CN1117277C

CN1117277C - 智能集成自动液相色谱系统

Info

Publication number: CN1117277C
Application number: CN 99127592
Authority: CN
Inventors: 饶平凡; 李珑; 陈天豹; 王中来; 周建武; 许巧玲; 程万里
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2003-08-06
Anticipated expiration: 2019-12-28
Also published as: CN1301964A

Abstract

本发明提供一种智能集成自动液相色谱系统，它是利用沉降-过滤-嗜硫色谱法设计而成，它是由沉降装置、过滤装置、嗜硫色谱装置及自动控制装置组成，它能将蛋白质分离中的样品预处理过程和色谱分离过程两大工序一体化，从而大大简化生产步骤；整个工艺流程可以全部由计算机自动控制，从而可实现低成本、高纯度、规模化地制备鸡蛋特异性抗体IgY。本系统的应用不仅仅限于鸡蛋抗体的分离，而且稍做调整后亦可用于血液、乳汁中抗体的分离。

Description

智能集成自动液相色谱系统

本发明涉及一种自动液相色谱系统，适用于制备克级规模生物制品，特别适用于制备克级规模的鸡蛋特异性抗体。

鸡蛋抗体在生命科学领域和生物技术产业中具有广阔的应用前景，目前国际上已经开发的抗体分离法，即便是技术上处于领先的日本太阳公司的分离法，基本上就是经典的蛋白质分离法，如高分子电解质沉淀脂蛋白、乙醇沉淀法、凝胶过滤法和离子层析等方法，而由这些方法设计的设备通常又将蛋白质分离中的样品预处理过程和色谱分离过程两大工序分开进行，使得整个制备过程中普遍存在着步骤多、过程复杂、批量小而试剂耗量大、设备投资高等问题，难以实现工业化生产，而且鸡蛋特异性抗体IgY总的回收率最高的仅65％，脱脂率只有93％，总之，现有技术均无法同时具备低成本、高纯度、规模化地制备鸡蛋特异性抗体IgY。

本发明的目的是提供一种智能集成自动液相色谱系统，它能将蛋白质分离中的样品预处理过程和色谱分离过程两大工序一体化，从而可实现低成本、高纯度、规模化地制备鸡蛋特异性抗体IgY。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。

本发明是利用沉降-过滤-嗜硫色谱法设计而成的，即它对蛋黄液的预处理是通过柠檬酸-磷酸缓冲液一步沉降蛋黄液得到上清液来实现的，从而大大简化了蛋黄样品的预处理；采用硅藻土作为助滤剂，进行一次膜微滤，除脂率极高；采用嗜硫吸附色谱材料(T-gel)单步分离纯化鸡蛋抗体，可得到高纯度的鸡蛋抗体lgY。本发明是由沉降装置、过滤装置、嗜硫色谱装置及自动控制装置组成，沉降装置是由沉降罐组成，过滤装置是由过滤器、压力罐、空气钢瓶及高压阀组成，嗜硫色谱装置是由混合罐、色谱柱、蠕动泵、紫外检测器、溶液贮罐及产品收集器组成，自动控制装置是由工业控制计算机、A/D转换器、搅拌器、计量泵、电磁阀、组合阀、两个液位计、两个温度计、电导仪及压力计组成，组合阀是由气控用电磁阀及自动液相色谱气控阀组成，它置于嗜硫色谱装置中流入色谱柱的溶液的输送管道中，电磁阀置于沉降装置及过滤装置的每一液体及气体输送通道中，它还置于嗜硫色谱装置中从溶液贮罐输送给混合罐的通道、排气口处及检测器出口处；沉降罐中的液体可流入压力罐，空气钢瓶中的压缩空气可作用于压力罐，使得压力罐中的液体能经过过滤器过滤后流入混合罐，压力计安装在压力罐上；两个液位计分别安装在沉降罐及混合罐上；搅拌器和电导仪均置于混合罐内；溶液贮罐中的液体分为浓盐液、平衡液、洗脱液、再生液及蒸馏水，其中浓盐液经计量泵流入混合罐，其余四种液体经蠕动泵流入色谱柱；混合罐中的液体经蠕动泵可流入色谱柱；色谱柱的输入通道处有一排气口，输出通道与紫外检测器连接，紫外检测器输出通道分别与产品收集器及废液罐连接，液位计、电导仪、紫外检测器、温度计及压力计将采集到的信号经A/D转换器输入给工业控制计算机，并经其处理后输出给电磁阀、组合阀、计量泵、蠕动泵、搅拌器，沉降罐、压力罐及过滤器置于4℃的冷柜内，嗜硫色谱装置、计量泵、组合阀及溶液贮罐均置于20℃冷柜内，空气钢瓶、高压阀及工业控制计算机置于冷柜外，两个温度计分别安装在上述两个冷柜内。

本发明具有如下优点：(1)自动化：整个工艺流程可以全部由计算机自动控制；(2)简单化：本发明能将蛋白质分离中的样品预处理过程和色谱分离过程两大工序一体化，从而大大简化了生产步骤，可实现低成本、高纯度、规模化地制备IgY；(3)高度集成化：沉降、过滤、吸附等全部过程高度集成到两个冷柜内，具有占地面积小、便于自动控制等优点；(4)机动灵活：本发明可任意选择全自动、分步自动或手动控制；(5)自动数据采集：整个自动液相色谱分离过程的实验数据，全部被计算机自动采集，并记录到数据文件中，便于进一步用其他软件进行数据分析和处理；(6)多用途：i)沉降、过滤预处理过程，可用于其它悬浮液的沉降与过滤预处理；ii)吸附、洗脱、再生自动色谱分离过程，既可直接用于不同体系(如蛋黄、血液及牛奶中的免疫球蛋白)的自动层析分离，也可通过改变色谱材料，将本系统扩展用于其它物系的自动层析分离(如转基因效用蛋白的亲和层析分离等)。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步的详细描述：

图1为本发明的带检测点、控制点的工艺流程图。

图2为本发明中自动控制装置电路方框图。

图3为本发明工艺流程程序框图。

图4为组合阀的结构框图。

图5为组合阀中自动液相色谱气控阀的结构图。

图6为整个工艺过程的检测曲线图。

如图1至图5所示，本发明是由沉降装置、过滤装置、嗜硫色谱装置及自动控制装置组成，沉降装置是由沉降罐A组成，过滤装置是由过滤器C、压力罐B、空气钢瓶及高压阀组成，嗜硫色谱装置是由混合罐D、色谱柱J、蠕动泵E1、紫外检测器、五种溶液(即浓盐液E、平衡液F、洗脱液G、再生液H、蒸馏水I)贮罐及产品收集器组成，自动控制装置是由工业控制计算机(其型号为IPC-610 P233)、A/D转换器(型号为A-823)、搅拌器、计量泵E2、电磁阀a、b、c、d、e、j、k、L，组合阀f、g、h、i、m，液位计Y1、Y2，电导仪Q、温度传感器及压力计P组成，如图4和图5所示，组合阀是由气控用电磁阀及自动液相色谱气控阀组成，气控用电磁阀的压缩空气出口与自动液相气控阀的压缩空气进口连接，在嗜硫色谱装置中使用组合阀可避免气液两相流问题，组合阀g、h、i、m、f分别置于嗜硫色谱装置中的平衡液F贮罐、洗脱液G贮罐、再生液H贮罐、蒸馏水I贮罐及混合罐D的输送通道中，电磁阀a、b、c、d分别置于沉降装置及过滤装置的每一液体及气体的输送管道中，浓盐液贮罐与混合罐D是通过管道连接的，且在它们之间置有计量泵E2及电磁阀e，沉降罐中的液体可经电磁阀a流入压力罐B，压力罐B中的液体在空气钢瓶中压缩空气的作用下流经过滤器C过滤后流入混合罐D，混合罐D中的液体可经组合阀f及蠕动泵E1流入色谱柱J，平衡液F、洗脱液G、再生液H及蒸馏水I均可经组合阀及蠕动泵E1流入色谱柱J，在色谱柱J入口附近的排气口处及紫外检测器的输出通道上均有一电磁阀L、J、K，由色谱柱J流经紫外检测器的IgY被产品收集器收集，其废液流入废液罐；压力计P安装在压力罐B上；两个液位计Y1和Y2分别置于沉降罐A及混合罐D上，搅拌器R及电导仪Q均置于混合罐D内，液位计Y1和Y2、电导仪Q、紫外检测器、温度计及压力计P将采集到的信号经A/D转换器输入给工业控制计算机，并经其处理后输出给电磁阀a、b、c、d、e、j、k、L，组合阀f、g、h、i、m，计量泵E2、蠕动泵E1及搅拌器R，并控制他们动作，其中AD_x表示A/D板第x模拟量输入通道，DO_x表示A/D板第x数字量输出通道，DA_x表示A/D板第x模拟量输出通道，空气钢瓶、高压阀及工业控制计算机置于冷柜外，其余的均置于冷柜内，其中沉降装置及过滤装置置于4℃的冷柜内，嗜硫色谱装置置于20℃的冷柜内，两个温度计分别置于上述两个冷柜内。如图1、图3及图6所示，以全自动工作方式方例，详细描述本发明的工作过程如下：(1)对工作方式和工作参数进行设置，即工作方式设置为“全自动”方式，工作参数包括液位值、电导值、检测值、时间等等；(2)点击“启动”，开始全自动工作；(3)沉降过程：当沉降罐A中的悬浮液沉降到一定程度后(通常为3～5小时)，打开电磁阀A和D使上清液流入压力罐B；(4)过滤过程：当液位计Y1显示值等于设定值时，而沉降罐中的上清液全部流入压力罐B后，在电脑的控制下自动关闭电磁阀A和D，打开高压阀及电磁阀b和c，靠气压使压力罐B中的液体流入过滤器C进行过滤，其滤液流入混合罐D；(5)嗜硫色谱上样液预处理过程：当液位计Y2显示值达到设定值，即压力罐B的液位为零时，关闭高压阀及电磁阀b和c，启动搅拌器R，添加约90％固体Na₂SO₄，待溶解后，等待并点击提示窗中的“确定”按钮，打开电磁阀e，启动计量泵E2，使缓冲液与过滤液在混合罐D中定量混合，当电导值等于设定值时，关闭计量泵E2及搅拌器R；(6)嗜硫色谱过程：在此过程中，流出色谱柱的液体经过紫外检测器检测蛋白质的浓度，检测波长为280nm，整个过程的检测曲线如图6所示，即：1)、1→2为预平衡过程：打开组合阀g及电磁阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，用平衡液F对色谱柱J进行预平衡，使色谱柱中的离子强度达到上样吸附时所需的离子强度，其废液流入废液罐，延时一定时间后，关闭蠕动泵E1，组合阀g及组合阀j；2)、2→3为上样吸附过程：打开组合阀f和组合阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，让混合罐D中的混合液流入色谱柱进行再生，使产品(如IgY)吸附在色谱材料(如T胶)上，而其它组分则流过色谱柱，不被吸附在色谱材料上。图6中的“3”点表示吸附饱和点，当检测值上升至某值(上样稳定值)并稳定时，即达到吸附饱和点时，关闭组合阀f、电磁阀j及蠕动泵E1；3)、3→4为平衡冲洗过程：打开组合阀g及电磁阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，用平衡液F对色谱柱J进行冲洗，将残留在色谱柱J中床层空隙内的未吸附组分全部赶出去，以免这些未吸附组分混入后面的洗脱产品中，当检测值下降至某值(平衡稳定值)并稳定时，关闭蠕动泵E1、组合阀g及组合阀j；4)、4→5为洗脱过程：打开组合阀h及电磁阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，使洗脱液G流入色谱柱，以洗脱吸附在色谱材料(如T胶)上的产品(如IgY)，延时一定时间后，若检测值开始迅速上升(收集起始值)，则打开电磁阀k，关闭电磁阀j，收集产品，延时一定时间后，若检测值下降至某值(洗脱终止值)并稳定时，关闭蠕动泵E1、组合阀h及组合阀k，若色谱柱需要再生，则执行下一步，否则结束生产或返回步骤1)；5)、5→6为水洗过程：打开组合阀m及电磁阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，使蒸馏水I流入色谱柱J，以冲洗色谱柱上的杂质，以便节省再生液用量，延时一段时间，关闭蠕动泵E1、组合阀m及组合阀j；6)、6→7为再生过程：打开组合阀I和L，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，使再生液H流入色谱柱J，将残留在色谱柱上的杂质全部洗出，色谱柱得到再生，以便可以循环使用，延时一定时间后，当检测值下降至某值(再生终止值)时，关闭蠕动泵E1、组合阀i及电磁阀j，结束生产或者将再生液换成蒸馏水，打开组合阀m和电磁阀L，启动蠕动泵E1，排除管道空气，延时1～2分钟，关闭电磁阀L，打开电磁阀j，使蒸馏水流入色谱柱J，延时一定时间后，关闭蠕动泵E1、组合阀m及电磁阀j，返回步骤1)，如此循环直至生产结束。

Claims

1、一种智能集成自动液相色谱系统，其特征是它是由沉降装置、过滤装置、嗜硫色谱装置及自动控制装置组成，沉降装置是由沉降罐组成，过滤装置是由过滤器、压力罐、空气钢瓶及高压阀组成，嗜硫色谱装置是由混合罐、色谱柱、蠕动泵、紫外检测器、溶液贮罐及产品收集器组成，自动控制装置是由工业控制计算机、A/D转换器、搅拌器、计量泵、电磁阀、组合阀、两个液位计、两个温度计、电导仪及压力计组成，组合阀是由气控用电磁阀及自动液相色谱气控阀组成，它置于嗜硫色谱装置中流入色谱柱的溶液的输送管道中，电磁阀置于沉降装置及过滤装置的每一液体及气体输送通道中，它还置于嗜硫色谱装置中从溶液贮罐输送给混合罐的通道、排气口处及检测器出口处；沉降罐中的液体可流入压力罐，空气钢瓶中的压缩空气可作用于压力罐，使得压力罐中的液体能经过过滤器过滤后流入混合罐，压力计安装在压力罐上；两个液位计分别安装在沉降罐及混合罐上；搅拌器和电导仪均置于混合罐内；溶液贮罐中的液体分为浓盐液、平衡液、洗脱液、再生液及蒸馏水，其中浓盐液经计量泵流入混合罐，其余四种液体经蠕动泵流入色谱柱；混合罐中的液体经蠕动泵可流入色谱柱；色谱柱的输入通道处有一排气口，输出通道与紫外检测器连接，紫外检测器输出通道分别与产品收集器及废液罐连接，液位计、电导仪、紫外检测器、温度计及压力计将采集到的信号经A/D转换器输入给工业控制计算机，并经其处理后输出给电磁阀、组合阀、计量泵、蠕动泵、搅拌器，沉降罐、压力罐及过滤器置于4℃的冷柜内，嗜硫色谱装置、计量泵、组合阀及溶液贮罐均置于20℃冷柜内，空气钢瓶、高压阀及工业控制计算机置于冷柜外，两个温度计分别安装在上述两个冷柜内。