PL187917B1 - Oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu, peptyd i jego zastosowanie - Google Patents

Oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu, peptyd i jego zastosowanie

Info

Publication number
PL187917B1
PL187917B1 PL32870197A PL32870197A PL187917B1 PL 187917 B1 PL187917 B1 PL 187917B1 PL 32870197 A PL32870197 A PL 32870197A PL 32870197 A PL32870197 A PL 32870197A PL 187917 B1 PL187917 B1 PL 187917B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
prosaposin
seq
peptide
pain
active fragment
Prior art date
Application number
PL32870197A
Other languages
English (en)
Other versions
PL328701A1 (en
Inventor
John S. O'brien
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of PL328701A1 publication Critical patent/PL328701A1/xx
Publication of PL187917B1 publication Critical patent/PL187917B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1 . Oczyszczony lub izolowany polipeptyd obejmujacy sekwencje Thr-R1 -Leu-Ile-Asp- -Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, w którym R1 oznacza D-alanine (SEQ ID nr 2). 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera polipeptyd jak okre- slono w zastrz. 1, w farmaceutycznie dopuszczalnym nosniku. 7. Zastosowanie skutecznej ilosci aktywnego fragmentu prosapozyny zlokalizowa- nego w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 1 lub modyfikowanego ak- tywnego fragmentu prosapozyny do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno- wrazliwego bólu neuropatycznego obwodowego ukladu nerwowego u osobnika cierpiace- go z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany. 12. Zastosowanie skutecznej ilosci polipeptydu zawierajacego sekwencje amino- kwasowa SEQ ID NO: 2 do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno-wrazliwego bólu neuropatycznego obwodowego ukladu nerwowego u osobnika cierpiacego z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany. 14. Zastosowanie peptydu zawierajacego sekwencje aminokwasowa TR1 LIDNNATEEILY, w której R 1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2) do wytwarzania leku do leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub mielinizacyjnych. 20. Peptyd zawierajacy sekwencje aminokwasowa TR1 LIDNNATEEILY, w której R 1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2) do stosowania do leczenia chorób neurodegeneracyj- nych lub mielinizacyjnych. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu i peptyd.
Ból neuropatyczny jest spowodowany uszkodzeniem nerwu. W przeciwieństwie do natychmiastowego bólu spowodowanego uszkodzeniem tkanki, ból neuropatyczny może rozwijać się przez dni lub miesiące po uszkodzeniu urazowym. Ponadto, podczas gdy ból spowodowany uszkodzeniem tkanki zazwyczaj ogranicza się w czasie do okresu naprawy tkanki, ból neuropatyczny jest często długotrwały lub przewlekły. Na dodatek ból neuropatyczny może wystąpić samorzutnie lub na skutek pobudzenia, które normalnie nie powoduje bólu.
Kliniczne przyczyny bólu neuropatycznego są bardzo szerokie i obejmują zarówno uraz, jak i chorobę. Tak np. urazowy ucisk lub zmiażdżenie nerwu, oraz urazowe uszkodzenie mózgu lub rdzenia kręgowego stanowią powszechne przyczyny bólu neuropatycznego. Ponadto większość urazowych uszkodzeń nerwów powoduje również powstanie nerwiaków, w przypadku których ból pojawia się na skutek nieprawidłowej regeneracji nerwu. Na dodatek ból neuropatyczny związany z rakiem występuje, gdy wzrost guza boleśnie ściska okoliczne nerwy, mózg i rdzeń kręgowy. Ból neuropatyczny jest również związany z chorobami takimi jak cukrzyca lub alkoholizm.
Niestety ból neuropatyczny często jest oporny na dostępne terapie lękowe. Na dodatek obecne terapie wywołują poważne działanie uboczne, obejmujące np. zmiany w pojmowaniu, uspokojenie polekowe, nudności oraz, w przypadku leków narkotycznych, uzależnienie. Wielu pacjentów z bólem neuropatycznym jest w podeszłym wieku lub ma inne stany medyczne, które w szczególności ograniczają ich tolerancje skutków ubocznych związanych z dostępnymi terapiami lękowymi. Nieprzydatność obecnej terapii w łagodzeniu bólu neuropatycznego
187 917 bez powodowania nie tolerowanych skutków ubocznych często objawia się depresją i skłonnościami samobójczymi osób z przewlekłymi bólami.
Sposoby łagodzenia bólu neuropatycznego powinny poprawiać jakość życia wielu ludzi cierpiących na skutek bólu spowodowanego urazem lub chorobą. Jednakże obecnie brak jest skutecznych leków, które łagodzą ból neuropatyczny bez niepożądanych skutków ubocznych, takich jak uspokojenie polekowe i uzależnienie. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby łagodzenia bólu neuropatycznego bez powodowania niepożądanych skutków ubocznych. Wynalazek spełnia to zapotrzebowanie oraz wykazuje inne pokrewne zalety.
Wynalazek rozwiązuje problemy związane z walką z bólem i pozwala na łagodzenie bólu neuropatycznego u osobnika.
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony lub izolowany polipeptyd obejmujący sekwencję Thr-Ri-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Tln-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, w którym Rj oznacza D-alaninę (SEQ ID nr 2).
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca polipeptyd który posiada sekwencję opisaną powyżej w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
Korzystnie kompozycja według wynalazku podawana jest w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu.
Korzystnie kompozycja według wynalazku może być podawana także w postaci liposomalnej.
Korzystnie kompozycja według wynalazku może być w postaci liofilizowanej.
Korzystnie kompozycja według wynalazku może być jednostkowej postaci dawkowania.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny zlokalizowanego w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 1 lub modyfikowanego aktywnego fragmentu prosapozyny do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno-wrażliwego bólu neuropatycznego obwodowego układu nerwowego u osobnika cierpiącego z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany.
Korzystie jako aktywny fragment prosapozyny do wytwarzania leku stosuje się fragment o sekwencji przedstawionej na SEQ ID nr 1.
Korzystnie, skuteczną ilość podaje się drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskóme, przezśluzówkowe i przeznosowe.
Korzystnie modyfikowany aktywny fragment prosapozyny stanowi sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID NO: 2 zmodyfikowana w zakresie aminokwasów 16-29 sekwencji SEQ ID NO: 1 przez podstawienie D-alaniny lizyną w pozycji 2, alaniną lizyny w pozycji 8, i przez delecję lizyny w pozycji 11 oraz addycję reszty tyrozyny na C-końcu.
Korzystnie neuropatyczny prosapozyno-wrażliwy ból jest charakteryzowany przez hyperalgezję.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno-wrażliwego bólu neuropatycznego obwodowego układu nerwowego u osobnika cierpiącego z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany.
Korzystnie wspomniany polipeptyd stanowi sekwencja aminokwasowa SEQ ID NO: 2.
Korzystnie do wytwarzania leku do leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub mielinizacyjnych stosuje się peptyd zawierający sekwencję aminokwasową TRiLIDNNATEEILY, w której R1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2).
Korzystnie, choroby neurodegeneracyjne lub mielinizacyjne wybiera się z grupy obejmującej polineuropatię; mononeuropatię; nerwiaka; ucisk nerwu; uraz nerwu; kontuzje, guz lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego; zawał; guz lub uraz pnia mózgu, wgórza lub kory; ucisk, urwanie korzenia lub zapalenie zwoju korzenia tylnego; zespól po zapaleniu istoty szarej rdzenia; niedokrwienne uszkodzenie ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego i stwardnienie rozsiane.
Bardziej korzystnie polineuropatię stanowi cukrzycowa neuropatia obwodowa.
187 917
Również korzystnie polineuropatię stanowi obwodowa neuropatia wynikająca z chemioterapii.
Także korzystnie choroba jest martwicą niedokrwienną w obwodowym lub ośrodkowym układzie nerwowym.
Korzystnie polipeptyd jest w postaci odpowiedniej do podawania drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskórne, przezśluzówkowe i przeznosowe.
Przedmiotem wynalazku jest także peptyd zawierający sekwencję aminokwasową TRiLIDNNATEEILY, w której R1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2) do stosowania do leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub mielinizacyjnych.
Korzystnie, choroby neurodegeneracyjne i mielinizacyjne wybiera się z grupy obejmującej polineuropatię; mononeuropatię; nerwiaka; ucisk nerwu; uraz nerwu; kontuzje, guz lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego; zawał; guz lub uraz pnia mózgu, wgórza lub kory; ucisk, urwanie korzenia lub zapalenie zwoju korzenia tylnego; zespół po zapaleniu istoty szarej rdzenia; niedokrwienne uszkodzenie ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego i stwardnienie rozsiane.
Bardziej korzystnie polineuropatię stanowi cukrzycowa neuropatia obwodowa.
Również korzystnie polineuropatię stanowi obwodowa neuropatia wynikająca z chemioterapii.
Także korzystnie choroba jest martwicą niedokrwienną w obwodowym lub ośrodkowym układzie nerwowym.
Peptyd według wynalazku korzystnie jest w postaci odpowiedniej do podawania drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskóme, przezśluzówkowe i przeznosowe.
Wynalazek został zilustrowany rysunkiem, na którym na fig. 1 pokazano próg alodynii dotykowej przed (czas 0) i w różnych okresach czasu po uderzeniowej iniekcji peptydu pochodzącego z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) na szczurzym modelu Chunga.
Na fig. 2 pokazano próg alodynii dotykowej przed (czas 0) i w różnych okresach czasu po uderzeniowej iniekcji peptydu pochodzącego z prosapozyny o 14 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) na szczurzym modelu Chunga.
Na fig. 3 pokazano sumy cofań w reakcji na 0,5% formaliną po śródotrzewnowym podaniu peptydu pochodzącego z prosapozyny o 14 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) lub roztworu soli diabetycznym myszom.
Zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny według wynalazku łagodzi ból neuropatyczny u osobnika leczonego. Jak wykazano, podawanie skutecznej ilości fragmentu prosapozyny może spowodować złagodzenie bólu neuropatycznego u osobnika w ciągu 30 minut po podaniu. Taka metoda łagodzenia bólu jest przydatna także w łagodzeniu bólu neuropatycznego wywołanego zaburzeniami nerwu obwodowego, zwojów korzenia tylnego, rdzenia kręgowego, pnia mózgowego, wzgórza wzrokowego lub kory.
Peptyd według wynalazku pochodzi od prosapozyny, będącej białkiem o 517 aminokwasach, początkowo zidentyfikowanej jako prekursor czterech białek aktywujących sfingolipidy (Kishimoto i inni, J. Lipid Res., 33: 1255-1267 (1992)). Cztery sąsiadujące tandemowe domeny w prosapozynie są przetwarzane proteolitycznie w lizosomach, tak że powstają saponiny, A, B, C i D, które uaktywniają hydrolizę glikosfingiolipidów przez hydrolazy lizosomowe (OBrien i Kishimoto, FASEM J„ 5: 301-308 (1991)).
Nieprzetworzona postać prosapozyny znajduje się w dużych stężeniach w mózgu człowieka i szczura, gdzie zlokalizowana jest ona w neuronalnych błonach powierzchniowych. W czasie rozwoju zarodka mRNA prosapozyny występuje obficie w mózgu i zwojach korzenia tylnego. Ponadto prosapozyna wiąże się z dużym powinowactwem z gangliozydami, które pobudzają wyrastanie aksonów', oraz ułatwia przenoszenie gangliozydów z miceli do błon.
187 917
Działanie neuropatyczne prosapozyny jest związane z jej lokalizacją w populacjach komórek nerwowych (O'Brien i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91: 9593-9596 (1994); Sato i inni, Biochem. Biophys. Res. Commun., 204: 994-1000 (1994)). Prosapozyna pobudza wzrost aksonów motorycznych in vitro i in vivo oraz zwiększa aktywność acetylotransferazy cholinowej, będącej markerem różnicowania komórek nerwowych. Na dodatek prosapozyna zapobiega obumieraniu komórek w komórkach nerwiaka niedojrzałego (O'Brien i inni, supra, 1994; O'Brien i inni, FASEB J. 9: 681-685 (1995)).
Aktywność neuropatyczna prosapozyny jest zlokalizowana w sapozynie C, domenie o 80 aminokwasach. Peptyd o 22 merach, odpowiadający aminokwasom 8-29 domeny sapozyny C (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) pobudza wzrost aksonów i aktywność acetylotransferazy cholinowej oraz zapobiega obumieraniu komórek w komórkach nerwiaka niedojrzałego (O'Brien i inni, supra, 1995).
Tak np. prosapozyna lub peptyd pochodzący z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) mogą modulować działanie motorycznych komórek nerwowych, ułatwiając wzrost aksonów. Jednakże przed dokonaniem wynalazku nie wiedziano, czy prosapozyna lub fragment peptydu z prosapozyny mogą wpływać na działanie czuciowych komórek nerwowych. Ponadto działanie neuropatyczne prosapozyny lub peptydu pochodzącego z prosapozyny w pobudzaniu wzrostu aksonu motorycznego obserwuje się dopiero po okresie 24-48 godzin (patrz np. O'Brien i inni, supra, 1994). Nie wykazano, aby działanie neuropatyczne prosapozyny lub peptydu pochodzącego z prosapozyny występowało w krótszym okresie czasu.
Peptyd według wynalazku i jego zastosowanie dostarcza sposobu łagodzenia bólu neuropatycznego, obejmującego jako składniki zarówno aksony czuciowe, jak i motoryczne. Ta metoda jest skuteczna w łagodzeniu bólu neuropatycznego w ciągu minut, a nie godzin lub dni, co wykazywano uprzednio jako niezbędny warunek działania neuropatycznego prosapozyny lub peptydu pochodzącego z prosapozyny.
Skuteczność w łagodzeniu bólu neuropatycznego wykazano wykorzystując dobrze znany model neuropatii obwodowej szczura Chunga. W szczurzym modelu Chunga częściowe podwiązanie nerwu rdzeniowego lewych nerwów rdzeniowych L-5 i L-6 powoduje długotrwałą nadwrażliwość na lekki ucisk drażnionej lewej łapy. Nadwrażliwość jest podobna do bólu pojawiającego się u ludzi ze stanem neuropatycznym bólu piekącego, co opisali Kim i Chung, Pain 50: 355-363 (1992).
Przed podaniem aktywnego fragmentu prosapozyny szczury z modelu Chunga wykazywały próg 3,0-4,0 g przed cofaniem drażnionej łapy w reakcji na nacisk (włoski Von Frey'a) (patrz fig. 1). Po podaniu aktywnego fragmentu prosapozyny (pochodzącego z prosapozyny, o 22 merach, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) nastąpiło złagodzenie bólu neuropatycznego, czego objawem była większa tolerancja na nacisk przed cofaniem drażnionej łapy. Działanie aktywnego fragmentu prosapozyny wystąpiło po 15 minutach i trwało przez 3 godziny od podania, co wynika z fig. 1. Takie szybkie ulżenie bólu neuropatycznego stoi w wyraźnym kontraście z opóźnionym działaniem neuropatycznym, o którym donoszono uprzednio w przypadku prosapozyny i peptydów pochodzących z prosapozyny.
Aktywny fragment prosapozyny, taki jak peptyd pochodzący z prosapozyny z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2, również łagodzi ból w przypadku szczurzego modelu bolesnej neuropatii cukrzycowej. Jak to opisano w przykładzie III, peptyd z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2 zmniejsza alodynię u szczurów z cukrzycą z krótkotrwałym niedoborem insuliny, wywołanym przez selektywną toksyną komórek β, streptozotocynę. W związku z tym aktywny fragment prosapozyny lub peptyd pochodzący z prosapozyny według wynalazku mogą być stosowane do łagodzenia różnych typów bólu neuropatycznego, w tym bólu mechanicznego, którego przykład stanowi model szczurzy Chunga, oraz bólu metabolicznego, czego przykład stanowi zastosowanie tych peptydów do zmniejszania bólu u diabetycznych myszy.
W użytym znaczeniu określenie „ból neuropatyczny” oznacza ból spowodowany uszkodzeniem nerwu. Ból neuropatyczny odróżnia się od bólu nocyceptywnego, będącego bólem spowodowanym przez ostre uszkodzenie tkanki obejmujące małe nerwy skórne lub małe nerwy w mięśniach albo w tkance łącznej. Ból wywołany mechanizmem nocyceptywnym zazwyczaj ograniczony jest w czasie do okresu naprawy tkanki i zwykle łagodzony jest dostępnymi
187 917 środkami przeciwbólowymi lub opioidami, jak to opisał Myers w Regional Anaesthesia 20: 173-184(1995).
Ból neuropatyczny zazwyczaj jest długotrwały lub przewlekły i często rozwija się przez dni lub miesiące po wyjściowym ostrym urazie tkanki. Ból neuropatyczny może obejmować uporczywy, samorzutny ból, a także alodynię, będącą bólową odpowiedzią na bodziec, który normalnie nie jest bolesny. Ból neuropatyczny może również charakteryzować się przeczulicą bólową, w przypadku której następuje wzmożona reakcja na bodziec bólowy, który zazwyczaj jest mało znaczący, taki jak ukłucie szpilką. W przeciwieństwie do bólu nocyceptywnego ból neuropatyczny jest zazwyczaj oporny na terapię opioidową (Myers, supra, 1995).
Zastosowanie polipeptydu według wynalazku jest przydatne w łagodzeniu bólu neuropatycznego spowodowanego zaburzeniami nerwu obwodowego zwojów korzenia tylnego, rdzenia kręgowego, pnia mózgowego, wzgórza wzrokowego lub kory. W użytym znaczeniu określenie „zaburzenie” oznacza uraz, uszkodzenie, chorobę lub stan wywołujący ból neuropatyczny.
Aktywny fragment prosapozyny w postaci leku jest przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego, niezależnie od etiologii bólu. Tak np. można to zastosować do łagodzenia bólu neuropatycznego spowodowanego zaburzeniem nerwu obwodowego, takim jak nerwiak, uciskiem nerwu, zmiażdżeniem nerwu, rozciągnięciem nerwu lub niecałkowitym przecięciem nerwu, oraz mononeuropatią lub polineuropatią, lub można go również wykorzystać do łagodzenia bólu neuropatycznego spowodowanego zaburzeniem, takim jak ucisk zwojów korzenia tylnego, zapalenie rdzenia kręgowego, uraz, guz lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego; guzy pnia mózgowego, wzgórza wzrokowego lub kory; albo urazu pnia mózgowego, wzgórza wzrokowego lub kory (patrz np. tabela 1).
Za jego pomocą, podając lek w odpowiednich dawkach można łagodzić ból neuropatyczny spowodowany nerwiakiem, który może pojawić się wkrótce po urazowym uszkodzeniu nerwu, zwłaszcza w przypadku, gdy cały nerw jest silnie zmiażdżony lub przecięty. W przypadku nerwiaka wzrost aksonów, który normalnie regeneruje nerw obwodowy, jest nienormalny lub nie trafiony, co spowodowane jest np. zagrożeniem fizycznym, takim jak tkanka bliznowata. W związku z tym następuje poplątanie regenerującego się włókna nerwowego w otoczeniu, w którym czynniki mechaniczne i fizyczne wywołują nienormalne działanie elektrofizjologiczne i ból (Myers, supra, 1995). Nerwiak amputacyjny może np. spowodować ból fantomowy, albo może spowodować ból pojawiający się przy używaniu protezy kończyny. Taki właśnie ból neuropatyczny można także łagodzić podając aktywny fragment prosapozyny według wynalazku.
187 917
Tabela 1
Nerw
Nerwiak (amputacja, przecięcie nerwu)
Ucisk nerwu (ucisk przez sąsiednią tkankę, guzy) Zmiażdżenie, naciągnięcie lub częściowe przecięcie nerwu Mononeuropatia
Cukrzyca
Napromieniowanie Niedokrwienie Zapalenie naczyń Polineuropatia
Zespół po zapaleniu istoty szarej rdzenia
Cukrzyca
Alkohol
Amyloid
Zatrucie
HIV
Niedoczynność tarczycy Mocznica Niedobór witamin
Chemioterapia (winkrystyna, cisplatyba, paklitaksel) ddC (zalcytamina) _Choroba Fabry’ego_
Zwój korzenia tylnego
Ucisk (dysk, guz, tkanka bliznowata)
Oderwanie korzenia _Stan zapalny (neuralgia poopryszczkowa)_
Rdzeń kręgowy Uraz Guz _Częściowe przecięcie_
Pień mózgowy, wzgórze wzrokowe, kora
Zawał, guzy, uraz
Ucisk nerwu również powoduje ból neuropatyczny, który można leczyć metodami opisanymi powyżej. Ucisk nerwu może być nagły, jak to jest w przypadku urazowego zmiażdżenia nerwu, albo może być przedłużony i umiarkowany, będący wtórnym skutkiem wzrostu guza lub tworzenia się blizny w sąsiedztwie ważnej wiązki nerwów. Neuropatia uciskowa może wystąpić jako wynik zmian w dopływie krwi do nerwu, co powoduje ostre niedokrwienie, a w efekcie uszkodzenie nerwu (Myers, supra, 1995).
Podawanie aktywnego fragmentu prosapozyny może również złagodzić ból neuropatyczny wynikający z mononeuropatii lub polineuropatii. W użytym znaczeniu neuropatia jest zaburzeniem funkcjonalnym lub zmianą patologiczną w obwodowym układzie nerwowym, charakteryzująca się klinicznie nienormalnością czuciowych lub motorycznych komórek nerwowych. Określenie mononeuropatia wskazuje, że podrażniony jest pojedynczy nerw obwodowy, natomiast określenie polineuropatia wskazuje, że podrażnionych jest szereg nerwów obwodowych.
Etiologia neuropatii może być znana lub nieznana (patrz np. Myers, supra, 1995; Galer, Neurology 45 (suppl 9): S17- S25 (1995); Stevens i Lowe, Pathology, Times Mirror International Publishers Limited, London (1995). Do znanych etiologii należą powikłania chorobowe lub stan zatrucia; tak np. cukrzyca jest najczęstszym zaburzeniem metabolicznym wywołującym neuropatię. Zastosowanie według wynalazku łagodzi mononeuropatyczny ból neuropatyczny, powodowany np. przez cukrzycę, napromieniowanie, niedokrwienie lub zapalenie naczyń. Sposób według wynalazku łagodzi również polineuropatyczny ból neuropatyczny, powodowany np. przez zespół po zapaleniu istoty szarej rdzenia, cukrzycę, alkohol, amyloid, toksyny, H1V, niedoczynność tarczycy, mocznicę, niedobór witamin, chemioterapię, ddC lub chorobę Fabry'ego (patrz tabela 1) Zastosowanie według wynalazku jest szczególnie przydatne w łagodzeniu bólu mięśniowego po zapaleniu istoty szarej rdzenia. W ten sposób można także łagodzić ból neuropatyczny o nieznanej etiologii.
187 917
Jak to ujawniono w opisie aktywny fragment prosapozyny może być również przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego lub pobudzaniu wzrostu aksonów, w hamowaniu obumierania komórek nerwowych, przyspieszaniu mielinizacji lub hamowaniu demielinizacji nerwowej, albo w hamowaniu neuropatii czuciowej. W użytym znaczeniu określenie „aktywny fragment prosapozyny” oznacza peptyd, którego sekwencja aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasów prosapozyny, oraz który wykazuje działanie łagodzenia bólu neuropatycznego lub pobudzania wzrostu aksonów, hamowania obumierania komórek nerwowych, przyspieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji nerwowej, albo hamowania neuropatii czuciowej lub motorycznej.
W użytym znaczeniu łagodzenie bólu neuropatycznego oznacza zmniejszenie ostrości bólu neuropatycznego. W przypadku człowieka aktywny fragment prosapozyny zmniejsza ostrość bólu neuropatycznego, tak że cierpienia osobnika zmniejszają się oraz poprawia się jakość życia. Aktyny fragment prosapozyny może również łagodzić ból neuropatyczny u dowolnego z wielu dobrze znanych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego, co zostanie opisane dokładniej poniżej (patrz także Bennett, Muscle & Nerve 16: 1040-1048 (1993)). W użytym znaczeniu określenie „aktywny fragment prosapozyny” jest synonimem określenia „peptyd pochodzący z prosapozyny”.
Aktywny fragment prosapozyny może zawierać sekwencję aminokwasową Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (sekwencja identyfikacyjna nr 3) odpowiadającą aminokwasom od 18 do 29 sapozyny C. Korzystnie, aktywny fragment prosapozyny ma sekwencję aminokwasową Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Vał-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (sekwencja identyfikacyjna nr 1) odpowiadającą aminokwasom od 8 do 29 sapozyny C lub sekwencję aminokwasową Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Thr (sekwencja identyfikacyjna nr 2) odpowiadającą aminokwasom od 16 do 29 sapozyny C, zmodyfikowaną przez podstawienie lizyny w pozycji 2 D-alaniną, lizyny w pozycji 8 alaniną, delecję lizyny w pozycji 11 i addycję tyrozyny na C-końcu (patrz tabela 2). Takie modyfikacje mogą służyć zwiększeniu stabilności peptydu lub wychwytu przez barierę krew-mózg, co opisano poniżej. D-alanina może być tutaj oznaczona jako D-Ala lub X.
Aktywny fragment prosapozyny może mieć od około 12 do około 80 aminokwasów, co odpowiada pełnej długości sapozyny C. Korzystnie, aktywny fragment prosapozyny ma od około 12 do około 40 aminokwasów, korzystniej od około 14 do około 22 aminokwasów.
Tabela 2
PEPTYD SEKWENCJA NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI
22-mer pochodzący z prosapozyny CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL 1
14-mer pochodzący z prosapozyny TXLIDNNATEE1LY 2
12-mer pochodzący z prosapozyny LIDNNKTEKEIL 3
gdzie X = D-alanina
Do łagodzenia bólu neuropatycznego u człowieka korzystne jest zastosowanie aktywnego fragmentu ludzkiej prosapozyny, takiego jak sekwencja identyfikacyjna nr 2. Jednakże, w łagodzeniu bólu neuropatycznego zgodnie z wynalazkiem są także przydatne aktywne fragmenty pochodzące z innej ssaczej prosapozyny. Tak też, na przykład, w łagodzeniu bólu neuropatycznego pacjenta przydatne są także aktywne fragmenty mysiej prosapozyny, szczurzej prosapozyny, prosapozyny pochodzącej od świnki morskiej lub bydlęcej prosapozyny, takie jak sekwencje identyfikacyjne nr od 4 do 7.
Sekwencja aminokwasowa aktywnego fragmentu ludzkiej prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 1) odpowiadająca aminokwasom od 8 do 29 sapozyny C jest silnie konserwowana u innych gatunków, co przedstawiono w tabeli 3. W szczególności, sąsiadujące ze sobą asparaginy (N) są konserwowane w ludzkiej, mysiej, szczurzej, świnki morskiej i bydlę10
187 917 cej prosapozynie. Ponadto, leucyna (L) jest konserwowana w pozycji 3 do 4 aminokwasów w kierunku N-końca od dwóch asparagin oraz jeden lub więcej naładowanych aminokwasów (kwas asparaginowy (D), lizyna (K), kwas glutaminowy (E) lub arginina R)) jest konserwowanych w pozycji 2 do 8 w kierunku C-końca od dwóch asparagin. Każdy z tych dobrze konserwowanych aminokwasów podkreślono w tabeli 3.
Tabela 3
GATUNEK SEKWENCJA NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI
Człowiek CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL 1
Mysz COFYMNKFSELIYNNATEELLY 4
Szczur COLYNRKLSELIINNATEELL 5
Świnka morska CEYVVKKVMLLIDNNRTEEKII 6
Bydło CEFWK.E YAKLIDNNRTEEEIL 7
Silnie konserwowane sąsiadujące ze sobą asparaginy, leucyna i naładowane aminokwasy opisane powyżej mogą być istotne dla aktywności aktywnego fragmentu prosapozyny w łagodzeniu bólu neuropatycznego lub w stymulacji wyrastania aksonu, hamowaniu śmierci komórek nerwowych, przyśpieszaniu mielinizacji lub hamowaniu demielinizacji lub w hamowaniu lub neuropatii czuciowej lub motorycznej. Na przykład, 22-mer pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 1) lub 14-mer pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 2) jest aktywnym fragmentem prosapozyny zmniejszającym alodynię obserwowaną w szczurzym modelu Changa neuropatii obwodowej, co ujawniono w przykładzie I (patrz fig. 1 i 2). W odróżnieniu od tego zmutowany 22-mer (sekwencja identyfikacyjna nr 8), który różni się tym od sekwencji identyfikacyjnej nr 1, że w miejsce pierwszej konserwowanej asparaginy ma wstawiony kwas asparaginowy (D) (patrz tabela 4), nie ma aktywności łagodzenia bólu neuropatycznego w badaniu z użyciem szczurów Chunga (patrz przykład I).
Tabela 4
PEPTYD SEKWENCJA NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI
22-mer pochodzący z prosapozyny CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL 1
Zmutowany 22-mer CEFLVKEVTKLIDDNKTEKEIL 8
14-mer pochodzący z prosapozyny TXLIDNNATEEILY 2
Zmutowany 14-mer M-1 TKLIDNDKTEKEIL 9
Zmutowany 14-mer M-2 TXSIDNNKTEKEIL 10
gdzie X = D-alanina
Aktywność peptydu w łagodzeniu bólu neuropatycznego może również korelować z aktywnością neurotropiczną. Na przykład 22-mer pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 1) lub 14-mer pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 2) łagodzą ból neuropatyczny i mają aktywność neurotropiczną. Ponadto, zmutowany 22-mer (sekwencja identyfikacyjna nr 8) jest nieaktywny w łagodzeniu bólu neuropatycznego, co opisano powyżej, oraz nie ma aktywności neurotropicznej, co dalej wskazuje że aktywność w łagodzeniu bólu neuropatycznego może korelować z aktywnością neurotropiczną. Zmutowany 14-merowy peptyd M-1 (sekwencja identyfikacyjna nr 9) z podstawioną drugą asparaginą nie ma aktywności neurotropicznej, co wskazuje na to, że peptyd o sekwencji identyfikacyjnej nr 9 jest także nieaktywny w łagodzeniu bólu neuropatycznego. Zmutowany 14-merowy peptyd M-2 (sekwencja identyfikacyjna nr 10) z podstawioną leucynąnie ma aktywności neurotropicznej,
187 917 co wskazuje na to, że peptyd o sekwencji identyfikacyjnej nr 10 jest także nieaktywny w łagodzeniu bólu neuropatycznego. W odróżnieniu od tego, 12-merowy peptyd pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 3), który ma konserwowane sąsiadujące ze sobąasparaginy i naładowane aminokwasy opisane powyżej, wykazuje aktywność czynnika neurotropicznego. Tak też, 12-merowy peptyd pochodzący z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 3) może także łagodzić ból neuropatyczny zgodnie z wynalazkiem.
Peptydy pochodzące z prosapozyny i ich neurotropiczne analogi mają wiele zastosowań terapeutycznych w przyśpieszaniu wyzdrowienia po toksycznych, urazowych, niedokrwiennych, degeneracyjnych lub odziedziczonych uszkodzeniach obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego. Dodatkowo, peptydy te mogą przyśpieszać mielinizację lub hamować demielinizację, przez to przeciwdziałać skutkom chorób demielinizacyjnych. Ponadto, takie peptydy stymulują wzrost komórek nerwowych i hamują programowaną śmierć komórek w tkankach nerwowych. Aktywne peptydy neurotropiczne i mielinotropiczne według wynalazku mają pomiędzy około 12 lub 14 a około 50 aminokwasów i korzystnie zawierają nie występującą naturalnie sekwencję prosapozyny o nr identyfikacyjnym 2. Na przykład, aktywne peptydy neurotropiczne i mielinotropiczne według wynalazku mają pomiędzy 14 a około 50 aminokwasów i zawierają nie występującą naturalnie sekwencję prosapozyny o nr identyfikacyjnym 2.
Polipeptyd według wynalazku znajduje także zastosowanie w stymulacji wzrostu aksonu, hamowania śmierci komórek nerwowych, przyśpieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji w zróżnicowanych lub niezróżnicowanych komórkach nerwowych przez podanie do komórek nerwowych skutecznej ilości peptydu ułatwiającego wzrost aksonu lub mieliny mającego pomiędzy około 12 a około 50 aminokwasów i korzystnie zawierającego peptyd o sekwencji identyfikacyjnej nr 2. W metodach tych do stymulacji wzrostu aksonu, hamowania śmierci komórek nerwowych, przyśpieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji można zastosować skuteczną ilość peptydu mającego, na przykład, pomiędzy 14 a około 50 aminokwasów i zawierającego peptyd o sekwencji identyfikacyjnej nr 2.
Zdolność jakiegokolwiek z takich peptydów do stymulacji wzrostu aksonu, hamowania śmierci komórek nerwowych, przyśpieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji może łatwo ocenić specjalista przy pomocy procedur opisanych w przykładach IV do VII. Metody testowania zdolności tych peptydów do przyśpieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji przedstawiono poniżej w przykładach VI i VII.
Przez kontakt komórek nerwowych ze środkiem zawierającym skuteczną w hamowaniu ilość aktywnego fragmentu prosapozyny, można hamować neuropatie czuciowe, na przykład, można hamować neuropatie czuciowe przez kontakt komórek nerwowych ze środkiem zawierającym skuteczną w hamowaniu ilość peptydu o sekwencji identyfikacyjnej nr 1 lub nr 2.
Peptyd pochodzący z prosapozyny może być znaleźć zastosowanie w hamowaniu neuropatii czuciowej, co opisano poniżej w przykładzie X. W modelu mysim, gdzie neuropatię czuciową wywołuje się przez podanie taksolu, normalnie obserwuje się utratę czucia ciepła. Jednakże u myszy traktowanych taksolem, którym podano 100 μ g/kg peptydu o sekwencji identyfikacyjnej nr 1, zahamowano utratę czucia ciepła. Wyniki te wskazują iż peptydy pochodzące z prosapozyny mogą być czynnikami neurotropicznymi zarówno w neuronach czuciowych jak i motorycznych.
Peptydami przydatnymi w sposobach według wynalazku mogą być także, na przykład, sekwencje o nr identyfikacyjnych od 11 do 19 (patrz tabela 5). Na przykład, dopasownie sekwencji 22-merowego peptydu pochodzącego z prosapozyny o sekwencji identyfikacyjnej nr 1 z cytokinami i czynnikami wzrostu wykazało podobieństwo z sekwencjami wielu ludzkich (h) cytokin włącznie z hCNTF, hIL-6, hIL-2, hIL-3, hIL-y, erytropoetyną (hEPO), ludzkim hamującym czynnikiem leukocytamym (hLIF), łańcuchem hIL-β i onkostatyną-M (hONC-M). Sekwencje identyfikacyjne o numerach od 11 do 19, tak jak aktywny fragment prosapozyny o sekwencji identyfikacyjnej nr 1, zawierają dwie asparaginy, które albo ze sobą sąsiadują, albo są rozdzielone jednym aminokwasem. Ponadto, sekwencje peptydowe pochodzące z cytokin mogą zawierać leucynę (L) lub izoleucynę (I) w odległości trzy do czterech aminokwasów w kierunku N-końca od dwóch asparagin oraz jeden lub więcej naładowanych amino12
187 917 kwasów (kwas asparaginowy (D), lizyna (K), kwas glutaminowy (E) lub arginina R)) w odległości dwa do ośmiu aminokwasów w kierunku C-końca od dwóch asparagin, co obserwuje się w aktywnym fragmencie prosapozyny (22-mer; sekwencja identyfikacyjna nr 1). Każdy z tych aminokwasów podkreślono w tabeli 5.
Modele wiązania przez receptor cytokinowy (Spang i Bazan, Cum Opin. Struct. Biol., 3:816 (1993) zwróciły uwagę na konserwację ewolucyjną struktury wiązki czterech helis powszechnie występującej w wielu cytokinach. Każda z sekwencji cytokin lub czynnika wzrostu porównywanych z sekwencją pochodzącą z prosapozyny o nr identyfikacyjnym 1 jest umieszczona pomiędzy helisami A i B (pętla AB) lub w obrębie helisy C cytokiny.
Tabela 5
CYTOKINA SEKWENCJA LOKALIZACJA NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI
Prosapozyna CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL pętla AB 1
hCNTF YVKHQGLNKNINLDSVDGVP pętla AB 11
hlL-6 EALAENNLNLPKMAG pętla AB 12
hIL-2 LOMILNGINNYKNPKLT pętla AB 13
hIL-3 ILMENNLRRPNL pętla AB 14
hIL-y FYLRNNOLYAGTL pętla AB 15
hEPO AEHCSLNENITVPDTKV pętla AB 16
hLIF YTAOGEPFPNNYEKLCAP pętla AB 17
hlL-1p FNKIEINNKLEFESA helisa C 18
hONC-M RPNIGLRNN1YCMAOLL helisa C 19
Strukturalnie pokrewne peptydy pochodzące z cytokin i czynników wzrostu o sekwencjach identyfikacyjnych nr od 11 do 19 mogą być również znaleźć zastosowanie w metodach łagodzenia bólu neuropatycznego. Peptydy o sekwencjach identyfikacyjnych nr od 11 do 19 można przebadać pod względem aktywności w łagodzeniu bólu neuropatycznego przy pomocy, na przykład, testu szczurzego modelu Chunga opisanego w przykładzie I, testu modelu neuropatii cukrzycowej opisanego w przykładzie III, opisanych przez Wall i inni, Pain 7:103113 (1979), Bennet i Xie, Pain 33:87-107 (1988), Lekan i inni, Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992) lub Palacek i inni, Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992) lub innych testów bólu neuropatycznego.
Strukturalnie pokrewne peptydy pochodzące z cytokin i czynników wzrostu o sekwencjach identyfikacyjnych nr od 11 do 19 mogą również znaleźć zastosowanie w metodach stymulacji wyrastania aksonu, hamowaniu śmierci komórek nerwowych, przyśpieszaniu mielinizacji lub hamowaniu demielinizacji lub w hamowaniu neuropatii czuciowej lub motorycznej. Peptydy mające pomiędzy około 14 a około 50 aminokwasów i zawierające aktywny neurotropicznie region zawarty w jednej z sekwencji o numerach identyfikacyjnych od 11 do 19, można przebadać pod względem zdolności stymulacji wyrastania aksonu, co opisano w przykładzie IV; lub przebadane pod względem zdolności hamowania śmierci komórek nerwowych, co opisano w przykładzie V; lub przebadane pod względem zdolności przyśpieszania mielinizacji, co opisano w' przykładzie VI; lub przebadane pod względem zdolności hamowania demielinizacji, co opisano w przykładzie VII; lub przebadane pod względem zdolności hamowania neuropatii czuciowej, co opisano w przykładzie X.
Aktywny fragment prosapozyny lub peptydu przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego można zidentyfikować przez przeszukanie dużej kolekcji, biblioteki, przypadkowych
187 917 peptydów lub interesujących badacza peptydów przy pomocy, na przykład, jednego z wielu zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego. Takimi interesującymi peptydami mogą być, na przykład, peptydy pochodzące z cytokin i czynników wzrostu o sekwencjach identyfikacyjnych nr od 11 do 19, które mają sekwencje aminokwasowe pokrewne z aktywnym fragmentem prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 1). Interesującymi peptydami mogą również być, na przykład, populacje peptydów z sekwencją aminokwasową pokrewną z sekwencją identyfikacyjną nr 1 poprzez posiadanie konserwowanych asparagin, leucyny/izoleucyny oraz jednego lub więcej naładowanych aminokwasów w pozycjach odpowiadających pozycjom w jakim znajdują się te aminokwasy w sekwencji identyfikacyjnej nr 1, ale posiadające także posiadających jeden lub więcej aminokwasów różniących je od sekwencji identyfikacyjnej nr 1.
Biblioteki peptydowe zawierają, na przykład, znakowane chemicznie biblioteki składające się z peptydów i cząsteczek peptydomimetycznych. Biblioteki peptydowe stanowią również takie, które utworzono przy pomocy technik phage display. Techniki phage display dotyczą ekspresji cząsteczek peptydowych na powierzchni faga, jak również innych metod w których ligand proteinowy jest lub może być związany z kwasem nukleinowym, który go koduje. Metody produkcji bibliotek phage display, włącznie z wektorami i metodami różnicowania populacji eksprymowanych peptydów są dobrze znane (patrz, na przykład, Smith i Scott, Methods Enzymol. 217:228-257 (1993); Scott i Smith, Science 249:386-390 (1990) oraz House, WO 91/07141 i 91/07149). Te lub inne dobrze znane metody można zastosować do produkcji bibliotek phage display, w których białka eksponowane na powierzchni można odłączyć i przebadać pod względem aktywności w łagodzeniu bólu neuropatycznego lub innej aktywności neurotropicznej lub mielinotropicznej tutaj opisanej. Jeżeli istnieje taka potrzeba, populacje peptydów można przebadać pod względem aktywności, oraz aktywną populację można podzielić i każdą z jej części powtórnie przebadać w celu wyizolowania z populacji aktywnego peptydu. Innymi metodami produkcji peptydów przydatnych w wynalazku jest, na przykład, racjonalne projektowanie i mutageneza na podstawie sekwencji aminokwasowych aktywnych fragmentów prosapozyny, takich jak na przykład sekwencje identyfikacyjne nr 1 i nr 2.
Jak zostało tutaj ujawnione, aktywny fragment prosapozyny lub peptyd przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego może zostać zidentyfikowany przez swoją aktywność w łagodzeniu bólu neuropatycznego w jakimkolwiek z wielu dobrze opracowanych zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego (Bennet, powyżej, 1993). Na przykład, aktywny fragment prosapozyny może zostać zidentyfikowany przy pomocy doświadczalnego modelu neuropatii obwodowej u szczura wytworzonej przez podwiązanie fragmentu nerwu rdzeniowego. Szczurzy model Chunga podwaja symptomy ludzi z kauzalgią lub parzącym bólem spowodowanymi uszkodzeniem nerwu obwodowego (Kim i Chung, powyżej, 1992). Procedura operacyjna Chunga i Kima powoduje długo utrzymującą się przeczulicę bólową na szkodliwe ciepło i mechaniczną alodynię stopy, której dotyczy zabieg. Jak opisano w przykładzie I, szczury z podwiązaniem nerwu rdzeniowego wykonanym zgodnie z procedurą odkrytą przez Chunga i Kima są przydatne w identyfikacji aktywnego fragmentu prosapozyny do użytku w łagodzeniu bólu neuropatycznego.
Aktywny fragment prosapozyny lub peptyd przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego mogą również zostać zidentyfikowane przez ich aktywność w łagodzeniu bólu neuropatycznego w szczurzym modelu bolesnej neuropatii cukrzycowej. Przeczulicę bólową na szkodliwy bodziec cieplny, mechaniczny i chemiczny stwierdzono także u szczurów z krótkoterminową cukrzycą z niedoborem insuliny wywołaną selektywnymi toksynami komórek β, takimi jak streptozotocyna (Calcutt i inni, Pain 68:293-299 (1996)). Taki szczurzy model jest reprezentatywny dla bólu występującego u ludzi chorych na cukrzycę, którzy mogą wykazywać różne niewłaściwe wrażliwości, włącznie z spontanicznym bólem, bólem spowodowanym przez dotknięcie światłem oraz przeczulicą bólową. Szczury traktowane streptozotocyną lub inną selektywną toksyną komórek β mogą być leczone badanym fragmentem lub peptydem; równocześnie mierzy się odpowiedź na szkodliwy bodziec, taki jak 0,5% formalina. Obniżona odpowiedź może zostać użyta do identyfikacji aktywnego fragmentu prosapozyny lub peptydów przydatnych w łagodzeniu bólu neuropatycznego.
187 917
Aktywny fragment prosapozyny lub peptydów przydatnych w łagodzeniu bólu neuropatycznego mogą również zostać zidentyfikowane przy pomocy modelu nerwiaka Walla i innych. Ten dobrze poznany model bólu neuropatycznego naśladuje ludzkie symptomy obserwowane po amputacji lub przecięcia nerwu w nieuszkodzonej kończynie (Wall i inni, powyżej, 1979). Jak wspominano wyżej, nerwiak formuje się łatwo po przecięciu nerwu z powodu daremnego wzrostu kiełkujących nerwów.
Model przewlekłego uszkodzenia zaciskowego może również zostać do identyfikacji aktywnego fragmentu prosapozyny lub peptydów przydatnych w łagodzeniu bólu neuropatycznego. Model przewlekłego uszkodzenia zaciskowego Bennetta i Xie, powyżej, 1988, jest szczurzym modelem neuropatii obwodowej powodującym zaburzenia bólowe podobne do obserwowanych u ludzi. W modelu Bennetta, uszkodzenie nerwu wytwarza się przez luźne zawiązanie podwiązek ściskających wokół szczurzego nerwu kulszowego, co powoduje degenerację nerwu dystalną w stosunku do zacisku. W uszkodzeniu zaciskowym poza spontanicznym bólem wytwarza się alodynia i przeczulica bólowa.
Modele bólu neuropatycznego u naczelnych także są przydatne w identyfikacji aktywnych fragmentów prosapozyny i peptydów przydatnych w łagodzeniu bólu neuropatycznego (patrz, na przykład, Lekan i inni, powyżej, 1992; Palacek i inni, powyżej, 1992).
Użyty tutaj termin „peptyd” odnoszący się do aktywnego fragmentu prosapozyny, peptydu pochodzącego z prosapozyny lub peptydu przydatnego w metodach według wynalazku, oznacza związek zawierający naturalnie występujące aminokwasy, aminokwasy nie występujące naturalnie lub chemicznie zmodyfikowane aminokwasy, pod warunkiem, że związek zachowuje aktywność łagodzenia bólu neuropatycznego lub inną aktywność neurotropiczną lub mielinotropiczną, co opisano powyżej. Peptyd pochodzący z prosapozyny może być również związkiem naśladującym peptyd, to znaczy może być to nieaminokwasowa struktura chemiczna naśladująca strukturę peptydu pochodzącego z prosapozyny i pozostaje aktywna. Taki związek naśladujący jest ogólnie scharakteryzowany jako wykazujący podobne właściwości fizyczne takie jak wielkość, ładunek i hydrofobowość w tym samym ustawieniu przestrzennym co w wywodzącym się z prosapozyny peptydowym odpowiedniku. Specyficznym przykładem takiego związku naśladującego peptyd jest związek, w którym wiązanie amidowe pomiędzy jednym lub więcej aminokwasów zostało zastąpione przez, na przykład, wiązanie węgiel-węgiel lub inne dobrze znane wiązanie (patrz, na przykład, Sayer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington (1995)).
Użyty tutaj termin „aminokwas” oznacza jeden z dwudziestu naturalnie występujących aminokwasów, włącznie z, dopóki nie zostanie stwierdzone inaczej, L-aminokwasami i D-aminokwasami. Termin aminokwas odnosi się także do związków takich jak chemicznie zmodyfikowane aminokwasy włącznie z analogami aminokwasów, naturalnie występującymi aminokwasami, które nie są normalnie włączane do białek, takimi jak norleucyna oraz związkami zsyntetyzowanymi chemicznie posiadającymi właściwości powszechnie znane jako charakterystyczne dla aminokwasów, pod warunkiem, że związek może być podstawiony do peptydu w taki sposób, że zachowa on swoją biologiczną aktywność. Na przykład, glutamina może być aminokwasowym analogiem asparaginy, pod warunkiem, że może ona być podstawiona w obrębie aktywnego fragmentu prosapozyny, która zachowa swoją aktywność w łagodzeniu bólu neuropatycznego lub inną aktywność neurotropiczną lub mielinotropiczną, co opisano powyżej. Inne przykłady aminokwasów i analogów aminokwasów wymieniono w Gross i Meienihofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983). Aminokwas może być także związkiem naśladującym aminokwas, co oznacza strukturę wykazującą zasadniczo to samo rozmieszczenie przestrzenne grup funkcyjnych co aminokwas, ale nie koniecznie posiadającą obie charakterystyczne dla aminokwasów grupy a-aminową i y-karboksylową.
Aktywny fragment prosapozyny lub peptyd przydatny w wynalazku może zostać wyizolowany lub zsyntetyzowany przy pomocy dobrze znanych metod. Metodami takimi mogą być metody rekombinacji DNA oraz syntezy chemicznej do produkcji peptydu. Rekombinacyjne metody produkcji peptydów przez ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującego peptyd w odpowiedniej komórce gospodarza są dobrze znane i opisane w, na przykład, Sambrook
187 917 i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie, tomy od 1 do 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).
Aktywny fragment prosapozyny lub peptyd przydatny w wynalazku może zostać wytworzony na drodze syntezy chemicznej, na przykład, metodą syntezy peptydów w fazie stałej Merrifielda i innych, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964). Dobrze znane standardowe metody syntezy w roztworze także mogą zostać zastosowane do syntezy peptydów przydatnych w wynalazku (patrz, na przykład, Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) i Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Nowo zsyntetyzowane peptydy można oczyścić przy pomocy, na przykład, chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości (HPLC) oraz scharakteryzowane przy pomocy, na przykład, spektrometrii masowej lub analizy sekwencji aminokwasowej.
Wiadome jest, że do aktywnego fragmentu prosapozyny można wprowadzić ograniczoną ilość modyfikacji bez mszczenia jej funkcji biologicznej. Tak też, modyfikacja aktywnego fragmentu prosapozyny, która nie niszczy jej zdolności do łagodzenia bólu neuropatycznego zawiera się w definicji aktywnego fragmentu prosapozyny. Modyfikacja może być, na przykład, addycją, delecją lub podstawieniem aminokwasu; podstawieniem związkiem naśladującym strukturę lub funkcję aminokwasu oraz addycją grup chemicznych takich jak grupy aminowe lub acetylowe. Aktywność zmodyfikowanych peptydów w łagodzeniu bólu neuropatycznego można przebadać przy pomocy zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego, takich jak opisane powyżej lub testu opisanego w przykładzie I.
Szczególnie przydatną modyfikacją aktywnego fragmentu prosapozyny jest modyfikacja nadająca, na przykład, zwiększoną stabilność. Na przykład, wstawienie jednego lub więcej D-aminokwasów lub podstawienie lub delecja lizyny może zwiększyć stabilność aktywnego fragmentu prosapozyny przez ochronę przeciwko degradacji peptydu. Na przykład, co ujawniono tutaj, 14-mer pochodzący z prosapozyny o sekwencji identyfikacyjnej nr 2 ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 16 do 29 sapozyny C, ale zmienioną przez podstawienie lub delecję każdej z trzech naturalnie występujących lizyn i addycję tyrozyny do C-końca. W szczególności, 14-mer pochodzący z prosapozyny o sekwencji identyfikacyjnej nr 2 ma lizynę w pozycji 2 podstawioną D-alaniną, lizynę w pozycji 8 podstawioną alaniną i delecję lizyny z pozycji 11. Podstawienie lizyny w pozycji 2 D-alaniną nadaje zwiększoną stabilność przez ochronę peptydu przed trawieniem przez endopeptydazę, co jest dobrze znane (patrz, na przykład, strona 247 Partrige, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York (1991)). Podstawienie lub delecja lizyny nadaje zwiększoną oporność na proteazy trypsynopodobne, co jest dobrze znane (Partridge, powyżej, 1991). Podstawienia te zwiększają stabilność i przez to biodostępność peptydu o sekwencji identyfikacyjnej nr 2, ale nie wpływają na aktywność w łagodzeniu bólu neuropatycznego.
Przydatną modyfikacją może być także modyfikacja ułatwiająca przechodzenie peptydu przez barierę krew-mózg, taka jak modyfikacja zwiększająca lipofilność lub zmniejszająca ilość wiązań wodorowych. Na przykład, tyrozyna dodana do C-końca peptydu pochodzącego z prosapozyny (sekwencja identyfikacyjna nr 2) zwiększa hydrofobowość i przenikalność przez barierę krew-mózg (patrz, na przykład, Banks i inni, Peptides 13:1289-1294 (1992) i Pardridge, powyżej, 1991). Chimeryczny leczniczy peptyd o zwiększonej stabilności biologicznej lub zwiększonej przenikalności przez barierę krew-mózg, na przykład, może być także przydatny w sposobach według wynalazku.
Specjalista może łatwo zbadać zdolność aktywnego fragmentu prosapozyny do przekraczania bariery krew-mózg in vivo, na przykład, co ujawniono w przykładzie Ii. Ponadto, aktywny fragment prosapozyny można zbadać pod względem jego zdolności do przekraczania bariery krew-mózg przy pomocy modelu in vitro bariery krew-mózg opartego na systemie hodowli komórek śródbłonka mikronaczyń mózgowych co opisano w, na przykład, Browman i inni, Ann. Neurol. 14:396-402 5 (1983) lub Takahura i inni, Adv. Pharmacol. 22:137-165 (1992).
Użyty tutaj termin „skuteczna ilość” oznacza ilość aktywnego fragmentu prosapozyny przydatnego w łagodzeniu bólu neuropatycznego lub zapobieganiu bólowi neuropatycznemu. Skuteczną ilość podaje się doustrojowo w dziennej dawce zależnej od masy ciała pacjenta.
187 917
Korzystnie, skuteczną ilość podaje się doustrojowo w dziennej dawce od około 0,1 pg/kg do około 10 pg/kg. Korzystniej, skuteczną ilość podaje się doustrojowo w dziennej dawce od około 10 pg/kg do około 100 pg/kg. Skuteczna ilość peptydu do łagodzenia bólu neuropatycznego może być oznaczona empirycznie przy pomocy metod dobrze znanych specjalistom, włącznie z, na przykład, testem opisanym w przykładzie I lub ujawnionym powyżej, włącznie z testami wykonywanymi na naczelnych (Lekan i inni, powyżej, 1992 i Palacek i inni, powyżej, 1992).
Typowa minimalna ilość peptydów według wynalazku o aktywności neurotropicznej lub mielinotropicznej w komórkowej pożywce wzrostowej wynosi 5 ng/ml. Ta lub większa ilość peptydu według wynalazku może być użyta in vitro. Typowo, stężenia wahają się od 0,1 pg/ml do około 10 pg/ml użytego peptydu według wynalazku. Skuteczna ilość do leczenia konkretnych tkanek może zostać ustalona w sposób opisany w przykładach IV i VI.
Komórki nerwowe można poddać działaniu peptydu in vitro lub ex vivo przez bezpośrednie podanie peptydu według wynalazku do komórki. Można to wykonać przez, na przykład, hodowanie komórek w odpowiedniej pożywce wzrostowej odpowiedniej dla konkretnego typu komórek oraz następnie dodanie peptydu do pożywki. Jeżeli leczone komórki nerwowe występują in vivo, zazwyczaj u kręgowców, korzystnie u ssaków, peptyd według wynalazku może zostać podany na jeden z kilku sposobów opisanych poniżej.
Użyty tutaj termin „pacjent” oznacza kręgowca, korzystnie ssaka, w szczególności człowieka.
Metoda łagodzenia bólu neuropatycznego, stymulacji wzrostu aksonu, hamowania śmierci komórek nerwowych, przyśpieszania mielinizacji lub hamowania demielinizacji lub w hamowaniu lub neuropatii czuciowej lub motorycznej przez podanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny według wynalazku dożylnie, domięśniowo, śródskórnie, podskórnie, wewnątrzczaszkowo, wewnątrzmózgowo-rdzeniowo, miejscowo, doustnie, przezskórnie, przez błonę śluzową lub wewnątrznosowo. Z aktywnym fragmentem prosapozyny może zostać podany dopuszczalny farmaceutycznie nośnik dobrze znanego typu. Takim nośnikiem jest, na przykład, roztwór soli buforowany fosforanem (PBS).
Skuteczną ilość aktywnego fragmentu prosapozyny wstrzykuje się bezpośrednio do krwi pacjenta. Na przykład, w celu podania aktywnego fragmentu prosapozyny do obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego można zastosować wstrzyknięcie dożylne, ponieważ jodowany 18-mer pochodzący z prosapozyny Tyr-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-AsnLys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (sekwencja identyfikacyjna nr 20), zawierający aminokwasy od 12 do 29 22-meru pochodzącego z prosapozyny o sekwencji identyfikacyjnej nr 1 z podstawieniem waliny w pozycji 12 tyrozyną (ciężar cząsteczkowy = 2000) przechodzi przez barierę krew-mózg i wchodzi do ośrodkowego układu nerwowego, co opisano w przykładzie II. Wychwyt przez mózg wynosił około 0,03%, co leży w środku zakresu dla peptydów o takim mniej więcej rozmiarze, które przejdą przez barierę krew-mózg (Banks i inni, powyżej, 1992).
Doustne podawanie może być często konieczne, a możliwe jest pod warunkiem, że aktywny fragment prosapozyny został zmodyfikowany w taki sposób, że jest stabilny w trawieniu żołądkowo jelitowym i łatwo wchłanialny. Podstawienie, na przykład, jednym lub więcej D-aminokawsem może nadać zwiększoną stabilność peptydu pochodzącego z prosapozyny przydatnego w wynalazku.
Bezpośrednia injekcja wewnątrzczaszkowa lub injekcja do płynu mózgowo-rdzeniowego może być także użyta do wprowadzenia skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny do ośrodkowego układu nerwowego pacjenta. Ponadto, aktywny fragment prosapozyny można podać do obwodowej tkanki nerwowej przez bezpośrednią injekcję lub miejscowe podanie lub przez podanie ogólnoustrojowe. Rozważa się również inne konwencjonalne metody podawania takie jak podawanie dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórnie, wewnątrzczaszkowe, nadtwardówkowe, miejscowe, doustne, przezskórne, przez błonę śluzową lub wewnątrznosowe.
Aktywny fragment prosapozyny może być także podawany w formie o przedłużonym uwalnianiu. Przedłużone uwalnianie aktywnego fragmentu prosapozyny ma takie zalety
187 917 w łagodzeniu bólu neuropatycznego, że działa przez przedłużony okres czasu bez potrzeby ponownego podawania aktywnego fragmentu.
Przedłużone uwalnianie można osiągnąć dzięki, na przykład, materiałowi o przedłużonym uwalnianiu takiemu jak opłatek do leków, immunokuleczki, mikropompa lub inny materiał umożliwiający kontrolowane wolne uwalnianie aktywnego fragmentu prosapozyny. Takie materiały do kontrolowania uwalniania są dobrze znane i dostępne w handlu (Alza Corp., Pało Alto CA; Depotech, La Jolla Ca; patrz też Pardoll, Ann. Rev. Immunol. 13:399-415 (1995). Ponadto, bioerodujące lub biodegradowalne materiały, które mogą być użyte w preparatach z aktywnym fragmentem prosapozyny, takie jak polikwas mlekowy, polikwas galaktonowy, regenerowany kolagen, liposomy wieloblaszkowe lub inne konwencjonalne preparaty depot mogą być zastosowane do wolnego uwalniana aktywnego fragmentu prosapozyny. W niniejszym wynalazku rozważa się także zastosowanie pomp wlewających, systemów wiązania w macierzy i narzędzi do podawania przez skórnego.
Aktywny fragment prosapozyny może być także korzystnie zamknięty w micelach lub liposomach. Technologia zamykania w liposomach jest dobrze znana. Liposomy mogą być zaadresowane do konkretnej tkanki, takiej jak tkanka nerwowa, przy pomocy receptorów, ligandów lub przeciwciał zdolnych do wiązania z docelową tkanką. Przygotowanie takich preparatów jest dobrze znane (patrz, na przykład, Pardridge, powyżej, 1991 i Radin i Metz, Meth. Enzymol. 98:613-618 (1983)).
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być pakowana i podawana w dawce jednostkowej, np. jako środek do iniekcji lub preparat do podawania miejscowego, w dawce która jest równoważna dziennej dawce podawanej pacjentowi, oraz, w razie potrzeby można ją przyrządzać jako środek o kontrolowanym uwalnianiu. Postać dawki jednostkowej może np. stanowić ampułka ze szczelnym zamknięciem, zawierająca dzienną dawkę aktywnego środka według wynalazku w PBS lub w postaci liofilizowanej. W przypadku leczenia chorób nerwów odpowiednia dzienna doustrojowa dawka peptydu według wynalazku jest zależna od wagi ciała kręgowca i zwykle wynosi od około 10 do około 100 pg/kg, choć można również rozważać stosowanie dawek od około 0,1 do około 1000 pg/kg. W związku z tym w przypadku typowego człowieka o wadze 70 kg, doustrojowa dzienna dawka może wynosić od około 7 do około 70 000 pg, a korzystnie od około 700 do około 7 000 pg. Dzienna dawka materiału podawanego miejscowo może być o rząd wielkości mniejsza od dawki podawanej doustrojowo. Rozważyć można także podawanie doustne.
Możliwa jest także terapia łagodzenia bólu neuropatycznego u osobnika poprzez przeszczepienie osobnikowi komórki zmodyfikowanej genetycznie tak, że będzie eksprymować i wydzielać aktywny fragment prosapozyny. Przeszczep może dostarczyć ciągłego źródła aktywnego fragmentu prosapozyny i w związku z tym przedłużone łagodzenie bólu neuropatycznego. W przypadku osobnika z przedłużonym lub przewlekłym bólem neuropatycznym zaletę takiego sposobu stanowi możliwość wyeliminowania lub ograniczenia potrzeby powtarzanego podawania aktywnego fragmentu prosapozyny.
Wykorzystując dobrze znane sposoby komórkę można w prosty sposób transfekować wektorem ekspresji zawierającym kwas nukleinowy kodujący aktywny fragment prosapozyny (Chang, Somatic Gene Therapy, CRS Press, Boca Raton (1995)). Po przeszczepieniu np. do mózgu transfekowana komórka eksprymuje i wydziela aktywny fragment prosapozyny i w związku z tym łagodzi ból neuropatyczny. Sposób taki może być przydatny w łagodzeniu bólu neuropatycznego, w sposób podobny do opisanego w przypadku przeszczepiania komórek, które wydzielają substancje o właściwościach przeciwbólowych (patrz np. Czech i Sagen, Prog. Neurobiol. 46: 507-529 (1995)).
Komórkę może stanowić dowolna komórka, która może przeżyć po przeszczepieniu, i która może być zmodyfikowana tak, aby eksprymować i wydzielać aktywny fragment prosapozyny. W praktyce komórka powinna być immunologicznie kompatybilna z osobnikiem. Tak np. szczególnie przydatną komórkę stanowi komórka pobrana od leczonego osobnika, gdyż taka komórka jest immunologicznie kompatybilna z osobnikiem.
Komórka pochodząca ze źródła innego niż leczony osobnik może być również przydatna, jeśli będzie chroniona przed odrzuceniem odpornościowym, np. poprzez mikrokapsułko18
187 917 wanie lub osłabienie odporności. Do przydatnych membranowych materiałów do mikrokapsułkowania należy alginian-alginian poli-L-lizyny i agaroza (patrz np. Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boca Raton (1993); Tai i Sun, FASEB J. 7:1061 (1993); Liu i inni, Hum. Gene Ther. 4: 291 (1993); oraz Taniguchi i inni, Transplant Proc. 24: 2977 (1992)). Tak np. zmniejszenie bólu osiągnięto stosując komórki kapsułkowane w polimerze przeszczepione do podpajęczynówkowego obszaru rdzenia szczura (Wang i inni, Soc. Neurosci. Abstr. 17: 235 (1991)).
W przypadku leczenia ludzi komórkę może stanowić komórka ludzka, choć mogą być również przydatne komórki nie pochodzące od ludzi. W szczególności ludzki fibroblast, komórkę mięśniową, komórkę glejową, komórkę będącą prekursorem komórki nerwowej, albo komórkę nerwową, można transfekować wektorem ekspresji, tak aby eksprymowały one i wydzielały aktywny fragment prosapozyny, np. o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1. Pierwotny fibroblast można np. uzyskać wykonując biopsję skóry leczonego osobnika, utrzymując go następnie w standardowych warunkach hodowli tkanek. Do przeszczepiania może również nadawać się pierwotna komórka mięśniowa. Rozważania dotyczące przeszczepiania komórek nerwowych znaleźć można np. w publikacji Changa, supra, 1995.
Komórka pochodząca z ośrodkowego układu nerwowego może szczególnie nadawać się do przeszczepiania do ośrodkowego układu nerwowego, gdyż zdolność przeżycia takiej komórki w jej naturalnym środowisku jest znacznie zwiększona. W sposobie według wynalazku szczególnie przydatna jest komórka będąca prekursorem komórki nerwowej, gdyż komórkę będącą prekursorem komórki nerwowej można hodować, transferować wektorem ekspresji i wprowadzić do organizmu osobnika, z którym zintegruje się ona. Wydzielanie komórek będących prekursorami komórek nerwowych, zdolnych do proliferacji i różnicowania się na komórki nerwowe i komórki glejowe, opisali Renfranz i inni, Celi 66: 713-729 (1991).
Sposoby transfekowania komórek ex vivo są również dobrze znane (Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manula, W.H. Freeman & Co., New York (1990)). Do transfekowania komórek, które w dalszym ciągu dzielą się, takich jak fibroblast, komórka mięśniowa, komórka glejowa lub komórka będąca prekursorem komórki nerwowej, korzystnie stosuje wykorzystuje się wektory retrowirusowe. Do transfekowania wektora ekspresji do komórki pomitotycznej, takiej jak komórka nerwowa, przydatny jest wektor z wirusa opryszczki ze zdefektowaną replikacją (HSV-1) (During i inni, Soc. Neurosci. Abstr. 17: 140 (1991); Sabie i inni, Soc. Neurosci. Abstr. 17: 570 (1991)).
Kwas nukleinowy kodujący aktywny fragment prosapozyny może być eksprymowany pod kontrolą jednego z wielu znanych promotorów, w tym promotora konstytutywnego lub promotora indukowanego, patrz np. Chang, supra, 1995. Szczególnie przydatny promotor konstytutywny, zapewniający wysoki poziom ekspresji, stanowi długa końcowa powtórka wirusa mysiej białaczki Moloney'a (MLV-LTR), bezpośredni wczesny obszar wirusa cytomegalii (CMV-IE) lub wczesny obszar wirusa małpiego 40 (SV40).
W opisie ujawniono sekwencję kwasu nukleinowego kodującą aktywny fragment prosapozyny. Tak np. sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą sekwencję o numerze identyfikacyjnym 1 stanowi
5”-TGTGAATrCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGAC TGAGAAAGAAATACTC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 21) (Dewji i inni, Proc Natl. Acad Sci USA 84: 8652-8656 (1987)). W celu kierowania wydzielaniem peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 można np. kwas nukleinowy kodujący sekwencję sygnałową, taką jak sekwencja sygnałowa β-laktamazy, można operacyjnie połączyć z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 21 w sposób opisany przez Simona i innych, J. Cell. Biol. 104:1165 (1987).
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego zakresu.
Przykład I
Łagodzenie bólu neuropatycznego u modelowych szczurów według Chunga
W przykładzie tym opisano wpływ uderzeniowej iniekcji dooponowej aktywnego fragmentu prosapozyny w doświadczalnym modelu Chunga obwodowego bólu neuropatycznego.
187 917
Każdy z 3 peptydów otrzymano w czystej postaci na drodze syntezy chemicznej, rozpuszczono w sterylnym PBS i buforowano do obojętnego pH.
Procedurę chirurgiczną, opisaną przez Kima i Chunga, supra, 1992, wykonano na samcach szczurów Sprague-Dawley o wadze 120-150 g, w celu wywołania stanu alodynii. W skrócie szczury uśpiono halotanem; następnie lewe nerwy rdzeniowe L-5 i L-6 oddzielono w sąsiedztwie kręgosłupa i podwiązano jedwabną nicią chirurgiczną 6.0 w miejscu oddalonym od zwoju korzenia tylnego. Po okresie 10-14 dni zdrowienia po operacji szczurom wprowadzono cewniki kręgowe. 5 dni po drugiej operacji podano dooponowo lek, stosując mechanicznie poruszaną strzykawkę do mikroiniekcji, połączoną z cewnikiem kręgowym, wstawionym przez otwór wielki kości potylicznej. Przed badaniem zwierzęta umieszczono w przezroczystych klatkach z siatki plastikowej i pozostawiono je do zaaklimatyzowania.
Aby ocenić 50% próg mechaniczny cofania łapy włos von Frey'a przyłożono do tylnej łapy, nie dotykając poduszeczki. Każdy z włosów Frey'a, które skalibrowano tak, aby zginały się przy siłach wzrastających logarytmicznie, dociskano prostopadle do łapy z siłą wystarczającą do spowodowania łagodnego wygięcia, przez okres około 6-8 s. Dodatnią odpowiedź obserwowano, gdy łapa była gwałtownie cofana. Dla każdego punktu zbierano 6 wyników, rejestrując dla każdego punktu czasowego maksymalny i minimalny bodziec. Uzyskany układ odpowiedzi tabelaryzowano i wyliczano 50% próg odpowiedzi. Na wykresie pokazano odpowiedź na podaną dawkę peptydu podawaną w postaci pojedynczej uderzeniowej iniekcji dooponowej. Na osi X podano czas po iniekcji, zaznaczając punkty, w których mierzono nadwrażliwość na naciskanie poduszeczki łapy.
Wszystkie zoperowane szczury wykazywały dotykową alodynę przed iniekcją aktywnego fragmentu prosapozyny. Jak to pokazano na fig. 1, w czasie 0 zmierzony próg wrażliwości wynosił mniej niż 3,0-4,0 g, przed podaniem peptydu. Dooponowe wstrzyknięcie 0,7 lub 0,07 pg peptydu pochodzącego z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) zahamowało alodynię w stopniu zależnym od dawki. Zmniejszenie alodynii objawia się wzrostem progowej siły, gdyż szczur wytrzymuje większą siłę przed cofnięciem drażnionej łapyZnaczące działanie zaobserwowano w 15 minut po iniekcji. Maksymalne działanie zaobserwowano 120 minut po iniekcji. Szczury, którym wstrzyknięto największą dawkę peptydu pochodzącego z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1), w dalszym ciągu wykazywały znacząco zmniejszoną alodynię w ostatnim czasowym punkcie pomiarowym (180 minut). Szczury, którym wstrzyknięto 0,007 pg peptydu pochodzącego z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) nie wykazywały znaczącego zmniejszenia alodynii. Przy żadnym stężeniu nie zaobserwowano znaczących skutków ubocznych, takich jak uspokojenie polekowe.
Zbadano również zdolność peptydu pochodzącego z prosapozyny o 14 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2, patrz tabela 1) na łagodzenie alodynii u modelowych szczurów według Chunga, jak to pokazano na fig. 2, aktywny fragment prosapozyny (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) wykazywał skuteczność w zmniejszaniu alodynii. Szczytowe działanie peptydu pochodzącego z prosapozyny o 14 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) zaobserwowano w 15-30 minut po iniekcji, a powrót do wielkości przed iniekcją nastąpił po 60 minutach (fig. 2). Nie zaobserwowano żadnych skutków ubocznych przy żadnym ze stężeń peptydu pochodzącego z prosapozyny o 14 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2).
Mutantowy peptyd o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), który różni się od peptydu pochodzącego z prosapozyny o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) tym, że zawiera resztę kwasu asparaginowego zamiast asparaginy (patrz tabela 4) również zbadano pod względem działania w łagodzeniu alodynii u modelowych szczurów według Chunga. Nie zaobserwowano zmiany w odpowiedzi alodynicznej szczurów Chunga po iniekcji 17,5 pg mutantowego peptydu o 22 merach (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8).
Normalnym szczurom, które nie odczuwały bólu na skutek urazów chirurgicznych wprowadzonych zgodnie z modelem Chunga, również wstrzyknięto aktywny fragment prosa20
187 917 pozyny (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1), po czym zbadano ich reakcję na bodziec cieplny, zgodnie z procedurą opracowaną przez Benneta i Xie, supra, 1988. W skrócie ustala się czas przed cofnięciem przez szczura drażnionej nogi ze źródła ciepła, określany jako okres utajenia na gorącej płycie i mierzy się tolerancję na ból powodowany przez bodziec cieplny.
Dooponowy cewnik wprowadzono normalnym samcom szczura Sprague-Dawley. 5 dni po tej operacji szczurom wstrzyknięto dooponowo aktywny fragment prosapozyny (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1). Szczury badano na gorącej płycie (52,5°C); okresy utajenia reakcji na gorącą płytę mierzono przed iniekcją, oraz w różnych punktach czasowych po iniekcji, do 180 minut. Nie zaobserwowano znaczącego wydłużenia okresu utajenia reakcji na gorącą płytę. Tak więc peptyd pochodzący z prosapozyny (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) nie wpływa na percepcję bólu przez normalne zwierzęta.
Przykład II
Wchłanianie in vivo peptydów pochodzących z prosapozyny przez ośrodkowy układ nerwowy
Wyniki przedstawione w tym przykładzie wskazują, że peptydy pochodzące z prosapozyny przechodzą przez barierę krew-mózg.
18-merowy peptyd (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 20) zawierający aminokwasy 12-29 sapozyny C z tyrozyną zastępującą walinę w pozycji 12, zsyntetyzowano chemicznie w syntetyzatorze peptydów Applied Biosystems Model 430. Następnie przeprowadzono radiojodowanie peptydu metodą laktoperoksydazową; radioznaczony peptyd o aktywności 20 x 106 cpm (zliczeń/minutę) wstrzyknięto w małżowiny uszne szczurów. Zwierzęta uśmiercono po 1 godzinie i 24 godzinach i ich serca poddano perfuzji izotonicznym roztworem soli w celu usunięcia krwi z mózgu.
W celu określenia procentowego wchłaniania peptydu mózg poddano zliczaniu w liczniku γ. Dodatkowo mózg zhomogenizowano i rozdzielono na frakcję bogatą w kapilary (osad) i miąższową frakcję mózgową (supematant), po odwirowaniu w dekstranie (Triguero i inni, J. Neurochem., 54: 1882-1888 (1990)). Sposób taki umożliwia rozróżnienie pomiędzy radioznaczonym peptydem w naczyniach krwionośnych i w mózgu. Po 24 godzinach 0,017% wstrzykniętego peptydu (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 20) wykryto w całym mózgu; 75% znacznika znajdowało się we frakcji miąższowej, a 25% we frakcji kapilarnej. Po 1 godzinie 0,03% wstrzykniętej dawki znajdowało się w całym mózgu.
Zbadano również w następujący sposób zdolność do przekraczania bariery krew-mózg przez peptyd pochodzący z prosapozyny o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2. Samice szczura Sprague-Dawley uśpiono metoksyfluranem i do żyły ogonowej wstrzyknięto około 20 pg peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym (3,2 x 108 cpm). Po 40 minutach zwierzęta uśmiercono przez uśpienie eterem i wykonano perfuzję około 250 ml PBS przez serce. Całkowitą ilość peptydu w mózgu, wątrobie i we krwi wyliczono jako procent wstrzykniętego materiału, co przedstawiono w tabeli 6. W celu określenia umiejscowienia w mózgu zastosowano metodę zubożania w kapilary, Triguero, J. Neurochem., 54: 1882 (1990) w celu rozdzielenia tkanki mózgowej na frakcję miąższową i mózgową frakcję kapilarną. Wyniki frakcjonowania wykazały, że 87% peptydów o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 znajdowało się w miąższu mózgu, a 13% znaleziono w kapilarach mózgowych.
Tabela 6
Tkanka Waga Całkowite cpm w tkance % wyjściowych cpm
Mózg 1,3 g 161 000 0,050
Wątroba 8,8 g 5,2 x 106 1,625
Krew około 22 μΙ 1,01 x 108 31,6
W podobnym doświadczeniu, w którym szczury uśmiercono po 3 godzinach od podania peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 stwierdzono obecność 0,06% peptydu w mózgu, z tego 85% w miąższu. Wyniki te wskazują, że co najmniej część peptydu pochodzącego z prosapozyny o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 przekracza barierę
187 917 krew-mózg i skupia się raczej w miąższu mózgowym, a nie w nabłonku naczyniowym (na naczyniach krwionośnych). Procent peptydu, który przekracza barierę krew-mózg, leży w średnim przedziale dla peptydów, które przekraczają tą barierę, podanym w publikacji Banksa, supra, 1992.
W celu oznaczenia procentowej zawartości nienaruszonego materiału w mózgu, wątrobie i we krwi, radioznaczony materiał (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) wydzielony z tkanek zanalizowano metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. W celu normalizowania w aspekcie degradacji w czasie obróbki homogenatów tkankowych, peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 dodawano do homogenatów tkankowych. Zaobserwowany stopień degradacji przy dodanym materiale peptydowym wykorzystano do normalizowania w aspekcie degradacji w czasie obróbki tkanek. Po normalizowaniu uzyskano następujące wyniki: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 w mózgu była w około 60% nienaruszona; w wątrobie nienaruszono w około 80%, a w krwi nienaruszono w około 40%. W drugim doświadczeniu peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 w mózgu był nienaruszony w około 68%. Wyniki te wskazują, że peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 przekracza barierę krew-mózg i w mózgu pozostaje w znacznym stopniu nienaruszony.
Przykład III
Łagodzenie bólu neuropatycznego u diabetycznych szczurów
W przykładzie tym przedstawiono wpływ śródotrzewnowego podawania peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 na szczurzy model neuropatii cukrzycowej.
U szczurów wywołano cukrzycę wstrzykując im dootrzewnowo jedną dawkę streptozotocyny (50 mg/kg wagi ciała, świeżo rozpuszczonej w 0,9% sterylnym roztworze soli) w celu usunięcia trzustkowych komórek β i wywołania deficytu insuliny, w sposób opisany przez Calcutta i innych, Pain 68: 20 293-299 (1996). Po 2 dniach cukrzycę u szczurów, którym wstrzyknięto streptozotocynę, potwierdzono mierząc im poziom glukozy we krwi. Zwierzęta, którym wstrzyknięto streptozotocynę, ze stężeniem glukozy we krwi poniżej 15 mmoli/litr wyłączono z dalszych badań, zgodnie z powszechnie przyjętą definicją hiperglikemii nie związanej z głodem w badaniach cukrzycy u szczurów.
Szczury z cukrzycą i kontrolne badano przez 8 tygodni analizując ich zachowanie w reakcji na szkodliwą chemicznie formalinę, jako wskaźnik alodynii (Calcutt i inni, supra, 1996). W skrócie szczurom podawano podskórnie świeżo przygotowaną formalinę (50 μ l 0,5% roztworu w sterylnym roztworze soli) w grzbietową część prawej tylnej łapy. Takie stężenie formaliny wywołuje podmaksymalne reakcje w zachowaniu szczurów kontrolnych i umożliwia wykrycie przeczulicy bólowej u szczurów diabetycznych w fazach Q i 2 (Calcutt i inni, Eur.
J. Pharmacol. 285: 189-197 (1995)). Zwierzęta przeniesiono do komory obserwacji, skonstruowanej tak, aby można było stale obserwować ich łapy. Liczby trzepotań w okresach jednominutowych zliczane były w odstępach 5 minutowych w ciągu następnych 60 minut przez obserwatora, który nie wiedział, do jakiej grupy należy każde zwierzę. Fazę 1 określa się jako fazę wyjściowego pomiaru trzepotań (minuty 1-2 i 5-6 po iniekcji), faza Q (uspokojenia) przypada dla pomiarów wykonywanych w minutach 10-11, 15-16 i 20-21, a faza 2 przypada dla wszystkich pozostałych pomiarów po iniekcji, jako to zostało uprzednio zdefiniowane dla badań diabetycznych szczurów (patrz np. Malmberg i inni, Neurosci. Lett. 161: 45-48 (1993)). Porównanie aktywności w każdej fazie wykonuje się sumując trzepotania w okresach pomiarowych w każdej fazie. U szczurów diabetycznych obserwuje się nienormalną odpowiedź w postaci trzepotania, jak to zostało uprzednio opisane.
Peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 otrzymano w czystej postaci na drodze syntezy chemicznej, rozpuszczono w sterylnym PBS i buforowano do obojętnego pH.
Diabetyczne szczury podzielono na 2 grupy po 4 zwierzęta w każdej grupie, i podano im odpowiednio roztwór soli i peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2. Na 2 godziny przed zastosowaniem 0,5% formaliny szczurom diabetycznym podano śródotrzewnowo roztwór soli lub 200 μg/kg peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2. Jak to pokazano na fig. 3, podawanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 całkowicie zapobiega nienormalnej reakcji trzepotania w fazie 1 i zmniejsza reakcję w fazie 2 o 70%. W związku
187 917 z tym pozajelitowe podawanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 łagodzi ból wywołany przez iniekcję formaliny w szczurzym modelu bolesnej neuropatii cukrzycowej.
Przykład IV
Pobudzanie wzrostu aksonów in vitro
W przykładzie tym opisano zastosowanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 do pobudzania wzrostu aksonów in vitro.
Komórki nerwiaka niedojrzałego NS20Y hodowano w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Komórki usunięto za pomocą trypsyny i wysiano w 30-mm szalkach Petriego, na szklanych pokrywkach. Po 20 i 24 godzinach pożywkę zastąpiono 2 ml DMEM zawierającego 0,5% płodowej surowicy cielęcej z 0, 0,5, 1, 2, 4 lub 8 ng/ml peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub rozrzuconego peptydu kontrolnego. Komórki hodowano dodatkowo przez 24 godziny, przemyto PBS i utrwalano roztworem Bouina (nasycony wodny roztwór kwasu pikrynowego/formalina/kwas octowy 15:5:1) przez 30 minut. Po usunięciu utrwalacza za pomocą PBS oceniono wzrost aksonów pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Komórki zawierające jeden lub więcej wyraźnych aksonów równych średnicy komórki lub dłuższych oceniano jako dodatnie w aspekcie wzrostu aksonów. Co najmniej 200 komórek w różnych położeniach oceniano na każdej szalce, w celu wyznaczenia udziału procentowego komórek zawierających aksony, przy czym każdy peptyd oceniano dwukrotnie.
Peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 znacząco zwiększa wzrost aksonów w komórkach NS20Y w porównaniu z rozrzuconym peptydem kontrolnym zawierającym takie same aminokwasy, ale w innej kolejności. Zwiększony wzrost aksonów obserwuje się przy zastosowaniu peptydu w ilości zaledwie 0,5 nm/ml.
Przykład V
Hamowanie obumierania komórek nerwowych in vitro
W przykładzie tym opisano zastosowanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 do hamowania obumierania komórek nerwowych in vitro.
Komórki NS20Y wysiano w sposób opisany w przykładzie IV i hodowano na szklanych pokrywkach w 0,5% płodowej surowicy bydlęcej przez 2 dni w obecności lub bez 8 ng/ml peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub rozrzuconego peptydu kontrolnego. Pożywki usunięto i do każdej studzienki dodano 0,2% błękitu trypanowego w PBS. Martwe komórki barwią się na niebiesko błękitem trypanowym. Oblicza się ich udział procentowy w całości pod odwróconym mikroskopem, zliczając 400 komórek w czterech obszarach każdej studzienki. Średni błąd przy powtórkach wynosił ± 5%. Peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 znacząco zmniejsza liczbę komórek dodatnich względem błękitu trypanowego (martwych). Oznacza to, że peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 może hamować programowane obumieranie komórek.
Przykład VI
Próba mielinizacji ex vivo
W przykładzie tym opisano zastosowanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 w pobudzaniu wzrostu aksonów i ułatwianiu mielinizacji
Eksplanty móżdżków nowo narodzonych myszy przygotowano w sposób podany przez Satomiego, Zool. Sci. 9: 127-137 (1992). Wzrost aksonów i mielinizację obserwowano w ciągu trwającej 22 dni hodowli, gdyż w tym czasie w móżdżku nowo narodzonych myszy zwykle następuje różnicowanie komórek nerwowych i rozpoczyna się mielinizacja. W drugim dniu po przygotowaniu preparatów eksplantów peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 dodano do trzech eksplantów w stężeniu 10 pg/ml, a do trzech eksplantów dodano rozrzucony peptyd kontrolny, również w stężeniu 10 pg/ml. Wzrost aksonów i mielinizację w trzech eksplantach kontrolnych i trzech potraktowanych peptydem o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 oceniano pod mikroskopem z jasnym polem oraz z wykorzystaniem kamery wideo. W ósmym dniu hodowle zawierające peptydy były cieńsze i bardziej rozprzestrzenione niż hodowle kontrolne. W 15 dniu hodowle, do których dodano peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, zawierały wiele komórek z długimi wypustkami na obwodzie eksplantu. Takie wypustki nie występują lub są mniej widoczne w hodowlach kontrolnych. Hodowle, do których dodano peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 znacząco
187 917 więcej mielinizowanych aksonów w podkorowej istocie białej w 22 dniu, w porównaniu z eksplantami kontrolnymi. Tak więc peptyd według wynalazku wywołuje mielinizację w różnicującym się móżdżku ex vivo.
Przykład VII
Hamowanie demielinizacji
Występuje korelacja pomiędzy zmniejszaniem się obumierania komórek Schwamma i hamowaniem demielinizacji. Dodanie peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 do komórek Schwamma w hodowli zmniejsza ich obumieranie w sposób zależny od dawki, czego nie obserwuje się w przypadku rozrzuconego peptydu kontrolnego. Tak więc peptyd o sekwencji według wynalazku o numerze identyfikacyjnym 2 może hamować demielinizację.
Przykład VIII
Leczenie urazowych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN)
Ludziom z uszkodzeniami urazowymi rdzenia kręgowego podano na drodze iniekcji domózgowo-rdzeniowej lub iniekcji bezpośredniej 100 pg/ml peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, w postaci roztworu w sterylnym roztworze soli, albo w postaci depotu umożliwiającym powolne, ciągłe uwalnianie peptydu w miejscu wystąpienia uszkodzenia. Poprawę oceniano na podstawie zwiększenia działania nerwu motorycznego, np. zwiększonego ruchu kończyn. Podawanie powtarzano do momentu, gdy nie nastąpiła dalsza poprawa.
Przykład IX
Leczenie zaburzeń demielinizacyjnych
Pacjentom z diagnozą wczesnego stadium MS podawano peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 stosując bezpośrednią dożylną iniekcję do płynu mózgowo-rdzeniowego, w takiej samej dawce, jak w przykładzie VIII. Dawkowanie powtarzano codziennie lub co tydzień; stwierdzono wzrost siły mięśni, koordynacji mięśniowo-szkieletowej i mielinizacji (określanej techniką MRI).
Przykład X
Leczenie neuropatii czuciowej
Myszom podano taksol w celu wywołania neuropatii czuciowej. Myszom, które poddano działaniu taksolu, podano peptyd pochodzący z prosapozyny, o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, w dawkach 100 pg/kg, 200 pg/kg i 1 mg/kg. Zanik czucia temperatury, jako wskaźnik neuropatii czuciowej, mierzono za pomocą aparatu Hargreaves do badania czucia. Każda z trzech dawek peptydu o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 skutecznie hamowała zanik czucia temperatury u myszy, które poddano działaniu taksolu. W podobny sposób zbadano również peptyd o 22 merach, pochodzący z prosapozyny, o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, stwierdzając, że jest on skuteczny w hamowaniu utraty czucia temperatury przez myszy, które poddano działaniu taksolu. Wyniki wskazują, że peptydy pochodzące z prosapozyny, takie jak peptyd o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 i 2, można zastosować do skutecznego hamowania neuropatii czuciowej.
Jakkolwiek wynalazek został opisany w odniesieniu do powyższych przykładów, należy zdawać sobie sprawę, że dokonać można różnych modyfikacji bez wychodzenia poza istotę wynalazku. W związku z tym zakres wynalazku jest ograniczony jedynie poniższymi zastrzeżeniami.
187 917
Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający: The Regents of the University of
California (ii) Tytuł wynalazku: Sposoby łagodzenia bólu neuropatycznego za pomocą peptydów pochodzących z prosapozyny (iii) Liczna sekwencji: 21 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Campbell and Flores (B) Ulica: 4370 La Jolla Village Drive, Suite 700 (C) Miasto: San Diego (D) Stan: California (E) Państwo: USA (F) Kod: 92122 (v) Postać odczytywana komputerowo:
(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release 1.0, wersja 1.25 (vi) Dane dotyczące zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszena::
(B) Data zglosenia:: 05 maraa 1977 (C) Klasyiiiacia:
(viii) Informacja dotycząca rzecznika/pełnomocnika:
(A) Nazwssk: : C^^i^j^ieell: Cathryn A.
(B) Numer rejestracyjy:: 35 815 (C) Numer rejestracyjny rzecznia:: FP-UD 2474 (ix) Informacje ttlekomunikacyjne:
(A) Telefon: (619) 553-9001 (B) Telefax: (β19) 535-8949 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) DŁugoć:: 25 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologa:: liniowa (xi) Opis sekwecji:: SEQ ID N:: ::
Cys Glu Phe LeL u aV lys Glu Vvl TTr Lyzs Llz :il Asp Asn Asn Ll: 15 10 15
Thr Glu Lys Glu Ile Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długoćć: 4 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topolcia: liniowa (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Peptyd (B) Położenie: 2 (C) Inne informacje: Uwaga: Xaa oznacza D· alaninę (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:
187 917
Thr Xaa Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu Ile Leu Tyr
10 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 12 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu
10 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 22 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:
Cys Gin Phe Val Met Asn Lys Phh Sse Glu Leu Ile Val Asn Asn Ala 15 11 15
Thr Glu Glu Leu Leu Tyr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 21 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:
Cys Gln Leu Val Asn Arg Lys Leu Ser GJ-u Leu Ile Ile Asn Asn Ala 15 11 11
Thr Glu Glu Leu Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 22 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:
Cys Glu Tyr Val Val Lys Lys Val Met Lm Leu Ile Asp Asn Asn Arg 15 11 11
Thr Glu Glu Lys Ile Ile (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 22 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:
187 917
Cys Glu Phe Val Val Lys Glu Val Ala Lys Leu Ile Asp Asn Asn Arg 15 10 15
Thr Glu Glu Glu ile Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 22 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:
Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asp Asn Lys
1 5 10 15
Thr Glu Lys Glu Ile Leu
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 14 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji.: SEQ ID NO: 9:
Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asp Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 15 10 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 10:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 14 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:
Thr Lys Ser Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 15 10 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 20 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:
Tyr Val Lys His Gin Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser- Val 15 10 15
Asp Gly Val Pro (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 12:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 15 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 12:
187 917
Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Gly 15 10 15 (2) Informacji dotycząca SEQ ID NO: 13:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 17 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 13:
Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly IIg Asa nsn Tyr Lys Ala rot Lyt Muu 15 11 15
Thr (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji.:
2S) Długość: 12 2lilLkwalnó (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 14:
Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Ang Ars Ppt Asn Leu
H (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 13 3linL0walnó (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 15:
Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Llu Aal GAg Gly Thr Leu
11 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 17 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 16:
Ala Glu His Cys Ser Leu Ans Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp TTh Lys 15 1(0 11 lal (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 18 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 17:
Tyr Thr Ala Gin Gly Glu Pito Phe Pro Asn Asn Vat Glu Lys Leu Cys 15 10 11
Ala Pro
187 917 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 18:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 15 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 18:
Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala 1 5 10 15 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 19:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 18 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 19:
Arg Pro Asn Ile LeuGly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin 1 5 11 11
Leu Leu (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 20:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 18 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 20:
Tyr Lys Glu Val Thr rLy Lee l le Asp Asn Aig Lys Thr Lyu Lts Glu
5 11 15
Ile Leu (2) Informacja dotycząca (i) Charakterystyka (xi) (A) (B) ©
(D)
Opis
SEQ ID NO: sekwencj i: Długość: 66 par zasad Typ: kwas nukleinowy
21:
Niciowość: Topologia: sekwencj i:
podwójna liniowa SEQ ID NO:
21, rlrlrrrrll TGlrlrAllA uiTimm lrlArrlAlr rlrAcrrlrl 60
TACTC
187 917
187 917
Próg (g)
FIG. 2
187 917 suma trzepotań
FIG. 3
187 917
0.7 /ig/szczura n = 3 -Δ— 0.07 μ9/szczura n = 3
0.007 ^g/szczura n = 3
FIG. I
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (25)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Oczyszczony lub izolowany polipeptyd obejmujący sekwencję Thr-Ri-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, w którym R1 oznacza D-alaninę (SEQ ID nr 2).
  2. 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd jak określono w zastrz. 1, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
  3. 3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jest w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu.
  4. 4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jest w postaci liposomalnej.
  5. 5. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jest w postaci liofilizowanej.
  6. 6. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jest w formie jednostkowej postaci dawkowania.
  7. 7. Zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny zlokalizowanego w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 1 lub modyfikowanego aktywnego fragmentu prosapozyny do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno-wrażliwego bólu neuropatycznego obwodowego układu nerwowego u osobnika cierpiącego z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany.
  8. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że aktywny fragment prosapozyny stanowi sekwencja przedstawiona na SEQ ID nr 1.
  9. 9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że skuteczną ilość podaje się drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskórne, przezśluzówkowe i przeznosowe.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że modyfikowany aktywny fragment prosapozyny stanowi sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID NO: 2 zmodyfikowana w zakresie aminokwasów 16-29 sekwencji SEQ ID NO: 1 przez podstawienie D-alaniny lizyną w pozycji 2, alaniną lizyny w pozycji 8, i przez delecję lizyny w pozycji 11 oraz addycję reszty tyrozyny na C-końcu.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że neuropatyczny prosapozyno-wrażliwy ból jest charakteryzowany przez hyperalgezję.
  12. 12. Zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 do wytwarzania leku do leczenia prosapozyno-wrażliwego bólu neuropatycznego obwodowego układu nerwowego u osobnika cierpiącego z powodu tego bólu, przy czym ból odczuwany przez osobnika jest usuwany lub zmniejszany.
  13. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd stanowi sekwencja aminokwasowa SEQ ID NO: 2.
  14. 14. Zastosowanie peptydu zawierającego sekwencję aminokwasową TRiLIDNNATEEILY, w której R1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2) do wytwarzania leku do leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub mielinizacyjnych.
  15. 15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że choroby neurodegeneracyjne lub mielinizacyjne wybiera się z grupy obejmującej polineuropatię; mononeuropatię; nerwiaka; ucisk nerwu; uraz nerwu; kontuzje, guz lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego; zawał; guz lub uraz pnia mózgu, wgórza lub kory; ucisk, urwanie korzenia lub zapalenie zwoju korzenia tylnego; zespół po zapaleniu istoty szarej rdzenia; niedokrwienne uszkodzenie ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego i stwardnienie rozsiane.
  16. 16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że polineuropatię stanowi cukrzycowa neuropatia obwodowa.
    187 917
  17. 17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że polineuropatię stanowi obwodowa neuropatia wynikająca z chemioterapii.
  18. 18. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że choroba jest martwicą niedokrwienną w obwodowym lub ośrodkowym układzie nerwowym.
  19. 19. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że polipeptyd jest w postaci odpowiedniej do podawania drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskórne, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskóme, przezśluzówkowe i przeznosowe.
  20. 20. Peptyd zawierający sekwencję aminokwasową TRiLIDNNATEEILY, w której R1 oznacza D-Ala (SEQ ID NO: 2) do stosowania do leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub mielinizacyjnych.
  21. 21. Peptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że choroby neurodegeneracyjne i mielinizacyjne wybiera się z grupy obejmującej polineuropatię; mononeuropatię; nerwiaka; ucisk nerwu; uraz nerwu; kontuzje, guz lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego; zawał; guz lub uraz pnia mózgu, wgórza lub kory; ucisk, urwanie korzenia lub zapalenie zwoju korzenia tylnego; zespół po zapaleniu istoty szarej rdzenia; niedokrwienne uszkodzenie ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego i stwardnienie rozsiane.
  22. 22. Peptyd według zastrz. 21, znamienny tym, że polineuropatię stanowi cukrzycowa neuropatia obwodowa.
  23. 23. Peptyd według zastrz. 21, znamienny tym, że polineuropatię stanowi obwodowa neuropatia wynikająca z chemioterapii.
  24. 24. Peptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że choroba jest martwicą niedokrwienną w obwodowym lub ośrodkowym układzie nerwowym.
  25. 25. Peptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że peptyd jest w postaci odpowiedniej do podawania drogą wybraną z grupy obejmującej podawanie: dożylne, domięśniowe, śródskóme, podskórne, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzmózgowo-rdzeniowe, miejscowe, doustne, przezskórne, przezśluzówkowe i przeznosowe.
PL32870197A 1996-03-05 1997-03-05 Oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu, peptyd i jego zastosowanie PL187917B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/611,307 US6271196B1 (en) 1996-03-05 1996-03-05 Methods of alleviating neuropathic pain using prosaposin-derived peptides
PCT/US1997/004143 WO1997032895A1 (en) 1996-03-05 1997-03-05 Methods of alleviating neuropathic pain using prosaposin-derived peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL328701A1 PL328701A1 (en) 1999-02-15
PL187917B1 true PL187917B1 (pl) 2004-11-30

Family

ID=24448513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL32870197A PL187917B1 (pl) 1996-03-05 1997-03-05 Oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu, peptyd i jego zastosowanie

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6271196B1 (pl)
EP (1) EP0929569B1 (pl)
JP (1) JP4138006B2 (pl)
KR (1) KR100507715B1 (pl)
AT (1) ATE340187T1 (pl)
AU (1) AU734566B2 (pl)
CA (1) CA2248139C (pl)
CZ (1) CZ297384B6 (pl)
DE (1) DE69736712T2 (pl)
IL (1) IL126082A0 (pl)
NO (1) NO984093L (pl)
NZ (1) NZ331757A (pl)
PL (1) PL187917B1 (pl)
RU (2) RU2223969C2 (pl)
SK (1) SK122898A3 (pl)
WO (1) WO1997032895A1 (pl)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571787A (en) * 1993-07-30 1996-11-05 Myelos Corporation Prosaposin as a neurotrophic factor
US6849602B1 (en) * 1996-03-05 2005-02-01 The Regents Of The University Of California Compositions for alleviating neuropathic pain with prosaposin receptor agonists
AU4267297A (en) * 1997-09-11 1998-09-22 Regents Of The University Of California, The Method of alleviating neuropathic pain
WO1998039357A1 (en) * 1997-03-05 1998-09-11 The Regents Of The University Of California Method of alleviating neuropathic pain
EP0971956A2 (en) * 1997-03-24 2000-01-19 Myelos Corporation Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides
CA2304108A1 (en) * 1997-09-09 1999-03-18 The Regents Of The University Of California Inhibition of apoptotis using prosaposin receptor agonists
US6458357B1 (en) * 1997-09-09 2002-10-01 Myelos Corporation Retro-inverso neurotrophic and analgesic peptides
IL141586A0 (en) * 1998-08-28 2002-03-10 Myelos Corp Cyclic prosaposin-derived peptide and uses thereof
US20020028783A1 (en) * 1999-09-09 2002-03-07 O'brien John S. Method of stimulating prosaposin receptor activity
USRE45976E1 (en) * 1999-02-24 2016-04-19 Tact Ip, Llc Methods of inhibiting the action of TNF for neurological conditions by administering etanercept intrathecally
CA2367766A1 (en) * 1999-03-30 2000-10-05 Myelos Corporation Retro-inverso prosaposin-derived peptides and use thereof
US7410941B1 (en) 1999-04-13 2008-08-12 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Methods for treatment of neurodegenerative conditions by peripherally administered erythropoietin
US7345019B1 (en) 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
AU6540500A (en) * 1999-06-16 2001-01-02 Myelos Corporation Retro-inverso peptides derived from interleukin-6
IL147093A0 (en) * 1999-06-16 2002-08-14 Myelos Corp Retro-inverso peptides derived from interleukin-3
IL147095A0 (en) * 1999-06-16 2002-08-14 Myelos Corp Retro-inverso peptides derived from leukemia inhibitory factor
US7135461B1 (en) 2000-06-16 2006-11-14 Myelos Corporation Retro-inverso peptides derived from interleukin-6
US7109168B1 (en) 2000-06-16 2006-09-19 Myelos Corporation Retro-inverso peptides derived from leukemia inhibitory factor
US7420030B2 (en) * 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
US7452964B2 (en) * 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US20050074747A1 (en) * 2000-09-08 2005-04-07 Wadih Arap Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (brasil)
US20040170955A1 (en) * 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20060287240A1 (en) * 2001-03-09 2006-12-21 O'brien John S Method of stimulating prosaposin receptor activity
WO2003007979A1 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Board Of Regents, The University Of Texas System An anti-angiogenic state in mice and humans with retinal photorecptor cell degeneration
US20040048243A1 (en) * 2001-09-07 2004-03-11 Wadih Arap Methods and compositions for in vitro targeting
US8507445B2 (en) * 2001-09-07 2013-08-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer
US7671010B2 (en) * 2002-08-30 2010-03-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer
WO2004016167A1 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 The General Hospital Corporation Non-invasive functional imaging of peripheral nervous system activation in humans and animals
US7166691B2 (en) * 2002-12-20 2007-01-23 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Saposin C and receptors as targets for treatment of benign and malignant disorders
EP1605965B1 (en) * 2003-03-26 2012-12-26 DeveloGen Aktiengesellschaft Use of saposin-related proteins for preventing and treating obesity, diabetes and/or metabolic syndrome
AU2004226430A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 Acadia Pharmaceuticals Inc. Muscarinic M1 receptor agonists for pain management
US7834147B2 (en) * 2003-04-28 2010-11-16 Childrens Hospital Medical Center Saposin C-DOPS: a novel anti-tumor agent
CN100366286C (zh) * 2003-04-28 2008-02-06 常州南云科技有限公司 Saposin C-DOPS:一种抗癌新药
US9345745B2 (en) * 2005-04-29 2016-05-24 Bo Wang Methods for treating inflammatory disorders and traumatic brain injury using stabilized non-hematopoietic EPO short peptides
EP1736481A1 (en) * 2005-05-13 2006-12-27 Charite Universitätsmedizin-Berlin Erythropoietin variants
RU2317829C2 (ru) * 2005-10-05 2008-02-27 Федеральное государственное учреждение науки "Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ лечения мононевропатий верхних конечностей
US7964585B2 (en) * 2006-03-14 2011-06-21 Case Western Reserve University Composition and method of treating peripheral neuropathy
RU2345786C2 (ru) * 2007-02-27 2009-02-10 Андрей Евгеньевич Кульчиков Способ лечения непрерывно-прогредиентных дегенеративных и демиелинизирующих заболеваний
PL2245056T4 (pl) 2008-01-22 2016-01-29 Araim Pharmaceuticals Inc Peptydy i analogi peptydowe chroniące tkanki do zapobiegania i leczenia chorób i schorzeń związanych z uszkodzeniem tkanek
RU2561582C2 (ru) * 2010-11-19 2015-08-27 Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации Инъекционная лекарственная форма олигопептидного препарата для лечения рассеянного склероза и способ ее получения
JP5971729B2 (ja) * 2011-02-23 2016-08-17 北海道公立大学法人 札幌医科大学 疼痛を治療、改善、または予防するための組成物
RU2669692C1 (ru) * 2017-08-14 2018-10-15 Павел Андреевич Канаев Способ получения комплекса биологически активных пептидов обладающих нейротропной активностью
CN114642720A (zh) * 2018-03-23 2022-06-21 百祥制药公司 皂化蛋白c药物组合物和治疗癌症的方法
JP7374117B2 (ja) 2018-03-29 2023-11-06 ラテラル、アイピー、プロプライエタリー、リミテッド 環状ペプチドおよびその使用
CA3176637A1 (en) * 2021-01-09 2022-07-14 Bexion Pharmaceuticals Inc. Methods of reducing neuropathy and neuropathic symptoms and treating cancer

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3750197D1 (de) 1986-04-22 1994-08-18 Salk Inst For Biological Studi Antagonisten des Fibroblasten-Wachstumsfaktors.
DD298412A5 (de) * 1989-04-28 1992-02-20 ������@���Kk�� Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele
US5169764A (en) * 1990-08-08 1992-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras
US5187151A (en) * 1991-02-12 1993-02-16 Genentech, Inc. Use of binding protein with igf-i as an anabolic growth promoting agent
RU2007417C1 (ru) * 1991-06-21 1994-02-15 Российский государственный медицинский университет Способ получения плацентарного протеина
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US5534495A (en) * 1993-05-25 1996-07-09 Advanced Peptides And Biotechnology Sciences Treatment of non-HIV neuropathic pain syndromes
US5700909A (en) * 1993-07-30 1997-12-23 The Regents Of The University Of California Prosaposin and cytokine-derived peptides
US5571787A (en) 1993-07-30 1996-11-05 Myelos Corporation Prosaposin as a neurotrophic factor
AU693489B2 (en) * 1993-11-15 1998-07-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method of treating neurological disorders
WO1998039357A1 (en) * 1997-03-05 1998-09-11 The Regents Of The University Of California Method of alleviating neuropathic pain
EP0971956A2 (en) * 1997-03-24 2000-01-19 Myelos Corporation Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides

Also Published As

Publication number Publication date
IL126082A0 (en) 1999-05-09
CA2248139A1 (en) 1997-09-12
KR19990087686A (ko) 1999-12-27
NZ331757A (en) 1999-10-28
EP0929569B1 (en) 2006-09-20
NO984093D0 (no) 1998-09-04
DE69736712T2 (de) 2007-09-13
JP2000506853A (ja) 2000-06-06
PL328701A1 (en) 1999-02-15
SK122898A3 (en) 2000-02-14
RU2223969C2 (ru) 2004-02-20
ATE340187T1 (de) 2006-10-15
DE69736712D1 (de) 2006-11-02
CA2248139C (en) 2004-05-18
CZ297384B6 (cs) 2006-11-15
AU2328697A (en) 1997-09-22
US6271196B1 (en) 2001-08-07
US6268347B1 (en) 2001-07-31
CZ283998A3 (cs) 1999-05-12
KR100507715B1 (ko) 2006-05-26
RU2266129C2 (ru) 2005-12-20
AU734566B2 (en) 2001-06-14
EP0929569A4 (en) 2000-08-23
EP0929569A1 (en) 1999-07-21
JP4138006B2 (ja) 2008-08-20
RU2003131695A (ru) 2005-04-10
WO1997032895A1 (en) 1997-09-12
NO984093L (no) 1998-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL187917B1 (pl) Oczyszczony lub izolowany polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny, zastosowanie skutecznej ilości polipeptydu, peptyd i jego zastosowanie
AU751034B2 (en) Cyclic prosaposin-derived peptides and uses thereof
US5741778A (en) Method for treating Huntington's disease using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
WO2008069876A2 (en) Amidated dopamine neuron stimulating peptides for cns dopaminergic upregulation
US6849602B1 (en) Compositions for alleviating neuropathic pain with prosaposin receptor agonists
CA2282827A1 (en) Method of alleviating neuropathic pain
CA2300221A1 (en) Retro-inverso neurotrophic and analgesic peptides
AU2002300005B2 (en) Method of alleviating neuropathic pain
WO1993009798A1 (en) Therapeutic and diagnostic methods based on tissue specific nt-3 expression and receptor binding
WO1998042746A2 (en) Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides
AU4267297A (en) Method of alleviating neuropathic pain
WO1998042746A9 (en) Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides
MXPA98007245A (en) Methods to alleviate neuropathic pain using peptides derived from prosapos
CN1224430A (zh) 利用prosaposin衍生多肽缓解神经性疼痛的方法
MXPA01001966A (en) Cyclic prosaposin-derived peptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080305