CN103739716A

CN103739716A - 一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽及其应用

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Publication number: CN103739716A
Application number: CN201410001666.9A
Authority: CN
Inventors: 陈哲宇; 闫靖; 苏擘; 王越
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CN103739716B

Abstract

本发明涉及一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽及其应用。一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，由九个精氨酸构成的进膜序列连接线粒体分裂蛋白Drp1上第三十三位到第五十五位氨基酸组成，并且线粒体分裂蛋白Drp1上第四十四位的丝氨酸修饰为磷酸化形式。本发明根据首次发现的线粒体动态平衡受损的分子机制设计了具有动态平衡受损线粒体的融合多肽，经后期的实验证明，该融合多肽可有效的保护AD小鼠脑内神经元的存活，并可以改善小鼠的认知能力和记忆能力，具有作为临床药物的巨大潜力。

Description

一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽及其应用，特别涉及一种具有保护神经元线粒体动态平衡、防治阿兹海默氏综合症的多肽类药物，属于生物医药技术领域。

背景技术

阿兹海默氏综合症（AD）是神经退行性疾病中最为常见的老年性疾病，严重危害病人晚年的健康和生活质量。其病理学特征主要为β-淀粉粒的沉积（amyloid-β，Aβ），神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT），同时伴有神经元数量及突触数量的大量减少，临床上表现为认知能力减退，记忆能力受损等。

目前，并没有有效治疗阿兹海默氏综合症的临床药物和方法。根据美国食品及药物管理局（FDA）的资料，目前可用于临床治疗AD的药物有两大类，分别属于乙酰胆碱酯酶抑制剂（donepezil，galantamine，rivastigmine）和NMDA受体拮抗剂（memantine），但这两类药物仅仅可以轻度改善或者延缓痴呆的进程，并不能有效的控制病情，同时具有相当程度的副作用。因此，开发有效的治疗AD药物是全球药物开发的重中之重。

由于大脑是能量需求非常高的器官，用于满足其日常的突触形成和信号转导。而大量的科学研究显示AD患者及模型动物中神经元能量产生严重不足，线粒体作为人体功能的主要场所受到了广泛的关注。科学研究证实，线粒体的动态平衡对于其功能的维持具有非常重要的作用，而AD疾病中，恰恰伴有相当严重的线粒体动态平衡受损。

因此，能够改善线粒体的动态平衡的药物成为目前寻求治疗阿兹海默氏综合症的新的途径。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，由九个精氨酸构成的进膜序列连接线粒体分裂蛋白Drp1上第三十三位到第五十二位氨基酸组成，并且线粒体分裂蛋白Drp1上第四十位和四十四位的丝氨酸突变为天冬氨酸或是谷氨酰胺。

本发明利用九个精氨酸构成的进膜序列使得药物可以穿透细胞膜进入神经元中，保护神经元内线粒体的正常功能从而保护整个神经系统。所合成的生物学多肽可以通过生物素进行检测。长期在小鼠海马脑区给药并不会引起免疫反应等不良反应。

根据本发明优选的，所述线粒体分裂蛋白Drp1来自人类、大鼠或小鼠线粒体分裂蛋白Drp1。

根据本发明优选的，所述具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种带有标记物的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，是在氨基酸序列如SEQID NO.1所示的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽的N端连接生物素，序列如下：

Biotin-GRRRRRRRRR-TQSSGKSSVLE(p)SLVGRDLLP-C。命名为Tat-Drp1-SpS。

有益效果

本发明根据首次发现的线粒体动态平衡受损的分子机制设计了具有动态平衡受损线粒体的融合多肽，经后期的实验证名，该融合多肽可有效的保护AD小鼠脑内神经元的存活和突触的形成，并可以改善小鼠的认知能力和记忆能力，具有作为临床药物的巨大潜力。

附图说明

图1Tat-Drp1-SpS经液相色谱串联质谱分析的结果照片；

图2Tat-Drp1-SpS经二级质谱分析的结果照片；

图3Tat-Drp1-SpS阻断Drp1的磷酸化的SDS-PAGE电泳结果照片；

图4Tat-Drp1-SpS阻断GSK3诱导额线粒体过度分裂结果的柱状图；

图5Tat-Drp1-SpS阻断AD小鼠脑内Drp1的磷酸化并降低caspase-3活性的SDS-PAGE电泳结果照片；

其中：5A为Tat-Drp1-SpS阻断AD小鼠脑内Drp1的磷酸化的SDS-PAGE电泳结果照片，5B为Tat-Drp1-SpS阻断AD小鼠脑内caspase-3活性的SDS-PAGE电泳结果照片；

图6Tat-Drp1-SpS改善AD小鼠认知和记忆能力结果的柱状图；

其中：6A为Tat-Drp1-SpS改善AD小鼠认知能力的柱状图，6B为Tat-Drp1-SpS改善AD小鼠记忆能力的柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例所述的带有标记物的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽由GL生物化学公司化学合成。

实施例1

Tat-Drp1-SpS的合成，纯度和化学结构的鉴定

Tat-Drp1-SpS由GL公司直接通过化学合成的方法进行合成，序列如下：

Biotin-GRRRRRRRRR-TQSSGKSSVLE(p)SLVGRDLLP-C，

经液相色谱串联质谱分析得到此多肽纯度为96.85%（图1），经质谱分析得到此多肽分子量为3945.53KDa（图2）；

实施例2

Tat-Drp1-SpS在体外培养神经元水平的功能鉴定

1.实验对象：

体外培养7天的神经元细胞；

体外培养的神经元取自18天孕龄的Wistar大鼠的胎鼠海马脑区，在培养7天左右生长为成熟形式的神经元，并用于后续的实验；

2.实验组别：

实验采用神经元培养液（购自Invitrogen公司）内给药的方式给药，药物浓度为2μM，处理时间为2小时，随后进行后续的实验分析。实验分为两组，分别为对照组和实验组；

对照组：对照的药物多肽，序列为Biotin-GRRRRRRRRRRR-SSGKSAVLEALVGRD-C（由GL公司合成）

实验组：Tat-Drp1-SpS，序列为SEQ ID NO.1。

3.研究方法及实验步骤

1）关于多肽抑制神经元细胞内Drp1的磷酸化：首先在神经元内，采用慢病毒转染的方法将源自于人的GSK3β重组质粒转入神经元细胞内使其在细胞内表达蛋白,并在48小时后加入药物多肽，2个小时后裂解细胞，随后将细胞裂解液在12000g下离心15分钟，取上清。取400μL上清液加入2μL Drp1的抗体在4℃混匀两个小时后，加Protein A的珠子（购自Sigms公司）进行免疫蛋白共沉淀。第二天对免疫共沉淀的复合物采用10wt%SDS-PAGE胶根据蛋白分子量进行分离，检测药物多肽是否可以影响Drp1两个位点磷酸化；

2）关于多肽对神经元中线粒体形态的影响：在体外培养的神经元细胞中，转染线粒体指示标记MITO DS RED2重组质粒（购自Invitrogen公司），48小时后加入药物多肽进行处理，2个小时后对神经元用4wt%多聚甲醛固定，封片；将处理后的神经元在60倍荧光显微镜下采用单盲实验方法统计，对神经元的分裂情况进行统计；

4.实验结果：

1)Tat-Drp1-SpS对Drp1磷酸化的影响：如图3所示，免疫蛋白印记实验显示，对照组中，对照多肽并不能阻止过表达GSK3对Drp1的磷酸化，而本文设计的多肽Tat-Drp1-SpS阻止了GSK3对Drp1蛋白的磷酸化，证实了多肽的效应；

2)Tat-Drp1-SpS对线粒体分裂的影响：如图4所示，通过对线粒体的染色，可发现对照药物多肽并不能能阻止过表达GSK3对线粒体过度分裂的诱导，而Tat-Drp1-SpS可有效的阻止GSK3诱导的线粒体过度分裂；

Tat-Drp1-SpS在AD转基因小鼠中的功能鉴定

1.实验对象：

APPswe/PS1dE9转基因AD小鼠（购自广东医学动物实验中心），C57/B6种系，12个月左右，体重30g左右，雌雄各半，随机分为实验组和对照组；

2.实验处理：

在小鼠海马脑区内给予药物注射，每侧海马注射20μg药物，每天一次，持续14天；实验分为对照组和实验组：

对照组：对照的药物多肽，序列为Biotin-GRRRRRRRRRRR-SSGKSAVLEALVGRD-C

实验组：Tat-Drp1-SpS，序列为SEQ ID NO.1

3.研究方法和实验步骤：

1）在生化检测中，对小鼠进行药物处理海马14天后，脱颈椎处死后迅速取脑，随后取其海马脑区进行裂解，将蛋白裂解液用于免疫印迹蛋白的检测；检测小鼠脑内Drp1磷酸化情况的变化以及活性形式caspase-3的含量；

2）在行为学检测中，分别采用新奇物体认知实验以及条件性恐惧记忆模型进行检测，此两种模型已被广泛用于阿兹海默病的学习和记忆的研究中。在新奇物体认知实验中，将药物处理后的小鼠放入40*40cm的旷场中，在固定的位置放置两个相同的物体A，给予10分钟的探索时间后拿出；24小时后，将其中一个物体A取出，放入相似大小的物体B，给予3分钟的探索时间，小鼠探索A的时间记为TA，探索B的时间记为TB；因为小鼠天性对新奇物体的探索性，记忆力较好的小鼠会用更多的时间探索新物体B，所以小鼠探索新物体B的时间占探索A物体和B物体的总时间的比例，即TB/(TA+TB)可代表小鼠的认知能力；在条件性恐惧记忆实验中，将小鼠放入测试平台并给与三次电击使其形成恐惧性记忆，在24小时后，将其放入相同的平台中，检测其静止时间，静止时间越长，证明其对恐惧记忆的记忆越强，以此评价小鼠的记忆能力。

4.实验结果：

1）Tat-Drp1-SpS对AD小鼠脑内生化指标的影响：如图5A所示，采用免疫蛋白印记的方法，与对照组小鼠相比，Tat-Drp1-SpS处理的小鼠脑内Drp1磷酸化水平显著下降；如图5B所示，Tat-Drp1-SpS处理的AD小鼠表现出神经元凋亡程度下降，生化指标恢复较好；（图5）

2）Tat-Drp1-SpS对AD小鼠认知与记忆的影响：如图6A所示，在新奇物体认知实验中，Tat-Drp1-SpS的小鼠探索新物体时间明显增强，比对照组小鼠表现优秀，显示其认知能力的增强；如图6B，在条件性恐惧记忆中，Tat-Drp1-SpS处理的AD小鼠的静止时间显著增加，显示其记忆能力得到显著的恢复。

结论

结合上述实验结果分析本发明所述的Tat-Drp1-SpS相对于对照药物可以显著的抑制神经元细胞内GSK3诱导的线粒体过度分裂，并在AD小鼠体内降低Drp1的磷酸化，可以显著的改善AD小鼠在学习和记忆方面的能力。

Claims

1.一种具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，由九个精氨酸构成的进膜序列连接线粒体分裂蛋白Drp1上第三十三位到第五十二位氨基酸组成，并且线粒体分裂蛋白Drp1上第四十四位的丝氨酸修饰为磷酸化形式。

2.如权利要求1所述的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，其特征在于，所述线粒体分裂蛋白Drp1来自人类、大鼠或小鼠线粒体分裂蛋白Drp1。

3.如权利要求1所述的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，其特征在于，所述具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种带有标记物的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽，是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的具有保护神经元线粒体动态平衡的融合多肽的尾端连接生物素，序列如下：Biotin-GRRRRRRRRR-TQSSGKSSVLE(p)SLVGRDLLP-C。