KR20040108747A - 알쯔하이머병의 치료를 위한 면역학적 방법 및 조성물 - Google Patents

알쯔하이머병의 치료를 위한 면역학적 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아밀로이드 펩타이드 Abeta42의 잔기 4-10(FRHDSGY)을 포함하는 면역성 조성물 및 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Abeta(4-10)항원성 결정기에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 알쯔하이머병을 치료하는 방법 및 알쯔하이머 환자에서 아밀로이드 적재량(load)을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 아밀로이드 침착의 소분자 억제제(small molecule inhibitor)를 설계하는 방법을 제공한다.

Description

알쯔하이머병의 치료를 위한 면역학적 방법 및 조성물{IMMUNOLOGICAL METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE}
알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 노인들 중에서 치매의 주요 원인인 신경변성 뇌 질환이다. AD의 증상은 학습 및 기억 기능의 진행성 손실, 성격 변화, 신경근(neuromuscule)의 변화, 발작 및 종종 정신병적 행동을 포함할 수 있다.
알쯔하이머병은 2가지의 특유의 신경 병리학적 특징, 즉 기억 및 기타 인지 기능에 중요한 뇌의 구역에서 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 침착(deposition) 및 신경 세포내에 신경 원섬유성 엉킴(neurofibrillary tangle)의 발생에 의해 특징이어 진다. 이는 뇌의 중요한 구역에서의 아밀로이드 플라크의 침착이 뇌의 작용을 방해하는 것으로 생각된다. 유사하게는, AD 환자의 신경 세포 내에서 축적되는 신경 원섬유 엉킴이 뉴런 대 뉴런의 신경 통신(neuron toneuron communication)을 방해한다는 것이 제안되어 있다.
알쯔하이머병의 또 다른 특징은 아밀로이드 플라크의 주요 성분으로서 소수성 아밀로이드-베타 펩타이드(Abeta42)가 존재한다는 것이다. 아밀로이드-베타 펩타이드(Abeta42)는 아밀로이드 단백질 전구체(APP)로 공지되거나 다르게는 알쯔하이머병 아밀로이드 A4 단백질로서 공지된 정상적인 내재성 막단백질(integral membrane protein)의 단백질 분해성 가공(proteolytic processing)으로부터 형성된 단편이다.
아밀로이드-베타 펩타이드(Abeta)는 APP로부터 가공된 39 내지 43개의 아미노산 길이의 펩타이드의 군을 포함한다(문헌[Pallitto et al., Biochemistry 38: 3570-3578, 1999] 참조). 전체 Abeta 펩타이드가 친양쪽성 특징을 가질 수 있을 지라도, Abeta 펩타이드는 일반적으로 APP 막횡단 영역(transmembrane region)의 11 내지 15개의 잔기를 포함하여, 소수성 영역을 포함한다(문헌[Kang et al., Nature 325: 733-736, 1987] 참조). Abeta 펩타이드는 배양시에 세포에 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(문헌[Pike et al., Eur. J. Pharmacol. 207: 367-368, 1991] 및 문헌[Iversen et al., Biochem. J. 311: 1-16, 1995] 참조). 알쯔하이머병에서 Abeta 펩타이드의 독성은 불용성 원섬유로의 가용성 Abeta 펩타이드의 응집(aggregation) 및 그 결과로서 아밀로이드 플라크로의 원섬유의 혼입(incorporation) 과정에 관련이 있는 것으로 생각된다(문헌[Pike et al., Eur. J. Pharmacol. 207: 367-368, 1991], 문헌[Pike et al., Brain Research, 563: 311-314, 1991] 및 문헌[Pike et al., J. Neurosci. 13: 1676-1687, 1993] 참조). 유사하게는, Abeta 펩타이드는 원섬유를 시험관내(in vitro) 형성할 것이고, 이 과정은 Abeta 응집 및 원섬유 형성의 억제를 측정하는데 사용될 수 있다.
이전에 보고된 바와 같이, 몇몇 그룹은 알쯔하이머병에 대한 형질전환 생쥐 모델을 사용하였으며, 이때 뇌에서의 아밀로이드 침착 및 인지 결함(cognitive defect) 둘다를 나타내는 형질전환 생쥐는 Abeta42항원 제제로 면역화되었다. 이들 연구로부터의 결과는, Abeta42에 의한 면역화는 생쥐의 알쯔하이머병형 신경 병리상태 및 공간 기억 장애 둘다를 감소시킬 수 있음을 증명하였다(문헌[Schenk et al., Nature 400: 173-177, 1999], 문헌[Bard et al., Nature Medicine 6: 916-919, 2000], 문헌[Janus et al., Nature 408: 979-982, 2000] 및 문헌[Morgan et al., Nature 408: 982-982, 2000] 참조). 바드(Bard) 등은 Abeta42백신에 의한 면역화가 소신경교세포(microglia)의 활성화 및 소신경교세포에 의한 Abeta42응집체(aggregate)의 후속적인 함입을 유도한다는 것을 가정하였다(문헌[Bard et al., Nature Medicine 6: 916-919, 2000]). 불행히도, 아밀로이드 플라크의 침착에서의 감소 및 개선된 인지 기능의 기초가 되는 거의 모든 면역학적 기작이 밝혀져 있지 않았다.
에피토프가 각각 Abeta 잔기 1-5 및 3-6인 항체 3D6 및 10D5의 수동적인 투여에 관한 이전 연구는 형질전환 생쥐에서의 Abeta 및 아밀로이드 플라크 적재량 둘다를 감소시키는 데 효과적이었다(문헌[Bard et al., Nature Medicine 6: 916-919, 2000] 참조). 생쥐는 혈소판-유래(PD) 성장 인자 프로모터의 조절을 받는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 질환-연관 돌연변이 형태에 있어서 형질전환성이다. 이들 (PDAPP) 생쥐는 인간 아밀로이드 전구체 단백질을 과대 발현시키고, 많은 알쯔하이머병의 병리학적 증상을 나타낸다(문헌[Bard et al., Nature Medicine 6: 916-919, 2000]참조).
다른 연구에서, Abeta의 잔기 13 내지 28에 대한 항체인 m266의 말초성 투여는 PDAPP 생쥐에서의 플라즈마 제거(plasma clearance)를 통해 뇌 Abeta 적재량을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Demattos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8850-8855, 2001] 참조). m266 항체는 Abeta 올리고머, 원형 원섬유(protofibril) 및 플라크에 대한 상이한 결합 특이성, 또는 CNS에 대한 차별적인 접근법을 나타낼 수 있는 Abeta의 2차 면역학적 부위를 표적으로 한다.
Abeta42항원 및 APP는 자가 단백질(self protein)이고, 따라서 이들 단백질을 발현하는 개인에서는 정상적으로 면역 유발성이 아니다. 결과적으로, 이들 항원에 기초한 백신을 제조하려는 노력은 필수적으로 가자항원성(autoimmunity)을 유도하는 것을 요구한다. 또한, 자가항원성을 유도하려고 시도한 임의의 면역화 프로토콜에서는 이 같은 자가항원(autoantigen)에 의해 유도된 면역 반응을 조심스럽게 검토해야 한다. 이 경우에, Abeta42또는 Abeta42의 성분을 혼입시키는 임의의자가항원이 정상적인 APP 단백질에 대해 자가면역성을 유도하지 않고, 이의 정상적인 세포성 기능을 혼란시키지 않는 것이 중요하다.
AD를 치료하기 위한 효과적인 면역치료학적 방법을 개발하기 위해, Abeta42형 항원에 의한 면역화 이후에 아밀로이드 플라크 적재량이 면역-중재적으로 감소하는 면역학적 기작을 결정하는 것이 바람직할 수 있다.
아밀로이드 플라크 감소에 관한 기작의 지식을 이용하여 유리한 생물 활성을 갖는 이들 에피토프만을 혼입시키는 면역성 조성물 및 항원을 설계하는 것이 유리할 수 있다. 추가적인 이점은, 이같은 면역성 조성물이 해로운 면역성을 유도하는 이들 에피토프를 제외하도록 설계될 수 있다는 것이다. 따라서, 오직 Abeta 항원의 변이형에 대해서만 매우 특이적이고 제한된 면역 반응을 유도하는 한정된 항원에 대한 요구가 존재한다.
오직 Abeta 항원의 병원성 형태에 대해서만 매우 특이적이고 제한된 면역 반응을 유도하도록 면역치료에 사용될 수 있는 한정된 항원을 포함하는 면역성 조성물에 대한 요구가 또한 존재한다. 또한, 수동적인 면역치료에 사용하기 위한 유리한 생물학적 특성을 갖는 한정된 Abeta 에피토프에 대한 항원을 단리하는 것이 유리할 수 있다. 가능한 한 치료가 시작된 후에 알쯔하이머병 환자가 Abeta 항원의 면역성 조성물에 의한 치료로부터 도움이 될 것인지를 결정하는 진단 분석법을 개발하는 것이 또한 유리할 수 있다. 아밀로이드 침착 및 원섬유 형성의 억제제를 확인하기 위한 추가적인 요구가 또한 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 아밀로이드 펩타이드 Abeta42(서열번호 2)의 잔기 4-10(서열번호 1)(Abeta(4-10)으로도 공지됨)을 포함하는 면역성 조성물을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다. 본 발명의 항원 및 면역성 조성물은 알쯔하이머병을 치료하고 아밀로이드 침착의 소분자(small molecule) 억제제를 설계하는데 유용하고, 진단 시약으로서 유용하다. 본 발명은 Abeta(4-10)항원성 결정기에 결합하는 항체를 추가로 제공한다. 본 발명의 면역성 조성물 및 항체는 또한 알쯔하이머 환자에서의 아밀로이드 적재량을 감소시킴으로써 알쯔하이머병의 증상을 완화시키는 방법에서 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드를 제공한다:
(A)n-- (Th)m-- (B)o-- Abeta(4-10)-- (C)p
상기 식에서,
A, B 및 C는 각각 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 서열이고,
n, o 및 p는 독립적으로 0 내지 약 20 범위의 정수이고,
Th는 독립적으로 보조 T 세포 에피토프(helper T cell epitope), 또는 면역 증강 유사체 또는 이의 단편을 포함하는 아미노산 잔기의 서열이고,
o가 0인 경우에 Th는 임의의 스페이서(spacer) 잔기없이 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고,
m은 1 내지 약 5의 정수이고,
Abeta(4-10)는 서열번호 1의 아미노산, 또는 연속적인 아미노산 치환체를 포함하는 이의 유사체이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 보조 T 세포(T-cell help)의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원; 및 보강제를 포함하는 것으로, 아밀로이드-베타펩타이드(서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체를 유도하기 위한 면역성 조성물을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 보조 T 세포의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원; 및 보강제를 포함하는 것으로, 아밀로이드-베타펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하기 위한 면역성 조성물을 제공하며, 이때 T-세포 에피토프는 (a) 동일한 단백질 골격(protein backbone) 상에서 B-세포 에피토프의 N-말단에 위치하는 하나 이상의 T-세포 에피토프, (b) 동일한 단백질 골격 상에서 B-세포 에피토프의 C-말단에 위치하는 하나 이상의 T-세포 에피토프, 및 (c) B-세포 에피토프를 포함하는 단백질 골격에 공유결합을 통해 부착되는 상이한 단백질 골격 상에 위치하는 하나 이상의 T-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 B-세포 에피토프 및 T-세포 에피토프를 갖는 면역성 조성물을 제공하며, 이때 T-세포 에피토프는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 항원 및 보강제를 포함하는 면역성 조성물을 제공하며, 이때 상기 보강제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 퀼 A, 퀼 A/ISCOM, 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드/아비딘, 다중음이온, 프로인트 완전 보강제, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민, 프로인트 불완전 보강제 및 리포좀으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 보조 T 세포의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-10)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원; 및 (b) 보강제를 포함하며, 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 또한 (a) 보조 T 세포의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-10)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원; 및 (b) 보강제를 포함하며, 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인의 뇌에서 아밀로이드 침착물의 양을 감소시키는 방법을 제공한다.
부가적인 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 보조 T 세포의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-10)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원; 및 (b) 보강제를 포함하며, 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인의 뇌에서 아밀로이드 원섬유를 분해시키는 방법을 제공한다.
추가적인 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아밀로이드 침착을 억제한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)에 결합할 수있는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아밀로이드 원섬유를 분해시킨다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)을 인식하고 결합하는 항체 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)을 인식하고 결합하는 항체 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법을 제공하며, 이때 항체 조성물은 다클론성 항체를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)을 인식하고 결합하는 항체 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법을 제공하며, 이때 항체 조성물은 단일클론성 항체를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)과 화합물을 접촉시키는 단계, 및 펩타이드와의 화합물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 것으로, 화합물이 아밀로이드 침착 및 원섬유 형성의 억제제인지를 결정하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 화합물이 아밀로이드 원섬유 형성을 시험관내 억제하는 지를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)에 대한 면역 반응의 발생을 모니터링하는 단계를 포함하는 것으로, 알쯔하이머병에 대한 능동 면역화 치료의 효능을 예상하는 진단 방법을 제공하며, 이때 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)에 대한 수동 면역 반응은 치료가 연속적일 수 있음을 나타내고, 면역 반응의 부재 및 매우 약한 면역 반응은 치료가 불연속적일 수 있음을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 항원 및 보강제를 포함하는 면역성 조성물을 제공하며, 이때 상기 항원은 보조 T 세포의 유효량을 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호 1)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하고, 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에 위치한 면역 표적물에 결합하는 항체를 유도하기 위한 효과적인 단백질의 구조적인 상황(protein structural context)을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에서 발견되는 바와 같이 면역 표적물의 2차 구조적인 모방(secondary structural mimicry)을 제공하는 B-세포 에피토프의 단백질의 구조적인 상황이 베타-시트(beta-sheet), 역회전(reverse turn), 나선(helix), 랜덤 코일(random coil) 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 B-세포 에피토프를 포함하는 항원을 제공한다. 특정한 추가의 실시태양에서, 항원은 펩타이드 Abeta(4-l0)(서열번호:1)의 모방체를 포함하는 B-세포 에피토프를 포함한다.
본 발명은 알쯔하이머병을 치료하기 위한 면역학적 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 형성을 억제하고/하거나, 알쯔하이머병 및 기타 신경변성 질환(neuro-degenerative disease)과 관련된 존재하는 아밀로이드 플라크를 제거하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
정의
달리 언급되지 않는 한, 하기 용어는 하기의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
보강제(adjuvant)
보강제는 항원과 조합하여, 면역성 조성물 중의 항원의 면역성을 증가시키는 물질의 혼합물일 수 있는 물질을 지칭한다. 보강제는 면역계에서 직접 작용하여, 항원의 느린 방출을 제공함으로써 항원에 대한 면역 반응을 증가시키도록 작용한다.
아밀로이드-베타 펩타이드(Abeta)
아밀로이드-베타 펩타이드(Abeta)는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 가공되는 39 내지 43개의 아미노산 잔기의 펩타이드의 그룹 중 임의의 펩타이드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, Abeta42는 42개 아미노산 잔기 Abeta 펩타이드를 지칭한다. 또한, Abeta(4-10)은 Abeta42의 4번째에서 내지 10번째 잔기까지의 7개의 아미노산 잔기 펩타이드를 지칭한다. 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, APP 유전자는 대체 스플라이싱(alternative splicing)을 겪어 770개의 아미노산(APP770), 751개의 아미노산(APP751) 및 695개의 아미노산(APP695)을 포함하는 3개의 일반적인 아이소폼(isoforms)을 생성한다. 규정에 따라, 가장 긴 아이소폼인 APP770의 코돈 넘버링(codon numbering)은 보다 짧은 아이소폼의 코돈 위치를 지칭하는 경우에 사용된다.
항원
본 발명의 항원은 보조 T-세포 에피토프 및 B-세포 에피토프의 조합이다. 보조 T-세포 에피토프는 동일한 폴리펩타이드 골격 상의 B-세포 에피토프의 N-말단 및 C-말단에 위치할 수 있다. T-세포 에피토프는, 예를 들어 작은 폴리펩타이드가 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 같은 담체 분자에 공유 결합되어 면역성을 제공하는 경우와 같이, B 세포 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드에 공유결합적으로 부착된 상이한 폴리펩타이드 골격 상에 위치할 수도 있다. 다르게는, T 세포 에피토프는 보강제와 함께 T 및 B 세포 에피토프를 조합함으로써 B-세포 에피토프와 비공유 결합적으로 회합될 수 있다.
항원 프로세싱(processing)
항원 프로세싱은 박테리아, 바이러스 또는 면역성 조성물로부터의 세포외 항원이 엔도시토시스 또는 식작용에 의해 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의해 흡수되는 과정을 지칭한다. 후속적으로, 항원은 엔도솜(endosome) 또는 라이소솜(lysosome)에 의해 단편화되고, 펩타이드 단편은 MHC I형 및 MHC II형 분자의 결합 홈(binding cleft)에 적재된다.
항원 제시(antigen presentation)
항원 제시는 MHC I형 및 MHC II형 분자가 짧고 프로세싱된 펩타이드와 결합하여, T 세포 수용기에 의해 중재되는 상호작용을 통해 T 세포에 의해 스크린닝하기 위한 세포 표면 상에 이들 펩타이드를 제시하는 과정을 지칭한다.
B-세포 에피토프
B-세포 에피토프는 항체 결합의 표적물이고 항원 결정기로도 공지된 항원의 일부를 지칭한다. 단백질 항원성 결정기에 있어서, B-세포 에피토프는 일반적으로 원형 구조(native structure)에 상응하는 특정한 3차원 배치의 아미노산 잔기를 지칭한다. T-세포 에피토프와는 달리, B-세포 에피토프는 단백질 형태에 대해 매우 민감할 수 있다.
유효량
유효량은 한정된 치료 목표 중 임의의 목표를 달성하는 본 발명의 면역성 조성물, 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 지칭한다. 유효량은 또한 조성물, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 예방 및 치료학적 용도 둘다를 포함하는 것으로 의도된다.
보조 T-세포 에피토프
보조 T-세포 에피토프(Th 에피토프)는 MHC II형 분자에 결합하고, 항원에 대한 항체 반응을 발생하기 위해 CD4+ T 세포를 활성화시켜 사이토카인의 형태로 B-세포에 보조를 제공하도록 작용하는 펩타이드이다. MHC II형 분자는, 특히 세포외 환경과 통신하는 세포성 구역에서 약 7 내지 약 30개의 잔기 길이의 프로세싱된 펩타이드 단편과 함께 적재된다. 따라서, 보조 T 세포 에피토프는 일반적으로 외래 단백질 단편을 나타낸다.
면역 표적물
면역 표적물은 아밀로이드 침착물에서의 실제 3차원 에피토프(원형), 또는 항원내의 B-세포 에피토프가 모방하려고 하는 순환하는 Abeta 펩타이드를 지칭한다. 항-단백질 항체는 일반적으로 특정한 2차 구조에서 아미노산의 특정한 서열에 특이적이다. 이상적으로, 에피토프의 항원 모방체에 대한 항체를 유도하면, 항체가 병리학적 아밀로이드 침착 또는 순환하는 Abeta 펩타이드에서 나타나는 바와 같이 원형 에피토프를 인식하여 결합하는 항체를 생산한다.
면역원
면역원은 항원성인 것으로 입증된 항원을 지칭한다.
항원성
항원성은 면역 반응을 유발시키는 항원의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 항원은 면역 유발성이 되기 위해 항원 제시 세포와 회합되어야 한다. 항원의 크기, 구조, 서열, 외래성의 정도, 보강제의 존재, 환자의 면역 조건을 비롯한 많은 인자 뿐만 아니라, 기타 유전적인 인자가 면역성에 영향을 미친다.
펩타이드
펩타이드는 함께 결합된 적은 수, 일반적으로 2 이상의 아미노산을 지칭한다.
폴리펩타이드
폴리펩타이드는 함께 결합된 아미노산의 보다 긴 쇄를 지칭하지만, 서열 및 길이는 일반적으로 제한되지 않는다. “단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드”란 용어는 종종 서로 교환가능하게 사용될 것이다.
난교성(Promiscuous) 보조 T 세포 에피토프
난교성 보조 T 세포 에피토프는 다양한 MHC 일배체형(haplotype), 즉 유전적으로 상이한 군집을 발현하는 수많은 개인에서 T 세포 활성화 반응(T 세포 보조)을 유도할 수 있는 보조 T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 같은 Th 에피토프는 이종의 군집의 많은 상이한 개인에서 작용하여, 난교성 Th 에피토프로서 고려된다.
단백질 또는 폴리펩타이드 골격
단백질 또는 폴리펩타이드 골격은 단백질 서열의 일부로서 아미노산을 나타내는 반복 단위를 지칭한다. 폴리펩타이드 골격은 -N-C-C-로서 일반적으로 표시될 수 있는 3개의 원자, 즉 아미드 질소(N-H), 알파-탄소(C) 및 카보닐 탄소(C=O)의 서열로 이루어진다.
단백질
단백질은 일반적으로 한정된 서열, 길이 및 폴딩(folding)된 형태를 갖는 아미노산의 특정한 쇄를 지칭하지만, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 종종 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
치료 또는 치료하기
치료 또는 치료하기는 (1) 아직까지 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태를 갖는 것으로 진단되지 않는 개체에서 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태가 발생하지 않도록 예방하거나, (2) 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태를 억제하는, 즉 이들의 발전을 저지하거나, 또는 (3) 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태를 개선시키거나 완화시키는, 즉 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태의 퇴화(regression)를 야기하는 목적을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 아밀로이드 플라크 침착물의 면역-중재 감소 및인지 기능에서의 상응하는 개선은 Abeta42에서 특정한 면역 표적물 또는 B-세포 에피토프에 대한 특정한 항체 반응에 의해 중재될 수 있다는 본 발명자에 의한 발견으로부터 유래한다. 이러한 중요한 면역 표적물은 가장 긴 아이소폼인 APP770의 코돈 넘버링에 따라 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 675 내지 681번째 잔기에 상응하는 Abeta42의 4 내지 10번째 잔기(FRHDSGY)(서열번호 1)로서 본 발명자에 의해 확인되었다. 결과적으로, 본 발명자들은 Abeta42형 항원에 의한 면역화 이후에 아밀로이드 플라크 적재량의 면역-중재 감소의 중요한 면역학적 기작을 규명하였다.
본 발명자들은 Abeta42의 4 내지 10번째 잔기(FRHDSGY)(서열번호 1)를 인식하여 결합하는 항체가 Abeta-원섬유 형성 및 Abeta 신경독성을 억제한다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 Abeta42의 4 내지 10번째 잔기(FRHDSGY)(서열번호 1)를 인식하여 결합하는 항체가 Abeta42의 이미-형성된 원섬유를 분해한다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명은 Abeta42에 의한 면역화 동안에 생성된 항체가 Abeta에 의해 규명된 시험관내 세포 사멸을 억제함을 개시하고 있다.
인간 AD에 대한 모델로서 TgCRND8 생쥐를 사용하여 본 발명을 수행하였다. TgCRND8 생쥐가 프리온(prion) 단백질 프로모터의 조절을 받는 인간 이중 돌연변이형 APP695형질전환유전자(transgene)를 갖고 있고, 진행성 인지 장애에 의해 동반되는 대뇌 피질(cerebral cortex)에서의 Abeta42펩타이드 및 신견염성(neuritic)아밀로이드 플라크의 진행성 축적(AD의 신경병리학적 중요 특징)을 나타내기 때문에 TgCRND8 생쥐는 AD에 대한 모델로서 유용하다(문헌[Chishti et al., J. Biol. Chem., 276: 21562-57, 2001] 참조).
본 발명은 Abeta42의 원형 원섬유 형태에 의한 C57BL6 x C3H 생쥐의 면역화 동안에 생산되는 Abeta의 N-말단 펩타이드에 특이적으로 관련되어 있는 항체를 제공한다. 본 발명은 알쯔하이머병에 대한 보호 면역에 중요한 에피토프를 나타내는 Abeta(4-10)에 상응하는 Abeta 서열 FRHDSGY (서열번호 1)을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 알쯔하이머병에 걸린 환자에서 유리한 보호 면역을 생성하는 면역 표적물로서 Abeta(4-10)에피토프를 확인한다.
항원 제시
항원 제시는 단백질 항원이 흡수되어, 항원 제시 세포(APC)에 의해 스포세싱되는 분자 및 세포성 사건을 지칭한다. 이어, 프로세싱된 항원 단편은 효과기 세포(effector cell)에 제시되며, 이는 후속적으로 활성화되어 면역반응을 개시한다. 대부분의 활성 항원 제시 세포는 대식세포(단성구로부터의 직접적인 발생 생성물임), 수지상 세포(dendritic cell) 및 특정 B 세포로서 특징이어 진다.
항원 제시 및 면역 반응 과정에서의 중요한 분자적 역할자는 주요 조직적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC)로서 공지된 영역에서 염색체적으로 암호화된 다형 유전자 부류(polymorphous gene family)인 MHC 분자이다. 인간에서의 MHC I형 및 II형 분자는 HLA(인간 백혈구 항원) 분자로서 명명되어 있다. 특정한 MHC 분자는 세포의 표면 상에 독특한 분자 단편을 제시하고, T 세포 및 기타 면역계 효과기 세포에 의한 이들의 인식을 조장하도록 작용한다(문헌[D. H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", pp. 263-285 in Fundamental Immunology, Fourth Edition, Edited by W. F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA, 1999] 참조). 또한 MHC I형 및 II형 분자는 항원 제시 세포에서 펩타이드를 결합시켜, T 세포의 표면 상의 αβ T 세포 수용체와 상호작용하도록 작용한다.
더욱 구체적으로는, MHC I형 분자는 내생성 세포질성 단백질, 새로이 번역된 바이러스 및 종양 항원을 비롯한 세포 자신의 펩타이드의 샘플에 결합하여 이들을 제시한다. MHC I형 분자는 일반적으로 CD8+ 세포독성 T 세포에 의해 인식되는 약 7 내지 16개의 잔기 길이의 펩타이드를 제시한다. MHC I형 분자는 바이러스에 의해 감염된 세포가 살해되는 세포독성 T 세포 반응에 영향을 주는 것과 관련이 있다.
본 발명은 우선적으로 항원에 대한 항체의 반응을 생성하는데 있어서 B 세포에 보조를 제공할 수 있는 CD4+ T 세포를 활성화시키도록 작용하는 T 세포 에피토프에 관한 것이다. 보조 T-세포 에피토프(Th 에피토프)는 세포외 환경과 통신하는 세포성 구획에서 약 7 내지 약 30개의 잔기 길이의 프로세싱된 펩타이드 단편으로 적재된 MHC II형 분자에 결합한다(문헌[D. H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", pp. 263-285 in Fundamental Immunology, FourthEdition, Edited by W. F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA, 1999 (Margulies)] 참조). 더욱 구체적으로는, MHC II형 분자는 항원 제시 세포에 의해 인접한 세포외 환경으로부터 섭취된 펩타이드의 샘플에 결합하여 CD4+ T 세포에 제시한다. 이어, CD4+ T 세포가 활성화되고, 이어 항체를 생산하기 위해 사이토카인의 형태로 B 세포에 보조를 제공한다. 인간에서, MHC II형 분자는 다양한 유전적으로 암호화된 대립 유전자(genetically coded allele)에서 발생하는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 분자를 포함한다.
본 발명의 면역성 조성물은 프로세싱되어 MHC 분자에 의해 단백질 또는 펩타이드 단편으로서 소위 “항원 제시 세포”의 표면 상에 제시되어, 효과기 세포로서 CD4+ T-림프구에 의해 인식되는 B-세포 에피토프 및 T-세포 에피토프를 갖는 항원을 포함한다.
효과적인 면역감시(immunosurveillance)를 확보하기 위해, MHC 분자가 가능한 한 넓은 항원성 펩타이드의 스펙트럼을 제시할 수 있도록 MHC 분자의 생리기능을 설계한다. 결과적으로, 항원 제시 세포의 세포 표면 상의 한정된 항원성 펩타이드의 복제수(copy number)는 매우 낮다(한정된 항원성 펩타이드의 크기 102는 약 105펩타이드 수용체의 총 군집을 나타냄). 이는 MHC 분자에 결합된 항원성 펩타이드(펩타이드 리간드)의 매우 이종성인 혼합물이 항원 제시 세포의 세포 표면 상에 노출된다는 것을 의미한다.
“T-세포 에피토프”란 용어는 MHC II형 분자의 결합 포켓(binding pocket)에서의 항원의 프로세싱 및 펩타이드의 제시 이후에 CD4+ T 보조(Th) 림프구를 활성화시키는 단백질의 서열을 지칭한다. T 세포의 표면 상의 알파/베타 T 세포 수용체는 활성화를 위한 자극으로서 작용하는 펩타이드 MHC II형 복합체와 상호작용한다. 결과적으로, T 세포 에피토프의 원형 구조는 중요하지 않지만, 1차 서열, 및 특정한 MHC 분자에 결합하는 능력이 중요하다.
본 발명은 아밀로이드 플라크 및 원섬유에서 발견되는 것과 같은 Abeta의 병리학적 형태에 대한 항체를 유도할 수 있는 펩타이드, 바람직하게는 합성 펩타이드에 관한 것이다.
펩타이드의 면역성은 펩타이드내의 "B-세포 에피토프" 또는 "항원성 결정기"를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체를 포함하는 항체 반응을 유도하는 펩타이드의 능력을 지칭한다(문헌[R. N. Germain,"Antigen Processing and Presentation", pp. 287-340 in Fundamental Immunology, Fourth Edition, Edited by W. F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA, 1999(이하, Germain으로 지칭됨)] 참조). 항원성이 되기 위해, B-세포 에피토프를 포함하는 펩타이드는 MHC II형 항원 또는 II형 T 세포 에피토프와 함께 제시되어야 한다. T-세포 에피토프는 일반적으로 항원 제시 세포에 의한 항원 프로세싱 동안에 면역원으로부터 프로세싱되고, 이어 서열 특이적인 방식으로 MHC II형 분자에 결합한다(상기 문헌[Germain] 참조) 이러한 MHC II형 T 세포 에피토프 복합체는 CD4+ T-림프구(Th 세포)에 의해 인식된다. Th 세포는 제시된 면역원으로부터 회합된 B 세포 에피토프를 인식할 수 있는 항체 분자를 생산하는 특정한 B 세포의 증식(proliferation)을 야기하는 능력을 갖는다.따라서, 특정 B 세포 에피토프에 대해 특이적인 항체의 생산은 면역원 내부의 T 세포 에피토프의 존재 또는 면역원과 회합된 T 세포 에피토프의 존재와 연결된다.
항원이 외래 단백질이 아닌 경우에 다른 복잡한 문제가 발생한다. Abeta가 자신의 분자이기 때문에, 림프구 활성화를 유도하여, 자신에 대한 항체 반응을 유도하는 임의의 Th 에피토프를 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 외래 T 세포 에피토프는 파상풍(tetanus) 독소, 백일해(pertussis) 독소, 홍역(measles) 바이러스 F 단백질 및 B형 감염 바이러스 표면 항원(HBsAg) 등을 포함하는 강력한 외래 면역원으로부터 유래된 특정한 서열을 포함함으로써 제공되어야 한다. 이 같은 T 세포 에피토프 서열은 Abeta(4-l0)펩타이드인 B-세포 에피토프와 동일한 단백질 골격 상에 포함될 수 있다. T 세포 에피토프의 위치는 B-세포 에피토프의 N-말단 또는 B-세포 에피토프의 C-말단일 수 있다. 다르게는, T 세포 에피토프는 B-세포 에피토프를 포함하는 펩타이드와 공유결합될 수 있거나 공유결합될 수 없는 담체 분자로서 공지된 개개의 단백질 골격 상에 제공될 수 있다.
부가적인 T 세포 에피토프는 당해 기술분야에 널리 공지된 하기 방법, 예를 들어 문헌[Rudensky et al., Nature 353: 622-627, 1991, 문헌[Chicz et al., Nature 358: 764-768, 1992] 및 문헌[Hunt et al., Science 256: 1817-1820, 1992]에 개시된 바와 같은 면역친화성-정제된(immunoaffinity-purified) II형 분자로부터의 MHC II형 결합형 펩타이드의 산 용출(acid elution) 및 질량 분광법 시퀀싱(sequencing)에 의해 선별될 수 있으며, 이들 개시문헌은 본원에서 전체가 참고로인용된다.
이상적으로, 선별된 Th 에피토프는 바람직하게는 상이한 MHC 단상형(haplotype)을 발현하는 수많은 개인에서 T 세포 활성화 반응(T 세포 보조)을 유도할 수 있다. 이는 이종의 군집의 많은 상이한 개인에서 이들 에피토프가 작용하고, 난교성 Th 에피토프로서 간주됨을 의미한다. 난교성 Th 에피토프는 유전적으로 상이한 군집 대부분에서 강력한 항-Abeta 항체 반응을 유도하는 이점을 제공한다.
본 발명의 보조 T 에피토프는 주어진 군집 대부분에서 면역 반응을 야기하는 능력 뿐만 아니라, 기억/회상 반응(memory/recall response)을 야기하는 능력으로 인해 선별된다. Abeta 면역치료를 받고 있는 거의 대부분의 인간 환자는 이미 홍역, 이하선염(mumps), 풍진(rubella), 디프테리아(diphtheria), 백일해 및 파상풍의 소아용 백신으로 면역화되어 있을 것이다. 따라서, 이들 환자는 이전에 면역원 혼합물에 존재하는 Th 에피토프 중 하나 이상에 노출되었다. 표준 백신에 의한 면역화를 통한 Th 에피토프에 대한 전 노출이 즉시 반응할 수 있고 항체 반응에 보조를 제공하는 Th 세포 클론을 확립할 수 있기 때문에 이같은 전 노출(prior exposure)이 유용할 수 있다.
보조 T-세포 에피토프는 Th 에피토프를 포함하는 아미노산(천연 또는 비천연 아미노산)의 서열이다. 보조 T-세포 에피토프는 연속 또는 불연속 에피토프로 이루어질 수 있다. 따라서, 보조 T-세포 에피토프의 모든 아미노산 잔기가 목적하는 에피토프의 일부는 아니다. 따라서, Th 에피토프의 유사체 또는 절편을 포함하는Th 에피토프는 Abeta에 대해 면역 반응을 증강시키거나 자극할 수 있다. 면역우성형(immunodominant) 보조 T-세포 에피토프는 매우 다양한 MHC 유형을 갖는 동물 및 인간 군집에서 광범위하게 반응성이다(문헌[Celis et al. J. Immunol. 140: 1808-1815, 1988], 문헌[Demotz et al. J. Immunol. 142: 394-402, 1989] 및 문헌[Chong et al. Infect. Immun. 60: 4640-4647, 1992] 참조). 청구주제인 펩타이드(subject peptide)의 보조 T-세포 에피토프는 약 10 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 10 내지 약 40개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 약 10 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 또는 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 15개의 아미노산 잔기를 갖는다. 다중 보조 T-세포 에피토프가 존재하는 경우(즉, n이 2 초과임), 각각의 보조 T-세포 에피토프는 독립적으로 동일하거나 상이하다.
보조 T-세포 에피토프는 유사체, 및 보조 T-세포 에피토프에서의 1 내지 약 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 보조 T-세포 에피토프 절편은 Abeta에 대한 면역 반응을 증강시키거나 자극하기에 충분한 보조 T-세포 에피토프의 연속적인 일부이다. 보조 T-세포 에피토프는 하나 이상의 스페이서 아미노산 잔기에 의해 B-세포 에피토프로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 Th 에피토프는 B형 간염 표면 항원 보조 T 세포 에피토프 (HBTh), 백일해 독소 보조 T 세포 에피토프(PT-Th), 파상풍 독소 보조 T 세포 에피토프(TT-Th), 홍역 바이러스 F 단백질 보조 T 세포 에피토프(MV-Th), 클라미디아 트라카메이트(Chlamydia trachamate) 주요 외막 단백질 보조 T 세포 에피토프(CT-Th), 디프테리아 독소 보조 T 세포 에피토프(DT-Th), 열대열 원충 서컴스포로조이트(Plasmodium falciparum circumsporozoite) 보조 T 세포 에피토프(PF-Th), 스키스토소마 만소니 트리오즈(Schistosoma mansoni triose) 포스페이트 아이소머라제(isomerase) 보조 T 세포 에피토프(SM-Th), 대장균 트라(Escherichia coli Tra) T 보조 T 세포 에피토프(TraT-Th), 및 이들 Th 에피토프 중 임의의 면역 증강 유사체 및 절편을 포함한다. 광범위하게 반응성인 Th 에피토프의 분리법은 라드(Ladd) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,759,551 호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 보조 T 세포 에피토프 서열의 예는 하기에서 제공된다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로부터 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 T-세포 에피토프를 갖는다.
항원 설계
본 발명의 면역성 조성물은 유효량의 보조 T-세포를 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 Abeta(4-l0)으로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원을 포함한다.
본 발명의 항원 펩타이드는 하기 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III으로 표시된다:
화학식 I
(A)n-- (Th)m-- (B)o-- Abeta(4-10)-- (C)p
(A)n-- Abeta(4-10)-- (B)o-- (Th)m-- (C)p
(D)q-- Abeta(4-10)-- (E)r
상기 식에서,
A, C, D 및 E는 독립적으로 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 서열이고,
스페이서인 B는 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 서열이고,
o가 0인 경우에 Th는 임의의 스페이서 잔기없이 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고,
n, o 및 p는 독립적으로 0 내지 약 20 범위의 정수이고,
o가 0인 경우에 Th는 임의의 스페이서 잔기없이 B 세포 에피토프에 직접 연결되고,
m은 1 내지 약 5의 정수이고,
q 및 r은 독립적으로 0 내지 약 100 범위의 정수이고,
Th는 독립적으로 보조 T 세포 에피토프 또는 이의 면역 증강 유사체 또는 절편을 포함하는 아미노산 잔기의 서열; 또는 연속적인 아미노산 치환을 포함하는 이의 유사체이고, Th는 탠덤(tandem)하게 반복되고,
Abeta(4-10)은 Abeta42의 잔기 4-10(FRHDSGY)(서열번호 1) 또는 연속적인 아미노산 치환을 포함하는 이의 유사체이고, Abeta(4-10)(서열번호 1)은 탠덤하게 반복되거나 다르게는 다중 복제수로 존재한다.
본 발명은 또한 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III으로 표시되는 2종 이상의 펩타이드의 조성물을 포함한다. 화학식 I의 하나 이상의 펩타이드를 조합하여 조성물을 제조할 수 있다. 다르게는, 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III의 하나 이상의 펩타이드를 조합하여 혼합물 또는 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 항원 펩타이드는 약 20 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 다르게는 약 20 내지 약 80개의 아미노산 잔기를 갖는다. 특정한 실시태양에서, 본 발명의 항원 펩타이드는 약 20 내지 약 60개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 20 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 갖고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항원 펩타이드는 약 20 내지 약 35개의 아미노산 잔기를 갖는다.
A, B, C, D 및 E가 아미노산 잔기인 경우, 이들은 임의의 비-천연적으로 발생하는 아미노산 또는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산일 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 아미노산으로는 베타알라닌, 오르니틴, 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline), 하이드록시프롤린, 티록신(thyroxine), 감마-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 천연적으로 발생하는 아미노산으로는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 들 수 있다. 또한, m이 1 이상이고 A, B, C, D 또는 E 그룹 중 2 이상이 아미노산인 경우, 각각의 아미노산은 독립적으로 동일하거나 상이하다.
A, B, C, D 또는 E 그룹의 아미노산은 지방산으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엡실론-팔미토일리신(epsilon-palmitoyllysine)은 Abeta 에피토프의 N-말단 및 C-말달에 첨가될 수 있고, 전체 펩타이드는 소낭의 표면 상에 앵커링(anchoring)될 수 있다. 소낭은 면역 자극제(immunostimulator)인 지질 A을 포함할 수 있다(문헌[Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 2332-2337, 2002] 참조(이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용됨)).
Abeta(4-l0)에피토프는 단백질 항원의 구축을 위한 직교 커플링 전략(orthogonal coupling strategy)을 사용하여 단백질 덴드리머(dendrimer)에 혼입될 수 있다. 특별히 구축된 덴드리머는, 예를 들어 탬(Tam)에게 허여된 미국 특허 제 6,310,810 호(이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용됨)에 개시된 바와 같은 다중 항원 펩타이드의 구축을 포함하는 효과저인 백신 항원의 집합(assembly)에 대한 기초를 제공할 수 있다.
항원 및 백신으로서의 합성 펩타이드
많은 경우, 효과적인 백신의 개발, 및 인간 질환 및 감염체에 대한 면역 치료를 위한 면역원으로서 전체 단백질 또는 당단백질이 사용되면 면역성의 부족으로 인해 효과가 없는 것으로 입증되거나, 비-보호성 에피토프를 포함함으로 인해 감염 및 질환이 증강된다(문헌[Osterhaus et al. Vaccine, 7: 137-141, 1989], 문헌[Gilbert et al. Virus Research, 7: 49-67 (1987)] 및 문헌[Burke, D. Perspect.Biol. Med. , 35: 511-530, 1992] 참조).
백신 또는 면역성 조성물에서 합성 펩타이드 항원이 사용되면 재조합 백신과 관련된 많은 문제가 해결될 수 있다. 특정한 단백질 도메인에 상응하는 합성 펩타이드를 사용하는 이점으로는, 보호성 에피토프만의 선별 및 포함; 질환 증강 에피토프의 배제; 해로운 자가면역 에피토프의 배제; 및 감염성 물질의 배제를 들 수 있고, 합성 펩타이드 항원은 화학적으로 잘 정의되고, 저렴한 비용으로 생산될 수 있다(문헌[Arnon and Horwitz, Curr. Opin. Immunol., 4: 449-453, 1992] 참조).
단점으로는, 작은 합성 펩타이드가 면역계에 제시하기 위해 주요 조직적합 복합체(MHC) I형 및 II형 단백질을 프로세싱하고 결합하는데 필요한 정확한 아미노산 서열을 포함하지 않을 수 있다는 것이다(문헌[Rothbard, Biotechnology, 20: 451-465, 1992] 참조). 다른 단점으로는, 작은 펩타이드의 3차원 용액 구조가 원형 단백질에서 발견되는 것과 상이할 수 있고, 따라서 펩타이드가 적절한 특이성 및 친화성으로 액성 면역을 유도하여 보호성 면역을 제공하지 못할 수 있다는 것이다(문헌[Bernard et al. Aids Res. and Hum. Retroviruses, 6: 243-249, 1990] 참조).
본 발명의 펩타이드 항원은 매우 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 비교적 작은 크기로 인해 펩타이드는 통상적인 기법에 따라 용액 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 및 수동 합성기는 현재 시판되고 있고, 공지된 프로토콜(protocol)에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 핀(Finn) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,827,666 호, 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984] 및 문헌[Tam et al.,J. Am Chem. Soc., 1983, 105: 6442]을 참고하며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
다르게는, 혼성(hybrid) DNA 기술을 사용할 수 있으며, 이때 합성 유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 단일 가닥(single strand) 또는 이의 실질적으로 상보적인 가닥을 이용함으로써 제조되며, 단일 가닥은 중첩(overlapping)되고, 혼성화(hybridizing)하기 위해 어닐링 배지(annealing medium)에서 결합될 수 있다. 이어, 혼성화된 가닥은 연결(ligation)하여 완전한 유전자를 형성하고, 적절한 말단을 선택함으로써 유전자를 발현 벡터에 삽입할 수 있으며, 이들 중 대부분이 현재 용이하게 입수가능하며(예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(이하, “Sambrook et al.,1989”로서 지칭됨)] 참조), 원핵성 또는 진핵성 발현 시스템에서 발현되어 목적하는 펩타이드를 생산할 수 있다.
담체
본 명세서 내에서 기술된 바와 같은 본 발명의 Abeta(4-20)에피토프 항원은 담체 분자와 접합(conjugating)하여 T 세포 보조를 제공할 수 있다.
본 발명의 항원이 공유 결합(접합)되는 담체 분자는 유리하게는 비독성이고, 약학적으로 허용가능하며, 동물에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 크기이다. 적절한 담체 분자의 예로는 파상풍 톡소이드(toxoid), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 비-AIDS 바이러스 유도 담체 분자를 치환할 수 있는 gp120 외피 당단백질의 T 세포 에피토프(즉, T1 및 T2)에 상응하는 펩타이드를 들 수 있다(문헌[Cease, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 84: 4249, 1987] 및 문헌[Kennedy et al., J. Biol. Chem. 262: 5769,1987]). 펩타이드는 또한 약학적으로 허용가능한 보강제, 예를 들어 백반(alum)과 함께 투여될 수 있고, 파상풍 톡소이드 보다 더 면역성이 강한 기타 담체 분자에 접합될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 항원에의 담체 분자의 연결은 직접적일 수 있거나 스페이서 분자를 통해서이다. 스페이서 분자는 유리하게는 비독성이고 반응성이다. 펩타이드의 아미노산 말단에 첨가된 2개의 글리신 잔기는 Abeta(4-10)서열 또는 이의 일부를 담체 분자에 연결시키기에 적합한 스페이서 분자를 제공하며, 다르게는 Abeta(4-10)서열 또는 이의 일부는, 예를 들어 다른 면역원성 아밀로이드 서열에 바로 인접하여 합성될 수 있다. 이황화 결합의 형성을 통해 쇄내 중합(interchainpolymerization)을 조장하기 위해 담체 분자 또는 양 말단에 접합하도록 Abeta(4-l0)펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 시스테인을 첨가하여 보다 큰 분자 응집체를 형성할 수 있다. 펩타이드에의 담체 분자의 접합은 커플링제(coupling agent)를 사용하여 달성된다. 유리하게는, 문헌[Green et al., Cell, 28: 477, 1982] 및 문헌[Palker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84: 2479, 1987]에 개시된 바와 같이, 헤테로작용성(heterofunctional) 커플링제 M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS) 또는 수용성 화합물 m-말레이미도벤조일설포숙신이미드 에스테르(설포-MBS)가 사용된다. 글루타르알데하이드와 같은 많은 기타 커플링제는 펩타이드를 기타 분자에 커플링하는데 이용가능하다. 접합 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[chapter 9 (pages 419-455) and chapter 11 (pages 494-527) of Bioconjugate Techniques by G. T. Hermanson, Academic Press, San Diego 1996)]을 참고하며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
보강제
항원의 특징 중 2가지는, 생체내 면역 반응을 유도하는 이들의 면역성 또는 이들의 능력(특정한 항체의 형성을 포함함), 및 서열 및 구조에 특이적인 항체에 의해 선택적으로 인식되는 이들의 항원성, 즉 이들의 능력이다.
몇몇 항원은 단독으로 투여되는 경우에 매우 빈약한 면역성을 나타낸다. 결과적으로, 빈약한 면역성 항원은 유기체에 대한 효과적인 면역치료 및 보호를 제공하는데 필요한 면역 반응을 유도하지 않을 수 있다.
항원의 면역성은 보강제로 지칭되는 부가적인 물질과의 혼합물로서 항원을 투여함으로써 증가될 수 있다. 보강제는 면역계에 직접 작용함으로써, 및 항원의 느린 방출을 제공함으로써 항원에 대한 면역 반응을 증가시키도록 작용한다. 따라서, 보강제는 항원의 약독학적 특징(pharmacokinetic characteristics)을 변경시키고, 면역계와 항원 사이의 상호작용 시간을 증가시킨다. 보강제의 사용은 당해 기술분야에서 널리 공지되어 있고, 많은 적합한 보강제가 사용될 수 있다. 면역성 조성물의 제조 및 보강제의 사용은 일반적으로 문헌[Vaccine Design--The subunit and adjuvant approach(Ed. Powell and Newman)Pharmaceutical BiotechnologyVol. 6 Plenum Press 1995]에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
가장 널리 보급된 보강제는 광유내의 생리 식염수에 사멸 마이코박테리아(dead mycobacteria)를 포함하는 유제인 프로인트 보강제, 및 마이코박테리아를 포함하지 않은 프로인트 불완전 보강제이다.
보강제는 항원에 대한 면역 반응의 강도를 증가시킬 수 있거나, 면역계를 특정하게 활성화시킬 수 있다. (1) 알루미늄 염, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, (2) 표면 활성제, 예를 들어 사포닌, 퀼 A, 퀼 A/ISCOM 및 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드/아비딘, (3) 다중음이온, (4) 박테리아성 유도체, 예를 들어 프로인트 완전 보강제, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(무라밀 다이펩타이드), N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(트레오닐 MDP), 및 (5) 비히클 및 서방형 물질, 예를 들어 프로인트 불완전 보강제(오일 유제(oil emulsion)), 리포좀을 포함하는 5개의 일반적인 범주의 보강제가 있다(문헌[New Generation Vaccines, Chapter 11, pages 129-140, Adjuvants for a New Generation of Vaccines by A. C. Allison and N. E. Byars, Marcel Dekker, New York, 1990] 참조).
본 발명의 면역성 조성물은 항원 및 보강제를 포함한다. 적합한 보강제는 알루미늄 하이드록사이드 겔 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염인 백반을 포함하지만, 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수 도 있다. 기타 적합한 보강제로는 아실화된 티로신 또는 아실화된 당의 불용성 현탁제, 음이온 또는 양이온적으로 파생된 다당류 또는 폴리포스파젠(polyphophazen)을 들 수 있다.
보강제의 조합은 보강제 시스템을 생성하는 데 사용될 수 있다. 적합한 보강제 시스템으로는, 예를 들어 알루미늄 염과의 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-데-0-아실화 모노프로포릴 리피드 A(3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A, 3DMPL)의 조합을 들 수 있다. 대체 보강제 시스템은, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-데-0-아실화 모노프로포릴 리피드 A(3DMPL), 합성 트레할로즈 다이코리노마이콜레이트(trehalose dicorynomycolate) 및 세포벽 골격 물질의 조합물인 리비 보강제 시스템TM(RIBI ADJUVANT SYSTEMTM)을 포함한다. 증강된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A와 사포닌 유도체의 조합, 특히 국제공개공보 제 WO94/00153 호에 개시된 바와 같이 QS21과 3DMPL의 조합, 또는 국제공개공보 제 WO 96/33739 호에 개시된 바와 같이 QS21을 콜레스테롤로 급냉(quenching)된 덜 반응성 조성물(reactogenic composition)을 포함한다. 수성 유제중의 오일내에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 강력한 보강제 제형은 국제공개공보 제 WO 95/17210 호에 개시되어 있으며, 바람직한 제형이다. 국제공개공보 제 WO 94/00153 호, 국제공개공보 제 WO 96/33739 호 및 국제공개공보 제 WO 95/17210 호의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
다르게는, 본 발명의 면역성 조성물은 풀러톤(Fullerton)에게 허여된 미국 특허 제 4,235,877 호에 개시된 바와 같이 리포좀 또는 비히클내에 캡슐화될 수 있으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
항체 구조
본 발명은 Abeta(4-10)에피토프에 결합하여 아밀로이드 침착 및 원섬유 형성을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 숙지한다. 일반적으로, 기본적인 항체 구조 단위는 테트라머(tetramer)를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 테트라머는 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄의 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 “경쇄(light chain)”(약 25kDa) 및 하나의 “중쇄(heavy chain)”(약 50 내지 70kDa)를 포함한다. 각각의 쇄의 아미노 말단 부위는 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 약 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함할 수 있다. 각각의쇄의 카복실 말단 부위는 주로 효과기 작용에 책임이 있는 불변 영역을 한정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤(mu), 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로서 분류되며, 항체의 아이소타입(isotype)을 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 각각 정의한다. 경쇄 및 중쇄내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 “J” 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 초과의 아미노산의 “D” 영역을 포함한다(문헌[J.K. Frazer and J.D. Capra, "Immunoglobulins: Structure and Function", pp. 37-75 in Fundamental Immunology, Fourth Edition, Edited by W.F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA, 1999, (Frazer)] 참조(이는 본원에서 모든 목적을 위해 전체가 참고로 인용됨)).
각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부의를 형성할 수 있다. 따라서, 일반적으로 온전한 IgG 항체는 2개의 결합 부의를 갖는다. 이작용성(bifunctional) 또는 이특이성(bispecific) 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
정상적으로, 쇄 모두는 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭되는 3개의 과가변 영역(hypervariable region)에 의해 연결된 비교적 보존된 골격 영역(framework region, FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 일반적으로 골격 영역에 의해 배열되어, 특정한 에피토프에 결합할 수 있다. 일반적으로, N-말단 또는 C-말단으로부터 경쇄 및 중쇄 둘다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에의 아미노산의 지정은일반적으로 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)]의 정의, 또는 문헌[Chothia, et al., J Mol.Biol. 196: 901-917, 1987] 및 문헌[Chothia, et al., Nature 342: 878-883, 1989]에 따른 것이다.
항체의 유형
“항체 분자”란 용어는 항체 및 이의 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 용어는 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 이특이성 항체, Fab 항체 단편, F(ab)2항체 단편, Fv 항체 단편(예를 들어, VH또는 VL), 단일 쇄 Fv 항체 단편 및 dsFv 항체 단편을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체 분자는 완전한 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체 분자는 단일 클론성의 완전한 인간 항체이다.
본 발명의 항-Abeta(4-l0)항체 분자는 바람직하게는 인간 아밀로이드 Abeta 단백질 및 펩타이드를 인식하지만, 본 발명은 상이한 종, 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 생쥐, 래트, 토끼, 양 또는 개)로부터의 아밀로이드 Abeta 단백질 및 펩타이드를 인식하는 항체 분자를 포함한다.
또한, 본 발명의 항-Abeta(4-10)항체는 인간 단일클론성 항체로부터 유래할 수 있다. 이 같은 항체는 항원성 도전에 반응하여 특정한 인간 항체를 생산하도록 “엔지니어링(engineering)된” 형질전환 생쥐로부터 수득된다. 이 기법에서, 인간 중쇄 및 경쇄 자리(locus)의 성분은 내생성 중쇄 및 경쇄 자리의 표적 분해물을 포함하는 배아 줄기 세포주(stem cell line)로부터 유래된 생쥐의 변종에 도입된다. 형질전환 생쥐는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 상기 생쥐를 사용하여 인간 항체 분비 하이브리도마(hybridoma)를 생산할 수 있다. 형질전환 생쥐로부터 인간 항체를 수득하는 방법은 문헌[Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994], 문헌[Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994] 및 문헌[Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994]에 개시되어 있다.
바람직한 실시태양에서, Abeta(4-10)에 대해 유도된 완전한 인간 단일클론성 항체는 생쥐 면역 시스템이 아닌 인간 면역 시스템의 일부를 갖는 형질전환 생쥐를 사용하여 생산된다. 본원에서 “HuMAb” 생쥐로서 지칭될 수 있는 이들 형질전환 생쥐는 내생성 뮤 및 카파 쇄 자리를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로블린 서열을 암호화하는 인간 면역글로블린 유전자 미세 자리(miniloci)를 포함한다(문헌[Lonberg, N., et al., 1994, Nature 368 (6474): 856-859). 따라서, 생쥐는 생쥐 IgM 또는 카파의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 형질전환 유전자(transgene)는 클래스 스위칭(class switching) 및 체성 돌연변이(somatic mutation)를 겪어 고친화성 인간 IgG 단일클론성 항체를 생성한다(문헌[Lonberg, N., et al., 1994, supra]; 문헌[Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101]에서 개괄 및 문헌[Lonberg, N., et al., 1995, Intern.Rev. Immunol. 13: 65-93]). HuMab 생쥐의 제조는 당해 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Lonberg, et al., 1994, Nature 368 (6474): 856-859], 문헌[Lonberg, N., 1994, Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101], 문헌[Lonberg, N., et al., 1995, Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93], 문헌[Fishwild, D., et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851]에 개시되어 있다. 롱버그(Lonberg) 및 케이(Kay), 및 진팜 인터내쇼날(GenPharm International)에게 모두 허여된 미국 특허 제 5,814,318 호, 미국 특허 제 5,874,299 호, 미국 특허 제 5,770,429 호; 및 수라니(Surani) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,545,807 호를 추가로 참고하며, 이의 모든 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
Abeta(4-l0)에 대한 완전한 인간 단일클론성 항체를 생산하기 위해, HuMab 생쥐를 본 발명의 Abeta(4-l0)항원을 포함하는 면역성 조성물로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 생쥐는 첫 번째 면역화시에 6 내지 16주령일 것이다. 예를 들어, 발명의 Abeta(4-l0)항원을 포함하는 면역성 조성물을 사용하여 HuMab 생쥐를 복막내 면역화할 수 있다. 생쥐는 또한 Abeta(4-l0)함유 유전자로 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 전체 HEK293 세포로 면역화될 수 있다. “항원성 Abeta(4-l0)폴리펩타이드”란 용어는 HuMab 생쥐에서 항-HuMab(4-l0)생쥐 면역 반응을 유도하는 이의 임의의 단편의 Abeta(4-l0)폴리펩타이드를 지칭한다.
일반적으로, HuMAb 형질전환 생쥐는 먼저 완전 프로인트 보강제 중의 항원에 의해 복강내(IP) 면역화된 후, 불완전 프로인트 보강제 중의 항원에 의해 기타 매주마다 IP 면역화(일반적으로 총 6회 이하)하는 경우에 HuMAb 형질전환 생쥐는 가장 잘 반응한다. 먼저, 생쥐는 Abeta(4-l0)(예를 들어, 안정하게 형질전환된 HEK293 세포)를 발현하는 세포로 면역화하고, 이어 본 발명의 면역성 조성물와 같은 Abeta(4-l0)을 함유하는 항원의 가용성 단편으로 면역화할 수 있고, 2개의 항원으로 교대로 연속적으로 면역화할 수 있다. 면역 반응은 레트로-오비탈(retro-orbital) 또는 테일 블리드(tail bleed)에 의해 수득되는 플라즈마 시료를 시용하는 면역화 프로토콜에 따라 모니터링할 수 있다. 플라즈마는, 예를 들어 ELISA에 의해 항-Abeta(4-l0)항체의 존재를 스크리닝할 수 있고, 면역글로블린의 충분한 적정농도를 갖는 생쥐는 융합용으로 사용할 수 있다. 생쥐를 희생시켜 비장을 제거하기 3일 전에 항원으로 정맥내 부스팅(boosting)할 수 있다. 개개의 항원에 대한 2 내지 3회의 융합이 수행될 필요가 있는 것으로 예상된다. 몇몇 생쥐는 각각의 항원에 대해 면역화될 수 있다. 예를 들어, HC07 및 HC012 변종의 총 12마리의 HuMAb 생쥐가 면역화될 수 있다.
이어, 단일클론성의 완전한 인간 항-Abeta(4-l0)항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 당해 기술분야에서 통상적으로 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이들 방법으로는 문헌[Kohler, et al., Nature 256: 495-497, 1975]에서 최초로 개발된 하이브리도마 기법 뿐만 아니라, 트리오마 기법(trioma technique)(문헌[Hering, et al., Biomed. Biochim. Acta. 47: 211-216, 1988] 및 문헌[Hagiwara, et al., Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15, 1993]); 인간 B 세포 하이브리도마 기법(문헌[Kozbor, et al., Immunology Today 4: 72, 1983] 및 문헌[Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80: 2026-2030, 1983]); 및 EBV-하이브리도마 기법(문헌[Cole, et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96,1985])을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 표준 프로토콜에 기초하여 생쥐 비장세포(splenocyte)를 단리하고, PEG를 사용하여 생쥐 골수종 세포주에 융합시킨다. 이어, 얻어진 하이브리도마는 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화 생쥐로부터의 비장성 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 생쥐 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)의 수의 1/6로 융합한다. 세포를 약 2 x 105세포로 평편한 바닥 마이크로티터 플레이트(flat bottom microtiter plate)에 도말한 후, 20% 우태아 혈청(fetal Calf Serum), 18% “653”조건화 배지(conditioned media), 5% 오리겐(origen, IGEN), 4mM L-글루타민, 1mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055mM 2-머캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 겐타마이신(gentamycin) 및 1X HAT(Sigma; HAT을 융합 24시간 후에 첨가함)를 포함하는 선택 배지에서 2주 동안 배양한다. 2주 후에 HAT 가 HT로 교체된 배지에서 세포을 배양한다. 이어, 개개의 웰(well)은 인간 항-Abeta(4-10)단일클론성IgM 및 IgG 항체를 위해 ELISA에 의해 스크리닝한다. 하이브리도마가 광범위하게 성장하면, 일반적으로 10 내지 14일 후에 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 재도말(replate)하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG인 항-Abeta(4-l0)단일클론성 항체에 대해 여전히 양성반응을 나타내는 경우에 희석을 제한함으로서 2회 이상 서브클로닝(subcloning)한다. 이어, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 이의 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생산한다.
본 발명의 항-Abeta 항체 분자는 또한 (상술한 바와 같이, E.coli/T7 발현 시스템에서) 재조합적으로 생산될 수 있다. 이 실시태양에서, 본 발명의 항체 분자(예를 들어, VH또는 VL)를 암호화하는 핵산은 PET-계 플라스미드에 삽입되어 E.coli/T7 시스템에서 발현될 수 있다. 당해 기술분야에서 널리 공지된 재조합 항체를 생산하는 몇몇 방법이 있다. 항체의 재조합 생산을 위한 방법 중 하나의 예는 미국 특허 제 4,816,567 호에 개시되어 있으며, 이는 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 또한, 항체 분자는 CHO 또는 NSO 세포에서 재조합적으로 생산될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, “단일클론성 항체”란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 군집으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고 군집을 포함하는 개개의 항체가 동일하다. 단일클론성 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대해 유도된다. 단일클론성 항체는 본질적으로 기타 면역글로블린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. “클론성”이란 변형된용어는 항체의 실질적으로 동종인 군집으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로 이해되어서는 안된다. 상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 문헌[Kohler, et al., Nature 256: 495, 1975]에서 최초로 개시된 하이브로도마 방법에 의해 제조될 수 있다.
다클론성 항체는 하나 이상의 기타 동일하지 않은 항체의 존재 사이 또는 존재하에서 생산되는 항체이다. 일반적으로, 다클론성 항체는 동일하지 않은 항체를 생산하는 몇몇 기타 B-림프구의 존재하에 B-림프구로부터 생산된다. 통상적으로, 다클론성 항체는 면역화 동물로부터 직접 수득된다.
“완전한 인간 항체”란 용어는 인간 면역 글로블린 서열만을 포함하는 항체이다. 유사하게는, “생쥐 항체”란 용어는 생쥐 면역글로블린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다.
본 발명은 다른 비-인간 종(예를 들어, 생쥐, 말, 토끼, 개, 소 및 닭)으로부터의 항체 영역(예를 들어, 불변 영역)과 융합되거나 키메릭화된 본 발명의 가변 영역을 포함하는 항체인 “키메릭 항체(chimeric antibody)”를 포함한다. 이들 항체는 비-인간 종에서 Abeta(4-10)의 발현 및 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
“인간화 항체”란 용어는 다른 인간 항체의 골격내의 비-인간 CDR, 및 다른 인간 항체의 불변 영역에 부착된 비-인간 가변 영역을 포함하는 항체이다. 본 발명은 본 발명의 가변 영역의 아미노산 서열 또는 CDR을 포함하는, 비-인간 종으로부터의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 고려한다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로블린은 상이한 부류로 분류될 수 있다. 면역글로블린의 5종 이상의 부류, 예를 들 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류(아이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 및 IgA-2로 추가로 분류될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 IgG-1 또는 IgG-4이다.
본 발명의 항체는 또한99Tc,90Y,111In,32P,14C,125I,3H,131I,11C,15O,13N,18F,35S,51Cr,57To,226Ra,60Co,59Fe,57Se,152Eu,67CU,217Ci,211At,212Pb,47SC,109Pd,234Th 및40K와 같은 방사선 동위원소 라벨(radioisotopic label), 및157Gd,55Mn,52Tr 및56Fe와 같은 비-방사선 동위원소 라벨과 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 희토류 킬레이트, 플루오레신(fluorescein) 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 이소티오시아네이트, 파이코에리트린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), o-프탈알데하이드(o-phthaladehyde), 플루오레스카민(fluorescamine),l52Eu, 단신(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 루시페린(luciferin), 루미날 라벨(luminal label), 이소루미날 라벨, 방향족 아크리듐 라벨, 이미다졸 라벨, 아크리듐 염 라벨, 옥살레이트 에스테르 라벨, 에쿼린(aequorin) 라벨, 2,3-다이하이드로프탈아진디온(2,3-dihydrophthalazinedione),비오틴/아비딘(biotin/avidin), 스핀 라벨(spin label) 및 안정한 자유 라디칼과 같은 형광발색단(fluorophore)을 비롯한 형광 또는 화학 발광(chemilluminescent) 라벨과 접합될 수 있다.
문헌[Hunter, et al., Nature 144: 945, 1962], 문헌[David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974], 문헌[Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981] 및 문헌[Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407, 1982]에 개시된 이들 방법을 비롯한, 본 발명의 항체 분자를 다양한 잔기에 접합시키는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 상기 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 항체를 접합시키는 방법은 당해 기술분야에서 통상적이며 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 Abeta(4-l0)또는 Abeta 펩타이드에 결합하는 분자를 포함하는 면역성 조성물의 투여에 기초하는 특정한 치료 방법에 관한 것이다. 따라서, Abeta(4-l0)을 포함하는 항원을 투여하여 노화, 및 알쯔하이머병과 같은 질환에서 플라크 침착을 억제하거나 강화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 Abeta(4-l0)항원 또는 이의 유사체의 제조, 확인, 정제 및 특징화 방법; 및 Abeta(4-l0)항원 및 이의 유사체의 사용 방법을 포함한다. Abeta(4-10)항원은 천연 공급원으로부터 단리된 보다 큰 아밀로이드 펩타이드의 단백질 분해성 개열을 비롯한, 유전 공학 기법(genetic engineering technique), 또는 화학 합성, 예를 들어 고체상(solid phase) 펩타이드 합성을 통한 변형에 의해 생산될 수 있거나, 유전 공학 방법 또는 고체상 펩타이드 합성에 의해 신생 생산될 수 있다.
분자 생물학
본 발명에 따라, 당해 기술분야의 범위 내에서 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법이 사용될 수 있다. 이 같은 기법은 문헌에서 상세하게 설명된다(문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (이하, “Sambrook et al., 1989”로서 지칭됨)], 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985), 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)], 문헌[Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1985]], 문헌[Transcription and Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984]], 문헌[Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed., 1986]], 문헌[Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, 1986]], 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984] 및 문헌[F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994] 참조).
CRND8 생쥐
TgCRND8 생쥐는 3개월 정도에 CNS에서 다량의 Abeta 합성 및 아밀로이드 침착을 나타내는 AD의 동물 모델이다. 2001년 12월 27일자로 공개된 국제 공개공보제 WO 01/97607 호를 참고하며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 또한, TgCRND8 생쥐는 아밀로이드 침착이 시작되는 기간 내에 인지 변화를 나타낸다. 형질전환 TgCRND8 생쥐 모델은 CNS에서의 Abeta 아밀로이드 단백질의 발현 뿐만 아니라, 조직 분석, 신경병학 및 행동 장애에 기초하여 자연적으로 발생하는 알쯔하이머병 표현형과 매우 유사한 것으로 특징지어 진다.
APP 유전자는 대체 스플라이싱(splicing)을 겪어 3개의 통상적인 아이소폼을 생성한다. 770개의 아미노산을 포함하는 가장 긴 아이소폼(APP770), 및 751개의 아미노산을 포함하는 두 번째로 긴 아이소폼(APP751)은 대부분의 조직에서 발현된다. 695개의 아미노산을 포함하는 세 번째 전사체(transcript, APP695)는 뇌에서 주로 발현된다. 규정에 따라, 가장 긴 아이소폼 APP770의 코돈 넘버링은 보다 짧은 아이소폼의 코돈 위치를 언급하는 경우에도 사용된다.
TgCRND8 형질전환 생쥐는 뇌-특이적 APP695아이소폼의 돌연변이성 형태를 발현하는 형질전환 유전자를 포함하고, 이 형질전환 유전자는 “스웨디쉬(Swedish)” 및 “인디아나(Indiana)” APP 돌연변이를 포함한다.
돌연변이 K595N/M596L(스웨디쉬 돌연변이) 및 V642F(인디아나 돌연변이)(APP695의 코돈 넘버링을 사용함)를 비롯한 APP695cNDA가 생산된다. 이들 및 기타 APP 돌연변이는 일반적으로 더욱 통상적인 APP770코돈 넘버링 시스템 의해, 즉 이들 2개의 돌연변이 K595N/M596L(스웨디쉬 돌연변이) 및 V642F(인디아나 돌연변이)에 대해 본원에서 지칭될 것이다.
이중 돌연변이성 APP695cDNA 카세트(cassette)는 시리아 햄스터 프리온 단백질 유전자 프로모터를 포함하는 코스미드 발현 벡터인 cosTet에 삽입되었다. 이어, 상기 벡터는 TgCRND8로 명명된 형질전환주를 생산하기 위해 생쥐 난모세포에 미세 주사되었다. 이들 생쥐는 3개월 정도에 다중 분산 아밀로이드 침착물(multiple diffuse amyloid deposit)을 나타내며, 이때 공간 학습에서의 시간 장애가 나타난다.
TgCRND8 생쥐는 AD-관련 돌연변이를 갖는 다양한 기타 형질전환 생쥐와 교잡되어, 추가로 증가된 AD-관련 신경 병리증상을 나타내는 이중-형질전환 생쥐를 생산한다.
투여 및 치료 방법
본 발명은 또한 플라크에 대한 Abeta42의 결합을 차단하는 약제를 확인하기 위해 Abeta(4-10)항원을 사용하는 방법을 포함한다. 이 같은 하나의 양태는 Abeta42의 효과를 모방하고/하거나 보충하는 약제를 확인하는 약제-스크리닝 분석법을 포함한다. 이 같은 한 실시태양에서, 약제 라이브러리(drug library)는 특정한 소분자에 대한 Abeta(4-10)을 포함하는 펩타이드의 결합 활성을 분석함으로써 스크리닝된다. 플라크에 대한 Abeta42의 친화성에 관한 가능성 있는 약제의 효과를 모니터링한다. 약제가 플라크에 대한 Abeta42의 결합 친화성을 감소시키는 경우, 이는 후보 약제가 된다. 약제는 플라크 형성을 중단하거나, 원섬유 생성 과정을 방해하거나, 또는 이미 형성된 원섬유를 분해하는 이들의 능력으로 인해 스크리닝될 수 있다.
본 발명에서 유용한 항원, 항체 또는 기타 화합물이 약학 조성물의 성분으로서 혼입될 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 약학적으로 유효한 담체와 함께 치료학적 양 또는 예방학적 양의 1종 이상의 항원, 항체 및 이의 기타 화합물을 포함한다.
본 방법에서 유용한 약학 조성물을 제조하는데 있어, 본원에서 개시된 방법에 따라 확인된 항원, 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 치료학적 화합물을 환자에게 투여하기에 적합한 임의의 상용성 및 비독성 물질인 약학 담체가 사용될 수 있다. 멸균수, 알콜, 지방, 왁스, 삽입 고체 및 심지어는 리포좀이 담체로서 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 보강제(완충제 및 분산제)가 또한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 항체 및 이의 약학 조성물은 비경구 투여, 즉 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 투여에 특히 유용하다. 그러나, 비강내 제형 또는 기타 에어로졸 제형도 또한 유용하다. 투여용 제형에서 항체와 같은 화합물의 농도는, 예를 들어 약 0.5중량% 미만, 통상적으로 1중량% 초과 15중량% 미만, 또는 20중량% 이상으로 광범위하게 변경할 수 있고, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이며, 선택된 특정한 투여 형식에 있어 바람직하다. 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있거나 자명할 것이며,예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 더욱 상세하게 개시되어 있으며, 이는 본원에서 참고로 인용된다.
본 발명의 면역성 조성물, 항체 또는 항원 결합 단편은 개체에서 아밀로이드 침착(또는 아밀로이드 적재)을 조정하기에 충분한 치료학적 유효 투여량으로 투여된다. “치료학적 유효 투여량”이란 용어는 바람직하게는 치료받지 않은 개체에 비해 아밀로이드 침착을 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 40% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 60% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 80% 이상으로 조정한다. 인간 질환에서 아밀로이드 침착을 조정하는데 있어서의 효율을 예상할 수 있는 모델 시스템, 예를 들어 당해 기술분야에서 공지된 동물 모델 시스템(예를 들어, 국제 공개공보 제 WO 96/28187 호를 포함하는 방법)에서, 또는 시험관내 방법(예를 들어, 국제 공개공보 제 WO 97/07402 호에 개시된 차크라바티(Chakrabartty)의 방법) 또는 본원에서 기술된 TgCRND8 모델 시스템에 의해 아밀로이드 침착을 조정하는 방법의 능력을 측정할 수 있다. 또한, 개체에서 아밀로이드 침착물의 양 또는 분포는, 예를 들어 아밀로이드 침착물과 회합한 후, 섬광 조형술(scintigraphy)에 의해 아밀로이드 침착물을 이미지화할 수 있는 방사선 라벨링된 트레이서(radiolabelled tracer)의 사용에 의해 비-침습성으로 생체내 모니터링할 수 있다(예를 들어, 문헌[Aprile, C. et al., Eur. J. Nuc. Med. 22: 1393, 1995], 문헌[Hawkins, P. N., Baillieres Clin. Rheumatol. 8: 635, 1994] 및 본원에서 인용된 문헌 참조). 따라서, 예를 들어 개체에서 아미로이드 적재는 본 발명의 방법에 따른 치료 기간 이후에 측정하고, 본 발명의 치료학적 화합물로 치료를 시작하기 전에 개체의 아밀로이드 적재와 비교하여 개체에서의 아밀로이드 침착에 대한 치료학적 화합물의 효과를 측정할 수 있다.
특정한 실시태양에서 아밀로이드 침착 또는 아밀로이드 적재를 조정하는 본 발명의 방법의 능력은 생체내 아밀로이드 침착 또는 아밀로이드 적재와 연관된 증상 또는 신호를 관측함으로써 측정할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 예를 들어 아밀로이드 침착 또는 아밀로이드 적재를 감소시키는 본 발명의 방법의 능력은 근원적인 아밀로이드-관련 질환 상태 또는 질병의 임상적인 표시에서의 관측가능한 개선, 또는 질병의 증상의 전개에서의 감속 또는 지연과 연관될 수 있다. 따라서, 질환의 임상적인 표시의 모니터링은 본 발명의 방법의 아밀로이드-조정 효율을 측정하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 아밀로이드 침착이 발생하는 기타 질환과 관련된 아밀로이드증(amyloidosis)을 치료하는데 유용할 수 있다. 임상적으로, 아밀로이드증은 원발성이거나, 이차성이거나, 가족성이거나, 단리된다. 아밀로이드는 아밀로이드내에 포함된 아밀로이드 생성 단백질의 유형에 의해 분류되었다. 이들 아밀로이드 생성 단백질에 의해 확인된 바와 같이 조정될 수 있는 아말로이드의 비제한적인 예로는 다음과 같다(아밀로이드 생성 단백질 이후의 괄호내에는 연관된 질환임): 베타-아밀로이드(알쯔하이머병, 다운 증후군, 유전성 뇌출혈 아밀로이드증(hereditary cerebral hemorrhage amyloidosis)[더취(Dutch)], 뇌 맥관병증(cerebral angiopathy)); 아밀로이드 A(반응성 [2차] 아밀로이드증, 가족성 지중해열(Mediterranean Fever), 두드러기(urticaria) 및 귀머거리(deafness)에 의한 가족성 아밀로이드 신증(nephropathy)[머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome)]); 아밀로이드 카파 L-쇄 또는 아밀로이드 람다 L-쇄(특발성(idiopathic) [원발성], 골수종 또는 매크로글로블린혈증-회합(macroglobulinemia-associated)); Abeta2M(만성 혈액투석(hemodialysis)); ATTR(가족성 아밀로이드 다발성 신경병증(polyneuropathy)[포르투기즈(Portuguese), 재팬내즈(Japanese) 및 스웨디쉬], 가족성 아밀로이드 심근증(cardiomyopathy)[대니쉬(Danish)], 단리된 심장 아밀로이드, 전신성 노인성 아밀로이드증(systemic senile amyloidosis)); AIAPP 또는 아밀린(amylin)(성인형 당뇨병(adult onset diabete), 인슐린종(insulinoma)); 심방 이뇨 인자(atrial naturetic factor)(단리된 심방 아밀로이드); 프로칼시토닌(procalcitonin)(갑상선의 수질 암종(medullary carcinoma)); 게솔린(gelsolin)(가족성 아밀로이드증[피니쉬(Finish)]); 시스타틴 C(cystatin C)(아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈[아이스랜딕(Icelandic)]); AApoA-I(가족성 아밀로이드 다발성 신경병증[아이오와(Iowa)]); AApoA-II(생쥐에서의 가속화된 노화); 피브리노겐-회합 아밀로이드(fibrinogen-associated amyloid); 리소자임-회합 아밀로이드(lysozyme-associated amyloid); 및 AScr 또는 PrP-27(스크레이피(Scrapie), 크로이츠펠트-아콥병(Creutzfeldt-Jacob disease), 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 광우병(bovine spongiform encephalitis)).
하기 실시예는 본 발명의 예시를 목적으로 제공되지만, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
<실시예 1>
항원 합성 및 구조적 특성화
본 실시예에서, 본 발명자들은 합성 Abeta 펩타이드 면역원을 합성하고, 정제하고 특징화하는 방법을 기술한다.
하기 Abeta 펩타이드(Abeta42, Abeta40, Abeta30및 N-말단 에피토프 펩타이드)의 합성은 노바신(NovaSyn, Novabiochem) PEG 이식편 중합체 수지 및 개시된 바와 같은 Fmoc N-말단 보호 방법을 사용하는 ABIMED EPS-221 반자동 펩타이드 합성기에 의해 수행되었다(문헌[Mayer-Fligge et al., J. Pept. Sci. 4: 355-363, 1998] 참조). Fmoc-탈보호 단계 및 최종 탈보호 주기는 분광 광도법으로 모니터링되었다. 합성 펩타이드는 반-제조용 역상 C18 μ본다팩(C18 μbondapak) HPLC 컬럼을 사용하여 정제된다.
이어, 정제된 합성 펩타이드의 분자량은 플라즈마 탈리(plasma desorption, MALDI) 및 전자분무(electrospray)(ESI) 질량 분광법에 의해 특징화되었다. 예상된 질량에 상응하는 분자 질량을 갖는 펩타이드 분획만이 후속적인 면역화에 사용되었다.
용액 중의 펩타이드의 2차 구조는 원편광 이색성(circular dichroism ,CD)을 사용하여 측정하였다. CD 스펙트럼은 JASCO J-500 분광 편광기(spectropolarimeter)를 사용하여 기록하였다(문헌[Mayer-Fligge et al., J. Pept. Sci. 4: 355-363, 1998] 참조). 또한, 이전에 기술된 바와 같이 브루커-AMX(Bruker-AMX)-600 기구가 장착된 2D-NMR-NOESY 분석을 이용하여 NMR 연구를 수행하였다(문헌[Michels et al., "Structure and Functional Characterization of the periplasmis N-terminal polypeptide domain of the sugar specific ion channel protein(scry-porin),"Protein Science (in Press 2002)] 참조).
<실시예 2>
Abeta 42 에 의한 CRND8 생쥐의 면역화
본 실시예에서, 본 발명자들은 Abeta42펩타이드가 APP 형질전환 유전자를 발현하는 생쥐 및 비-형질전환 생쥐에서 및 비-형질전환 생쥐에서 면역성이다.
생쥐
TgCRND8 생쥐는 문헌[Chishti et al, J. Biol. Chem. 276: 21562-21570, 2001]에 의해 달리 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 생쥐는 베타-APP695전사체 상에서 베타-APP스웨디쉬및 베타-APPV7I7F돌연변이를 시스형으로 과량 발현시키는 이계 교배된 C3H/C57BL/6J 배경(background)에서유지된다. 베타-APP스웨디쉬및 베타-APPV7I7F유전자는 시리아 햄스터 프리온 유전자 프로모터(Syrian hamster prion gene promoter)의 조절을 받는다. C3H/C57BL6(82%/18%) 형질전환 유전자-반접합성(hemizygous) 생쥐와 야생형 C57BL/6J 생쥐의 교배로부터 유래한 TgCRND8 생쥐를 이유시키고, 베타-APP 형질전환 유전자의 존재를 위해 유전자형 분석을 하고, 표준 생쥐 우리에서 동일한 성의 2 내지 4마리의 생쥐 그룹으로 투숙하였다. 생쥐에게 음식 펠릿(food pellet), 분말 음식 및 물을 임의적으로 제공하였다. 모든 생쥐는 첫 번째 면역화 전에 1주 동안 조정하고, 매 면역화 2일전 및 면역화 2일 이후에 이들의 중량을 기록하였다. 실험군 모두는 성 및 중량이 일치하였다.
면역화 프로토콜 및 혈청 단리
섬세포 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP) 펩타이드의 잔기 8-37(ATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY)(서열번호 52)로 이루어진 합성 Abeta42및 대조군 펩타이드를 C18 μ본다팩 컬럼 상의 역상 HPCL에 의해 단리되고, 상기 펩타이드의 순도를 질량 분광계 및 아미노산 분석에 의해 측정하였다.
면역화 프로토콜 및 일정표는 이전에 문헌[Schenk et al. Nature 400: 173-177, 1999]에 개시된 바와 같으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 이어, 항체의 적정농도는 13주령에는 뒷다리 정맥 전자(vein puncture) 및 25주령에는 심장 전자(cardiac puncture)를 통해 수집된 혈청 시료(혈액 200㎕)에서 측정하였다. 이들 연구에 사용하기 전에, 56℃에서 30분 동안 배양함으로써 보체를 불활성화시켰다. Ig 분획을 5㎖ 단백질 G 컬럼 상에서 단리하였다. 시료를 적재하고, PBS로 세척하고, 0.1M 시트르산나트륨으로 용출하고, 1M 트리스로 완충하였다. 모든 Ig 분획을 사용하기 전에 필터 멸균하였다.
면역화 결과
비-면역화 생쥐(N=18), 및 Abeta42(개체수: 34; 18마리의 TgCRND8 및 16마리의 비-Tg), 또는 말초성 아밀로이드 펩타이드(섬세포 회합 폴리펩타이드(IAPP)(이때, 면역화된 생쥐의 개체수는 17마리이며, 10마리가 TgCRND8이고 7마리가 비-형질전환(비-Tg) 쥐임)로 5개월에 걸쳐 반복적으로 면역화되었던 TgCRND8 생쥐 및 이들의 비-형질전환 한배의 새끼 둘다로부터 혈청을 단리하였다. 생쥐는 Abeta42에 대한 유의한 적정 농도(1:5,000 내지 1:50,000) 및 IAPP에 대한 유의한 적정 농도(1:5000 내지 1:30,000)를 생산한다. 흥미롭게도, TgCRND8 형질전환 생쥐 및 이들의 비-형질전환 한배의 새끼의 항-Abeta42적정 농도에서 유의한 차이가 검출되지 않았다. Abeta42-면역화 생쥐로부터의 혈청의 모든 시료는 20주령의 비-면역화 TgCRND8 생쥐로부터의 뇌의 조직 절편에서 성숙한 Abeta 플라크를 포지티브하게 염색할 수 있다. 대조적으로, 대조군 펩타이드 IAPP-면역화 및 비-면역화 생쥐로부터의 혈청은 20주령의 비-면역화 TgCRND8 생쥐로부터의 뇌의 조직 절편에서 성숙한 Abeta 플라크를 포지티브하게 염색할 수 없다. 따라서, 상기 결과는 Abeta를 포함하는 신경 병리학적 플라크를 인식하여 결합할 수 있는 항체 자가면역이 유도될 수 있음을 나타낸다.
<실시예 3>
생쥐 면역 혈청에 의한 원섬유 형성의 억제
본 실시예에서는 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명자는 대부분의 Abeta42면역화 생쥐로부터의 혈청이 원섬유 형성을 억제하였음을 보여준다.
저 농도에서, Abeta 펩타이드의 용액은 14일 동안의 배양 기간에 걸쳐 원섬유로 자발적으로 집합할 것이다. 이들 원섬유는 하기에서 기술된 바와 같이 전자 현미경법에 의해 모니터링될 수 있는 특징적인 50 내지 70Å 직경을 갖는다.
전자 현미경법
Abeta42는 10㎎/㎖의 저장 농도에서 물에 가용화시킨 후, 또는 성숙한 아밀로이드 원섬유로 집합하기 전에 직접 사용되었다. Abeta42는 100㎍/㎖의 최종 펩타이드 농도에서 혈청의 존재 유무에 따라 배양하였다. 다양한 혈청의 일련의 희석액을 Abeta42에 첨가하고, 실온(RT)에서 2주 이하 동안 배양하였다. 네가티브 염색 전자 현미경법에 있어, 탄소-코팅된 피올로폼 그리드를 펩타이드의 수용액 상에 부유시켰다. 그리드를 블로팅하고, 공기 건조시킨 후, 시료를 1%(중량/부피) 포스포텅스텐산으로 염색하였다. 75V에서 60,000X 배율로 작동하는 히타치(Hitachi)7000 전자 현미경으로 펩타이드 집합을 관찰하였다.
전자 현미경법의 결과
원섬유로의 Abeta의 집합에 대한 Abeta 면역화 생쥐 혈청의 효과를 측정하기 위해, 37℃에서 14주 이하 동안 Abeta42의 존재 유무에 따라 상술한 바와 같이 혈청을 배양하였다. 각각의 반응 혼합물로부터의 분취량(Aliquot)을 1, 3, 7, 10 및 14일에 네가티브 염색 전자 현미경법에 의해 Abeta42원섬유의 존재에 대해 검사하였다.
혈청의 부재하에 또는 비-면역화 혈청의 존재하에, Abeta42는 특징적인 50 내지 70Å 직경을 갖는 긴 원섬유(7,500Å)를 형성한다. 따라서, 긴 원섬유는 정상적인 혈청 성분이 본 발명의 분석 조건하에서 Abeta 원섬유 형성을 억제하지 못한다는 것을 보여준다. IAPP-면역화 동물로부터의 혈청의 존재하에, 보다 덜 긴 Abeta42원섬유가 생산되지만, 형성한 원섬유는 특징적인 50 내지 70Å의 직경을 갖는다. 대조적으로 표 2에서 도시된 바와 같이, 다수의 Abeta42-면역화 생쥐 혈청(개체수: 27/34)은 원섬유 형성을 주로 차단할지라도, 소량의 혈청(개체수: 7/34)은 어떠한 효과도 나타내지 않는다. 또한, TgCRND8 생쥐 또는 비-형질전환 한배의 새끼로부터의 Abeta-면역화 혈청은 Abeta-원섬유 형성을 동일하게 억제하였으며, 이는 항체 레퍼토리가 면역원에만 의존하고, 내생성 Abeta42의 적재에는 의존하지 않음을 보여준다.
표 2에서 요약된 바와 같이, 비-면역화 생쥐 혈청의 존재하에서 배양하는 경우 원섬유의 구조에서는 어떠한 차이도 검출되지 않았다. IAPP로 면역화된 생쥐로부터의 혈청은 원섬유 형성의 정도를 감소시켰지만, 형성한 원섬유는 Abeta42단독에 의해 형성된 원섬유와 유사하였다. 최종적으로, Abeta42에 의해 면역화된 생쥐로부터의 혈청은 원섬유 농도에서의 완전 억제에서 오직 소량의 감소에 이르는 다양한 정도로 원섬유 형성을 억제하였다.
<실시예 4>
면역 혈정에 의한 존재하는 원섬유의 분해
본 실시예에서, 본 발명자들은 Abeta42-면역화 생쥐로부터의 혈청이 이미 형성된 Abeta42원섬유를 분해하지만, 이미 형성된 Abeta42원섬유는 면역화 대조군 생쥐 혈청에 의한 배양 및 IAPP 면역화 생쥐로부터의 혈청에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
Abeta42면역화 생쥐로부터의 혈청이 이미 형성된 Abeta 원섬유를 분해할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해, Abeta42면역화 생쥐로부터의 혈청을 이미 형성된 Abeta42원섬유와 함께 30일 이하 동안 배양하였다. 응집의 흔적으로 인해 Abeta 분취량을 일정하게 교반하면서 고농도로 배양함으로써 Abeta42원섬유를 생성하였다. 이미 형성된 원섬유를 혈청없이(Abeta 단독), IAPP-면역화 혈청과 함께 또는 비-면역화 혈청(도시하지 않음)과 함께 배양하면 배양 30일 후에도 어떠한 효과도 없다. 대조적으로, Abeta42-면역화 생쥐(개체수: 26/34)로부터의 혈청은 Abeta42원섬유를 100Å의 평균 길이를 갖는 30Å 직경의 작고 짧은 원섬유, 또는 부정형 응집체로 분해하였다. 이러한 분해는 배양 3일 후에만 명백하게 나타나고, 14일 후에 완전히 분해되었다. 또한, 분해는 농도 의존적이며, 항체의 농도가 증가함에 딸 원섬유 분해에 요구되는 시간은 감소하였다. 최종적으로, 항체 대 Abeta42의 1:1의 비가 분해에 필수적인 것이 아니므로, 항-Abeta 항체는 원형 원섬유성 올리고머 또는 기타 전구체와 같은 Abeta 종의 하위단위(subset)에만 결합할 가능성이 있다. 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 60,OOOX 배율에서 전자 현미경법을 사용하여 결과를 측정하였다.
<실시예 5>
생쥐 항-혈청에 의해 인식되는 Abeta 42 의 면역 표적 에피토프의 질량 분광학적 측정
본 실시예에서, 발명자들은 아밀로이드 침착물 질환의 치료에 사용하기 위한 중요한 생물학적 유의성을 갖는 에피토프를 정확하게 확인하는 방법을 나타낸다.
일반적인 계획
항-Abeta42-혈청에 의해 인식되는 에피토프를 규명하기 위해, 나노-전자분무법(nano-electrospray, nESI) 및 MALDI-이온화법(MALDI-ionization) 둘다를 이용하는 고해상 퓨리에-트랜스폼 이온 사이클로트론 공명 질량 분광법(high resolution Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR-MS; 문헌[Marshall et al., Mass Spectrom. Rev. 17: 1-35, 1998])은 후술된 에피토프 절제 및 에피토프 추출 방법과 함께 적용되었다(문헌[Macht et al., Biochemistry 35: 15, 633-15, 639, 1996\], 문헌[Suckau et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 9848-9852, 1990] 및 문헌[Przybylski et al.,"Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry." In New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ. , Amsterdam, pp.17-43, 1998] 참조).
에피토프 절제로서 공지된 하나의 방법에서, 본 발명자는 펩타이드가 방출된후에 결합된 펩타이드 상에 위치하는 질량 분광학적 펩타이드와 온전하고 고정된 면역 복합체의 선택적인 단백질 분해성 개열을 조합하였다. 구체적으로는, Abeta42-면역화 TgCRND8 생쥐로부터의 혈청, IAPP-면역화 생쥐로부터의 대조군 항-혈청, 생쥐(단일클론성) 및 토끼(다클론성) Abeta42항체를 세파로즈-미세모세관(sepharose-microcapillary)에 고정하였다. 이어, 고정된 항체를 Abeta42응집체에 노출시키고, Abeta42에피토프에 결합하도록 하였다. 다양한 프로테아제 및 엑소펩티다제를 사용하거나, 효소와 함께 면역 복합체의 에피토프 절제 방법을 수행하였다(표 2 참조).
다르게는, 에피토프 추출 방법을 사용하였다. 에피토프 추출에 있어, Abeta42는 다양한 프로테아제로 먼저 소화하고, 후속적으로 프로테아제 가공된 Abeta42펩타이드의 상응하는 혼합물을 항체 컬럼에 적용하고, 항체를 에피토프에 결합하도록 하였다. 결합된 펩타이드의 용출시에 질량 분광법을 사용하여 에피토프를 확인하였다. 이 방법은 에피토프 추출로서 공지되어 있다.
개개의 방법은 하기에 상세하게 기술되어 있다:
항체 면역화
커플링 완충액(0.2M NaHCO3, 0.5M NaCl, pH 8.3) 100㎍의 용액을 건조한 NHS-활성화 6-아미노헥산산-커플링된 세파로즈(Sigma)에 첨가하고, 커플링 반응을20℃에서 60분 동안 수행하였다. 이어, 100㎛ 미세 모세관 컬럼 상에 세파로즈 물질을 전달하여 물질의 손실없이 광범위하게 세척한다(문헌[Macht et al., Biochemistry 35: 15,633-15, 639, 1996] 참조). 상술된 바와 같은 블로킹 완충액(에탄올아민/NaCl)과 세척 완충액(NaAc/NaCl)을 교대로 사용하여 컬럼을 세척하고, pH 7.5 및 4℃에서 컬럼을 최종적으로 PBS에 저장하였다(문헌[Macht et al., Biochemistry 35: 15,633-15, 639, 1996] 참조).
에피토프 절제
먼저, 2 내지 5㎍ Abeta42또는 기타 Abeta-항원을 항체 미세컬럼에 적용하고, 완만하게 교반하면서 20℃에서 60분 동안 배양함으로써 에피토프 절제 방법을 수행하였다. 4㎖ PBS로 5회 연속해서 세척한 후, 200㎕ PBS중의 프로테아제 0.2㎎을 배양함으로써 37℃에서 2시간 동안 컬럼 상에서 프로테아제 소화를 수행하였다. 프로테아제로는 트립신, Lys-C 프로테아제, Asp-N-프로테아제, α-키모트립신 및 Glu-C 프로테아제를 들 수 있다. 4㎖ PBS로 5회 세척함으로써 결합되지 않은 펩타이드, 소화된 펩타이드 또는 상층액을 제거하였다. 이어, 항체 결합된 에피토프 펩타이드를 소화시키고, 0.1%(부피/부피) TFA 500㎕를 첨가함으로써 용출하였다(에피토프 용출).
20℃에서 15분 동안 배양한 후, 에피토프 용출 분획을 동결 건조시키고, 질량 분광학적 분석을 위해 0.1% TFA 10㎕에서 복원시켰다. 30분 동안 아미노펩티다제 M(aminopeptidase M) 또는 카복실펩티다제 Y(carboxypeptidase Y) 0.1㎍과 배양 한 후에 4㎖ PBS로 5회 세척함으로써 부가적인 엑소펩티다제 소화에 의한 방법을 수행하였다.
에피토프 추출
단백질 분해성 소화 혼합물을 항체 컬럼에 적용하고, 20℃에서 60분 동안 배양한다는 것을 제외하고는 에피토프 용출과 동일한 방식으로 에피토프 추출 방법을 수행하였다. 이어, 4㎖ PBS로 5회 세척함으로써 결합되지 않은 펩타이드(상층액)를 제거하였다. 이어, 항체 결합된 에피토프를 분리시키고, 0.1%(부피/부피) TFA 500㎕를 첨가함으로써 용출하였다(에피토프 용출). 20℃에서 15분 동안 배양한 후, 에피토프 용출 분획을 동결 건조시키고, 질량 분광학적 분석을 위해 0.1% TFA 10㎕에서 복원시켰다.
단백질 분해성 소화
50mM NH4HCO3에 용해된 펩타이드 5 내지 50㎍을 사용하여 50:1의 기질 대 프로테아제의 비로 37℃에서 2시간 동안 유리 항원의 단백질 분해성 소화를 수행하였다. 질량 분광학적 분석을 위해 반응 혼합물을 동결 건조시키거나, 에피토프 추출을 위해 제조하였다. 사용된 프로테아제는 트립신(미국 위스톤신주 매디슨 소재의 Promega); Lys-C, Asp-N, Glu-C(Roche-Boehringer Mannheim); α-키모트립신, 아미노펩티다제 M, 카복실펩티다제 Y(Sigma)이다.
질량 분광법
7T 초전도성 자석(superconducting magnet) 및 ICR 분석기 세포가 장착된 브루커(Bruker, Bruker Daltonik, Bremen, FRG) 아펙스(Apex) II FTICR 분광기를 사용하여 FTICR-MS를 수행하였다(문헌[Bauer et al., Anal. Biochem. 298: 25-31, 2001] 참조). 이전에 파동 충돌(pulsed collision) 아폴로-나노-ESI-공급원(Apollo-nano-ESI-source)과 함께 MALDI-FTICR 공급원, 및 기계의 조건 및 질량 검정(mass calibration)이 기술되어 있다(문헌[Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496, 2000] 참조). 질량 측정 정확도는 약 200,000의 질량 해상도에서 약 1ppm(MALDI)이고, 전형적으로는 0.5 내지 1ppm(ESI)이다. 2,5-다이-하이드로벤조산(DHB)을 MALDI-MS 시료 제조용 매트릭스로서 사용하였다(문헌[Bauer et al., Anal. Biochem. 298: 25-31, 2001] 참조). 0.01% TFA 수용액을 사용하여 ESI-MS를 일반적으로 수행하였다(문헌[Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496, 2000] 참조).
질량 분광법의 결과
ESI- 및 MALDI-FTICR-질량 분광법에 의한 분석에 의해 세파로즈-조건화된 미세모세관에 고정된 항체에 의한 에피토프 절제 및 추출을 수행하였다(문헌[Macht et al., Biochemistry 35: 15633-39, 1996] 및 문헌[Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496, 2000 참조, 및, 문헌[Bauer et al., Anal. Biochem. 298: 25-31,2001] 및 문헌[Przybylski et al., "Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry." In New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, pp.l7-43, 1998] 추가로 참조). 먼저, 유리 Abeta42항원의 트립신성 펩타이드 혼합물의 MALDI-MS는 하기 펩타이드를 포함하는 예상된 Abeta 단백질 분해성 펩타이드 모두를 나타낸다:
Lys-C 및 트립신 소화를 사용하는 에피토프 절제는 MALDI-FTICR 검출을 이용하여 단일 이온 종 Abeta(1-16)1957.8806을 생산하는 단일 펩타이드 단편을 용출한다. 이 경우에, Abeta의 R5 잔기는 Lys-C 및 트립신에 의한 소화로부터 보호된다.
S. 아우레우스(S. Aureus) Glu-C 프로테아제를 이용한 에피토프 절제시에 펩타이드 단편 Abeta(1-11)1324.5395Da이 용출된다.
α-키모트립신 및 아미노펩티다제 M 개열 이후에 에피토프 추출로부터의 용출물의 ESI- 및 MALDI 스텍트럼은 Abeta(1-10)1195.4968Da 및 Abeta(4-l0)880.3827Da의 단편을 생산하였다.
항체 결합된 키모트립신 단편 및 Abeta(1-10)면역 복합체의 아미노펩티다제 M-소화를 이용함으로써 코어(core) 에피토프를 결정하였다. 이러한 이중 소화는 최소 에피토프로서 Abeta42의 친화성에 상응하는 친화성을 갖는 Abeta(4-10), FRHDSGY를 확인하였다. 카복실펩티다제 A를 사용한 Y10으로부터의 추가적인 C-말단 소화가 Abeta42와 비교시에 급격히 감소된 친화성을 갖는 펩타이드를 수득하였기 때문에 C-말단 아미노산은 Y10이다.
표 3은 항-Abeta 항체 및 Abeta 펩타이드를 사용하는 에피토프 절제 및 추출 방법의 질량 분광법에 의해 수득된 펩타이드 단편을 나타낸다. Abeta42펩타이드(표 3의 1열)가 트립신에 의해 예비 소화되는 경우, 항체 결합 부위로부터 수득된 펩타이드는 표 3의 1열에서 나타나 있는 서열에 상응하였다. 트립신과 Lys-C 프로테아제의 조합은 동일한 16개의 잔기 펩타이드(표 3의 2열)를 확인하였다. 프로테아제가 S. 아우레우스 Glu-C 프로테아제이고, 에피토프 절제에 사용되는 경우, 표 3의 3열에서 나타나 있는 바와 같이 11개의 잔기 펩타이드가 항체 결합 부위로부터 용출되었다. 10개의 잔기 펩타이드는 α-키모트립신 단독 소화에 의해 관찰되었다(표 3의 4열). 표 3의 5열에 나타나 있는 바와 같이, 2개의 효소인 α-키모트립신 및 아미노펩티다제 M에 의해 프로테아제 소화를 수행하는 경우 7개의 아미노산 코어 에피토프가 관찰되었다.
요약
MALDI- 및 ESI-MS 분석은 에피토프 절제시에 유일하고 특정한 생성물로서 N-말단 서열인 Abeta(1-10)을 포함하는 선형 에피토프를 확인하였다(표 3 및 표 4 참조). 유리 Abeta42항원의 트립신 소화의 질량 분광법은 예상된 모든 펩타이드 (1-16), (6-16), (17-28) 및 (29-42)을 수득하였다(표 3 및 표 4 참조). 트립신 및 Lys-C-프로테아제에 의한 에피토프 절제는 단일 펩타이드(1-16)를 제공한다. Glu-C-프로테아제 및 α키모트립신은 단편 (1-11) 및 단편 (1-10)을 각각 생성한다(표 3 및 표 4 참조). 대조적으로, 잔기 R5, E3 및 F4는 이들 프로테아제에 의한 소화로부터 각각 차폐되었다. 항체-결합된 엔도 프로테아제 단편의 추가적인 소화를엑소펩티다제로 수행하여 코어 에피토프를 한정하였다. 키모트립신성 단편의 아미노펩티다제 M-소화는 Abeta42의 친화성에 상응하는 친화성을 갖는 최소 에피토프로서 Abeta(4-10); FRHDSGY를 확인하였지만, Y10(카복실펩티다제 A)로부터의 추가적인 C-말단 소화는 급격히 감소된 친화성을 갖는 펩타이드를 수득하였다. 질량 분광학적 에피토프 절제 실험에서 수득된 친화성 차이는 알킬아미노-스페이서 그룹을 통한 N-말단에서 비오티닐화된 합성 에피토프 펩타이드의 ELISA에 의해 측정된 친화성과 완전히 일치한다(문헌[Gitlin et al., Biochem. J. 242: 923-926, 1987] 및 문헌[Craig et al., Anal. Chem. 68: 697-701, 1996] 참조). 에피토프는 단일 동위원소성 분자 이온(monoisotopic molecular ion)의 높은 질량 측정 정확도(0.5 내지 2ppm)에 의해 명확하게 확인되었다. 또한, 이들 결과는 IR-다중광자 레이저 분리, 및 서열 돌연변이체 및 동종의 Abeta42펩타이드를 이용한 대조군 실험(도시하지 않음)에 의한 FTICR-스펙트럼에서의 선별된 분자 이온의 서열-특이적 단편화에 의해 확인되었다(문헌[Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496, 2000] 참조). 따라서, R5G 및 Y10F 이중 돌연변이를 포함하는 래트 Abeta42는 에피토프 절제시에 어떠한 용출 생성물을 수득하지 않았다. 대조적으로, 인간 Abeta(1-40)및 Abeta(1-30)은 Abeta42와 동일한 에피토프(4-l0)을 제공하였다. IAPP-면역화 생쥐로부터의 대조군 항체는 어떠한 검출가능한 에피토프 펩타이드를 수득하지 않았다(표 3 및 표 4 참조).
<실시예 6>
Abeta 펩타이드의 구조적인 특징화
본 실시예에서, 발명자들은 면역화된 항체에 대해 확인된 합성 에피토프 펩타이드의 친화성과 Abeta42의 친화성을 비교하고, 용액에서 합성 에피토프 펩타이드의 2차 구조를 특징화하였다.
합성 펩타이드, 2차 구조 분석, 및 상응하는 진정 펩타이드(authenticpeptide), 비오틴-Gly-Gly-Abeta(1-10)및 비오틴-Abeta(4-10)의 면역-분석적 특징화하여 질량 분광법에 의해 확인된 에피토프를 추가로 특화하였다. 먼저, 에피토프 펩타이드의 ELISA 및 도트-블롯 분석(dot-blot analysis)을 이용하여 항-Abeta 항체에 대한 다양한 펩타이드의 친화성을 측정하였다(데이터는 도시하지 않음). 결과는 표 3에 나타나 있는 모든 펩타이드가 Abeta42에 상응하는 친화성을 나타냈다는 것을 보여주었다.
활성 에피토프의 가능한 형태학적 효과를 측정하기 위해, Abeta40 및 Abeta42의 이전에 보고된 구조와 N-말단 펩타이드의 2차 구조를 비교하였다. N-말단의 극성 펩타이드인 Abeta(1-19)및 Abeta(1-16)의 CD 스펙트럼 및 2D NMR-NOESY 스펙트럼(도시하지 않음)은 Abeta 단편에 대한 명확한 용액 구조의 임의의 증거를 보여주지 않았다. 그러나, 이 같은 데이터는 항체 인식에 대한 에피토프의 특정 유연성을 제시한다. 이는 Abeta(4-10)에피토프 영역 주변에서 α-나선 형성에 대한 경향에서의 차단을 보여주는 Abeta42서열에 대한 2차 구조의 예측과 일치한다. 대조적으로, 막횡단 영역(Abeta(18-42))을 포함하는 서열에 대해 α-나선 경향 및 나선-코일/3-시트(sheet) 형태적인 전이가 관찰되었다(문헌[Coles et al., Biochemistry 37: 11064-1107, 1998] 및 문헌[Kohno et al., Biochemistry 35: 16094-16104, 1996] 참조).
<실시예 7>
Abeta-유도 독성에 대한 혈청의 효과
본 실시예에서, 발명자는 Abeta-면역화 혈청이 Abeta42-유도 세포독성을 억제하는 능력을 측정하였다.
일반적인 계획
Abeta-면역화 이후에 TgCRND8 생쥐에서 기억 결핍의 예방이 Abeta의 세포독성에 대한 유사한 효과를 반영할 수 있는 지를 측정하기 위해, 본 발명가는 PC-12 세포를 이용하여 표준 Abeta42독성 분석을 수행하였다(문헌[McLaurin et al., J. Biol. Chem. 275: 18495-502, 2000] 및 문헌[Pallitto et al., Biochemistry 38: 3570-78, 1999] 참조). 먼저 혈청의 유무에 따라 PC12 세포을 Abeta42와 함께 24시간 동안 배양하였다. 이어, 대사활성을 나타내는 알라머 블루 분석(Alamar blue assay)(문헌[Ahmed et al., J. Immunol. Methods 170: 211-24, 1994]), 및 세포간 에스테라제 활성 및 플라즈마 막 활성 둘다를 나타내는 사활 분석(Live/Dead assay)(문헌[Pike et al., J. Biol. Chem. 270: 23895-98, 1995]) 둘다를 이용하여 세포성 독성을 측정하였다.
Abeta 독성 분석
PC-12 세포를 96웰 플레이트에서 웰당 500세포로 도말하고, N2/DMEM(미국 메릴랜드주 록크빌 소재의 Gibco/BRL)에서 희석된 30ng/㎖ NGF(Alamone Labs, Israel)에 현탁하였다. 세포가 웰당 10,000 내지 15,000개의 최종 세포수가 되도록 5 내지 7일 동안 분화시켰다. 실온에서 3일 동안 Abeta를 용액(25mmol) 중에 유지시켜, 배양액에 첨가하기 전에 원섬유 형성을 유도하였다. 이러한 beta 제제는 전자 현미경법에 의해 측정된 바와 같이 ADDL 및 원형 원섬유(신경 독소로서 현재까지 확인된 Abeta-종)을 포함하는 다수의 집합 올리고머를 포함한다(도시하지 않음)(문헌[Lambert et al., J. Neurochem. 79: 595-605, 2001], 문헌[Walsh et al., J. Biol. Chem., 274: 25945-52, 1999] 및 문헌[Hartley et al., J. Neuroscience 19: 8876-8884, 1999] 참조). 또한, 웨스턴 블럿 분석은 Abeta42-면역화 혈청은 Abeta42단량체, 사량체, 육량체 및 98kDa 초과의 큰 올리고머(도시하지 않음)를 인식한다는 것을 증명하였다. 3일 동안의 예비 배양 이후, 최종 농도가 0.1㎍/㎕가 되도록 Abeta를 세포 배양액에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 사활 형광 분석(Live/Dead fluorescent assay)(미국 오리곤주 유겐 소재의 Molecular Probes) 및 알라마 블루 분석(미국 캘리포니아주 카마릴로 소재의 Biosource Inc)을 이용하여 독성을 분석하였다.
결과
비-면역화 또는 IAPP-면역화 생쥐로부터의 혈청은 Abeta-독성에 대한 효과가 없었다. 대조적으로, Abeta42-면역화 생쥐로부터 단리된 혈청은 농도 의존적인 방식으로 Abeta42-세포독성을 예방하였지만, 이들 효과의 정도에서 두드러진 가변성을 나타냈다. 이 분석에서, Abeta42-유도 독성과 비교시에 n은 18/22이고, p는 0.01 미만이고, n은 4/22이고 p는 0.001 초과이다. 세포 생존과 원섬유 분해의 정도 사이의 관계를 개개의 혈청에 대해 플로팅(plotting)하고, 독성을 억제하고 원섬유를 분해하는 혈성의 효율성 사이의 직접적인 관계를 나타냈다. 또한, 원섬유 형성/분해를 억제하는데 있어 가장 효율적인 항체는 또한 독성을 감소시키는데 가장 효율적이다(불활성 혈청과 비교시 3일경에 p는 0.001 미만이고, 7일경에 p는 0.0001 미만임).
세포독성을 예방하는데 필요한 항체 대 Abeta의 화학량론(stoichiometry)은 활동 기작에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 세포독성의 억제를 유도하는데 필요한 항체 대 Abeta의 화학량론을 측정하기 위해, 본 발명자는 10개의 반응성 혈성에 대한 EC50을 측정하였다. EC50이 Abeta-유도 세포독성의 50%를 구조하는 혈청의 양으로서 정의되는 경우, EC50값은 234±39의 평균 ±SD를 갖는 1:100 내지 1:300의 범위이다. 결과적으로, 본 발명자는 낮은 항체 대 Abeta의 비(50:1)로 보호 효과가 검출되었다는 것을 발견하였으며, 이는 항체가 단량체성 Abeta 또는 Abeta 응집체가 아닌 Abeta-올리고머, 원형 원섬유 또는 전구체 단백질 단편과 같은 소량의 다양한 종에 결합한다는 것을 제시하였다. 또한, 활성 혈청은 모든 처리 투여량에서 Abeta-세포독성을 상당히 감소시켰으며, 이는 세포사멸이 혈청에 의해 특이적으로 차단되는 과정에 의해 유도된다는 것을 제시하였다. 피셔의 PLSD(Fischer's PLSD,* p<0.01 및 † p<0.001)에 의한 일원변량분석(One way ANOVA)을 사용하여 통계학적 분석을 달성하였다.
<실시예 8>
보호 효과를 중재하는 혈청 성분
본 실시예에서, 본 발명자는 혈청 성분이 Abeta의 감소된 세포독성에 대해 책임이 있음을 결정하는 방법을 보여준다. 본 발명자는 활성 성분이 혈청으로부터의 정제된 IgG에 존재하고, 기타 어떠한 혈청 성분은 Abeta-중재 세포 사멸을 억제할 수 없다는 것을 발견하였다.
Abeta-면역화의 효과가 몇몇 기타 효과, 예를 들어 기타 혈청 단백질의 발현에서의 2차 변화에 기인하는 것이 아니라 Abeta-유도 항체에 기인하였다는 것을 증명하고, Abeta(4-10)에피토프를 선택적으로 표적하는 항체만이 효과적임을 확인하기 위해, 본 발명가는 Abeta42-면역화 혈청으로부터의 정제된 IgG를 사용하여 세포독성 실험을 수행하였다. 또한, 본 발명가는 Abeta의 특정한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 시판되는 단일클론성 항체인 4G8, 6E10 및 Bam10을 포함하였다.
결과는 결정적이었다. Abeta42-면역화 혈청으로부터 정제된 면역글로블린 G는 조질의 혈청과 독성의 동일한 억제를 증명하였으며, 이는 기타 혈청 성분이 보호 반응에 기여하지 않는다는 것을 제시하였다. 또한, 이들 IgG 분획은 Abeta-원섬유 형성을 억제하고, 전체 혈청과 동일한 정도로 Abeta 원섬유 분해를 유도하였다. Abeta 서열 17-24 및 11-17을 각각 인식하는 항체인 4G8 및 6E10은 원섬유 형성을 억제하지 않았지만, 총 원섬유의 양을 감소시켰다. 이들 항체가 용액중의 소량의 유리 Abeta 펩타이드와 결합하여, 원섬유 형성으로부터 이를 격리시킬 수 있기 때문에 후자의 효과가 발생할 수 있다. 대조적으로, Abeta(1-10)내의 서열을 인식하는 Bam10은 Abeta42-면역화 혈청에서 나타난 것과 유사한 원섬유 형성을 억제한다. 이들 결과는 Abeta 서열의 N-말단을 인식하는 항체만이 효과적인 원섬유 형성의 억제제이고, Abeta42-면역화 혈청내의 활성 성분이 특이적 IgG임을 추가로 증명하였다.
<실시예 9 내지 실시예 27>
항원 설계
표 5 및 실시예 9 내지 실시예 27에 나타나 있는 펩타이드는 하기 화학식에 따라 설계되었다:
화학식 I
(A)n-- (Th)m-- (B)o-- Abeta(4-10)-- (C)p
상기 식에서,
Abeta(4-10)의 단일 복사체가 존재하고,
n은 0이고,
m은 1이고,
o는 2이고,
B는 글리신이고,
C는 글리신이고,
p는 1이고,
T-세포 보조 에피토프는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21 중 임의의 서열번호이다. 항원을 포함하는 이들 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43에 상응한다.
<실시예 28>
항원 설계
서열번호 44에 상응하는 실시예 28에 나타나 있는 펩타이드(표 5)가 하나의 예로서, n이 0이고, m이 1이고, o가 1이고, B가 글리신이고, C가 글리신이고, p가 1이고, T-세포 보조 에피토프가 서열번호 21이다. 항원을 포함하는 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 44에 나타나 있는 펩타이드에 상응한다.
<실시예 29>
항원 설계
서열번호 45에 상응하는 실시예 29에 나타나 있는 펩타이드(표 5)가 하나의 예로서, n이 0이고, m이 1이고, o가 0이고, T-세포 에피토프가 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고, C가 글리신이고, p가 1이고, T-세포 보조 에피토프가 서열번호 21이다. 항원을 포함하는 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 45에 나타나 있는 펩타이드에 상응한다.
<실시예 30>
항원 설계
서열번호 46에 상응하는 실시예 30에 나타나 있는 펩타이드(표 5)가 하나의 예로서, n이 0이고, m이 1이고, o가 0이고, T-세포 에피토프가 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고, C가 글리신이고, p가 1이고, T-세포 보조 에피토프가 서열번호 21이다. 항원을 포함하는 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 46에 나타나 있는 펩타이드에 상응한다.
<실시예 31 내지 실시예 33>
항원 설계
실시예 31 내지 실시예 33에 나타나 있는 펩타이드(표 5)는 하기에 나타나 있는 화학식 II에 따라 설계된다:
화학식 II
(A)n-- Abeta(4-10)-- (B)o-- (Th)m -- (C)p
상기 식에서,
Abeta(4-10)의 단일 복사체가 존재하고,
n은 2이고,
m은 1이고,
o는 2이고,
A 및 B는 글리신이고,
p는 0이고,
T-세포 보조 에피토프는 서열번호 21이다. 항원을 포함하는 이들 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 49에 상응한다.
<실시예 34 및 실시예 35>
항원 설계
실시예 34에 나타나 있는 펩타이드(표 5)는 하기에 나타나 있는 화학식 II에 따라 설계된다:
화학식 II
(A)n-- Abeta(4-10)-- (B)o-- (Th)m-- (C)p
상기 식에서,
Abeta(4-l0)의 단일 복사체가 존재하고,
n은 0이고,
m은 1이고,
o는 실시예 34에서는 2이고 o는 실시예 35에서는 1이고,
B는 글리신이고,
p는 0이고,
T-세포 보조 에피토프는 서열번호 21이다. 항원을 포함하는 이들 조합된 B 및 T 세포 에피토프는 서열번호 50 및 서열번호 51에 상응한다.
<실시예 36>
설계된 펩타이드의 합성
서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 대조군 펩타이드인 섬세포 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP)(서열번호 52)에 상응하는 설계된 펩타이드의 고체상 펩타이드 합성은 수동 고체상 합성; 및 Fmoc 보호된 링크 아미드(Rink Amide) MBHA 수지, Fmoc 보호된 아미노산, N,N-다이메틸포름아미드(DMF) 용액중의 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N’,N-테트랍메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)를 이용하는 심포니 펩타이드 합성기(Symphony peptide Synthesizer)를 사용하고, N-메틸 모폴린(NMM)에 의해 활성화하고, Fmoc 그룹의 피페리딘을 탈보호(단계 1)하여 100μmol 규모로 수행하였다. 필요한 경우, Lys(Aloc) 그룹의 선택적인 탈보호는 수동으로 수행되고, 수지를 CHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5) 5㎖에 용해된 Pd(PPh3)4의 3등가량의 용액으로 2시간 동안 처리함으로써 달성되었다(단계 2). 이어, 수지를 CHCl3(6 X 5㎖), 다이클로로메탄(DCM) (6 X 5㎖)중의 20% HOAc, 및 DMF(6 X 5㎖)로 세척하였다. 이어, 몇몇 경우에서는 합성이 하나의 AEEA(아미노에톡시에톡시아세트산(aminoethoxyethoxyacetic acid)) 그룹의 첨가, 아세트산의 첨가 또는 3-말레이미도프로피온산(MPA)의 첨가를 위해 재-자동화되었다(단계 3). 85% TFA/5% TIS/5% 티오아니솔(thioanisole) 및 5% 페놀을 사용하여 수지 개열 및 생성물 단리를 수행한 후, 드라이-아이스로 냉각된 Et2O에 의해 침전시켰다(단계 4). 바리안 (레인닌) 제조용 이원 HPLC 시스템(Varian (Rainin) preparative binary HPLC system)을 이용하는 제조용 역상 HPLC(페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 10μ페닐-헥실의 21㎜ X 25㎝ 컬럼, 및 214 및 254㎚에서의 UV 검출기(바리안 다이나믹(Varian Dynamax) UVD II)를 사용하여 180분에 걸쳐 9.5㎖/분으로 30 내지 55% 완충액(H2O중의 0.045% TFA(A) 및 CH3CN중의 0.045% TFA(B)) 구배 용출)에 의해 생성물을 정제하였다. 다이오드 배열 검출기(diode array detector)가 장착된 휴렛 패커드(Hewlett Packard) LCMS-1100 시리즈 분광계를 사용하고, 전자 분무 이온화를 사용하는 RP-HPLC 질량 분광계에 의해 정제 및 질량 검증을 95% 정도로 확인하였다.
<실시예 37>
화학식 I 및 화학식 II에 따라 설계된 펩타이드 항원에 의한 CRND8 생쥐의 면역화
실시예 2에서 기술된 바와 같이 TgCRND8 생쥐를 이유시키고, 베타-APP 형질전환 유전자의 존재를 위해 유전자형 분석을 하고, 표준 생쥐 우리에서 동일한 성의 2 내지 4마리의 생쥐 그룹으로 투숙하였다. 생쥐에게 음식 펠릿, 분말 음식 및 물을 임의적으로 제공하였다. 모든 생쥐는 첫 번째 면역화 전에 1주 동안 조정하고, 매 면역화 2일전 및 면역화 2일 이후에 이들의 중량을 기록하였다. 실험군 모두는 성 및 중량이 일치하였다.
면역화 프로토콜 및 혈청 단리
서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 대조군 펩타이드인 섬세포 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP) 펩타이드(서열번호 52)에 상응하는 합성 펩타이드를 사용하여 형질전환 CRND8 생쥐를 면역화시켰다. 면역화 프로토콜 및 일정표는 이전에 문헌[Schenk et al. Nature 400: 173-177, 1999]에 개시되었으며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 각각의 세트의 주사를 위해 각각의 펩타이드를 동결 건조된 분말로부터 새롭게 제조하였다. 면역화를 위해, 각각의 펩타이드 2㎎을 탈이온화수 0.9㎖의 개개의 용기에 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱(vortexing)하여 용액을 혼합하였다. 이어, 10X 포스페이트 완충된 식염수(PBS)(이때, 1X PBS는 pH 7.5에서의 0.15M NaCl 및 0.01 인산나트륨임) 100㎕를 각각의 펩타이드 용액에 첨가하였다. 각각의 용액을 다시 볼텍싱하고, 37℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 최초의 면역화를 위한 프로인트 완전 보강제와 후속적인 상승(boost)을 위한 프로인트 불완전 보강제의 비가 1:1(부피/부피)이 되도록 펩타이드를 유화시켰다. 최초의 상승은 초기 면역화 2주 후이고, 그 이후에는 월 1회수행하였다. 각각의 동물을 주사 당 항원 약 100㎍으로 면역화시켰다. 각각의 면역화 그룹은 6 내지 10마리의 생쥐를 포함한다. 이어, 항체의 적정농도는 13주령에는 뒷다리 정맥 전자및 25주령에는 실험의 중단시에 심장 전자(cardiac puncture)를 통해 수집된 혈청 시료(혈액 200㎕)에서 항체 적정 농도를 측정하였다. 이들 연구에 사용하기 전에, 56℃에서 30분 동안 배양함으로써 보체를 불활성화시켰다. Ig 분획을 5㎖ 단백질 G 컬럼 상에서 단리하였다. 시료를 적재하고, PBS로 세척하고, 0.1M 시트르산나트륨으로 용출하고, 1M 트리스로 완충하였다. 모든 Ig 분획을 사용하기 전에 필터 멸균하였다.
면역화 결과
서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 대조군 펩타이드인 섬세포 아밀로이드 폴리펩타이드(islet amyloid polypeptide, IAPP) 펩타이드(서열번호 52)에 상응하는 합성 펩타이드로 면역화된 생쥐, 및 비면역화된 TgCRND8 생쥐 및 이들의 비-형질전환 한배의 새끼로부터 혈청을 단리하였다.
대부분의 생쥐는 Abeta42, 면역원 또는 IAPP에 대해 유의한 적정농도를 생산한다. 흥미롭게도, TgCRND8 형질전환 생쥐 및 이들의 비-형질전환 한배의 새끼의 항-Abeta42적정 농도에서는 어떠한 유의한 차이가 검출되지 않았다. 면역화된 생쥐로부터의 혈청을 사용하여 20주령의 비-면역화 TgCRND8 생쥐로부터의 뇌의 조직 절편에서 성숙한 Abeta 플라크를 포지티브하게 염색할 수 있다. 대조적으로, 대조군 펩타이드 IAPP-면역화 및 비-면역화 생쥐로부터의 혈청은 20주령의 비-면역화 TgCRND8 생쥐로부터의 뇌의 조직 절편에서 성숙한 Abeta 플라크를 염색할 수 없다. 따라서, 상기 결과는 Abeta를 함유하는 신경 병리학적 플라크를 인식하여 결합할 수 있는 항체 자가면역이 유도될 수 있음을 나타낸다.
<실시예 38>
생쥐 면역 혈청에 의한 원섬유 형성의 억제
실시예 3에서 토의된 바와 같이, Abeta 펩타이드는 14일 동안의 배양 기간에 걸쳐 원섬유로 자발적으로 집합할 것이고, 원섬유는 하기에서 기술된 바와 같이 전자 현미경법에 의해 모니터링될 수 있는 특징적인 50 내지 70Å 직경을 갖는다.
전자 현미경법
Abeta42는 10㎎/㎖의 저장 농도로 물에 가용화시킨 후, 또는 성숙한 아밀로이드 원섬유로 집합하기 전에 직접 사용되었다. Abeta42는 100㎍/㎖의 최종 펩타이드 농도에서 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41,서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 대조군 펩타이드인 섬세포 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP) 펩타이드에 상응하는 펩타이드 항원으로 면역화된 생쥐로부터의 혈청의 존재 유무에 따라 배양하였다. 혈청의 일련의 희석액을 Abeta42에 첨가하고, 실온(RT)에서 2주 이하 동안 배양하였다. 네가티브 염색 전자 현미경법에 있어, 탄소-코팅된 피올로폼 그리드를 펩타이드의 수용액 상에 부유시켰다. 그리드를 블로팅하고, 공기 건조시킨 후, 시료를 1%(중량/부피) 포스포텅스텐산으로 염색하였다. 75V에서 60,000X 배율로 작동하는 히타치 7000 전자 현미경으로 펩타이드 집합을 관찰하였다.
전자 현미경 결과
원섬유로의 Abeta의 집합에 대한 면역화 생쥐 혈청의 효과를 측정하기 위해, Abeta42의 존재 유무에 따라 혈청을 37℃에서 14일 이하 동안 상술한 바와 같이 배양하였다. 이 같은 반응 혼합물로부터의 분취량을 1,3, 7, 10 및 14일에 네가티브 염색 전자 현미경으로 Abeta42원섬유의 존재를 조사하였다.
혈청의 부재하에 또는 비-면역화 혈청의 존재하에, Abeta42는 특징적인 50 내지 70Å 직경을 갖는 긴 원섬유(약 7,500Å)를 형성하였다. IAPP-면역화 동물로부터의 혈청의 존재하에, 보다 작고 긴 Abeta42원섬유가 생산되지만, 형성된 원섬유는 특징적인 50 내지 70Å 직경을 갖는다. 대조적으로, B-세포 에피토프 Abeta(4-10)을 포함하는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51에 상응하는 펩타이드 항원으로 면역화된 생쥐의 대부분의 생쥐 혈청은 주로 원섬유 형성을 차단하지만, 몇몇은 이러한 효과를 거의 나타내지 않았다.
또한, 비-면역화 생쥐 혈청의 존재하에서 원섬유를 배양하는 경우에 원섬유의 구조에서는 어떠한 차이도 검출되지 않았다. IAPP로 면역화된 생쥐로부터의 혈청은 원섬유 형성의 정도를 감소시켰지만, 형성된 원섬유는 Abeta42단독에 의해 형성된 원섬유와 유사하다. 최종적으로, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51에 상응하는 펩타이드 항원으로 면역화된 생쥐로부터의 혈청은 다양한 정도로 원섬유 형성을 억제한다.
<110> The Governing Council of the University of Toronto <120> Immunological Methods and Compositions for the Treatment of Alzheimer's Disease <150> US 60/373,914 <151> 2002-04-19 <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 4 Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr 20 25 30 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 5 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6 Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 1 5 10 15 Val Ser Ala Ser His Leu 20 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 7 Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 8 Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys 20 25 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 9 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <400> 10 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Measles virus <400> 11 Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp 1 5 10 15 Thr Glu Ser Tyr 20 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 12 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 13 Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val 1 5 10 15 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 14 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 15 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 16 Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala 1 5 10 15 Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala 20 25 30 Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys 35 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 17 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <400> 18 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 20 Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu 1 5 10 15 Asp Val Asn <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 21 Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys 20 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 25 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 26 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 26 Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly 20 25 30 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 35 40 <210> 27 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 27 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 28 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 28 Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 1 5 10 15 Val Ser Ala Ser His Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 30 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 29 Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gly 1 5 10 15 Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 30 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 30 Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Gly Gly Phe Arg His 20 25 30 Asp Ser Gly Tyr Gly 35 <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 31 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Gly <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 32 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly 1 5 10 15 Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 33 Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp 1 5 10 15 Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 30 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 34 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 35 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 35 Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val 1 5 10 15 Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 36 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 36 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp 20 25 30 Ser Gly Tyr Gly 35 <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 37 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly <210> 38 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 38 Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala 1 5 10 15 Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala 20 25 30 Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 35 40 45 Gly <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 39 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 40 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 41 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 41 Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 42 Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu 1 5 10 15 Asp Val Asn Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 43 Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 30 <210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 44 Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 45 Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly 20 25 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 46 Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 20 25 <210> 47 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 47 Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly 1 5 10 15 Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 20 25 30 <210> 48 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 48 Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn 1 5 10 15 Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 20 25 30 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 49 Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln 1 5 10 15 His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 20 25 <210> 50 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 50 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln 1 5 10 15 His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 20 25 <210> 51 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric sequence <400> 51 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His 1 5 10 15 His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 20 25 <210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe 1 5 10 15 Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 20 25 30

Claims (19)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드:
    화학식 I
    (A)n-- (Th)m-- (B)o-- 베타아밀로이드(Abeta)(4-10)-- (C)p
    상기 식에서,
    A, B 및 C는 각각 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 서열이고,
    n, o 및 p는 독립적으로 0 내지 약 20 범위의 정수이고,
    Th는 독립적으로 보조 T 세포 에피토프(helper T cell epitope), 또는 면역 증강 유사체 또는 이의 단편을 포함하는 아미노산 잔기의 서열이고,
    o가 0인 경우에 Th는 임의의 스페이서(spacer) 잔기없이 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고,
    m은 1 내지 약 5의 정수이고,
    베타아밀로이드(4-10)는 서열번호 1의 아미노산, 또는 연속적인 아미노산 치환체를 포함하는 이의 유사체이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    Th가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드.
  4. 하기 화학식 I로 표시되는 2 이상의 펩타이드 혼합물을 포함하는 펩타이드 조성물:
    화학식 I
    (A)n-- (Th)m-- (B)o-- 베타아밀로이드(4-10)-- (C)p
    상기 식에서,
    A, B 및 C는 각각 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 서열이고,
    n, o 및 p는 독립적으로 0 내지 약 20 범위의 정수이고,
    Th는 독립적으로 보조 T 세포 에피토프, 또는 면역 증강 유사체 또는 이의 단편을 포함하는 아미노산 잔기의 서열이고,
    o가 0인 경우에 Th는 임의의 스페이서 잔기없이 펩타이드 결합을 통해 B 세포 에피토프에 직접 연결되고,
    m은 1 내지 약 5의 정수이고,
    베타아밀로이드(4-10)는 서열번호 1의 아미노산, 또는 연속적인 아미노산 치환체를 포함하는 이의 유사체이다.
  5. (a) 유효량의 보조 T-세포를 제공하는 T-세포 에피토프, 및 펩타이드 베타아밀로이드(4-10)(서열번호 1)로 이루어진 B-세포 에피토프를 포함하는 항원, 및
    (b) 보강제(adjuvant)
    를 포함하는, 아밀로이드-베타 펩타이드(서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 면역성 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    T-세포 에피토프가
    (a) 동일한 단백질 골격(protein backbone) 상에서 B-세포 에피토프의 N-말단에 위치한 하나 이상의 T-세포 에피토프,
    (b) 동일한 단백질 골격 상에서 B-세포 에피토프의 C-말단에 위치한 하나 이상의 T-세포 에피토프, 및
    (c) B-세포 에피토프를 포함하는 단백질 골격에 공유결합을 통해 부착되는 상이한 단백질 골격 상에 위치하는 하나 이상의 T-세포 에피토프로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역성 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 T-세포 에피토프가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 면역성 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 보강제가 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 퀼 A, 퀼 A/ISCOM, 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드/아비딘, 다중음이온, 프로인트 완전 보강제, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민, 프로인트 불완전 보강제 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질을 포함하는 면역성 조성물.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법.
  10. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 알쯔하이머병에 걸린 개인의 뇌에서 아밀로이드 침착물(amyloid deposit)의 양을 감소시키는 방법.
  11. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 면역성 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 알쯔하이머병에 걸린 개인의 뇌에서 아밀로이드 원섬유(amyloid fibril)를 분해시키는 방법.
  12. 펩타이드 베타아밀로이드(4-10)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제 12 항에 있어서,
    아밀로이드 침착을 억제하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제 12 항에 있어서,
    아밀로이드 원섬유를 분해시키는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 펩타이드 베타아밀로이드(4-10)(서열번호 1)을 인식하여 결합하는 항체 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 알쯔하이머병에 걸린 개인을 치료하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    항체 조성물이 다클론성 항체를 포함하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    항체 조성물이 단일클론성 항체를 포함하는 방법.
  18. (i) 화합물을 펩타이드 베타아밀로이드(4-10)(서열번호 1)과 접촉시티는 단계, 및
    (ii) 펩타이드와의 화합물의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는, 화합물이 아밀로이드 침착 및 원섬유 형성의 억제제인지를 결정하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    화합물이 시험관내(in vitro) 아밀로이드 원섬유 형성을 억제하는 지를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
CA2504349A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-15 Diagenics International Corporation Monoclonal antibodies specific for beta-amyloid
US20050106626A1 (en) * 2002-10-20 2005-05-19 George Pieczenik Ligand binding of amyloid peptide protein epitope
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
US8193250B2 (en) 2004-10-22 2012-06-05 Mount Sinai School Of Medicine Compositions and methods for treating alzheimer's disease and related disorders and promoting a healthy nervous system
US20090123952A1 (en) * 2004-11-12 2009-05-14 Pfizer, Inc. Method of Measuring Amyloid-Beta Peptides
KR101667623B1 (ko) 2005-11-30 2016-10-19 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
EP2808032B1 (en) 2005-12-12 2018-08-01 AC Immune S.A. A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
CN101421299A (zh) * 2006-02-22 2009-04-29 株式会社林原生物化学研究所 用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗
CA2630344C (en) 2006-03-23 2015-04-28 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
JP5190957B2 (ja) * 2006-04-28 2013-04-24 国立大学法人 鹿児島大学 アミロイドβ線維化阻害ペプチド
MX2009000476A (es) 2006-07-14 2009-01-28 Ac Immune Sa Anticuerpo humanizado contra beta amiloide.
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2094730A4 (en) * 2006-12-07 2010-08-04 Mayo Foundation METHODS AND MATERIALS ASSOCIATED WITH ANTI-AMYLOID ANTIBODIES
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
MX2009009234A (es) 2007-03-01 2009-12-01 Probiodrug Ag Uso nuevo de inhibidores de ciclasa de glutaminilo.
WO2008128985A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
AU2008311367B2 (en) 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
WO2010024927A2 (en) * 2008-08-28 2010-03-04 The Research Foundation Of State University Of New York Treatment of amyloidoses using myelin basic protein and fragments thereof
US8912145B2 (en) 2008-11-28 2014-12-16 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. Vaccine composition for prophylaxis and/or therapy of Alzheimer's disease
WO2010061899A1 (ja) * 2008-11-28 2010-06-03 北興化学工業株式会社 ワクチンを蓄積する形質転換ダイズ植物およびその利用
CN101797493B (zh) * 2009-02-06 2014-05-21 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法
CN101486768B (zh) * 2009-02-25 2012-05-30 吉林大学 一种用于治疗阿尔茨海默氏病的抗原蛋白及蛋白基因
WO2010124028A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Vasylyev Sergiy V Light collection and illumination systems employing planar waveguide
KR101755737B1 (ko) 2009-09-11 2017-07-07 프로비오드룩 아게 글루타미닐 사이클라제의 억제제로서 헤테로사이클릭 유도체
US9181233B2 (en) 2010-03-03 2015-11-10 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
CA2789440C (en) 2010-03-10 2020-03-24 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
JP5945532B2 (ja) 2010-04-21 2016-07-05 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
CA2806909C (en) 2010-07-30 2019-12-17 Ac Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
US20120321694A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-20 Daniel Larocque Compositions and uses
ES2570167T3 (es) 2011-03-16 2016-05-17 Probiodrug Ag Derivados de benzimidazol como inhibidores de glutaminil ciclasa
DE102011057019A1 (de) * 2011-12-23 2013-06-27 Forschungszentrum Jülich GmbH Standard zur Quantifizierung von pathogenen Aggregaten aus körpereigenen Proteinen
JP6130401B2 (ja) * 2012-01-20 2017-05-17 アンナプラガダ，アナンス 医学画像を客観的に特徴付けるための方法および組成物
US9534048B2 (en) * 2012-08-24 2017-01-03 University Health Network Antibodies to TTR and methods of use
PL2895512T3 (pl) * 2012-09-12 2018-11-30 Neurimmune Holding Ag Przeciwciała swoiste dla polipeptydu amyloidowego ludzkich wysepek (HIAPP) i ich zastosowania
HUE051127T2 (hu) * 2012-10-15 2021-03-01 Medimmune Ltd Béta-amiloid antitestek
WO2015017280A1 (en) 2013-07-28 2015-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
FI3137094T3 (fi) 2014-04-29 2023-03-20 Advantage Therapeutics Inc Alzheimerin taudin (ad) hoitaminen ja ehkäiseminen
SG11201610734RA (en) 2014-07-10 2017-01-27 Bioarctic Neuroscience Ab IMPROVED Aß PROTOFIBRIL BINDING ANTIBODIES
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
WO2017098516A1 (en) * 2015-12-10 2017-06-15 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. VARIANTS OF AMYLOID beta-PROTEIN PRECURSOR INHIBITOR DOMAIN
ES2848720T3 (es) * 2016-11-25 2021-08-11 Genuv Inc Composición para promover la diferenciación y la protección de células madre neurales y método para inducir la regeneración neural utilizando la misma
MA49947B1 (fr) 2017-08-22 2023-03-31 Biogen Ma Inc Compositions pharmaceutiques contenant des anticorps anti-bêta-amyloïdes
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
US11958889B2 (en) 2017-10-25 2024-04-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions of phosphorylated tau peptides and uses thereof
CA3099946A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Universite Laval Use of nod2 agonist for the treatment, prophylaxis and/or delay of the onset of multiple sclerosis and alzheimer's disease
WO2020163730A2 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Ac Immune S.A. Method of safe administration of phosphorylated tau peptide vaccine
KR20220005033A (ko) 2019-04-24 2022-01-12 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 타우 백신의 이종 투여
TW202144387A (zh) * 2020-02-11 2021-12-01 美商聯合生物醫學公司 針對胰島澱粉樣多肽（iapp）的胜肽免疫原及其預防和治療與聚集iapp相關疾病的製劑
CN115925987A (zh) * 2022-02-28 2023-04-07 安域生物科技(杭州)有限公司 基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0671948T3 (da) 1992-06-25 1997-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5840294A (en) 1993-03-29 1998-11-24 Queen's University At Kingston Method for treating amyloidosis
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
CA2161445C (en) * 1993-04-27 2009-06-30 Anna Efim Ladd Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CA2242851A1 (en) 1995-08-17 1997-02-27 The Ontario Cancer Institute Protein fibril assembly assay
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
WO2001097607A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic animal model of neurodegenerative disorders
US6310810B1 (en) 2000-07-14 2001-10-30 Raj Kumar Jain High-speed sense amplifier
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200408811B (en) 2005-07-27
NZ536064A (en) 2008-06-30
NO20045021L (no) 2005-01-18
NO335192B1 (no) 2014-10-20
JP4662719B2 (ja) 2011-03-30
ES2368907T3 (es) 2011-11-23
CA2481952A1 (en) 2003-10-30
AU2003218560B2 (en) 2009-09-03
JP2006505502A (ja) 2006-02-16
JP5345920B2 (ja) 2013-11-20
KR100994748B1 (ko) 2010-11-17
US20120315321A1 (en) 2012-12-13
EP2330113A1 (en) 2011-06-08
CA2481952C (en) 2013-10-29
NO20131483L (no) 2005-01-18
EP1497321A1 (en) 2005-01-19
PL209696B1 (pl) 2011-10-31
US20030232758A1 (en) 2003-12-18
EP1497321B1 (en) 2011-06-29
WO2003089460A1 (en) 2003-10-30
IL196532A (en) 2013-02-28
ATE514707T1 (de) 2011-07-15
JP2013075898A (ja) 2013-04-25
MXPA04010255A (es) 2008-03-04
EP2330113B1 (en) 2016-06-29
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