KR20110036808A

KR20110036808A - 베타-아밀로이드증을 치료하기 위한 화합물

Info

Publication number: KR20110036808A
Application number: KR1020117000814A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠스 맨들러; 크리스티안 기에프퍼스; 프랭크 매트너; 안드레아스 돌리치카; 올레크산드르 오타바
Original assignee: 아피리스 아게
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2011-04-11
Also published as: CA2723991A1; US8613931B2; AT509106B1; ES2461492T3; BRPI0915137A2; RU2011100126A; JP6041917B2; US20130230545A1; AT506819B1; PT2310034E; DK2310034T3; AT506819A1; EP2310034A2; RS53236B; CY1115316T1; CN102123727B; IL209895A; IL209895A0; HK1152470A1; AU2009257169A1

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환을 포함하는 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집과 연관된 질환(β-아밀로이드증)의 치료에서의 미모토프의 용도에 관한 것으로, 상기 미모토프는 Aβ1-40/42, AβpE3-40/42, Aβ3-40/42 및 Aβ11-40/42로 유도되는 항체의 생체내 형성을 유도할 수 있다.

Description

베타-아밀로이드증을 치료하기 위한 화합물{COMPOUNDS FOR TREATING BETA-AMYLOIDOSES}

질병 치료를 위한 화합물

본 발명은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집(β-아밀로이드증)과 연관된 질병의 예방, 치료 및 진단을 위한 미모토프의 용도에 관한 것이다.

다양한 퇴행성 질환은 비정상적 중합 및 특정 단백질의 축적에 의해 특징화된다. 소위 단백질증(proteopathies)으로 불리는 이것은 신경학적 장애, 예컨대, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 헌팅턴 질환을 비롯하여 아밀로이드증을 포함하는 다양한 전신 질환을 포함한다. 본 발명은 β-아밀로이드 단백질과 연관된 단백질증(이하 β-아밀로이드증이란 단어로 요약됨)의 예방, 치료 및 진단에 관한 것이다. β-아밀로이드증의 가장 두드러진 형태는 알츠하이머 질환(AD)이다. 다른 예는 루이소체 치매 및 다운 증후군 중 치매를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

AD는 세포외 아밀로이드 플라크의 비정상적 축적에 의해 특징화된다 - 자세히는 광범위한 성상 세포증(astrocytosis) 및 소교 세포증(microgliosis)을 비롯하여 이영양성 뉴런(dystrophic neurones) 및 뉴런 손실과 연관됨. 이러한 아밀로이드 플라크는 주로 신경계에서 다양한 세포 유형으로 발현되는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에서 유래된 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드 Aβ40 및 Aβ42로 이루어진다. Aβ 펩티드는 AD의 병인 및 진행에 직접적으로 관련된 것으로 여겨진다.

APP는 두번의 절단 단계에 의해 정상적으로 진행되어, 아밀로이드 베타(Abeta) x-40/42/43의 현재 공지된 형태를 형성한다. 제 1 절단은 소위 베타-지점 APP-절단 효소 1 및 2(BACEl 및 BACE2)에 의해 수행되고; 제 2 단백질 분해성 단계는 감마-세크리타제 복합체에 의해 수행된다([De Strooper et al. J Cell Sci 113 (2000) : 1857-1870]에서 개관됨).

BACE 효소는 잠정적 Aβ 펩티드의 N-말단 부분에서 두 지점을 인식한다: BACE과 APP의 제 1 상호작용은 서열 DAEFR(Aβ 내 위치.1)에서의 절단 및 아밀로이드 베타 1-X의 형성을 유도한다. 대안적으로, BACE 또한 Aβ 내의 장래 위치 11을 절단하여 단편 H-X을 생성할 수 있다. 따라서, BACE 매개 APP 프로세싱은 주요 기여자(contribuent)로서 전장 아밀로이드 베타 1-40/42를 지니는 다양한 서로 다른 Aβ 종을 형성시킨다. 감마-세크리타제 활성은 3개의 주요 단편의 생산을 유도한다: Aβ 1-40/42/43. 이러한 펩티드가 생산되면, 이들은 아미노-펩티다아제에 의해 가공되어 이들의 후속 단계적 분해를 진행시킨다. 이러한 추가 단계는 예를 들어 각각 Aβ3-40/42와 같은 다른 형태의 형성을 유도한다. 인간에서, 평균 60 - 85%의 아밀로이드 플라크 물질은 N-말단이 트렁케이션된(truncated) 주로 개질된 Aβ40/42 유도체에 의해 형성된다. N-말단이 트렁케이션된 Aβ 종의 상대량은 Aβ 수준, 돌연변이 및 BACE 활성에 대하여 변화가능하다.

Aβ의 가장 많이 트렁케이션된 형태는 Aβ3-40/42 및 Aβ11-40/42이다. 상기 두개의 펩티드 모두는 N-말단 글루타메이트 잔기를 포함하며, 이 잔기는 효소적으로 피로글루타메이트로 주로 개질되어, 각각 Aβ3(pE)-40/42 및 Aβ11(pE) -40/42를 형성한다. 아밀로이드 베타 3(pE) 및 11(pE) 펩티드의 아미노 말단이 내부 락탐에 의해 블로킹되기 때문에, 피로글루타메이트 특이적인 것 이외에 아미노펩티다제의 단백질 분해 활동에서 보호되며, 따라서 조직 내에서 안정성을 유지할 수 있다.

N-말단이 트렁케이션된 개질된 아밀로이드의 가장 현저한 형태는 펩티드 3 (pE)-40/42에 의해 형성되는데, 이는 모든 트렁케이션된 형태의 최대 50%를 구성하는 것으로 생각된다. 이것은 이러한 동형(isoforms)이 AD 뇌에서 모든 아밀로이드 펩티드의 25-40 %를 구성하는 것을 의미한다. 트렁케이션된 Aβ 펩티드의 또 다른 현저한 형태는 Aβ11-40/42이다: 나스런드(Naslund et al.) 및 휴즈(Huse et al.)는 AD 환자의 인간 뇌를 비롯하여 AD에 대한 인프라-임상 환자에서 검출가능한 이러한 트렁케이션된 종의 상당한 수준이 존재한다고 설명할 수 있었다. 더욱이, 이러한 펩티드는 3(pE)-40/42에 대해 설명된 바와 같은 유사한 결과로 분자내 분해를 겪고 안정한 (pE) 형태를 형성한다.

트렁케이션되고 개질된 펩티드가 전장 Aβ보다 신경 조직에서 더욱 안정하다는 사실이 이미 관찰되었다. 추가적으로, Aβ의 N-말단 트렁케이션된 형태는 비개질된 Aβ 펩티드보다 더 아밀로이드를 생성하므로, 플라크 형성 속도를 강화하고 또한 배양 및 생체내 실험에서 뉴런에 적용된 경우 신경독성 활성을 보인다. Aβ의 트렁케이션된 형태는 AD의 초기 단계에서 Aβ의 확산 응집체 중 이미 검출될 수 있으며, 생체내에서 개별 씨드(individual seeds)로 작용하면서, 초기 플라크 형성에 관여될 수 있다.

N-말단 트렁케이션된 Aβ 종의 발생이 산발성 및 패밀리성 알츠하이머 질환을 비롯하여 다운 증후군 환자에서 신경퇴행성의 조기 발병 및 중증도의 증가와 상관관계가 있다는 강력한 증거가 존재한다.

이러한 펩티드의 증가된 안정성과 연결된 응집성 효과는 이들을 AD 발달에 있어서 잠재적인 위험한 플레이어로 만든다. 패밀리성 AD 또는 다운 증후군을 앓고 있는 인프라 임상 환자에서의 검정은 Aβ 3(pE)-42이 질환의 최초 단계, 소위 "씨드" 단계 중에 검출될 수 있다는 사실을 명백히 밝혀냈다. 이 시기에, Aβ 3(pE) -42 펩티드 종을 포함하는 플라크가 축적되기 시작할지라도, 없거나 작은 신경학적 증상만이 감지될 수 있다. 따라서, 이러한 환자로부터 획득한 정보는 트렁케이션된 Aβ 종의 초기 형성과 질환 발병을 비롯하여 진행 사이의 연결을 포함하고 있다.

이러한 연구결과에 비추어, AD 환자에서 이러한 펩티드 종의 함량을 감소시켜 질환 진행을 개질시키고, 독성 및 수반되는 인지 감퇴를 감소시키는 것이 중요한 것으로 보인다. 따라서, 최적의 AD-백신은 AD 환자의 뇌에 존재하는 Aβ 펩티드의 가장 현저한 형태를 표적화할 수 있는, 면역 반응을 유발한다.

실제로, 전장 Aβ를 표적화하기 위한 활성 및 수동적 면역화 전략을 이용한 면역요법적 치료는 Aβ 플라크의 감소를 유도하고, AD의 동물 모델에서 질환 진행에 이로운 영향을 미친다. AD의 마우스 모델에서의 수동적 백신 접종 실험은, Aβ40/42의 N- 및 C-말단에 대해 특이적으로 유도된 항체가 뇌에 존재하는 플라크를 감소시킬 수 있고, 또한 행동적 검정에서 판단된 바대로 치료된 동물에서 인지 기능을 향상시키는 사실을 명확히 나타냈다. 마우스에서 Aβ40/42에 대해 유도된 면역 반응을 유도하기 위한 상이한 접근을 이용하여, 활성 백신 접종 실험에서 유사한 관찰이 이뤄졌다. 이러한 접근법 전부는 Aβ의 본래(native) 서열을 함유하는 단편 또는 전장 Aβ40/42를 이용하였고, 트랜스제닉(transgenic) 마우스 모델에서 아밀로이드 존재량을 대부분 감소시켰다. 중요하게도, 이러한 동물은 또한 개선된 인지 기능을 보였다. 놀랍게도, 레메어(Lemere et al.)(Am J Pathol 165 (2004) : 283-297)는 비-인간 영장류에서, 플라크 침전의 명백한 감소를 보이며, 전장 Aβ를 이용한 활성 백신 접종에 대응한 병리학과 연관된, 이러한 결과를 재현할 수 있었다. 그러나, 전장 Aβ42를 항원으로서 이용하여 AD 환자에서의 제 1 상 IIa 임상 백신 접종 시도는 자가반응 T-세포의 뇌 침윤을 포함하는 심각한 신경염증성 부작용 때문에 중단되었다. 그럼에도 불구하고, AN-1792로 치료된 환자에서 임상적 효과를 조사하는 연구는, Aβ42에 대한 항체 반응을 발달시켰지만 수막뇌염을 앓지 않았던 환자들이 비-반응 환자보다 인지 테스트에서 더 잘 수행하였음을 나타내었고, 이는 면역요법이 AD에서 치료 접근에 매우 유용할 수 있음을 나타낸다.

더욱 중요한 것은, AN1792 백신 접종을 했던 환자를 검정하는 부검의 경우에서 획득한 최근 연구는 뇌로부터 전장 Aβ 종이 제거되었으나, Aβ의 N-말단 트렁케이션된 형태는 지속됨을 나타냈다. 이는 전장 Aβ를 비롯하여 이러한 분자의 N-말단 트렁케이션된 형태 및 개질된 형태를 표적화하는, 신규한 백신의 발명의 필요성을 강조한다.

인간에서 Aβ40/42 펩티드에 대한 면역 반응 유도는 AD 환자에서 인지 감퇴를 방해할 수 있으나, 안전한 알츠하이머 백신은 자가반응 T-세포의 형성을 피해야 한다. 본래 Aβ40/42 펩티드 또는 이의 단편을 이용한 백신접종은 환자에서 자가면역 질환 유도의 내재적 위험을 겪는데, 이는 면역 반응이 Aβ에 독점적으로 표적화될 수 없기 때문이다.

본 발명의 목적은 알츠하이머 질환을 포함하는 β-아밀로이드증을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있는 화합물 및 약제(medicaments)를 제공하는 것이다. 이러한 화합물은 개인에게 투여된 경우, 자가면역 질환을 유도할 위험이 없거나 상당히 감소시키는 것으로 보여야 한다. 본 발명의 또 다른 목적에 따라, 상기 화합물은 보통 아밀로이드 침전물의 주요 성분인, Aβ의 트렁케이션된 및/또는 안정화된 형태로 유도되는, 개인 내 항체의 생체내 형성을 유도할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 화합물의 β- 아밀로이드증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 생산을 위한, 용도에 관한 것이며, 이 화합물은 아미노산 서열 EFRHDSGY 및/또는 pEFRHDSGY를 포함하는 아밀로이드-베타-펩티드(Aβ)의 에피토프에 특이적인 항체에 대한 결합 능력을 지닌다:

(화학식 I),

상기 화학식에서,

X₁은 이소루신(I) 또는 발린(V)이며,

X₂는 트립토판(W) 또는 티로신(Y)이고,

X₃는 트레오닌(T), 발린(V), 알라닌(A), 메티오닌(M), 글루타민(Q) 또는 글리신(G)이고,

X₄는 프롤린(P), 알라닌(A), 티로신(Y) , 세린(S), 시스테인(C) 또는 글리신 (G)이며,

X₅는 프롤린(P), 루신(L), 글리신(G), 또는 시스테인(C)이고,

X₆는 시스테인(C)이며,

n, m 및 o는 독립적으로, 0 또는 1임.

놀랍게도, 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 화합물은 트렁케이션된 Aβ 형태 AβpE3-40/42 및 Aβ3-40/42로 유도되는 항체의 생체내 형성을 유도할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 형성된 항체는 상기 Aβ 단편에 결합하여 Aβ 플라크의 분해를 유도할 수 있다.

본원에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 각각의 항체의 형성을 유도할 수 있도록, 화학식 I 및 II 및 본원에 개시된 모든 기타 펩티드성 분자(peptidic molecules)는 천연 발생 Aβ 펩티드 및 변이체 Aβl- 40/42, AβpE3-40/42, Aβ3-40/42 및 Aβll-40/42를 모방한다.

본원에 제시된 발명은 본래 Aβ 펩티드 서열을 포함하지 않고, 예컨대 WO 2004/062556에 개시된 바와 같은 미모토프에 의해 검출가능하지 않은 네오-에피토프의 구조를 모방한, 항원을 지칭한다. 따라서, 이러한 미모토프-기반 AD 백신은 본원에 언급된 병리학적 Aβ 분자와 독점적으로 반응하지만 APP와 같은 모체 구조(parental structures)와 반응하지 않는 항체 반응을 유도할 것이다. 더욱이, 미모토프는 잠재적 T-세포 셀프-에피토프를 포함하지 않으나, 해로운 자가반응 T-세포의 유도를 회피한다.

본원에서 사용된, "β-아밀로이드증"은 비정상적 중합 및 특정 단백질의 축적, 소위 단백질증에 의해 특징화되는 다양한 퇴행성 질환을 지칭한다. 본 발명은 용어 β-아밀로이드증으로 요약되는 β-아밀로이드 단백질과 연관된 단백질증의 예방, 치료 및 진단에 관한 것이다. β-아밀로이드증의 가장 현저한 형태는 알츠하이머 질환(AD)이다. 다른 예는, 루이소체 치매 및 다운 증후군 중 치매를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 예는 루이소체 치매, 근염, 산발성 봉입체 근염, 아밀로이드증을 동반한 유전적 뇌출혈(더치 타입(dutch type)), 대뇌 아밀로이드 혈관 병증, Aβ 관련 혈관염이다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, "β-아밀로이드증"은 알츠하이머 질환이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 화합물은 IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) 및 IRWDGG(C)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 화합물은 상기 식별된 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는데, 상기 획득한 화합물이 예를 들어, 담체 분자와 결합될 수 있도록 상기 펩티드의 C-말단은 시스테인 잔기(대괄호 사용으로 표시됨)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 물론 상기 펩티드의 N-말단이 시스테인 잔기에 결합하는 것도 가능하다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 아미노산 서열은 IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C) 또는 IRYDMAG(C)이다.

본 발명의 또 다른 양태는 하기 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 화합물의 β- 아밀로이드증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 생산을 위한, 용도에 관한 것이며 이 화합물은 아미노산 서열 EVHHQKL를 포함하는 아밀로이드-베타-펩티드(Aβ)의 에피토프에 특이적인 항체에 대한 결합 능력을 지닌다.:

(화학식 II),

상기 화학식에서,

X₁은 발린(V), 아르기닌(R) 또는 루신(L)이며,

X₂는 아르기닌(R) 또는 글루탐산(E)이고,

X₃은 알라닌(A), 히스티딘(H), 리신(K), 루신(L), 티로신(Y) 또는 글리신(G)이며,

X₄는 프롤린(P), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 글루타민(Q) 또는 시스테인(C)이고,

X₅는 시스테인(C)이며,

n 및 m은 독립적으로, 0 또는 1임.

화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 화합물의 투여는 트렁케이션된 Aβ 형태 Aβ11-40/42에 대한 면역 반응을 불러일으킨다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 화합물은

으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 β-아밀로이드증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 생산을 위한,

으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다.

이러한 화합물 각각은 Aβl-40/42, AβpE3-40/42 및 AB3-40/42으로 유도된 항체의 생체내 형성을 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물은 특히 β-아밀로이드증, 예컨대, AD의 치료 및/또는 예방에 적합한데, 이는 하나의 화합물의 투여는 세가지 주요 Aβ 형태 Aβl-40/42, AβpE3-40/42 및 Aβ3-40/42를 인지할 수 있는 항체의 형성을 유도하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 화합물은

으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드로 이루어지거나 이를 포함한다.

본원에 개시된 아미노산 서열은 아미노산 서열 EFRHDSGY, pEFRHDSGY 또는 EVHHQKL을 포함하는 Aβ의 에피토프의 미모토프가 되는 것으로 여겨진다. 본 발명에 따르면, "미모토프"라는 용어는 이것이 의태(mimic)하는 에피토프와 동등한 토폴로지(topology)를 지닌 형태를 갖는 분자를 지칭한다. 미모토프는 요망되는 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 동일한 항원 결합 영역에 결합한다. 미모토프는 이것이 의태하는 항원에 반응성인 숙주에서 면역학적 반응을 유도해낸다. 또한, 미모토프는 시험관내 억제 검정 (예를 들어, ELISA 억제 검정)에서 이것이 의태하는 에피토프에 대해 경쟁물질로서 작용할 수 있는데, 상기 검정은 상기 에피토프와 이러한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 그러나, 본 발명의 미모토프는 시험관내 억제 검정에서 이것이 의태하는 에피토프의 결합을 반드시 억제하거나 상기 에피토프와 경쟁하지 않을 수는 있지만, 포유동물에게 투여되는 경우 특정 면역 반응을 유도할 수 있다.

본원에서 사용된, 용어 "에피토프"는 특정 항체 분자에 의해 인식되는 항원의 면역원성 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 것이고, 각각은 특정 에피토프를 인식하는 항체에 결합할 수 있다.

본 발명의 미모토프는 분리된 펩티드로서 또는 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 당 분야에 널리 공지된 화학 합성 방법에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 또한, 펩티드 미모토프는 이러한 펩티드 미모토프를 생성하는 미생물에서 생성될 수 있는데, 이러한 미생물에서 생성된 펩티드 미모토프는 후속하여 분리되고 요망되는 경우 추가로 정제된다. 펩티드 미모토프는 세균, 효모 또는 진균과 같은 미생물에서, 포유동물 또는 곤충 세포와 같은 진핵생물 세포에서, 또는 아데노바이러스(adenovirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 심리키 포레스트 바이러스(Simliki forest virus), 바큘로바이러스(baculovirus), 박테리오파아지(bacteriophage), 신드비스 바이러스(sindbis virus) 또는 센다이 바이러스(sendai virus)와 같은 재조합 바이러스 벡터에서 생성될 수 있다. 펩티드 미모토프를 생성시키기 위한 적절한 세균으로는 대장균, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis), 또는 펩티드 미모토프와 같은 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 세균이 있다. 펩티드 미모토프를 발현시키기 위한 적절한 효모 유형으로는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다(Candida), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모가 있다. 상응하는 방법들은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 재조합적으로 생성된 펩티드를 분리하고 정제하는 방법들이 당 분야에 널리 공지되어 있는데, 예로는 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등이 있다.

펩티드 미모토프의 분리를 용이하게 하기 위해, 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있으며, 여기서 펩티드 미모토프는 이종 폴리펩티드에 번역단계에서(translationally) 융합되어(공유결합되어), 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 전형적인 이종 폴리펩티드는 His-Tag (예를 들어, His₆; 6개의 히스티딘 잔기), GST-Tag (글루타티온-S-트랜스퍼라아제) 등이다. 융합 폴리펩티드는 미모토프의 정제를 용이하게 할 뿐만 아니라 정제 동안 미모토프 폴리펩티드가 분해되지 않게 할 수 있다. 정제 후에 이종 폴리펩티드를 제거하는 것이 요망되는 경우, 융합 폴리펩티드는 펩티드 미모토프와 이종 폴리펩티드의 접합부에 절단 부위를 포함할 수 있다. 절단 부위는 그러한 부위에 있는 아미노산에 대해 특이적인 효소 (예를 들어, 프로테아제)로 절단되는 아미노산 서열로 구성된다.

또한, 본 발명의 미모토프는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에서 또는 그 근처에서 시스테인 잔기가 이러한 위치들에 결합되도록 개질될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이황화물 결합을 통해 펩티드를 고리화시키기 위해 말단에 위치한 (펩티드의 N-말단 및 C-말단에 위치함) 시스테인 잔기가 사용된다. 상기 시스테인 잔기는 또한 상기 펩티드/화합물 추가 분자(예를 들어, 담체)에 결합하는 역할을 할 수 있다.

또한, 본 발명의 미모토프는 다양한 검정 및 키트, 특히 면역학적 검정 및 키트에서 사용될 수 있다. 따라서, 미모토프가 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 특히 면역학적 검정에서 리포터로서 사용되는 효소의 일부일 수 있는 것이 특히 바람직하다. 이러한 리포터 효소로는 예를 들어 알칼리 포스파타아제 또는 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 있다.

본 발명에 따른 미모토프는 바람직하게는 이의 아미노산 서열이 Aβ의 아미노산 서열 또는 Aβ의 단편의 아미노산 서열과 상이한 항원성 폴리펩티드이다. 이와 관련하여, 본 발명의 미모토프는 하나 이상의 천연 아미노산 잔기 뿐만 아니라 하나 이상의 비천연 아미노산 (즉, 20개의 "표준" 아미노산이 아닌 아미노산)에 의한 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 전적으로 그러한 비천연 아미노산들로 조립될 수 있다. 더욱이, Aβ1-40/42, AβpE3-40/42, Aβ3-40/42 및 Aβ11-40/42에 대해 유도되어 이들에 결합하는 항체를 유도하는 본 발명의 항원은, D- 또는 L-아미노산으로 조립되거나 DL-아미노산의 조합으로 조립될 수 있고, 임의로 추가의 개질, 고리 닫힘 또는 유도체화에 의해 변화될 수 있다. 적절한 항체 유도성 항원은 상업적으로 이용가능한 펩티드 라이브러리로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 적어도 7개의 아미노산이고, 바람직한 길이는 16개 이하, 바람직하게는 14개 또는 20개 이하의 아미노산 (예를 들어, 5개 내지 16개의 아미노산 잔기)일 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 보다 긴 펩티드가 항체 유도성 항원으로서 매우 잘 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 미모토프는 폴리펩티드의 일부일 수도 있으며, 따라서 이의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 미모토프 (즉, 본 명세서에 기재된 항체 유도성 항원)를 제조하기 위해, 물론 파아지 라이브러리, 펩티드 라이브러리가 또한 적합한데, 이는 예를 들어 조합 화학에 의해 생성되거나 가장 다양한 구조를 위한 고처리량 스크리닝 기술에 의해 수득된다 (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50(6):837-54).

또한, 본 발명에 따르면, 핵산을 기반으로 하는 항-Aβ1-40/42-, -AβpE3-40/42-, -Aβ3-40/42- 및 -Aβ11-40/42-항체 유도성 항원("앱타머(aptamer))이 사용될 수도 있는데, 이들 역시 가장 다양한 (올리고뉴클레오티드) 라이브러리를 사용하여 찾아낼 수 있다 (예를 들어, 2개 내지 180개의 핵산 잔기를 사용함) (예: Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc.). 핵산을 기반으로 하는 항체 유도성 항원의 경우, 핵산 골격은, 예를 들어 천연 포스포르-디에스테르 화합물에 의해, 또는 포스포로티오에이트 또는 조합 또는 화학적 변이 (예를 들어, PNA로서)에 의해 제공될 수 있으며, 여기서 본 발명에 따르면 염기로서 주로 U, T, A, C, G, H 및 mC가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 뉴클레오티드의 2'-잔기는 바람직하게는 H, OH, F, Cl, NH₂, O-메틸, O-에틸, O-프로필 또는 O-부틸이며, 여기서 핵산은 또한 상이하게 개질될 수 있는데, 즉, 올리고뉴클레오티드 합성에서 통상적으로 사용되는 바와 같이 예를 들어 보호기에 의해 상이하게 개질될 수 있다. 따라서, 앱타머를 기반으로 하는 항체 유도성 항원이 또한 본 발명의 범위에 속하는 바람직한 항체 유도성 항원이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH (키호울 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)), 파상풍 톡소이드, 알부민 결합 단백질, 우혈청 알부민, 덴드리머(dendrimer) (MAP; Biol. Chem. 358: 581), 펩티드 링커 (또는 플랭킹(flanking) 영역) 뿐만 아니라 싱(Singh) 등의 문헌 [Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081] (특히, 이러한 문헌의 표 1에 기재된 것들) 및 오하건(O'Hagan) 등의 문헌 [Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735] (특히, 이러한 문헌에 기재된 내인성 면역강화 화합물 및 전달 시스템)에 기재된 애쥬번트 물질, 또는 이들의 혼합물에 커플링된다. 이와 관련하여, 컨쥬게이션 화학 (예를 들어, 이형이작용성(heterobifunctional) 화합물, 예를 들어 GMBS 그리고 물론 또한 문헌 ["Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson]에 기재된 다른 화합물들에 의해 이루어짐)이 당업자에게 공지된 반응으로부터 선택될 수 있다. 더욱이, 백신 조성물은 애쥬번트, 바람직하게는 저용해성(low soluble) 알루미늄 조성물, 특히 수산화 알루미늄을 사용하여 제형화될 수 있다. 물론, MF59 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 사이토카인 (예를 들어, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사포닌 (예를 들어, QS21), MDP 유도체, CpG 올리고, LPS, MPL, 폴리포스파젠, 에멀젼 (예를 들어, 프로인트(Freund's), SAF), 리포솜, 비로솜(virosome), 이스콤(iscom), 코클레이트(cochleate), PLG 미세입자(microparticle), 폴록사머 입자, 바이러스 유사 입자, 열-불안정 엔테로톡신 (LT), 콜레라 독소 (CT), 뮤턴트 독소(mutant toxin) (예를 들어, LTK63 및 LTR72), 미세입자 및/또는 중합 리포솜과 같은 애쥬번트가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 링커를 통해 담체 또는 애쥬번트에 결합되며, 이러한 링커는 NHS-폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO) (예를 들어, NHS-PEO₄-말레이미드)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 화합물 (미모토프)과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신은 임의의 적절한 방식, 예를 들어 피내(i.d.), 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 근내(i.m.), 비내, 경구, 피하 등의 경로에 의해 그리고 임의의 적절한 전달 장치로 투여될 수 있다 (참조: O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). 본 발명의 화합물은 바람직하게는 정맥내, 피하, 피내 또는 근내 투여를 위해 제형화된다 (참조: "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

본 발명에 따른 약제 (백신)은 본 발명에 따른 화합물을 0.1 ng 내지 10 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 1 mg, 특히 100 ng 내지 100 μg, 또는 예를 들어 100 fmol 내지 10 μmol, 바람직하게는 10 pmol 내지 1 μmol, 특히 100 pmol 내지 100 nmol의 양으로 함유한다. 전형적으로, 백신은 보조 물질, 예를 들어 완충액, 안정화제 등을 또한 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 시뉴클레오병증(synucleopathy)의 치료 및/또는 개선 증상을 위한 상기 정의된 화합물의 용도에 관한 것이다.

놀랍게도 본 발명의 화합물이 시뉴클레오병증과 연관된 치료 및 경감 증상에도 이용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

아밀로이드증 및 시뉴클레오병증은 각각 β-아밀로이드 및 α-시뉴클레인의 대뇌 축적과 연관이 있다. 일부 환자는 상기 두 질환의 임상적 및 병리학적 특성을 보이며, 이는 병리학적 경로가 겹칠 가능성을 높인다. 이러한 환자는 또한 루이소체 치매 또는 치매를 동반한 파킨슨 질환(DLB/PDD)과 같이 상술된 새롭게 확인된 증후군을 앓는다. 최근 DLB/PDD에 대한 트랜스제닉 동물 모델에서, 마우스 내 시뉴클레인 및 아밀로이드 전구체 단백질(hAPP) 둘 모두의 과다발현이 인지 발달 및 콜린성 뉴런의 손실과 동반된 운동 근육 변형(motor alterations) 및 시냅스 소포의 감소, 광대한 아밀로이드 플라크 및 haSYN-면역반응성 뉴런내 원섬유 함유물 형성을 유발하는 것으로 나타났다. 이러한 특성 모두 DLB/PDD 증후군에서 또한 관찰된다. 최근, 상기 두 분자는 잠재적으로 상호작용할 수 있고 시험관 내 혼성 올리고머를 형성할 수 있음이 설명되었다. 또한, APP의 과다발현은 α-시뉴클레인 과다발현의 병리학적 효과의 일부분을 악화시킬 수 있다고 나타났다. 대조적으로, α-시뉴클레인은 아밀로이드 베타 펩티드의 독성 및 분비를 강화시킬 수 있고, 따라서 신경 퇴행성 과정에서 겹치는 병원성 경로의 개념을 지지하는, β-아밀로이드의 효과를 증가시킬 수 있었다.

상기 두 단백질증에서, 펩티드 올리고머의 점진적 축적은 시뉴클레오병증 또는 아밀로이드증에 대해 전형적인 다양한 변형을 일으키는, 중앙 독소 사건(central toxic events) 중 하나로 확인되었다. 이러한 기계적 유사점에도 불구하고, α-시뉴클레인 및 Aβ는 뇌의 보전 및 기능에 영향을 미치는 별개이면서 수렴하는 병원성 효과를 갖는 것으로 가정한다. 시뉴클레인은 인지 기능보다 운동 근육 기능에 더 심각한 영향을 미치는 것으로 생각되는 반면, 아밀로이드 β 펩티드는 반대 효과를 갖는 것으로 설명된다. 이러한 불일치 이유는 현재 알려지지 않았으나, 이는 상기 두 분자의 상호 의존성 및 효과의 명확한 설명을 불가능하게 한다.

현재 발명에서 제시된 치료 접근법은 주로 세포외 아밀로이드의 제거를 유도할 것인 Aβ를 표적화하는 면역요법을 설명하고 있다. 따라서, 이 접근법은 플라크 침전에서 신경세포사는 물론 기억력 문제 및 인지 감퇴에 이르는 아밀로이드 연관 변형을 경감시키는 것으로 생각된다. 그러나, 시뉴클레인의 세포 이하의 국소화는, 이러한 세포내 단백질이 시냅스, 특히 시냅스 소포에 가두어진 시냅스에서 작용 주로 활성임을 나타낸다. 흥미로운 것은, 시뉴클레오병증의 병리학적 특징을 일치시키는, 시냅스 축적 또한 주로 세포내적으로 검출가능하다는 것이다. 또한, 병원성 메카니즘 근원의 시뉴클레오병증은 미토콘드리아 기능장애, 비정상적 폴딩의 축적, 고분자량(ubiquitinated) 또는 인산화 단백질은 물론 알파 시뉴클레인의 축적에 이르는, 뉴런 내 변화에 기여하는 것으로 생각된다. 이러한 변형은 그 결과 시냅스 기능, 시냅스 결핍, 및 도파민성 뉴런의 손실 및 시뉴클레오병증의 고전적인 임상 징후를 야기한다. 반면에, Aβ는 뉴런외에서 주로 검출가능하며, 아밀로이드 플라크를 비롯하여, 원섬유, 원시섬유(protofibril) 및 베타 아밀로이드의 올리고머는 세포외적으로 또는 대뇌내적으로 적용된 경우 신경독소 기능을 발휘할 수 있다. 따라서, 주로 세포외 아밀로이드를 표적화하는 접근법이, 하기 상술된 전형적인 증상을 유발하며 주로 세포내 과정에 영향을 미치는 PD와 같은 시뉴클레오병증의 증상을 완화시킬 것이라는 점은 당업자에게 놀라운 발견이다. 더욱 놀라운 것은, 현재 상기 두 분자의 중복되는 효과는 주로 세포내적으로 일어나는 두 단백질의 직접적인 상호작용에 의해 발생된다고 생각된다는 것이다. 본 발명에 따른 용어 "시뉴클레인성 병증(synucleinopathy)"은 병리학적 시뉴클레인 응집에 의해 특징화되는 모든 신경퇴행성 장애를 포함한다. 파킨슨 질환(PD), 루이소체 질환(LBD), 미만성 루이소체 질환(DLBD), 루이소체 치매(DLB), 치매를 동반한 파킨슨병(PDD), 다발성 신경계 위축(Multiple System Atrophy, MSA) 및 뇌 철침착을 동반한 신경퇴행 유형 I(NBIA 유형 I)을 포함하는 몇가지 신경퇴행성 장애는 집합적으로 시뉴클레인성 병증으로 그룹화된다.

본원에서 이용된 "시뉴클레오병증의 증상"은 상기 질환을 앓고 있는 환자의 운동 근육 및 비-운동 근육 양태에 영향을 미치는, 시뉴클레오 병증, 특히 파킨슨 질환의 이러한 증상을 지칭한다. "운동 근육 증상"은 안정시 진전(resting tremor), 운동완서(Bradykinesia), 경직, 체위불안정, 웅크린 자세, 근육긴장이상(dystonia), 피로, 손상된 운동근육 기민성(impaired fine motor dexterity) 및 운동근육 공동 작용(motor coordination), 손상된 대근육 운동기능(impaired gross motor coordination), 운동 부족(팔 진동범위 감소), 정좌불능증(akathisia), 언어 문제, 예컨대, 근육 조절의 결핍에 의해 발생되는 음성의 부드러움 또는 불명료한 언어, 안면 표정의 손실, 또는 "마스킹(masking)", 작은글씨증(micrographia), 연하 곤란(difficulty swallowing), 성적 장애, 침흘림을 포함한다. "비-은동 근육" 증상은 통증, 치매 또는 혼란, 수면 장애, 변비, 피부 문제, 우울, 두려움 또는 불안, 기억 장애 및 생각 둔화, 배뇨 장애, 피곤 및 쑤심, 에너지 손실, 강박행위, 경련 등을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 시뉴클레오병증은 파킨슨 질환, 루이소체 치매, 다발성 신경계 위축 및 뇌 철 침착을 동반한 신경퇴행으로 이루어진 군에서 선택된다. 특히 바람직한 것은 파킨슨 질환이다.

본 발명의 또 다른 양태는

로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나 서열을 갖는 펩티드에 관한 것이다. 괄호의 사용으로 나타냈듯이, 본 발명의 펩티드는 C- 또는 N-말단에 시스테인 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그 결과, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 또한 포함한다:

.

바람직한 구체예에 따르면, 상기 펩티드는 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH(키호울 림펫 헤모시아닌)과 결합된다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 다른 펩티드를 하나 이상 포함하는, 약학적 제형, 바람직하게는 백신에 관한 것이다. 상기 약학적 제형은 알츠하이머 질환을 포함하는 β-아밀로이드증을 앓고 있는 개인을 치료하거나, 개인 내 Aβ-플라크의 형성을 방해하여 알츠하이머 질환을 포함하는 β-아밀로이드증의 형성을 예방하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 추가적으로 하기 도면 및 실시예에서 설명될 것이나, 이것에 제한되지 않는다.

도 1은 모노클로날 항체 MV-001이 특정 펩티드 및 재조합 단백질에 결합하는 것을 도시한다.
도 2는 모노클로날 항체 MV-003이 특정 펩티드 및 재조합 단백질에 결합하는 것을 도시한다.
도 3은 모노클로날 항체 MV-004가 특정 펩티드 및 재조합 단백질에 결합하는 것을 도시한다.
도 4는 β-아밀로이드 및 N-말단 트렁케이션되고/되거나 번역후 개질된 β-아밀로이드 단편에 대한 미모토프를 사용하는 전형적인 결합 검정을 도시한다.
도 5는 β-아밀로이드 및 N-말단 트렁케이션되고/되거나 번역후 개질된 β-아밀로이드 단편에 대한 미모토프를 사용하는 전형적인 억제 검정을 도시한다.
도 6은 미모토프 백신접종 (주입된(injected) 펩티드/무관한(irrelevant) 펩티드)에 의해 유도되는 면역 반응의 생체내 특성규명에 관한 예를 도시한다
도 7은 아밀로이드 베타 단편에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유도되는 면역 반응의 생체내 특성규명에 관한 예를 도시한다.
도 8은 전장 Aβ40/42에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유도되는 면역 반응의 생체내 특성규명에 관한 예를 도시한다.
도 9는 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적을 도시한다. 수산화 알루미늄(ALUM)이 애쥬번트로 첨가된 미모토프 백신을 사용하여 Tg2576을 1개월 간격으로 피하(s.c.) 접종에 의해 6회 주입하였다. 대조 마우스에는 단지 PBS-ALUM을 투여하였다. 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적은 대조군에 대한 퍼센트로서 도시된다. Gr1... 대조군; Gr2... p4381 투여군; Gr3... p4390 투여군; Gr4... p4715 투여군.
도 10은 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적을 도시한다. 수산화 알루미늄(ALUM)이 애쥬번트로 첨가된 AFFITOPE 백신을 사용하여 Tg2576을 1개월 간격으로 피하 접종에 의해 6회 주입하였다. 대조 마우스에는 단지 PBS-ALUM을 투여하였다. 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적은 대조군에 대한 퍼센트로서 도시된다. Gr1... 대조군; Gr2... p4395 투여군.

실시예 :

방법

본 발명에 따라 미모토프 확인을 위해 사용되는 항체는 인간 Aβ로부터 유래된 아미노산을 검출하지만 전장 인간 APP에는 결합하지 않는다. 검출된 서열로는 EFRHDS (= Aβ의 본래의 에피토프 아미노산(aa)3-8), p(E)FRHDS (= Aβ의 본래의 에피토프 aa3-8의 변형물), EVHHQK(= Aβ의 본래의 에피토프 aa11-16)가 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 제조물 또는 이의 임의의 항체 부분 또는 유도체일 수 있는데, 유일한 전제조건은 그러한 항체 분자가 상기 언급된 에피토프들 (인간 Aβ로부터 유래됨) 중 하나 이상을 특이적으로 인식하지만 전장 인간 APP에는 결합하지 않는다는 것이다.

상기 모노클로날 항체 및 펩티드 라이브러리를 사용하여 미모토프를 확인하고, 이를 추가로 특성규명하였다.

실시예 1: β-아밀로이드 및 N-말단 트렁케이션되고 /거나 번역후 개질된 β-아밀로이드 단편을 특이적으로 검출하기 위한 모노클로날 항체의 생성.

실시예 1a: 모노클로날 항체 MV -001의 생성

실험 Alz-5의 융합체로부터 유래되는 모노클로날 항체를 생성시켰다: 실험 Alz-5에서, 애쥬번트로서의 KLH(키호울 림펫 헤모시아닌)과 Alum(수산화 알루미늄)에 커플링된 본래의 Aβ 에피토프 DAEFRHDSGYC를 사용하여 C57/Bl6 마우스를 반복적으로 면역접종하였다. p4371-펩티드 특이적인 항체-생산 하이브리도마를 ELISA (p1253- 및 p4371-펩티드 코팅된 ELISA 플레이트)에 의해 검출하였다. 인간 Aβ40/42 (재조합 단백질)를 양성 대조 펩티드로서 사용하였고, ELISA 플레이트상에 고정된 상기 재조합 단백질을 인식하는 하이브리도마를 포함시켰는데, 이는 이러한 하이브리도마가 펩티드 및 전장 Aβ 둘 모두와 특이적으로 결합하기 때문이다. P1454 (인간 Aβ 33-40)를 음성 대조 펩티드로서 사용하였다. 또한, p4373에 대해 하이브리도마를 시험하였다. p4373에 결합하지 않거나 제한적으로 결합하는 하이브리도마만을 후속 항체 개발에 사용하였다.

하이브리도마 클론 MV-001 (내부 명칭 824; IgG1)을 정제하고, p1253, p4371, p4373, p1454 및 Aβ 각각의 특이적 검출에 대해 검정하였다. MV-001은 ELISA에서 주입된 에피토프 (p1253) 뿐만 아니라 특정 에피토프 (p4371) 그리고 전장 Aβ 단백질 (재조합 단백질; 바켐 아게(Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)로부터 입수됨)를 인식하였다. 그러나, 이는 ELISA에서 p1454를 검출하지 못했다. 또한, MV-001 항체는 기본적으로 Aβ3-10의 피로글루타메이트 변형체를 엔코딩하는 펩티드 p4373을 검출해내지 못했다 (역가가 본래의 에피토프보다 30배 낮음).

실시예 1b: 모노클로날 항체 MV -003의 생성

실험 Alz-16의 융합체로부터 유래되는 모노클로날 항체를 생성시켰다: 실험 Alz-16에서, 애쥬번트로서의 KLH (키호울 림펫 헤모시아닌)과 Alum (수산화 알루미늄)에 커플링된 에피토프 p(E)FRHDSC (p4373)를 사용하여 BalbC 마우스를 반복적으로 면역접종하였다. p4373-펩티드 특이적인 항체-생산 하이브리도마를 ELISA (p4373-펩티드 코팅된 ELISA 플레이트)에 의해 검출하였다. p1253, p1454 및 Aβ40/42를 음성 대조 펩티드로서 사용하였다. 또한, p4371에 대해 하이브리도마를 시험하였다. 피로글루타메이트 특이성을 보장하기 위해 p4371에 결합하지 않거나 제한적으로 결합하는 하이브리도마만을 후속 항체 개발에 사용하였다.

하이브리도마 클론 MV-003 (내부 명칭 D129; IgG1)을 정제하고, p1253, p4371, p4373, p1454 및 Aβ 각각의 특이적 검출에 대해 검정하였다. MV-003은 ELISA에서 주입된 에피토프 (p4373)을 인식하였지만 p1454, p1253 또는 전장 Aβ 단백질 (재조합 단백질; 바켐 아게(Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)로부터 입수됨)를 인식해내지 못하였다. 또한, MV-003 항체는 Aβ3-10의 정상적인 형태를 엔코딩하는 펩티드 p4371을 검출해내지 못했다 (역가가 본래의 에피토프보다 15배 낮음).

실시예 1c: 모노클로날 항체 MV -004의 생성

실험 Alz-15의 융합체로부터 유래되는 모노클로날 항체를 생성시켰다: 실험 Alz-15에서, 애쥬번트로서의 KLH (키호울 림펫 헤모시아닌)과 Alum (수산화 알루미늄)에 커플링된 에피토프 EVHHQKC (p4372)를 사용하여 BalbC 마우스를 반복적으로 면역접종하였다. p4372-펩티드 특이적인 항체-생산 하이브리도마를 ELISA (p4372-펩티드 코팅된 ELISA 플레이트)에 의해 검출하였다. P4376, p4378, p1454 및 Aβ40/42를 음성 대조 펩티드로서 사용하였다. aa11 위치에 있는 유리 N-말단에 대한 특이성을 보장하기 위해 p4376과 p4378에 결합하지 않거나 제한적으로 결합하는 하이브리도마만을 후속 항체 개발에 사용하였다.

하이브리도마 클론 MV-004 (내부 명칭 B204; IgG1)을 정제하고, p4372, p4376, p4378, p1454 및 Aβ 각각의 특이적 검출에 대해 검정하였다. MV-004는 ELISA에서 주입된 에피토프 (p4372)를 인식하였지만 p1454, p4376 및 p4378 뿐만 아니라 전장 Aβ 단백질 (재조합 단백질; 바켐 아게(Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)로부터 입수됨)을 검출해내지 못했다. p4376, p4378을 검출해내지 못한 것은 트렁케이션된 Aβ의 aa11 위치에 있는 유리 N-말단에 대한 특이성을 입증한다.

실시예 2: 파아지 디스플레이, 시험관내 결합 및 억제 ELISA

본 실시예에서 사용된 파아지 디스플레이 라이브러리는 다음과 같았다: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (선형 7량체 라이브러리). 파아지 디스플레이를 제조업자의 프로토콜 (www.neb.com)에 따라 이루어졌다.

2회 또는 3회의 후속 패닝(panning) 라운드 후에, 단일 파아지 클론들을 골라내고, 파아지 상층액을 패닝 절차에 사용되는 항체로 코팅된 플레이트상에서 ELISA에 적용하였다. 이러한 ELISA에서 양성인 파아지 클론 (표적에 대해서는 강한 신호를 나타내지만 비특이적 대조표준에 대해서는 신호를 나타내지 않음)을 시퀀싱하였다. DNA 서열로부터, 펩티드 서열을 추론하였다. 이러한 펩티드를 합성하고, 결합 및 억제 ELISA로 특성규명하였다. 또한, 미모토프 백신접종을 위한 컨센서스(consensus)의 서열 확인을 뒷받침하기 위해 스크리닝에서 확인된 미모토프로부터의 서열 정보를 조합함으로써 얼마간의 신규한 미모토프를 생성하였다.

1. 시험관내 결합 검정 (ELISA)

파아지 디스플레이로부터 유래된 펩티드 뿐만 아니라 이의 변이체를 BSA에 커플링시키고 ELISA 플레이트에 결합시킨 후 (1μM; 각각의 도면에 나타나 있는 바와 같음), 확인된 펩티드의 결합 능력을 검정하기 위해 스크리닝 절차에 사용된 모노클로날 항체와 인큐베이션하였다.

2. 시험관내 억제 검정 (ELISA)

파아지 디스플레이로부터 유래되는 다양한 양의 펩티드 (10 μg 내지 0.08μg의 농도; 연속 희석)를, 스크리닝 절차에 사용되는 모노클로날 항체와 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트상에 코팅된 본래의 에피토프에 항체가 후속하여 결합하는 것을 감소시키는 펩티드가 이러한 검정에서 억제성인 것으로 간주되었다.

실시예 3: 미모토프의 생체내 시험: 면역원성과 교차반응성의 검정

1. 미모토프의 생체내 시험

억제성 펩티드 뿐만 아니라 비억제성 펩티드를 KLH에 커플링시키고, 적절한 애쥬번트 (수산화 알루미늄)와 함께 마우스내로 주입하였다 (야생형 C57/Bl6 마우스; 옆구리에 피하 주입함). 동물들을 2주 간격으로 3회 내지 6회 백신접종하고, 혈청을 또한 2주에 1회 채취하였다. 주입된 펩티드에 대한 역가 뿐만 아니라 무관한 펩티드에 대한 역가를 모든 혈청에 대해 측정하였다. 또한, 재조합 인간 Aβ 단백질에 대한 역가 그리고 본래의 펩티드에 대한 역가를 각각 측정하였다. 일반적으로, 우혈청 알부민(BSA)에 커플링된 펩티드 그리고 ELISA 플레이트상에 고정된 재조합 전장 단백질에 대한 반응에 의해 혈청을 검정하였다. 항-마우스 IgG 특이적 항체를 사용하여 역가를 측정하였다. 상세한 결과에 대해서는, 도 6, 7 및 8 을 각각 참조할 수 있다.

2. 결과

2.1. n-말단 트렁케이션된 개질된 형태의 Aβ에 대해 유도된 특정 모노클로 날 항체 ( mAB )의 확인:

도 1은 전장 Aβ 및 위치 E3에서 트렁케이션된 Aβ에 대해 특이성을 나타내는, 실험 Alz-5로부터 유래된 모노클로날 항체 MV-001(내부 명칭 824; IgG1)의 특성규명을 도시한다.

도 2는 위치 p(E)3에서 트렁케이션된 번역후 개질된 Aβ에 대해 특이성을 나타내는, 실험 Alz-16로부터 유래된 모노클로날 항체 MV-003(내부 명칭 D129; IgG1)의 특성규명을 도시한다.

도 3은 위치 E11에서 트렁케이션된 Aβ에 대해 특이성을 나타내는, 실험 Alz-15에서 유래된 모노클로날 항체 MV-004(내부 명칭 B204; IgG1)의 특성규명을 도시한다.

2.2. n-말단 트렁케이션된 개질된 형태의 Aβ에 대해 유도된 특정 mAB 를 사용하는 스크리닝:

2.2.1. 파아지 디스플레이 라이브러리 Ph .D. 7

2.2.1.1. p4373 에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용하는 스크리닝

본 스크리닝에서 PhD 7 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 8개 서열을 확인하였다: 표 1A는 확인된 펩티드들 그리고 이들 펩티드들의 결합 능력을 본래의 에피토프와 비교하여 요약한 것이다.

2.2.1.2. p4372 에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용하는 스크리닝

본 스크리닝에서 PhD 7 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 9개 서열을 확인하였다: 표 1B는 확인된 펩티드들 그리고 이들 펩티드들의 결합 능력을 본래의 에피토프와 비교하여 요약한 것이다.

2.2.1.3. p4371 에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용하는 스크리닝

본 스크리닝에서 PhD 7와 PhD12 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 71개 서열을 확인하였다: 표 1C는 확인된 펩티드와 본래의 에피토프와 비교한 이들 펩티드들의 결합 능력을 요약한 것이다.

표 1A의 범례: 결합 능력은 하기 결합 코드에 의해 코딩된다: 1:X는 모 AB에 대한 희석률을 나타낸다.

표 1B의 범례: 결합 능력은 하기 결합 코드에 의해 코딩된다: 1:X는 모 AB에 대한 희석률을 나타낸다.

표 1C의 범례: 결합 능력은 하기 결합 코드에 의해 코딩된다: 1:X는 모 AB에 대한 희석률을 나타낸다.

2.3. n-말단 트렁케이션되고 개질된 형태의 Aβ에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용하는 파아지 디스플레이 라이브러리 스크리닝에서 확인된 미모토프의 시험관내 특성규명:

도 4와 5는 시험관내에서 미모토프의 특성규명을 위해 사용된 결합 및 억제 검정에 관한 대표적인 예들을 제시한다. 획득된 데이터는 각각 표 1과 2에 요약되어 있다.

MV-003 미모토프: 제시된 8개 서열로부터, 6개 서열이 시험관내 경쟁 실험에서 p(E) 3-7Aβ 특이적 모노클로날 항체의 결합을 억제한다: 추가의 2개 서열은 시험관내 경쟁 실험에서 모노클로날 항체의 결합을 억제하지 않지만, 여전히 모 항체에 대한 결합 능력을 보유하는 것으로 확인되었다(표 2A).

MV-004 미모토프: 제시된 9개 서열 모두가 시험관내 경쟁 실험에서 위치 E1l에서 트렁케이션된 Aβ의 유리 N-말단과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 결합을 억제한다: (표 2B).

MV-OO1 미모토프: 제시된 71개 서열로부터 27개의 서열이 시험관내 경쟁 실험에서 위치 E3에서 트렁케이션된 Aβ에 대해 특이적으로 유도된 모노클로날 항체의 결합을 억제한다: 추가의 44개 서열은 시험관내 경쟁 실험에서 모노클로날 항체의 결합을 억제하지 않지만, 여전히 모 항체에 대한 결합 능력을 보유하는 것으로 확인되었다(표 2C).

표 2: 억제 검정에서 포지티브한 결과를 제시하는 본 발명에서 확인된 미모토프

표 2A의 범례: 억제 능력은 하기 코드에 의해 코딩된다: 약한 억제는 본래의 에피토프의 경우 보다 AB 결합을 저하시키기 위해 더 많은 펩티드가 요구된다는 것을 의미하고; 강한 억제는 AB 결합을 저하시키기 위해 미모토프와 본래의 에피토프에 대해 유사한 펩티드 양이 요구된다는 것을 의미한다. 미모토프는 표준으로써 본래의 펩티드와 비교된다. 본 검정에 사용한 10㎍ 펩티드의 OD를 이용하여 본래의 펩티드에 대한 경쟁 능력을 계산한다.

표 2B의 범례: 억제 능력은 하기 코드에 의해 코딩된다: 약한 억제는 본래의 에피토프의 경우 보다 AB 결합을 저하시키기 위해 더 많은 펩티드가 요구된다는 것을 의미하고; 강한 억제는 AB 결합을 저하시키기 위해 미모토프와 본래의 에피토프에 대해 유사한 펩티드 양이 요구된다는 것을 의미한다. 미모토프는 표준으로써 본래의 펩티드와 비교된다. 본 검정에 사용한 10㎍ 펩티드의 OD를 이용하여 본래의 펩티드에 대한 경쟁 능력을 계산한다.

표 2C의 범례: 억제 능력은 하기 코드에 의해 코딩된다: 약한 억제는 본래의 에피토프의 경우 보다 AB 결합을 저하시키기 위해 더 많은 펩티드가 요구된다는 것을 의미하고; 강한 억제는 AB 결합을 저하시키기 위해 미모토프와 본래의 에피토프에 대해 유사한 펩티드 양이 요구된다는 것을 의미한다. 미모토프는 표준으로써 본래의 펩티드와 비교된다. 본 검정에 사용한 10㎍ 펩티드의 OD를 이용하여 본래의 펩티드에 대한 경쟁 능력을 계산한다.

2.4. n-말단 트렁케이션되고 개질된 형태의 Aβ에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용하는 파아지 디스플레이 라이브러리 스크리닝에서 확인된 미모토프의 생체내 특성규명:

암컷 C57/b16 마우스(그룹당 마우스 5-6마리)를 KLH에 커플링된 30μg의 펩티드로 피하적으로 면역접종하였다. 대조군에게는 각각 본래의 에피토프-KLH 컨쥬게이트를 투여하였다. 애쥬번트로써 명반(alum)을 사용하였다(마우스당 항상 1 mg). 투여한 펩티드 모두는 특이적으로 모노클로날 항체에 결합할 수 있었지만, 펩티드들 중 일부는 시험관내에서(시험관내 억제 검정에서) 본래의 에피토프가 이의 모 항체에 결합하는 것을 억제하지 못했다. 항체 역가를 결정하기 위한 시험관내 ELISA 검정을 2주 간격으로 각각의 백신접종후 단일 마우스의 혈청을 사용하여 수행하였다 (각각 도 6과 7을 참조). ELISA 플레이트의 웰을 미모토프-BSA 컨쥬게이트 및 무관한(irrelevant) 펩티드-BSA 컨쥬게이트(음성 대조표준)로 코팅시켰다. 모 항체와 상기 각각의 미모토프-BSA 컨쥬게이트를 반응시킴으로써 양성 대조표준 실험을 수행하였다. 항-마우스 IgG로 검출을 수행하였다. 추가로, 재조합 단백질을 ELISA 플레이트 상에 고정시키고 그에 맞춰 혈청을 반응시켰다. 도 6 내지 8은 생체내에서 미모토프의 특성규명을 위해 이용한 검정의 대표적인 예를 보여준다.

도 6은 주입된 펩티드 그리고 관련없는 서열을 함유하는 무관한 펩티드에 대한 면역 반응을 검정함으로써 미모토프 백신접종에 의해 유발되는 면역 반응을 생체내 특성규명하는 것에 관한 예를 제시한다. 제시된 3가지 예 모두에서, 본래의 에피토프와 미모토프는 주입된 펩티드에 대한 면역 반응을 유발시키지만, 관련없는 서열(p1454)에 대해서는 적절한 면역 반응을 유도해내지 못했다.

MV-003-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4373과 미모토프 p4395, p4396, p4397 및 p4399이 도 6A에 도시되어 있다. 모든 백신은 이들 각각의 미모토프에 대하여 유사한 면역 반응을 유발시킨다. 본래의 에피토프 p4373-백신으로 처리된 동물들 및 미모토프 p4395, p4396, p4397 또는 p4399-백신으로 처리된 동물들 모두가 무관한 펩티드 p1454에 대하여 적절한 역가를 유발시키지 못한다 (주입된 펩티드보다 11배 내지 25배 더 적음).

MV-004-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4372와 미모토프 p4417, p4418, p4419 및 p4420이 도 6B에 도시되어 있다. 모든 백신은 이들 각각의 미모토프에 대하여 유사한 면역 반응을 유발시킨다. 본래의 에피토프 p4372-백신으로 처리된 동물들 및 미모토프 p4417, p4418, p4419 및 p4420-백신으로 처리된 동물들 모두가 무관한 펩티드 p1454에 대하여 적절한 역가를 유발시키지 못한다 (주입된 펩티드보다 20배 내지 80배 더 적음).

MV-001-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4371과 미모토프 p4381, p4382 및 p4390이 도 6C에 도시되어 있다. 모든 백신은 이들 각각의 미모토프에 대하여 유사한 면역 반응을 유발시킨다. 본래의 에피토프 p4371-백신으로 처리된 동물들 및 미모토프 p4381, p4382 및 p4390-백신으로 처리된 동물들 모두가 무관한 펩티드 p1454에 대하여 적절한 역가를 유발시키지 못한다 (주입된 펩티드보다 10배가 넘게 더 적음).

도 7은 모 항체의 각각의 본래의 에피토프 뿐만 아니라 Aβ의 다른 형태의 트렁케이션된 종에서 유래된 펩티드에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유발된 면역 반응의 생체내 특성규명에 대한 예를 제시한다.

MV-003-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4373와 미모토프 p4395, p4396, p4397 및 p4399이 도 7A에 도시되어 있다. 제시된 미모토프 백신중 3/4이 본래의 에피토프 p4373에 대한 검출가능한 면역 반응을 유발한다. p4371에 의해 디스플레이되는 바와 같이 비개질된 형태에 대한 교차 반응성을 검정하는 경우 유사한 현상을 관찰할 수 있다. 본래의 에피토프 p4373-백신 및 미모토프 백신의 2/4가 p4371에 대해 적절한 역가를 유발하였다. 놀랍게도, p4373에 특이적으로 결합하는, MV-003에 의해 선별된 미모토프가 비개질된 형태의 본래의 에피토프와 교차 반응하는 면역 반응을 또한 유도한다.

MV-004-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4372와 미모토프 p4417, p4418, p4419 및 p4420이 도 7B에 도시되어 있다. 제시된 미모토프 백신 중 3/4이 본래의 에피토프 p4372에 대한 검출가능한 면역 반응을 유발하였다.

MV-001-미모토프에 대한 예로서, 본래의 에피토프 p4371와 미모토프 p4381, p4382 및 p4390이 도 7C에 도시되어 있다. 도시된 미모토프 백신 모두가 본래의 에피토프 p4371에 대해 검출가능한 면역 반응을 유발하였다. p4373에 의해 디스플레이되는 바와 같이 피로글루타메이트-개질된 형태에 대한 교차 반응성을 검정하는 경우 MV-003 유래된 미모토프에 관하여 기술한 것과 유사한 현상을 관찰할 수 있다. 본래의 에피토프 p4371-백신 및 모든 미모토프 백신이 p4373에 대해 적절한 역가를 유발하였다. 놀랍게도, p4371에 특이적으로 결합하는, MV-001에 의해 선별된 미모토프는 본래의 에피토프 유도된 면역 반응 또는 모 항체보다 본래의 에피토프의 개질된 형태와 더 많이 교차 반응하는 면역 반응을 유발한다. 따라서, 이러한 미모토프는 놀랍게도 면역 반응을 유도해낼 수도 있지만 반드시 모 항체보다 더욱 광범위한 면역 반응을 유도하는 것은 아니며, Aβ 형태의 더욱 광범위한 표적화에 사용될 수 있다.

도 8은 전장 Aβ에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유발된 면역 반응의 생체내 특성규명에 대한 예를 제시한다. 놀랍게도, MV-001과 MV-003을 사용함으로써 선별된 미모토프는, 항체들을 생성시키기 위해 사용된 트렁케이션되거나 개질된 짧은 에피토프와의 교차 반응을 유도할 뿐만 아니라, 본래의 서열만큼 양호하거나 p4371/p4373보다 훨씬 더 효율적으로 비개질된 형태의 전장 Aβ에 대해 교차 반응성을 유도한다. MV-002 본래의 에피토프 뿐만 아니라 확인된 미모토프의 경우, 그러한 교차 반응성은 검출될 수 없는데, 이는 비개질된 Aβ11-40/42의 유리 N-말단으로 항체의 특이성이 전이됨을 입증한다. 따라서, 본 발명에 제시된 미모토프는 AD 환자의 뇌에서 확인된 바와 같이 광범위한 천연 Aβ 펩티드 형태를 표적화하기 위한 최적화된 백신 후보체를 구성한다. 상기 형태는 각각 Aβ1-40/42, 및 N-말단 트렁케이션된 형태, 예컨대 Aβ3-40/42, Aβ(pE) 3-40/42 및 비개질된 Aβ11-40/42를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

표 4와 5에는 MV-001와 MV-003 유래된 미모토프를 사용하여 전장 Aβ에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유발된 면역 반응의 추가 예가 기재되어 있다.

표 4에 나열된 모든 펩티드는 전장 및/또는 트렁케이션된 개질된 형태의 Aβ 또는 이의 단편에 대한 특이적 면역 반응을 유발한다.

표 5에 나열된 모든 펩티드는 전장 및/또는 트렁케이션된 개질된 형태의 Aβ 또는 이의 단편에 대한 특이적 면역 반응을 유발한다.

2.5: 트랜스제닉 동물에서 AD 유사 질병을 경감시키는 효능에 관한 미모토프의 생체내 특성규명

Tg2576 AD 마우스 모델을 사용하여 미모토프 백신의 전임상 효능을 연구하였다. 이러한 트랜스제닉 계통은 당해 단백질의 과발현을 야기시키는 햄스터 프리온 단백질(PrP) 프로모터의 조절하에서 aa 위치 670/671에서 Swedish 이중 돌연변이를 지니는 인간 APP를 발현시킨다. 이 모델은 현재 AD 연구에서 가장 광범위하게 사용되는 모델 중의 하나이다. Tg2576 모델은 질병-특이적 아밀로이드 플라크 침착 및 성상교세포증(astrocytosis)을 포함하는 AD 병리현상의 다양한 특질(hallmark)을 재현한다. 현재까지 이용가능한 다른 모든 AD 모델 시스템과 같이, 이는 AD의 모든 주요 신경병리학적 특징을 나타내지 않는다.

미모토프를 사용한 처리가 뇌내 Aβ 축적을 막을 수 있는지 여부를 평가하기 위해, Tg2576 마우스에게 ALUM에 흡착된 펩티드-KLH 컨쥬게이트(애쥬번트: 수산화알루미늄) 또는 ALUM에 흡착된 PBS (PBS 또는 대조표준으로 지칭됨) 단독을 1개월 간격으로 6회 피하 주사하였다. 마지막 면역접종후 8주째까지, 동물들을 절명시키고, 이들의 뇌를 수거하고 이들의 Aβ 로드(load)(AD-유사 질병)를 검정하였다. 마우스를 깊은 마취하에서 절명시켰다. 후속하여, 뇌를 분리하고, 4% PFA에서 고정시키고, 단계적(graded) 에탄올 시리즈로 탈수시키고 난 다음 크실렌에서 인큐베이션시키고 파라핀 포매(embedding)를 진행하였다. 각각의 파라핀-포매된 뇌를 슬라이싱 마이크로톰(slicing microtome)을 사용하여 7μM에서 절편화하고, 절편을 유리 슬라이드상에 마운팅하였다.

Tg2576 동물에서 AD-유사 질병을 검정하기 위한 방법으로써, 처리된 동물의 뇌내의 아밀로이드 침착물이 차지하는 상대 면적을 검정하였다. 이 검정을 자동화된 면적 인식 프로그램을 사용하여 수행하였다. 플라크를 확인하기 위해, 절편을 모노클로날 항체(mAb) 3A5(Aβ40/42에 대해 특이적임)로 염색하였다. 미모토프 처리된 동물들을 대조 동물들과 비교하였다. 모든 동물들은 13.5 내지 14월령에서 절명시켰다. 이 검정의 경우, 동물 당 피질과 해마를 커버하는 3개의 슬라이드를 선택하고, mAb 3A5로 염색하고, 후속하여 Mirax-system(Zeiss)을 사용하여 기록하였다. 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적의 계산을 위해, 슬라이드당 최대 4개의 개개의 절편을 검정하였고, 조직 가공물(tissue artefact) 및 비정상적 염색 강도를 지니는 절편들은 결과 사진을 검사한 후 제외시켰다.

MVOO1에서 유래한 미모토프의 경우, 3개의 예시적인 후보체를 사용한 면적 검정을 수행하였다: 펩티드-KLH 컨쥬게이트 백신을 사용하여 반복 백신접종한 후 검정을 수행하였다. 미모토프로 처리된 동물들 각각에 대한 0.11%, 0.14% 및 0.22%와 비교하여 대조군은 0.35%의 평균 점유율을 나타내었다. 이것은 미모토프 처리후, 그룹 2에서의 67% 감소, 그룹 3에서의 60% 감소, 및 그룹 4에서의 36% 감소에 상응한다 (도 9 참조).

MV003 유래된 미모토프 그룹에 대하여 유사한 사진을 확인할 수 있다. 본원에는 p4395의 예가 도시되어 있다. MVOO1 유래된 미모토프에 관하여 기재한 것과 같이, 펩티드-컨쥬게이트 백신접종후 아밀로이드 플라크가 차지하는 면적의 검정을 수행하였다. 미모토프 처리된 동물들 각각에 대한 0.21%와 비교하여 대조군은 0.35%의 평균 점유율을 나타내었다. 이것은 미모토프 처리후, 그룹 2에서의 38% 감소에 상응한다 (도 19 참조) .

따라서, 이 데이터 세트는 트랜스제닉 동물에서 AD 유사 질병에 대한 미모토프 백신 처리의 유익한 효과를 명백하게 제시한다.

SEQUENCE LISTING <110> Affiris AG <120> Compounds for treating diseases <130> R 54219 <140> PCT/AT2009/000236 <141> 2009-06-12 <150> AT A 951/2008 <151> 2008-06-12 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 1 Ile Arg Trp Asp Thr Pro Cys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 2 Val Arg Trp Asp Val Tyr Pro Cys 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 3 Ile Arg Tyr Asp Ala Pro Leu Cys 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 4 Ile Arg Tyr Asp Met Ala Gly Cys 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 5 Ile Arg Trp Asp Thr Ser Leu Cys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 6 Ile Arg Trp Asp Gln Pro Cys 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 7 Ile Arg Trp Asp Gly Cys 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 8 Ile Arg Trp Asp Gly Gly Cys 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 9 Glu Val Trp His Arg His Gln Cys 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 10 Glu Arg Trp His Glu Lys His Cys 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 11 Glu Val Trp His Arg Leu Gln Cys 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 12 Glu Leu Trp His Arg Tyr Pro Cys 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 13 Glu Leu Trp His Arg Ala Phe Cys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 14 Glu Leu Trp His Arg Ala Cys 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 15 Glu Val Trp His Arg Gly Cys 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 25 Ser Ala Phe Arg His His Cys 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 26 Leu Pro Phe Arg His Gly Cys 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 27 Ser His Phe Arg His Gly Cys 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 28 Ile Leu Phe Arg His Gly Cys 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 29 Gln Phe Lys His Asp Leu Cys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 30 Asn Trp Phe Pro His Pro Cys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 31 Glu Glu Phe Lys Tyr Ser Cys 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 32 Asn Glu Leu Arg His Ser Thr Cys 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 33 Gly Glu Met Arg His Gln Pro Cys 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 34 Asp Thr Tyr Phe Pro Arg Ser Cys 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 35 Val Glu Leu Arg His Ser Arg Cys 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 36 Tyr Ser Met Arg His Asp Ala Cys 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 37 Ala Ala Asn Tyr Phe Pro Arg Cys 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 38 Ser Pro Asn Gln Phe Arg His Cys 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 39 Ser Ser Ser Phe Phe Pro Arg Cys 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 40 Glu Asp Trp Phe Phe Trp His Cys 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 41 Ser Ala Gly Ser Phe Arg His Cys 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 42 Gln Val Met Arg His His Ala Cys 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 43 Ser Glu Phe Ser His Ser Ser Cys 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 44 Gln Pro Asn Leu Phe Tyr His Cys 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 45 Glu Leu Phe Lys His His Leu Cys 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 46 Thr Leu His Glu Phe Arg His Cys 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 47 Ala Thr Phe Arg His Ser Pro Cys 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 48 Ala Pro Met Tyr Phe Pro His Cys 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 49 Thr Tyr Phe Ser His Ser Leu Cys 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 50 His Glu Pro Leu Phe Ser His Cys 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 51 Ser Leu Met Arg His Ser Ser Cys 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 52 Glu Phe Leu Arg His Thr Leu Cys 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 53 Ala Thr Pro Leu Phe Arg His Cys 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 54 Gln Glu Leu Lys Arg Tyr Tyr Cys 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 55 Thr His Thr Asp Phe Arg His Cys 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 56 Leu His Ile Pro Phe Arg His Cys 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 57 Asn Glu Leu Phe Lys His Phe Cys 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 58 Ser Gln Tyr Phe Pro Arg Pro Cys 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 59 Asp Glu His Pro Phe Arg His Cys 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 60 Met Leu Pro Phe Arg His Gly Cys 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 61 Ser Ala Met Arg His Ser Leu Cys 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 62 Thr Pro Leu Met Phe Trp His Cys 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 63 Leu Gln Phe Lys His Ser Thr Cys 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 64 Ala Thr Phe Arg His Ser Thr Cys 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 65 Thr Gly Leu Met Phe Lys His Cys 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 66 Ala Glu Phe Ser His Trp His Cys 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 67 Gln Ser Glu Phe Lys His Trp Cys 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 68 Ala Glu Phe Met His Ser Val Cys 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 69 Ala Asp His Asp Phe Arg His Cys 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 70 Asp Gly Leu Leu Phe Lys His Cys 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 71 Ile Gly Phe Arg His Asp Ser Cys 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 72 Ser Asn Ser Glu Phe Arg Arg Cys 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 73 Ser Glu Leu Arg His Ser Thr Cys 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 74 Thr His Met Glu Phe Arg Arg Cys 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 75 Glu Glu Leu Arg His Ser Val Cys 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 76 Gln Leu Phe Lys His Ser Pro Cys 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 77 Tyr Glu Phe Arg His Ala Gln Cys 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 78 Ser Asn Phe Arg His Ser Val Cys 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 79 Ala Pro Ile Gln Phe Arg His Cys 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 80 Ala Tyr Phe Pro His Thr Ser Cys 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 81 Asn Ser Ser Glu Leu Arg His Cys 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 82 Thr Glu Phe Arg His Lys Ala Cys 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 83 Thr Ser Thr Glu Met Trp His Cys 1 5 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 84 Ser Gln Ser Tyr Phe Lys His Cys 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 85 Cys Ser Glu Phe Lys His 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 86 Ser Glu Phe Lys His Cys 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 87 Cys His Glu Phe Arg His 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 88 His Glu Phe Arg His Cys 1 5 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 89 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Cys 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 90 Glu Phe Arg His Asp Ser Cys 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 91 Glu Val His His Gln Lys Cys 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = pE, pyroglutamate <400> 92 Xaa Phe Arg His Asp Ser Cys 1 5 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = pE, pyroglutamate <400> 93 Xaa Val His His Gln Lys Leu Val Phe Cys 1 5 10 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 94 Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Cys 1 5 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 95 Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Cys 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 96 Cys Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 10 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 97 Cys Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 <210> 98 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 98 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 99 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <400> 99 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = T, V, A, M, Q or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = P, A, Y, S, C, G or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = P, L, G, C or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = C or no amino acid residue <400> 100 Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimotope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X= is V, R or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= is R or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X= is A, H, K, L, Y or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X= is P, H, F, Q, C or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X= is C or no amino acid <400> 101 Glu Xaa Trp His Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amyloid-beta fragment <400> 102 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amyloid-beta fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = pE, pyroglutamate <400> 103 Xaa Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amyloid-beta fragment <400> 104 Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5

Claims

β-아밀로이드증(β-amyloidoses)의 예방 및/또는 치료용 약제를 생산하기 위한,
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도.
β-아밀로이드증의 예방 및/또는 치료용 약제의 생산을 위한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도로서, 이 화합물이 아미노산 서열 EFRHDSGY 및/또는 pEFRHDSGY를 포함하는 아밀로이드-베타-펩티드(Aβ)의 에피토프에 특이적인 항체에 대한 결합 능력을 갖는, 용도:

(화학식 I),
상기 화학식에서,
X₁은 이소루신(I) 또는 발린(V)이며,
X₂는 트립토판(W) 또는 티로신(Y)이고,
X₃는 트레오닌(T), 발린(V), 알라닌(A), 메티오닌(M), 글루타민(Q) 또는 글리신(G)이고,
X₄는 프롤린(P), 알라닌(A), 티로신(Y), 세린(S), 시스테인(C) 또는 글리신 (G)이며,
X₅는 프롤린(P), 루신(L), 글리신(G), 또는 시스테인(C)이고,
X₆는 시스테인(C)이며,
n, m 및 o는 독립적으로, 0 또는 1이다.
제 2항에 있어서, 상기 화합물이
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
β-아밀로이드증의 예방 및/또는 치료용 약제의 생산을 위한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도로서, 이 화합물이 아미노산 서열 EVHHQKL를 포함하는 아밀로이드-베타-펩티드(Aβ)의 에피토프에 특이적인 항체에 대한 결합 능력을 갖는, 용도:

(화학식 II),
상기 화학식에서,
X₁은 발린(V), 아르기닌(R) 또는 루신(L)이며,
X₂는 아르기닌(R) 또는 글루탐산(E)이고,
X₃은 알라닌(A), 히스티딘(H), 리신(K), 루신(L), 티로신(Y) 또는 글리신(G)이며,
X₄는 프롤린(P), 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 또는 글루타민(Q) 또는 시스테인(C)이고,
X₅는 시스테인(C)이며,
n 및 m은 독립적으로, 0 또는 1이다.
제 4항에 있어서, 상기 화합물이
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
β-아밀로이드증의 예방 및/또는 치료용 약제의 생산을 위한,
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도.
제 6항에 있어서, 상기 화합물이
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 4 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 용도.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH(키호울 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin))에 커플링되는 것을 특징으로 하는, 용도.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 정맥내, 피하, 피내, 또는 근내 투여용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 용도.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 에쥬번트(adjuvant), 바람직하게는 수산화 알루미늄과 함께 제형화되는 것을 특징으로 하는, 용도.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 0.1 ng 내지 10 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 1 mg, 특히 100 ng 내지 10 μg의 함량으로 약제 내에 포함되는 것을 특징으로 하는, 용도.
시뉴클레오병증의 증상을 치료 및/또는 경감시키기 위한, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 정의된 화합물의 용도.
제 13항에 있어서, 상기 시뉴클레오병증이 파킨슨 질환, 루이소체 치매, 다발성 신경계 위축 및 뇌 철 침착을 동반한 신경퇴행으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 용도.
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 갖는 펩티드.
제 15항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 KLH(키호울 림펫 헤모시아닌)에 커플링되는 것을 특징으로 하는, 펩티드.
제 15항 또는 제 16항에 따른 펩티드를 하나 이상 포함하는, 약학적 제형, 바람직하게는 백신.