縮小が達成されるまで継続する治療経路によって変化する。最適投与計画は、患者の身体における薬剤蓄積の測定により計算することができる。「患者」という用語は、動物(例えば、ネコ、イヌ、およびウマ)並びにヒトを包含するものである。通常の技術者であれば、最適投薬量、投与法、および反復速度を容易に決定することができる。最適投薬量は個々の治療薬の相対的効力によって変化することがあり、一般にイン・ビトロおよびイン・ビボ動物モデルで有効であることが見出されているED₅₀に基づいて予測することができる。

一般に、異なる哺乳類に対する治療薬の効果は広範囲に変化し、用量は典型的にはヒトではラットの(単位体重当たり)20、30または40分の1であるので、用量(ターゲッティング可能な構築物または複合体の投与量)の範囲は広い。一般に、投薬量は、体重1kg当たり0.01μg - 100mgであり、好ましくは0.01μg - 10mg/kg体重であり、0.01μg - 50mg/kg体重であり、0.01μg - 100 mg/kg体重であり、0.01μg - 10 mg/kg体重であり、0.01μg - 1mg/kg体重であり、 0.01μg - 100μg/kg体重であり、 0.01μg - 10μg/kg体重であり、 0.01μg - 1μg/kg体重であり、0.01μg - 10μg/kg体重であり、 0.01μg - 1μg/kg体重であり、 0.01μg - 0.1μg/kg体重であり、範囲は、前の濃度範囲の境界に基づいている。従って、投薬量の上記説明は、10mg - 100mg/kg体重、1.0mg - 100mg/kg体重、0.1mg - 100mg/kg体重などの範囲内の投薬量を包含する。

投薬は、毎日、週、月または年に1回以上、または2 - 20年に1回ずつ行うことができる。当該技術分野で通常の技術を有するものであれば、体液または組織におけるターゲッティング可能な構築物または複合体の滞留時間および濃度の測定値に基づいて投与の反復速度を容易に予測することができる。良好な治療に続いて、疾患状態の再発を防止するために患者が維持療法を受けるのが望ましいことがあり、治療薬は0.01μg - 100mg/kg体重の維持用量で、1日1回以上から20年毎に1回投与される。

特異的用量は、患者の近似的体重または表面積に従って計算される。適当な投薬量の決定における他の因子としては、治療または予防する疾患または疾病、疾患の重篤度、投与経路、患者の年齢、性別、および医学的条件を挙げることができる。治療のための適当な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる改善は、特に本明細書に開示された投薬情報および分析法を考慮して当業者によって日常的に行われる。投薬量は、適当な用量-応答データーと共に用いられる投薬量を決定するための既知分析法を使用することによって決定することもできる。

個別の患者の投薬量は、疾患の進行を観察しながら、調整することができる。患者におけるターゲッティング可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に達するかまたはこれを保持するのに投薬量を調整する必要があるかどうかを見ることができる。ファーマコゲノミックス(pharmacogenomics)を用いて、どのターゲッティング可能な構築物および/または複合体、およびその投薬量が所定の個人に最も有効と思われるかを決定することができる(Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308:43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308:33-41, 2001)。

本発明のヘテロ接合体は、好ましくはカテーテルを介する灌流によるまたは病巣部への直接投与による静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内などの非経口的に投与する。これは、1日1回以上、1週間に1回以上、1月に1回以上、および1年に1回以上投与することができる。

本明細書に記載または引用された文献、特許明細書および特許出願明細書、および他の総ての書類、およびエレクトロニクスにより入手可能な情報の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。出願人らは、あらゆるこれらの文献、特許明細書、特許出願明細書、または他の文書からの任意および総ての材料および情報を本出願明細書に物理的に組み入れる権利を保有する。

本明細書に例示的に記載した発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要件または要件類、制限または制限類の非存在下で適当に実施することができる。従って、例えば、「含んでなる」、「包含する」、「含む」などの用語は、拡張的かつ制限なしに読むべきである。また、本明細書に用いられている用語および表現は説明の用語としてかつ制限の用語としてでなく用いられており、示されおよび記載された特徴またはその部分と同等なものを除外する用語および表現に使用する意図はないが、特許請求する本発明の範囲内では様々な修飾が可能であることが認められる。従って、本発明を好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書に包含され開示された本発明は当業者が修飾および変更することができ、またこれらの修飾および変更は本発明の範囲内にあると考えられると理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に具体的に記載したもの以外の別の方法で実施することができる。

本発明を、本明細書では広義にかつ包括的に記載してきた。この包括的開示の範囲内にあるより狭い種および亜属群のそれぞれも、本発明の部分を形成する。これは、切り取られた材料が具体的に本明細書に再度引用されているかどうかには関わりなく、この属から任意の材料を除去するという条件または負の制限で本発明の包括的説明を包含する。

さらに、本発明の特徴または態様がMarkushグループによって記載されている場合には、当業者であれば、本発明は、Markushグループの任意の個々の成員または成員の亜群によっても記載されていることを認めるであろう。

材料および方法
bsAbは、2個の親Fab'断片をSharkey et al., Cancer Research 63:354-363, 2003に記載のo-フェニレンジマレイミドで連結することによって調製した。総てのイン・ビトロでの検討は、CD20、CD22およびCD74を発現するヒトバーキットリンパ腫細胞系であるダウディを用いて行った。腫瘍細胞は、10%ウシ胎児血清(Hyclone,カタログ番号SH 30070.03)、L-グルタミン(GIBCO-Invitrogen,カタログ番号25030-149)最終濃度2 mM、ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO-Invitrogen,カタログ番号15140-122)最終濃度ペニシリン100U/mLおよび ストレプトマイシン100μg/mLを補足したRPMI 1640(GIBCO-Invitrogen,カタログ番号21870-084)を含む培地で増殖させた。マウス抗ヒトIgM抗体(Southern Biotechnology Associates, Inc.,カタログ番号9020-01)を、B細胞抗原受容体に結合したときにアポトーシスを誘発する能力についてのポジティブコントロールとして用いた。細胞培地で増殖するダウディ細胞は、変更のない細胞増殖についてのネガティブコントロールとして用いた。

いくつかの極めて感度が高くかつ相補的フローサイトメトリー分析法を用いて、これらの分析法の試薬も製造しているGuava Technologies, Inc.(ヘイワード, カリフォルニア)から購入したGuava PCA装置で細胞増殖阻害およびアポトーシスを評価した。

Guava ViaCount Assayを用いて、生育可能な細胞数、総細胞数、およびGuava ViaCount Reagentで供給されるDNA結合色素への透過性に基づいて生育可能および非生育可能細胞を差分染色することによって生育率%を測定した。

アポトーシスを測定するため、Guava Nexin Assayを用いた。Annexin V-PEおよびNexin 7-AADにより、アポトーシス細胞(Annexin V-PE陽性)を初期段階(7-AAD陰性)および後期段階(7-AAD陽性)に分類することができる。Annexin Vは、ホスファチジルセリン(PS)に高親和性を有するカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。Annexin V-PEは、アポトーシスの誘発によって細胞膜の外側に移動したPSに結合する。Nexin 7-AADは、膜崩壊後の細胞内の核材料に結合するので、膜構造の完全性の指示薬として用いられる。

Guava MultiCaspase Assayでは、活性化カスパーゼを測定するためSR-VAD-FMKと呼ばれるカスパーゼの細胞透過性の非細胞傷害性の蛍光色素を接合した阻害薬が用いられる。細胞内部では、SR-VAD-FMKは、アポトーシスで活性化された複数のカスパーゼに共有結合する。生成するシグナルは、細胞中に存在する活性カスパーゼ酵素の数に比例する。有意な陽性SR-VAD-FMK染色細胞は、初 - 中期アポトーシス段階にある。MultiCaspase Assayは、後期段階のアポトーシス細胞および死細胞を検出するための7-AADも包含する。

Guava TUNEL Assayを用いて、DNA分解が起こっているときの中 - 後期段階のアポトーシスにおける細胞を定量した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて、ニック末端標識によって3'-ヒドロキシル末端における断片化核DNAへのBrdU残基の組込みを触媒する。その後、蛍光性のTRITC接合抗BrdU抗体を加えて組込んだBrdU残基に結合させることによって、アポトーシス細胞(TRITC陽性)を標識する。非アポトーシス細胞はTRITC陰性である。

インターナリゼーションの検討は、二重特異性抗体の結合後に最初はFITC接合ヤギ抗ヒトFab(Sigma,カタログ番号F5512)を用いて評価した。FITC接合ヤギ抗ヒトFabによってバックグラウンド型かくなるため、以後の検討は蛍光色素Alexa488に直接接合した二重特異性抗体を用いて行った。染色細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化した。

結果および論考
Guava Nexin Assayによって測定されるダウディ細胞上の3種類のbsAb(hLL2 x hA20、hA20 x hLL1、およびhLL2 x hLL1)を、図1に示す。ダウディ細胞のアポトーシスは、試験を行った3濃度(0.1、1.0、および10μg/mL)で用量依存的にhLL2 x hA20で明確に観察された。ダウディ細胞に10μg/mLを24時間投与したところ、細胞の約25%は、アネキシンV結合によって評価されるように、初期アポトーシスであった。対照的に、同一濃度のhA20 x hLL1は、ダウディ細胞で総ての時点においてアポトーシスを誘発するのにhLL2 x hA20ほど有効ではなかった。hLL2 x hLL1については、同様の条件下ではアポトーシス効果はほとんどまたは全く見られなかった。

これらの結果は、B細胞上のCD22およびCD20を同時にターゲッティングすることができるhLL2 x hA20のようなbsAbは、ダウディ細胞のアポトーシスを誘発することができかつ生育可能な個体数を減少させることができ、さらなる架橋を必要としないことを示している。

表1には、ダウディ細胞上でhLL2 x hA20についてGuava Nexin Assayによって得た結果をまとめてある。hLL2 x hA20によって誘発された初期段階のアポトーシス細胞%は、三つの時点のそれぞれにおけるαIgMコントロールに匹敵した。10μg/mLでのhLL2 x hA20について観察されたアポトーシスの程度は、24時間ではhLL2 F(ab')₂とhA20 F(ab')₂の混合物(それぞれ5μg/mL)について観察されたものの約7倍であり、48および72時間後では2 - 3倍であった。

hLL2 x hA20について観察されたアポトーシス効果を、表2に示した第二のバッチで確かめた。

Guava MultiCaspase AssayおよびGuava TUNEL分析法からの予備結果も、ダウディ細胞上でのhLL2 x hA20のアポトーシス効果がカスパーゼ活性化およびDNA断片化を伴うことも示した。hLL2 x hA20 (10μg/mL)を投与した細胞個体数の約11%は、24時間後のMultiCaspase Assay(対未処理1%)および24時間後のGuava TUNEL Assay(対未処理9%)によって49%陽性であることによって示されるように中期アポトーシス段階にあることが分かった。

インターナリゼーションの検討では、hLL2 x hA20は、ダウディへの結合によって、細胞表面上の受容体が別個のパッチまたはクラスターへ凝集し、これは後でインターナリゼーションすることを示した。

上記の説明は特定の態様を表しているが、本発明はこれらに限定されないことが理解されるであろう。開示した態様に対して様々な修飾を行うことができ、これらの修飾を本発明の範囲内にあるようにすることが、当業者であれば考えつくであろう。

本明細書に引用した総ての公表文献、および特許出願明細書および特許明細書の全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

グァバ-ネキシン分析法(Guava Nexin Assay)によって測定されるアポトーシスを誘発するための表示された濃度の3種類のBsAb(hLL2 x hA20、hA20 x hLL1、およびhLL2 x hLL1)のダウディに対する効果。ダウディ細胞(0.8 x 10⁵)は、200μl培地のものを48穴プレートに播種した。試験したBsAb (200μl)を、2倍濃縮溶液から細胞に加えた。3種類のコントロールが包含された: (1)ネガティブコントロールは、培地のみで増殖する細胞によって提供され、(2)アポトーシスのポジティブコントロールは、抗IgM抗体とインキュベーションした細胞によって提供され、(3)抗体コントロールは、試験BsAbと同一の対の抗原をターゲッティングする2種類の親F(ab')₂と共にインキュベーションした細胞によって提供された。プレートを37℃でインキュベーションし、5%CO₂を供給した。選択した時点で、分析を行い、初期アポトーシスにおける細胞%を測定した。

Claims (16)

1. 一つの第一の結合アームと一つの第二の結合アームとを少なくとも含んでなるヘテロ接合体であって、
   前記第一の結合アームが、前記第二の結合アームと異なる結合特異性を有し、
   前記第一の結合アームが、抗CD20モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、
   前記抗CD20モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、hA20抗体の軽鎖および重鎖のCDRを含む抗体が結合するCD20のエピトープと同じエピトープに結合するものであり、
   前記第二の結合アームが、抗CD22モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、
   前記抗CD22モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、hLL-2の軽鎖および重鎖のCDRを含む抗体が結合するCD22のエピトープと同じエピトープに結合するものであり、
   １０μg/mlの前記ヘテロ接合体とダウティ細胞とが２４時間接触したときに、前記ヘテロ接合体が、１８．４±８．８％のダウティ細胞において、初期段階のアポトーシスを誘発しうる、ヘテロ接合体。
2. 一つの第一の結合アームと一つの第二の結合アームとを少なくとも含んでなるヘテロ接合体であって、
   前記第一の結合アームが、前記第二の結合アームと異なる結合特異性を有し、
   前記第一の結合アームが、抗CD20モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、
   前記抗CD20モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、hA20抗体の軽鎖および重鎖のCDRを含み、
   前記第二の結合アームが、抗CD22モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、
   前記抗CD22モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、hLL-2抗体の軽鎖および重鎖のCDRを含み、
   １０μg/mlの前記ヘテロ接合体とダウティ細胞とが２４時間接触したときに、前記ヘテロ接合体が、１８．４±８．８％のダウティ細胞において、初期段階のアポトーシスを誘発しうる、ヘテロ接合体。
3. 前記抗C20抗体および抗C22抗体がそれぞれ、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク配列を含む、請求項１または２に記載のヘテロ接合体。
4. 前記第一および第二の結合アームが、互いに接合されていない状態では、アポトーシス活性を有しないものである、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
5. 前記ヘテロ接合体が、前記第一および前記第二の結合アームを含んでなる融合タンパク質を含んでなるものである、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
6. 前記第一および前記第二の結合アームが、化学結合を介して接合している、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
7. 前記ヘテロ接合体が互いに架橋することなく用量依存的にアポトーシスを誘発する、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
8. 前記第一の結合アームが、リンパ腫または固形腫瘍と関連したヒト腫瘍ターゲットに特異的に結合する、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
9. 3つ以上の抗原に結合する多重特異性ヘテロ接合体である、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
10. 前記結合アームが、ヒト、ネズミ、キメラ、霊長類化、またはヒト化抗体または抗原結合フラグメントである、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
11. IgG x Fab'、IgG x sFv、F(ab')₂ x Fab'、Fab' x Fab'、Fab' x sFv、(sFv x sFv)₂、sFv x sFv、ダイアボディー(diabody)、トリアボディー(triabody)、テトラボディー(tetrabody)およびクィンタボディーからなる群から選択される構造を有するものである、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
12. 二重特異性抗体、または3つ以上の特異結合タンパク質を有する多重特異性抗体からなる、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
13. 前記二重特異性抗体が、二価のFab' x Fab'構造を有するものである、請求項１２に記載のヘテロ接合体。
14. キレート剤、化学療法薬、酵素、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種、ホウ素化合物、光活性剤および毒素からなる群から選択される少なくとも一つの化合物をさらに含んでなる、請求項1または２に記載のヘテロ接合体。
15. 前記化合物が、DTPA、DOTA、TETA、NOTA、および検出可能な標識または細胞傷害剤に接合しうる適当なペプチドからなる群から選択されるキレート剤である、請求項１４に記載のヘテロ接合体。
16. 前記化合物が、アントラサイクリン、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写因子の拮抗物質または阻害剤、アルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位錯体、COX-2阻害剤、アポトーシス剤、サリドマイドおよびその誘導体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤または拮抗薬からなる群から選択される化学療法薬である、請求項１４に記載のヘテロ接合体。

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