CZ283998A3 - Způsob použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti - Google Patents
Způsob použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283998A3 CZ283998A3 CZ982839A CZ283998A CZ283998A3 CZ 283998 A3 CZ283998 A3 CZ 283998A3 CZ 982839 A CZ982839 A CZ 982839A CZ 283998 A CZ283998 A CZ 283998A CZ 283998 A3 CZ283998 A3 CZ 283998A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- prosaposin
- peptide
- nerve
- neuropathic pain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Způsoby použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká oblasti léčby bolesti a přesněji použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti.
Dosavadní stav techniky
Neuropatická bolest vzniká v důsledku poškození nervu. Oproti okamžité bolesti vzniklé v důsledku poškození tkáně může ke vzniku neuropatické bolesti dojít za dny až měsíce po traumatickém poškození. Dále, zatímco bolest způsobená tkáňovým poškozením je obvykle omezena na dobu reparace tkáně, je neuropatická bolest často dlouhodobá nebo chronická. Kromě toho, neuropatická bolest se může vyskytnout spontánně nebo v důsledku stimulace, která není normálně bolestivá.
Klinických příčin neuropatické bolesti je mnoho a zahrnují jak traumata, tak nemoci. Například, traumatická komprese nervu nebo rozdrcení nervu a traumatické poranění mozku jsou častými příčinami neuropatické bolesti. Kromě toho, většina traumatických poškození nervu také způsobuje tvorbu neuromů, u kterých vzniká bolest v důsledku aberantní nervové regenerace. Kromě toho', s nádory související neuropatická bolest je způsobena tehdy, pokud rostoucí nádor bolestivě stlačuje okolní nervy, mozek nebo míchu. Neuropatická bolest je také spojena s nemocemi jako je diabetes mellitus nebo alkoholismus.
Naneštěstí je neuropatická bolest často resistentní na dostupnou medikamentosní léčbu. Kromě toho, současné léčby bolesti mají závažné nežádoucí účinky, včetně, například, kognitivních změn, sedace, nausey a, v případě narkotických léčiv, návyku. Mnoho pacientů trpících neuropatickou bolestí je vysokého věku nebo má jiné zdravotní komplikace, které významně limitují jejich toleranci k vedlejším účinkům spojeným s terapií. Inadekvátnost současné terapie zmírnění neuropatieké bolesti bez produkce neto1erovatelnýeh vedlejších účinků se často manifestuje depresí a sebevražednými sklony pacientů trpících chronickou bolestí.
Způsoby pro zmírnění neuropatieké bolesti by měly zlepšit kvalitu života mnoha pacientů trpících bolestí způsobenou traumatem nebo nemocí. Nicméně, v současnosti neexistují účinné léky, které by mírnily neuropatickou bolest bez nežádoucích vedlejších účinků jako je sedace a návyk. Proto existuje potřeba způsobů pro zmírněni neuropatieké bolesti bez produkce nežádoucích vedlejších účinků. Předkládaný vynález uspokojuje tuto potřebu a zároveň poskytuje s ní související výhody.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro zmírnění neuropatieké bolesti u subjektu, ve kterém je subjektu podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Například, vynález poskytuje způsob pro zmírnění neuropatieké bolesti vzniklé v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové, ve kterém je subjektu podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu, který má aminokyselinovou sekvenci Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu3
Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) nebo Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-GluGlu-I1e-Leu-Tyr (SEQ ID NO: 2). Kromě toho, vynález poskytuje způsob pro prevenci neuropatické bolesti u subjektu, ve které je subjektu podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Předkládaný vynález také poskytuje peptidy odvozené od prosaposinu a použití těchto peptidů pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici nervové demyelinizace. Kromě toho jsou poskytnuty metody pro inhibici sensorieké nebo motorické neuropatie, ve kterých jsou nervové buňky uvedeny do kontaktu s kompozicí obsahující účinné inhibiční množství aktivního fragmentu prosaposinu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek i ukazuje práh taktilní alodynie před (čas 0) a různou dobu po bolusové injekci 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) v Chungově krysím modelu.
Obrázek 2 ukazuje práh taktilní alodynie před (čas 0) a různou dobu po bolusové injekci 14-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (ŠEQ ID NO: 2) v Chungově krysím modelu.
Obrázek 3 ukazuje součet záškubů v odpovědi na formalin po intraperitoneálním podání 14-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) nebo salinického roztoku u diabetických krys.
• 4
44
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu, ve které je subjektu podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Jak je zde popsáno, způsob podle předkládaného vynálezu může zmírnit neuropatickou bolest během 30 minut po podání. Takový způsob j e vhodný pro zmírnění neuropatické bolesti vznikající v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové.
Peptid použitelný v předkládaném vynálezu je odvozen od prosaposinu, což je protein o 517 aminokyselinách, který byl původně identifikován jako prekursor čtyř sfingolipidových aktivátorových proteinů (Kishimoto et al., J. Lipid Res. 33: 1255 - 1267 (1992)). Čtyři sousedící tandemové domény prosaposinu jsou proteolyticky zpracovávány v lysozomech za vzniku saponinů A, B,
C a D, které aktivují hydrolýzu glykosfingolipidů lysozomálními hydrolázami (0'Brien and Kishimoto, FÁSEB J., 5: 301 - 308 (1991)).
Nezpracovaná forma prosaposinu je nacházena ve vysokých koncentracích v mozku lidí a krys, kde je lokalizována v povrchových membránách neuronů. Během embryonálního vývoje je prosaposinová mRNA hojně nacházena v mozku a v gangliích zadních kořenů míšních. Dále, prosaposin se váže s vysokou afinitou na gangliosidy a podporuje přenos gangliosidů z micel do membrán.
Neurotrofická aktivita prosaposinu je v souladu s jeho lokalizací na populaci neuronálních buněk (0'Brien et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 9593 - 9596 (1994); Sáno et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 994 - 1000 (1994)).
Prosaposin stimuluje růst motorických neuritů in vitro a in vivo
♦ · · ··· · · • · · • · · · • · ·· a zvyšuje aktivitu acetyltransferasy, která je markérem neuronální diferenciace. Kromě toho, prosaposin zabraňuje buněčné smrti u neuroblastomových buněk (O'Brien et al., výše, 1994;
0’Brien et al,, FASEB J., 9: 681 - 685 (1991)).
Neurotrofická aktivita prosaposinu je lokalizována na saponinu C, doméně o 8Ό aminokyselinách. 22-mer peptid odpovídající aminokyselinám 8 až 29 doméně saponinu C (SEQ ID NO: 1) stimuluje růst neuritů a zvyšuje aktivitu acetyltransferasy a zabraňuje buněčné smrti u neuroblastomových buněk (0'Brien et al., výše, 1995).
Prosaposin nebo 22-mer peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 1), například, může modulovat funkci motorických neuronů podporou růstu neuritů. Před předkládaným vynálezem nebylo nicméně známo, zda prosaposin nebo peptidové fragmenty prosaposinu mohou ovlivňovat funkci sensorických neuronů. Kromě toho, neurotrofická aktivita prosaposinu nebo peptidu odvozeného od prosaposinu ve stimulaci růstu motorických neuritů je zřetelná pouze po době 24 až 48 hodin (viz například O'Brien et al., výše, 1994). Neurotrofická aktivita prosaposinu nebo peptidu odvozeného od prosaposinu nebyla prokázána během kratšího časového období.
Oproti tomu, předkládaný vynález poskytuje způsob pro zmírnění neuropatické bolesti, která obsahuje jak sensorickou, tak motorickou složku. Kromě toho, způsob podle předkládaného vynálezu je účinný při mírnění neuropatické bolesti v řádu minut, spíše než hodin nebo dní, jak to bylo dříve prokázáno jako nutné pro neurotrofickou aktivitu prosaposinu nebo peptidu odvozeného od prosaposinu.
• ··· · ·
Účinnost způsobu podle předkládaného vynálezu při mírnění neuropatické bolesti byla prokázána na dobře známém Chungově krysím modelu periferní neuropatie. V Chungově krysím modelu způsobuje částečná ligace levých spinálních nervů L5 a L6 dlouhodobou hypersensitivitu na lehký tlak na postiženou levou tlapku. Hypersensitivita je podobná bolesti u lidí s neuropatickým stavem kausalgie, jak to popisuje Kim and Chung, Pain 50: 355 - 363 (1992) .
Před podáním aktivního fragmentu prosaposinu měly krysy Chung modelu práh 3,0 až 4,0 g před ucuknutím postižené tlapky v odpovědi na tlak (Von Freyovi vlásky) (viz obrázek 1). Po podání aktivního fragmentu prosaposinu (22-mer peptidů odvozeného od prosaposinu; SEQ ID NO: 1) se neuropatická boles zmírní, jak je prokázáno vyšší tolerancí na tlak před ucuknutím postižené tlapky. Účinek aktivního fragmentu prosaposinu se dostavil během 15 minut a trval po dobu 3 hodin, jak je ukázáno na obrázku 1. Toto rychlé zmírnění neuropatické bolesti prudce kontrastuje s oddálenými neurotrofickými účinky, které byly dříve popsány pro prosaposin a peptid odvozený od prosaposinu.
Aktivní fragment prosaposinu jako je peptidů odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 také mírni bolest v krysím modelu bolestivé diabetické neuropatie. Jak je popsáno v příkladu 3, peptid SEQ ID NO: 2 redukoval alodynii u krys s krátkodobým insulin-deficientním diabetem indukovaným toxinem selektivním pro β-buňky, streptazotocinem. Proto může být aktivní fragment prosaposinu nebo peptid odvozený od prosaposinu podle předkládaného vynálezu použit ke zmírnění mnoha typů neuropatické bolesti, včetně mechanické bolesti, jak je doloženo Chung krysím modelem, a metabolické bolesti, jak je doloženo použitím těchto • · · · · • · 4 4 4 ··· 4 44 peptidů při redukci bolesti u krys s diabetem.
Jak je zde použito znamená termín neuropatická bolest bolest vzniklou v důsledku poškození nervu. Neuropatická bolest se liší od nociceptivní bolesti, která je způsobena akutním poškozením tkáně postihujícím drobné kožní nervy nebo drobné svalové nervy nebo nervy pojivové tkáně. Bolest způsobená nociceptivními mechanismy je obvykle omezená na dobu reparace tkáně a obyčejně ji lze mírnit dostupnými analgetickými činidly nebo opiáty, jak je to popsáno v Myers, Regional Anesthesia 20: 173 - 184, (1995).
Neuropatická bolest je typicky dlouhodobá nebo chronická a často vzniká dny nebo měsíce po počátečním akutním poranění tkáně. Neuropatická bolest může zahrnovat persistentní, spontální boles, stejně jako alodynie, což je bolestivá reakce ná stimuly, které normálně nejsou bolestivé. Neuropatická bolest může být také charakterizována hyperalgesií, při které existuje akcentovaná reakce na bolestivé stimuly, které jsou obvykle triviální, jako je například píchnutí špendlíkem. Oproti nociceptivní bolesti je neuropatická bolest obvykle resistentní na terapii opiáty (Myers, výše, 1995).
Způsob podle předkládaného vynálezu je použitelný pro zmírnění neuropatické bolesti vznikající v důsledku onemocnění periferního nervu, ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmene, thalamu nebo kůry mozkové. Termín onemocnění, jak je zde použit, znamená jakékoliv trauma, poranění, onemocnění nebo stav vedoucí ke vzniku neuropatické bolesti.
Způsob podle předkládaného vynálezu je použitelný pro zmírnění neuropatické bolesti bez ohledu na etiologii bolesti. Například, způsob podle předkládaného vynálezu může být použit pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku onemocnění periferního nervu jako je neurom; komprese nervu; rozdrcení nervu; natažení nervu nebo inkompletního naříznutí nervu; mononeuropatie nebo polyneuropatie. Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku onemocnění jako je komprese ganglií zadních kořenů míšních; zánět míchy; kontuse, nádor nebo hernísekce míchy; nádor mozkového kmene, thalamu nebo mozkové kůry; nebo trauma mozkového kmene, thalamu nebo mozkové kůry (viz například tabulka 1).
Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit, například, pro zmírnění neuropatické bolesti vzniklé v důsledku neuromu, který může snadno vzniknout po traumatickém poškození nervu, zejména pokud je celý nerv vážně rozdrcen nebo přerušen. Při neuromu je růst neuritu, který normálně regeneruje periferní nerv, aberantní nebo chybný díky, napříkjlad, fyzikální obstrukci jako je jizevnatá tkáň. Tak je regenerující nervové vlákno umístěno v prostředí, ve kterém mechanické a fyzikální faktory způsobují abnormální elektrofyziologickou aktivitu a bolest (Myers, výše, 1995) . Amputační neurom, například, může způsobovat fantomovou bolest nebo může způsobovat bolest spouštěnou použitím končetinových protés. Jak je zde popsáno, taková bolest může být zmírněna podáním aktivního fragmentu prosaposinu podle způsobu podle předkládaného vynálezu.
9
9 9 9
9 9·
999 9 9
999 99 9999
Tabulka 1
Nerv
Neurom (amputace, přerušení nervu)
Komprese nervu (svodné neuropatie, nádory)
Rozdrcení nervu, natažení nervu nebo neúplné přerušení nervu (trauma)
Mononeuropatie
Diabetes mellitus Ozáření
Ischemie Vasculitis
Polyneuropatie
Post-poliotický syndrom Diabetes mellitus Alkohol
Amyloid
Toxické
HIV
Hypotyreosa
Uremie
Deficience vitamínů
Chemoterapie (Vincristin, cis-platina, paclitaxel) ddC (zalcitabin)
Fabryho nemoc
Ganglia zadních kořenů míšních
Komprese (ploténka, nádor, jizevnatá tkáň) Odtržení kořene
Zánět (postherpetická neuralgie)
Mícha
Kontuse
Nádor
Hemisekce
Mozkový kmen, thalamus, mozková kůra Infarkt, nádory, trauma
Komprese nervu také vede ke vzniku neuropatické bolesti, která může být léčena způsobem podle předkládaného vynálezu. Komprese nervu může být náhlá, jak je tomu v případě traumatického nervového rozdrcení, nebo může být dlouhodobá a mírná, jak je tomu sekundárně při růstu nádoru nebo při tvorbě jizvy v blízkosti hlavního nervového svazku. Kompresní neuropatie může také vzniknou v důsledku změn v průtoku krve nervem, což způsobí závažnou ischemii a následné poškození nervu (Myers, výše, 1995) .
Podání aktivního fragmentu prosaposinu podle předkládaného vynálezu může také zmírnit neuropatickou bolest vznikající v důsledkumononeuropatie nebo polyneuropatie. Jak je zde použito, neuropatie znamená funkční poruchu nebo patologickou změnu v periferním nervovém systému a klinicky je charakterizována abnormalitami sensorických a motorických neuronů. Termín mononeuropatie naznačuje, že postižen je jediný periferní nerv, zatímco termín polyneuropatie naznačuje, že postiženo je více periferních nervů.
Etiologie neuropatie může být známá nebo neznámá (viz například Myers, výše, 1995; Galér, Neurology 45(supil 9): S17 S25 (1995); Stevens and Lowe, Pathológy, Times Mirror
International Publishers Limited, London (1995)). Známé etiologie zahrnují komplikace onemocnění nebo toxických stavů; například, diabetes je nej častějším metabolickým onemocněním, které způsobuje neuropatii. Způsob podle předkládaného vynálezu zmirňuje neuropatickou bolest u mononeuropatie vznikají v důsledku, například, diabetů, ozáření, ischemie nebo vaskulitidy. Způsob podle předkládaného vynálezu zmírňuje neuropatickou bolest u polyneuropatie vznikají v důsledku, například, post-poliotického syndromu, diabetů, alkoholismu, amyloidu, toxinů, HIV, hypotyreosy, uremie, deficitů vitamínů, chemoterapie, ddC nebo Fabryho nemoci (viz tabulka 1). Způsob • to • to • to . ·· ·· toto toto to to · · • to · · ·· • to · ·♦ to to to • · · · · • to· ··· ·· ·· podle předkládaného vynálezu je zejména výhodný pro zmírnění post-poliotické myalgie. Způsob podle předkládaného vynálezu může také zmírnit neuropatickou bolest neznámé etiologie.
Jak je zde popsáno, aktivní fragment prosaposinu může také být použit pro zmírnění neuropatické bolesti nebo pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici demyelinizace nebo pro inhibici sehsorické neuropatie. Termín aktivní fragment prosaposinu, jak je zde použito, znamená, že peptid má aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci prosaposinu a že má aktivitu ve zmírněni neuropatické bolesti nebo při stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici nervové demyelinizace nebo při inhibici sensorické nebo motorické neuropatie.
Jak je zde uvedeno, zmírnění neuropatické bolesti znanená redukci závažnosti neuropatické bolesti. U lidských subjektů redukuje aktivní fragment prosaposinu závažnost neuropatické bolesti, takže je utrpení subjektu zmenšeno a je zlepšena kvalita života. Aktivní fragment prosaposinu může také zmirňovat neuropatickou bolest v jakémkoliv z mnoha zvířecích modelů neuropatické bolesti, jak jsou popsány dále (viz též Bennet, Muscle and Nerve 16: 1040 - 1048 (1993)). Jak je zde použito, termín aktivní fragment prosaposinu je synonymem pro peptid odvozený od prosaposinu.
Aktivní fragment prosaposinu výhodně obsahuje aminokyselinovou sekvenci Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 3), která Odpovídá aminokyselinám 18 až 29 saponinu C. Výhodněji, aktivní fragment prosaposinu obsahuje aminokyselinovou ·♦ ·· ·· ·· · «
• · « « · · • · ·· • · · · » · ·
sekvenci Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-AspAsn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) , která odpovídá aminokyselinám 8 až 29 saponinu C nebo aminokyselinovou sekvenci Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-LeuTyr (SEQ ID NO: 2) , která odpovídá aminokyselinám 16 až 29 saponinu C, ale která byla modifikována D-alaninovou substitucí lysinu v pozici 2; substitucí lysiny alaninem v pozici 8; delecí lysinu v pozici 11 a adicí C-koncového tyrosinu (viz tabulka 2). Takové modifikace mohou být výhodné pro zlepšení stabilty peptidu nebo pro průnik přes hematoencefalickou barieru, jak je popsáno dále. Jak je zde použito, D-alanin je representován D-Ala nebo X.
Aktivní fragment prosaposinu může mít okolo 12 aminokyselin až okolo 80 aminokyselin, což je kompletní saponin C. Výhodně má aktivní fragment prosaposinu od asi 12 aminokyselin do asi 40 aminokyselin, a ještě lépe od asi 14 aminokyselin do asi 22 aminokyselin.
Tabulka 2
Peptid Sekvence SEQ ID NO:
22-mer odvozený od prosaposinu CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL l 14-mer odvozený od prosaposinu TXLIDNNATEEILY 2 12-mer odvozený od prosaposinu LIDNNKTEKEIL 3 kde X - D-alanin
Pro použití při zmírnění neuropatické bolesti u lidí je výhodné použití aktivního fragmentu lidského prosaposinu, jako je » « ·
• ·· • · ·
SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2. Nicméně, aktivní fragment odvozený od jiného savčího prosaposinu je také použitelný ve zmírnění neuropatické bolesti podle předkládaného vynálezu. Tak, například, aktivní fragment myšího prosaposinu, krysího prosaposinu, prosaposinu od morčat nebo hovězího prosaposinu jako jsou SEQ ID NO: 4 až 7, může být také použit pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu.
Aminokyselinová sekvence aktivního fragmentu lidského prosaposinu (SEQ ID NO: 1), která odpovídá aminokyselinám 8-29 saponinu C, je dobře konzervována mezi jinými druhy, jak je ukázána v tabulce 3. Konkrétně, sousedící asparoaginové (N) zbytky jsou konzervovány mezi lidským, myším, krysím, morčecím a hovězím prosaposinem. Kromě toho, leucinový (L) zbytek) je je konzervován v pozici 3 až 4 zbytky směrem k N-konci od dvou asparaginových zbytků a jeden nebo více zbytků s nábojem (kyselina asparagová (D), lysin (K), kyselina glutamová (E) nebo arginin (R)) je konzervováno v pozici 2 až 8 zbytků směrem k C-konci od dvou asparaginových zbytků. Každý z těchto dobře konzervovaných zbytků je v tabulce 3 podtržen.
Tabulka 3
Druh | Sekvence | SEQ | ID | NO: |
Člověk | CE FLVKEVTKLIDNNKTEKEIL | SEQ | ID | NO: 1 |
Myš | CQFVMNKFSELIVNNATEELLY | SEQ | ID | NO: 4 |
Krysa | COLVNRKLSELI innateell - | SEQ | ID | NO: 5 |
Morče | CEYWKKVMLLIDNNRTEEKI I | SEQ | ID | NO: 6 |
Kráva | CEFWKEVAKLIDNNRTEEEIL | SEQ | ID | NO: 7 |
Dobře konzervované sousedící asparaginové zbytky, leucinové zbytky a zbytky s nábojem popsané výše mohou být důležité pro aktivitu aktivního fragmentu prosaposinu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo při stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podpoře myelinizace nebo inhibici demyelinizace nebo při inhibici sensorické nebo motorické neuropatie.
Například, 22-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) nébo 14-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) je aktivná fragment prosaposinu, který redukuje bolestivou alodynii pozorovanou na Chungově krysím modelu periferní neuropatie, jak je to popsáno v příkladu 1 (viz obrázky 1 a 2). Naopak, mutantní 22-mer (SEQ ID NO: 8), který se odlišuje od SEQ ID NO: lv tom, že má zbytek kyseliny asparagové (D) místo prvního konzervovaného asparaginu (viz tabulka 4), nemá aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti jak je testováno za použití Chungových krys (viz přiklad 1).
Tabulka 4
Peptid | Sekvence | SEQ ID NO: | |
22-mer odvozený | od prosaposinu | CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL | 1 |
mutantní 22-mer | CEFLVKEVTKLIDDNKTEKEIL | 8 | |
14-mer odvozený | od prosaposinu | TXLIDNNATEEILY | 2 |
mutantní 14-mer | M-l | TKLIDNDKTEKEIL | 9 |
mutantní 14-mer | M-2 | TK&IDNNKTEKEIL | 10 |
kde X = D-alanin |
Aktivita peptidu ve zmírnění neuropatické bolesti může také korelovat s neurotrofickou aktivitou, například, 22-mer odvozený • ·
4 44
4 · · 4 • ·
od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) a 14-mer odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) zmírňují neuropatickou bolest a mají neurotrofickou aktivitu. Kromě toho, mutantní 22-mer (SEQ ID NO:
8) je inaktivní ve zmírnění neuropatické bolesti jak je popsáno výše a nemá neurotrofickou aktivitu, což dále naznačuje, že aktivita v mírnění neuropatické bolesti koreluje s neurotrofickou aktivitou. Mutantní 14-mer peptid M-1 (SEQ ID NÓ: 9), který má substituci druhého konzervovaného asparaginového zbytku, nemá neurotrofickou aktivitu, což naznačuje, že peptid SEQ ID NO: 9 je také inaktivní v mírnění neuropatické bolesti. Mutantní 14-mer peptid M-21 (SEQ ID NO: 10), který má substituci druhého konzervovaného leucinového zbytku, nemá neurotrofickou aktivitu, což naznačuje, že peptid SEQ ID NO: 10 je také inaktivní v mírnění neuropatické bolesti. Oproti tomu, 12-mer peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 3), který konzervované sousedící asparaginy, leucin a zbytky s nábojem, jak je popsáno výše, je aktivní jako neurotrofický faktor. Proto bude 12-mer peptid odvozený od prosaposinu (SEQ ID NO: 3) také mírnit neuropatickou bolest ve způsobu podle předkládaného vynálezu.
Peptidy odvozené od prosaposinu a jejich neurotrofické analogy, mají významné terapeutické aplikace v podpoře znovunabytí funkce po toxickém, traumatickém, ischemickém, degenerativním nebo dědičném poškození periferního nebo centrálního nervového systému. Kromě toho, tyto peptidy mohou podporovat myelinizaci nebo inhibovat demyelinizaci, což působí proti demyelinizačním onemocněním. Ještě dále, takové peptidy stimulují růst neuronů a inhibuji programovanou buněčnou smrt v neuronální tkáni. Aktivní neurotrofické a myelotrofické peptidy podle předkládaného vynálezu mají od 12 nebo 14 do asi 50 aminokyselin a výhodně obsahují nepřirozenou sekvenci prosaposinu • ··
ukázanou v SEQ ID NO: 2. Například, aktivní neurotrofické a myelotrofické peptidy podle předkládaného vynálezu mají od 14 do asi 50 aminokyselin a obsahují nepřirozenou sekvenci prosaposinu ukázanou v SEQ ID NO: 2.
V jiném provedení předkládaného vynálezu je poskytnuta metoda pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti neuronů, navození myelinizace nebo inhibici demyelinizace v diferencovaných nebo nediferencovaných neuronech, ve které je neuronům podáno účinné množství peptidu podporujícího růst neuritů nebo myelinizaci, který má od 12 do 50 aminokyselin a výhodně obsahuje peptid ukázaný v SEQ ID NO: 2. V metodách předkládaného vynálezu pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti neuronů, navození myelinizace nebo inhibici demyelinizace, může být použito účinné množství peptidu, který má od 14 do 50 aminokyselin a výhodně obsahuje peptid ukázaný v SEQ ID NO: 2,
Schopnost jakéhokoliv peptidu stimulovat růst neuritů, inhibovat smrt neuronů, navodit myelinizaci nebo inhibici demyelinizace, může být odborníkem v oboru snadno určena za použití postupů popsaných v příkladu 4 a 7. Způsoby pro testování schopnosti takových peptídů navozovat myelinizaci nebo inhibovat demyelinizaci jsou uvedeny v příkladech 6 a 7, dále.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro inhibici sensorické neuropatie, při kterém jsou neurony uvedeny do kontaktu s kompozicí obsahující účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Vynález obsahuje, například, způsob pro inhibici sensorické neuropatie, při kterém jsou neurony uvedeny do kontaktu s kompozicí obsahující účinné množství peptidu majícího sekvenci podle SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2.
Jak je popsáno v příkladu 10, peptidy odvozené od prosaposinu mohou být užitečné v inhibici sensorické neuropatie. V myším modelu, ve kterém je sensorická neuropatie indukována podáním taxolu, je běžně pozorována ztráta citlivosti na teplo. Nicméně, pokud dostaly taxolem léčené myši 100 /zg/kg peptidu podle SEQ ID NO: 1, tak byla ztráta tepelné citlivosti inhibována. Tyto výsledky naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu mohou působit jako neurotrofický faktor jak pro sensorické, tak pro motorické neurony.
Peptidy použitelné ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou mít, například, SEQ ID NO: ll až SEQ ID NO: 19 (viz tabulka 5). Například, seřazení sekvence 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu se SEQ ID NO: 1 s cytokiny a růstovými faktory naznačuje, že existuje podobnost sekvence s mnoha lidskými (h) cytokiny včetně hCNTF, hIL-6, h-IL2, hIL-3, hIL-1-τ, erytropoetinu (hEPO), lidského leukocytárního inhibičního faktoru (hLIF), β-řetězce lidského IL-1 a onkostatinu-M (hONC-M). SEQ ID NO: 11 až 19, podobně jako aktivní fragment prosaposinu se SEQ ID NO: 1, obsahují dva asparaginové zbytky, kterou sousedí, nebo které jsou separovány jednou aminokyselinou. Kromě toho, od cytokinů odvozené peptidové sekvence mohou obsahovat leucin (L) nebo izoleucin (I) tři až čtyři zbytky směrem k N-konci od dvou asparaginů a jeden nebo více zbytků s nábojem (kyselina asparagová (D) , lysin (K) , kyselina glutamová (E) nebo arginin (R)) dva až osm zbytků směrem k C-konci od dvou asparaginů, stejně jako v aktivním fragmentu prosaposinu (22-mer; SEQ ID NO: 1). Každý z těchto zbytků je v tabulce 5 podtržen.
Modely vazby cytokinů na receptor (Sprang and Bazan, Gurr. Opin. Struct. Biol. 3: 816 (1993)) mají zvýrazněnou evoluční • · · • · · φ · · · • · « • · « « · · · · • · · ··» konzervaci 4-šroubovicové struktury společné pro mnoho cytokinů. Každá sekvence cytokinů nebo růstového faktoru příbuzná sekvenci SEQ ID NO: 1 odvozené od prosaposinu je umístěna mezi šroubovicí A a B (AB smyčka) nebo v šroubovicí C cytokinů.
Tabulka 5
Cytokin | Sekvence | Umístění | SEQ ID NO: |
Prosaposin | CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL | ---.--- | 1 |
hCNTF | YVKHQGLNKNINLDSVDGVP | AB smyčka | 11 |
hIL-6 | EALAENNLNLPKMAG | AB smyčka | 12 |
hIL-2 | LQMILNGINNYKNPKLT | AB smyčka | 13 |
hlL-3 | ILMENNLRRPNL | AB smyčka | 14 |
hIL-Ιτ | FYLRNNQLVAGTL | AB smyčka | 15 |
hEPO | AEHCSLNENITVPDTKV | AB smyčka | 16 |
hLIF | YTAQGEPFPNNVEKLCAP | AB smyčka | 17 |
hIL-lS | FNKI EINNKLEFESA | Šroubovice | C 18 |
hONC-M | RPNIGLRNNIYCMAQLL | Šroubovice | C 19 |
Strukturálně příbuzné cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být také užitečné ve způsobech pro zmírnění neuropatické bolesti. Peptidy podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být testovány na aktivitu při mírnění neuropatické bolesti, za použití, například, Chung krysího modelu popsaného v příkladu 1; modelu diabetické neuropatie popsaného v příkladu 3; testů popsaných Wall et al., Pain 7: 103 - 113 (1979); Bennett and Xie, Pain 33: 87 - 107 (1988); Lekán et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18: 287 (1992) nebo Palácek et al., Soc. Neurosci. Abstr. 18: 287 (1992); nebo jiných « · · · · « · · · · 9 9 • 999 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9
999 9 9 999 9 99
testů pro neuropatickou bolest.
Cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů podle SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 mohou být také užitečně ve způsobech pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, podporu myelinizace a inhibici nervové demyelinizaee nebo ve způsobech pro inhibici sensorické nebo motorické neuropatie. peptid mající od asi 14 do asi 50 aminokyselin a obsahující aktivní neurotrofický region obsažený v jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 11 až SEQ ID NO: 19 může být testován na svou schopnost stimulovat růst neuritů jak je popsáno v příkladu 4; inhibovat smrt nervových buněk, jak je popsáno v příkladu 5; podporovat myelinizaci jak je popsáno v příkladu 6; nebo inhibovat demyelinizaci jak je popsáno v příkladu 7; nebo může být testován na svou schopnost inhibovat sensorickou neuropatii jak je popsáno v příkladu 10.
Aktivní fragment prosaposinu nebo peptidu použitelného ve zmírnění neuropatické bolesti může být identifikován vyšetřováním velkého souboru, nebo knihovny, náhodných peptidů nebo určitých peptidů za použití, například, jednoho z mnoha zvířecích modelů neuropatické bolesti. Takové určité peptidy mohou být, například, cytokiny a peptidy odvozené od růstových faktorů, jejichž aminokyselinová sekvence je příbuzná sekvenci aktivního fragmentu prosaposinu (SEQ ID NO: 1). Určitými peptidy může být, například, populace peptidů, které mají příbuznou aminokyselinovou sekvenci k SEQ ID NO: 1, takže mají konzervované asparaginové zbytky, lecinové/izoleucinové zbytky a jeden nebo více zbytků s nábojem v pozicích odpovídajících pozicím, ve kterých se tyto zbytky nacházejí v SEQ ID NO: 1, ale které mají také jednu nebo více aminokyselin, které se liší od aminokyselin • · · · • · 4 • · · · v SEQ ID NO: 1.
Peptidové knihovny zahrnují, například, značené chemické knihovny obsahující peptidy a peptidomimetické molekuly.
Peptidové knihovny také zahrnují ty, které jsou generovány fágovou zobrazovací technologií. Fágová zobrazovací technologie obsahuje expresi peptidových molekul na povrchu fágu, stejně jako jiné postupy, pomocí kterých je nebo může být proteinový ligand asociován s nukleovou kyselinou, která ho kóduje. Metody pro produkci fágových zobrazovacích knihoven, včetně vektorů a způsobů pro rozlišení populace peptidů, které jsou exprivovány, jsou v oboru dobře známé (viz, například, Smith and Scott,
Methods Enzymol. 217: 228 - 257, (1993); Scott and Smith, Science
249: 386 - 390 (1990); a Huse WO 91/07141 a WO 91/07149). Tyto nebo jiné dobře známé metody mohou být použity pro produkci fágových zobrazovacích knihoven, ze kterých mohou být zobrazené peptidy štěpeny a mohou být testovány na aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo na další neurotrofické nebo myelinotrofické aktivity, jak je zde popsáno. Pokud je to žádoucí, může být populace peptidů testována na aktivitu a aktivní populace může být dále rozdělena a znovu testována pro izolaci aktivního peptidu z populace. Další metody pro produkci peptidů, které je možné použít v předkládaném vynálezu, zahrnují, například, racionální vývoj a mutagenesi založenou na aminokyselinové sekvenci aktivních fragmentů prosaposinu jako je SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, například.
Jak je zde popsáno, aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při zmírnění neuropatické bolesti může být identifikován podle své aktivity při mírnění neuropatické bolesti u mnoha zavedených zvířecích modelů neuropatické bolesti • · • · ·
9n9 9 « · «0 99
9 9 9 fc ·· • •fc · 9
9 9 ·* 99 (Bennett, výše, 1993). Například, aktivní fragment prosaposinu může být identifikován za použití experimentálního modelu periferní neuropatie produkované segmentální ligací míšního nervu u krys. Chung krysí model napodobuje příznaky lidských pacientů s kausalgií, nebo záchvaty bolesti způsobené poškozením periferního nervu (Kim and Chung, výše, 1992). Chirurgický zákrok podle Kim a Chunga způsobuje dlouhodobou hyperalgesii na vliv tepla a mechanickou alodynii na postižené tlapce. Jak je popsáno v příkladu 1, krysy s ligací míšního nervu provedenou podle postupu navrženého Chungem a Kimem jsou použitelné pro .identifikaci aktivního fragmentu prosaposinu pro použití při mírnění neuropatické bolesti.
Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při mírnění neuropatické bolesti může být identifikován také podle své aktivity při mírnění neuropatické bolesti v krysím modelu diabetické neuropatie. Hyperalgesie na termální, mechanické a chemické stimuly byla také popsána u diabetických krys s krátkodobým insulin-deficientním diabetem indukovaným toxiny selektivními pro β-buňky, jako je streptazocin (Calcutt et al., Pain 68: 293 - 299 (1996). Takový krysí model je representativní pro bolest pociťovanou diabetiky, u kterých mohou existovat různé aberantní pocity včetně spontánní bolesti, bolesti provokované lehkým dotykem a hyperalgesie. Krysy ošetřené streptazocinem nebo jiným selektivním toxinem pro β buňky mohou být ošetřeny požadovaným fragmentem nebo peptidem; potom je měřena odpověd na stimul jako je 0,5% formalin. Redukovaná odpověď může být použita pro identifikaci aktivního fragmentu prosaposinu nebo peptidu použitelného pro zmírnění neuropatické bolesti.
Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při · ·
9 99 »
• 9
9 9 9
99
9 9 9
9 99
999 9 9 • 9 9
9 9 9 mírnění neuropatické bolesti může být identifikován také za použití modelu neuromu podle Wall et al.. Tento dobře známý model neuropatické bolesti reprodukuje lidské příznaky pozorované po amputaci nebo přerušení nervu na nepoškozené končetině (Wall et al., výše, 1979). Jak byly uvedeno výše, neuromy se snadno tvoří po porušení nervu díky neplnohodnotnému růstu neuritových výběžků.
Model chronického konstrikčního poškození může být použit pro identifikaci prosaposinu nebo peptidu použitelného při mírnění neuropatické bolesti. Model chronického konstrikčního poškození podle Benneta a Xie, výše, 1988, je krysí model periferní neuropatie, který produkuje bolestivé poruchy podobné těm, které jsou pozorovány u lidí. V Bennetově modelu je poškození nervu vytvořeno těsnými konstruktivními ligaturami okolo krysího ischiadického nervu, což způsobí degeneraci nervu distálně od konstrukce. Kromě spontální bolesti jsou konstrikčním poškozením produkovány alodynie a hyperalgesie.
Modely neuropatické bolesti na primátech jsou také použitelné pro identifikaci prosaposinu nebo peptidu použitelného při mírnění neuropatické bolesti (viz, například, Lekán et al., výše, 1992; Palacek et al., výše, 1992).
Jak je zde použito, termín peptid, jak je použit ve vztahu k aktivnímu fragmentu prosaposinu, peptidu odvozeného od prosaposinu nebo peptidu použitelnému ve způsobech podle předkládaného vynálezu, znamená sloučeninu obsahující přirozené aminokyseliny, nepřirozené aminokyseliny nebo chemicky modifikované aminokyseliny, s podmínkou, že sloučenina si zachovává aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo jiné • · · * · · • · ·· » · » • · » ·· · · · ♦ · ·« 99
99 9 9 9 9
9 9 9 99 • 9 · · 4 9 9 9 · 9 9 9 ··· · ·· 9 9 99 neurotrofické nebo myelinotrofické aktivity zde popsané. Peptidem odvozeným od prosaposinu může být také falešný peptid, který má non-aminokyselinovou chemickou strukturu, která napodobuje pepti odvozený od prosaposinu a zachovává si aktivitu. Takový falešný peptid je charakterizován tím, že vykazuje podobné fyzikální charakteristiky, jako je velikost, náboj a hydrofobicita, jako je peptidový protějšek odvozený od prosaposinu. Specifickým příkladem falešného peptidů je sloučenina, ve které jsou amidové vazby mezi jednou nebo více aminokyselinami nahrazeny, například, vazbou uhlík-uhlík nebo jinou vazbou dobře známou v oboru {viz například Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington (1995)).
Jak je zde použito, termín aminokyselina označuje jednu z dvaceti přirozených aminokyselin, včetně, pokud není jinak uvedeno, L-aminokyselin a D-aminokyselin. Termín aminokyselina také označuje sloučeniny jako jsou chemicky modifikované aminokyseliny včetně analogů aminokyselin, přirozených aminokyselin, které nejsou obvykle inkorporovány do proteinů jako je norleucin, a chemicky syntetizovaných sloučenin mající vlastnosti charakteristické pro aminokyseliny, s tou podmínkou, že sloučenina může být substituována v peptidů tak, že si zachovává svou biologickou aktivitu. Například, glutamin může být aminokyselinovým analogem asparaginu, s tou podmínkou, že může být substituován v aktivním fragmentu prosaposinu, který si zachovává aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti nebo jiné neurotrofické nebo myelinotrofické aktivity zde popsané. Další příklady aminokyselin a analogů aminokyselin jsou uvedeny v Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academie Press, Inc., New York (1983). Aminokyselinou také může být falešná aminokyselina, což je struktura, která vykazuje v · · • 00 · 0 0 00 0 0 0 0
0 0 «Μ0 0 0 · 0
0 0 ·
0 00 0 000 0 0
0 0 0 0 <0 podstatě stejné prostorové rozložení funkčních skupin jako aminokyselina, ale nemusí nutně mít ani α-amino, ani a-karboxylovou skupinu charakteristickou pro aminokyselinu.
Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný při mírnění neuropatické bolesti může být izolován nebo syntetizován za použití způsobů v oboru dobře známých. Takové způsoby zahrnují rekombinantní DNA metody a metody chemické syntesy pro produkci peptidů. Rekombinantní metody pro produkci peptidů pomocí exprese sekvence nukleových kyselin kódující peptid ve vhodné hostitelské buňce jsou v oboru dobře známé a jsou popsány, například, v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, svazek 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).
Aktivní fragment prosaposinu nebo peptid použitelný podle předkládaného vynálezu může být také produkován chemickou syntesou, například metodou syntesy peptidů na pevné fázi podle Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964). Standartní metody roztoků mohou být také použity pro syntesu peptidů podle předkládaného vynálezu (viz například Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Veřlag, Berlin (1984) a Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Nově syntetizovaný peptid může být přečištěn, například, kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) a může být charakterizován, například, pomocí hmotnostní spektrometrie nebo analýzy aminokyselinové sekvence.
Je jasné, že na aktivním fragmentu prosaposinu mohou být provedeny limitované modifikace, bez ovlivnění jeho funkce. Proto, modifikace aktivního fragmentu prosaposinu, které neruší • »· « « 9
9 99
9 9-9 · 9
9-9 9 9 9
jeho schopnost zmírňovat neuropatickou bolest, spadají do definice aktivního fragmentu prosaposinu. Modifikace mohou obsahovat, například, adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků; substituce sloučenin, které napodobují aminokyselinovou strukturu nebo funkci; a adice chemických skupin jako je amino nebo acetylová skupina. Aktivita modifikovaného peptidů v mírnění neuropatické bolesti může být testována za použití zvířecího modelu neuropatické bolesti, jako jsou modely popsané výše nebo v příkladu 1.
Zejména výhodná modifikace aktivního fragmentu prosaposinu je taková, která způsobuje, například, zvýšenou stabilitu, například, inkorporace jedné nebo více D-aminokyselin nebo substituce nebo delece lysinu může zvyšovat stabilitu aktivního fragmentu prosaposinu ochranou před degenerací peptidů.
Například, jak je zde popsáno, 14-mer odvozený od prosaposinu, podle SEQ ID NO: 2, má aminokyselinovou sekvenci odvozenou od aminokyselin 16 aš 29 saponinu C, ale modifikovanou substitucí nebo delecí každého ze tří přirozeně se vyskytujících lysinů a adicí C-koncového tyrosinu. Konkrétně, 14-mer odvozený od prosaposinu, podle SEQ ID NO: 2, má substituci D-alaninu za lysin v pozici 2; substituci alaninu za lysin v pozici 8 a deleci lysinu v pozici 11. Substituce D-alaninu v pozici 2 způsobuje zvýšenou stabilitu ochranou peptidů před degradací endoproteasami, která je v oboru dobře známá (viz například strana 247 Partgridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York, (1991)). Substituce nebo delece lysinu způsobuje zvýšenou resistenci na proteasy podobné trypsinu, jak je v oboru dobře známo (Partridge, výše, 1991). Tyto substituce zvyšují stabilitu a, z toho důvodu, biodostupnost peptidů podle SEQ ID NO: 2, ale neovlivňují aktivitu ve zmírnění neuropatické bolesti.
• · to tototo to« to · to · • #«« « « to ·« • to toto • ·
Použitelné modifikace také mohou být ty, které napomáhají prostupu peptidu přes hematoencefalickou barieru, jako jsou modifikátory, které zvyšují lipofilii nebo snižují vodíkovou vazbu. Například, adice tyrosinu na C-konec peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) zvyšuje hydrofobnost a permeabilitu přes hematoencefalickou barieru (viz například Banks et al., Peptides 13: 1289 - 1294 (1992) a Partridge, výše, 1991). Chierický produkt peptid-farmaceutické činidlo , které zvyšuje biologickou stabilitu nebo zvyšuje permeabilitu přes hematoencefalickou barieru, například, může být také použitelný ve způsobech podle předkládaného vynálezu.
Odborník v oboru může snadno testovat schopnost aktivního fragmentu prosaposinu překonávat hematoencefalickou barieru in vivo, například, jak je popsáno v Příkladu 2. Kromě toho, aktivní fragment prosaposinu může být testován na svou schopnost překonávat hematoencefalickou barieru za použití in vitro modelu hematoencefalické bariery založeném na systému kultury endotelových buněk mozkových mikrokapilár, například jak je to popsáno v Bowman ^t al., Ann. Neurol. 14: 396 - 402 (1983) nebo Takahura et al., Adv. Pharmacol. 22: 137 - 165 (1992).
Jak je zde použito, znamená termín účinné množství množství aktivního fragmentu prosaposinu použitelné pro zmírnění neuropatické bolesti nebo pro prevenci neuropatické bolesti. Účinné množství může být podáno systémově denně za základě tělesné hmotnosti subjektu. Výhodně, účinné množství, které bude podáno systémově denně, bude okolo 0,1 £ig/kg do asi 1000 Mg/kg. Výhodněji, účinné množství, které bude podáno systémově denně, bude okolo 10 Mg/kg do asi 100 M9/kg. Účinné množství peptidu pro zmírnění nebo pro prevenci bolesti může být určeno empiricky za
• ft ft · • · ··· «
« ft
2Ί ·· • ft ft • ftftft • ft ft ♦ »»· 9 9 • · «· použití metod dobře známých v oboru, včetně, například, testu popsaného v příkladu 1 nebo testů popsaných výše, včetně testů na primátech (Lekán et al., výše, 1992 a Palacek et al., výše,
1992) .
Typické minimální množství peptidů podle předkládaného vynálezu pro neurotrofickou a myelotrofickou aktivitu v buněčném kultivačním mediu je alespoň 5 ng/ml. Toto množství nebo vyšší množství peptidu podle předkládaného vynálezu může být použito pro použití in vitro. Typicky mohou být použity koncentrace peptidu podle předkládaného vynálezu v rozmezí od 0,1 £tg/ml do asi 10 /zg/ml. Účinné množství pro léčbu určité tkáně může být určeno tak, jak je uvedeno v příkladech 4 a 6.
Nervové buňky mohou být ošetřeny in vitro nebo ex vivo přímým podáním peptidu podle předkládaného vynálezu k buňkám. Toto může být provedeno, například, kultivací buněk v kultivačním mediu vhodném pro určitý typ buněk a následným přidáním peptidu do media. Když jsou nervové buňky ošetřeny in vivo, jak tomu typicky je u obratlovců, výhodně savců, tak může být peptid podle předkládaného vynálezu podán jednou z několika technik popsaných dále.
Jak je zde použit, označuje termín subjekt obratlovce, výhodně savce, a zejména, člověka.
Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro zmírnění bolesti, stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, navození myelinizace a inhibici demyelinizace a způsoby pro inhibici sensorické a motorické neuropatie, ve kterých je podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu intravenosně, • · «
*· ♦ φ · · · • •Φ « ♦ 9 9 ♦ 9
9 9 9
999 99 999 9
9 9
9
999 9 9 9
9 intramuskulárně, intradermálně, subkutánně, intrakraniálně, intracerebrospinálně, lokálně, orálně, transdermálně, transmukosálně nebo intranasálně. Spolu s aktivním fragmentem prosaposinu může být podán farmaceuticky přijatelný nosič dobře známého typu. Takové nosiče zahrnují, například, fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS).
Výhodně je účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu injikováno přímo do krve subjektu. Například, pro podání aktivního fragmentu prosaposinu do periferního nebo centrálního nervového systému může být použita intravenosní injekce, protože jodem značený od prosaposinu odvozený 18-mer Tyr-Lys-Glu-ValThr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO: 20), skládající se z aminokyselin 12 až 29 22-mer odvozeného od prosaposinu SEQ ID NO: 1 se substitucí tyrosinu za valin v aminokyselinové pozici 12 (MW = 2000) překonává hematoencefalickou barieru a vstupuje do centrálního nervového systému jak je popsáno v příkladu 2. Vychytávání v mozku bylo asi 0,03%, což je střední hodnota pro peptidy přibližně této velikosti, které překonávají hematoencefalickou barieru (Banks et al., výše, 1992) .
Často může být žádoucí orální podáni, za podmínky, že aktivní fragment prosaposinu je modifikován tak, aby byl stabilní vůči degradaci v gastrointestinálním traktu a aby byl snadno absorbovatelný. Substituce, například, jedné nebo více D-aminokyselin může způsobit zvýšenou stabilitu peptidu odvozeného od prosaposinu podle předkládaného vynálezu.
Pro podání účinného množství aktivního fragmentu prosaposinu do periferního nebo centrálního nervového systému subjektu může
AA • · AAA • A A
A ·
A A A w τ» w
A A A A A · AA ··· · ·
A A A
AA AA být také použita přímá intrakraniální injekce. Kromě toho, aktivní fragment prosaposinu může být podán do periferní nervové tkáně přímou injekcí nebo lokální aplikací nebo systémovým podáním. Také jsou předpokládány různé konvenční způsoby podání, včetně intravenosního, intramuskulárního, intradermálního, subkutáního, intrakraniálního, epidurálního, lokálního, orálního, transdermálního, transmukosálního a intranasálního podání.
Aktivní fragment prosaposinu může být podán také v přípravku se zpomaleným uvolňováním. Aktivní fragment prosaposinu se zpomaleným uvolňováním má tu výhodu, že mírní neuropatickou bolest po prodlouženou dobu bez potřeby opakovaného podání aktivního fragmentu.
Zpomalené uvolňování může být provedeno například pomocí ma teriálu zpomalujících uvolňování, jako jsou oplatky, imunokorálky, mikropumpy nebo jiné materiály, které umožňují kontrolované zpomalené uvolňování aktivního fragmentu prosaposinu. Takové materiály pro zpomalené uvolňování jsou dobře v oboru známé a jsou dostupné z komerčních zdrojů (Alza Corp., Palo Alto CA; Depotech, La Jolla, CA; viz též Pardoll, Ann. Rev. Immunol. 13: 399 - 415 (1995). Kromě toho, bioerodovatelné nebo biodegradovatelné materiály, které mohou být formulovány s aktivním fragmentem prosaposinu, jako je kyselina polymléčná, kyselina polygalaktonová, regenerovaný kolagen, mnoholamelární liposomy nebo jiné běžné depotní formulace, mohou být implantovány pro zpomalené uvolňování aktivního fragmentu prosaposinu. také se v předkládaném vynálezu předpokládá použití infusních pump, systémů s vychytáváním v matrici a transdermálních systémů pro podání léčiva.
·♦ • ··
Aktivní fragment prosaposinu může být také výhodně uzavřen v micelách nebo liposomech. Technologie obalení v liposomech je v oboru dobře známá. Liposomy mohou být zaměřeny na specifické tkáně, jako je nervová tkáň, pomocí receptorů, ligandů nebo protilátek schopných vazby na cílovou tkáň. Příprava takových přípravků je v oboru dobře známá (viz, například, Pardridge, výše, 1991, a Radin a Metz, Meth. Enzymol. 98: 613 - 618 (1983)).
Peptidový přípravek podle předkládaného vynálezu může být zabalen a podáván v jednotkové dávkové formě, jako je injikovatelný přípravek nebo přípravek pro lokální podání, v dávkovém množství ekvivalentním denní dávce podané pacientovi, a pokud je to žádoucí, tak může být připraven v přípravku s kontrolovaným uvolňováním. Jednotková dávková forma může být, například, šeptem opatřená fiola obsahující denní dávku aktivního přípravku podle předkládaného vynálezu v PBS nebo v lyofilizované formě. Pro léčbu nervových onemocnění je vhodná denní systémová dávka peptidu podle předkládaného vynálezu určena na základě tělesné hmotnosti obratlovce a je v rozmezí od asi 10 do asi 100 /xg/kg, ačkoliv dávky v rozmezí od 0,1 do 1000 ptg/kg mohou také být použity. Tak, pro typické lidského pacienta o hmotnosti 70 kg bude systémová denní dávka mezi asi 7 a asi 70000 /xg/den a výhodně mezi 700 a 7000 gg/den. Denní dávka pro lokálně podaný materiál bude řádově nižší než Systémová dávka. Také se předpokládá systémové podání.
Vynález také poskytuje způsob pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu, ve kterém jsou subjektu transplantovány buňky, které jsou geneticky modifikovány tak, aby exprivovaly a secernovaly aktivní fragment prosaposinu. Transplantace poskytne kontinuální zdroj aktivního fragmentu prosaposinu a proto « ·«· * ·
Ο-ι ···*·· · « · · · ··· ·-· ·<· ··· ·* ·· ♦ * · · • · ·· ··· · · • · · • · ·zmírnění neuropatické bolesti. Pro subjekt trpící dlouhodobou bolestí má takový způsob tu výhodu, že se ruší nebo je redukována potřeba opakovaného podávání aktivního fragmentu prosaposinu.
Za použití způsobů v oboru dobře známých může být buňka snadno transfektována expresním vektorem obsahujícím aktivní fragment prosaposinu (Chang, Sómatic Gene Therapy, CRC Press, Boča Raton (1995)). Například, po transplantaci do mozku transfektovane buňky exprivují a secernují aktivní fragment prosaposinu a tak zmírňují neuropatickou bolest. Takový způsob může být použit pro zmírněni neuropatické bolesti jak je popsáno pro transplantaci buněk, které secernují substance s analgetickými vlastnostmi (viz například Czech a Sagen, Proč. Neurobiol. 46: 507 - 529 (1995)).
Buňkou může být jakákoliv buňka, která přežívá, je-li transplantována a která může být modifikována tak, aby exprivovala a secernovala aktivní fragment prosaposinu. V praxi by měla být imunologicky kompatibilní se subjektem. Například, konkrétní použitelnou buňkou je buňka izolovaná z léčeného subjektu, protože taková buňka je imunologicky kompatibilní se subjektem.
Buňka izolovaná ze zdroje jiného než je léčený subjekt může být také použita, pokud je chráněna před imunologickou rejekcí, například, uložením do mikrokapsle nebo imunosupresí. Použitelné materiály pro membrány mikrokapslí zahrnují alginat-poly-L-lysin-alginat a agarosu (viz například Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boča Raton (1993; Tai a Sun, FASEB J. 7: 1061 (1993); Liu et al., Hum. Gene Ther. 4: 291 (1993); a Taniguchi et al., Transplant Proč. 24: 2977 (1992)). Například, redukce bolesti
4 *» 4 4 | 4 4 | 4 4 | |
4 44 4 4 4 4 · | 4 4 4 | ||
9 4 | 99 | 4*4 | 4 4 |
• 4 4 · • · 44
999 4 · • 4 * » 44 může být dosažena za použití buněk obalených polymerem, které jsou transplantovány do subarachnoidálnímho prostoru míchy u krysy (Wang et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 235 (1991)).
Pro léčbu lidských subjektů mohou být buňky lidské buňky, ačkoliv použitelné mohou být také ηθη-lidské savčí buňky. Konkrétně, lidské fibroblasty, svalové buňky, gliální buňky, prekursorové buňky neuronů nebo neurony mohou být transfektovány expresním vektorem tak, aby exprivovaly a secernovaly aktivní fragment prosaposinu podle SEQ ID NO: 1. Primární fibroblasty mohou být získány, například, z kožní biopsie od léčeného subjektu a mohou být udržovány za standartních podmínek pro kultivaci tkání. Pro transplantaci lze také použít svalových buněk. Předpoklady pro transplantaci do nervového systému jsou popsány, například, v Chang, výše, 1995.
Buňka odvozená z centrálního nervového systému může být zejména užitečná pro transplantaci do centrálního nervového systému, protože přežití takových buněk je zvýšeno v jejich přirozeném prostředí. Prekursorové buňky nervového systému jsou zejména užitečné ve způsobu podle předkládaného vynálezu, protože prekursorové buňky nervového systému mohou být kultivovány v kultuře, mohou být transfektovány expresním vektorem a mohou být vloženy do jedince, kde jsou integrovány. Izolace prekursorových buněk nervového sytému, které jsou schopné proliferace a diferenciace na neurony a glie, je popsána v Refranz et al., Cell 66: 713 - 729 (1991).
Způsoby pro transfekci buněk ex vivo jsou v oboru dobře známé (Kriegler , Gene Transfer and Exprešion: A Laboratory Manual,
W.H. Freeman and Co., New York, (1990)). Pro transfekci buněk, • ·· ·· · 4 4 4 •44 4 · 4 4 4 4
4·· · ·· ··· · ·
4 · 4 4 4 · které pokračují v dělení, jako jsou fibroblasty, svalové buňky, gliální buňky nebo prekursorové buňky neuronů, je výhodný retrovirový vektor. Pro transfekci expresního vektoru do postmitotických buněk, jako je neuron, je výhodný vektor replikace-deficientního herpes simplex viru typu - 1 (HSV-1) (During et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 140 (1991); Sable et al., Soc. Neurosci. Abstr. 17: 570 (1991)).
Nukleová kyselina kódující aktivní fragment prosaposinu může být exprivována pod kontrolou jednoho nebo více promotorů, které jsou v oboru dobře známé, včetně konstitutivního promotoru nebo indukovatelného promotoru. Viz například Chang, výše, 1995. konkrétním vhodným konstitutivním promotorem pro vysokou hladinu exprese je dlouhý koncový opakující se usek viru Moloney myší leukemie (MLV-LTR), cytomegalovirový okamžitý časný (CMV-IE) nebo SV40 časný region (SV40).
Sekvence nukleové kyseliny kódující aktivní fragment prosaposinu je zde popsána. Například, sekvence nukleové kyseliny kódující SEQ ID NO: 1 je 5'-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTG ACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3’ (SEQ ID NO: 21) (Dewji et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8652 - 8656 (1987)). Pro přímou sekreci peptidu podle SEQ ID NO: 1 může být nukleová kyselina kódující signální sekvenci, jako je například sekvence pro β-laktamasu, operativně připojena na SEQ ID NO: 21, jak to popisuje Simon et al., J. Cell. Biol. 104: 1165 (1987).
Vynález dále poskytuje způsob pro prevenci neuropatické bolesti u subjektu, ve kterém je subjektu podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu. Způsob pro prevenci neuropatické bolesti je užitečný, například, když je aplikován před vznikem
• · · · * * ··
bolestivého podnětu, například před chemoterapií nebo před chirurgickým zákrokem, o němž je známo, že způsobuje neuropatickou bolest.
Následující příklady jsou míněny jako ilustrace, nikoliv jako omezení vynáálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Zmírnění neuropatické bolesti v Chungově krysím modelu
Tento příklad popisuje účinek bolusové intrathekální injekce aktivního fragmentu prosaposinu v Chungově pokusném modelu periferní neuropatické bolesti.
Každý ze tří peptidů byl získán v čisté formě pomocí chemické syntézy, byl rozpuštěn ve sterilním PBS a byl pufrován na neutrální pH.
Chirurgický výkon, který byl popsán dříve Kimem a Chungem, byl proveden na samcích Sprague-Dawley krys o hmotnosti 120 a 150 gramů pro indukci alodynie. Stručně, zvířata byla uvedena do anestesie halotanem; potom byly v sousedství páteře izolovány levé L-5 a L-6 míšní nervy a byly ligovány 6,0 hedvábnou suturou distálně od ganglia zadního kořene míšního. Za deset až čtrnáct dní po operační rekonvalescenci byl zaveden míšní kathetr. Pět dní po druhém chirurgickém zákroku bylo provedeno intrathekální podání léku za použití přesně zavedené mikroinjekční stříkačky připojené na míšní kathetr zavedený přes foramen magnum. Před testováním byly krysy umístěny do plastových boxů a nechaly se
9 « » 9 94
449 9 4 • · «
99 • ·· • « aklimatizovat.
Pro hodnocení 50% mechanického prahu pro uhýbavý pohyb tlapkou byl von Freyův vlas aplikován na zadní nohu mimo tlapku.
Každý z von Freyových vlasů, které jsou kalibrovány tak, aby se měnily při logaritmicky se zvyšující síle, byl přitlačen na tlapku s dostatečnou silou pro mírný ohyb na dobu přibližně 6-8 sekund. Pozitivní odpověď byla zaznamenána, pokud tlapka rychle ucukla.
Bylo zaznamenáno šest dat pro každý čas s maximálním a minimálním stimulem zaznamenaným pro každý čas. Výsledný charakter odpovědi byl zanesen do tabulky a byl vypočítán 50% práh odpovědi. Grafy ukazují odpověď na ukázanou dávku peptidu podaného jeko jediná intrathekální bolusová injekce. Osa X ukazuje čas po injekci, ve kterém byla měřena hypersensitivita na tlak na tlapku.
Všechny chirurgicky poškozené krysy vykazovaly taktilní alodyrtii před injekcí aktivního fragmentu prosaposinu. Jak je ukázáno v čase 0 na obrázku 1, měřený práh byl menší než 3,0 až 4,0 g za absence peptidu. Intrathekální injekce 0,7 nebo 0,07 μ$ 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) potlačila alodynii způsobem závislým na dávce. Redukce alodynie se projeví zvýšením prahové sily, protože krysy snesou vyšší sílu před tím, než ucuknou tlapkou.
Signifikantí účinek byl pozorován za 15 minut po injekci. Maximální účinek byl pozorován 120. minutu po injekci. Krysy, kterým byla injikována maximální dávka 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) stále vykazovaly signifikantně redukovanou alodynii v nejzažší testovanou dobu (180 minut). Krysy, kterým byla injikována dávka 0,007 ptg 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) nevykazovaly žádnou signifikantní redukci alodynie. Při jakékoliv koncentraci nebyly pozorovány žádné signifikantní vedlejší účinky, jako je sedace.
Schopnost 14-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2; viz tabulka 1) mírnit alodynii v Chungově krysím modelu byla také vyšetřována. Jak je ukázáno na obrázku 2, aktivní fragment prosaposinu (SEQ ID NO: 2) byl účinný v redukci alodynie. Maximální účinek 14-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2) byl pozorován za 15 až 30 minut po injekci a návrat k hodnotám před injekcí byl pozorován za 60 minut (obrázek 2).
6ádné vedlejší účinky nebyly pozorovány při použití jakékoliv testované koncentrace 14-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 2).
Mutantní 22-mer peptid (SEQ ID NO: 8), který se liší od 22-mer peptidu odvozeného od prosaposinu (SEQ ID NO: 1) tím, že obsahuje zbytek kyseliny asparagové místo asparaginu (viz tabulka 4) byl také testován na svou aktivitu v mírnění alodynie v Chungově krysím modelu. Po injekci 17,5 pg mutantního 22-mer peptidu (SEQ ID NO: 8) nebyla pozorována žádná změna v alodynické odpovědi v Chungově krysím modelu.
Normální krysy, které nepociťovaly bolest v důsledku chirurgické léze provedené podle Chungova modelu, také dostaly injekci aktivního fragmentu prosaposinu (SEQ ID NO: 1) a byly také testovány na odpověď na tepelné stimuly podle postupu, který popsal Bennet a Xie, výše, 1988. Stručně, doba, za kterou krysa ucukne postiženou tlapkou od zdroje tepla je definována jako latence na horké plotně a je měřena tolerance na bolest způsobenou tepelným stimulem.
• 4 · 4 ·' . ; ·' 44 .
4
' · 4 .
·· 4 4 4 • ··
44 4 4 *
Intrathekalní katetr byl zaveden do normálních samců Sprague-Dawley krys. Pět dní po tomto chirurgickém zákroku byl krysám podán injekčně intrathekálně aktivní fragment prosaposinu (SEQ ID NO: 1). Krysy byly vyšetřovány na horké plotně; latence na horké plotně byly měřeny před injekcí a různou dobu po injekci do doby 180 minut. Nebylo pozorováno žádné signifikantní zvýšení latence na horké plotně. Proto, peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 1 neovlivňuje percepci bolesti u normálních zvířat.
Příklad 2 - In vivo vychytávání peptidů odvozených od prosaposinu v centrálním nervovém systému
Výsledky popsané v tomto příkladu naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu překonávají hematoencefalickou barieru.
18-mer peptid (SEQ ID NO: 20) skládající se z aminokyselin 12 - 29 saponinu C s tyrosinem substituovaným za valin v pozici 12 byl chemicky syntetizován na Applied Biosystems Model 430 syntezátoru peptidů. Peptid byl potom radioaktivně značen jodem za použití laktoperoxidasové metody; 20 χ 106 rpm radioaktivně značeného peptidu bylo injikováno do boltců krys1. Zvířata byla usmrcena za 1 hodinu a za 24 hodin a jejich srdce byla perfundována izotonickým salinickým roztokem pro odstranění krve z mozku.
Pro určení procenta vychytávání peptidu byl potom mozek odečítán na gamma čítači. Kromě toho byl mozek homogenizován a frakcionován na frakci bohatou na kapiláry (peletu) a frakci mozkového parenchymu (supernatant) po centrifugaci v dextranu (Triguero et al., J. Neurochem. 54: 1882 - 1888 (1990)). Tato • 9 • ·· ·· · · • ··· • · · · • · · ··· ·· · ·· ·· • · · · · * · * ··· 9 9 · 9 ·· metoda umožňuje odlišení radioaktivně značeného peptidů v cévách a v mozku. Po 24 hodinách bylo 0,017% injikovaného peptidů (SEQ ID NO: 20) detekováno v celém mozku; 75% z radiaktivní značky bylo v parenchymové frakci a 25% bylo v kapilární frakci. V 1 hodině bylo v celém mozku přítomno 0,03% injikované dávky.
Peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 byla také testován na schopnost překonávat hematoencefalickou barieru následujícím způsobem. Samice Sprague-Dawley krys byly podrobeny anestesii methoxyfluraném a přibližně 20 μ$ peptidů podle SEQ ID NO: 2 (3,2 χ 108 cpm) bylo injikováno do ocasní vény. Po 40 minutách byly krysy usmrceny anestesii etherem a byly perfundovány asi 250 ml PBS přes srdce. Celkové množství peptidů v mozku, játrech a v krvi bylo počítáno jako procento injikovaného materiálu jak je ukázáno v tabulce 6. Pro určení lokalizace v mozku byla použita metoda deplece kapilár podle Triguero et al., J. Neuróchem. 54: 1882 (1990), pro separaci mozkové tkáně na parenchymovou frakci a na mozkovou kapilární frakci. Výsledky frakcionace ukazují, že 87% peptidů SEQ ID NO: 2 přítomného v mozku bylo lokalizováno v mozkovém parenchymu, zatímco pouze 13% bylo lokalizováno v mozkových kapilárách.
Tabulka 6
Tkáň | Hmotnost | Celkem cpm ve tkáni | Procento počáteční cpm |
Mozek | 1,3 g | 161000 | 0,050 |
Játra | 8,8 g | 5,2 χ 106 | 1, 625 |
Krev | asi 22 μΐ | 1,01 x 108 | 31,6 |
V podobném pokusu, ve kterém byly krysy usmrceny po třech hodinách po ošetření peptidem podle SEQ ID NO: 2 bylo v mozku nalezeno 0,06% peptidu, z toho 85% v parenchymu. Tyto výsledky prokazují, že alespoň část peptidu odvozeného od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2 překonává hematoencefalickou barieru a koncentruje se v mozkovém parenchymu, spíše než v cévním endotelu (krevní cévy). Procento peptidu, který překonává hematoencefalickou barieru, je v mezích pro peptidy překonávající barieru, jak je uvádí Banks, výše, 1992.
Pro určení procenta intaktního materiálu v mozku, játrech a v krvi byl radioaktivně značený materiál (SEQ ID NO: 2) izolovaný z tkání analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Pro normalizaci degradace během zpracování homogenátú tkáně byl peptid SEQ ID NO: 2 přidán do homogenátú tkáně. Rozsah pozorované degradace při přidaném peptidovém materiálu byl použit pro normalizaci degradace v průběhu zpracování tkáně. Po normalizaci byly výsledky následující: SEQ ID NO: 2 byla z 60% v mozku intaktní; z asi 80% bylá intaktní v játrech a asi ze 40% byla intaktní v krvi. Ve druhém pokusu byl peptid SEQ ID NO: 2 asi z 68% v mozku intaktní.' Ty to výsledky naznačují, že peptid SEQ ID NO: 2 překonává hematoencefalickou barieru a že je v mozku z významné části intaktní.
Příklad 3 - Zmírnění neuropatické bolesti u diabetických krys
Tento příklad popisuje účinky intraperitoneálního podání peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 v krysím modelu diabetické neuropat i e.
• ·
Krysám byl způsoben diabetes jedinou intraperitoneální injekcí streptozotocinu (50 mg/kg tělesné hmotnosti, bezprostředně naředěný v 0,9% sterilním fyziologickém roztoku) pro likvidaci β-buněk slinivky břišní a pro indukci insulinové deficience jak to popisuje Calcutt et al., Pain, 68: 293 - 299 (1996). O dva dny později byl u krys, kterým byl injikován streptozotocin, potvrzen diabetes tak, že byla měřena hladina glukosy v krvi. Zvířata, kterým byl injikován stretozotocin, která měla koncentraci glukosy v krvi nižší než 15 mmol/1, byla vyloučena z dalšího pokusu, podle obecně přijímaných kriterií hyperglykemie nezpůsobené stravou ve studiích diabetů u krys.
Diabetické a kontrolní krysy byly studovány v čase 8 týdnů analýzou chování v odpovědi na škodlivou chemikálii formalin jako indikátor alodynie (Calcutt et al., výše, 1996). Stručně, krysy dostaly subkutánní injekci čerstvě připraveného formalinu (50 μΐ 0,5% roztoku ve sterilním fyziologickém roztoku) do hřbetu pravé zadní tlapky. Tato koncentrace formalinu indukuje sub.-maximální odpovědi u kontrolních krys a umožňuje detekci hyperalgesie u diabetických krys během fází Q a 2 (Calcutt et al., Eur. J. Pharmacol. 285: 189 - 197 (1995). Zvířata byla přenesena do pozorovacího boxu konstruovaného tak, aby byla umožněna trvalá vizuální kontrola tlapky. Počet ucuknutí během jedné minuty byl počítán v 5 minutových intervalech po dobu následuj ících 60 minut pozorovatelem, který neznal příslušnost každého zvířete k testované skupině. Fáze 1 byla definována jako počáteční měřeni záškubů (1-2 a 5-6 minut po injekci); Q (klidová) fáze jako měření provedené v 10-11, 15-16 a 20-21 minutě; a fáze 2 jako všechna další měření po injekci, jak bylo definováno dřivé pro studium diabetických krys (viz například Malmberg et al.,
Neurosci. Lett. 161: 45 - 48 (1993)). Srovnání aktivity během
každé fáze bylo provedeno součtem záškubů v měřeních během jedné fáze. Diabetické krysy měly abnormální odpověd záškubů, jak bylo popsáno dříve.
Peptid SEQ ID NO: 2 byl získán v čisté formě pomocí chemické syntézy, byl rozpuštěn ve sterilním PBS a byl pufrován na neutrální pH. Diabetické krysy byly rozděleny do dvou skupin po čtyřech zvířatech, kde jedné skupině byl podán peptid SEQ ID NO:
a druhé fyziologický roztok. Dvě hodiny před ošetřením 0,5% formalinem byl diabetickým krysám podán bud fyziologický roztok, nebo 200 pg/kg peptidu SEQ ID NO: 2 intraperitoneálně. Jak je ukázáno na obrázku 3, podání SEQ ID NO: 2 zcela bránilo abnormálním záškubům ve fázi 1 a mírnilo odpověd ve fázi 2 o 70%. Proto, parenterální podání peptidu SEQ ID NO: 2 zmírňuje bolest vzniklou injekcí formalinu v krysím modelu bolestivé diabetické neuropat i e.
Příklad 4 - Stimulace růstu neuritů in vitro
Tento příklad popisuje použití peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 ve stimulaci růstu neuritů in vitro.
NS20Y neuroblastomové buňky jsou kultivovány v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS). Buňky jsou odstraněny trypsinem a jsou umístěny v 30 mm Petriho miskách na skleněných krycích sklíčkách. Po 20 až 24 hodinách je medium nahrazeno 2 ml DMEM obsahujícím 0,5% fetální telepcí sérum s 0, 0,5, 1, 2, 4 nebo 8 ng/ml peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo nepravidelně promíchaný kontrolní peptid. Buňky jsou kultivovány po dalších 24 hodin, jsou promyty PBS a jsou fixovány Bouinovým roztokem (nasycený vodný roztok kyseliny pikrové/formalinu/ • · · · · · · · · · .• · · · · · · ··· · · • « · . ' · : · ··„>.· ··· ·· ·♦··· «·· ·· ·♦ kyseliny octové. 15': 5 :Ί) po dobu 30 minut. Po odstranění fixačního činidla PBS je růst neuritů hodnocen pod fázovým kontrastním mikroskopem. Buňky vykazující jeden nebo více jasně definovaných neuritů rovných nebo delších než jeden průměr buňky jsou počítány jako pozitivní z hlediska růstu neuritů. Alespoň 200 buněk je vyšetřováno v různých pozicích každé misky pro určení procenta buněk s neurity pro každý peptid testovaný dvojitě.
Peptid se sekvencí SEQ ID NO: 2 signifikantně zvyšuje růst neuritů u NS20Y buněk ve srovnání s nepravidelně promíchaným kontrolním peptidem majícím stejné aminokyseliny v jiném pořadí. Zvýšený růst neuritů je možné pozorovat i při použití koncentrace 0,5 ng/ml peptidu.
Příklad 5 - Inhibice smrti nervových buněk in vitro
Tento příklad popisuje použití peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 pro inhibici smrti nervových buněk in vitro.
NS20Y buňky jsou umístěny na plotny stejně jak je popsáno v příkladu 4 a jsou kultivovány na skleněných krycích sklíčkách v 0,5% fetálním telecím séru po dobu 2 dnů -za přítomnosti nebo za absence 8 ng/ml peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo nepravidelně promíchaného kontrolního peptidu. Medium je odstraněno a do každé jamky se přidá 0,2% trypanová modř v PBS. Mrtvé buňky se trypanovou modří barví modře a jsou počítány jako procento buněk celkem invertovanou mikroskopií, za počítání 400 buněk ve čtyřech oblastech každé jamky. Průměrná chyba ve dvojitém provedení je ± 5%. Peptid se sekvencí SEQ ID NO: 2 významně redukuje počet buněk pozitivních na barvení trypanovou modří (mrtvých buněk). Tento výsledek naznačuje, že peptid mající >0 0 0-0 0 · .00 0
0 00 0 · ·. 0.-/-- :♦· .·:·
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ; ·
-0-0- 0 -0 -0 · -·:· . -.--..0
000 00 000 «00 -0 0 . -.-00 sekvenci SEQ ID NO: 2 může inhibovat programovanou buněčnou smrt.
Příklad 6 - Test myelinizace ex vivo
Tento příklad popisuje použití peptidu majícího sekvenci SEQ ID NO: 2 pro stimulaci růstu neuritů ex vivo a pro navození myelini zace.
Mozkové explantáty z novorozených myší byly připraveny postupem, který popsal Satomi, Zool. Sci. 9: 127 - 137 (1992). Růst neuritů a myelinizace jsou pozorovány v průběhu 22 dní v kultuře, t.j. během období, kdy v mozku novorozených myší normálně probíhá neuronální diferenciace a myelinizace. Druhý den po přípravě explantátů je ke třem explantátům přidán peptid mající sekvenci SEQ ID NO: 2 v koncentraci 10 pg/ml a ke třem explantátům je přidán nepravidelně promíchaný kontrolní peptid v koncentraci 10 pg/ml. Růst neuritů a myelinizace ve třech z
kontrolních a třech ošetřených explantátech je hodnocen světelnou mikroskopií s video kamerou. V den 8 jsou kultury obsahující peptidy tenčí a více se šíří než kontrolní kultury. V den 15 obsahují kultury ošetřené peptidem SEQ ID NO: 2 mnoho buněk s dlouhými výběžky do periferie explantátů. Takové výběžky nejsou přítomné nebo nejsou ták výrazné v kontrolních kulturách. Kultury ošetřené peptidem SEQ ID NO: 2 obsahují signifikantně více mye1inizovaných axonů v subkortikální bílé hmotě v den 22, ve srovnání s kontrolními explantáty. Proto, peptid podle předkládaného vynálezu indukuje myelinizaci v diferencujícím se mozku ex vivo.
• · 4 • · · · ·
• · 4
Příklad 7 - Inhibice demye1 i nizace
Redukce Schwanových buněk je v souladu s inhibici demyelinizace. Schwanovi buňky obsahují rozsáhlé myelinové pochvy. Přidání peptidu podle SEQ ID NO: 2 ke Schwanovým buňkám v kultuře redukuje smrt Schwanových buněk způsobem závislým na dávce, což není pozorováno při použití kontrolního nepravidelně promíchaného kontrolního peptidu. Proto, peptid podle předkládaného vynálezu mající sekvenci SEQ ID NO: 2 může inhibovat demyelinizaci.
Příklad 8 - Léčba traumatických ischemických lézí GNS
Lidem s traumatickými lézerni míchy byla podána intracerebrospinálnl injekce nebo přímá injekce přibližně 100 pg/tnl peptidu podle SEQ ID NO: 2 ve sterilním fyziologickém roztoku nebo v depotní formě pro umožnění pomalého, kontinuálního podání peptidu v místě léze. Zlepšení je hodnoceno podle zlepšení funkcí motorických nervů jako je zlepšená hybnost končetin. Léčba byla opakována do té doby, dokud nedocházelo k žádným dalším zlepšením.
Příklad 9 - Léčba demye1 i ni začnich onemocnění
Pacientům, u kterých bylo diagnostikováno časné stadium MS, byl podán peptid mající sekvenci SEQ ID NO: 2 přímou intravenosní injekcí do mozkomíšního moku za použití stejných dávek, jako je uvedeno v příkladu 8. Dávky byly opakovány denně nebo jednou týdně a byla pozorována svalová síla, muskuloskeletální koordinace a myelinizace (jak je určeno MRI).
♦ -:·'· · • · · · ..· · ·· . ··
Příklad 10 - Léčba sensorické neuropatie
Myším byl podán taxol pro indukci sensorické neuropatie. Myším ošetřeným taxolem bylo podáno 100 pg/kg, 200 pg/kg nebo 1 mg/kg peptidu odvozeného od prosaposinu podle SEQ ID NO: 2. Ztráta termálního čití byla měřena za použití Hargreaves sensorického testovacího přístroje a byla použita jako indikátor sensorické neuropatie. Každá ze tří podaných dávek peptidu podle SEQ ID NO:
byla účinná v inhibici ztráty termálního čití n myší ošetřených taxolem. 22-mer peptid odvozený od prosaposinu podle SEQ ID NO: 1 byl testován podobně a bylo zjištěno, že je účinný při inhibici ztráty termálního čití u myší ošetřených taxolem. Tyto výsledky naznačují, že peptidy odvozené od prosaposinu jako jsou SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 mohou být použity pro účinnou inhibici sensorické neuropatie.
Ačkoliv byl vynález popsán ve smyslu jeho výhodných provedení, mělo by být jasné, že mohou být provedeny jeho různé modifikace bez odchýlení se od rozsahu vynálezu. Proto je vynález omezen pouze následujícími patentovými nároky.
• · ► «
··
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: The Reagents of the University of
California (ii) Název vynálezu: Způsoby použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti (iii) Počet sekvencí: 21 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Adresa: Cambpell and Flores (B) Ulice: 4370 La Jolla Village Drive, | ||
(C) | Město: San Diego | |
(D) | Země: CA | |
(E) | Stát: USA | |
(F) | ZIP: 92122 |
(v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (Dj Software: Petentln Release #1.0, verse #1.25 (vi) Data současné přihlášky:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání: 5.3.1997 (C) Klasifikace:
(viii) Zástupce/Agent - informace:
(A) Jméno: Cambpell, Cathryn A.
(B) Registrační čisio: 31815 (C) Odkaz/číslo rejstříku: FP-UD 2474 (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (619) 535-9001 (Bj Telefax: (619) 535-8949 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys 15 10 15
Thr Glu Lys Glu Ile Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění: 2 ► 4 • A (D) Jiné informace: (poznámka = Xaa je D-alanin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Thr Xaa Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu Ile Leu Tyr 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3
Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Cys Gin Phe Val Met Asn Lys Phe Ser Glu Leu Ile Val Asn Asn Ala 1 5 10 15
Thr Glu Glu Leu Leu Tyr 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Cys Gin Leu Val Asn Arg Lys Leu Ser Glu Leu Ile Ile Asn Asn Ala 15 10 15
Thr Glu Glu Leu Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Cys Glu Tyr Val Val Lys Lys Val Met Leu Leu Ile Asp Asn Asn Arg 15 10 15
Thr Glu Glu Lys Ile Ile 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Cys Glu Phe Val Val Lys Glu Val Ala Lys Leu Ile Asp Asn Asn Arg 1 5 10 15
Thr Glu Glu Glu 20
Ile Leu • ♦» · · »· ♦» ·· · ·· ·· · · · » « ·♦· » ♦ « « ·♦ • · · · · · « ·»· » * a « · · · · a » aaa aa ··· ··· ·· »· (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
cvs Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asp Asn Lys 1 5 10 15
Thr Glu Lys Glu Ile Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asp Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Thr Lys Ser Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu 1 5 10 ··· • · * ·· fcfc • · * * « ϊ ♦♦ ♦ ·-» fc · (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: ll:
Tyr Val Lys His Gin Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Val 1 5 10 15
Asp Gly Val Pro 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glv 1 5 ίο 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu 1 5 10 15
Thr (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Val Ala Gly Thr Leu 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D)' Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys 15 10 15
Val
9· • 4 4 ·
44 ·
4« 4 4 4 « • 4 * 44 « 4 444 4 4
4 4 4
444 44 44 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
Tyr Thr Ala Gin Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu Lys Leu Cys 1 5 10 15
Ala Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(ij Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ TD NO: 18:
Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu ser Ala 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin 1 5 10 15
Leu Leu ·· • · · 9
9 99 ♦ · · · ·
9 9
99 ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
Tvr Lvs Glu Val Thr rys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu 15 10 15
Ile Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 66 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
TGTGAATTCC TGGTGAAGGA GGTGACCAAG CTGATTGACA ACAACAAGAC TGAGAAAGAA
ATACTC
Claims (27)
1. Peptid odvozený od prosaposinu mající od přibližně 14 do přibližně 50 aminokyselin a obsahující sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
2. Peptid podle nároku 1, kde uvedený peptid má sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
3. Farmaceutický přípravek pro terapii nervových nebo demyelinizačních chorob v nervové tkáni obsahující peptid podle nároku 1 nebo 2 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
4. Přípravek podle nároku 3 ve formulaci s řízeným uvolňováním.
5. Přípravek podle nároku 3 ve formě liposomů.
6. Přípravek podle nároku 3 v lyofi 1 izované formě.
7. Přípravek podle nároku 3 v jednotkové dávkové formě.
8. Způsob pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství aktivního fragmentu prosaposinu subjektu.
· · · · · · · · • · 9 9 9
999 99 9; 99 9♦ množství aktivního
9 * ·· 9 9 ·'· · · « • · · · · · .
9 ··· • ··· • · * že uvedená neuropatická bolest vzniká v důsledku poruchy periferního nervu.
9. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedený aktivní fragment má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.
9 9 9
9 9999 9
9 9 99
9 9 9 9
10. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, • ·♦ ·· ·
11. Způsob podle nároku 10 vyznačuj ící se tím, že uvedená porucha periferního nervu je vybrána ze skupiny skládající se z neuromu; komprese nervu; rozdrcení nervu; natažení nervu a neúplného přerušení nervu; mononeuropatie a polyneuropat i e.
12. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedená neuropatická bolest vzniká v důsledku onemocnění vyhraného ze skupiny skládající se z onemocnění ganglií zadních kořenů míšních, míchy, mozkového kmenu, thalamu a kůry mozkové.
13. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedené podání je vybráno ze skupiny skládající se z: intravenosního, intramuskulárního, intradermálního, subkutánního, intrakraniálního, intracerebrospinálního, lokálního, orálního, transdermálního, transmukosálního a transnasálního podání.
14. Způsob pro prevenci neuropatické bolesti u subjektu vyznačující se tím, že subjektu je podáno účinné množství aktivního fragmentu prosaposinu.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený aktivní fragment má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.
16. Způsob pro zmírnění neuropatické bolesti u subjektu vyznačující se tím, že uvedenému subjektu je podáno účinné množství peptidů majícího více než 50 aminokyselin ό 7 . . . . . . . . . ....
a aa . .: A ' · *· ·· »A A At aa A a · A
AAAA . A· ’ A · A' A. AA
A A A A A A A A A A A ·
A A. A ' ' ' A A ' ···.·* A • *A AA AAA AAA AA AA a obsahujícího aktivní neurotrofický region obsažený v jedné z následujících sekvencí: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO: 19.
17. Použití peptidu majíčího více než 50 aminokyselin a obsahujícího aktivní neurotrofický region obsažený v jedné z následujících sekvencí: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 nebo SEQ ID NO: 19 pro léčbu neurotrofické bolesti.
18. Způsob pro stimulaci růstu neuritů, inhibici smrti nervových buněk, navození myelinizace nebo inhibici demyelinizace vyznačující se tím, že obsahuje krok kontaktování nervových buněk s přípravkem obsahujícím účinné stimulační nebo inhibiční množství peptidu přibližně 14 až přibližně 50 aminokyselin a obsahujícího sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
19. Způsob podle nároku 18vyznačující se tím, že uvedený přípravek obsahuje peptid mající sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
20. Způsob podle že uvedené nervové
21 . Způsob podle že uvedené nervové nároku 18vyznaču buňky jsou kontaktovány nároku lSvyznaču buňky jsou kontaktovány jící se tím, in vitro.
jící se tím, in vivo.
22. Použití peptidu podle nároku 1 nebo 2 pro léčbu nervových nebo demyelinizačnich onemocnění nervové tkáně.
23. Způsob pro inhibici sensorické nebo motorické neuropatie vyznačující se tím, že obsahuje krok kontaktování nervových buněk s přípravkem obsahujícím účinné inhibiční fragmentu prosaposinu.
nároku 23vyznačující se tím, fragment prosaposinu je peptid mající přibližně 14 až přibližně 50 aminokyselin a obsahující sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
24. Způsob podle že uvedený aktivní
25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený aktivní fragment prosaposinu je peptid mající sekvenc znázorněnou v SEQ ID NO: 2.
26. Způsob podle nároku 23 v y z n a č u j í c í se tím, že uvedené nervové buňky jsou kontaktovány in vitro.
27. Způsob podle nároku 23 vyznačuj ící se tím, že uvedené nervové buňky jsou kontaktovány in vivo.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/611,307 US6271196B1 (en) | 1996-03-05 | 1996-03-05 | Methods of alleviating neuropathic pain using prosaposin-derived peptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ283998A3 true CZ283998A3 (cs) | 1999-05-12 |
CZ297384B6 CZ297384B6 (cs) | 2006-11-15 |
Family
ID=24448513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ0283998A CZ297384B6 (cs) | 1996-03-05 | 1997-03-05 | Aktivní fragment prosaposinu a farmaceutický prípravek jej obsahující |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6271196B1 (cs) |
EP (1) | EP0929569B1 (cs) |
JP (1) | JP4138006B2 (cs) |
KR (1) | KR100507715B1 (cs) |
AT (1) | ATE340187T1 (cs) |
AU (1) | AU734566B2 (cs) |
CA (1) | CA2248139C (cs) |
CZ (1) | CZ297384B6 (cs) |
DE (1) | DE69736712T2 (cs) |
IL (1) | IL126082A0 (cs) |
NO (1) | NO984093L (cs) |
NZ (1) | NZ331757A (cs) |
PL (1) | PL187917B1 (cs) |
RU (2) | RU2266129C2 (cs) |
SK (1) | SK122898A3 (cs) |
WO (1) | WO1997032895A1 (cs) |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5571787A (en) * | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
US6849602B1 (en) * | 1996-03-05 | 2005-02-01 | The Regents Of The University Of California | Compositions for alleviating neuropathic pain with prosaposin receptor agonists |
CA2282827A1 (en) * | 1997-03-05 | 1998-09-11 | The Regents Of The University Of California | Method of alleviating neuropathic pain |
JP2001524944A (ja) * | 1997-03-05 | 2001-12-04 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア | 神経障害性疼痛の緩和方法 |
CA2284105A1 (en) * | 1997-03-24 | 1998-10-01 | John S. O'brien | Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides |
US6458357B1 (en) * | 1997-09-09 | 2002-10-01 | Myelos Corporation | Retro-inverso neurotrophic and analgesic peptides |
AU9774698A (en) * | 1997-09-09 | 1999-03-29 | Regents Of The University Of California, The | Inhibition of apoptotis using prosaposin receptor agonists |
BR9913490A (pt) * | 1998-08-28 | 2001-09-25 | Myelos Corp | Prosaposina cìclicos e seus usos |
US20020028783A1 (en) * | 1999-09-09 | 2002-03-07 | O'brien John S. | Method of stimulating prosaposin receptor activity |
USRE45976E1 (en) * | 1999-02-24 | 2016-04-19 | Tact Ip, Llc | Methods of inhibiting the action of TNF for neurological conditions by administering etanercept intrathecally |
CA2367766A1 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Myelos Corporation | Retro-inverso prosaposin-derived peptides and use thereof |
US7345019B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
US7410941B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-08-12 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Methods for treatment of neurodegenerative conditions by peripherally administered erythropoietin |
US7135461B1 (en) | 2000-06-16 | 2006-11-14 | Myelos Corporation | Retro-inverso peptides derived from interleukin-6 |
AU6540500A (en) * | 1999-06-16 | 2001-01-02 | Myelos Corporation | Retro-inverso peptides derived from interleukin-6 |
EP1183266A4 (en) * | 1999-06-16 | 2002-10-23 | Myelos Corp | INVERTED RETRO PEPTIDES DERIVED FROM LEUKEMIA INHBITION FACTOR |
US7109168B1 (en) | 2000-06-16 | 2006-09-19 | Myelos Corporation | Retro-inverso peptides derived from leukemia inhibitory factor |
WO2000077028A1 (en) * | 1999-06-16 | 2000-12-21 | Myelos Corporation | Retro-inverso peptides derived from interleukin-3 |
US20050074747A1 (en) * | 2000-09-08 | 2005-04-07 | Wadih Arap | Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (brasil) |
US7420030B2 (en) | 2000-09-08 | 2008-09-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer |
US7452964B2 (en) | 2001-09-07 | 2008-11-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues |
US20040170955A1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-09-02 | Wadih Arap | Human and mouse targeting peptides identified by phage display |
US6531121B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
US20060287240A1 (en) * | 2001-03-09 | 2006-12-21 | O'brien John S | Method of stimulating prosaposin receptor activity |
EP1418932A4 (en) * | 2001-07-18 | 2006-03-15 | Univ Texas | ANTI-ANGIOGENIC STATE IN MOUSE AND HUMAN BEINGS SUFFERING FROM CELL DEGENERATION OF THE RETINAL PHOTORECEPTOR |
US8507445B2 (en) * | 2001-09-07 | 2013-08-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer |
US20040048243A1 (en) * | 2001-09-07 | 2004-03-11 | Wadih Arap | Methods and compositions for in vitro targeting |
US7671010B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-03-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer |
WO2004016167A1 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | The General Hospital Corporation | Non-invasive functional imaging of peripheral nervous system activation in humans and animals |
US7166691B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-01-23 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Saposin C and receptors as targets for treatment of benign and malignant disorders |
US20060275274A1 (en) * | 2003-03-26 | 2006-12-07 | Daria Onichtchouk | Use of saposin-related proteins for preventing and treating obesity, diabetes and/or metabolic syndrome |
CA2520125A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-14 | Acadia Pharmaceuticals Inc. | Muscarinic m1 receptor agonists for pain management |
CN100366286C (zh) * | 2003-04-28 | 2008-02-06 | 常州南云科技有限公司 | Saposin C-DOPS:一种抗癌新药 |
US7834147B2 (en) * | 2003-04-28 | 2010-11-16 | Childrens Hospital Medical Center | Saposin C-DOPS: a novel anti-tumor agent |
US9345745B2 (en) * | 2005-04-29 | 2016-05-24 | Bo Wang | Methods for treating inflammatory disorders and traumatic brain injury using stabilized non-hematopoietic EPO short peptides |
US7964585B2 (en) * | 2006-03-14 | 2011-06-21 | Case Western Reserve University | Composition and method of treating peripheral neuropathy |
WO2009094172A2 (en) | 2008-01-22 | 2009-07-30 | Araim Pharmaceuticals, Inc. | Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage |
RU2561582C2 (ru) * | 2010-11-19 | 2015-08-27 | Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации | Инъекционная лекарственная форма олигопептидного препарата для лечения рассеянного склероза и способ ее получения |
US9327012B2 (en) * | 2011-02-23 | 2016-05-03 | Sapporo Medical University | Composition for treating, improving, or preventing pain |
RU2669692C1 (ru) * | 2017-08-14 | 2018-10-15 | Павел Андреевич Канаев | Способ получения комплекса биологически активных пептидов обладающих нейротропной активностью |
US10682411B2 (en) | 2018-03-23 | 2020-06-16 | Bexion Pharmaceuticals Inc. | Saposin C pharmaceutical compositions and methods of treating cancer |
CN111936508A (zh) | 2018-03-29 | 2020-11-13 | 横向知识产权私人有限公司 | 环肽及其用途 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU7180787A (en) | 1986-04-22 | 1987-10-29 | Salk Institute For Biological Studies, The | Fibroblast growth factor |
US5470582A (en) | 1992-02-07 | 1995-11-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles |
US5571787A (en) | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
US5700909A (en) * | 1993-07-30 | 1997-12-23 | The Regents Of The University Of California | Prosaposin and cytokine-derived peptides |
CA2282827A1 (en) * | 1997-03-05 | 1998-09-11 | The Regents Of The University Of California | Method of alleviating neuropathic pain |
CA2284105A1 (en) * | 1997-03-24 | 1998-10-01 | John S. O'brien | Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides |
-
1996
- 1996-03-05 US US08/611,307 patent/US6271196B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-03-05 JP JP53205097A patent/JP4138006B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-05 AU AU23286/97A patent/AU734566B2/en not_active Ceased
- 1997-03-05 IL IL12608297A patent/IL126082A0/xx unknown
- 1997-03-05 RU RU2003131695/14A patent/RU2266129C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 DE DE69736712T patent/DE69736712T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-05 SK SK1228-98A patent/SK122898A3/sk unknown
- 1997-03-05 NZ NZ331757A patent/NZ331757A/en active IP Right Revival
- 1997-03-05 EP EP97916005A patent/EP0929569B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-05 CA CA002248139A patent/CA2248139C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-05 KR KR1019980707151A patent/KR100507715B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 AT AT97916005T patent/ATE340187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 PL PL32870197A patent/PL187917B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 RU RU98118091/04A patent/RU2223969C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 CZ CZ0283998A patent/CZ297384B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-05 WO PCT/US1997/004143 patent/WO1997032895A1/en active IP Right Grant
-
1998
- 1998-09-04 NO NO984093A patent/NO984093L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-01-15 US US09/231,159 patent/US6268347B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2248139A1 (en) | 1997-09-12 |
RU2003131695A (ru) | 2005-04-10 |
US6271196B1 (en) | 2001-08-07 |
DE69736712T2 (de) | 2007-09-13 |
NZ331757A (en) | 1999-10-28 |
AU734566B2 (en) | 2001-06-14 |
RU2266129C2 (ru) | 2005-12-20 |
US6268347B1 (en) | 2001-07-31 |
EP0929569B1 (en) | 2006-09-20 |
CZ297384B6 (cs) | 2006-11-15 |
DE69736712D1 (de) | 2006-11-02 |
IL126082A0 (en) | 1999-05-09 |
NO984093D0 (no) | 1998-09-04 |
EP0929569A4 (en) | 2000-08-23 |
WO1997032895A1 (en) | 1997-09-12 |
JP2000506853A (ja) | 2000-06-06 |
ATE340187T1 (de) | 2006-10-15 |
AU2328697A (en) | 1997-09-22 |
RU2223969C2 (ru) | 2004-02-20 |
KR19990087686A (ko) | 1999-12-27 |
SK122898A3 (en) | 2000-02-14 |
CA2248139C (en) | 2004-05-18 |
EP0929569A1 (en) | 1999-07-21 |
JP4138006B2 (ja) | 2008-08-20 |
KR100507715B1 (ko) | 2006-05-26 |
PL328701A1 (en) | 1999-02-15 |
NO984093L (no) | 1998-11-04 |
PL187917B1 (pl) | 2004-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ283998A3 (cs) | Způsob použití peptidů odvozených od prosaposinu pro zmírnění neuropatické bolesti | |
US20050164948A1 (en) | Methods of treatment with prosaposin-derived peptides | |
JP2002523518A (ja) | 環状プロサポシン由来のペプチドおよびその使用 | |
US8765673B2 (en) | Methods for promoting wound healing and/or reducing scar formation | |
CA2282827A1 (en) | Method of alleviating neuropathic pain | |
AU2002300005B2 (en) | Method of alleviating neuropathic pain | |
US20060257869A1 (en) | Short peptides from the '2nd loop' of 7 transmembrane receptor which selectively modulate signal transduction | |
MXPA98007245A (en) | Methods to alleviate neuropathic pain using peptides derived from prosapos | |
EP0971956A2 (en) | Synthetic saposin c-derived neurotrophic peptides | |
JP2001524944A (ja) | 神経障害性疼痛の緩和方法 | |
AU2007200957B2 (en) | Methods for promoting wound healing and/or reducing scar formation | |
CN1224430A (zh) | 利用prosaposin衍生多肽缓解神经性疼痛的方法 | |
MXPA01001966A (en) | Cyclic prosaposin-derived peptides and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20080305 |