CN100360555C - 治疗阿尔茨海默氏病的免疫学方法及组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含淀粉样肽Aβ₄₂中第4-10个残基(FRHDSGY)的免疫原性组合物及肽。本发明还涉及与Aβ_(4-10)抗原决定簇结合的抗体。本发明提供了治疗阿尔茨海默氏病及减少阿尔茨海默氏病患者中淀粉样蛋白负荷的方法。本发明还涉及设计淀粉样蛋白沉积的小分子抑制剂的方法。

Description

治疗阿尔茨海默氏病的免疫学方法及组合物

技术领域

本发明涉及治疗阿尔茨海默氏病的免疫学方法及组合物。本发明还涉及鉴别化合物的方法，所述化合物抑制淀粉样蛋白斑的形成和/或清除与阿尔茨海默氏病及其他神经退行性疾病相关的、已经存在的淀粉样蛋白斑。

背景技术

作为一种脑部神经退行性疾病的阿尔茨海默氏病(“AD”)是导致老年人痴呆的主要原因之一。AD的症状可包括学习及记忆能力逐渐丧失、个性改变、神经肌肉变化、癫痫发作和偶有精神病行为。

阿尔茨海默氏病有两大独特的神经病理性特征：淀粉样蛋白斑在脑内对于记忆及其他认知性功能关键的区域中沉积，以及在神经细胞内出现神经原纤维缠结。据信淀粉样蛋白斑在脑内所述关键区域的沉积会干扰脑的功能。类似地，认为在AD患者神经细胞内积聚的神经原纤维缠结会干扰神经元与神经元之间的通信。

阿尔茨海默氏病的另一特征是存在疏水性淀粉样β肽(Aβ₄₂)，该淀粉样β肽为淀粉样蛋白斑的主要成分。所述淀粉样β肽(Aβ₄₂)是由称为淀粉样蛋白前体(APP)或阿尔茨海默氏病淀粉样A4蛋白的正常膜组成蛋白通过水解过程产生的片段。

淀粉样β肽(Aβ)包含一组由APP加工而成的、长39～43个氨基酸的肽。参见Pallitto等人，《生物化学(Biochemistry)》，38卷，3570-3578页(1999)。尽管整个Aβ肽可能具有两性特征，但是Aβ肽通常包括APP跨膜区的11～15个残基，因而其包含疏水区。参见Kang等人，《自然(Nature)》325卷，733-736页(1987)。已发现Aβ肽对培养的细胞具有毒性。参见Pike等人，《欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)》，207卷，367-368页(1991)；Iversen等人，《生物化学杂志(Biochem.J.)》，311卷，1-16页(1995)。据认为，阿尔茨海默氏病中Aβ肽的毒性与可溶性Aβ肽聚集成不溶性纤维、随后该纤维整合入淀粉样蛋白斑的过程相关。参见Pike等人，Eur.J.Pharmacol.，207卷，367-368页(1991)；Pike等人，《大脑研究(Brain Research)》，563卷，311-314页(1991)；及Pike等人，《神经科学(J.Neurosci.)》，13卷，1676-1687页(1993)。类似地，Aβ肽也能在体外形成纤维，并且可利用所述过程来测定对Aβ肽聚集及纤维形成的抑制作用。

以前曾有几个小组采用Aβ₄₂抗原制备物免疫的转基因小鼠模型用于研究阿尔茨海默氏病，所述转基因小鼠表现出脑内淀粉样蛋白沉积和认知缺陷。这些研究结果证明，用Aβ₄₂免疫可以使小鼠阿尔茨海默氏病样神经病变及空间记忆障碍的状况得到改善。参见Schenk等人，Nature 400卷，173-177页(1999)；Bard等人，《自然医学分册(Nature Medicine)》，6卷，916-919页(2000)；Janus等人，Nature，408卷，979-982页(2000)；及Morgan等人，Nature，408卷，982-982页(2000)。Bard等人推测Aβ₄₂疫苗免疫可能使小胶质细胞活化，随后使小胶质细胞参与Aβ₄₂的聚集。参见Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919页(2000)。不幸的是，淀粉样蛋白斑沉积减少和认知功能改善的全部免疫学机制尚未阐明。

在以前的研究中，被动施用3D6及10D5抗体可有效降低转基因小鼠中Aβ及淀粉样蛋白斑的负荷，所述两种抗体的表位分别为Aβ的第1～5个残基和第3～6个残基。参见Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919页(2000)。使用突变的、疾病相关形式的人淀粉样蛋白前体(APP)蛋白对小鼠进行转基因，所述APP受血小板衍生(PD)生长因子的启动子控制。所述(PDAPP)小鼠过表达人淀粉样蛋白前体蛋白，并表现出许多阿尔茨海默氏病的病理症状。参见Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919页(2000)。

在另一项研究中，在外周施用针对Aβ第13～28个残基的抗体m266后，发现可通过清除PDAPP小鼠血浆中的Aβ来降低脑内的Aβ负荷。参见Demattos等人，《美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，98卷，8850-8855页(2001)。m266抗体针对Aβ的次要免疫原性位点，该位点具有对Aβ寡聚体、初原纤维及蛋白斑的不同的结合特异性，或者进入中枢神经系统(CNS)的差异性。

由于Aβ₄₂抗原和APP均为自身蛋白，因而在正常情况下，在表达所述蛋白的个体内不具有免疫原性。因此，试图生产基于这些抗原的疫苗，就必定需要诱导自身免疫作用。此外，任何试图诱导自身免疫的免疫方案都必须仔细检验由所述自身抗原所诱导的免疫反应。在这种情况下，整合入Aβ₄₂或作为Aβ₄₂成分的任何自身抗原都不会诱导针对正常APP蛋白的自身免疫作用，也不会破坏其正常的细胞功能是非常重要的。

对于研发治疗AD的有效免疫治疗方法而言，希望确定Aβ₄₂型抗原免疫后免疫作用介导的淀粉样蛋白斑负荷降低的免疫学机制。

可以利用淀粉样蛋白斑减少的机制来设计仅引入具有有益生物学活性表位的免疫原性组合物及抗原，所述设计思路是具有优势的。另一优势是此类免疫原性组合物可以被设计成不包括那些诱导有害免疫反应的表位。因此，需要有仅针对Aβ抗原异常形式的、能够诱导非常特异和有限的免疫反应的明确抗原。

也需要有包含明确抗原的免疫原性组合物，所述抗原可在免疫治疗中诱导仅针对Aβ抗原致病形式的、非常特异和有限的免疫反应。此外，将抗体与明确的Aβ表位分离开来是有利的，其中所述表位在被动免疫治疗中应用时具有有益的生物学性质。更为有利的是，研发在治疗开始后尽快测定阿尔茨海默氏病患者是否从Aβ抗原的免疫原性组合物治疗中受益的诊断检测方法。还需要鉴定淀粉样蛋白沉积及纤维形成的抑制剂。

发明内容

本发明通过提供含有淀粉样肽Aβ₄₂(SEQ ID NO：2)上的第4～10个残基(SEQ ID NO：1)的免疫原性组合物完成了上述需求，所述第4-10个残基称为Aβ_(4-10)。本发明的抗原及免疫原性组合物可用于治疗阿尔茨海默氏病、设计淀粉样蛋白沉积的小分子抑制剂，及作为诊断试剂使用。

本发明还提供了与Aβ_(4-10)抗原决定簇结合的抗体。本发明的免疫原性组合物和抗体也可在改善阿尔茨海默氏病症状的方法中使用，其中通过减少阿尔茨海默氏病患者淀粉样蛋白负荷实现所述症状的改善。

在一个实施方案中，本发明提供了下式所示的肽：

(A)_n--(Th)_m--(B)_o--Aβ_(4-10)--(C)_p

其中A、B及C均为氨基酸残基或氨基酸残基序列；

其中n、o及p为0至约20的相互独立整数；

Th为包含辅助性T细胞表位或者其免疫增强类似物或片段的氨基酸残基序列；

当o等于0时，Th通过肽键直接与B细胞表位相连而不含间隔残基；

其中m为1至约5的整数；

其中Aβ_(4-10)为(SEQ ID NO：1)或其包含保守性氨基酸替换的类似物。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于诱导与Aβ肽(SEQ IDNO：2)特异性结合的抗体的免疫原性组合物，该组合物包含抗原及佐剂，该抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)构成的B细胞表位。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了用于诱导与Aβ肽特异性结合的抗体的免疫原性组合物，该组合物包含一种抗原及佐剂，该抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQ IDNO：1)构成的B细胞表位，其中T细胞表位选自：

(a)一个或一个以上的T细胞表位，其位于同一蛋白质骨架的B细胞表位的N(氨基)端，

(b)一个或一个以上的T细胞表位，其位于同一蛋白质骨架的B细胞表位的C(羧基)端，或

(c)一个或一个以上的T细胞表位，其位于不同蛋白质骨架上，该蛋白骨架通过共价键与含有所述B细胞表位的蛋白质骨架相连。

在一个特别的实施方案中，本发明提供了具有B细胞表位和T细胞表位的免疫原性组合物，其中该T细胞表位选自以下氨基酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。

在另一个特别的实施方案中，本发明提供了包含抗原及佐剂的免疫原性组合物，其中所述佐剂含有选自一种或一种以上的以下物质：氢氧化铝、磷酸铝、皂甙、奎乐A(Quill A)、奎乐A/免疫刺激复合物(ISCOMs)、二甲基双十八烷基溴化铵/艾卫定(arvidine)、聚阴离子、弗氏完全佐剂、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺、弗氏不完全佐剂或脂质体。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的方法，该方法包括将有效量的免疫原性组合物施用于所述个体，以诱导产生与Aβ肽(SEQ ID NO：2)特异性结合的抗体；其中所述组合物包含(a)抗原和(b)佐剂，所述抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)构成的B细胞表位。

在另一个的优选实施方案中，本发明提供了一种减少患有阿尔茨海默氏病个体的脑内淀粉样蛋白沉积的方法，该方法包括将有效量的免疫原性组合物施用于所述个体以诱导产生与Aβ肽(SEQ ID NO：2)特异性结合的抗体；其中所述组合物包含(a)抗原和(b)佐剂，所述抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQ IDNO：1)构成的B细胞表位。

在另一个的优选实施方案中，本发明提供了一种使患有阿尔茨海默氏病个体脑内的淀粉样蛋白纤维解聚的方法，该方法包括将有效量免疫原性组合物施用于所述个体，以诱导产生与Aβ肽(SEQ ID NO：2)特异性结合的抗体；其中所述组合物包含(a)抗原和(b)佐剂，所述抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQID NO：1)构成的B细胞表位。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了能够与Aβ_(4-10)(SEQ IDNO：1)结合的分离抗体或其抗原结合片段。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了能够与Aβ_(4-10)(SEQ IDNO：1)结合的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制淀粉样蛋白的沉积。

在另一个实施方案中，本发明提供了能够与Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)结合的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够使淀粉样蛋白纤维解聚。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的方法，该方法包括将识别Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)并与之结合的有效量抗体组合物施用于所述个体。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的方法，该方法包括将识别Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)并与之结合的有效量抗体组合物施用于所述个体，其中所述组合物包含多克隆抗体。

在一个特别的实施方案中，本发明提供了一种治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的方法，该方法包括将识别Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)并与之结合的有效量抗体组合物施用于所述个体，其中所述组合物包含单克隆抗体。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了测定一个化合物是否为淀粉样蛋白沉积及纤维形成的抑制剂的方法，该方法包括：将化合物与肽Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)接触，检测化合物与该肽的结合。在另一个实施方案中，该方法还包括评价所述化合物是否在体外抑制淀粉样蛋白纤维的形成。

在另一优选实施方案中，本发明提供了预测主动免疫治疗对阿尔茨海默氏病效果的诊断方法，该方法包括：监测针对肽Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)的免疫反应的发展，其中对Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)的阳性免疫反应表明应继续进行治疗，缺乏免疫反应或极弱的免疫反应表明应当终止治疗。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，该组合物包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含可提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)(SEQ ID NO：1)构成的B细胞表位，所述抗原提供了用于诱导产生抗体的有效蛋白质结构，所述抗体能够与位于Aβ肽(SEQ ID NO：2)内的免疫靶点结合。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种包含B细胞表位的抗原，其中，B细胞表位的蛋白质结构提供了如在Aβ肽(SEQ ID NO：2)中所发现的免疫作用靶点的模拟二级结构，这些二级结构选自β折叠、回折、螺旋、无规则卷曲或它们的组合。在另一个特定的实施方案中，所述抗原包括含有所述Aβ_(4-10)肽(SEQ ID NO：1)模拟物的B细胞表位。

定义

除非另有说明，应将下列术语理解为下述含义：

佐剂——指免疫原性组合物中与抗原联用以增强抗原免疫原性的一类物质，也可以是这些物质的混合物。佐剂的作用在于增强对抗原的免疫反应，该作用通常通过其直接作用于免疫系统和使抗原缓慢释放而实现。

淀粉样β肽(Aβ)——指一组由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)加工而得的39～43个氨基酸残基的肽中的任一种。本文所用的Aβ₄₂指42个氨基酸残基的Aβ肽。此外，Aβ_(4-10)指Aβ₄₂中第4～10个残基的7氨基酸残基的肽。正如下文更为详细的讨论一样，APP基因经过选择性剪接后生成三种常见的同种型产物，这三种产物分别含有770个氨基酸(APP₇₇₀)、751个氨基酸(APP₇₅₁)和695个氨基酸(APP₆₉₅)。为方便起见，即使在指代短同种型产物的密码子位置时，也使用最长同种型产物APP₇₇₀的密码子来计数。

抗原——本发明的抗原结合了辅助性T细胞的表位和B细胞的表位。辅助性T细胞表位可位于同一多肽骨架上B细胞表位的N端或C端。例如在小分子肽与诸如钥孔血蓝蛋白的载体分子共价相连以提供免疫原性时，T细胞表位也可位于与含有B细胞表位的多肽共价相连的不同多肽骨架上。替代性地，也可以通过使用佐剂将T细胞和B细胞的表位结合在一种组合物中的方法，把T细胞表位与B细胞表位非共价相连。

抗原加工——指来自细菌、病毒或免疫原性组合物的细胞外抗原被抗原呈递细胞(APC)通过胞饮或吞噬作用摄取的过程。随后，所述抗原被内体或溶酶体片段化，所形成的片段再被载入I型及II型主要组织相容性(MHC)分子的结合裂隙中。

抗原呈递——指I型及II型MHC分子与加工后的短肽结合并将这些肽呈递到细胞表面，以通过T细胞受体介导的相互作用进行T细胞筛选的过程。

B细胞表位——指作为抗体结合靶点的抗原部分，也称为抗原决定簇。对于蛋白质抗原决定簇而言，B细胞表位指通常按照天然结构以特定三维构象排列的氨基酸残基。与T细胞表位不同，B细胞表位可对蛋白质构象非常敏感。

有效量——指可完成任一明确治疗目标的本发明免疫原性组合物、抗体或抗原结合片段的量。有效量也包括组合物、抗体或其抗原结合片段的预防性及治疗性应用。

辅助性T细胞表位——辅助性T细胞表位(Th表位)是与II型MHC分子结合并活化CD4⁺T细胞的肽，从而以细胞因子的形式辅助B细胞产生针对抗原的抗体反应。II型MHC分子在细胞腔室中负载长约7～30个残基的加工肽片段，其中所述腔室与细胞外环境发生通信。因此，辅助性T细胞表位通常代表外源蛋白质片段。

免疫靶点——指抗原中B细胞表位试图模拟的淀粉样蛋白沉积或循环Aβ肽中实际的三维表位(天然的)。抗蛋白的抗体通常对特定二级结构中的特定氨基酸序列具有特异性。理想的情况是，诱导针对表位抗原模拟物的抗体，从而产生识别天然表位并与之结合的抗体，所述天然表位出现在病理性淀粉样蛋白沉积或循环Aβ肽中。

免疫原——指经证明具有免疫原性的抗原。

免疫原性——指抗原引起免疫反应的能力。一般来说，为了表现出免疫原性，抗原必须与抗原呈递细胞结合。免疫原性受许多因素影响，包括抗原大小、结构、序列、异源性程度、佐剂存在与否、患者的免疫状态及其他遗传因素。

肽——指通常为2个或更多个的连在一起的少数几个氨基酸。

多肽——指更长的连在一起的氨基酸链，但其序列或长度常常还未确定。术语蛋白质、肽及多肽有时可以互相交换使用。

混杂辅助性T细胞表位——指能够在表达不同MHC单元型的大量个体中诱导T细胞活化反应(T细胞辅助作用)的一类辅助性T细胞表位，所述大量个体即遗传多样性群体。在异源群体的多个不同个体中发挥作用的所述Th表位被认为是混杂的Th表位。

蛋白质或多肽骨架——指代表作为蛋白质序列一部分的氨基酸重复单位。多肽骨架由三种原子的序列组成：酰胺氮(N-H)，α-碳(C)及羧基碳(C＝O)，常被表示为-N-C-C-。

蛋白质——通常指具有明确的序列、长度及折叠构象的特定氨基酸链，但是蛋白质、多肽及肽有时可以互相交换使用。

治疗或处理——包括下列目标：(1)在尚未诊断出具有不希望有的症状或病理性状态的受试者中防止其发生；(2)抑制不希望有的症状或病理性状态，即阻止其进展；或(3)改善或缓解不希望有的症状或病理性状态，即促进不希望有的症状或病理性状态消退。

本发明的组合物和方法来源于本发明人的发现，即免疫反应介导的淀粉样蛋白斑沉积的减少，及相应的认知功能改善可由针对Aβ₄₂中特定免疫靶点或B细胞表位的特异性抗体反应介导。所述关键免疫靶点由本发明人鉴定为Aβ₄₂的第4～10个残基(FRHDSGY)(SEQ ID NO：1)，其中，根据最长同种型APP₇₇₀密码子来计数，所述Aβ₄₂的第4～10个残基对应于淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的第675～681个残基。由此，本发明人阐明了一种用Aβ型抗原免疫后由免疫作用介导的淀粉样蛋白斑负荷减少的重要免疫学机制。

本发明人发现，识别Aβ₄₂第4～10个残基(FRHDSGY)(SEQ ID NO：1)并与之结合的抗体可抑制Aβ纤维形成及Aβ的神经毒性。此外，本发明人发现识别Aβ₄₂第4～10个残基(FRHDSGY)(SEQ ID NO：1)并与之结合的抗体可解聚已经形成的Aβ₄₂纤维。而且，本发明发现用Aβ₄₂免疫时产生的抗体在Aβ所致的体外死亡细胞中消失了。

本发明的实施使用TgCRND8小鼠作为人类AD的模型。TgCRND8小鼠可用作AD模型是因为其携带了受朊病毒蛋白启动子控制的人类双突变APP₆₉₅转基因，并表现出大脑皮质中Aβ₄₂肽及神经炎性淀粉样蛋白斑的进行性积聚(一种AD的神经病理学标志)，同时伴随进行性认知功能障碍。参见Chishti等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，276卷，21562-570页(2001)。

本发明提供了特异性针对Aβ肽N端的抗体，该抗体在用Aβ₄₂的原纤维形式免疫C57BL6×C3H小鼠时产生。本发明还提供了与Aβ_(4-10)对应的Aβ序列FRHDSGY(SEQ ID NO：1)，其代表了针对阿尔茨海默氏病的保护性免疫作用的关键表位。此外，本发明将Aβ_(4-10)鉴定为能够在患有阿尔茨海默氏病的患者中产生有益的保护性免疫作用的免疫靶点。

抗原呈递

抗原呈递指抗原呈递细胞(APC)摄取和加工蛋白抗原的分子及细胞事件。加工后的抗原片段呈递到效应细胞，然后效应细胞活化并启动免疫应答。最具活性的抗原呈递细胞为巨噬细胞(是单核细胞的直接发育产物)、树突状细胞及某些B细胞。

抗原呈递及免疫反应过程中的关键分子为MHC分子，该分子是位于已知为主要组织相容性复合物Mhc的染色体区域内的多态性基因家族。人类中的I型及II型MHC分子称为HLA(人类白细胞抗原)分子。某些MHC分子可以在细胞表面上展示独特分子片段并促进T细胞及其他免疫系统效应分子对这些分子的识别。参见D.H.Margulies，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第263-285页中的《主要组织相容性复合物(The Major Histocompatibility Complex)》部分，第4版，W.F.Paul编，Lippencott-Raven，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)(1999)。此外，I型及II型MHC分子可与抗原呈递细胞中的肽结合，然后与T细胞表面上的αβT细胞受体相互作用。

更具体地说，I型MHC分子结合并呈递细胞自身肽的样品，该样品包括内源性胞浆蛋白、全新翻译的病毒及肿瘤抗原。I型MHC分子通常呈递长度约7～16个残基的肽，这些肽为CD8⁺细胞毒T细胞所识别。I型MHC分子参与影响细胞毒性T细胞应答，其中，感染病毒的细胞被杀死。

本发明主要涉及用于活化CD4⁺T细胞的T细胞表位，其中所述CD4⁺T细胞可辅助B细胞生成针对某一抗原的抗体。辅助性T细胞表位(Th表位)与细胞腔室中的II型MHC分子结合，其中，所述分子与长约7～30个残基的加工后肽片段一起负载，所述细胞腔室与细胞外环境通信。参见D.H.Margulies，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第263-285页中的《主要组织相容性复合物(The Major HistocompatibilityComplex)》部分，第4版，由W.F.Paul编辑，Lippencott-Raven，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)(1999)(Margulies)。更具体地，II型MHC分子结合肽样品并将其呈递给CD4⁺T细胞，所述肽样品在紧靠细胞的细胞外环境中被抗原呈递细胞消化。然后CD4⁺T细胞活化，并以细胞因子的形式辅助B细胞生成抗体。在人类中，II型MHC分子包括HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP分子，它们在不同遗传编码的等位基因中出现。

本发明的免疫原性组合物包括具有B细胞表位及T细胞表位的抗原，所述表位被所谓“抗原呈递细胞”表面上的MHC分子加工并作为蛋白质或肽片段呈递，并被作为效应细胞的CD4⁺T淋巴细胞所识别。

为了确保有效的免疫监视，将MHC分子的生理作用设计为能够呈递尽可能广谱的抗原肽。因此，抗原呈递细胞表面上确定的抗原肽的拷贝数很低(给定总数约为10⁵个肽受体中确定的抗原肽的数量级为10²)。也就是说，与MHC分子(“肽配体”)结合的异源性非常强的抗原肽混合物暴露于抗原呈递细胞的细胞表面上。

术语“T细胞表位”指在抗原加工及II型MHC分子结合袋内的肽呈递后，使CD4⁺T辅助(Th)淋巴细胞活化的蛋白质序列。T细胞表面上的α/βT细胞受体与肽-II型MHC分子复合物相互作用，该作用刺激了活化。因而，T细胞表位的天然构象并不重要，而是只有一级序列及其与特定MHC分子结合的能力更为重要。

本发明涉及能够诱导产生针对Aβ病理形式抗体的肽，优选合成肽，所述Aβ病理形式例如在淀粉样蛋白斑及纤维中发现的Aβ。

肽的免疫原性指肽诱导抗体反应的能力，所述反应包括可特异性识别肽内“B细胞表位”或“抗原决定簇”并与之结合的抗体。参见R.N.Germain，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第287-340页中的《抗原的加工和呈递(Antigen Processing and Presentation)》部分，第4版，W.F.Paul编辑，Lippencott-Raven，费城(Philadelphia)，宾夕法尼亚州(PA)(1999)(Germain)。为表现出抗原性，含B细胞表位的肽必须与II型MHC抗原或II型T表位联合呈递。T细胞表位通常由抗原呈递细胞在加工抗原时从免疫原加工而来，并以序列特异性的方式与II型MHC分子结合。参见上述Germain的文章。所述II型MHC分子-T细胞表位复合物为CD4⁺T淋巴细胞(Th细胞)所识别。所述Th细胞具有使产生抗体分子的特定B细胞增殖的能力，其中所述抗体分子能识别来自所呈递免疫原的相关B细胞表位。因此，特定B细胞表位的特异抗体的产生与T细胞表位的呈递相关联，所述T细胞表位存在免疫原中的或与其相关。

当抗原不是外源蛋白时会产生另一个问题。由于Aβ是自身分子，其不应含有可诱导淋巴细胞活化及针对自身抗体反应的Th表位。因此，外源T细胞表位须通过包括来源于强外来免疫原的特异性序列来提供，这些免疫原包括破伤风毒素、百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)及其他免疫原。此类T细胞表位序列可以与B细胞表位Aβ_(4-10)一起包含于同一蛋白质骨架上。所述T细胞表位的位置可以在B细胞表位的N端或C端。替代性地，T细胞表位也可位于不同的蛋白质骨架上，该骨架可以与含有B细胞表位的肽共价相连或不共价相连，该骨架也被称为载体分子。

可以通过本领域内众所周知的下述方法选择更多的T细胞表位，例如，将免疫亲和纯化的II型MHC分子中的II型MHC结合肽进行酸洗脱和质谱测序，该方法在Rudensky等人，《Nature》，353卷，622-627页(1991)；Chicz等人，《Nature》，358卷，764-768页(1992)；及Hunt等人，《Science》，256卷，1817-1820页(1992)中公开，并在此将其以整体引入作为参考。

理想的情况是，优选的选定Th表位能够在表达不同MHC单元型的大量个体中引起T细胞活化反应(T细胞辅助作用)。也就是说，这些表位可在异源群体中的大量不同个体中发挥作用，且被认为是混杂Th表位。混杂Th表位具有在遗传多样性群体的大部分成员中引起强烈的抗Aβ抗体反应的优势。

本发明辅助性T细胞表位的选择不仅要考虑在给定群体的大部分成员中引起免疫反应的能力，还要考虑导致记忆/回忆反应的能力。接受Aβ免疫治疗的大多数人类患者，已经用麻疹、流行性腮腺炎、风疹、白喉、百日咳、破伤风的儿童疫苗免疫过了。因此这些患者此前已暴露于免疫原混合物内超过一种的Th表位中。这些先前的暴露可能是有用的，因为标准疫苗免疫造成的先前Th表位暴露，应该生成了可直接应答并为抗体反应提供帮助的Th细胞克隆。

辅助性T细胞表位是包含Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。辅助性T细胞表位可包含连续的或不连续的表位。因而并不是辅助性T细胞表位中的每个氨基酸残基均是表位的必须部分。因此，包括Th表位类似物及片段在内的Th表位能够增强或刺激针对Aβ的免疫反应。辅助性T细胞优势免疫表位广泛地在含有各种不同MHC类型的动物及人类群体中具有反应性。参见Celis等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，140卷，1808-1815页，(1988)；Demotz等人，《J.Immunol.》，142卷，394-402页，(1989)；Chong等人，《感染免疫学(Infect.Immun.)》，60卷，4640-4647页，(1992)。受试肽的辅助性T细胞表位含有约10～50个氨基酸残基，优选约10～40个氨基酸残基，更优选约10～30个氨基酸残基，进一步更优选约10～20个氨基酸残基，或优选约10～15个氨基酸残基。当存在多个辅助性T细胞表位(即n＞2)时，各个辅助性T细胞表位可相互独立的相同或不同。

辅助性T细胞表位可包括所述辅助性T细胞表位的长约1～10个氨基酸的类似物、取代体、缺失体及插入体。辅助性T细胞表位片段是辅助性T细胞表位中的连续部分，该连续部分足以增强或刺激针对Aβ的免疫反应。辅助性T细胞表位与B细胞表位之间可被一个或一个以上的间隔氨基酸残基隔开。

本发明的表位包括乙型肝炎表面抗原辅助性T细胞表位(HB-Th)、百日咳毒素辅助性T细胞表位(PT-Th)、破伤风毒素辅助性T细胞表位(TT-Th)、麻疹病毒F蛋白辅助性T细胞表位(MV-Th)、沙眼衣原体(Chlamydia trachamates)主要外膜蛋白辅助性T细胞表位(CT-Th)、白喉毒素辅助性T细胞表位(DT-Th)、恶性疟原虫环子孢子辅助性T细胞表位(PF-Th)、曼氏裂体吸虫磷酸丙糖异构酶辅助性T细胞表位(SM-Th)、大肠埃希氏菌Tra辅助性T细胞表位(TraT-Th)和这些Th表位任意的免疫增强类似物及片段。Ladd等人的专利号为No.5,759,551的美国专利描述了广泛反应性Th表位的选择，在此将其公开的内容以整体引入作为参考。下面提供了辅助性T细胞表位序列的例子：

表1、辅助性T细胞表位

                                                                               

HB-Th：

Phe--Phe--Leu--Leu--Thr--Arg--Ile--Leu--thr--Ile--Pro--Gln--

Ser--Leu--Asp，SEQ ID NO：3

PT-Th：

Lys--Lys--Leu--Arg--Arg--Leu--Leu--Tyr--Met--Ile--Tyr--Met--

Ser--Gly--Leu--Ala--Val--Arg--Val--His--Val--Ser--Lys--Glu--

Glu--Gln--Tyr--Tyr--Asp--Tyr，SEQ ID NO：4

TT-Th：

Lys--Lys--Gln--Tyr--Ile--Lys--Ala--Asn--Ser--Lys--Phe--Ile--

Gly--Ile--Thr--Glu--Leu，SEQ ID NO：5

TT2-Th：

Lys--Lys--Phe--Asn--Asn--Phe--Thr--Val--Ser--Phe--Trp--Leu--

Arg--Val--Pro--Lys--Val--Ser--Ala--Ser--His--Leu

SEQ ID NO：6

PT-Th：

Tyr--Met--Ser--Gly--Leu--Ala--Val--Arg--Val--His--Val--Ser--

Lys--Glu--Glu，SEQ ID NO：7

TT3-Th：

Tyr--Asp--Pro--Asn--Tyr--Leu--Arg--Thr--Asp--Ser--Asp--Lys--

Asp--Arg--Phe--Leu--Gln--Thr--Met--Val--Lys--Leu--Phe--Asn--

Arg--Ile--Lys，SEQ ID NO：8

PT-Th：

Gly--Ala--Tyr--Ala--Arg--Cys--Pro--Asn--Gly--Thr--Arg--Ala--

Leu--Thr--Val--Ala--Glu--Leu--Arg--Gly--Asn--Ala--Glu--Leu

SEQ ID NO：9

MVF1-Th：

Leu--Ser--Glu--Ile--Lys--Gly--Val--Ile--Val--His--Arg--Leu--

Glu--Gly--Val SEQ ID NO：10

MVF2-Th：

Gly--Ile--Leu--Glu--Ser--Arg--Gly--Ile--Lys--Ala--Arg--Ile--

Thr--His--Val--Asp--Thr--Glu--Ser--Tyr SEQ ID NO：11

TT4-Th：

Trp--Val--Arg--Asp--Ile--Ile--Asp--Asp--Phe--Thr--Asn--Glu--

Ser--Ser--Gln--Lys--Thr SEQ ID NO：12

TT5-Th：

Asp--Val--Ser--Thr--Ile--Val--Pro--Tyr--Ile--Gly--Pro--Ala--

Leu--Asn--His--Val SEQ ID NO：13

CT-Th：

Ala--Leu--Asn--Ile--Trp--Asp--Arg--Phe--Asp--Val--Phe--Cys--

Thr--Leu--Gly--Ala--Thr--Thr--Gly--Tyr--Leu--Lys--Gly--Asn--

Ser SEQ ID NO：14

DT-Th：

Asp--Ser--Glu--Thr--Ala--Asp--Asn--Leu--Glu--Lys--Thr--Val--

Ala--Ala--Leu--Ser--Ile--Leu--Pro--Gly--His--Gly--Cys

SEQ ID NO：15

DT-Th：

Glu--Glu--Ile--Val--Ala--Gln--Ser--Ile--Ala--Leu--Ser--Ser--

Leu--Met--VaL--Ala--Gln--Ala--Ile--Pro--Leu--VaL--Gly--Glu--

Leu--Val--Asp--Ile--Gly--Phe--Ala--Ala--Thr--Asn--Phe--Val--

Glu--Ser--Cys

SEQ ID NO：16

PF-Th：

Asp--His--Glu--Lys--Lys--His--Ala--Lys--Met--Glu--Lys--Ala--

Ser--Ser--Val--Phe--Asn--Val--Val--Asn--Ser

SEQ ID NO：17

SM-Th：

Lys--Trp--Phe--Lys--Thr--Asn--Ala--Pro--Asn--Gly--Val--Asp--

Glu--Lys--His--Arg--His SEQ ID NO：18

TraTl-Th：

Gly--Leu--Gln--Gly--Lys--Hfis--Ala--Asp--Ala--Val--Lys--Ala-

Lys--Gly SEQ ID NO：19

TraT2-Th：

Gly--Leu--Ala--Ala--Gly--Leu--Val--Gly--Met--Ala--Ala--Asp--

Ala--Met--Val--Glu--Asp--Val--Asn SEQ ID NO：20

TraT-Th：

Ser--Thr--Glu--Thr--Gly--Asn--Gln--His--His--Tyr--Gln--Thr--

Arg--Val--Val--Ser--Asn--Ala--Asn--Lys SEQ ID NO：21

在一些实施方案中，本发明包含具有选自以下氨基酸序列的T细胞表位：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21。

抗原设计

本发明的免疫原性组合物包含抗原，该抗原包含提供有效量T细胞辅助性T细胞表位和由所述Aβ_(4-10)肽构成的B细胞表位。

本发明的抗原肽由下式表示：

I.  (A)_n--(Th)_m--(B)_o--Aβ_(4-10)--(C)_p

II. (A)_n--Aβ_(4-10)--(B)_o--(Th)_m--(C)_p

III.(D)_q--Aβ_(4-10)--(E)_r

其中A、C、D及E为相互独立的氨基酸残基或氨基酸残基序列；

其中作为间隔子的B是氨基酸残基或氨基酸残基序列；当o等于0时，Th通过不含任何间隔残基的肽键与B细胞表位直接相连；

其中n、o及p为相互独立的0至约20的整数；当o等于0时，Th直接与B细胞表位相连而不含任何间隔残基；

其中m为1至约5的整数；

其中q和r为相互独立的0至约100的整数；

Th为包含辅助性T细胞表位或者其免疫增强类似物或片段的独立氨基酸序列；或者含有保守氨基酸替换的所述氨基酸序列类似物；Th可以呈串联重复；

Aβ_(4-10)为Aβ₄₂ SEQ ID NO：1的第4～10个残基(FRHDSGY)，或者是其含有保守氨基酸替换的类似物；Aβ_(4-10)SEQ ID NO：1可以串联重复，或以多拷贝形式存在。

本发明也包括式I、II和III所示的两个或更多个肽的组合物。式I的一个或一个以上的肽可以组合从而形成组合物。替代性地，来自式I、II和III的一个或一个以上的肽可以组合从而形成混合物或组合物。

本发明的抗原肽含约20～100个氨基酸残基，或者含有约20～80个氨基酸残基。在一个特定的实施方案中，本发明的抗原肽含有约20～60个氨基酸残基，优选约20～50个氨基酸残基，更优选约25～40个氨基酸残基。在另一个优选的实施方案中，抗原肽含有约20～35个氨基酸残基。

当A、B、C、D及E为氨基酸残基时，它们可以是任意的非天然存在的氨基酸或任意天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、原丝氨酸、瓜氨酸，等等。天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸。此外，当m至少为1且A、B、C、D或E基团中两个或更多个为氨基酸残基时，各个氨基酸相互独立的相同或不同。

A、B、C、D或E基团的氨基酸残基可以被脂肪酸修饰。例如，可在Aβ表位的N端或C端加上一个或一个以上的ε-棕榈酰赖氨酸，使整个肽可以锚定于囊泡的表面。囊泡可含免疫刺激剂脂质A。参见Nicolau等人，《Proc.Natl.Aead.Sci.USA》，99卷，2332-2337页(2002)，其公开的内容在此以整体引入作为参考。

通过使用用于构建蛋白质抗原的正交偶联策略，可将Aβ_(4-10)表位引入蛋白质的树枝状结构(dendrimer)中。特定构建的树枝状结构可形成装配有效疫苗抗原的基础，例如可包括Tam的专利号为No.6,310,810的美国专利中所描述的多元抗原肽构建，其公开的内容在此以整体引入作为参考。

用作抗原和疫苗的合成肽

在很多情况下，已经证明使用完整蛋白或糖蛋白作为开发感染制剂和用于人类疾病的有效疫苗及免疫治疗方法的免疫原，不是由于缺乏免疫原性而导致没有效果，就是因为包含非保护性表位而致使感染及疾病的恶化。参见Osterhaus等人，《疫苗(Vaccine)》，7卷，137-141页(1989)；Gilbert等人，《病毒研究(Virus Research)》，7卷，49-67页(1987)；Burke，D.《生物医学前景(Perspect.Biol.Med.)》，35卷，511-530页(1992)。

在疫苗或免疫原性组合物中使用合成肽抗原可以避免与重组疫苗相关的许多问题。使用与特定蛋白质结构域相对应的合成肽的优势包括：仅选择和包括保护性表位，排除使疾病恶化的表位，排除有害的自身免疫表位，排除感染性物质；且合成的肽在化学上是非常明确的，并能够以合理的成本生产。参见Arnon和Horwitz，《最新免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》，4卷，449-453页(1992)。

不足之处在于小分子合成肽不含加工及与I型和II型主要组织相容性复合物(MHC)蛋白结合、呈递给免疫系统所需的精确氨基酸序列。参见Rothbard，《生物技术(Biotechnology)》，20卷，451-465页(1992)。另一个不足之处是小分子肽的三维溶液结构可能与天然蛋白中观察到的不同，因此，该肽可能无法诱导具有适当特异性和亲和性的体液免疫以提供保护性免疫。参见Bernard等人，《艾滋病研究和人类逆转录病毒(Aids Res.and Hum.Retroviruses)》，6卷，243-249页(1990)。

本发明的肽抗原能够以广泛的各种方式制备。所述肽由于相对较小，可以根据常规技术在溶液中或在固相支持物上合成。目前可从商业途径获得各种不同的自动化或人工合成仪，并可按照已知方案使用。例如，可参见Finn等人的专利号为No.5,827,666的美国专利；Stewart和Young，《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》，第2版，PierceChemical Co.，1984年；及Tam等人，《美国化学协会杂志(J.Am Chem.Soc.)(1983)105卷，6442页，其公开的内容在此以整体引入作为参考。

替代性地，当采用编码所述多肽的单链或其基本互补序列制备合成基因时，可使用杂交DNA技术，此时单链发生重叠并可在退火介质中合在一起以便杂交。可将杂交的链加以连接以形成完整的基因，并可通过选择恰当的末端将该基因插入到表达载体中，目前许多载体均可容易地获得；例如，可参见Sambrook，Fritsch & Maniatis，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，ColdSpring Harbor，纽约(N.Y.)(本文中称为“Sambrook等人，1989”)；然后在原核或真核表达系统中表达，以产生所需的肽。

载体

例如在本申请中所述的本发明Aβ_(4-10)表位抗原，可以与载体分子结合以提供T细胞辅助作用。

本发明抗原所共价相连(偶联)的载体分子是有益的、无毒的、制药学上可接受的，且大小足以在哺乳动物中产生免疫反应。适当载体分子的例子包括破伤风毒素、钥孔血蓝蛋白(KLH)及与gp120包膜糖蛋白T细胞表位(即T1和T2)相对应的肽，其中所述糖蛋白可替代非艾滋病(non-AIDS)病毒衍生的载体分子(Cease，《Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)》，84卷，4249页，1987年；Kennedy等人，《J.Biol.Chem.》，262卷，5769页，1987年)。所述肽可与制药学上可接受的佐剂如明矾一起施用，或与其他免疫原性超过破伤风毒素的载体分子结合后施用。

载体分子可直接或通过间隔分子与本发明的肽抗原相连。间隔分子是有益的、无毒的，并具有反应性。在肽的氨基末端增加的两个甘氨酸残基，可以提供用于将Aβ_(4-10)或其部分和载体分子连接的适当间隔分子；替代性地，Aβ_(4-10)或其部分例如可以合成为与例如另一个免疫原性淀粉样蛋白序列直接相连。半胱氨酸可加入到Aβ_(4-10)肽的N端或C端用于与载体分子偶联，或者同时加入到其两端以通过二硫键的形成来促进链间的多聚体化，从而形成更大的分子聚集物。载体分子与肽的偶联使用偶联剂来完成。如Green等人，《细胞(Cell)》，28卷，477页(1982)；及Palker等人，《Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.》，84卷，2479页(1987)所述，优先使用异质功能(heterofunctional)偶联剂M-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)或水溶性化合物M-马来酰亚胺苯甲酰磺化琥珀酰亚胺酯(磺化-MBS)。许多其他偶联剂如戊二醛，可用于使肽和其他分子偶联。偶联方法在本领域内众所周知。例如可参见G.T.Hermanson著的《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》中的第9章(419～455页)及第11章(494～527页)，学院出版社(AcedemicPress)，圣地亚哥(San Diego)，1996年，其公开的内容在此以整体入作为参考。

佐剂

抗原的两大特征是其免疫原性或其诱导体内免疫反应(包括特异性抗体的形成)的能力；和抗原性，即可被对该序列和结构具有特异性的抗体选择性识别的能力。

某些抗原独自施用时仅有微弱的免疫原性。因此，微弱免疫原性的抗原不能诱导提供有效免疫治疗或保护该生物的免疫反应。

可通过将抗原与称为佐剂的额外物质混合施用，来增强其免疫原性。佐剂通过直接作用于免疫系统和使抗原缓慢释放的作用，来增强针对抗原的免疫反应。因此，佐剂改变了抗原的药物动学性质，且提高了抗原与免疫系统之间相互作用的时间。佐剂的用途在本领域内众所周知，有许多可以使用的适当佐剂。在《疫苗设计—亚基和佐剂方法(VaccineDesign--The subunit and adjuvant approach)》(Powell和Newman编辑)，《制药学生物技术(Pharmaceutical Biotechnology)》，6卷，Plenum出版社(1995)中，概要描述了免疫原性组合物的制备及佐剂的应用，其公开地内容在此以整体引入作为参考。

应用最为广泛的佐剂是弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂，前者为在矿物油中包含溶于盐水溶液的死亡分枝杆菌的乳剂，后者不含分枝杆菌。

佐剂可增强针对特异抗原的免疫反应的强度，或产生免疫系统的特异性活化。佐剂通常分成五类，包括：(1)铝盐，如氢氧化铝或磷酸铝；(2)表面活性剂，如皂甙、奎乐A、奎乐A/免疫刺激复合物、二甲基双十八烷基溴化铵/艾卫定；(3)聚阴离子；(4)细菌衍生物，如弗氏完全佐剂、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(胞壁酰二肽)、N-乙酰胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(苏氨酰MDP)；(5)赋形剂及缓释物质，如弗氏不完全佐剂(油乳剂)及脂质体。参见《新一代疫苗(New Generation Vaccines)》，第11章，129-140页，“用于新一代疫苗的佐剂(Adjuvants for a New Generation of Vaccines)”，A.C.Allison及N.E.Byars著，Marcel Dekker，纽约，1990年。

本发明的免疫原性组合物包含抗原和佐剂。适当的佐剂包括明矾，其为铝盐如氢氧化铝凝胶或磷酸铝，但也可以是钙、铁或锌的盐。其他适当的佐剂包括酰化酪氨酸的不溶性悬液、酰化糖类、阳离子或阴离子衍生的多糖、或聚磷腈。

可使用佐剂组合以产生佐剂系统。适当的佐剂系统包括例如单磷酸脂质A与铝盐的组合，其中单磷酸脂质A优选3-去氧酰化单磷酸脂质A(3D-MPL)。一个替代性的佐剂系统包含例如RIBI ADJUVANT SYSTEM^TM，其为单磷酸脂质A、合成的海藻糖二棒分枝杆菌酸酯(trehalosedicorynomycolate)及细胞壁骨架物质的组合，其中单磷酸脂质A优选3-去氧酰化单磷酸脂质A。一个增强的系统包括单磷酸脂质A与皂甙衍生物的组合，尤其是WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或反应原性更小的组合物，其中QS21用WO 96/33739中公开的胆固醇猝灭。WO 95/17210中描述了一种包含水包油乳剂中QS21、3D-MPL及生育酚的特别强效的佐剂制剂，其为优选的制剂。WO 94/00153、WO 96/33739及WO 95/17210所公开的内容在此以整体引入作为参考。

此外，本发明的组合物可像Fullerton的专利号为No.4,235,877的美国专利中所述的那样封装入脂质体或微囊中，其公开的内容在此以整体引入作为参考。

抗体结构

本发明设计了可与Aβ_(4-10)表位结合并抑制淀粉样蛋白沉积及纤维形成的抗体或其抗原结合片段。一般来说，已知基本的抗体结构单元包括四聚体。每一个四聚体包括两对相同的多肽链，每对含一条“轻链”(约25kDa(千道尔顿))和一条“重链”(约50～70kDa)。每条链的氨基端部分可包括约100～110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分可界定一个恒定区，其主要负责起效应器作用。人类轻链一般分为κ和λ轻链。此外，人类重链一般分为μ、δ、γ、α及ε，它们分别将抗体的同种型界定为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在轻链和重链的内部，可变区和恒定区用长约12或更多个氨基酸的“J”区相连，其中重链也包括长约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见J.K.Frazer和J.D.Capra，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第37-75页的“免疫球蛋白：结构与功能(Immunoglobulins：Structure andFunction)”，第4版，W.F.Paul编辑，Lippencott-Raven，Philadelphia，PA(1999)(Frazer)，将其内容以整体引入作为所有目的之参考。

每个轻链/重链对的可变区可形成抗体结合部位。因此，一般来说，完整的IgG有两个结合部位。除了双功能或双特异性抗体外，一般来说这两个结合部位是相同的。

正常情况下，所有的链均表现出由三个高度可变区连接的相对保守框架区(FR)的相同通用结构，高度可变区也称为互补决定区或CDRs。来自每对链中两条链的CDRs通常沿框架区排列，使得可以与特异性表位结合。一般来说，从N端到C端，轻链和重链均含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。各结构域的氨基酸通常与“免疫学目标蛋白Kabat序列”(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1987和1991)；Chothia等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，196卷，901-917页(1987)；或Chothia等人，《Nature》，342卷，878-883页(1989)的定义一致。

抗体的类型

术语“抗体分子”包括但不限于抗体或其片段。该术语包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、Fab抗体片段、F(ab)₂片段、Fv抗体片段(如V_H或V_L)、单链Fv抗体片段及dsFv抗体片段。而且，本发明的抗体分子可以是完全人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。抗体分子优选为单克隆完全人类抗体。

优选本发明的抗Aβ_(4-10)抗体分子识别人类的淀粉样蛋白Aβ肽蛋白及肽；但是，本发明包括识别来自不同种属的淀粉样蛋白Aβ肽蛋白及肽的抗体分子，所述不同种属优选哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、羊或狗)。

此外，本发明的抗Aβ_(4-10)抗体可来源于人类单克隆抗体。此类抗体可从转基因小鼠获得，其中所述小鼠已被“改造成”对抗原攻击应答时产生特异的人类抗体。在此技术中，将人类重链及轻链基因座的元件导入了小鼠株中，所述小鼠株来源于内源重链及轻链基因座受到定向破坏的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以合成针对人类抗原的特异性人类抗体，并且该小鼠可用于生产分泌人类抗体的杂交瘤。在以下文献中描述了从转基因小鼠中获取人类抗体的方法：Green等人，《自然遗传学(Nature Genet.)》，7卷，13页(1994)；Lonberg等人，《Nature》，368卷，856页，(1994)；以及Taylor等人，《国际免疫学(Int.Immun.)》，6卷，579页(1994)。

在一个优选的实施方案中，利用携带部分人类免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠产生针对Aβ_(4-10)的完全人类单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文可称为“HuMAb”小鼠，其含有人类免疫球蛋白基因的小基因座(miniloci)，它编码未重排的人类重链(μ、γ)及κ轻链免疫球蛋白序列，并产生了使内源μ和κ链基因座失活的定点突变(Lonberg，N.等人，(1994)，《Nature》，368(6474)：856-859页)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达减少，并在对免疫产生应答时，导入的人类重链及轻链转基因发生类型交换和体细胞突变，以产生高亲和力的人类IgG单克隆抗体(Lonberg，N.等人，(1994)，《Nature》，368(6474)：856-859页；Lonberg，N.(1994)，《实验药理学手册(Handbook of ExperimentalPharmacology)》，113：49-101页中的综述；以及Lonberg，N.等人，(1995)，《国际免疫学综述(Intern.Rev.Immunol)》，13：65-93页)。HuMAb小鼠的制备在本领域内是已知的，并在例如下列文献中描述：Lonberg等人，(1994)《Nature》，368(6474)：856-859页；Lonberg，N.(1994)《Handbook of Experimental Pharmacology》，113：49-101页；Lonberg，N.等人，(1995)《Intern.Rev.Immunol.》，13卷，65-93页；Fishwild，D.等人，(1996)《自然生物技术分册(NatureBiotechnology)》，14：845-851页。进一步可参见Lonberg和Kay及GenPharm International的专利号为No.5,814,318、5,874,299和5,770,429的美国专利；Surani等人的专利号为No.5,545,807的美国专利。将其所有公开的内容以整体引入作为参考。

为了产生针对Aβ_(4-10)的完全人类单克隆抗体，可用含有本发明的Aβ_(4-10)抗原的免疫原性组合物免疫HuMAb小鼠。优选在第一次免疫时小鼠应为6～16周龄。例如，含有本发明Aβ_(4-10)抗原的免疫原性组合物可用于腹腔内免疫HuMAb小鼠。小鼠也可用完整的HEK293细胞免疫，其中所述细胞已用含有Aβ_(4-10)的基因稳定转化或转染。“抗原性Aβ_(4-10)多肽”可指在HuMAb小鼠中引起抗Aβ_(4-10)免疫反应的Aβ_(4-10)多肽或其片段。

一般来说，起初用完全弗氏佐剂中的抗原进行腹腔内(IP)免疫，然后每隔一周(通常总时间最多为6周)用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫，采用所述方法的HuMAb转基因小鼠的免疫应答最好。首先，可用表达Aβ_(4-10)的细胞(如稳定转化的HEK293细胞)免疫小鼠，再用含有Aβ_(4-10)的抗原的可溶片段如本发明的免疫原性组合物免疫，然后连续用这两种抗原交替免疫。可以采用眶后采血或尾部取血的方法采集血浆样品，来监测所述免疫方案的过程中的免疫反应。血浆可用于检测是否存在抗Aβ_(4-10)抗体，如使用ELISA(酶联免疫吸附检测)方法检测，具有足够免疫球蛋白滴度的小鼠可用于融合。可在处死小鼠及取脾脏前3天用抗原进行静脉内增强免疫。预计需要对每一抗原进行2～3次融合。每一抗原可以免疫数只小鼠。例如，可以免疫总共12只的HCO7和HCO12株HuMAb小鼠。

然后可用本领域内通常已知的方法生成可产生单克隆完全人类抗Aβ_(4-10)抗体的杂交瘤细胞。这些方法包括但不限于以下技术：最初由Kohler等人，《Nature》，256卷，495-497页(1975)开发的杂交瘤技术；以及Hering等人，《生物医学和生物化学学报(Biomed.Biochim.Acta.)》，47卷，211-216页，(1988)，和Hagiwara等人，《人类抗体杂交瘤(Hum.Antibod.Hybridomas)》，4卷，15页(1993)所研发的三瘤(trioma)技术；Kozbor等人，《今日免疫学(Immunology Today)》4卷72页(1983)的人类B细胞杂交瘤技术；及Cote等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，80卷，2026-2030页，(1983)；以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人，《单克隆抗体与癌症治疗(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)》，Alan R.Liss，Inc.，77-96页，1985年)。优选按标准方案用PEG将分离得到的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。将所得的杂交瘤进行生成抗原特异性抗体的筛选。例如，将来源于免疫小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液，用50％PEG(聚乙二醇)与1/6数量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC(美国典型培养物保藏中心)，CRL 1580)融合。将细胞以约2×10⁵个细胞的量接种到平底微量滴定板中，在含20％胎牛血清、18％″653″条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM(毫摩尔每升)L(左旋)-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素及1X HAT(次黄嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶核苷)(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择培养性培养基中孵育2周。两周后，细胞在将HAT替换成HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)的培养基中培养。然后在每个培养孔中用ELISA方法进行抗Aβ_(4-10)单克隆IgG及IgM抗体的筛选。当发生杂交瘤大量生长时，常常在10～14天后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新种植和筛选，并且如果仍为人类IgG、抗Aβ_(4-10)单克隆抗体阳性，则可用有限稀释法进行至少两次亚克隆。然后将稳定的亚克隆于体外培养，以在组织培养基中产生用于鉴定的少量抗体。

本发明的抗Aβ抗体分子也可以由重组生成(例如，在如上所述的大肠埃希氏菌(E.Coli)/T7表达系统中生成)。在本实施方案中，可以将编码本发明抗体分子(如V_H或V_L)的核酸插入基于pet的质粒中，并在E.Coli/T7系统中表达。本领域内有数种众所周知的生产重组抗体的方法。专利号为No.4,816,567的美国专利公开了一种抗体重组生产方法的实例，在此将其整体引入作为参考。抗体分子也可在CHO或NSO细胞中重组生成。

本文中的术语“单克隆抗体”指从基本同源的抗体的群体中所获得的抗体，即除了可能存在的少量天然发生的突变外，包含所述群体的单一抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。单克隆抗体的优势在于其被一种杂交瘤培养物合成，且基本上不会被其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”表明抗体是从抗体基本同源的群体获得的这一特征，并不是指需要采用任何特定方法来生成抗体。正如前面所提到的，按照本发明使用的单克隆抗体可用Kohler等，《Nature》，256卷，495页(1975)中最初所述的杂交瘤方法制备。

多克隆抗体是在一种或一种以上的不同抗体存在下产生的抗体。一般来说，多克隆抗体在有其他B淋巴细胞存在的条件下从B淋巴细胞中产生的，其他淋巴细胞产生不同的抗体。多克隆抗体通常由直接免疫动物获得。

术语“完全人类抗体”指仅包含人类免疫球蛋白序列的抗体。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。

本发明包括“嵌合抗体”——该抗体包含本发明所述抗体的可变区，该可变区与来自于另一个非人类种属(如小鼠、马、兔、狗、牛、鸡)的抗体区(如恒定区)融合或嵌合。这些抗体可用于调节非人类种属中Aβ_(4-10)的表达或活性。

“人源化抗体”指在其他人类抗体框架内包括非人类CDR的抗体，或是非人类抗体可变区与其他人类抗体恒定区相连的抗体。本发明设计了人源化抗体，该抗体包括来源于非人类种属的CDR或可变区，该CDR或可变区包含本发明可变区或CDR的氨基酸序列。

根据重链恒定域的氨基酸序列的差异，免疫球蛋白可分为不同的类别。至少有5大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；其中有数种还可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本发明的抗体分子优选IgG-1或IgG-4。

本发明的抗体也可与诸如⁹⁹Tc、⁹⁰Y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁶S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、²¹⁷Ci、²¹¹AT、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th及⁴⁰K的放射性同位素标记，及诸如¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr和⁵⁶Fe的非放射性同位素标记偶联。

本发明的抗体也可与荧光标记或化学发光标记偶联，所述标记包括荧光团，例如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸盐、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、¹⁵²Eu、丹酰、伞形花内酯、荧光素、鲁米那标记物、异鲁米那标记物、芳香吖啶酯标记物、咪唑标记物、吖啶盐标记物、草酸酯标记物、水母素标记物、2，3-二氢二氮杂萘酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物及稳定自由基。

可采用本领域中已知的任何方法，将本发明的抗体分子与各种成分偶联，所述方法包括在下列文献中描述的方法：Hunter等人，《Nature》，144卷，945页(1962)；David等人，《Biochemistry》，13卷，1014页(1974)；Pain等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)》，40卷，219页(1981)；及Nygren，《组织化学和细胞化学杂志(J.，Histochem.and Cytochem.)》，30卷，407页，(1982)，在此将其公开的内容以整体引入作为参考。偶联抗体的方法是常规的，并在本领域内众所周知。

本发明也涉及基于施用免疫原性组合物的某些治疗方法，其中组合物含有Aβ_(4-10)或与Aβ肽结合的分子。因此，可以施用含有Aβ_(4-10)的抗原，以抑制或加强衰老中或诸如阿尔茨海默氏病的人类疾病中的蛋白斑沉积。

本发明也包括制备、鉴别、纯化、鉴定Aβ_(4-10)抗原及其类似物的方法，和使用Aβ_(4-10)抗原及其类似物的方法。Aβ_(4-10)抗原可以通过修饰产生，所述修饰方法包括利用基因工程技术、例如固相肽合成的化学合成方法对从天然来源的大淀粉样蛋白肽进行蛋白水解切割；或利用基因工程方法或固相肽合成重新生成。

分子生物学

依据本发明，可在本领域技术内采用常规的分子生物学、微生物学及重组DNA技术。这些技术已在文献中得以全面的阐述。例如，可参见Sambrook，Fritsch & Maniatis，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(本文称为“Sambrook等人，1989年”)；《DNA克隆：一种实用方法(DNA Cloning：A Practical Approach)》，第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》，(M.J.Gait ed.1984)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》[B.D.Hames和S.J.Higgins eds.(1985)]；《转录与翻译(Transcription And Translation)》[B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.(1984)]；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》[R.I.Freshney，ed.(1986)]；《固定细胞与酶(Immobilized Cells AndEnzymes)》[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，《分子克隆实用指南(APractical Guide To Molecular Cloning)》，(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)，《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

CRND8小鼠

CRND8小鼠是AD动物模型，该模型到3月龄时表现出CNS中Aβ高水平合成和淀粉样蛋白沉积。参见2001年12月27日公布的国际公开号为No.WO01/97607的专利，在此将其整体引入作为参考。此外，TgCRND8小鼠在淀粉样蛋白沉积开始的期间表现出认知功能的改变。根据CNS中Aβ淀粉样蛋白的表达，和组织学分析结果、神经病学及行为学上的缺陷，此转基因TgCRND8小鼠模型的特征与天然发生的阿尔茨海默氏病表型非常相似。

APP基因发生变异性剪接，从而产生三种常见的同种型。最长的同种型含有770个氨基酸(APP₇₇₀)，第二长的同种型含有751个氨基酸(APP₇₅₁)，它们在大部分组织中均有表达。第三个转录产物含有695个氨基酸(APP₆₉₅)，主要在脑内表达。即使在指更短一些的同种型时，传统上仍使用最长同种型密码子APP₇₇₀计数。

TgCRND8转基因小鼠包含表达脑内特异性APP₆₉₅突变形式的转基因，此转基因同时携带了“瑞典”和“印地安那州”的APP突变。

产生了含有K595N/M596L突变(瑞典突变)和V642F突变(印地安那州突变)的APP₆₉₅cDNA(使用APP₆₉₅的密码子计数)。在本文中一般通过更常用的APP₇₇₀密码子计数系统提及所述突变及其他突变，即K670N/M671L突变(瑞典突变)和V717F突变(印地安那州突变)这两个突变。

将双突变APP₆₉₅cDNA序列组件插入到粘粒表达载体cosTet中，该载体含有叙利亚仓鼠(Syrian hamster)朊病毒蛋白基因启动子。然后将载体微注射入小鼠的卵细胞中，以产生命名为TgCRND8的转基因细胞系。这些小鼠到3月龄时表现出多发性淀粉样蛋白沉积，此时其空间学习能力的缺陷很明显。

TgCRND8小鼠与其他带有AD相关突变的不同转基因小鼠交配，以产生双转基因小鼠，其表现出进一步的、更强的AD相关神经病理学病变。

施用制剂及治疗方法

本发明也包括了使用Aβ_(4-10)抗原来鉴定可干扰Aβ₄₂与蛋白斑结合的药物的方法。此方面包括药物筛选测定以鉴定与Aβ₄₂作用相仿和/或互补的药物。在一个这样的实施方案中，通过测定含Aβ_(4-10)的肽与特定小分子的结合活性来筛选药物库。监测有希望的药物对Aβ₄₂与蛋白斑亲和力的影响。如果该药能够降低Aβ₄₂与蛋白斑的结合亲和性，则成为侯选药物。可以通过检测破坏蛋白斑形成、阻碍纤维生成过程或解聚已形成纤维的能力来筛选药物。

本发明中的抗原、抗体或其他可用化合物，可作为药用组合物的成分导入。药用组合物优选为，含有治疗量或预防量的带有药学有效载体的抗原、抗体或其他化合物中的至少一种。

在制备本方法中有用的药用组合物时，应当采用可任意配伍的、无毒的药用载体，所述药用载体适于将抗原、抗体或其结合片段或治疗性化合物输送至患者，所述治疗性化合物根据本文公开的方法鉴定得到。无菌水、乙醇、脂肪、蜡类、惰性固体甚至脂质体均可用作载体。制药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)也可导入药用组合物中。因此，抗体及药用组合物非常利于肠道外施用，即静脉内、动脉内、肌肉内或皮下施用。但是，鼻内或其他喷雾制剂也可使用。制剂中的化合物如抗体的浓度可以有很大的不同，即按重量计算从约少于0.5％到高达15％或20％，通常至少为1％，其选择主要基于流体容积、粘性等，基于所选择的具体施用方式进行优选。制备可施用组合物的实际方法对于本领域的熟练技术人员而言是已知的或显而易见的，更详细的描述例如可参见《Remington氏药物科学(Remington’s Pharmaceutical Science)》，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)，在此将其整体引入作为参考。

本发明的免疫原性组合物、抗体或抗原结合片段，以足以在受试者体内调节淀粉样蛋白沉积(淀粉样蛋白负荷)的治疗有效剂量施用。相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选为调节淀粉样蛋白沉积减少至少20％，更优选为至少40％，进一步更优选为至少60％，再进一步更优选至少80％。调节淀粉样蛋白沉积的方法的能力，可以在能预测人类疾病中调节淀粉样蛋白沉积能力的模型系统中加以评价，所述模型系统例如本领域内已知的动物模型系统(例如包括在国际公开号为WO 96/28187的PCT(专利合作条约)专利中所描述的方法)，或用体外方法如国际公开号为WO 97/07402的PCT专利中所描述的Chakrabartty方法，或本文所述的TgCRND8模型系统。而且，受试者体内淀粉样蛋白的含量或分布能够以无创性的方式在体内加以监测，例如可以使用与淀粉样蛋白沉积相关的放射性标记示踪剂，然后用闪烁扫描技术使淀粉样蛋白成像来监测(例如，可参见Aprile，C.等人，《欧洲核医学杂志(Eur.J.Nuc.Med.)》，22卷，1393页(1995)；Hawkins，P.N.，《Baillieres Clin.Rheumatol.》，8卷，635页(1994)，及其所引用的文献)。因此，举例来说，在经过一段时间的治疗后，受试者的淀粉样蛋白负荷可按本发明的方法加以评价，并与该受试者开始用本发明的治疗性化合物治疗前的淀粉样蛋白负荷比较，以确定治疗性化合物对受试者中淀粉样蛋白沉积的影响。

应该认识到，本发明方法调节淀粉样蛋白沉积或淀粉样蛋白负荷的能力，可在某些实施方案中通过观察体内与淀粉样蛋白沉积或淀粉样蛋白负荷相关的症状或体征加以评价。因此，举例来说，本发明方法减少淀粉样蛋白沉积或淀粉样蛋白负荷的能力，可能与淀粉样蛋白相关疾病状态或病情中的临床表现的可观察到的改善相关，或者与所述病情症状的进展减慢或延缓相关。因此，监测疾病的临床表现可用于评价本发明所述的方法调节淀粉样蛋白的疗效。

本发明的方法可用于治疗与发生淀粉样蛋白沉积的其他疾病相关的淀粉样变性。临床上，淀粉样变性可以原发的、继发的、家族性的或单发的。可采用淀粉样蛋白中的淀粉样蛋白原性蛋白类型对淀粉样蛋白进行分类。按照其所鉴定的淀粉样蛋白原性蛋白，可调节淀粉样蛋白的非限制性实例如下(淀粉样蛋白原性蛋白后括号内为相关的疾病)：β-淀粉样蛋白(阿尔茨深入海默症、唐氏综合征、遗传性大脑出血性淀粉样变性[荷兰]、脑血管病)，淀粉样蛋白A(反应性[继发性]淀粉样变性、家族性地中海热、伴发荨麻疹及耳聋的家族性淀粉样变性[默-韦综合征(Muckle-Wells syndrome)])，淀粉样蛋白κL-链或淀粉样变性λL-链(特发性(原发性)，骨髓瘤或巨球蛋白血症相关的)，Aβ2M(长期血液透析)，ATTR(家族性淀粉样蛋白多发性神经病[葡萄牙、日本、瑞典]，家族性淀粉样蛋白心脏病[丹麦]、单发性心脏淀粉样蛋白、系统性老年淀粉样变性)，AIPP或胰岛淀粉样多肽(成年起病型糖尿病、胰岛瘤)，心房苄氟噻(嗪)因子((atrial naturetic factor)，单发性心房淀粉样蛋白)、降钙素原(甲状腺髓样瘤)，凝胶溶素(家族性淀粉样变性[芬兰])，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(遗传性大脑出血性淀粉样变性[冰岛])，AAPOA-I(家族性淀粉样变性(amyloidotic)多发性神经病[爱荷华州])，AAPOA-II(在小鼠中加速衰老)，纤维原相关的淀粉样蛋白，溶菌酶相关的淀粉样蛋白，以及AScr或PrP-27(羊迟发性病毒感染(瘙痒病)、克-雅综合征、格-施-沙综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome)、牛海绵状脑炎)。

具体实施方式

以示例的而非限制的方式描述以下实施例。

实施例1

抗原合成及结构鉴定

在此实施例中，发明人说明了如何合成、纯化及鉴定合成的Aβ肽免疫原。

用ABIMED EPS-221半自动肽合成仪、NovaSyn(NovaBiochem)PEG移植物多聚体树脂和Fmoc N端保护方法，按其所述完成下列Aβ肽的合成：Aβ₄₂、Aβ₄₀、Aβ₃₀及N端表位肽。参见Mayer-Fligge等人，《肽科学杂志(J.Pept.Sci.)》，4卷，355-363页(1998)。Fmoc去保护步骤及最终的去保护循环用分光光度计监测。合成的肽用半制备、反相C18μbondapak HPLC(高效液相色谱)柱纯化。

然后用血浆解吸附作用(MALDI)及电喷雾(ESI)质谱鉴定纯化后合成肽的分子量。只将分子量与预测分子量的肽相同的组分用于随后的免疫。

用循环两向色性(CD)评价溶液中肽的二级结构。用JASCO J-500旋光分光计记录CD谱。参见Mayer-Fligge等人，《J.Pept.Sci.》，4卷，355-363页(1998)。然后，将Bruker-AMX-600仪器按以前所述进行2D-NMR-NOESY分析来完成NMR研究。Michels等，“糖特异性离子通道蛋白(scry-porin)周质N端多肽域的结构及功能鉴定(Structure andFunctional Characterization of the periplasmis N-terminalpolypeptide domain of the sugar specific ion channel protein(scry-porin))”，《蛋白质科学(Protein Science)》(2002)。

实施例2

用Aβ₄₂免疫CRND8小鼠

在此实施例中，发明人表明Aβ₄₂肽在表达APP的转基因小鼠及非转基因小鼠中均具有免疫原性。

小鼠

TgCRND8小鼠已由Chishti等人，《J.Biol.Chem.》，276卷，21562-21570页(2001)在别处作了说明，在此将其整体引入作为参考。小鼠在远亲繁殖的C3H/C57BL/6J背景下培养，所述C3H/C57BL/6J在APP695转录物上顺式过度表达β-APP_瑞典及β-APP_V717F突变。β-APP_瑞典及β-APP_V717F基因受叙利亚仓鼠朊病毒基因启动子的调控。来源于C3H/C57BL(82％/18％)转基因阳性半合子小鼠与野生型C57BL/6J杂交的TgCRND8小鼠断奶后，测定基因型以确定β-APP转基因的存在，并以同一性别每组2～4只小鼠在同一标准的小鼠笼内饲养。小鼠自由供给食物小丸、粉末状食物及水。所有小鼠在免疫前均管理一周，记录每次免疫前一天及免疫后两天的体重。所有试验组别的性别和体重均匹配。

免疫方案及血清的分离

合成的Aβ₄₂及由胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)肽第8～37个残基(ATQRLANFLVHSSNNFGAIL-SSTNVGSNTY)(SEQ ID NO：52)组成的对照肽在C18μbondapak HPLC柱上通过反相HPLC分开，用质谱及氨基酸分析测定纯度。

免疫方案和计划以前已由Schenk等人，《Nature》，400卷，173-177页，(1999)作了描述，在此将其内容以整体引入作为参考。接下来，测定血清样品(200μ血)中的抗体滴度，样品于13周龄时通过后肢静脉穿刺，及25周龄于该过程停止时通过心脏穿刺来收集。在这些研究中使用所述血液之前，于56℃孵育30分钟以灭活补体。在5ml G蛋白柱上分离Ig(免疫球蛋白)组分。将样品上样，用PBS洗涤，用0.1M的柠檬酸钠洗脱，用1M Tris进行缓冲。所有Ig组分在使用前均过滤除菌。

免疫结果

从未免疫小鼠(N＝18)和TgCRND8小鼠及其非转基因同窝出生仔分离血清，其中所述TgCRND8小鼠及其非转基因同窝出生仔已用Aβ₄₂(n＝34；18只TgCRND8和16只非Tg)或外周淀粉样蛋白肽(胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)，免疫过的小鼠数为17，其中10只为TgCRND8，7只为非转基因(非Tg))，重复免疫超过5个月。所述小鼠对Aβ7₄₂(1∶5000-1∶50,000)和IAPP(1∶5000-1∶30,000)表现出显著的抗体滴度。有趣的是，在TgCRND8小鼠和其非转基因同窝出生仔中未检测到抗Aβ₄₂滴度的差异。来自Aβ₄₂所免疫小鼠的血清的每一样品，均可在来自于20周龄非免疫TgCRND8小鼠的脑组织学切片中染出阳性成熟的Aβ蛋白斑。与此相反，来自对照肽IAPP所免疫小鼠及未免疫小鼠的血清的样品，不能在来自于20周龄非免疫TgCRND8小鼠的脑组织学切片中染出阳性成熟Aβ斑。因此，所述结果表明可诱导产生能识别含Aβ的神经病理性蛋白斑并与之结合的抗体自身免疫。

实施例3

小鼠免疫血清对纤维形成的抑制

在此实施例中，如表2所示，本发明人显示来自大部分Aβ₄₂所免疫小鼠的血清能够抑制纤维形成。

在14天的孵育期内，低浓度的Aβ肽溶液可自发性装配成纤维。这些纤维具有特征性的50～70(埃)直径，其可由下述的电子显微镜术监测。

电子显微检测

Aβ₄₂在水中溶解成10mg/ml浓度的储备液后直接使用，或聚集成成熟淀粉样蛋白纤维后使用。在有血清及无血清的条件下，以肽终浓度为100μg/ml孵育Aβ₄₂。将各种血清的序列稀释液加到Aβ₄₂中，并于室温(RT)孵育多至2周。对于负染色电子显微术，将碳包被的聚乙烯醇缩醛网浮于肽的水溶液之上。将网进行印迹并晾干后，样品用1％(w/v)的磷钨酸染色。在Hitachi 7000电子显微镜下观察肽聚集物，工作电压为75V、放大倍数为60,000倍。

电子显微镜检测结果

为了评估Aβ免疫的小鼠的血清对Aβ聚集成纤维的影响，血清在存在或不存在Aβ₄₂的条件下如上述条件于37℃孵育多至14天。在第1、3、7、10及14天，使用负染色电子显微术检测来自各反应混合物的试样中是否存在Aβ₄₂。

在无血清或有未免疫的血清时，Aβ₄₂形成特征性的直径为50～70的长纤维(～7500)。因此，长纤维表明在目前条件下正常血清组分不能抑制纤维形成。有来自IAPP免疫的动物的血清时，很少产生长的Aβ₄₂肽，但形成的纤维具有特征性的50～70直径。与此相反，如表2所示，虽然有少量血清(n＝7/34)效果甚微或无效，但是大部分Aβ₄₂免疫小鼠的血清(n＝27/34)很大程度上阻止了纤维的形成。而且，来自TgCRND8小鼠或非转基因同窝出生仔的Aβ免疫血清可等效地抑制Aβ纤维的形成，所述现象表明抗体的总量仅取决于免疫原，而不是内源性Aβ₄₂的负荷。

正如表2所总结的，当在未免疫小鼠血清中孵育时，未检测到纤维结构的差异。来自用IAPP免疫的小鼠的血清降低了纤维形成的程度，但所形成的纤维与仅由Aβ₄₂形成的纤维类似。最后，来自Aβ₄₂免疫小鼠的血清可不同程度地抑制纤维生成，从完全抑制到仅稍微降低纤维密度均有。见表2。

表2未免疫小鼠、Aβ₄₂免疫小鼠及IAPP免疫血清对纤维形成、纤维解聚和细胞毒性的影响的总结

抑制研究
					免疫原	总样品数	聚集	解聚集	毒性
未免疫	18	0/18	0/18	0/18
					Aβ<sub>42</sub>	34	27/34	26/34	22/30
IAPP	17	4/17	1/17	2/11

实施例4

免疫血清对已存在纤维的破坏

在此实施例中，本发明人显示来自Aβ₄₂所免疫小鼠的血清使预先形成的Aβ₄₂纤维解聚，但预先形成的Aβ₄₂不受与未免疫对照小鼠血清或来自IAPP免疫小鼠的血清一起孵育的影响。

为了确定来自Aβ₄₂免疫小鼠的血清能否破坏预先形成的Aβ₄₂，将来自Aβ₄₂免疫小鼠的血清与预先形成的Aβ₄₂一起孵育多至30天。有证据证明，通过将高浓度的Aβ₄₂试样量持续搅拌来生成聚集的Aβ₄₂纤维。预先形成的Aβ₄₂与无血清(仅Aβ)、IAPP免疫血清或未免疫血清(数据未显示)一起孵育并无解聚效果，即使在孵育30天后也一样。与此相反，来自Aβ₄₂免疫小鼠的血清(n＝26/34)使Aβ₄₂纤维解聚成直径30、平均长度为100的短小纤维，或解聚成无定形的聚集物。此解聚仅在孵育后3天就很明显，到14天时就完成了。此外，解聚呈浓度依赖性，升高抗体浓度可缩短纤维解聚所需时间。最后，由于抗体与Aβ₄₂的1∶1比例不是解聚必需的，所以很可能抗Aβ抗体仅与例如初原纤维寡聚体或其他前体的Aβ种类子集结合。结果用实施例4中所述的电子显微检测方法测定，放大倍数为60,000倍。

实施例5

小鼠抗血清所识别的Aβ₄₂靶表位的质谱测定

在此实施例中，本发明人说明如何精确鉴别在淀粉样蛋白沉积疾病中具有关键生物学意义的表位。

一般图表

为了阐明抗Aβ₄₂血清所识别的表位，在与下面所讨论的表位切除和表位提取方法联用时，采用了使用纳米-电喷雾(nESI)和MALDI-离子化的高分辨率傅立叶-转换离子加旋加速器共掁质谱(FT-ICR-MS；Marshall等人，《质谱评论(Mass Spectrom.Rev.)》，17卷，1-35页(1998))。参见Macht等人，《Biochemistry》，35：15，633-15，639(1996)；Suckau等人，《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，87卷，9848-9852页(1990)；Przybylski等人，《通过联用蛋白质化学和质谱来鉴定三级及超级分子蛋白质结构(Approaches to the characterization of tertiary andsupramolecular protein structures by combination of proteinchemistry and mass spectrometry)》，《生物分子复合物研究的新方法(New Methods for the study of Biomolecular Complexes)》，KluwerAcad.Publ.，Amsterdam，17-43页(1998)。

在一种已知的表位切除的过程中，我们将完整的固定化的免疫复合物的选择性蛋白水解切割与结合肽释放后的质谱肽图结合。具体地说，将来自Aβ₄₂免疫的TgCRND8小鼠的抗血清、来自IAPP免疫的小鼠的对照抗血清、小鼠(单克隆)和兔(多克隆)Aβ₄₂抗体固定于琼脂糖-微毛细管中。接下来，将固定化的抗体暴露于Aβ₄₂聚集物，并使其与Aβ₄₂表位结合。可利用各种蛋白酶及外肽酶或酶的组合来实施免疫复合物的表位切割过程。见表2。

另外，可使用表位提取过程。对于表位提取来说，用各种蛋白酶预消化Aβ₄₂，随后将蛋白酶加工后的Aβ₄₂肽的相应混合物加到抗体柱上，从而使抗体能与表位结合。所述表位在结合肽洗脱时用质谱鉴定。所述过程称为表位提取。

下面详细地说明了单个过程：

抗体固定化

在干燥的NHS活化的6-氨基已酸偶联琼脂糖(Sigma)中加入100μg偶联缓冲液(0.2M NaHCO₃、0.5M NaCl，pH8.3)，偶联反应于20℃进行60分钟。然后将琼脂糖物质转到100μm微毛细管柱上，该柱允许充分冲洗而不丢失物质。参见Macht等人，《Biochemistry》，35：15，633-15，639(1996)。按其所述，该柱可交替地用阻断缓冲液(氨基乙醇/NaCl)和洗涤缓冲液(NaAc/NaCl)冲洗，该柱最终储存于4℃、pH7.5的PBS中。参见Macht等，Biochemistry 35：15，633-15，639(1996)。

表位切割

表位切割过程实施时，首先将2～5μg Aβ₄₂或其他Aβ抗原上样到抗体微柱上，于20℃轻轻振摇孵育60分钟。每次用4ml PBS连续洗涤5次(5×4ml PBS)后，在柱上于37℃使用溶于200μl PBS中的0.2μg蛋白酶进行2小时的蛋白酶消化处理。蛋白酶包括胰蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Asp-N-蛋白酶、α-糜蛋白酶和Glu-C蛋白酶。用5×4ml PBS洗去未结合的及消化了的肽或上清液。接下来，加入500μl 0.1％(v/v)TFA(表位洗脱液)将抗体所结合的肽解离并进行洗脱。将表位洗脱组分于20℃孵育15分钟后冻干，并在10μl 0.1％TFA中重构用于质谱分析。进行额外的外肽酶消化过程时，将所述表位与0.1μg氨肽酶M或羧肽酶Y孵育30分钟，然后用5×4ml PBS洗涤。

表位提取

除了将蛋白裂解消化混合物上样到抗体柱并在20℃孵育60分钟的条件不同以外，表位提取过程采用与表位洗脱相同的方法完成。随后，用5×4ml PBS洗涤除去未结合的肽(上清)。接下来加入500μl 0.1％(v/v)TFA(表位洗脱液)，使抗体结合的表位解离并洗脱下来。将表位洗脱组分于20℃孵育15分钟后冻干，并在10μl 0.1％的TFA中重构用于质谱分析。

蛋白裂解消化

对游离抗原进行蛋白裂解消化，其条件如下：用50mM NH₄HCO₃溶解5-50μg肽，底物对蛋白酶比率为50∶1，在37℃孵育2小时。将反应混合物冻干用于质谱分析，或制备用于表位提取。所用蛋白酶为胰蛋白酶(Promega，Madison)、Lys-C、Asp-N、Glu-C(Roche-BoehringerMannheim)、α-糜蛋白酶、氨肽酶M及羧肽酶Y(Sigma)。

质谱

用装有7T超导磁铁和ICR分析仪比色皿的Bruker(Bruker Daltonik，Bremen，FRG)Apex II FTICR光度计进行FTICR-MS。参见Bauer等人，《生物化学年报(Anal.Biochem.)》，298卷，25-31页(2001)。对带有脉冲振动Apollo-nano-ESI-source的MALDI-FTICR、仪器条件和质量校正先前已有描述。参见Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496页(2000)。质量测定可以精确到约1ppm(MALDI)，通常质量分辨率为约200,000时可精确到0.5-1ppm(ESI)。将2，5二羟苯甲酸(DHB)作为MALDI-MS样品制备的基质。参见Bauer等人，《Anal.Biochem.》，298卷，25-31页，(2001)。ESI-MS通常用水性0.01％TFA溶液进行。参见Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496页(2000)。

质谱结果

使用固定于琼脂糖微毛细管的抗体进行表位切割和提取，并用ESI质谱和MALDI-FTICR质谱进行分析。参见Macht等人，《Biochemistry》，35卷，15633-39页(1996)；Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496页(2000)；参见Bauer等人，《Anal.Biochem.》，298卷，25-31页(2001)；Przybylski等人，《通过联用蛋白质化学和质谱来鉴定三级及超级分子蛋白结构(Approaches to the characterization oftertiary and supramolecular protein structures by combination ofprotein chemistry and mass spectrometry)》，《生物分子复合物研究的新方法(New Methods for the study of Biomolecular Complexes)》，Kluwer Acad.Publ.，Amsterdam，17-43页(1998)。首先，游离Aβ42抗原的胰蛋白酶肽混合物的MALDI-MS显示了所有预期的Aβ蛋白分解肽，这些肽包括：

肽分子量(Da)

1.Aβ_(1-16)  1954.8892

2.Aβ_(6-16)  1336.6030

3.Aβ_(17-28) 1325.6735

4.Aβ_(29-42) 1268.7804

5.Aβ_(17-42) 2575.4164

使用Lys-C和胰蛋白酶消化进行表位切割，洗脱出单一肽片段，该片段使用MALDI-FTICR检测时产生单一的离子类型Aβ_(1-16)1954.8806。在该情况下，Aβ的R5残基被Lys-C和胰蛋白酶消化屏蔽掉了。

金黄色葡萄球菌(S.Aureus)的Glu-C蛋白酶表位切割物洗脱出肽片段Aβ_(1-11)1324.5395 Da。

α-糜蛋白酶及氨肽酶M切割后的表位提取物洗脱物的ESI质谱及MALDI质谱分析，产生片段Aβ_(1-10)1195.4968 Da和Aβ_(4-10)880.3827 Da。

利用抗体所结合的糜蛋白酶片段及Aβ_(1-10)免疫复合物的氨肽酶M消化物测定核心表位。此双消化物将Aβ_(4-10)FRHDSGY鉴定为具有与Aβ42相当的亲和力的最小表位。因为与Aβ42相比，利用羧肽酶A从Y10上进一步消化C端得到的肽的亲和力显著降低，所以C端的氨基酸为Y10。

表3列出了利用抗Aβ抗体和Aβ肽的表位切割及提取过程的质谱所获得的肽片段。当Aβ42肽(表3，第1行)用胰蛋白酶预消化时，从抗体结合部位获得的肽与表3第1行所示的序列一致。联用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶鉴定出相同的16残基肽(表3，第2行)。当蛋白酶为金黄色葡萄球菌Glu-C蛋白酶，并在表位切割中使用该酶时，从抗体结合部位洗脱出11残基的肽，如第3行所示。仅用α-糜蛋白酶消化则观察到10残基的肽(表3，第4行)。如表3第5行所示，当用α-糜蛋白酶和氨基肽酶M实施蛋白酶消化时观察到7个残基的肽。

表3质谱所鉴别的肽

行号	残基数目1       5         10        15	所用蛋白酶
			1	D A E F R H D S G Y E V H H Q KSEQ ID NO：22	胰蛋白酶
2	D A E F R H D S G Y E V H H Q KSEQ ID NO：22	胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶
			3	D A E F R H D S G Y ESEQ ID NO：23	金黄色葡萄球菌的Glu-C蛋白酶
4	D A E F R H D S G YSEQ ID NO：24	α-糜蛋白酶
			5	F R H D S G YSEQ ID NO：1	α-糜蛋白酶和氨基肽酶M

总结

MALDI-MS及ESI-MS分析鉴定出一段包含N端序列的线性肽，Aβ_(1-10)是表位切割时唯一的特异性产物。见表3和表4。游离Aβ42抗原的胰蛋白酶消化物的质谱产生所有预期的肽(1-16)、(6-16)、(17-28)和(29-42)。见表3和表4。用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶进行表位切割产生单一的肽(1-16)。Glu-C蛋白酶和α-糜蛋白酶仅分别产生片段(1-11)和(1-10)。见表3和表4。与此相反，用这些酶消化时，R5、E3和F4残基分别免受消化。用外肽酶进一步消化抗体所结合的内切蛋白酶片段，以确定核心表位。糜蛋白酶片段的氨基肽酶M消化鉴定出Aβ_(4-10)；FRHDSGY为与Aβ42具有相当亲和力的最小表位，然而从Y10进一步C端消化(羧肽酶A)时，肽的亲和力显著降低。质谱表位切割试验中获得的亲和力差异，与ELISA测定的合成表位肽亲和力完全一致，其中所述合成表位肽在N端通过烷酰胺间隔基团生物素化。参见Gitlin等人，《Biochem.J.》，242卷，923-926页(1987)；Craig等人，《Anal.Chem.》，68卷，697-701页(1996)。通过单一同位素分子离子的高测定精确度(0.5-2ppm)，得以明确鉴定表位。此外，通过将选定分子离子在FTICR谱中用IR-多光子激光解离进行序列特异性片段化，以及使用突变及同源Aβ42肽的对照试验(数据未显示)，使所述结果得到确认。参见Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496页(2000)。因此，含有R5G和Y10F双突变的大鼠Aβ₄₂，在表位切割时不产生洗脱产物。相反，人Aβ_(1-40)和Aβ_(1-30)提供了与Aβ₄₂相同的表位(4-10)。来自IAPP免疫小鼠的对照抗体未产生可检测到的表位肽。见表3和表4。

表4.Aβ₄₂免疫血清及IAPP免疫血清的表位切割/提取质谱数据总结

                    鉴定得到的肽^c

表位实验<sup>a</sup>	蛋白酶<sup>b</sup>	Aβ<sub>42</sub>抗血清的上清组分	洗脱	IAPP抗血清<sup>c</sup>的上清组分	洗脱
						切割提取	Lys-C胰蛋白酶Glu-CAsp-N胰蛋白酶α-糜蛋白酶α-糜蛋白酶/	17-28 29-4217-28 29-4212-22 23-4223-421-5 6-1617-28 29-425-10 11-2021-421-4 5-10	1-161-161-112-221-161-104-10	1-16 17-2829-421-5 6-16 17-2829-424-11 12-2223-422-22 23-421-5 6-16 17-2829-421-4 5-10 11-2021-42未检测	-<sup>d</sup>------

氨基肽酶-M胰蛋白酶/氨基肽酶-M

11-20<sup>e</sup>6-16 7-16<sup>e</sup>

4-16

未检测

-

^a表位切割及提取(参见《方法》及内容)

^b《方法》中给定的蛋白酶浓度；氨基肽酶M，微粒体氨基肽酶。

^c上清及用TFA洗脱的表位组分中鉴别出的主要肽的序列

^d没有可检测到的Aβ序列的结合

^e只给出了N端肽

实施例6

Aβ肽的结构鉴定

在本实施例中，发明者比较了鉴定得到的合成的表位肽的亲和力与用于固定抗体的Aβ₄₂的亲和力，并鉴定了溶液中合成的表位肽的二级结构。

采用相应真实肽、生物素-Gly-Gly-Aβ_(1-10)及生物素-Aβ_(4-10)的合成肽、二级结构分析及免疫分析进一步鉴定由质谱鉴定的表位。首先，使用ELISA及表位肽的点印迹分析评估各种肽的抗Aβ抗体亲和力(数据未列出)。结果表明，表3中所示的所有肽表现出与Aβ₄₂相当的亲和力。

为了评价活性表位可能的构象效应，将肽N端的二级结构与以前所报道的Aβ₄₀和Aβ₄₂的结构加以对比。N端、极性肽Aβ_(1-10)和Aβ_(1-16)的CD及2D NMR-NOESY谱(数据未列出)表明无任何明确的Aβ片段的溶液结构。但是，这些数据提示表位对于抗体识别具有一定的柔性。这与Aβ₄₂序列的二级结构预测结果一致，该Aβ₄₂序列能够阻断在Aβ_(4-10)表位区域周围形成α螺旋的倾向性。与此相反，在包含跨膜区(Aβ_(18-42))的序列中观察到形成α螺旋的倾向性及螺旋-卷曲/β折叠构象的转变。参见Coles等人，《Biochemistry》，37卷，11064-11077页(1998)；Kohno等人，《Biochemistry》，35卷，16094-16104页(1996)。

实施例7

血清对Aβ所诱导的毒性的影响

在本实施例中，发明者评估了Aβ免疫的血清抑制Aβ₄₂所诱导的细胞毒性的能力。

综合计划

为了探讨Aβ免疫后TgCRND8小鼠记忆缺陷的预防，是否可以反映对Aβ细胞的毒性的类似影响，发明人用PC-12细胞进行标准的Aβ₄₂细胞毒性测定。参见McLaurin等人，《J.Biol.Chem.》，275卷，18495-502页(2000)；Pallitto等人，《Biochemistry》，38卷，3570-78页(1999)。首先，在有血清或没有血清的条件下，将PC-12细胞与Aβ₄₂一起孵育24小时。然后使用Alamar蓝检测方法(Ahmed等人，《J.Immunol.Methods》，170卷，211-24页(1994))和存活/死亡检测方法(Pike等人，《J.Biol.Chem.》，270卷，23895-98页(1995))来鉴定细胞毒性，其中，所述Alamar蓝检测方法显示代谢活性，存活/死亡检测方法同时指示细胞内酯酶活性及质膜完整性。

Aβ毒性的测定

将PC-12细胞以每孔500个细胞的密度接种到96孔板中，并悬浮于用N2/DMEM(Gibco/BRL，Rockville，MD)稀释的30ng/ml的NGF(AlamoneLabs，以色列)中。使细胞分化5-7天，使其细胞数达到每孔10,000-15,000个。在将Aβ加到培养物中前，将其于室温在溶液(25微摩尔)中维持3天，以诱导纤维生成。如电子显微检测所测定的(数据未列出)，该Aβ制备物含有大量聚集的寡聚体，该寡聚体包括ADDLs及原纤维(到目前为止鉴定为具神经毒性的Aβ种类)。参见Lambert等人，《J.Neurochem.》，79卷，595-605页(2001)；Walsh等人，《J.Biol.Chem.》，274卷，25945-52页(1999)；Hartley等人，《J.Neuroscience》，19卷，8876-8884页(1999)。此外，蛋白质印迹分析证明，Aβ₄₂免疫的血清能够识别Aβ₄₂单体、四聚体、六聚体及超过98kDa的更大寡聚体(数据未列出)。在预孵育3天后，将Aβ以终浓度为0.1μg/μl加到细胞培养物中，于37℃继续孵育24小时。然后，用存活/死亡测定方法(MolecularProbes，Eugene，OR)及Alamar蓝测定法(Biosource Inc，Camarillo，CA)测定毒性。

结果

来自未免疫或IAPP免疫的小鼠的血清对Aβ的毒性无影响。相反，从Aβ₄₂所免疫小鼠分离的血清，以浓度依赖性方式预防Aβ₄₂的细胞毒性，但是在效果的程度方面具有显著变化。在所述测定中，与Aβ₄₂诱导的毒性相比，n＝18/22，p＜0.01及n＝4/22，p＜0.001。对每一个体的血清，绘制细胞存活与纤维解聚的相关曲线，并发现血清抑制毒性的效果与使纤维解聚的效果直接相关。而且，抑制纤维形成/解聚方面最有效的抗体，在降低毒性时也最有效(与无活性血清相比，第3天p＜0.001，第7天p＜0.0001)。

预防细胞毒性所需的抗体对Aβ的化学计量学可提供对作用机制的深刻理解。为了测定激发细胞毒性抑制作用所需的抗体对Aβ的化学计量学，我们检测了10份反应血清的EC₅₀。EC₅₀为1∶100-1∶300，平均值±标准差为234±39，将EC₅₀定义为使Aβ诱导的毒性降低50％所需的血清量。结果发现在抗体对Aβ比值较低(为50∶1)时，检测到保护性效果，该结果提示抗体与诸如Aβ寡聚体、原纤维或前体蛋白片段的低丰度Aβ种类结合，而不是与单体Aβ或Aβ聚集物结合。而且，活性血清在所有受试剂量中均使Aβ细胞毒性显著降低，该现象提示细胞死亡由血清特异性阻断的过程所诱导。使用单因素方差分析完成统计分析，其中Fischer的PLSD的*p＜0.01，p＜0.001.

实施例8

介导保护作用的血清组分

在本实施例中，发明者显示如何测定降低Aβ细胞毒性的血清组分。发明者发现，活性组分在来自于血清的纯化IgG组分中，其他血清组分均不能抑制Aβ介导的细胞死亡。

为了验证Aβ免疫是由Aβ诱导的抗体所引起，而不是其他作用如其他血清蛋白的表达的继发性变化。因此，为了确认只有抗体选择性靶向Aβ_(4-10)表位是有效的，发明人使用来自Aβ₄₂免疫血清的纯化IgG组分进行了细胞毒性实验。此外，还包括了对Aβ特定表位具有特异性的市售单克隆抗体4G8、6E10及Bam10。

结果是无可置疑的。从Aβ₄₂免疫血清纯化的免疫球蛋白G显示了与未加工血清相同的毒性抑制作用，该结果提示血清的其他组分对保护性反应没有作用。此外，这些IgG组分抑制Aβ纤维形成及诱导Aβ纤维解聚的程度与全血清相同。分别识别Aβ序列17-24及11-17的抗体4G8和6E10不能抑制纤维形成，但确实能降低总纤维的含量。后一效应的出现可能是因为这些抗体会与溶液中的一小部分游离Aβ肽结合，从而阻止其形成纤维。与此相反，识别Aβ_(1-10)中一段序列的Bam10抗体与Aβ₄₂免疫的血清类似，都能够抑制纤维形成。这些结果进一步证明，只有识别Aβ序列N末端的抗体才是有效的纤维生成抑制剂，且Aβ₄₂免疫的血清中活性成分为特异性IgG。

实施例9-27

抗原设计

表5中所示肽及实施例9-27按如下式I设计：

I.(A)_n--(Th)_m--(B)_o--Aβ_(4-10)--(C)_p

其中Aβ_(4-10)只存在一个拷贝，n为0，m为1，o为2，B为甘氨酸，C为甘氨酸，p为1，而T细胞辅助表位为SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21中的任何一个。这些含有抗原的组合的B细胞及T细胞表位对应于SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42及43。

表5Aβ肽抗原

实施例	SEQ ID NO：	抗原肽序列
			9	25	FFLLTRILTIPQSLD-GGFRHDSGYG
10	26	KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY-GGFRHDSGYG
			11	27	KKQYIKANSKFIGITE-GGFRHDSGYG
12	28	KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL-GGFRHDSGYG

13	29	YMSGLAVRVHVSKEE-GGFRHDSGYG
			14	30	YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK-GGFRHDSGYG
15	31	GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL-GGFRHDSGYG
			16	32	LSEIKGVIVHRLEGV-GGFRHDSGYG
17	33	GILESRGIKARITHVDTESY-GGFRHDSGYG
			18	34	WVRDIIDDFTNESSQKT-GGFRHDSGYG
19	35	DVSTIVPYIGPALNHV-GGFRHDSGYG
			20	36	ALNIWDRFDVFCTLGATTGGYLKGNS-GGFRHDSGYG
21	37	DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-GGFRHDSGYG
			22	38	EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESC-GGFRHDSGYG
23	39	DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS-GGFRHDSGYG
			24	40	KWFKTNAPNGVDEKHRH-GGFRHDSGYG
25	41	GLQGKHADAVKAKG-GGFRHDSGYG
			26	42	GLAAGLVGMAADAMVEDVN-GGFRHDSGYG
27	43	STETGNQHHYQTRVVSNANK-GGFRHDSGYG
			28	44	STETGNQHHYQTRVVSNANK-GFRHDSGYG
29	45	STETGNQHHYQTRVVSNANK-FRHDSGY
			30	46	STETGNQHHYQTRVVSNANK-FRHDSGY
31	47	GGFRHDSGYGG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
			32	48	GGFRHDSGYG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
33	49	GGFRHDSGY-STETGNQHHYQTRVVSNANK
			34	50	FRHDSGYGG-STETGNQHHYQTRVVSNANK
35	51	FRHDSGYG-STETGNQHHYQTRVVSNANK

实施例28

抗原设计

与SEQ ID NO：44一致的、实施例28中所示的肽(表5)是一个实例，其中n为0，m为1，o为1，B为甘氨酸，C为甘氨酸，p为1，而T细胞辅助表位为SEQ ID NO：21。含抗原的组合的B细胞及T细胞表位与SEQ ID NO：44所示的肽一致。

实施例29

抗原设计

与SEQ ID NO：45一致的、实施例29中所示的肽(表5)是一个实例，其中n为0，m为1，o为0，T细胞表位通过肽键直接与B细胞相连，C为甘氨酸，p为1，而T细胞辅助表位为SEQ ID NO：21。含抗原的组合的B细胞及T细胞表位与SEQ ID NO：45所示的肽一致。

实施例30

抗原设计

与SEQ ID NO：46一致的、实施例30中所示的肽(表5)是一个实例，其中n为0，m为1，o为0，T细胞表位通过肽键直接与B细胞相连，C为甘氨酸，p为1，而T细胞辅助表位为SEQ ID NO：21。含抗原的组合的B细胞及T细胞表位与SEQ ID NO：46所示的肽一致。

实施例31-33

抗原设计

实施例31-33(表5)中所示的肽按如下式II设计：

II.(A)_n--Aβ_(4-10)--(B)_o--(Th)_m--(C)_p

其中Aβ_(4-10)只存在一个拷贝，n为2，m为1，o为2，A和B为甘氨酸，p为0，而T细胞辅助表位为SEQ ID NO：21。这些含抗原的组合的B细胞及T细胞表位与SEQ ID NO：47、48及49一致。

实施例34和35

抗原设计

实施例34(表5)中所示的肽按如下式II设计：

II.(A)_n--Aβ_(4-10)--(B)_o--(Th)_m--(C)_p

其中Aβ_(4-10)只存在一个拷贝，n为0，m为1，在实施例34中o为2，在实施例35中o为1，B为甘氨酸，p为0，而T细胞辅助表位为SEQID NO：21。这些含抗原的组合的B细胞及T细胞表位与SEQ ID NO：50和51一致。

实施例36

合成设计的肽

利用人工固相肽合成及Symphony肽合成仪，使用Fmoc保护的RinkAmide MBHA树脂、Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的氨基酸、溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中并用N-甲基吗啉(NMM)活化的联苯并三唑-1-基-N，N， N’，N四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，以及哌啶除去Fmoc基团保护，在100微摩尔水平上合成按SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51所设计的肽和对照肽，即胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)(SEQID NO：52)(第一步)。需要时，以人工方式实施Lys(Aloc)基团的选择性去保护，该步骤通过用溶于5ml CHCl₃∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)的3当量Pd(PPh₃)₄溶液处理树脂2小时来完成(第二步)。用CHCl₃(6×5mL)、二氯甲烷(DCM)中的20％HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)以及DMF(6×5mL)洗涤树脂。在某些情况下，在加入一个AEEA(氨基乙氧基乙氧基醋酸(aminoethoxyethoxyacetic acid))基团、加入醋酸或加入3-顺丁烯二酰亚丙酸(MPA)时，所述合成过程能够重新自动化(第三步)。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷及5％酚进行树脂的切割及产物的分离，然后用干冰冷却的乙醚进行沉淀(第4步)。产物利用Varian(Rainin)制备型二元HPLC系统通过制备型反相HPLC进行纯化：使用Phenomenex Luna10μ苯基-已基、21mm×25cm柱及214和254nm UV检测器(Varian DynamaxUVD II)，用30％-55％梯度洗脱液B(H.sub.20(A)中的0.045％TFA及CH₃ CN(B)中的0.045％TFA)以9.5mL/min的速度洗脱180分钟。采用装有二极管矩阵检测仪的惠普(Hewlett Packard)LCMS-1100系列分光光度计以及电喷雾离子化的RP-HPLC质谱测定纯度及分子量，其结果为95％。

实施例37

用按照式I及II设计的肽抗原免疫CRND8小鼠

实施例2中所述的TgCRND8小鼠，断奶并测定基因型以确定β-APP转基因的存在，并在标准小鼠笼中以相同性别每组2-4只小鼠饲养。小鼠自由供给食物小丸、粉末状食物及水。所有小鼠在免疫前均管理一周，记录每次免疫前一天及免疫后两天的体重。所有试验组别的性别和体重均匹配。

免疫方案及血清的分离

将与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的合成肽及对照肽，即胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)(SEQ ID NO：52)，用于免疫转基因CRND8小鼠。免疫方案和日程以前已由Schenk等人，在《Nature》，400卷，173-177页(1999)中作了描述，在此将其内容以整体引入作为参考。每组注射所用的每种肽均从冻干粉新鲜制备。免疫时，取每种肽2mg加入含0.9ml去离子水的单独容器内，将混合物混悬以将溶液混合。然后向每种肽溶液中加入100μl 10×磷酸缓冲盐(PBS)(1×PBS为0.15M NaCl、0.01磷酸钠，pH7.5)。将各溶液再次混悬，于37℃静置过夜。首次免疫时，所述肽以1∶1(v/v)比率用完全弗氏佐剂乳化，随后的增强免疫时用不完全弗氏以相同比率乳化。第一次增强免疫在起始免疫两周后进行，以后每月一次。给每只动物每次注射约100μg抗原。每个免疫组含6-10只小鼠。接下来，测定血清样品(200μl血)中的抗体滴度。血清样品于13周龄时通过后肢静脉穿刺，及25周龄于该过程停止时通过心脏穿刺来收集。样品在用于研究之前，于56℃孵育30分钟以灭活补体。在5-ml G蛋白柱上分离Ig组分。将样品上样，用PBS洗涤，用0.1M的柠檬酸钠洗脱用1M Tris缓冲。所有Ig组分在使用前均过滤除菌。

免疫结果

从用与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的合成肽及对照肽胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)(SEQ ID NO：52)免疫的小鼠，和未免疫的TgCRND8小鼠及其非转基因同窝出生仔中分离血清。

大部分小鼠均产生了对Aβ₄₂免疫原或对IAPP的明显滴度。有趣的是，在TgCRND8转基因小鼠和其非转基因同窝出生仔中未检测到抗Aβ42滴度差异。来自于Aβ₄₂所免疫小鼠的血清，能够在来自于20周龄非免疫TgCRND8小鼠的脑组织学切片染上阳性成熟Aβ蛋白斑。与此相反，来自于对照肽IAPP所免疫小鼠和未免疫小鼠的血清，不能在来自于20周龄非免疫TgCRND8小鼠的脑组织学切片染上阳性成熟Aβ蛋白斑。因此，所述结果表明，可以诱导能够识别含有Aβ的神经病理性蛋白斑并与之结合的抗体自身免疫。

实施例38

小鼠免疫血清对纤维形成的抑制

正如实施例3中所述，经过14天的孵育期后，Aβ肽将自发地聚集成纤维，这些纤维具有特征性的50-70的直径，其可由下面所述的电子显微镜检测术监测。

电子显微镜检测

Aβ₄₂在溶解于水形成10mg/ml的储备液后直接使用，或聚集成成熟淀粉样蛋白纤维后使用。在有血清及无血清、对照肽、胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)的条件下孵育Aβ₄₂，肽终浓度为100μg/ml，其中血清来自于用与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原免疫的小鼠。将各种血清的系列稀释液加到Aβ₄₂中，并于室温(RT)孵育多达2周。对于负染色电子显微术来说，碳包被的聚乙烯醇缩醛网浮于肽的水溶液之上。将网进行印迹并晾干后，样品用1％(w/v)的磷钨酸染色。在日立(Hitachi)7000电子显微镜下观察肽聚积物，工作电压为75V、放大倍数为60,000倍。

电子显微镜检测结果

为了评估免疫小鼠的血清对Aβ聚积成纤维的影响，在存在或不存在Aβ₄₂的条件下、如上所述条件将血清于37℃孵育多达14天。在第1、3、7、10及14天利用负染色电子显微术检验来自等份的各反应混合物中是否存在Aβ₄₂。

无血清或有未免疫血清时，Aβ₄₂形成长纤维(约7500)，具有特征性的50-70的直径。存在来自于IAPP免疫动物的血清时，产生的长Aβ₄₂肽减少了，但形成的纤维确实具有特征性的50-70的直径。相反，来自于与含有B细胞表位Aβ_(4-10)的SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原所免疫小鼠的血清中，虽然有少量血清效果甚微或无效，但是大部分免疫小鼠的血清能够极大地阻止纤维形成。

此外，当用未免疫小鼠的血清进行孵育时，未检测到纤维结构的差异。来自于用IAPP免疫的小鼠的血清降低了纤维形成的程度，但所形成的纤维与仅由Aβ₄₂形成的纤维类似。最后，来自用SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原所免疫小鼠的血清可不同程度地抑制纤维生成。

序列信息

		残基数目1       5         1015
D A E F R H D S G Y	Aβ<sub>42</sub>表位切割物的Maldi/ESI呈递给AB的蛋白酶产物
		D A E F R H D S G Y E V H HQ K	胰蛋白酶及Lys-C-蛋白酶表位切割片段
D A E F R H D S G Y E	金黄色葡萄球菌Glu-C蛋白酶
		D A E F R H D S G Y	α-糜蛋白酶
F R H D S G Y	α-糜蛋白酶(Y10)和氨基肽酶M(D1、A2及E3)

Aβ42

          1        5       10        15        20

25        30

(APP-672) D A E F R H D S G Y E V H H Q K L V F F A E D V

G S N K G A

          31     35        40

          I I G L M V G G V V I A-(APP-713)

<110>多伦多大学董事局

<120>治疗阿尔茨海默氏病的免疫学方法及组合物

<130>P04CA104563

<140>PCT/CA03/00502

<141>2003-04-07

<150>US 60/373,914

<151>2002-04-19

<160>52

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1               5

<210>2

<211>42

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

            20                  25                  30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

        35                  40

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>3

Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp

1               5                   10                  15

<210>4

<211>30

<212>PRT

<213>百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)

<400>4

Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala

1               5                   10                  15

Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr

            20                  25                  30

<210>5

<211>17

<212>PRT

<213>破伤风梭菌(Clostridium tetani)

<400>5

Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu

1               5                   10                  15

Leu

<210>6

<211>22

<212>PRT

<213>破伤风梭菌

<400>6

Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

1               5                   10                  15

Val Ser Ala Ser His Leu

            20

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>百日咳博德特氏菌

<400>7

Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu

1               5                   10                  15

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>破伤风梭菌

<400>8

Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu

1               5                   10                  15

Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys

            20                  25

<210>9

<211>24

<212>PRT

<213>百日咳博德特氏菌

<400>9

Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala

1               5                   10                  15

Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu

            20

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>麻疹病毒(Measles virus)

<400>10

Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val

1               5                   10                  15

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>11

Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp

1               5                   10                  15

Thr Glu Ser Tyr

            20

<210>12

<211>17

<212>PRT

<213>破伤风梭菌

<400>12

Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys

1               5                   10                  15

Thr

<210>13

<211>16

<212>PRT

<213>破伤风梭菌

<400>13

Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val

1               5                   10                  15

<210>14

<211>25

<212>PRT

<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400>14

Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala

1               5                   10                  15

Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser

            20                  25

<210>15

<211>23

<212>PRT

<213>白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

<400>15

Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Pro Gly His Gly Cys

            20

<210>16

<211>39

<212>PRT

<213>白喉棒杆菌

<400>16

Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala

1               5                   10                  15

Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala

            20                  25                  30

Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys

        35

<210>17

<211>21

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>17

Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe

1               5                   10                  15

Asn Val Val Asn Ser

            20

<210>18

<211>17

<212>PRT

<213>曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)

<400>18

Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg

1               5                   10                  15

His

<210>19

<211>14

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

<400>19

Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly

1               5                   10

<210>20

<211>19

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌

<400>20

Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu

1               5                   10                  15

Asp Val Asn

<210>21

<211>20

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌

<400>21

Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asn Ala Asn Lys

            20

<210>22

<211>16

<212>PRT

<213>智人

<400>22

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

<210>23

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>23

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu

1               5                   10

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>24

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1               5                   10

<210>25

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223>嵌合序列(chimeric sequence)

<400>25

Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly

1               5                   10                  15

Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>26

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>26

Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala

1               5                   10                  15

Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly

            20                  25                  30

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

        35                  40

<210>27

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>27

Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu

1               5                   10                  15

Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>28

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>28

Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

1               5                   10                  15

Val Ser Ala Ser His Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

<210>29

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>29

Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gly

1               5                   10                  15

Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>30

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>30

Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu

1               5                   10                  15

Gln Thr Met Val Lys Leu phe Asn Arg Ile Lys Gly Gly Phe Arg His

            20                  25                  30

Asp Ser Gly Tyr Gly

        35

<210>31

<211>34

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>31

Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala

1               5                   10                  15

Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly

            20                  25                  30

Tyr Gly

<210>32

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>32

Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly

1               5                   10                  15

Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>33

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>33

Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp

1               5                   10                  15

Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

<210>34

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>嵌合序列

<223>

<400>34

Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys

1               5                   10                  15

Thr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>35

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>35

Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val

1               5                   10                  15

Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>36

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>36

Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala

1               5                   10                  15

Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp

            20                  25                  30

Ser Gly Tyr Gly

        35

<210>37

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>37

Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

            20                  25                  30

Gly

<210>38

<211>49

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>38

Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala

1               5                   10                  15

Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala

            20                  25                  30

Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

        35                  40                  45

Gly

<210>39

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>39

Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe

1               5                   10                  15

Asn Val Val Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

<210>40

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>40

Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg

1               5                   10                  15

His Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>41

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>41

Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly Gly Gly

1               5                   10                  15

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20

<210>42

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>42

Gly Leu Ala Ala Gly Leu val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu

1               5                   10                  15

Asp Val Asn Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>43

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>43

Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asn Ala Asn Lys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

<210>44

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>44

Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asn Ala Asn Lys Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>45

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>45

Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly

            20                  25

<210>46

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>46

Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

            20                  25

<210>47

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>47

Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly

1               5                   10                  15

Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys

            20                  25                  30

<210>48

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>48

Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn

1               5                   10                  15

Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys

            20                  25                  30

<210>49

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>49

Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln

1               5                   10                  15

His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys

            20                  25

<210>50

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>50

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln

1               5                   10                  15

His  His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys

             20                  25

<210>51

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合序列

<400>51

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His

1               5                   10                  15

His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys

            20                  25

<210>52

<211>30

<212>PRT

<213>智人

<400>52

Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe

1               5                   10                  15

Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr

            20                  25                  30

Claims (19)

1.下式所示的肽：

(A)_n--(Th)_m--(B)_o--Aβ_(4-10)--(C)_p

其中A、B及C均为氨基酸残基或氨基酸残基序列；

其中n、o及p为0到20的相互独立的整数；

Th为相互独立地包含辅助性T细胞表位或其免疫增强类似物或片段的氨基酸残基序列；

当o等于0时，Th通过肽键直接与Aβ_(4-10)相连而不含任何间隔残基；

其中m为1到5的整数；和

Aβ_(4-10)为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的肽，其中Th选自以下序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：21。

3.如权利要求1所述的肽，该肽选自以下序列：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46。

4.一种肽组合物，该肽组合物包含两个或两个以上的下式所示的肽的混合物：

(A)_n--(Th)_m--(B)_o--Aβ_(4-10)--(C)_p

其中A、B及C均为氨基酸残基或氨基酸残基序列；

其中n、o及p为0到20的相互独立的整数；

Th为包含辅助性T细胞表位或其免疫增强类似物或片段的氨基酸残基序列；

当o等于0时，Th通过肽键直接与Aβ_(4-10)相连而不含任何间隔残基；

其中m为1到5的整数；和

Aβ_(4-10)为SEQ ID NO：1。

5.用于诱导产生与SEQ ID NO：2所示的淀粉样β肽特异性结合的抗体的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：

(a)抗原，该抗原包含提供有效量T细胞辅助作用的T细胞表位和由SEQ ID NO：1所示的肽构成的B细胞表位；和

(b)佐剂。

6.如权利要求5所述的组合物，其中T细胞表位选自：

(a)一个或一个以上的T细胞表位，其位于同一蛋白质骨架上的B细胞表位的N端，

(b)一个或一个以上的T细胞表位，其位于同一蛋白质骨架上的B细胞表位的C端，或

(c)一个或一个以上的T细胞表位，其位于不同的蛋白质骨架上，该蛋白质骨架通过共价键与含有所述B细胞表位的蛋白质骨架相连。

7.如权利要求5所述组合物，其中所述T细胞表位具有选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。

8.如权利要求5所述组合物，其中所述佐剂包含选自以下一种或多种物质：氢氧化铝、磷酸铝、皂甙、奎乐A、奎乐A/免疫刺激复合物、二甲基双十八烷基溴化铵/艾卫定、聚阴离子、弗氏完全佐剂、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺、弗氏不完全佐剂或脂质体。

9.权利要求5-8中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的药物中的应用。

10.权利要求5-8中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于减少患有阿尔茨海默氏病的个体的脑内淀粉样蛋白沉积量的药物中的应用。

11.权利要求5-8中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于使患有阿尔茨海默氏病的个体的脑内淀粉样蛋白纤维解聚的药物中的应用。

12.能与SEQ ID NO：1所示的肽结合的分离的抗体或其抗原结合片段。

13.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段抑制淀粉样蛋白的沉积。

14.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段使淀粉样蛋白纤维解聚。

15.识别SEQ ID NO：1所示的肽并与之结合的抗体组合物在制备用于治疗患有阿尔茨海默氏病的个体的药物中的应用。

16.如权利要求15所述的应用，其中所述抗体组合物包含多克隆抗体。

17.如权利要求15所述的应用，其中所述抗体组合物包含单克隆抗体。

18.检测化合物是否为淀粉样蛋白沉积及纤维形成的抑制剂的方法，该方法包括：

(i)将化合物与SEQ ID NO：1所示的肽接触；和

(ii)检测化合物与该肽的结合。

19.如权利要求18所述方法，该方法还包括评价所述化合物是否在体外抑制淀粉样蛋白纤维的形成。