CN101797493B - 一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明公开了一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法。该方法特征在于凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行。该方法减少了反应前后产物需转移或处理过程中需要利用更多容器的不便，同时也缩短了转移和处理时间，达到了省时、省力、不浪费材料的效果。本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质纯化抗体蛋白的用途。

Description

一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明公开了一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法。 

背景技术

目前，生物制药领域中的反应多为固液或液液反应，终产物也多为固液混合物，在生产过程中反应往往是在反应釜中进行反应，反应完毕后将固液混合物转移到另外一个容器中进行后处理或通过离心进行分离。有时在反应前需要将反应物放置在一个容器中进行预处理，反应时再将经过预处理的反应物转移到反应釜中进行反应。许多固液或液液反应需要重复多次的预处理一反应和/或反应一后处理过程才能达到所需要的反应结果。对于反应条件要求不剧烈，例如不需要特殊的反应温度或者要求搅拌条件温和的反应，在预处理一反应和/或反应一后处理的转移过程中需要利用更多的容器并且增加了处理时间。 

例如制备亲和层析介质，一般采用的方法是：首先用蒸馏水反复清洗凝胶(预处理过程)，加入活化溶液进行反应(活化反应过程)；活化后的凝胶再次反复清洗(后处理过程)，然后与重组蛋白A进行偶联反应(偶联反应过程)；反应后获得偶联重组蛋白A的凝胶再次反复清洗(后处理过程)，备用。上述方法在小规模制备时，需要在多个锥形烧瓶和布氏漏斗中反复操作，一方面增加了操作的复杂性和时间，另一方面也容易造成各种反应成分的流失和浪费，收获的亲和层析介质仅在百克级。如果在更大规模制备时，上述方法的费时、费力、费材料的缺陷则更明显。 

发明内容

本发明公开了一种制备亲和层析介质的方法，亲和层析介质由重组蛋白A与活化的凝胶偶联而成，其特征在于，凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行。 

上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，所述反应釜由釜体和釜盖组成，釜盖位于釜体两端，在反应时，反应釜由釜体(2)、釜盖(1)和(3)组成，反应前预处理或反应后处理反应物时，反应釜由釜体(2)、釜盖(4)和(5)组成。在该反应釜中，不但可以进行固液或液液反应，而且还可以直接将反应前的反应物进行预处理或对反应后的终产物进行后处理。 

上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，包括以下几步骤： 

a.在活化或偶联反应时，将反应物质放入反应釜中，并将反应釜的釜盖(1)、(3)与釜体(2)固定，然后将反应釜放置到混合机上进行反应， 

b.在活化或偶联反应前的预处理或反应结束后进行后处理时，将反应釜的釜盖(4)、(5)与釜体(2)固定，将釜盖(4)、(5)分别连接耐压硅胶管(6)，利用压缩空气将固液混合物分离， 

c.上述a、b操作可重复进行。 

上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，反应釜的釜盖(4)的中间有一通气接头，釜盖(5)为具有不锈钢丝网(7)的不锈钢盖(8)，所述不锈钢盖(8)的中间有一通气接头，釜盖(4)、(5)通过通气接头连接耐压硅胶管(6)。反应釜内还可以设置导流板(9)，所述导流板(9)可以是平面板或弧型板形状。 

上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，活化反应时间为1-24小时， 偶联反应时间为3-72小时。 

上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，活化反应所用的活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺。 

上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，活化剂的浓度是1-10g/L。 

上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，偶联反应所用的重组蛋白A的浓度是10-60g/L。 

本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质的用途，用于纯化抗体蛋白。其中公开了用于纯化抗Her2单克隆抗体的方法。 

本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质。 

本发明中反应釜的结构和工作原理介绍如下： 

在反应时，反应釜由釜体2、釜盖1、3组成(如图1所示)。为了增加密闭效果，防止在反应过程中反应液渗漏，釜体和釜盖接触面的中央可以有圆形凹槽，凹槽中可以放置起密闭作用的垫圈，一般选择聚四氟乙烯垫圈，外用阀兰将釜体和釜盖固定。为了增加固液混合效果，在釜内可以设置导流板9，导流板可为有利于固液或液液混合效果的任意形状，包括但不限于平面板、弧型板，如为平面板，板面和水平面的夹角为60～85度之间，优选75度(如图5所示)。在使用时，将釜盖1、3与釜体2固定，反应釜按图1方向旋转90度，放置到混合机上，按所需的反应时间进行反应。 

反应完毕后，利用可连接压缩空气釜盖4替代釜盖1、具有滤过功能的釜盖5替代釜盖3(如图2所示)，釜盖5为焊接了不锈钢丝网7的不锈钢盖8(如图4所示)，其中不锈钢丝网的规格可以根据具体的固液混合物分离的要求进行调整，一般规格为200-400目。釜盖4的中间有一通气接头(如图3所示)，连接耐压硅胶管6。釜盖5的不锈钢盖8中间有一通气接头(如图4所示)，方 便滤液流出，也可以连接耐压硅胶管6。为了增加密闭效果，防止在压滤过程中液体渗漏，同样地，在釜盖4和5与釜体2接触面的中央可以有圆形凹槽，凹槽中可以放置起密闭作用的垫圈，一般选择聚四氟乙烯垫圈，外用阀兰将釜体和釜盖固定。在使用时，将反应釜固定，釜盖4、釜盖5可以分别连接耐压硅胶管6，利用压缩空气将固液混合物分离。如果需要利用液体对固体进行充分洗涤，可重复将釜盖1、3替换釜盖4、5，将反应釜放置到混合机上，混合数分钟，然后进行压滤。上述操作可重复进行。 

本发明采用在上述反应釜中制备亲和层析介质的方法，可以将预处理一反应和/或反应一后处理过程在同一容器内进行，减少了反应前后产物需转移或处理过程中需要利用更多容器的不便，同时也缩短了转移和处理时间，达到了省时、省力、不浪费材料的有益效果。本发明采用的方法适合大规模制备亲和层析介质。采用在上述反应釜中制备亲和层析介质，收获的介质可以达到几十公斤。 

附图说明

图1，反应釜在反应时的外观平面图； 

图2，反应釜在反应前进行预处理或反应结束后进行后处理时的外观平面图； 

图3，釜盖4的结构剖面图； 

图4，釜盖5的结构剖面图； 

图5，釜体2的横向结构剖面图； 

其中，1：釜盖、2：釜体、3：釜盖、4：釜盖、5：釜盖、6：硅胶管、7：不锈钢丝网、8：不锈钢盖、9：导流板。 

图6，12％SDS-PAGE检测纯化产物图，其中Lanel：Marker；Lane2-4：自 制重组蛋白A亲和介质纯化抗Her2抗体。 

图7，SEC-HPLC检测纯化产物图。 

具体实施方式

实施例1：利用反应釜制备亲和层析介质 

重组蛋白A：rPA50，Repligen公司。凝胶：聚合琼脂糖凝胶Spharose FF，GE公司。活化剂：N-羟基琥珀酰亚胺。混合机：W-600型，江阴市龙昌制药机械有限公司。 

亲和层析介质由重组蛋白A与活化的凝胶偶联而成，其中凝胶活化、活化的凝胶与重组蛋白A偶联的反应过程均在本实用新型的反应釜中进行。活化反应前的预处理、活化反应后的后处理、偶联反应前的预处理以及偶联反应后的后处理过程也均在本实用新型的反应釜中进行。 

活化：将Sepharose FF加入反应釜中，使用釜盖4、5(如图2所示)，用蒸馏水清洗凝胶。然后更换釜盖1、3(如图1所示)，加入活化溶液(5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺，5g/L的碳化二亚胺，0.5g/L的Tween20，10mM磷酸钠盐缓冲液，pH 6.0)。将反应釜放置在混合机上室温反应1小时。 

偶联：更换釜盖4、5，用蒸馏水清洗凝胶(如图2所示)。然后更换釜盖1、3(如图1所示)，加入偶联溶液(30g/L rPA50，0.5g/L的Tween20，10mM磷酸钠盐缓冲液，pH 7.4)。将反应釜放置在混合机上室温反应3小时。 

保存：更换釜盖4、5(如图2所示)，用蒸馏水清洗凝胶。将偶联后的凝胶保存于20％的乙醇中。 

实验例：动态载量(人免疫球蛋白)的比较 

自制的重组蛋白A亲和层析介质及GE公司rProteinA Sepharose Fast Flow装柱，使用GE公司C10/10型层析柱，装至2mL；层析系统为GE公司AKTA Purifier。 

平衡液(20mmol/LPB+250mmol/LNaCl pH7.0)，以1.5mL/min流速平衡层析柱。 

人免疫球蛋白(伽玛莱士，上海莱士血制品有限公司)调节至2mg/mL，首先bypass通过层析系统紫外检测器，读取样品的OD280记为A，并将样品流穿OD＝A/10时，已经通过层析柱的免疫球蛋白量定义为动态载量。 

样品以0.6-1.5mL/min的流速过柱，检测OD280，当OD280＝A/10时，停止上样，计算此时流过层析柱的免疫球蛋白量，除以柱体积2mL，可以得出该柱的动态载量。 

洗脱液(20mmol/l citrate，pH3.0)以1.5mL/min流速过柱。 

层析柱使用完毕，立即用注射用水，以1.5mL/min流速冲洗层析柱。 

保存液(20％乙醇)以0.8mL/min过柱，保存于2-8℃。 

自制重组蛋白A亲和层析介质动态载量测定结果为25.3mg/mL，GE公司rProteinA Sepharose Fast Flow亲和层析介质动态载量测定结果为23.2mg/mL，说明本发明方法制备的亲和层析介质性质优良，完全可以替代现有同类商品。 

实施例2：利用自制的重组蛋白A亲和层析介质纯化重组抗Her2人源化单抗 

自制的重组蛋白A亲和层析介质装柱，使用GE公司C10/10型层析柱，装至2mL；层析系统为GE公司AKTA Purifier。 

平衡液(20mmol/L PB+250mmol/LNaCl pH7.0)，以1.5mL/min流速平衡层析柱。 

重组抗Her2人源化单抗(Herceptin^TM)无血清培养上清，以1.5mL/min的流速过柱。 

平衡液(20mmol/L PB+250mmol/LNaCl，pH7.0)以1.5mL/min的流速过柱 洗脱液(20mmol/l citrate，pH3.0)以1.5mL/min流速过柱。 

收集λ280处有紫外吸收的流出峰。 

层析柱使用完毕，用注射用水，以1.5mL/min流速冲洗层析柱。 

保存液(20％乙醇)以0.8mL/min过柱，直到流出液有乙醇，关闭泵，层析柱保存于2-8℃。 

采用12％SDS-PAGE检测纯化产物(如图6所示)，结果显示采用本发明方法制备的亲和层析介质一步纯化抗体蛋白，其纯度高，重复性好。 

采用SEC-HPLC检测纯化产物(如图7所示)，结果同样显示采用本发明方法制备的亲和层析介质一步纯化抗体蛋白，纯化效果好。 

Claims (7)

1.一种制备亲和层析介质的方法，亲和层析介质由重组蛋白A与活化的凝胶偶联而成，凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行，其特征在于，所述反应釜由釜体和釜盖组成，釜盖位于釜体两端，在反应时，反应釜由釜体(2)、可与釜体密闭连接的第1釜盖(1)和第2釜盖(3)组成，反应前预处理或反应后处理反应物时，反应釜由釜体(2)、可连接压缩空气的第3釜盖(4)和具有滤过功能的第4釜盖(5)组成；所述方法包括以下几步骤：

a.在活化或偶联反应时，将反应物质放入反应釜中，并将反应釜的第1釜盖(1)、第2釜盖(3)与釜体(2)固定，然后将反应釜放置到混合机上进行反应，

b.在活化或偶联反应前的预处理或反应结束后进行后处理时，将反应釜的第3釜盖(4)、第4釜盖(5)与釜体(2)固定，将第3釜盖(4)、第4釜盖(5)分别连接耐压硅胶管(6)，利用压缩空气将固液混合物分离，

c.上述a、b操作可重复进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应釜的第3釜盖(4)的中间有一通气接头，第4釜盖(5)为具有不锈钢丝网(7)的不锈钢盖(8)，所述不锈钢盖(8)的中间有一通气接头，第3釜盖(4)、第4釜盖(5)通过通气接头连接耐压硅胶管(6)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应釜内设置导流板(9)，所述导流板(9)是平面板或弧型板形状。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活化反应时间为1-24小时，偶联反应时间为3-72小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活化反应所用的活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，活化剂的浓度是1-10g／L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，偶联反应所用的重组蛋白A的浓度是10-60g／L。

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