CZ297384B6 - Aktivní fragment prosaposinu a farmaceutický prípravek jej obsahující - Google Patents

Abstract

Resení se týká aktivního fragmentu prosaposinu majícího od 14 do 50 aminokyselin a obsahujícího sekvenci znázornenou v SEQ ID NO: 2 a farmaceutickéhoprípravku pro terapii nervových nebo demyelinizacních chorob v nervové tkáni a pro zmírnení nebo prevenci neuropatické bolesti obsahujícího aktivní fragment prosaposinu.

Description

Aktivní fragment prosaposinu a farmaceutický přípravek jej obsahující

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká oblasti léčby bolesti a přesněji peptidů odvozených od prosaposinu a farmaceutického přípravku s jejich obsahem.

Dosavadní stav techniky

Neuropatická bolest vzniká v důsledku poškození nervu. Oproti okamžité bolesti vzniklé v důsledku poškození tkáně může ke vzniku neuropatické bolesti dojít za dva až měsíce po traumatickém poškození. Dále, zatímco bolest způsobená tkáňovým poškozením je obvykle omezena na dobu reparace tkáně, je neuropatická bolest často dlouhodobá nebo chronická. Kromě toho, neuropatická bolest se může vyskytnout spontánně nebo v důsledku stimulace, která není normálně bolestivá.

Klinických příčin neuropatické bolesti je mnoho a zahrnují jak traumata, tak nemoci. Například, traumatická komprese nervu nebo rozdrcení nervu a traumatické poranění mozku jsou častými příčinami neuropatické bolesti. Kromě toho, většina traumatických poškození nervu také způsobuje tvorbu neuronů, u kterých vzniká bolest v důsledku aberantní nervové regenerace. Kromě toho, s nádory související neuropatická bolest je způsobena tehdy, pokud rostoucí nádor bolestivě stlačuje okolní nervy, mozek nebo míchu. Neuropatická bolest je také spojena s nemocemi jako je diabetes mellitus nebo alkoholismus.

Naneštěstí je neuropatická bolest často rezistentní na dostupnou medikamentózní léčbu. Kromě toho, současné léčby bolesti mají závažné nežádoucí účinky, včetně, například, kognitivních změn, sedace, nausey a, v případě narkotických léčiv, návyku. Mnoho pacientů trpících neuropatickou bolestí je vysokého věku nebo má jiné zdravotní komplikace, které významně limitují jejich toleranci k vedlejším účinkům spojených s terapií. Inadekvátnost současné terapie zmírnění neuropatické bolesti bez produkce netolerovatelných vedlejších účinků se často modifikuje depresí a sebevražednými sklony pacientů trpících chronickou bolestí.

Farmaceutické přípravky pro zmínění neuropatické bolesti by měly zlepšit kvalitu života mnoha pacientů trpících bolestí způsobenou traumatem nebo nemocí. Nicméně, v současnosti neexistují účinné léky, které by mírnily neuropatickou bolest bez nežádoucích vedlejších účinků jako je sedace a návyk. Proto existuje potřeba farmaceutických přípravků pro zmírnění neuropatické bolesti bez produkce nežádoucích vedlejších účinků. Předkládaný vynález uspokojuje tuto potřebu a zároveň poskytuje s ní související výhody.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje aktivní fragment prosaposinu mající od 14 do 50 aminokyselin a obsahující aminokyselinovou sekvenci Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-LeuIle-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) nebo Thr-D-Ala-Leu-IleAsp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ue-Leu-Tyr (SEQ ID NO: 2).

Vynález dále poskytuje farmaceutický přípravek pro terapii nervových nebo demyelinizačních chorob v nervové tkáni, kteiý obsahuje aktivní fragment prosaposinu ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Farmaceutický přípravek je např. užitečný pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové podáváním účinného množství aktivního fragmentu proposinu, který má aminokyselinovou sekvenci Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-AspAsn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-lle-Leu (SEQ ID NO: 1) nebo Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp

-1 CZ 297384 B6

Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr (SEQ ID NO: 2). Kromě toho, vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci neuropatické bolesti, obsahující účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek obsahující aktivní fragment prosaposinu, který stimuluje růst neuritů, inhibuje smrt nervových buněk, podporuje myelinizaci a inhibuje demyelinizaci.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje práh taktilní alodynie před (čas 0) a různou dobu po bolusové injekci 22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) v Chungově krysím modelu.

Obrázek 2 ukazuje práh taktilní alodynie před (čas 0) a různou dobu po bolusové injekci 14-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) v Chungově krysím modelu.

Obrázek 3 ukazuje součet záškubů v odpovědi na formalin po intraperitoneálním podání 14—mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) nebo salinického roztoku u diabetických krys.

Předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek pro zmírnění neuropatické bolesti, obsahující účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Jak je zde popsáno, farmaceutický přípravek podle vynálezu může zmírnit neuropatickou bolest během 30 minut po podání. Takový farmaceutický přípravek je vhodný pro zmírnění neuropatické bolesti vznikající v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové.

Peptid použitelný v předkládaném vynálezu je odvozen od prosaposinu, což je protein o 517 aminokyselinách, který byl původně identifikován jako prekurzor čtyř sfingolipidových aktivátorových proteinů (Kishimoto et al., J. Lipid Res. 33: 1255 - 1267 (1992)). Čtyři sousedící tandemové domény prosaposinu jsou proteolyticky zpracovávány v lypozomech za vzniku saponinů A, B, C a D, které aktivují hydrolýzu glykosfingolipidů lysozomálních hydrolýzami (O'Brien and Kishimoto, FASEB J., 5: 301 - 308 (1991)).

Nezpracovaná forma prosaposinu je navázána ve vysokých koncentracích v mozku lidí a krys, kde je lokalizována v povrchových membránách neuronů. Během embryonálního vývoje je prosaposinová mRNA hojně nacházena v mozku a v gangliích zadních kořenů míšních. Dále, prosaposin se váže s vysokou afinitou na gangliosidy a podporuje přenos gangliosidů z micel do membrán.

Neurotrofická aktivita prosaposinu je v souladu s jeho lokalizací na populaci neuronálních buněk (O'Brien et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 9593 - 9596 (1994); Sáno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 994 - 1000 (1994)). Prosaposinu stimuluje růst motorických neuritů in viro a in vivo a zvyšuje aktivitu acetyltransferázy, která je markérem neuronální diferenciace. Kromě toho, prosaposin zabraňuje buněčné smrti u neuroblastomových buněk (O'Brien et al., výše, 1994; O'Brien et al., FASEB J., 9: 681 - 685 (1991)).

Neurotrofická aktivita prosaposinu je lokalizována na saponinů C, doméně o 80 aminokyselinách. 22-mer peptid odpovídající aminokyselinám 8 až 29 doméně saponinů C (SEQ ID NO: 1) stimuluje růst neuritů a zvyšuje aktivitu acetyltransferázy a zabraňuje buněčné smrti u neuroblastomových buněk (O'Briet et al., výše, 1995).

Prosaposin nebo 22-met peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 1), například, může modulovat funkci motorických neuronů podporou růst neuritů. Před předkládaným vynálezem nebylo nicméně známo, zda prosaposin nebo peptidové fragmenty prosaposinu mohou ovlivňovat funkci senzorických neuronů. Kromě toho, neurotrofická aktivita prosaposinu nebo peptidů odvozeného od prosaposinu ve stimulaci růstu motorických neuritů je zřetelná pouze po době 24 až

-2CZ 297384 B6 hodin (viz například O'Brien et al., výše, 1994). Neurotrofická aktivita prosaposinu nebo peptidů odvozeného od prosaposinu nebyla prokázána během kratšího časového období.

Oproti tomu poskytuje předkládaný vynález farmaceutický přípravek pro zmírnění neuropatické bolesti, která obsahuje jak senzorickou, tak motorickou složku. Kromě toho je farmaceutický přípravek podle vynálezu účinný při mírnění neuropatické bolesti v řádu minut, spíše než hodin nebo dní, jak to bylo dříve prokázáno jak nutné pro neurotrofickou aktivitu prosaposinu nebo peptidů odvozeného od prosaposinu.

Účinnost farmaceutického přípravku podle vynálezu při mírnění neuropatické bolesti byla prokázána na dobře známém Chungově krysím modelu periferní neuropatie. V Chungově krysím modelu způsobuje částečná ligace levých spinálních nervů L5 a L6 dlouhodobou hypersenzitivitu na lehký tlak na postiženou levou tlapku. Hypersenzitivita je podobná bolesti u lidí s neuropatickým stavem kausalgie, jak to popisuje Kim and Chung, Pain 50: 355 - 363 (1992).

Před podáním aktivního fragmentu prosaposinu měly krysy Chung modelu práh 3,0 až 4,0 g před ucuknutím postižené tlapky v odpovědi na tlak (Von Freyovi vlásky) (viz obrázek 1). Po podání aktivního fragmentu prosaposinu (22-mer peptidů odvozeného od propsaposinu; SEQ ID NO: 1) se neuropatická bolest zmírní, jak je prokázáno vyšší tolerancí na tlak, před ucuknutím postižené tlapky. Účinek aktivního fragmentu prosaposinu se dostavil během 15 minut a trval po dobu 3 hodin, jak je ukázáno na obrázku 1. Toto rychlé zmírnění neuropatické bolesti prudce kontrastuje s oddálenými neurotrofíckými účinky, které byly dříve popsány pro propsaposin a peptid odvozený od prosaposinu.

Aktivní fragment prosaposinu jako je peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 také mírní bolest v krysím modelu bolestivé diabetické neuropatie. Jak je popsáno v příkladu 3, peptid SEQ ID NO: 2 redukoval aludynii u krys s krátkodobým inzulin-deficientním diabetem indukovaným toxinem selektivním pro β-buňky, streptazotocinem. Proto může být aktivní fragment prosaposinu nebo peptid odvozený od prosaposinu podle předkládaného vynálezu použit ke zmírnění mnoha typů neuropatické bolesti, včetně mechanické bolesti, jak je doloženo Chung krysím modelem, a metabolické bolesti, jak je doloženo použitím těchto peptidů při redukci bolesti u krys s diabetem.

Jak je zde použito, znamená termín „neuropatická bolest“ bolest vzniklou v důsledku poškození nervu. Neuropatická bolest se liší od nociceptivní bolesti, která je způsobena akutním poškozením tkáně postihujícím drobné kožní nervy nebo drobné svalové nervy nebo nervy pojivové tkáně. Bolest způsobená nociceptivními mechanismy je obvykle omezená na dobu reparace tkáně a obyčejně ji lze mírnit dostupnými analgetickými činidly nebo opiáty, jak je to popsáno v Myers, Regional Anesthesia 20: 173 - 1984, (1995).

Neuropatická bolest je typicky dlouhodobá nebo chronická a často vzniká dny nebo měsíce po počátečním akutním poranění tkáně. Neuropatická bolest může zahrnovat perzistentní, spontánní bolest, stejně jako alodynie, což je bolestivá reakce na stimuly, které normálně nejsou bolestivé. Neuropatická bolest může být také charakterizována hyperalgesií, při které existuje akcentovaná reakce na bolestivé stimuly, které jsou obvykle triviální, jako je například píchnutí špendlíkem. Oproti nociceptivní bolesti je neuropatická bolest obvykle rezistentní na terapii opiáty (Myers, výše, 1995).

Farmaceutický přípravek podle vynálezu je použitelný pro zmírnění neuropatické bolesti vznikající v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové. Termín „onemocnění“, jak je zde použit, znamená jakékoliv trauma, poranění, onemocnění nebo stav vedoucí ke vzniku neuropatické bolesti.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu je použitelný pro zmírnění neuropatické bolesti bez ohledu na etiologii bolesti. Například, farmaceutický přípravek podle vynálezu může být použit

-3CZ 297384 B6 pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku onemocnění periferního nervu jako je neurom; komprese nervu; rozdrcení nervů; natažení nervu nebo inkompletního naříznutí nervu; mononeuropatie nebo polyneutropatie. Farmaceutický přípravek podle vynálezu může být použit pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku onemocnění jako je komprese ganglií zadních kořenů míšních; zánět míchy; kontuze, nádor nebo hemisekce míchy; nádor mozkového kmene, thalamu nebo mozkové kůry; nebo trauma mozkového kmene, thalamu nebo mozkové kůry (viz například tabulka 1).

Farmaceutický přípravek podle vynálezu může být použit, například pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku neuronu, který může snadno vzniknout po traumatickém poškození nervu, zejména pokud je celý nerv vážně rozdrcen nebo přerušen. Při neuromu je růst neuritu, který normálně regeneruje periferní nerv, aberantní nebo chybný díky, například, fyzikální obstrukci jako je jizevnatá tkáň. Tak je regenerující nervové vlákno umístěno v prostředí, ve kterém mechanické a fyzikální faktory způsobují abnormální elektrofýziologickou aktivitu a bolest (Myers, výše, 1995). Amputaění neurom, například, může způsobovat fantomovou bolest nebo může způsobovat bolest spouštěnou použitím končetinových protéz. Jak je zde popsáno, taková bolest může být zmírněna podáním farmaceutického přípravku obsahujícího aktivní fragment prosaposinu, což je provedení podle vynálezu.

Tabulka 1

Nerv

Neurom (amputace, přerušení nervu)

Komprese nervu (svodné neuropatie, nádory)

Rozdrcení nervu, natažení nervu nebo neúplné přerušení nervu (trauma) Mononeuropatie

Diabetes mellitus

Ozáření

Ischemie

Vasculitis

Polyneuropatie

Post-poliotický syndrom

Diabetes mellitus

Alkohol

Amyloid

Toxické

HIV

Hypotyreóza

Uremie

Defícience vitaminů

Chemoterapie (Vincristin, cis-platina, paclitaxel) ddC (zelcitabin) ________Fabryho nemoc___________________________________________

Ganglia zadních kořenů míšních

Komprese (ploténka, nádor, jizevnatá tkáň) Odtržení kořene-+

Zánět (postherpetická neuralgie)______________________________________

Mícha

Kontuze

Nádor

Hemisekce___________________________________________________

Mozkový kmen, thalamus, mozková kůra

Infarkt, nádory, trauma

-4CZ 297384 B6

Komprese nervu také vede ke vzniku neuropatické bolesti, která může být léčena farmaceutickým přípravkem podle vynálezu. Komprese nervu může být náhlá, jako je tomu v případě traumatického nervového rozdrcení, nebo může být dlouhodobá a mírná, jak je tomu sekundárně při růstu nádoru nebo při tvorbě jizvy v blízkosti hlavního nervového svazku. Kompresní neuropatie může také vzniknout v důsledku změn v průtoku krve nervem, což způsobí závažnou ischemii a následné poškození nervu (Myers, výše, 1995).

Podání farmaceutického přípravku obsahujícího aktivní fragment prosaposinu může také zmírnit neuropatickou bolest vznikající v důsledku mononeuropatie nebo polyneuropatie. Jak je zde použito, neuropatie znamená funkční poruchu nebo patologickou změnu v periferním nervovém systému a klinicky je charakterizována abnormalitami senzorických a motorických neuronů. Termín mononeuropatie naznačuje, že postižen je jediný periferní nerv, zatímco termín polyneuropatie naznačuje, že postiženo je více periferních nervů,

Etiologie neuropatie může být známá nebo neznámá (viz například Myers, výše, 1995; Galér, Neurology 45 (suppl 9): S17 - S25 (1995); Stevens and Lowe, Pathology, Timer Mirror Intemational Publishers Limited, London (1995)). Známé etiologie zahrnují komplikace onemocnění nebo toxických stavů; například, diabetes je nejčastějším metabolickým onemocněním, které způsobuje neuropatii. Farmaceutický přípravek podle vynálezu mírňuje neuropatickou bolest u mononeuropatie vznikající v důsledku například, diabetů, ozáření, ischemie nebo vaskulitidy. Farmaceutický přípravek pode vynálezu zmírňuje neuropatickou bolest u polyneuropatie vznikající v důsledku například, post-poliotického syndromu, diabetů, alkoholismu, amyloidu, toxinů, HIV, hypotyreózy, uremie, deficitů vitaminů, chemoterapie, ddC nebo Fabryho nemoci (viz tabulka 1). Farmaceutický přípravek podle vynálezu je zejména výhodný pro zmírnění postpoliotické myalgie. Farmaceutický přípravek podle vynálezu může také zmírnit neuropatickou bolest neznámé etiologie.

Jak je zde popsáno, aktivní fragment prosaposinu může také být použit pro zmírnění neuropatické bolesti nebo pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici demyelinizace nebo pro inhibici senzorické neuropatie. Termín „aktivní fragment prosaposinu“, jak je zde použito, znamená, že peptid má aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci prosaposinu a že má aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo při stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporuje myelinizaci a inhibici nervové demyelinizace nebo při inhibici senzorické nebo motorické neuropatie.

Jak je zde uvedeno, zmírnění neuropatické bolesti znamená redukci závažnosti neuropatické bolesti. U lidských subjektů redukuje aktivní fragment prosaposinu závažnost neuropatické bolesti, takže je utrpení subjektu zmenšeno a je zlepšena kvalita života. Aktivní fragment prosaposinu může také zmírňovat neuropatickou bolest v jakémkoliv z mnoha zvířecích modelů neuropatické bolesti, jak jsou popsány dále (viz též Bennet, Muscle and Nerve 16: 1040 - 1048 (1993)). Jak je zde použito, termín „aktivní fragment prosaposinu“ je synonymem pro „peptid odvozený od prosaposinu“.

Aktivní fragment prosaposinu výhodně obsahuje aminokyselinovou sekvenci Leu-Ile-Asp-AsnAsn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 3), která odpovídá aminokyselinám 18 až 29 saponinu C. Výhodněji, aktivní fragment prosaposinu obsahuje aminokyselinovou sekvenci Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-LysGlu-Ile-ILeu (SEQ ID NO: 1), která odpovídá aminokyselinám 8 až 29 saponinu C nebo aminokyselinovou sekvenci Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr (SEQ ID NO: 2), která odpovídá aminokyselinám 16 až 29 saponinu C, ale která byla modifikována D-alaninovou substitucí lysinu v pozici 2; substitucí lysinu alaninem v pozici 8; delecí lysinu v pozici 11 a adicí C-koncového tyrosinu (viz tabulka 2). Takové modifikace mohou být výhodné pro zlepšení stability peptidu nebo pro únik přes hemotoencefalickou bariéru, jak je popsáno dále. Jak je zde použito, D-alanin je reprezentován D-Ala nebo X.

-5CZ 297384 B6

Aktivní fragment prosaposinu může mít okolo 12 aminokyselin až okolo 80 aminokyselin, což je kompletní saponin C. Výhodně má aktivní fragment prosaposinu od asi 12 aminokyselin do asi aminokyselin, a ještě lépe od asi 14 aminokyselin do asi 22 aminokyselin.

Tabulka 2

Peptid Sekvence SEQ ID NO;

22-mer odvozený od prosaposinu CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL1

14-mer odvozený od prosaposinu TXLIDNNATEEILY2

12-mer odvozený od·prosaposinu LIDNNKTEKEIL3 kde X = D-alanin

Pro použití při zmírnění neuropatické bolesti u lidí je výhodné použití aktivního fragmentu lidského prosaposinu, jako je SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2. Nicméně, aktivní fragment ío odvozený od jiného savčího prosaposinu je také použitelný ve zmírnění neuropatické bolesti podle předkládaného vynálezu. Tak, například, aktivní fragment myšího prosaposinu, krysího prosaposinu, prosaposinu od morčat nebo hovězího prosaposinu jak jsou SEQ ID NO: 4 a 7, může být také použit pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu.

Aminokyselinová sekvence aktivního fragmentu lidského prosaposinu (SEQ ID NO: 1), která odpovídá aminokyselinám 8-29 saponinu C, je dobře konzervována mezi jinými druhy, jak je ukázána v tabulce 3. Konkrétně, sousedící asparaginové (N) zbytky jsou konzervovány mezi lidským, myším, krysím, morčecím a hovězím prosaposinem. Kromě toho, leucinový (L) zbytek je konzervován v pozici 3 až 4 zbytky směrem k N-konci od dvou asparaginových zbytků a jeden 20 neb více zbytků s nábojem (kyselina asparagová (D), lysin (K), kyselina glutamová (E) nebo arginin (R)) je konzervováno v pozici 2 až 8 zbytků směrem k C-konci od dvou asparaginových

zbytků. Každý z těchto dobře konzervovaných zbytků je v tabulce 3 podtržen. Tabulka 3
Druh	Sekvence	SEQ	ID	NO:
Člověk	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	SEQ	ID	NO:	1
Myš	COFVMNKFSELIVNNATEELLY	SEQ	ID	NO:	4
Krysa	CÓLVNRKLSELIINNATEELL-	SEQ	ID	NO:	5
Morče	CEYWKKVMLLIDNNRTEEKII	SEQ	ID	NO:	6
Kráva	CEFWKEVAKLIDNNRTEEEIL	SEQ	ID	NO:	7

Dobře konzervovaná sousedící asparaginové zbytky, leucinové zbytky a zbytky s nábojem popsané výše mohou být důležité pro aktivitu aktivního fragmentu prosaposinu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo při stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podpoře 30 myelinizace nebo inhibici demyelinizaci nebo při inhibici senzorické nebo motorické neuropatie.

Například, 22-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) nebo 14-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) je aktivní fragment prosaposinu, který redukuje bolestivou alodynii pozorovanou na Chungově krysím modelu periferní neuropatie, jak je to popsáno v příkladu 1 (viz obrázky 1 a 2). Naopak, mutantní 22-mer (SEQ ID NO: 8), který se odlišuje od SEQ ID

-6CZ 297384 B6

NO 1 a v tom, že má zbytek kyseliny asparagové (D) místo prvního konzervovaného asparaginu (viz tabulka 4), nemá aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti jak je testováno za použití

Chungovy krys (viz příklad 1).

Tabulka 4

Peptid	Sekvence SEQ	ID NO:
22-mer odvozený od prosaposinu	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	1
mutantní 22-mer	CEFLVKEVTKLIDDNKTEKEIL	8
14-mer odvozený od prosaposinu	TXLIDNNATEEILY	2
mutantní 14-mer M-l	TKLIDNDKTEKEIL	9
mutantní 14-mer M-2	TKSIDNNKTEKEIL	10
kde X = D-alanin

Aktivita peptidu ve zmírnění neuropatické bolesti může také korelovat s neurotrofickou aktivitou, například, 22-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) a 14-mer odvozený od prosaposinu (SEQ Dl NO: 2) zmírňují neuropatickou bolest a mají neurotrofíckou aktivitu. Kromě toho, mutantní 22-mer (SEQ ID NO: 8) je inaktivní ve zmírnění neuropatické bolesti jak je popsáno výše a nemá neurotrofíckou aktivitu, což dále naznačuje, že aktivita v mírnění neuropatické bolesti koreluje s neurotrofíckou aktivitou. Mutantní 14-mer peptid M-l (SEQ ID NO: 9), který má substituci druhého konzervovaného asparaginového zbytku, nemá neurotrofíckou aktivitu, což naznačuje, že peptid SEQ ID NO: 9 je také inaktivní v mírnění neuropatické bolesti. Mutantní 14-mer peptid M-21 (SEQ ID NO: 10), který má substituci druhého konzervovaného leucinového zbytku, nemá neurotickou aktivitu, což naznačuje, že peptid SEQ ID NO: 10 je také inaktivní v mírnění neuropatické bolesti. Oproti tomu, 12-mer peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 3), který má konzervované sousedící asparaginu, leucin a zbytky s nábojem, jak je popsáno výše, je aktivní jako neurotrofický faktor. Proto bude 12-mer peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 3) také mírnit neuropatickou bolest.

Peptidy odvozené do prosaposinu a jejich neurotrofické analogy, mají významné terapeutické aplikace v podpoře znovunabytí funkce po toxickém, traumatickém, ischemickém, degenerativní nebo dědičném poškození periferního nebo centrálního nervového systému. Kromě toho, tyto peptidy mohou podporovat myelinizaci nebo inhibovat demyelinizaci, což způsobí proti demyelinizačním onemocněním. Ještě dále, také peptidy stimulují růst neuronů a inhibují programovatelnou buněčnou smrt v neuronální tkáni. Aktivní neurotrofické a myelotrofické peptidy podle předkládaného vynálezu mají od 12 nebo 14 do asi 50 aminokyselin a výhodně obsahují nepřirozenou sekvenci prosaposinu ukázanou v SEQ ID NO: 2. Například, aktivní neurotrofické a myelotrofické peptidy podle předkládaného vynálezu mají od 14 do asi 50 aminokyselin a obsahují nepřirozenou sekvenci prosaposinu ukázanou v SEQ ID NO: 2.

V jiném provedení předkládaného vynálezu je poskytnout farmaceutický přípravek pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti neuronů, navození myelinizace nebo inhibici demyelinizace v diferencovaných nebo nediferencovaných neuronech, přičemž je přípravek podán neuronům v účinném množství peptidu podporujícího růst neuritů nebo myalinizaci, který má od 12 do 50 aminokyselin a výhodně obsahuje peptid ukázaný v SEQ ID NO: 2. Ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti neuronů, navození myelinizace nebo inhibici demyelinizace může být použito účinné množství peptidu, který má např. od 14 do 50 aminokyselin a obsahuje peptid ukázaný v SEQ ID NO: 2.

-7CZ 297384 B6

Schopnost jakéhokoliv peptidu stimulovat růst neuritů, inhibovat smrt neuronů navodit myelinizaci nebo inhibici demyalinizace, může být odborníkům v oboru snadno určena za použití postupů popsaných v příkladu 4 a 7. Způsoby pro testování schopnosti takových peptidů navozovat myelinizaci nebo inhibovat demyelinizaci jsou uvedeny v příkladech 6 a 7, dále.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro inhibici senzorické neuropatie kontaktováním neuronů s farmaceutickým přípravkem obsahujícím účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Vynález poskytuje například farmaceutický přípravek pro inhibici senzorické neuropatie kontaktováním neuronů farmaceutickým přípravkem obsahujícím účinné množství peptidu majícího sekvenci podle SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2.

Jak je popsáno v příkladu 10, peptidy odvozené od prosaposinu mohou být užitečné v inhibici senzorické neuropatie. V myším modelu, ve kterém je senzorická neuropatie indukována podáním taxolu, je běžně pozorována ztráta citlivosti na teplo. Nicméně, pokud dostaly taxolem léčené myši 100 Tg/kg peptidu podle SEQ ID NO: 1, tak byla ztráta tepelné citlivosti inhibována. Tyto výsledky naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu mohou působit jako neurotrofický faktor jak pro senzorické, tak pro motorické neurony.

Peptidy použitelné ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu mohou být také, například, SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 (viz tabulka 5). Například, seřazení sekvence 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu se SEQ ID NO: 1 s cytokiny a růstovými faktory naznačuje, že existuje podobnost sekvence s mnoha lidskými (h) cytokiny včetně hCNTF, hIL-6, h-IL2, hIL-3, hIL-1-τ, erytropoetinu (hEPO), lidského leukocytámího inhibičního faktoru (hLIF), D-řetězce lidského IL-1 a onkostatinu-m (hONC-M). SEQ ID NO: 11 až 19, podobně jako aktivní fragment prosaposinu se SEQ ID NO: 1, obsahují dva asparaginové zbytky, kterou sousedí, nebo které jsou separovány jednou aminokyselinou. Kromě toho, od cytokinů odvozené peptidové sekvence mohou obsahovat leucin (L) nebo izoleucin (1) tři až čtyři zbytky směrem k N-konci od dvou asparaginů a jeden nebo více zbytků s nábojem (kyselin asparagová (D), lysin (K), kyselina glutamová (E) nebo erginin (R)) dva až osm zbytků směrem k C-konci od dvou asparaginů, stejně jako v aktivním fragmentu prosaposinu (22-mer; SEQ ID NO: 1). Každý z těchto zbytků je v tabulce 5 podtržen.

Modely vazby cytokinů na receptor (Sprang and Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 816 (1993)) mají zvýrazněnou evoluční konzervaci 4-šroubovicové struktury společné pro mnoho cytokinů. Každá sekvence cytokinů nebo růstového faktoru příbuzná sekvenci SEQ ID NO: 1 odvozené od prosaposinu je umístěna mezi šroubovicí A a B (AB smyčka) nebo v šroubovici C cytokinů.

Tabulka 5

Cytokin	Sekvence	Umístění	SEQ ID NO:
Prosaposin	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL		1
hCNTF	YVKHQGLNKNINLpSVDGVP	AB smyčka	11
hIL-6	EALAENNLNLPKMAG	AB smyčka	12
hIL-2	LQMILNGINNYKNPKLT	AB smyčka	13
hIL-3	ILMENNLRRPNL	AB smyčka	14
hIL-lT	FYLRNNQLVAGTL	AB smyčka	15
hEPO	AEHCSLNENITVPDTKV	AB smyčka	16
hLIF	YTAQGEPFPNNVEKLCAP	AB smyčka	17
hIL-lĎ	FNKIEINNKLEFESA	Šroubovíce	C 18
hONC-M	RPNIGLRNNIYCMAQLL	Šroubovice	C 19

-8CZ 297384 B6

Strukturálně příbuzné cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být také užitečné ve farmaceutických přípravcích pro zmírnění neuropatické bolesti. Peptidy podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být testovány na aktivitu při mírnění neuropatické bolesti, za použití, například, Chung krysího modelu popsaného v příkladu 1; modelu diabetické neuropatie popsaného v příkladu 3; testů popsaných Wall et al., pain 7: 103- 113 (1979); Bennetr and Xie, Pain 33: 87- 107 (1988); Lekán et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18: 287 (1992) nebo Palacek et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18: 287 (1992); nebo jiných testů pro neuropatickou bolest.

Cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být také užitečné ve farmaceutických přípravcích pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici nervové demyelinizace nebo ve farmaceutických přípravcích pro inhibici senzorické nebo motorické neuropatie. Peptid mající od asi 14 do asi 50 aminokyselin a obsahující aktivní neurotrofický region obsažený v jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 může být testován na svou schopnost stimulovat růst neuritů jak je popsáno v příkladu 4; inhibovat smrt nervových buněk, jak je popsáno v příkladu 5; podporovat myelinizaci jak je popsáno v příkladu 6; nebo inhibovat demyelinizaci jakje popsáno v příkladu 7; nebo může být testován na svou schopnost inhibovat senzorickou neuropatii jakje popsáno v příkladu 10.

Aktivní fragment prosaposinu nebo peptidu použitelného ve zmírnění neuropatické bolesti může být identifikován vyšetřováním velkého souboru, nebo knihovny, náhodných peptidů nebo určitých peptidů za použití, například, jednoho z mnoha zvířecích modelů neuropatické bolesti. Takové určité peptidy mohou být, například, cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů, jejichž aminokyselinová sekvence je příbuzná sekvenci aktivního fragmentu prosaposinu (SEQ ID NO: 1). Určitými peptidy může být, například, populace peptidů, které mají příbuznou aminokyselinovou sekvenci k SEQ ID NO: 1, takže mají konzervované asparaginové zbytky, leucinové/izoleucinové zbytky a jeden nebo více zbytků s nábojem v pozicích odpovídajících pozicím, ve kterých se tyto zbytky nacházejí v SEQ ID NO: 1, ale které mají také jednu nebo více aminokyselin, které se liší od aminokyselin v SEQ ID NO: 1.

Peptidové knihovny zahrnují, například, značené chemické knihovny obsahující peptidy a peptidomimetické molekuly. Peptidové knihovny také zahrnují ty, které jsou generovány fágovou zobrazovací technologií. Fágová zobrazovací technologie obsahuje expresi peptidových molekul na povrchu fágu, stejně jako jiné postupy, pomocí kterých je nebo může být proteinový ligand asociován s nukleovou kyselinou, která ho kóduje. Metody pro produkci fágových zobrazovacích knihoven, včetně vektorů a způsobů pro rozlišení populace peptidů, které jsou exprimovány, jsou v oboru dobře známé (viz, například, Smith and Scott, Methods Enzymol. 217: 228 - 257, (1993), Scott and Smith, Science 249: 386 - 390 (1990); a Huse WO 91/07141 a WO 91/07149). Tyto nebo jiné dobře známé metody mohou být použity pro produkci fágových zobrazovacích knihoven, ze kterých mohou být zobrazené peptidy štěpeny a mohou být testovány na aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo na další neurotrofícké nebo myelinotrofícké aktivity, jak je zde popsáno. Pokud je to žádoucí, může být populace peptidů testována na aktivitu a aktivní populace může být dále rozdělena a znovu testována pro izolaci aktivního peptidu z populace. Další metody pro produkci peptidů, které je možné použít v předkládaném vynálezu, zahrnují, například, racionální vývoj a mutagenezi založenou na aminokyselinové sekvenci aktivních fragmentů prosaposinu jako je SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, například.

Jak je zde popsáno, aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při zmírnění neuropatické bolesti může být identifikován podle své aktivity při mírnění neuropatické bolesti u mnoha zavedených zvířecích modelů neuropatické bolesti (Bennett, výše 1993). Například, aktivní fragment prosaposinu může být identifikován za použití experimentálního modelu periferní neuropatie produkované segmentální ligací míšního nervu u kiys. Chung krysí model napodobuje příznaky lidských pacientů s kausalgií, nebo záchvaty bolesti způsobené poškozením periferního nervu (Kim and Chung, výše, 1992). Chirurgický zákrok podle Kim a Chunga způsobuje

-9CZ 297384 B6 dlouhodobou hyperalgesii na vliv tepla a mechanickou alodynii na postižené tlapce. Jak je popsáno v příkladu 1, krysy s ligací míšního nervu provedenou podle postupu navrženého

Chungem a Kimem jsou použitelné pro identifikaci aktivního fragmentu prosaposinu pro použití při mírnění neuropatické bolesti.

Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při mírnění neuropatické bolesti může být identifikován také podle své aktivity při mírnění neuropatické bolesti v krysím modelu diabetické neuropatie. Hyperalgesie na termální, mechanické a chemické stimuly byla také popsána u diabetických krys s krátkodobým inzulin-defícientním diabetem indukovaným toxiny selektivními pro D-buňky, jako je straptazocin (Calcutt et al., Pain 68: 293 - 299 (1996). Takový krysí model je reprezentativní pro bolest pociťovanou diabetiky, u kterých mohou existovat různé aberantní pocity včetně spontánní bolesti, bolesti provokované lehkým dotykem a hyperalgesie. Krysy ošetřené streptazocinem nebo jiným selektivním toxinem pro D buňky mohou být ošetřeny požadovaným fragmentem nebo peptidem; potom je měřena odpověď na stimul jako je 0,5% formalin. Redukovaná odpověď může být použita pro identifikaci aktivního fragmentu prosaposinu nebo peptidu použitelného pro zmírnění neuropatické bolesti.

Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při mírnění neuropatické bolesti může být identifikován také za použití modelu neuromů podle Wall et al.. Tento dobře známý model neuropatické bolesti reprodukuje lidské příznaky pozorované po amputaci nebo přerušení nervu na nepoškozené končetině (Wall et al., výše, 1979). Jak bylo uvedeno výše, neuromy se snadno tvoří po porušení nervu díky neplnohodnotnému růstu neuritových výběžků.

Model chronického konstrikčního poškození může být použit pro identifikaci prosaposinu nebo peptidu použitelného při mírnění neuropatické bolesti. Model chronického konstrikčního poškození podle Benneta a Xie, výše, 1988, je krysí model periferní neuropatie, který produkuje bolestivé poruchy podobné těm, které jsou pozorovány u lidí. V Bennetově modeluje poškození nervu vytvořeno těsnými konstruktivními ligaturami okolo krysího ischiadického nervu, což způsobí degeneraci nervu distálně od konstrikce. Kromě spontánní bolesti je konstrikčním poškozením produkovány alodynie a hyperalgesie.

Modely neuropatické bolesti na primátech jsou také použitelné pro identifikaci prosaposinu nebo peptidu použitelného při mírnění neuropatické bolesti (viz, například, Lekán et al., výše, 1992; Palace et al., výše, 1992).

Jak je zde použito, termín „peptid“, jak je použit ve vztahu k aktivního fragmentu prosaposinu, peptidu odvozeného od prosaposinu nebo peptidu použitelného ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu, znamená sloučeninu obsahující přirozené aminokyseliny, nepřirozené aminokyseliny nebo chemicky modifikované aminokyseliny, s podmínkou, že sloučenina si zachovává aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo jiné neurotrofické nebo myelinotrofické aktivity zde popsané. Peptidem odvozeným od prosaposinu může být také falešný peptid, který má nonaminokyselinovou chemickou strukturu, která napodobuje peptid odvozený od prosaposinu a zachovává si aktivitu. Takový falešný peptid je charakterizován tím, že vykazuje podobné fyzikální charakteristiky, jako je velikost, náboj a hydrofobicita, jako je peptidový protějšek odvozený od prosaposinu. Specifickým příkladem falešného peptidu je sloučenina, ve které jsou amidové vazby mezi jednou nebo více aminokyselinami nahrazeny, například, vazbou uhlík-uhlík nebo jinou vazbou dobře známou v oboru (viz například Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washinton (1995)).

Jak je zde použito, termín „aminokyselina“ označuje jednu z dvaceti přirozených aminokyselin, včetně, pokud není jinak uvedeno, L-aminokyselin a D-aminokyselin. Termín aminokyselina také označuje sloučeniny jako jsou chemicky modifikované aminokyseliny včetně analogů aminokyselin, přirozených aminokyselin, které nejsou obvykle inkorporovány do proteinů jako je norleucin, a chemicky syntetizovaných sloučenin mající vlastnosti charakteristické pro aminokyseliny, s tou podmínkou, že vlastnosti charakteristické pro aminokyseliny, s tou podmínkou, že

-10CZ 297384 B6 sloučenina může být substituována v peptidů tak, že si zachovává svou biologickou aktivitu. Například, glutamin může být aminokyselinovým analogem asparaginu, s tou podmínkou že může být substituován v aktivním fragmentu prosaposinu, který si zachovává aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo jiné neurotrofické nebo myelinotrofické aktivity zde popsané. Další příklady aminokyselin a analogů aminokyselin jsou uvedeny v Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academie Press, lne., New York (1983). Aminokyselinou také může být falešná aminokyselina, což je struktura, která vykazuje v podstatě stejné prostorové rozložení funkčních skupin jako aminokyselina, ale nemusí nutně mít ani d-amino, ani d-karboxylovou skupinu charakteristickou pro aminokyselinu.

Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při mírnění neuropatické bolesti může být izolován nebo syntetizován za použití způsobů v oboru dobře známých. Takové způsoby zahrnují rekombinantní DNA metody a metody chemické syntézy pro produkci peptidů. Rekombinantní metody pro produkci peptidů pomocí exprese sekvence nukleových kyselin kódující peptid ve vhodné hostitelské buňce jsou v oboru dobře známé a jsou popsány, například, v Sambrook et al., Moleculas Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, svazek 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory press, New York (1989).

Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný podle předkládaného vynálezu může být také produkován chemickou syntézou, například metodou syntézy peptidů na pevné fázi podle Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964). Standardní metody roztoků mohou být také použity pro syntézu peptidů podle předkládaného vynálezu (viz například Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) a Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Nově syntetizovaný peptid může být přečištěn, například, kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) a může být charakterizován, například, pomocí hmotnostní spektrometrie nebo analýzy aminokyselinové sekvence.

Je jasné, že na aktivním fragmentu prosaposinu mohou být provedeny limitované modifikace, bez ovlivnění jeho funkce. Proto, modifikace aktivního fragmentu prosaposinu, které neruší jeho schopnost zmírňovat neuropatickou bolest, spadají do definice aktivního fragmentu prosaposinu. Modifikace mohou obsahovat, například, adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků; substituce sloučenin, které napodobují aminokyselinovou strukturu nebo funkci; a adice chemických skupin jako je amino nebo acetylová skupina. Aktivita modifikovaného peptidů v mírnění neuropatické bolesti může být testována za použití zvířecího modelu neuropatické bolesti, jako jsou modely popsané výše nebo v příkladu 1.

Zejména výhodná modifikace aktivního fragmentu prosaposinu je taková, která způsobuje, například zvýšenou stabilitu. Například, inkorporace jedné nebo více D-aminokyselin nebo substituce nebo delece lysinu může zvyšovat stabilitu aktivního fragmentu prosaposinu ochranou před degenerací peptidů. Například, jak je zde popsáno, 14—mer odvozený od prosaposinu, podle SEQ ID NO: 2, má aminokyselinovou sekvenci odvozenou do aminokyselin 16 až 29 saponinu C, ale modifikovanou substitucí nebo delecí každého ze tří přirozeně se vyskytujících lysinů a adicí C-koncového tyrosinu. Konkrétně, 14-mer odvozený od prosaposinu, podle SEQ ID NO: 2, má SEQ ID NO: 2, má substituci D-alaninu za lysin v pozici 2; substituci alaninu za lysin v pozici 8 a deleci lysinu v pozici 11. Substituce D-alaninu v pozici 2 způsobuje zvýšenou stabilitu ochrannou peptidů před degradací endoproteázami, která je v oboru dobře známá (viz například strana 247 Pargridge, Peptide Drug Velivery to the Brain, Raven Press, New York, (1991)). Substituce nebo delece lysinu způsobuje zvýšenou rezistenci na proteázy podobné trypsinu, jak je v oboru dobře známo (Partridge, výše, 1991). Tyto substituce zvyšují stabilitu a, z toho důvodu, biodostupnost peptidů podle SEQ ID NO: 2, ale neovlivňují aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti.

Použitelné modifikace také mohou být ty, které napomáhají prostupu peptidů přes hematoencefalickou bariéru, jako jsou modifikátory, které zvyšují lipofilii nebo snižují vodíkovou vazbu. Například, adice tyrosinu na C-konec peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2)

-11 CZ 297384 B6 zvyšuje hydrofobnost a permeabilitu přes hematoencefalickou bariéru (viz například Banks et al.,

Peptides 13: 1289 - 1294 (1992) a Partridge, výše, 1991). Chimérický produkt peptid-farmaceutické činidlo, které zvyšuje biologickou stabilitu nebo zvyšuje permeabilitu přes hematoencefalickou bariéru, například, může být také použitelný ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu.

Odborník v oboru může snadno testovat schopnost aktivního fragmentu prosaposinu překonávat hematoencefalickou bariéru in vivo, například, jak je popsáno v příkladu 2. Kromě toho, aktivní fragment prosaposinu může být testován na svou schopnost překonávat hematoencefalickou bariéru za použití in vitro modelu hematoencefalické bariéry založeném na systému kultury endotelových buněk mozkových mikrokapilár, například jak je to popsáno v Bowman et al., Ann Neurol. 14: 396 - 402 (1982) nebo Takahura et al., Adv. Pharmacol. 22: 137 - 165 (1992).

Jak je zde použito, znamená termín „účinné množství“ množství aktivního fragmentu prosaposinu použitelné pro zmírnění neuropatické bolesti nebo pro prevenci neuropatické bolesti. Účinné množství může být podáno systémově denně na základě tělesné hmotnosti subjektu. Výhodně, účinné množství, které bude podáno systémově denně, bude okolo 0,1 Tg/kg od asi 1000 Tg/kg. Výhodněji, účinné množství, které bude podáno systémově denně, bude okolo 10 Tg/kg do asi 100 Tg/kg. Účinné množství peptidů pro zmírnění nebo pro prevenci bolesti může být určeno empiricky za použití metod dobře známých v oboru, včetně, například, testu popsaného v příkladu 1 nebo testů popsaných výše, včetně testů na primátech (Lekán et al., výše, 1992 a Palacek et al., výše, 1992).

Typické minimální množství peptidů podle předkládaného vynálezu pro neurotrofickou a myelotrofickou aktivitu v buněčném kultivačním médiu je alespoň 5 ng/ml. Toto množství nebo vyšší množství peptidů podle předkládaného vynálezu může být použito pro použití in vitro. Typicky mohou být použity koncentrace peptidů podle předkládaného vynálezu v rozmezí od 0,1 Tg/ml do asi 10 Tg/ml. Účinné množství pro léčbu určité tkáně může být určeno tak, jak je uvedeno v příkladech 4 a 6.

Nervové buňky mohou být ošetřeny in vitro nebo ex vivo přímým podáním peptidů podle předkládaného vynálezu k buňkám. Toto může být provedeno, například kultivací buněk v kultivačním médiu vhodném pro určitý typ buněk a následným přidáním peptidů do média. Když jsou nervové buňky ošetřeny in vivo, jak tomu typicky je u obratlovců, výhodně savců, tak může být peptid podle předkládaného vynálezu podán jednou z několika technik popsaných dále.

Jak je zde použit, označuje termín „subjekt“ obratlovce, výhodně savce, a zejména, člověka.

Předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek pro zmírnění bolesti, stimulace růstu neuritů, inhibicí smrti nervových buněk, navození myelinizace a inhibicí demyelinizace a farmaceutický přípravek pro inhibicí senzorické a motorické neuropatie podáním účinného množství aktivního fragmentu prosaposinu intravenózně, intramuskulámě, intradermálně, subkutánně, intrakraniálně, intracerebrospinálně, lokálně, orálně, transdermálně, transmukosálně nebo intranasálně. Spolu s aktivním fragmentem prosaposinu může být podán farmaceuticky přijatelný nosič dobře známého typu. Takové nosiče zahrnují, například, fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS).

Výhodně je účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu injikováno přímo do krve subjektu. Například, pro podání aktivního fragmentu prosaposinu do periferního nebo centrálního nervového systému může být použita intravenózní injekce, protože jodem značený od prosaposinu odvozený 18-mer Tyr-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-GluIle-Leu (SEQ ID NO: 20), skládající se z aminokyselin 12 až 29 22-mer odvozeného do prosaposinu SEQ ID NO: 1 se substitucí tyrosinu za valin v aminokyselinové pozici 12 (MW - 2000) překonává hematoencefalickou bariéru a vstupuje do centrálního nervového systému jak je

- 12CZ 297384 B6 popsáno v příkladu 2. Vychytávání v mozku bylo asi 0,03%, což je střední hodnota pro peptidy přibližně této velikosti, které překonávají hematoencefalitickou bariéru (Banks et al., výše, 1992).

Často může být žádoucí orální podání, za podmínky, že aktivní fragment prosaposinu je modifikován tak, aby byl stabilní vůči degradaci v gastrointestinálním traktu a aby byl snadno absorbovatelný. Substituce, například, jedné nebo více D-aminokyselin může způsobit zvýšenou stabilitu peptidů odvozeného od prosaposinu podle předkládaného vynálezu.

Pro podání účinného množství aktivního fragmentu prosaposinu do periferního nebo centrálního nervového systému subjektu může být také použita přímá intrakraniální injekce. Kromě toho, aktivní fragment prosaposinu může být podán do periferní nervové tkáně přímo injekcí nebo lokální aplikací nebo systémovým podáním. Také jsou předpokládány různé konvenční způsoby podání, včetně intravenózního, intramuskulámího, intradermálního, subkutáního, intrakraniálního, epidurálního, lokálního, orálního, transdermální, transmukosálního a intranasálního podání.

Aktivní fragment prosaposinu může být podán také v přípravku se zpomaleným uvolňováním. Aktivní fragment prosaposinu se zpomaleným uvolňováním má tu výhodu, že mírní neuropatickou bolest po prodlouženou dobu bez potřeby opakovaného podání aktivního fragmentu.

Zpomalené uvolňování může být provedeno například pomocí materiálů zpomalujících uvolňování, jako jsou oplatky, imunokorálky, mikropumpy nebo jiné materiály, které umožňují kontrolované zpomalené uvolňování aktivního fragmentu prosaposinu. Takové materiály pro zpomalené uvolňování jsou dobře v oboru známé a jsou dostupné z komerčních zdrojů (Alza Corp., Palo Alta CA; Deptech, La Jolla, CA; viz též Pardoll, Ann. Rev. Immunol. 13: 399 - 415 (1995). Kromě toho, bioerodovatelné nebo biodegradovatelné materiály, které mohou být formulovány s aktivním fragmentem prosaposinu, jako je kyselina polymléčná, kyselina polygalaktonová, regenerovaný kolagen, mnoholamelámí liposomy nebo jiné běžné depotní formulace, mohou být implantovány pro zpomalené uvolňování aktivního fragmentu prosaposinu, také se v předkládaném vynálezu předpokládá použití infuzních pump, systémů s vychytáváním v matrici a transdermálních systémů pro podání léčiva.

Aktivní fragment prosaposinu může být také výhodně uzavřen v micelách nebo liposomech. Technologie obalení v liposomech je v oboru dobře známá. Liposomy mohou být zaměřeny na specifické tkáně, jako je nervová tkáň, pomocí receptorů, ligandů nebo protilátek schopných vazby na cílovou tkáň. Příprava takových přípravků je v oboru dobře známá (viz, například, Pardridge, výše, 1991, a Radin a Metz, Meth. Enzymol. 98: 613 - 618 (1983)).

Peptidový přípravek podle předkládaného vynálezu může být zabalen a podáván v jednotkové dávkové formě, jako je injikovatelný přípravek nebo přípravek pro lokální podání, v dávkovém množství ekvivalentním denní dávce podané pacientovi, a pokud je to žádoucí, tak může být připraven v přípravku s kontrolovaným uvolňováním. Jednotková dávková forma může být například, šeptem opatřená fiola obsahující denní dávku aktivního přípravku podle předkládaného vynálezu v PBS nebo v lyofilizované formě. Pro léčbu nervových onemocnění je vhodná denní systémová dávka peptidů podle předkládaného vynálezu určena na základě tělesné hmotnosti obratlovce a je v rozmezí od asi 10 do asi 100 Tg/kg, ačkoliv dávky v rozmezí od 0,1 do lOOOTg/kg mohou také být použity. Tak, pro typického lidského pacienta o hmotnosti 70 kg bude systémová denní dávka mezi asi 7 a asi 70 000 Tg/den a výhodně mezi 700 a 7000 Tg/den. Denní dávka pro lokálně podaný materiál bude řádově nižší než systémová dávka. Také se předpokládá systémové podání.

Vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu, přičemž přípravek obsahující buňky, které jsou geneticky modifikovány tak, aby exprimovaly a secemovaly aktivní fragment prosaposinu, je transplantován subjektu. Transplantace poskytne kontinuální zdroj aktivního fragmentu prosaposinu a proto zmírnění neuropatické bolesti. Pro

- 13CZ 297384 B6 subjekt trpící dlouhodobou bolestí má takový farmaceutický přípravek tu výhodu, že se ruší nebo je redukována potřeba opakovaného podávání aktivního fragmentu prosaposinu.

Za použití způsobů v oboru dobře známých může být buňka snadno transfektována expresním vektorem obsahujícím aktivní fragment prosaposinu (Chang, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boča Raton (1995)). Například pro transplantaci do mozku transfektované buňky exprimují a secemují aktivní fragment prosaposinu a tak zmírňují neuropatickou bolest. Takový způsob může být použit pro zmírnění neuropatické bolesti jak je popsáno pro transplantaci buněk, které secemují substance s analgetickými vlastnostmi (viz například Czech a Sagen, Proč. Neurobiol. 46: 507-529(1995)).

Buňkou může být jakákoliv buňka, která přežívá, je-li transplantována a která může být modifikována tak, aby exprimovala a secemovala aktivní fragment prosaposinu. V praxi by měla být imunologicky kompatibilní se subjektem. Například, konkrétní použitelnou buňkou je buňka izolovaná z léčeného subjektu, protože taková buňka je imunologicky kompatibilní se subjektem.

Buňka izolovaná ze zdroje jiné než je léčený subjekt může být také použita, pokud je chráněna před imunologickou rejekcí, například, uložením do mikrokapsle nebo imunosupresií. Použitelné materiály pro membrány mikrokapslí zahrnují alginát-poly-L-lysin-alginát a agarózu (viz například Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encepsulation and Immobilization, CRC Press, Boča Raton (1993; Tai a Sun, FASEB J. 7: 1061 (1993); Liu et al., Hum. Gene Ther. 4: 291 (1993); a Taniguchi et al., Transplant Proč. 24: 2977 (1992)). Například, redukce bolesti může být dosažena za použití buněk obalených polymerem, které jsou transplantovány do suberachnoidálního prostoru míchy u krysy (Wang et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 235 (1991)).

Pro farmaceutický přípravek použitý v léčbě lidských subjektů mohou být buňky lidské buňky, ačkoliv použitelné mohou být také non-lidské savčí buňky. Konkrétně, lidské fíbroblasty, svalové buňky, gliální buňky, prekurzorové buňky neuronů nebo neurony mohou být transfektovány expresním vektorem tak, aby exprimovaly a secemovaly aktivní fragment prosaposinu podle SEQ ID NO: 1. Primární fíbroblasty mohou být získány, například, z kožní biopsie od léčeného subjektu a mohou být udržovány za standardních podmínek pro kultivaci tkání. Pro transplantaci lze také použít svalových buněk. Předkládaný pro transplantaci do nervového systému jsou popsány, například, v Chang, výše, 1995.

Buňka odvozená z centrálního nervového systému může být zejména užitečná pro transplantaci do centrálního nervového systému, protože přežití takových buněk je zvýšeno v jejich přirozeném prostředí. Prekurzorové buňky nervového systému jsou zejména užitečné ve farmaceutických přípravcích podle vynálezu, protože prekurzorové buňky nervového systému mohou být kultivovány v kultuře, mohou být transfektovány expresním vektorem a mohou být vloženy do jedince, kde jsou integrovány. Izolace prekurzorových buněk nervového systému, které jsou schopné proliferace a diferenciace na neurony a glie, je popsána v Refranz et al., Cell 66: 713-729(1991).

Způsoby pro transfekci buněk ex vivo jsou v oboru dobře známé (Kriegler, Gene Transfer and Expresion: A laboratory Manual, W.H. Freeman and Co., New York, (1990)). Pro transfekci buněk, které pokračují v dělení, jako jsou fíbroblasty, svalové buňky, gliální buňky nebo prekurzorové buňky neuronů, je výhodný retrovirový vektor. Pro transfekci expresního vektoru do postmitotických buněk, jako je neuron, je výhodný vektor replikace defícientního herpes simplex viru typu - 1 (HSV-1) (During et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 140 (1991); Sable et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 570 (1991)).

Nukleová kyselina kódující aktivní fragment prosaposinu může být exprimována pod kontrolou jednoho nebo více promotorů, které jsou v oboru dobře známé, včetně konstitutivního promotoru nebo indukovatelného promotoru. Viz například Chang, výše, 1995. Konkrétním vhodným konstitutivním promotorem pro vysokou hladinu exprese je dlouhý koncový opakující se úsek

- 14CZ 297384 B6 viru Moloney myší leukemie (MLV-LTR), cytomegalovirový okamžitý časný (CMV-1E) nebo

SV40 časný region (SV40).

Sekvence nukleové kyseliny kódují aktivní fragment prosaposinu je zde popsána. Například, sekvence nukleové kyseliny kódující SEQ ID NO: 1 je 5'-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3' (SEQ ID NO: 21) (Dewji et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8652 - 8656 (1987)). Pro přímou sekreci peptidů podle SEQ ID NO: 1 může být nukleová kyselina kódující signální sekvenci, jako je například sekvence pro β-laktamázu, operativně připojena na SEQ ID NO: 21, jak to popisuje Simon et al., J. Cell. Biol. 104: 1165 (1987).

Vynález dále poskytuje farmaceutický přípravek pro prevenci neuropatické bolesti u subjektu podáním účinného množství aktivního fragmentu prosaposinu. Farmaceutický přípravek pro prevenci neuropatické bolesti je užitečný, například, když je aplikován před vznikem bolestivého podnětu, například před chemoterapií nebo před chirurgickým zákrokem, o němž je známo, že způsobuje neuropatickou bolest.

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace, nikoliv jako omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Zmírnění neuropatické bolesti v Chungově krysím modelu

Tento příklad popisuje účinek bolusové intrathekální injekce aktivního fragmentu prosaposinu v Chungově pokusném modelu periferní neuropatické bolesti.

Každý ze tří peptidů byl získán v čisté formě pomocí chemické syntézy, byl rozpuštěn ve sterilním PBS a byl pufrován na neutrální pH.

Chirurgický výkon, který byl popsán dříve Kimem a Chungem, byl proveden na samcích Sprague-Dawley krys o hmotnosti 120 až 150 gramů pro indukci alodynie. Stručně, zvířata byla uvedena do anestezie halotanem; potom byly v sousedství páteře izolovány levé L-5 a L-6 míšní nervy a byly ligovány 6,0 hedvábnou suturou distálně od galglia zadního kořene míšního. Za deset až čtrnáct dní po operační rekonvalescenci byl zaveden míšní katétr. Pět. dní po druhém chirurgickém zákroku bylo provedeno intrathekální podání léku za použití přesně zavedené mikroinjekční stříkačky připojené na míšní katétr zavedený přes foramem magnum. Před testováním byly krysy umístěny do plastových boxů a nechaly se aklimatizovat.

Pro hodnocení 50% mechanického prahu pro uhýbavý pohyb tlapkou byl von Freyův vlas aplikován na zadní nohu mimo tlapku. Každý z von Freyových vlasů, které jsou kalibrovány tak, aby se měnily při logaritmicky se zvyšující síle, byl přitlačen na tlapku s dostatečnou silou pro mírný ohyb na dobu přibližně 6-8 sekund. Pozitivní odpověď byla zaznamenána, pokud tlapka rychle ucukla. Bylo zaznamenáno šest dat pro každý čas s maximálním a minimálním stimulem zaznamenaným pro každý čas. Výsledný charakter odpovědi byl zanesen do tabulky a byl vypočítán 50% práh odpovědi. Graíý ukazují odpověď na ukázanou dávku peptidů podaného jako jediná intrathekální bolusová injekce. Osa X ukazuje čas pro injekci, ve kterém byla měřena hypersenzitivita na tlak na tlapku.

Všechny chirurgicky poškozené krysy vykazovaly taktilní alodynii před injekcí aktivního fragmentu prosaposinu. Jak je ukázáno v čase 0 na obrázku 1, měřený práh byl menší než 3,0 až 4,0 g za absence peptidů. Intrathekální injekce 0,7 nebo 0,07 pg 22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) potlačila alodynii způsobem závislým na dávce. Redukce alodynie se projeví zvýšením prahové síly, protože krysy snesou vyšší sílu předtím, než ucuknou tlapkou.

-15CZ 297384 B6

Signifikantní účinek byl pozorován za 15 minut po injekci. Maximální účinek byl pozorován 120. minutu po injekci. Krysy, kterým byla injikována maximální dávka 22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) stále vykazovaly signifikantně redukovanou alodynii v nejzažší testovanou dobu (180 minut). Krysy, kterým byla injikována dávka 0,07 pg 22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) nevykazovaly žádnou signifikantní redukci alodynie. Při jakékoliv koncentraci nebyly pozorovány žádní signifikační vedlejší účinky, jako je sedace.

Schopnost 14-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2; viz tabulka 1) mírnit alodynii v Chungově krysím modelu byla také vyšetřována. Jak je ukázáno na obrázku 2, aktivní fragment prosaposinu (SEQ ID NO: 2) byl účinný v redukci alodynie. Maximální účinek 14-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) byl pozorován za 15 až 30 minut po injekci a návrat k hodnotám před injekcí byl pozorován za 60 minut (obrázek 2). Žádné vedlejší účinky nebyly pozorovány při použití jakékoliv testované koncentrace 14-mer peptidů odvozeného do prosaposinu (SEQ ID N O: 2).

Mutantní 22-mer peptid (SEQ ID NO: 8), který se liší od 22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) tím, že obsahuje zbytky kyseliny asparagové místo asparaginu (viz tabulka 4) byl také testován na svou aktivitu v mírnění alodynie v Chungově krysím modelu. Po injekci 17,5 pg mutantního 22-mer peptidů (SEQ ID NO: 8) nebyla pozorována žádná změna v alodynické odpovědi v Chungově krysím modelu.

Normální krysy, které nepociťovaly bolest v důsledku chirurgické léze provedené podle Chungova modelu, také dostaly injekci aktivního fragmentu prosaposinu (SEQ ID NO: 1) a byly také testovány na odpověď na tepelné stimuly podle postupu, který popsal Bennet a Xie, výše, 1988. Stručně, doba, za kterou krysa ucukne postiženou tlapkou od zdroje tepla je definována jako latence na horké plotně a je měřena tolerance na bolest způsobenou tepelným stimulem.

Intrathekální katétr byl zaveden do normálních samců Sprague-Dawley krys. Pět dní po tomto chirurgickém kroku byl krysám podán injekčně intrathekálně aktivní fragment prosaposinu (SEQ ID NO: 1). Krysy byly vyšetřovány na horké plotně; latence na horké plotně byly měřeny před injekcí a různou dobu po injekci do doby 180 minut. Nebylo pozorováno žádné signifikantní zvýšení latence na horké plotě. Proto, peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 1 neovlivňuje percepci bolesti u normálních zvířat.

Příklad 2 - In vivo vychytávání peptidů odvozených od prosaposinu v centrálním nervovém systému

Výsledky popsané v tomto příkladu naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu překonávají hematoencefalickou bariéru.

18-mer peptid (SEQ ID NO: 20) skládající se z aminokyselin 12-29 saponinu C styrosinem substituovaným za valin v pozici 12 byl chemicky syntetizován na Applied Biosystems Model 430 syntezátoru peptidů. Peptid byl potom radioaktivně značen jodem za použití laktoperoxidázové metody; 20xl0⁶rpm radioaktivně značeného peptidů bylo injikováno do boltců krys. Zvířata byla usmrcena za 1 hodinu a za 24 hodin a jejich srdce byla perfundována izotonickým salinickým roztokem pro odstranění krve z mozku.

Pro určení procenta vychytávání peptidů byl potom mozek odečítán na gama čítači. Kromě toho byl mozek homogenizován a frakcionován na frakci bohatou na kapiláry (peletu) a frakci mozkového parenchymu (supematant) po centrifugací v dextranu (Triguero et al., J. Neurochem. 54: 1882 - 1888 (1990)). Tato metoda umožňuje odlišení radioaktivně značeného peptidů v cévách a v mozku. Po 24 hodinách bylo 0,017% injikovaného peptidů (SEQ ID NO: 20) detekováno

-16CZ 297384 B6 v celém mozku; 75 % z radioaktivní značky bylo v parenchymové frakci a 25 % bylo v kapilární frakci. V 1. hodině bylo v celém mozku přítomno 0,03 % injikované dávky.

Peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 byl také testován na schopnost překonávat 5 hematoencefalickou bariéru následujícím způsobem. Samice Sprague-Dawley krys byly podrobeny anesterzii methoxyfluranem a přibližně 20 pg peptidu podle SEQ ID NO: 2 (3,2 χ 10⁸ cpm) bylo injikováno do ocasní vény. Po 40 minutách byly krysy usmrceny anesterzii etherem a byly perfundovány asi 250 ml PBS přes srdce. Celkové množství peptidu v mozku, játrech a v krvi byl počítáno jako procento injikovaného materiálu, jak je ukázáno v tabulce 6. Pro určení lokalizace io v mozku byla použita metoda delece kapilár podle Triguero et al., J. Neurochem. 54: 1882 (1990), pro separaci mozkové tkáně na parenchymovou frakci a na mozkovou kapilární frakci. Výsledky frakcionace ukazují, že 87 % peptidu SEQ ID NO: 2 přítomného v mozku bylo lokalizováno v mozkovém parenchymu, zatímco pouze 13% bylo lokalizováno v mozkových kapilárách.

Tabulka 6

Tkáň	Hmotnost	Celkem cpm ve tkáni	Procento počáteční cpm
Mozek	1,3 g	161000	0,050
Játra	8,8 g	5,2 X 106	1,625
Krev	asi 22 μΐ	1,01 x 10s	31,6

V podobném pokusu, ve kterém byly krysy usmrceny po třech hodinách po ošetření peptidem podle SEQ ID NO: 2 bylo v mozku nalezeno 0,06 % peptidu, z toho 85 % v parenchymu. Tyto 20 výsledky prokazují, že alespoň část peptidu odvozeného od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 překonává hematoencefalickou bariéru a koncentruje se v mozkovém parenchymu, spíše než v cévním endotelu (krevní cévy). Procento peptidu, který překovává hematoencefalickou bariéru, je v mezích pro peptidy překonávající bariéru, jak je uvádí Banks, výše, 1992.

Pro určení procenta intaktního materiálu v mozku, játrech a v krvi byl radioaktivně značený materiál (SEQ ID NO: 2) izolovaný z tkání analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Pro normalizaci degradace během zpracování homogenátů tkáně byl peptid SEQ ID NO: 2 přidán do homogenátů tkáně. Rozsah pozorované degradace při přidaném peptidovém materiálu byl použit pro normalizaci degradace v průběhu zpracování tkáně. Po normalizaci byly výsledky následující: SEQ ID N O: 2 byla z 60 % v mozku intaktní; z asi 80 % byla intaktní v játrech a asi ze 40% byla intaktní v krvi. Ve druhém pokusu byl peptid SEQ ID NO: 2 asi z 68 % v mozku intaktní. Tyto výsledky naznačují, že peptid SEQ ID NO: 2 překonává hematoencefalickou bariéru a že je v mozku z významné části intaktní.

Příklad 3 - Zmírnění neuropatické bolesti u diabetických krys

Tento příklad popisuje účinky intraperitoneálního podání peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 v krysím modelu diabetické neuropatie.

Krysám byl způsoben diabetes jedinou intraperitoneální injekcí streptozotocinu (50 mg/kg tělesné hmotnosti, bezprostředně naředěný v 0,9% sterilním fyziologickém roztoku) pro likvidaci β-buněk slinivky břišní a pro indukci inzulínové defícience, jak to popisuje Calcutt et al., Pain, 68: 293 -299 (1996). O dva dny později byl u krys, kterým byl injikován streptozotocin, potvrzen diabetes tak, že byla měřena hladina glukózy v krvi. Zvířata, kterým byl injikován stretozotocin,

-17CZ 297384 B6 která měla koncentraci glukózy v krvi nižší než 15 mmol/1, byla vyloučena z dalšího pokusu, podle obecně přijímaných kritérií hyperglykemie nezpůsobené stravou ve studiích diabetů u krys.

Diabetické a kontrolní krysy byly studovány v čase 8 týdnů analýzou chování v odpovědi na škodlivou chemikálii formalin jako indikátor alodynie (Calcutt et al., výše, 1996). Stručně, krysy dostaly subkutánní injekci čerstvě připraveného formalinu (50 μΐ 0,5% roztoku ve sterilním fyziologickém roztoku) do hřbetu pravé zadní tlapky. Tato koncentrace formalinu indukuje sub.-maximální odpovědi u kontrolních krys a umožňuje detekci hyperalgesie u diabetických krys během fází Q a 2 (Calcutt et al., Eur. J. Pharmacol. 285: 189 - 197 (1995). Zvířata byla přenesena do pozorovacího boxu kontrolovaného tak, aby byla umožněna trvalá vizuální kontrola tlapky. Počet ucuknutí během jedné minuty byl počítán v 5minutových intervalech po dobu následujících 60 minut pozorovatelem, který neznal příslušnost každého zvířete k testované skupině. Fáze 1 byla definována jako počáteční měření záškubů (1-2 a 5-6 minut po injekci); Q (klidová) fáze jako měření provedené v 10-11, 15-16 a 20-21 minutě; a fáze 2 jako všechna další měření po injekci, jak bylo definováno dříve pro studium diabetických krys (viz například Malmberg et al., Neurosci. Lett. 161: 45 - 48 (1993)). Srovnání aktivity během každé fáze bylo provedeno součtem záškubů v měřeních během jedné fáze. Diabetické krysy měly abnormální odpověď záškubů, jak bylo popsáno dříve.

Peptid SEQ ID NO: 2 byl získán v čisté formě pomocí chemické syntézy, byl rozpuštěn ve sterilním PBS a byl pufrován na neurální pH. Diabetické krysy byly rozděleny do dvou skupin po čtyřech zvířatech, kde jedné skupině byl podán peptid SEQ ID NO: 2 a druhé fyziologický roztok. Dvě hodiny před ošetřením 0,5% formalinem byl diabetickým krysám podán buď fyziologický roztok, nebo 200 pg/kg peptidů SEQ fD NO: 2 intraperitoneálně. Jak je ukázáno na obrázku 3, podání SEQ ID NO: 2 zcela bránilo abnormálním záškubům ve fázi 1 a mírnilo odpověď ve fázi 2 o 70 %. Proto, parenterální podání peptidů SEQ ID NO: 2 zmírňuje bolest vzniklou injekcí formalinu v krysím modelu bolestivé diabateické neuropatie.

Příklad 4 - Stimulace růstu neuritů in vitro

Tento příklad popisuje použití peptidů majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 ve stimulu růstu neuritů in vitro.

NS20Y neuroblastomové buňky jsou kultivovány v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS). Buňky byly odstraněny trypsinem a jsou umístěny v 30mm Petriho miskách na skleněných krysích sklíčkách. Po 20 až 24 hodinách je médium nahrazeno 2 ml DMEM obsahujícím 0,5% fetální telecí sérum s 0, 0,5, 1, 2, 4 nebo 8 ng/ml peptidů majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo nepravidelně promíchaný kontrolní peptid. Buňky jsou kultivovány po dalších 24 hodin, jsou promyty PBS a jsou fixovány Bouinovým roztokem (nasycený vodný roztok kyseliny pikrové/formalinu/kyseliny octové 15:5:1) po dobu 30 minut. Po odstranění fixačního činidla PBS je růst neuritů hodnocen pod fázovým kontrastním mikroskopem. Buňky vykazující jeden nebo více jasně definovaných neuritů rovných nebo delších než jeden průměr buňky jsou počítány jako pozitivní z hlediska růstu neuritů. Alespoň 200 buněk je vyšetřováno v různých pozicích každé misky pro určení procenta buněk s neurity pro každý peptid testovaný dvojitě.

Peptid se sekvencí SEQ ID NO: 2 signifikantně zvyšuje růst neuritů u NS20Y buněk ve srovnání s nepravidelně promíchaným kontrolním peptidem majícím stejné aminokyseliny v jiném pořadí. Zvýšený růst neuritů je možné pozorovat i při použití koncentrace 0,5 ng/ml peptidů.

Příklad 5 - Inhibice smrti nervových buněk in vitro

Tento příklad popisuje použití peptidů majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 pro inhibici smrti nervových buněk in vitro.

-18CZ 297384 B6

NS20Y buňky jsou umístěny na plotny stejně jak je popsáno v příkladu 4 a jsou kultivovány na skleněných krysích sklíčkách v 0,5% fetálním telecím séru po dobu 2 dnů za přítomnosti nebo za absence 8 ng/ml peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo nepravidelně promíchaného kontrolního peptidu. Médium je odstraněno a do každé jamky se přidá 0,2% trypanová modř v PBS. Mrtvé buňky se trypanovou modří barví modře a jsou počítány jako procento buněk celkem invertovanou mikroskopií, za počítání 400 buněk ve čtyřech oblastech každé jamky. Průměrná chyba ve dvojitém provedení je ± 5 %. Peptid se sekvencí SEQ ID NO: 2 významně redukuje počet buněk pozitivních na barvení trypanovou modří (mrtvých buněk). Tento výsledek naznačuje, že peptid mající sekvenci SEQ ID NO: 2 může inhibovat programovou buněčnou smrt.

Příklad 6 - Test myelinizace ex vivo

Tento příklad popisuje použití peptidu majícího sekvenci SEW ID NO: 2 pro stimulaci růstu neuritů ex vivo a pro navození myelinizace.

Mozkové explantáty z novorozených myší byly připraveny postupem, který popsal Satomi, Zool. Sci. 9: 127 - 137 (1992). Růst neuritů a myelinizace jsou pozorovány v průběhu 22 dní v kultuře, tj. během období, kdy v mozku novorozených myší normálně probíhá neuronální diferenciace a myelinizace. Druhý den po přípravě explantátů je ke třem explantátům přidán peptid mající sekvenci SEQ ID NO: 2 v koncentraci 10 pg/ml a ke třem explantátům je přidán nepravidelně promíchaný kontrolní peptid v koncentraci 10 pg/ml. Růst neuritů a myelinizace ve třech kontrolních a třech ošetřených explantátech je hodnocen světelnou mikroskopií s videokamerou. V den 8 jsou kultury obsahující peptidy tenčí a více se šíří než kontrolní kultury. V den 15 obsahují kultury ošetřené peptidem SEQ ID NO: 2 mnoho buněk s dlouhými výběžky do periferie explantátů. Takové výběžky nejsou přítomné nebo nejsou tak výrazné v kontrolních kulturách. Kultury ošetřené peptidem SEQ ID NO: 2 obsahují signifikantně více myelinizovaných axonů v subkortikální bílé hmotě v den 22, ve srovnání s kontrolními explantáty. Proto, peptid podle předkládaného vynálezu indukume myelinizaci v diferencujícím se mozku ex vivo.

Příklad 7 - Inhibice demyelinizace

Redukce Schwanových buněk je v souladu s inhibici demyelinizace. Schwanovy buňky obsahují rozsáhlé myelinové pochvy. Přidání peptidu podle SEQ ID NO: 2: ke Schwanovým buňkám v kultuře redukuje smrt Schwanových buněk způsobem závislým ne dávce, což není pozorováno při použití kontrolního nepravidelně promíchaného kontrolního peptidu. Proto, peptid podle předkládaného vynálezu mající sekvenci SEQ ID NO: 2 může inhibovat demyelinizaci.

Příklad 8 - Léčba traumatických ischemických lézí CNS

Lidem s traumatickými lézemi míchy byla podána intracerebrospinální injekce nebo přímá injekce přibližně 100 pg/ml peptidu podle SEQ ID NO: 2 ve sterilním fyziologickém roztoku nebo v depotní formě pro umožnění pomalého, kontinuálního podání peptidu v místě léze. Zlepšení je hodnoceno podle zlepšení funkcí motorických nervů jako je zlepšená hybnost končetin. Léčba byla opakována do té doby, dokud nedocházelo k žádným dalším zlepšením.

Příklad 9 - Léčba demyelizačních onemocnění

Pacientům, u kterých bylo diagnostikováno časté stadium MS, byl podán peptid mající sekvenci SEQ ID NO: 2 přímou intravenózní injekcí do mozkomíšního moku za použití stejných dávek, jako je uvedeno v příkladu 8. Dávky byly opakovány denně nebo jednou týdně a byla pozorována svalová síla, muskuloskeletální koordinace a myelinizace (jak je určeno MRI).

- 19CZ 297384 B6

Příklad 10 - Léčba senzorické neuropatie

Myším byl podán taxol pro indukci senzorické neuropatie. Myším ošetřených taxolem bylo podáno 100 pg/kg, 200 pg/kg nebo 1 mg/kg peptidu odvozeného od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2. Ztráta termálního čití byla měřena za použití Hargreaves senzorického testovacího přístroje a byla použita jako indikátor senzorické neuropatie. Každá ze tří podaných dávek peptidu podle SEQ ID NO: 2 byla účinná v inhibicí ztráty termálního čití u myší ošetřených taxolem. 22-mer peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 1 byl testován podobně a bylo zjištěno, že je účinný při inhibicí ztráty termálního čití u myší ošetřených taxolem. Tyto výsledky naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu jako jsou SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 mohou být použity pro účinnou inhibicí senzorické neuropatie.

Ačkoliv byl vynález popsán ve smyslu jeho výhodných provedení, mělo by být jasné, že mohou být provedeny jeho různé modifikace bez odchýlení se od rozsahu vynálezu. Proto je vynález omezen pouze následujícími patentovými nároky.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: The Reagents of the University of Califomia (ii) Název vynálezu: Způsoby použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti (iii) Počet sekvencí: 21 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Cambpell and Flores (B) Ulice: 4370 La Jolla Village Drive, Suitě 700 (C) Město: San Diego (D) Země: CA (E) Stát: USA (F) ZIP:92122 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Petentln Release # 1.0, verse #1.25 (vi) Data současné přihlášky:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání: 5.3. 1997 (C) Klasifikace:

(viii) Zástupce/Agent - informace:

(A) Jméno: Cambpell, Cathryn A.

(B) Registrační číslo: 31815 (C) Odkaz/číslo rejstříku: FP-UD 2474 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: (619) 535-9001 (B) Telefax: (619) 535-8949

-20CZ 297384 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

cva Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys 1 5 10 15

Thr Glu Lys Glu Ile Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění: 2 (D) Jiné informace: (poznámka = „Xaa je D-alanin“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Thr Xaa Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu Ile Leu Tyr

10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 15 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

-21 CZ 297384 B6

Cys Gin Phe Val Met Asn Lys Phe Ser Glu Leu Ile Val Asn Asn Ala

5 10 15

Thr Glu Glu Leu Leu Tyr (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Cys Gin Leu val Asn Arg Lys Leu Ser Glu Leu Ile Ile Asn Asn Ala 15 10 15

Thr Glu Glu Leu Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Cys Glu Tyr Val Val Lys Lys Val Met Leu Leu Ile Asp Asn Asn Arg 15 10 1S

Thr Glu Glu Lys Ile Ile (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

cys Glu Phe val Val Lys Glu Val Ala Lys Leu Ile Asp Asn Asn Arg 1 5 10 15

Thr Glu Glu Glu Ile Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární

-22CZ 297384 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Cys Glu phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asp Asn Lys 15 10 15

Thr Glu Lys Glu Ile Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asp Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Thr Lys ser Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu i 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Tyr Val Lys His Gin Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Val

10 15

Asp Gly Val Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu

5

Asn Leu Pro Lys Met Ala Gly

15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile

5

Thr (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg

5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu

5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu

15

Arg Pro Asn Leu

Val Ala Gly Thr Leu

-24CZ 297384 B6

Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

5

Val

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Tyr Thr- Ala Gin Gly Glu Pro Phe

5

Ala Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg 1 5

Leu Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Pro Asn Asn Val Glu Lys Leu Cys is

Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala

15

Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin

15

-25CZ 297384 B6

Tyr Lys Glu val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu

5 10 15

Ile Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 66 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (D) Topologie: dvojitý (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

TGTGAATTCC TGGTGAAGGA GGTGACCAAG CTGATTGACA ACAACAAGAC TGAGAAAGAA 60

ATACTC 66

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Aktivní fragment prosaposinu mající od 14 do 50 aminokyselin a obsahující sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
2. 2. Aktivní fragment prosaposinu podle nároku 1 sestávající ze sekvence znázorněné v SEQ ID NO: 2.
3. 3. Farmaceutický přípravek pro terapii nervových nebo demyelinizačních chorob v nervové tkáni, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní fragment prosaposinu podle nároku 1 nebo 2 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že je ve formulaci s řízeným uvolňováním.
5. 5. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že je ve formě liposomů.
6. 6. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že je v lyofilizované formě.
7. 7. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že jev jednotkové dávkové formě.
8. 8. Farmaceutický přípravek pro zmírnění neuropatické bolesti, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní fragment prosaposinu podle nároku 1 nebo 2 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
9. 9. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že neuropatická bolest vzniká v důsledku poruchy periferního nervu.

   -26CZ 297384 B6
10. 10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že porucha periferního nervu je vybrána ze skupiny skládající ze zneuromu, komprese nervu, rozdrcení nervu, natažení nervu a neúplného přerušení nervu, mononeuropatie a polyneuropatie.
11. 11. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že neuropatická bolest vzniká v důsledku onemocnění vybraného ze skupiny skládající se z onemocnění ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmenu, thalamu a kůry mozkové.
12. 12. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se tím, že je ve formě pro podání vybrané ze skupiny skládající se z intravenózního, intramuskulámího, intradermálního, subkutánního, intrakraniálního, intracerebrospinálního, lokálního, orálního, transdermálního, transmukosálního a transnasálního podání.
13. 13. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní fragment prosaposinu podle nároku 1 nebo 2, přičemž aktivní fragment prosaposinu stimuluje růst neuritů, inhibuje smrt nervových buněk, podporuje myelinizaci a inhibuje demyelinizaci.
14. 14. Farmaceutický přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že je pro použití in vitro.
15. 15. Farmaceutický přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že je pro použití in vivo.
16. 16. Použití aktivního fragmentu prosaposinu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva pro léčbu nervových nebo demyelinizačních onemocnění nervové tkáně.