CN102047113A - 用于检测神经损伤的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病的方法以及用于诊断青光眼等伴随有神经损伤的疾病的组合物或试剂盒,其中,所述方法包括测定来自受试者的生物体样品中的序列号1~15所示的多肽、其突变体或其片段中的任意一种或多种。
Description
技术领域
本发明涉及一种对神经损伤的诊断有用的组合物或试剂盒。
本发明还涉及一种使用该组合物或试剂盒检测(或者判定或鉴定)神经损伤的方法。
背景技术
由于医疗技术的进步和社会环境的变化,近年来,随着年龄增长而发生或发展的疾病备受关注。代表性地如生活习惯病,据说这些疾病是体内产生的微小变化随年龄的增长而逐渐蓄积并发生、发展的。其中,以神经损伤为主要原因的疾病已成为严重的社会问题。
神经损伤是由于动脉硬化等原因引起向组织供给氧和营养的的末梢血管狭窄·闭塞,血流停滞、不能将营养成分充分地供给至末梢组织,结果导致神经功能异常的状态。血管障碍在血管丰富的器官·组织发生时引起神经损伤之类的严重问题,如果血管障碍在感觉器官、特别是在眼组织发生时,有时导致失明。
被称为房水的液体代替血液在眼睛中流动以运输营养等。房水在睫状体中生成从Schlemm氏管中排出。眼睛的形状被称作眼压的该房水的压力保持。眼压随时间或季节略微变化,但基本保持一定的值。
青光眼是一种由某种原因引起的视神经损伤、视野变窄的疾病,眼压上升被称为是其病因之一,为高龄者的失明原因之一。随着近年的高龄者人口的急剧增加,患者数也持续增加。
由于青光眼是无症状的所以早期发现困难。由于是能导致失明的疾病,所以早期进行诊断是非常重要的。一直以来,在青光眼的诊断中,主要进行眼底检查,在检查之前对患者滴入用于扩大瞳孔的散瞳药,然后,医师使用眼底镜或眼底照相机直接观察视网膜。但是,现状为:当散瞳药引起瞳孔扩大时,房水的流动变差,眼压上升,不能说完全不存在使病情进一步恶化的可能性。另外,不能说医师对视网膜的直接观察一定是客观的检测方法,由于医师必须一个人一个人地对患者进行检查,所以难以将该检查应用于包括大量受试者的集团检查。
如上所述,现有的检查方法存在较多的问题,人们期望一种用于早期诊断的、能够更客观且定量地显示患者的病态的发展程度和治疗中的经时变化、使患者负担少的高通量的检测方法。。
使用诊断标记的检测方法是客观的高通量方法之一。到目前为止公开了一种特异性识别由小梁细胞产生的作为糖皮质激素诱导蛋白质的TIGR的抗体的青光眼的诊断法(专利文献1)、和房水中的TGF-β的定量(非专利文献1)。上述方法不能使用上述标记以相对高的特异性判定青光眼,并且由于以诊断目的取出困难的眼组织为样品,所以该方法目前仍处于研究阶段。
随着近年的基因组分析或蛋白质组分析的进步,已经报道了各种各样的新型标记候选。青光眼中,通过使用眼组织的蛋白质组分析,已经报道了各种各样的新型标记候选(非专利文献2、非专利文献3)。但是,还没有通过使用血液样品的蛋白质组分析发现青光眼的蛋白质标记的报道、并且未知使用青光眼患者的血液中的蛋白质标记诊断青光眼的方法。人们期待如果能够开发出可以诊断青光眼的标记及可以使用该标记进行诊断的方法,则可以扩大应用于神经损伤自身的诊断。
专利文献1:日本特表平10-509866
非专利文献1:Min SH,Lee TI,Chung YS,Kim HK.,Korean JOphthalmol.2006Sep;20(3):162-5.Transforming growth factor-beta levelsin human aqueous humor of glaucomatous,diabetic and uveitic eyes.
非专利文献2:Bhuattacharya SK,Crabb JS,Bonilha VL,Gu X,Takahara H,Crabb JW.,Invest Ophthalmol Vis Sci.2006Jun;47(6):2508-14..Proteomics implicates peptidyl arginine deiminase 2 andoptic nerve citrullination in glaucoma pathogenesis.
非专利文献3:Tezel G,Tang X,Cai J.,Invest Ophthalmol Vis Sci.2005Sep;46(9):3177-3187.Proteomic identification of oxidatively modifiedretinal proteins in a chronic pressure-induced rat model of glaucoma.
发明内容
上述已知的标记、及标记候选物缺乏特异性及/或灵敏性,并且还没有确立从生物样品检测上述标记的有效方法,所以通常情况下不进行临床上的使用,因此强烈需要一种特异性及灵敏性更高的神经损伤的标记。另外,人们期望一种能够更客观及定量地显示出患者的病态的发展程度及术后的经时变化、使患者负担小的高通量检测方法。
本发明的目的在于提供一种对伴随有神经损伤的疾病、特别是青光眼的诊断有用的组合物、试剂盒、及使用该组合物或试剂盒的检测伴随有神经损伤的疾病的方法。
本发明人等通过对青光眼患者和其他眼部疾病患者的血液样品进行蛋白质组分析,发现了在青光眼患者中被特异性检测的血中蛋白质标记,并由此完成了使用该蛋白质标记的青光眼的检测方法的发明。
本发明具有以下特征。
(1)一种神经损伤的检测方法,包括定量或定性地测定及/或检测包含在来自受试者的生物体样品中的多肽、其突变体或其片段中的任意1种或多种,所述多肽含有序列号1~15所示的氨基酸序列。
(2)如(1)所述的方法,其中,神经损伤为眼组织的神经损伤。
(3)如(2)所述的方法,其中,眼组织的神经损伤为青光眼。
(4)如(1)~(3)中任一项所述的方法,其中,上述多肽、其突变体或其片段的测定及/或检测是使用质谱法进行的。
(5)如(4)所述的方法,其中,上述测定及/或检测是使用能与上述多肽、其突变体或其片段结合的物质进行的。
(6)如(5)所述的方法,其中,上述可结合的物质为抗体或其抗原结合片段。
(7)如(6)所述的方法,其中,使用的上述抗体为被酶、荧光物质、色素、放射性同位素或生物素中的任一种标记过的抗体。
(8)如(6)或(7)所述的方法,其中,所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或多克隆抗体或者其抗原结合片段。
(9)如(1)~(8)中任一项所述的方法,其中,所述生物体样品为血液、血浆或血清。
(10)一种用于诊断及/或检测神经损伤的组合物,含有选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
(11)一种用于诊断及/或检测神经损伤的试剂盒,含有选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
(12)如(10)或(11)所述的用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒,其中,神经损伤为眼组织的神经损伤。
(13)如(12)所述的用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒,其中,眼组织的神经损伤为青光眼。
(14)抗体探针在(11)~(13)中任一项所述的试剂盒的制造中的应用,其中,所述抗体探针选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
<定义>
本说明书中使用的用语具有以下定义。
本说明书中所谓的含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽的突变体,是指在序列号1~15所示的氨基酸序列或其部分序列中含有1或多个、优选为1或几个的氨基酸的缺失、取代、添加或插入的突变体,或者是含有与该氨基酸序列或其部分序列具有约80%以上、约85%以上、优选为约90%以上、较优选为约95%以上、约97%以上、约98%以上、约99%以上同一性的氨基酸序列的突变体。
本说明书中使用的“%同一性”的用语通常是指通过在2个氨基酸序列中引入空隙、或不引入空隙进行编组(比对)时,两个序列共有的同一氨基酸残基或位置的数相对于氨基酸残基或位置的总数的比例(%)。2个氨基酸序列的同一性可以使用数学算法确定,所述算法的例子为Karlin and Altshul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990,87:2264及作为其改良版的Karlin and Altshul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993,90:5873-5877。这种算法被引入BLASTN、BLASTX等(Altshulet al.,J.Mol.Biol.1990,215:403)。为了得到与本发明的序列号1~15所示的多肽的各氨基酸序列相同的氨基酸序列,使用例如分数=50、字长=3的BLAST程序进行BLAST的蛋白质检索。另外,为了得到引入空隙的比对,可以使用空隙引入BLAST(gapped BLAST)(Altshul et al.,Nucleic Acid Res.1997,25:3389)。
本说明书中使用的“几个”的用语是指约10、9、8、7、6、5、4、3或2的整数。
本说明书中使用的“化学修饰衍生物”的用语,是指例如通过酶、荧光物质、色素、放射性同位素等标记的标记化衍生物;或者含有生物素化、乙酰化、糖基化、磷酸化、泛素化、硫酸化等化学修饰的衍生物,但不限定于上述物质。
本说明书中使用的“用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒”的用语,是指可以直接或间接地用于下述用途的组合物或试剂盒:诊断及/或检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病的罹患的有无、罹患的程度或改善的有无或改善的程度,或者筛选对青光眼等伴随有神经损伤的疾病的预防、改善或治疗有用的候选物质。
本说明书中作为检测或诊断对象的所谓的“生物样品”,是指取自生物体的、含有或者可能含有随青光眼等伴随有神经损伤的疾病的发生而出现的靶多肽的样品,例如细胞、组织、体液(例如血液、淋巴液、尿等)等样品。
本说明书中所谓“特异性结合”是指抗体或其抗原结合片段只与本发明中作为青光眼标记的靶多肽、其突变体或其片段形成抗原-抗体复合体,与其他的肽性或多肽性物质实质上不形成该复合体。此处所谓的“实质上”,是指可能发生非特异性的复合体形成但程度小。
本发明中的青光眼等伴随有神经损伤的疾病的标记,由于在青光眼患者的血液等生物体样品中被发现,但在白内障或老年黄斑变性等其他眼部疾病中基本上、或完全未被发现,因此仅以该标记的存在或量为指标可以得到如下的显著的作用效果:例如使用血液可以容易地检测青光眼及伴随有神经损伤的疾病。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2008-091522号的说明书及/或附图中记载的内容。
具体实施方式
以下更具体地说明本发明。
<伴随有神经损伤的疾病的标记>
本发明的使用检测组合物或试剂盒用于诊断及/或检测伴随有神经损伤的疾病的标记,是含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段。所述组合物或试剂盒用于诊断或检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病。
本发明的含有序列号1~15的氨基酸序列的多肽、其蛋白质号(Swiss-Prot注册名及注册号)、及它们的特性均示于下述表1。所述多肽在青光眼患者血浆中被特异性检测,在白内障及老年黄斑变性的患者的血浆中未被检测或者与青光眼患者血浆中相比检测显著地减少。需要说明的是,序列表所示的上述多肽的氨基酸序列可以通过存取在Swiss-Prot等数据库中而获得。
[表1]
本发明中,用于检测伴随有神经损伤的疾病的上述靶多肽的特征在于,均只在青光眼患者的血浆中被检测,或者青光眼患者中的多肽水平显著地或格外地高于白内障及老年黄斑变性的患者。此处,所谓“显著地”是表示统计学上的显著,是显著性水平(p)低于0.05时使用的用语。
因此,在受试者的生物体样品中检测上述青光眼标记多肽中的任意1种、优选为2种或2种以上时,可以判定为青光眼、及神经损伤。
本发明中的多肽可以通过例如作为本领域中的惯用技术的化学合成(肽合成等)或DNA重组技术制备。从工序或纯化的简易的方面考虑,优选使用DNA重组技术。
首先,使用DNA自动合成装置化学合成编码本发明中的多肽的部分序列的多核苷酸序列。上述合成中通常使用亚磷酰胺法,通过该方法可以自动合成具有不超过约100个核苷酸长度的单链DNA。DNA自动合成装置例如可以从Polygen公司、ABI公司等商业获得。
将所得的多核苷酸用作探针或引物,通过众所周知的cDNA克隆化得到目标cDNA克隆,具体而言,从上述靶基因被表达的眼组织等活体组织中提取全RNA,使用寡聚脱氧胸苷纤维素柱对所述全RNA进行处理,通过RT-PCR法由所得的聚A(+)RNA构建cDNA文库,对该文库进行杂交筛选、表达筛选、抗体筛选等筛选,由此得到目标cDNA克隆。根据需要,也可以使用PCR法对cDNA克隆进行进一步扩增。由此可以得到对应于目标基因的cDNA。
探针或引物从基于序列号1~15所示的多肽序列的15~100个连续核苷酸的序列中选择,可以如上所述合成。另外,cDNA克隆技术例如被记载在Sambrook,J.and Russel,D.,Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,issued January 15,2001,Vol.1,7.42~7.45and Vol.2,8.9~8.17,andAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,1994,JohnWiley&Sons。
然后,将如上所述得到的cDNA克隆导入表达载体,通过培养由该载体转化或转染得到的原核或真核宿主细胞,可以从该细胞或培养上清液中得到目标多肽。此时,通过使编码分泌信号序列的核苷酸序列位于编码目标成熟多肽的DNA的5’末端,可以使成熟多肽在细胞外分泌。
载体及表达系统可以从Novagen公司、宝酒造、第一化学药品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、Roche Diagnositics公司、Invitrogen公司、Genetics Institute公司、Amersham Bioscience公司等获得。作为宿主细胞,可以使用细菌等原核细胞(例如大肠菌、枯草菌)、酵母(例如酿酒酵母)、昆虫细胞(例如Sf细胞)、哺乳动物细胞(例如COS、CHO、BHK、NIH3T3等)等。载体中,除编码该多肽的DNA之外,还可以含有:调节元件,例如启动子(例如1ac启动子、trp启动子、PL启动子、PR启动子、SV40病毒启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子、糖酵解酶启动子等);增强子;多腺苷酸化信号及核糖体结合位点;复制起点;终止子;选择标记(例如耐氨苄西林基因、耐四环素基因等耐药性基因;LEU2、URA3等营养缺陷型辅助标记等)等。
另外,为了容易地纯化多肽,也可以以标记肽结合在多肽的C末端或N末端的融合多肽的形式生成表达产物。代表性的标记肽中,可以举出含有6~10个组氨酸残基的组氨酸重复片段(His标签)、FLAG、myc肽、GFP多肽等,但标记肽不限定于此。
不添加标记肽生产本发明的多肽时,作为其纯化法,可以举出例如使用离子交换层析的方法。除此之外,也可以为组合下述技术的方法:凝胶过滤或疏水性层析、等电点层析、高效液相色谱(HPLC)、电泳、硫酸铵分馏、盐析、超滤、透析等。进而,该多肽与组氨酸重复单元、FLAG、myc、GFP标记肽结合时,可以举出使用适合于通常使用的每一个标记肽的亲和层析的方法。此时,可以构筑使分离·纯化变得容易的表达载体。特别是构筑以多肽和标记肽的融合多肽的形式表达的表达载体,并且使用该载体以基因工程制备该多肽。由此,可以容易地进行多肽的分离·纯化。
核酸的纯化可以通过使用琼脂糖凝胶电泳、DNA结合性树脂柱等的纯化法进行。另外,由于自动核酸纯化装置和核酸纯化试剂盒等可以通过商业渠道获得,所以也可以使用它们进行核酸纯化。
如上述所定义,本发明中的上述多肽的突变体是在序列号1~15所示的氨基酸序列或其部分序列中含有1个以上、优选为1个或几个的氨基酸的缺失、取代、添加或插入的突变体,或者是含有与该氨基酸序列或其部分序列具有约80%以上、约85%以上、优选为约90%以上、较优选为约95%以上、约97%以上、约98%以上、约99%以上同一性的氨基酸序列的突变体。上述突变体中,包括例如不同于人的哺乳动物种的同系物;基于同种哺乳动物(例如人种)间的多型性变异的突变体、剪接突变体、自然突变体等天然突变体。
本发明中的上述多肽的片段含有该多肽的氨基酸序列的至少7个、至少8个、至少10个、至少15个、优选至少20个、至少25个、更优选至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少150个或至少200个或全部连续的氨基酸残基,并且保持1个或多个表位。上述片段能与本发明的抗体或其抗原结合片段免疫特异性的结合。上述多肽存在于血液中时,例如设想该多肽通过存在于此的蛋白酶或肽酶等酶的切断和片段化而存在。
<用于诊断或检测青光眼的组合物或试剂盒>
本发明提供一种用于诊断及/或检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病的组合物,所述组合物含有选自抗体或其抗原结合片段、或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种、优选为3种以上、较优选为5种以上、更优选为10种以上、最优选为15种的不同抗体探针,所述抗体或其抗原结合片段、或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15表示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段特异性结合。
本发明中,“组合物”用语不仅指多个抗体探针的单一混合物,也指多个抗体探针的组合。
识别作为青光眼标记的多肽的抗体可以通过抗体的抗原结合部位与该多肽特异性结合。可用于本发明的抗体可以将含有序列号1~15的氨基酸序列的多肽、其突变体、其片段、或者其融合多肽用作1个或多个免疫原,通过惯用技术而制备。上述多肽、片段、突变体或融合多肽含有诱导抗体形成的表位,上述表位可以为直链,也可以为更高级结构(断续的)。可与抗体结合的表位通常被认为存在于多肽结构的亲水性表面上。
可用于本发明的抗体包括任意种类、纲、亚纲的抗体。所述抗体中例如含有IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgY、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。
进而,所有形式的抗体被本发明的多肽诱导。该多肽的全部或一部分或者表位被分离时,多克隆抗体及单克隆抗体均可以使用惯用技术制备。所述方法中例如可以举出Kemet et al(主编),Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in BiologicalAnalyses,Ple num Press,NewYork,1980中所述的方法。
多克隆抗体可以用本发明的多肽对鸟类(例如鸡等)、哺乳动物(例如兔子、山羊、马、绵羊、小鼠等)等动物进行免疫而制备。目标抗体可以通过适当组合硫酸铵分馏、离子交换层析、亲和层析等方法从被免疫的动物的血液中纯化。
单克隆抗体可以通过下述技术获得,所述技术包括使用惯用技术在小鼠中产生杂交瘤细胞株的步骤,所述杂交瘤细胞株产生对每个多肽均具有特异性的单克隆抗体。用于产生上述杂交瘤细胞株的方法之一包括下述步骤:用本发明的多肽对动物进行免疫,从被免疫的动物中取出脾脏细胞,将该脾脏细胞融合在骨髓瘤细胞株中,由此生成杂交瘤细胞,然后对产生与该多肽结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行鉴定。单克隆抗体可以通过惯用技术回收。
以下详细说明单克隆抗体及多克隆抗体的制备。
A.单克隆抗体的制备
(1)免疫及抗体产生细胞的收集
将如上所述得到的免疫原给与哺乳动物,例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔子等。免疫原的1次给与量根据免疫动物的种类、给与途径等适当确定,但每1只动物约为50~200μg。免疫主要通过皮下、腹腔内注入免疫原而进行。另外,免疫的间隔没有特殊限定,初次免疫后,在数日到数周的间隔,优选在1~4周的间隔中,进行2~10次、优选进行3~4次的追加免疫。初次免疫后,通过ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法等对免疫动物的血清中的抗体效价反复进行测定,抗体效价达到稳定水平时,静脉内或腹腔内注射免疫原,完成最终免疫。然后,从最终免疫日的2~5日后,优选在3日后,收集抗体产生细胞。作为抗体产生细胞,可以举出脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等,但优选为脾脏细胞或局部淋巴结细胞。
(2)细胞融合
产生对每个蛋白质均具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株可以通过惯用技术产生并进行鉴定。用于产生上述杂交瘤细胞株的方法之一包括下述步骤:用本发明的多肽对动物进行免疫,从被免疫的动物中取出脾脏细胞,将该脾脏细胞融合在骨髓瘤细胞株中,由此生成杂交瘤细胞,然后对产生与该多肽结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行鉴定。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞株,可以使用小鼠等动物的通常可获得的细胞株。作为使用的细胞株,优选具有下述性质的细胞株:具有药物选择性,以未融合的状态不能在HAT选择培养基(包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)中存活,只有以与抗体产生细胞融合的状态才能存活。另外细胞株优选来自与免疫动物同种的动物。作为骨髓瘤细胞株的具体例,可以举出作为来自Balb/c小鼠的次黄嘌呤·鸟嘌呤·磷酸核糖基·转移酶(HGPRT)缺陷细胞株的P3X63-Ag.8株(ATCC TIB9)等。
然后,将上述骨髓瘤细胞株与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合如下进行:在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用培养基中,在融合促进剂的存在下以约1∶1~20∶1的比例混合抗体产生细胞和骨髓瘤细胞株。作为细胞融合促进剂,可以以约10~80%的浓度使用平均分子量为1500~4000道尔顿的聚乙二醇等。另外,根据情况为了提高融合效率,也可以并用二甲基亚砜等辅助剂。进而,也可以使用利用了电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞株融合。
(3)杂交瘤的选择及克隆
从细胞融合处理后的细胞中选择目标杂交瘤。该方法可以如下进行:例如用含胎牛血清的RPMI-1640培养基等对细胞悬浊液进行适当稀释,之后将该悬浊液以200万个细胞/孔的程度加到微量滴定板上的各孔中,在各孔中加入选择培养基,然后适当地改变选择培养基进行培养。培养温度为20~40℃,优选为约37℃。骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷株或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷株时,通过使用含有次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核苷的选择培养基(HAT培养基),可以选择性地只对具有抗体产生能力的细胞和骨髓瘤细胞株的杂交瘤进行培养和增殖。结果为在选择培养基中开始培养后的约14天左右可以得到作为杂交瘤的开始生长的细胞。
然后,筛查在增殖的杂交瘤的培养上清液中是否存在目标抗体。杂交瘤的筛查可以按照通常的方法,没有特殊限定。例如,可以取出含有生长的杂交瘤的孔中的培养上清液的一部分,然后通过酶免疫测定法(EIA:Enzyme Immuno Assay及ELISA)、放射性免疫测定法(RIA:Radio Immuno Assay)等进行。融合细胞的克隆通过有限稀释法等进行,最终确立作为单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。杂交瘤在RPMI-1640、DMEM等基础培养基中培养是稳定的,并且杂交瘤能产生、分泌与本发明的多肽性青光眼标记特异性反应的单克隆抗体。
(4)抗体的回收
单克隆抗体可以通过惯用技术回收。即作为从确立的杂交瘤中收集单克隆抗体的方法,可以使用通常的细胞培养法或腹水形成法等。细胞培养法中,杂交瘤在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养基中、在通常的培养条件(例如37℃、5%CO2浓度)下培养2~10天,从该培养上清液中得到抗体。为腹水形成法时,对与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种的动物的腹腔内给与约1000万个杂交瘤,使杂交瘤大量增殖。然后,1~2周后从动物中取出腹水或血清。
上述抗体的收集方法中,必须纯化抗体时,可以通过适当地选择硫酸铵盐析法、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等公知的方法,或将它们进行组合,得到纯化的本发明的单克隆抗体。
B.多克隆抗体的制备
制备多克隆抗体时,与上述同样地对动物进行免疫,从最终免疫日开始的6~60天后,使用酶免疫测定法(EIA及ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体效价,在测定的抗体效价为最大之日进行采血,得到抗血清。然后,使用ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。
另外本发明中也可以使用上述抗体的抗原结合片段。通过惯用技术可产生抗原结合片段的例子中,包括Fab及F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv等片段,但不限定于此。另外也包括通过基因工程技术可产生的抗体片段及衍生物。上述抗体中,例如包括合成抗体、重组抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、单链抗体等。
本发明的抗体可以在体外及体内被使用,本发明中,抗体可以在用于检测多肽或它的(多)肽片段的存在的测定中使用。为了能在测定中特异性地检测,优选使用单克隆抗体,但即使为多克隆抗体,也可以通过包括使抗体结合在与纯化多肽相结合的亲和柱上的所谓的吸收法得到特异抗体。
因此,本发明的组合物可以含有能够与多肽、其突变体、或其片段特异性结合的抗体或其抗原结合片段中的至少1种,优选为多种(2种以上、3种以上等)、较优选为全部种类,所述多肽含有序列号1~15的氨基酸序列。
本发明中使用的抗体或其抗原结合片段,根据需要可以与例如为荧光团、酶、放射性同位素等标记结合,上述标记也可以与二次抗体结合。
荧光团中,例如包括荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹磺酰氯和其衍生物、伞形酮等。
酶中,包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
放射性同位素中,包括例如碘(131I、125I、123I、121I)、磷(32P)、硫(35S)、金属类(例如68Ga、67Ga、68Ge、54Mn、99Mo、99Tc、133Xe等)等。
其他的标记中,包括例如鲁米诺等发光物质、荧光素酶、荧光素等生物发光物质等。
另外,根据需要,也可以使用抗生物素蛋白-生物素类或链酶抗生物素蛋白-生物素类,此时,本发明的抗体或其抗原结合片段中例如也可以结合生物素。
如上所述,本发明进一步提供一种用于诊断及/或检测神经损伤、优选为眼的神经损伤、更优选为青光眼的试剂盒,含有选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段中的至少1种特异性结合。
与此相关,本发明还提供一种抗体探针在上述试剂盒的制备中的应用,所述探针为选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
该试剂盒包含例如不同容器(例如小瓶等),所述容器以个体或适当混合的形式装有用于检测青光眼标记的上述抗体探针。抗体探针优选以冷冻干燥的形式装在容器中。
另外,本发明的试剂盒也可以包含已附着(共价或非共价)或结合有可与上述各多肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段的例如多孔板、阵列、微量滴定板、试验片(或试验条)及乳胶微珠或磁性微珠等球状载体等固相载体。
试剂盒中还可以进一步含有在本发明的检测方法中使用的缓冲液、二次抗体、使用说明书等。
本发明的方法、组合物及试剂盒中,可以使用或含有核酸探针代替上述抗体探针。核酸探针为编码如上所述的含有序列号1~15所示的氨基酸序列的任意多肽的DNA、其突变体或其片段。上述核酸探针可以通过用于以基因重组技术制备相应多肽的上述方法制备。突变体或片段例如可以使用PCR法制备,所述PCR法使用合适的引物和亲本多肽(parent polypeptides)作为模板。核酸探针的大小通常可以为15~100个核苷酸或其以上、优选为20~80个核苷酸左右。另外,使用核酸探针时,在严格条件下进行DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等以检测目标标记。关于杂交条件,例如可以使用Sambrook,J.and Russel,D.,Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,published on January 15,2001,Vol.1,7.42-7.45,Vol.2,8.9-8.17,或Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,1994,JohnWiley&Sons,etc.等记载的条件。
<伴随有神经损伤的疾病的检测>
根据本发明,通过下述方法可以检测伴随有神经损伤的疾病,所述方法包括下述步骤:使用可与上述标记结合的物质,对来自受试者的生物体样品中的含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段中1种或多种的量或存在进行体外测定。根据本发明的方法,青光眼标记被检测、或基因表达水平被判定为显著地高于对照时,可以诊断为受试者处于神经损伤的发展阶段,患有眼的神经损伤、特别是青光眼。
本发明的方法中,上述伴随有神经损伤的标记的检测可以使用单个标记,优选使用多个例如2个以上、3个以上、4个以上、5个以上,22以下标记进行。这是为了避免非预期的非特异性复合体的检测,换言之是为了避免误诊。
本发明的组合物或试剂盒对伴随有神经损伤的疾病的诊断、判定或检测,即对罹患的有无或罹患的程度的诊断是有用的。在伴随有神经损伤的疾病的诊断中,进行与正常细胞、组织或体液等阴性对照的比较,检测受试者的生物样品中上述青光眼标记的存在或量,其存在或量的差别显著时,怀疑受试者处于神经损伤的发展阶段,或患有青光眼。
作为本发明方法中使用的试验样品,为血液、血清、血浆、尿等体液。
可以与上述青光眼标记结合的物质,除了上述抗体或其抗原结合片段之外,包括例如适配体、Affibody(商标)(Affibody公司)、各个青光眼标记的受体、各个阻碍青光眼标记的特异性作用的物质、各个活化青光眼标记的特异性作用的物质等,优选为抗体或其抗原结合片段、或它们的化学修饰衍生物。
本发明的实施方式中,测定可以包括如下工序:将根据需要用惯用的酶或荧光团标记的抗体或片段与组织切片、匀浆组织或体液接触的工序;定性或定量测定抗原-抗体复合体的工序。检测例如可以通过下述方法等进行:采用免疫电镜测定目标多肽的存在和水平的方法,采用酶抗体法(例如ELISA)、荧光抗体法、放射性免疫测定法、均一法、不均一法、固相法、夹层法等惯用法测定目标多肽的存在或水平的方法。目标多肽存在于体液或青光眼组织或细胞、优选存在于血液中时,或者与阴性对照相比目标多肽的水平显著增大或高时,判定为青光眼。此处,所谓“显著”是指统计学上的显著(p<0.05)。
作为代替免疫学方法的测定方法,包括使用质谱法的方法。具体而言,该方法可以通过实施例中所述的方法进行。即,使用过滤器过滤生物样品除去杂质,所述生物样品例如为血清或血浆,用缓冲液(例如pH约为8)稀释,调节为约10mg/ml~约15mg/ml的浓度,然后通过可除去分子量为5万以上的蛋白质的中空纤维过滤器(下述参考例(1))或离心型平膜过滤器进行分子量分馏,用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理馏分以使其肽化,将其注入质谱仪(使用基质辅助激光解吸离子化法或电喷射离子化法的类型),可以基于来自目标多肽的特定峰的质荷比和强度,测定青光眼患者与健康人或其他眼部疾病患者的样品中的多肽存在量的差异。
实施例
根据以下的实施例更具体地说明本发明。但是,本发明并不限制于这些实施例。
<参考例>
(1)中空纤维过滤器的制备
将100根在膜表面具有分馏分子量约5万的孔径的聚砜中空纤维扎成束,使用环氧类灌封剂将两末端固定在玻璃管上以使中空纤维的中空部分不关闭,制成微型组件。该微型组件(组件A)可用于除去血清或血浆中的高分子量蛋白质,其直径为约7mm、长为约17cm。同样地使用具有分馏分子量约3千的孔径的膜制备可用于浓缩低分子量蛋白质的微型组件(组件B)。微型组件具有一端与中空纤维内腔连接的入口,另一端则为出口。中空纤维入口和出口通过硅胶管形成封闭循环系统流路,液体被Peristar泵驱至该流路内进行循环。另外,中空纤维外套的玻璃管中装有端口(port)以排出从中空纤维中漏出的液体,由此构成了一个组件组。组件通过丁字连接器被连接在流路中部,3个组件A和1个组件B串联连接形成一个中空纤维过滤器。使用蒸馏水对该中空纤维过滤器进行洗涤,填充25mM碳酸氢铵水溶液(pH8.2)。将分馏原料的血清或血浆从该中空纤维过滤器的流路入口注入,分馏·浓缩后从流路出口排出。注入该中空纤维过滤器的血清或血浆经每个组件A即分馏分子量约5万的分子筛被分馏,分子量小于5万的低分子成分被组件B浓缩,由此进行制备。
<实施例1>
(1)正常眼压青光眼、白内障、及老年黄斑变性患者血浆蛋白质的鉴定
从平均年龄为82岁的10名正常眼压青光眼患者、及相仿年龄的10名白内障患者、10名老年黄斑变性患者得到肝素化血浆,并分别进行测定。离心分离血浆除去杂质。用25mM碳酸氢铵溶液(pH8.2)将该血浆进一步稀释至12.5mg/mL,使用参考例(1)所述的中空纤维过滤器根据分子量进行分馏。使用AKTA explorer 10s(GEHealthcare Biosciences株式会社)通过反相色谱将分馏后的血浆样品(总量为1.8mL,含有最大250μg的蛋白质)分离成3个馏分,将各部分冷冻干燥后,重新溶解在8M尿素溶液中。将该样品用DTT·碘乙酰胺处理后稀释至10倍,使用为蛋白质五十分之一量的胰蛋白酶在37℃下消化一夜以进行肽化。使用脱盐柱除去尿素后,进一步使用离子交换柱将各馏分的肽分馏成8种馏分。使用反相柱对各馏分进一步分馏,使用在线连接的质谱仪LCQ Deca XP plus(ThermoFisher Scientific K.K.株式会社)对溶出的肽进行测定。
(2)正常眼压青光眼患者、白内障患者、老年黄斑变性患者的血浆蛋白质表达的比较
通过使用作为蛋白质鉴定软件的Bioworks(Thermo FisherScientific K.K.株式会社)及Phenyx(GENEBIO社)解析上述(1)中测定的数据,进行广泛地蛋白质鉴定。从被鉴定的蛋白质中,将用2种软件均被鉴定出的蛋白质列出,作为从各疾病的患者血浆样品中被检测的蛋白质。这是为了通过组合算法不同的二种软件以排除一种软件的解析结果中含有的假阳性蛋白质而进行的。但是,Phenyx与Bioworks不同,由于是考虑了通过相同蛋白质的选择性剪接得到的异构体特异的氨基酸序列、和翻译后修饰之后的质量的变化等而进行的检索,所以可以对用Bioworks不能鉴定的肽进行鉴定。在上述条件下,仅被Phenyx鉴定的蛋白质也被列出。
各疾病中被列出的蛋白质中,将在正常眼压青光眼中被检测的、而在白内障患者、老年黄斑变性患者中完全未被检测的蛋白质当作血浆标记蛋白质。上述蛋白质为含有表1(上述)及序列表中所示的序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽,因此表明该蛋白质作为青光眼标记在青光眼的检测及在治疗中青光眼发展的诊断中是有用的。
产业上的可利用性
本发明能够提供一种特异性及灵敏性优异的、用于青光眼等伴随有神经损伤的疾病的诊断的组合物或试剂盒,特别是在制药及医药产业上有用。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请直接被引入本说明书中作为参考。
Claims (14)
1.一种神经损伤的检测方法,包括定量或定性地测定及/或检测包含在来自受试者的生物体样品中的多肽、其突变体或其片段中的任意1种或多种,所述多肽含有序列号1~15所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法,其中,神经损伤为眼组织的神经损伤。
3.如权利要求2所述的方法,其中,眼组织的神经损伤为青光眼。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,所述多肽、其突变体或其片段的测定及/或检测是使用质谱法进行的。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述测定及/或检测是使用能与所述多肽、其突变体或其片段结合的物质进行的。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所述可结合的物质为抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求6所述的方法,其中,使用的所述抗体为被酶、荧光物质、色素、放射性同位素或生物素中的任一种标记过的抗体。
8.如权利要求6或7所述的方法,其中,所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或多克隆抗体或者其抗原结合片段。
9.如权利要求1~8中任一项所述的方法,其中,所述生物体样品为血液、血浆或血清。
10.一种用于诊断及/或检测神经损伤的组合物,含有选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
11.一种用于诊断及/或检测神经损伤的试剂盒,含有选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针,其中,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
12.如权利要求10或11所述的组合物或试剂盒,其中,神经损伤为眼组织的神经损伤。
13.如权利要求12所述的组合物或试剂盒,其中,眼组织的神经损伤为青光眼。
14.抗体探针在权利要求11~13中任一项所述的试剂盒的制造中的应用,其中,所述抗体探针选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种,所述抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1~15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
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