CN103648517B - 神经保护肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗神经退行性紊乱的方法。该方法包括向所述的受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，并且包含神经保护活性。

Description

神经保护肽
本发明的技术领域和背景技术
在一些实施方案中，本发明涉及神经保护肽试剂及其用途。
神经退行性紊乱（例如阿尔茨海默氏疾病(AD)、帕金森氏疾病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和Huntington疾病(HD)）是成人发作的、慢性的、进行性且不可逆转的严重丧失能力的疾病，其中存在神经元的结构和功能的进行性丧失，包含神经元的死亡。
阿尔茨海默氏疾病（AD）是最普遍的神经退行性紊乱，其可表征为认知功能的进行性丧失。AD的组织病理学定义为蛋白质的异常，即，蛋白斑和神经元纤维的缠结，这是分别由淀粉样肽-β(Aβ)和过度磷酸化Tau蛋白的沉积所导致的。这些病理学伴随有神经元和白质的丧失、嗜刚果红血管病、炎症和氧化性损伤[1]。炎症在AD中的作用可通过老年斑周围的小神经胶质细胞形态学的改变以及神经胶质过多症来证明[2]。Aβ肽是由β-淀粉样肽前体蛋白质（APP）通过初始β-分泌酶切割、然后通过γ-分泌酶（在其催化核心与早老素1形成蛋白质络合物）的膜内消化而生产的。所得的肽被分泌并沉积在AD定义的淀粉样蛋白斑中[1]。
帕金森氏疾病(PD)是在大脑的黑质密部中多巴胺能神经元的选择性退化所导致的慢性进行性的神经退行性疾病。症状包含运动神经相关的情况，包含运动的震颤、肌张力增高、迟缓、以及姿势不稳定。自主功能障碍以及感觉和睡眠困难为非运动神经的症状。认知和神经行为的问题（包含痴呆）在疾病的晚期是普通的。PD通常在大约60岁显现，但是存在年轻人发作的情况。PD的主要病理学特征为黑质（更具体而言为密部的腹侧部）中的细胞死亡，从而到患者死亡时影响了至多70%的细胞[3]。
CD44编码了I类跨膜蛋白质家族，其由广泛的选择性剪切和翻译后修饰得到。变化位于蛋白质的最接近细胞外膜的部分，并且由变体外显子V2（在小鼠中为V1）至V10编码[4]。CD44为透明质酸（HA）的主要细胞表面受体，但是其还显示出与诸如胶原蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白和骨桥蛋白之类的蛋白质结合[5]。对于使淋巴细胞循环至炎症位点处的募集而言，CD44是必须的[6,7]。CD44S是最普遍的形式，并且大多数类型的细胞所表达，其中所述的CD44S不包含任何变体外显子[8]。CD44变体蛋白质大多与癌症和自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎[10]和多发性硬化[11]）相关报道[9]，其中包含10个变体外显子中的一个或多个。CD44剪接变体所提示的一种独特的功能为参与信号传导。例如，显示CD44V6对于通过酪氨酸激酶（例如c-Met[12]和VEGFR-2[13]）的信号发射而言是必须的。
在大脑中，CD44主要在白质的星形胶质细胞中发现[14-18]。与此不同的是，包含外显子V4、V5和V10的CD44变体局限于神经元[17]。此外，在短暂性前脑缺血后的海马体中，在活化的小神经胶质细胞中发现了CD44的表达[19]。当Akiyamaetal报道了CD44阳性星形胶质细胞的特定子集（其数量在AD的大脑中急剧升高）时，CD44首次与AD相关提及[14]。由于发现CD44对于视网膜神经节细胞的轴突是必须的，报道了CD44在CNS再生中的潜在作用[20]。由于与大脑中动脉阻塞后的野生型小鼠的梗塞面积相比，CD44缺陷型小鼠的梗塞面积减小，CD44在缺血性脑损伤中起到作用[21]。Lammichetal[22]报道，CD44通过早老素依赖的分泌物完成双重膜内分裂，其中所述的分泌物释放出细胞外结构域和用于推定的核信号发射的CD44细胞内结构域[22]。
WO2009007934教导与非AD个体相比，在AD患者的海马体中，剪接变体CD44V3、CD44V6和CD44V10的表达显著升高。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括：向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，包括：向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，前提条件是所述的肽并非由SEQIDNO:49或50所列的氨基酸序列构成，所述的肽包含神经保护活性。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了分离的肽，该肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，所述的肽包含神经保护活性，前提条件是所述的肽并非由SEQIDNO:1、51或52所列的氨基酸序列构成。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，包含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，该分离的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V10氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含式1所示的氨基酸序列：
X1-G-Y-T-S
其中X1为谷氨酸或谷氨酰胺的任意一者。
根据本发明的一些实施方案，所述的氨基酸序列包含拟肽。
根据本发明的一些实施方案，所述的拟肽包含逆反模拟物。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽如SEQIDNO:26、45或46所列。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽由CD44V10氨基酸序列构成。
根据本发明的一些实施方案，CD44V10氨基酸序列为人CD44V10氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，CD44V6氨基酸序列为人CD44V6氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含核心序列X1-X2-S-H，其中X1和X2为酸性氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，X1包含谷氨酸。
根据本发明的一些实施方案，X2包含天冬氨酸。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽由CD44V6氨基酸序列构成。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:8-15、18-45或46中所列的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:49或50中所列的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:2-7、16或17中所列的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于治疗神经退行性紊乱的分离的肽，该分离的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
根据本发明的一些实施方案，神经退行性紊乱选自：帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、多系统萎缩、阿尔茨海默氏疾病、中风、创伤性脑损伤、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆伴与染色体17相关的帕金森病、以及Pick疾病。
根据本发明的一些实施方案，神经退行性疾病为帕金森氏疾病。
根据本发明的一些实施方案，神经退行性疾病为阿尔茨海默氏疾病。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含选自SEQIDNO:12,15,17,19,24,26,31,32,34,36-38,43-46中的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:26或45中所列的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，本发明提供了药物组合物，包含作为活性试剂的分离的肽和药学上有效的载体，所述的分离的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过CD44V6氨基酸序列的100个氨基酸，并且包含神经保护活性。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽附着在细胞渗透试剂上。
根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸为天然存在的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸为合成的氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，合成的氨基酸包含D异构体。
根据本发明的一些实施方案，分离的肽共价附着在细胞渗透试剂上。
根据本发明的一些实施方案，细胞渗透试剂为肽试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽不超过20个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案，所述的肽的长度为5-10个氨基酸。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了选择用于治疗神经退行性疾病的试剂的方法，该方法包括：
(a)在神经毒剂存在下，使CD44V10/6肽与神经元细胞接触；以及
(b)监测神经元细胞的细胞死亡，其中与在CD44V10/6肽缺乏下神经元细胞的细胞死亡的量或时间相比，在CD44V10/6肽存在下神经元细胞的细胞死亡的量或时间降低指示用于治疗神经退行性疾病的试剂。
根据本发明的一些实施方案，神经毒剂选自淀粉样肽、谷氨酸盐、6-OHDA、MPTP和MPP+。
根据本发明的一些实施方案，给药包含皮下给药。
根据本发明的一些实施方案，给药包含鼻内给药。
除非另作说明，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有本发明所属领域中任一普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或相当的方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方案，但是示例性的方法和/或材料如下描述。在矛盾的情况下，本专利的说明书（包含定义）将具有控制权。此外，所述的材料、方法和实例仅是示例性的，无意于一定是限定性的。
附图简述
本发明的一些实施方案在本文中仅以实例的方式参照附图进行描述。现在详细地参见附图，重点在于所示的具体特征为实例，并且其目的在于示例性地讨论本发明的实施方案。就此而言，说明以及附图使得本领域的技术人员如何可以实施本发明的实施方案而变得显而易见。
在附图中：
如图1A-B为具有多种哺乳动物有机体的蛋白质序列的特征的CD44V6（图1A）和CD44V10（图1B）的多个蛋白质序列比对。使用蛋白质Blast在线算法（NCBI）进行比对。保守残基被标记为框，其中在所述的保守残基中，在任何物种中具有至多1个保守的替代。在保守残基中的非保守替代标记为红色字母。
图2示出了V6（小鼠）和V10（人）肽的列表，其中所述的肽的合成是根据图1所示的保守区域来指导的。
图3为柱状图，其示出了V6和V10肽在3种浓度下对使用80μMAβ(1-42)处理48小时后的SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。使用XTT比色测定来确定细胞的生存能力。
图4A-B为柱状图，其示出了V6和V10肽在1nM下对使用25μMAβ(25-35)处理48小时后的N2A小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出（图4A）通过XTT测量的相对的细胞生存能力以及（图4B）相对的Caspase3活性水平。
图5A-B为柱状图，其示出了V6和V10肽在1μM下对使用200μMMPTP处理48小时后的N2A小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出相对的细胞生存能力（图5A）以及Caspase3活性水平（图5B）。
图6A-C为这样的图，其示出了在表1和图2中所列的人V6和V10肽在1pM下对使用30μM处理48小时后的N2A小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出相对的生存能力（图6A）以及Caspase3活性（图6B）。在各种浓度下，测试N-乙酰化的和C-酰胺化的V10A1_N+4肽对30μM6-OHDA在N2A细胞中的保护作用。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力。
图7A-B为柱状图，其示出了在表1和图2中所列的人V6和V10肽在1pM下对使用25μMAβ(25-35)处理48小时后的SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力（图7A）和Caspase3活性（图7B）。
图8A-B为柱状图，其示出了在表3中所列的人P26衍生的肽在10fM和1pM下对使用30μM6-OHDA(图8A)或40μM(图8B)处理22小时后的N2A小鼠神经母细胞瘤细胞的生存能力的影响。在图8B中，将细胞与所述的肽预温育2.3小时，然后加入6-OHDA；而在图8A中，将6-OHDA与所述的肽一起加入。示出通过阿尔玛蓝荧光测量的相对生存能力。
图9为柱状图，其示出了在新目标识别（NOR）任务中，在保持测试阶段上，重复IH/ICV给药P26(SEQIDNO:26,1,10和100ng/大鼠)或P34(SEQIDNO:34,10和100ng/大鼠)对鉴别指数的影响。**P<0.01Aβ(1–42)是媒介物VS对照组(无Aβ(1–42))并且##P<0.01是VS媒介物对照的情况。
图10A-B为皮下（SC）给药所述的肽对微注射Aβ后的摩里斯水迷宫（MWM）空间记忆测试的影响的图。A为在MWM中经过4段训练时期后的平均潜伏期。在肽处理组中，P26组示出与赋形剂组相比较低水平的平均潜伏期（在第2、3和4天中为#p<0.001）。B示出了在测试时期上在目标象限中的时间消耗。P26示出了在目标象限中与赋形剂组（UV未处理组）相比较高水平的时间消耗(#p<0.05)。
图11为柱状图，其示出了SC给药的肽对微注射Aβ后的NOR测试的影响。示出在保持测试阶段上的鉴别指数。*P<0.05VS对照组并且#p<0.05VS只有Aβ组的情况。
图12为示出P26(SEQIDNO:26)和P26-RI(SEQIDNO:45)的药代动力学的图，其中所述的药代动力学是在雄性SpragueDawley大鼠中皮下给药剂量为1mg/kg的肽之后进行评价的。使用LC-MS/MS方法来定量血浆样品中的两种肽。最低定量限（LLOQ）为22.34ng/mL。
图13为CD44的基因组结构的示意图。
本发明的具体实施方案的描述
在一些实施方案中，本发明涉及神经保护肽试剂及其用途。
在详细地讲解本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是本发明并非一定使其用途局限于在以下说明书中列出的或通过实施例举例说明的详细情况。本发明可以为其他实施方案，或者以不同的方式实施或执行。
之前发现，与非AD的个体相比，剪接变体CD44V3、CD44V6和CD44V10的表达在AD患者的海马体中显著升高。表达的CD44变体被进一步表征，并发现为主要的神经元[23]。
本发明人表征了由CD44V6和V10外显子序列衍生的多个肽的功能，并发现这些肽赋予神经元细胞对神经毒素（例如β淀粉样肽(Aβ)、MPTP和6-OHDA）的抗性，表明这些肽或衍生物可以作为用于治疗神经退行性紊乱的药品。
本发明人进行了结构-功能分析，从而揭示赋予神经保护的最小活性结构域。结果在用于帕金森氏疾病和阿尔茨海默氏疾病的动物模型中进一步证实。这些发现使得本发明的肽成为用于药品研发的前导化合物。
因此，根据本发明的一个方面，提供了分离的肽，其包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，其中所述的肽包含神经保护活性。
根据本发明的其他或备选方面，提供了分离的肽，其包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，所述的肽包含神经保护活性。
根据一个实施方案，CD44V10氨基酸序列并非由以下序列构成：
DSTDRIPATIRNDVTGGRR(SEQIDNO:49)；或
NSNVNRSLSGDQDTFHPSG(SEQIDNO:50)。
根据另一个实施方案，CD44V6氨基酸序列并非由以下序列构成：
DSTDRIPATIQATPSSTTE(SEQIDNO:51)；或
DSHSTTGTAGDQDTFHPSG(SEQIDNO:52)。
包含在SEQIDNO:49-52中所列的氨基酸序列的肽被考虑用于治疗神经退行性疾病，其在下文中进一步详细描述。
如本文所用，“CD44”是指如在RefSeq编号No:NM_000610.3中所列的在大量的哺乳动物细胞类型中表达的细胞表面蛋白质。根据具体的实施方案，CD44为人CD44基因。包含外显子1-5和16-20的标准的同工型（命名为CD44）在大部分的细胞类型中表达。在图13中提供了基因结构，包含剪接变体CD44V6和CD44V10的基因结构。
如本文所用，术语“CD44V10”相当于SEQIDNO:53（RefSeq编号No:NM_000610.3，人CD44抗原同工型1前体，NCBI参照序列）的氨基酸配合物537-604，并且通过SEQIDNO:2举例说明。
如本文所用，术语“CD44V6”相当于SEQIDNO:53（RefSeq编号No:NP_000601.3，人CD44抗原同工型1前体，NCBI参照序列）的氨基酸配合物386-427，并且通过SEQIDNO:8举例说明。
如本文所用，短于“神经保护活性”是指防止神经细胞死亡。其作用可以采用保护神经元细胞（即，神经元）凋亡或退化的形式。合格地用于神经保护活性的测试包含细胞生存能力测试（例如XTT、MTT）、形态学测试（例如细胞染色）、或者凋亡生物化学测试（例如Caspase3活性等）。
根据具体的实施方案，CD44V6氨基酸序列为人CD44V6氨基酸序列。
根据具体的实施方案，CD44V10氨基酸序列为人CD44V10氨基酸序列。
根据另一个具体的实施方案，所述的肽由CD44V6氨基酸序列(SEQIDNO:2)构成。
尽管将本发明进一步简化为实践，但是本发明人揭示赋予神经保护的肽部分（氨基酸序列）包含核心序列X1-X2-S-H，其中X1和X2为酸性氨基酸。
如本文所用，短语“酸性氨基酸”是指在生理pH下为极性且带负电荷的天然存在的或合成的氨基酸。
根据具体的实施方案，X1包含谷氨酸。
根据具体的实施方案，X2包含天冬氨酸。
根据具体的实施方案，所述的肽包含SEQIDNO:6或7的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，CD44V6由CD44V6氨基酸序列(SEQIDNO:2)构成。
根据另一个实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:2-7,16或17中所列的氨基酸序列。
如所提及的那样，本发明还考虑了CD44V10的肽。因此，根据示例性实施方案，所述的肽包含在SEQIDNO:8-15,18-46、或者具体为SEQIDNO:8-15,18-38,39-42或43-46中所列的氨基酸序列。
尽管将本发明进一步简化为实践，但是本发明人能够鉴别在赋予神经保护中为活性的CD44V10的最小部分。
因此，根据示例性实施方案，CD44V10肽包含式1的氨基酸序列：
X1-G-Y-T-S，
其中X1为谷氨酸或谷氨酰胺的任一者。
下文将进一步详细描述，所述的肽的氨基酸序列包含拟肽，例如逆反模拟物（例如SEQIDNO:45或46）。
根据示例性的实施方案，所述的肽在SEQIDNO:26中列出。
根据示例性的实施方案，所述的肽在SEQIDNO:26,45或46中列出。
根据另一个具体的实施方案，所述的肽由CD44V10氨基酸序列(SEQIDNO:8)构成。
如本文所用，术语“肽”是指天然或合成的氨基酸的聚合物，涵盖了天然的肽（或者降解产物，以合成方式合成的多肽或重组多肽）和拟肽（例如翻转、反向或逆反的，通常为以合成方式合成的肽），以及作为多肽类似物的类肽和半类肽（其可以具有例如修饰，从而使所述的肽在肌体中时甚至更稳定，或者更能够渗透到细胞中）。
此类修饰包含但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、多肽键修饰，包含但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH、CF=CH、主链修饰、和残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法是本领域公知的，并且在例如QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplinPergamonPress(1992)中详述，所述的文献以引用方式并入本文，如同在本文中全部列出一样。下文将提供这方面的其他细节。
所述的多肽中的多肽键(-CO-NH-)可以被例如N-甲基化的键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-),α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R为任何的烷基，例如甲基、碳胺键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH=CH-)、反向酰胺键(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-，其中R为天然存在于碳原子上的“正常的”侧链)。
这些修饰可以在沿着多肽链的任何键上以及甚至在多处(2-3)同时形成。
天然的芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以取代合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、naphthylelanine(Nol)、Phe的环甲基化的衍生物、Phe的卤化衍生物或者O-甲基-Tyr。
除了上文所述，本发明的多肽还可以包含一种或多种修饰的氨基酸、或者一种或多种非氨基酸单体（例如脂肪酸、络合的碳水化合物等）。
如在以下说明书和权利要求书部分所用，术语“一种氨基酸”或“多种氨基酸”可以理解为包含：20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸通常在体内经过翻译后修饰，包含例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包含但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包含D-和L-氨基酸（立体异构体）。
下表A和B列出了可以在本发明中使用的天然存在的氨基酸（表A）和非常规的或修饰的氨基酸（表B）。
表A
氨基酸 三字母缩写 单字母符号
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酰胺 Gln Q
谷氨酸 Glu E
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Iie I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
蛋氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
上文所述的任何氨基酸 Xaa X
表B
表B续.
本发明的肽的氨基酸可以被保守或非保守的取代。
如本文所用，术语“保守的取代”是指在所述的肽的天然序列中存在的氨基酸被具有相似空间性质的天然或非天然存在的氨基酸或拟肽所替代。在待替代的天然氨基酸的侧链为极性或疏水性的情况下，保守的取代应该在同为极性或疏水性（除了具有与所替代的氨基酸的侧链具有相同的空间性质）的天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或拟肽部分中进行。
由于天然存在的氨基酸通常根据它们的性质来分类，所以记住根据本发明，空间相似的非带电荷氨基酸替代带电荷的氨基酸被认为是保守的取代，则可以容易地确定被天然存在的氨基酸的保守的取代。
就产生被非天然存在的氨基酸的保守的取代而言，还可以使用本领域公知的氨基酸类似物（合成氨基酸）。天然存在的氨基酸的拟肽在技术实施者已知的文献中较好的证明。
当影响保守取代时，取代氨基酸应该具有与侧链中原始氨基酸相同或相似的官能团。
如本文所用，短语“非保守的取代”是指在亲代序列中存在的氨基酸被具有不同电化学和/或空间性质的另一种天然或非天然存在的氨基酸所替代。因此，取代氨基酸的侧链可以明显大于（或小于）被取代的天然氨基酸的侧链，和/或可以具有与被取代的氨基酸显著不同的电性质的官能团。这种类型的非保守取代的实例包含苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸、异亮氨酸取代甘氨酸、或者-NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-取代天冬氨酸。落入本发明的范围的这些非保守取代为仍构成具有神经保护性质的肽的那些取代。
如所提及的那样，本发明的肽的N-和C-末端可以受到官能团的保护。合适的官能团在GreenandWuts,″ProtectingGroupsinOrganicSynthesis″,JohnWileyandSons,Chapters5and7,1991中有所描述，该文献的教导以引用方式并入本文。优选的保护基团为例如通过降低化合物的亲水性和增加化合物的亲脂性而有利于附着于该基团上的化合物运送至细胞中的那些。
这些部分可以在体内在细胞内通过水解或酶的方式裂解。羟基保护基团包含酯、碳酸和氨基甲酸保护基。胺保护基包含烷氧基和烷氧基羰基，如上文用于N-末端保护基中所述。羧酸保护基包含脂肪族、苯甲基和芳基酯，如上文用于C-末端保护基中所述。在一个实施方案中，优选的是使用甲基、乙基、苯甲基或取代的苯甲基酯保护在本发明的肽中在一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链中的羧酸基团。
N-末端保护基的实例包含酰基(-CO-R1)和烷氧基羰基或芳氧基羰基(-CO-R1)，其中R1为脂肪族、取代的脂肪族、苯甲基、取代的苯甲基、芳香族或取代的芳香族基团。酰基的具体实例包含乙酰基、(乙基)-CO-,正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、月桂酰、棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、油酰苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苯甲基-CO-、以及(取代的苯甲基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基的实例包含CH3-O-CO-、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO-、异丙基-O-CO-、正丁基-O-CO-、仲丁基-O-CO-、叔丁基-O-CO-、苯基-O-CO-、取代的苯基-O-CO-和苯甲基-O-CO-、(取代的苯甲基)-O-CO。金刚烷、naphtalen、myristoleyl、tuluen、联苯基、肉桂酰、nitrobenzoy、苯甲酰、糠酰、苯甲酰、环己烷、降莰烷、Z-己酸。为了有利于N-酰化作用，在分子的N-末端可以存在1至4个甘氨酸残基。
可以通过例如酰胺（即，在C-末端的羟基被-NH2、-NHR2和-NR2R3替代）或酯（即，在C-末端的羟基被-OR2替代）保护在化合物的C-末端的羧基。R2和R3独立地为脂肪族、取代的脂肪族、苯甲基、取代的苯甲基、芳基或取代的芳香剂。此外，考虑到氮原子，R2和R3可以与大约0-2的其他杂原子（例如氮、氧或硫）形成C4至C8杂环。合适的杂环的实例包含哌啶基、吡咯烷基、吗啉代、硫代吗啉代或哌嗪。C-末端保护基的实例包含-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基)2、-N(甲基)(乙基)、-NH(苯甲基)、-N(C1-C4烷基)(苯甲基)、-NH(苯基)、-N(C1-C4烷基)(苯基)、-OCH3、-O-(乙基)、-O-(正丙基)、-O-(正丁基)、-O-(异丙基)、-O-(仲丁基)、-O-(叔丁基)、-O-苯甲基、以及-O-苯基。
值得注意的是，本发明的肽（如上文所述由CD44V6、CD44V10衍生的）一般是指本发明的CD44肽。
本发明的CD44肽（即，神经保护肽部分）的长度为3-100、3-50、3-40、或3-30个氨基酸。根据其他的实施方案，所述的肽的长度为3-20、5-20、5-20、5-18、5-15、5-10、7-10、8-10个氨基酸。
如上文所述和在实施例部分中，就神经保护活性而言，本发明的CD44肽可以是合格的，其中在实施例部分中使用体外和体内模型用于神经保护和神经退行性状况。
本教导可以进一步用于鉴别用于治疗神经退行性疾病的试剂。
因此，提供了这样的方法，其包含：
(a)在神经毒剂存在下，将CD44V10/6肽与神经元细胞接触；以及
(b)监测所述的神经元细胞的细胞死亡，其中与在所述的CD44V10/6肽缺乏下所述的神经元细胞的细胞死亡的量或时间相比，在所述的CD44V10/6肽存在下所述的神经元细胞的细胞死亡的量或时间表明用于治疗神经退行性疾病的试剂。
监测神经细胞死亡的方法是本领域公知的，并且在上文（在神经保护下）以及接下来的实施例部分中进一步描述。
如本文所用，神经毒剂是指通常通过杀死神经元来损毁神经系统和/或脑的分子、状况或状态。
根据具体的实施方案，神经毒剂选自淀粉样肽、谷氨酸盐、6-OHDA、MPTP、以及MPP+。
为了改善CD44肽的生物利用度，在所述的肽中的单个、部分或者甚至所有的氨基酸都可以为对酶蛋白水解活性不敏感的D-氨基酸，并且可以完全改善本发明的肽作为药物的用途。本发明的肽可以附着（共价或非共价的方式）在渗透试剂上。
如本文所用，短语“渗透试剂”是指加强任何所附着的肽穿过细胞膜的迁移的试剂。
根据一个实施方案，渗透试剂为肽，并且通过肽键附着（直接或非直接的方式）在CD44肽上。
通常，肽渗透试剂具有这样的氨基酸组成，其包含相对丰度较高的带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸；或者具有这样的序列，其包含极性/带电氨基酸以及非极性疏水氨基酸的交替模式。
非限定的实例，为了加强细胞内的渗透，可以使用细胞渗透肽（CPP）序列。CPP可以包含HIVTAT蛋白质的短的及长的版本的蛋白质转导结构域（PTD）[YGRKKRR(SEQIDNO:54)，YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:55)，或者RRQRR(SEQIDNO:56)]。但是，本公开不限于此，并且可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的渗透试剂。
根据具体的实施方案，本发明的肽缀合物不超过25、30或40个氨基酸（这包含了CD44肽以及任何额外的附着序列，例如上文所述的细胞渗透肽）。
此外，本发明的肽还可以包含非氨基酸部分，例如附着在肽上的疏水部分（各种线性、支化、环状、多环或杂环的烃及烃衍生物）；非肽渗透试剂；各种保护基团，特别是在所述的化合物为线性的情况下，所述的保护基团附着在化合物的末端，从而降低降解。化合物中存在的化学（非氨基酸）基团可以包含在内，以便改善各种生理性质；降低降解或清除；降低由各种细胞泵引起的排斥，改善免疫原活性，改善各种给药方式（附着各种序列，该序列允许渗透通过各种屏障、通过肠等）；增加特异性，增加亲和性，降低毒性等。
本发明的肽的氨基酸序列成分与其他非氨基酸试剂的附着可以通过共价连接，通过非共价络合来进行，例如通过与疏水聚合物络合，该聚合物可以被降解或裂解，从而产生能够持续释放的化合物；通过使所述的肽的氨基酸部分被诱捕在脂质体或微团中，从而产生本发明的最终的肽。结合可以通过使氨基酸序列诱捕在其他成分（脂质体、微团），或者通过使氨基酸序列浸渍在聚合物中，从而产生本发明的最终的肽。
本发明的肽可以为线性或环状（环化作用可以改善稳定性）。环化作用可以通过本领域已知的任何手段进行。在化合物主要由氨基酸构成的情况下，环化作用可以为通过N-与C-末端、N-末端与侧链、N-末端与主链、C-末端与侧链、C-末端与主链、侧链与侧链、侧链与侧链、以及主链与主链的环化作用。此外，本发明的环化作用还可以通过将非氨基酸有机部分包含在所述的肽中来进行。
本发明的肽可以是生物化学合成的，例如通过使用标准的固相技术。这些方法包含专有的固相合成、部分固相合成方法、片段缩合法、经典溶液合成法。固相多肽的合成过程是本领域公知的，并且在JohnMorrowStewart和JanisDillahaYoung，SolidPhasePolypeptideSyntheses(2ndEd.，PierceChemicalCompany，1984)中进一步描述。
大规模的肽合成由AnderssonBiopolymers2000;55(3):227-50进行了描述。
可以通过制备高效液相色谱[CreightonT.(1983)Proteins,structuresandmolecularprinciples.WHFreemanandCo.N.Y.]来纯化合成的肽，并且肽的组成可以通过氨基酸测序来实施。
此外，重组技术也可以用于生成本发明所述的肽。为了利用重组技术来产生本发明的肽，将编码本发明所述的肽的多核苷酸连接至核酸表达载体中，该表达载体包含在顺式调节序列(例如，启动子序列)的转录调控下的多核苷酸序列，其中所述的顺式调节序列适合在宿主细胞中指导构成性的、组织特异性的或诱导性的本发明所述的多肽的转录。
除了在宿主细胞中合成，本发明所述的多肽还可以使用体外表达系统合成。这些方法是本领域公知的，并且该系统的成分是市售可得的。
如所提及的那样，凭借它们的神经保护功能，本发明的肽可以用于治疗神经退行性紊乱。
因此，根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，其包含向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V10氨基酸序列的20个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗有需要的受试对象的神经退行性紊乱的方法，其包含向受试对象给药治疗有效量的分离的肽，该肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3个氨基酸和不超过所述的CD44V6氨基酸序列的20个氨基酸，并且包含神经保护活性，由此治疗神经退行性紊乱。
如本文所用，短语“有需要的受试对象”或“受试对象”是指哺乳动物，优选为任何年纪下的遭受神经损害或者处于发展成神经损害的风险下的人。
如本文所用，短语“神经损害”是指表征为神经元细胞和/或神经胶质细胞的急性和/或进程性损害和/或损失的任何疾病、紊乱或状况。
根据本发明的一些实施方案，与神经损害有关的病理学会影响中枢神经系统的神经元和/或神经胶质细胞。
由对神经元细胞的急性或突发损害所引起的病理学的非限定性实例包含脑损伤、脊髓损伤、头损伤和中风[脑血管意外(CVA)]。
根据本发明的一些实施方案，与神经损伤有关的病理学为癌症。影响神经元和神经胶质细胞的癌症的非限定性实例包含胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、脑的腺癌、以及远端癌症（例如乳腺癌、肺癌等）的转移。
根据本发明的一些实施方案，与神经损伤有关的病理学是慢性的。
根据本发明的一些实施方案，与神经损伤有关的病理学为神经退行性疾病。
示例性的神经退行性疾病或状况包含但不限于多系统萎缩、中风、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆伴与染色体17相关的帕金森病、创伤性脑损伤(TBI)、Pick疾病、多发性硬化、Lupuseruthromatosis、阿尔茨海默氏疾病、帕金森氏疾病、老年性痴呆、肌萎缩侧索硬化、Down′s综合症、荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、反应性淀粉样变、家族性地中海热、家族性淀粉样肾病伴荨麻疹和耳聋、大威尔斯综合症、突发性骨髓瘤、巨球蛋白血症相关的骨髓瘤、家族性淀粉样多神经病变、家族性淀粉样心肌病、IsolatedCardiacAmyloid、全身老年性淀粉样变、成人突发性糖尿病、胰岛瘤、孤立性心房淀粉样变、甲状腺髓样癌、家族性淀粉样变、遗传性脑出血伴淀粉样变、家族性淀粉样多神经病、痒病、Creutzfeldt-Jacob疾病、GerstmannStraussler-Scheinker综合症、牛海绵状脑炎、朊病毒介导的疾病、以及Huntington疾病。
根据具体的实施方案，神经退行性疾病为阿尔茨海默氏疾病。
根据具体的实施方案，神经退行性疾病为帕金森氏疾病。
本发明的肽可以以药物组合物本身或者作为药物组合物的一部分来提供，在作为药物组合物的一部分来提供的情况下，将所述的肽与合适的载体或赋形剂混合。
如本文所用，“药物组合物”是指一种或多种本文所述的活性组分与其他化学成分（例如生理学合适的载体和赋形剂）形成的制剂。药物组合物的目的是为了便于将化合物给予有机体。
本文中的术语“活性组分”是指产生生物效应的肽。
在下文中，短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可交换使用，是指不会引起对有机体的明显刺激并且不消除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包含在这些短语中。
本文中的术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步有利于给予活性组分的惰性物质。赋形剂的实例包含但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、凝胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和给药药品的技术可以在“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版中找到，其以引用方式并入本文。
适合的给药途径可包含例如口服、直肠、经粘膜（尤其是经鼻）、肠或肠胃外传递，包含肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心脏内（例如进入右或左心室腔、进入冠状总动脉）、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
如在接下来的实施例部分的长度部分中所述，本发明的肽能够在直接向脑给药（例如通过海马内(IH)注射、侧脑室(ICV)注射、颅内(IC)或鞘内给药，从而根本上提供了局部的给药模式，这些给药方式在本文中均有所考虑）时保护对抗阿尔茨海默氏和帕金森氏疾病。
用于将药品传递至中枢神经系统（CNS）的传统方法包含：神经外科策略（例如大脑内注射或侧脑室输注）；试剂的分子操控（例如产生嵌合融合蛋白，其包含对内皮细胞表面分子具有亲和性的运输肽、以及其本身不能穿过BBB的试剂），试图利用BBB的一种内部运输途径；设计用于增加试剂的脂溶性的药理学策略（例如水溶性试剂与脂质或胆固醇载体缀合）；以及通过高渗透压破坏来暂时破坏BBB的整体性（将甘露醇溶液输注到颈动脉或者使用诸如血管紧缩素之类的生物活性试剂来达到）。然而，这些策略中的每一个都具有局限性，例如与侵入性手术过程有关的固有风险；由内部运输系统所固有的局限所施加的尺寸限制；与由载体基元构成的嵌合分子的系统给药有关的潜在不理想的生物副作用，其中所述的载体基元在CNS外部是活性的；以及在其中BBB被破坏的脑的区域中可能的脑损伤的风险，这使得其为不理想的传递方法。
本发明所述的药物组合物可通过本领域公知的工艺来制造，例如，采用常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、水飞、乳化、胶囊化、包埋或冻干工艺。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，该生理学上可接受的载体包含赋形剂和辅料，其有利于活性组分加工成药学上可使用的制备物。合适的配方取决于所选择的给药途径。
对于注射剂，药物组合物的活性组分可以在水性溶液中配制，优选在生理学相容的缓冲中配制，例如Hank溶液、Ringer溶液、或生理盐缓冲剂。对于经粘膜给药，在配方中使用了适合待透过的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
对于口服给药，药物组合物可以容易地通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体结合而配制。此类载体能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等以供患者口服摄入。供口服使用的药理学制备物可以使用固体赋形剂制备，可任选地在加入合适的辅料（如果需要）后研磨所得的混合物，并加工颗粒混合物，从而获得片剂或糖衣丸的核。合适的赋形剂具体为：填充剂，例如糖，包含乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、凝胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐（例如海藻酸钠）。
提供具有合适包衣的糖衣丸核。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以可任选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、涂膜溶液(lacquersolution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包含由凝胶制备的推入适配胶囊(push-fitcapsule)，以及由凝胶和增塑剂（例如甘油或山梨醇）制备的软的密封胶囊。推入适配胶囊可以包含与填充剂（例如乳糖）、黏合剂（例如淀粉）、润滑剂（例如滑石粉或硬脂酸镁）、以及可任选的的稳定剂预混的活性组分。在软胶囊中，可以将活性组分溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡、或液态聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。口服给药的所有配方的剂量应适合于所选择的给药途径。
对于含服给药，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于经鼻吸入给药，根据本发明使用的活性组分可以以喷雾剂制备物的形式方便地传递，其中所述的制备物通过使用合适的推进剂（例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳）由加压的包装或喷雾器提供。对加压的气雾剂而言，可以通过提供阀门来传递经计量的量以确定剂量单位。可以配制在分配器中使用的诸如凝胶之类的胶囊和盒，以包含化合物和合适的粉基（例如乳糖或淀粉）的混合粉末。
可以配制本文所述的药物组合物以用于肠胃外给药，例如，通过团注或持续输注。用于注射的配制物可以以单位剂型提供，例如，在安瓿中或在具有可任选的添加的防腐剂的多剂量容器中。组合物可以是在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以包含诸如悬浮试剂、稳定试剂和/或分散试剂的配方剂(formulatoryagent)。
用于肠胃外给药的药物组合物包含水溶性形式的活性制备物的水性溶液。此外，活性组分的混悬剂可以制备成基于合适的油或水的注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包含脂肪油（例如芝麻油）、或合成脂肪酸酯（例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体）。水性注射混悬剂可以包含能够增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，混悬剂还可以包含合适的稳定剂或增加活性组分的溶解度以便能够制备高浓度溶液的试剂。
备选地，活性组分可以为粉末形式以用于在使用前与合适的媒介物构建，例如，基于无菌无热原水的溶液。
此外，本发明的药物组合物还可以配制为直肠用组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，其使用了例如传统的栓剂基质，例如可可油或其他甘油酯。
适用于本发明上下文的药物组合物包含这样的组合物，其中含有有效达到预期目的的量的活性组分。更具体而言，治疗有效量意味着可有效预防、减轻或缓解紊乱（例如帕金森氏疾病、阿尔茨海默氏疾病）的症状或延长接受治疗的受试对象的存活期的活性组分（CD44肽）的量。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文所提供的发明详述。
对于本发明的方法中使用的任何制备物，治疗有效量或剂量可以通过体外和细胞培养测试初步估算。例如，在动物模型中配制某一剂量，从而取得所需的浓度或效价。此信息可用于更精确地确定在人类中的有用剂量。
本文所述的活性组分的毒性和治疗效力可以通过在体外、细胞培养或实验动物中的标准制药过程来确定。从体外、细胞培养测试和动物研究中获得的数据可以用来配制用于人类的一定范围的剂量。剂量根据所采用的剂型和所利用的给药途径而有所不同。确切的配方、给予途径和剂量可由医生个人参照患者病情进行选择（参见，例如Fingl等，(1975)″ThePharmacologicalBasisofTherapeutics″，Ch.1p.1）。
剂量和间隔可以单独地调节至活性组分足以诱导或抑制生物学作用的脑或血液的水平（最低有效浓度，MEC）。对于各种制备物而言，MEC将改变，但是可以由体外数据来估算。取得MEC所必需的剂量将取决于个体的特征和给药途径。可以使用检测分析来确定血浆的浓度。
根据所治疗状况的严重性和应答性，定量给药可以是单次给药或多次给药，疗程持续数日或数周或直至达到治愈或实现了疾病状态的减轻。
当然，待给药的组合物的量将取决于所治疗的受试对象、痛苦的严重性、给药方式、处方医师的判断等。
如果需要，本发明所述组合物可以在包装容器或分配装置中提供，例如FDA批准的试剂盒，其可以包含含有活性组分的一种或多种单位剂型。包装容器可以包含例如金属或塑料薄膜，例如透明包装。包装容器或分配装置可以附有给药说明书。此外，还可以以由监管药物的生产、使用或销售的政府机构规定的形式通过与容器有关的公告对包装容器或分配装置进行调整，该公告反映了机构对该组合物的形式或人类或动物给药的批准。这样的公告可以为，例如美国食品和药品监督管理局批准标签用于处方药或作为已批准产品的说明书。此外，还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明的制备物的组合物，将其放置在合适的容器中，并标记用于治疗所指示的状况，如上文进一步详述的那样。
如本文所用，术语“大约”是指±10%。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包含但不限于化学、药理、生物、生化和医疗领域的从业人员已知的，或由已知的方式、手段、技术和过程容易地研发的那些方式、手段、技术和过程。
如本文所用，术语“治疗”包含去除，基本上抑制、减缓或逆转状况的进程，基本上改善状况的临床或美学症状，或基本上预防状况的临床或美学症状的外观。
应该理解的是，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以与单独的实施方案以组合的方式提供。反之，为简洁起见，在单独实施方案的上下文中所描述的不同的发明特征也可以单独或以任意合适的亚组合形式或在本发明的任何其他所述的实施方案中适当地提供。在不同的实施方案的上下文中所描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案在没有这些元素时无法实施。
如上所述及如下权利要求书所要求的本发明的各种实施方案和方面可从如下实施例中得到实验性支持。
实施例
现参考以下实施例，其与以上说明书以非限制的方式说明本发明的某些实施方案。
通常，本文中使用的术语和本发明利用的实验过程包含分子、生化、微生物和重组DNA技术。文献对此类技术进行了充分说明。例如参见，“MolecularCloning：AlaboratoryManual”Sambrooketal.，(1989)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”VolumesI-IIIAusubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubeletal.，“CurrentProtocolsinMolecularBiology”，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“APracticalGuidetoMolecularCloning”，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)；Watsonetal.，“RecombinantDNA”，ScientificAmericanBooks，NewYork；Birrenetal.(eds)“GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries”，Vols.1-4，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)；在美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中列出的方法；″CellBiology:ALaboratoryHandbook″,VolumesI-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；″CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique″byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition；″CurrentProtocolsinImmunology″VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994)；Stitesetal.(eds),″BasicandClinicalImmunology″(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；MishellandShiigi(eds),″SelectedMethodsinCellularImmunology″,W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可利用的免疫测试在专利和科学文献中广泛描述，例如参见美国专利No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；″OligonucleotideSynthesis″Gait,M.J.,ed.(1984)；“NucleicAcidHybridization″Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1985)；″TranscriptionandTranslation″Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1984)；″AnimalCellCulture″Freshney,R.I.,ed.(1986);″ImmobilizedCellsandEnzymes″IRLPress,(1986)；″APracticalGuidetoMolecularCloning″Perbal,B.,(1984)and″MethodsinEnzymology″Vol.1-317,AcademicPress；″PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications″,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshaketal.,″StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual″CSHLPress(1996)；所有这些文献均以引用方式并入本文，如同在本文中全部列出。在本文件的全文中提供了其他一般的参考。其中的过程被认为是本领域公知的，并为读者提供便利。其中所包含的所有信息以参考方式并入本文。
实施例1
由CD44的外显子6和10得到的活性肽的鉴别
材料和方法
所有的肽均通过LifeTein(SouthPleinfield,NJ,USA)合成，纯度为>95%。将N2A小鼠神经母细胞瘤和SK-N-SH人神经母细胞瘤（ATCC）保持在补充有10%胎牛血清、L-Glut和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(BeitHaemek,Israel)。将细胞保持在37℃、5%CO2的孵化器中。试验前使用3μMRA(Sigma-Aldrich)将SK-N-SH细胞处理5天，从而允许细胞分化成神经元细胞。使细胞在24孔平板中生长，使用Aβ肽处理48小时或者使用MPTP（Sigma-Aldrich，24hrs）处理，其后使这些细胞经历XTT生存能力测试。XTT生存能力测试是基于代谢活性细胞将四唑盐XTT还原为桔色化合物甲臜的能力。水溶性燃料的强度与代谢活性细胞的数量成比例。在使用生长培养基以1:3稀释后，将XTT(BeitHaemek,Israel)加入到处理后的细胞中，并温育1-2小时。在420nm下测量吸光率。通过Caspase3测试(EnzChekCaspase3Assaykit,Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA)，根据制造商提供的说明书进行生存能力测试。
结果
使用siRNA的功能试验的体外和体内损失表明CD44V6和CD44V10在神经退行性紊乱（例如AD、PD和ALS）中起作用（数据未公开）。CD44S和剪接变体同工型显示参与了多种蛋白质-蛋白质间的相互作用，包含在信号传导途径中的相互作用(Pontaetal[9]的综述)。因此，本发明预见此类相互作用可以调节CD44V6和CD44V10在神经元细胞死亡中的功能，以及由V6或V10外显子序列衍生的肽可以起到干扰这些相互作用的试剂的作用。实际上显示由人V6序列衍生的小的五肽(NRWHE-SEQIDNO:1)能够抑制通过Met酪氨酸激酶受体的肝细胞生长因子（HGF）的信号传导[24]。
为了识别可以帮助识别此类肽的保守序列，本发明人针对V6和V10序列进行了多个物种序列的比对（图1）。基于保守序列，在V6和V10外显子中覆盖不同区域的合成的多种肽被合成（图2）。测定这些肽对神经母细胞瘤细胞系N2A（小鼠）和SK-N-SH（人）的细胞死亡的作用。如图3所示的实例，测试由小鼠V6序列衍生的两种肽和由人V10序列衍生的两种肽在3种浓度下对由Aβ1-42肽诱导的SK-N-SH细胞的细胞死亡的作用。通过还原XTT测量细胞的生存能力。显示相对生存能力百分率100%定义为非处理细胞的生存能力。发现与非肽对照相比，所有4种肽至少赋予细胞以保护（图3）。令人惊奇的是，V6肽所赋予的保护在浓度低至20pM下最大，并且在更高的浓度下，保护程度降低。进一步合成由小鼠V6和人V10序列衍生的其他肽（6-21氨基酸，图2），并比较它们在N2A细胞中针对Aβ25-35毒性的保护活性（图4A-B）。Aβ25-35模拟了毒理学，及全长肽的累积性质，并且效力增加[25]。在1nM浓度下，如通过生存能力测试（XTT，图4A）和Caspase3活性（作为诱导凋亡的标志物，图4B）所测量，大部分的肽至少部分保护了细胞。此外，还针对由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的细胞死亡来测试这些肽的保护情况，旗子旗子所述的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶为PD造模神经毒素，其代谢形成毒性阳离子1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)。实际上，还发现与对照细胞（不具有肽）相比，一些肽在1μM下具有对抗MPTP的保护作用。结果示于图5A-B中。
实施例2
CD44肽的结构/功能分析
材料和方法
所有的方法与上述实施例1中的相同。肽和6-羟多巴胺购自Sigma-Aldrich(St.Lewis,USA)。
结果
这些发现促使本发明人扩大对所述的肽的筛选，以得到由V6B、V10A和V10B人序列中的保守区域衍生得到的较小的肽（表1）。
表1（就图6和7而言）
针对它们在1pM浓度下对6-羟多巴胺（6-OHDA）处理的N2A细胞的保护作用来筛选这些肽。6-OHDA为多巴胺类似物，其通常用于模型系统中，从而模拟体外和体内的帕金森氏疾病。6-OHDA通过释放反应性氧物质（ROS）以及通过可能的直接作用于线粒体呼吸链来诱导凋亡。结果显示肽对6-OHDA处理的细胞的细胞生存能力和Caspase3活化的作用不同（图6A-B）。在广泛的剂量范围内测试一些肽的保护作用。例如，对8肽V10A1_N+4而言，发现最佳的保护剂量为大约fM浓度（图6C）。此外，在pM浓度下，在SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞中针对Aβ(25-35)诱导的毒性的作用测试肽面板。肽有效对抗Aβ应激的概况与6-OHDA-有效的肽明显不同（图7A-B）。
实施例3
本发明的一些肽在体内帕金森氏模型中的体内作用
材料和方法
在第1和2天分隔3hr，通过腹膜内（IP）注射，使用18mg/kgMPTP(Sigma-Aldrich)以100μl/小鼠的剂量给药C57BL小鼠（所有小鼠均为雄性，8-12周龄，得自HarlanLaboratoriesIsrael）。在研究的第0天，并连续的8天，使用PBS（媒介物）或一种肽在1mg/kg下，以12μl/小鼠鼻内给药小鼠。通过LifeTein合成体内研究中使用的所有肽，并且使用N-末端乙酰化和C-末端酰胺化来修饰。就鼻内滴注而言，温和地麻醉(2.5%异磷氟烷)各个小鼠，然后将颈部控制并保持与桌子平行，同时将12μl的总量给药鼻孔。将6μl以两滴3μl给药左侧鼻孔，然后保持15秒，并将6μl以两滴3μl给药右侧鼻孔，然后保持15秒。在第8天，通过颈脱位将动物无痛处死。在无痛处死后立即除去脑，并切开纹状体（将左侧和右侧的纹状体合并），称重并在干冰中冻结。通过在80W下进行5秒钟的超声处理，将纹状体样品在包含0.1M高氯酸和10ng/mg3,4-二羟苯甲胺(DHBA)的溶液中均化。将各个组织提取物的上清液直接注射到HPLC泵(JascoPU-2080Plus)的逆向柱(GL-Science,InertsilODS-25um4.6x150mm，在室温下)上，其中所述的逆向柱与具有条件细胞模型5021和分析细胞模型5011的电化学检测器CoulochemIIESA偶联。在条件细胞模型下，将工作电位设定至0.35V，在分析细胞模型下，将工作电位设定为0.1V至-0.35V。流动相为0.05M磷酸二氢钠，以及80mg/LEDTA、125mg/L庚烷磺酸、55ml甲醇和50ml乙腈（pH=2.7）。流动速率为1.5ml/min。将多巴胺、DOPAC和HVA值归一化至裂解液蛋白质浓度(BCAkit,Pierce)。
结果
针对小鼠中体内PD模型（即，注射MPTP）来选择对抗MPTP和6-OHDA的最有效的肽。在这种模型中，重复的腹膜内注射MPTP（在连续的2天内在3h间隔下给与18mg/kg）得到黑质中多巴胺能的神经元死亡以及纹状体的多巴胺耗尽。从第1天开始以1mg/kg每日两次鼻内滴注施加所述的肽（或媒介物），然后暴露于MPTP，并持续直到研究结束。在注入MPTP后的第7天，杀死小鼠，并通过HPLC评价多巴胺（DA）、3,2-二羟苯基乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的纹状体水平。在8组中测试9种肽，并将DA、DOPAC和HVA的结果示于表2中。
具体而言，表2说明了人V6和V10-衍生的肽（1mg/kg，鼻内给药）在MPTP处理的小鼠中对多巴胺和代谢物的纹体状水平的作用。根据材料和方法中所述的方案处理小鼠。通过HPLC确定DA、DOPAC和HVA的纹体状水平，然后除以总的蛋白质含量值，并归一化至在媒介物处理的小鼠获得的水平。1组和3组采用正常命名的与逆反类似物（反向序列中的D氨基酸）的1:1混合物进行处理。6组使用10B2.5_6和10B2.5_9肽的1:1混合物进行处理。
表2
SEQ ID NO 肽的名称 DA DOPAC HVA
1 17 hV6B1_C4 20.7 41.7 16.6
2 19 V10A/B_S 26.6 27.2 13.7
3 24 V10A1_N6 17.7 24.3 -0.7
4 26 V10A1_N+4 58.0* 61.8* 28.5
5 15 hV10B3 18.1 22.5 44.2*
6 31和32 10B2.5_6+10B2.5_9 13.6 35.1 53.0*
7 34 10B1_8 46.6* 75.9** 83.3**
8 12 hV10A2 24.7 54.8* 73.4**
*p值<0.05
**p值<0.01
与媒介物对照相比，使用两种V10衍生的8肽（即，V10A1_N+4(SEQIDNO:26)和10B1_8(SEQIDNO:34)）进行处理对纹状体的DA水平具有显著的积极作用。此外，这些肽以及3种其他的肽（hV10B3–SEQIDNO:15；V10A2–SEQIDNO:12；10B2.5_6–SEQIDNO:31；以及10B2.5_9–SEQIDNO:32）显著增加2种DA代谢物（DOPAC和HVA）中的至少一者的水平（上文表2）。这些结果表明由CD44V10衍生的肽能够在体内保护多巴胺能神经元免于MPTP的作用，并说明这些肽作为用于帕金森氏疾病的新型药品来研发。
实施例4
鉴别本发明的一些实施方案的肽中的活性序列
结果
选择V10A1_N+4(在本文中为“P26”，SEQIDNO:26)用于进一步结构-功能分析。合成由该肽衍生的肽并示于下表3中。
表3
名称 SEQ ID NO: 序列
26-1 36 EGYTSHY
26-2 37 EGYTSH
26-3 38 EGYTS
26-4 39 GYTSHYP
26-5 40 YTSHYP
26-6 41 TSHYP
26-7 42 GYTSHY
26-8 43 QGYTSHYP
26-9 44 EGYTSAYP
26-RI 45 *P*Y*H*S*T*Y*G*E
26-R 46 PYHSTYGE
*D氨基酸
针对表3中所示的肽保护N2A免于6-OHDA的作用来测试这些肽（图8）。这些数据表明在至少保持部分活性的同时可以耐受P26序列中的一些修饰。此类修饰包含C-末端截短(26-1,26-2和26-3)，使用谷氨酰胺替代在N-末端谷氨酸残基，以及使用丙氨酸替代位置7的组氨酸（分别为26-8和26-9）。
最有趣的是，逆反（RI，其中一级序列是反向的，使用D-氨基酸而非L-氨基酸）P26衍生物（26-RI,SEQIDNO:26）还保持了其神经保护活性。假定逆反肽在其延伸的构造中呈现出与其天然L-序列相似的侧链拓扑结构，并且在完全抵抗蛋白质降解的同时保持了母体分子的生物活性[Chorev,M.andM.Goodman,Recentdevelopmentsinretropeptidesandproteins--anongoingtopochemicalexploration.TrendsBiotechnol,1995.13(10):p.438-45]。因此，考虑用于调节神经保护的最小序列列于SEQIDNO:47STYG-X(其中X为E或Q)中，或者该最小序列的反向构造，因此每个氨基酸可以为D或L。
实施例5
海马体（IH）/侧脑室（ICV）注射V10A1_N+4(P26)和P34肽保护大鼠免 受Aβ(1–42)的损害
材料和方法
动物-成年雄性SpragueDawley大鼠得自theLaboratoryAnimalCenterofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan,China。到达后，将大鼠单独饲养在温度和湿度受控的环境中，并随意使用食物和水。将动物保持在12hr光/暗时间表下，并且在7A.M.时开始光照。饲养后，对大鼠进行为期1周的处理（每天每只大鼠5-6min），从而使其习惯于试验。根据theNationalInstitutesofHealthGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals进行试验，并且试验方案经theUniversityAnimalCareandUseCommittee批准。
药品-Aβ(1–42)购自Sigma-Aldrich(USA)。肽得自LifeTein(USA)。
阿尔茨海默氏疾病（AD）模型的建立-将Aβ(1–42)(Sigma-Aldrich,USA)以浓度为6μg/μl溶解于过滤的PBS中，并将溶液在使用前在37℃下保持2天。在戊巴比妥钠(55mg/kgi.p.)麻醉下，通过微量调节注射器将1微升溶液注射到右海马体中，其中立体坐标为：距前囟点AP=-3.6、ML=2.0，并且距颅骨DV=3.0。对照大鼠注射1μlPBS。在IH/ICV研究中，在相同的立体坐标处，将1μl肽或PBS也注射到右海马体中。
肽给药-对于ICV注射而言，根据以下立体坐标：AP=-1、ML=1.6、DV=3.8，将显微注射插管植入侧脑室中。在Aβ注射后的24小时，大鼠接受第一ICV注射的指定剂量的PBS或肽。在皮下（SC）研究中，每天SC注射1ml/大鼠至1mg/kg剂量的PBS或处于PBS中的肽溶液，并持续21天。
新物体识别任务-在Aβ注射后的21天测试NOR任务。
训练装置为放置在减音罩中的黑色Plexiglas盒(50×50×40cm)，所述的减音罩位于光照明亮且隔离的房间中。通过固定在减音罩顶部的15W的白色室光提供照明，并通过减音罩中的通风机提供65dB的背景噪声。所述的盒的底部用锯末覆盖。在该任务中使用的物体由具有不同形状和颜色的防水材料（例如玻璃和塑料）制成。物体的尺寸为大约6×6×8cm。两个物体总是位于盒的后角上。位置和物体是相抗衡的，从而控制大鼠可能对一角或一个物体的任何偏好。行为过程涉及两个阶段：训练和记忆保持测试。在训练试验中，将大鼠放置在盒中，并允许其查看两个相同的物体达10min，并记录查看两个物体所花费的总时间。物体的查看定义为鼻子指示物体的距离<1cm，和/或使用鼻子接触物体。搅拌锯末，并在试验之间使用40%乙醇溶液清洁盒和物体。在训练试验（记忆力保持试验）后的24小时，将一个熟悉的物体和一个新物体放置在相同的位置处作为训练阶段的刺激物。将大鼠在盒中放置3min，并记录查看各物体花费的时间以及查看两个物体所花费的总时间。计算用于评估记忆的鉴别指数作为查看新的和熟悉的物体的时间的差异，表达查看两个物体所花费的总时间的比例。
摩里斯水迷宫测试-由环形水箱（直径为200cm，高度为60cm）构成，其中填加水(25±1℃)至40cm深度。围绕水池边缘的4个等距的位置用作起点，该起点将水池分成4个扇形。逃离台（直径为10cm）放置在水池中水表面以下2cm处。将逃离台放置在随意选择的水池的一个扇形的中间，并在整个试验过程中保持相同的位置。在开始训练之前，在不具有平台的条件下允许大鼠自由进入水池达120s。使动物接受4天的训练期，每个训练期由4个试验（每个起点一次）构成，每次试验的最长时间为120s，试验间隔为大约30s。在爬到隐藏的平台之上以后，使动物在平台上保持30s，然后开始下一次试验。如果大鼠在最大时间120s内没有达到隐藏的平台上，则将其温和地放置在平台上，并允许其保持相同的时间间隔。测量达到隐藏的平台上所需要的时间（潜伏期，以秒计）。在获取阶段后的24小时，通过除去平台来实施试探测试。允许大鼠在水池中自由游动120s，并记录在目标扇形中花费的时间，其中所述的扇形中之前包含由因此的平台。在目标扇形中花费的时间表明在学习后发生的记忆巩固的程度。在Aβ注射后的24天开始摩里斯水迷宫测试。
统计分析-使用单因素ANOVA进行统计分析。使用FisherLSDTest(SigmaStat3.2)进行事后比较。所有的数据表示为平均值±SEM。显著性水平设定为p<0.05。
结果
为了测试P26和V10B1_8(在本文中为P34)肽在体内在Alzheumer疾病（AD）模型中的效力，在Aβ(1–42)显微注射大鼠模型中测试这些肽[Soto,C.,etal.,Beta-sheetbreakerpeptidesinhibitfibrillogenesisinaratbrainmodelofamyloidosis:implicationsforAlzheimer′stherapy.NatMed,1998.4(7):p.822-6]。在该模型中，大鼠接受单次显微注射6μgAβ(1–42)到右海马体中。同时，将1μg肽溶液或PBS（媒介物）也注射到相同的位置。该处理后每天ICV注射不同剂量的肽或媒介物（PBS）。在Aβ注射后的21天，对新物体识别测试来测定大鼠（NOR，图9）。结果显示100ng/大鼠的P26、以及10和100ng/大鼠的P34显著增加了鉴别指数(p<0.01)。数据表明ICV/IH给药P26和P34肽会防止Aβ在体内的毒性作用。
实施例6
外周注射V10A1_N+4(P26)肽保护大鼠免受Aβ(1–42)的损害
材料和方法
试验过程和皮下注射（SC）在上述实施例5中有所描述。
结果
针对保护大鼠免受Aβ的毒性来测试通过皮下（SC）注射而外周给药的肽。因此，对大鼠模型显微注射Aβ(1–42)，然后每天SC注射1mg/kgP26肽、以及对照肽（cont1:AVAVEAAGSEQIDNO:48，n=10-11）。在21天的注射期后进行摩里斯水迷宫测试(MWM)和NOR记忆测试。结果显示在两种测试中，在3种SC注射的肽中，仅P26显著改善了行为（图10和11）。这些结果证明在通过肠胃外给药给与所述的肽时，也看见P26肽的神经保护作用，表明所述的肽能够穿过血脑屏障并在相关的脑区域达到足够的浓度。
实施例7
P26和P26-IR的药代动力学
材料和方法
在雄性SpragueDawley大鼠中，在SC肽给药后评价肽的药代动力学。使用磷酸盐缓冲剂(pH7.4)作为媒介物来制备肽溶液，并在定量给药为2mL/kg内在1mg/kg剂量下通过皮下给药。
给药后，在0(预剂量)、以及0.17、0.5、1、2、4、8和24小时时收集血液样品。在各时间点下，通过插管大鼠的颈静脉取回大约0.25mL血液，并转移至包含200mMK2EDTA(20μL每mL血液)的预标记微离心管中。在取样后，将等体积的肝素化盐水冲刷至导管中。在4±2℃下，将血液样品在5000g下离心5分钟。所有的血浆样品储存在-70℃下，直至分析。适于所述的意图的LC-MS/MS方法用于定量血浆样品中的肽。最低定量限(LLOQ)为22.34ng/mL。
结果
通过以1mg/kg皮下注射在大鼠中测试P26和P26-IR的药代动力学（图12）。与P12的表观Cmax为130ng/ml相比，P26-RI证明了改善的SC药代动力学，其表观Cmax为1227ng/ml。这种P26-IR类似物的10倍的改善以及其在体外的活性表明与P26相比，P26-IR可以在较低的剂量下使用。
尽管连同具体的实施方案描述了本发明，但是明显的是许多备选物、修饰和改变对于本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，意欲包含落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有这些备选物、修饰和改变。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此均以引用方式全文并入本文，如同每一份单独的出版物、专利或专利申请特意且单独地表明以引用方式并入本文。此外，在本说明书中的任何参考文献的引用或确认不应该被解释为承认此类参考文献作为本发明的现有技术来利用。就使用的各部分的标题而言，它们不应该被解释为必须的限定。
参考文献
（在本申请中引用的其他参考文献）
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Claims (11)

1.一种分离的肽，由SEQIDNO:26、34或45组成。
2.一种药物组合物，包含作为活性试剂的权利要求1所述的分离的肽和药学上有效的载体。
3.权利要求1所述的分离的肽用于制备用于治疗选自由帕金森氏疾病和阿尔茨海默氏疾病组成的组的神经退行性紊乱的药物的用途。
4.权利要求3所述的用途，其中所述的神经退行性疾病为帕金森氏疾病。
5.权利要求3所述的用途，其中所述的神经退行性疾病为阿尔茨海默氏疾病。
6.权利要求2所述的药物组合物，其中所述的肽附着在细胞渗透试剂上。
7.权利要求3-5任意一项所述的用途，其中所述的肽附着在细胞渗透试剂上。
8.权利要求6所述的药物组合物，其中所述的细胞渗透试剂为肽试剂。
9.权利要求7所述的用途，其中所述的细胞渗透试剂为肽试剂。
10.权利要求3所述的用途，其中所述的分离的肽被配制用于皮下给药。
11.权利要求3所述的用途，其中所述的分离的肽被配制用于鼻内给药。
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