MX2010013648A - Compuestos para tratar enfermedades. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona al uso de mimotopos en el tratamiento de enfermedades asociadas con la formación y/o agregación de ß-amiloide (ß-amiloidosis) que incluye la enfermedad de Alzheimer, donde los mimotopos son capaces de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos a Abetal-40/42 AßpE3-40/42, Aß3-40/42 y Aß11-40/42 y AßpE11-40/42.

Description

COMPUESTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al uso de mimotopos para la prevención, tratamiento y diagnosis de enfermedades asociadas con la formación y/o agregación de beta-amiloides (beta-amiloidosis) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varias enfermedades degenerativas se caracterizan por la polimerización aberrante y acumulación de proteínas específicas. Estas así llamadas proteopatías las cuales incluyen trastornos neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington así como también trastornos diversos sistemáticos los cuales incluyen las amiloidosis. La presente invención se relaciona a la prevención, tratamiento y diagnosis de proteopatías asociadas con proteínas beta-amiloides resumidas bajo el término beta-amiloidosis. La forma más prominente de las beta-amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en inglés) . Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a demencia con cuerpos de Lewy y demencia en síndrome de Down .

La AD está caracterizada por la acumulación anormal de placas amiloides extracelulares - cercanamente asociado con astrocitosis extensiva y microgliosis así como también Ref.:216368 neuronas distróficas y pérdida neuronal . Estas placas amiloides principalmente consisten de los péptidos ?ß40 y ?ß42 amiloide-beta (?ß; derivados de la proteína precursora amiloide (APP por sus siglas en inglés) , la cual es expresada en varios tipos celulares en el sistema nervioso. Los péptidos ?ß son considerados para estar implicados directamente en la patogénesis y progresión de AD.

La APP es normalmente procesada por dos etapas de escisión para formar las formas actualmente conocidas de Abeta x-40/42/43. La primera escisión es realizada por las así llamadas enzimas 1 y 2 de escisión del sitio beta APP (BACE1 y BACE2 por sus siglas en inglés) ; la segunda etapa proteolítica es realizada por el complejo de gamma-secretasa (resumido en De Strooper et al . J Cell Sci 113 (2000) : 1857-1870) .

Las enzimas BACE reconocen dos sitios en la porción N-terminal del péptido ?ß de presunción: la primera interacción de BACE con APP lleva a un corte en la secuencia DAEFR (pos. 1 en ?ß) y la formación de Abeta 1-X. Alternativamente BACE puede también cortar en la posición 11 futura dentro de ?ß lo cual resulta en el fragmento 11-X. De esta forma el procesamiento de APP mediada por BACE crea una variedad de diferentes especies de ?ß con longitud completa de Abeta 1-40/42 como contribuyente principal.

La actividad de la gamma-secretasa lleva a la producción de 3 fragmentos principales: ?ß 1-40/42/43. Una vez que estos péptidos son producidos son además procesados por amino-peptidasas lo cual resulta en su subsecuente degradación en forma de etapa. Estas etapas adicionales llevan a la formación de otras formas como por ejemplo ?ß3-40/42 respectivamente. En humanos en promedio se forma 60-85% de material de placa amiloide por los derivados ?ß40/42 los cuales son truncados N-terminalmente y modificados frecuentemente. Las cantidades relativas de especies ?ß truncadas N-terminalmente son variables con respecto a los niveles de ?ß, mutaciones y activación BACE.

Las formas truncadas más abundantes de ?ß son: ?ß3-40/42 y ?ß?1-40/42. Ambos péptidos contienen un residuo glutamato N-terminal, el cual es frecuentemente modificado enzimáticamente a piro-glutamato, lo cual resulta en la formación de ?ß3 (pE) -40/42 y ?ß?? (pE) -40/42 , respectivamente. Ya que la amino-terminal de los péptidos Abeta 3 (pE) y 11 (pE) es bloqueada por la lactama interna, es protegida de la acción proteolítica de aminopeptidasas diferentes a las piroglutamato específicas y puede de esta forma permanecer estable en tejidos.

La forma más prominente de amiloide modificado truncado N-terminalmente es formado por el péptido 3 (pE) -40/42, el cual es pensado para constituir hasta 50% de todas las formas truncadas. Esto significa que estas isoformas constituyen 25-40% de todos los péptidos amiloides en cerebros con AD. Otra forma prominente de péptidos ?ß truncados es ?ß?1-40/42: Naslung et al. and Huse et al. puede demostrar que hay un nivel significativo de estas especies truncadas detectables en cerebros humanos de pacientes AD .así como también en pacientes infra clínicos para AD. Adicionalmente estos péptidos sufren de deshidratación intramolecular y formas estable (pe) formas con consecuencias similares como se describe para 3 (pE) -40/42.

Se ha mostrado previamente que los péptidos truncados y modificados son más estables en tejido neural que ?ß de longitud completa. Adicionalmente, las formas truncadas N-terminalmente de ?ß son péptidos ?ß más amiloidogénicos que no modificados, de esta forma incrementando la proporción de formación de placa, y también muestran actividad neurotóxica cuando se aplica a neuronas en cultivo así como también en experimentos in vivo. Las formas truncadas de ?ß pueden ser fácilmente detectadas en agregaciones difusas de ?ß en etapas tempranas de AD y pueden estar implicadas en formación temprana de placas, que actúan como semillas individuales in vivo.

Hay una evidencia apremiante que la ocurrencia de especies ?ß truncadas N-terminalmente está correlacionada con severidad incrementada e inicio temprano de neurodegeneración en enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar así como también en pacientes con síndrome de Down.

Los efectos agregatorios junto con la estabilidad incrementada de estos péptidos los hacen un jugador potencialmente peligroso en el desarrollo de AD. El análisis en pacientes infraclínicos que sufren de AD familiar o síndrome de Down han mostrado inequívocamente que ?ß3 (pE) -42 pueden ser detectados durante las etapas más tempranas de la enfermedad, también así llamado las etapas "de siembra" . En este momento ningún síntoma neurológico o solamente síntomas menores pueden ser detectados aunque las placas están iniciando para acumularse las cuales portan las especies de péptido ?ß3(??)-42. De esta forma, los datos de los pacientes están implicando un enlace entre la formación temprana de especies ?ß truncadas e inicio así como también progresión de la enfermedad.

A la luz de estos descubrimientos parece ser importante disminuir la cantidad de estas especies de péptido en pacientes con AD para modificar la progresión de la enfermedad y reducir la toxicidad y acompañar la declinación cognitiva. Una vacuna AD óptima debe de esta forma producir una respuesta inmunológica la cual es capaz de objetivar las formas más prominentes de péptidos ?ß presentes en el cerebro de pacientes con AD.

En efecto, el tratamiento inmunoterapéutico el cual usa estrategias de inmunización activa y pasiva para objetivar ?ß de longitud completa, lleva a la reducción de las placas ?ß y tiene impacto benéfico en la progresión de la enfermedad en modelos animales de AD. Los experimentos de vacunación pasiva en modelos de ratón de AD claramente muestra, que los anticuerpo específicamente dirigidos contra la N-terminal y C de ?ß40/42 son capaces de reducir la carga amiloide en modelos de ratón transgénicos . En forma importante, estos animales muestran funciones cognitivas mejoradas. Sorpresivamente, Lemere et al. (AM J Pathol 165 (2004) : 283-297) puede reproducir estos resultados en primates no humanos lo cual muestra reducción clara de deposición de placa y patología asociada en respuesta a la vacunación activa con ?ß de longitud completa. Sin embargo, la primera prueba de vacunación clínica lia en pacientes AD usando ?ß42 de longitud completa como antígeno que tiene que ser discontinuado debido a los varios efectos laterales neuroinflamatorios que incluyen infiltración cerebral de células T auto reactivas. Sin embargo, los estudios que investigan los efectos clínicos en pacientes tratados con AN-1792 revela que los pacientes quienes desarrollan una respuesta de anticuerpo contra ?ß42 no sufren de meningoencefalicitis realizada mejor en pruebas cognitivas que pacientes que no responden, indicando que la inmunoterapia puede ser un procedimiento de tratamiento útil en AD.

Más importante, los resultados recientes obtenidos de casos de autopsia que analizan pacientes quienes sufrieron de vacunación A 1792 muestra una claridad de especies de ?ß de longitud completa a partir del cerebro pero una persistencia de formas truncadas N-terminalmente de ?ß (Nicoll, J. A., et al. 2006 J Neuropathol Exp Neurol 65:1040-1048) . Esto acentúa la necesidad de la invención de vacunas novedosas las cuales están objetivando ?ß de longitud completa así como también formas truncadas N-terminalmente y modificadas de esta molécula.

Inducir una respuesta inmunológica contra los péptidos ?ß40/42 en humanos puede interferir con la declinación cognitiva en pacientes AD, pero una vacuna segura contra Alzheimer tiene que ser evitada para la formación de células T auto reactivas. Si en la vacunación se usan péptidos ?ß40/42 nativos o fragmentos de los mismos sufre de riesgo intrínseco de inducir la enfermedad inmunológica en pacientes, ya que la respuesta inmunológica no puede ser exclusivamente objetivada a ?ß.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar compuestos y medicamentos los cuales pueden ser usados para tratar y/o evitar la beta-amiloidosis que incluye la enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos muestran riesgo significativamente reducido o ningún riesgo para inducir las g enfermedades autoinmunológicas cuando se administran a un individuo. De acuerdo a otro objeto de la presente invención el compuesto puede ser capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos en un individuo los cuales son dirigidos a formas truncadas y/o estabilizadas de ?ß, los cuales son los componentes principales de depósitos amiloides.

Por lo tanto la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o (fórmula I) en donde Xi es isoleucina (I) , o valina (V) , X2 es triptófano ( ) , o tirosina (Y) , X3 es treonina (T) , valina (V) , alanina (A) , metionina (M) , glutamina (Q) o glicina (G) , X4 es prolina (P) , alanina (A) ) , tirosina (Y) , serina (S) , cisteina (C) , o glicina (G) , X5 es prolina (P) , leucina (L) , glicina (G) o cisteina (C) , X6 es cisteina (C) , N, m y 0 son, independientemente, 0 ó 1.

El compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (?ß) el cual comprende la secuencia de aminoácidos EFRHDSGY y/o pEFRHDSGY.

Para producir un medicamento para evitar y/o tratar beta-amiloidosis .

Esto resulta sorpresivamente, en que un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula I es capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos los cuales se dirigen a la forma ?ß truncada ?ß (pE) 3-40/42, y ?ß3-40/42. Los anticuerpos formados son capaces de enlazar a los fragmentos ?ß que resultan en la desintegración de las placas ?ß .

La Fórmula I y II y todas las otras moléculas peptídicas descritas en la presente imitan los péptidos ?ß que ocurren en forma natural y variantes ?ß?-40/42, ?ß??3-40/42, ?ß3-40/42, y ?ß?1-40/42, de tal forma que los compuestos los cuales comprenden las secuencias de aminoácidos descritas en la presente son capaces de inducir la formación de anticuerpos respectivos.

La invención presentada en la presente se refiere a antígenos los cuales no contienen secuencias del péptido ?ß nativo e imitan la estructura de neo-epítopos no detectable por mimotopos tales como los descritos en la solicitud WO 2004/062556. La vacuna AD a base de mimotopo por lo tanto induce las respuestas de anticuerpo que reaccionan exclusivamente con las moléculas ?ß patológicas mencionadas en la presente pero no con estructurales parentales como APP. Adicionalmente , los mimotopos no contienen autoepítopos de células T potenciales y evita la inducción de células T auto reactivas experimentales.

La "beta-amiloidosis" como se usa en la presente, se refiere a varias enfermedades degenerativas las cuales se caracterizan por la polimerización aberrante y acumulación de proteínas específicas así llamadas proteopatías . La presente invención se relaciona a la prevención, tratamiento y diagnosis de proteopatías asociadas con proteínas beta-amiloides resumidas bajo el término beta-amiloidosis. La forma más prominente de beta-amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (AD) . Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a demencia con cuerpos de Lewy y demencia en síndrome de Down.

Ejemplos adicionales son demencia de cuerpo de Lewi, miositis, miositis de cuerpos de inclusión esporádica, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch) , angiopatía amiloide cerebral, angitis relacionada a ?ß .

De acuerdo a una modalidad particularmente preferida de la presente invención "beta-amiloidosis" es la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención la secuencia de aminoácidos es IRWDTP(C) (C) , VR DVYP (C) , IRYDAPL (C) , IRYDMAG (C) , IRWDISL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) Y IRWDGG(C) Los compuestos preferidos particularmente de la presente invención comprenden o consisten en las secuencias de aminoácidos identificadas, en las cuales, el C-terminal del péptido puede o no comprender un residuo de cisteína (indicado por el uso de paréntesis) de tal manera que el compuesto obtenido puede acoplarse, por ejemplo, a una molécula portadora. Sin embargo, también es posible ligar el N-terminal del péptido con un residuo de cisteína.

De conformidad con una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia de aminoácido es IRWDTP(C), VR DVYP(C), IRYDAPL (C) o IRYDMAG (C) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos EXxWHXzXa (X4)n(X5)m (Fórmula II), En donde Xi es valina (V) , arginina (R) o leucina (L) , X2 es arginina (R) , o ácido glutámico (E) , X3 es alanina (A) , histidina (H) , lisina (K) , leucina (L) , tirosina (Y) , o glicina (G) , X4 es prolina (P) , histidina (H) , fenilalanina (F) , glutamina (Q) o cisteína (C) X5 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1.

El compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (Abeta) el cual comprende la secuencia de aminoácidos EVHHQKL.

Para producir un medicamento para evitar y/o tratar la beta-amiloidosis .

La administración de un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula II provoca una respuesta inmunológica contra la forma truncadas ?ß de ?ß??-40/42.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo el cual consiste de EV HRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EWHRLQ (C) , ELWHRYP (C) , ELWHRAF (C) , ELWHRA (C) , EV HRG (C) , EVWHRH (C) , Y ERWHEK (C) , preferentemente EVWHRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EVWHRLQ (C) , ELWHRYP (C) y ELWHRAF (C) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de por lo menos un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , NELRHST (C) , GEMRHQP (C) , DTYFPRS (C) , VELRHSR (C) , YSMRHDA (C) , AANYFPR (C) , SPNQFRH (C) , SSSFFPR (C) , EDWFFWH (C) , SAGSFRH (C) , QVMRHHA (C) , SEFSHSS (C) , QPNLFYH (C) , ELFKHHL (C) , TLHEFRH (C) , ATFRHSP (C) , APMYFPH (C) , TYFSHSL (C) , HEPLFSH (C) , SLMRHSS (C) , EFLRHTL (C) , ATPLFRH (C) , QELKRYY (C) , THTDFRH (C) , LHIPFRH (C) , NELFKHF (C) , SQYFPRP (C) , DEHPFRH (C) , MLPFRHG (C) , SAMRHSL (C) , TPLMFWH (C) , LQFKHST (C) , ATFRHST (C) , TGLMFKH (C) , AEFSHWH (C) , QSEFKHW (C) , AEFMHSV (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , IGFRHDS (C) , SNSEFRR (C) , SELRHST (C) , THMEFRR (C) , EELRHSV (C) , QLFKHSP (C) , YEFRHAQ (C) , SNFRHSV (C) , APIQFRH (C) , AYFPHTS (C) , NSSELRH (C) , TEFRHKA (C) , TSTE H (C) , SQSYFKH (C) , (C)SEFKH, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) para producir un medicamento para evitar y/o tratar la beta-amiloidosis .

Cada uno de estos compuestos es capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos ?ß?-40/42, ?ß??3-40/42, y ?ß3-40/42. Por lo tanto estos compuestos son particularmente bien adecuados para tratar y/o evitar la beta-amiloidosis, como AD, ya que la administración de un compuesto resulta en la formación de anticuerpos los cuales son capaces de reconocer las tres formas ?ß principales ?ß?-40/42, ?ß??3-40/42, y ?ß3-40/42.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto comprende o consiste de un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , SPNQFRH (C) , TLHEFRH (C) , THTDFRH (C) , DEHPFRH (C) , QSEFKHW (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , ELRHSV (C) , TEFRHKA (C) , (C) SEFKH, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) preferentemente SEFKHG (C) , TSVFRH (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , ILFRHG (C) , SPNQFRH (C) , ELFKHHL (C) , TLHEFRH (C) , THTDFRH (C) , DEHPFRH (C) , QSEFKH (C) , ADHDFRH (C) , YEFRHAQ (C) , TEFRHKA (C) .

Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente son consideradas para ser mimotopos de los epítopos de ?ß los cuales comprenden las secuencias de aminoácidos EFRHDSGY, pEFRHDSGY o EVHHQKL . De acuerdo a la presente invención el término "mimotopo" se refiere a una molécula la cual tiene una conformación que tiene una topología equivalente al epítopo del cual es un imitador. El mimotopo enlaza a la misma región de enlace de antígeno de un anticuerpo el cual enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno deseado. El mimotopo producirá una respuesta inmunológica en un hospedero que es reactivo al antígeno para el cual es un imitador. El mimotopo puede también actuar como un competidor para el epítopo del cual es un imitador en ensayos de inhibición in vitro (por ejemplo ensayos de inhibición de ELISA) los cuales implican el epítopo y un anticuerpo que enlaza al epítopo. Sin embargo, un mimotopo de la presente invención no puede necesariamente evitar o competir con el enlace del epítopo del cual es un imitador en un ensayo de inhibición in vitro aunque es capaz de inducir una respuesta inmunológica específica cuando se administra a un mamífero.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a una región inmunogénica de un antígeno el cual es reconocido por una molécula anticuerpo particular. En general, un antígeno poseerá uno o más epítopos, cada uno i capaz de enlazar a un anticuerpo que reconoce el epítopo particular .

Los mimotopos de la presente invención pueden ser producidos sintéticamente por métodos de síntesis químicos los cuales son bien conocidos en la técnica, ya sea como un péptido aislado o como parte de otro péptido o polipéptido. Alternativamente, el mimotopo de péptido puede ser producido en un microorganismo el cual produce el mimotopo de péptido el cual es entonces aislado y si se desea, además purificado. El mimotopo péptido puede ser producido en microorganismos como bacterias, levaduras u hongos, en células eucariotas como una célula de mamífero o un insecto, o en un vector de virus recombinante como los adenovirus, viruela, virus herpes, virus de Simlikii fores, baculovirus, bacteriófago, virus sindbis o virus sendai . Las bacterias adecuadas para producir el mimotopo de péptido incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra bacteria que es capaz de expresar péptido como el mimotopo de péptido. Los tipos de levadura adecuados para expresar el mimotopo de péptido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar los péptidos. Los métodos correspondientes son bien conocidos en la técnica. También los métodos para aislar y purificar péptidos producidos recombinantemente son bien conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo como filtración de gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, etc.

Para facilitar el aislamiento del mimotopo de péptido, un polipéptido de fusión puede ser hecho en donde el mimotopo de péptido es fusionado translacionalmente (enlazado covalentemente) a un polipéptido heterologo el cual permite el aislamiento por cromatografía de afinidad. Los polipéptidos heterólogos típicos son His-Tag (por ejemplo His6; 6 residuos de histidina) , GST-Tag (glutationa-S-transferasa) etc. El polipéptido de fusión facilita no solamente la purificación de los mimotopos sino puede también evitar que el polipéptido de mimotopo sea degradado durante la purificación. Si se desea remover el polipéptido heterologo después de la purificación el polipéptido de fusión puede comprender un sitio de escisión en la unión entre el mimotopo de péptido y el polipéptido heterologo. El sitio de escisión consiste de una secuencia de aminoácidos que se escinde con una enzima específica para la secuencia de aminoácidos en el sitio (por ejemplo proteasas) .

Los mimotopos de la presente invención pueden también ser modificados en o cerca de su N y/o C-terminal de tal forma que en las posiciones se enlaza un residuo de cisteína al mismo. En una modalidad preferida los residuos de cisteína colocados terminalmente (ubicados en la N- y C-terminal del péptido) son usados para ciclizar los péptidos a través del enlace disulfuro. El residuo de cisteína puede también servir para enlazar al péptido/compuesto una molécula adicional (por ejemplo, un portador) .

Los mimotopos de la presente invención pueden también ser usados en varios ensayos y kits, en particular en ensayos inmunológicos y kits. Por lo tanto, es particularmente preferido que el mimotopo pueda ser parte de otro péptido o polipéptido, particularmente una enzima la cual es usada como un reportador en ensayos inmunológicos. Las enzimas reportadoras incluyen por ejemplo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano.

Los mimotopos de acuerdo a la presente invención preferentemente son polipéptidos antigénicos los cuales en su secuencia de aminoácidos varían de la secuencia de aminoácidos de ?ß o de fragmentos de ?ß . En este aspecto, los mimotopos inventivos pueden no solamente comprender substituciones de aminoácidos de uno o más residuos de aminoácidos que ocurren en forma natural sino también de uno o más de los aminoácidos no naturales (es decir no de 20 aminoácidos "clásicos") o pueden ser completamente ensamblados de los aminoácidos no naturales. Por otra parte, los antígenos inventivos los cuales inducen los anticuerpos dirigidos y enlace a ?ß?-40/42, ?ß??3-40/42, ?ß3-40/42, ?ß??-40/42, pueden ser ensamblados de D- o L-aminoácidos o de combinaciones de DL-aminoácidos y, opcionalmente , pueden haber sido cambiados por modificaciones adicionales, cierres de anillo o derivatizaciones . Los antígenos que inducen antígenos adecuados pueden ser proporcionados de bibliotecas de péptido comercialmente disponibles. Preferentemente, estos péptidos son por lo menos 7 aminoácidos, y longitudes preferidas puede ser hasta 16, preferentemente hasta 14 ó 20 aminoácidos (por ejemplo 5 a 16 de residuos de aminoácidos) . De acuerdo a la invención, sin embargo, también péptidos más largos pueden ser empleados muy bien como antígenos que inducen anticuerpo. Adicionalmente los mimotopos de la presente invención pueden también ser parte de un polipéptido y consecuentemente que comprenden en su N- y/o C-terminal por lo menos un residuo de aminoácido adicional.

Para preparar los mimotopos de la presente invención (es decir los antígenos que inducen anticuerpos descritos en la presente) , por supuesto también las bibliotecas de fagos, bibliotecas de péptido son adecuadas, por ejemplo producidas por medio de química combinatorial u obtenida por medio de técnicas de tamizado de alto rendimiento para las estructuras más variadas (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al., Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec . ; 50(6): 837-54).

Adicionalmente, de acuerdo a la invención también antígenos inductores de anticuerpos anti-APl-40/42 , ?ß??3-40/42, -?ß3-40/42, y -?ß?1-40/42- en base a ácidos nucleicos ( "aptámeros" ) pueden ser empleados, y estos, también, pueden ser encontrados con las bibliotecas más variadas (oligonucleótido) (por ejemplo con 2-180 residuos de ácidos nucleicos (por ejemplo Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc . Chem. Res. 33(2000), 591-599 ; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc) . En antígenos inductores de anticuerpos en base a los ácidos nucleicos, la estructura principal de ácido nucleico puede ser proporcionada por ejemplo por los compuestos fosforo-diéster naturales, o también por fosforotioatos o combinaciones o variaciones químicas (por ejemplo como PNA) , en donde como bases, de acuerdo a la invención principalmente U, T, A, C, G, H y mC pueden ser empleados. Los residuos 2' de los nucleótidos los cuales pueden ser usados de acuerdo a la presente invención preferentemente son H, OH, F, 'el, NH2, 0-metilo, 0-etilo, O-propilo, o O-butilo, en donde los ácidos nucleicos pueden también ser modificados en forma diferente, es decir por ejemplo con grupos protectores, ya que son comúnmente empleados en la síntesis de oligonucleótidos . De esta forma, los antígenos inductores de anticuerpo a base de aptámeros son también antígenos inductores de anticuerpos preferidos dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención el compuesto es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (hemocianina modificada de lapa), toxoide de tétanos, proteína de enlace de albúmina, albúmina sérica bovina, un dendrímero (MAP; Biol .. Chem. 358: 581), enlazadores de péptido (o regiones de flanqueo) así como también las substancias adyuvantes descritas en Singh et al., Nat . Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (en particular aquellas en la Tabla 1 de ese documento) , y O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (en particular los compuestos de inmunopotenciación endógenos y sistemas de suministro descritos en la misma) , o mezclas de los mismos. El químico de conjugación (por ejemplo, por medio de compuestos heterobifuncionales como GMBS y por supuesto también otros descritos en "Bioconjugate Techniques" , Greg T. Hermanson) en este contexto puede ser seleccionado de reacciones conocidas para el hombre experto en la técnica. Por otra parte, la composición de vacuna puede ser formulada con un adyuvante, preferentemente una composición de aluminio soluble bajo, en particular hidróxido de aluminio. Por supuesto, también los adyuvantes como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citosinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF) , saponinas (por ejemplo, QS21) , derivados MDP, oligosacáridos CpG, LPS, MPL, polifosfacenos , emulsiones (por ejemplo de Freund, SAF) , liposomas, virosomas, iscoms, cocleatos, micropartículas de PGL, partículas de poloxámero, partículas similares a virus, enterotoxina termolábil (LT por sus siglas en inglés) , toxina de cólera (CT por sus siglas en inglés) , toxinas mutantes (por ejemplo LTK63 y LTR72) , micropartículas y/o liposomas polimerizadas pueden ser usadas.

El compuesto de la presente invención es enlazado preferentemente al portador o adyuvante por medio de un enlazador, el cual es seleccionado del grupo el cual consiste de NHS-poli (óxido de etileno) (PEO) (por ejemplo NHS-PE04-maleimida) .

Una vacuna la cual comprende el compuesto presente (mimotopo) y el portador aceptable farmacéuticamente puede ser administrado por cualquier modo adecuado de aplicación, por ejemplo, i.d., i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subcutáneamente, etc y en cualquier dispositivo de suministro adecuado (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). El compuesto de la presente invención es formulado preferentemente para administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular (ver, por ejemplo "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations" , Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc. 2004).

El medicamento (vacuna) de acuerdo a la presente invención contiene el compuesto de acuerdo a la invención en una cantidad de 0.1 ng a 10 mg( preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 g o, alternativamente, por ejemplo 100 fmol a 10 µ???? , preferentemente 10 pmol a ?µp??? , en particular 100 pmol a 100 nmol . Típicamente, la acuna puede también contener substancias auxiliares, por ejemplo amortiguadores, estabilizantes, etc.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de un compuesto como se define anteriormente para tratar y/o mejorar los síntomas de sinucleopatía.

Es un resultado sorprendente que los compuestos de la presente invención puede también ser usado para tratar y mejorar los síntomas asociados con las sinucleopatías .

Las amiloidosis y sinucleopatías están asociadas con la acumulación cerebral de beta-amiloide y alfa-sinucleina, respectivamente. Algunos pacientes muestran características clínicas y patológicas de ambas enfermedades, incrementando la posibilidad de trayectorias patogénicas de traslape. Estos pacientes están también clasificados como que sufren de un síndrome recientemente identificado descrito como demencia con cuerpos de Lewy o enfermedad de Parkinson con demencia (DLB/PDD) . En un modelo animal transgénico reciente para DLB/PDD se ha mostrado que la sobre expresión de tanto sinucleina y proteína precursora amiloide (ap. Por sus siglas en inglés) , en ratones que lleva al desarrollo de alteraciones cognitivas y motoras acompañadas por la pérdida de neuronas colinérgicas y reducción en vesículas sinápticas, formación de placas amiloides extensivas, e inclusiones fibrilares intraneuronales inmunoreactivas haSYN. Todas estas características son también encontradas en el síndrome DLB/PDD. Se ha descrito recientemente que tanto las moléculas son potencialmente capaces de interactuar y para formar oligómeros híbridos in vitro. Se ha mostrado también la sobre expresión de APP puede exacerbar algunos de los efectos patológicos de sobre expresión de alfa-sinucleina . En contraste, la alfa-sinucleina es capaz de incrementar la secreción y toxicidad de beta péptidos amiloides y puede también de esta forma incrementar los efectos de beta-amiloide que soportan la noción de trayectorias patogénicas de traslape en procesos neurodegeratiyos.

En ambas proteopatías la acumulación progresiva de oligómeros de péptidos ha sido identificada como uno de los eventos tóxicos centrales que llevan a las varias alteraciones típicas para ya sea sinucleopatías o amiloidosis. A pesar de esta similitud mecánica, se tiene la hipótesis que alfa-sinucleina y ?ß tienen efectos patogénicos distintos, así como también convergentes en la integridad y función del cerebro. Las sinucleinas son creídas para afectar la función motora más severamente que la función cognitiva, mientras que los péptidos ß amiloides son descritos para tener efectos opuestos. La razón para esta discrepancia es actualmente desconocida pero incluye una descripción clara de las interdependencias y efectos de ambas moléculas .

El procedimiento de tratamiento presentado en la invención presente está describiendo una inmunoterapia que objetiva ?ß lo cual lleva a la remoción de amiloide principalmente extracelula . Es de esta forma creído para liberar las alteraciones asociadas a amiloides en el intervalo de deposición de placa a muerte neuronal así como también a problemas de memoria y declinación cognitiva. La localización subcelular de sinucleinas sin embargo indica que estas proteínas intracelular son principalmente activas en la sinapsis, especialmente confinado a vesículas sinapticas. En forma interesante, también las acumulaciones de sinucleina, las cuales son el sello patológico unificante de sinucleopatías , son principalmente detectables intracelularmente . Adicionalmente , el mecanismo patogénico que subyace a las sinucleopatías es creído para ser atribuible a cambios intraneuronales en el intervalo de disfunción mitocondrial , acumulación de proteínas anormalmente duplicada, ubiquitinado o fosforilada así como la acumulación de alfa sinucleina. Estas alteraciones son consecuentemente resultantes en cambios en funciones sinápticas, falla sináptica, y pérdida de neuronas dopaminérgicas y signos clínicos clásicos de sinucleopatías . En contraste ?ß es principalmente detectable extraneuronalmente y placas amiloides así como también fibrilas, protofibrilas y oligómeros de beta amiloide pueden ejercer funciones neurotóxicas cuando se aplican extracelularmente o intracerebralmente . De esta forma es sorprendente encontrar para un experto que un procedimiento principalmente que objetiva amiloide extracelular puede reducir los síntomas de sinucleopatías como PD, las cuales están afectando principalmente procesos intracelulares que llevan a los síntomas típicos descritos posteriormente. Es incluso más sorprendente ya que es actualmente creído que los efectos de traslape de ambas moléculas son provocadas por interacciones directas de las dos proteínas lo cual puede principalmente ocurrir intracelularmente . De acuerdo a la presente invención el término "sinucleinopatía" incluye todos los trastornos neurodegenerativos caracterizados por agregaciones de sinucleina patológica. Varios trastornos neurodegenerativos que incluyen la enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en inglés) , enfermedad de cuerpos de Lewi (LBD por sus siglas en inglés) , enfermedad de cuerpo de Lewy difuso (DLBD por sus siglas en inglés) , demencia con cuerpos de Lewy (DLB por sus siglas en inglés) , parkinsonismo con demencia (PDD por sus siglas en inglés) , atrofia sistemática múltiple (MSA por sus siglas en inglés) y neurodegeneracion con acumulación de hierro cerebral tipo I (NBIA tipo I por sus siglas en inglés) son agrupados colectivamente como sinucleinopatías .

Los "síntomas de sinucleopatía" como se usa en la presente, se refiere a aquellos síntomas de las sinucleopatí'as , en particular la enfermedad de Parkinson, lo cual afecta el comportamiento motor y no motor de un paciente el cual sufre de la enfermedad. "Síntomas motores" incluyen tremor de descanso, Bradiquinesia, rigidez, inestabilidad postural, postura detenida, distonia, fatiga, dexteridad motora fina dañada y coordinación motora, coordinación motora gruesa dañada, insuficiencia de movimiento (movimiento del brazo disminuido) , acatisia, problemas de velocidad, como la suavidad de voz o palabras arrastradas provocado por la carencia de control muscular, pérdida de la expresión facial, o "enmascarado", micrografía, hinchamiento dificultosa, disfunción sexual, babeado, etc. Síntomas "no motores" incluyen dolor, demencia o confusión, perturbaciones del sueño, constipación, problemas de la piel, depresión, miedo o ansiedad, dificultades de la memoria y pensado lento, problemas urinarios, fatiga y dolor, pérdida de energía, comportamiento compulsivo, calambre, etc.

De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención la sinucleopatía es seleccionada del grupo de enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia sistemática múltiple y neurodegeneracion con acumulación de hierro cerebral. Particularmente preferido es la enfermedad de Parkinson.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un péptido el cual tiene o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de IRWDTP(C) (C) , VR DVYP (C) , IRYDAPL (C) , IRYDMAG (C) , IRWDTSL (C) , IR DQP (C) , IRWDG (C) , IRWDGG (C) , EVWHRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EVWHRLQ (C) , ELWHRYP (C) , EL HRAF (C) , ELWHRA (C) , EVWHRG (C) , EVWHRH (C) , ERWHEK (C) , QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , NELRHST (C) , GEMRHQP (C) , DTYFPRS (C) , VELRHSR (C) , YSMRHDA (C) , AANYFPR (C) , SPNQFRH (C) , SSSFFPR (C) , EDWFFWH (C) , SAGSFRH (C) , QVMRHHA (C) , SEFSHSS (C) , QPNLFYH (C) , ELFKHHL (C) , TLHEFRH (C) , ATFRHSP (C) , APMYFPH (C) , TYFSHSL (C) , HEPLFSH (C) , SL RHSS (C) , EFLRHTL (C) , ATPLFRH (C) , QELKRYY (C) , THTDFRH (C) , LHIPFRH (C) , NELFKHF (C) , SQYFPRP (C) , DEHPFRH (C) , MLPFRHG (C) , SAMRHSL (C) , TPLMFWH (C) , LQFKHST (C) , ATFRHST (C) , TGLMFKH (C) , AEFSH H (C) , QSEFKHW (C) , AEFMHSV (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , IGFRHDS (C) , SNSEFRR (C) , SELRHST (C) , THMEFRR (C) , EELRHSV (C) , QLFKHSP (C) , YEFRHAQ (C) , SNFRHSV (C) , APIQFRH (C) , AYFPHTS (C) , NSSELRH (C) , TEFRHKA (C) , TSTEMWH (C) , SQSYFKH (C) , (C)SEF H, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) .

Como se indica por el uso de los paréntesis los péptidos de la presente invención pueden o no pueden comprender el residuo cisteína en la C- o N- terminal. < Consecuentemente la presente invención comprende también las siguientes secuencias de aminoácidos; IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IR DTSL, IR DQP, IR DG, IRWDGG, EVWHRHQ, ERWHEKH, EV HRLQ, EL HRYP, EL HRAF, ELWHRA, EVWHRG, EVWHRH, ERWHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NWFPHP, EEFKYS , NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS , VELRHSR, YSMRHDA, AA YFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, ED FFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRH, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS , EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFWH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS , SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS , NSSELRH, TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C) SEFKH, SEFKH HEFRH y HEFRH (C) .

De acuerdo a una modalidad preferida el péptido es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (por sus siglas en inglés de hemocianina modificada de lapa) .

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona a una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, la cual comprende por lo menos un péptido de acuerdo a la presente invención. La formulación farmacéutica puede ser empleada para tratar individuos que sufren de beta-amiloidosis la cual incluye la enfermedad de Alzheimer o evitan la formación de placas ?ß en un individuo para impedir la formación de beta-amiloidosis que incluye la enfermedad de Alzheimer .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención es además ilustrada por las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo sin estar restringido al mismo.

La Figura 1 muestra enlace de anticuerpo monoclonal MV-002 para especificar péptidos y proteínas recombinantes .

La Figura 2 muestra enlace de anticuerpo monoclonal MV-003 para especificar péptidos y proteínas recombinantes.

La Figura 3 muestra enlace de anticuerpo monoclonal MV-004 para especificar péptidos y proteínas recombinantes Las Figuras 4A-4C muestran ensayos de enlace típicos con mimotopos para beta-amiloide y fragmentos de beta-amiloide truncados N-terminalmente y/o modificados post-translacionalmente .

Las Figuras 5A-5C muestran los ensayos de inhibición típicos con mimotopos para beta-amiloide y fragmentos beta-amiloide truncados N-terminalmente y/o modificados post translacionalmente .

Las Figuras 6A-6C muestran ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo (péptido inyectado/péptido irrelevante) .

Las Figuras 7A-7C muestran ejemplos para caracterización in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo contra fragmentos beta amiloides .

Las Figuras 8A-8B muestran ejemplos para caracterización in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopos contra ?ß40/42 de longitud completa.

La Figura 9 muestra áreas ocupadas por placas amiloides. Tg2576 son inyectadas 6 veces con vacunas de mimotopo con adyuvante de hidróxido de aluminio (ALUM) por inoculación s.c. en intervalos mensuales. Los ratones de control reciben PBS-ALU solamente. El área ocupada por las placas amiloides mostrada como porcentaje del grupo de control. Grl ... grupo de control; Gr2 ... reciben p4381; Gr3... reciben p4390; Gr4... reciben p4715.

La Figura 10 muestra áreas ocupadas por placas amiloides. Tg2576 son inyectados 6 vecs con vacunas AFFITOPE con adyuvante de hidróxido de aluminio (ALUM) , por inoculación s.c. en intervalos mensuales. Los ratones de control reciben PBS-ALUM solamente. El área ocupada por las placas amiloides mostrada como porcentaje del grupo de control. Grl ... grupo de control; Gr2... reciben p4395.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS Métodos Los anticuerpos usados para la identificación de mimotopos de acuerdo a la presente invención detectan secuencias de aminoácidos derivadas de ?ß humano pero no enlazan a APP humana de longitud completa. Las secuencias detectadas incluyen EFRHDS (=epítopo original aa3-8 de ?ß) , p (E) FRHDS (= epítopo original de aa3-8 modificado de ?ß) , EVHHQK (=epítopo original aall-16 de ?ß) . El anticuerpo puede ser una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal o cualquier parte de anticuerpo o derivado del mismo, el único prerrequisito es que la molécula de anticuerpo reconoce específicamente por lo menos uno de los epítopos mencionados anteriormente (derivado de ?ß humano) , pero no enlaza a APP humana de longitud completa.

Los mimotopos son identificados y además caracterizado con los anticuerpos monoclonales y bibliotecas de péptido.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales para detectar específicamente beta-amiloide y fragmentos beta-amiloides truncados N- terminalmente y/o modificados post-translacionalmente Ejemplo la: Generación de anticuerpo monoclonal MV-001 Un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión del experimento Alz-9 es generado: En el experimento los ratones Alz-5 C57/B16 son inmunizados repetidamente con epítopo ?ß original DAEFRHDSGYC acoplado a KLH (hemocianina modificada de lapa y Alum (hidróxido de aluminio) como adyuvante. El péptido específico p4371, hibridomas de producción de anticuerpo son detectados por ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido pl253 Y p4371) . ?ß40/42 humano (proteína recombinante) es usado como un péptido de control positivo: los hibridomas que reconocen la proteína recombinante inmovilizada en placas ELISA son incluidas ya que son enlazadas tanto a péptido y ?ß de longitud completa específicamente. Se usa pl454 (?ß 33-40 humano) como péptido de control negativo. Además más hibridomas son probados contra p4373. Solamente hibridomas con o sin enlace p4373 son usados para desarrollo adicional de anticuerpos.

El clon de hibridoma (MV-001 (nombre interno 824; IgGl) es purificado y analizado para detección específica de pl253, p4371, p4373, pl454, y ?ß respectivamente. MV-001 reconoce el epítopo inyectado (pll53) así como también el epítopo específico (p4371) y proteína ?ß de longitud completa (proteína recombinante: obtenido de Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. Sin embargo no detecta pl454 en ELISA. Adicionalmente , los anticuerpos MV-001 fallan básicamente para detectar el péptido p4373 el cual codifica la versión de piroglutamato de ?ß3-10 (30 veces más título que los epítopos originales) .

Ejemplo Ib: Generación de anticuerpo monoclonal MV-003 Un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión del experimento Alz-16 es generado: En el experimento los ratones Alz-16 BalbC son inmunizados repetidamente con el epítopo p(E)FRHDSC (p4373) acoplado a KLH (hemocianina modificada de lapa) y Alum (hidróxido de aluminio) como adyuvante. El péptido específico p4373, hibridomas de producción de anticuerpo son detectados por ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p4373) . Se usan pl253, pl454 y ?ß40/42 como péptidos de control negativo: además, los hibridomas son probados contra p4371. Solamente hibridomas con o sin enlace p4371 limitados son usados para desarrollo adicional de anticuerpos con el fin de garantizar la especificidad a piroglutamato .

El clon de hibridoma (MV-003 (nombre interno D129; IgGl) es purificado y analizado para detección específica de pl253, p4371, p4373, pl454, y ?ß respectivamente. MV-003 reconoce el epítopo inyectado (p4373) pero falla para detectar pl454, pl253 ó proteína ?ß de longitud completa (proteína recombinante : obtenido de Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. Adicionalmente , los anticuerpos MV-003 fallan para detectar el péptido p4371 el cual codifica la versión normal de ?ß3-10 (15 veces menos título que el epítopo original) .

Ejemplo le: Generación de anticuerpo monoclonal MV-004 Un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión del experimento Alz-15 es generado: En el experimento los ratones Alz-15 BalbC son inmunizados repetidamente con el epítopo EVHHQKC (p4372) acoplado a KLH (hemocianina modificada de lapa) y Alum (hidróxido de aluminio) como adyuvante. El péptido específico p4372, hibridomas de producción de anticuerpo son detectados por ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p4372) . Se usan p4376, p4378, P1454 y ?ß40/42 como péptidos de control negativo. Solamente hibridomas con o sin enlace p4376 Y p4378 limitados son usados para desarrollo adicional de anticuerpos con el fin de garantizar la especificidad a la N-terminal libre en la posición aall.

El clon de hibridoma (MV-004 (nombre interno B204; IgGl) es purificado y analizado para detección específica de p4372, p4376f p4378, pl454( y ?ß respectivamente. MV-004 reconoce el epítopo inyectado (p4372) pero falla para detectar pl454, p4376 y p4378 así como también la proteína ?ß de longitud completa (proteína recombinante : obtenido de Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. La falla para detectar p4376, p4378 demuestra especificidad para la N-terminal libre en la posición all en ?ß truncado.

Ejemplo 2: Exhibición de fagos, ELISA de enlace e Inhibición Las bibliotecas de exhibición de fago usadas en este ejemplo son: Ph. D. 7: New England BioLabs E8102L (biblioteca 7mer lineal) . La exhibición de fagos es hecha de acuerdo al protocolo del fabricante (www . neb . com) .

Después de 2 ó 3 vueltas subsecuentes de apelmazado, los clones de fagos sencillos son tomados y los sobrenadantes de fagos son sometidos a ELISA en placas recubiertas con el anticuerpo que es usado para el procedimiento de apelmazado. Los clones de fagos que son positivos en este ELISA (señal fuerte para el objetivo, pero no señal para control no específico) son secuenciados . A partir de las secuencias de ADN, las secuencias de péptidos son deducidas. Estos péptidos son sintetizados y caracterizados en ELISA de enlace e inhibición. Adicionalmente , algunos mimotopos novedosos son creados por combinar la información de secuencia a partir de los mimotopos identificados en el tamiz para soportar la identificación de una secuencia de consenso para una vacunación de mimotopo. 1. Ensayo de enlace in vitro (ELISA) Los péptidos derivados de exhibición de fagos así como también variantes de los mismos son acoplados a BSA y enlazado a las placas de ELISA (1 uM; como se indica en las figuras respectivas) y se incuba subsecuentemente con el anticuerpo monoclonal que es usado para el procedimiento de tamizado para analizar la capacidad de enlace de péptidos identificados . 2. Ensayo de inhibición in vitro (ELISA) Diferentes cantidades de péptidos (concentraciones en el intervalo de 10 µg a 0.08 diluciones en serie), derivado de exhibición de fagos son incubados con el anticuerpo monoclonal que es usado para el procedimiento de tamizado. Los péptidos que disminuyen enlace subsecuente del anticuerpo al epítopo original recubierto en placas ELISA son considerados como que se inhiben en este ensayo.

Ejemplo 3; Prueba in vivo de mimotopos: Análisis de inmunogenicidad y reactividad cruzada 1. Prueba in vivo de mimotopos Péptidos de inhibición así como también de no inhibición son acoplados a KLH e inyectados en ratones (ratones C57/B16 del tipo silvestre; inyección subcutánea en el flanco) junto con un adyuvante apropiado (hidróxido de aluminio)'. Los animales son vacunados 3-6 veces en intervalos bisemanalmente y el suero es tomado bisemanalmente también. Se determinan los títulos a péptidos inyectados, así como también para un péptido irrelevante con cada suero. Adicionalmente, los títulos contra la proteína ?ß humana recombinante , y contra los péptidos originales son determinados respectivamente. En general los sueros son analizados por reacción contra los péptidos acoplados a albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés) y las proteínas de longitud completa recombinante las cuales son inmovilizadas en placas ELISA. Los títulos son determinados usando anticuerpos específicos IgG anti ratón. Para los resultados detallados ver las figuras 6A a 8B respectivamente. 2. Resultados 2.1 Identificación de anticuerpos monoc loríales específicos (mAB) dirigidos contra formas de ?ß truncadas N- terminalmente y modificadas La Figura 1 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-001 (nombre interno 824; IgGl) derivado de Alz-5 experimental que demuestra especificidad para ?ß longitud completa y ?ß truncada en la posición E3.

La Figura 2 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-003 (nombre interno D129; IgGl) derivado de Alz-16 experimental que demuestra especificidad para ?ß truncada y post-translacionalmente modificada en la posición p(E)3.

La Figura 3 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-004 (nombre interno B204; IgGl) derivado de Alz-15 experimental que demuestra especificidad para ?ß truncada en la posición Ell. 2.2. Tamizado con mAB específicos dirigidos contra formas de ?ß truncadas N- terminalmente y modi f icadas 2.2.1 Biblioteca de exhibición de fagos Ph. D. 7 2.2.1.1. Tamizado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4373 8 secuencias son identificadas por bibliotecas de exhibición de fagos PhD7 de tamizado en este tamiz: La Tabla 1A resume los péptidos identificados y su capacidad de enlace como se compara al epítopo original . 2.2.1.2. Tamizado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4372 9 secuencias son identificadas por bibliotecas de exhibición de fagos PhD7 de tamizado en este tamiz: La Tabla IB resume los péptidos identificados y su capacidad de enlace como se compara al epítopo original . 2.2.1.3. Tamizado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4371 71 secuencias son identificadas por bibliotecas de exhibición de fagos PhD7 y PhD12 de tamizado en este tamiz: La Tabla 1C resume los péptidos identificados y su capacidad de enlace como se compara al epítopo original.

Tabla 1A . Mimotopos que enlazan al anticuerpo parental MV-003 Leyenda a la Tabla 1A: la capacidad de enlace codificada por el siguiente código de enlace: 1:X describe factor de dilución del AB parental.

Código de enlace OD máx. media 1:X 0 Sin enlace : 0 1 Enlace débil :<16000 2 Enlace medio :16-6000 3 Enlace fuerte : >60000 Tabla IB; mime-topos que enlazan al anticuerpo parental MV-004 Leyenda para la Tabla IB: la capacidad de enlace es codificado por el siguiente código de enlace: l:x describe el factor de dilución del AB parental.

Código de enlace OD máx media 1:X 0 Sin enlace :0 1 Enlace débil :<24000 2 Enlace medio :24-96000 3 Enlace fuerte : >96000 Tabla 1C ; mimotopos que enlazan al anticuerpo parental MV- 001 Numero de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido enlace interno p4380 18 QDFRHYC 2 p4381 19 SEFKHGC 3 p4382 20 TSFRHGC 2 p4383 21 TSVFRHC 3 p4384 22 TPFRHTC 2 p4385 23 SQRFHYC 2 p4386 24 LMFRHNC 3 p4387 25 SAFRHHC 2 p4388 26 LPFRHGC 2 p4389 27 SHFRHGC 2 p4390 28 ILFRHGC 3 p4391 29 QFKHDLC 2 p4392 30 NWFPHPC 1 p4393 31 EEFKYSC 2 p4701 32 NELRHSTC 3 p4702 33 GEMRHQPC 3 p4703 34 DTYFPRSC 2 p4704 35 VELRHSRC 2 p4705 36 YSMRHDAC 2 Numero de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido enlace interno · p4706 37 AANYFPRC 2 p4707 38 SPNQFRHC 3 p4708 39 SSSFFPRC 2 p4709 40 EDWFF HC 1 p4710 41 SAGSFRHC 3 p4711 42 QVMRHHAC 2 p4712 43 SEFSHSSC 3 p4713 44 QPNLFYHC 1 p4714 45 ELFKHHLC 3 p4715 46 TLHEFRHC 3 p4716 47 ATFRHSPC 2 p4717 48 APMYFPHC 2 p4718 49 TYFSHSLC 2 p4719 50 HEPLFSHC 1 p4721 51 SLMRHSSC 2 p4722 52 EFLRHTLC 3 p4723 53 ATPLFRHC 3 p4724 54 QELKRYYC 1 p4725 55 THTDFRHC 3 p4726 56 LHIPFRHC 3 p4727 57 NELFKHFC 2 Numero de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido enlace interno p4729 58 SQYFPRPC 2 p4730 59 DEHPFRHC 3 p4731 60 MLPFRHGC 2 p4732 61 SAMRHSLC 2 p4733 62 TPLMFWHC 1 p4734 63 LQFKHSTC 2 p4735 64 ATFRHSTC 2 p4736 65 TGLMFKHC 2 p4737 66 AEFSH HC 2 p4738 67 QSEFKHWC 3 p4739 68 AEFMHSVC 2 p4740 69 ADHDFRHC 3 p4741 70 DGLLFKHC 3 p4742 71 IGFRHDSC 2 p4743 72 SNSEFRRC 3 p4744 73 SELRHSTC 3 p4745 74 THMEFRRC 3 p4746 75 EELRHSVC 3 p4747 76 QLFKHSPC 3 p4748 77 YEFRHAQC 3 p4749 78 SNFRHSVC 3 Numero de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido enlace interno p4750 79 APIQFRHC 3 p4751 80 AYFPHTSC 2 p4752 81 NSSELRHC 3 p4753 82 TEFHKAC 3 p4754 83 TSTE HC 1 p4755 84 SQSYFKHC 3 p4800 85 CSEFKH 3 p4801 86 SEFKHC 3 p4802 87 CHEFRH 3 p4803 88 HEFRHC 3 Leyenda para la Tabla 1C: la capacidad de enlace es codificada por el siguiente código de enlace: 1:X describe el factor de dilución del AB parental 2.3. Caracterización in vitro de mimotopos identificados en bibliotecas de exhibición de fagos de tamización con anticuerpo monoclonales contra formas de ?ß truncadas N- terminalmente y modificadas Las Figuras 4A-4C y 5A-5C muestran ejemplos representativos para ensayos de enlace e inhibición usados para caracterizar mimotopos in vitro. Los datos obtenidos son resumidos en las Tablas 1 y 2 respectivamente.

Los mimotopos MV-003: A partir de 8 secuencias presentadas 6 secuencias inhiben el enlace en experimentos de competición in vitro de anticuerpo monoclonal específico ?(?)3-7?ß. Las 2 secuencias adicionales son identificadas que no inhiben el enlace de anticuerpo monoclonal en experimentos de competición in vitro pero todavía retienen capacidad de enlace al anticuerpo parental (Tabla 2A) .

Los mimotopos MV-004: Todas las 9 secuencias presentadas inhiben el enlace en experimentos de competición in vitro de anticuerpo monoclonal específicament enlazado a la N-terminal libre de ?ß truncado en la posición Ell (Tabla 2B) .

Los mimotopos MV-001: A partir de 71 secuencias presentadas 27 secuencias inhiben el enlace en experimentos de competición in vitro de anticuerpo monoclonal específicamente dirigido contra ?ß truncado en la posición E3. Las 44 secuencias adicionales son identificadas que no inhiben el enlace de anticuerpo monoclonal en experimentos de competición in vitro pero todavía retienen capacidad de enlace al anticuerpo parental (Tabla 2C) .

Tablas 2A a 2C: mimotpos identificados en esta invención que dan resultados pósitos en ensayos de inhibición Tabla 2A. Mimotopos MV-003 Leyenda para la Tabla 2A: la capacidad de inhibición es codificada por el siguiente código: la inhibición débil significa que más péptido es requerido para disminuir el enlace AB que con el epítopo original; la inhibición fuerte significa que cantidades de péptidos similares son requeridas para mimotopo y epítopo original para disminuir el enlace AB. Los mimotopos son comparados al péptido original como estándar. OD en 10 ug de péptido us en el ensayo es usado para calcular la capacidad competición comparada con el péptido original.

Tabla 2: mimotopos MV- 004 Numero de SEQ ID No. Secuencia Capacidad de péptido inhibición interno p4417 9 EVWHRHQC 1 p4418 10 ERWHEKHC 2 p4419 11 EVWHRLQC 2 p4420 12 ELWHRYPC 1 p4665 13 ELWHRAFC 2 p4786 14 ELWHRAC 1 p4788 15 EVWHRGC 1 p4789 16 EVWHRHC 1 p4790 17 ERWHEKC 2 Leyenda para la Tabla 2B: la capacidad de inhibición es codificada por el siguiente código: la inhibición débil significa que más péptido es requerido para disminuir el enlace AB que con el epítopo original; la inhibición fuerte significa que cantidades de péptidos similares son requeridas para mimotopo y epítopo original para disminuir el enlace AB . Los mimotopos son comparados al péptido original como estándar. OD en 10 ug de péptido usado en el ensayo es usado para calcular la capacidad de competición comparada con el péptido original.

Código de competición 0 Sin inhibición (OD de 10 ug de péptido arriba 5 veces del péptido original) 1 Más débil que el epítopo original (OD de 10 ug de péptido abajo 5 veces de péptido original) 2 Fuerte inhibición (como epítopo original; OD de 10 ug de péptido abajo 2 veces de péptido original) Tabla 2C- Mimotopos MV-001 Numero de SEQ ID No. secuencia Capacidad de péptido Inhibición interno p4380 18 QDFRHYC 1 p4381 19 SEFKHGC 1 p4382 20 TSFRHGC 1 p4383 21 TSVFRHC 1 p4384 22 TPFRHTC 1 p4385 23 SQFRHYC 1 p4386 24 LMFRHNC 1 p4387 25 SAFRHHC 1 p4388 26 LPFRHGC 1 p4389 27 SHFRHGC 1 p4390 28 ILFRHGC 1 p4391 29 QFKHDLC 1 p4392 30 NWFPHPC 1 p4393 31 EEFKYSC 1 p4707 38 SPNQFRHC 1 p4715 46 TLHEFRHC 2 p4725 55 THTDFRHC 1 p4730 59 DEHPFRHC 1 p4738 67 QSEFKHWC 1 p4740 69 ADHDFRHC 1 p4741 70 DGLLFKHC 1 p4746 75 EELRHSVC 1 p4753 82 TEFRHKAC 2 p4800 85 CSEFKH 2 p4801 86 SEFKHC 1 p4802 87 CHEFRH 2 p4803 88 HEFRHC 2 Leyenda para la Tabla 2C: la capacidad de inhibición es codificada por el siguiente código: la inhibición débil significa que más péptido es requerido para disminuir el enlace AB que con el epítopo original; la inhibición fuerte significa que cantidades de péptidos similares son requeridas para mimotopo y epítopo original para disminuir el enlace AB. Los mimotopos son comparados al péptido original como estándar. OD en 10 ug de péptido usado en el ensayo es usado para calcular la capacidad de competición comparada con el péptido original.

Tabla 3 Péptidos no mime-topos 2.4 La caracterización in vivo de mimotopos identificados en bibliotecas de exhibición de fagos de tamización con un anticuerpo monoclonal dirigidos contra formas truncadas N- terminalmente y modificadas de Abeta; Los ratones C57/bl6 hembra, 5-6 ratones por grupo, son inmunizados subcutáneamente con 30 g de péptido acoplado a KLH. Los grupos de control son conjugados epítopo-KLH originales administrados respectivamente. En cuanto se usa el alum adyuvante (siempre 1 mg por ratón) . Los péptidos administrados son todos capaces de enlazar a los anticuerpos monoclonales específicamente aunque algunos de los péptidos no inhiben el enlace del epítopo original a su anticuerpo parental in vitro (en un ensayo de inhibición in vitro) . El ensayo ELISA in vitro para determinar el título de anticuerpo es realizado con sueros de ratones individuales después de cada vacunación en un intervalo de dos semanas (ver las Figuras 6A a 6C y 7A a 7C respectivamente) . Los pozos de la placa ELISA son recubiertos con conjugado de mimotopo-BSA y un conjugado de péptido-BSA irrelevante (control negativo) . El control positivo es realizado por reacción del anticuerpo parental con el conjugado de mimotopo-BSA respectivo. La detección es realizada con IgG antiratón. Adicionalmente , las proteínas recombinantes son inmovilizadas en placas ELISA y sueros reaccionados por consiguiente. Las Figuras 6A a 6C y 8A a 8B muestran ejemplos representativos para ensayos usados para caracterizar mimotopos in vivo.

Las Figuras 6A a 6C muestran los ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo por analizar la respuesta inmunológica contra péptido inyectado y un péptido irrelevante, el cual contiene una secuencia no relacionada. En todos los tres ejemplos mostrados, los epítopos originales y los mimotopos, producen respuestas inmunológicas contra los péptidos inyectados pero fallan para inducir una respuesta inmunológica no específica relevante contra una secuencia no relacionada (pl454) .

Como ejemplo para mimotopos MV-003, el epítopo original p4373 y los mimotopos p4395, p4396, p4397 y p4399 son representados en la Figura 6A. Todas las vacunas están montando respuestas inmunológicas similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna de epítopo p4373 original tratada ni los animales tratados con vacuna de mimotopo p4395, p4396, p4397 ó p4399 montan títulos relevantes contra péptido pl454 irrelevante (llx-25x menos que los péptidos inyectados) .

Como ejemplo para mimotopos MV-004, el epítopo original p4372 original y los mimotopos p4417, p4418, p4419 y p4420 son representados en la Figura 6B. Todas las vacunas están montando respuestas inmunológicas similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna de epítopo p4372 original tratada ni los animales tratados con vacuna de mimotopo p4417, p4418, p4419 ó p4420 montan títulos relevantes contra el péptido pl454 irrelevante (20-80x menos que los péptidos inyectados) .

Como ejemplo para mimotopos MV-001, el epítopo original p4371 y los mimotopos p4381, p4382, y p4390 son representados en la Figura 6C. Todas las vacunas están montando respuestas inmunológicas similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna de epítopo p4371 original tratada ni los animales tratados con vacuna de mimotopo p4381, p4382, y p4390 montan títulos relevantes contra péptido pl454 · irrelevante (>10x menos que los péptidos inyectados) .

Las Figuras 7A a 7C muestran ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo contra el epítopo original respectivo del anticuerpo parental así como también contra los péptidos derivados de otras formas de especies truncadas de ?ß .

Como ejemplo para mimotopos MV-003, el epítopo original p4373 y los mimotopos p4395, p4396, p4397 y p4399 son representados en la Figura 7A. Tres cuartos de vacunas de mimotopo indican montaje de respuestas inmunológicas similares detectables el epítopo original p4373. Un fenómeno similar puede ser detectado analizando la reactividad cruzada contra la forma no modificada como se exhibe por p4371. La vacuna de epítopo p4373 original y dos cuartos de vacunas de mimotopos montan títulos relevantes contra p4371. Sorpresivamente, los mimotopos seleccionados por MV-003, los cuales están enlazando específicamente a p4373 están también induciendo una reacción cruzada de reacción inmunológica con la forma no modificada del epítopo original.

Como ejemplo para mimotopos MV-004, el epítopo original p4372 original y los mimotopos p4417, p4418, p4419 y p4420 son representados en la Figura 7B. Tres cuartos de las vacunas de mimotopos muestran montaje de respuestas inmunológicas detectables contra el epítopo p4372 original.

Como ejemplo para mimotopos MV-001, el epítopo original p4371 y los mimotopos p4381, p4382, y p4390 son representados en la Figura 7C. Todas las vacunas de mimotopo representan montaje de respuestas inmunológicas detectables contra el epítopo original p4371. Un fenómeno similar puede ser detectado analizando la reactividad cruzada contra la forma modificada con piroglutamato como se exhibe por p4373. La vacuna de epítopo p4371 original y todas las vacunas de mimotopos montan títulos relevantes contra p4373. Sorpresivamente, los mimotopos seleccionados por MV-001, los cuales están enlazando específicamente a p4371 están induciendo una reacción cruzada de reacción inmunológica mejor con la forma modificada del epítopo original que el epítopo original que induce la reacción inmunológica o el anticuerpo parental. De esta forma estos mimotopos pueden ser capaces sorpresivamente para inducir pero no necesariamente inducir una reacción inmunológica más amplia que el anticuerpo parental y pueden ser usados para una objetivación más amplia de formas de ?ß .

Las Figuras 8A a 8B muestran ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopo contra ?ß de longitud completa. Sorpresivamente, los mimotopos seleccionados por usar V-001 y Mv-003 inducen una reacción cruzada no solamente con los epítopos cortos truncados o modificados usados para crear los anticuerpos sino también inducen reactividad cruzada para formas no modificadas de longitud completa, de ?ß tan buenas como la secuencia original o incluso más eficientemente que p4371/p4372. Para epítopo original MV-002 así como también para los mimotopos identificados, ninguna reactividad cruzada puede ser detectada lo cual demuestra una transferencia de especificidad del anticuerpo a la N-terminal libre de Abetal 1 - 40 /42 no modificada. De esta forma los mimotopos presentados en esta invención constituyen candidatos de vacuna optimizados para objetivar un espectro amplio de formas que se encuentran en forma natural de los péptidos ?ß como han sido encontrados en el cerebro de pacientes AD . Las formas incluyen pero no se limitan a ?ß?-40/42 y formas truncadas N-terminalmente como ?ß3-40/42, ?ß (pE ) 3 - 40 /42 y ?ß??-40/42 no modificada respectivamente.

En la Tabla 4 y 6 ejemplos adicionales de la respuesta inmunológica producida por vacunación de mimotopos contra ?ß de longitud completa por u mimotopos derivados de MV-001 y Mv-003 son descritos Tabla 4. Caracterización in vivo de mimotopos; MV-001 Todos los péptidos enlistados en la Tabla 4 montan reacciones inmunológicas específicas contra formas de longitud completa y/o truncadas y modificadas de ?ß o fragmentos de los mismos.

Tabla 5; Caracterización in vivo de mimotopoas : MV- 003 Todos los péptidos enlistados en la Tabla 4 montan reacciones inmunológicas específicas contra formas de ?ß de longitud completa y/o truncadas y modificadas o fragmentos de la misma. 2.5 Caracterización in vivo de mimotopos para la eficacia para reducir la enfermedad como AD en animales transgénicos Se usa el modelo de ratón Tg2576 AD para estudiar la eficacia preclínica de las vacunas de mimotopos. Esta línea transgénica está expresando APP humana que porta la doble mutación sueca en la posición aa 670/671 bajo el control de un promotor de proteína de priones de hámster (PrP) el cual resulta en sobre expresión de la proteína. Es actualmente uno de los modelos empleados más ampliamente en investigación de AD. El modelo Tg2576 recapitula varios sellos de patología de AD que incluyen deposición de placa amiloide específica a enfermedad y astrocitosis . Como todos los otros sistemas de modelo AD disponibles a la fecha, estos no reflejan todas las características neuropatológicas cardinales de AD.

Para evaluar si el tratamiento con mimotopos es capaz de evitar la acumulación de ?ß cerebral, los ratones Tg2576 son inyectados s.c. 6 veces en intervalos mensuales con conjugados de péptido-KLH adsorbidos a ALUM (adyuvante: hidróxido de aluminio) o PBS adsorbido a ALUM (referido como PBS o control) solo. Hasta ocho semanas después de la última inmunización, los animales son sacrificados, sus cerebros son cosechados y analizados por su carga de ?ß (patología como AD) . Los ratones son sacrificados bajo anestesia profunda. Subsecuentemente, el cerebro es aislado, fijado en 4% de PFA y deshidratado por series de etanol graduado seguido por incubación en xileno y embebido en parafina. Cada cerebro embebido en parafina es seccionado en 7 µ? usando un microtomo de corte y las secciones son montadas en portaobjetos de vidrio.

Como un método para ensayar la patología similar a AD en animales Tg2576, se analiza en la presente el área relativa ocupada por depósitos amiloides en el cerebro de animales tratados. Este análisis es realizado usando un programa de reconocimiento de área automatizada. Para identificar las placas, se tiñen las secciones con el anticuerpo monoclonal (mAb) 3A5 (específico para ?ß40/42) . Los animales tratados con mimotopos son comparados a animales dé control. Todos los animales han sido sacrificados en una edad de 13, 5-14 meses. Para este análisis 3 cortes/animal que cubren la corteza y el hipocampo son seleccionados, teñidos con mAb 3A5 y documentados subsecuentemente usando el sistema Mirax (Zeiss) . Para el cálculo del área ocupada por las placas amiloides, se analiza hasta cuatro secciones individuales por portaobjetos y secciones que portan artefactos de tejido e intensidades de tinción aberrante han sido excluidas después de la inspección de las fotos resultantes.

Para los mimotopos derivados de MVOOl se realiza un análisis de área usando tres candidatos de ejemplo. El análisis es realizado después de la vacunación repetida usando vacunas de conjugado de péptido-KLH. El grupo de control muestra una ocupación promedio de 0.35% como se compara a 0.11%, 0.14% y 0.22% para los animales tratados con mimotopo respectivamente. Esto corresponde a una reducción después del tratamiento de mimotopos de 67% en el grupo 2, una reducción de 60& en el grupo 3 y una reducción de 36% en el grupo 4 (ver la figura 9) .

Una foto similar puede ser detectada para el grupo de mimotopos derivados de Mv003. Aquí el ejemplo de p4395 es presentado. Como se describe para los mimotopos derivados de MV001, un análisis del área ocupada por placas amiloides que siguen a la vacunación de péptido-conjugado ha sido realizado. El grupo de control muestra una ocupación promedio de 0.3% como se compara con 0.21% para los animales tratados con mimotopo respectivamente. Esto corresponde a una reducción después del tratamiento con mimotopo de 38% en el grupo 2 (ver la Figura 10) .

De esta forma, este grupo de datos indica claramente un efecto benéfico del tratamiento de vacuna de mimotopos sobre patología como AD en animales transgénicos .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de SEFKHG (C) , TLHEFRH (C) , ILFRHG (C) , TSVFRH (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SPNQFRH (c) , ELFKHHL (C) THTDFRH (C) , DEHPFRH (C) , QSEFKHW (C) , ADHDFRH (C) , YEFRHAQ (C) y TEFRHKA (C) para producir un medicamnto para evitar y/o tratar beta-amiloidosis .

2. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos XiRX2DX3 (X4) n (X5) m (?ß) o (fórmula I) en donde Xi es isoleucina (I) , o valina (V) , X2 es triptófano (W) , o tirosina (Y) , X3 es treonina (T) , valina (V) , alanina (A) , metionina (M) , glutamina (Q) o glicina (G) , X4 es prolina (P) , alanina (A) ) , tirosina (Y) , serina (S) , cisteina (C) , o glicina (G) , X5 es prolina (P) , leucina (L) , glicina (G) o cisteina (C) , ?e es cisteina (C) , , m y O son, independientemente, 0 ó 1, el compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (?ß) el cual comprende la secuencia de aminoácidos EFRHDSGY y/o pEFRHDSGY, para producir un medicamento para evitar y/o tratar beta-amiloidosis .

3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de IR DTP(C) (C) , VR DVYP (C) , IRYDAPL (C) , IRYDMAG (C) , IRWDTSL (C) , IRWDQP (C) , IRWDG (C) , y IRWDGG (C) .

4. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende la secuencia de aminoácidos EX! HX2X3 (X4)n(X5)m (Fórmula II), en donde Xi es valina (V) , arginina (R) o leucina (L) , X2 es arginina (R) , o ácido glutámico (E) , 3 es alanina (A) , histidina (H) , lisina (K) , leucina (L) , tirosina (Y) , o glicina (G) , X4 es prolina (P) , histidina (H) , fenilalanina (F) , glutamina (Q) o cisteína (C) X5 es cisteína (C) , n y m son, independientemente, 0 ó 1. el compuesto el cual tiene una capacidad de enlace a un anticuerpo el cual es específico para un epítopo del amiloide-beta-péptido (Abeta) el cual comprende la secuencia de aminoácidos EVHHQKL, para producir un medicamento para evitar y/o tratar la beta-amiloidosis .

5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el compuesto comprende un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de EVWHRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EVWHRLQ (C) , ELWHRYP (C) , ELWHRAF (C) , ELWHRA (C) , EVWHRG (C) , EVWHRH (C) , Y ERWHEK (C) , preferentemente EVWHRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EVWHRLQ (C) , ELWHRYP (C) y ELWHRAF (C) .

6. El uso de por lo menos un compuesto el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , NELRHST (C) , GEMRHQP (C) , DTYFPRS (C) , VELRHSR (C) , YSMRHDA (C) , AANYFPR (C) , SPNQFRH (C) , SSSFFPR (C) , EDWFFWH (C) , SAGSFRH (C) , QVMRHHA (C) , SEFSHSS (C) , QPNLFYH (C) , ELFKHHL (C) , TLHEFRH (C) , ATFRHSP (C) , APMYFPH (C) , TYFSHSL (C) , HEPLFSH (C) , SLMRHSS (C) , EFLRHTL (C) , ATPLFRH (C) , QELKRYY (C) , THTDFRH (C) , LHIPFRH (C) , NELFKHF (C) , SQYFPRP (C) , DEHPFRH (C) , MLPFRHG (C) , SAMRHSL (C) , TPLMFWH (C) , LQFKHST (C) , ATFRHST (C) , TGLMFKH (C) , AEFSH H (C) , QSEFKHW (C) , AEFMHSV (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , IGFRHDS (C) , SNSEFRR (C) , SELRHST (C) , THMEFRR (C) , EELRHSV (C) , QLFKHSP (C) , YEFRHAQ (C) , SNFRHSV (C) , APIQFRH (C) , AYFPHTS (C) , NSSELRH (C) , TEFRHKA (C) , TSTEMWH (C) , SQSYFKH (C) , (C)SEFKH, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) para producir un medicamento para evitar y/o tratar la beta-amiloidosis .

7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el compuesto es un péptido el cual tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , SPNQFRH (C) , TLHEFRH (C) , THTDFRH (C) , DEHPFRH (C) , QSEFKHW (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , EELRHSV (C) , TEFRHKA (C) , (C) SEFKH, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) , preferentemente SEFKHG (C) , TSVFRH (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , ILFRHG (C) , SPNQFRH (C) , EELRHSV (C) , TLHEFRH (C) , THTDFRH (C) , DEHPFRH (C) , QSEFKHW (C) , ADHDFRH (C) , YEFRHAQ (C) , TEFRHKA (C) .

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1 a 7, en donde el compuesto es un polipéptido el cual comprende 4 a 20 residuos de aminoácidos.

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el compuesto es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente, preferentemente KLH (hemocianina modificada de lapa) .

10. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el compuesto es formulado para administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, o intramuscular.

11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el compuesto es formulado con un adyuvante, preferentemente hidróxido de aluminio.

12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el compuesto está contenido en el medicamento en una cantidad de 0.1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 10 µg.

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para tratar y/o mejorar los síntomas de sinucleopatía .

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde la sinucleopatía es seleccionada del grupo de enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Le y, atrofia sistemática múltiple y neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral .

15. El péptido caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo el cual consiste de IRWDTP(C) (C) , VRWDVYP (C) , IRYDAPL (C) , IRYDMAG (C) , IR DTSL (C) , IRWDQP (C) , IR DG (C) , IRWDGG (C) , EVWHRHQ (C) , ERWHEKH (C) , EV HRLQ (C) , ELWHRYP (C) , ELWHRAF (C) , ELWHRA (C) , EV HRG (C) , EVWHRH (C) , ERWHEK (C) , QDFRHY (C) , SEFKHG (C) , TSFRHG (C) , TSVFRH (C) , TPFRHT (C) , SQFRHY (C) , LMFRHN (C) , SAFRHH (C) , LPFRHG (C) , SHFRHG (C) , ILFRHG (C) , QFKHDL (C) , NWFPHP (C) , EEFKYS (C) , NELRHST (C) , GEMRHQP (C) , DTYFPRS (C) , VELRHSR (C) , YSMRHDA (C) , AANYFPR (C) , SPNQFRH (C) , SSSFFPR (C) , EDWFFWH (C) , SAGSFRH (C) , QVMRHHA (C) , SEFSHSS (C) , QPNLFYH (C) , ELFKHHL (C) , TLHEFRH (C) , ATFRHSP (C) , APMYFPH (C) , TYFSHSL (C) , HEPLFSH (C) , SLMRHSS (C) , EFLRHTL (C) , ATPLFRH (C) , QELKRYY (C) , THTDFRH (C) , LHIPFRH (C) , NELFKHF (C) , SQYFPRP (C) , DEHPFRH (C) , MLPFRHG (C) , SAMRHSL (C) , TPLMFWH (C) , LQFKHST (C) , ATFRHST (C) , TGLMFKH (C) , AEFSHWH (C) , QSEFKHW (C) , AEFMHSV (C) , ADHDFRH (C) , DGLLFKH (C) , IGFRHDS (C) , SNSEFRR (C) , SELRHST (C) , THMEFRR (C) , EELRHSV (C) , QLFKHSP (C) , YEFRHAQ (C) , SNFRHSV (C) , APIQFRH (C) , AYFPHTS (C) , NSSELRH (C) , TEFRHKA (C) , TSTEMWH (C) , SQSYFKH (C) , (C)SEFKH, SEFKH (C) , (C) HEFRH y HEFRH (C) .

16. El péptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el péptido es acoplado a un portador aceptable farmacéuticamente preferentemente KLH (hemocianina modificada de lapa) .

17. Una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un péptido de conformidad con la reivindicación 15 ó 16.