KR101813708B1

KR101813708B1 - 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101813708B1
Application number: KR1020157034147A
Authority: KR
Inventors: 김호언
Original assignee: (주) 아이벤트러스
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2017-12-29
Also published as: CA3085446A1; WO2014142591A1; CA3085446C; EP3486255A2; AU2014230291B2; EP2975061A4; US10118971B2; US20160152726A1; EP2975061A1; CA2918328C; CN105229036B; KR20160012151A; AU2014230291A1; EP3486255A3; CA2918328A1; CN105229036A

Abstract

본 발명은 에 관한 것으로, 단백질의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 선택된 한쌍의 소수성 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로, 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형되어 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하에 의해 단백질의 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 또는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단백질 또는 항체를 제조한 방법, 상기 항체를 이용하여 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음 정도를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 단백질 또는 항체는 동형이중체 또는 모노머에 의한 오염이 적어서, 높은 순도로 이종성이중체(heterodimer)을 얻을 수 있다.

Description

소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 및 이의 제조방법{Protein in which electrostatic interaction is introduced within hydrophobic interaction site and preparation method thereof}

순도가 높은 이종성이중화 양쪽 특이성 항체(Bispecific antibody; BsAbs) 또는 양쪽특이성 융합 단백질(Bispecific fusion proteins; BsFp)에 관한 것이다.

양쪽 특이성 항체는 자연적으로는 일반적으로 나타나지 않고, 두 개의 다른 생물학적 타겟에 동시 결합하는 것은 오히려 인위적으로 제조되는 것이 많다. 이런 이중의 타겟팅 능력은 BsAb에게 이전의 단일특이성 항체(MsAbs)로는 적용할 수 없는 새로운 적용 분야를 제공한다. 치료적 목적에서 특별한 관심은 (1) 면역 세포를 타겟 세포의 근접부로 확실하게 도입하는 것, (2)타겟 세포의 두개의 멀리 떨어진 신호 전달 경로를 시너지를 일으키도록 막거나 활성화하는 것, (3) 타겟 세포로 치료적, 방사활성 물질, 의약, 독소 또는 진달적 물질을 특이적 및 조절가능하게 전달하는 것과 같은 촉발된 가능성이다.

양쪽 특이성 항체는 종양 세포의 세포 표면 항원과 세포독성 T 세포의 CD3-TCR 복합체를 연결하는 방식으로 비-MHC 제한 방식으로 종양 세포에 T 세포를 보내는데 일반적으로 사용하였다(도 1 참조). 도 1은 악성 복수를 치료하는데 사용하는 쥐(rat)와 생쥐(mouse)의 하이브리드 단일클론 항체인 Catumaxomab(Removab^®)로 보인다. 이들을 3중기능성(Trifunctional) 항체라고도 부른다.

가능한 최소한의 변형을 가지고, 사슬 결합 문제와 충돌하지 하지 않고 전장의 IgG-유사 BsAb를 생산하기 위하여, 온전한 사슬 결합은 두 개의 다른 수준에서 이루어져야 한다. (1) 두 개의 무거운 사슬(Heavy chain; HC)는 서로 이종성이중화되어야 하고, (2) 두 개의 가벼운 사슬(Light chain; LC)은 그들의 각각의 HC와 정확하게 짝지어져야 한다.

양쪽 특이성 항체를 신뢰할 수 있는 방법으로 만들기 위해서, 사슬 결합의 문제를 풀어야 한다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 두개의 무거운 사슬과 두 개의 가벼운 사슬의 조합은 10개의 다른 항체 키메라 형태를 만든다. 이들 중에 하나만이 정확한 양쪽성 항체이고 나머지는 가치가 없는 키메라 형태들이다. 이 사슬 결합 문제는 산업분야에서 양쪽 특이성 항체를 생산하는데 정확한 양쪽 특이성 항체의 생산 수율은 적어도 10배 감소하게 되고, 양쪽 특이성 항체를 다른 키메라로 부터 분리하는데 매우 어려운 여러 가지의 문제를 일으킨다. 때문에, 많은 제약회사들이 많은 자원과 노력을 직접적이고 믿을 수 있는 방식으로 생산할 수 있는 양쪽 특이성 항체 기술을 개발 및 획득하는데 사용한다.

다양한 무수한(45개의 다른 포맷) BsAb-관련 기술이 개발 되었다. 이들 기술은 구조를 기초로 하여 4개의 카테고리로 분류되어질 수 있다. 첫째로, 노브-인투-홀(Knob-into-Hole) 또는 간략히 KiH로 알려진 구조적 상보적 상태, 전하 극성 보완(전기적 스티어링 효과; electrostatic steering effect), 또는 CH3 도메인 서플링(SEEDbody^TM으로 불리움)를 포함하는 다양한 방법을 통해 무거운 사슬 이종성이중화를 하는 기술; 둘째로, Diabody^TM, BiTE^TM 및 DART^TM과 같은 여러 가지 항체 분절 포맷, 셋째로, Modular Antibody^TM, Zybody^TM, dAbs^TM 및 DVD-IG^TM과 같은 하나 또는 그 이상의 기능적 도메인을 사용하는 기술이 온전한 항체에 접합되는 기술; 및 넷째로, Duobody^TM (Fab-Arm Exchange), CrossMab^TM, AzymetricTM, 및 kI body^TM 같은 전장 길이의 IgG-유사 설계를 채용한 기술들이 개발 되었다.

이중에서 Zymeworks는 미국 특허출원 2013-892198호를 통하여, Fc 도메인에서 돌연변이를 가진 면역글로블린 사슬의 이종성다량체 구조체에 대해 특허를 청구하면서, 이황화결합을 하는 시스테인 부분을 전하를 가진 아미노산으로 변형하여 전기적 상호작용에 의해서 이종성다량체 구조의 항체를 만들 수 있다는 점을 개시하고 있다.

그러나, 상기 어떠한 특허에서도 소수성 상호작용을 하는 부분에서 선택된 한쌍의 아미노산 쌍을 변형하여 전기적상호작용을 일으켜서 선택적으로 결합하도록 유도하는 기술은 공개되어 있지 않다. 본 발명자들은 소수성 상호작용을 하는 아미노산 한쌍을 각기 산성 아미노산과 염기성 아미노산으로 변형하였을 때, 보다 선택적으로 이종성이중화가 일어나는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 이종적이중화(heterodimer)가 우수하게 일어난 양쪽 특이성 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질의 소수성 상호작용 부분에서 한쌍의 아미노산을 서로 반대의 전하를 가지도록 변형하여, 이종적이중화가 잘 일어나는 단백질 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여, 본 발명의 제1의 형태는 단백질의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 선택된 한쌍의 소수성 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로, 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형되어 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하에 의해 단백질의 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질을 제공한다. 상기 포지티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니지만 염기성 아미노산일 수 있고, 상기 네가티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니지만 산성 아미노산일 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 글리신,알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고, 상기 산성 아미노산은 아스파트산 또는 글루탐산에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.

두 개의 서로 다른 HC/LC 쌍으로 부터 전장의 IgG-유사 양쪽 특이성 항체를 조립은 두개의 사슬 결합 과정을 통하여 이루어진다. 즉, HC 이종성이중화 및 생산적인 HC/LC 짝지음, 이들의 성공비율은 두 개의 무거운 사슬 사이뿐만이 아니라, 무거운 사슬과 가벼운 사슬 사이의 사슬 상호간 구별 효율에 의존한다.

적절한 변형 사이트를 찾기 위하여, 소수성 상호작용이 단백질의 접힘과 결합에 주요한 구동력이 되기 때문에 항체의 사슬간 소수성 경계면의 잔기에 집중하였다. 적절한 변형 타입을 선택하면서, 소수성 상호작용 만큼 강력하고, 양쪽 특이성 항체의 사슬 결합 문제를 해결하는데 필요한 단백질의 구별력을 제공하기 때문에 전기적 상호작용을 선택하였다.

이와 같은 사슬간 구별은 두 개의 결합 사슬 사이의 경계면에서 구조적 변형의 보완적 짝지음을 도입함으로써 해결할 수 있다고 착안하였다. 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산을 서로 상대적으로 하전된 아미노산의 짝으로 돌연변이화하여 치환하였다. 이하에서는 이와 같은 변형을 줄여서 SHOCAP(substitution of hydrophobic into oppositely charged amino acid pair)라고 부른다. 두개의 무거운 사슬의 Fc 도메인의 SHOCAP 변형은 양성적으로 및 음성적으로 하전된 무거운사슬들(각각 Ha 및 Hb라 부름)을 만든다. 이들의 전기적 상호작용은 무거운 사슬의 동종이중화(homodimerization) 보다 이종성이중화(heterodimerization)을 선호하게 된다. 같은 방법으로, 두 개의 Fab 도메인에 SHOCAP 변형은 양성적으로 및 음성적으로 하전된 가벼운 사슬(각각 La 및 Lb라 부름)을 만들고, 무거운 사슬의 반대적으로 하전된 Fab 도메인과의 전기적 상호작용은 정확한 HC/LC 짝지음의 확률을 높여준다.

사슬 결합과 충돌하지 않고 양쪽 특이성 항체를 생산하기 위하여, 천연의 항체 분자에 두 개의 독립적인 변형을 도입했다. 하나는 Fc 도메인의 이종성이중화를 위한 것이고 다른 하나는 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 정확한 짝지음을 위한 것이다.

본 발명에서는 항체의 Fc 도멘인의 하나 이상의 소수성 상호작용을 전기적 상대방(예를 들어, 407번째 타이로신 타이로신 소수성 상호작용(Y407:Y407)를 407번째 아스파트산 리신(D407:K407)로 전환하여 아스파트산의 네가티브 전하와 리신의 포지티브 전하의 전기적 상호작용을 유도하게 되면, Fc 도메인의 이종성이중화(heterodimerization)가 활력적이고 견고하게 일어나게 된다.

SHOCAP 기술을 이용하게 되면, Fab 도메인의 주요한 소수성 잔기(예를 들어, 128번 류신과 118번 페닐알라닌(L128:F118)를 128번 아스파트산과 118번의 리신(K128:D118)으로 치환하였을 때, 두개의 무거운 사슬(heavy chain)과 두 개의 가벼운 사슬(light chain)이 쉽게 구별될 수 있다. 때문에 원칙적으로 SHOCAP 기술을 항체의 양 Fc 및 Fab 도메인에 적용하게 되면 IgG-유사 이중 특이성 항체를 만들 수 있다.

본 발명의 제 2 의 형태는 항체의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 선택된 한쌍의 소수성 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로, 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형되어 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하에 의해 단백질의 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 항체를 제공한다. 상기 포지티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니나 염기성 아미노산일 수 있으며, 상기 네가티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니나 산성 아미노산일 수 있다. 보다 구체적으로는

인간의 항체의 CH3 도메인의 소수성 상호작용 351 류신과 351 류신, 395 프롤린과 397 발린, 395 프롤린과 395프롤린, 407 타이로신과 407 타이로신; CH1 도메인과 CL 도메인 사이의 128 류신과 118 페닐알라닌, 128 류신과 133 발린, 141 알라닌과 116 페닐알라닌, 141 알라닌과 135 류신, 145 류신과 133 발린, 170 페닐알라닌과 135 류신, 185 발린과 118 페닐알라닌, 185 발린과 135 류신으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 한 쌍 이상의 하나의 아미노산 중 한 쌍의 아미노산 중 어느 하나를 아스파트산 또는 글루탐산에서 선택되는 산성아미노산으로 돌연변이화하고, 또다른 하나의 아미노산을 리신, 아르기닌, 히스티딘에서 선택되는 염기성 아미노산으로 돌연변이화하여 상기 돌연변이화된 아미노산들의 전기적 상호작용에 의해 결합력이 발생하는 항체이다. 보다 더 구체적으로는 하기 표4의 Z0 내지 Z14의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 세트로 돌연변이화된 것을 특징으로 하는 항체이다. 상기 항체는 한 쌍의 기능을 가진 한 쌍의 엑토도메인을 가질 수 있다. 상기 엑토도메인은 항암역할을 할 수 있고, 신호전달에 관여할 수 있으며, 독소이어서 다른 특이성 항체가 결합부의 세포를 죽임으로서 항암제로 사용될 있다. 이에 제한 되는 것은 아니나 상기 엑토도메인은 TNR2, Her3, Tie2, TGFbR1, BMPbR1, Il-12R-b1, IL-4Ra, ITGA4, ITGA2B, INFAR1, IL-12A, IL-4, InFa, BMP2, IL-1R1L, IL-17RA, IL-17A, Fas, FltD2, Her1, Tie1, TGFbR2, IL-12R-b2, IL-13Ra1, ITGB1, ITGB3, INFAR2, IL-12B, IL-13, INFb, BMP7, IL-1RAP, IL-17RC, IL-17F로 이루어진 그룹에선 선택된 어느 한 쌍의 엑토도메인일 수 있다. 보다 더 구체적으로는 상기 항체는 Her2/FltD2 조합, Her1/Her3 조합, 또는 Tie/Tie2 조합에서 선택된 어느 하나의 엑토도메인 조합이 융합된 항체일 수 있다. 보다 더 구체적으로는 상기 Z14의 조합으로 돌연변이화된 무거운 사슬과 A-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 4D9 엑토도메인 및 B-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 2B9 엑토도메인을 포함하는 공통의 가벼운 사슬을 가진 양쪽 특이성 항체일 수 있다. 보다 더 구체적으로는 상기 항체는 하기 표7의 무거운 사슬(HP)와 또다른 무거운 사슬(HN), 가벼운사슬(LP)와 또다른 가벼운 사슬(LN)의 V1 내지 V5, W1 내지 W8, V2p, V3p, W4p, V3W4, W4v3, V3v1의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 조합으로 이루어진 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음 정도가 향상된 항체일 수 있다. 보다 더 상세하게는 상기 항체는 무거운 사슬의 하나에서 103 트립토판이 리신으로 돌연변이화되고, 또다른 무거운 사슬의 128번 리신이 아스파트산으로 돌연변이화되고, 가벼운 사슬의 118번 페닐알라닌이 리신으로 돌연변이화 되고, 또다른 가벼운 사슬의 44번 프롤린이 아스파트산으로 돌연변이화되어 이루어진 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음 정도가 향상된 항체이다.

본 발명의 제 3 의 형태는 폴리펩타이드 사슬과 폴리펩타이드 사슬 사이의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 한쌍의 소수성 아미노산을 선택하는 단계; 상기 선택된 한쌍의 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로, 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형시키는 단계; 및 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하가 접촉하여 전기적 상호작용으로 결합되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 사슬 선택성이 증가된 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 포지티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니나 염기성 아미노산일 수 있고, 상기 네가티브 전하를 가진 물질은 이에 제한되는 것은 아니나 산성 아미노산일 수 있다.

본 발명의 제 4 의 형태는 상기 Z14의 조합으로 돌연변이화된 무거운 사슬과 A-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 4D9 엑토도메인 및 B-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 2B9 엑토도메인을 포함하는 공통의 가벼운 사슬을 가진 양쪽 특이성 항체를 이용하여 양쪽 특이성 항체의 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음 정도 측정 방법을 제공한다.

두 개의 무거운 사슬의 Fc 도메인의 SHOCAP 변형은 양성적으로 및 음성적으로 하전된 무거운사슬들(각각 Ha 및 Hb라 부름)을 만든다. 이들의 전기적 상호작용은 무거운 사슬의 동형이중화(homodimerization) 보다 이종성이중화(heterodimerization)을 선호하게 된다. 같은 방법으로, 두개의 Fab 도메인의 SHOCAP 변형은 양성적으로 및 음성적으로 하전된 가벼운 사슬(각각 La 및 Lb라 부름)을 만들고, 무거운 사슬의 반대적으로 하전된 Fab 도메인의 전기적 상호작용은 정확한 HC/LC 짝지음의 확률을 높여준다. 이에 따라 본 발명에 따른 항체는 동형 또는 모노머에 의한 오염이 적은 이종성이중화된 항체 또는 단백질을 획득할 수 있다.

본 발명의 또다른 이점은 천연의 항체에 최소한의 숫자로 변형을 가져오므로, 천연 항체의 구조에 어떠한 의미있는 구조적 변화를 일으키지 않고, 더욱이 타켓이 되는 잔기들은 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 소수성 상호작용 결합면에 깊게 파묻혀 있어서 면역 거부 반응을 덜 유도한다.

도 1은 양쪽성항체(Bispecific Antibody)의 일반적인 형태이다. 일례로서 악성 복수를 치료하는데 사용하는 쥐(rat)와 생쥐(mouse)의 하이브리드 단일클론 항체인 Catumaxomab(Removab^®)를 보인다.
도 2는 두개의 무거운 사슬과 두 개의 가벼운 사슬의 조합은 10개의 다른 항체 키메라 형태를 만드는 것을 보인다.
도 3은 항체에서 소수성 상호작용에 관여하는 아미노산을 나타낸다.
도 4는 인간과 쥐의 항체 Fc의 아미노산 서열이 잘 보존되어 있음을 보인다.
도 5는 항체의 Fc 이종성이중화의 효율을 보기 위하여 TNFR2 엑토도메인 및 FAS 엑토도메인이 각각 결합된 Fc 부분에서 전기적상호작용의 도입을 위해 돌연변이화된 14종의 세트를 보인다. A 사슬은 소수성 상호작용내 포지티브로 하전된 아미노산이 삽입되었고, B 사슬은 소수성 상호작용내 네가티브로 하전된 아미노산이 삽입되었다.
도 6은 Fc 이종성이중화가 얼마나 잘 일어나는지를 보기 위해 표4의 세트 Z0 내지 Z4 세트를 SDS-PAGE에서 걸어준 것이다.
도 7은 이종성이중화가 얼마나 잘 일어나는지를 보기 위해 표4의 세트 Z5 내지 Z9 세트를 SDS-PAGE에서 걸어준 것이다.
도 8은 이종성이중화가 얼마나 잘 일어나는지를 보기 위해 표4의 세트 Z10 내지 Z14 세트를 SDS-PAGE에서 걸어준 것이다.
도 9는 Z14를 기초로 하여 제조된 Her3/FltD2 이종성이중화 항체와 대조군과의 이종성이중화 효율을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. A) 이종성이중화 항체 모식도 B)SDS-PAGE 결과
도 10은 Z14를 기초로 하여 제조된 Her1/Her3 이종성이중화 항체와 대조군과의 이종성이중화 효율을 비교한 것이다. (A) Her1/Her3 이종성이중화 항체 모식도, (B) SDS-PAGE 결과, (C) HIC-HPLC 분석 결과
도 11은 Z14를 기초로 하여 제조된 Tie1/Tie2 이종성이중화 항체와 대조군과의 이종성이중화 효율을 비교한 것이다. (A) Tie1/Tie2 이종성이중화 항체 모식도, (B) SDS-PAGE 결과, (C) HIC-HPLC 분석 결과
도 12는 공통의 가벼운 사슬(light chain)을 공유하는 항체에서 이종성이중화를 보인다. 정확한 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음이 필요없기 때문에 양쪽 특이성 항체는 단지 Fc의 이종성 이중화에 의해 가능하다.
도 13는 공통의 가벼운 사슬(light chain)을 공유하는 항체의 경우에는 10 종류가 아닌 3종류의 항체가 만들어지는 것을 보이는 모식도이다.
도 14는 SDS-PAGE의 결과로 볼 때, 표4의 Z14를 기초로 하여 제조된 공통의 가벼운 사슬을 공유하는 항체의 경우에는 순수하게 양쪽 특이성 항체를 생산하는 것을 보인다.
도 15는 HIS-HPLC 크로마토그래피의 결과로 볼 때, 표4의 Z14를 기초로 하여 제조된 공통의 가벼운 사슬을 공유하는 항체의 경우에는 순수하게 양쪽 특이성 항체를 생산하는 것을 보인다.
도 16은 표4의 Z14를 기초로 제조된 항체가 이중 항원 결합 능력을 가지고 있음을 보인다. 대조구로는 4D9(HA0+LC) 및 2B9(HB)+LC)가 사용되었다.
도 17는 본 발명에 따라 제조된 항체의 Fc가 수용체와 잘 결합한다는 것을 보인다.
도 18는 본 발명에 따라 제조된 가벼운 사슬을 공통으로 가지는 양쪽 특이성항체의 약물동력학적 데이타를 보인다.
도 19는 본 발명에 따라 항체를 제조할 때, 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 결합이 하전된 전하의 위치를 기준으로 대칭 또는 비대칭으로 구별될 수 있음을 보이는 모식도이다.
도 20은 본 발명에 따른 항체가 무거운 사슬과 가벼운 사슬이 정확히 짝지음이 되고 있는지를 보여준다. 표7의 V3W1 조합이 가장 우수하게 무거운 사슬과 가벼운 사슬이 정확히 짝짓고 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) Fc 도메인의 이종성 이중화(heterodimerization)

A. 변형 사이트 및 유형의 선택

Fc 및 Fa 모두에서 적절한 SHOCAP 변형 사이트를 찾기 위하여, 항체 사슬간 소수성 접촉부분이 프로테인 인터액션 칼큘레이터(Protein Interaction Calculator; PIC)를 이용하여 분석되었다. 여러개의 사슬간 소수성 상호작용이 전체 항체 도메인을 통하여 발견되었다. 두 개의 CH3 도메인으로 부터 5개의 잔기 쌍이 사슬간 소수성 상호작용에 관여하였다(표 1 및 도 3 참조). 두 개의 CH3 도메인에 3개의 다른 지점에서 소수성 상호작용은 대칭적으로 분포하였다. 하나의 지점은 P395와 V397 사이의 상호 소수성 상호작용으로 구성되어 있었고, 다른 두 개의 지점은 각각 Y407 및 L351의 소수성 짝 상호작용으로 구성되어 있었다. 이들 잔기는 인간 및 쥐(그리고 다른 포유류에서도 또한)의 항체 클래스에서 매우 보존된 부위로 밝혀졌고(도 4 참조), 이는 이들 소수성 짝 상호작용이 Fc 도메인의 이중화 구조의 안정성을 유지하는데 중심적인 역할을 하는 것으로 보인다. CH1과 CL 도메인으로 9개의 잔기 쌍이 사슬간 소수성 상호작용에 관여하였다(표 2 및 도 3 참조). CDR에 있는 잔기를 제외하였을 경우에 VH 및 VL 도메인으로부터 전체 12 잔기 쌍이 사슬산 소수성 상호작용에 관여하였다(표 3 및 도 3 참조). CH2-CH2 도메인 사이에는 주목할 만한 상호작용 경계면이 없었다.

Fc의 이종성이중화에서 사슬 결합 문제를 풀기 위하여 두개의 CH3 도메인에 퍼져있는 4개의 다른 소수성 잔기(L351, P395, V397 및 V407)로 이루어진 5개의 잔기 쌍이 주된 변형 사이트로 고려되었다.

이들 4개의 소수성 잔기(L351, P393, V397 및 Y407)은 각기 변형되었거나 조합으로 변형되어, 전기적 상호작용을 하는 쌍으로 변형되어 전체 14개 세트의 TNFR2-Fc 및 FAS-Fc 변이체를 제조하였다(표4 및 도 5 참조).

이들 14개 변이체 집합의 이종성이중화 가능성을 SDS-PAGE를 이용하여 검사하였다. 이들 결과의 해석을 촉진하기 위하여, 다른 분자 사이즈 및 구별되는 리간드 결합 활성을 가진 엑토도메인을 가진 두개의 수용체가 선택되었다. TNFα에 결합할 수 있는 큰 TNFR2 엑토도메인은 이들의 Fc 소수성 잔기를 양성적인 하전을 가진 잔기(이하에서는 "A 사슬"이라 부름)로 돌연변이화 하였다. FASL에 결합 친화도를 가지는 FAS의 작은 엑토도메인은 이들의 Fc 소수성 잔기를 음성적으로 하전된 잔기(이하에서는 "B 사슬"이라 부름)으로 치환하였다.

각각의 변이체 세트에서, A 및 B 사슬은 동시에 독립적으로 발현하였다. 단일(A 및 B) 및 공동-발현 (A+B) 세트로부터의 생산된 Fc 융합단백질은 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 단백질은 최종적으로 1ml의 프로테인 A 용출 완충용액으로 용출시켰고, 10 마이크로리터의 용출 시료를 10% SDS-PAGE에 걸어주었다. 이종성이중화의 가능성은 TNFR2-Fc/FAS-Fc 이종성이중화의 밴드 밀도를 공동-발현 세팅(A+B)에서 (TNFR2-Fc)₂ 및 (FAS-Fc)₂ 동종성이중화의 밴드의 밀도와의 비교에 의해 측정되었다. 또한 단일성의 TNFR2-Fc 및 FAS-Fc 생산물을 동질성이중화 (TNFR2-Fc)₂ 및 (FAS-Fc)₂ 생산물과 단일 발현 세팅(A and B)에서 비교하였다. 도 6은 Z0~Z4 변이체 세트로부터 데이타를 보인다. 도 7은 Z5-Z9 변이체 세트의 데이타를 보인다. 도 8은 Z10-Z14의 변이체 데이타를 보인다. 이중에서 가장 우수한 것으로 변이체 세트 Z14가 최종적으로 선택되었다. 변이체 세트 Z14는 다른 것들보다 이종성이중화 가능성이 우수하였다. 이 세트에서 TNFR2-Fc/FAS-Fc 형태의 이종성이중화체가 공동 발현 세트에서 (TNFR2-Fc)₂ 및 (FAS-Fc)₂ 동형이중화체에 비해 가장 우세하였고, 이들의 단일형 TNFR2-Fc 및 FAS-Fc 형태는 단일 발현 세트에서 가장 불안정하였다. 이는 본 발명에 따른 항체는 단일형에 또는 동형이중화체에의한 오염이 적다는 것을 보인다.

( 실시예 2) 표4의 Z14를 바탕으로한 이종성이중화 항체 제조

Z14 Fc 이종성이중화를 채용하여, 표5와 같이 여러가지 타겟 질병에 대해서전체 17개의 다른 양쪽 특이성 Fc 융합 단백질(BsFcFs)을 구성하였다.

가. Z14-기초 Her3/FltD2 이종성이중화의 설계

Her3 엑토도메인은 양성적으로 하전된 Fc 도메인(A 사슬; 97 kD) 및 FltD2 도메인은 음성적으로 하전된 (B 사슬, 40 kD)에 융합되었다. 양 외부세포 도메인들은 매우 내재적인 동종이중화 가능성을 유지하고 있는 것으로 알려졌다.

SDS-PAGE 패턴

두 개의 매칭 사슬은 공-발현하고, 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하여, 10% SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단일형 Her3-Fc 및 FltD2-Fc 형태는 다른 3개의 대조구 세트에서 보이고, Z14에서 보이지 않기 때문에, Z14의 이종성이중화는 다른 것에 비해 우수하였다.

나. Z14-기초 Her1/Her3 이종성이중체의 설계

Her3 엑토도메인을 양성적으로 하전된 Fc 도메인(A 사슬; 97 kD)으로 융합하였고, Her1 엑토도메인은 음성적으로 하전된 Fc 도메인(B 사슬, 95 KD)와 융합하였다. 양 외부세포 도메인들은 매우 내재적인 동종이중화 가능성을 유지하고 있는 것으로 알려졌다.

(1) SDS-PAGE 패턴

두 개의 매칭 사슬을 공-발현하고, 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제되고, 10% SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 동일형 Her3-Fc 및 Her1-Fc 형태는 Z0 세트에서 보였으나, Z14에서는 보이지 않아, Z14의 이종성이중화 가능성은 Her1과 Her3의 내재적인 동형이중화를 극복할 수 있을 만큼 매우 높았다(도 10(B) 참조).

(2) HIC-HPLC 분석

20 마이크로리터의 농축된 시료(1~5mg/ml)을 TSK겔 페닐 HIC 컬럼에 걸었다. 60 에서 100% 아세토니트릴로부터 40 분 선형 경사를 0.1 ml/분 유속으로 적용하였다. 관측은 214 및 280nm에서 수행하였다. SDS-PAGE와 유사하게 Z14가 이종성이중화 가능성이 높다는 것을 보인다(도 10(C) 참조).

다. Z14-기초 Tie/Tie2 이종성이중체의 설계

Tie1 엑토도메인을 양성으로 하전된 Fc 도메인(A 사슬)으로 융합하고, Tie2 엑토도메인을 음성적으로 하전된 Fc 도메인(B 사슬)으로 융합하였다.

(1) SDS-PAGE 패턴

두개의 매칭 사슬을 공-발현하고 프로테인 A 크로마토그래피로 정제하였고, 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 단일형 Tie1-Fc 및 Tie2-Fc 형태는 Z0 세트에서 보였으나 Z14에서는 보이지 않았다. 이는 Z14 우수한 이종성이중화 가능성을 유지한다는 것을 나타낸다다(도 11(B) 참조).

(2) HIC-HPLC 분석

HIC-HPLC 분석을 이전에 설명한 바와 같이 수행하였다. SDS-PAGE와 유사하게 Z14가 이종성이중화 가능성이 높다는 것을 보인다(도 11(C) 참조).

(실시예 3) 가벼운 사슬을 공통으로 가지는 항체에서 이종성이중화 항체 제조

파이지 디스플레이 기술에 의해서 두 개의 완전히 인간화된 항체를 발견하였다. 하나는 A-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 4D9 항체이고 다른 것은 B-타입 인플루엔자 바이러스에 특이적인 2B9 이었다. 흥미롭게도 두개의 항체는 하나의 가벼운 사슬을 공유하고 있다는 것이 발견되었다(도 12 참조). 두 개의 항체에서 공통의 가벼운 사슬을 공유하고 있는 이점을 이용하여 공통의 가벼운 사슬 양쪽 특이성 항체(Common light chain bispecific antibody; CLC-BsAb)이 설계되었다. 양쪽 특이성 항체는 Fc 이종성이중화에 의해서만 형성될 수 있다(즉, 정확한 HC/LC 짝지음 과정은 생략될 수 있다).

천연적인 두개의 무거운 사슬을 공통의 가벼운 사슬로 짝지었을 때, 세개의(10개가 아님) 가능한 항체가 생산된다(도 13 참조). 세개의 대조군 세트와 Z14 세트를 표6과 같이 만들었다.

결과분석

(1) SDS-PAGE를 걸었을 때, 예상한 바와 같이 천연의 세트(Z0)는 세개의 가능한 항체를 만들었다. (HB/LC)₂, (HA/LC)//(HB/LC) 및 (HA/LC)₂. 대조적으로, Z14 세트는 양쪽 특이성 (HA/LC)//(HB/LC) 형태만을 생산하였다(도 14 참조). Z14 세트는 어떤 가시적인 수준에서도 단일형 형태 항체를 생산하지 않았다. 이는 Z14 세트에 의해 공-발현된 시료는 매우 단일형의 항체에 의해 오염되지 않고, 양쪽 특이성 항체 형태만으로 순수도가 높다는 것을 보인다.

(2) HIC 분석

Z14의 순수성은 HIC-HPLC 크로마토그래피에 의해서 평가하였다. Z0 세트는 (HA/LC)₂, (HA/LC)//(HB/LC) 및 (HB/LC)₂에 해당하는 각각의 세개의 피크를 가지고 있다. 대조적으로, Z14 세트는 양쪽 특이성 (HA/LC)//(HB/LC) 항체에 대응하는 하나의 피크를 가지고 있다. 이는 SDS-PAGE 결과와 같이 Z14 세트에 의해 공-발현된 시료는 매우 단일형의 항체에 의해 오염되지 않고, 양쪽 특이성 항체 형태만으로 순수도가 높다는 것을 보인다(도 15 참조).

(3) 양쪽 항원 결합 활성 확인

두개의 항원, A-HA5 및 B-HA을 세개의 다른 양(100, 50 및 25 ng/웰)에서 코팅하고, ELISA 플레이트에 분리적으로 코팅되었다. 블로킹 용액으로 블로킹한 후 100ng 의 항체를 첨가하고, 하룻밤 항온반응하엿다. 플레이트를 완전히 세척한후 HRP-접합 항-인간 Fc 마우스 항체를 각각의 웰에 첨가하였다.

결과분석

Z14는 A-HA5 및 B-HA 항원에 대하여 양쪽 결합 활성을 가지고 있다. 반면에 두개의 대조군 항체 4D9 (HA0+LC) 및 2B((HB0+LC)는 단일 결합 활성을 가지고 있었다(도 16 참조).

(실시예 4) 항체의 Fc 부분의 수용체의 결합 활성도 측정

100ng의 FcRn-Fc 융합 단백질을 ELIZA 플레이트의 각각의 웰에 코팅하였다. 블로킹 용액으로 블로킹한 후, 100ng의 4D9 (HA0+LC), 2B9(HB0+LC), Z14 항체를 하룻밤동안 첨가하고 항온반응하였다. 플레이트를 완전히 세척하고, HRP-접합 항-인간 Fc 마우스 항체를 각각의 웰에 첨가했다.

결과분석, 4D9 (HA0+LC), 2B9(HB0+LC), Z14 항체의 Fc 부분의 수용체의 결합 활성도는 큰 차이를 보이지 않았다(도 17 참고).

(실시예 5) 본 발명에 따른 양쪽 특이성 항체의 약물동력학 분석

레미카드(Remicade) 10mg/ml 및 CLC-BsAb 4mg/kg의 투여양으로 B6CBA 쥐에 주입하였고, 다른 시료 농도를 투여후 14일까지 측정하였다. 두개의 항체 사이에 항체 농도의 프로파일에서 크게 의미있는 차이가 없었다. Remicade 및 CLC-BsAbs 사이에 약물동력학 인자를 분석하기 위해서, ANOVA 테스트를 NCA 및 두개의 -컴파트먼트 모델 분석에 의해 계산해서 여러가지 약물동력학적 인자들(CL, V1, AUC, MRT, t1/2)로 수행하였다(도 18 참조).

(실시예 6) 본 발명에 따른 양쪽 특이성 항체의 무거운 사슬(HC)과 가벼운 사슬(LC)의 정확한 짝지음

HC/LC 짝지음 스텝에서 사슬 결합 문제를 풀기 위해서, 12개의 소수성 잔기 (VL 도메인의 Y36, A43, P44, Y87, Y96 및 F98, VH 도메인의 V37, F45, W47, W50, Y91 및 W103) 및 9개의 소수성 (CL 도메인내의 F116, F118, L133 및 L135 및 CH1 도메인의 L128, A141, L145, F170 및 V185)가 우선적인 변형 사이트로 고려되었다.

가. HC/LC 짝지음 분석방법

정확한 HC/LC 짝지음을 이끄는 변형 사이트를 발견을 촉진하기 위하여, 신규의 HC/LC 짝지음 분석 방법을 고안했다.

만약 단백질의 변형이 100% 사슬 구별을 할 수 있게 해준다면, 가벼운 사슬 LP(포지티브 하전된 가벼운 사슬)는 무거운 사슬 HN(네가티브로 하전된 무거운사슬)과 결합하지만 HP(포지티브로 하전된 무거운 사슬)와는 결합하지 않아, 50kD HN 및 25kD CP(포지티브로 하전된 공통 가벼운 사슬)로 구성되어 동질의 HN/LP 항체를 형성한다. 이는 환원된 SDS-PAGE 젤에 의해서 확인될 수 있다. 만약에, 단백질의 변형이 사슬 구별을 해주지 않는다면, 가벼운 사슬 LP는 HP 및 HN 무거운 사슬과 결합할 것이고, 결과적으로 세개의 다른 Ab를 형성할 것이다. 이는 환원된 SDS-PAGE 젤에서 50kD HN, 25kD LP 뿐만 아니라 60 kD HP를 만든다.

나. 대칭 및 비대칭 설계

변형이 두개의 다른 디자인으로 만들어진다. 두개의 Fab 도메인에서 전하 분포 패턴 면에서 대칭 형태 또는 비대칭 형태일 수 있다(도 19 참조).

다. HC/LC 짝지음에 대한 변형체

전체 21개의 소수성 잔기가 분리적으로 또는 결합적으로 전기적으로 상호작용 잔기 짝지음으로 변형되었고, 21개의 변형체 세트로 결합되었다(표 7 참조).

이들 변형체 세트의 정확한 HC/LC 짝지음 정도를 이전에 설명한 HC/LC 짝지음 분석법에 의해서 측정하였다.

SDS-PAGE 분석

V3W1 변이체 세트가 21개의 세트에서 정확한 HC/LC 짝지음을 가져오는 최고의 변형으로 선택되었다(도 20 참조).

Claims

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인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인을 두 개 포함하는 단백질에서 상기 두 개의 Fc 도메인 간 소수성 상호작용을 하는 CH3 도메인 간의 351 류신과 351 류신, 395 프롤린과 397 발린, 및 395 프롤린과 395 프롤린으로 이루어진 그룹에서 두 쌍 이상의 소수성 아미노산을 선택하는 단계;
상기 선택된 두 쌍 이상의 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산을 리신, 아르기닌, 및 히스티딘에서 선택되는 어느 하나의 포지티브 전하를 가진 아미노산으로, 다른 소수성 아미노산을 아스파트산 및 글루탐산에서 선택되는 어느 하나의 네가티브 전하를 가진 아미노산으로 변형시키는 단계; 및
상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하가 접촉하여 전기적 상호작용으로 결합되는 단계
를 포함하는,
사슬 선택성이 증가된 단백질의 제조 방법.
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인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인을 두 개 포함하는 단백질로서,
상기 두 개의 Fc 도메인 간 소수성 상호작용을 하는 CH3 도메인 간의 351 류신과 351 류신, 395 프롤린과 397 발린, 및 395 프롤린과 395 프롤린으로 이루어진 그룹에서 선택된 두 쌍 이상의 소수성 아미노산 쌍에 있어서,
각각의 아미노산 쌍의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 포지티브 전하를 가진 아미노산으로 돌연변이화되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 네가티브 전하를 가진 아미노산으로 돌연변이화되고,
상기 돌연변이화된 아미노산들의 전기적 상호작용에 의해 결합력이 발생하는 것을 특징으로 하는,
돌연변이화된 CH3 도메인 포함하는 단백질.
인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인을 두 개 포함하는 단백질로서, CH3 도메인이 하기하는 표의 Z4, Z6, Z7, Z8, Z10, Z11, Z12, 및 Z14로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 세트로 돌연변이화된 것을 특징으로 하는 단백질:

.
제 19 항 또는 제20항에 있어서, 상기 단백질은, 상기 2개의 Fc 도메인에, TNFR2, Her3, Tie2, TGFbR1, BMPbR1, Il-12R-b1, IL-4Ra, ITGA4, ITGA2B, IFNAR1, IL-12A, IL-4, IFN-alpha, BMP2, IL-1R1L, IL-17RA, IL-17A, Fas, FltD2, Her1, Tie1, TGFbR2, IL-12R-b2, IL-13Ra1, ITGB1, ITGB3, IFNAR2, IL-12B, IL-13, IFN-beta, BMP7, IL-1RAP, IL-17RC, 및 IL-17F로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 한 쌍의 엑토도메인이 각각 하나씩 결합된 것인, 단백질.
제 21 항에 있어서, 상기 선택된 한 쌍의 엑토도메인은 Her3/FltD2 조합, Her1/Her3 조합, 또는 Tie/Tie2 조합인, 단백질.
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제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 단백질은
인간 IgG1 또는 IgG4 타입의 무거운 사슬 두 개 및 인간 카파 타입 가벼운 사슬 두 개을 포함하는 항체이고,
어느 하나의 무거운 사슬(HP)과 또 다른 무거운 사슬(HN), 및 어느 하나의 가벼운 사슬(LP)과 또 다른 가벼운 사슬(LN)에 하기하는 표의 V1, V3 내지 V5, W1 내지 W8, V3P, W4P, V3W4, W4V3, V3V1, 및 V3W1로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 돌연변이가 추가로 도입되고, 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 짝지음 정도가 향상된 것인, 단백질:

.
제 25 항에 있어서, 상기 항체는 V3W1의 돌연변이가 추가로 도입된 것인, 단백질.
제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 인간 IgG1 또는 IgG4 타입의 무거운 사슬 두 개 및 인간 카파 타입 가벼운 사슬 두 개를 포함하는 항체이고,
CH1 도메인과 CL 도메인 사이의, 128 류신과 118 페닐알라닌, 128 류신과 133 발린, 141 알라닌과 116 페닐알라닌, 141 알라닌과 135 류신, 145 류신과 133 발린, 170 페닐알라닌과 135 류신, 185 발린과 118 페닐알라닌, 및 185 발린과 135 류신으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 소수성 아미노산 쌍에 있어서,
각각의 소수성 아미노산 쌍의 아미노산 중 어느 하나는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 포지티브 전하를 가진 아미노산으로 돌연변이화되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 네가티브 전하를 가진 아미노산으로 돌연변이화되고,
상기 돌연변이화된 아미노산들의 전기적 상호작용에 의해 결합력이 발생하는 것을 특징으로 하는, 단백질.
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