AT506819A1

AT506819A1 - Ad vaccine

Info

Publication number: AT506819A1
Application number: AT0095108A
Authority: AT
Original assignee: Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2009-12-15
Also published as: CA2723991A1; US8613931B2; AT509106B1; ES2461492T3; BRPI0915137A2; RU2011100126A; JP6041917B2; US20130230545A1; AT506819B1; PT2310034E; KR20110036808A; DK2310034T3; EP2310034A2; RS53236B; CY1115316T1; CN102123727B; IL209895A; IL209895A0; HK1152470A1; AU2009257169A1

Description

1

··· · • · ·· ·· ·· ·· • · • ·

·· ·

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Mimotopen zur Prävention, Behandlung und Diagnose von mit ß-Amyloid-Bildung und/oder -Anhäufung (ß-Amyloidosen) assoziierten Erkrankungen.

Verschiedene degenerative Erkrankungen sind durch die aberrante Polymerisation und Akkumulation bestimmter Proteine gekennzeichnet. Zu diesen so genannten Proteopathien gehören neurologische Störungen wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit sowie diverse systemische Störungen einschließlich Amyloidosen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Prävention, Behandlung und Diagnose von mit ß-Amyloid-Proteinen assoziierten Proteopathien, die unter der Bezeichnung ß-Amyloidosen zusammengefasst sind. Die prominenteste Form von ß-Amyloidose ist Alzheimer-Krankheit (AD). Weitere Beispiele inkludieren Demenz mit Levy-Körperchen und Demenz bei Down-Syndrom, sind aber nicht darauf beschränkt. AD ist durch die abnorme Akkumulation von extrazellulären Amyloidplaques gekennzeichnet - was in engem Zusammenhang mit extensiver Astrozytose und Mikrogliose sowie dystrophen Neuronen und Neuronenverlust steht. Diese Amyloidplaques bestehen zum Großteil aus den Amyloid-ß(Aß)-Peptiden Aß40 und Aß42, die sich vom Amyloid-Vorläuferprotein (APP) herleiten, welches bei verschiedenen Zelltypen im Nervensystem exprimiert wird. Man glaubt, dass Aß-Peptide direkt an der Pathogenese und Progression von AD teilhaben. APP wird normalerweise mit Hilfe von zwei Spaltungsschritten zur Bildung der derzeit bekannten Formen von Abeta x-40/42/43 verarbeitet. Die erste Spaltung erfolgt durch die so genannten beta-Stellen-APP-Spaltenzyme 1 und 2 (BACE1 und BACE2); der zweite proteolytische Schritt wird mit Hilfe des gamma-Sekretase-Komplexes durchgeführt (besprochen in De Strooper et al., J Cell Sei 113 (2000): 1847-1870). BACE-Enzyme erkennen zwei Stellen im N-terminalen Teil des präsumptiven Aß-Peptids: die erste Wechselwirkung von BACE mit APP führt zu einem Schnitt an der DAEFR-Sequenz (Pos. 1 in Aß) und zur Bildung von Abeta 1-X. Alternativ kann BACE auch an der künftigen Position 11 innerhalb von Aß schneiden, was ein Fragment 11-X ergibt. So wird durch BACE-vermittelte APP-Verarbeitung eine Vielzahl von verschiedenen Aß-Spezies mit Abeta.1-40/42 voller Länge als Hauptbeteiligten gpgrhaffpn.

NACHGEREICHT 2

• · • · ··· ·· • · ·· ·· • · · · • · · ·· • ·

Ganuna-Sekretase-Aktivität führt zur Produktion von drei Hauptfragmenten: Aßl-40/42/43. Sobald diese Peptide produziert sind, werden sie mit Aminopeptidasen weiter verarbeitet, was in ihrem anschließenden schrittweisen Abbau resultiert. Diese weiteren Schritte führen zur Bildung von anderen Formen wie beispielsweise Aß3-40/42. Beim Menschen entsteht durchschnittlich 60-85% des Amyloidplaquematerials durch Aß40/42-Derivate, die N-terminal trunkiert und häufig modifiziert sind. Die relativen Mengen von N-terminal trunkierten Aß-Spezies sind hinsichtlich Aß-Level, Mutationen und BACE-Aktivität variabel.

Die am häufigsten auftretenden trunkierten Formen von Aß sind: Aß3-40/42 und Aßll-40/42. Beide Peptide enthalten einen N-terminalen Glutamatrest, der häufig enzymatisch zu Pyroglutamat modifiziert wird, was zur Bildung von Aß3(pE)-40/42 bzw. Aßll(pE)-40/42 führt. Weil der Aminoterminus von Abeta-3(pE)-und -11(pE)-Peptiden durch internes Laktam blockiert wird, ist er vor der proteolytischen Wirkung von anderen Aminopeptidasen als Pyroglutamat-spezifischen geschützt und kann somit in Geweben stabil bleiben.

Die prominenteste Form von N-terminal trunkiertem, modifiziertem Amyloid wird durch das Peptid 3(pE)-40/42 gebildet, von dem man glaubt, dass es bis zu 50% aller trunkierten Formen darstellt. Das bedeutet, das diese Isoformen 25-40% aller Amyloidpeptide in AD-Gehirnen darstellen. Eine andere prominente Form von trunkierten Aß-Peptiden ist Aßll-40/42: Naslund et al. und Huse et al. konnten nachweisen, dass ein signifikanter Gehalt an diesen trunkierten Spezies in menschlichen Gehirnen von AD-Patienten sowie bei infraklinischen AD-Patienten nachweisbar ist. Außerdem machen diese Peptide eine intramolekulare Dehydratisierung durch und bilden dabei stabile (pE) Formen mit ähnlichen Konsequenzen wie für 3(pE)-40/42 beschrieben.

Schon früher wurde gezeigt, dass trunkierte und modifizierte Peptide in Nervengewebe stabiler sind als Aß voller Länge.

Darüber hinaus sind N-terminal trunkierte Formen von Aß amyloidogener als nicht modifizierte Aß-Peptide, weshalb die Plaquebildungsrate erhöht ist, und sie zeigen auch neurotoxische Aktivität bei der Applikation auf kultivierte Neuronen sowie bei in-vivo-Versuchen. Trunkierte Formen von Aß können bereits in diffusen Ansammlungen von Aß in frühen Stadien von AD nach-

NACHGEREICHT 3 ·· • · ·· • · • · • · • · • ·

··· gewiesen werden und könnten an früher Plaquebildung beteiligt sein, da sie in vivo als Einzelkeime agieren.

Es gibt zwingende Beweise, dass das Auftreten von N-terminal trunkierten Aß-Spezies mit erhöhter Schwere und frühem Einsetzen von Neurodegeneration bei sporadischer und familiärer Alzheimer-Krankheit sowie bei Down-Syndrom-Patienten korreliert. Die Aggregationswirkung in Verbindung mit der erhöhten Stabilität dieser Peptide macht sie zu potentiell gefährlichen Akteuren bei der Entstehung von AD. Eine Analyse bei infraklinischen Patienten, die an familiärer AD oder Down-Syndrom leiden, hat eindeutig ergeben, dass Aß 3(pE)-42 während der ganz frühen Stadien der Krankheit, auch „Keim"-Stadien genannt, nachgewiesen werden kann. Zu dieser Zeit können keine oder nur geringe neurologische Symptome nachgewiesen werden, auch wenn Plaques bereits beginnen sich anzusammeln, welche die Aß -3(pE)-42-Peptid-Spezies tragen. Somit weisen Daten von solchen Patienten auf eine Verbindung zwischen der frühen Bildung von trunkierten Aß-Spezies und dem Einsetzen sowie der Progression der Krankheit hin.

Angesichts dieser Erkenntnisse scheint es wichtig, die Menge dieser Peptidspezies bei AD-Patienten zu verringern, um die Progression der Krankheit zu verändern und die Toxizität sowie den einhergehenden kognitiven Verfall zu reduzieren. Eine optimale AD-Vakzine sollte daher eine Immunantwort auslösen, die in der Lage ist, die prominentesten Formen von Aß-Peptiden anzuvisieren, die im Gehirn von AD-Patienten vorhanden sind.

Eine immunotherapeutische Behandlung unter Verwendung von aktiven und passiven Immunisierungsstrategien zur Abzielung auf Aß voller Länge führte nämlich zu einer Reduktion von Aß-Plaques und zeigte günstige Auswirkungen auf die Progression der Krankheit in AD-Tiermodellen. Passive Impfversuche in AD-Mausmodellen zeigten deutlich, dass spezifisch gegen die N- und C-Termini von Aß40/42 gerichtete Antikörper die Belastung durch Plaques im Gehirn verringern und auch die kognitiven Funktionen bei den behandelten Tieren verbessern konnten, wie aus Verhaltens-analysen hervorgeht. Ähnliche Beobachtungen wurden bei aktiven Impfversuchen unter Verwendung verschiedener Ansätze zur Induktion von Immunantworten gegen Aß40/42 bei Mäusen gemacht. Alle diese Ansätze verwendeten Aß40/42 voller Länge oder Fragmente, die die native Sequenz von Aß enthielten, und die

NACHGEREICHT meisten davon reduzierten die Amyloid-Belastung in transgenen Mausmodellen. Zudem zeigten diese Tiere auch verbesserte kognitive Funktionen. Auf beeindruckende Weise konnten Lemere et al. (Am J. Pathol 165 (2004):283-297) diese Ergebnisse bei Primaten außer dem Menschen reproduzieren, wobei sich eine deutliche Reduktion der Plaqueablagerung und damit verbundenen Pathologie als Reaktion auf die aktive Impfung mit Aß voller Länge zeigte. Der klinische erste-Phase-IIa-Impftestlauf bei AD-Patienten unter Verwendung von Aß42 voller Länge als Antigen musste jedoch aufgrund schwerer neuroentzündlicher Nebenwirkungen einschließlich der Infiltration von autoreaktiven T-Zellen in das Gehirn abgebrochen werden. Nichtsdestotrotz zeigten Studien, die die klinischen Wirkungen bei mit AN-1792 behandelten Patienten untersuchten, dass Patienten, die eine Antikörperantwort gegen Aß42 entwickelten, aber nicht an Meningoenzaphalitis litten, bei kognitiven Tests besser abschnitten als nicht ansprechende Patienten, was darauf hinweist, dass die Immuntherapie ein sehr nützlicher Behandlungsansatz bei AD sein könnte.

Was aber am wichtigsten ist, so zeigten aktuelle Ergebnisse aus Autopsiefällen zur Untersuchung von Patienten, die eine AN1792-Impfung erhielten, dass das Gehirn von Aß-Spezies voller Länge frei wurde, N-terminal trunkierte Aß-Formen aber bestehen blieben. Das unterstreicht die Notwendigkeit der Erfindung von neuen Vakzinen, die sowohl auf das Aß voller Länge als auch auf N-terminal trunkierte und modifizierte Formen dieses Moleküls abzielen.

Die Induktion einer Immunantwort gegen Aß40/42-Peptide beim Menschen kann zwar in den kognitiven Verfall von AD-Patienten eingreifen, eine sichere Alzheimer-Vakzine muss jedoch die Bildung von autoreaktiven T-Zellen vermeiden. Eine Vakzinierung unter Verwendung von nativen Aß40/42-Peptiden oder Fragmenten davon leidet am inhärenten Risiko der Induktion einer Autoimmunerkrankung bei den Patienten, da die Immunantwort nicht ausschließlich auf Aß abgezielt werden kann.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verbindungen und Medikamente zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung und/oder Prävention von ß-Amyloidosen einschließlich Alzheimer-Krankheit verwendet werden können. Diese Verbindungen sollten bei Verabreichung an ein Individuum kein oder ein signifikant

NACHGEREICHT - 5 - - 5 - ·· «· ·· ·· *·Λ _ * · · · · · · « k ·· ·· · · · ·· ; · · · ··· ·· · « ·· > · · · · ·· ·· ·· reduziertes Risiko der Induktion von Autoimmunerkrankungen aufweisen. Gemäß einem weiteren Ziel der vorliegenden Erfindung kann diese Verbindung die in-vivo-Bildung von Antikörpern in einem Individuum induzieren, die gegen trunkierte und/oder stabilisierte Formen von Aß gerichtet sind, welche üblicherweise die Hauptbestandteile von Amyloidablagerungen sind.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von mindestens einer Verbindung mit der Aminosäuresequenz (Formel I) ,

XlRX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o worin

Xi Isoleucin (I) oder Valin (V) ist, X2 Tryptophan (W) oder Tyrosin (Y) ist, X3 Threonin (T), Valin (V), Alanin (A), Methionin (M),

Glutamin (Q) oder Glycin (G) ist, X4 Prolin (P), Alanin (A), Tyrosin (Y), Serin (S), Cystein (C) oder Glycin (G) ist, X5 Prolin (P), Leucin (L), Glycin (G) oder Cystein (C) ist, X6 Cystein (C) ist, n, m und o unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, welche Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper aufweist, der spezifisch für ein Epitop des Amyloid-beta-Peptids (Aß) umfassend die Aminosäuresequenz EFRHDSGY und/oder pEFRHDSGY ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.

Es hat sich überraschend gezeigt, dass eine Verbindung mit einer Aminosäuresequenz der Formel I die in-vivo-Bildung von Antikörpern induzieren kann, die gegen die trunkierten Aß-Formen AßpE3-40/42 und Aß3-40/42 gerichtet sind. Die gebildeten Antikörper können an die Aß-Fragmente binden, was zu einem Zerfall von Aß-Plaques führt.

Formel I und II und alle anderen hierin offenbarten Peptidmoleküle ahmen die natürlich vorkommenden Aß-Peptide und die Varianten Aß-40/42, AßpE3-40/42, Aß3-40/42 und Aßll-40/42 nach, so dass Verbindungen mit der hierin offenbarten Aminosäuresequenz die Bildung von entsprechenden Antikörpern induzieren können. f NACHGEREICkTi 6 • · • · • ·

·· • · • · • · · • ·· • · · ·· ·· • · ·

Die hierin präsentierte Erfindung bezieht sich auf Antigene, die keine Sequenzen des nativen Aß-Peptids enthalten und die Struktur von Neoepitopen nachahmen, welche nicht durch Mimotope, wie sie in WO 2004/062556 beschrieben sind, nachgewiesen werden können. Eine derartige Mimotop-basierte AD-Vakzine würde daher Antikörperantworten induzieren, die ausschließlich mit den hierin genannten pathologischen Aß-Molekülen, nicht aber mit parentalen Strukturen wie APP reagieren. Weiters enthalten Mimotope keine potentiellen T-Zellen-Selbstepitope und vermeiden die Induktion von schädlichen autoreaktiven T-Zellen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verbindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) und IRWDGG(C).

Besonders bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen die bzw. bestehen aus den oben identifizierten Aminosäuresequenzen, wobei der C-Terminus des Peptids gegebenenfalls einen Cysteinrest (angezeigt durch Klammern) enthalten kann, so dass die erhaltene Verbindung z.B. an ein Trägermolekül gekoppelt werden kann. Es ist jedoch auch möglich, einen Cysteinrest an den N-Terminus des Peptids anzuhängen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C) or IRYDMAG(C).

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einer Verbindung mit der Aminosäuresequenz (Formel II) ΕΧ^ΗΧ2Χ3(Χ4)η(Χ5)π> worin

Xi Valin (V), Arginin (R) oder Leucin (L) ist, X2 Arginin (R) oder Glutaminsäure (E) ist, X3 Alanin (A), Histidin (H), Lysin (K), Leucin (L), Tyrosin (Y) oder Glycin (G) ist,

Xi Prolin (P), Histidin (H), Phenylalanin (F), Glutamin (Q) oder Cystein (C) ist, X5 Cystein (C) ist,

NACHGEREICHT n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, welche Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper aufweist, der spezifisch für ein Epitop des Amyloid-beta-Peptids (Aß) umfassend die Aminosäuresequenz EVHHQKL ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.

Die Verabreichung einer Verbindung umfassend eine Aminosäuresequenz der Formel II bewirkt eine Immunantwort gegen die trunkierte Aß-Form Aßll-40/42.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verbindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C) und ERWHEK(C), vorzugsweise EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C) und ELWHRAF(C).

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einer Verbindung mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), TYFSHSL(C), QELKRYY(C), DEHPFRH(C), ATPLFRH(C) , SQYFPRP(C) , DTYFPRS(C), VELRHSR(C), YSMRHDA(C), AANYFPR(C), SPNQFRH(C), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRHHA(C), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL(C) THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C) MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), AEFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH und HEFRH(C) zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.

Jede dieser Verbindungen kann die in-vivo-Bildung von Antikörpern induzieren, die gegen Aßl-40/42, AßpE3-40/42 und Aß3-40/42 gerichtet sind. Daher eignen sich diese Verbindungen besonders gut zur Behandlung und/oder Prävention von AD, weil die Verabreichung einer Verbindung zur Bildung von Antikörpern I nachgereicht - 8 ·· ·· » · · 1 » · · ·♦· -·« ·· ·· führt, die die drei wichtigsten Aß-Formen, nämlich Aßl-40/42, AßpE3-40/42 und Aß3-40/42, erkennen können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst oder besteht die Verbindung (aus) ein(em)

Peptid mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), SPNQFRH(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), EELRHSV(C), TEFRHKA(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH und HEFRH(C) vorzugsweise SEFKHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), ILFRHG(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C), TEFRHKA(C).

Die hierin offenbarten Aminosäuresequenzen werden als Mimotope der Epitope von Aß umfassend die Aminosäuresequenz EFRHDSGY, pEFRHDSGY oder EVHHQKL angesehen. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Mimotop" auf ein Molekül, das eine Konformation mit einer Topologie äquivalent zu dem Epitop aufweist, von dem es eine Mimikry ist. Das Mimitop bindet an dieselbe Antigen-bindende Region eines Antikörpers, der immunspezifisch an ein gewünschtes Antigen bindet. Das Mimotop ruft eine immunologische Antwort in einem Wirt hervor, die auf das Antigen reagiert, für die es eine Mimikry ist. In in-vitro-Inhibitionsassays (z.B. ELISA-Inhibitionsassays), bei denen das Epitop und ein an dieses Epitop bindender Antikörper involviert sind, kann das Mimotop auch als Konkurrent für das Epitop fungieren, von dem es eine Mimikry ist. Ein erfindungsgemäßes Mimotop muss aber nicht unbedingt die Bindung des Epitops, von dem es eine Mimikry ist, in einem in-vitro-Inhibitionsassay verhindern bzw. mit diesem konkurrieren, auch wenn es bei Verabreichung an einen Säuger eine spezifische Immunantwort induzieren kann.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Epitop" auf eine immunogene Region eines Antigens, das von einem bestimmten Antikörpermolekül erkannt wird. Im allgemeinen besitzt ein Antigen ein oder mehr Epitope, von denen jedes einen Antikörper binden kann, der das bestimmte Epitop erkennt.

Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe von chemischen Syntheseverfahren synthetisch hergestellt werden, die

NACHGEREICHT - 9 - - 9 - • · « ·♦ ·· Π Ο auf dem Gebiet gut bekannt sind, u.zw. entweder als isoliertes Peptid oder als Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids. Alternativ kann das Peptidmimotop in einem Mikroorganismus produziert werden, der das Peptidmimotop produziert, das dann isoliert und gewünschtenfalls weiter gereinigt wird. Das Peptidmimotop kann in Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen oder Pilzen, in eukaryotischen Zellen wie einer Säuger- oder einer Insektenzelle, oder in einem rekombinanten Virusvektor wie Adenovirus, Pockenvirus, Herpesvirus, Simliki-Forest-Virus, Baculovirus, Bakteriophage, Sindbis-Virus oder Sendai-Virus hergestellt werden. Geeignete Bakterien zur Herstellung des Peptidmimotops inkludieren E.coli, B.subtilis oder jedes andere Bakterium, das Peptide wie das Peptidmimotop exprimieren kann. Geeignete Hefearten zur Expression des Peptidmimotops inkludieren Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris oder jede andere Hefe, die Peptide exprimieren kann. Entsprechende Verfahren sind auf dem Gebiet gut bekannt. Auch Verfahren zum Isolieren und Reinigen von rekombinant hergestellten Peptiden sind auf dem Gebiet gut bekannt und inkludieren z.B. Gelfiltration, Affinitätschromato-grafie, Ionenaustauschchromatografie etc..

Um die Isolierung des Peptidmimotops zu erleichtern, kann ein Fusionspolypeptid erzeugt werden, wobei das Peptidmimotop translatorisch mit einem heterologen Polypeptid verschmolzen (kovalent gekoppelt) wird, das die Isolierung mittels Affinitätschromatografie ermöglicht. Typische heterologe Polypeptide sind His-Tag (z.B. His6; 6-Histidinreste), GST-Tag (Glutathion-S-Transferase) etc.. Das Fusionspolypeptid erleichtert nicht nur die Reinigung der Mimotope, sondern kann auch verhindern, dass das Mimotoppolypeptid während der Reinigung abgebaut wird. Wird eine Entfernung des heterologen Polypeptids nach der Reinigung gewünscht, kann das Fusions-polypeptid eine Spaltstelle an der Verbindung zwischen dem Peptidmimotop und dem heterologen Polypeptid aufweisen. Die Spaltstelle besteht aus einer Aminosäuresequenz, die mit einem für die Aminosäuresequenz an dieser Stelle spezifischen Enzym (z.B. Proteasen) gespalten wird.

Die erfindungsgemäßen Mimotope können auch an oder nahe ihres N- und/oder C-Terminus modifiziert werden, so dass in diesen Positionen ein Cysteinrest daran gebunden wird. In einer

NACHGEREICHT - 10 - 10 • · « · ....... » · · · « M #· ·· bevorzugten Ausführungsform werden terminal positionierte (am N-und C-Terminus des Peptids befindliche) Cysteinreste zur Zyklisierung der Peptide durch eine Disulfidbindung verwendet.

Die erfindungsgemäßen Mimotope können auch in verschiedenen Tests und Sets, insbesondere immunologischen Tests und Sets, verwendet werden. Daher wird besonders bevorzugt, dass das Mimotop Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids, insbesondere eines Enzyms, sein kann, welches als Reporter in immunologischen Tests verwendet wird. Solche Reporterenzyme inkludieren z.B. Alkaliphosphatase oder Meerrettich-Peroxidase.

Die erfindungsgemäßen Mimotope sind vorzugsweise antigene Polypeptide, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz von Aß oder von Aß-Fragmenten unterscheiden. Diesbezüglich können die erfindungsgemäßen Mimotope nicht nur Aminosäuresubstitutionen eines oder mehrerer natürlich vorkommender Aminosäurereste, sondern auch eine oder mehr nicht natürliche Aminosäuren (d.h. nicht von den 20 „klassischen" Aminosäuren) aufweisen, oder sie können zur Gänze aus solchen nicht natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt sein. Außerdem können die erfindungsgemäßen Antigen, die Antikörper induzieren, welche gegen Aßl-40/42, AßpE3-40/42, Aß3-40/42 und Aßll-40/42 gerichtet sind und an diese binden, aus D- oder L-Aminosäuren oder DL-Aminosäure-Kombinationen zusammengesetzt und gegebenenfalls durch weitere Modifikationen, Ringschließungen oder Derivatisierungen verändert worden sein. Geeignete Antikörper induzierende Antigene können von handelsüblichen Peptidbibliotheken zur Verfügung gestellt werden. Vorzugsweise sind diese Peptide mindestens 7 Aminosäuren lang, und bevorzugte Längen können bis zu 16, vorzugsweise bis zu 14 oder 20 Aminosäuren (z.B. 5 bis 16 Aminosäurereste) aufweisen. Erfindungsgemäß können jedoch auch längere Peptide sehr gut als Antikörper induzierende Antigene eingesetzt werden. Weiters können die erfindungsgemäßen Mimotope auch Teil eines Polypeptids sein und in der Folge an ihrem N- und/oder C-Terminus mindestens einen weiteren Aminosäurerest aufweisen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mimotope (d.h. der hierin offenbarten Antikörper induzierenden Antigene) sind natürlich auch Phagenbibliotheken, Peptidbibliotheken geeignet, die beispielsweise mittels kombinatorischer Chemie erzeugt oder mit Hilfe von Hochdurchsatz-Screening-Methoden für die unter-

NACHGEREICHT - 11 - m* ·· ·· ·· * ·· . · ι· · · · mrn · · · ·· • · • · • · • · • · · I ·· »« » · • · i ·· ·· schiedlichsten Strukturen erhalten werden (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50(6):837-54).

Weiters können erfindungsgemäß auch anti-Aßl-40/42-, -AßpE3-40/42-, -Aß3-40/42- und -Aßll-40/42-Antikörper induzierende Antigene basierend auf Nukleinsäuren („Aptamere") verwendet werden, und auch diese sind in den verschiedensten (Oligonukleotid-) Bibliotheken (z.B. mit 2-180 Nukleinsäureresten) zu finden (z.B. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem.

Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc.). Bei Antikörper induzierenden Antigenen basierend auf Nukleinsäuren kann das Nukleinsäure-Grundgerüst z.B. durch die natürlichen Phosphordiester-Verbindungen oder auch durch Phosphorthioate oder Kombinationen oder chemische Variationen (z.B. als PNA) zur Verfügung gestellt werden, wobei erfindungsgemäß als Basen in erster Linie U, T, A, C, G, H und mC eingesetzt werden können. Die 2'-Reste der Nukleotide, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind vorzugsweise H, OH, F, CI, NH2, O-Methyl, O-Ethyl, O-Propyl oder O-Butyl, wobei die Nukleinsäuren auch unterschiedlich modifiziert sein können, d.h. mit Schutzgruppen, wie sie üblicherweise bei der Oligo-nukleotid-Synthese verwendet werden. Somit sind Aptamer-basierte Antikörper induzierende Antigene auch bevorzugte Antikörper induzierende Antigene im Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin), Tetanus-toxoid, Albumin bindendes Protein, Rinderserumalbumin, ein Dendrimer (MAP; Biol. Chem. 358: 581), Peptidlinker (oder flankierende Regionen) sowie die Adjuvanzien, die in Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (insbesondere in Tabelle 1 dieses Dokuments) und in O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (insbesondere die darin beschriebenen endogenen immunpotenzierenden Verbindungen und Abgabesysteme) beschrieben sind, oder Mischungen davon gekoppelt. Die Konjukationschemie (z.B. über heterobifunktionelle Verbindungen wie GMBS und natürlich auch andere wie in „ Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, beschrieben)

I NACHGEREICHT - 12 ·· ·· ·· · · : :: :: :: :χ ·« :: ; ··: e;s: : ·· ·♦ ·· ·· kann dabei aus dem Fachmann bekannten Reaktionen ausgewählt werden. Außerdem kann die Vakzinezusammensetzung mit einem Adjuvans, vorzugsweise einer leicht löslichen Aluminiumzusammensetzung, insbesondere Aluminiumhydroxid, formuliert werden. Selbstverständlich können auch Adjuvanzien wie MF59 Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, Zytokine (z.B. IL-2, IL-12, GM-CSF), Saponine (z.B. QS21), MDP-Derivate, CpG-Oligos, LPS, MPL, Polyphosphazene, Emulsionen (z.B. Freund's, SAF), Liposome, Virosome, Iscome, Cochleate, PLG-Mikroteilchen, Poloxamer-teilchen, virusartige Teilchen, hitzelabiles Enterotoxin (LT), Choleratoxin (CT), mutante Toxine (z.B. LTK63 und LTR72), Mikroteilchen und/oder polymerisierte Liposome verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise über einen Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NHS-Poly (Ethylenoxid) (PEO) (z.B. NHS-PE04-Maleimid) an den Träger bzw. das Adjuvans gebunden.

Eine die vorliegende Verbindung (Mimotop) und den pharmazeutisch akzeptable Träger umfassende Vakzine kann mittels jeder geeigneten Applikationsmethode, z.B. i.d., i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subkutan etc. und in jeder geeigneten Abgabevorrichtung (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735) verabreicht werden. Die erfindungsgemäße

Verbindung ist vorzugsweise für intravenöse, subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung formuliert (siehe z.B. "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations",

Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

Das erfindungsgemäße Medikament (die erfindungsgemäße Vakzine) enthält die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 pg, oder alternativ z.B. 100 fmol bis 10 pmol, vorzugsweise 10 pmol bis 1 pmol, insbesondere 100 pmol bis 100 nmol. Typischerweise kann die Vakzine auch Hilfsstoffe, z.B. Puffer, Stabilisatoren etc. enthalten.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Peptid mit oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C), IRWDGG(C), EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C), ERWHEK(C), QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C),

NACHGEREICHT Η ·; ··· !: : *.· ·· ·· ·· - 13 - LMFRHN(C) , SAFRHH(C) , LPFRHG(C), SHFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), AYFPHTS(C) (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH und HEFRH(C). Wie durch die Verwendung der Klammern angedeutet, können die erfindungsgemäßen Peptide gegebenenfalls den Cysteinrest am C- oder N-Terminus aufweisen. Daher umfasst die SQFRHY(C), ILFRHG(C), GEMRHQP(C), SPNQFRH(C), SEFSHSS(C), APMYFPH(C), ATPLFRH(C), SQYFPRP(C), LQFKHST(C), AEFMHSV(C) , SELRHST(C), SNFRHSV(C), TSTEMWH(C), DTYFPRS(C) SSSFFPR(C) QPNLFYH(C) TYFSHSL(C) QELKRYY(C) DEHPFRH(C) ATFRHST(C) ADHDFRH(C) THMEFRR(C) APIQFRH(C) SQSYFKH(C) VELRHSR(C) EDWFFWH(C) ELFKHHL(C) HEPLFSH(C) THTDFRH(C) MLPFRHG(C) TGLMFKH(C) DGLLFKH(C) EELRHSV(C) YSMRHDA(C) SAGSFRH(C) TLHEFRH(C) SLMRHSS(C) LHIPFRH(C) SAMRHSL(C) AEFSHWH(C) IGFRHDS(C) QLFKHSP(C) NSSELRH(C) AANYFPR(C) , QVMRHHA(C) , ATFRHSP(C) , EFLRHTL(C) , NELFKHF(C) , TPLMFWH(C) , QSEFKHW(C) , SNSEFRR(C) , YEFRHAQ(C) , TEFRHKA(C) , vorliegende Erfindung auch die folgenden Aminosäuresequenzen: IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IRWDTSL, IRWDQP, IRWDG, IRWDGG, EVWHRHQ, ERWHEKH, EVWHRLQ, ELWHRYP, ELWHRAF, ELWHRA, EVWHRG, EVWHRH, ERWHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NWFPHP, EEFKYS, NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS, VELRHSR, YSMRHDA, AANYFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, EDWFFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRH, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS, EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFWH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS, SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS, NSSELRH, HEFRH und HEFRH. TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C)SEFKH, SEFKH,

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin) gekoppelt.

Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Formulierung, vorzugsweise eine Vakzine, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid umfasst. Diese pharmazeutische Formulierung kann zur Behandlung von an ß-Amyloidosen einschließlich Alzheimer-Krankheit leidenden Individuen oder zur Verhinderung der Bildung von Aß-Plaques in einem Individuum zwecks Hintanhaltens der Bildung von ß-

NACHGEREICHT 14 \ • ·· · · · · · · · · · ···· · ···

Amyloidosen einschließlich Alzheimer-Krankheit verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher veranschaulicht, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt die Bindung des monoklonalen Antikörpers MV-001 an bestimmte Peptide und rekombinante Proteine;

Fig. 2 zeigt die Bindung des monoklonalen Antikörpers MV-003 an bestimmte Peptide und rekombinante Proteine;

Fig. 3 zeigt die Bindung des monoklonalen Antikörpers MV-004 an bestimmte Peptide und rekombinante Proteine;

Fig. 4 zeigt typische Bindungsassays mit Mimotopen für ß-Amyloid und N-terminal trunkierte und/oder posttranslatorisch modifizierte ß-Amyloid-Fragmente;

Fig. 5 zeigt typische Inhibitionsassays mit Mimotopen für ß-Amyloid und N-terminal trunkierte und/oder posttranslatorisch modifizierte ß-Amyloid-Fragmente;

Fig. 6 zeigt Beispiele für in-vivo-Charakerisierungen der durch Mimotop-Vakzinierung (injiziertes Peptid/irrelevantes Peptid) hervorgerufenen Immunantwort;

Fig. 7 zeigt Beispiele für die in-vivo-Charakerisierung der durch Mimotop-Vakzinierung gegen Amyloid-beta-Fragmente hervorgerufenen Immunantwort;

Fig. 8 zeigt Beispiele für die in-vivo-Charakerisierung der durch Mimotop-Vakzinierung gegen Aß40/42 voller Länge hervorgerufenen Immunantwort. BEISPIELE :

Verfahren

Die zur Identifizierung der Mimotope gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper weisen von humanem Aß abgeleitete Aminosäuresequenzen nach, binden aber nicht an humanes APP voller Länge. Zu den nachgewiesenen Sequenzen gehören EFRHDS (= Originalepitop aa3-8 von Aß), p(E)FRHDS (= Originalepitop des modifizierten aa3-8 von Aß), EVH-HQK (= Originalepitop aall-16 von Aß). Der Antikörper kann eine monoklonale oder polyklonale Antikörperpräparation oder jeder Antikörperteil oder jedes Derivat davon sein, mit der einzigen Maßgabe, dass das Antikörpermolekül mindestens eines der oben

NACHGEREICHT 15 genannten (von humanem Aß abgeleiteten) Epitope spezifisch erkennt, nicht aber an humanes APP voller Länge bindet.

Die Mimotope werden mit solchen monoklonalen Antikörpern und Peptidbibliotheken identifiziert und weiter charakterisiert.

Beispiel 1: Herstellung von monoklonalen Antikörpern für den spezifischen Nachweis von ß-Amyloid und N-terminal trunkierten und/oder posttranslatorisch modifizierten ß-Amyloid-Fragmenten.

Beispiel la: Herstellung des monoklonalen Antikörpers MV-001

Es wurde ein monoklonaler Antikörper, abgeleitet aus der Fusion von Versuch Alz-5, hergestellt: Im Versuch Alz-5 wurden C57/B16-Mäuse mit dem Original-Aß-Epitop DAEFRHDSGYC, gekoppelt an KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin) und Alum (Aluminiumhydroxid) als Adjuvans, wiederholt immunisiert. p4371-Peptid-spezifische, Antikörper produzierende Hybridome wurden mittels ELISA nachgewiesen (mit pl253- und p4371-Peptid beschichtete ELISA-Platten). Humanes AB40/42 (rekombinantes Protein) wurde als positives Kontrollpeptid verwendet: Hybridome, die das auf ELISA-Platten immobilisierte rekombinante Protein erkennen, wurden mit eingeschlossen, weil sie sowohl das Peptid als auch das Aß voller Länge spezifisch binden. P1454 (humanes Aß33-40) wurde als negatives Kontrollpeptid verwendet. Weiters wurden Hybridome gegen p4373 getestet. Nur Hybridome mit keiner oder eingeschränkter p4374-Bindung wurden für eine weitere Antikörperentwicklung verwendet.

Der Hybridomklon (MV-001) (interner Name 824; IgGl) wurde gereinigt und für den spezifischen Nachweis von pl253, p4371, p4373, pl454 bzw. Aß analysiert. MV-001 erkannte das injizierte Epitop (pl253) sowie das spezifische Epitop (p4371) und das Aß-Protein voller Länge (rekombinantes Protein; erhalten von Bachem Antigen, Bubendorf, Schweiz) im ELISA. Es wies jedoch nicht pl454 im ELISA nach. Weiters versagten die MV-001-Antikörper prinzipiell beim Nachweis des für die Pyroglutamatversion von Aß3-10 codierenden Peptids p4373 (30-mal geringerer Titer als die Originalepitope).

Beispiel lb: Herstellung des monoklonalen Antikörpers MV-003

Es wurde ein monoklonaler Antikörper, abgeleitet aus der Fusion von Versuch Alz-16, hergestellt: Im Versuch Alz-16 wurden BalbC-Mäuse mit dem Epitop p(E)FRHDSC (p4373), gekoppelt an KLH

NACHGEREICHT - 16 - • ·· ·· ·· · ·· • ·· · ··· ···· · ···· · · · · (Keyhole-Limpet-Hemocyanin) und Alum (Aluminiumhydroxid) als Adjuvans, wiederholt immunisiert. p4373-Peptid-spezifische, Antikörper produzierende Hybridome wurden mittels ELISA nachgewiesen (mit p4373-Peptid beschichtete ELISA-Platten). pl253, pl454 und Aß40/42 wurden als negative Kontrollpeptide verwendet. Weiters wurden Hybridome gegen p4371 getestet. Nur Hybridome mit keiner oder eingeschränkter p4371-Bindung wurden für eine weitere Antikörperentwicklung verwendet, um eine Pyroglutamat-Spezifität zu garantieren.

Der Hybridomklon (MV-003) (interner Name D129; IgGl) wurde gereinigt und für den spezifischen Nachweis von pl253, p4371, p4373, pl454 bzw. Aß analysiert. MV-003 erkannte das injizierte Epitop (p4373), versagte jedoch beim Nachweis von pl454, pl253 oder dem Aß-Protein voller Länge (rekombinantes Protein; erhalten von Bachem Antigen, Bubendorf, Schweiz) im ELISA.

Weiters waren die MV-003-Antikörper nicht in der Lage, das für die normale Version von Aß3-10 codierende Peptid p4371 nachzuweisen (15-mal geringerer Titer als das Originalepitop).

Beispiel lc: Herstellung des monoklonalen Antikörpers MV-004

Es wurde ein monoklonaler Antikörper, abgeleitet aus der Fusion von Versuch Alz-15, hergestellt; Im Versuch Alz-15 wurden BalbC-Mäuse mit dem Epitop EVHHQKC (p4372), gekoppelt an KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin) und Alum (Aluminiumhydroxid) als Adjuvans, wiederholt immunisiert. p4372-Peptid-spezifische, Antikörper produzierende Hybridome wurden mittels ELISA nachgewiesen (mit p4372-Peptid beschichtete ELISA-Platten). p4376, p4378, pl454 und Aß40/42 wurden als negative Kontrollpeptide verwendet. Nur Hybridome mit keiner oder eingeschränkter p4376-und p4378-Bindung wurden für eine weitere Antikörperentwicklung verwendet, um eine Spezifität gegen den freien N-Terminus in Position aall zu garantieren.

Der Hybridomklon (MV-004) (interner Name B204; IgGl) wurde gereinigt und für den spezifischen Nachweis von p4372, p4376, p4378, pl454 bzw. Aß analysiert. MV-004 erkannte das injizierte Epitop (p4372), versagte jedoch beim Nachweis von pl454, p4376 und p4378 sowie dem Aß-Protein voller Länge (rekombinantes Protein; erhalten von Bachem Antigen, Bubendorf, Schweiz) im ELISA. Das Versagen beim Nachweis von p4376, p4378 beweist die Spezifität für den freien N-Terminus in Position aall im trunkierten Aß.

NACHGEREICHT 17

Beispiel 2: Phagen-Display, in-vitro-Bindung und Inhibitions-ELISA

Die in diesem Beispiel verwendeten Phagen-Display-Biblio-theken waren: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (lineare 7mer-Bibliothek). Das Phagen-Display erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers (www.neb.com).

Nach 2 oder 3 aufeinander folgenden Panning-Runden wurden einzelne Phagenklone gepickt und die Phagenüberstände einem ELISA auf Platten unterzogen, die mit dem Antikörper beschichtet waren, der für das Panning-Verfahren verwendet wurde. Phagenklone, die in diesem ELISA positiv waren (starkes Signal für das Target, aber kein Signal für unspezifische Kontrolle), wurden sequenziert. Aus DNA-Sequenzen wurden Peptidsequenzen abgeleitet. Diese Peptide wurden synthetisiert und im Bindungsund Inhibitions-ELISA charakterisiert. Darüber hinaus wurden einige neue Mimotope geschaffen, indem im Screen identifizierte Sequenzinformationen von Mimotopen zur Unterstützung der Identifizierung einer .Konsensussequenz für eine Mimotop-Vakzinierung kombiniert wurden. 1. In-vitro-Bindungsassay (ELISA)

Vom Phagen-Display abgeleitete Peptide sowie Varianten davon wurden an BSA gekoppelt und an ELISA-Platten gebunden (ΙμΜ; wie in den entsprechenden Figuren angegeben) und anschließend mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert, der für den Screening-Vorgang verwendet wurde, um die Bindungskapazität von identifizierten Peptiden zu analysieren. 2. In-vitro-Inhibitionsassay (ELISA)

Vom Phagen-Display abgeleitete, unterschiedliche Peptidmengen (Konzentrationen von 10 pg bis 0,08pg; Serienverdünnungen) wurden mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert, der für den Screening-Vorgang verwendet wurde. Peptide, die die anschließende Bindung des Antikörpers an das auf ELISA-Platten beschichtete Originalepitop verringerten, wurden in diesem Assay als inhibierend angesehen.

Beispiel 3: In-vivo-Untersuchung von Mimotopen: Analyse der Ixmxmogenität und Kreuzreaktivität

I NACHGEREICHT 18 1. In-vivo-Untersuchung von Mimotopen

Inhibierende und nicht inhibierende Peptide wurden an KLH gekoppelt und Mäusen injiziert (Wildtyp C57/B16-Mäuse; subkutane Injektion in die Flanke), zusammen mit einem geeigneten Adjuvans (Aluminiumhydroxid). Die Tiere wurden 3- bis β-mal in zweiwöchigen Intervallen geimpft, und Seren wurden ebenfalls zweiwöchentlich genommen. Die Titer zu den injizierten Peptiden sowie zu einem irrelevanten Peptid wurden bei jedem Serum bestimmt. Weiters wurden Titer gegen das rekombinante humane Aß-Protein bzw. gegen Originalpeptide bestimmt. Im allgemeinen wurden die Seren durch Reaktion mit an Rinderserumalbumin (BSA) gekoppelten Peptiden und auf ELISA-Platten immobilisierten rekombinanten Proteinen voller Länge analysiert. Die Titer wurden unter Verwendung von anti-Maus-IgG-spezifischen Antikörpern bestimmt. Für detaillierte Ergebnisse siehe Fig. 6, 7 bzw. 8. 2. Ergebnisse 2.1. Identifizierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAB), die gegen n-terminal trunkierte und modifizierte Formen von Aß gerichtet sind:

Fig. 1 zeigt die Charakterisierung des vom Versuch Alz-5 stammenden monoklonalen Antikörpers MV-001 (interner Name 824; IgGl) und zeigt die Spezifität für Aß voller Länge und in Position E3 trunkiertes Aß.

Fig. 2 zeigt die Charakterisierung des vom Versuch Alz-16 stammenden monoklonalen Antikörpers MV-003 (interner Name D129; IgGl) und zeigt die Spezifität für trunkiertes und in Position p(E)3 posttranslatorisch modifiziertes Aß.

Fig. 3 zeigt die Charakterisierung des vom Versuch Alz-15 stammenden monoklonalen Antikörpers MV-004 (interner Name B204; IgGl) und zeigt die Spezifität für in Position Eil trunkiertes Aß. 2.2. Screening mit spezifischen mABs, die gegen n-terminal trunkierte und modifizierte Formen von Aß gerichtet sind: 2.2.1. Phagen-Display-Bibliothek Ph.D. 7 2.2.1.1. Screening mit gegen p4373 gerichtetem monoklonalem Antikörper

Durch Screenen von PhD-7-Phagenbibliotheken wurden 8 Sequenzen in diesem Screen identifiziert: Tabelle 1A fasst die identifizierten Peptide und ihre Bindungskapazität im Vergleich

NACHGEREICHT zum Originalepitop zusammen. 2.2.1.2. Screening mit gegen p4372 gerichtetem monoklonalem Antikörper

Durch Screenen von PhD-7-Phagenbibliotheken wurden 9 Sequenzen in diesem Screen identifiziert: Tabelle 1B fasst die identifizierten Peptide und ihre Bindungskapazität im Vergleich zum Originalepitop zusammen. 2.2.1.3. Screening mit gegen p4371 gerichtetem monoklonalem Antikörper

Durch Screenen von PhD-7- und PhD12-Phagenbibliotheken wurden 71 Sequenzen in diesem Screen identifiziert: Tabelle IC fasst die identifizierten Peptide und ihre Bindungskapazität im Vergleich zum Originalepitop zusammen.

Tabelle 1A: Mimotope, die an den parentalen Antikörper MV-003 binden

Interne Peptid- SEQ ID Bindungs- nummer No. Sequenz kapazität p4395 1 IRWDTPC 2 p4 396 2 VRWDVYPC 1 p4 397 3 IRYDAPLC 1 p4 399 4 IRYDMAGC 1 p4728 5 IRWDTSLC 3 p47 56 6 IRWDQPC 3 p47 92 7 IRWDGC 1 p47 93 8 IRWDGGC 2

Legende zu Tabelle 1A: die Bindungskapazität ist durch den folgenden Bindungscode codiert: 1:X beschreibt den Verdünnungsfaktor des parentalen AB.

Bindungscode OD halbmax 1: X 0 keine Bindung : 0 1 schwache Bindung :<16000 2 mittlere Bindung :16-60000 3 starke Bindung :>60000

Tabelle 1B: Mimotope, die an den parentalen Antikörper MV-004 binden

NACHGEREICHT - 20 - ί f Interne Peptid-nuiraner SEQ ID No. Sequenz Bindungs kapazität p4 417 9 EVWHRHQC 2 p4 418 10 ERWHEKHC 3 p4419 11 EVWHRLQC 3 p4420 12 ELWHRYPC 2 p4 665 13 ELWHRAFC 2 p4786 14 ELWHRAC 1 p4788 15 EVWHRGC 1 p4789 16 EVWHRHC 1 p47 90 17 ERWHEKC 1

Legende zu Tabelle 1B: die Bindungskapazität ist durch den folgenden Bindungscode codiert: 1:X beschreibt den Verdünnungsfaktor des parentalen AB. Bindungscode OD halbmax 1: X 0 keine Bindung : 0 1 schwache Bindung :’<24000 2 mittlere Bindung :24-96000 3 starke Bindung :>96000

Tabelle IC: Mimotope, die an den parentalen Antikörper MV-001 binden Interne Peptidnummer SEQ ID No. Sequenz Bindungs kapazität p4 380 18 QDFRHYC 2 p4381 19 SEFKHGC 3 p4382 20 TSFRHGC 2 p4383 21 TSVFRHC 3 p4 384 22 TPFRHTC 2 p4385 23 SQFRHYC 2 p4 38 6 24 LMFRHNC 3 p4 387 25 SAFRHHC 2 p4388 26 LPFRHGC 2 p4389 27 SHFRHGC 2 p4390 28 ILFRHGC 3 p4391 29 QFKHDLC 2

NACHGEREICHT 21 p4392 30 NWFPHPC 1 p4393 31 EEFKYSC 2 p4701 32 NELRHSTC 3 p4702 33 GEMRHQPC 3 p47 03 34 DTYFPRSC 2 p4704 35 VELRHSRC 2 p4705 36 YSMRHDAC 2 p4706 37 AANYFPRC 2 p4707 38 SPNQFRHC 3 p4708 39 SSSFFPRC 2 p4709 40 EDWFFWHC 1 p4710 41 SAGSFRHC 3 p4711 42 QVMRHHAC 2 p4712 43 SEFSHSSC 3 p4713 44 QPNLFYHC 1 p4714 45 ELFKHHLC 3 p4715 46 TLHEFRHC 3 p4716 47 ATFRHSPC 2 p4717 48 APMYFPHC 2 p4718 49 TYFSHSLC 2 p4719 50 HEPLFSHC 1 p4721 51 SLMRHSSC 2 p4722 52 EFLRHTLC 3 p4723 53 ATPLFRHC 3 p4724 54 QELKRYYC 1 p4725 55 THTDFRHC 3 p4726 56 LHIPFRHC 3 p4727 57 NELFKHFC 2 p4729 58 SQYFPRPC 2 p4730 59 DEHPFRHC 3 p4731 60 MLPFRHGC 2 p4732 61 SAMRHSLC 2 p4733 62 TPLMFWHC 1 p4734 63 LQFKHSTC 2 p4735 64 ATFRHSTC 2 p4736 65 TGLMFKHC 2 p4737 66 AEFSHWHC 2 p4738 67 QSEFKHWC 3 p4739 68 AEFMHSVC 2

I NACHGEREICHT

! I • · · · ··· ·· · · ···· · ··· - 22 - p4740 69 ADHDFRHC 3 p4741 70 DGLLFKHC 3 p47 42 71 IGFRHDSC 2 p4743 72 SNSEFRRC 3 p4744 73 SELRHSTC 3 p4745 74 THMEFRRC 3 p4746 75 EELRHSVC 3 p4747 76 QLFKHSPC 3 p4748 77 YEFRHAQC 3 p474 9 .78 SNFRHSVC 3 p4750 79 APIQFRHC 3 p4751 80 AYFPHTSC 2 p4752 81 NSSELRHC 3 p4753 82 TEFRHKAC 3 p4754 83 TSTEMWHC 1 p4755 84 SQSYFKHC 3 p4800 85 CSEFKH 3 p4801 86 SEFKHC 3 p4802 87 CHEFRH 3 p4803 88 HEFRHC 3

Legende zu Tabelle IC: die Bindungskapazität ist durch den folgenden Bindungscode codiert: 1:X beschreibt den Verdünnungsfaktor des parentalen AB.

Bindungscode OD halbmax 1: X 0 keine Bindung : 0 1 schwache Bindung :<4000 2 mittlere Bindung 4000-200 00 3 starke Bindung :>20000 2.3. In-vitro-Charakterisierung von Mimotopen, die beim Screenen von Phagen-Display-Bibliotheken mit gegen n-terminal trunkierte und modifizierte Formen von Aß gerichteten monoklonalen Antikörpern identifiziert wurden:

Die Fig. 4 und 5 zeigen repräsentative Beispiele für Bindungs- und Inhibitionsassays, die zur Charakterisierung von

- 23 - • · • ·♦· ·· · • ·

Mimotopen in vitro verwendet wurden. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 bzw. 2 zusammengefasst. MV-003-Mimotope: Von den dargestellten 8 Sequenzen hemmen 6 Sequenzen die Bindung des p(E)3-7Aß-spezifischen monoklonalen Antikörpers bei in-vitro-Konkurrenzversuchen: weitere 2 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers bei in-vitro-Konkurrenzversuchen zwar nicht inhibieren, aber ihre Bindungskapazität an den parentalen Antikörper beibehalten (Tabelle 2A). MV-004-Mimotope: Alle 9 dargestellten Sequenzen inhibieren die Bindung des den freien N-Terminus von in Position Eil trunkiertem Aß spezifisch bindenden monoklonalen Antikörpers bei in-vitro-Konkurrenzversuchen: (Tabelle 2B). MV-001-Mimotope: Von den 71 dargestellten Sequenzen hemmen 27 Sequenzen die Bindung des spezifisch gegen in Position E3 trunkiertes Aß gerichteten monoklonalen Antikörpers bei in-vitro-Konkurrenzversuchen: weitere 44 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers bei in-vitro-Konkurrenzversuchen zwar nicht inhibieren, aber ihre Bindungskapazität an den parentalen Antikörper beibehalten (Tabelle 2C).

Tabelle 2: In der vorliegenden Erfindung identifizierte Mimo-tope, die in Inhibitionsassays positive Ergebnisse bringen

Tabelle 2A: MV-003-Mimotope

Interne Peptid- SEQ ID Sequenzen Inhibitions- nummer No. kapazität p4395 1 IRWDTPC 1 p4 3 97 3 IRYDAPLC 1 p4728 5 IRWDTSLC 2 p4756 6 IRWDQPC 1 p4792 7 IRWDGC 1 p4 7 93 8 IRWDGGC 1

Legende zu Tabelle 2A: Die Inhibitionskapazität ist durch den folgenden Code codiert: Schwache Inhibition bedeutet, dass mehr Peptid als beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich ist; starke Inhibition bedeutet, dass ähnliche Peptidmengen beim Mimotop und beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich sind. Die Mimotope werden mit dem

NACHGEREICHT ! I • ·· ·· ·· ·· · • ·· ·φ ·· ··· • * · · ··· ·· · · ···· · ··· - 24

Originalpeptid als Standard verglichen. Die OD bei 10 ug Peptid wie im Assay verwendet wird zur Berechnung der Konkurrenzkapazität im Vergleich zum

Originalpeptid verwendet.

Konkurrenz code 0 keine Inhibition (OD von 10 pg Peptid über 12-mal des Originalpeptids) 1 schwächer als Originalepitop (OD von 10 pg Peptid unter 12-mal des Originalpeptids) 2 starke Inhibition (wie beim Originalepitop; OD von 10 pg Peptid unter 5-mal des Originalpeptids)

Tabelle 2B: MV-004-Mimotope

Interne Peptidnummer SEQ ID No. Sequenz Inhibitions kapazität p4417 9 EVWHRHQC 1 p4418 10 ERWHEKHC 2 p4419 11 EVWHRLQC 2 p4420 12 ELWHRYPC 1 p4 665 13 ELWHRAFC 2 p47 8 6 14 ELWHRAC 1 p4788 15 EVWHRGC 1 p47 8 9 16 EVWHRHC 1 p47 90 17 ERWHEKC 2

Legend zu Tabelle 2B: Schwache Inhibition bedeutet, dass mehr Peptid als beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich ist; starke Inhibition bedeutet, dass ähnliche Peptidmengen beim Mimotop und beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich sind. Die Mimotope werden mit dem Originalpeptid als Standard verglichen. Die OD bei 10 ug Peptid wie im Assay verwendet wird zur Berechnung der Konkurrenzkapazität im Vergleich zum Originalpeptid verwendet.

Konkurrenz code 0 keine Inhibition (OD von 10 pg Peptid über 5-mal des Originalpeptids) 1 schwächer als Originalepitop (OD von 10 pg Peptid unter 5-mal des Originalpeptids) nachgereicht 5 - 25 2 ♦ · ·· • • ♦ • · • • · ·· • ··· • · • • • · ♦ · ·· starke Inhibition (wie beim Originalepitop; OD von 10 pg Peptid unter 2-mal des Originalpeptids)

Tabelle 2C: MV-001-Mimotope Interne Peptid-nuitimer SEQ ID No. Sequenz Inhibitions kapazität p4380 18 QDFRHYC 1 p4381 19 SEFKHGC 1 p4382 20 TSFRHGC 1 p4383 21 TSVFRHC 1 p4384 22 TPFRHTC 1 p4385 23 SQFRHYC 1 p4386 24 LMFRHNC 1 p4 387 25 SAFRHHC 1 p4388 26 LPFRHGC 1 p4389 27 SHFRHGC 1 p4390 28 ILFRHGC 1 p4391 29 QFKHDLC 1 p4392 30 NWFPHPC 1 p4393 31 EEFKYSC 1 p4707 38 SPNQFRHC 1 p4 715 46 TLHEFRHC 2 p4725 55 THTDFRHC 1 p4730 59 DEHPFRHC 1 p47 38 67 QSEFKHWC 1 p4 7 4 0 69 ADHDFRHC 1 p4741 70 DGLLFKHC 1 p4746 75 EELRHSVC 1 p4753 82 TEFRHKAC 2 p4800 85 CSEFKH 2 p4801 86 SEFKHC 1 p4802 87 CHEFRH 2 p4803 88 HEFRHC 2 Legende zu Tabelle 2C: Schwache Inhibition bedeutet, dass mehr Peptid als beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich ist; starke Inhibition bedeutet, dass ähnliche Peptidmengen beim Mimotop und beim Originalepitop zur Verringerung der AB-Bindung erforderlich sind. Die

NACHGEREICHT

Mimotope werden mit dem Originalpeptid als Standard verglichen. Die OD bei 10 ug Peptid wie im Assay verwendet wird zur Berechnung der Konkurrenzkapazität im Vergleich zum Originalpeptid verwendet. Konkurrenz code 0 keine Inhibition (OD von 10 pg Peptid über 3-mal des Originalpeptids) 1 schwächer als Originalepitop (OD von 10 pg Peptid unter 3-mal des Originalpeptids) 2 starke Inhibition (wie beim Originalepitop; OD von 10 pg Peptid unter 2-mal des Originalpeptids)

Tabelle 3: Nicht-mimotope Peptide Interne Peptid- SEQ ID nuiraner No. Sequenz pl2 53 89 DAEFRHDSGYC p4371 90 EFRHDS-C p4 372 91 EVHHQK-C p4 37 3 92 p(E)FRHDS-C p4 37 4 93 p (E)VHHQKLVFC p4 37 6 94 GYEVHHQKC p4377 95 EVHHQKLVFC p4 37 8 96 C-EVHHQKLVFF pl454 97 CGLMVGGVV Aß 1-4 0 98 DAE FRH DS GYEVHHQKLVFFAE DVGSNKGA11GLMVGG VV Aß1-42 99 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG VVIA sAPPalpha 100 alpha-Sekretase-induziertes Spaltprodukt, abgeleitet von humanem APP (gi:112927) 2.4. In-vivo-Charakterisierung von Mimotopen, die beim Screenen von Phagen-Display-Bibliotheken mit einem gegen n-terminal trunkierte und modifizierte Formen von Aß gerichteten monoklonalen Antikörper identifiziert wurden:

Weibliche C57/bl6-Mäuse, 5-6 Mäuse pro Gruppe, wurden subkutan mit 30 pg an KLH gekoppeltem Peptid immunisiert. An Kontrollgruppen wurden jeweils Originalepitop-KLH-Konjugate verabreicht. Als Adjuvans wurde Alum verwendet (immer 1 mg pro

NACHGEREICHT - 27 - - 27 -

Maus). Die verabreichten Peptide konnten alle spezifisch an monoklonale Antikörper binden, auch wenn manche Peptide die Bindung des Originalepitops an seinen parentalen Antikörper in vitro nicht inhibierten (in einem in-vitro-Inhibitionassay). Der in-vitro-ELISA zum Nachweis des Antikörpertiters wurde mit Seren von einzelnen Mäusen nach jeder Vakzinierung in einem zweiwöchigen Intervall durchgeführt (siehe Fig. 6 bzw. 7). Die Vertiefungen der ELISA-Platte wurden mit Mimotop-BSA-Konjugat und einem irrelevanten Peptid-BSA-Konjugat (negative Kontrolle) beschichtet. Die positive Kontrolle erfolgte durch Umsetzung des parentalen Antikörpers mit dem entsprechenden Mimotop-BSA-Konjugat. Der Nachweis erfolgte mittels anti-Maus-IgG. Darüber hinaus wurden rekombinante Proteine auf ELISA-Platten immobilisiert, und die Seren reagierten dementsprechend. Die Fig. 6, 7 und 8 zeigen repräsentative Beispiele für Assays, die zur Charakterisierung von Mimotopen in vivo verwendet wurden.

Fig. 6 zeigt Beispiele für in-vivo-Charakterisierungen der durch Mimotop-Vakzinierung hervorgerufenen Immunantwort durch Untersuchung der Immunantwort gegen injiziertes Peptid und ein irrelevantes Peptid, das eine nicht verwandte Sequenz enthält. Bei allen drei gezeigten Beispielen rufen die Originalepitope und die Mimotope Immunantworten gegen die injizierten Peptide hervor, versagen aber bei der Induktion einer relevanten Immunantwort gegen eine nicht verwandte Sequenz (pl454).

Als Beispiele für MV-003-Mimotope sind das Originalepitop p4373 und die Mimotope p4395, p4396, p4397 und p4399 in Fig. 6A gezeigt. Alle Vakzinen bewirken ähnliche Immunantworten gegen die jeweiligen Mimotope. Weder die mit der Original-Epitop-p4373-Vakzine behandelten noch die mit den Mimotop-p4395-, -p4396-, -p4397- oder -p4399-Vakzinen behandelten Tiere zeigen relevante Titer gegen das irrelevante Peptid pl454 (llx - 25x weniger als die injizierten Peptide).

Als Beispiele für MV-004-Mimotope sind das Originalepitop p4372 und die Mimotope p4417, p4418, p4419 und p4420 in Fig. 6B dargestellt. Alle Vakzinen zeigen ähnliche Immunantworten gegen die jeweiligen Mimotope. Weder die mit der Original-Epitop-p4372-Vakzine behandelten noch die mit den Mimotop-p4417-, -p4418-, -p4419- und -p4420-Vakzinen behandelten Tiere zeigen relevante Titer gegen das irrelevante Peptid pl454 (20x - 80x weniger als die injizierten Peptide). _

NACHGEREICHT i » 28

··* ..*· ·· ·· ·

Als Beispiele für MV-OOl-Mimotope sind das Originalepitop p4371 und die Mimotope p4381, p4382 und p4390 in Fig. 6C dargestellt. Alle Vakzinen zeigen ähnliche Immunantworten gegen die jeweiligen Mimotope. Weder die mit der Original-Epitop-p4371-Vakzine behandelten noch die mit den Mimotop-p4381-, -p4382- und -p4390-Vakzinen behandelten Tiere zeigen relevante Titer gegen das irrelevante Peptid pl454 (>10x weniger als die injizierten Peptide).

Fig. 7 zeigt Beispiele für in-vivo-Charakterisierungen der durch Mimotop-Vakzinierung hervorgerufenen Immunantwort gegen das entsprechende Originalepitop des parentalen Antikörpers sowie gegen von anderen Formen von trunkierten Spezies von Aß abgeleitete Peptide.

Als Beispiele für MV-003-Mimotope sind das Originalepitop p4373 und die Mimotope p4395, p4396, p4397 und p4399 in Fig. 7A dargestellt. 3/4 der angeführten Mimotop-Vakzinen zeigen nachweisbare Immunantworten gegen das Originalepitop p4373. Ein ähnliches Phänomen lässt sich bei Untersuchung der Kreuzreaktivität gegen die nicht modifizierte Form nachweisen, wie p4371 zeigt. Die Original-Epitop-p4373-Vakzine und 2/4 Mimotop-Vakzinen zeigen relevante Titer gegen p4371. Überraschender weise induzieren die Mimotope, die von MV-003 ausgewählt wurden, welches spezifisch an p4373 bindet, auch eine Immunreaktion, die mit der nicht modifizierten Form des Originalepitops kreuzreagiert .

Als Beispiele für MV-004-Mimotope sind das Originalepitop p4372 und die Mimotope p4417, p4418, p4419 und p4420 in Fig. 7B dargestellt. 3/4 Mimotop-Vakzinen zeigen nachweisbare Immunantworten gegen das Originalepitop p4372.

Als Beispiele für MV-001-Mimotope sind das Originalepitop p4371 und die Mimotope p4381, p4382 und p4390 in Fig. 7C dargestellt. Alle Mimotop-Vakzinen zeigen nachweisbare Immunantworten gegen das Originalepitop p4371. Ein ähnliches Phänomen wie für MV-003-abgeleitete Mimotope kann bei Untersuchung der Kreuzreaktivität gegen die Pyroglutamat-modifizierte Form nachgewiesen werden, wie durch p4373 gezeigt. Die Original-epitop-p4371-Vakzine und alle Mimotop-Vakzinen zeigen relevante Titer gegen p4373. Überraschenderweise induzieren die Mimotope, die von MV-001 ausgewählt wurden, welches spezifisch an p4371 bindet, eine Immunreaktion, die mit der modifizierten Form des

NACHGEREICHT - 29

) V ·· ·.

1 · · I

Originalepitops besser kreuzreagiert als die durch das Originalepitop oder den parentalen Antikörper induzierte Immunreaktion. Somit könnten diese Mimotope überraschenderweise zur Induktion fähig sein, induzieren aber nicht unbedingt eine breitere Immunantwort als der parentale Antikörper und können für ein breiteres Abzielen auf Aß-Formen verwendet werden.

Fig. 8 zeigt Beispiele für in-vivo-Charakterisierungen der durch Mimotop-Vakzinierung hervorgerufenen Immunantwort gegen Aß voller Länge. Überraschenderweise induzieren die unter Verwendung von MV-001 und MV-003 ausgewählten Mimotope eine Kreuzreaktion nicht nur mit den zur Herstellung der Antikörper verwendeten trunkierten oder modifizierten kurzen Epitopen, sondern induzieren auch eine ebenso gute Kreuzreaktivität gegen nicht modifizierte Aß-Formen voller Länge wie die Originalsequenz oder sogar noch effizienter als p4371/p4373. Für das Originalepitop MV-002 sowie für die identifizierten Mimotope kann keine derartige Kreuzreaktivität nachgewiesen werden (keine Daten gezeigt), was eine Übertragung der Spezifität des Antikörpers an den freien N-Terminus von nicht modifiziertem Aßll-40/42 aufzeigt. Die in der vorliegenden Erfindung präsentierten Mimotope stellen somit optimierte Vakzinekandidaten zum Abzielen auf ein breites Spektrum natürlich vorkommender Formen von Aß-Peptiden dar, wie sie Gehirn von AD-Patienten anzutreffen sind. Zu diesen Formen gehören, aber nicht ausschließlich Aßl-40/42 und N-terminal trunkierte Formen wie Aß3-40/42, Aß(pE)3-40/42 bzw. nicht modifiziertes Aßll-40/42.

NACHGEREICHT

Claims

I » .*·. .··. ....... • ϊ ϊ I! *· ·· ·· • · . ϊ ..· · · ·· • · . ! ··· ··· · · ·· ·« . · ·· · "· ·· ·· ·· ff» I 30 Patentansprüche: 1. Verwendung von mindestens einer Verbindung umfassend die Aminosäuresequenz X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o (Formel I), worin Xi Isoleucin (I) oder Valin (V) ist, X2 Tryptophan (W) oder Tyrosin (Y) ist, X3 Threonin (T), Valin (V), Alanin (A), Methionin (M), Glutamin (Q) oder Glycin (G) ist, X4 Prolin (P), Alanin (A) , Tyrosin (Y), Serin (S), Cystein (C) oder Glycin (G) ist, X5 Prolin (P), Leucin (L), Glycin (G) oder Cystein (C) ist, X6 Cystein (C) ist, n, m und o unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, welche Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper aufweist, der spezifisch für ein Epitop des Amyloid-beta-Peptids (Aß) umfassend die Aminosäuresequenz EFRHDSGY und/oder pEFRHDSGY ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) und IRWDGG(C) umfasst.
3. Verwendung von mindestens einer Verbindung mit der Aminosäuresequenz (Formel II), EXiWHX2X3(X4)n(X5)m worin Xi Valin (V), Arginin (R) oder Leucin (L) ist, X2 Arginin (R) oder Glutaminsäure (E) ist, X3 Alanin (A), Histidin (H), Lysin (K), Leucin (L), Tyrosin NACHGEREICHT ( * ·· ·· • · · : ·· ·· ;; : : · · ··. ·· ·· ·· ·· • « Ä ·· ··· · a • · « ·· ·· 31 (Y) oder Glycin (G) ist, X4 Prolin (P), Histidin (H), Phenylalanin (F), Glutamin (Q) oder Cystein (C) ist, X5 Cystein (C) ist, n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, welche Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper aufweist, der spezifisch für ein Epitop des Amyloid-beta-Peptids (Aß) umfassend die Aminosäuresequenz EVHHQKL ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C) und ERWHEK(C), vorzugsweise EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C) und ELWHRAF(C) umfasst.
5. Verwendung von mindestens einer Verbindung mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), YSMRHDA(C) AANYFPR(C), SPNQFRH(C), QVMRHHA(C), SEFSHSS(C), DTYFPRS(C), VELRHSR(C) , SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C) ATFRHSP(C), APMYFPH(C), EFLRHTL(C), ATPLFRH(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C) TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C) QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), ApFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH und HEFRH(C) zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Alzheimer-Krankheit.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die NACHGEREICHT - 32 - — * φ _ - - - w m ...... »··..· . Verbindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(G), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), SPNQFRH(C), TLHEFRH(C) , THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C) , ADHDFRH(C), DGLLFKH(C) , EELRHSV(C), TEFRHKA(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH und HEFRH(C) vorzugsweise SEFKHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), ILFRHG(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C) , ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C), TEFRHKA(C) umfasst.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Polypeptid mit 4 bis 20 Aminosäureresten ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin), gekoppelt ist.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung für intravenöse, subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung formuliert ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit einem Adjuvans, vorzugsweise Aluminiumhydroxid, formuliert ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung im Medikament in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 10© ng bis 100 pg enthalten ist.
12. Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C), IRWDGG(C), EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C), ERWHEK(C), QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NACHGEREICHT

33 - V NWFPHP(C) , VELRHSR(C) EDWFFWH(C) ELFKHHL(C) HEPLFSH(C) THTDFRH(C) MLPFRHG(C) TGLMFKH(C) DGLLFKH(C) EELRHSV(C) AYFPHTS(C) (C)SEFKH, EEFKYS(C), NELRHST(C) , GEMRHQP(C), , YSMRHDA , SAGSFRH , TLHEFRH , SLMRHSS , LHIPFRH , SAMRHSL , AEFSHWH , IGFRHDS , QLFKHSP , NSSELRH SEFKH(C) , (C), AANYFPR(C), (C), QVMRHHA(C), (C), ATFRHSP(C), (C), EFLRHTL(C), (C), NELFKHF(C), (C), TPLMFWH(C), (C), QSEFKHW(C), (C), SNSEFRR(C), (C), YEFRHAQ(C), (C), TEFRHKA(C) , SPNQFRH(C) SEFSHSS(C) APMYFPH(C) ATPLFRH(C) SQYFPRP(C) LQFKHST(C) AEFMHSV(C) SELRHST(C) SNFRHSV(C) TSTEMWH(C) DTYFPRS(C), , SSSFFPR(C) , QPNLFYH(C) , TYFSHSL(C) , QELKRYY(C) , DEHPFRH(C) , ATFRHST(C) , ADHDFRH(C) , THMEFRR(C) , APIQFRH(C) , SQSYFKH(C) t r (C)HEFRH und HEFRH(C)
13. Peptid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole-Limpet-Hemocyanin), gekoppelt ist.
14. Pharmazeutische Formulierung, vorzugsweise Vakzine, umfassend mindestens ein Peptid nach Anspruch 12 oder 13. NACHGEREICHT