CN105229036B - 在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其制备方法 - Google Patents
在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105229036B CN105229036B CN201480027216.5A CN201480027216A CN105229036B CN 105229036 B CN105229036 B CN 105229036B CN 201480027216 A CN201480027216 A CN 201480027216A CN 105229036 B CN105229036 B CN 105229036B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bispecific
- amino acid
- antibody
- leucine
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 44
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 17
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- -1 Her3 Proteins 0.000 claims description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 10
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101100481404 Danio rerio tie1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 101100481406 Mus musculus Tie1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000002801 charged material Substances 0.000 description 4
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 3
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 2
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010025538 Malignant ascites Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SCVVSSZVLZQUDZ-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2,6-dihydro-1H-pyrimidine-2-carboxylic acid Chemical compound CN1C(NCC=C1)C(=O)O SCVVSSZVLZQUDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 101100044298 Drosophila melanogaster fand gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710194995 Interleukin-12 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100036701 Interleukin-12 subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 101710187487 Interleukin-12 subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 description 1
- 101710186083 Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 1
- 102100035012 Interleukin-17 receptor C Human genes 0.000 description 1
- 101710186068 Interleukin-17 receptor C Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100335198 Pneumocystis carinii fol1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/247—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
Abstract
本发明提供了一种蛋白或抗体,其中,在选自所述蛋白的疏水性相互作用位点内的一对疏水性氨基酸之中,一个疏水性氨基酸转化成带有正电荷的物质,而另一个疏水性氨基酸转化成带有负电荷的物质,并且借助所述正电荷和所述负电荷而在所述蛋白的所述疏水性相互作用位点内引入静电相互作用。本发明还提供了一种制备所述蛋白或抗体的方法,以及一种使用所述抗体测量重链与轻链之间的偶合程度的方法。根据本发明的所述蛋白或抗体受到同源二聚体或单体的污染较低,并因此能以高纯度得到异源二聚体。
Description
【技术领域】
本发明涉及具有高纯度的异源双特异性抗体(BsAb)或双特异性融合蛋白(BsFp)。
【背景技术】
大多数双特异性抗体(BsAb)均通过人工制造以同时结合两个不同的靶标,而不是通常在自然界中产生。双重靶向能力为BsAb提供了新的尚未被单特异性抗体(MsAb)涉足的应用领域。对治疗性目的的特别关注是引人深思的可能性,以使得BsAb(1)可靠地将免疫细胞募集到靶细胞附近,(2)抑制或激活靶细胞中两个相隔较远的信号传导通路以产生协同效应,以及(3)以特异性和调控方式递送辐射诱导的治疗性物质、药品、毒素或信号传导分子。
BsAb通常用于以非MHC依赖性方式将T细胞递送到肿瘤细胞中,从而介导肿瘤细胞的细胞表面抗原与细胞毒性T细胞的CD3-TCR复合物之间的联系(图1)。图1中的卡妥索单抗(大鼠-小鼠混合单克隆抗体)用于治疗恶性腹水,其称为“三功能抗体”。
完整的链缔合应在两个不同的水平上发生,以便产生修饰最少的全长IgG样的BsAb,而无任何链缔合问题。(1)两条重链应为异源双特异性的,并且(2)两条轻链(LC)应与其相应的重链正确配对。
链缔合问题应加以解决以按值得信赖的方法产生BsAb。如图2中所示,两条重链和两条轻链的组合生成了10个不同形式的抗体嵌合体。在它们之中,仅有一个是正确的BsAb,而其余的是无价值的嵌合体。该链缔合问题在工业领域中将正确的BsAb的产率降低至至少10倍,并导致难以将BsAb与其他嵌合体分离的各种问题。因此,许多制药公司花费了大量的资源并努力开发和获得以直接且可靠的方式产生BsAb的技术。
已开发了多种多样的BsAb相关技术(45种不同的形式)。这些技术基于结构而被分成4类。第一,通过包括称为Knob-into-Hole或简称为KiH的结构互补性、静电指向效应或CH3结构域混编(称为SEEDbodyTM)的各种方法对重链进行的异源双特异化;第二,各种抗体片段形式,诸如DiabodyTM、BiTETM和DARTTM;第三,使用与完整抗体相结合的一个或多个功能性结构域的技术,诸如Modular AntibodyTM、ZybodyTM、dAbsTM和DVD-IGTM;第四,采用全长IgG类似方案的技术,如DuobodyTM(Fab-Arm Exchange)、CrossMabTM、AzymetricTM和kIbodyTM,已得到开发。
在它们之中,Zymeworks通过美国专利申请第2013-892198号(对在Fc结构域中具有突变的异源多聚体免疫球蛋白链的结构专利提出了权利要求)表明异源多聚体结构的抗体可通过用带电荷的氨基酸对二硫键中涉及的半胱氨酸残基进行修饰而制备。
然而,以上任何专利均未公开这样一种技术:选自疏水性相互作用部分的修饰氨基酸对通过静电相互作用而引起与彼此选择性偶合。本发明人已通过确认以下方面而完成了本发明:当将疏水性相互作用中涉及的一对氨基酸分别修饰成酸性氨基酸和碱性氨基酸时,异源双特异化更具选择性地发生。
【发明内容】
【技术问题】
本发明的目的在于提供具有优异的异源双特异化的双特异性抗体(异源二聚体)。
本发明的另一个目的在于提供一种通过将疏水性相互作用中的一对氨基酸改变成彼此相反的电荷而制造异源双特异化很好地发生的蛋白的方法。
【技术方案】
对于以上目标,本发明的第一方面是提供通过上述负电荷和上述正电荷而引入了静电相互作用的蛋白,其中一对疏水性氨基酸选自蛋白的疏水性相互作用的一部分,将一个疏水性氨基酸改变成正电荷,并将另一个疏水性氨基酸改变成负电荷。带有正电荷的材料可以是碱性氨基酸但不限于此,带有负电荷的材料可以是酸性氨基酸但不限于此。
疏水性氨基酸是选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸中的任一种氨基酸,并且酸性氨基酸是选自天冬氨酸或谷氨酸的任一种氨基酸。
从两个不同的HC/LC对来组装全长IgG类似的双特异性抗体通过两个链缔合过程进行。换句话讲,HC异源双特异化和富有成效的HC/LC配对,及其在两条重链之间的成功率取决于区分重链与轻链的效率。
为了找到适当的变异位点,已关注了抗体的链之间的疏水性界面上的氨基酸残基,因为疏水性相互作用是蛋白折叠和结合的主要驱动力。为了选择如同疏水性相互作用一样强大的适当类型的修饰(因为其提供解决双特异性抗体的链缔合问题所必需的蛋白鉴别力),已选择了静电相互作用。
据设想,此类链之间的区别通过在两条结合链之间的界面处引入结构修饰的互补配对而解决。一个或多个疏水性氨基酸被突变的带电荷的氨基酸替换以与对应物配对。这样的变化在下文中称为SHOCAP(将疏水性置换成带相反电荷的氨基酸对)。两条重链的Fc结构域中的SHOCAP生成带正电和带负电的重链(各自称为Ha和Hb)。这些静电相互作用比重链的同源双特异化(同源二聚化)更偏向于异源双特异化(异源二聚化)。以相同的方式,通过SHOCAP对两个Fab结构域的修饰形成带正电和带负电的轻链(分别称为La和Lb),并且与重链的带相反电荷的Fab结构域的静电相互作用提高了正确HC/LC配对的概率。
为了在无任何链缔合问题的情况下产生BsAb,将两个独立的修饰引入天然存在的抗体中。一个针对Fc结构域的异源双特异化,而另一个针对重链与轻链的正确配对。
在本发明中,Fc结构域的异源双特异化(异源二聚化)在抗体的Fc结构域中的一个或多个疏水性相互作用转化成静电对相互作用(例如,第407位残基处的两个酪氨酸的疏水性相互作用(Y407:Y407)转化成第407位残基处天冬氨酸和赖氨酸的静电对相互作用(D407:K407))时可靠且积极地发生。
当Fab结构域的主要疏水性残基被置换时(例如,第128位残基的亮氨酸和第118位残基的苯丙氨酸(L128:F118)置换成第128位残基的赖氨酸和第118位残基的天冬氨酸(K128:D118))时,使用SHOCAP技术可较为容易地区分两条重链(重链)和两条轻链(轻链)。因此,IgG类似的双特异性抗体可通过将SHOCAP技术应用于抗体的Fc和Fab结构域而生成。
本发明的第二方面是提供这样的抗体,其中已通过将一个疏水性氨基酸突变成带正电的氨基酸并将另一个突变成带负电的氨基酸而将静电相互作用引入了疏水性相互作用区。以上正电荷可以是碱性的但不限于此,并且以上负电荷可以是酸性的但不限于此。
具体地,抗体因以下两者之间的静电相互作用而具有结合力:任一个氨基酸突变成选自天冬氨酸或谷氨酸的酸性氨基酸,而另一个突变成选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性氨基酸,其中,突变被引入选自以下的一个或多个氨基酸对:CH3结构域中的351亮氨酸和351亮氨酸疏水性相互作用对、395脯氨酸和397缬氨酸疏水性相互作用对、395脯氨酸和395脯氨酸疏水性相互作用对、407酪氨酸和407酪氨酸疏水性相互作用对;以及人抗体的CH1结构域与CL结构域之间的128亮氨酸和118苯丙氨酸对、128亮氨酸和133缬氨酸对、141丙氨酸和116苯丙氨酸对、141丙氨酸和135亮氨酸对、145亮氨酸和133缬氨酸对、170苯丙氨酸和135亮氨酸对、185缬氨酸和118苯丙氨酸对以及185缬氨酸和135亮氨酸对。更具体地,抗体被表征为在选自表4中的Z0至Z14的一组组合上发生突变。抗体可带有一对具有一对功能的胞外域。胞外域可在癌症和信号传导中发挥作用,并且该毒素可用于治疗通过另一种特异性抗体结合的与细胞死亡相关的癌症。胞外域可以是选自TNR2、Her3、Tie2、TGFbR1、BMPbR1、Il-12R-b1、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、INFAR1、IL-12A、IL-4、InFa、BMP2、IL-1R1L、IL-17RA、IL-17A、Fas、FltD2、Her1、Tie1、TGFbR2、IL-12R-b2、IL-13Ra1、ITGB1、ITGB3、INFAR2、IL-12B、IL-13、INFb、BMP7、IL-1RAP、IL-17RC和IL-17F但不限于此的一对胞外域。更具体地,抗体可与选自Her2/FltD2组合、Her1/Her3组合和Tie/Tie2四氢甲基嘧啶羧酸的胞外域组合融合。更具体地,其可以是双特异性抗体,该抗体具有突变成Z14组合的重链以及同时包含甲型流感病毒特异性的4D9胞外域和乙型流感病毒特异性的2B9胞外域的轻链。更具体地,以上抗体可以是具有增强的重链与轻链之间的配对的抗体,其由选自表7所示的一条重链(HP)和另一条重链(HN)以及一条轻链(LP)和另一条轻链(LN)的V1至V5、W1至W8、V2p、V3p、W4p、V3W4、W4v3和V3v1的任何组合组成。更具体地,以上抗体可以是具有增强的重链与轻链之间的配对的抗体,其由第103位残基的色氨酸至赖氨酸突变体、第128位的赖氨酸至天冬氨酸突变体、第118位的苯丙氨酸至赖氨酸突变体、第44位的脯氨酸至天冬氨酸突变体组成。
本发明的第三方面是提供制造增加了链选择性的蛋白的方法,其包括诸如以下步骤:
(1)在多肽链与多肽链之间的疏水性相互作用区中选择一对疏水性氨基酸;
(2)在所选的一对氨基酸中将一个疏水性氨基酸修饰成正电荷,并将另一个疏水性氨基酸修饰成负电荷;以及
(3)通过正电荷与负电荷之间的接触而以静电相互作用结合。带有正电荷的材料可以是碱性氨基酸但不限于此,并且带有负电荷的材料可以是酸性氨基酸但不限于此。
本发明的第四方面是提供一种测量BsAb的重链与轻链之间的配对程度的方法,其中使用具有突变成Z14组合的重链以及包含甲型流感病毒特异性的4D9胞外域和乙型流感病毒特异性的2B9胞外域的共同轻链的BsAb。
【有益效果】
Fc结构域的重链的SHOCAP修饰产生带正电和带负电的重链(下文各自称为Ha和Hb)。这些静电相互作用比重链的同源双特异化(同源二聚化)更偏向于异源双特异化(异源二聚化)。以相同的方式,两个Fab结构域的SHOCAP修饰生成带正电和带负电的轻链(分别称为La和Lb)。并且重链的带正电的Fab结构域的静电相互作用提高正确HC/LC配对的概率。因此,本发明的抗体可获得受同源二聚体或单体的污染较少的异源双特异性抗体或蛋白。
本发明的另一个优点是引起较低的免疫排斥,因为在最少数量的氨基酸上的突变未导致任何明显的天然抗体结构变化,并且另外的目标残基被深埋在重链与轻链之间的疏水性相互作用表面中。
【附图说明】
图2示出了两条轻链和两条重链的组合生成了10个不同的抗体嵌合体。
图3示出了在抗体的疏水性相互作用中涉及的氨基酸。
图4示出了在人与小鼠之间氨基酸序列在抗体的Fc结构域中高度保守。
图5示出了在通过相应的TNFR2胞外域和FAS胞外域结合的Fc部分中的14组突变,其引入了静电相互作用,以便显示出异源双特异化的效率。带正电的氨基酸被插入A链中的疏水性相互作用区,并且带负电的氨基酸被插入B链中的疏水性相互作用区。
图6通过SDS-PAGE分析示出了Fc的异源双特异化在表4的Z0至Z4组中较好地发生。
图7通过SDS-PAGE分析示出了Fc的异源双特异化在表4的Z5至Z9组中较好地发生。
图8通过SDS-PAGE分析示出了Fc的异源双特异化在表4的Z10至Z14组中较好地发生。
图9是比较基于Z14生成的异源Her3/FltD2 BsAb与对照抗体之间的异源双特异化的效率的SDS-PAGE分析。A)异源BsAb的示意图,B)SDS-PAGE分析
图10比较基于Z14生成的异源Her1/Her3 BsAb与对照抗体之间的异源双特异化的效率。(A)异源BsAb即Her1/Her3的示意图,(B)SDS-PAGE分析,(C)HIC-HPLC分析
图11比较基于Z14生成的异源Tie1/Tie2 BsAb与对照抗体之间的异源双特异化的效率。(A)异源BsAb即Tie1/Tie2的示意图,(B)SDS-PAGE分析,(C)HIC-HPLC分析
图12示出了异源双特异化以共享抗体的共同轻链。BsAb仅通过Fc的异源双特异化才成为可能,因为其不需要重链和轻链的正确配对。
图13是示意图,其示出了就共享共同的轻链的抗体而言制备的3种类型的抗体,但不是10种类型。
图14示出了从作为SDS-PAGE分析结果的角度来看,就抗体共享基于表4中的Z14而制备的共同轻链而言,单纯地产生BsAb。
图15示出了从作为HIS-HPLC色谱法结果的角度来看,就抗体共享基于表4中的Z14而制备的共同轻链而言,单纯地产生BsAb。
图16示出了基于表4中的Z14产生的抗体具有双特异性抗原结合活性。将4D9(HA0+LC)和2B9(HB)+LC)用作对照。
图17示出了在本发明中生成的抗体的Fc与受体结合良好。
图18示出了通过本发明制造的具有共同的轻链的BsAb的药代动力学数据。
图19是示意图,示出了在根据本发明的抗体的制造中,将重链和轻链的结合相对于电荷的位置而区分成对称的或不对称的。
图20示出了根据本发明的抗体的重链和轻链的配对是正确的。表7中的V3W1组合是重链与轻链之间最优异的对。
【最佳模式】
下文,将参照实施例进一步详细描述本发明。然而,应当理解,这些实施例仅用于说明性目的,而不应被解释为限制本发明的范围。
<实施例1>Fc结构域的异源二聚化
A)选择修饰位点和类型
为了在Fc和Fa两者中搜索适当的SHOCAP修饰位点,通过蛋白相互作用计算器(PIC)分析了抗体链之间的疏水性接触。在整个抗体结构域中已发现了链之间的许多疏水性相互作用。两个CH3结构域中的五对残基参与了链之间的疏水性相互作用(参见表1和图3)。在两个CH3结构域中在不同位点的三个疏水性相互作用对称分布。一个区域由P395与V397之间的相互疏水性相互作用构成,而另两个区域分别由Y407和L351疏水对的相互作用构成。据发现,这些残基在人与小鼠(以及其他哺乳动物)抗体类别之间高度保守(图4),从而表明这些疏水对相互作用可能在维持Fc结构域的二聚体结构完整性方面发挥着关键作用。九对残基参与CH1与CL之间的疏水性相互作用(表2,图3)。CDR中的残基除外,VH和VL结构域中的总共12对残基参与链之间的疏水相互作用(参见表3和图3)。在CH2-CH2结构域之间的界面中不存在明显的相互作用。
【表1】
HIP编号 | CH3结构域(A链) | CH3结构域(B链) |
1 | L351 | L351 |
2 | P395 | V397 |
3 | P395 | P395 |
4 | V397 | P395 |
5 | Y407 | Y407 |
【表2】
HIP编号 | CH1结构域 | CL结构域 |
6 | L128 | F118 |
7 | L128 | V133 |
8 | A141 | F116 |
9 | A141 | F118 |
10 | A141 | L135 |
11 | L145 | V133 |
12 | F170 | L135 |
13 | V185 | F118 |
14 | V185 | L135 |
【表3】
HIP编号 | VH结构域 | VL结构域 |
15 | V37 | F98 |
16 | F45 | P44 |
17 | F45 | Y87 |
18 | F45 | F98 |
19 | W47 | Y96 |
20 | W47 | F98 |
21 | W50 | Y96 |
22 | Y91 | P44 |
23 | W103 | Y36 |
24 | W103 | Y36 |
25 | W103 | A43 |
26 | W103 | P44 |
27 | W103 | F98 |
为解决Fc异源双特异化中的链缔合问题,已将由跨越两个CH3结构域的四个其他疏水性残基(L351、P395、V397和V407)组成的五对残基视为主要修饰位点。
各自地或以组合方式,将四个疏水残基(L351、P393、V397和Y407)转化成静电相互作用对以产生总共14组TNFR2-Fc和FAS-Fc变体(表4和图5)。
【表4】
使用SDS-PAGE分析检查了那14组突变体的异源双特异化的潜力。为了有利于解读结果,选择了两个受体,它们的胞外域具有不同的分子大小和相异的配体结合特性。将能够结合到TNFα的TNFR2的这些大Fc胞外域中的疏水性部分突变成带正电的部分(下文称为“A链”)。将具有FASL结合亲和力的FAS的这些小Fc胞外域中的疏水性部分置换成带负电的部分(下文称为“B链”)。
在每个变体组中,在同一时间独立地表达A链和B链。从单表达(A和B)和共表达(A+B)组产生的Fc融合蛋白已通过蛋白A层析进行了纯化。最终将蛋白用1ml蛋白A洗脱缓冲溶液洗脱,将洗脱出的蛋白级分中的10μl通过10%的SDS-PAGE分析。通过在共表达组(A+B)中将异源双特异性TNFR2-Fc/FAS-Fc的谱带密度与同源双特异性(TNFR2-Fc)2和(FAS-Fc)2的谱带密度进行比较而确定异源双特异化的可能性。此外,在单表达(A和B)组中将单体TNFR2-Fc和FAS-Fc产物与同源双特异性(TNFR2-Fc)2和(FAS-Fc)2产物进行了比较。图7示出了Z5-Z9变体的数据集。图8示出了Z10-Z14变体的数据集。最终将Z14突变体组选择为最佳的组。Z14变体的异源双特异化的概率可能优于任何其他变体。在该组中,异源双特异性TNFR2-Fc/FAS-Fc与同源双特异性(TNFR2-Fc)2和(FAS-Fc)2相比在共表达组中是最优异的,并且单体TNFR2-Fc和FAS-Fc产物在单表达组中是最不稳定的。这表明,根据本发明的抗体受到单体或同源双特异性变体的污染较少。
<实施例2>基于表4中的Z14的异源BsAb的制备
通过采用基于Z14的Fc结构域的异源双特异化,得到了表5中针对各种目标疾病的总共17种不同的异源双特异性Fc融合蛋白(BsFcF)。
【表5】
A.基于Z14的异源双特异性Her3/FltD2的设计
将Her3胞外域融合到带正电的Fc结构域中(A链;97kD),并将FltD2结构域融合到带负电的Fc结构域中(B链,40kD)。据报道,带正电的胞外结构域保持了固有的同源双特异化的可能性。
SDS-PAGE图
共表达两条匹配的链,通过蛋白A层析而纯化,并通过10%SDS-PAGE分析。Z14异源双特异化优于其他双特异化,因为单体Her3-Fc和FltD2-Fc在三个不同的对照组中,但未在Z14中观察到。
B.基于Z14的异源双特异性Her1/Her3的设计
将Her3胞外域融合到带正电的Fc结构域中(A链;97kD),并将Her1结构域融合到带负电的Fc结构域中(B链,95kD)。已知的是,带正电的胞外结构域保持了固有的同源双特异化的可能性。
(1)SDS-PAGE图
共表达两条匹配的链,通过蛋白A层析而纯化,并通过10%的SDS-PAGE分析。Z14异源双特异化的可能性足够高以克服Her1和Her3的固有同源双特异化,但单体Her3-Fc和Her1-Fc形式在Z0组中已观察到(图10(B))。
(2)HIC-HPLC分析
将20μl浓缩样品(1-5mg/ml)上样到TSK凝胶苯基HIC柱。应用从60%至100%乙腈的线性梯度,流量为0.1ml/min,持续40分钟。在214和280nm处进行观察。类似于SDS-PAGE图,Z14显示出异源双特异化的高潜力(参见图10(C))。
C.基于Z14的异源双特异性Tie/Tie2的设计
将Tie1胞外域融合到带正电的Fc结构域中(A链),并将Tie2结构域融合到带负电的Fc结构域中(B链)。
(1)SDS-PAGE图
共表达两条匹配的链,通过蛋白A层析而纯化,并通过10%的SDS-PAGE分析。单体Tie1-Fc和Tie2-Fc形式在Z0组中,但未在Z14中观察到。其表明,Z14保持优异的异源双特异化潜力(参见图11(B))。
(2)HIC-HPLC分析
如之前所述的,进行了HIC-HPLC分析。类似于SDS-PAGE图,其表明Z14的异源双特异化的潜力较高(参见图11(C))。
<实施例3>从具有共同轻链的抗体制备异源BsAb
已通过噬菌体展示技术发现了两个完全人源化的抗体。一个是甲型流感病毒特异性的4D9,另一个是乙型流感病毒特异性的2B9。令人感兴趣的是,据发现,两个抗体共享单条共同的轻链(参见图12)。使用在两个抗体中共享共同的轻链的益处,设计了共同轻链双特异性抗体(CLC-BsAb)。双特异性抗体可仅通过Fc异源双特异化而形成(即,可以省去HC/LC正确配对的过程)。
当天然的两条重链与共同的轻链配对时,产生了三个(不是10个)可能的抗体(参见图13)。如表6中所示制备了三个对照组合Z14组。
【表6】
(1)结果分析
正如预期的,天然组(Z0)在SDS-PAGE分析中生成了三个可能的抗体。(HB/LC)2、(HA/LC)//(HB/LC)和(HA/LC)2。相比之下,Z14组仅产生了双特异性形式(HA/LC)//(HB/LC)(参见图14)。Z14组未以任何可见的水平产生单体抗体。其揭露出,通过Z14组共表达的样品未受单体抗体污染,并且为高纯度样品,仅有双特异性抗体形式。
(2)HIC分析
通过HIC-HPLC色谱法评价了Z14的纯度。Z0组具有三个对应于每个(HA/LC)2、(HA/LC)//(HB/LC)和(HB/LC)2的峰。相比之下,Z14组具有对应于双特异性(HA/LC)//(HB/LC)抗体的单峰。其揭露出,类似于SDS-PAGE的结果,通过Z14组共表达的样品未受单体抗体的污染,并且为高纯度样品,仅有双特异性抗体形式(参见图15)。
(3)双重抗原结合活性的确认
将两种抗原A-HA5和B-HA单独地以三种不同的量(100、50和25ng/孔)包被在ELISA板上。在用封闭溶液封闭后,添加100ng抗体并孵育过夜。将板彻底洗涤,并向每个孔中添加HRP-偶联的抗人Fc小鼠抗体。
结果分析
Z14具有抗A-HA5和B-HA两种抗原的双重结合活性。在另一方面,4D9(HA0+LC)和2B((HB0+LC)的两个对照抗体显示出单一结合活性(参见图16)。
<实施例4>测量抗体的Fc结构域的受体结合活性
将100ng的FcRn-Fc融合蛋白包被在ELISA板的每个孔中。在用封闭溶液封闭后,添加100ng的4D9(HA0+LC)、2B9(HB0+LC)和Z14抗体并孵育过夜。将板彻底洗涤,并向每个孔中添加HRP-偶联的抗人Fc小鼠抗体。
结果分析表明,4D9(HA0+LC)、2B9(HB0+LC)和Z14抗体的Fc结构域的受体结合活性无明显不同(图17)。
<实施例5>在本发明中制造的双特异性抗体的药代动力学分析
将10mg/ml的Remicade(英夫利昔单抗)和4mg/kg的B6CBA注射进小鼠CLC-BsAb,在施用后直至14天时测量样品浓度。浓度概况在两种抗体之间无明显差异。为了分析Remicade和CLC-BsAb之间的药代动力学参数,通过若干药代动力学参数(CL、V1、AUC、MRT、t1/2)进行了ANOVA检验,这些参数通过NCA和二室模型的分析进行计算(参见图18)。
<实施例6>在本发明中制造的抗体的重链(HC)与轻链(LC)之间的正确配对
为了解决HC/LC链配对步骤中的问题,已将12个疏水性残基(VL结构域的Y36、A43、P44、Y87、Y96和F98,以及VH结构域的V37、F45、W47、W50、Y91和W103)和9个疏水性(CL结构域内的F116、F118、L133和L135,以及CH1结构域的L128、A141、L145、F170和V185)视为优选的修饰位点。
A.HC/LC配对的分析方法
设计了HC/LC配对分析以便有利于搜索导致正确的HC/LC配对的正确修饰位点。
如果蛋白的修饰允许对链进行100%区分,则将轻链LP(带正电的轻链)与重链HN(带负电的重链)结合,但不与HP(带正电的重链)结合,以形成由50kD HN和25kD CP(带正电的共同轻链)组成的同源HN/LP抗体。其可通过还原SDS-PAGE凝胶进行确认。如果蛋白的修饰无法区分链,则轻链LP将与重链HP和HN结合,并将导致形成三个不同的Ab。其将在还原SDS-PAGE凝胶中形成60kD HP以及50kD HN和25kD LP。
B.对称和不对称设计
以两种不同的设计进行了修饰。两个Fab结构域中的电荷分布模式可以是对称的或不对称的(参见图19)。
C.HC/LC配对的变体
单独地或以组合方式,将整个21个疏水性残基修饰成静电相互作用对残基,并在21组变体中缔合(参见表7)。
【表7】
通过之前所述的HC/LC配对分析方法测量了变体组中正确的HC/LC配对的程度。
SDS-PAGE分析
在21组中将V3W1组选择为导致修饰成正确的HC/LC配对的最佳变体(参见图20)。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或双特异性融合蛋白,其中所述双特异性融合蛋白包括选自由TNFR2、Her3、Tie2、TGFbR1、BMPbR1、Il-12R-b1、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、IFNAR1、IL-12A、IL-4、IFN-α、BMP2、IL-1R1L、IL-17RA、IL-17A、Fas、FltD2、Her1、Tie1、TGFbR2、IL-12R-b2、IL-13Ra1、ITGB1、ITGB3、IFNAR2、IL-12B、IL-13、IFN-β、BMP7、IL-1RAP、IL-17RC和IL-17F所组成的组胞外域对。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体或双特异性融合蛋白,其中所述胞外域对选自由Her2/FltD2、Her1/Her3和Tie/Tie2所组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗体或双特异性融合蛋白,其中,
所述双特异性抗体包括人IgG1型或人IgG4型的两条重链以及人κ型的两条轻链,并且
所述双特异性抗体进一步包括至少一个疏水性氨基酸对的突变,所述至少一个疏水性氨基酸对选自CH1结构域和CL结构域之间的由128位亮氨酸和118位苯丙氨酸对、128位亮氨酸和133位缬氨酸对、141位丙氨酸和116位苯丙氨酸对、141位丙氨酸和135位亮氨酸对、145位亮氨酸和133位缬氨酸对、170位苯丙氨酸和135亮氨酸对、185位缬氨酸和118位苯丙氨酸对以及185位缬氨酸和135位亮氨酸对所组成的组,所述至少一个疏水性氨基酸对的突变是通过将所述疏水性氨基酸对的一个氨基酸替换为选自由亮氨酸、精氨酸和组氨酸所组成的组的带正电的氨基酸,并将所述疏水性氨基酸对的另一个氨基酸替换为选自由天冬氨酸和谷氨酸所组成的组的带负电的氨基酸进行的,从而在疏水性氨基酸对的经突变的氨基酸之间引入静电相互作用。
6.根据权利要求5所述的双特异性抗体或双特异性融合蛋白,其中一个重链中的103色氨酸突变成赖氨酸;另一条重链中的128赖氨酸突变成天冬氨酸;一个轻链中的118苯丙氨酸突变成赖氨酸;并且另一条轻链中的44脯氨酸突变成天冬氨酸。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361780390P | 2013-03-13 | 2013-03-13 | |
US61/780,390 | 2013-03-14 | ||
PCT/KR2014/002139 WO2014142591A1 (ko) | 2013-03-13 | 2014-03-13 | 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 및 이의 제조방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105229036A CN105229036A (zh) | 2016-01-06 |
CN105229036B true CN105229036B (zh) | 2022-05-24 |
Family
ID=51537128
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480027216.5A Active CN105229036B (zh) | 2013-03-13 | 2014-03-13 | 在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其制备方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10118971B2 (zh) |
EP (2) | EP3486255A3 (zh) |
KR (1) | KR101813708B1 (zh) |
CN (1) | CN105229036B (zh) |
AU (1) | AU2014230291B2 (zh) |
CA (2) | CA2918328C (zh) |
WO (1) | WO2014142591A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10538595B2 (en) * | 2015-08-26 | 2020-01-21 | Bison Therapeutics, Inc. | Multispecific antibody platform and related methods |
WO2017205014A1 (en) | 2016-05-26 | 2017-11-30 | Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation | Mixtures of antibodies |
MX2019000925A (es) * | 2016-07-19 | 2019-06-03 | Ibentrus Inc | Proteinas biespecificas y metodo de su preparacion. |
SG11201900201YA (en) * | 2016-08-16 | 2019-02-27 | Regeneron Pharma | Methods for quantitating individual antibodies from a mixture |
CN110312523B (zh) | 2016-11-08 | 2024-04-26 | 齐鲁皮吉特湾生物治疗有限公司 | 抗pd1和抗ctla4抗体 |
US11248054B2 (en) | 2017-06-12 | 2022-02-15 | Bluefin Biomedicine, Inc. | Anti-IL1RAP antibodies and antibody drug conjugates |
WO2019014912A1 (zh) * | 2017-07-21 | 2019-01-24 | 赵磊 | 一种异二聚体蛋白及其制备方法 |
KR20230019227A (ko) * | 2017-11-17 | 2023-02-07 | 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. | 신규한 포유동물 발현 인간 면역결핍 바이러스 외피 단백질 항원 |
EP4326772A1 (en) * | 2021-04-23 | 2024-02-28 | Chimagen Biosciences, Ltd. | Heterodimeric antibodies and antigen-binding fragment thereof |
WO2023168426A1 (en) * | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Enosi Therapeutics Corporation | Compositions and cells containing mixtures of oligo-trap fusion proteins (ofps) and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009089004A1 (en) * | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Amgen Inc. | Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects |
CN101627053A (zh) * | 2006-06-12 | 2010-01-13 | 西福根有限公司 | 泛细胞表面受体特异的治疗剂 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005014618A2 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells |
WO2006106905A1 (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
US9493578B2 (en) * | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
WO2011143545A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
WO2012123949A1 (en) | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same |
US11851476B2 (en) * | 2011-10-31 | 2023-12-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain |
-
2014
- 2014-03-13 CA CA2918328A patent/CA2918328C/en active Active
- 2014-03-13 US US14/776,045 patent/US10118971B2/en active Active
- 2014-03-13 KR KR1020157034147A patent/KR101813708B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-13 EP EP18209348.4A patent/EP3486255A3/en active Pending
- 2014-03-13 EP EP14764140.1A patent/EP2975061A4/en not_active Withdrawn
- 2014-03-13 AU AU2014230291A patent/AU2014230291B2/en active Active
- 2014-03-13 CN CN201480027216.5A patent/CN105229036B/zh active Active
- 2014-03-13 WO PCT/KR2014/002139 patent/WO2014142591A1/ko active Application Filing
- 2014-03-13 CA CA3085446A patent/CA3085446C/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101627053A (zh) * | 2006-06-12 | 2010-01-13 | 西福根有限公司 | 泛细胞表面受体特异的治疗剂 |
WO2009089004A1 (en) * | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Amgen Inc. | Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Effects of engineering charged amino acids in the CH3 domains on antibody heavy chain dimerization;Maria Aiko Angela A. Diaz;《Philippine Science Letters》;20110527;第4卷(第1期);第48-55页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3085446C (en) | 2022-08-09 |
AU2014230291A1 (en) | 2015-11-05 |
WO2014142591A1 (ko) | 2014-09-18 |
CA2918328C (en) | 2020-09-01 |
EP3486255A3 (en) | 2019-11-13 |
EP2975061A4 (en) | 2017-03-01 |
KR20160012151A (ko) | 2016-02-02 |
US10118971B2 (en) | 2018-11-06 |
CA3085446A1 (en) | 2014-09-18 |
US20160152726A1 (en) | 2016-06-02 |
KR101813708B1 (ko) | 2017-12-29 |
EP3486255A2 (en) | 2019-05-22 |
AU2014230291B2 (en) | 2018-02-22 |
CA2918328A1 (en) | 2014-09-18 |
EP2975061A1 (en) | 2016-01-20 |
CN105229036A (zh) | 2016-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105229036B (zh) | 在疏水性相互作用位点内引入了静电相互作用的蛋白及其制备方法 | |
JP7457764B2 (ja) | ヘテロ二量体多重特異性抗体フォーマット | |
CN110799539B (zh) | 抗4-1bb抗体及其制备和使用方法 | |
AU2012236603A1 (en) | Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation | |
CA2797981A1 (en) | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them | |
US11401299B2 (en) | Generating multispecific antibody mixtures and methods of uses thereof | |
Gu et al. | Generation of dual-variable-domain immunoglobulin molecules for dual-specific targeting | |
EP4047018B1 (en) | Tetravalent bispecific antibody against pd-1 and vegf, preparation method therefor, and use thereof | |
US20230114801A1 (en) | MINIATURE GUIDANCE AND NAVIGATION CONTROL (miniGNC) ANTIBODY-LIKE PROTEINS AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOF | |
CN112111012B (zh) | 共价多特异性抗体 | |
US20240059798A1 (en) | Conditionally activated antigen binding polypeptide complexes and methods of use thereof | |
US20220127360A1 (en) | Tetravalent bispecific antibody against pd-1 and vegf, preparation method therefor, and use thereof | |
RU2021112298A (ru) | Полученные путем рационального дизайна новые белковые композиции | |
CN116063547A (zh) | 一种二聚体融合蛋白及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |