PL209696B1 - Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhbitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu - Google Patents

Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhbitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu

Info

Publication number
PL209696B1
PL209696B1 PL373450A PL37345003A PL209696B1 PL 209696 B1 PL209696 B1 PL 209696B1 PL 373450 A PL373450 A PL 373450A PL 37345003 A PL37345003 A PL 37345003A PL 209696 B1 PL209696 B1 PL 209696B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
abeta
peptide
gly
amyloid
Prior art date
Application number
PL373450A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373450A1 (pl
Inventor
Peter St.George-Hyslop
Joanne Mclaurin
Original Assignee
Univ Toronto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Toronto filed Critical Univ Toronto
Publication of PL373450A1 publication Critical patent/PL373450A1/pl
Publication of PL209696B1 publication Critical patent/PL209696B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)

Description

Tło wynalazku
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy immunologicznych sposobów i kompozycji do leczenia choroby Alzheimera. Wynalazek niniejszy dotyczy ponadto sposobów identyfikacji związków, które hamują tworzenie płytek amyloidowych i/lub eliminują występujące płytki amyloidowe związane z chorobą Alzheimera i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi.
Stan techniki
Choroba Alzheimera („AD") jest neurodegeneracyjną chorobą mózgu stanowiącą główną przyczynę demencji wśród osób starszych. Objawy AD mogą obejmować postępującą utratę funkcji poznawczych i pamięci, zmiany osobowości, zmiany neuromięśniowe, ataki i sporadycznie zachowanie psychotyczne.
Chorobę Alzheimera charakteryzuje się przez dwie odmienne zmiany neuropatologiczne: odkładanie się płytek amyloidowych w obszarach mózgu, które są krytyczne dla pamięci i innych funkcji poznawczych; oraz rozwój splątków neurofibrylarnych w komórkach nerwowych. Uważa się, że odkładanie się płytek amyloidowych, w tych krytycznych obszarach mózgu, zaburza funkcjonowanie mózgu. Podobnie, sugerowano, że splątki neurofibrylarne, które nagromadzają się w komórkach nerwowych pacjenta z AD, zaburzają komunikację między neuronami.
Dalszą cechą charakterystyczną choroby Alzheimera jest obecność hydrofobowego peptydu beta amyloidu (Abeta42) jako głównego składnika płytek amyloidowych. Peptyd beta amyloidu (Abeta42) stanowi fragment utworzony w trakcie obróbki proteolitycznej prawidłowego integralnego białka błonowego, znanego jako prekursor białka amyloidu (ang. amyloid protein precursor, APP), lub znanego alternatywnie jako białko amyloidu A4 choroby Alzheimera.
Peptydy beta amyloidu (Abeta) obejmują grupę peptydów o długości 39 - 43 aminokwasów, które powstają w wyniku obróbki APP. Patrz Pallitto i wsp.. Biochemistry 38: 3570-3578 (1999). Pepetydy Abeta generalnie zawierają od 11 do 15 reszt regionu przezbłonowego APP i w związku z tym zawierają region hydrofobowy, chociaż cały peptyd Abeta może mieć charakter amfifilowy. Patrz Kang i wsp., Nature: 325: 733 - 736 (1987). Wykazano, że peptydy Abeta są toksyczne w stosunku do komórek w hodowli komórkowej. Patrz Pike i wsp., Eur. J. Pharmacol. 207: 367 - 368 (1991); Iversen i wsp., Biochem. J. 311: 1-16 (1995). Uważa się, że toksyczność peptydów Abeta w chorobie Alzheimera jest związana z procesem agregacji rozpuszczalnych peptydów Abeta w nierozpuszczalne włókienka i następnie inkorporację włókienek w płytki amyloidowe. Patrz Pike i wsp., Eur. J. Pharmacol. 207: 367 - 368 (1991); Pike i wsp., Brain Research, 563: 311 - 314 (1991); i Pike i wsp., J. Neurosci. 13: 1676 - 1687 (1993). Podobnie, peptydy Abeta będą tworzyły włókienka in vitro i process ten może być wykorzystywany do mierzenia hamowania agregacji Abeta oraz tworzenia włókienek.
Poprzednio, kilka zespołów stosowało modele myszy transgenicznych dla choroby Alzheimera, w których myszy transgeniczne wykazujące zarówno odkładanie się amyloidu w mózgu, jak i zaburzenia poznawcze, były immunizowane preparatami antygenu Abeta42. Wyniki tych badań wykazały, że immunizacja Abeta42 może powodować zmniejszenie się zarówno neuropatologii podobnych do choroby Alzheimera, jak i zaburzeń pamięci przestrzennej u myszy. Patrz Schenk i wsp., Nature 400: 173 - 177 (1999); Bard i wsp., Nature Medicine 6: 916 - 919 (2000); Janus i wsp., Nature 408: 979 982 (2000) i Morgan i wsp., Nature 408: 982 - 982 (2000). Bard i wsp. postulowali, że immunizacja szczepionką Abeta42 prawdopodobnie prowadzi do aktywacji mikrogleju i następnie otoczenia agregatów Abeta42 przez mikroglej. Bard i wsp., Nature Medicine 6: 916 - 919 (2000). Niestety nie wszystkie z mechanizmów immunologicznych leżących u podłoża zmniejszania odkładania się płytek amyloidowych i poprawy funkcji poznawczych zostały już wyjaśnione.
W poprzednich badaniach biernego podawania przeciwciał 3D6 i 10D5, których epitopy stanowią reszty odpowiednio 1 -5 i 3 - 6 Abeta, wykazano skuteczność tych przeciwciał do zmniejszania obciążenia zarówno Abeta, jak i płytkami amyloidu u myszy transgenicznych. Patrz Bard i wsp., Nature Medicine 6: 916 - 919 (2000). Myszy były myszami transgenicznymi pod względem związanej
PL 209 696 B1 z chorobą zmutowanej postaci białka prekursorowego amyloidu (APP), pod kontrolą promotora płytko-pochodnego czynnika wzrostu (PD). Myszy te (PDAPP) wykazują nadekspresję ludzkiego białka prekursora amyloidu i ujawnia się u nich wiele z objawów patologicznych choroby Alzheimera. Patrz Bard i wsp., Nature Medicine 6: 916 - 919 (2000).
W innym badaniu wykazano, że obwodowe podawanie m266, przeciwciała przeciwko resztom 13 - 28 Abeta, zmniejszało u myszy PDAPP obciążenie mózgu Abeta poprzez klirens osoczowy. Patrz Demattos i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8850 - 8855 (2001). Przeciwciało m266 ukierunkowane jest na drugorzędowe miejsce immunogenne Abeta, które może wykazywać zróżnicowaną specyficzność wiązania wobec oligomerów Abeta, protofibryli i płytek lub zróżnicowany dostęp do CNS.
Zarówno antygen Abeta42, jak i APP są białkami własnymi i dlatego normalnie nie są immunogenne u osobników wykazujących ich ekspresję. W konsekwencji, próby wytworzenia szczepionek opartych na tych antygenach koniecznie wymagają indukcji autoimmunizacji. Ponadto, każdy protokół immunizacyjny usiłujący indukować autoimmunizację musi dokładnie zbadać odpowiedzi immunologiczne indukowane przez takie antygeny własne. W tym przypadku jest bardzo istotnym, aby żaden z antygenów własnych, które inkorporują Abeta42 lub elementy Abeta42, nie indukował autoimmunizacji wobec prawidłowego białka APP i nie zakłócał jego prawidłowego funkcjonowania.
Dla opracowania skutecznych sposobów immunoterapeutycznych do leczenia AD wskazanym byłoby określenie zależnych od układu immunologicznego mechanizmów immunologicznych zmniejszenia obciążenia płytkami amyloidowymi po immunizacji antygenem typu Abeta42.
Dla projektowania kompozycji immunogennych i antygenów zawierających jedynie te epitopy o odpowiedniej aktywności biologicznej zalecane byłoby wykorzystanie wiedzy dotyczącej mechanizmu zmniejszania odkładania się płytki amyloidowej. Inną zaletą jest to, że takie kompozycje immunogenne mogą być projektowane tak, by wykluczały te epitopy, które indukują szkodliwą reakcję immunologiczną. Z tego względu istnieje zapotrzebowanie na określone antygeny, które indukują bardzo specyficzne i ograniczone odpowiedzi immunologiczne, jedynie wobec niewłaściwych (aberracyjnych) postaci antygenu Abeta.
Istnieje również zapotrzebowanie na kompozycje immunogenne zawierające zdefiniowane antygeny, które mogą być zastosowane w immunoterapii w celu indukcji bardzo specyficznych i ograniczonych odpowiedzi immunologicznych, jedynie wobec postaci patogennych antygenu Abeta. Dodatkowo dogodnym byłoby wyizolowanie przeciwciał przeciwko zdefiniowanym epitopom Abeta o dogodnych właściwościach do zastosowania w immunoterapii biernej. Jeszcze dogodniejsze byłoby opracowanie oznaczeń diagnostycznych do określania, możliwie szybko po rozpoczęciu leczenia, czy pacjent dotknięty chorobą Alzheimera odniesie korzyść z leczenia kompozycjami immunogennymi z antygenami Abeta. Istnieje także zapotrzebowanie na identyfikację inhibitorów odkładania się płytki amyloidowej i tworzenia włókienek.
Podsumowanie wynalazku
Niniejszy wynalazek spełnia te zapotrzebowanie przez dostarczenie kompozycji immunogennych zawierających reszty 4-10 (SEQ ID NO: 1) peptydu amyloidu Abeta42 (SEQ ID NO: 2), znane jako Abeta(4-10). Antygeny i kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku są użyteczne w leczeniu choroby Alzheimera, do projektowania małocząsteczkowych inhibitorów odkładania się amyloidu i jako odczynniki diagnostyczne. Ujawniono tu ponadto przeciwciała, które wiążą się z determinantą antygenową Abeta(4-10). Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku i ujawnione tu przeciwciała mogą być również wykorzystywane w sposobach łagodzenia objawów choroby
Alzheimera poprzez zmniejszanie obciążenia amyloidem u pacjentów dotkniętych chorobą Alzheimera.
Przedmiotem wynalazku jest peptyd o wzorze:
(A)n - - (Th)m - - (B)o - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20;
Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T;
gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez żadnych reszt rozdzielających;
w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta(4-10) stanowi (SEQ ID NO:1);
PL 209 696 B1 przy czym peptyd ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO: 46.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja peptydowa, charakteryzująca się tym, że zawiera mieszaninę dwóch lub więcej peptydów o wzorze:
(A)n - - (Th)m, - - (B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20;
Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T;
gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B wiązaniem peptydowym bez żadnych reszt rozdzielających;
w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta(4-10) stanowi (SEQ ID NO:1);
przy czym jeden z tych peptydów wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ
ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO: 46.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta-amyloidu (SEQ ID NO: 2), charakteryzująca się tym, że zawiera:
(a) antygen obejmujący epitop T-komórkowy, który zapewnia skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym antygen ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; oraz (b) adiuwant.
Korzystnie adiuwant obejmuje jedną lub więcej substancji wybranych z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, saponiny. Quill A, Quill A/ISCOMs, bromku dimetylo-dioktadecyloamonu/arwidyny, polianionów, kompletnego adiuwanta Freund'a, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy, N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy, niekompletnego adiuwanta Freunda i liposomów.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do zmniejszania ilości złogów amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do deagregowania włókienek amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób określania czy związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu, polegający na tym, że:
(i) kontaktuje się związek z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); i (ii) wykrywa się wiązanie związku z peptydem.
W sposobie tym korzystnie ocenia się ponadto czy związek hamuje tworzenie włókienek amyloidu in vitro.
Ujawniono tu również peptydy reprezentowane wzorem:
(A)n - - (Th)m - - (B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
w którym n, o, i p niezależnie oznaczają liczby całkowite od 0 do około 20;
PL 209 696 B1
Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczych komórek T lub jego pobudzający układ immunologiczny analog lub segment;
gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączona z epitopem komórki B przez wiązanie peptydowe bez żadnych reszt sekwencji rozdzielającej;
w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do około 5; a Abeta(4-10) stanowi (SEQ ID NO:1), lub jego analog zawierający konserwatywną substytucję aminokwasową.
Ujawniono tu również kompozycję immunogenną do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO:2), zawierającą: antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO: 1); i adiuwant.
W pewnej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu zawierającą: antygen obejmujący epitop T-komórkowy, zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej, i epitop B-komórkowy, składający się się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO: 1), oraz adiuwant, przy czym epitop T-komórkowy wybrany jest z grupy składającej się z:
(a) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego N-końcowo w stosunku do epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka, (b) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego C-końcowo w stosunku do epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka, i (c) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego na innym szkielecie głównym białka, który jest przyłączony przez wiązanie kowalencyjne do łańcucha głównego białka zawierającego epitop B-komórkowy.
W szczególnej postaci realizacji ujawniono także kompozycję immunogenną zawierającą epitop B-komórkowy i epitop T-komórkowy, przy czym epitop T-komórkowy ma sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO; 20 i SEQ ID NO: 21.
W innej, szczególnej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną zawierającą antygen i adiuwant, przy czym wspomniany adiuwant zawiera jedną lub więcej substancji wybranych z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, saponiny. Quill A, Quill A/ISCOMs, bromku dimetylodioktadecyloamonu/arwidyny, polianionów, kompletnego adiuwanta Freunda, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy, N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy, niekompletnego adiuwanta Freunda i liposomów.
Ujawniono tu również sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy, składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID N0:1), oraz (b) adiuwant.
Ujawniono tu również sposób zmniejszania ilości złogów amyloidowych w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); i (b) adiuwant.
Ujawniono tu także sposób deagregacji włókienek amyloidowych w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen obejmujący epitop T-komórkowy, zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej, oraz epitop B-komórkowy, składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1), oraz (b) adiuwant.
Ujawniono tu również wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1).
PL 209 696 B1
Ujawniono tu także wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen hamuje odkładanie się amyloidu.
Ujawniono tu również wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen deagreguje włókienka amyloidowe.
Ujawniono tu też sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1).
Ujawniono tu także sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym ta kompozycja przeciwciała zawiera przeciwciała poliklonalne.
Ujawniono tu również sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym kompozycja przeciwciała zawiera przeciwciała monoklonalne.
W jeszcze innej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza sposób do określania czy związek jest inhibitorem odkładania się i tworzenia włókienek obejmujący: kontaktowanie związku z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); i wykrywanie wiązania się związku z peptydem. W innej korzystnej postaci realizacji wynalazku sposób obejmuje ponadto ocenianie czy związek hamuje tworzenie włókienek amyloidu in vitro.
Ujawniono tu także sposób diagnostyczny do przewidywania skuteczności immunoterapii aktywnej w chorobie Alzheimera obejmujący: monitorowanie powstawania odpowiedzi immunologicznej wobec peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym pozytywna odpowiedź wobec peptydu Abeta(4-10) wskazuje, że terapię powinno się kontynuować a brak odpowiedzi immunologicznej lub bardzo słaba odpowiedź immunologiczna wskazuje, że terapii powinno się zaprzestać.
Ujawniono tu również kompozycję immunogenną zawierającą: antygen i adiuwant; przy czym antygen obejmuje epitop T-komórkowy, który zapewnia skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym antygen dostarcza skuteczną ilość białkowego kontekstu strukturalnego do indukowania przeciwciał, które wiążą się z celem immunologicznym zlokalizowanym w peptydzie beta amyloidu (SEQ ID NO:2).
Ujawniono tu również antygen obejmujący epitop B-komórkowy, przy czym białkowy kontekst strukturalny epitopu B-komórkowego, który zapewnia naśladowanie struktury drugorzędowej celu immunologicznego takiej jaka jest w peptydzie beta amyloidu (SEQ ID NO:2), wybrany jest z grupy składającej się z beta-kartki, skrętu w lewo, helisy, losowego zwinięcia lub ich kombinacji. W pewnych dalszych postaciach realizacji antygen zawiera epitop B-komórkowy zawierający mimetyk peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1).
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje
Należy rozumieć, że następujące terminy mają, chyba że wskazano inaczej, następujące znaczenia:
Adiuwant - odnosi się do substancji, które mogą być mieszaninami substancji, które łączy się z antygenem w celu wzmocnienia immunogenności antygenu w kompozycji immunogennej. Adiuwanty działają w taki sposób, że wzmacniają odpowiedź immunologiczną wobec antygenu zazwyczaj przez działanie bezpośrednio na układ immunologiczny i przez zapewnianie powolnego uwalniania antygenu.
Peptyd beta amyloidu (Abeta) - odnosi się do dowolnego peptydu z grupy peptydów o 39 - 43 resztach aminokwasowych, które powstają w wyniku obróbki z białka prekursora amyloidu (APP). W stosowanym tu znaczeniu Abeta42 odnosi się do peptydu Abeta o 42 resztach aminokwasowych. Ponadto, Abeta(4-10) odnosi się do peptydu o 7 resztach aminokwasowych z peptydu Abeta42 od reszty 4 do reszty 10. Jak zostanie to poniżej bardziej szczegółowo przedyskutowane, gen APP zostaje poddany alternatywnemu splicingowi w celu wytworzenia trzech powszechnych izoform, zawierających 770 aminokwasów (APP770), 751 aminokwasów (APP751) i 695 aminokwasów (APP695). Zwyczajowo numeracja kodonów najdłuższej izoformy, APP770, stosowana jest nawet wtedy gdy odnosi się do pozycji kodonów krótszych izoform.
PL 209 696 B1
Antygen - antygeny według niniejszego wynalazku stanowią kombinacje epitopów pomocniczych komórek T i epitopów B-komórkowych. Epitop pomocniczych komórek T może być zlokalizowany N-końcowo lub C-końcowo względem epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka. Epitop T-komórkowy może być również zlokalizowany na innym łańcuchu głównym polipeptydu, który jest kowalencyjnie przyłączony do polipeptydu zawierającego epitop B-komórkowy tak jak, przykładowo, mały peptyd jest kowalencyjnie przyłączony do cząsteczki nośnika, takiej jak hemocyjanina ze skałoczepa (ang. keyhole limpet, KLH), w celu zapewnienia immunogenności. Ewentualnie, epitop komórki T może być nie-kowalencyjnie zasocjowany z epitopem komórki B przez połączenie epitopu komórki T i B w kompozycji adiuwantem.
Obróbka antygenu - odnosi się do procesu, w którym antygeny zewnątrzkomórkowe z bakterii, wirusów lub kompozycji immunogennych pobierane są przez komórki prezentujące antygen (APC) na drodze endocytozy lub fagocytozy. Następnie, antygen ulega fragmentacji przez endosomy lub lizosomy a fragmenty peptydowe umieszczane są w bruzdach wiążących cząsteczek MHC klasy I i MHC klasy II.
Prezentacja antygenu - odnosi się do procesu, w którym cząsteczki MHC klasy I i MHC klasy II wiążą się z krótkimi przetworzonymi antygenami i prezentują te peptydy na powierzchni komórki w celu przeszukiwania przez komórki T poprzez interakcję zależną od receptora komórki T.
Epitop B-komórkowy - odnosi się do części antygenu, która jest celem wiązania przeciwciała i o której wiadomo również, że jest determinantą antygenową. Dla białkowych determinant antygenowych epitop B-komórkowy odnosi się do reszt aminokwasowych w szczególnej 3-wymiarowej aranżacji zazwyczaj odpowiadającej strukturze natywnej. Inaczej niż w przypadku epitopów T-komórkowych, epitopy B-komórkowe mogą być niezwykle wrażliwe na konformację białka.
Skuteczna ilość - odnosi się do ilości kompozycji immunogennej według wynalazku, opisanych tu przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen, które osiągają dowolne z określonych celi terapii. Skuteczna ilość ma również obejmować zarówno profilaktyczne, jak i terapeutyczne zastosowania kompozycji, przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen.
Epitop pomocniczej komórki T - epitopy pomocniczych komórek T (epitop Th) (epitop T-komórkowy) są peptydami, które wiążą się z cząsteczkami MHC klasy II i służą do aktywacji komórek T CD4+ aby zapewnić pomoc w postaci cytokin dla komórek B w wytwarzaniu odpowiedzi na antygen w postaci przeciwciał. Cząsteczki MHC klasy II załadowane są przetworzonymi fragmentami peptydowymi o długości od około 7 do około 30 reszt, w przedziałach komórkowych, które komunikują się ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Dlatego, epitopy pomocniczych komórek T ogólnie reprezentują fragmenty obcych białek.
Cel immunologiczny - odnosi się do rzeczywistego 3-wymiarowego epitopu (natywnego) w złogu amyloidowym lub krążących peptydach Abeta, który próbuje naśladować epitop B-komórkowy w antygenie. Przeciwciała przeciw białku zazwyczaj są specyficzne dla szczególnych sekwencji aminokwasowych w szczególnej strukturze drugorzędowej. Idealnie, indukowanie przeciwciał wobec antygenu naśladowcy antygenowego epitopu skutkuje wytwarzaniem przeciwciał, które rozpoznają i wiążą się z natywnym epitopem jaki występuje w patologicznych złogach amyloidowych lub krążących peptydach Abeta.
Immunogen - odnosi się do antygenu, dla którego istnieją dowody, że jest immunogenny.
Immunogenność - odnosi się do zdolności antygenu do prowokowania odpowiedzi immunologicznej. Antygeny, ogólnie, aby być imunogennymi muszą być zasocjowane z komórkami prezentującymi antygen. Wiele czynników wpływa na immunogenność, włączając wielkość antygenu, strukturę, sekwencję, stopień obcości, obecność adiuwanta, stan układu immunologicznego pacjenta, jak również inne czynniki genetyczne.
Peptyd - odnosi się do małej liczby, zazwyczaj 2, lub więcej, aminokwasów połączonych ze sobą.
Polipeptyd - odnosi się do dłuższych łańcuchów aminokwasów połączonych ze sobą, ale o sekwencji lub długości ogólnie niezdefiniowanej. Terminy białko, peptyd i polipeptyd sporadycznie będą stosowane wymiennie.
Ogólny epitop pomocniczej komórki T - odnosi się do epitopów pomocniczych komórek T zdolnych do indukowania T-komórkowych odpowiedzi aktywacyjnych (pomocy T-komórkowej) u dużej liczby osobników wykazujących ekspresję zróżnicowanych haplotypów MHC tj. populacji genetycznie zróżnicowanej. Takie epitopy funkcjonują u różnych osobników heterogennej populacji i uważane są za ogólne epitopy Th.
PL 209 696 B1
Łańcuch główny białka lub polipeptydu - odnosi się do powtarzanej jednostki reprezentującej aminokwas jako część sekwencji białka. Łańcuch główny polipeptydu składa się z sekwencji trzech atomów: azotu amidowego (N-H); węgla alfa (C); i węgla karbonylowego (C=O): które mogą być ogólnie przedstawione następująco: -N-C-CBiałko - ogólnie odnosi się do specyficznych łańcuchów i aminokwasów o zdefiniowanej sekwencji, długości i zwiniętej konformacji, ale białko, polipetyd i peptyd mogą być sporadycznie stosowane wymiennie.
Terapia lub leczenie - obejmuje następujące cele: (1) zapobieganie występowaniu niepożądanych objawów lub stanów patologicznych u podmiotu, u którego jeszcze nie rozpoznano ich występowania; (2) hamowanie niepożądanych objawów lub stanów patologicznych, tj. zatrzymywanie ich postępu; lub (3) łagodzenie objawów lub stanów patologicznych lub uwalnianie od nich, tj. wywoływanie regresji objawów lub stanów patologicznych.
Kompozycje i sposoby według niniejszego wynalazku mają swe źródło w stwierdzeniu niniejszych twórców, że na zależne od układu immunologicznego zmniejszenie złogów płytek amyloidowych i odpowiadającą temu poprawę funkcji poznawczych można wpływać przez specyficzne odpowiedzi immunologiczne w postaci przeciwciał wobec szczególnego celu immunologicznego lub epitopu B-komórkowego w Abeta42. Ten krytyczny cel immunologiczny został zidentyfikowany przez niniejszych twórców jako reszty 4-10 (FRHDSGY) (SEQ ID NO:1) Abeta42, co odpowiada resztom 675 do 681 białka prekursora amyloidu (APP), zgodnie z numeracją kodonów najdłuższej izoformy, APP770. W konsekwencji niniejsi twórcy określili ważny mechanizm immunologiczny zależnego od układu immunologicznego zmniejszania odkładania się płytek amyloidowych po immunizacji antygenami typu Abeta42.
Niniejsi twórcy stwierdzili, że przeciwciała rozpoznające i wiążące się z resztami 4-10 (FRHDSGY)(SEQ ID NO:1) Abeta42 hamują tworzenie się włókienek Abeta i neurotoksyczność Abeta. Ponadto, niniejsi twórcy stwierdzili, że przeciwciała rozpoznające i wiążące się z resztami 4-10 (FRHDSGY) Abeta42, deagregują utworzone włókienka Abeta42.
Ponadto, niniejsi twórcy ujawniają, że przeciwciała wytworzone podczas immunizacji Abeta42 znoszą in vitro śmierć komórek wywołaną przez Abeta.
Niniejszy wynalazek zrealizowano z użyciem myszy TgCRND8 jako modelu ludzkiej AD. Myszy TgCRND8 są użyteczne jako model AD, dlatego że przenoszą ludzki podwójnie zmutowany transgen APP695 pod kontrolą promotora białka prionowego i wykazują postępujące nagromadzanie peptydu Abeta42 oraz neurytycznych płytek amyloidowych w korze mózgowej (neuropatologiczna oznaka AD), którym towarzyszy postępujące zaburzenie funkcji poznawczych. Patrz Chishti i wsp., J. Biol. Chem., 276: 21562 - 570 (2001).
Ujawniono tu również przeciwciała specyficznie ukierunkowane na N-terminalny peptyd Abeta, które zostały wytworzone podczas immunizacji myszy C57BL6 x C3H protofibrilarnymi postaciami Abeta42. Ujawniono tu ponadto sekwencję Abeta FRHDSGY (SEQ ID NO:1) odpowiadającą Abeta(4-10), która reprezentuje epitop krytyczny dla odporności ochronnej dla choroby Alzheimera. Dodatkowo, w niniejszym wynalazku zidentyfikowano epitop Abeta(4-10) jako cel immunologiczny do wytwarzania korzystnej odporności ochronnej u pacjentów dotkniętych chorobą Alzheimera.
Prezentacja antygenu
Prezentacja antygenu odnosi się do molekularnych i komórkowych zdarzeń, w których antygeny są pobierane i przetwarzanie przez komórki prezentujące antygen (APC). Przetworzone fragmenty antygenu są następnie prezentowane komórkom efektorowym, które następnie ulegają aktywacji i zapoczątkowują odpowiedź immunologiczną. Jako najbardziej aktywne komórki prezentujące antygen scharakteryzowane zostały makrofagi (które są bezpośrednimi produktami rozwoju monocytów), komórki dendrytyczne i pewne komórki B.
Kluczowymi cząsteczkami w prezentacji antygenu i procesie odpowiedzi immunologicznej są cząsteczki MHC, które są polimorficzną rodziną genów kodowanych chromosomowo w regionie znanym jako główny układ zgodności tkankowej MHC. Cząsteczki MHC klasy I i klasy II u ludzi oznaczone są jako cząsteczki HLA (antygen ludzkich leukocytów). Pewne cząsteczki MHC mają za zadanie prezentację unikalnych fragmentów molekularnych na powierzchni komórek i ułatwianie ich rozpoznawania przez komórki T i inne komórki efektorowe układu immunologicznego. Patrz D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", str. 263 - 285 w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999). Ponadto, cząsteczki MHC klasy I
PL 209 696 B1 i klasy II mają za zadanie wiązanie peptydów w komórkach prezentujących antygen i następnie oddziaływanie z receptorami komórek T αβ na powierzchni komórek T.
Dokładniej, cząsteczki MHC klasy I wiążą się z i prezentują próbki własnych peptydów komórki, włącznie z endogennymi, cytozolowymi białkami, podlegającymi de novo translacji wirusami i antygenami nowotworowymi. Cząsteczki MHC klasy I generalnie prezentują peptydy o około 7 do około 16 resztach długości, które rozpoznawane są przez cytotoksyczne komórki T CD8+. Cząsteczki MHC klasy I zaangażowane są w uskutecznianie odpowiedzi cytotoksycznych komórek T, przy czym komórki zakażone wirusem są zabijane.
Niniejszy wynalazek dotyczy głównie epitopów komórek T, które służą do aktywacji komórek T CD4+, które mogą zapewnić pomoc komórkom B w wytwarzaniu odpowiedzi na antygen w postaci przeciwciał. Epitopy pomocniczych komórek T (epitop Th) wiążą się z cząsteczkami MHC klasy II, które załadowane są fragmentami peptydowymi o od około 7 do około 30 resztach długości, w kompartmentach komórkowych, które komunikują się ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Patrz D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", str. 263 - 285 w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA (1999) (Margulies). Dokładniej, cząsteczki MHC klasy II wiążą się z i prezentują komórkom T CD4+ próbki peptydów, które są wchłaniane przez komórki prezentujące antygen ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Komórki T CD4+ ulegają następnie aktywacji i zapewniają pomoc komórkom B w postaci cytokin przy wytwarzaniu przeciwciał. U ludzi, cząsteczki MHC klasy II obejmują cząsteczki HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP, które występują w różnych genetycznie kodowanych allelach.
Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku obejmują antygeny zawierające epitop B-komórkowy i epitop T-komórkowy, które są przetwarzane i prezentowane jako białka lub fragmenty peptydowe przez MHC na powierzchni tak zwanych "komórek prezentujących antygen", i są rozpoznawane przez limfocyty T CD4+ jako komórki efektorowe.
W celu zapewnienia przetrwania immunologicznego fizjologia cząsteczek MHC jest tak opracowana, że mogą one prezentować możliwie najszersze spektrum peptydów antygenowych. W konsekwencji liczba kopii zdefiniowanego peptydu antygenowego na powierzchni komórek prezentujących 2 antygen jest bardzo niska (zwielokrotnienie o 102 danego peptydu antygenowego przy całkowitej po5 pulacji receptorów peptydowych wynoszącej w przybliżeniu 105). Oznacza to, że na powierzchni komórek prezentujących antygen eksponowana jest bardzo heterogenna mieszanina peptydów antygenowych związanych z cząsteczkami MHC ("ligandy peptydowe").
Termin „epitop T-komórkowy" odnosi się do sekwencji białka, która wywołuje aktywację pomocniczych limfocytów T CD4+ (Th) po obróbce antygenu i prezentacji peptydu w kieszeni wiążącej cząsteczki MHC klasy II. Receptory komórek T alfa/beta na powierzchni komórek T oddziałują z kompleksem peptyd-MHC klasy II, który służy jako bodziec dla aktywacji. W efekcie natywna konformacja epitopu komórki T nie jest istotna, a jedynie istotna jest sekwencja pierwszorzędowa oraz zdolność wiązania się ze szczególną cząsteczką MHC.
Niniejszy wynalazek dotyczy peptydów, w szczególności peptydów syntetycznych, które zdolne są do indukowania przeciwciał wobec patologicznych postaci Abeta, takich jak te znajdowane w płytkach amyloidowych i we włókienkach.
Immunogenność peptydu odnosi się do zdolności peptydu do indukowania odpowiedzi w postaci przeciwciał, obejmującej przeciwciała, które specyficznie wiążą się z "epitopem B-komórkowym" lub "determinantą antygenową" w peptydzie. Patrz R.N. Germain, "Antigen Processing and Presentation", str. 287 - 340 w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, LippencottRaven, Filadelfia, PA (1999) (Germain). Aby być immunogennym, peptyd zawierający epitop B-komórkowy musi być prezentowany w połączeniu z antygenem MHC klasy II lub epitopem komórki T klasy II. Epitop T-komórkowy zazwyczaj jest przetwarzany z immunogenu podczas obróbki antygenu przez komórki prezentujące antygen i następnie wiąże się z cząsteczką MHC klasy II w sposób zależny od sekwencji. Patrz Germain. Ten kompleks MHC klasy II epitop komórki T rozpoznawany jest przez limfocyty T CD4+ (komórki Th). Komórki Th mają zdolność do wywoływania proliferacji specyficznych komórek B produkujących cząsteczki przeciwciał, które zdolne są do odróżniania zasocjowanego epitopu komórki B od prezentowanego immunogenu. Zatem, wytwarzanie przeciwciała, które jest specyficzne dla szczególnego epitopu komórki B jest powiązane z obecnością epitopu komórki T w obrębie lub zasocjowanego z immunogenem.
Inne powikłanie powstaje w przypadku gdy antygen nie jest obcym białkiem. Ze względu na to, że Abeta jest cząsteczką własną, nie powinna ona zawierać żadnych epitopów Th, które indukują
PL 209 696 B1 aktywację limfocytów i zatem odpowiedź w postaci przeciwciał przeciwko sobie samej. Dlatego należy zapewnić obce epitopy komórki T poprzez zawarcie specyficznych sekwencji pochodzących z silnych immunogenów obcych, włącznie z toksyną botulinową, toksyną krztuśca, białkiem F wirusa odry oraz antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) i innym. Takie sekwencje epitopów komórek T mogą być zawarte w tym samym łańcuchu głównym białka co epitop B-komórkowy, którym jest peptyd Abeta(4-10). Lokalizacja epitopu komórki T względem epitopu B-komórkowego może być albo N-końcowa, albo C-końcowa. Ewentualnie, epitop komórki T może być dostarczony na oddzielnym łańcuchu głównym białka, znanym jako cząsteczka nośnikowa, która może być, ale niekoniecznie, związana kowalencyjnie z peptydem zawierającym epitop B-komórkowy.
Dodatkowe epitopy komórki T mogą być wybrane z użyciem następujących procedur znanych w dziedzinie, takich jak kwasowa elucja i sekwencjonowanie z użyciem spektroskopii masowej peptydów związanych cząsteczkami MHC klasy II z oczyszczonych immunochromatograficznie cząsteczek klasy II jak ujawniono w Rudensky i wsp., Nature 353: 622 - 627 (1991); Chicz i wsp., Nature 358: 764 - 768 (1992); i Hunt i wsp.. Science 256: 1817 - 1820 (1992).
Idealnie, wybrane epitopy Th zdolne są, dogodnie, do wzbudzania aktywacyjnych odpowiedzi komórek T (pomoc komórek T) u dużej liczby osobników z ekspresją zróżnicowanych haplotypów MHC. Oznacza to, że te epitopy funkcjonują u wielu różnych osobników heterogennej populacji i uważane są za ogólne epitopy Th. Ogólne epitopy Th mają tę zaletę, że wzbudzają silne odpowiedzi w postaci przeciwciał anty-Abeta u większości członków zróżnicowanej populacji.
Epitopy pomocniczych komórek T według wynalazku wybierane są nie tylko ze względu na zdolność do wywołania odpowiedzi immunologicznych u większości członków danej populacji, ale również ze względu na zdolność do powodowania odpowiedzi typu pamięci przypominania (ang. memory/recall response). Większość z pacjentów ludzkich otrzymujących immunoterapię Abeta okaże się być już immunizowana szczepionkami pediatrycznymi przeciwko odrze, śwince, różyczce, błonicy, krztuścowi i tężcowi. Ci pacjenci zostali już uprzednio poddani ekspozycji na więcej niż jeden z epitopów Th obecnych w mieszaninie immunogenów. Taka wcześniejsza ekspozycja na epitop Th poprzez immunizację standardowymi szczepionkami powinna spowodować powstanie klonów komórek Th, które mogą natychmiastowo odpowiedzieć i zapewnić pomoc dla odpowiedzi w postaci przeciwciał.
Epitop pomocniczych komórek T stanowi sekwencję aminokwasów (aminokwasy naturalne lub nie-naturalne), która obejmuje epitop T. Epitop pomocniczych komórek T może składać się z ciągłego lub nieciągłego epitopu. Zatem nie każda reszta aminokwasowa epitopu pomocniczych komórek T jest pożądaną częścią epitopu. W związku z tym epitopy Th, włączając analogi i segmenty epitopów Th, zdolne są do nasilania lub stymulowania odpowiedzi immunologicznej wobec Abeta. Immunodominanty epitopów pomocniczych komórek T wykazują szeroką reaktywność w populacjach ludzi i zwierząt o znacznie rozbieżnych typach MHC. Patrz Cells i wsp. J. Immunol. 140: 1808 - 1815 (1988); Demotz i wsp. J. Immunol. 142: 394 -402 (1989); Chong i wsp. Infect. Immun. 60: 4640 - 4647 (1992). Epitop pomocniczych komórek T przedmiotowych peptydów ma od około 10 do około 50 reszt aminokwasowych, dogodnie od około 10 do około 40 reszt aminokwasowych, dogodniej od około 10 do około 30 reszt aminokwasowych, jeszcze dogodniej od około 10 do około 20 reszt aminokwasowych, lub w szczególności od około 10 do około 15 reszt aminokwasowych. W przypadku występowania wielokrotnych epitopów komórek T pomocniczych (tj. n > 2), każdy epitop pomocniczej komórki T może być niezależnie taki sam, albo inny.
Epitop pomocniczej komórki T może obejmować analogi, substytucje, delecje i insercje od jednej do około 10 reszt aminokwasowych w epitopie pomocniczej komórki T. Segmenty epitopu pomocniczej komórki T są ciągłymi częściami epitopu pomocniczej komórki T, które są wystarczające do wzmocnienia lub stymulowania odpowiedzi immunologicznej wobec Abeta. Epitop pomocniczej komórki T może być oddzielony od epitopu B-komórkowego za pomocą jednej lub więcej reszt aminokwasowych grupy rozdzielającej.
Opisane tu epitopy Th obejmują epitopy pomocniczych komórek T powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B (HB-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny krztuśca (PT-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny tężca (TT-Th), epitopy pomocniczych komórek T białka F wirusa odry (MV-Th), epitopy pomocniczych komórek T głównego białka błony zewnętrznej Chlamydia trachamates (CT-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny błonicy (DT-Th), epitopy pomocniczych komórek T sporozoitu typu „circumsporozoite" Plasmodium falciparum (PF-Th), epitopy pomocniczych komórek T izomerazy triozofosforanowej Schistosoma mansoni (SM-Th), epitopy pomocniczych komórek T Tra T Escherichia coli (TraT-Th) oraz wzmagające odpowiedź immunologiczną anaPL 209 696 B1 logi i segmenty dowolnych z tych epitopów Th. Szereg wykazujących szeroką reaktywność epitopów Th opisanych jest w Patencie U.S.A. nr 5,759,551 wydanym dla Ladd i wsp. Przykłady sekwencji epitopów komórek T pomocniczych dostarczone są poniżej:
Tabela 1. Epitopy pomocniczych komórek T
HB-Th:
Phe--Phe--Leu--Leu--Thr--Arg- - Ile--Leu--thr--Ile --Pro--Gln-Ser--Leu--Asp, SEQ ID NO: 3
PT-Th:
Lys--Lys--Leu--Arg--Arg--Leu--Leu--Tyr--Met--Ile--Tyr--Met-Ser--Gly--Leu--Ala--Val--Arg--Val--His--Val--Ser--Lys--Glu-Glu--Gln--Tyr--Tyr--Asp--Tyr, SEQ ID NO:4
TT-Th:
Lys--Lys--Gin--Tyr--Ile--Lys--Ala--Asn--Ser--Lys--Phe--Ile-Gly--Ile--Thr--Glu--Leu, SEQ ID NO:S
TT2-Th:
Lys - -Lys - - Phe--Asn- - Asn- -Phe--Thr- -Val - -Ser--phe--Trp--Leu-Arg--Val--Pro--Lys--Val--Ser--Ala--Ser--His--Leu SEQ ID NO:6
PT-Th:
Tyr--Met--Ser--Gly--Leu--Ala- -Val--Arg--Val--His--Val--Ser-Lys--Glu--GlU, SEQ ID NO:7
TT3-Th:
Tyr- - Asp--Pro--Asn--Tyr--Leu--Arg--Thr--Asp--Ser--Asp--Lys-Asp- - Arg- - Phe- -Leu - -Gin- -Thr- -Met - -Val - -Lys - - Leu - -Phe - -Asn- Arg--Ile--Lys, SEQ ID NO:8
PT-Th:
Gly --Ala--Tyr- - Ala -- Arg- -Cys - - Pro--Asn- -Gly- -Thr--Arg--Ala-Leu--Thr--Val--Ala--Glu--Leu--Arg--Gly--Asn--Ala--Glu--Leu SEQ ID NO:9
MVF1-Th:
Leu--Ser - -Glu- - Ile--Lys - -Gly- -Val--Ile--Val--His—Arg--Leu— Glu--Gly--Val SEQ ID NO:10
MVF2-Th :
Gly--Ile--Leu--Glu--Ser--Arg--Gly--Ile - -Lys - - Ala - - Arg--Ile- Thr--His--Val--Asp--Thr--Glu--Ser--Tyr SEQ ID NO:11
TT4-Th :
Trp--Val- Arg--Asp--Ile--Ile --Asp--Asp--Phe--Thr--Asn--Glu-Ser--Ser--Gln--Lys--Thr SEQ ID NO:12
TT5-Th
Asp--Val- - Ser--Thr-- Ile--Val--Pro--Tyr--Ile--Gly- -Pro--Ala-Leu--Asn--His--Val SEQ ID NO: 13
CT-Th : '
Ala--Leu--Asn--Ile--Trp--Asp--Arg--Phe--Asp--Val--Phe--Cys-Thr--Leu--Gly--Ala - -Thr--Thr--Gly--Tyr- -Leu--Ly3--Gly--Asn-Ser SEQ ID NO:14
DT-Th :
Asp--Ser- -Glu - -Thr--Ala- - Asp - - Asn- -Leu--Glu--Lys--Thr--Val -Ala - -Ala- -Leu--Ser--Ile- -Leu--Pro—Gly--His--Gly--Cys SEQ ID NO : 15
PL 209 696 B1
DT-Th :
Glu--Glu--Ile--Val--Ala--Gin--Ser--Ile--Ala--Leu--Ser--Ser-Leu--Met--Val--Ala--Gln--Ala--Ile--Pro--Leu--Val--Gly--Glu-Leu--Val--Asp- - Ile--Gly- - Phe- - Ala- - Ala- -Thr--Asn--Phe--Val- Glu--Ser--Cys
SEQ ID NO:16
PF-Th :
Asp--His --Glu--Lys--Lys--His --Ala--Lys .--Met--Glu--Lys--Ala-Ser- -Ser--Val - - Phe- -Asn- - Val - - Val- - Asn- - Ser SEQ ID NO: 17
SM-Th :
Lys - -Trp - - Phe - -Lys - -Thr- - Asn- - Ala- - Pro - - Asn--Gly- -Val--Asp-Glu--Lys--His--Arg--His SEQ ID NO: 18
TraTl-Th :
Gly--Leu--Gin--Gly--Lys--Hf is--Ala--Asp--Ala--Val--Lys--AlaLys--Gly SEQ ID NO:19
TraT2-Th :
Gly--Leu--Ala--Ala--Gly--Leu--Val- -Gly--Met--Ala--Ala--Asp-Ala--Met - - Val--Glu--Asp--Val--Asn SEQ ID NO:20
TraT-Th :
Ser--Thr- -Glu--Thr- -Gly- -Asn- -Gin- -His - -His - -Tyr--Gln- -Thr- Arg--Val--Val--Ser--Asn--Ala--Asn--Lys SEQ ID NO: 21
W pewnych postaciach realizacji ujawniono tu epitop T-komórkowy o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; i SEQ ID NO: 21;
Wzorzec antygenu
Kompozycje immunologiczne według niniejszego wynalazku zawierają antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z Abeta(4-10).
Peptydy antygenowe tu ujawnione reprezentowane są następującymi wzorami:
I. (A)n - - (Th)m - - (B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p
II. (A)n - - Abeta(4-10) - - (B)0 - - (Th)m - - (C)p
III. (D)q - - Abeta(4-10) (E)r w których A, C, D i E niezależnie oznaczają resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
w których B, grupa rozdzielająca, oznacza resztę aminokwasową albo sekwencję reszt aminokwasowych; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez reszt grupy rozdzielającej;
w których n, o i p oznaczają niezależnie liczby całkowite od 0 do około 20; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez reszt grupy rozdzielającej;
w których m oznacza liczbę całkowitą od 1 do około 5; w których q i r niezależnie oznaczają liczby całkowite z zakresu od 0 do około 100;
Th niezależnie oznacza sekwencję reszt aminkwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T lub jego wzmagający odpowiedź immunologiczną analog lub segment zawierający konserwatywną substytucję; Th może występować w powtórzeniach tandemowych;
Abeta(4-10) oznacza reszty 4-10 (FRHDSGY) z Abeta42 SEQ ID NO:1, lub jego wzmagający odpowiedź immunologiczną analog lub segment zawierający konserwatywną substytucję; Abeta(4-10)
PL 209 696 B1
SEQ ID NO: 1 może występować w powtórzeniach tandemowych lub w inny sposób występować w wielokrotnych powtórzeniach.
Wynalazek obejmuje również zdefiniowane w zastrzeżeniach kompozycje dwóch lub więcej peptydów reprezentowanych wzorami I, II i III. Jeden lub więcej peptydów o wzorze I może być połączonych z wytworzeniem kompozycji. Ewentualnie jeden lub więcej peptydów o wzorach I, II i i III może być połączonych z wytworzeniem mieszaniny lub kompozycji.
Peptydy antygenowe tu ujawnione mają od około 20 do około 100 reszt aminokwasowych, ewentualnie od około 20 do około 80 reszt aminokwasowych. W pewnej postaci realizacji wynalazku peptydy antygenowe według niniejszego wynalazku mają od około 20 do około 60 reszt aminokwasowych, dogodnie od około 20 do około 50 reszt aminokwasowych, i jeszcze dogodniej od około 25 do około 40 reszt aminokwasowych. W innej zalecanej postaci realizacji peptyd antygenowy ma od około 20 do około 35 reszt aminokwasowych.
Gdy A, B, C, D i E są resztami aminokwasowymi, mogą być dowolnymi aminokwasami niewystępującymi naturalnie lub dowolnymi aminokwasami występującymi naturalnie. Aminokwasy niewystępujące naturalnie obejmują, ale bez ograniczeń, beta-alaninę, ornitynę, norleucynę, norwalinę, hydroksyprolinę, tyroksynę, kwas gamma-aminomasłowy, homoserynę, cytrulinę i podobne. Naturalnie występujące aminokwasy obejmują alaninę, argininę, asparaginę, kwas asparaginowy, cysteinę, kwas glutaminowy, glutaminę, glicynę, histydynę, izoleucynę, leucynę, lizynę, metioninę, fenyloalaninę, prolinę, serynę, treoninę, tryptofan, tyrozynę i walinę. Ponadto, gdy m oznacza przynajmniej jeden, a dwie lub więcej z grup A, B, C, D lub E są aminokwasami, to każdy aminokwas oznacza niezależnie taki sam lub inny aminokwas.
Aminokwasy grup A, B, C, D lub E mogą być modyfikowane kwasami tłuszczowymi. Przykładowo, N-końcowo lub C-końcowo wobec epitopu Abeta można dodać 1 lub więcej epsilonpalmitoilo-lizyn, a cały peptyd może być zakotwiczony na powierzchni nośników. Nośniki mogą zawierać immunostymulator w postaci lipidu. Patrz Nicolau i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 2332 - 2337 (2002).
W celu skonstruowania antygenów białkowych epitop Abeta(4-10) może być włączony do dendrimerów białkowych poprzez zastosowanie strategii sprzęgania ortogonalnego. Specjalnie skonstruowane dendrimery mogą tworzyć podstawę do składania skutecznych antygenów szczepionkowych, włączając, przykładowo, konstrukcję peptydów wieloantygenowych jak to opisano w Patencie U.S.A. nr 6,310,810 dla Tarn.
Peptydy syntetyczne jako antygeny i szczepionki
W wielu przypadkach udowodniono, że zastosowanie jako immunogenu, do opracowywania skutecznych szczepionek i immunoterapii do leczenia chorób człowieka, całego białka lub glikoproteiny oraz czynników zakaźnych jest nieskuteczne albo ze względu na brak immunogenności, albo skutkuje nasileniem zakażenia lub choroby ze względu na zawarcie nie mających działania ochronnego epitopów. Patrz Osterhaus i wsp. Vaccine, 7: 137 - 141 (1989); Gilbert i wsp., Virus Research, 7: 49 - 67 (1987); Burke, D. Perspect. Biol. Med., 35: 511 - 530 (1992).
Zastosowanie syntetycznych antygenów peptydowych w szczepionkach lub kompozycjach immunogennych może przezwyciężyć wiele z problemów związanych ze szczepionkami rekombinowanymi. Zalety stosowania peptydów syntetycznych, które odpowiadają specyficznym domenom obejmują: wybór i włączenie jedynie epitopów o działaniu ochronnym; eliminacja epitopów nasilających chorobę; eliminacja szkodliwych epitopów autoimmunizacyjnych; eliminacja materiału zakaźnego; i to, że peptydy syntetyczne są dobrze zdefiniowane chemicznie i mogą być wytwarzane po rozsądnych kosztach. Patrz Arnon i Horwitz, Curr. Opin. Immunol., 4: 449 - 453, (1992).
Wadą jest to, że małe peptydy syntetyczne mogą nie zawierać dokładnych sekwencji aminokwasowych niezbędnych do przetwarzania i wiązania białek głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II, w celu prezentacji układowi immunologicznemu. Patrz Rothbard, Biotechnology, 20: 451-465, (1992). Inną wadą jest to, że 3-wymiarowa struktura roztworu małych peptydów może być inna, niż ta w natywnym białku i, dlatego, peptyd taki niekoniecznie będzie wzbudzać humoralną odpowiedź immunologiczną o odpowiedniej specyficzności i powinowactwie wraz z uzyskaniem ochronnej odporności. Patrz Bernard i wsp. Aids. Res. and Hum. Retroviruses, 6: 243-249, (1990).
Antygeny peptydowe według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane na szereg różnych sposobów. Peptyd, ze względu na swój względnie mały rozmiar, może być syntetyzowany w roztworze lub na nośniku stałym zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Obecnie komercyjnie
PL 209 696 B1 dostępne są różne syntetyzery automatyczne i manualne, i można je wykorzystywać zgodnie ze znanymi protokołami. Patrz, przykładowo. Patent U.S.A. nr 5,827,666 dla Finn i wsp.; Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. 2-gie., Pierce Chemical Co., 1984; i Tarn i wsp., J. Am Chem. Soc. (1983) 105: 6442.
Ewentualnie można zastosować technologię hybrydowego DNA, w której syntetyczny gen wytwarza się z użyciem pojedynczych nici kodujących polipeptyd lub zasadniczo komplementarnych do nich nici, przy czym pojedyncze nici zachodzą na siebie i mogą być połączone w środowisku do hybrydyzacji w celu zhybrydyzowania. Zhybrydyzowane nici mogą być następnie ligowane z utworzeniem kompletnego genu i, poprzez wybór odpowiednich końców, gen można wstawić do wektora ekspresyjnego, z których wiele jest obecnie łatwo dostępnych. Patrz, na przykład, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie Drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (tu "Sambrook i wsp., 1989"). Następnie mogą być one eksprymowane w prokariotycznych lub eukariotycznych układach ekspresyjnych w celu wytworzenia pożądanych peptydów.
Nośniki
Dla zapewnienia pomocy komórek T, antygeny epitopu Abeta(4-10) według wynalazku, takie jak opisane w tym zgłoszeniu, mogą być sprzęgane z cząsteczką nośnika.
Zalecane cząsteczki nośnika, do których kowalencyjnie przyłącza się (sprzęga) antygeny według wynalazku są nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne i o wystarczającej do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej u ssaków wielkości.
Przykłady odpowiednich cząsteczek nośnika obejmują toksoid tężca, hemocyjaninę ze skałoczepa (KLH) i peptydy odpowiadające epitopom komórek T (to jest T1 i T2) glikoproteiny otoczkowej gp120, które mogą zastępować cząsteczki nośnikowe niepochodzące z wirusa AIDS (Cease, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 4249, 1987; Kennedy i wsp., J. Biol. Chem. 262: 5769, 1987). Peptydy mogą być również podawane z farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem, na przykład, tzw. „Alum", lub sprzęgane z cząsteczkami nośnika bardziej immunogennymi niż toksoid tężca.
Wiązanie cząsteczki nośnika z antygenem peptydowym według wynalazku może być albo bezpośrednie albo za pomocą cząsteczki rozdzielającej. Cząsteczki rozdzielające są, dogodnie, nietoksyczne i reaktywne. Odpowiednią cząsteczkę rozdzielającą do wiązania sekwencji Abeta(4-10), lub jej części, z cząsteczką nośnika mogą zapewnić dwie reszty glicyny dodane na aminokońcowym końcu peptydu; ewentualnie, sekwencje Abeta(4-10), lub ich części, mogą być przykładowo syntetyzowane w bezpośrednim sąsiedztwie do, przykładowo, innej immunogennej sekwencji amyloidu. W celu sprzęgania z cząsteczką nośnika cysteiny można dodać albo na N lub C końcu peptydu Abeta(4-10) albo, w celu utworzenia większych agregatów molekularnych, można przyłączać je do obu końców w celu ułatwienia polimeryzacji międzyłańcuchowej za pomocą tworzenia wiązań disiarczkowych.
Sprzęganie cząsteczki nośnika z peptydem dokonywane jest z użyciem środka sprzęgającego. Dogodnie stosuje się heterofunkcyjny środek sprzęgający - ester M-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynoimidu (MBS) lub związek rozpuszczalny w wodzie - ester m-maleimidobenzoilosulfosykcynoimidu (sulfo-MBS), jak opisano przez Green i wsp., Cell, 28: 477 (1982); oraz przez Palker i wsp., Proc. Nat' Acad. Sci. U.S.A. 84: 2479 (1987). Do sprzęgania peptydów z innymi cząsteczkami dostępnych jest wiele innych środków sprzęgających, takich jak aldehyd glutarowy. Sposoby sprzęgania są dobrze znane w dziedzinie. Patrz przykładowo rozdział 9 (strony 419 - 455) i rozdział 11 (strony 494-527) w Bioconjugate Techniques autorstwa G.T. Hermanson, Academic Press, San Diego 1996).
Adiuwanty
Dwie z charakterystycznych cech antygenów to ich immunogenność lub zdolność do indukowania odpowiedzi immunologicznej in vivo (włączając tworzenie specyficznych przeciwciał), oraz ich antygenowość, to jest zdolność do selektywnego rozpoznawania przez przeciwciała, które są specyficzne wobec sekwencji i struktury.
Pewne antygeny są jedynie słabo immunogenne w przypadku gdy podawane są same. W konsekwencji, słabo immunogennemu antygenowi może nie udać się wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej niezbędnej do zapewnienia skutecznej immunoterapii lub ochrony dla organizmu.
PL 209 696 B1
Immunogenność antygenu można zwiększyć poprzez podawanie go w mieszaninie z substancjami dodatkowymi, nazywanymi adiuwantami. Adiuwanty działają tak, by zwiększyć odpowiedź immunologiczną wobec antygenu albo poprzez działanie bezpośrednio na układ immunologiczny, albo przez zapewnienie powolnego uwalniania antygenu. Zatem, adiuwant modyfikuje farmakokinetyczne właściwości antygenu i wydłuża czas oddziaływania między antygenem a układem immunologicznym. Zastosowanie adiuwantów jest dobrze znane w dziedzinie i zastosować można wiele różnych adiuwantów. Wytwarzanie kompozycji immunogennych oraz zastosowanie adiuwantów opisane jest ogólnie w Vaccine Design--The subunit and adjuvant approach (Wyd. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology tom 6 Plenum Press 1995.
Najbardziej rozpowszechnionymi adiuwantami są adiuwanty w postaci kompletnego adiuwanta Freund'a, emulsja zawierająca martwe mykobakterie w roztworze soli fizjologicznej w oleju mineralnym oraz niekompletny adiuwant Freund'a, który nie zawiera mykobakterii.
Adiuwanty zdolne są albo do zwiększania intensywności odpowiedzi immunologicznej wobec antygenu, albo do wywoływania specyficznej aktywacji układu immunologicznego. Istnieje pięć ogólnych kategorii adiuwantów obejmujących (1) sole glinu, takie jak wodorotlenek glinu lub fosforan glinu; (2) środki powierzchniowo czynne, takie jak saponina i Quill A, Quill A/ISCOMs, bromek dimetylo-dioktadecylo-amonu/arwidyna; (3) polianiony; (4) pochodne bakteryjne, takie jak kompletny Freund'a, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (dipeptydy muramylowe), N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (treonylo MDP); (5) podłoża i materiały do powolnego uwalniania, takie jak niekompletny Freund'a (emulsja olejowa), liposomy. Patrz New Generation Vaccines, Rozdział 11, strony 129-140, Adjuvants for a New Generation of Vaccines autorstwa A.C. Allison i N.E. Byars, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1990).
Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku zawierają antygen i adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują „alum", który jest solą glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu lub fosforanu glinu, ale również może być to sól wapnia, żelaza lub cynku. Inne odpowiednie adiuwanty obejmują nierozpuszczalne zawiesiny acylowanej tyrozyny lub acylowane cukry, pochodne kationowe lub anionowe polisacharydów lub polifosfazeny.
Do stworzenia układu adiuwantowego można zastosować kombinacje adiuwantów. Odpowiednie układy adiuwantowe obejmują, na przykład, kombinację monofosforylolipidu A, dogodnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) wraz z solą glinu. Alternatywny układ adiuwantowy obejmuje, na przykład, RIBI ADJUVANT SYSTEMTM, który stanowi kombinację monofosforylolipidu A, dogodnie 3-de-0-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL), syntetyczny dikorynomykolan trehalozy (ang. trehalose dicorynomycolate) oraz materiały szkieletu ściany komórkowej. Wzmocniony układ obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w publikacji WO 94/00153, lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest tłumiony jak ujawniono w publikacji WO 96/33739. Szczególnie silny preparat adiuwanta wykorzystujący QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej/woda opisany jest w WO 95/17210 i jest on preparatem zalecanym.
Ewentualnie kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku mogą być zawarte w liposomach lub nośnikach jak opisano w patencie U.S.A. dla Fullerton, o nr 4,235,877.
Struktura przeciwciała
W niniejszym wynalazku bierze pod uwagę przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen, które wiążą się z epitopem Abeta(4-10) i hamują odkładanie się amyloidu oraz tworzenie włókienek. Ogólnie, wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer. Każdy tetramer zawiera dwie identyczne pary łańcuchów polipeptydowych, każda para ma jeden łańcuch "lekki" (około 25 kDa) i jeden łańcuch "ciężki" (około 50-70 kDa). Aminokońcowa część każdego łańcucha może zawierać region zmienny o około 100 do 110 lub więcej aminokwasach odpowiedzialny głównie za rozpoznanie antygenu. Karboksy-końcowa część każdego łańcucha może definiować region stały, odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. Zazwyczaj, ludzkie łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako łańcuchy lekkie kappa i lambda. Ponadto, ludzkie łańcuchy ciężkie klasyfikuje się zazwyczaj jako łańcuchy ciężkie mu, delta, gamma, alfa lub epsilon, i definiują one izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. W łańcuchach lekkich i ciężkich regiony zmienne i stałe połączone są razem poprzez region "J" o około 12 lub więcej aminokwasach, przy czym łańcuch ciężki zawiera również region "D" o około 10 lub więcej aminokwasach. Patrz J.K. Frazer i J.D. Capra, "Inmunoglobulins: Structure and Function", str. 37 - 75 w Funda16
PL 209 696 B1 mental Immunology, Wydanie Czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999) (Frazer).
Regiony zmienne każdej pary łańcuch lekki/ciężki mogą tworzyć miejsce wiązania przeciwciała. Zatem, ogólnie, nienaruszone przeciwciało ma dwa miejsca wiązania antygenu. Za wyjątkiem bifunkcyjnych lub bispecyficznych przeciwciał, te dwa miejsca są, uogólniając, takie same.
Zazwyczaj, wszystkie łańcuchy wykazują taką samą strukturę ogólną o względnie konserwowanych regionach zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, nazywanymi również regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów każdej pary są zazwyczaj dopasowane z regionami zrębowymi, umożliwiając wiązanie ze specyficznym epitopem. Ogólnie ujmując, od N- do C- końca, łańcuchy lekkie i ciężkie obejmują domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny następuje, uogólniając, zgodnie z definicjami zawartymi w Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), lub Chothia, i wsp., J Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia, i wsp., Nature 342: 878 - 883 (1989).
Typy przeciwciał
Termin "cząsteczka przeciwciała" obejmuje, ale bez ograniczenia, przeciwciała i ich fragmenty. Termin obejmuje przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała bispecyficzne, fragmenty Fab przeciwciała, fragmenty F(ab)2 przeciwciała, fragmenty Fv przeciwciała (np. VH lub VL), jedno łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała i fragmenty dsFv przeciwciała. Ponadto, cząsteczki przeciwciał mogą być w pełni ludzkimi przeciwciałami, przeciwciałami humanizowanymi lub przeciwciałami chimerycznymi. Zalecane cząsteczki przeciwciał stanowią przeciwciała monoklonalne, całkowicie ludzkie.
Zalecane cząsteczki przeciwciał anty-Abeta(4-10) rozpoznają ludzkie białka i peptydy amyloidu Abeta; jednakże niniejsze ujawnienie obejmuje również cząsteczki przeciwciał, które rozpoznają białka i peptydy amyloidu Abeta innych gatunków, dogodnie ssaków (np. myszy, szczura, królika, owcy lub psa).
Ponadto, przeciwciała anty-Abeta(4-10) mogą pochodzić z ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Takie przeciwciała uzyskiwane są z myszy transgenicznych, które zostały tak zmienione, żeby w odpowiedzi na prowokację antygenem wytwarzały specyficzne, ludzkie przeciwciała. W tej technice elementy lokus ludzkich łańcuchów lekkich i ciężkich wprowadza się do szczepów myszy uzyskanych z linii zarodkowych komórek macierzystych, które zawierają celowane przerwy w endogennych loci łańcucha ciężkiego i lekkiego. Myszy transgeniczne mogą wytwarzać ludzkie przeciwciała specyficzne dla antygenów ludzkich, a myszy mogą być stosowane do wytwarzania hybrydom wydzielających ludzkie przeciwciała. Sposoby uzyskiwania ludzkich przeciwciał z myszy transgenicznych są opisane przez Green i wsp., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg i wsp., Naturę 368: 856 (1994) i Taylor 10 i wsp., Int. Immun. 6: 579 (1994).
W zalecanej postaci realizacji w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko Abeta(4-10) wytwarza się z użyciem myszy transgenicznych niosących części ludzkiego układu immunologicznego zamiast układu immunologicznego myszy. Te myszy transgeniczne, do których można się tu odnosić jako do myszy "HuMAb", zawierają ludzkie miniloci genu immunoglobuliny, które koduje niepoddane rearanżacji sekwencje ludzkich immunoglobulin łańcucha ciężkiego (mu i gamma) oraz łańcucha lekkiego kappa, wraz z celowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha mu i kappa (Lonberg, N., i wsp., (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859). W związku z powyższym myszy wykazują zmniejszoną ekspresję mysich IgM lub kappa, a w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego poddawane są przełączaniu klas oraz mutacjom somatycznym z wytworzeniem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG o wysokim powinowactwie (Lonberg, N., i wsp., (1994), powyżej; przegląd w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101; i Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65 - 93. Wytwarzanie myszy HuMab jest powszechnie znane w dziedzinie i opisane w, przykładowo, Lonberg, i wsp., (1994) Nature 368(6474): 856 - 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101; Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol, tom 13: 65 - 93; Fishwild, D., i wsp., (1996) Nature Biotechnology 14: 845 - 851. Patrz ponadto, Patenty U.S.A. o numerach 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie dla Lonberg i Kay, oraz GenPharm International; Patent U.S.A. nr 5,545,807 dla Surani, i wsp.
PL 209 696 B1
W celu wytworzenia w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko Abeta(4-10), myszy HuMab można immunizować kompozycjami zawierającymi antygen Abeta(4-10) według niniejszego wynalazku. Dogodnie, po pierwszej immunizacji, myszy będą w wieku 6-16 tygodni. Przykładowo, kompozycje immunogenne zawierające antygen Abeta(4-10) według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do śródotrzewnowej immunizacji myszy HuMab. Myszy mogą być również immunizowane całymi komórkami HEK293, które są stabilnie transformowane lub transfekowane genem zawierającym Abeta(4-10). "Antygenowy polipeptyd Abeta(4-10)" może odnosić się do polipeptydu Abeta(4-10) lub jego dowolnego fragmentu, który wzbudza odpowiedź immnunologiczną anty-Abeta(4-10) u myszy HuMab.
Ogólnie, myszy transgeniczne HuMAb odpowiadają najlepiej w przypadku gdy wstępnie immunizowane są śródotrzewnowo (IP) antygenem w kompletnym adiuwancie Freund'a, po czym w każdym następnym tygodniu immunizacjami IP (zazwyczaj do całkowitej ilości 6) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freund'a. Myszy mogą być immunizowane, początkowo, komórkami z ekspresją Abeta(4-10) (np. stabilnie transformowane komórki HEK293), po czym rozpuszczalnym fragmentem antygenu zawierającym Abeta(4-10), takim jak kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku, i w sposób ciągły otrzymywać naprzemienne immunizację dwoma antygenami. Odpowiedź immunologiczną można monitorować podczas trwania protokołu immunizacji w próbkach osocza uzyskiwanych przez skrwawianie pozaoczodołowe lub ogona. Osocze można następnie poddawać badaniu pod kątem obecności przeciwciał anty-Abeta(4-10), na przykład za pomocą ELISA, a myszy z wystarczającymi mianami immunoglobulin można wykorzystywać do fuzji. 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony myszy mogą być stymulowane dożylnie podanym antygenem. Oczekuje się, że potrzebne może być przeprowadzenie 2-3 fuzji dla każdego antygenu. Dla każdego antygenu można immunizować kilka myszy. Przykładowo, można immunizować całkowitą ilość dwunastu myszy HuMAb szczepów HC07 i HC012.
Komórki hybrydoma, które wytwarzają monoklonalne, w pełni ludzkie przeciwciała antyAbeta(4-10) mogą być następnie wytwarzane za pomocą sposobów powszechnie znanych w dziedzinie. Sposoby te obejmują, ale bez ograniczenia, techniki hybrydom oryginalnie opracowane przez Kohler, i wsp., Nature 256: 495 - 497 (1975); jak również technikę triomy opracowaną przez Hering, i wsp., Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 (1988) oraz Hagiwara, i wsp., Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15 (1993); technikę hybrydomy ludzkich komórek B (Kozbor, i wsp., Immunology Today 4: 72 1983); oraz Cote, i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80: 2026 - 2030 (1983); oraz technikę hybrydomy EBV- (Cole, i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77 - 96, 1985). Dogodnie mysie splenocyty izoluje się i poddaje fuzji z PEG z mysią linią komórkową szpiczaka według standardowych protokołów. Powstałe tak hybrydomy przeszukuje sie następnie pod kątem wytwarzania przeciwciał specyficznych dla antygenu. Przykładowo, zawiesiny pojedynczych komórek z limfocytów śledziony od immunizowanych myszy poddaje się fuzji z jedną szóstą liczby niewydzielających mysich komórek szpiczaka P3X63-Ag8.653 (ATCC,
CRL 1580) z 50% PEG. Komórki umieszcza się na płytkach płaskodennych do mikromiareczko5 wania w przybliżeniu w ilości 2 x 105 komórek, po czym następuje dwu tygodniowa inkubacja w pożywce selekcyjnej zawierającej 20% płodową surowicę cielęcą, 18% kondycjonowane pożywki "653", 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutaminę, 1 mM L-glutaminę, 1 mM pirogronian sodu, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny i IX HAT (Sigma; HAT dodaje się 24 godziny po fuzji). Po dwóch tygodniach komórki hoduje się w pożywce, w której HAT zastępuje się HT. Poszczególne studzienki przeszukuje się następnie za pomocą ELISA pod kątem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgM i IgG anty-Abeta(4-10). Po wystąpieniu intensywnego wzrostu hybrydomy, pożywkę obserwuje się zazwyczaj po 10 - 14 dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciała przenosi się na nowe płytki, przeszukuje ponownie i jeżeli wciąż są pozytywne pod względem ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG anty- Abeta(4-10), mogą być one subklonowane przynajmniej dwukrotnie poprzez ograniczające rozcieńczenia. Stabilne subklony hoduje się następnie w hodowli tkankowej in vitro w celu wytworzenia małych ilości przeciwciała do charakteryzacji.
Cząsteczki przeciwciał anty-Abeta mogą być również wytwarzane rekombinacyjnie (np. w układzie ekspresyjnym E.coli/T7 jak dyskutowano powyżej). W tej postaci realizacji kwasy nukleinowe kodujące cząsteczki przeciwciała (np. VH lub VL) wprowadzane są do plazmidu opartego na pet i poddawane ekspresji w układzie E.coli/T7. Istnieje kilka sposobów wytwarzania przeciwciał rekombinacyjnych, które są dobrze znane w dziedzinie. Jeden z przykładów sposobu wytwa18
PL 209 696 B1 rzania przeciwciał rekombinacyjnych ujawniony jest w Patencie U.S.A. nr 4,816,567. Cząsteczki przeciwciała mogą być również wytwarzane rekombinacyjnie w komórkach CHO lub NSO.
W stosowanym tu znaczeniu termin "przeciwciało monoklonalne" odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała składające się na populację są identyczne za wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoko specyficzne, ukierunkowane przeciwko pojedynczemu miejscu antygenowemu. Zaletą przeciwciał monoklonalnych jest to, że mogą być one syntetyzowane przez hodowlę hybrydomy, zasadniczo niezanieczyszczoną innymi immunoglobulinami. Modyfikator "monoklonalne" wskazuje na charakter przeciwciała uzyskiwanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie ma być rozumiany jako wymagający wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek szczególną metodą. Jak wspomniano powyżej, przeciwciała monoklonalne, które mają być użyte zgodnie z wynalazkiem mogą być wytwarzane z użyciem sposobu hybrydomy opisanego po raz pierwszy przez Kohler, i wsp., Nature 256: 495 (1975).
Przeciwciało poliklonalne oznacza przeciwciało, które zostało wytworzone wśród innych lub w obecności innych przeciwciał. Ogólnie, przeciwciała poliklonalne, wytwarza się z limfocytów B w obecności kilku innych limfocytów B, które wytwarzały inne, nieidentyczne przeciwciała. Zazwyczaj, przeciwciała monoklonalne wytwarza się bezpośrednio w immunizowanym zwierzęciu.
Termin "przeciwciało w pełni ludzkie" odnosi się do przeciwciała, które obejmuje jedynie sekwencje ludzkich immunoglobulin. Podobnie, "przeciwciało mysie" odnosi się do przeciwciała, które obejmuje jedynie sekwencje immunoglobulin mysich.
Niniejsze ujawnienie obejmuje "przeciwciało chimerowe" - przeciwciało, które obejmuje ujawniony tu region zmienny poddany fuzji lub w postaci chimery z regionem przeciwciała (np. regionem stałym) z innego gatunku niż człowiek (np. mysz, koń, królik, pies, krowa, kurczak). Te przeciwciała mogą być stosowane do modulowania ekspresji lub aktywności Abeta(4-10) u gatunków innych niż człowiek.
"Przeciwciało humanizowane" odnosi się do przeciwciała, które zawiera CDR nie człowieka w zrębie skądinąd przeciwciała ludzkiego lub region zmienny nieczłowieka przyłączony do regionu stałego skądinąd przeciwciała ludzkiego. W niniejszym ujawnieniu bierze się również pod uwagę przeciwciała humanizowane, które zawierają CDR lub region zmienny z gatunku innego niż człowiek, który obejmuje ujawnioną tu sekwencję aminokwasową regionu zmiennego lub CDR.
Immunoglobuliny można przypisać do różnych klas w zależności od sekwencji aminokwasowych domeny stałej ich łańcuchów ciężkich. Występuje przynajmniej pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM a kilka z nich można ponadto podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG-1, IgG-2, IgG-3 i IgG-4; IgA-1 i IgA-2. Ujawnione tu cząsteczki przeciwciała stanowią dogodnie IgG-1 lub IgG-4.
Ujawnione tu przeciwciała według wynalazku mogą być sprzężone ze znacznikami izotopowymi, takimi jak 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 46Sc, 109Pd, 234Th, i 40K, oraz znacznikami nie radioizotopowymi, takimi jak 157Gd, 55Mn, 52Tr, 56Fe.
Ujawnione tu przeciwciała według wynalazku mogą być sprzężone ze znacznikami fluorescencyjnymi lub chemiluminescencyjnymi, włączając fluorofory, takie chelaty pierwiastków ziem rzadkich, fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, izotiocyjanina, fikoerytryna, fikocy152 janina, allofikocyjanina, aldehyd o-ftalowy, fluoreskamina, 152Eu, dansyl, umbeliferon, lucyferyna, znacznik luminalowy, znacznik izoluminalowy, znacznik aromatyczny ester akrydyny, znacznik imidazolowy, znacznik sól akrydyny, znacznik ester szczawianu, znacznik ekworynowy, 2,3-dihydroftalazynodiony, biotyna/awidyna, znaczniki spinowe oraz trwałe wolne rodniki.
Do sprzęgania ujawnionych tu cząsteczek przeciwciał z różnymi ugrupowaniami można zastosować dowolną technikę znaną w dziedzinie, włącznie ze sposobami opisanymi przez Hunter, i wsp., Nature 144: 945 (1962); David, i wsp., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, i wsp., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); i Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:1407 (1982). Sposoby sprzęgania przeciwciał są sposobami konwencjonalnymi i dobrze znanymi w dziedzinie.
Ujawniono tu również pewne sposoby terapeutyczne oparte na podawaniu kompozycji immunogennych zawierających Abeta(4-10) lub cząsteczek, które wiążą się z peptydami Abeta. Zatem, antygeny zawierające Abeta(4-10) mogą być podawane w celu hamowania nasilonego odkładania się płytek amyloidowych w starzeniu, chorobach człowieka, takich jak choroba Alzheimera.
PL 209 696 B1
Ujawniono tu również sposoby wytwarzania, identyfikowania, oczyszczania, charakteryzowania antygenów i analogów Abeta(4-10); oraz sposoby stosowania antygenów i analogów Abeta(4-10)). Antygeny Abeta(4-10) mogą być wytwarzane poprzez modyfikacje, włączając cięcie proteolityczne większych peptydów amyloidu izolowanych ze źródeł naturalnych, z użyciem technik inżynierii genetycznej, lub syntezy chemicznej, np. syntezy peptydów w fazie stałej; lub mogą być wytwarzane de novo z użyciem metodologii inżynierii genetycznej lub syntezy peptydów w fazie stałej.
Biologia molekularna
W niniejszym wynalazku wykorzystane mogą być znane w dziedzinie konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii i rekombinacji DNA. Techniki tego rodzaju zostały w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz, przykładowo, Sambrook, Pritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie Drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (tutaj "Sambrook i wsp., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, tomy I i II (wyd. D. N. Glover 1985); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M. J. Gait 1984); Nucleic Acid Hybridization [wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins (1985)]; Transcription And Translation [wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins, (1984)]; Animal Cell Culture [wyd. R. I. Freshney, (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel i wsp. (wyd.). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Myszy CRND 8
Myszy TgCRMDS stanowią model zwierzęcy AD, w którym występują duże poziomy syntezy Abeta i odkładania się amyloidu w CNS w wieku 3 miesięcy. Patrz publikacja międzynarodowa nr W001/97607 opublikowana 12/27/01. Ponadto, myszy TgCRNDS wykazują zmiany w funkcjach poznawczych w tym samym okresie czasu co zapoczątkowanie odkładania się amyloidu. Model myszy transgenicznej TgCRND8 cechuje się dużym podobieństwem z naturalnie występującym fenotypem choroby Alzheimera, w oparciu o ekspresję w CNS białka amyloidu Abeta, jak również analizę histologiczną, neurologię i deficyty behawioralne.
W celu wytworzenia trzech powszechnych izoform, gen APP poddawany jest alternatywnemu splicingowi. W większości tkanek ekspresji ulega najdłuższa izoforma, zawierająca 770 aminokwasów (APP770) i druga co do długości izoforma zawierająca 751 aminokwasów (APP751). Trzecia, najkrótsza, izoforma zawierająca 695 aminokwasów (APP695), ulega ekspresji głównie w mózgu. Zwyczajowo numeracja kodonów najdłuższej izoformy, APP770, stosowana jest nawet w przypadku odnoszenia się do krótszych izoform.
Mysz transgeniczna TgCRND8 zawiera transgen eksprymujący zmutowaną postać specyficznej dla mózgu izoformy APP695; transgen ten przenosi obydwie mutacje APP szwedzką i "Indiana".
cDNA APP695 wytworzono tak, że zawiera (stosując numerację kodonów APP695) mutacje K595N/M596L (mutacja szwedzka i V642F (mutacja Indiana). Do tych i innych mutacji APP będzie się tu ogólnie odnosić stosując bardziej powszechny system numerowania kodonów APP770 tzn. dla tych mutacji, K670N/M671L (mutacja szwedzka) i V717F (mutacja Indiana).
Kasetę cDNA podwójnego mutanta APP695 wstawiono do kosmidowego wektora ekspresyjnego, cosTet, który zawiera promotor białka prionowego chomika syryjskiego. Wektor wprowadzono za pomocą mikrowstrzyknięcia do oocytu myszy w celu stworzenia transgenicznej linii TgCRND8. U myszy tych w wieku trzech miesięcy występują mnogie rozlane złogi amyloidowe, w którym to okresie widoczne są deficyty w uczeniu przestrzennym.
W celu wytworzenia myszy bitransgenicznych, myszy TgCRND8 krzyżowano z wieloma innymi myszami transgenicznymi obciążonymi mutacjami związanymi z AD, które wykazują jeszcze inne nasilone neuropatologie związane z AD.
Podawanie i zastosowania medyczne
Ujawniono tu również sposoby stosowania antygenu Abeta(4-10) do identyfikacji leków, które zakłócają wiązanie się Abeta42 z płytkami. Jeden z takich aspektów obejmuje oznaczenia do wyszukiwania leków w celu identyfikacji leków, które naśladują i/lub uzupełniają wpływ Abeta42. W jednej z takich postaci realizacji bibliotekę leku przeszukuje się poprzez oznaczanie aktywności wiązania peptydu zawierającego Abeta(4-10) ze specyficzną małą cząsteczką. Monitoruje się wpływ ewentualnego leku na powinowactwo Abeta42 do płytek. Jeżeli lek zmniejsza powinowactwo wiązania Abeta42 do płytek, staje się lekiem kandydującym. Leki mogą być wyszukiwane pod względem ich zdolności do przerywania tworzenia się płytek, powstrzymywania procesu włókienkogenezy lub deagregacji już utworzonych włókienek.
PL 209 696 B1
Antygeny, przeciwciała lub inne związki użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być wprowadzane jako komponenty kompozycji farmaceutycznej. Kompozycje farmaceutyczne zawierają dogodnie terapeutyczną lub profilaktyczną ilość przynajmniej jednego z antygenów, przeciwciał lub innych ich związków z farmaceutycznie skutecznym nośnikiem.
Do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych użytecznych w niniejszych sposobach należy zastosować taki nośnik farmaceutyczny, który jest dla pacjenta substancją zgodną, nietoksyczną, odpowiednią do dostarczania antygenów, przeciwciał lub ich fragmentów wiążących lub związków terapeutycznych zidentyfikowanych zgodnie ze sposobami tu ujawnionymi. Jako nośnik stosowane mogą być jałowa woda, alkohol, tłuszcze, woski, obojętne ciała stałe a nawet liposomy. Do kompozycji farmaceutycznych wprowadzone mogą być również farmaceutycznie dopuszczalne adiuwanty (środki buforujące, środki dyspergujące). Przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne je zawierające są szczególnie użyteczne do podawania pozajelitowego, tj. dożylnie, dotętniczo, śródmięśniowo lub podskórnie. Jednakże, użyteczne są również preparaty donosowe i inne preparaty aerozolowe. Stężenie związku takiego jak przeciwciało w preparacie do podawania może się znacząco różnić, tj. od poniżej około 0,5%, zazwyczaj przynajmniej 1% aż do 15 lub 20% lub więcej wagowo, i wybiera się je głównie na podstawie objętości cieczy, lepkości itp., zalecanych dla szczególnej wybranej drogi podawania. Właściwe sposoby wytwarzania kompozycji do podawania będą znane lub oczywiste dla specjalistów w dziedzinie i opisane zostały szczegółowo, przykładowo, w Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 18-ste, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990).
Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku, albo ewentualnie opisane tu przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen podaje się w terapeutycznie skutecznych dawkach wystarczających do modulowania odkładania się u podmiotu amyloidu (lub złogów amyloidu). "Terapeutycznie skuteczna dawka" dogodnie moduluje odkładanie się amyloidu o przynajmniej około 20%, dogodniej o przynajmniej około 40%, jeszcze dogodniej o przynajmniej około 60%, i jeszcze dogodniej o przynajmniej około 80% względem podmiotów niepoddawanych traktowaniu. Zdolność sposobu do modulowania odkładania się amyloidu można oceniać na układach modelowych, które mogą przewidywać skuteczność w modulowaniu odkładania się amyloidu w chorobach człowieka, takich jak modele zwierzęce znane w dziedzinie, włączając, np. sposób opisany w publikacji PCT nr WG 96/28187) lub sposobami in vitro, np. sposobem Chakrabartty'ego opisanym w publikacji PCT nr WO 97/07402, lub na opisanym tu układzie modelowym TgCRND8. Ponadto, ilość lub rozmieszczenie złogów amyloidu u podmiotu można w sposób nie inwazyjny monitorować in vivo, na przykład, przez zastosowanie znakowanych radioaktywnie wskaźników, które mogą asocjować ze złogami amyloidu, po czym przeprowadza się scyntygrafię dla zobrazowania złogów amyloidu (patrz np. Aprile, C. i wsp., Eur. J. Nuc. Med. 22: 1393 (1995); Hawkins, P. N., Baillieres Clin. Rheumatol. 8:635 (1994) i odsyłacze tam cytowane). Zatem, przykładowo, w celu określenia wpływu związku terapeutycznego na odkładanie się złogów amyloidu u podmiotu można oceniać, po okresie leczenia zgodnie ze sposobami według wynalazku, ilość złogów amyloidu u podmiotu i porównywać z ilością złogów u podmiotu przed rozpoczęciem leczenia związkiem terapeutycznym według wynalazku.
Powinno być zrozumiałym, że zdolność opisanego tu sposobu do modulowania odkładania się amyloidu lub ilości złogów amyloidu można, w pewnych postaciach realizacji, oceniać poprzez obserwowanie objawów i oznak związanych z odkładaniem się amyloidu lub ilością złogów amyloidu in vivo. Zatem, przykładowo, zdolność opisanego tu sposobu do zmniejszania odkładania się amyloidu lub ilości złogów amyloidu może być związana z możliwą do zaobserwowania poprawą objawów klinicznych choroby lub stanu związanych ze złogami amyloidu, lub spowolnieniem albo opóźnieniem postępu objawów stanu chorobowego. Zatem, monitorowanie objawów klinicznych choroby może być użyteczne do oceny skuteczności opisanego tu sposobu do modulowania amyloidu.
Sposoby tu opisane mogą być użyteczne do leczenia skrobawicy związanej z innymi chorobami, w których występuje odkładanie się amyloidu. Klinicznie skrobawica może być określona jako pierwotna, wtórna, rodzinna i izolowana. Amyloidy zostały podzielone na kategorie ze względu na typ białka amyloidowego zawartego w amyloidzie. Nieograniczające przykłady amyloidów, które można modulować, w oparciu o identyfikację ich białek amyloidowych, są następujące (związana z nimi choroba podana jest w nawiasie po białku amyloidowym): beta-amyloid (choroba Alzheimera, zespół Downa, dziedziczny krwotok mózgowy typu duńskiego ze skrobawicą, angioPL 209 696 B1 patia mózgowa); amyloid A (reaktywna [wtórna] skrobawica, rodzinna gorączka Śródziemnomorska, zespół Muckle-Well'a; amyloid kappa łańcuch L lub amyloid lambda łańcuch L (idiopatyczna [pierwotna] skrobawica], związana ze szpiczakiem lub makroglobulinemią); Abeta2M (przewlekła hemodializa); ATTR (rodzinna polineuropatia amyloidowa [typu portugalskiego, japońskiego, szwedzkiego], rodzinna kardiomiopatia amyloidowa (typu duńskiego), izolowane złogi amyloidu w sercu (ang. isolated cardiac amyloid, układowa skrobawica osób starszych); AIAPP lub amylina (cukrzyca wieku dorosłego, gruczolak wysepkowatokomórkowy); przedsionkowy czynnik sodopędny (izolowane złogi przedsionkowe amyloidu); prokalcytonina (rak rdzeniasty tarczycy); gelsolina (rodzinna skrobawica typu fińskiego); cystatyna C (dziedziczny krwotok mózgowy ze skrobawica [typ islandzki]); AApoA-I (rodzinna polineuropatia amyloidowa [typ Iowa]); AApoA-II (przyspieszone starzenie u myszy); amyloid związany z fibrynogenem; amyloid związany z lizozymem; i AScr lub PrP-27 (choroba Scrapie, choroba Creutzfeldt'a-Jacob'a, zespół Gerstmann'a-Straussler'a-Scheinker'a, gąbczaste encefalopatia bydła).
Następujące przykłady przedstawione są jedynie jako ilustracja, a nie ograniczenie zakresu wynalazku.
Szczegółowy opis zalecanych postaci realizacji wynalazku
P r z y k ł a d 1
Synteza antygenu i charakteryzacja strukturalna
W przykładzie tym twórcy opisują jak syntetyzować, oczyszczać i charakteryzować syntetyczne immunogeny peptydu Abeta.
Syntezy następujących peptydów Abeta: Abeta42, Abeta40, Abeta30, i N-końcowych peptydów epitopowych przeprowadzono na pół-automatycznym syntetyzerze peptydów ABIMED EPS221, z użyciem żywicy z polimeru szczepionego PEG NovaSyn (Novabiochem) PEG i metodologii ochrony N-końcowej Fmoc, tak jak opisano. Patrz Mayer-Fligge i wsp., J. Pept. Sci. 4: 355 - 363 (1998). Etapy cykli odbezpieczania Fmoc i końcowego odbezpieczania monitorowano spektrofotometrycznie. Peptydy syntetyczne oczyszczano z użyciem chemi-preparatywnej kolumny do HPLC z odwróconą fazą C18 ąbondapak.
Masy cząsteczkowe oczyszczonych peptydów syntetycznych charakteryzowano następnie z użyciem spektroskopii masowej przez desorpcję plazmową (MALDI) i spektroskopii masowej elektrospreju (ESI). Następnie do immunizacji zastosowano jedynie te frakcje peptydów o masach cząsteczkowych odpowiadających przewidywanym masom.
Drugorzędową strukturę peptydów w roztworze oceniano z użyciem dichroizmu kołowego (CD). Spektra CD zapisywano z użyciem spektropolarymetru JASCO J-500. Patrz Mayer-Fligge i wsp., J. Pept. Sci. 4: 355 - 363 (1998). Ponadto, przeprowadzono badania NMR z użyciem analizy 2D-NMRNOESY na instrumencie Bruker-AMX-600 jak opisano wcześniej. Michels i wsp., "Structure and Functional Characterization of the periplasmis N-terminal polypeptide domain of the sugar specific ion channel protein (scry-porin)," Protein Science (w Press 2002).
P r z y k ł a d 2
Immunizacja myszy CRND8 Abeta42
W tym przykładzie, twórcy pokazują, że peptyd Abeta42 jest immunogenny u myszy z ekspresją transgenu APP oraz u myszy nie-transgenicznych.
Myszy
Myszy TgCRND8 zostały wcześniej opisane przez Chishti i wsp., J. Biol. Chem. 276: 21562 - 21570 (2001). Myszy trzymano w niekrewniaczym tle C3H/C57BL/6J z nadekspresją Beta-APPtypu szwedzkiego i mutacji Beta-APPV717F w położeniu cis na transkrypcie beta-APP695. Geny Beta-APPtypu szwedzkiego i Beta-APPV717F były pod kontrolą promotora genu prionowego chomika syryjskiego. Myszy TgCRND8 uzyskano z krzyżówek dodatnich pod względem transgenu hemizygotycznych myszy C3H/C57BL6 (82%/18%) z myszami dzikiego typu (wt) C57BL/6J, odstawiono od karmiących matek, genotypowano pod względem obecności transgenu beta-APP i trzymano w grupach po 2-4 myszy tej samej płci w standardowych klatkach dla myszy. Myszom dostarczano bez ograniczeń karmę granulowaną, karmę proszkowaną i wodę. Wszystkie myszy przechowano przez jeden tydzień przed immunizacją a ich masy zapisywano dzień przed i dwa dni po każdej immunizacji. Wszystkie z grup doświadczalnych były dopasowane pod względem wieku i płci.
PL 209 696 B1
Protokół immunizacji i izolacja surowic
Syntetyczny peptyd Abeta42 i peptyd kontrolny składający się z reszt 8-37 (ATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY) (SEQ ID NO:52) wysepkowego polipeptydu amyloidu (ang. islet amyloid polypeptide (lAPP)) izolowano z użyciem chromatografii HPLC na kolumnie C18 ąbondapak a czystość oznaczano z użyciem spektroskopii masowej i analizy aminokwasów.
Protokół immunizacji i schemat zostały wcześniej opisane w publikacji autorstwa Schenk i wsp. Nature 400: 173 - 177 (1999). Następnie określono miana w próbkach surowic (200 μΐ krwi) zebranych poprzez nakłucie żyły kończyny tylnej w wieku 13 tygodni i poprzez punkcję serca przy zakończeniu procedury, w wieku 25 tygodni. Przed zastosowaniem w tych badaniach deaktywowano dopełniacz poprzez inkubację w 56°C przez 30 minut. Frakcje Ig izolowano na 5 ml kolumnie z białkiem G. Próbki nałożono, przepłukano PBS, eluowano 0,1 M cytrynianem sodu i buforowano 1 M Tris. Wszystkie frakcje Ig przed użyciem sterylizowano przez filtrację.
Wyniki immunizacji
Surowice izolowano od myszy nieimmunizowanych (N=18), oraz zarówno od myszy TgCRND8, jak i nie-transgenicznych myszy z tego samego miotu, które w sposób powtarzany immunizowano przez okres 5 miesięcy albo Abeta42 (n=34; 18 TgCRND8 i 16 nie-Tg), lub obwodowym peptydem amyloidu (polipeptyd związany z wysepkami (ang. islet associated polypeptide, (lAPP)), przy czym liczba myszy immunizowanych wynosiła 17, z których 10 było myszami TgCRND8 a 7 myszami nie-transgenicznymi (nie-tg). U myszy powstały znaczące miana przeciw Abeta42 (1:5000-1:50,000) i przeciwko lAPP (1-5000 do 1:30,000). Co interesujące, nie wykryto znaczących różnic w mianach anty-Abeta42 u myszy transgenicznych TgCRND8S i nietransgenicznych myszy z tego samego miotu. Każda próbka surowic od myszy immunizowanych Abeta42 mogła pozytywnie barwić płytki dojrzałego Abeta w skrawkach histopatologicznych mózgów nie-immunizowanych myszy TgCRND8 w wieku 20 tygodni. Przeciwnie, surowice od myszy kontrolnych immunizowanych peptydem lAPP i myszy nieimmunizowanych nie mogły barwić płytek dojrzałego Abeta w skrawkach histopoatologicznych mózgów nieimmunizowanych myszy TgCRND8 w wieku 20 tygodni. Dlatego wyniki wskazują, że można indukować autoimmunizację w postaci przeciwciał, które rozpoznają i wiążą się z płytkami neuropatologicznymi zawierającymi Abeta.
P r z y k ł a d 3
Hamowanie tworzenia włókienek przez mysią surowicę odpornościową
W przykładzie tym, jak przedstawiono w Tabeli 2, twórcy pokazują, że surowice od większości myszy immunizowanych Abeta42 hamowały tworzenie włókienek.
W niskich stężeniach roztwory peptydów Abeta będą spontanicznie grupowały się we włókienka w czasie 14 dniowego okresu inkubacji. Te włókienka charakteryzują się średnicą 50 - 70 A, którą można monitorować z użyciem opisanej poniżej mikrosko pii elektronowej.
Mikroskopia elektronowa
Abeta42 stosowano bezpośrednio po rozpuszczeniu w wodzie w wyjściowym stężeniu wynoszącym 10 mg/ml lub po zgrupowaniu w dojrzałe włókienka amyloidu. Abeta42 inkubowano w obecności i przy braku surowic w końcowym stężeniu peptydu wynoszącym 100 μg/ml. Seryjne rozcieńczenia rożnych surowic dodano do Abeta42 i inkubowano w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do 2 tygodni. W przypadku ujemnych wybarwień w mikroskopii elektronowej pokryte węglem siatki z pioloformu zatopiono w roztworach wodnych peptydów. Po hybrydyzacji i wysuszeniu powietrzem siatek próbki wybarwiono 1% (wag./obj.) kwasem fosfowolframowym. Ugrupowania peptydu obserwowano w mikroskopie elektronowym Hitachi, który pracował przy 75 V i powiększeniu 60,000 X.
Wyniki mikroskopii elektronowej
Dla oceny wpływu surowic myszy immunizowanych Abeta na grupowanie się Abeta we włókienka, inkubowano surowice jak opisano powyżej, w obecności i przy braku Abeta42, w 37°C przez okres do 14 dni. Porcje z każdej z mieszanin reakcyjnych badano w dniach 1, 3, 7, 10 i 14 pod kątem występowania włókienek Abeta42 poprzez mikroskopię elektronową z barwieniem ujemnym.
Przy braku surowic lub w obecności surowic nieimmunizowanych Abeta42 tworzył długie włókienka (~7500 A) o średnicy charakterystycznej 50-70 A. Długie włókienka wskazywały zatem, że normalne składniki surowic nie hamowały tworzenia włókienek Abeta w niniejszych warunkach oznaczenia. W obecności surowic od zwierząt immunizowanych lAPP wytwarzanych było mniej
PL 209 696 B1 włókienek Abeta42, ale postać włókienek nie miała charakterystycznej średnicy 50 - 70 A. Przeciwnie, jak pokazano w Tabeli 2, większość surowic od myszy immunizowanych Abeta42 (n=27/34) w dużym stopniu blokowało tworzenie włókienek, chociaż kilka z surowic wywarło niewielki lub żaden wpływ. Ponadto, surowice od myszy TgCRND8 immunizowanych Abeta lub od nietransgenicznych myszy z tego samego miotu hamowały równoważnie tworzenie włókienek Abeta, wskazując, że repertuar przeciwciał jest zależny jedynie od immunogenu a nie od ilości złogów
Abeta42.
Jak zostało to podsumowane w Tabeli 2, nie wykryto różnic w strukturze włókienek po inkubacji w obecności surowic od myszy nieimmunizowanych. Surowice od myszy immunizowanych lAPP zmniejszały rozległość tworzenia włókienek, ale utworzone włókienka były podobne do włókienek utworzonych przez sam Abeta42. Ostatecznie, surowice od myszy immunizowanych Abeta42 hamowały powstawanie włókienek w różnym stopniu, od całkowitego hamowania do jedynie lekkich spadków gęstości włókienek. Patrz Tabela 2.
T a b e l a 2 Podsumowanie wpływów surowic nieodpornościowych, immunizowanych Abeta42 i immunizowanych lAPPP na tworzenie włókienek, rozpad włókienek i cytotoksyczność
Badania dotyczące hamowania
Immunogen Całkowita liczba Agregacja Deagregacja Toksyczność
Nie odpornościowe 18 0/18 0/18 0/18
Abeta42 34 27/34 26/34 22/30
lAPP 17 4/17 1/17 2/11
P r z y k ł a d 4
Rozbicie istniejących włókienek przez surowicę odpornościową
W przykładzie tym twórcy pokazali, że surowice od myszy immunizowanych Abeta42 powodowały rozbicie wcześniej utworzonych włókienek Abeta42, natomiast inkubacja z kontrolnymi surowicami myszy nieimmunizowanych lub surowicami od myszy immunizowanych lAPP nie wywierała wpływu na wcześniej utworzone włókienka.
Surowice od myszy immunizowanych Abeta42 inkubowano z wcześniej utworzonymi włókienkami Abeta42 przez okres do 30 dni, w celu określenia czy surowice od myszy immunizowanych Abeta42 mogą rozbijać wcześniej utworzone włókienka Abeta. Włókienka Abeta42 z ewidentną agregacją wytwarzano poprzez inkubację porcji Abeta w wysokich stężeniach przy ciągłym mieszaniu. Inkubację utworzonych wcześniej włókienek bez surowicy (sam Abeta), z surowicami od myszy immunizowanych lAPP, lub surowic od myszy nieimmunizowanych (dane nie pokazane) nie wywierały wpływu, nawet po 30 dniach inkubacji. Przeciwnie, surowice od myszy immunizowanych Abeta42 (n=26/34) wywoływały deagregację włókienek Abeta42 albo do małych krótkich włókienek o średnicy 30 A i średniej długości 100 A, albo do amorficznych agregatów. Deagregacja była ewidentna już po trzech dniach inkubacji i zakończona po 14 dniach. Ponadto, deagregacja była zależna od stężenia, przy zwiększających się stężeniach przeciwciała zmniejsza się czas potrzebny do deagregacji włókienek. Ostatecznie, ponieważ proporcja 1:1 przeciwciała do Abeta42 nie była niezbędna do deagregacji, prawdopodobnym jest, że przeciwciała anty-Abeta wiązały się jedynie z podgrupą cząsteczek Abeta, takich jak oligomery protofibrylarne lub inne prekursory. Wyniki określono z użyciem mikroskopii elektronowej jak opisano w Przykładzie 4, przy powiększeniu 60,000 X.
P r z y k ł a d 5
Określenie z użyciem spektroskopii masowej docelowego epitopu immunologicznego Abeta42 rozpoznawanego przez mysie surowice odpornościowe
W przykładzie tym twórcy pokazują jak dokładnie zidentyfikować epitop mający krytyczne znaczenie biologiczne do zastosowania w leczeniu chorób ze złogami amyloidu.
Schemat ogólny
W celu określenia epitopu rozpoznawanego przez surowice anty- Abeta42 zastosowano spektroskopię masową o wysokiej rozdzielczości z cyklotronowym rezonansem jonowym (ang.
high resolution Fourie r-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FT-ICR-MS); Marshall i wsp.. Mass Spectrom. Rev. 17: 1 - 35 (1998)) z użyciem zarówno nano-elektrospreju (nESI),
PL 209 696 B1 jak i jonizacji MALDI w kombinacji z procedurami wycięcia epitopu i procedur ekstrakcji epitopu opisanych poniżej. Patrz Macht i wsp., Biochemistry 35: 15,633-15,639 (1996); Suckau i wsp.. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 9848 - 9852 (1990); Przybylski i wsp., "Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry." w New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, str. 17 - 43 (1998).
W jednej procedurze, znanej jako wycięcie epitopu, połączono selektywne cięcie proteolityczne z nienaruszonym unieruchomionym kompleksem immunologicznym z mapowaniem peptydu z użyciem spektroskopii masowej na związanym peptydzie po jego uwolnieniu. Dokładniej, surowice odpornościowe od myszy TgCRND8 immunizowanych Abeta42, odpornościowe od myszy immunizowanych Abeta42, kontrolne surowice odpornościowe od myszy immunizowanych lAPP, mysie (monoklonalne) i królicze (poliklonalne) przeciwciała Abeta42 unieruchomiono w mikrokapilarach sefarozowych. Następnie, unieruchomione przeciwciała poddano ekspozycji wobec agregatów Abeta42 i pozwolono na związanie się z epitopem Abeta42. Przeprowadzono procedurę wycięcia epitopu z kompleksu immunologicznego z użyciem różnorodnych proteaz i egzopeptydaz, lub kombinacji enzymów. Patrz Tabela 2.
Alternatywnie stosowano procedurę ekstrakcji epitopu.
W celu ekstrakcji epitopu trawiono wstępnie Abeta42 różnymi proteazami i następnie nakładano na kolumny z przeciwciałami odpowiednie mieszaniny peptydów Abeta42 przetworzonych przez proteazy i pozwalano na związanie się z epitopem. Epitop identyfikowano z użyciem spektroskopii masowej po elucji związanego peptydu. Procedurę tę znano jako ekstrakcję epitopu.
Poszczególne procedury opisano szczegółowo poniżej:
Unieruchamianie przeciwciała
Do suchej, aktywowanej NHS, sprzężonej z kwasem 6-aminoheksanowym sefarozy (Sigma) dodano roztwór 100 μΐ buforu do sprzęgania (0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) przeprowadzono reakcję sprzęgania przez 60 min. w 20°C. Materiał sefarozowy przeniesiono następnie na kolumnę mikrokapilarną 100 μm, która pozwala na intensywne płukanie bez utraty materiału. Patrz Macht i wsp., Biochemistry 35: 15,633 - 15,639 (1996). Kolumnę przepłukano ewentualnie z użyciem buforu blokującego (etanolamina/NaCl) i buforu do płukania (NaAc/NaCl), jak opisano, a kolumnę ostatecznie przechowywano w PBS w pH 7,5, 4°C. Patrz Macht i wsp., Biochemistry 35: 15,633 - 15,639 (1996).
Wycięcie epitopu
Procedury wycięcia epitopu przeprowadzono najpierw przez nakładanie 2-5 μg Abeta42 lub innych antygenów Abeta na mikrokolumnę z przeciwciałem i inkubowanie przez 60 min. w 20°C z delikatnym wytrząsaniem. Następnie po płukaniach 5 x 4 ml PBS, przeprowadzano przez 2 godziny trawienie proteazą na kolumnie w 37°C przez inkubowanie 0,2 μg proteazy w 200 μΐ PBS. Proteazy obejmowały trypsynę, proteazę Lys-C; proteazę Asp-N; α-chymotrypsynę; i proteazę Glu-C. Niezwiązane i strawione peptydy lub nadsącz usunięto przez płukanie w 5 x 4 ml PBS. Następnie, peptyd epitopu związany z przeciwciałem poddano deasocjacji i eluowano przez dodanie 500 μl 0,1% (obj.) TFA (elucja epitopu). Po inkubacji przez 15 min. w 20°C frakcję elucji epitopu liofilizowano i rekonstytuowano w 10 μl 0,1% TFA do analizy metodą spektroskopii masowej. Procedury z dodatkowym trawieniem egzopeptydazą przeprowadzono przez inkubację z 0,1 μg aminopeptydazy M lub karboksypeptydazy Y przez 30 min., po czym przepłukanie 5 x 4 ml PBS.
Ekstrakcja epitopu
Procedurę ekstrakcji epitopu przeprowadzono w ten sam sposób jak elucję epitopu z takim wyjątkiem, że mieszaninę z trawienia proteolitycznego naniesiono na kolumnę z przeciwciałem i inkubowano przez 60 min. w 20°C. Następnie, niezwiązane peptydy (nadsącz) usunięto przez płukanie 5 x 4 ml PBS. Następnie, epitop związany z przeciwciałem poddano deasocjacji i eluowano 500 μl 0,1% (obj.) TFA (elucja epitopu). Po inkubacji przez 15 min. w 20°C frakcje elucji epitopu liofilizowano i rekonstytuowano w 10 μl 0,1% TFA do analizy metodą spektroskopii masowej.
Trawienie proteolityczne
Trawienia proteolityczne nie-związanych antygenów prowadzono z 5 - 50 μg peptydu rozpuszczonymi w 50 mM NH4HCO3 przez 2 godz. w 37°C przy proporcji substratu do proteazy wynoszącej 50:1. Mieszaniny reakcyjne liofilizowano do analizy metodą spektroskopii masowej lub preparowano do ekstrakcji epitopu. Stosowanymi proteazmi były trypsyna (Promega, Madison);
PL 209 696 B1
Lys-C, Asp-N, Glu-C (Roche-Boehringer, Mannheim); α-chymotrypsyna, aminopeptydaza M, karboksypeptydaza Y (Sigma).
Spektroskopia masowa
FTICR-MS przeprowadzono na spektrometrze Bruker (Bruker Daltonik, Bremen, FRG) Apex II FTICR wyposażonym w magnes nadprzewodnikowy 7T i analizator komórek IGR. Patrz Bauer i wsp., Anal. Biochem. 298: 25 - 31 (2001). Źródło MALDI-FTICR z pulsacyjnym źródłem zderzeń Apollonano-ESI a warunki instrumentalne i kalibracja masowa zostały opisane wcześniej. Patrz Fligge i wsp., Biochemistry 39: 8491 -8496 (2000). Dokładność określania mas wynosiła ~1 ppm (MALDI) a zazwyczaj, 0,5-1 ppm (ESI) przy rozdzielczości masowej wynoszącej ~200,000. Kwas 2,5-di-hydroksybenzoesowy (DHB) stosowano jako matrycę do przygotowywania próbek do MAL -DI-MS. Patrz Bauer i wsp., Anal. Biochem. 298: 25 - 31 (2001). ESI-MS zazwyczaj przeprowadzano z wodnymi roztworami 0,01% TFA. Patrz Fligge i wsp., Biochemistry 39: 8491 - 8496 (2000).
Wyniki spektroskopii masowej
W analizach spektroskopii masowej ESI i MALDI-PTICR zastosowano wycięcie epitopu i ekstrację epitopu z przeciwciałem unieruchomionym na traktowanej sefarozą mikrokapilarze. Patrz Macht i wsp. Biochemistry 35: 15633 - 39 (1996); Fligge i wsp., Biochemistry 39: 8491 - 8496 (2000); Patrz Bauer i wsp.. Anal. Biochem. 298: 25 - 31 (2001); Przybylski i wsp., "Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry." w New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, str. 17 - 43 (1998). Po pierwsze, mieszanina MALDI-MS peptydów tryptycznych niezwiązanego antygenu Abeta42 uwidacznia wszystkie oczekiwane proteolityczne peptydy z Abeta, włącznie z następującymi:
Peptyd_Masa (Da)
1. Abeta(1-16) 2. Abeta(6-16 3. Abeta(17-28) 4. Abeta(29-42) 5. Abeta(17-42)
1954.8892
1336.6030
1325.6735
1268.7804
2575.4164
Wycięcie epitopu za pomocą trawienia Lys-C i trypsyną, spowodowało elucję w postaci pojedynczego fragmentu peptydowego, który wytworzył pojedynczy rodzaj jonu Abeta(1-16) 1954.8806 przy użyciu detekcji MALDI-FTICR. W tym przypadku resztę R5 Abeta chroniono przed trawieniem przez Lys-C i trypsynę.
Fragment peptydowy Abeta(1-11), 1324.5395 Da eluowano po wycięciu epitopu proteazą Glu-C ze S. Aureus.
Spektra ESI i MALDI eluatu po ekstrakcji epitopu po cięciu α-chymotrypsyną i aminopeptydazą M wyłoniły fragmenty Abeta(1-10) 1195.4968 Da i 10 Abeta(4-10) 880.3827 Da.
Epitop rdzeniowy został określony z użyciem trawienia aminopeptydazą M fragmentu po trawieniu chymotrypsyną, związanego z przeciwciałem oraz kompleksu immunlogicznego Abeta(1-10). Dzięki temu podwójnemu trawieniu zidentyfikowano Abeta(4-10), FRHDSGY jako minimalny epitop o porównywalnym powinowactwie z Abeta42. C-końcowy aminokwas stanowi Y10, ponieważ dalsze niż Y10 trawienie C-końcowe skutkowało powstawaniem peptydów o drastycznie zmniejszonym powinowactwie w porównaniu z Abeta42.
Tabela 3 przedstawia fragmenty peptydowe, które uzyskano przez spektroskopię masową z procedur wycięcia i ekstrakcji epitopu z użyciem przeciwciał anty-Abeta i peptydów Abeta. W przypadku gdy peptyd Abeta42 (Tabela 3, rząd 1) trawiono wstępnie trypsyną, to peptyd uzyskiwany z miejsca wiązania przeciwciała odpowiadał sekwencjom pokazanym w Tabeli 3, rząd 1. Kombinacja proteaz trypsyny i Lys-C zidentyfikowała taki sam peptyd o 16 resztach (Tabela 3, rząd 2). W przypadku gdy proteazą była proteaza Glu-C ze S. Aureus i używana była do wycięcia epitopu z miejsca wiązania przeciwciała, eluowany był peptyd o 11 resztach, jak pokazano w rzędzie 3. Przy trawieniu tylko a-chymotrypsyną zaobserwowano peptyd o dziesięciu resztach (Tabela 3, rząd 4). Jak pokazano w Tabeli 3, rząd 5, w przypadku gdy przeprowadzono trawienia proteazą z użyciem dwóch enzymów a-chymotrypsyny i aminopeptydazy M zaobserwowano siedmioaminokwasowy epitop rdzeniowy.
PL 209 696 B1
T a b e l a 3. Peptydy zidentyfikowane z użyciem spektroskopii masowej
Nr rzędu Liczba reszt 1 5 10 15 Zastosowana proteaza
1 D A E F R H D S G Y E V H H Q K SEQ ID NO: 22 trypsyna
2 D A E F R H D S G Y E V H H Q K SEQ ID NO: 22 trypsyna i proteaza Lys-C
3 D A E F R H D S G Y E SEQ ID NO: 23 Proteaza Glu-C ze S. Aureus
4 D A E F R H D S G Y SEQ ID NO: 24 a-chymotrypsyna
5 F R H D S G Y SEQ ID NO: 1 α-chymotrypsyna i aminopeptydaza M
Podsumowanie
Analiza MALDI i ESI-MS pozwoliła na zidentyfikowanie liniowego epitopu obejmującego N-końcową sekwencję, Abeta(1-10) jako jedyny specyficzny produkt po wycięciu epitopu. Patrz Tabele 3 i 4. Spektroskopia masowa trawienia trypsyną wolnego antygenu Abeta42 skutkowała powstaniem wszystkich oczekiwanych peptydów, (1-16), (6-16), (17-28), (29-42). Patrz Tabele 3 i 4.
Wycięcie epitopu trypsyną i proteazą Lys-C dostarczyło jeden peptyd (1-16). Proteaza Glu-C i α-chymotrypsyną generowały jedynie odpowiednio fragmenty (1 -11) i (1-10). Patrz Tabele 3 i 4. W przeciwieństwie do tego, odpowiednio reszty R5, E3, F4 chronione były przed trawieniem tymi proteazami. W celu zdefiniowania epitopu rdzeniowego przeprowadzono dalsze trawienie związanych z przeciwciałem fragmentów po cięciu endoproteazą, z użyciem egzopeptydaz. Trawienie aminopeptydazą M fragmentów po trawieniu chymotrypsyną zidentyfikowało jako minimalny epitop, o porównywalnym powinowactwie do powinowactwa Abeta42, Abeta(4-10); FRHDSGY, natomiast dalsze trawienie C-końcowe od Y10 (karboksypeptydaza A) skutkowało drastycznie zmniejszonym powinowactwem. Różnice w powinowactwach uzyskane w doświadczeniach dotyczących wycięcia epitopu z użyciem spektroskopii masowej były całkowicie zgodne z powinowactwami określonymi z użyciem ELISA dla syntetycznych peptydów epitopowych biotynylowanych na N-końcu przez alkiloamidową grupę rozdzielającą. Patrz Gitlin i wsp., Biochem. J. 242: 923 - 926 (1987); Craig i wsp., Anal. Chem. 68: 697 - 701 (1996). Epitop zdefiniowano jednoznacznie, dzięki wysokiej dokładności określania mas (0,5 - 2 ppm) monoizotopowych jonów cząsteczkowych. Ponadto, wyniki te potwierdzono poprzez specyficzną wobec sekwencji fragmentację wybranych jonów cząsteczkowych w spektrach FTICR przez multifotonowo-IR dysocjację laserową oraz przez kontrolne doświadczenia z mutantami sekwencyjnymi i homologicznymi peptydami Abeta42 (dane nie pokazane). Patrz Fligge i wsp., Biochemistry 39: 8491 - 8496 (2000).
Zatem, szczurzy Abeta42, zawierający podwójną mutację R5G i Y10F nie skutkował powstaniem żadnego produktu elucji po wycięciu epitopu. W przeciwieństwie do tego, ludzkie Abeta(1-40) i Abeta(1-30) dostarczyły takiego samego epitopu (4-10) jak Abeta42. Kontrolne przeciwciało od myszy immunizowanych lAPP nie skutkowało powstaniem żadnego wykrywalnego epitopu. Patrz Tabele 3 i 4.
PL 209 696 B1
T a b e l a 4 Podsumowanie danych ze spektroskopii masowej po wycięciu/ekstrakcji epitopu dla surowic po immunizacji Αβ42 i po immunizacji IAPP
Ό
-i—<
Q_
Φ
Q_
Φ g
N
PL 209 696 B1
P r z y k ł a d 6
Charakteryzacja strukturalna peptydów Abeta
W przykładzie tym twórcy porównywali powinowactwa zidentyfikowanych syntetycznych peptydów epitopowych z powinowactwem Abeta42 dla unieruchomionych przeciwciał oraz charakteryzowali strukturę drugorzędową syntetycznych peptydów epitopowych w roztworze.
Epitop zidentyfikowany przez spektroskopię masową był dalej charakteryzowany z użyciem syntetycznych peptydów, analizy struktury drugorzędowej i charakterystyki immunoanalitycznej odpowiadających mu autentycznych peptydów, biotyno-Gly-Gly- Abeta(1-10) i biotyno-Abeta(4-10). Po pierwsze oceniano powinowactwo różnych peptydów wobec przeciwciała anty-Abeta z użyciem analizy ELISA i hybrydyzacji typu dot-blot peptydów epitopowych (dane nie pokazane). Wyniki pokazały, że wszystkie peptydy przedstawione w Tabeli 3 wykazywały porównywalne powinowactwo wobec Abeta42.
W celu oceny potencjalnego wpływu na aktywny epitop przeprowadzono porównanie struktury drugorzędowej N-końcowych peptydów z wcześniej przedstawianymi strukturami Abeta40 i Abeta42. Spektra CD i spektra 2D NMR-NOESY (dane nie pokazane) N-końcowych, polarnych peptydów Abeta(1-10) i Abeta (1-16) nie przedstawiają żadnego dowodu na zdefiniowaną strukturę roztworu dla fragmentów Abeta. Takie dane sugerują jednak pewną elastyczność epitopu względem rozpoznania przeciwciała. Jest to zgodne z przewidywaniem struktury drugorzędowej dla sekwencji Abeta42 wykazującej lukę w skłonności do tworzenia α helisy wokół regionu epitopu Abeta(4-10). W przeciwieństwie do tego zaobserwowano skłonność do przejścia konformacyjnego α helisy i helisa-skręt/beta-kartka w przypadku sekwencji obejmujących region przezbłonowy Abeta(18-42).Patrz Coles i wsp., Biochemistry 37: 11064 - 11077 (1998); Kohno i wsp., Biochemistry 35: 16094 - 16104 (1996).
P r z y k ł a d 7
Wpływ surowic na toksyczność indukowaną Abeta
W przykładzie tym twórcy oceniali zdolność surowic po immunizacji Abeta do hamowania cytotoksyczności indukowanej Abeta42.
Schemat ogólny
Dla zbadania czy zapobieganie utracie pamięci u myszy TgCRND8 po immunizacji Abeta może odzwierciedlać podobny wpływ na cytotoksyczność Abeta, przeprowadzono standardowe oznaczenia toksyczności Abeta42 z użyciem komórek PC-12. Patrz McLaurin i wsp., J. Biol. Chem. 275: 18495 502 (2000); Pallitto i wsp., Biochemistry 38: 3570 - 78 (1999). Najpierw, komórki PC12 inkubowano przez 24 godziny z Abeta42, w obecności lub przy braku surowic. Następnie mierzono toksyczność komórkową z użyciem zarówno testu Alamar Blue (Ahmed i wsp., J. Immnunol. Methods 170: 211 -24 (1994)), który stanowi wskazówkę co do aktywności metabolicznej, jak i oznaczenia żywotności/śmierci komórek (ang. Live/Dead assay) (Pike i wsp., J. Biol. Chem. 270: 23895 - 98 (1995)), które wskazuje zarówno na aktywność wewnątrzkomórkowej esterazy, jak i ciągłości błony plazmatycznej.
Oznaczenie toksyczności Abeta
Komórki PC-12 posiano na 96-studzienkowe płytki w ilości 500 komórek na studzienkę i zawieszono w 30 ng/ml NGF (Alamone Labs, Izrael) rozcieńczonego w N2/DMEM (Gibco/BRL, Rockville, MD). Komórkom pozwolono na różnicowanie przez 5-7 dni aż do osiągnięcia całkowitej liczby komórek wynoszącej 10,000 - 15,000 na studzienkę. Przed dodaniem do hodowli Abeta utrzymywano w roztworze (25 mikromolarnym) przez 3 dni w RT w celu indukcji powstawania włókienek. Ten preparat Abeta zawiera wielorakie ugrupowania oligomerów włączając ADDL i protofibryle (gatunek cząsteczek Abeta zidentyfikowany dotąd jako neurotoksyczny) jak zostało to zidentyfikowane z użyciem mikroskopii elektronowej (dane nie pokazane). Patrz Lambert i wsp., J. Neurochem. 79: 595 - 605 (2001); Walsh i wsp., J. Biol. Chem., 274: 25945 - 52 (1999); Hartley i wsp., J. Neuroscience 19: 8876 - 8884 (1999). Ponadto, analizy metodą hybrydyzacji typu western blot wykazały, że surowice po immunizacji Abeta42 rozpoznawały monomery Abeta42, tetramery, heksamery i duże oligomery większe niż 98 kDa (dane nie pokazane). Po 3 dniach wstępnej inkubacji do hodowli komórkowych dodano Abeta w końcowym stężeniu wynoszącym 0,1 pg/pl i inkubowano przez 24 godziny w 37°C. Następnie oznaczano toksyczność za pomocą fluorescencyjnego oznaczenia żywotności/śmierci komórki (ang. Live/Dead fluorescent assay (Molecular Probes, Eugene, OR)) i testu Alamar Blue (Biosource Inc, Camarillo, CA).
Wyniki
Surowice od nie-immunizowanych myszy i myszy immunizowanych lAPP nie wywarły wpływu na toksyczność Abeta. W przeciwieństwie do tego, surowice izolowane od myszy immunizowanych Abeta42 zapobiegały cytotoksyczności Abeta42 w sposób zależny od dawki, ale prezentowały znaczne
PL 209 696 B1 zróżnicowanie co do stopnia tego wpływu. W tym oznaczeniu otrzymano n=18/22, p<0,01 i n=4/22, p<0,001 w porównaniu z toksycznością indukowaną Abeta42. Korelację między przeżyciem komórek a stopniem deagregacji włókienek przedstawiono na wykresie dla poszczególnych surowic i pokazał on bezpośrednią korelację skutecznością surowic do hamowania toksyczności a deagregowaniem włókienek. Ponadto, przeciwciała które były najbardziej skuteczne w hamowaniu tworzenia włókienek/deagregacji były również najbardziej skuteczne w zmniejszaniu toksyczności (Dzień 3 p<0,001 i Dzień 7 p<0,0001 w porównaniu z surowicami nieaktywnymi).
Stechiometria przeciwciała do Abeta niezbędna do zapobiegania cytotoksyczności mogłaby dostarczyć wglądu w mechanizm działania. W celu określenia stechiometrii przeciwciała do Abeta niezbędnej do wzbudzenia hamowania cytotoksyczności określono EC50 dla 10 reaktywnych surowic. Wartości EC50 znajdowały się w zakresie 1:100-1:300, przy czym średnia ± SD wynosiła 234±39, przy czym EC50 definiuje się jako ilość surowic, która zachowała 50% cytotoksyczności indukowanej Abeta. W rezultacie stwierdzono, że można było wykryć ochronny wpływ przy niskich proporcjach przeciwciała do Abeta, 50:1, sugerując, że przeciwciała były związane raczej z gatunkiem cząsteczek Abeta o niskiej złożoności, takich jak oligomery Abeta, protofibryle lub fragmenty prekursora białka, niż monomerycznym Abeta lub agregatami Abeta. Ponadto aktywne surowice wywoływały znaczący spadek cytotoksyczności Abeta we wszystkich testowanych dawkach; sugerując, że śmierć komórkowa indukowana była przez procesy specyficznie blokowane przez te surowice. Analizy statystyczne przeprowadzono z użyciem jednostronnego testu ANOVA z PLSD Fischer'a * p<0,01 i t p<0,001.
P r z y k ł a d 8
Składniki surowicy wpływające na wpływ ochronny
W tym przykładzie twórcy pokazali jak określić, które składniki surowicy były odpowiedzialne za zmniejszoną cytotoksyczność Abeta. Twórcy stwierdzili, że składnik aktywny znajdował się w oczyszczonej frakcji IgG z surowic i żaden inny składnik nie mógł hamować śmierci komórkowej zależnej od Abeta.
W celu weryfikacji czy wpływy immunizacji były raczej spowodowane przeciwciałami indukowanymi Abeta, niż innymi wpływami, np. wtórnymi zmianami ekspresji białek surowicy i potwierdzenia, że skuteczne były jedynie przeciwciała selektywnie ukierunkowane na epitop Abeta(4-10) przeprowadzono doświadczenia cytotoksyczności z użyciem oczyszczonych frakcji IgG z surowic po immunizacji Abeta42. Ponadto, włączono do badań komercyjnie dostępne przeciwciała monoklonalne, 4G8, 6E10 i Bam10 o specyficzności wobec szczególnych epitopów Abeta.
Wyniki były stanowcze. Immunoglobulina G oczyszczona z surowic po immunizacji Abeta42 wykazywała się takim samym hamowaniem toksyczności jak nie-przetworzone surowice, sugerując, że inne składniki surowicy nie przyczyniają się do odpowiedzi ochronnej. Ponadto te frakcje IgG hamowały tworzenie włókienek Abeta i indukowały deagregację włókienek Abeta w takim samym stopniu jak pełne surowice. Przeciwciała 4G8 i 6E10, które rozpoznają odpowiednio sekwencje Abeta 17-24 i 11-17 nie hamowały tworzenia włókienek, ale zmniejszały całkowitą liczbę włókienek. Ten ostatni wpływ może wynikać z faktu, że przeciwciała te będą wiązały się z małą częścią wolnego peptydu Abeta w roztworze, uniemożliwiając mu w ten sposób tworzenie włókienek. W przeciwieństwie do tego, Bam10, które rozpoznaje sekwencję w Abeta(1-10), hamuje tworzenie włókienek podobnie do hamowania pokazanego dla surowic po immunizacji Abeta42.
Wyniki te ponadto wykazują zarówno to, że tylko przeciwciała które rozpoznają N-końcową sekwencję Abeta są skutecznymi inhibitorami genezy włókienek jak i to, że aktywnym składnikiem w surowicach po immunizacji Abeta42 jest specyficzna IgG.
P r z y k ł a d y 9-27
Model przeciwciała
Peptydy pokazane w Tabeli 5 i Przykładach 9-27 zaprojektowano według wzoru I pokazanego poniżej:
I. (A)n - - (Th)m - - (B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym występuje pojedyncza kopia Abeta(4-10) a n oznacza 0, m oznacza 1, o oznacza 2, B oznacza glicynę, C oznacza glicynę, p oznacza 1 a epitop pomocniczej komórki T oznacza dowolną z sekwencji SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 lub 21. Te antygeny zawierające sprzężony epitop komórek B i T odpowiadają sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 i 43.
PL 209 696 B1
T a b e l a 5
Przykład SEQ ID NO: Sekwencja peptydu antygenowego
9 25 FFLLTRILTIPQSLD-GGFRHDSGYG
10 26 KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY-GGFRHDSGYG
11 27 KKQYIKANSKFIGITE-GGFRHDSGYG
12 28 KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL-GGFRHDSGYG
13 29 YMSGLAVRVHVSKEE-GGFRHDSGYG
14 30 YD PNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK-GGFRHDSGYG
15 31 GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL-GGFRHDSGYG
16 32 LSEIKGVIVHRLEGV-GGFRHDSGYG
17 33 GILESRGIKARITHVDTESY-GGFRHDSGYG
18 34 WVRDIIDDFTNESSQKT-GGFRHDSGYG
19 35 DVSTIVPYIGPALNHV-GGFRHDSGYG
20 36 ALNIWDRFDYFCTLGATTGGYLKGNS-GGFRHDSGYG
21 37 DSETADNLEKTYAALSILPGHGC-GGFRHDSGYG
22 38 EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESC-GGFRHDSGYG
23 39 DHEKKHAKMEKASSVFNWNS-GGFRHDSGYG
24 40 KWFKTNAPNGVDEKHRH-GGFRHDSGYG
25 41 GLQGKHADAVKAKG-GGFRHDSGYG
26 42 GLAAGLVGMAADAMVEDVN-GGFRHDSGYG
27 43 STETGNQHHYQTRVVSNANK-GGFRHDSGYG
28 44 STETGNQHHYQTRVVSNANK-GFRHDSGYG
29 45 STETGNQHHYQTRVVSNANK-FRHDSGYG
30 46 STETGNQHHYQTRVVSNANK-FRHDSGY
31 47 GGFRHDSGYGG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
32 48 GGFRHDSGYG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
33 49 GGFRHDSGY-STETGNQHHYQTRVVSNANK
34 50 FRHDSGYGG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
35 51 FRHDSGYG-STETGNQHHYQTRWSNANK
P r z y k ł a d 28
Model przeciwciała
Peptyd pokazany w Przykładzie 28 (Tabela 5), odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 44 stanowi przykład, w którym n oznacza 0, m oznacza 1, o oznacza 1, B oznacza glicynę, C oznacza glicynę, p oznacza 1 a epitop pomocniczej komórki T stanowi sekwencja SEQ ID NO: 21. Antygen zawierający sprzężony epitop komórek B i T odpowiada peptydowi pokazanemu na sekwencji SEQ ID NO: 44.
P r z y k ł a d 29
Model antygenu
Peptyd pokazany w Przykładzie 29, (Tabela 5), odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 45 stanowi przykład, w którym n oznacza 0, m oznacza 1, o oznacza 0 a epitop komórki T jest połączony z epitopem komórki B bezpośrednio wiązaniem peptydowym, C oznacza glicynę, p oznacza 1 a epitop
PL 209 696 B1 pomocniczej komórki T stanowi sekwencja SEQ ID NO: 21. Antygen zawierający sprzężony epitop komórki B i T odpowiada peptydowi pokazanemu na sekwencji SEQ ID NO: 45.
P r z y k ł a d 30
Model antygenu
Peptyd pokazany w Przykładzie 30, (Tabela 5), odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 46 stanowi przykład, w którym n oznacza 0, m oznacza 1, o oznacza 0 a epitop komórki T jest połączony bezpośrednio z epitopem komórki B wiązaniem peptydowym, C oznacza glicynę, p oznacza 1, a epitop pomocniczej komórki T stanowi sekwencja SEQ ID NO: 21. Antygen zawierający sprzężony epitop komórek B i T odpowiada peptydowi pokazanemu na sekwencji SEQ ID NO: 46.
P r z y k ł a d y 31 - 33
Model antygenu
Peptydy pokazane w Przykładach 31 - 33, (Tabela 5), zaprojektowano zgodnie z pokazanym poniżej wzorem II:
II. (A)n - - Abeta(4-10) - - (B)0 - - (Th)m - - (C)p w którym występuje pojedyncza kopia Abeta(4-10) a n oznacza 2, m oznacza 1, o oznacza 2, A i B oznaczają glicynę, p oznacza 0, a epitop pomocniczej komórki T stanowi sekwencja SEQ ID NO: 21. Te antygeny zawierające sprzężony epitop Komórek B i T odpowiadają sekwencjom SEQ ID NO: 47, i 49.
P r z y k ł a d 34 i 35
Model antygenu
Peptyd pokazany w Przykładzie 34, (Tabela 5), projektowano zgodnie ze wzorem II pokazanym poniżej:
II. (A)n - - Abeta(4-10) - - (B)0 - - (Th)m - - (C)p w którym występuje pojedyncza kopia Abeta(4-10) a n oznacza 0, m oznacza 1, o oznacza 2 w Przykładzie 34, a w Przykładzie 35 o oznacza 1; B oznacza glicynę, p oznacza 0, a epitop pomocniczej komórki T stanowi sekwencja SEQ ID NO: 21. Te antygeny zawierające sprzężony epitop komórek B i T odpowiadają sekwencjom SEQ ID NO: 50 i 51.
P r z y k ł a d 36
Synteza zaprojektowanych peptydów
Przeprowadzono syntezę w fazie stałej zaprojektowanych peptydów odpowiadających sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 oraz peptydu kontrolnego, wysepkowego polipeptydu amyloidu (lAPP) (SEQ ID NO: 52) w 100 pmolowej skali stosując manualną syntezę w fazie stałej i syntetyzer Symphony Peptide Synthesizer z użyciem zabezpieczonej Fmoc żywicy Rink Amide MBHA, aminokwasów zabezpieczonych Fmoc, heksafluorofosforanu O-benzotriazolo-1-ilo-N,N,N',N-tetrametylo-uronowego (HBTU) w roztworze N,N-dimetyloformamidu (DMF) i aktywacji N-metylomorfoliną (NMM), oraz odbezpieczania piperydyna Fmoc (Etap 1). W przypadkach gdy jest to wskazane, przeprowadza się selektywne odbezpieczanie grupy Lys(Aloc) manualnie i uzyskuje przez traktowanie żywicy roztworem 3 równoważników Pd(PPh3)4 rozpuszczonym w 5 mL CHCI3: NMM:HOAc (18:1:0,5) przez 2 godz. (Etap 2). Żywicę następnie płucze się CHCI3 (6 x 5 ml), 20% HOAc w dichlorometanie (DCM) (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) i DMF (6 x 5 ml). W pewnych przypadkach syntezę przeprowadza się następnie automatycznie w celu dodania jednej grupy AEEA (kwas aminoetoksyetoksyoctowy), dodanie kwasu octowego lub dodanie kwasu 3-maleimidopropionowego (MPA) (Etap 3). Cięcie żywicy i izolację produktu przeprowadza się z użyciem 85% TFA/5% TIS/5% tioanizolu i 5% fenolu, po czym przeprowadza się strącanie przy pomocy schłodzonego suchym lodem Et2O (Etap 4). Produkty oczyszcza się z użyciem preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, stosując preparatywny binarny układ HPLC typu Varian (Rainin): elucja gradientem 30 - 55% B (0,045% TEA w H.sub. 2 0 (A) i 0,045 % TPA w CH3CN (B)) ponad 180 min. przy 9,5 ml/min. z użyciem kolumny Phenomenex Luna 10 p, fenyl-heksyl, 21 mm x 25 cm i detektora UV (Varian Dynamax UVD II) przy 214 i 254 nm. Weryfikację czystości i masy określa się jako 95% z użyciem spektroskopii masowej RP-HPLC z użyciem spektrometru Hewlett Packard LCMS-1100 wyposażonego w detektor z zestawem diod oraz stosując jonizację elektrospreju.
P r z y k ł a d 37
Immunizacja myszy CRND8 antygenami peptydowymi opracowanymi zgodnie ze wzorami I i II
Myszy TgCRND8 opisane w Przykładzie 2 odstawiono od karmiących matek i genotypowano pod kątem występowania transgenu beta-APP i trzymano w grupach tej samej płci po 2-4 myszy w standardowych klatkach dla myszy. Myszom podaje się karmę granulowaną, karmę proszkowaną
PL 209 696 B1 i wodę bez ograniczeń. Wszystkie myszy przetrzymuje się przez jeden tydzień przed immunizacją, waży dzień przed i dwa dni po każdej immunizacji. Wszystkie grupy doświadczalne są dopasowane ze względu na wiek i płeć.
Protokół immunizacji i izolacji surowic
Do immunizacji myszy CRND8 stosuje się peptydy syntetyczne odpowiadające sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51 i peptyd kontrolny, wysepkowy polipeptyd amyloidu (lAPP) (SEQ ID NO: 52). Protokół immunizacji i schemat są takie, jak już opisano wcześniej w publikacji autorstwa Schenk i wsp. Nature 400: 173 - 177 (1999). Każdy z peptydów przygotowuje się na nowo z liofilizowanego proszku dla każdej serii wstrzyknięć. W celu immunizacji, 2 mg każdego z peptydów umieszcza się w oddzielnym pojemniku zawierającym 0,9 ml wody dejonizowanej i mieszaniny wytrząsa się intensywnie w celu zmieszania roztworów. Następnie do każdego roztworu peptydu dodaje się 100 ąl 10 x fizjologicznego roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) (przy czym 1 x PBS oznacza 0,15 M NaCl 0,1 M fosforan sodu; pH 7,5). Następnie, każdy roztwór ponownie wytrząsa się intensywnie i pozwala na osadzenie przez noc w 37°C. Do pierwszej immunizacji peptydy emulsyfikuje się w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda a z niekompletnym adiuwantem Freunda do kolejnych wstrzyknięć przypominających. Pierwsze wstrzyknięcie przypominające następuje po dwóch tygodniach od wstępnej immunizacji a następnie w odstępach miesięcznych. Każde zwierzę immunizuje się około 100 ąg antygenu na wstrzyknięcie. Każda z grup immunizacyjnych obejmuje od 6 do 10 myszy. Następnie, określa się miana przeciwciał w próbkach surowic (200 ąl krwi) zebranych przez nakłucie żyły kończyny tylnej w wieku 13 tygodni oraz punkcję serca po przerwaniu procedury w wieku 25 tygodni. Przed zastosowaniem w tych badaniach deaktywuje się dopełniacz poprzez inkubację w 56 °C przez 30 minut. Izoluje się frakcje Ig na 5 ml kolumnie z białkiem G. Próbki nakłada się, przepłukuje PBS, eluuje 0,1 M cytrynianem sodu i buforuje 1 M Tris. Przed zastosowaniem wszystkie frakcje Ig jałowi się przez filtrowanie.
Wyniki immunizacji.
Surowice izoluje się od myszy immunizowanych syntetycznymi peptydami odpowiadającymi sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 i kontrolnym peptydem, wysepkowym polipeptydem amyloidu (lAPP) (SEQ ID NO: 52) oraz myszy nie-immunizowanych TgCRND8 oraz nie-transgenicznych myszy z tego samego miotu.
U większości myszy powstają wysokie miana przeciwko Abeta42, immunogenowi lub lAPP. Co interesujące, nie wykryto znaczących różnic w mianach anty-Abeta42 u myszy transgenicznych TgCRND8 i myszy nie-transgenicznych z tego samego miotu. Surowice od immunizowanych myszy stosuje się do pozytywnego barwienia płytek dojrzałego Abeta w skrawkach histologicznych mózgu nie-immunizowanych myszy TgCRND8 w wieku 20 tygodni. W przeciwieństwie do tego surowice od myszy immunizowanych kontrolnym peptydem lAPP i myszy nieimmunizowanych nie są w stanie wybarwić płytek dojrzałego Abeta w skrawkach histologicznych mózgu nieimmunizowanych myszy TgCRND8 w wieku 20 tygodni. W związku z czym wyniki pokazują, że można indukować autoimmunizację związaną z przeciwciałami, które rozpoznają i wiążą się z neuropatogennymi płytkami zawierającymi Abeta.
P r z y k ł a d 38
Hamowanie tworzenia włókienek przez mysią surowicę odpornościową
Jak dyskutowano w Przykładzie 3, peptydy Abeta będą spontanicznie grupowały się we włókienka w czasie 14 dniowego okresu inkubacji oraz że włókienka mają charakterystyczną średnicę wynoszącą 50 - 70 A, którą można monitorować z użyciem mikroskopii elektronowej jak opisano poniżej.
Mikroskopia elektronowa
Abeta42 stosuje się bezpośrednio po rozpuszczeniu w wodzie w stężeniu wyjściowym wynoszącym 10 mg/ml lub po zgrupowaniu we włókienka dojrzałego amyloidu. Abeta42 inkubuje się w obecności i przy braku surowic od myszy immunizowanych antygenami peptydowymi odpowiadającymi sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46,
47, 48, 49, 50, 51 i peptydem kontrolnym, wysepkowym polipeptydem amyloidu (lAPP). Przy czym końcowe stężenie peptydów wynosiło 100 ąg/ml. Surowice w seryjnych rozcieńczeniach dodaje się do Abeta42 i inkubuje w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do dwóch tygodni. W przypadkach mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywnym pokryte węglem siatki pioloformu zatapia się
PL 209 696 B1 w roztworach wodnych peptydów. Po hybrydyzacji i wysuszeniu na powietrzu siatek próbki wybarwia się 1% (wag./obj.) kwasu fosfowolframowego. Ugrupowania peptydowe obserwuje się w mikroskopie elektronowym Hitachi 7000, obsługiwanym przy 75V i powiększeniu 60,000 X.
Wyniki mikroskopii elektronowej
W celu oceny wpływu immunizacji surowicami od immunizowanych myszy na grupowanie się Abeta we włókienka, inkubuje się surowice jak opisano powyżej w obecności i przy braku Abeta42 w 37°C przez okres do 14 dni. Porcje z każdej mieszaniny reakcyjnej bada się w dniach 1, 3, 7, 10 i 14 pod kątem występowania włókienek Abeta42 poprzez mikroskopię elektronową z bawieniem negatywnym.
Przy braku surowic lub w obecności surowic od myszy nie-immunizowanych, Abeta42 tworzył długie włókienka (~7500 A) o charakterystycznej średnicy 50 - 70 A. W obecności surowic od zwierząt immunizowanych lAPP tworzy się mniej włókienek Abeta42, ale włókienka, które jednak powstały miały charakterystyczną średnicę 50 - 70 A. W przeciwieństwie do tego większość mysich surowic od myszy immunizowanych antygenami peptydowymi odpowiadającymi sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50 i 51, które zawierają epitop B-komórkowy Abeta(4-10) w dużym stopniu blokowały tworzenie włókienek, chociaż część surowic wykazywała niewielki lub żaden wpływ.
Ponadto, nie wykrywa się żadnych różnic w strukturze włókienek w przypadku gdy inkubuje się włókienka w obecności surowic myszy nie-immunizowanych. Surowice od myszy, które immunizuje się lAPP zmniejszają stopień tworzenia włókienek, ale włókienka które jednak są tworzone są podobne do włókienek tworzonych przez sam Abeta42. Ostatecznie, surowice od myszy, które immunizuje się antygenami peptydowymi odpowiadającymi sekwencjom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50 i 51 hamuje tworzenie nowych włókienek.
Informacja dotycząca sekwencji
Liczba reszt 1 5 0 15
D A E F R H D S G Y Wycięcie epitopu. Maldi/ESI Λβ42 Produkty proteazy prezentowane AB
D A E F R H D S G Y E V H H Q K Fragmenty epitopu po wycięciu trypsyną i proteazą Lys-C
D A E F R H D S G Y E Proteaza Glu-C ze S. Aureus
D A E F R H D S G Y a-chymotrypsyna
F R H D S G Y α-chymotrypsyna (Y10) i aminopeptydaza M (D1, A2, E3);
A beta 42
10 15 20
30 (APP-672) D AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDV GSNKGA
35 40
IIGLMVGGVVI A-(APP-713)
PL 209 696 B1
LISTA SEKWENCJI
<110> The Governing Conncil of the University of Toronto Peptyd. kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji
<120> tmmunogennej ora/ sposób określania czy' związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia wlókienek amyloidu
<130> 9267-96/PAR
<140> PCT CA03/00502
<141> 2003-04-07
<150> US 60/373,914
<151> 2002-04-19
<160> 52
<170> Patentln wersja 3.1
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
5 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Asp Ala Glu 1 Phe Arg 5 His Asp Ser Gly Tyr 10 Glu Val His His Gin 15 Lys
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
40 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu B <400> 3
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Len Thr Ile Pro Gin Ser Leu Asp 15 10 15
PL 209 696 B1
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> Bordetel.
<400> 4
Lys Lys Leu Arg
1
Val Arg Val His
20
<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 5
Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 15 10 15
Leu <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6
Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 15 10 15
Val Ser Ala Ser His Leu 20 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 7
Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu 15 10 15 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Clostridium tetani
PL 209 696 B1 <400> 8
Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu 15 10 15
Gin Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys 20 25 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 9
Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 15 10 15
Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Wirus odry <400> 10
Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 15 10 15
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> Wirus odry
<400> 11
Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp
1 5 10 15
Thr Glu Ser Tyr
<210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 12
Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gin Lys 15 10 15
PL 209 696 B1
Thr <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 13
Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val 15 10 15 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 14
Ala 1 Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 15
5 10
Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser
20 25
<210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 15
Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 15 10 15
Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 16
Glu 1 Glu Ile Val Ala 5 Gin Ser Ile Ala Leu 10 Ser Ser Leu Met Val 15 Ala
Gin Ala Ile Pro 20 Leu Val Gly Glu Leu 25 Val Asp Ile Gly Phe 30 Ala Ala
Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys
PL 209 696 B1
<210> <211> <212> <213> 17 21 PRT Plasntodium falciparum
<400 17
Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe
1 5 10 15
Asn Val Val Asn Ser
20
<210 18 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma rn.an.soni <400> 18
Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 15 10 15
His <210 19 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19
Gly Leu Gin Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly 15 10 <210 20 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia coli <400 20
Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu 15 10 15
Asp Val Asn
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
PL 209 696 B1 <213> Escherichia coli <400> 21
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser 15 10 15
Asn Ala Asn Lys 20 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 15 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT
<213> Komo sapiens
<40Q> 24
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> Sekwencja chimery czna
<223>
<400> 25
Phe Phe ! Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gin Ser Leu Asp Gly
1 5 10 15
PL 209 696 B1
Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25 <210> 26 <211> 40 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3> Sekwencj a chimeryczna <400> 26
Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala
1 5 10 15
Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gin Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly
20 25 30
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
35 40
<210> 27 <211> 26 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3 > Sekwencj a chimeryczna <400> 27
Lys 1 Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 15
5 10
Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20 25
<210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna ' <220>
<22 3> Sekwencja chimeryczna <400> 23
Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 15 10 15
PL 209 696 B1
Val Ser Ala Ser His Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25 30 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 29
Tyr 1 Met Ser Gly Leu Ala Val Arg 5 Val His Val 10 Ser Lys Glu Glu Gly 15
Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20 25
<210> 30 <211> 37 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 30
Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu
1 5 10 15
Gin Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Gly Gly Phe Arg His
20 25 30
Asp Ser Gly Tyr Gly
<210> 31 <211> 34 <212> PRT <213 > S ekwencj a sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 31
Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 15 10 15
PL 209 696 B1
Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly
25 30
Tyr Gly <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<2 2 3> Sekwencj a chimeryczna <400> 32
Leu 1 Ser Glu Ile Lys 5 Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly
10 15
Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20 25
<210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3 > Sekwencja chimery czna <400> 33
Gly 1 Ile Leu Glu Ser Arg 5 Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp
10 15
Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja chimery czna
<400> 34
Trp Val . Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gin Lys
1 5 10 15
PL 209 696 B1
Thr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25 <210> 35 <211> 26 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 35
Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val 15 10 15
Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 36 <211> 36 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 36
Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp
20 25 30
Ser Gly Tyr Gly 35 <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3 > Sekwencja chimery czna <400> 37
Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 15 10 15
PL 209 696 B1
Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
25 30
Gly <210 38 <211> 49 <212> PRT < 213 > Sekwencja sztuczna <220 <223> Sekwencja chimeryczna <400 38
Glu Glu Ile Val Ala Gin Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala
1 5 10 15
Gin Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala
20 25 30
Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
35 40 45
Gly <210> 39 <211> 31 <212> PRT < 213 > Sekwencj a sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 39
Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe
1 5 10 15
Asn val Val Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp S£r Gly Tyr Gly
20 25 30
<210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Sekwencja chimeryczna
PL 209 696 B1
<400> 40
Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly
1 5 10
His Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
20 25
<210> 41
<211> 24
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja chimeryczna
<400> 41
Gly Leu Gin Gly Lys His Ala Asp Ala Val
1 5 10
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20
<210> 42 <211> 29 <212> PRT < 213 > Sekwencj a s ztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 42
Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu
1 5 10 15
Asp Val Asn Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
20 25
<210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<22 3> Sekwencja chimeryczna <400> 43
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser 15 10 15
PL 209 696 B1
Asn Ala Asn Lys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25 30 <210> 44 <211> 29 <212> PRT < 213 > Sekwencj a sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimeryczna <400> 44
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asn Lys Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<2 2 3> Sekwencja chimeryczna <400> 45
Ser 1 Thr Glu Thr Gly Asn 5 Gin His His Tyr 10 Gin Thr Arg Val Val Ser 15
Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly
25
<210> 46
<211> 27
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja chimeryczna
<400> 46
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser
10 15
Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 20 25
PL 209 696 B1 <210> 47 <211> 31 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3 > Sekwencja chimeryczna <400> 47
Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly 15
1 5 10
Asn Gin l His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
20 25 30
<210> 48
<211> 30
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja chimeryczna
<400> 48
Gly Gly ' Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn
1 5 10 15
Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 29
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja chimeryczna
<400> 49
Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin
1 5 10 15
His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
20 25
<210> 50
<211> 29
<212> PRT
PL 209 696 B1 < 213 > Sekwencja sztuczna <220>
< 2 2 3 > Sekwencj a chimeryczna <400> 50
Phe 1 Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin
5 10 15
His His Tyr Gin Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
20 25
<210> 51 <211> 28 <212> PRT < 213 > Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja chimery czna <400> 51
Phe 1 Arg His Asp Ser 5 Gly Tyr Gly Ser Thr 10 Glu Thr Gly Asn Gin His 15
His Tyr Gin Thr 20 Arg Val Val Ser Asn 25 Ala Asn Lys
<210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe 15 10 15
Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 20 25 30

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Peptyd o wzorze:
    (A)n - - (Th)m - - (B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
    w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20;
    Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T;
    PL 209 696 B1 gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez żadnych reszt rozdzielających;
    w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta(4-10) stanowi (SEQ ID NO:1);
    przy czym peptyd ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26;
    SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; 1 SEQ ID NO:46.
  2. 2. Kompozycja peptydowa, znamienna tym, że zawiera mieszaninę dwóch lub więcej peptydów o wzorze:
    (A)n - - (Th)m - - B)0 - - Abeta(4-10) - - (C)p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych;
    w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20;
    Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T;
    gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B wiązaniem peptydowym bez żadnych reszt rozdzielających;
    w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta(4-10) stanowi (SEQ ID NO:1);
    przy czym jeden z tych peptydów wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ
    ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO:46.
  3. 3. Kompozycja immunogenna do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta-amyloidu (SEQ ID NO:2), znamienna tym, że zawiera:
    (a) antygen obejmujący epitop T-komórkowy, który zapewnia skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta(4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym antygen ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ D NO: 31; SEQ ID NO 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO : 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ D NO: 43; SEQ ID NO 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO :46; oraz (b) adiuwant.
  4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że adiuwant obejmuje jedną lub więcej substancji wybranych z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, saponiny. Quill A, Quill A/ISCOMs, bromku dimetylo-dioktadecyloamonu/arwidyny, polianionów, kompletnego adiuwanta Freund'a, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy, N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy, niekompletnego adiuwanta Freunda i liposomów.
  5. 5. Zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono w zastrz. 3 lub 4 do wytwarzania leku do leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
  6. 6. Zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono w zastrz. 3 lub 4 do wytwarzania leku do zmniejszania ilości złogów amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
  7. 7. Zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono w zastrz. 3 lub 4 do wytwarzania leku do deagregowania włókienek amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera.
  8. 8. Sposób określania czy związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu, znamienny tym, że:
    (i) kontaktuje się związek z peptydem Abeta(4-10) (SEQ ID NO: 1; i (ii) wykrywa się wiązanie związku z peptydem.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że ponadto ocenia się czy związek hamuje tworzenie włókienek amyloidu in vitro.
    PL 209 696 B1
    Departament Wydawnictw UP RP
    Cena 7,38 zł (w tym 23% VAT)
PL373450A 2002-04-19 2003-04-07 Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhbitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu PL209696B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37391402P 2002-04-19 2002-04-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373450A1 PL373450A1 (pl) 2005-08-22
PL209696B1 true PL209696B1 (pl) 2011-10-31

Family

ID=29251102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373450A PL209696B1 (pl) 2002-04-19 2003-04-07 Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhbitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu

Country Status (18)

Country Link
US (5) US20030232758A1 (pl)
EP (2) EP1497321B1 (pl)
JP (3) JP4662719B2 (pl)
KR (1) KR100994748B1 (pl)
CN (1) CN100360555C (pl)
AT (1) ATE514707T1 (pl)
AU (1) AU2003218560B2 (pl)
CA (1) CA2481952C (pl)
ES (1) ES2368907T3 (pl)
HK (2) HK1072947A1 (pl)
IL (3) IL164643A0 (pl)
MX (1) MXPA04010255A (pl)
NO (2) NO335192B1 (pl)
NZ (1) NZ536064A (pl)
PL (1) PL209696B1 (pl)
SG (1) SG173214A1 (pl)
WO (1) WO2003089460A1 (pl)
ZA (1) ZA200408811B (pl)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
CA2504349A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-15 Diagenics International Corporation Monoclonal antibodies specific for beta-amyloid
US20050106626A1 (en) * 2002-10-20 2005-05-19 George Pieczenik Ligand binding of amyloid peptide protein epitope
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
US8193250B2 (en) 2004-10-22 2012-06-05 Mount Sinai School Of Medicine Compositions and methods for treating alzheimer's disease and related disorders and promoting a healthy nervous system
US20090123952A1 (en) * 2004-11-12 2009-05-14 Pfizer, Inc. Method of Measuring Amyloid-Beta Peptides
KR101667623B1 (ko) 2005-11-30 2016-10-19 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
EP2808032B1 (en) 2005-12-12 2018-08-01 AC Immune S.A. A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
CN101421299A (zh) * 2006-02-22 2009-04-29 株式会社林原生物化学研究所 用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗
CA2630344C (en) 2006-03-23 2015-04-28 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
JP5190957B2 (ja) * 2006-04-28 2013-04-24 国立大学法人 鹿児島大学 アミロイドβ線維化阻害ペプチド
MX2009000476A (es) 2006-07-14 2009-01-28 Ac Immune Sa Anticuerpo humanizado contra beta amiloide.
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2094730A4 (en) * 2006-12-07 2010-08-04 Mayo Foundation METHODS AND MATERIALS ASSOCIATED WITH ANTI-AMYLOID ANTIBODIES
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
MX2009009234A (es) 2007-03-01 2009-12-01 Probiodrug Ag Uso nuevo de inhibidores de ciclasa de glutaminilo.
WO2008128985A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
AU2008311367B2 (en) 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
WO2010024927A2 (en) * 2008-08-28 2010-03-04 The Research Foundation Of State University Of New York Treatment of amyloidoses using myelin basic protein and fragments thereof
US8912145B2 (en) 2008-11-28 2014-12-16 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. Vaccine composition for prophylaxis and/or therapy of Alzheimer's disease
WO2010061899A1 (ja) * 2008-11-28 2010-06-03 北興化学工業株式会社 ワクチンを蓄積する形質転換ダイズ植物およびその利用
CN101797493B (zh) * 2009-02-06 2014-05-21 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法
CN101486768B (zh) * 2009-02-25 2012-05-30 吉林大学 一种用于治疗阿尔茨海默氏病的抗原蛋白及蛋白基因
WO2010124028A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Vasylyev Sergiy V Light collection and illumination systems employing planar waveguide
KR101755737B1 (ko) 2009-09-11 2017-07-07 프로비오드룩 아게 글루타미닐 사이클라제의 억제제로서 헤테로사이클릭 유도체
US9181233B2 (en) 2010-03-03 2015-11-10 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
CA2789440C (en) 2010-03-10 2020-03-24 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
JP5945532B2 (ja) 2010-04-21 2016-07-05 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
CA2806909C (en) 2010-07-30 2019-12-17 Ac Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
US20120321694A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-20 Daniel Larocque Compositions and uses
ES2570167T3 (es) 2011-03-16 2016-05-17 Probiodrug Ag Derivados de benzimidazol como inhibidores de glutaminil ciclasa
DE102011057019A1 (de) * 2011-12-23 2013-06-27 Forschungszentrum Jülich GmbH Standard zur Quantifizierung von pathogenen Aggregaten aus körpereigenen Proteinen
JP6130401B2 (ja) * 2012-01-20 2017-05-17 アンナプラガダ，アナンス 医学画像を客観的に特徴付けるための方法および組成物
US9534048B2 (en) * 2012-08-24 2017-01-03 University Health Network Antibodies to TTR and methods of use
PL2895512T3 (pl) * 2012-09-12 2018-11-30 Neurimmune Holding Ag Przeciwciała swoiste dla polipeptydu amyloidowego ludzkich wysepek (HIAPP) i ich zastosowania
HUE051127T2 (hu) * 2012-10-15 2021-03-01 Medimmune Ltd Béta-amiloid antitestek
WO2015017280A1 (en) 2013-07-28 2015-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
FI3137094T3 (fi) 2014-04-29 2023-03-20 Advantage Therapeutics Inc Alzheimerin taudin (ad) hoitaminen ja ehkäiseminen
SG11201610734RA (en) 2014-07-10 2017-01-27 Bioarctic Neuroscience Ab IMPROVED Aß PROTOFIBRIL BINDING ANTIBODIES
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
WO2017098516A1 (en) * 2015-12-10 2017-06-15 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. VARIANTS OF AMYLOID beta-PROTEIN PRECURSOR INHIBITOR DOMAIN
ES2848720T3 (es) * 2016-11-25 2021-08-11 Genuv Inc Composición para promover la diferenciación y la protección de células madre neurales y método para inducir la regeneración neural utilizando la misma
MA49947B1 (fr) 2017-08-22 2023-03-31 Biogen Ma Inc Compositions pharmaceutiques contenant des anticorps anti-bêta-amyloïdes
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
US11958889B2 (en) 2017-10-25 2024-04-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions of phosphorylated tau peptides and uses thereof
CA3099946A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Universite Laval Use of nod2 agonist for the treatment, prophylaxis and/or delay of the onset of multiple sclerosis and alzheimer's disease
WO2020163730A2 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Ac Immune S.A. Method of safe administration of phosphorylated tau peptide vaccine
KR20220005033A (ko) 2019-04-24 2022-01-12 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 타우 백신의 이종 투여
TW202144387A (zh) * 2020-02-11 2021-12-01 美商聯合生物醫學公司 針對胰島澱粉樣多肽（iapp）的胜肽免疫原及其預防和治療與聚集iapp相關疾病的製劑
CN115925987A (zh) * 2022-02-28 2023-04-07 安域生物科技(杭州)有限公司 基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0671948T3 (da) 1992-06-25 1997-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5840294A (en) 1993-03-29 1998-11-24 Queen's University At Kingston Method for treating amyloidosis
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
CA2161445C (en) * 1993-04-27 2009-06-30 Anna Efim Ladd Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CA2242851A1 (en) 1995-08-17 1997-02-27 The Ontario Cancer Institute Protein fibril assembly assay
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
WO2001097607A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic animal model of neurodegenerative disorders
US6310810B1 (en) 2000-07-14 2001-10-30 Raj Kumar Jain High-speed sense amplifier
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200408811B (en) 2005-07-27
NZ536064A (en) 2008-06-30
NO20045021L (no) 2005-01-18
NO335192B1 (no) 2014-10-20
JP4662719B2 (ja) 2011-03-30
ES2368907T3 (es) 2011-11-23
CA2481952A1 (en) 2003-10-30
AU2003218560B2 (en) 2009-09-03
JP2006505502A (ja) 2006-02-16
JP5345920B2 (ja) 2013-11-20
KR100994748B1 (ko) 2010-11-17
US20120315321A1 (en) 2012-12-13
EP2330113A1 (en) 2011-06-08
CA2481952C (en) 2013-10-29
NO20131483L (no) 2005-01-18
EP1497321A1 (en) 2005-01-19
US20030232758A1 (en) 2003-12-18
EP1497321B1 (en) 2011-06-29
WO2003089460A1 (en) 2003-10-30
IL196532A (en) 2013-02-28
ATE514707T1 (de) 2011-07-15
JP2013075898A (ja) 2013-04-25
MXPA04010255A (es) 2008-03-04
EP2330113B1 (en) 2016-06-29
CN1646559A (zh) 2005-07-27
HK1072947A1 (en) 2005-09-16
JP2010065046A (ja) 2010-03-25
CN100360555C (zh) 2008-01-09
US20160297876A1 (en) 2016-10-13
US20090041771A1 (en) 2009-02-12
US20140212481A1 (en) 2014-07-31
SG173214A1 (en) 2011-08-29
IL196532A0 (en) 2009-09-22
KR20040108747A (ko) 2004-12-24
PL373450A1 (pl) 2005-08-22
AU2003218560A1 (en) 2003-11-03
IL164643A (en) 2011-11-30
HK1158665A1 (zh) 2012-07-20
IL164643A0 (en) 2005-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2003218560B2 (en) Immunological methods and compositions for the treatment of alzheimer&#39;s disease
JP5736565B2 (ja) Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ病の予防および治療
DK2368907T3 (en) Anti-Abeta antibodies and their use
JP5989074B2 (ja) アミロイドーシス治療のための化合物
SG172617A1 (en) Therapeutic vaccine
JP2003534351A (ja) アミロイドβ及びアミロイド沈着物に対する免疫応答誘導のための、アミロイドβと相同的な、合成の、免疫原性だが非アミロイド原性ペプチド
EP3527220A1 (en) Vaccine engineering
JP2014039561A (ja) 治療的特性を有するβ１〜４２特異的モノクローナル抗体
KR20120059562A (ko) 루이 소체 질병을 치료하기 위한 알파-시누클레인 에피토프의 미모토프의 용도
DK2465533T3 (en) Methods and compositions comprising supramolecular constructs

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification