CN112608926A - 一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组、杂交瘤细胞组及胶乳增强免疫比浊法试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组和杂交瘤细胞组，以及基于它们的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。本发明自制了三株单克隆抗体，交联到胶乳微球上，形成胶乳增强免疫比浊法试剂盒，相比酶联免疫法，该方法测定β淀粉样蛋白，可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉且自动化高节省检测时间。

Description

一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组、杂交瘤细胞组及胶 乳增强免疫比浊法试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域及免疫学测定分析领域，具体涉及一种基于单克隆抗体制备的β淀粉样蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒(A amyloidβ-protein latexenhanced turbidimetric test kit based on monoclonal antibodies)及其制备方法。
背景技术
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)分子量约4kDa，由淀粉样前体蛋白水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。它是一种主要含有40个或42个氨基酸的多肽，是由前体蛋白APP经过两次蛋白酶切而来。且在三维结构中呈β折叠，故称为“β淀粉样蛋白”。
β-淀粉样蛋白可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在，由淀粉样前体蛋白水解产生。淀粉样前体蛋白可能被三种分泌酶酶切，而只有同时经过β分泌酶和γ分泌酶的酶切才可得到Aβ。α分泌酶则扮演着阻止Aβ分泌的角色，平衡Aβ的分泌水平。含有40个氨基酸的Aβ1-40是体内最常见的，而含有42个氨基酸的Aβ1-42则被发现在AD中分泌增加且更容易发生淀粉样聚集，这可能与Aβ1-42C末端增加的两个疏水性氨基酸有关。在健康人的一生中，Aβ都会存在于大脑和脑脊液中，所以，Aβ的存在并不意味着神经病变。当出现神经元损伤时，生理分泌的可溶性Aβ聚集为低聚物或更大的Aβ纤维，则被认为是AD发病的一个决定性因素。然而，通常以可溶形式存在于脑脊液和血浆中的Aβ为何变得容易聚集并形成具有神经毒性的低聚物、原纤维和成熟的纤维，进而累积形成斑块，造成这种现象的原因还不是特别清楚。Shaked等提出，Aβ可以直接与APP相互作用，促进APP的聚集，经过一系列的级联反应，最终会引起细胞凋亡；而作用的位点正是APP上的Aβ区域。崔玉琴等人也对AD患者血清中β淀粉样蛋白的含量及临床意义进行了研究。他们采用放射免疫分析法检测了22例AD患者和30例正常对照组血清中Aβ的含量。结果显示，AD患者血清中Aβ的含量明显高于对照组，以72.3pg/mL作为正常人群Aβ的上限，诊断老年性痴呆的敏感性为63.6％，特异性为83.3％；最终实验的结论为AD患者血清中Aβ含量升高，对诊断老年性痴呆有较高的敏感性和特异性，具有一定临床应用价值。彭丹涛在其论文中也研究了老年性痴呆患者血浆中Aβ1-40，Aβ1-42及P-Tau的产生及变化。采用Sigma公司生产的Aβ1-40，Aβ1-42试剂盒对早期AD患者、中期AD患者及非痴呆对照组的人群进行研究，最终发现，AD早期患者Aβ1-40和Aβ1-42血浆浓度均有升高，其中Aβ1-42浓度显著升高，Aβ1-40浓度较对照组仅有上升趋势，并无统计学意义。而中期与对照组相比Aβ1-42浓度差异无显著性，这可能是由于随着病情的加重，Aβ1-42沉淀加速致使其血浆浓度下降。故Aβ1-42血浆浓度升高有可能成为很好的AD早期诊断的辅助指标，但还需进一步加大样本量进行验证。
目前，市售的β淀粉样蛋白(Aβ)检测试剂盒主要是采用酶联免疫技术，该方法存在灵敏度低、线性范围窄、操作步骤复杂、耗时等问题，且无法满足临床应用要求。因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的Β淀粉样蛋白(Aβ)的快速定量检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的Aβ抗原性较差，检测方法时间过长，检测量过小，检测成本高无法在临床推广的问题，本发明提供一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组、杂交瘤细胞组及胶乳增强免疫比浊法试剂盒，可代替酶联免疫检测方法，提高检测检测效率，扩大检测样本量。同时该方法和酶联免疫法相关性良好，且适用于各类全自动生化分析仪分析，便于临床应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组，包括基因片段一、基因片段二和基因片段三，所述基因片段一的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因片段二的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因片段三的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供一种用于检测β淀粉样蛋白的杂交瘤细胞组，包括杂交瘤细胞一、杂交瘤细胞二和杂交瘤细胞三，所述杂交瘤细胞一由经基因片段一的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成，所述杂交瘤细胞二由经基因片段二的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成，所述杂交瘤细胞三由经基因片段三的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成。
本发明提供一种β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000031
所述试剂R2包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000032
所述Aβ-latexMIX由三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别交联至聚苯乙烯胶乳微球后混合而成。
进一步地，所述三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别选用所述的杂交瘤细胞一、所述的杂交瘤细胞二和所述的杂交瘤细胞三分泌的抗体。
进一步地，所述Aβ-latexMIX的制备方法如下：
5.1用活化缓冲液悬浮聚苯乙烯胶乳微球，得到微球活化液；
5.2向微球活化液中加入EDC，室温孵育，然后再次加入EDC，继续室温孵育，得到微球孵育液；
5.3用包被缓冲液清洗微球孵育液，然后将得到的聚苯乙烯胶乳微球悬浮在包被缓冲液中，得到微球悬浮；
5.4用包被缓冲液溶解Aβ1-mab，得到Aβ1-mab抗体溶液；
5.5将Aβ1-mab抗体溶液加入微球悬液中，持续搅拌室温孵育，得到反应溶液；
5.6向反应溶液中加入乙醇胺，持续搅拌室温孵育，得到交联混合液；
5.7用储存缓冲液悬浮交联混合液，移除未结合的抗体和乙醇胺，获得Aβ1-mab的胶乳微球Aβ1-latex；
5.8按照上述操作，获得Aβ2-mab、Aβ3-mab的胶乳微球Aβ2-latex、Aβ3-latex；
5.9将Aβ1-latex、Aβ2-latex、Aβ3-latex按2：2：3混合，获得Aβ-latexMIX。
进一步地，还包括试剂校准品，所述试剂校准品包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000041
其中，rAβ1-3为三种目的蛋白rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
本发明还提供上述β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的测定方法，其分析方法采用两点终点法，条件如下：
反应方向:上升反应；
校准方式:Logit-Log(5P)；
测定波长:570nm；
测定温度:37℃；
样本:试剂R1:试剂R2＝20:210:70(μL)
测试步骤：吸取20μL样本，加入210μL试剂R1，37℃孵育5min，加入70μL试剂R2，1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。
胶乳增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的均相免疫比浊检测方法。胶乳增强比浊法是在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液透光性能(即吸光度)。而且，反应液透光性能的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。胶乳增强比浊法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，成本低且省时省力。此外，该方法可以在大型全自动生化仪上使用，不需要添置额外的设备。胶乳增强比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
本发明分区取三段β淀粉样蛋白基因，三者之间有交叉，送华大基因合成，并连接到表达载体pET-28a中，导入到表达菌BL-21中，形成三种表达菌Aβ-1，Aβ-2，Aβ-3，然后将三种表达菌的三种表达产物进行纯化和鉴定，纯化产物免疫小鼠，免疫达到指定抗体水平后无菌取脾脏，制备杂交瘤细胞，培养筛选杂交瘤，鉴定后，得到三种杂交瘤细胞备用；
之后将三种杂交瘤细胞分泌的三种单克隆抗体分别交联至直径100～300nm聚苯乙烯胶乳微球，得到三种单克隆抗体胶乳微球，然后按一定的比例混合在一起作为本试剂盒R2的一种成分。本试剂盒由试剂R1和试剂R2构成，所述试剂R1由缓冲液、表面活性剂、稳定剂及防腐剂构成，所述试剂R2由缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂及交联混合Aβ1-3单克隆抗体的胶乳微球构成。
本发明的有益效果体现在：
本发明自制三株单克隆抗体，交联到胶乳微球上，形成胶乳增强免疫比浊法试剂盒，相比酶联免疫法，该方法测定β淀粉样蛋白，可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉且自动化高节省检测时间。
附图说明
图1为重组人Aβ蛋白Western Blot鉴定结果。
泳道M:蛋白Marker 26610，泳道1:空菌对照，泳道2:重组人Aβ-1纯化后样本，泳道3:重组人Aβ-2纯化后样本，永道4：重组人Aβ-3纯化后样本。
图2为制备的抗Aβ蛋白三株单克隆抗体Western Blot鉴定结果。
泳道M:蛋白Marker26610，泳道1:BSA对照，泳道2～4:制备的抗Aβ蛋白单抗1～3，泳道5:abcam公司抗人Aβ蛋白单抗对照。
图3本发明试剂盒与酶联免疫法测试结果的相关性曲线图
图4本发明试剂盒线性范围验证图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例所使用的各种原料，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。
实施例1
重组人Aβ蛋白的制备
(1)人Aβ蛋白基因的切割
人Aβ完整基因序列如下：
CAGGCCTAGAAAGAAGTTTTGGGTAGGCTTTGTCTTACAGTGTTATTATTTATGAGTAAAACTAATTGGTTGTCCTGCATACTTTAATTATGATGTAATACAGGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTACGTAAAATAATTTACCTCTTTCCACTACTGTTTGTCCTCATCCAAATGTCCCCGTCATTTAAGAAATGAAATTCTTCTAATTGCGTTTATAAATTGTAAATTATATTGCATTTAGAAATTAAAATTCTTTTTCTTAATTTGTTTTCAAGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTAGGTAAACTTGACTGCATGTTTCCAAGTGGGAATTAAGACTATGAGAGAATTAGGC
人为切割第一段序列为：
CAGGCCTAGAAAGAAGTTTTGGGTAGGCTTTGTCTTACAGTGTTATTATTTATGAGTAAAACTAATTGGTTGTCCTGCATACTTTAATTATGATGTAATACAGGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTACGTAAAATAATTTACCTCTTTCCACTA人为切割第二段序列为：
GACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTACGTAAAATAATTTACCTCTTTCCACTACTGTTTGTCCTCATCCAAATGTCCCCGTCATTTAAGAAATGAAATTCTTCTAATTGCGTTTATAAATTGTAAATTATATTGCATTTAGAAATTAAAATTCTTTTTCTTAATTTGTTTTCAAGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTG
人为切割第三段序列为：
TCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTAGGTAAACTTGACTGCATGTTTCCAAGTGGGAATTAAGACTATGAGAGAATTAGGC
(2)重组人rAβ1-3蛋白的表达：
三段基因送至华大基因分别进行合成，并连接到表达载体pET-28a中，导入到表达菌BL-21中，形成三种表达工程菌Aβ-1，Aβ-2，Aβ-3，收到表达工程菌后分别于含氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基中37℃摇菌2h复苏工程菌活性，后在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中放大培养8h后，测OD值达到1.0时，加入IPTG，32℃诱导表达(终浓度10μg/mL)8h，收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，分别得到带HIS标签融合蛋白的目的蛋白rAβ1、rAβ2、rAβ3。
(3)重组人rAβ1-3粗制品的制备:
分别向带HIS标签融合蛋白的目的蛋白rAβ1、rAβ2、rAβ3中加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，20℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率:40W，工作2s，间隔1s，超声破碎10min，重复3次，于4℃，12000r/min离心30min分别取上清、沉淀，得到rAβ1、rAβ2、rAβ3的粗制蛋白；
(4)重组人rAβ1-3粗制品纯化:
分别对rAβ1、rAβ2、rAβ3的粗制蛋白进行纯化，具体方法如下：
亲和层析:将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 30mM还原性谷胱甘肽pH 8.6)梯度洗脱，收集rAβ峰；
脱盐、缓冲液置换:将第一步纯化的rAβ过脱盐柱，用缓冲液(50mMTris-ClpH10.0)置换，准备下一步离子交换层析；
离子交换层析:分别用Loading buffer(50mMTris-Cl pH7.0)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH7.0)梯度洗脱，收集rAβ峰；
分子筛层析:离子交换层析收集到的rAβ过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa2HPO4 0.15MNaCl pH7.0)收集rAβ峰；
取收集rAβ做Wersten Blot验证:使用abcam公司Aβ抗体(Y188)为第一抗体，使用abcam公司山羊抗兔IgG(HRP标记)为第二抗体做WB，沉淀与上清样本在约17kD处均有阳性条带，表明纯化后所得rAβ为β淀粉样蛋白。
加入20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用。
以下试剂盒的所用的即是纯化后的rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
实施例2
Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab单克隆抗体的制备
(1)小鼠免疫
选用6～10周龄，健康、发育良好的雌性BALb/c小鼠进行免疫。第一次腹腔注射0.2mL/鼠，间隔2周重复注射1次，融合前3d用同样剂量静脉注射加强免疫一次。取免疫后的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用完全培养液悬浮细胞，加入rHulL-2、rHulL-6、PWM和Aβ1-3，使其终浓度分别为50U/mL、500U/mL、1200和500ug/mL，置5％CO2，37℃温箱中培养5d后，收获细胞供融合用。
(2)杂交瘤选择
选用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。复苏的瘤细胞需在含10％新鲜小牛血清的RPMI-1640培养液中，置5％CO237℃温箱培养，每2d换培养液一次，3d传代一次。在倒置显微镜下挑选观察为圆形明亮，排列整齐，形态完整，密度适宜(0.1×106～1×106个/ml)。经台盼蓝染色，活细胞数应大于90％时供细胞融合用。
(3)细胞培养和融合
加入小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，免疫亲代脾细胞与骨髓留细胞在PEG作用下，膜先行融合形成双核细胞或混核体：
将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1/5比例混合，加入20mL RPMI-1640液，1500rpm×5min离心，弃上清，用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中，吸取1mL37℃预温的50％PEG缓缓滴入离心管内，1min内加完。37℃静置1min，滴加完全培养液(37℃预温)1mL，1min内加完，再加RPM1-1640液到50mL使PEC作用终止。800r/min×10min离心，弃上清，将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中，接种24孔或96孔培养板置37℃5％CO2温箱中培养。
(4)筛选克隆培养
经PEC处理后的两种亲本细胞，应用含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苦(HAT)培养液予以筛选出来克隆培养，融合后每3d换一次HAT培养液，每次吸出培养孔旧液1/2换入新液，连续2周(14天)。5d后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增值，当集落大于3mm或布满孔底1/2时，即取上清作抗体活性检测，同时补加新鲜HAT培养液。
(5)杂交瘤阳性克隆的克隆化
杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性抗Aβ1-3的McAb的细胞，用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选和克隆化。初筛出能分泌与预定抗原起反应的McAb杂交瘤细胞，再进一步从中筛选出有预定特异性的杂交瘤细胞，然后选出可供实际应用，具有能稳定生长和有功能特性的细胞克隆。采用软琼脂法筛选分离后将选出的杂交瘤细胞放入96孔板中培养。
(6)抗Aβ1-3McAb的制备
采取体内诱生法，制备腹水。
选择6-8周龄健康小鼠，先于小鼠腹腔注射0.3mL降植烷，7～10d后于每只小鼠腹腔注射阳性克隆的杂交瘤细胞1.0×108个，正常饲养。待小鼠腹部明显膨大到一定程度时，用9号针头抽取腹水或用16号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经12000rpm离心10min后，取上清分装。
(7)腹水的纯化
采用辛酸-硫酸铵法进行粗纯化后过亲和层析：腹水4℃，12000rpm离心15min，腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用1M NaOH调pH至4.5逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。12000r/min，4℃，30min，收集上清。上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的pH7.4的0.1M 10*PBS用1M NaOH调至7.4，冰浴至4℃。根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵，再搅拌0min，继续静置过夜。再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，沉淀溶解于结合缓冲液中。结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min，上样，结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质，用10个柱床体积洗脱液进行洗脱。纯化产物可以利用Hi Trap Desalting交换缓冲液。
(8)Aβ1-3McAb鉴定
对产生抗体的细胞克隆，检查染色体数目，约80～100条。
取腹水纯化产物1-3作为第一抗体，使用上述制备的rAβ1-3为抗原，使用abcam公司羊抗小鼠IgG(HRP标记，ab7063)为第二抗体做WB，对应好抗原和抗体分别孵育，在17kD处有阳性条带产生。见图2。因rAβ1-3已经商品化单抗验证，且使用abcam公司商品化单克隆抗体验证rAβ同样出现阳性条带，表明单克隆抗体制备成功。
从图1中泳道2-4阳性片段可以判定重组Aβ构建成功，并成功表达。从图2中泳道2～4出现的阳性片段结合实施例1重组人Aβ蛋白鉴定结果，并结合泳道5结果，可以判定山羊抗人Aβ蛋白三株单克隆抗体制备成功。
实施例3
β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制备
试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂校准品；
所述试剂R1包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000101
所述试剂R2包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000102
所述试剂校准品包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000103
其中，所述Aβ-latexMIX由三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别交联至聚苯乙烯胶乳微球后混合而成，所述三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别选用如权利要求2所述的杂交瘤细胞一、所述的杂交瘤细胞二和所述的杂交瘤细胞三分泌的抗体，rAβ1-3为三种目的蛋白rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
所述Aβ-latexMIX的制备方法如下：
1)准备50mM、pH6.0的MES缓冲液作为活化缓冲液，用活化缓冲液悬浮聚苯乙烯胶乳微球，得到浓度为1％(W/V)的微球活化液；
2)每mL微球活化液中加入20mg的EDC，室温孵育20min，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20min，得到微球孵育液；
3)通过离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球孵育液，最后将聚苯乙烯胶乳微球悬浮在包被缓冲液中，得到微球悬浮，包被缓冲液选用pH6.0，浓度为80mM的MES缓冲液；
4)用包被缓冲液溶解Aβ1-mab到1mg/mL，得到Aβ1-mab抗体溶液；
5)将Aβ1-mab抗体溶液快速加入搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育3h，得到反应溶液；
6)每mL反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌，室温孵育10min，得到交联混合液；
7)通过离心或超滤，用储存缓冲液悬浮交联混合液，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，获得Aβ1-mab的胶乳微球Aβ1-latex，储存缓冲液选用pH7.4的tris缓冲液；
8)按照上述操作，获得Aβ2-mab、Aβ3-mab的胶乳微球Aβ2-latex、Aβ3-latex；
9)将Aβ1-latex、Aβ2-latex、Aβ3-latex按2：2：3混合，获得Aβ-latexMIX。
实施例4
β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制备
试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂校准品；
所述试剂R1包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000111
Figure BDA0002823283970000121
所述试剂R2包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000122
所述试剂校准品包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000123
其中，所述Aβ-latexMIX由三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别交联至聚苯乙烯胶乳微球后混合而成，所述三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别选用如权利要求2所述的杂交瘤细胞一、所述的杂交瘤细胞二和所述的杂交瘤细胞三分泌的抗体，rAβ1-3为三种目的蛋白rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
所述Aβ-latexMIX的制备方法如下：
1)准备50mM、pH6.0的MES缓冲液作为活化缓冲液，用活化缓冲液悬浮聚苯乙烯胶乳微球，得到浓度为1％(W/V)的微球活化液；
2)每mL微球活化液中加入20mg的EDC，室温孵育20min，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20min，得到微球孵育液；
3)通过离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球孵育液，最后将聚苯乙烯胶乳微球悬浮在包被缓冲液中，得到微球悬浮，包被缓冲液选用pH6.0，浓度为50mM的MES缓冲液；
4)用包被缓冲液溶解Aβ1-mab到1mg/mL，得到Aβ1-mab抗体溶液；
5)将Aβ1-mab抗体溶液快速加入搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2h，得到反应溶液；
6)每mL反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌，室温孵育10min，得到交联混合液；
7)通过离心或超滤，用储存缓冲液悬浮交联混合液，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，获得Aβ1-mab的胶乳微球Aβ1-latex，储存缓冲液选用pH7.4的tris缓冲液；
8)按照上述操作，获得Aβ2-mab、Aβ3-mab的胶乳微球Aβ2-latex、Aβ3-latex；
9)将Aβ1-latex、Aβ2-latex、Aβ3-latex按2：2：3混合，获得Aβ-latexMIX。
实施例5
β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制备
试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂校准品；
所述试剂R1包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000131
所述试剂R2包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000132
Figure BDA0002823283970000141
所述试剂校准品包括如下组分：
Figure BDA0002823283970000142
其中，所述Aβ-latexMIX由三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别交联至聚苯乙烯胶乳微球后混合而成，所述三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别选用如权利要求2所述的杂交瘤细胞一、所述的杂交瘤细胞二和所述的杂交瘤细胞三分泌的抗体，rAβ1-3为三种目的蛋白rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
所述Aβ-latexMIX的制备方法如下：
1)准备50mM、pH6.0的MES缓冲液作为活化缓冲液，用活化缓冲液悬浮聚苯乙烯胶乳微球，得到浓度为1％(W/V)的微球活化液；
2)每mL微球活化液中加入20mg的EDC，室温孵育20min，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20min，得到微球孵育液；
3)通过离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球孵育液，最后将聚苯乙烯胶乳微球悬浮在包被缓冲液中，得到微球悬浮，包被缓冲液选用pH6.0，浓度为100mM的MES缓冲液；
4)用包被缓冲液溶解Aβ1-mab到1mg/mL，得到Aβ1-mab抗体溶液；
5)将Aβ1-mab抗体溶液快速加入搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育5h，得到反应溶液；
6)每mL反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌，室温孵育10min，得到交联混合液；
7)通过离心或超滤，用储存缓冲液悬浮交联混合液，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，获得Aβ1-mab的胶乳微球Aβ1-latex，储存缓冲液选用pH7.4的tris缓冲液；
8)按照上述操作，获得Aβ2-mab、Aβ3-mab的胶乳微球Aβ2-latex、Aβ3-latex；
9)将Aβ1-latex、Aβ2-latex、Aβ3-latex按2：2：3混合，获得Aβ-latexMIX。
实施例6
β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的评价
分析方法:两点终点法；
反应方向:上升反应；
校准方式:Logit-Log(5P)；
测定波长:570nm；
测定温度:37℃；
样本:试剂R1:试剂R2＝20:210:70(μL)
测试步骤：吸取20μL样本，加入210μL试剂R1，37℃孵育5min，加入70μL试剂R2，1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。
定标方法：5点定标，采用日立7180全自动生化分析仪(或其他品牌型号)，进行检测，设置校准品浓度分别为：5.625、11.25、22.5、45、90ng/ml(mg/L)。
依据浓度和ΔA值测算样本中Aβ含量。
(1)相关性验证
利用实施例3配方配制试剂，与酶联免疫法进行对照检测，检测50份临床血清样本，检测结果如下表1，获得了本发明试剂盒与酶联免疫法相关性曲线，见图3，从图3中可以看出本试剂盒与商品化人Aβ蛋白检测试剂盒相关性良好，通过检测结果显示，本案试剂与酶联免疫法的线性相关曲线为y＝0.8027x+2.7608，相关系数R2＝0.8152，说明两者较大的相关性。
表1本发明试剂盒与酶联免疫检测相关性比对值
Figure BDA0002823283970000151
Figure BDA0002823283970000161
(2)线性范围验证
使用重组Aβ1-3纯化品和生理盐水配制成浓度100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L和0mg/L(生理盐水对照)的测试品，使用本发明试剂盒测定各测试品浓度，以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。结果显示测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y＝1.0163x+0.1231，见图4，从图4中可以看出本发明试剂盒线性范围良好，相关系数R2＝0.997，说明线性关系良好，线性范围可达100mg/L。
表2本发明试剂盒线性范围验证
序号 稀释浓度 测试值1 测试值2 测试值3 平均数 预测值 绝对偏差 相对偏差
1 100 106.36 97.23 102.40 102.00 101.75 0.24 0.24％
2 50 47.65 51.38 54.27 51.10 50.94 0.16 0.32％
3 25 24.66 24.89 23.18 24.24 25.53 -1.29 -5.04％
4 12.5 13.20 12.51 12.53 12.75 12.83 -0.08 -0.63％
5 6.25 6.89 6.52 6.25 6.55 6.47 0.08 1.21％
6 0 1.15 0.89 0.97 1.00 0.12 0.88
(3)准确度及精密验证
取高值血清质控和低值血清各一份，使用所述试剂盒检测6次，取均值，与质控靶值进行比对。结果表明检测值较靶值相对偏差较小，CV较小，准确度及精密度较高。见表3。
表3所述试剂盒准确度验证结果
Figure BDA0002823283970000171
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002823283970000181
Figure BDA0002823283970000191
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽大千生物工程有限公司
<120> 一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组、杂交瘤细胞组及胶乳增强免疫比浊法试剂盒
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggcctaga aagaagtttt gggtaggctt tgtcttacag tgttattatt tatgagtaaa 60
actaattggt tgtcctgcat actttaatta tgatgtaata caggttctgg gttgacaaat 120
atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag aattccgaca tgactcagga 180
tatgaagttc atcatcaaaa attggtacgt aaaataattt acctctttcc acta 234
<210> 2
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactcaggat atgaagttca tcatcaaaaa ttggtacgta aaataattta cctctttcca 60
ctactgtttg tcctcatcca aatgtccccg tcatttaaga aatgaaattc ttctaattgc 120
gtttataaat tgtaaattat attgcattta gaaattaaaa ttctttttct taatttgttt 180
tcaaggtgtt ctttgcagaa gatgtgggtt caaacaaagg tgcaatcatt g 231
<210> 3
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgacagt gatcgtcatc accttggtga 60
tgctgaagaa gaaacagtac acatccattc atcatggtgt ggtggaggta ggtaaacttg 120
actgcatgtt tccaagtggg aattaagact atgagagaat taggc 165

Claims (7)

1.一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组，其特征在于：包括基因片段一、基因片段二和基因片段三，所述基因片段一的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因片段二的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因片段三的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种用于检测β淀粉样蛋白的杂交瘤细胞组，其特征在于：包括杂交瘤细胞一、杂交瘤细胞二和杂交瘤细胞三，所述杂交瘤细胞一由经基因片段一的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成，所述杂交瘤细胞二由经基因片段二的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成，所述杂交瘤细胞三由经基因片段三的表达产物免疫的细胞和骨髓瘤细胞融合而成。
3.一种β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括如下组分：
Figure FDA0002823283960000011
所述试剂R2包括如下组分：
Figure FDA0002823283960000012
所述Aβ-latexMIX由三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别交联至聚苯乙烯胶乳微球后混合而成。
4.如权利要求3所述的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述三株单克隆抗体Aβ1-mab、Aβ2-mab、Aβ3-mab分别选用如权利要求2所述的杂交瘤细胞一、所述的杂交瘤细胞二和所述的杂交瘤细胞三分泌的抗体。
5.如权利要求3或4所述的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述Aβ-latexMIX的制备方法如下：
5.1用活化缓冲液悬浮聚苯乙烯胶乳微球，得到微球活化液；
5.2向微球活化液中加入EDC，室温孵育，然后再次加入EDC，继续室温孵育，得到微球孵育液；
5.3用包被缓冲液清洗微球孵育液，然后将得到的聚苯乙烯胶乳微球悬浮在包被缓冲液中，得到微球悬浮；
5.4用包被缓冲液溶解Aβ1-mab，得到Aβ1-mab抗体溶液；
5.5将Aβ1-mab抗体溶液加入微球悬液中，持续搅拌室温孵育，得到反应溶液；
5.6向反应溶液中加入乙醇胺，持续搅拌室温孵育，得到交联混合液；
5.7用储存缓冲液悬浮交联混合液，移除未结合的抗体和乙醇胺，获得Aβ1-mab的胶乳微球Aβ1-latex；
5.8按照上述操作，获得Aβ2-mab、Aβ3-mab的胶乳微球Aβ2-latex、Aβ3-latex；
5.9将Aβ1-latex、Aβ2-latex、Aβ3-latex按2：2：3混合，获得Aβ-latexMIX。
6.如权利要求3或4所述的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：还包括试剂校准品，所述试剂校准品包括如下组分：
Figure FDA0002823283960000021
其中，rAβ1-3为三种目的蛋白rAβ1、rAβ2和rAβ3按1:1:1混合的混合物。
7.如权利要求3至6中任一项所述的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的测定方法，其特征在于：分析方法采用两点终点法，条件如下：
反应方向:上升反应；
校准方式:Logit-Log(5P)；
测定波长:570nm；
测定温度:37℃；
样本:试剂R1:试剂R2＝20:210:70(μL)
测试步骤：吸取20μL样本，加入210μL试剂R1，37℃孵育5min，加入70μL试剂R2，1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。
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