NO335192B1 - Immunologiske peptider og peptidpreparater som induserer dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid; deres anvendelse til fremstilling av et medikament for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom, og en fremgangsmåte for bestemmelse av hvorvidt en forbindelse er en inhibitor av amyloide avleiringer og fibrilldannelse. - Google Patents

Abstract

Sammendrag Foreliggende oppfinnelse gjelder immunogene preparater og peptider som omfatter aminosyrerestene 4-10 (FRHDSGY) i det amyloide peptid Abeta42. Oppfinnelsen gjelder videre antistoffer som bindes til den antigene determinant Abeta 4-10.Antigenene og de immunogene preparater i følge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for behandling av Alzheimers sykdom, for utforming av lavmolekylære inhibitorer av amyloid deponering, og som diagnostiske reagenser.

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse gjelder immunogene preparater og deres anvendelse ved behandling av Alzheimers sykdom. Foreliggende oppfinnelse gjelder videre fremgangsmåter for påvisning av forbindelser som inhiberer dannelse av amyloide plakk og/eller fjerner de foreliggende amyloide plakk som er forbundet med Alzheimers sykdom og andre nevrodegenerative sykdommer.

BESKRIVELSE AV TEKNIKKEN STAND

Alzheimers sykdom ("AD") er en nevrodegenerativ hjernesykdom som er hovedårsaken til dementia blant eldre. Symptomene på AD kan omfatte progressivt tap av lære- og hukommelsesfunksjoner, personlighetsendringer, nevromuskulære endringer, kramper og av og til psykotisk adferd.

Alzheimers sykdom særpreges ved to adskilte nevropatologier: utfelling av amyloide plakk i områder i hjernen som er avgjørende for hukommelse og andre kognitive funksjoner, og utvikling av nevrofibrilære nettverk inne i nerveceller. Man tror at utfelling av amyloide plakk i disse kritiske områder i hjernen forstyrrer hjernefunksjoner. På tilsvarende måte er det blitt foreslått at de nevrofibrilære nettverk som akkumuleres i nerveceller hos AD-pasienter interfererer med kommunikasjonen mellom nevroner.

Nok et særpreg ved Alzheimers sykdom er forekomsten av det hydrofobe amyloid-beta-peptid (Abeta42) som en hovedbestanddel av amyloide plakk. Amyloid-beta-peptidet (Abeta42) er et fragment som dannes ved proteolytisk prosessering av et normalt integrert membranprotein som betegnes amyloidproteinforløper (APP), alternativt betegnet Alzheimers sykdom amyloid-A4-protein.

Amyloidbeta-peptider (Abeta) utgjør en gruppe av peptider med lengde 39-43 aminosyrer som dannes ved prosessering av APP. Se Pallitto et al., Biochemistry 38:3570-3578 (1999). Abeta-peptidene omfatter generelt fra 11 til 15 aminosyrerester fra transmembranområdet i APP og inneholder derfor et hydrofobt område, selv om det fullstendige Abeta-peptid kan ha en amfifil natur. Se Kang et al., Nature 325:733-736

(1987). Det er blitt vist at Abeta-peptider er toksiske for celler i kultur. Se Pike et al., Eur. J. Pharmacol. 207:367-368 (1991); Iversen et al., Biochem. J. 311:1-16 (1995). Toksisiteten av Abeta-peptider i Alzheimers sykdom antas å være forbundet med prosessen hvor løselige Abeta-peptider aggregerer til uløselige fibriIler, fulgt av inkorporering av fibriller i amyloide plakk. Se Pike et al., Eur. J. Pharmacol. 207:367-368 (1991); Pike et al., Brain Research, 563:311-314 (1991), og Pike et al., J. Neurosci. 13:1676-1687 (1993). På tilsvarende måte vil Abeta-peptider danne fibriller in vitro, og denne prosessen kan utnyttes for å måle inhibering av Abeta-aggregering og fibrilldannelse.

Tidligere har flere grupper benyttet transgene musemodeller for Alzheimers sykdom hvor transgene mus, som viser både amyloid utfelling i hjernen og kognitive defekter, ble immunisert med Abeta42-antigenpreparater. Resultatene fra disse undersøkelsene viste at immunisering med Abeta42kan redusere både den Alzheimers sykdom-lignende nevropatologi og den rommelige hukommelsessvekkelse hos musene. Se Schenk et al., Nature 400:173-177 (1999), Bard et al, Nature Medicine 6:916-919 (2000), Janus et al., Nature 408:979-982 (2000) og Morgan et al., Nature 408:982-982 (2000). Bard et al. postulerte at immunisering med Abeta42-vaksine fører trolig til aktivering av mikroglia og påfølgende opptak av Abeta42-aggregater i mikroglia. Bard et al., Nature Medicine 6:916-919 (2000). Uheldigvis har ikke alle de immunologiske mekanismer som ligger til grunn for reduksjonen av utfelling av amyloide plakk og den forbedrede kognitive funksjon blitt utledet.

Tidligere undersøkelser av passiv tilførsel av antistoffene 3D6 og 10D5, hvis epitoper er Abeta-aminosyrerestene 1-5 henholdsvis 3-6, var effektive når det gjaldt både reduksjon av Abeta og belastningen med amyloide plakk hos transgene mus. Se Bard et al., Nature Medicine 6:916-919 (2000). Musene var transgene for en mutert, sykdoms-forbundet form av det humane amyloidforløperprotein (APP) som var under kontroll av promoteren fra blodplateavledet (PD) vekstfaktor. Disse musene (PDAPP-musene) overuttrykker det humane amyloidforløperprotein og viser mange av de patologiske symptomene på Alzheimers sykdom. Se Bard et al., Nature Medicine 6:916-919 (2000).

I en annen undersøkelse ble perifer tilførsel av m266, et antistoff mot aminosyrerestene 13-28 i Abeta, vist å redusere Abeta-byrden i hjerne via fjerning fra plasma hos PDAPP-mus. Se Demattos et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 98:8850-8855 (2001). m266-antistoffet er rettet mot et sekundært immunogent sete i Abeta, og kan vise forskjellig bindingsspesifisitet mot Abeta-oligomerer, protofibriller og plakk eller forskjellig grad av tilgang til CNS.

Monsonego et al. PNAS, vol. 98, no. 18, 2001, s. 10273-10278 gjør kjent at Alzheimers sykdom involverer progressiv avsetning av amyloid beta-protein (AP) i områder av hjernen som er viktig for hukommelse og andre kognitive funksjoner.

Spooner et al. Vaccine, vol. 21, no. 3-4, 2002, s. 290-297 viser til at epitop-kartlegging indikerer at muse anti-AP antistoffer gjenkjenner residier innenfor peptidfragmentet Api-15

Town et al. Neuroscience Letters, vol. 307, nr. 2, s. 101-104 vedrører karakterisering av murine immunoglobulin G antistoffer mot human amyloid-pi-42 peptid.

Både Abeta42-antigen og APP er selv-proteiner og er derfor normalt ikke immunogene hos et individ som uttrykker disse proteinene. Forsøk på å fremstille vaksiner basert på disse antigenene krever følgelig en induksjon av autoimmunitet. Videre må enhver immuniseringsfremgangsmåte hvor man forsøker å indusere autoimmunitet nøye undersøke immunresponsene som induseres av slike autoantigener. I dette tilfelle er det viktig at et eventuelt autoantigen som omfatter Abeta42eller deler av Abeta42ikke induserer autoimmunitet mot det normale APP-protein og forstyrrer dettes normale cellulære funksjon.

For utvikling av effektive immunterapeutiske fremgangsmåter for behandling av AD vil det være ønskelig at de immunologiske mekanismene for immunformidlet reduksjon av belastningen av amyloide plakk etter immunisering med antigener av Abeta42-type blir utledet.

Det vil være fordelaktig å benytte kunnskap vedrørende mekanismen for reduksjon av amyloide plakk for utforming av immunogene preparater og antigener som kun omfatter de epitoper som har en gunstig biologisk aktivitet. Nok en fordel er at slike immunogene preparater kan utformes slik at de ikke omfatter de epitoper som induserer skadelig immunitet. Det foreligger derfor et behov for definerte antigener som induserer svært spesifikke og begrensede immunresponser mot kun avvikende former av Abeta-antigenet.

Det foreligger også et behov for immunologiske preparater som omfatter definerte antigener som kan anvendes i immunterapi for induksjon av svært spesifikke og begrensede immunresponser mot kun patogene former av Abeta-antigenet. I tillegg vil det være gunstig å isolere antistoffer mot definerte Abeta-epitoper med gunstige biologiske egenskaper for anvendelse i passiv immunterapi. Det vil videre være fordelaktig å utvikle diagnostiske analyser for så snart som mulig etter påbegynt behandling å fastslå hvorvidt en pasient med Alzheimers sykdom vil dra nytte av behandling med immunogene preparater av Abeta-antigener. Det foreligger også et behov for påvisning av inhibitorer av amyloid utfelling og fibrilldannelse.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse oppfyller de ovenfor nevnte behov ved å tilveiebringe immunologiske preparater som omfatter aminosyrerestene 4-10 (SEQ ID NO:l) fra det amyloide peptid Abeta42(SEQ ID NO: 2), betegnet Abeta(4-i0). Antigenene og de immunogene preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for behandling av Alzheimers sykdom, for utforming av lavmolekylære inhibitorer av amyloid utfelling og som diagnostiske reagenser. Beskrivelsen omtaler videre antistoffer som bindes til den antigene determinant i Abeta(4-i0). De immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse og de beskrevne antistoffene kan også anvendes i fremgangsmåter for lindring av symptomene på Alzheimers sykdom ved å redusere amyloidbelastningen hos Alzheimer-pasienter.

I én utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse peptider som representeres ved formelen

(A)n~ (Th)m~ (B)o~ Abeta(4.io) -- (C)p

hvor hver av A, B og C er en aminosyrerest eller en sekvens av aminosyrerester, hvor n, o og p uavhengig av hverandre er heltall i området fra 0 til tilnærmet 20,

hver Th uavhengig av de andre er en sekvens av aminosyrerester som omfatter en T-hjelpercelleepitop,

hvor dersom o er lik 0, Th er direkte bundet til B-celleepitopen via en peptidbinding uten noen spacer aminosyrerester,

hvor m er et heltall fra 1 til tilnærmet 5, og

Abeta(4-io) er (SEQ ID NO:l) hvor peptidet er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 og SEQ ID NO: 46.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et immunogent preparat for å indusere dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid (SEQ ID NO: 2) kjennetegnet ved at det omfatter: (a) et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptid Abeta(4-io) (SEQ ID NO: 1), hvor antigenet er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 og SEQ ID NO: 46, og

(b) en adjuvans.

I en bestemt utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et immunogent preparat for induksjon av dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid som omfatter: et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptid Abeta(4-i0), og en adjuvans, hvor T-celleepitopen er utvalgt fra gruppen som består av: (a) én eller flere T-celleepitoper som ligger N-terminalt for B-celleepitopen i samme protein kjede, (b) én eller flere T-celleepitoper som ligger C-terminalt for B-celleepitopen i samme protein kjede, og (c) én eller flere T-celleepitoper som ligger på en annen proteinkjede som er tilkoblet via en kovalent binding til proteinkjeden som inneholder B-celleepitopen.

I en spesiell utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et immunogent preparat som har en B-celleepitop og en T-celleepitop, hvor T-celleepitopen har en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID

NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID

N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO:20 og SEQ ID NO:21.

I en annen spesiell utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et immunogent preparat som omfatter et antigen og en adjuvans, hvor adjuvansen omfatter én eller flere forbindelser utvalgt fra gruppen som består av aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat, saponin, Quill A, Quill A/ISCOMs, dimetyldioktadecyl-ammoniumbromid/arvidin, polyanioner, Freunds komplette adjuvans, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-isoglutamin, Freunds ufullstendige adjuvans og liposomer.

I en annen foretrukket utførelse anvendes foreliggende oppfinnelse til fremstilling av et medikament for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et immunogent preparat for induksjon av dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid (SEQ ID NO:2) som omfatter: (a) et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptid Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), og (b) en adjuvans.

I en mer foretrukket utførelse anvendes foreliggende oppfinnelse til fremstilling av et medikament for reduksjon av mengden av amyloide utfellinger i hjernen hos et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et immunogent preparat for induksjon av dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid (SEQ ID NO:2) som omfatter: (a) et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptid Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), og (b) en adjuvans.

I nok en foretrukket utførelse anvendes foreliggende oppfinnelse til fremstilling av et medikament for disaggregering av de amyloide fibriller i hjernen hos et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et immunogent preparat for induksjon av dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid beta-peptid (SEQ ID NO:2) som omfatter: (a) et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en b-celleepitop som består av peptid Abeta(4.i0) (SEQ ID NO:l) og (b) en adjuvans.

Beskrivelsen omtaler også et isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav som kan bindes til peptid-Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l).

Beskrivelsen omtaler også et isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav som kan bindes til peptid Abeta(4.i0) (SEQ ID NO:l), hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment inhiberer amyloid-utfelling.

Beskrivelsen omtaler også et isolert antistoff eller et antigenbindende fragment derav som kan bindes til peptid-Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment disaggregerer amyloide fibriller.

Beskrivelsen omtaler også en fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et antistoffpreparat som gjenkjenner og bindes til peptid-Abeta(4-i0) (SEQ ID NO: 1).

Beskrivelsen omtaler også en fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et antistoffpreparat som gjenkjenner og bindes til peptid-Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), hvor antistoffpreparatet omfatter polyklonale antistoffer.

Beskrivelsen omtaler også en fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom som omfatter tilførsel til individet av en effektiv mengde av et antistoffpreparat som gjenkjenner og bindes til peptid Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), hvor antistoffpreparatet omfatter et monoklonalt antistoff.

Beskrivelsen omtaler også en fremgangsmåte for å fastslå hvorvidt en forbindelse er en inhibitor av amyloid utfelling og fibrilldannelse som omfatter: å sette forbindelsen i forbindelse med peptid-Abeta(4-io) (SEQ ID NO:l) og påvise binding av forbindelsen til peptidet. I en annen utførelse tilveiebringer fremgangsmåten videre en evaluering av hvorvidt forbindelsen inhiberer amyloidfibrilldannelse in vitro.

Beskrivelsen omtaler også en diagnostisk fremgangsmåte for å forutsi virkningen av en aktiv immuniseringsbehandling for Alzheimers sykdom som omfatter: måling av utviklingen av en immunrespons mot peptid-Abeta(4.i0) (SEQ ID NO:l), hvor en positiv immunrespons mot peptid-Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l) indikerer at behandlingen børt fortsette, mens en manglende immunrespons eller en svært svak immunrespons tilsier at behandlingen bør avbrytes.

Beskrivelsen omtaler også et immunogent preparat som omfatter: et antigen og en adjuvans, hvor antigenet omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptidet Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l), hvor antigenet tilveiebringer en effektiv proteinstruktursammenheng for induksjon av antistoffer som bindes til et immunmål som foreligger i et amyloid-beta-peptid (SEQ ID NO: 2).

Beskrivelsen omtaler også et antigen som omfatter en B-celleepitop, hvor B-celleepitopens proteinstruktursammenheng, som sørger for en etterligning av sekundærstrukturen til immunmålet som den foreligger i amyloid-beta-peptidet (SEQ ID NO:2), er utvalgt fra gruppen som består av beta-plater, revers dreiing, heliks, tilfeldig kveiling eller en kombinasjon av disse. I visse ytterligere utførelser omfatter antigenet en B-celleepitop som omfatter en etterligner av peptid- Abeta(4-i0) (SEQ ID NO:l).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

DEFINISJONER

Dersom ikke annet er angitt skal de påfølgende begreper forstås å ha den angitte betydning: Adiuvans - viser til forbindelser som kan være blandinger av forbindelser som er sammenblandet med et antigen for å forsterke immunogenisiteten av antigenet i et immunogent preparat. Adjuvanser fungerer ved å forsterke immunresponsen mot antigenet, vanligvis ved å virke direkte på immunsystemet og ved å gi en langsom frigivelse av antigenet.

Amyloid- beta- peptid (Abeta) - viser til et hvilket som helst peptid fra en gruppe av peptider med 39-43 aminosyrerester som dannes ved prosessering av amyloid-forløperprotein (APP). Som anvendt her viser Abeta42til det 42 aminosyrerester lange Abeta-peptid. I tillegg viser Abeta(4-io) til det 7 aminosyrerester lange peptid fra Abeta42fra aminosyrerest 4 til og med aminosyrerest 10. Som diskutert i mer detalj nedenfor gjennomgår APP-genet alternativ spleising for dannelse av tre vanlige isoformer som inneholder 770 aminosyrer (APP770), 751 aminosyrer (APP75i), og 695 aminosyrer (APP695). Konvensjonelt anvendes kodon-nummereringen til den lengste isoform, APP770, også når det vises til kodonposisjoner i de kortere isoformene.

Antigen - antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse er kombinasjoner av T-hjelpercelleepitoper og B-celleepitoper. T-hjelpercelleepitopen kan ligger N-terminalt eller C-terminalt for B-celleepitopen på samme polypeptidkjede. T-celleepitopen kan også ligge på en annen polypeptidkjede som er kovalent bundet til polypeptidet som inneholder B-celleepitopen, for eksempel som når et lite peptid er kovalent bundet til et bærermolekyl, for eksempel hemocyanin fra albueskjell, for å oppnå immunogenisitet. Alternativt kan T-celleepitopen være ikke-kovalent forbundet med B-celleepitopen ved at T- og B-celleepitopen sammen-blandes i et preparat sammen med adjuvansen.

An ti q e n p rosesse ri n q - viser til den prosess hvor ekstracellulære antigener fra bakterier, virus eller immunogene preparater tas opp av antigenpresenterende celler (APC) ved endocytose eller fagocytose. Deretter fragmenteres antigenet i endosomer eller lysosomer, og peptidfragmentene lastes inn i bindingsgropene i MHC klasse I- og MHC klasse II-molekyler.

Antigenpresentering - viser til den prosess hvor MHC klasse I- og MHC klasse II-molekyler binder korte, prosesserte peptider og presenterer disse peptidene på celleoverflaten for gjennomsøking av T-celler via en interaksjon formidlet av en T-cellereseptor.

B- celleepitop - viser til den del av antigenet som er målet for antistoffbinding og betegnes også som den antigene determinant. For antigene determinanter i proteiner viser B-celleepitopen til aminosyrerester i et spesielt tredimensjonalt arrangement som vanligvis tilsvarer den native struktur. I motsetning til T-celleepitoper kan B-celleepitoper være ytterst følsomme for proteinkonfirmasjon.

Effektiv mengde - viser til en mengde av de immunogene preparatene, antistoffene eller antigenbindende fragmentene ifølge oppfinnelsen som oppnår ethvert av de definerte behandlingsmål. Effektiv mengde er også ment å omfatte både profylaktisk og terapeutisk anvendelse av preparatene, antistoffene eller de antigenbindende fragmentene derav.

T- hielpercelleepitop - T-hjelpercelleepitoper (Th-epitop) er peptider som bindes til MHC klasse II-molekyler og bidrar til å aktivere CD4+ T-celler slik at de gir hjelp i form av cytokiner til B-celler for frembringelse av en antistoffrespons mot et antigen. MHC klasse II-molekylene lades med prosesserte peptidfragmenter på fra tilnærmet 7 til tilnærmet 30 aminosyrer i cellulære avdelinger som kommuniserer med det ekstracellulære miljø. T-hjelpercelleepitoper representerer derfor generelt fremmede proteinfragmenter.

Immunmål - viser til den faktiske 3-dimensjonale epitop (den native epitop) i den amyloide avleiringen eller sirkulerende Abeta-peptider som B-celleepitopen i antigenet prøver å etterligne. Anti-proteinantistoffer er generelt spesifikke for gitte sekvenser av aminosyrer i en gitt sekundær struktur. Induksjon av antistoffer mot den epitopetterlignende del av antigenet fører ideelt sett til dannelse av antistoffer som gjenkjenner og bindes til den native epitop som denne opptrer i de patologiske amyloide avleiringer eller i sirkulerende Abeta-peptider.

Immuno<g>en - viser til et antigen som viser seg å være immunogent.

Immuno<g>enisitet - viser til et antigens evne til å utløse en immunrespons. Generelt må antigener være forbundet med antigenpresenterende celler for å være immunogene. Mange faktorer påvirker immunogenisiteten, inkludert antigenets størrelse, struktur, sekvens, grad av fremmedhet, nærvær av adjuvans, pasientens immuntilstand samt andre genetiske faktorer.

Peptid - viser til et lite antall, vanligvis to eller flere, aminosyrer som er sammenbundet.

Polypeptid - viser til lengre kjeder av aminosyrer som er sammenbundet, men hvor sekvensen eller lengden generelt ikke er definert. Begrepene protein, peptid og polypeptid vil iblant anvendes om hverandre.

Promiskuøs T- hielpercelleepitop - viser til T-hjelpercelleepitoper som kan indusere T-celleaktiveringsresponser (T-cellehjelp) i et stort antall individer som uttrykker forskjellige

MHC-haplotyper, dvs. en genetisk uensartet populasjon. Slike Th-epitoper virker i mange forskjellige individer i en heterogen populasjon og anses å være promiskuøse Th-epitoper.

Protein- eller polvpeptidryqqrad - viser til den gjentatte enhet som representerer en aminosyre som del av en proteinsekvens. Polypeptidryggraden består av sekvensen av tre atomer: amidnitrogenet (N-H), alfa-karbonet (C) og karbonyl karbonet (C=0), som generelt kan representeres som følger: -N-C-C-

Protein - viser generelt til spesifikke kjeder av aminosyrer med en definert sekvens, lengde og foldet konformasjon, men protein, polypeptid og peptid kan iblant anvendes om hverandre.

Behandling eller behandle - omfatter følgende mål: (1) å forhindre at uønskede symptomer eller patologiske tilstander opptrer i et individ som ennå ikke er blitt diagnostisert til å ha disse (2) å inhibere uønskede symptomer eller patologiske tilstander, dvs. å stanse deres utvikling, eller (3) å lindre eller lette uønskede symptomer på patologiske tilstander, dvs. å gi regresjon av de uønskede symptomene eller de patologiske tilstandene.

Preparatene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse stammer fra de foreliggende oppfinneres oppdagelse av at immunformidlede reduksjoner av avleiringer av amyloide plakk og den medfølgende forbedring i kognitiv funksjon kan formidles via spesifikke antistoffresponser mot et gitt immunmål eller en B-celleepitop i Abeta42. Dette avgjørende immunmål ble av de foreliggende oppfinnere identifisert som aminosyrerestene 4-10 (FRHDSGY) (SEQ ID NO: 1) i Abeta42som tilsvarer sekvensen fra aminosyrerest 675 til og med 681 i det amyloide forløperprotein (APP), ifølge kodonnummereringen for den lengste isoform, APP770. Som en følge av dette har de foreliggende oppfinnere utledet en viktig immunologisk mekanisme for immunformidlet reduksjon av belastningen med amyloide plakk etter immunisering med antigener av Abeta42-type.

De foreliggende oppfinnere har oppdaget at antistoffer som gjenkjenner og bindes til aminosyrerestene 4-10 (FRHDSGY) (SEQ ID NO: 1) i Abeta42, inhiberer Abeta-fibrilldannelse og Abeta-nevrotoksisitet. I tillegg har de foreliggende oppfinnere oppdaget at antistoffer som gjenkjenner og bindes til aminosyrerestene 4-10 (FRHDSGY) i Abeta42disaggregerer allerede dannede fibriller av Abeta42. Videre beskriver foreliggende oppfinnelse at antistoffer frembrakt under immunisering med Abeta42forhindrer celledød in vitro utløst av Abeta.

Foreliggende oppfinnelse ble utført ved anvendelse av TgCRND8-mus som modell for humant AD. TgCRND8-mus er anvendbare som modell for AD siden de bærer et humant, dobbeltmutert APP695-transgen under kontroll av prionproteinpromoteren og viser progressiv akkumulering av Abeta42-peptid og nevrittiske amyloide plakk i hjernebarken (et nevropatologisk kjennetegn på AD) som ledsages av progressiv kognitiv svekkelse. Se Chishti et al., Biol. Chem., 276:21562-570 (2001).

Beskrivelsen omtaler antistoffer som spesifikt er rettet mot det N-terminale peptid i Abeta og som ble frembrakt under immunisering av C57BL6 x C3H-mus med protofibrillære former av Abeta42. Beskrivelsen omtaler videre Abeta-sekvensen FRHDSGY (SEQ ID NO:l), som tilsvarer Abeta(4-i0), som representerer en avgjørende epitop for beskyttende immunitet for Alzheimers sykdom. I tillegg viser foreliggende oppfinnelse at Abeta(4-io)-epitopen er et immunmål for frembringelse av gunstig, beskyttende immunitet i pasienter som lider av Alzheimers sykdom.

ANTIGENPRESENTASJON

Antigenpresentasjon viser til de molekylære og cellulære begivenheter hvor proteinantigener tas opp og prosesseres av antigenpresenterende celler (APC). De prosesserte antigenfragmentene presenteres så for effektorceller, som i sin tur blir aktiverte og utløser en immunrespons. De mest aktive antigenpresenterende cellene er blitt vist å være makrofagene (som er direkte utviklingsprodukter fra monocytter), dendrittceller og visse B-celler.

Molekylære nøkkelspillere i antigenpresentasjonen og immunresponsprosessen er MHC-molekylene, som er en polymorf genfamilie som kodes kromosomalt i et område som betegnes vevsforliklighetsgenkomplekset, Mhc. MHC klasse I- og klasse II-molekylene hos mennesker betegnes HLA (humant leukocyttantigen)-molekyler. Visse MHC-molekyler bidrar til å fremvise unike molekylære fragmenter på overflaten av celler og til å lette gjenkjenning av disse av T-celler og andre effektorceller i immunsystemet. Se D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", s. 263-285 i Fundamental Immunology, 4. utgave, redigert av W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999). Videre bidrar MHC klasse I- og klasse II-molekyler til å binde peptider i antigenpresenterende celler og så interagere med ap-T-cellereseptorer på overflaten av T-celler.

Nærmere bestemt binder og presenterer MHC klasse I-molekyler prøver av cellens egne peptider inkludert endogene cytosolproteiner og de novo-translaterte virus- og tumorantigener. MHC klasse I-molekyler presenterer generelt peptider med fra tilnærmet 7 til tilnærmet 16 aminosyrerester som gjenkjennes av CD8+ cytotoksiske T-celler. MHC klasse I-molekyler deltar i utføringen av den cytotoksiske T-celleresponsen hvor celler som er infisert med et virus drepes.

Foreliggende oppfinnelse gjelder primært T-celleepitoper som bidrar til å aktivere CD4+-T-celler som kan hjelpe B-celler til å frembringe en antistoff respons mot et antigen. T-hjelpercelleepitoper (Th-epitop) bindes til MHC klasse II-molekyler, som lades med prosesserte peptidfragmenter med lengde fra tilnærmet 7 til tilnærmet 30 aminosyrerester i deler av cellen som kommuniserer med det ekstracellulære miljø. Se D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex" s. 263-285 i Fundamental Immunology, 4. utgave, redigert av W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999) (Margulies). Nærmere bestemt binder MHC klasse II-molekyler peptider som tas inn av den antigenpresenterende celle fra det nærmeste ekstracellulære miljø og presenterer disse for CD4+ T-celler. CD4+ T-cellene aktiveres så og gir hjelp i form av cytokiner til B-celler for dannelse av antistoffer. Hos mennesker omfatter MHC klasse II-molekylene molekylene HLA-DR, HLA-DQ og HLA-DP, som opptrer i forskjellige, genetisk kodede alleler.

De immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter antigener som har en B-celleepitop og en T-celleepitop som prosesseres og presenteres som protein-eller peptidfragmenter av MHC-molekyler på overflaten av såkalte "antigenpresenterende celler" og gjenkjennes av CD4+ T-lymfocytter som effektorceller.

For å sikre en effektiv immunovervåkning er MHC-molekylenes fysiologi utformet slik at de kan presentere et så bredt spektrum av antigene peptider som mulig. Kopitallet av et bestemt antigent peptid på overflaten av antigenpresenterende celler er følgelig svært lavt (av størrelsesorden IO<2>av et gitt antigent peptid, ut fra en total populasjon på tilnærmet IO<5>peptidreseptorer). Dette betyr at en svært heterogen blanding av antigene peptider bundet til MHC-molekyler ("peptidligander") eksponeres på overflaten av de antigenpresenterende cellene.

Begrepet "T-celleepitop" viser til en sekvens i et protein som gir en aktivering av CD4+-T-hjelper (Th)-lymfocytter etter antigenprosessering og presentasjon av peptidet i bindingsgropen i et MHC klasse II-molekyl. Alfa/beta-T-cellereseptorene på overflaten av T-celler interagerer med peptid-MHC klasse II-komplekset, som fungerer som stimulus for aktivering. Som en følge av dette er T-celleepitopens native konformasjon ikke viktig, men bare primærsekvensen og evnen til å bindes til et gitt MHC-molekyl.

Foreliggende oppfinnelse gjelder peptider, fortrinnsvis syntetiske peptider, som kan indusere antistoffer mot patologiske former av Abeta, for eksempel formene som forefinnes i amyloide plakk og i fibriller.

Et peptids immunogenisitet viser til peptidets evne til å indusere en antistoff respons som omfatter antistoffer som spesifikt gjenkjenner og bindes til en "B-celleepitop" eller "antigen determinant" i peptidet. Se R.N. Germain. "Antigen Processing and Presentation", s. 287-340 i Fundamental Immunology, 4. utgave, redigert av W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999) (Germain). For å være immunogent må et peptid som inneholder en B-celleepitop presenteres i forbindelse med et MHC klasse II-antigen eller en klasse II T-celleepitop. T-celleepitopen prosesseres vanligvis fra immunogenet under antigen-prosessering av antigenpresenterende celler og bindes så til MHS klasse II-molekylet på en sekvensspesifikk måte. Se Germain. Dette MHC klasse II-T-celleepitopkompleks gjenkjennes av CD4+ T-lymfocytter (Th-celler). Th-cellene har evnen til å forårsake proliferasjon av spesifikke B-celler som danner antistoffmolekyler som kan gjenkjenne den assosierte B-celleepitopen fra det presenterte immunogenet. Dannelsen av et antistoff som er spesifikt for en gitt B-celleepitop er således koblet til nærvær av en T-celleepitop innen eller forbundet med immunogenet.

En annen komplikasjon oppstår dersom antigenet ikke er et fremmed protein. Siden Abeta er et selv-molekyl må det ikke inneholde Th-epitoper som induserer lymfocytt-aktivering og således en antistoff respons mot seg selv. Fremmede T-celleepitoper må derfor tilveiebringes ved å inkludere spesifikke sekvenser avledet fra kraftige fremmede immunogener, inkludert tetanustoksin, kikhostetoksin, F-protein fra meslingvirus og overflateantigen fra hepatitt B-virus (HBsAg) og andre. Slike T-celleepitopsekvenser kan foreligge i samme proteinkjede som B-celleepitopen, som er Abeta(4-io)-peptidet. Lokaliseringen av T-celleepitopen kan enten være N-terminalt for B-celleepitopen eller C-terminalt for B-celleepitopen. Alternativt kan T-celleepitopen foreligger på en separat proteinkjede, kjent som et bærermolekyl, som kanskje eller kanskje ikke er kovalent bundet til peptidet som inneholder B-celleepitopen.

Ytterligere T-celleepitoper kan utvelges ved de påfølgende fremgangsmåter som er velkjente innen faget, for eksempel ved syreeluering og sekvensering ved massespektroskopi av MHC klasse II-bundne peptider fra immunaffinitetsrensede klasse II-molekyler som beskrevet i Rudensky et al., Nature 353:622-672 (1991); Chicz et al., Nature 358:764-768 (1992); og Hunt et al., Science 256:1817-1820 (1992).

Ideelt sett er de utvalgte Th-epitopene fortrinnsvis i stand til å utløse T-celle-aktiveringsresponser (T-cellehjelp) i et stort antall individer som uttrykker forskjellige MHC-haplotyper. Dette betyr at disse epitopene fungerer i mange forskjellige individer i en heterogen populasjon og anses å være promiskuøse Th-epitoper. Promiskuøse Th-epitoper gir en fordel at de utløser kraftige anti-Abeta-antistoffresponser i de fleste medlemmer av en genetisk variert populasjon.

T-hjelperepitopene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke bare utvalgt for evne til å gi immunresponser hos de fleste medlemmer av en gitt populasjon, men også for evnen til å gi hukommelsesresponser. Det store flertall av humane pasienter som mottar Abeta-immun-terapi vil allerede ha blitt immunisert med barnevaksinene mot meslinger, vannkopper, røde hunder, difteri, kikhoste og stivkrampe. Disse pasientene har derfor allerede blitt eksponert overfor mer enn én av Th-epitopene som foreligger i den immunogene blanding. Slik tidligere eksponering kan være nyttig, fordi tidligere eksponering overfor en Th-epitop ved immunisering med standardvaksinene bør etablere Th-cellekloner som kan respondere umiddelbart og bidra til en antistoffrespons.

T-hjelpercelleepitopen er en sekvens av aminosyrer (naturlige eller ikke-naturlige aminosyrer) som omfatter en Th-epitop. En T-hjelpercelleepitop kan bestå av en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop. Således er ikke hver enste aminosyrerest i en T-hjelpercelle-epitop en nødvendig del av epitopen. Følgelig kan Th-epitoper, inkludert analoger og segmenter av Th-epitoper, forsterke og stimulere en immunrespons mot Abeta. Immun-dominante T-hjelpercelleepitoper har bred reaktivitet i dyre- og menneskepopulasjoner med svært divergente MHC-typer. Se Celis et al. J. Immunol. 140:1808-1815 (1988); Demotz et al. J. Immunol. 142:394-402 (1989); Chong et al. Infect. Immun. 60:4640-4647 (1992). T-hjelpercelleepitopen i de her beskrevne peptider har fra tilnærmet 10 til tilnærmet 50 aminosyrerester, fortrinnsvis fra tilnærmet 10 til tilnærmet 40 aminosyrerester, mer foretrukket fra tilnærmet 10 til tilnærmet 30 aminosyrerester, enda mer foretrukket fra tilnærmet 10 til tilnærmet 20 aminosyrerester og mest foretrukket fra tilnærmet 10 til tilnærmet 15 aminosyrerester. Når flere T-hjelpercelleepitoper foreligger (dvs. at n>2) da er hver T-hjelpercelleepitop uavhengig like eller forskjellige.

T-hjelpercelleepitop kan omfatte analoger, substitusjoner, delesjoner og insersjoner av fra 1 til tilnærmet 10 aminosyrerester i T-hjelpercelleepitopen. T-hjelpercelleepitop-segmentene er kontinuerlige deler av en T-hjelpercelleepitop som er tilstrekkelig til å forsterke eller stimulere en immunrespons mot Abeta. T-hjelpercelleepitopen kan være adskilt fra B-celleepitopen ved én eller flere spacer aminosyrerester.

Th-epitoper ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter T-hjelpercelleepitoper fra overflateantigen fra hepatitt B (HB-Th), T-hjelpercelleepitoper fra kikhostetoksin (PT-Th), T-hjelpercelleepitoper fra tetanustoksin (TT-Th), T-hjelpercelleepitoper fra F-protein fra meslingvirus (MV-Th), T-hjelpercelleepitoper fra det ytre hovedmembranprotein fra Chlamydia trachamates (CT-Th), T-hjelpercelleepitoper fra difteritoksin (DT-Th), T-hjelpercelleepitoper fra Plasmodium falciparum circumsporozoitt (PF-Th), T-hjelpercelleepitoper fra triosefosfatisomerase fra Schistosoma mansoni (SM-Th), T-hjelpercelleepitoper fra TraT fra Escherchia coli (TraT-Th) og immunforsterkende analoger og segmenter av alle disse Th-epitopene. Et utvalg av Th-epitoper med bred reaktivitet beskrives i U.S. patentskrift nr. 5759551, tilhørende Ladd et al.. Eksempler på T-hjelpercelleepitopsekvenser gis nedenfor:

I visse utførelser har foreliggende oppfinnelse en T-celleepitop med en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7,

SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17,

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20 og SEQ ID NO:21.

ANTIGENUTFORMING

De immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer et antigen som omfatter en T-celleepitop som fremskaffer en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptidet Abeta(4_i0)

Antigenpeptidene ifølge foreliggende beskrivelse representeres ved følgende formler:

I- (A)n-- (Th)m- (B)o- Abeta(4-io) ~ (C)p

II. (A)n- Abeta(4-io)-- (B)o-- (Th)m- (C)p

III. (D)q » Abeta(4-io) -- (E)r

hvor A, C, D og E uavhengig av hverandre er en aminosyrerest eller en sekvens av aminosyrerester,

hvor B, en spacer, er en aminosyrerest eller en sekvens av aminosyrerester; når o er lik 0 så er Th direkte bundet til B-celleepitopen ved en peptidbinding uten noen spacer aminosyrerester,

hvor n, o og p uavhengig av hverandre er heltall i området fra 0 til tilnærmet 20, når o er lik 0 er Th direkte bundet til B-celleepitopen uten spacer aminosyrerester,

hvor m er et heltall fra 1 til tilnærmet 5,

hvor q og r uavhengig av hverandre er heltall i området fra 0 til tilnærmet 100,

Th er, uavhengig av de andre, en sekvens av aminosyrerester som omfatter en T-hjelpercelleepitop eller en immunforsterkende analog eller et segment derav, eller en analog derav som inneholder en konservativ aminosyresubstitusjon, Th kan være repetert i tandem,

Abeta(4-io) er aminosyrerestene 4-10 (FRHDSGY) i Abeta42SEQ ID NO:l, eller en analog derav som inneholder en konservativ aminosyresubstitusjon, Abeta(4-io), SEQ ID NO:l, kan være repetert i tandem eller kan på annet vis foreligge i flere kopier.

Oppfinnelsen omfatter også, i den utstrekning disse er omfattet av patentkravene, preparater av to eller flere av peptidene som representeres ved formel I, II og III. Ett eller flere peptider med formel I kan kombineres slik at det dannes preparater. Alternativt kan ett eller flere peptider fra formel I, II og III kombineres for å gi blandinger eller preparater.

Antigenpeptidene ifølge foreliggende beskrivelse har fra tilnærmet 20 til tilnærmet 100 aminosyrerester, alternativt fra tilnærmet 20 til tilnærmet 80 aminosyrerester. I en spesiell utførelse har antigenpeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse fra tilnærmet 20 til tilnærmet 60 aminosyrerester, fortrinnsvis fra tilnærmet 20 til tilnærmet 50 aminosyrerester og mer foretrukket fra tilnærmet 25 til tilnærmet 40 aminosyrerester. I en annen foretrukket utførelse har antigenpeptidet fra tilnærmet 20 til tilnærmet 35 aminosyrerester.

Når A, B, C, D og E er aminosyrerester så kan de være enhver ikke-naturlig forekommende aminosyre eller enhver naturlig forekommende aminosyre. Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter beta-alanin, ornitin, norleucin, norvalin, hydroksyprolin, tyroksin, gamma-amino-smørsyre, homoserin, citrullin og lignende. Naturlig forekommende aminosyrer omfatter alanin, arginin, asparagin, asparaginsyre, cystein, glutaminsyre, glutamin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tryptofan, tyrosin og valin. Dessuten når m er minst én og to eller flere av gruppene A, B, C, D og E er aminosyrer så er hver aminosyre uavhengig av hverandre like eller forskjellige.

Aminosyrene i gruppene A, B, C, D og E kan være modifisert med fettsyrer. For eksempel kan én eller flere epsilon-palmitoyllysiner være addert N-terminalt og C-terminalt for Abeta-epitopen, og hele peptidet kan være forankret til overflaten av vesikler. Vesiklene kan inneholde immunstimulatoren lipid A. Se Nicolau et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 99:2332-2337 (2002).

Abeta(4-io)-epitopen kan inkorporeres i proteindendrimerer ved anvendelse av en ortogonal koblingsstrategi for konstruksjon av proteinantigener. Spesielt konstruerte dendrimerer kan danne grunnlaget for sammensetningen av effektive vaksineantigener, inkludert for eksempel en peptidkonstruksjon med flere antigener som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 6310810, tilhørende Tam.

SYNTETISKE PEPTIDER SOM ANTIGENER OG VAKSINER

I mange tilfeller har anvendelse av et helt protein eller glykoprotein som et immunogen for utvikling av effektive vaksiner og immunterapier for humane sykdommer og infeksiøse midler vist seg enten ineffektive grunnet manglende immunogenisitet, eller de har ført til forsterkning av infeksjonen og sykdommen på grunn av inkludering av ikke-beskyttende epitoper. Se Osterhaus et al. Vaccine, 7:137-141 (1989); Gilbert et al. Virus Research, 7:49-67 (1987); Burke, D. Perspect. Biol. Med., 35:511-530 (1992).

Anvendelse av syntetiske peptidantigener i vaksiner eller i immunogene preparater kan omgå mange av problemene som er forbundet med rekombinante vaksiner. Fordelene ved å anvende syntetiske peptider som tilsvarer spesifikke proteindomener omfatter: seleksjon og inklusjon av kun beskyttende epitoper, utelukkelse av sykdomsforsterkende epitoper, utelukkelse av skadelige, autoimmune epitoper, utelukkelse av infeksiøst materiale; og syntetiske peptidantigener er kjemisk veldefinerte og kan fremstilles med rimelige kostnader. Se Arnon and Horwitz, Curr. Opin. Immunol., 4:449-453, (1992).

Ulempene er at små syntetiske peptider inneholder nødvendigvis ikke de nøyaktige aminosyresekvenser som er nødvendige for prosessering og binding til vevsforlikelighets-genkompleks (MHC) klasse I- og klase II-proteiner for presentasjon overfor immunsystemet. Se Rothbard, Biotechnology, 20:451-465, (1992). En annen ulempe er at den tre-dimensjonale strukturen av små peptider i løsning kan være forskjellig fra strukturen som foreligger i det native protein, og peptidet vil derfor ikke nødvendigvis indusere humoral immunitet med den nødvendige spesifisitet og affinitet for å frembringe beskyttende immunitet. Se Bernard et al. Aids Res. and Hum, Retroviruses, 6:243-249,

(1990).

Peptide antigener ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en rekke forskjellige måter. Fordi det er relativt lite kan peptidet syntetiseres i løsning eller på en fast bærer i samsvar med konvensjonelle teknikker. Forskjellige automatiske og manuelle synteseinstrumenter er i dag kommersielt tilgjengelige og kan anvendes i samsvar med kjente fremgangsmåter. Se for eksempel U.S. patentskrift nr. 5827666 tilhørende Finn et al.; Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave, Pierce Chemical Co., 1984; og Tam et al., J. Am Chem. Soc. (1983) 105:6442.t.

Alternativt kan det benyttes hybrid-DNA-teknologi hvor et syntetisk gen fremstilles ved å benytte enkeltkjeder som koder for polypeptidet eller i det vesentlige komplemen-tære tråder derav, hvor enkelttrådene overlapper og kan bringes sammen i et hybridiserings-medium slik at de hybridiserer. De hybridiserte trådene kan så ligeres slik at det fullstendige gen dannes, og ved valg av egnede ender kan genet settes inn i en ekspresjonsvektor, av hvilke mange er lett tilgjengelige i dag. Se for eksempel Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (her betegnet "Sambrook et al., 1989"); og uttrykkes i prokaryote eller eukaryote ekspresjonssystemer for fremstilling av de ønskede peptider.

BÆRERE

Abeta(4-io)-epitopantigenene ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som beskrivet i den foreliggende patentsøknad, kan være konjugerte til et bærermolekyl for å oppnå T-cellehjelp.

Bærermolekyler som antigener ifølge oppfinnelsen er kovalent bundet (konjugert) til er med fordel ikke-to ksi ske, farmasøytisk aksepterbare og har en størrelse som er tilstrekkelig til å gi en immunrespons i pattedyr. Eksempler på egnede bærermolekyler omfatter tetanustoksoid, hemocyanin fra albueskjell (KLH) og peptider som tilsvarer T-celleepitoper (dvs. Tl og T2) fra kappeglykoproteinet gpl20, som kan erstatte ikke-AIDS-virusavledede bærermolekyler (Cease, Proe. Nat'1, Acad. Sei. (USA) 84:4249, 1987; Kennedy et al., J. Biol, Chem. 262:5769, 1987). Peptider kan også administreres sammen med en farmasøytisk aksepterbar adjuvans, for eksempel alun, eller konjugert til andre bærer-molekyler som er mer immunogene enn tetanustoksoid.

Bindingen mellom et bærermolekyl og et peptidantigen ifølge oppfinnelsen kan være direkte eller via et spacer molekyl. Spacer molekyler er med fordel ikke-toksiske og reaktive. To glysinrester addert til den aminoterminale enden av peptidet kan fremskaffe et egnet spacer molekyl for kobling av Abeta(4-io)-sekvenser eller deler av disse til et bærermolekyl, alternativt kan Abeta(4-io)-sekvenser eller deler av disse for eksempel syntetiseres direkte i nabostilling til for eksempel en annen immunogen amyloidsekvens. Cysteiner kan innføres, enten i N- eller C-enden av Abeta(4-io)-peptidet, for konjugering til bærermolekylet, eller til begge ender for å lette interkjedepolymerisering via dannelse av disulfidbroer slik at det dannes større molekylære aggregater. Konjugering av bærermolekylet til peptidet oppnås ved anvendelse av et koblingsmiddel. Det heterofunksjonelle koblingsmiddel M-maleimido-benzoyl-N-hydroksysuksinimidester (MBS) eller den vannløselige forbindelse M-maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (sulfo-MBS) kan med fordel anvendes, som beskrevet av Green et al., Cell, 28:477 (1982); og av Palker et al., Proe. Nat'1 Acad. Sei. U.S.A. 84:2479 (1987). Mange andre koblingsmidler, foreksempel glutaraldehyd, er tilgjengelige for kobling av peptider til andre molekyler. Konjugasjonsfremgangsmåter er velkjente innen faget. Se for eksempel kapittel 9 (sider 419-455) og kapittel 11 (sider 494-527) i Bioconjugate Techniques av G.T. Hermanson, Academic Press, San Diego 1996).

ADJUVANSER

To av de karakteristiske egenskapene til antigener er deres immunogenisitet, eller deres evne til å indusere en immunrespons in vivo (inkludert dannelse av spesifikke antistoffer), og deres antigenisitet, dvs. evnen til selektivt å gjenkjennes av antistoffer som er spesifikke for den sekvensen og strukturen.

Noen antigener er bare svak immunogene når de administrerers alene. Følgelig kan et lite immunogent antigen mislykkes i å indusere den immunrespons som er nødvendig for å gi en effektiv immunterapi eller beskyttelse for organismen.

Immunogenisiteten til et antigen kan forsterkes ved å tilføre antigenet som en blanding med ytterligere forbindelser kalt adjuvanser. Adjuvanser bidrar til å forsterke immunresponsen mot antigenet, enten ved å virke direkte på immunsystemet eller ved å gi en langsom frigjøring av antigenet. Således modifiserer adjuvansen de farmakokinetiske egenskapene til antigenet og forlenger interaksjonstiden mellom antigen og immunsystem. Anvendelse av adjuvanser er velkjent innen faget, og mange egnede adjuvanser kan anvendes. Fremstilling av immunogene preparater og anvendelse av adjuvanser beskrives generelt i Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach (red. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology bind 6 Plenum Press 1995..

De hyppigst anvendte adjuvansene er Freunds adjuvans, en emulsjon som omfatter døde mykobakterier i en saltløsning i mineralolje, og Freunds ufullstendige adjuvans, som ikke inneholder mykobakterier.

Adjuvanser kan enten forsterke intensiteten av immunresponsen mot antigenet eller gi en spesifikk aktivering av immunsystemet. Det finnes fem generelle klasser av adjuvanser, inkludert (1) aluminiumsalter, foreksempel aluminiumhydroksid eller aluminiumfosfat, (2) overflateaktive midler som saponin og Quill A, Quill A/ISCOMs, dimetyl-dioktadecylammoniumbromid/arvidin (3) polyanioner, (4) bakteriederivater som Freunds komplette adjuvans, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (muramyldi-peptider),

N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-isoglutamin (treonyl-MDP) (5) bærere og materialer som gir langsom frigivelse, for eksempel Freunds ufullstendige adjuvans (oljeemulsjon), liposomer. Se New Generation Vaccines, kapittel 11, s. 129-140, Adjuvants for a New Generation of Vaccines av A.C. Allison og N.E. Byars, Marcel Dekker, New York, 1990).

De immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et antigen og en adjuvans. Egnede adjuvanser omfatter alun, som er et aluminiumsalt, for eksempel aluminiumhydroksidgel eller aluminiumfosfat, men som også kan være et salt av kalsium, jern eller sink. Andre egnede adjuvanser omfatter uløselige suspensjoner av asylert tyrosin eller asylerte sukkere, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider og polyfosfazener.

Kombinasjoner av adjuvanser kan anvendes for dannelse av et adjuvanssystem. Egnede adjuvanssystemer omfatter for eksempel en kombinasjon av monofosforyHipid A, fortrinnsvis 3-de-O-asylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) sammen med et aluminiumsalt. Et alternativt adjuvanssystem omfatter for eksempel "Ribi Adjuvant System", som er kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-asylert monofosforyHipid A (3D-MPL), syntetisk trehalosedikorynomykolat og celleveggskjelettmaterialer. Et forsterket system omfatter kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponinderivat, særlig kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller et mindre reaktivt preparat hvor aktiviteten av QS21 er dempet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739. Et spesielt kraftig adjuvanspreparat som omfatter QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje i vann-emulsjon er beskrevet i WO 95/17210 og er en foretrukket utforming.

Alternativt kan de immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse være innkapslet i liposomer eller vesikler som beskrevet av Fullerton, U.S. patentskrift nr. 4,235,877.

ANTISTOFFSTRUKTUR

Foreliggende beskrivelse omfatter antistoffer eller antigenbindende fragmenter derav som bindes til Abeta(4-io)-epitopen og inhiberer utfelling av amyloid og fibrilldannelse. Generelt er det kjent at den grunnleggende strukturelle antistoff en heten omfatter en tetramer. Hver tetramer inkluderer to identiske par av polypeptidkjeder hvor hvert par har en "lett" (tilnærmet 25 kDa) og én "tung" (tilnærmet 50-70 kDa) kjede. Den aminoterminale del av hver kjede kan inkludere et variabelt område på fra tilnærmet 100 til 110 eller flere aminosyrer som hovedsakelig er ansvarlige for gjenkjenning av antigen. Den karboksy-terminale delen av hver kjede kan definere et konstant område som primært er ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lettkjeder er typisk klassifisert som kappa- og lamda-lettkjeder. Videre er humane tungkjeder typisk klassifisert som mu, delta, gamma, alfa eller epsilon og definerer antistoffets isotype som IgM, IgD, IgG, IgA, henholdsvis IgE. I tungkjeder og lettkjeder er de variable og konstante områder sammenbundet via et "J"-område på tilnærmet 12 eller flere aminosyrer, hvor tungkjeden også omfatter et "D"-område på ytterligere tilnærmet 10 aminosyrer. J.K. Frazer og J.D. Capra, "Immunoglobulins: Structure and Function", s. 37-75 i Fundamental Immunology, 4. utgave, redigert av W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999) (Frazer).

De variable områdene i hvert lett/tungkjedepar kan danne antistoffets bindingssete. Generelt har således et intakt IgG-antistoff to bindingsseter. Bortsett fra for bifunksjonelle eller bispesifikke antistoffer er de to bindingssetene generelt like.

Normalt viser kjedene alle den samme generelle struktur med relativt konserverte rammeverksområder (FR) som er sammenbundet via tre hypervariable områder som også betegnes komplementaritetsbestemmende områder eller CDR. CDR fra de to kjedene i hvert par er vanligvis justert av rammeverksområdene, noe som tillater binding til en spesifikk epitop. Fra N-ende til C-ende omfatter generelt både lettkjeder og tungkjeder domenene FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Allokeringen av aminosyrer til disse domenene skjer generelt i samsvar med definisjonene i Kabat: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health Bethesda, Md. (1987 og 1991)), eller Chothia, et al., J Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883

(1989).

ANTISTOFFTYPER

Begrepet "antistoffmolekyl" omfatter antistoffer og fragmenter derav. Begrepet omfatter monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, bispesifikke antistoffer, Fab-antistoff rag menter, F(ab)2-antistoffragmenter, Fv-antistoff rag menter (f.eks. VH eller VL) enkeltkjedede Fv-antistoffragmenter og dsFv-antistoff rag menter. Antistoffmolekylene kan videre være fullt ut humane antistoffer, humaniserte antistoffer eller kimære antistoffer. Antistoffmolekylene er fortrinnsvis monoklonale, fullt ut humane antistoffer.

Anti-Abeta(4-io)-antistoffmolekylene gjenkjenner fortrinnsvis humane amyloid-Abeta-proteiner og -peptider, men foreliggende beskrivelse omfatter antistoffmolekyler som gjenkjenner amyloidet Abeta-proteiner og -peptider fra andre arter, fortrinnsvis pattedyr (f.eks. mus, rotte, kanin, sau eller hund).

I tillegg kan et anti-Abeta(4-io)-antistoff være avledet fra et humant monoklonalt antistoff. Slike antistoffer fremskaffes fra transgene mus som er blitt modifisert slik at de danner spesifikke, humane antistoffer som respons på antigen utfordring. I denne teknikken innføres elementer fra det humane tungkjede- og lettkjede-locus i musestammer avledet fra embryonale stamcellelinjer som inneholder målrettede forstyrrelser i det endogene tungkjede- og lettkjede-locus. De transgene musene kan syntetisere humane antistoffer som er spesifikke for humane antigener, og musen kan anvendes for fremstilling av hybridomer som utskiller humant antistoff. Fremgangsmåter for fremskaffing av humane antistoffer fra transgene mus beskrives av Green et al., Nature Genet. 7:13

(1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), og Taylor et al., Int. Immun. 6:579

(1994).

I en foretrukket utførelse frembringes fullt ut humane monoklonale antistoffer rettet mot Abeta(4-io) ved anvendelse av transgene mus som bærer deler av det humane immun-system istedenfor musesystemet. Disse transgene musene, som her kan betegnes "HuMAb"-mus, inneholder et humant immunglobulingen (minilocus som koder for ikke-rearrangerte, humane tungkjede- (mu og gamma) og kappa-lettkjede-immunglobulinsekvenser i tillegg til målrettede mutasjoner som inaktiverer det endogene mu- og kappa-kjede-locus. (Lonberg, N., et al., (1994) Nature 368 (6474):856-859). Følgelig viser musene redusert ekspresjon av muse-IgM eller -kappa, og som respons på immunisering gjennomgår de innførte humane tungkjede- og lettkjede-transgener klassebytte og somatisk mutasjon slik at det dannes humane, monoklonale IgG-antistoffer med høy affinitet (Lonberg, N., et al., (1994), supra; sitert i Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; og Lonberg, N., et al., (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93. Fremstilling av HuMab-mus er alminnelig kjent innen faget og beskrives foreksempel i Lonberg, et al., (1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Lonberg, N.

(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. et al., (1995) Intern. Rev. Immunol. bind 13: 65-93; Fishwild, D., et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Se videre U.S. patentskrifter nr. 5814318, 5874299 og 5770429, alle tilhørende Lonberg og Kay samt GenPharm International, og U.S. patentskrift nr. 5545807, tilhørende Surani et al..

For frembringelse av fullt ut humane monoklonale antistoffer mot Abeta(4-i0) kan HuMab-mus immuniseres med et immunogent preparat som omfatter Abeta(4-io)-antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse. Musene vil fortrinnsvis være 6-16 uker gamle ved første immunisering. For eksempel kan et immunogent preparat som omfatter Abeta(4.i0)-antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for intraperitoneal immunisering av HuMab-musene. Musene kan også immuniseres med hele HEK293-celler som er stabilt transformert eller transfektert med et Abeta(4-i0)-holdig gen. Et "antigent Abeta(4-iorpolypeptid" kan vise til et Abeta(4-i0)-polypeptid eller ethvert fragment derav som utløser en anti-Abeta(4-io)-immunrespons i HuMab-mus.

Generelt responderer HuMAb-transgene mus best dersom de først immuniseres intraperitonealt (IP) med antigen i komplett Freunds adjuvans, fulgt av IP-immuniseringer annenhver uke (vanligvis opp til i alt 6) med antigen i ufullstendig Freunds adjuvans. Musene kan først immuniseres med celler som uttrykker Abeta(4.i0) (f.eks. stabilt tansformerte HEK293-celler), og så med et løselig fragment av et antigen som inneholder Abeta(4-io), for eksempel de immunogene preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, og gis kontinuerlig alternerende immuniseringer med de to antigenene. Immunresponsen kan følges i løpet av immuniseringsskjemaet med plasmaprøver erholdt ved retroorbital blodtapping eller tapping fra halen. Plasmaet kan analyseres for nærvær av anti-Abeta(4.io)-antistoffer, for eksempel ved ELISA, og mus med en tilstrekkelig titer av immunglobulin kan anvendes for fusjoner. Musene kan gis intravenøse forsterkerin-jeksjoner med antigen tre dager før de avlives og milten fjernes. Det forventes at det kan være nødvendig å utføre to-tre fusjoner for hvert antigen. Flere mus kan immuniseres for hvert antigen. For eksempel kan i alt tolv HuMAb-mus fra stammene HC07 og HC012 immuniseres.

Hybridomceller som danner de monoklonale, fullt ut humane anti-Abeta(4-i0)-antistoffene kan så fremstilles ved fremgangsmåter som er alminnelig kjente innen faget. Disse fremgangsmåtene omfatter hybridomteknikken som opprinnelig utviklet av Kohler, et al., Nature 256:495-497 (1975); så vel som triomteknikken Herng, et al., Biomed.

Biochim. Acta. 47:211-216 (1988) og Hagiwara, et al., Hum. Antibod. Hybridomas 4:15

(1993); den humane B-cellehybridomteknikk (Kozbor, et al., Immunology Today 4:72

(1983); og Cote, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A 80:2026-2030 (1983); og EBV-hybridomteknikken (Cole, et al., in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96, 1985). Fortrinnsvis isoleres musesplenocytter og fusjoneres ved hjelp av PEG til en musemyelom-cellelinje basert på standard fremgangsmåter. De resulterende hybridomer analyseres så for dannelse av antigenspesifikke antistoffer. For eksempel fusjoneres én-cellesuspensjoner av milt lymfocytter fra immuniserte mus med et sjettedels antall P3X63-Ag8.653 ikke-sekreterende musemyelomceller (ATCC, CRL 1580) med 50 % PEG. Cellene såes ut i en mengde på tilnærmet 2 x IO<5>celler i flatbunnede mikrotiterplater, fulgt av to ukers inkubering i seleksjonsmedium inneholdende 20 % føtalt kalveserum, 18 % "653"-kondisjonert medium, 5 % origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 enheter/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamycin og IX HAT (Sigma; HAT tilsettes 24 timer etter fusjonen). Etter to uker dyrkes cellene i medium hvor HAT er erstattet med HT. Individuelle brønner analyseres så ved ELISA for monoklonale, humane anti-Abeta(4-i0)-IgM- og IgG-antistoffer. Så fort omfattende hybridomvekst opptrer analyseres mediet vanligvis etter 10-14 dager. De antistoffutskillende hybridomene såes ut på nytt og analyseres igjen, og dersom de fortsatt er positive for humane, monoklonale anti-Abeta(4.io)-antistoffer av type IgG kan de subklones minst to ganger ved begrensende fortynning. De stabile subklonene dyrkes så in vitro for dannelse av små mengder antistoff i vevsdyrkningsmedium for karakterisering.

Anti-Abeta-antistoffmolekylene kan også fremstilles rekombinant (f.eks. i et E. coli /T7-ekspresjonssystem som diskutert ovenfor). I denne utførelsen kan nukleinsyrer som koder for antistoffmolekylene (f.eks. VH eller VL) innsettes i et pet-basert plasmid og uttrykkes i E. co///T7-systemet. Det er flere fremgangsmåter for fremstilling av rekombinante antistoffer som er velkjente innen faget. Et eksempel på en fremgangsmåte for rekombinant fremstilling av antistoffer beskrives i U.S. patentskrift nr. 4,816,567. Antistoffmolekylene kan også produseres rekombinant i CHO- eller NSO-celler.

Begrepet "monoklonalt antistoff som anvendt her viser til et antistoff fremskaffet fra en populasjon av i det vesentlige homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som utgjør populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke og er rettet mot ett enkelt antigent sete. Monoklonale antistoffer er fordelaktige ved at de kan syntetiseres av en hybridomkultur, i det vesentlige ikke-forurenset av andre immunglobuliner. Adjektivet "monoklonalt" viser til antistoffets egenskaper som erholdt fra en i det vesentlige homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke oppfattes som at det krever fremstilling av antistoffet ved en gitt fremgangsmåte. Som nevnt ovenfor kan de monoklonale antistoffene som skal anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse fremstilles ved hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler, et al., Nature 256:495 (1975).

Et polyklonalt antistoff er et antistoff som ble dannet sammen med eller i nærvær av ett eller flere andre, ikke-identiske antistoffer. Generelt dannes polyklonale antistoffer fra en B-lymfocytt i nærvær av flere andre B-lymfocytter som danner ikke-identiske antistoffer. Vanligvis erholdes polyklonale antistoffer direkte fra et immunisert dyr.

Begrepet "fullt ut humant antistoff" viser til et antistoff som kun omfatter humane immunglobulinsekvenser. På tilsvarende måte viser "museantistoff" til et antistoff som kun omfatter muse-immunglobulinsekvenser.

Foreliggende beskrivelse omfatter "kimære antistoffer" - et antistoff som omfatter et variabelt område ifølge foreliggende beskrivelse fusjonert til eller kimærisert med et antistoffregion (f.eks. et konstant region) fra en annen, ikke-human art (f.eks. mus, hest, kanin, hund, ku, kylling). Disse antistoffene kan anvendes for å modulere ekspresjonen eller aktiviteten av Abeta(4-i0) i de ikke-humane artene. "Humanisert antistoff viser til et antistoff som omfatter et ikke-humant CDR i rammeverket fra et ellers humant antistoff, eller et ikke-humant variabelt område koblet til det konstante område i et ellers humant antistoff. Foreliggende beskrivelse omfatter humaniserte antistoffer som omfatter et CDR eller variabelt område fra en ikke-human art og som omfatter aminosyresekvensen til et variabelt område eller CDR ifølge foreliggende beskrivelse.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante område i tungkjedene kan immunglobuliner fordeles på forskjellige klasser. Det finnes minst fem hovedklasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan oppdeles videre i underklasser (isotyper), f.eks. IgG-1, IgG-2, IgG-3 og IgG-4; IgA-1 og IgA-2. Antistoffmolekylene ifølge beskrivelsen er fortrinnsvis IgG-1 eller IgG-4.

Antistoffene ifølge beskrivelsen kan også være konjugerte til radioaktive isotoper, for eksempel "Tc,90Y, mIn,32P,14C,1251,3H,131I, UC, 150, 13N, 18F, 35S, 51Cr,57To, 226Ra,

<60>Co,<59>Fe,<57>Se,1<52>Eu,6<7>CU,<217>Ci,21<1>At,2<12>Pb,4<7>Sc,<109>Pd,23<4>Th, og<40>K, og ikke-radioaktive isotoper som<157>Gd, 55Mn, 5<2>Tr,<56>Fe.

Antistoffene ifølge beskrivelsen kan også være konjugert til fluorescerende eller kjemiluminiscerende grupper, inkludert fluoroforer som chelater av sjeldne jordmetaller, fluorescein og fluoresceinderivater, rhodamin og rhodaminderivater, isotiocyanat, fycoerytrin, fycocyanin, allofycocyanin, o-ftalaldehyd, fluorescamin<152>Eu, dansyl, umbelliferon, luciferin, luminal, isoluminal, en aromatisk akridiniumester, et imidazol, et akridiniumsalt, en oksalatester, et ekvorin, 2,3-dihydroftalazindioner, biotin/avidin, spinnmerkede grupper og stabile frie radikaler.

Enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget for konjugering av antistoffmolekylene ifølge beskrivelsen til de forskjellige gruppene kan benyttes, inkludert fremgangsmåtene som beskrives av "Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); og Nygren, J., Histochem. og Cytochem. 30:407 (1982). Fremgangsmåter for konjugering av antistoffer er konvensjonelle og svært velkjente innen faget.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også visse terapeutiske fremgangsmåter som bygger på tilførsel av immunogene preparater som omfatter Abeta(4-io) eller molekyler som bindes til Abeta-peptider. Således kan antigener som omfatter Abeta(4-i0) tilføres for å inhibere eller forsterke utfellingen av plakk ved aldring eller humane sykdommer som Alzheimers sykdom.

Foreliggende beskrivelsen omfatter også fremgangsmåter for fremstilling, påvisning, rensing og karakterisering av Abeta(4-i0)-antigener og analoger derav og fremgangsmåter for anvendelse av Abeta(4-i0)-antigener og analoger derav. Abeta(4-i0)-antigener kan fremstilles ved modifikasjoner som omfatter proteolytisk spalting av større amyloide peptider isolert fra naturlige kilder, ved teknikker for genetisk modifisering, eller ved kjemisk syntese, for eksempel ved peptidsyntese i fast fase, eller de kan fremstilles de novo ved fremgangsmåter for genetisk modifisering eller ved peptidsyntese i fast fase.

MOLEKYLÆRBIOLOGI

I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan det benyttes konvensjonelle molekylærbiologiske teknikker, mikrobiologiske teknikker og rekombinante DNA-teknikker ifølge teknikkens stand. Slike teknikker er forklart fullt ut i litteraturen. Se f.eks. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (her betegnet "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, bind I og II (D.N. Glover, red. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, red. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins, red. (1985)]; Tanscription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, red.

(1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, red. (1986)]; Immobilized Cells And Ezymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.

(1994).

CRND8-mus

TgCRND8-mus er en dyremodell for AD som viser høyt nivå av Abeta-syntese og utfelling av amyloid i CNS ved en alder på 3 måneder. Se internasjonalt patentskrift nr. WO01/97607, publisert 27. desember 2001. Videre viser TgCRND8-mus kognitive endringer i løpet av det tidsrom hvor utfellingen av amyloid foregår. Den transgene TgCRND8-muse-modell særpreges ved at den viser stor likhet med den naturlig forekommende Alzheimers sykdom-fenotype, basert på ekspresjonen av Abeta-amyloidprotein i CNS så vel som på histologisk analyse, nevrologi og adferdssvikt.

APP-genet gjennomgår alternativ spleising slik at det dannes tre vanlige isoformer. Den lengste isoformen, som inneholder 770 aminosyrer (APP770) og den nest lengste isoformen, som inneholder 751 aminosyrer (APP75i), uttrykkes i de fleste vev. Det tredje transkript, som inneholder 695 aminosyrer (APP695), uttrykkes hovedsakelig i hjernen. Vanligvis benyttes kodonnummereringen til den lengste isoform, APP770, også når det vises til kodonposisjoner i de kortere isoformene.

Den TgCRND8-transgene mus inneholder et transgen som uttrykker en mutant form av den hjernespesifikke APP695-isoform, dette transgen bærer både den "svenske" APP-mutasjon og "Indiana"-APP-mutasjonen.

Et APP695-cDNA som inneholdt (ifølge kodonnummereringen for APP69s) mutasjonene K595N/M596L (den svenske mutasjon) og V642F (Indiana-mutasjonen) ble fremstilt. Disse og andre APP-mutasjoner vil generelt vises til her ved det mer vanlig brukte APP770-kodonnummereringssystem, det vil for disse to mutasjonene si K670N/M671L (den svenske mutasjon) og V717F (Indiana-mutasjonen).

Denne dobbeltmuterte APP695-cDNA-kassett ble innsatt i cosmidekspresjons-vektoren cosTet, som inneholder promoteren fra prionproteingenet fra Syriahamster. Vektoren ble så mikroinjisert inn i en muse-oocytt slik at det ble fremstilt en transgen linje som ble betegnet TgCRND8. Disse musene viser flere diffuse amyloide utfellinger i en alder på tre måneder, på et tidspunkt hvor mangler i rommelig læring blir åpenbare.

TgCRND8-mus er blitt krysset med forskjellige andre transgene mus som bærer en AD-forbundet mutasjon slik at det er blitt fremstilt bitransgene mus som viser ytterligere, forsterket AD-relatert nevropatologi.

ADMINISTRASJON OG MEDISINSK BRUK

Utsagnene nedenfor refererer til fremgangsmåter for behandling. Det skal forstås at fremgangsmåter for behandling er ikke en del av oppfinnelsen, men utsagnene beholdes i og med at de er relevante for den medisinske bruk av oppfinnelsen som definert i patentkravene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåter for anvendelse av Abeta(4-io)-antigener for påvisning av medikamenter som interferer med bindingen av Abeta42til plakk. Én slik utførelse omfatter analyser for medikamentgjennomsøking for påvisning av medikamenter som etterligner og/eller komplementerer virkningen av Abeta42. I én slik utførelse gjennomsøkes et medikamentbibliotek ved å analysere bindingsevnen til et peptid som omfatter Abeta(4-i0) til et spesifikt, lite molekyl. Virkningen av et mulig medikament på affiniteten av Abeta42til plakk måles. Dersom medikamentet reduserer bindingsaffiniteten av Abeta42til plakk blir det et kandidatmedikament. Medikamenter kan analyseres for evne til å forstyrre plakkdannelsen, hindre fibrillogenese-prosessen eller disaggregere allerede dannede fibriller.

Antigenene, antistoffene eller andre forbindelser som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse kan innføres som bestanddeler av farmasøytiske preparater. De farmasøytiske preparatene inneholder fortrinnsvis en terapeutisk eller profylaktisk mengde av minst ett av antigenene, antistoffene eller andre forbindelser derav sammen med et farmasøytisk effektivt bærerstoff.

Ved fremstilling av de farmasøytiske preparatene som er anvendbare i de foreliggende fremgangsmåtene bør det benyttes et farmasøytisk bærerstoff, som er enhver kompatibel, ikke-toksisk forbindelse som er egnet for tilførsel av antigenene, antistoffene eller de bindende fragmenter derav eller terapeutiske forbindelser som er påvist i samsvar med fremgangsmåtene som beskrives hertil pasienten. Sterilt vann, alkohol, fett, voks, inerte faste stoffer og til og med liposomer kan anvendes som bærer. Farmasøytisk aksepterbare adjuvanser (bufringsmidler, dispersjonsmidler) kan også innføres i det farmasøytiske preparat. Antistoffene og de farmasøytiske preparater derav er spesielt anvendbare for parenteral tilførsel, dvs. intravenøst, intraarterielt, intramuskulært eller subkutant. Intranasal tilførsel eller tilførsel ved andre aerosolutforminger er imidlertid også anvendbare. Konsentrasjonen av forbindelse, f.eks. et antistoff, i en utforming for tilførsel kan variere innen vide grenser, dvs. fra mindre enn tilnærmet 0,5 %, vanligvis minst 1 %, til opp til 15 eller 20 % (vekt/vekt) eller mer, og vil hovedsakelig utvelges basert på væskevolumer, viskositet osv. som foretrekkes for den valgte tilførselsmåte. Faktiske fremgangsmåter for fremstilling av tilførbare preparater vil være kjente eller åpenbare for fagfolk og beskrives i mer detalj i f.eks. Remington's Pharmaceutical Science, 18. utgave, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990).

Immunogene preparater ifølge foreliggende oppfinnelse eller antistoffer eller antigenbindende fragmenter ifølge beskrivelsen tilføres i en terapeutisk effektiv dose som er tilstrekkelig til å modulere utfelling av amyloid (eller amyloidbelastningen) i et individ. En "terapeutisk effektiv dose" modulerer fortrinnsvis utfellingen av amyloid med minst tilnærmet 20 %, mer foretrukket med minst tilnærmet 40 %, enda mer foretrukket med minst tilnærmet 60 % og ytterligere mer foretrukket med minst tilnærmet 80 % sammenlignet med ikke-behandlede individer. Evnen til en fremgangsmåte til å modulere utfelling av amyloid kan evalueres i modellsystemer som kan forutsi virkningen når det gjelder modulering v utfelling av amyloid i humane sykdommer, f.eks. dyremodellsystemer som er kjente innen faget (f.eks. inkludert fremgangsmåten som beskrives i PCT-publikasjon W096/28187), eller ved in wtro-fremgangsmåter, f.eks. fremgangsmåten til Chakrabartty, som beskrives i PCT-publikasjon WO97/07402, eller TgCRND8-modellsystemet som beskrives her. Videre kan mengden eller fordelingen av amyloide utfellinger i et individ måles ikke-invasivt in vivo f.eks. ved anvendelse av radioaktivt merkede sporstoffer som kan bindes til amyloide utfellinger, fulgt av scintigrafi for synliggjøring av de amyloide utfellinger (se for eksempel Aprile, C. et al., Eur. J. Nuc. Med. 22:1393 (1995): Hawkins, P. N., Baillieres Clin. Rheumatol. 8:635 (1994) og referanser som siteres der). Foreksempel kan således amyloidbelastningen i et individ evalueres etter en periode med behandling ifølge fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen og sammenlignes med amyloidbelastningen hos individet før påbegynt behandling med en terapeutisk forbindelse ifølge oppfinnelsen, for å bestemme virkningen av den terapeutiske forbindelse på utfellingen av amyloid i individet.

Det vil forstås at evnen til en fremgangsmåte ifølge beskrivelsen til å modulere utfelling av amyloid eller amyloidbelastningen i visse utførelser kan evalueres ved å observere symptomene eller tegnene som er forbundet med utfelling av amyloid eller amyloidbelastning in vivo. Således kan f.eks. evnen til en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse til å redusere amyloidutfelling eller amyloidbelastningen assosieres med en observerbar forbedring i en klinisk manifestering av den underliggende, amyloidforbundne sykdomstilstand eller en reduksjon eller forsinkelse av utviklingen av symptomer på tilstanden. Måling av kliniske sykdomsmanifestasjoner kan således være nyttig for evaluering av den amyloidmodulerende virkning av en fremgangsmåte ifølge beskrivelsen.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelsen kan være anvendbare for behandling av amyloidose forbundet med andre sykdommer i hvilke utfelling av amyloid opptrer. Klinisk kan amyloidose være primær, sekundær, familiær eller isolert. Amyloid er blitt klassifisert ut fra typen amyloidogent protein som foreligger i amyloidet. Eksempler på amyloid som kan moduleres, identifisert ved det amyloidogene protein, er som følger (hvor den tilhørende sykdom er gitt i parentes etter det amyloidogene protein): beta-amyloid (Alzheimers sykdom, Downs syndrom, arvelig hjerneblødning-amyloidose [nederlandsk], cerebral angiopati), amyloid A (reaktiv [sekundær] amyloidose, familiær middelhavsfeber, familiær amyloid nefropati med urticaria og døvhet [Muckle-Wells syndrom], amyloid kappa-L-kjede eller amyloid lambda L-kjede (idiopatisk [primær], myelom eller makro-globulinemi-forbundet), Abeta2M (kronisk hemodialyse), ATTR (familiær amyloid polynevropati [portugisisk, japansk, svensk], familiær amyloid cardiomyopati [dansk], isolert hjerteamyloid, systemisk senil amyloidose), AIAPP eller amylin (diabetes hos voksne, insulinom), atrial naturetisk faktor (isolert atrialt amyloid), prokalsitonin (medullær karsinom i skjoldbrukskjertelen), gelsolin (familiær amyloidose [finsk]), cystatin C (arvelig cerebral blødning med amyloidose [islandsk]) AApoA-I (familiær amyloid polynevropati [Iowa]), AApoA-II (akselerert aldring hos mus), fibrinogenassosiert amyloidotisk, lysozymassosiert amyloid og AScr eller Prp-27 (Skrapesyke, Creutzfeldt-Jacobs sykdom, Gertsmann-Straussler-Scheinker-syndrom, bovin spongiform encefalitt).

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSER

Eksempel 1

Antigensyntese og strukturell karakterisering

I dette eksempel beskriver oppfinnerne hvordan man kan syntetisere, rense og karakterisere syntetiske Abeta-peptidimmunogener.

Syntese av følgende Abeta-peptider: Abeta42, Abeta40, Abeta30, og N-terminale epitoppeptider ble utført med et ABIMED EPS-221 halvautomatisk peptidsynteseinstrument ved anvendelse av NovaSyn (Novabiochem) PEG-transplantert polymerresin og Fmoc N-terminal beskyttelsesmetodologi som beskrevet. Se Mayer-Fligge et al., J. Pept. Sei. 4:355-363 (1998). Fmoc-avspaltningstrinnene og de endelige avbeskyttelsessykluser ble fulgt spektrofotometrisk. De syntetiske peptidene ble renset ved anvendelse av en semi-preparativ revers fase C18-|abondapak HPLC-kolonne.

Molekylvekten av de rensede, syntetiske peptidene ble så bestemt ved plasma-desorpsjons (MALDI)- og elektrospray (ESI)-massespektroskopi. Kun peptidfraksjoner med molekylmasse som tilsvarte den forventede masse ble anvendt for de påfølgende immuniseringer.

Sekundærstrukturen til peptidene i løsning ble evaluert ved anvendelse av sirkulær dikroisme (CD). CD-spektrene ble oppsamlet ved anvendelse av et JASCO J-500 spektropolarimeter. Se Mayer-Fligge et al., J. Pept. Sei. 4:355-363 (1998). I tillegg ble det utført NMR-undersøkelser ved benyttelse av 2D-NMR-NOESY-analyse med et Bruker-AMX-600-instrument som beskrevet tidligere. Michels et al., "Structure and Functional Characterization of the periplasmis N-terminal polypeptide domain of the sugar specific ion channel protein (scry-porin)", Protein Science (undertrykking 2002).

Eksempel 2

Immunisering av CRND8- mus med Abeta42

I dette eksempel viser oppfinnerne at Abeta42-peptidet er immunogent i mus som uttrykker APP-transgenet og i ikke-transgene mus.

Mus

TgCRND8-musene er tidligere blitt beskrevet av Chishti et al, J. Biol. Chem. 276:21562-21570 (2001). Musene ble vedlikeholdt i en utavlet C3H/C57BL/6J-bakgrunn som overuttrykker Beta-APPSwedish- og Beta-APPV7i7F-mutasjonen i cis på Beta-APP695-transkriptet. Beta-APPSwedish- og Beta-APPV7i7F-genene var under kontroll av priongen-promoteren fra Syriahamster. TgCRND8-mus erholdt ved krysning mellom C3H/C57BL6 (82%/18%) transgen-positive hemizygote mus og wt C57BL/6J-mus ble avvendt, genotypen for forekomst av beta-APP-transgenet og plassert i grupper på 2-4 mus av samme kjønn i standard musebur. Musene ble gitt forpellets, pulverisert for og vann ad libitum. Alle mus ble håndtert i én uke før første immunisering, og kroppsvekten ble målt dagen før og to dager etter hver immunisering. Alle de eksperimentelle grupper var tilpasset hverandre når det gjelder kjønn og vekt.

Immuniseringsfremgangsmåte og isolering av serum

Det syntetiske Abeta42og et kontroll peptid bestående av aminosyrerestene 8-37 (ATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY) (SEQ ID NO:52) fra amyloid polypeptid fra Langerhans øyer (IAPP) ble isolert ved revers fase-HPLC på en C18 ubondapak-olonne, og peptidenes renhet ble bestemt ved massespektrometri og aminosyreanalyse.

Immuniseringsfremgangsmåten og immuniseringsskjemaet var som beskrevet tidligere i Schenk et al. Nature 400:173-177 (1999). Deretter ble antistofftiteret bestemt i serumprøver (200 ul blod) oppsamlet ved punksjon av bakbensvenen ved en alder på 13 uker, og ved hjertepunksjon ved avsluttet immunisering ved en alder på 25 uker. Før serumet ble anvendt i disse undersøkelsene ble komplement inaktivert ved inkubering ved 56 °C i 30 minutter. Ig-fraksjoner ble isolert over en 5 ml protein G-kolonne. Prøver ble påsatt, vasket med PBS, eluert med 0,1 M natriumsitrat og bufret med 1 M tris. Alle Ig-fraksjoner ble filtersterilisert før bruk.

Immuniseringsresulta ter

Serum ble isolert fra ikke-immuniserte mus (N=18) og fra både TgCRND8-mus og deres ikke-transgene kullsøsken etter gjentatt immunisering over et tidsrom på 5 måneder med enten Abeta42(n=34, 18 TgCRND8 og 16 ikke-Tg) eller med et perifert amyloidpeptid (øyassosiert polypeptid (IAPP), hvor antall immuniserte mus var 17, med 10 TgCRND8 og 7 ikke-transgene (ikke-Tg). Musene utviklet signifikante titere mot Abeta42(1:5000-1:50000) og mot IAPP (1-5000 til 1-30000). Interessant nok ble ingen signifikante forskjeller observert i anti-Abeta42-titerene hos TgCRND8-transgene mus og deres ikke-transgene kullsøsken. Alle serumprøver fra Abeta42-immuniserte mus kunne farge modne Abeta-plakk positivt i histologiske snitt fra hjerne fra 20 uker gamle ikke-immuniserte TgCRND8-mus. I motsetning til dette kunne serum fra kontrollpeptid i APP-immuniserte og ikke-immuniserte mus ikke farge modne Abeta-plakk i histologiske snitt fra hjerne fra 20 uker gamle ikke-immuniserte TgCRND8-mus. Resultatene viser følgelig at antistoff-autoimmunitet som kan gjenkjenne og bindes til nevropatologiske plakk som inneholder Abeta kan induseres.

EKSEMPEL 3

Inhibering av fibrilldannelse med immunserum fra mus

I dette eksempel viser oppfinnerne, som i Tabell 2, at serum fra de fleste Abeta42-immuniserte mus inhiberte fibrilldannelse.

I lave konsentrasjoner vil løsninger av Abeta-peptider spontant danne fibriller over en inkuberingstid på 14 dager. Disse fibrillene har en karakteristisk diameter på 50-70 Å som kan måles ved elektronmikroskopi som beskrevet nedenfor.

Elektronmikroskopi

Abeta42ble anvendt direkte etter at peptidet var løst i vann i en lagerkonsentrasjon på 10 mg/ml eller etter oppbygging av modne amyloide fibriller. Abeta42ble inkubert i nærvær og fravær av serum ved en endelig peptidkonsentrasjon på 100 ug/ml. Seriefortynninger av forskjellige sera ble tilsatt til Abeta42og inkubert ved romtemperatur (RT) i opp til 2 uker. For elektronmikroskopi ved negativ farging fikk karbonbelagte pioloform-nett flyte på vandige løsninger av peptider. Etter fjerning av overskudd av væske og lufttørking av nettene ble prøvene farget med 1 % (vekt/vol) fosfowolframsyre. Peptidaggregatene ble observert i et Hitachi 7000 elektronmikroskop som ble drevet ved 75V ved en forstørrelse på 60000 X.

Elektronmikroskopiresulta ter

For å anslå virkningen av serum fra Abeta-immuniserte mus på oppbygging av Abeta til fibriller ble serum inkubert som beskrevet ovenfor i nærvær eller fravær av Abeta42ved 37 °C i opp til 14 dager. Uttak fra hver reaksjonsblanding ble undersøkt på dag 1, 3, 7, 10 og 14 for nærvær av Abeta42-fibriller ved elektronmikroskopi med negativ farging.

I fravær av serum eller i nærvær av ikke-immunisert serum dannet Abeta42lange fibriller (~7500Å) med en karakteristisk diameter på 50-70 Å. De lange fibrillene viste således at normale bestanddeler av serum ikke inhiberte Abeta-fibrilldannelsen under de foreliggende analysebetingelser. I nærvær av serum fra IAPP-immuniserte dyr ble det dannet færre lange Abeta42-fibriller, men fibrillene som ble dannet hadde den karakteristiske diameter på 50-70 Å. I motsetning til dette blokkerte, som vist i Tabell 2, de fleste sera fra Abeta42-immuniserte mus (n=27/34) i stor grad fibrilldannelsen, selv om noen få sera (n=7/34) hadde liten eller ingen virkning. Videre inhiberte serum fra Abeta-immuniserte TgCRND8-mus eller fra ikke-transgene kullsøsken Abeta-fibrilldannelsen i samme grad, noe som viser at antistoffrepertoaret kun avhenger av immunogenet og ikke av mengden endogent Abeta42.

Som oppsummert i Tabell 2 kunne ingen forskjeller i fibrillstrukturen påvises ved inkubering i nærvær av serum fra ikke-immuniserte mus. Serum fra mus immunisert med IAPP reduserte omfanget av fibrilldannelsen, men de fibriller som ble dannet tilsvarte fibrillene som dannes av Abeta42alene. Endelig inhiberte serum fra mus immunisert med Abeta42fibrillogenesen i varierende grad fra fullstendig inhibering til kun svak reduksjon av fibrilltettheten. Se Tabell 2.

Tabell 2 Oppsummering av virkninger av serum fra ikke-immuniserte mus, Abeta--immuniserte mus og IAPP-immuniserte mus på fibrilldannelse, fibrillnedbrytning og cytotoksisitet.

Eksempel 4

Oppbryting av eksisterende fibriller med immunserum

I dette eksempel viser oppfinnerne at serum fra Abeta42-immuniserte mus disaggregerte allerede dannede Abeta42-fibriller, men at allerede dannede Abeta42-fibriller ikke påvirkes ved inkubering med serum fra ikke-immuniserte kontrollmus eller med serum fra IAPP-immuniserte mus.

For å fastslå hvorvidt serum fra Abeta42-immuniserte mus kan oppbryte allerede dannede Abeta-fibriller ble serum fra Abeta42-immuniserte mus inkubert med allerede dannede Abeta42-fibriller i opp til 30 dager. Abeta42-fibrillene, med tegn på aggregering, ble dannet ved å inkubere Abeta-porsjoner i høye konsentrasjoner under konstant omrøring. Inkubering av foreliggende fibriller uten serum (Abeta alene), med IAPP-immunisert serum eller med ikke-immunisert serum (resultater ikke vist) hadde ingen virkning, selv etter 30 dagers inkubering. I motsetning til dette disaggregerte serum fra Abeta42-immuniserte mus (n=26/34) Abeta42-fibriller, enten til små, korte fibriller med diameter 30 Å og en gjennomsnittslengde på 100 Å eller til amorfe aggregater. Denne disaggregering var åpenbar etter kun tre dagers inkubering og var fullstendig etter 14 dager. I tillegg var disaggregeringen konsentrasjonsavhengig, hvor økende konsentrasjoner av antistoff reduserte tiden som var nødvendig for disaggregering av fibriller. Endelig er det, siden et 1:1 forhold mellom antistoff og Abeta42ikke var nødvendig for disaggregeringen, sannsynlig at anti-Abeta-antistoffer kun ble bundet til en undergruppe av Abeta-molekyltypene, for eksempel protofibrillære oligomerer eller andre forløpere. Resultatene ble bestemt ved anvendelse av elektronmikroskopi som beskrevet i Eksempel 4 ved en forstørrelse på 60000 x.

Eksempel 5

Massespektrometrisk bestemmelse av immunmålepitopen i Abeta42som gjenkjennes av an ti serum fra mus.

I dette eksempel viser oppfinnerne hvordan man nøyaktig kan identifisere en epitop med avgjørende biologisk betydning for anvendelse ved behandling av amyloide utfellingssykdommer.

Generelt opplegg

For å identifisere epitopen som gjenkjennes av anti-Abeta42-seraene ble Fourier-transformasjons-ionesyklotronresonans-massespektrometri med høy resolusjon (FT-ICR-MS; Marshall et al., Mass Spectrom. Rev. 17:1-35 (1998)) og bruk av både nano-elektrospray (nESI)- og MALDI-ionisering benyttet i kombinasjon med utkutting av epitoper og epitopekstraksjonsfremgangsmåter som diskuteres nedenfor. Se Macht et al., Biochemistry 35: 15,633-15,639 (1996); Suckau et al., Proe. Nati Acad. Sei. USA 87:9848-9852 (1990); Przybylski et al., "Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry-" In New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, s. 17-43 (1998).

I én fremgangsmåte, som betegnes epitopeksisjon, kombinerte vi selektiv proteolytisk spalting av intakt, immobilisert immunkompleks med massespektrometrisk peptidkartlegging av det bundne peptid etter frigivelse av dette. Nærmere bestemt ble antiserum fra Abeta42-immuniserte TgCRND8-mus, kontroll-antisera fra IAPP-immuniserte mus, monoklonale Abeta42-antistoffer fra mus og polyklonale Abeta42-antistoffer fra kanin immobilisert til sefarose-mikrokapillærer. Deretter ble de immobiliserte antistoffene behandlet med Abeta42-aggregater slik at de fikk bindes til Abeta42-epitopen. Epitopeksisjonsfremgangsmåten ble utført på immunkomplekset ved anvendelse av en rekke proteaser og eksopeptidaser eller med kombinasjoner av enzymer. Se Tabell 2.

Alternativt ble epitopekstraksjonsfremgangsmåten benyttet. For epitopekstraksjon ble Abeta42på forhånd kuttet med forskjellige proteaser, hvoretter blandingen av proteaseprosesserte Abeta42-peptider ble satt på antistoffkolonnene slik at antistoffet fikk binde epitopen. Epitopen ble identifisert ved anvendelse av massespektroskopi etter eluering av det bundne peptid. Denne fremgangsmåte betegnes epitopekstraksjon.

De enkelte fremgangsmåtene er beskrevet i detalj nedenfor:

Antistoffimmobilisering

En løsning av 100ug i koblingsbuffer (0,2 M NaHC03, 0,5 M NaCI, pH 8,3) ble tilsatt til tørr NHS-aktivert, 6-aminoheksansyrekoblet sefarose (Sigma), og koblingsre-aksjonen ble utført i 60 minutter ved 20 °C. Sefarose-materialet ble så overført til en 100H.m mikrokapillærkolonne som tillater omfattende vask uten tap av materiale. Se Macht et al., Biochemistry 35: 15,633-15,639 (1996). Kolonnen ble vasket alternerende med blokkeringsbuffer (etanolamin/NaCI) og vaskebuffer (NaAc/NaCI) som beskrevet, og kolonnen ble til slutt lagret i PBS ved pH 7,5, 4 °C. Se Macht et al., Biochemistry 35: 15,633-15,639 (1996).

Epitopeksisjon

Epitopeksisjonsfremgangsmåtene ble utført ved først å påsette 2-5 ug Abeta42eller andre Abeta-antigener på antistoff-mikrokolonnen og inkubere i 60 min ved 20 °C under forsiktig omristing. Etter gjentatt vask med 5 x 4 ml PBS ble proteasekuttingen utført på kolonnen i 2 timer ved 37 °C ved å inkubere med 0,2 ug protease i 200 ul PBS. Proteasene omfattet trypsin; Lys-C-protease; Asp-N-protease; a-chymotrypsin; og Glu-C-protease. Ubundne og kuttede peptider eller supernatant ble fjernet ved vask med 5 x 4 ml PBS.

Deretter ble antistoffbundet epitoppeptid dissosiert og eluert ved tilsetning av 500jllI 0,1 %

(vol/vol) TFA (epitopeluering). Etter inkubering i 15 minutter ved 20 °C ble epitopelueringsfraksjonen frysetørket og rekonstituert i 10 jllI 0,1 % TFA for massespektrometrisk analyse. Fremgangsmåter med ytterligere kutting med eksopeptidase ble utført ved inkubering med 0,1 ug aminopeptidase M eller karboksypeptidase Y i 30 minutter, fulgt av vask med 5x4 ml PBS.

Epitopekstraksjon

Epitopekstraksjonsfremgangsmåten ble utført på samme måte som epitop-elueringen, bortsett fra at blandingen av proteolytiske fragmenter ble påsatt antistoff-kolonnen og inkubert i 60 minutter ved 20 °C. Deretter ble ubundne peptider (supernatant) fjernet ved vask med 5 x 4 ml PBS. Deretter ble den antistoffbundne epitop disassosiert og eluert ved tilsetning av 500 ul 0,1 % (vol/vol) TFA (epitopeluering). Etter inkubering i 15 minutter ved 20 °C ble epitopelueringsfraksjonen frysetørket og rekonstituert i 10 jllI 0,1 % TFA for massespektrometrisk analyse.

Proteolytisk spalting

Proteolytisk spalting av frie antigener ble utført med 5-50 ug peptid løst i 50 mM NH4HCO3i 2 timer ved 37 °C ved et forhold mellom substrat og protease på 50:1. Reaksjonsblandingene ble frysetørket for massespektrometrisk analyse eller forberedt for epitopekstraksjon. De anvendte proteaser var trypsin (Promega, Madison); Lys-C, Asp-N, Glu-C (Roche-Boehringer Mannheim): a-chymotrypsin, aminopeptidase M, karboksypeptidase Y (Sigma).

Massespektrometri

FTICR-MS ble utført med et Bruker (Bruker Daltonik, Bremen, FRG) Apex II FTICR spektrometer utstyrt med en 7T superledende magnet og en ICR-analysecelle. Se Bauer et al., Anal. Biochem. 298:25-31 (2001). MALDI-FTICR-kilden med en pulset Apollo-nano-ESI-kollisjonskilde, instrumentbetingelser og massekalibrering er beskrevet tidligere. Se Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496 (2000). Nøyaktigheten i massebestemmelsen var tilnærmet~1 ppm (MALDI) og typisk 0,5-1 ppm (BSI) ved en masseresolusjon på~200000. 2,5-di-hydroksybenzosyre (DHB) ble anvendt som støttemiddel for MALDI-MS prøvefremstilling. Se Bauer et al., Anal. Biochem. 298:25-31 (2001). ESI-MS ble generelt utført med løsninger i vandig 0,01 % TFA. Se Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496

(2000).

Massespektroskopiske resultater

Epitopeksisjon og -ekstraksjon med antistoff immobilisert til et sefarose-kondisjonert mikrokapillær ble anvendt, fulgt av analyse ved ESI- og MALDI-FTICR-massespektrometri. Macht et al. Biochemistry 35: 15633-39 (1996); Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496 (2000); Se Bauer et al., Anal. Biochem. 298:25-31 (2001); Przybylski et al., "Approaches to the characterization of tertiary and supramolecular protein structures by combination of protein chemistry and mass spectrometry." In New Methods for the study of Biomolecular Complexes, Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, s. 17-43 (1998).

Først viser MALDI-MS av en tryptisk peptidblanding av fritt Abeta42-antigen alle de forventede proteolytiske Abeta-peptider, inkludert følgende:

Epitopeksisjon ved anvendelse av kutting med Lys-C og trypsin ga eluering av et enkelt peptidfragment som ga et enkelt ion, Abeta(i-i6) med masse 1954,8806 ved anvendelse av MALDI-FTICR-påvisning. I dette tilfelle var R5-aminosyreresten i Abeta beskyttet mot kutting med Lys-C og trypsin.

Peptidfragmentet Abeta(i-ii) med masse 1324,5395 Da ble eluert etter epitopeksisjon med S. Aureus Glu-C-protease.

ESI- og MALDI-spektra fra eluatet fra epitopekstraksjon etter kutting med a-chymotrypsin og aminopeptidase M ga fragmentene Abeta(i-i0) 1195,4968 Da og Abeta(4-io) 880,3827 Da.

Den sentrale epitop ble bestemt ved anvendelse av aminopeptidase M-kutting av det antistoffbundne chymotropsinfragment og Abeta(i-i0)-immunkomplekset. Denne dobbeltkutting identifiserte Abeta(4-i0), FRHDSGY, som den minimale epitop med en affinitet som tilsvarte affiniteten til Abeta42. Den C-terminale aminosyre er Y10, siden videre C-terminal kutting fra Y10 ved anvendelse av karboksypeptidase A ga peptider med drastisk redusert affinitet sammenlignet med Abeta42.

Tabell 3 viser peptidfragmentene som ble erholdt ved massespektroskopi etter epitopeksisjon og epitopekstraksjon ved anvendelse av anti-Abeta-antistoffene og Abeta- peptidene. Dersom Abeta42-peptid (Tabell 3, rad 1) ble kuttet på forhånd med trypsin tilsvarte peptidet erholdt fra antistoffbindingssetet sekvensen som er vist i Tabell 3, rad 1. Kombinasjonen av proteasene trypsin og Lys-C identifiserte det samme peptid på 16 aminosyrerester (Tabell 3, rad 2). Dersom proteasen var Glu-C protease fra S. Aureus og denne ble anvendt for epitopeksisjon ble et peptid på 11 aminosyrerester eluert fra antistoffbindingssetet som vist i rad 3. Et peptid på 10 aminosyrerester ble observert ved kutting med a-chymotrypsin alene (Tabell 3, rad 4). Som vist i Tabell 3, rad 5, ble den sentrale epitop på syv aminosyrer observert dersom proteasekuttingen ble utført med de to enzymene a-chymotrypsin og aminopeptidase M.

Oppsummering

Analyse ved MALDI- og ESI-MS påviste en lineær epitop som omfattet den N-terminale sekvens, Abeta(i-i0) som det eneste spesifikke produkt etter epitopeksisjon. Se Tabeller 3 og 4. Massespektroskopisk analyse av trypsinbehandlet, fritt Abeta42-antigen ga alle de forventede peptider (1-16), (6-16), (17-28), (29-42). Se Tabeller 3 og 4. Epitopeksisjon med trypsin og Lys-C-protease ga et enkelt peptid (1-16). Glu-C-protase og a-chymotrypsin ga kun fragmentene (1-11) henholdsvis (1-10). Se Tabeller 3 og 4. I motsetning til dette var aminosyrerestene R5, E3 henholdsvis F4 beskyttet mot kutting med disse proteasene. Videre kutting av antistoffbundne endoproteasefragmenter ble utført med eksopeptidaser for å definere den sentrale epitop. Aminopeptidase M-kutting av det chymo-tryptiske fragment identifiserte Abeta(4-i0), FRHDSGY, som den minimale epitop som hadde en affinitet som tilsvarte affiniteten til Abeta42mens videre C-terminal kutting fra Y10 (karboksypeptidase A) ga drastisk redusert affinitet. Affinitetsforskjellene som ble erholdt ved epitopeksisjon og massespektrometrisk analyse sto fullt ut i samsvar med affiniteten bestemt ved ELISA med de syntetiske epitoppeptider, biotinylerte i N-enden via en spacer alkylamidogruppe. Gitlin et al., Biochem. J. 242:923-926 (1987); Craig et al., Anal. Chem. 68:697-701 (1996). Epitopen ble entydig identifisert ved den høye nøyaktighet i masse-bestemmelsen (0,5-2 ppm) for de monoisotopiske molekylioner. I tillegg ble disse resultatene bekreftet ved sekvenspesifikk fragmentering av utvalgte molekylioner i FTICR-spektra ved IR-multifotonlaserdissosiering og ved kontroll-eksperimenter med sekvens-mutanter og homologe Abeta42-peptider (resultater ikke vist). Se Fligge et al., Biochemistry 39: 8491-8496 (2000). Således ga Abeta42fra rotte, som inneholder en dobbeltmutasjon R5G og Y10F, intet elueringsprodukt etter epitopeksisjon. I motsetning til dette ga humant Abeta(i-40) og Abeta(i-3o) den samme epitop (4-10) som Abeta42. Kontrollantistoffet fra IAPP-immuniserte mus ga intet påvisbart epitoppeptid. Se Tabeller 3 og 4.

Eksempel 6

Strukturell karakterisering av Abeta- peptider

I dette eksempel sammenlignet oppfinnerne affiniteten av de påviste, syntetiske epitoppeptider med affiniteten av Abeta42for immobiliserte antistoffer og karakteriserte sekundærstrukturen til de syntetiske epitoppeptider i løsning.

Epitopen påvist ved massespektrometri blekarakterisertvidere ved anvendelse av syntetiske peptider, sekundærstrukturanalyse og immunanalytisk karakterisering av de tilsvarende autentiske peptider, biotin-Gly-Gly-Abeta(i-i0) og biotin-Abeta (4.i0). Først ble affiniteten av de forskjellige peptider for anti-Abeta-antistoff bestemt ved anvendelse av ELISA og dot-blot-analyse av epitoppeptidene (resultater ikke vist). Resultatene viste at alle peptider som vises i Tabell 3 viste tilsvarende affinitet som Abeta42.

For evaluering av en mulig konformasjonsvirkning på den aktive epitop ble en sammenligning av sekundærstrukturen til de N-terminale peptider og de tidligere rapporterte strukturer for Abeta40og Abeta42utført. CD-spekterne og 2D NMR-NOESY-spektrene (resultater ikke vist) for de N-terminale, polare peptidene Abeta(i-i0) og Abeta(i-i6) viste ingen tegn på en endelig struktur i løsning for Abeta-fragmentene. Slike resultater antyder imidlertid en viss fleksibilitet av epitopen for antistoffgjenkjenning. Dette er i samsvar med den utledede sekundærstruktur for Abeta42-sekvensen, som viser et brudd i evnen til a-heliksdannelse rundt Abeta(4-i0)-epitopområdet. I motsetning til dette ble evne til a-heliksdannelse og en heliks-løkke/p-plate-konformasjonstransisjon observert for sekvenser som omfattet transmembranområdet (Abeta(i8-42)). Se Coles et al., Biochemistry 37: 11064-11077 (1998); Kohno et al., Biochemistry 35: 16094-16104

(1996).

Eksempel 7

Virkning av serum på Abeta- indusert toksisitet

I dette eksempel evaluerte oppfinnerne evnen til Abeta-immunisert serum til å inhibere Abeta42-indusert cytotoksisitet.

Generelt opplegg

For å undersøke hvorvidt forebyggelsen av hukommelsessvikt hos TgCRND8-mus etter Abeta-immunisering kunne gjenspeile en tilsvarende virkning på cytotoksisiteten av Abeta utførte vi standard Abeta42-toksisitetsanalyser ved anvendelse av PC-12-celler. Se McLaurin et al., J. Biol. Chem. 275:18495-502 (2000); Pallitto et al., Biochemistry 38:3570-78 (1999). Først ble PC12-celler inkubert med Abeta42i nærvær eller fravær av serum i 24 timer. Deretter ble cellulær toksisitet målt ved anvendelse av både Alamar blue-analysen (Ahmed et al., J. Immunol. Methods 170:211-24 (1994)), som viser metabolsk aktivitet, og "Live/Dead"-analysen (Pike et al., J. Biol. Chem. 270:23895-98 (1995)), som viser både intracellulær este ra sea kti vitet og plasmamembranintegritet.

Abeta toksisitetsanalyse

PC-12-celler ble utsådd med 500 celler pr. brønn i en 96-brønners plate og suspendert i 30 ng/ml NGF (Alamone Labs, Israel) fortynnet med N2/DMEM (Gibco/BRL, Rockville, MD). Cellene fikk differensiere i 5-7 dager til et endelig celletall på 10000-15000 pr. brønn. Abeta ble inkubert i løsning (25 mikromolar) i 3 dager ved RT for induksjon av fibrillogenese før tilsetning til kulturene. Dette Abeta-preparat inneholder et stort antall oppbygde oligomerer (inkludert ADDL og protofibriller (Abeta-molekyltyper som til nå er blitt vist å være nevrotoksiske), bestemt ved elektronmikroskopi (resultater ikke vist). Se Lambert et al., J. Neurochem. 79:595-605; Walsh et al., J. Biol. Chem., 274:25945-52

(1999); Hartley et al., J. Neuroscience 19:8876-8884 (1999). I tillegg viste western blot-analyse at Abeta42-immunisert serum gjenkjente Abeta42-monomerer, -tetramerer, - heksamerer og store oligomerer på mer enn 98 kDa (resultater ikke vist). Etter preinkuberingen i 3 dager ble Abeta tilsatt cellekulturene i en sluttkonsentrasjon på 0,1ug/ml og inkubert i 24 timer ved 37 °C. Deretter ble toksisiteten analysert ved anvendelse av den fluorescensbaserte "Live/Dead"-analyse (Molecular Probes, Eugene, OR) og Alamar Blue-analysen (Biosource, Inc, Camarillo, CA)

Resultater

Serum fra ikke-immuniserte eller IAPP-immuniserte mus hadde ingen virkning på Abeta-toksisitet. I motsetning til dette forhindret serum isolert fra Abeta42-immuniserte mus Abeta42-cytotoksisitet på en konsentrasjonsavhengig måte, men viste en markant variabilitet i omfanget av denne virkningen. I denne analysen var n = 18/22, p<0,01 og n=4/22, p<0,001, sammenlignet med Abeta42-indusert toksisitet. Korrelasjonen mellom celleoverlevelse og omfanget av disaggregering av fibriller ble fremstilt grafisk for enkeltsera og viste en direkte korrelasjon mellom serumets effektivitet når det gjaldt inhibering av toksisitet og disaggregering av fibriller. Videre var antistoffene som var mest effektive når det gjaldt inhibering av fibrilldannelse og disaggregering av fibriller også de mest effektive når det gjaldt reduksjon av toksisiteten (dag 3 p<0,001) og dag 7 p<0,0001, sammenlignet med inaktivt serum).

Støkiometrien mellom antistoff og Abeta som er nødvendig for å forhindre cytotoksisitet kan gi et innsyn i virkningsmekanismen. For å bestemme støkiometrien mellom antistoff og Abeta som var nødvendig for å utløse inhibering av cytotoksisitet bestemte vi EC50for 10 reaktive sera. EC50-verdiene varierte fra 1:100-1:300 med et gjennomsnitt ± SD på 234 ±39, hvor EC50er definert som den serummengde som forhindret 50 % av den Abeta-induserte cytotoksisitet. Resultatet var at vi fant at den beskyttende virkning ble observert ved et lavt forhold mellom antistoff og Abeta på 50:1, noe som antyder at antistoffene bandt seg til Abeta-molekyltyper som forelå i lave konsentrasjoner, for eksempel Abeta-oligomerer, protofibriller eller forløperprotein- fragmenter, snarere enn til monomert Abeta eller Abeta-aggregater. Videre ga aktive sera en signifikant reduksjon av Abeta-cytotoksisiteten ved alle analyserte doser, noe som antyder at celledød ble indusert ved prosesser som spesifikt blokkeres av disse sera. Den statistiske analyse ble utført ved anvendelse av enveis ANOVA med Fischer's PLSD ' p < 0,01 og t p<0,001.

Eksempel 8

Serumbestanddeler som formidler beskyttende virkning

I dette eksempel viser oppfinnerne hvordan man kan bestemme hvilke serumbestanddeler som er ansvarlige for den reduserte cytotoksisitet av Abeta. Oppfinnerne fant at den aktive bestanddel forelå i den rensede IgG-fraksjon fra serum og at ingen annen serumbestanddel kunne inhibere Abeta-formidlet celledød.

For å bekrefte at virkningene av Abeta-immunisering skyltes Abeta-induserte antistoffer snarere enn en annen virkning, f.eks. sekundære endringer i ekspresjonen av andre serumproteiner, og for å bekrefte at kun antistoffer som selektivt var rettet mot Abeta(4-io)-epitopen var effektive, utførte vi cytotoksisitseksperimenter ved anvendelse av rensede IgG-fraksjoner fra Abeta42-immuniserte sera. I tillegg analyserte vi de kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoffene 4G8, 6E10 og Barn 10, som har spesifisitet for spesielle epitoper i Abeta.

Resultatene var entydige. Immunglobulin G renset fra Abeta42-immuniserte sera viste samme inhibering av toksisitet som urenset serum, noe som antyder at andre serumbestanddeler ikke bidro til den beskyttende respons. Videre inhiberte disse IgG-fraksjonene Abeta-fibrillogenese og induserte disaggregering av Abeta-fibriller i samme grad som helserum. Antistoffene 4G8 og 6E10, som gjenkjenner Abeta-sekvensene 17-24 henholdsvis 11-17, inhiberte ikke fibrillogenesen, men reduserte den totale mengde fibrill. Denne siste virkningen kan oppstå ved at disse antistoffene vil bindes til en liten andel av det frie Abeta-peptid i løsning, slik at dette ikke kan delta i fibrilldannelse. I motsetning til dette inhiberer BamlO, som gjenkjenner en sekvens inne i Abetai-io, fibrilldannelsen på tilsvarende måte som vist for Abeta42-immuniserte sera. Disse resultatene viser videre at kun antistoffer som gjenkjenner den N-terminale del av Abeta-sekvensen er effektive inhibitorer av fibrillogenesen og at den aktive bestanddel i Abeta42-immunisert serum er et spesifikt IgG.

Eksempler 9- 27

ANTIGENUTFORMING

Peptidene vist i Tabell 5 og Eksemplene 9-27 er utformet ifølge formelen vist nedenfor:

I. (A)n-- (Th)m--(B)0-- Abeta(4-io) -- (C)p

II. hvor en enkelt kopi av Abeta(4-io) foreligger og n er 0, m er 1, o er 2, B er glysin, C er glysin, p er 1 og T-hjelpercelleepitopen er enhver av SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 og 21. Disse antigenene, som inneholder både B- og T-celleepitopen, tilsvarer SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 og 43.

Eksempel 28

ANTIGENUTFORMING

Peptidet vist i Eksempel 28 (Tabell 5), som tilsvarer SEQ ID NO: 44, er et eksempel hvor n er 0, m er 1, o er 1, B er glysin, C er glysin, p er 1 og hjelper T-celleepitopen er SEQ ID NO: 21. Antigenet, som inneholder både B- og T-celleepitopen, tilsvarer peptidet vist i SEQ ID NO: 44.

Eksempel 29

ANTIGENUTFORMING

Peptidet vist i Eksempel 29 (Tabell 5), som tilsvarer SEQ ID NO: 45, er et eksempel hvor n er 0, m er 1, o er 0 og T-celleepitopen er koblet direkte til B-celleepitopen via en peptidbinding, C er glysin, p er 1 og T-hjelpercelleepitopen er vist i SEQ ID NO: 45.

Eksempel 30

ANTIGENUTFORMING

Peptidet som vises i Eksempel 30 (Tabell 5), som tilsvarer SEQ ID NO: 46, er et eksempel hvor n er 0, m er 1, o er 0 og T-celleepitopen er koblet direkte til B-celleepitopen via en peptidbinding, C er glysin, p er 1 og T-hjelpercelleepitopen er SEQ ID NO: 21. Den kombinerte B og T celleepitopen inneholdende antigen korresponderer til peptidet vist i SEQ ID NO: 46.

Eksempler 31- 33

ANTIGENUTFORMING

Peptidene vist i Eksemplene 31-33 (Tabell 5) er utformet ifølge formel II vist nedenfor:

II. (A)n» Abeta(4-io) -- (B)o~ (Th)m» (C)p

hvor en enkelt kopi av Abeta(4-i0) foreligger og n er 2, m er 1, o er 2, A og B er glysin og p er 0, og T-hjelpercelleepitopen er SEQ ID NO: 21. Disse antigenene, som inneholder både B- og T-celleepitopen, tilsvarer SEQ ID NO: 47, 48 og 49.

Eksempler 34 og 35

ANTIGENUTFORMING

Peptidet vist i Eksempel 34 (Tabell 5) er utformet ifølge formel II vist nedenfor:

II (A)n» Abeta(4-io) -- (B)o~ (Th)m» (C)p

hvor en enkelt kopi av Abeta(4-i0) foreligger og n er 0, m er 1, o er 2 i Eksempel 34 og 1 i Eksempel 35, B er glysin og p er 0, og T-hjelpercelleepitopen er SEQ ID NO: 21. Disse antigenene, som inneholder både B- og T-celleepitopen, tilsvarer SEQ ID NO: 50 og 51.

Eksempel 36

Syntese av utformede peptider

Peptidsyntese i fast fase av de utformede peptider som tilsvarer SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 og et kontrollpeptid, amyloidpolypeptid fra Langerhans øyer (IAPP) (SEQ ID NO: 52) utføres i 100 |amol skala ved anvendelse av manuell syntese i fast fase og et symfoni-peptidsynteseinstrument ved anvendelse av Fmoc-beskyttet Rink-amid-MBHA-resin, Fmoc-beskyttede aminosyrer, 0-benzotriazol-l-yl-N,N,N', N-tetrametyluronium heksafluorfosfat (HBTU) i N,N-dimetylformamid (DMF)-løsning og aktivering med N-metylmorfolin (NMM), samt piperidinavspalting av Fmoc-grupper (Trinn 1). Etter behov utføres selektiv avspalting av Lys(Aloc)-gruppen manuelt og oppnås ved å behandle resinet med en løsning av 3 ekv. Pd(PPh3)4løst i 5 ml CHCI3:NMM:HOAc (18:1:0,5) i 2 timer (Trinn 2). Resinet vaskes så med CHCI3(6X5 ml), 20 % HOAc i diklormetan (DCM) (6x5 ml), DMC (6x5 ml), og DMF (6x5 ml). I noen tilfeller gjentas syntesen for addering av én AEEA (aminoetoksy-etoksyeddiksyre)-gruppe, addering av eddiksyre eller addering av en 3-maleimidopropion-syre (MPA) (Trinn 3). Kløyving fra resinet og isolering av produkt utføres ved anvendelse av 85 % TFA/5 % TIS/5 % tioanisol og 5 % fenol, fulgt av utfelling med Et20 avkjølt i tørris (Trinn 4). Produktene renses ved preparativ revers fase-HPLC ved anvendelse av et Varian (Rainin) preparativt, binært HPLC-system, gradienteluering med 30-55 % B (0,045 % TFA i H20 (A) og 0,045 % TFA i CH3CN (B)) over et tidsrom på 180 minutter ved 9,5 ml/minutt ved anvendelse av en Fenomenex Luna 10 n fenyl-heksyl-kolonne på 21 mm x 25 cm og UV-detektor (Varian Dynamax UVD II) ved 214 og 254 nm. Renhet og massebekreftelse bestemmes til 95 % ved RP-HPLC-massespektrometri ved anvendelse av et Hewlett Packard LCMS-1100-serie spektrometer utstyrt med diodematrisedetektor og ved anvendelse av elektrospray-ionisering.

Eksempel 37

Immunisering av CRND8- mus med peptidantigener utformet ifølge formlene I og II

TgCRND8-mus som beskrevet i Eksempel 2 avvennes og genotypes for forekomst av beta-APP-transgenet, og oppstalles i grupper på 2-4 mus av samme kjønn i standard musebur. Musene gis forpelleter, pulverisert for og vann ad libitum. Alle mus håndteres i én uke før første immunisering, og vekten måles dagen før og to dager etter hver immunisering. Alle de eksperimentelle grupper er tilpasset hverandre når det gjelder kjønn og vekt.

Immuniseringsfremgangsmåte og isolering av serum

Syntetiske peptider tilsvarende SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 og et kontrollpeptid, amyloidpolypeptid fra Langerhans øyer (IAPP) (SEQ ID NO: 52) anvendes for immunisering av transgene CRND8-mus. Immuniseringsfremgangsmåten og immuniseringsskjemaet er som beskrevet tidligere i Schenk et al. Nature 400:173-177 (1999).. Alle peptider oppløses fra frysetørket pulver kort tid før hvert sett med injeksjoner. For immuniseringene tilsettes 2 mg av hvert peptid til en separat beholder inneholdende 0,9 ml avionisert vann, og blandingene vorteks-behandles for sammenblanding. Deretter tilsettes 100 jllI 10X fosfatbufret saltvann (PBS) (hvor IX PBS er 0,15 M NaCI, 0,01 M natriumfosfat ved pH 7,5) til hver peptidløsning. Løsningene vorteksbehandles igjen og inkuberes over natten ved 37 °C. Peptidene emulgeres i et forhold på 1:1 (vol/vol) med komplett Freunds adjuvans for første immunisering og med Freunds ukomplette adjuvans for påfølgende forsterker-injeksjoner. Den første forsterkerinjeksjon gis to uker etter den innledende immunisering og hver måned etter dette. Hvert dyr immuniseres med tilnærmet 100 ug antigen pr. injeksjon. Hver immuniseringsgruppe inneholder fra 6 til 10 mus. Deretter bestemmes antistofftiteret i serumprøver (200 jllI blod) oppsamlet ved punksjon av bakbensvenen ved en alder på 13 uker og ved hjertepunksjon ved immuniseringens avslutning, ved en alder på 25 uker. Før anvendelse i disse undersøkelsene inaktiveres komplement ved inkubering ved 56 °C i 30 minutter. Ig-fraksjoner isoleres over en 5 ml protein G-kolonne. Prøvene påsettes, vaskes med PBS, elueres med 0,1 M natriumsitrat og bufres med 1 M tris. Alle Ig-fraksjoner filtersteriliseres før bruk.

Immuniseringsresulta ter

Serum isoleres fra mus immunisert med syntetiske peptider tilsvarende

SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 og et kontrollpeptid, amyloidpolypeptid fra Langerhans øyer (IAPP)

(SEQ ID NO: 52), og fra ikke-immuniserte TgCRND8-mus og deres ikke-transgene kullsøsken.

De fleste mus utvikler signifikante titere mot Abeta42, immunogenet, eller mot IAPP. Det er av interesse at ingen signifikante forskjeller observeres i anti-Abeta42-titeret hos TgCRND8-transgene mus og deres ikke-transgene kullsøsken. Serum fra immuniserte mus anvendes for positiv farging av modne Abeta-plakk i histologiske snitt fra hjerne fra 20 uker gamle ikke-immuniserte TgCRND8-mus. I motsetning til dette er serum fra kontrollpeptid IAPP-immuniserte og ikke-immuniserte mus ikke i stand til å farge modne Abeta-plakk i histologiske snitt fra hjerne fra 20 uker gamle ikke-immuniserte TgCRND8-mus. Resultatene viser følgelig at antistoff-autoimmunitet som kan gjenkjenne og bindes til nevropatologiske plakk som inneholder Abeta kan induseres.

Eksempel 38

Inhibering av fibrilldannelse med immunserum fra mus

Som diskutert i Eksempel 3 vil Abeta-peptider spontant oppbygges til fibriller over en inkuberingstid på 14 dager, og fibrillene har en karakteristisk diameter på 50-70 Å som kan måles ved elektronmikroskopi som beskrevet nedenfor.

Elektronmikroskopi

Abeta42anvendes direkte etter at det er løst i vann til en lagerkonsentrasjon på 10 mg/ml eller etter oppbygging til modne amyloidfibriller. Abeta42inkuberes i nærvær eller fravær av serum fra mus immunisert med peptidantigener som tilsvarer SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 og et kontrollpeptid, amyloidpolypeptid fra Langerhans øyer (IAPP) ved en endelig peptid konsentrasjon på 100ug/ml. Serielt fortynnet serum tilsettes til Abeta42og inkuberes ved romtemperatur (RT) i opp til 2 uker. For elektronmikroskopi med negativ farging får karbonbelagte pioloform-nett flyte på vandige løsninger av peptider. Etter fjerning av overskudd av væske og lufttørking av nettene farges prøvene med 1 %

(vekt/vol) fosfowolframsyre. Peptidaggregatene observeres i et Hitachi 7000 elektronmikroskop som får arbeide ved 75V ved en forstørrelse på 60000 X.

Elektronmikroskopi- resultater

For å anslå virkningen av serum fra immuniserte mus på oppbyggingen av Abeta til fibriller inkuberes serum som beskrevet ovenfor i nærvær eller fravær av Abeta42ved 37 °C i opp til 14 dager. Uttak fra hver reaksjonsblanding undersøkes på dag 1, 3, 7, 10 og

14 for forekomst av Abeta42-fibriller ved elektronmikroskopi og negativ farging.

I fravær av serum eller i nærvær av serum fra ikke-immuniserte dyr dannet Abeta42lange fibriller (~7500Å) med en karakteristisk diameter på 50-70Å. I nærvær av serum fra IAPP-immuniserte dyr dannes færre lange Abeta42-fibriller, men fibrillene som ble dannet hadde den karakteristiske diameter på 50-70 Å. I motsetning til dette blokkerte de fleste sera fra mus immunisert med peptidantigener tilsvarende SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50 og 51, som inneholder B-celleepitopen Abeta(4-i0), i stor grad fibrilldannelsen, selv om noen sera viste liten eller ingen virkning.

I tillegg kan ingen forskjeller i strukturen av fibrillene påvises dersom fibrillene inkuberes i nærvær av ikke-immunisert museserum. Serum fra mus som er immuniserte med IAPP reduserer omfanget av fibrilldannelse, men fibrillene som dannes ligner fibrillene som dannes av Abeta42alene. Endelig inhiberte serum fra mus som er immunisert med peptidantigenene som tilsvarer SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50 og 51 fibrillogenesen i varierende grad.

Sekvensinformasjon

Claims (9)

1. Peptid, karakterisert vedat det har formelen (A)n-- (Th)m-- (B)o-- Abeta(4-io) -- (C)p hvor A, B og C alle er en aminosyrerest eller en sekvens av aminosyrerester, hvor n, o og p uavhengig av hverandre er heltall i området fra 0 til tilnærmet 20, hvor Th uavhengig av de andre er en sekvens av aminosyrerester som omfatter en T-hjelpercelleepitop, hvor dersom o er lik 0 er Th direkte bundet til B-celleepitopen via en peptidbinding uten spacer aminosyrerester, hvor m er et heltall fra 1 til tilnærmet 5, og Abeta(4-io) er (SEQ ID NO: 1), hvor peptidet er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 og SEQ ID NO: 46.

2. Peptid preparat, karakterisert vedat det omfatter en blanding av to eller flere peptider representert ved formelen (A)n-- (Th)m- (B)o-- Abeta(4-io) -- (C)p hvor A, B og C alle er en aminosyrerest eller en sekvens av aminosyrerester, hvor n, o og p uavhengig av hverandre er heltall i området fra 0 til tilnærmet 20, hver Th uavhengig av de andre er en sekvens av aminosyrerester som omfatter en T-hjelpercelleepitop eller en immunforsterkende analog eller et segment derav, hvor dersom o er lik 0 er Th direkte bundet til B-celleepitopen via en peptidbinding uten spacer aminosyrerester, hvor m er et heltall fra 1 til tilnærmet 5, og Abeta(4-io) er (SEQ ID NO:l) hvor ett av peptidene er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:

30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 og SEQ ID NO: 46.

3. Immunogent preparat for å indusere dannelse av antistoffer som spesifikt bindes til et amyloid-beta-peptid (SEQ ID NO: 2) karakterisert vedat det omfatter: (a) et antigen som omfatter en T-celleepitop som sørger for en effektiv mengde av T-cellehjelp og en B-celleepitop som består av peptid Abeta(4-i0) (SEQ ID NO: 1), hvor antigenet er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:

27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 og SEQ ID NO: 46, og (b) en adjuvans.

4. Preparat ifølge krav 3, hvor adjuvansen omfatter én eller flere forbindelser utvalgt fra gruppen som består av aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat, saponin, Quill A, Quill A/ISCOMs, dimetyldioktadecylammoniumbromid/arvidin, polyanioner, Freunds komplette adjuvans, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-isoglutamin, Freunds ukomplette adjuvans og liposomer.

5. Anvendelse av et immunogent preparat i følge ethvert av kravene 3-4 til fremstilling av et medikament for behandling av et individ som lider av Alzheimers sykdom.

6. Anvendelse av et immunogent preparat i følge ethvert av kravene 3-4 til fremstilling av et medikament for å redusere mengden av amyloide avleiringer i hjernen hos et individ som lider av Alzheimers sykdom.

7. Anvendelse av et immunogent preparat i følge ethvert av kravene 3-4 til fremstilling av et medikament for disaggregering av de amyloide fibriller i hjernen hos et individ som lider av Alzheimers sykdom.

8. Fremgangsmåte for bestemmelse av hvorvidt en forbindelse er en inhibitor av amyloide avleiringer og fibrilldannelse, karakterisert vedat den omfatter: (i) kontakte forbindelse med peptidet Abeta(4.i0) (SEQ ID NO: 1), og (ii) påvise binding av forbindelsen til peptidet.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor den videre omfatter evaluering av hvorvidt forbindelsen inhiberer dannelse av amyloide fibriller in vitro.