KR19990087686A

KR19990087686A - 프로사포신계 펩티드를 이용한 신경통 경감 방법

Info

Publication number: KR19990087686A
Application number: KR1019980707151A
Authority: KR
Inventors: 존 에스 오브리엔
Original assignee: 스티븐슨 린다 에스; 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 1999-12-27
Also published as: CZ283998A3; RU2266129C2; DE69736712T2; SK122898A3; AU734566B2; US6268347B1; EP0929569B1; ATE340187T1; EP0929569A4; JP4138006B2; US6271196B1; EP0929569A1; WO1997032895A1; KR100507715B1; NZ331757A; CA2248139C; AU2328697A; CZ297384B6; IL126082A0; PL187917B1

Abstract

본 발명은 프로사포신 활성 단편의 유효량을 검체에게 투여하여 검체의 신경통을 경감 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 프로사포신계 단편과, 신경돌기 분지 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진 및 수초탈락 억제를 위한 이들 단편의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 프로사포신 활성 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 뉴런 세포와 접촉시켜 감각 신경병 또는 운동 신경병을 억제하는 방법을 제공한다.

Description

프로사포신계 펩티드를 이용한 신경통 경감 방법

신경통은 신경 손상에서 발생하는 것이다. 조직 손상에 의해 일어나는 즉각적인 통증과는 반대로, 신경통은 외상 후 수일이나 수개월이 지난 후에 발생할 수 있다. 또한, 조직 손상에 의해 일어나는 통증은 보통 조직 손상 기간 동안에만 지속되지만, 신경통은 통상 장기 지속적이거나 만성적이다. 더욱이, 신경통은 보통 통증이 없는 자극과 동시에 일어나거나 또는 그 자극의 결과로서 일어날 수도 있다.

신경통의 임상적 원인은 다양하지만 외상과 질환이 있다. 예컨대, 신경통의 일반적인 원인은 외상성 신경 압박이나 압착 및 척수나 뇌에 대한 외상성 손상이다. 또한, 대부분의 외상성 신경 손상은 이상 신경 재생의 결과로서 통증을 일으키는 신경종을 형성시킨다. 또한, 암과 관련있는 신경통은 종양 성장시 인접 신경, 뇌 또는 척수가 고통스럽게 압박되어 일어난다. 신경통은 당뇨병이나 알콜 중독과 같은 질환과도 관련이 있다.

신경통은 종종 유용한 약물 치료에 대해 내성을 나타내어 바람직하지 않다. 또한, 통상의 치료법은 예컨대 인식 변화, 진정, 메스꺼움과, 최면제 경우에는 중독과 같은 심각한 부작용을 일으킨다. 신경통이 있는 대부분의 환자들은 장년층이거나 특히 유용한 약물 치료와 관련있는 부작용의 내성을 제한하는 기타 다른 질환을 갖고 있다. 과도한 부작용을 일으키지 않고 신경통을 경감시키는 현재 통용되는 치료법이 부적절하다는 것은 만성 통증 환자들의 우울증과 자살하는 추세를 볼 때 명확히 알 수 있다.

신경통을 경감시키는 방법은 외상이나 질환으로 인해 통증을 겪고 있는 많은 사람들의 삶의 질을 개선시킨다. 하지만, 진정 작용 및 중독과 같은 바람직하지 않은 부작용을 일으킴이 없이 신경통을 경감시키는 효과적인 약물은 현재 없다. 따라서, 바람직하지 않은 부작용을 일으킴이 없이 신경통을 경감시키는 방법이 필요하게 되었다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 이와 관련된 잇점을 제공한다.

본 발명은 통증(pain) 치료 분야, 구체적으로 신경통(neuropathic pain) 치료에 사용되는 프로사포신(prosaposin)계 펩티드의 용도에 관한 것이다.

도 1은 정(Chung) 모델 래트에 대하여 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)를 주입하기 전(0 시간)과 환괴로 주입한 후 여러 시간마다 측정한 촉감 이질통증의 역치를 도시한 것이다.

도 2는 정 모델 래트에 대하여 프로사포신계 14량체 펩티드(서열 번호 2)를 주입하기 전(0 시간)과 환괴로 주입한 후 여러 시간마다 측정한 촉감 이질통증의 역치를 도시한 것이다.

도 3은 당뇨병이 있는 래트에 대하여 프로사포신계 14량체 펩티드(서열 번호 2) 또는 식염수를 복강내 투여한 후 0.5% 포르말린에 대한 응답반응으로 일어나는 총 움찔함의 횟수를 도시한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 검체에게 유효량의 프로사포신 활성 단편을 투여하여 검체의 신경통을 경감시키는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 검체에게 투여한 후 30분내에 검체의 신경통을 경감시킬 수 있다. 이러한 방법은 말초 신경, 배측 신경절근, 척수, 뇌간, 시상 또는 피질의 질환으로 부터 일어나는 신경통을 경감시키는데 유용하다.

본 발명에 유용한 펩티드는 본래 4개의 스핑고리피드 활성인자 단백질[Kishimoto 등, J. Lipid Res., 33:1255-1267(1992)]의 전구체로서 동정된 바 있는 517개 아미노산으로 이루어진 단백질인 프로사포신으로부터 유도된 것이다. 프로사포신에 존재하는 4개의 인접 직렬 도메인은 리소좀에서 단백분해적으로 가공되어 사포신 A, B, C 및 D를 생성하며, 이것은 리소좀 가수분해효소에 의한 글리코스핑고리피드의 가수분해를 활성화시킨다[O'Brien and Kishimoto, FASEB J., 5:301-308(1991)].

프로사포신의 미가공 형태는 인간과 래트의 뇌에서 신경 표면 막에 편재된 상태로 고농도로 발견된다. 태아 발생동안에도, 프로사포신 mRNA는 뇌와 배측 신경절근에 풍부하다. 또한, 프로사포신은 강글리오사이드에 대하여 높은 친화도로서 결합하여 신경돌기의 분지를 자극하고 미포(微胞)로부터 막으로의 강글리오사이드의 이동을 촉진한다.

프로사포신의 향신경성 활성은 신경 세포군내에 프로사포신의 편재화와 일치한다[O'Brien 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:9593-9596(1994); Sano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204:994-1000(1994)]. 프로사포신은 시험관내 및 생체내에서 운동 신경돌기 분지를 자극하고, 뉴런 분화의 마커인 콜린 아세틸트란스퍼라제 활성을 증가시킨다. 또한, 프로사포신은 신경아세포종 세포내의 세포 사멸을 예방한다[O'Brien 등, 상기 문헌 참조, 1994; O'Brien 등, FASEB J. 9:681-685(1995)].

프로사포신의 향신경성 활성은 80개 아미노산으로 이루어진 도메인인 사포신 C에 편재한다. 사포신 C 도메인의 아미노산 8 내지 29에 상응하는 22량체 펩티드(서열 번호 1)는 신경돌기 분지 및 콜린 아세틸트란스퍼라제 활성을 자극하고 신경아세포종 세포 내에서의 세포 사멸을 예방한다[O'Brien 등, 상기 문헌 참조, 1995).

예컨대, 프로사포신 또는 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)는 신경돌기의 분지를 촉진하여 운동 뉴런 기능을 조절할 수 있다. 하지만, 본 발명 이전에는 프로사포신이나 이의 펩티드 단편이 감각 뉴런 기능에 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바 없었다. 더욱이, 운동 신경돌기 분지를 자극하는데 있어서 프로사포신이나 프로사포신계 펩티드의 향신경성 활성은 단지 24 시간 내지 48 시간 후에만 관찰할 수 있었다(예컨대, O'Brien 등, 상기 문헌 참조, 1994). 즉, 이보다 짧은 시간내에 프로사포신 또는 프로사포신계 펩티드의 향신경성 활성이 일어난다는 것은 입증된 바 없다.

이와는 대조적으로, 본 발명은 감각 및 운동 뉴런 성분을 포함하여 신경통을 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 프로사포신 또는 프로사포신계 펩티드의 향신경성 활성에 요구되는 것으로 종래 입증된 바 있는 수시간 또는 수일 보다는 약 수분내에 신경통을 경감시키는데 효과적이다.

신경통을 경감시키는 본 발명의 방법의 효과는 말초 신경병을 앓고 있는 공지의 정 래트 모델을 사용하여 입증하였다. 정 래트 모델에서, 좌 척추 신경 L-5 또는 L-6을 척추 신경 부분 결합시키면 처치된 왼발은 경압에도 장기간동안 과민증을 나타낸다. 과민증은 김과 정의 문헌[Pain 50:355-363(1992)]에 기재된 바와 같은 작열통의 신경 질환이 있는 인간이 앓는 통증과 유사하다.

프로사포신의 활성 단편을 투여하기 이전의 정 모델의 래트는 압력(폰 프레이 모)에 대한 응답 반응으로 처치된 발을 움츠리기까지 3.0 내지 4.0g의 역치를 나타내었다(도 1 참조). 프로사포신의 활성 단편(프로사포신계 22량체; 서열 번호 1)을 투여한 후, 처치된 발을 움츠리기 전까지 압력에 대한 내성의 증가로 알 수 있는 바와 같이 경감된 신경통을 확인할 수 있었다. 프로사포신 활성 단편의 효과는 도 1에 도시된 바와 같이 15분 이내에 일어났고, 투여 후 3 시간동안 유지되었다. 이와 같이 신속한 신경통의 경감은 종래 보고된 프로사포신 및 프로사포신계 펩티드의 지연된 향신경성 효과와는 완전 대조적인 것이다.

또한, 프로사포신계 펩티드(서열 서열 2) 같은 프로사포신의 활성 단편도 통증이 있는 당뇨병성 신경병을 가진 래트 모델에서 통증을 경감시켰다. 실시예 III에 기재된 바와 같이, 펩티드(서열 번호 2)는 선택적 β 세포 독소인 스트렙토조토신에 의해 유도되는 단기간 인슐린 결손 당뇨병이 있는 래트의 이질통증을 경감시켰다. 따라서, 본 발명에 기재된 프로사포신 활성 단편이나 프로사포신계 펩티드는 정 래트 모델에 예시된 바와 같은 기계적 통증 및 당뇨병이 있는 래트의 통증을 경감시키는데 상기 펩티드를 사용하는 것으로 예시된 바와 같은 대사적 통증을 비롯하여 다양한 종류의 신경통을 경감시키는데 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "신경통"이라는 용어는 신경 손상으로부터 생기는 통증을 의미한다. 신경통은 작은 피부 신경 또는 근육이나 결합 조직내 작은 신경을 비롯하여 급성 조직 손상에 의해 일어나는 외상수용성 통증과는 구별되는 것이다. 외상수용성 기작과 관련된 통증은 보통 조직 수복 기간 동안에만 나타나고, 문헌[Myers, Regional Anesthesia 20:173-184(1995)]에 기재된 바와 같이 유효 마취제 또는 아편양제제에 의해 경감된다.

신경통은 일반적으로 장기간 지속되거나 만성적이며 초기 급성 조직 손상 이후 수일이나 수개월 후에 발생하기도 한다. 신경통은 일반적으로 통증이 없는 자극에 대해 통증을 나타내는 응답 반응인 이질통증 뿐 아니라 영구적이고 자연적인 통증을 포함할 수 있다. 또한, 신경통은 핀으로 찌르는 것 같은 일반적으로는 경미한 통증을 나타내는 자극에 대해 과도한 응답 반응인 통각과민을 나타내는 것이 특징이다. 이질통증과 달리, 신경통은 일반적으로 아편양제제 치료에도 효과가 없다(Myers, 상기 문헌 참조, 1995).

본 발명의 방법은 말초 신경, 배측 신경절근, 척수, 뇌간, 시상 또는 피질의 질환으로부터 일어나는 신경통을 경감시키는데 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 "질환"이라는 용어는 신경통을 일으키는 모든 외상, 손상, 질환 또는 증상을 의미한다.

본 발명의 방법은 통증의 병인과는 무관한 신경통을 경감시키는데 유용하다. 예컨대, 본 발명의 방법은 신경종; 신경 압박; 신경 압착, 신경 신장 또는 불완전한 신경 절단; 단발신경병증이나 다발신경병증 같은 말초 신경 질환 유래의 신경통을 경감시키는데 사용할 수 있다. 또한, 배측 신경절근 압박; 척수 염증; 척수 좌상, 척수 종양 또는 척수 반절; 뇌간 종양, 시상 종양 또는 피질 종양; 또는 뇌간에 대한 외상, 시상에 대한 외상, 피질에 대한 외상 같은 질환으로부터 생기는 신경통을 경감시키는데에도 사용할 수 있다(표 1 참조).

본 발명의 방법은, 예컨대 신경에 대한 외상 손상 후, 특히 전체 신경이 심하게 압착되거나 절단된 후 쉽게 일어날 수 있는 신경종으로부터 생긴 신경통을 경감시키는데 유용하게 사용할 수 있다. 신경종에서는, 일반적으로 말초 신경을 재생시키는 신경돌기 분지가 예컨대 조직 상처 같은 물리적 장애로 인하여 변질되거나 이상유도된다. 따라서, 기계적 인자 및 물리적 인자가 비정상적인 전기생리학적 활성과 통증을 촉진시키는 환경에서 재생 신경 섬유는 뒤엉키게 된다(Myers, 상기 문헌 참조, 1995). 예컨대, 신경종 절단은 가상 통증이나 사지 인공삽입물의 사용후 야기되는 통증을 일으킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 신경통은 본 발명의 방법에 따라 프로사포신의 활성 단편을 투여함으로써 경감될 수 있다.

신경신경종(절단, 신경 절단)신경 압박(포착성 신경병증, 종양)신경 압착, 신장 또는 불완전한 절단(외상)단발신경병증진성당뇨병방사선조사허혈맥관염다발신경병증소아마비후 증후군진성당뇨병알콜아밀로이드독소HIV갑상선기능저하증요독증비타민 결핍증화학치료법(빈크리스틴, 시스플라티넘, 파클리탁셀)ddC(잘시타빈)파브리병

배측 신경절근압박(디스크, 종양, 조직 상처)근 염제염증(포진후 신경통)

척수좌상종양반절

뇌간, 시상, 피질경색, 종양, 외상

또한, 신경 압박은 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 신경통을 일으킨다. 신경 압박은 외상 신경 압착의 증상에서와 같이 돌발적이거나 또는 주 신경 속(束)의 근접 부위에 상처 형성이나 종양 성장에 부차적으로 나타나 장기 지속적이며 병의 진행이 완화적일 수 있다. 압박 신경병은 신경으로의 혈액 유동의 변화 결과로서 일어날 수 있고, 그 결과 허혈과 후속적인 신경 손상을 일으킨다(Myers, 상기 문헌 참조, 1995).

본 발명의 방법에 따라 프로사포신의 활성 단편을 투여하면 단발신경병증이나 다발신경병증으로 부터 생긴 신경통을 경감시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 신경병은 말초 신경계내의 기능적 혼란이나 병리적 변화를 의미하고 임상적으로는 감각 뉴런 이상이나 운동 뉴런 이상을 나타내는 것이 특징이다. 단발신경병증이란 용어는 하나의 말초 신경이 영향을 받은 것을 의미하고, 다발신경병증이란 용어는 복수의 말초 신경들이 영향을 받은 것을 의미한다.

신경병의 병인인자는 일부 알려진 것도 있으나, 알지 못하는 것도 있다[예컨대, Myers, 상기 문헌 참조, 1995; Galer, Neurology 45(suppl 9):S17-S25(1995); Stevens and Lowe, Pathology, Times Mirror International Publishers Limited, London(1995)]. 공지의 병인인자로는 질병이나 독성 상태의 합병증을 포함하며, 예컨대 당뇨병은 신경병을 일으키는 가장 일반적인 대사 질환이다. 본 발명의 방법은 예컨대 당뇨병, 방사선조사, 허혈 또는 맥관염으로 부터 생긴 단발신경병증의 신경통을 경감시킨다. 또한, 예컨대 소아마비후 증후군, 당뇨병, 알콜, 아밀로이드, 독소, HIV, 갑상선기능저하증, 요독증, 비타민 결핍증, 화학치료법, ddC 또는 파브리병으로부터 생긴 다발신경병증의 신경통을 경감시킨다(표 1 참조). 특히, 본 발명의 방법은 소아마비후 근육통을 경감시키는데 유용하다. 본 발명의 방법은 미지의 병인인자에 따른 신경통 역시 경감시킬 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이, 프로사포신의 활성 단편은 신경통 경감, 신경돌기 분지 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진이나 수초탈락 억제, 또는 감각 신경병의 억제에 유용하게 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "프로사포신의 활성 단편"이란 용어는 프로사포신의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지며, 신경통 경감, 신경돌기 분지 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진이나 수초탈락 억제, 또는 감각 신경병이나 운동 신경병의 억제 활성을 나타내는 펩티드를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, 신경통 경감이란 신경통의 정도를 감소시키는 것을 의미한다. 인체에 대하여, 프로사포신의 활성 단편은 검체의 고통이 경감되어 삶의 질이 개선될 정도로 신경통의 정도를 감소시킨다. 또한, 프로사포신의 활성 단편은 하기 기재되는 바와 같은 신경통에 대한 다수의 공지된 동물 모델중 어느 하나의 모델에서 신경통을 경감시킬 수 있다[Bennett 참조, Muscle & Nerve 16: 1040-1048(1993)]. 본원에 사용된 바와 같은 "프로사포신의 활성 단편"이란 용어는 "프로사포신계 펩티드"와 동의어이다.

프로사포신의 활성 단편은 사포신 C의 아미노산 18 내지 29에 상응하는 아미노산 서열 Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(서열 번호 3)을 함유하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 프로사포신의 활성 단편이 사포신 C의 아미노산 8 내지 29에 상응하는 아미노산 서열 Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(서열 번호 1)을 갖거나, 또는 사포신 C의 아미노산 16 내지 29에 상응하나 2 위치의 아미노산 Lys이 D-알라닌으로 치환되고; 8 위치의 리신이 알라닌으로 치환되며; 위치 11의 리신이 결실되고; C-말단에 티로신 잔기가 첨가된 아미노산 서열 Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr(서열 번호 2)을 갖는 것이다(표 2 참조). 이러한 변형은 하기 기재되는 바와 같이 혈뇌관문을 통한 펩티드 흡수나 안정성을 증가시키는데 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, D-알라닌은 D-Ala 또는 X로 표시할 수 있다.

프로사포신의 활성 단편은 약 12개 아미노산 내지 사포신 C의 전 길이인 약 80개 아미노산을 가질 수 있다. 바람직하게는, 약 12개 아미노산 내지 약 40개 아미노산을 가진 것이고, 보다 바람직하게는 약 14개 아미노산 내지 약 22개 아미노산을 가진 것이다.

펩티드	서열	서열 번호
프로사포신계 22량체	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	1
프로사포신계 14량체	TXLIDNNATEEILY	2
프로사포신계 12량체	LIDNNKTEKEIL	3
X는 D-알라닌임

인간 검체의 신경통 경감에 사용하기 위해서, 서열 번호 1이나 서열 번호 2와 같은 인간 프로사포신의 활성 단편이 바람직하다. 하지만, 다른 포유류 프로사포신계 활성 단편도 역시 본 발명의 방법에 따라 신경통을 경감시키는데 유용하다. 따라서, 예컨대 서열 번호 4 내지 서열 번호 7과 같은 마우스 프로사포신, 래트 프로사포신, 기니아 피그 프로사포신 또는 소 프로사포신의 활성 단편 역시 검체내의 신경통을 경감시키는데 유용하게 사용할 수 있다.

사포신 C의 아미노산 8 내지 29에 상응하는 인간 프로사포신의 활성 단편의 아미노산 서열(서열 번호 1)은 표 3에 제시한 바와 같이 기타 다른 종에서도 보존성이 큰 서열이다. 특히, 인접 아스파라긴(N) 잔기는 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그 및 소의 프로사포신중에서 보존된다. 또한, 로이신(L) 잔기는 2개의 아스파라긴의 N-말단 쪽으로 3 내지 4번째 잔기에서 보존적이고, 1개 이상의 하전을 띤 잔기[아스파르트산(D), 리신(K), 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)]는 2개의 아스파라긴 잔기의 C-말단 쪽으로 2 내지 8번째 잔기에서 보존적이다. 이와 같이 보존성이 큰 잔기들은 하기 표 3에 밑줄로 나타내었다.

종	서열	서열 번호
인간	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	1
마우스	CQFVMNKFSELIVNNATEELLY	4
래트	CQLVNRKLSELIINNATEELL-	5
기니아 피그	CEYVVKKVMLLIDNNRTEEKII	6
소	CEFVVKEVAKLIDNNRTEEEIL	7

전술한 바와 같은 보존성이 큰 인접 아스파라긴 잔기, 로이신 잔기 및 하전된 잔기는 신경통 경감, 신경돌기 분지 자극, 뉴런 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진이나 수초탈락 억제, 또는 감각 신경병이나 운동 신경병의 억제에 있어서 프로사포신 활성 단편의 활성에 중요하다. 예컨대, 프로사포신계 22량체(서열 번호 1) 또는 프로사포신계 14량체(서열 번호 2)는 실시예 I에 개시된 바와 같은 말초 신경병에 관한 정 래트 모델에서 관찰되는 고통스러운 이질통증을 감소시키는 프로사포신의 활성 단편이다(도 1 및 2 참조). 이와 반대로, 보전적인 첫 아스파라긴 대신에 아스파르트산 잔기(D)가 치환되었다는 점에서 서열 번호 1과 상이한 돌연변이 22량체(서열 8)는 정 래트를 사용하여 분석시 신경통을 경감시키는 활성이 부족하게 나타났다(실시예 I 참조).

신경통을 경감시키는데 있어서도 펩티드의 활성이 향신경성 활성과 상관될 수 있다. 예를 들어, 프로사포신계 22량체(서열 번호 1) 및 프로사포신계 14량체(서열 번호 2)는 신경통을 경감시키고, 향신경성 활성을 지닌다.

펩티드	서열	서열 번호
프로사포신계 22량체	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	1
돌연변이 22량체	CEFLVKEVTKLIDDNKTEKEIL	8
프로사포신계 14량체	TXLIDNNATEEILY	2
돌연변이 14량체 M-1	TKLIDNDKTEKEIL	9
돌연변이 14량체 M-2	TKSIDNNKTEKEIL	10
여기서, X는 D-알라닌

또한, 돌연변이 22량체(서열 번호 8)는 상기한 바와 같이 신경통을 경감시키는데 있어서 불활성이고, 향신경성 활성이 결핍되어 있는데, 이것 또한 신경통을 경감시키는데 있어서의 활성이 향신경성 활성과 상관될 수 있음을 시사하는 것이다. 제2의 보존된 아스파라긴 잔기가 치환된 돌연변이 14량체 펩티드 M-1(서열 번호 9)은 향신경성 활성이 결핍되어 있으며, 이것은 서열 번호 9의 펩티드 역시 신경통을 경감시키는 데 불활성임을 시사하는 것이다. 보존된 로이신 잔기가 치환된 돌연변이 14량체 펩티드 M-2(서열 번호 10)은 향신경성 활성이 결핍되어 있으며, 이것은 서열 번호 10의 펩티드가 신경통을 경감시키는 데 불활성임을 시사하는 것이다. 대조적으로, 보존된 인접 아스파라긴, 로이신 및 상기한 하전된 잔기를 가진 프로사포신계 12량체 펩티드(서열 번호 3)는 향신경성 인자로서 활성이 있다. 따라서, 프로사포신계 12량체 펩티드(서열 번호 3)는 또한 본 발명의 방법에 따른 신경통을 경감시킬 수 있다.

프로사포신계 펩티드 및 그 향신경성 유사물은, 말초신경계 또는 중추신경계에 독성 병변, 외상성 병변, 허혈성 병변, 퇴행성 병변 또는 유전적 병변이 있은 후에 기능 회복을 촉진하는데 있어서 현저한 치료적 용도를 가진다. 또한, 상기 펩티드들은 수초발생을 촉진하거나 또는 수초탈락을 억제함으로써 수초탈락성 질병의 효과를 상쇄시킬 수 있다. 또한, 그러한 펩티드는 뉴런의 분지(分枝, outgrowth)를 자극하고, 뉴런 조직에서의 의도적인 세포 사멸을 억제한다. 본 발명의 활성 향신경성 펩티드 및 향수초성 펩티드는 약 12개 또는 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가지며, 서열 번호 2로 표시되는 비-자연발생적 프로사포신 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 활성 향신경성 펩티드 및 향수초성 펩티드는 14 내지 약 50개의 아미노산을 가지며, 서열 번호 2로 표시되는 비-자연발생적 프로사포신 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 신경돌기 분지 또는 수초발생을 용이하게 하는 펩티드 유효량을 뉴런 세포에 투여함으로써 신경돌기의 분지를 자극하고, 신경 세포 사멸을 억제하고, 분화되거나 또는 미분화된 뉴론 세포에서 수초발생을 촉진하거나 또는 수초탈락을 억제하는 방법이 제공되는데, 이 때 펩티드는 약 12개 내지 약 50개의 아미노산을 가진 것이며, 서열 번호 2로 표시된 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 신경돌기 분지를 자극하고, 신경 세포 사멸을 억제하고, 수초발생을 촉진하거나 또는 수초탈락을 억제하는 본 발명의 방법에서는, 예를 들면 서열 번호 2로 표시되는 펩티드를 포함하여 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가진 펩티드의 유효량을 사용할 수 있다.

임의의 상기 펩티드가 신경돌기 분지를 자극하고, 신경 세포 사멸을 억제하고, 수초발생을 촉진하거나 또는 수초탈락을 억제하는 능력은 당업자라면 실시예 IV 내지 VII에 기술한 절차를 사용하여 측정할 수 있다. 상기 펩티드들이 수초발생을 촉진하고 수초탈락을 억제하는 능력을 분석하는 방법은 하기 실시예 VI 및 VII에 제시한다.

본 발명은 또한 뉴런 세포를 프로사포신 활성 단편의 유효 억제량을 함유하는 조성물과 접촉시킴으로써 감각 신경병을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 표시된 서열을 가진 펩티드의 억제 유효량을 함유하는 조성물과 뉴런 세포를 접촉시킴으로써 감각 신경병을 억제하는 방법을 제공한다.

실시예 X에 개시된 바와 같이, 프로사포신계 펩티드는 감각 신경병을 억제하는 데에 유용할 수 있다. 감각 신경병이 택솔 투여에 의해 유도되는 마우스 모델에서는, 열 감각의 상실이 정상적으로 관찰된다. 그러나, 서열 번호 1의 펩티드 100 ㎍/㎏이 투여된 택솔 처리된 마우스에서는, 열 감각의 상실이 억제되었다. 이러한 결과는 프로사포신계 펩티드가 감각 뉴런 또는 운동 뉴런 둘다의 향신경성 인자일 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 방법에 유용한 펩티드는 또한, 예컨대 서열 번호 11 내지 19의 펩티드일 수 있다(표 5 참조). 예를 들면, 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)의 서열을 시토킨 및 성장 인자와 함께 배열하면, 다수의 인간(h) 시토킨에 대해 서열 유사도를 나타내는데, 그 시토킨의 예로는 hCNTF, hIL-6, hIL-2, hIL-3, hIL1-γ, 에리스로포이에틴(hEPO), 인간 백혈구 억제 인자(hLIF), hIL-1 β쇄 및 온코스타틴-M(hONC-M)이 있다. 서열 번호 11 내지 19는 서열 번호 1의 프로사포신의 활성 단편과 같이, 인접하거나 또는 하나의 아미노산에 의해 분리되어 있는 두 개의 아스파라긴 잔기를 포함한다. 또한, 프로사포신의 활성 단편(22량체; 서열 번호 1)에서 볼 수 있는 바와 같이, 시토킨에 의해 유도된 펩티드 서열은 두 개의 아스파라긴 잔기의 N-말단을 향해 3개 내지 4개 잔기에 로이신(L) 또는 이소로이신(I) 잔기를 포함하고, 두 개의 아스파라긴 잔기의 C-말단을 향해 2개 내지 8개의 잔기에서 하나 이상의 하전된 잔기(아스파르트산(D), 리신(K), 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R))를 포함한다. 표 5에서 각각의 잔기들에는 밑줄을 그었다.

시토킨-수용체 결합 모델(Sprang 및 Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:816 (1993))은 다수의 시토킨에 공통적인 4개-나선형 다발 구조의 진화적인 보존에 대해 집중 연구하였다. 프로사포신계 서열(서열 번호 1)과 관련된 시토킨 또는 성장인자 서열 각각은 시토킨의 나선 A와 B 사이에(AB 루프) 또는 나선 C내에 위치하고 있다.

시토킨	서열	위치	서열 번호
프로사포신	CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL	----	1
hCNTF	YVKHQGLNKNINLDSVDGVP	AB 루프	11
hIL-6	EALAENNLNLPKMAG	AB 루프	12
hIL-2	LQMILNGINNYKNPKLT	AB 루프	13
hIL-3	ILMENNLRRPNL	AB 루프	14
hIL1-γ	FYLRNNQLVAGTL	AB 루프	15
hEPO	AEHCSLNENITVPDTKV	AB 루프	16
hLIF	YTAQGEPFPNNVEKLCAP	AB 루프	17
hIL-1β	FNKIEINNKLEFESA	나선 C	18
hONC-M	RPNIGLRNNIYCMAQLL	나선 C	19

구조적으로 관련된 시토킨 및 성장인자에 의해 유도된 펩티드(서열 번호 11 내지 19) 역시 신경통을 경감시키는 방법에 유용할 수 있다. 신경통을 경감시키는 활성에 대해 펩티드(서열 번호 11 내지 19)를 분석할 수 있는데, 그 분석 방법으로는 예를 들어 실시예 I에 기술한 정(Chung) 래트 모델; 실시예 III에 기술된 당뇨병성 신경병 모델; 문헌[Wall등, Pain 7:103-113 (1979); Bennett 및 Xie, Pain 33:87-107 (1988); Lekan등, Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992) 또는 Palacek등, Soc. Neurosci. Abstr. 18:287 (1992)]에 기술된 분석법; 또는 신경통에 대한 기타 분석법을 사용할 수 있다.

시토킨 및 성장인자에 의해 유도된 펩티드(서열 번호 11 내지 19)는 역시 신경돌기의 분지를 자극하고, 신경 세포의 사멸을 억제하고, 수초발생을 촉진하거나 또는 수초탈락을 억제하는 방법, 또는 감각 신경병 또는 운동 신경병을 억제하는 방법에 유용할 수 있다. 약 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가지며 서열 번호 11 내지 19의 서열중 하나에 포함된 활성 향신경성 영역을 포함하는 펩티드는 실시예 IV에 기술된 신경돌기의 분지를 자극하는 능력에 대해 분석하거나; 또는 실시예 V에 기술된 신경 세포 사멸을 억제하는 능력에 대해 분석하거나; 또는 실시예 VI에 기술된 수초발생을 촉진하는 능력에 대해 분석하거나; 또는 실시예 VII에 기술된 수초탈락을 억제하는 능력에 대해 분석하거나; 또는 실시예 X에 기술한 감각 신경병증을 억제하는 능력에 대해 분석할 수 있다.

신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드는 예를 들어 신경통의 다수의 동물 모델중의 하나를 사용하여 해당 펩티드 또는 무작위 펩티드의 대형 집합물, 즉 라이브러리를 검색함으로써 확인할 수 있다. 그러한 해당 펩티드의 예로는 시토킨 및 성장인자에 의해 유도된 펩티드(서열 번호 11 내지 19)가 있는데, 이들 펩티드는 프로사포신의 활성 단편과 관련된 아미노산 서열(서열 번호 1)을 가진다. 또한 해당 펩티드의 예로는, 보존된 아스파라긴 잔기, 로이신/이소로이신 잔기 및 하나 이상의 하전된 잔기를, 서열 번호 1에서 그들 잔기가 확인되는 위치와 상응하는 위치에서 가지지만, 서열 번호 1의 아미노산과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가지기도 함으로써, 아미노산 서열에 있어 서열 번호 1과 관련되는 펩티드의 군집을 들 수 있다.

펩티드 라이브러리의 예로는 펩티드 및 펩티드 유사 분자를 포함하는 표지된 화학적 라이브러리를 들 수 있다. 펩티드 라이브러리는 또한 파지 디스플레이 기술에 의해 생성되는 것들을 포함한다. 파지 디스플레이 기술은 파지 표면상에 펩티드 분자를 발현시키는 방법 뿐만 아니라 단백질 리간드가 그것을 암호화하는 핵산이거나 또는 그 핵산과 관련될 수 있는 기타 방법론을 포함한다. 벡터를 비롯한 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법 및 발현되는 펩티드의 군집을 다양화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[Smith 및 Scott, Methods Enzymol. 217:228-257 (1993); Scott 및 Smith, Science 249:386-390 (1990); 및 Huse의 WO 91/07141 및 WO 91/07149호 참조]. 상기 방법 또는 다른 널리 공지된 방법을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조할 수 있는데, 이 라이브러리로부터 표현된 펩티드를 절단하고, 본원에 기술한 바와 같이 신경통 또는 기타 향신경성 활성 또는 향수초 활성을 경감시키는 활성에 대해 분석하였다. 필요에 따라, 펩티드 군집의 활성을 분석하고, 활성 군집을 분할하고, 분석을 반복하여 군집으로부터 활성 펩티드를 분리할 수 있다. 본 발명에 유용한 펩티드를 제조하는 다른 방법의 예로는 서열 번호 1 및 서열 번호 2와 같은 프로사포신 활성 단편의 아미노산 서열에 기초한 합리적인 계획과 돌연변이 유발 방법이 있다.

본원에 개시하는 바와 같이, 신경통을 경감시키는 데에 유용한 프로사포신 활성 단편 또는 펩티드는, 신경통이 있는 다수의 공지된 동물 모델중 하나에서 신경통을 경감시키는 활성으로 확인할 수 있다(Bennett의 상기 문헌 참조(1993)). 예를 들면, 프로사포신의 활성 단편은 래트에서 분절성 척추신경 연접에 의해 생성된 말초 신경병의 실험 모델을 사용하여 확인할 수 있다. 정(Chung)의 쥐 모델은 작열통(causalgia), 또는 말초 신경의 손상으로 인한 작열통(burning pain) 환자의 증상을 배가시킨다(Kim 및 Chung의 상기 문헌 참조 (1992)). Kim 및 Chung의 외과 수술은 발병된 발의 유해한 열 및 기계적 이질통증에 대해 장기간 지속되는 통각과민을 야기한다. 실시예 I에 기술한 바와 같이, Chung 및 Kim이 개발한 절차에 따른 척추 신경 연접을 가진 래트가 신경통의 경감에 사용하기 위한 프로사포신의 활성 단편을 확인하는 데에 유용하다.

또한 신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드는, 통증이 있는 당뇨병성 신경병의 래트 모델에서 신경통을 경감시키는 활성에 의해 확인할 수 있다. 열적, 기계적 및 화학적 유해 자극에 대한 통각과민 역시 당뇨병 래트에서 보고되었는데, 그 래트는 스트렙토조토신과 같은 선택성 β 세포 독소에 의해 유도된 단기 인슐린 결핍 당뇨병을 가진 것이었다(Calcutt등, Pain 68:293-299 (1996)). 그러한 래트 모델은 당뇨병이 있는 사람에게서 관찰되는 통증을 대표하는 것인데, 그 사람은 가벼운 접촉에 의해 야기된 자연적인 통증 및 통각과민을 포함한 다양한 이상 감각을 나타낼 수 있는 사람이다. 스트렙토조토신 또는 또 다른 선택성 β 세포 독소로 처리한 래트는 해당 펩티드 또는 단편으로 처리할 수 있고; 이어서, 0.5% 포르말린과 같은 유해성 자극에 대한 반응을 측정한다. 감소된 반응으로 신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드를 확인할 수 있다.

신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드는 또한 Wall 등의 신경종 모델을 사용하여 확인할 수 있다. 널리 공지된 신경통 모델은 무손상 사지에서 절단 또는 신경 절단 이후에 나타나는 인체 증상을 보여준다(Wall 등의 상기 문헌 참조 (1979)). 상기한 바와 같이, 신경종은 신경돌기 싹의 저해된 성장으로 인해 신경 절단 후에 쉽게 형성된다.

만성 협착 손상 모델 역시 신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드를 확인하는 데에 사용할 수 있다. Bennett 및 Xie(상기 문헌 참조 (1988))의 만성 협착 손상 모델은 사람에게 나타나는 것과 같은 통증 질환을 일으키는 말초 신경병의 래트 모델이다. 베넷의 모델에서, 신경 손상은 래트의 좌골 신경 주위의 협착 연결체를 느슨하게 결박함으로써 야기되는데, 이는 협착부에 떨어진 신경의 퇴화를 일으킨다. 이질통증 및 통각과민은 자발적인 통증 외에도 협착 손상에 의해 야기된다.

신경통의 원시적 모델 역시 신경통의 경감에 유용한 프로사포신의 활성 단편 또는 펩티드를 확인하는 데에 유용하다(참조 문헌의 예; Lekan 등의 상기 문헌(1992); Palacek 등의 상기 문헌(1992)).

본원에서 "펩티드"란 용어는 프로사포신의 활성 단편, 프로사포신계 펩티드 또는 본 발명의 방법에 유용한 펩티드와 관련하여 사용되는 것으로서, 자연발생적 아미노산, 비-자연발생적 아미노산 또는 화학적으로 변형된 아미노산을 함유하는 화합물을 의미하나, 단 화합물이 본원에 기술한 신경통 또는 기타 향신경성 활성 또는 향수초 활성을 경감시키는 활성을 보유해야 한다. 프로사포신계 펩티드는, 그 펩티드의 구조와 유사하고 활성을 보유하는 비아미노산 화학 구조물인 펩티드 유사물일 수도 있다. 그러한 유사물은 일반적으로 프로사포신계 펩티드에서 확인되는 동일한 공간적 배열에서 크기, 전하 또는 소수성과 같은 유사한 물리적 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 펩티드 유사물의 구체적인 예는 하나 이상의 아미노산들 사이의 아미드 결합이, 예컨대 탄소-탄소 결합 또는 당업계에 널리 공지된 기타 결합에 의해 대체된 화합물이다[참조 문헌의 예; Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, 워싱턴(1995)].

본원에 사용된 "아미노산"이란 용어는 다른 언급이 없으면, L-아미노산 및 D-아미노산을 포함하여 20개의 자연 발생적 아미노산중의 하나를 말한다. 아미노산이란 용어는 또한 아미노산 유사물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산, 통상 노르로이신과 같이 단백질내로 혼입되지 않는 자연발생적 아미노산 및 아미노산의 특성인 것으로 당업계에 공지된 성질을 가진 화학적으로 합성된 화합물을 말하는데, 단, 상기 화합물은 펩티드내에 치환되어 그 생물학적 활성을 보유하할 수 있어야 한다, 예를 들면, 글루타민은 아스파라긴의 아미노산 유사물인데, 단 그것이 본원에 기술하는 신경통 또는 기타 향신경성 활성 또는 향수초 활성을 경감시키는 활성을 보유하는 프로사포신의 활성 단편내에 치환될 수 있어야 한다. 아미노산 및 그 유사물의 다른 예는 문헌[Gross 및 Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, 아카데믹 프레스 인코포레이티드, 뉴욕 (1983)]에 열거되어 있다. 또한 아미노산은 아미노산 유사물일 수 있으며, 그 구조는 아미노산과 작용기의 실질적으로 동일한 공간적 배열을 나타내지만, 아미노산의 α-아미노기 특성 및 α-카르복실기 특성 둘다를 반드시 가질 필요는 없다.

프로사포신의 활성 단편 또는 본 발명에 유용한 펩티드는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 분리 또는 합성할 수 있다. 그러한 방법의 예로는 펩티드 제조를 위한 재조합 DNA 방법 및 화학 합성 방법을 들 수 있다. 적합한 숙주내에서 펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 통해 펩티드를 제조하는 재조합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[SambrooK등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2 판, 제1 권 내지 제3 권, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 뉴욕 (1989)]에 기술되어 있다.

프로사포신의 활성 단편 또는 본 발명에 유용한 펩티드는 또한 화학 합성에 의해, 예를 들면, 문헌[Merrifield등, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964)]에 기재된 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 표준 용액 방법을 사용하여 본 발명에 유용한 펩티드를 합성할 수 있다(참조문헌의 예; Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 스프링거-벌랙, 베를린 (1984) 및 Bodanszky, Peptide Chemistry, 스프링거-벌랙, 베를린 (1993)). 새로이 합성된 펩티드는, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제할 수 있으며, 예를 들어, 질량 분광분석법 또는 아미노산 서열 분석법을 사용하여 특성분석할 수 있다.

그 생물학적 기능을 파괴하지 않으면서 프로사포신의 활성 단편에 한정된 변형을 가할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 신경통을 경감시키는 능력이 파괴되지 않는 프로사포신 활성 단편의 변형물은 프로사포신의 활성 단편의 정의에 포함된다. 변형의 예로는 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환; 아미노산 구조 또는 기능이 유사한 화합물의 치환; 및 아미노기 또는 아세틸기와 같은 화학 부분의 첨가를 들 수 있다. 신경통을 경감시키는 데에 있어서 변형된 펩티드의 활성은 상기한 분석법 또는 실시예 I에 예시한 분석법과 같은 신경통의 동물 모델을 사용하여 분석할 수 있다.

프로사포신 활성 단편의 특히 유용한 변형은, 예를 들어 증가된 안정성을 부여하는 변형이다. 예를 들면, 하나 이상의 D-아미노산의 혼입 또는 리신의 치환 또는 결실은 펩티드 분해를 방지함으로써 프로사포신의 활성 단편의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이, 프로사포신계 14량체(서열 번호 2)는 사포신 C의 아미노산 16 내지 29에서 유래한 아미노산 서열을 가지지만, 그것은 3개의 자연발생적 리신의 각각의 치환 또는 결실 및 C-말단 티로신 잔기의 첨가에 의해 변형된 것이다. 구체적으로, 프로사포신계 14량체(서열 번호 2)는 위치 2에서 리신 치환 대신에 D-알라닌; 위치 8에서 리신 치환 대신에 알라닌 및 위치 11에서 리신의 결실을 가진다. 위치 2에서 D-알라닌 치환은 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 엔도프로테아제 분해로부터 펩티드를 보호함으로써 증가된 안정성을 부여한다(참조 문헌의 예; Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, p.247, 라벤 프레스, 뉴욕 (1991)). 리신 잔기의 치환 또는 결실은 당해 분야에 널리 알려진 바와 같이(상기 Partridge의 문헌(1991) 참조), 트립신형 프로테아제에 대해 증가된 내성을 부여한다. 이러한 치환은 안정성을 증가시키고, 따라서, 서열 번호 2의 펩티드의 생체 이용률을 증가시키지만, 신경통을 경감시키는 활성에는 영향을 끼치지 않는다.

유용한 변형은 또한 혈뇌관문을 통과하도록 촉진하는 변형, 예컨대 지질친화성을 증가시키거나 또는 수소결합을 감소시키는 변형이다. 예를 들면, 프로사포신계 펩티드(서열 번호 2)의 C-말단에 첨가된 티로신 잔기는 혈뇌관문에 대한 소수성 및 투과성을 증가시킨다(참조 문헌의 예; Banks등, Peptides 13:1289-1294 (1992) 및 Partridge의 상기 문헌(1991)). 혈뇌관문에 대해 증가된 생물학적 안정성 또는 증가된 투과성을 가지는 키메라형 펩티드-약제 역시 본 발명의 방법에 유용할 수 있다.

당업자라면 실시예 II에 개시된 바와 같이, 프로사포신의 활성 단편이 생체내에서 혈뇌관문을 통과하는 능력을 용이하게 분석할 수 있다. 또한, 프로사포신의 활성 단편은, 예컨대 문헌[Bowman등, Ann. Neurol. 14:396-402 (1983) 또는 Takahura등, Adv. Pharmacol. 22:137-165 (1992)]에 기술된 바와 같이, 뇌의 미세혈관 내피 세포 배양계에 근거하여 혈뇌관문의 시험관 모델을 사용하여 혈뇌관문을 통과하는 능력에 대해 시험하였다.

본원에 사용된 "유효량"이란 용어는 신경통의 경감 또는 신경통의 예방에 유용한 프로사포신 활성 단편의 양을 의미한다. 일일 기준으로 전신으로 투여되는 유효량은 검체의 체중에 따라 다르다. 일일 기준으로 전신에 투여되는 유효량은 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 1000 ㎍/㎏이 바람직하다. 일일 기준으로 전신에 투여되는 유효량은 약 10 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎍/㎏이 더 바람직하다. 통증의 경감 또는 예방용 펩티드의 유효량은 당업계에 널리 알려진 방법, 예를 들면, 실시예 1에서 기술한 분석법 또는 영장류에서의 분석법을 포함한 상기 분석법[Lekan 등의 상기 문헌(1992) 및 Palacek 등의 상기 문헌(1992)]을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다.

세포 성장 배지에서 향신경성 활성 또는 향수초 활성을 위한 본 발명의 펩티드의 전형적인 최소량은 적어도 약 5 ng/㎖이다. 생체외의 사용에는 본 발명의 펩티드의 상기 양 또는 더 많은 양을 사용할 수 있다. 통상, 본 발명의 펩티드는 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖ 범위의 농도로 사용할 수 있다. 특정 조직을 치료하기 위한 유효량은 실시예 IV 및 VI에 제시한 바와 같이 측정할 수 있다.

신경 세포는 본 발명의 펩티드를 세포내로 직접 투여함으로써 시험관내 또는 생체외에서 치료할 수 있다. 이것은, 예컨대 특정 세포형에 적합한 성장 배지에서 세포를 배양한 다음, 펩티드를 배지에 첨가함으로써 행해진다. 치료할 신경 세포가 통상 척추동물, 바람직하게는 포유동물의 생체내에 존재하는 경우, 본 발명의 펩티드는 하기하는 여러 가지 기술중 하나에 의해 투여할 수 있다.

본원에서 사용된 "검체"란 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 구체적으로 인간을 의미한다.

본 발명은 유효량의 프로사포신 활성 단편을 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 두개내, 뇌척수내, 국소, 경구, 경피, 경점막 또는 비강내 투여하므로써, 통증 경감, 신경돌기 분지 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진 및 수초탈락 억제 방법과 감각 신경병 또는 운동 신경병 억제 방법을 제공한다. 잘 알려진 유형의 약학적으로 허용 가능한 담체를 프로사포신의 활성 단편과 함께 투여할 수 있다. 이러한 담체로는, 예를 들어 인산염 완충 염수(PBS)가 있다.

프로사포신 활성 단편의 유효량을 검체의 혈류내로 직접 주입하는 것이 바람직하다. 예를 들어 말초 신경계나 중추 신경계에 활성 단편을 투여하는 데 프로사포신 활성 단편을 정맥내로 주입할 수 있으며, 이는 아미노산 12에 발린 대신 티로신이 치환된 서열 번호 1의 프로사포신계 22량체의 아미노산 12 내지 아미노산 29로 구성된(Mw =2000), 요오드화된 프로사포신계 18량체 Tyr-Lys-Glu- Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (서열 번호 20)이 혈뇌관문을 통과하여 실시예 II에 기재된 바와 같이 중추 신경계로 유입되기 때문이다. 뇌에 의한 흡수는 대략 0.03%이며, 이는 혈뇌관문을 통과하는 대략적인 크기의 펩티드에 대한 중간범위의 값이다(Banks 등, 상기 문헌 참조 1992).

종종 경구 투여가 바람직하며, 단 프로사포신의 활성 단편을 변형시켜 위장 분해에 대한 안정성을 부여하고 용이하게 흡수될 수 있도록 한다. 예를 들어 1 이상의 D-아미노산을 치환하여 본 발명에 유용한 프로사포신계 펩티드에 대한 증가된 안정성을 부여할 수 있다.

두개내로 직접 주입 또는 뇌척수액내로 주입하여 프로사포신 활성 단편의 유효량을 검체의 중추신경계에 유입시킬 수 있다. 또한, 프로사포신의 활성 단편을 직접 주입 또는 국부적 국소 적용이나, 또는 전신 투여에 의해서 말초 신경 조직으로 투여할 수 있다. 통상적인 각종 투여 방식으로는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 두개내, 경막외, 국소, 경구, 경피, 경점막 및 비강내 투여가 있다.

프로사포신의 활성 단편을 서방형태로 투여할 수 있다. 서방형태의 프로사포신 활성 단편의 장점은 이 활성 단편을 반복적으로 투여할 필요없이 장기간 동안 신경통을 경감시킨다는 것이다.

예를 들어 프로사포신 활성 단편을 조절하에 서서히 방출시키는 웨이퍼, 면역비드, 미소펌프 또는 기타 재료와 같은 서방형 물질을 사용하여 지속적으로 유리시킬 수 있다. 이러한 조절된 유리 물질은 당업계에 알려져 있으며, 시판용(알짜 코포레이숀, 캘리포니아 팔로 알토 소재; 데포테크, 캘리포니아 라졸라; 참고 Paradoll, Ann. Rev. Immunol. 13:399-415(1995))을 이용할 수 있다. 또한 프로사포신 활성 단편, 예컨대 폴리락트산, 폴리갈락산, 재생된 콜라겐, 다층판상 리포좀 또는 기타 통상적인 데포 제제와 제형화시킬 수 있는 생체부식성 또는 생체분해성 물질을 이식하여 프로사포신 활성 성분을 서서히 유리되도록 할 수 있다. 본 발명은 또한 주입 펌프, 매트릭스 포착계 및 경피 전달 장치의 용도에 관한 것이다.

또한, 프로사포신의 활성 성분은 미포 또는 리포좀내에 둘러싸인 것이 유리할 수 있다. 리포좀의 캡슐화 기술은 잘 알려져 있다. 리포좀은, 표적 조직과 결합할 수 있는 수용체, 리간드 또는 항체를 통하여 신경 조직 등의 특정 조직에 표적화할 수 있다. 이들 제제의 제법이 당업계에 잘 알려져 있다(참고, 예를 들어 Pardridge, 상기 문헌 참조, 1991, 및 Radin과 Metz. Meth. Enzymol. 98:613-618 (1983)).

본 발명의 펩티드 조성물은 포장할 수 있으며, 단위 복용 형태, 예를 들어 주입 조성물 또는 국부 제제를 일일 사용량과 동량으로 환자에게 투여할 수 있으며, 필요하다면 서방형 제제로 조제할 수 있다. 단위 사용형태는, 예를 들어 PBS 내에 또는 동결건조된 형태로 본 발명의 활성 조성물의 일일 투여량을 함유하는 격막 밀봉된 병의 형태일 수 있다. 신경계 질병을 치료하기 위해서, 본 발명의 펩티드의 적절한 일일 전신 사용량은 척추 동물의 체중을 기준으로 하며, 약 10 ㎍/kg 내지 약 100 ㎍/kg의 범위내에 있지만, 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1,000 ㎍/kg의 복용량도 가능하다. 따라서, 일반적으로 70 kg의 사람의 경우, 전신 사용량은 매일 약 7 ㎍ 내지 약 70,000 ㎍, 더 바람직하게는 약 700 ㎍ 내지 7,000 ㎍이다. 국부적으로 투여되는 물질의 일일 사용량은 대략 전신 사용량 미만의 범위내에 있다. 경구 투여 또한 가능하다.

또한, 본 발명은 프로사포신 활성 단편을 발현 및 분비하도록 유전적으로 변형된 세포를 검체에게 이식하여 신경통을 경감시키는 방법을 제공한다. 이식으로 프로사포신 활성 단편을 연속으로 공급할 수 있으며, 따라서 신경통을 지속적으로 경감시킬 수 있다. 지속적이거나 만성적인 신경통으로 고생하는 검체의 경우, 이러한 방법의 장점은 프로사포신의 활성 단편을 반복 투여 할 필요 없이 또는 반복 투여의 필요성을 감소시킨다는 것이다.

당업계에 알려진 방법을 사용하여, 프로사포신의 활성 단편을 암호하는 핵산 함유 발현 벡터로 세포를 용이하게 형질감염시킬 수 있다[Chang, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boca Raton (1995)). 뇌로 이식한 후에, 예를 들어 형질 감염된 세포는 프로사포신의 활성 단편을 발현시키고 분비하며, 따라서 신경통이 경감된다. 이러한 방법은, 진통 특성이 있는 물질을 분비하는 세포를 이식하기 위해 기재된 바와 같이 신경통을 경감시키는 데 유용할 수 있다[참고, 예컨대 Czech와 Sagen, Prog. Neurobiol. 46:507-529 (1995)).

세포는, 이식시 생존할 수 있고 프로사포신 활성 단편을 발현 및 분비할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 실제, 세포는 검체와 면역학적으로 적합해야 한다. 예를 들어, 특히 유용한 세포는 처리할 검체로부터 분리한 세포이며, 이는 이러한 세포가 검체와 면역학적으로 적합하기 때문이다.

처리할 검체외에 다른 공급원으로부터 유도된 세포는, 예를 들어 미세캡슐화 또는 면역 억제를 사용하여 면역 거부반응으로부터 보호된다면 유용할 수도 있다. 유용한 미세캡슐화 막 물질로는 알기네이트-폴리-L-리신 알기네이트 및 아가로스가 있다[참고, 예컨대 Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boca Raton (1993); Tai 및 Sun, FASEB J. 7: 1061(1993); Liu 등, Hum. Gene. Ther. 4:291(1993); 및 Taniguchi 등, Transplant. Proc. 24:2977 (1992)). 예를 들어, 래트 척추 지주막하 공간내로 이식한 중합체 캡슐화 세포를 사용하여 통증을 감소시켜왔다[Wang 등, Soc. Neurosci. Abstr. 17:235 (1991)].

인간 검체를 치료하기 위해서, 세포는 인간 세포일 수 있지만, 비-인간 포유동물 세포 또한 이용할 수 있다. 구체적으로, 인간 섬유아세포, 근육 세포, 신경교 세포, 뉴런 전구 세포 또는 뉴런을 발현 벡터로 형질감염시켜 서열 번호 1과 같은 프로사포신의 활성 단편을 발현 및 분비할 수 있다. 예를 들어 표준 조직 배양 조건에서 처리되고 유지되는 검체의 피부 생검으로부터 1차 섬유아세포를 얻을 수 있다. 1차 근육 세포도 이식에 유용할 수 있다. 신경 이식을 위해 고려 사항들은 문헌[Chang 등, 상기 문헌 참조 (1995)]에 개시되어 있다.

중추 신경계로부터 유도된 세포는, 세포의 생존이 자연 환경에서 증가되기 때문에 중추 신경계에 이식하기에 특히 유용하다. 뉴런 전구 세포는, 뉴런 전구 세포가 배양액에서 증식되고, 삽입할 발현 백터로 형질감염된 후 개체내로 유입할 수 있기 때문에 본 발명의 방법에 사용하기 특히 유용하다. 뉴런 및 신경교 세포를 증식 및 분화시킬 수 있는 뉴런 전구 세포의 분리는, Renfranz 등의 문헌[Cell 66:713-729 (1991)]에 기재되어 있다.

생체외에서 세포를 형질감염시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 더블유.에이치. 프리만 앤드 코포레이숀, 뉴욕 (1990)]. 섬유아세포, 근육 세포, 신경교 세포 또는 뉴런 전구 세포 등으로 분리되는 세포를 형질감염시키기 위해서, 레트로비루스 벡터가 바람직하다. 뉴런 등의 유사핵분열후 세포내로 발현 벡터를 형질감염시키기 위해서, 복제-결손 헤르페스 심플렉스 비루스(HSV-1) 벡터가 유용하다[During 등, Soc. Neurosci. Abstr. 17: 140 (1991); Sable 등, Soc. Neurosci. Abstr. 17:570 (1991)].

프로사포신의 활성 단편을 암호하는 핵산은, 구조 프로모터 또는 유도 프로모터를 비롯하여 당업게에 알려진 1 이상의 각종 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. [참고, 예를 들어 장 등의 문헌, 상기 문헌 참조, 1995]. 특히 다량 발현을 위해 유용한 구조 프로모터로는 몰로니 마우스 백혈병 비루스 긴 말단 반복부(MLV-LTR), 시토메가로비루스 바로-초기부(immediate-early)(CMV-IE) 또는 시미안 비루스 40 초기부(SV 40)가 있다.

프로사포신의 활성 단편을 암호하는 핵산 서열이 본원에 개시되어 있다. 예를 들어 서열 번호 1을 암호하는 핵산 서열은 5'-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGA CCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3'(서열 번호 21)이다[Duwji 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8652-8656 (1987)]. 펩티드 서열 번호 1을 직접 분비하기 위해서, 예를 들어 β-락타마제의 시그널 서열 등의 시그널 서열을 암호하는 핵산을 Simon 등의 문헌[J. Cell Biol. 104:1165 (1987)]에 개시된 바와 같이 서열 번호 21에 작동 가능하게 결합시킬 수 있다.

본 발명은 또한 검체에게 프로사포신 활성 단편의 유효량을 투여하여 검체의 신경통을 방지하는 방법을 제공하는 것이다. 신경통을 에방하는 본 방법은 통증이 있기전, 예컨대 통증을 유발하는 것으로 알려진 화학요법 및 수술 전에 사용하는 것이 좋다

본 발명은 검체에게 유효량의 프로사포신 활성 단편을 투여하여 검체의 신경통을 경감시키는 방법을 제공한다. 예컨대, 본 발명은 아미노산 서열 Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(서열 번호 1) 또는 Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr- Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr(서열 번호 2)을 갖는 프로사포신의 활성 단편을 유효량 투여하여 검체내의 말초 신경, 배측 신경절근, 척수, 뇌간, 시상 또는 피질의 질환으로부터 일어나는 신경통을 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 검체에게 유효량의 프로사포신 활성 단편을 투여하여 검체내의 신경통을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 프로사포신계 펩티드 및 신경돌기 분지(分枝, outgrowth)의 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진 및 신경 수초탈락 억제에 대한 상기 펩티드의 용도도 제공한다. 또한, 프로사포신 활성 단편의 유효 억제량을 함유하는 조성물과 뉴런 세포를 접촉시켜 감각 신경병이나 운동 신경병을 억제하는 방법도 제공한다.

하기의 실시예는 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 I

정(Chung) 모델 래트에서 신경통의 경감

이 실시예는 말초 신경통의 정 실험 모델에서 프로사포신의 활성 성분을 환괴형태로 초내 주입한 효과를 개시하고 있다.

3개의 각 펩티드를 화학 합성에 의해 순수한 형태로 얻고, 무균 PBS에 용해시키고 중성 pH로 완충시켰다.

Kim 및 Chung 등의 문헌[상기 문헌 참조, 1992]에 이미 개시된 수술 과정을 무게가 120 g∼150 g인 수컷 래트(Sprague-Dawley)에서 수행하여 이질(異質)통증 상태를 유발하였다. 간단히 요약하면, 래트를 할로탄으로 마취시키고; 이어서 척추주에 인접한 왼쪽 L-5 및 L-6 척추 신경을 분리하고 배근신경절 말단에 6.0 실크 봉합으로 결찰시켰다. 작동 회복 기간이 지난 10일 내지 14일 후에, 척수 카테터를 삽입하였다. 2차 수술 5일 후, 대후두공을 통해 삽입한 척추 카테터에 연결된 기어로 추진력을 제공하는 미세-주입 주사기를 사용하여 초내 약물 투여하엿다. 시험 전에, 래트를 투명한 플라스틱 선 그물이 쳐진 우리내에 두고 환경에 적응시켰다.

발 움츠림에 대한 50% 기계적인 역치를 평가하기 위해서, 폰 프레이 모(von Frey hair)를 발 바닥을 피하려는 뒷 발에 적용하였다. 각각의 폰 프레이 모를 충분한 힘으로 발에 수직으로 압박하여 약 6초 내지 8초 동안 약간 구부리게 하였으며, 증가하는 힘의 로그값으로 구부러짐을 계산한다. 발을 심하게 움츠리는 것을 양성 응답으로 하였다. 각 점에 대해 최대 및 최소 자극을 살피면서 각 점에 대해 6개의 데이터 점을 모았다. 응답의 생성 패턴을 표로 만들고 50% 응답 역가를 계산하였다. 그래프는 단일 초내 환괴 주입으로서 제공되는 펩티드의 투여량에 대한 응답을 나타낸다. X축은 발 바닥상에 압력에 대한 민감성을 측정하는 지점에서의 주입후 시간을 나타낸다.

모든 외과적 병변이 있는 래트는 프로사포신의 활성 단편을 주입하기 전에 촉각으로 알 수 있는 이질 통증을 나타낸다. 도 1의 0시에서 나타나는 바와 같이, 측정된 역치는 펩티드의 부재하에 3.0 g 내지 4.0 g 미만이었다. 0.7 ㎍ 또는 0.07 ㎍의 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)를 초내 주입하여 용량-의존 방식으로 이질 통증을 억제하였다. 영향을 받지 않은 발이 움츠리기 전에 래트가 힘의 증가를 견디어 낼 때 힘 역치의 증가로 이질 통증이 감소되는 것이 명백하다.

주요 효과는 주입한 지 15분 후에 관찰되었다. 최대 효과는 주입 후 120분에 나타났다. 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)를 최대 사용량으로 주입한 래트는 분석한 최후의 시점(180 분)에서 상당히 감소된 이질 통증을 나타내었다. 0.007 ㎍ 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)를 주입한 래트는 이질통증의 현저한 감소를 나타내지 않았다. 진정작용과 같은 주요 부작용은 어떤 농도에서도 관찰되지 않았다.

정 모델 래트에서 프로사포신계 14량체 펩티드(서열 번호 2; 참고 표 1)가 이질 통증을 경감시키는 능력을 검사하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 프로사포신의 활성 단편(서열 번호 2)은 이질통증을 감소시키는데 효과적이었다. 프로사포신계 14량체 펩티드(서열 번호 2)의 피크 효과는 주입한 지 15분 내지 30분동안 관찰되었으며, 약 60분 후에 주입 이전의 값으로 복귀하였다(도 2). 부작용은 시험한 프로사포신계 14량체 펩티드(서열 번호 2)의 어떤 농도에서도 관찰되지 않았다.

정 모델 래트에서 아스파라긴 대신 아스파르트산 잔기를 포함하므로써 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)와 구별되는 돌연변이 22량체 펩티드(서열 번호 8)(표 4 참고)의 이질통증을 경감시키는 활성에 대해 시험하였다. 17.5 ㎍ 돌연변이 22량체 펩티드(서열 번호 8)를 주입한 후에 정 래트의 이질통증 응답에 변화가 없었다.

정 모델에 따라 외과적 병변으로 인한 통증을 경험하지 않은 정상 래트에게 프로사포신의 활성 단편(서열 번호 1)을 주입하고 Bennett 및 Xie[문헌 상기 문헌 참조, 1988]에 의해 개발된 과정으로 열 자극에 대한 응답을 시험하였다. 간단히 요약하면, 래트가 열원으로부터 영향을 받지 않은 발을 이탈시키기 전에 기간을 고온판 잠복기로 정의하고 열 자극에 의해 유발되는 통증에 대한 내성을 측정하였다.

초내 카테터를 정상 수컷(Sprague Dawley) 래트에 넣는다. 수술 5일 후, 프로사포신의 활성 단편(서열 번호 1)으로 래트에게 초내 주입하였다. 래트를 고온판(52.5℃)에서 검사하였다; 고온판 응답 잠복기를 주입전에, 그리고 주입 후 최대 180분으로 각 시점에서 측정하였다. 고온판 응답 잠복기의 현저한 증가는 관찰되지 않았다. 따라서, 프로사포신계 펩티드 서열 번호 1은 정상 동물에서 통증을 지각하는데 효과가 없다.

실시예 II

중추 신경계에 의한 프로사포신계 펩티드의 생체내 흡수

이 실시예에 개시된 결과는 프로사포신계 펩티드가 혈뇌관문을 통과하는 것을 나타낸다.

12 위치에 발린이 티로신으로 치환된 사포신 C의 아미노산 12 내지 29로 구성된 18량체 펩티드(서열 번호 20)를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 모델 430 펩티드 합성기에서 화학적으로 합성하였다. 이어서, 락토퍼옥시다제 방법으로 방사성 요오드화시켰다; 20×10⁶cpm 방사능 표지된 펩티드를 래트의 이개(耳介)내로 주사하였다. 1시간 후와 24 시간 후에 동물을 희생시켜 등장 염수로 심장을 관류시켜 뇌로부터 혈액을 제거하였다.

펩티드 흡수율(%)을 측정하기 위해서, 뇌를 감마 계수기에서 계수하였다. 또한, 뇌를 균질화하고 덱스트란 원심분리후에 뇌실질 분획물(상등액)과 모세관이 축척된 분획물(펠렛)로 분류하였다[Triguero 등, J. Neurochem., 54:1882-1888 (1990). 이 방법으로 혈관내에 방사능표지된 펩티드와 뇌내에 방사능표지된 펩티드를 구별할 수 있다. 24 시간 후에, 0.017%의 주입된 펩티드(서열 번호 20)을 전체 뇌에서 검출하였다; 75%의 표지가 실질 분획물에 존재하고 25%는 모세관 분획물에 존재하였다. 1시간 째에, 주입된 사용량의 0.03%가 전체 뇌에 존재하였다.

프로사포신계 펩티드(서열 번호 2)가 하기과 같이 혈뇌관문을 통과하는 능력을 또한 평가하였다. 암컷(Sprague-Dawley) 래트를 메톡시플루란으로 마취시키고, 약 20㎍의 펩티드(서열 번호 2)(3.2×10⁸cpm)를 꼬리 정맥으로 주사하였다. 40 분 후, 래트를 에테르로 마취시켜 희생시키고 심장을 통해 약 250㎖의 PBS를 관류시켰다. 뇌, 간 및 혈액중의 총 펩티드 양을 표 6에 나타난 바와 같이 주입된 물질에 대한 백분율로 계산하였다. 뇌에서의 위치를 측정하기 위해서, Triguero의 문헌[J.Neurochem. 54:1882 (1990)]에 개시된 모세관 방혈법을 사용하여 뇌 조직을 실질 분획과 뇌 모세관 분획으로 분리하였다. 분류 결과는, 뇌에 존재하는 서열 번호 2인 펩티드의 87%가 뇌 실질에 위치하는 반면 13%는 뇌 모세관에서 발견된다는 것을 보여준다.

조직	중량	조직중 총 CPM	초기 CPM의 백분율
뇌	1.3g	161,000	0.050
간	8.8g	5.2×10⁶	1.625
혈액	약 22㎕	1.01×10⁸	31.6

서열 번호 2로 처리한 지 3 시간 후에 래트를 희생시킨 유사한 실험에서, 0.06%의 펩티드가 뇌에서 나타났으며, 이중 85%는 실질에 존재하엿다. 이 결과는 적어도 일부의 프로사포신계 펩티드(서열 번호 2)가 혈뇌관문을 통과하며 혈관 내피(혈관)보다는 뇌 실질에 농축되어 있다는 것을 보여준다. 혈뇌관문을 통과하는 펩티드의 백분율은 뱅크스의 문헌[상기 문헌 참조, 1992]에 개시한 관문을 통과하는 펩티드의 중간 범위내에 있다.

뇌, 간 및 혈액에서 손상되지 않은 물질의 백분율을 측정하기 위해서, 조직으로부터 분리한 방사능 표지된 물질(서열 번호 2)를 고압 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 조직 균등액의 처리 과정에서 분해를 표준화하기 위해서, 펩티드(서열 번호 2)를 조직 균등액에 첨가하였다. 첨가된 펩티드 물질을 이용하여 관찰되는 분해 정도를 사용하여 조직 처리시 분해를 표준화하였다. 표준화 후에, 결과는 하기와 같았다: 서열 번호 2는 뇌에서 약 60%; 간에서 약 80%; 혈액에서 약 40%가 손상되지 않았다. 2차 실험에서 펩티드(서열 번호 2)는 뇌에서 약 68%가 손상되지 않았다. 이들 결과는 펩티드(서열 번호 2)가 혈뇌관문을 통과하고 뇌에서 대개 손상되지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 III

당뇨병 래트에서 신경통의 경감

이 실시예는 당뇨병 신경병 래트 모델에서 서열 번호 2의 서열을 가지는 펩티드의 복강내 투여 효과를 개시하고 있다.

스트렙토조토신(체중 1kg당 50 ㎎, 0.9% 무균 염수에 새로 용해시킴)을 단일 복강내 주입하여 Calcutt 등의 문헌[Pain 68:293-299 (1996)]에 개시된 바와 같이 췌장 β 세포를 제거하고 인슐린 결핍을 유도하여 당뇨병 래트를 만들었다. 2일 후에, 혈당량을 측정하여 스트렙토조토신을 주사한 래트가 당뇨병인지를 확인하였다. 혈당 농도가 15mmol/ℓ이하인 스트렙토조토신을 주사한 동물은, 래트의 당뇨병 연구에서 비-절식 고혈당증의 일반적인 허용 범위에 따라, 연구에서 제외시켰다.

당뇨병 래트와 대조 래트를, 이질통증의 지표로서 유해성이 있는 화학 포르말린에 대한 행동 응답을 분석하므로써 8주 동안 연구하였다[Calcutt 등, 상기 문헌 참조, 1996]. 간단히 요약하면, 오른쪽 뒷발의 배측 표면내로 새로 조제한 포르말린(무균 염수 용액중 0.5% 용액 50㎕)을 래트에세 피하주사하였다. 이 농도의 포르말린은 대조군 래트에서는 최대 행동 응답에 버금가는 행동 응답을 유도하며 기(期) Q 및 2 동안에 당뇨병 래트의 통각과민을 검출할 수 있다[Calcutt 등, Eur. J. Pharmacol. 285:189-197 (1995)]. 동물의 발을 계속적으로 볼 수 있도록 만들어진 관찰 챔버로 동물을 옮겼다. 처리한 각 동물군을 모르는 관찰자가 1분 동안 움찔한 횟수를 5분 간격으로 60간 계수하였다. 당뇨병 래트의 연구에서 이미 정의한 바와 같이, 기 1은 움찔한 행동의 초기 측정(주입후 1∼2 분 및 5∼6 분); Q(정지기) 기는 10∼11, 15∼16 및 20∼21분에 측정; 및 기 2는 주입 후 연속되는 모든 측정으로 정의한다[참고, 예를 들어 Malmberg 등, Neurosci. Lett. 161:45-48 (1993)]. 기(期)내에 측정 점에서 움찔한 횟수를 합하여 각 기간동안에 활성을 비교하였다. 당뇨병 래트는, 이미 보고한 바와 같이 비정상적인 움찔 행동 응답을 나타낸다.

펩티드(서열 번호 2)를 화학 합성에 의해 순수한 형태로 얻고, 무균 PBS에 용해시키고 중성 pH로 완충시켰다. 당뇨병 래트를 2개의 군(각 군에서 4마리의 동물)으로 나누고, 염수 또는 펩티드(서열 번호 2)를 각각 투여하였다. 0.5% 포르말린으로 처리하기 2시간 전에, 당뇨병 래트는 복강내 투여를 이용하여 염수 또는 200 ㎍/kg 펩티드(서열 번호 2)로 처리하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 서열 번호 2를 투여하면 기 1에서 비정상적인 움찔 응답을 완전히 방지할 수 있고 기 2에서는 약 70% 까지 이 응답을 개선시킬 수 있었다. 따라서, 펩티드(서열 번호 2)의 비경구 투여는 통증이 있는 당뇨병 신경병의 래트 모델에서 포르말린을 주입으로 유래하는 경감시켰다.

실시예 IV

시험관내 신경돌기 분지 자극

이 실시예는 시험관내에서 신경돌기 분지를 자극하는 데 서열 번호 2의 서열을 가지는 펩티드의 용도를 개시하고 있다.

NS20Y 신경아세포종 세포를 10% 태아 소 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 증식시켰다. 트립신을 사용하여 세포를 제거하고, 유리 커버슬립상에 30 mm 페트리 디쉬에서 평판배양하였다. 20 내지 24시간 후에, 배지를 0.5% 태아 소 혈청과 함께 서열 번호 2의 서열을 가지는 0 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 2 ng/㎖, 4 ng/㎖ 또는 8 ng/㎖의 펩티드 또는 스크램블(scramble) 대조 펩티드를 함유하는 2㎖ DMEM로 대치한다. 세포를 24시간 더 배양하고, PBS로 세척하고 부앵 용액(포화 수성 피크르산/포르말린/아세트산 15:5:1)으로 30분 동안 고정시켰다. 고정액을 PBS로 제거한 후, 신경돌기 분지를 위상 현미경하에서 기록하였다. 하나의 세포 직경과 동일하거나 그 이상인 하나 이상의 분명하게 한정된 신경돌기를 나타내는 세포를 신경 돌기 분지의 양성으로 기록한다. 복제에서 분석된 각 펩티드가 있는 세포를 보유하는 신경돌기의 백분율을 측정하기 위해서 각 접시의 여러 위치에서 200개 이상의 세포를 기록한다.

서열 번호 2로 표시된 펩티드는, 다른 순서로 동일한 아미노산을 가지는 스크램블 대조 펩티드와 비교하여 NS20Y 세포에 신경 돌기 분지를 상당히 증가시킨다. 0.5 ng/㎖ 펩티드 정도의 작은 양을 사용하여 신경돌기 분지 증가를 명백하게 알 수 있다.

실시예 V

시험관내 신경 세포 사멸의 억제 방법

이 실시예는 시험관내 신경 세포 사멸을 억제하는 데 서열 번호 2의 서열을 가지는 펩티드의 용도를 개시하고 있다.

NS20Y 세포를 실시예 IV에 개시된 바와 같이 평판배양하고, 서열 번호 2로 표시된 서열을 가지는 펩티드 또는 스크램블 대조 펩티드 8 ng/㎖의 존재 또는 부재하에 2일 동안 0.5% 태아 소 혈청중 유리 커버슬립에서 증식시킨다. 배지를 제거하고 PBS중 0.2% 트립판 블루를 각 웰에 첨가한다. 사멸된 세포를 트립판 블루 염료로 염색하고, 역상현미경에서 총 백분율로서 기록하여 각 웰의 4개 부분에서 400 세포를 계수한다. 복제의 평균 오차는 ±5%이다. 서열 번호 2에 도시된 펩티드는 트립신 블루-양성(사멸) 세포의 수를 실질적으로 감소시킨다. 이는 서열 번호 2의 서열을 가지는 펩티드가 계획된 세포 사멸을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 VI

생체외 수초발생 분석

이 실시예는 생체외 신경돌기 분지를 자극하고 수초발생을 촉진하는 데 서열 번호 2의 서열을 가지는 펩티드의 용도를 개시하고 있다.

신생 마우스 소뇌 외식편을 Satomi 등의 문헌[Zool. Sci. 9:127-137 (1992)]에 따라 제조한다. 신생 마우스 소뇌가 정상적으로 신경 분화를 진행하고 수초발생을 시작할 때, 그 기간 동안 배양 22일에 걸쳐 신경돌기 분지 및 수초발생이 관찰되었다. 외식편을 제조한 후 2일 째에, 서열 번호 2를 가지는 펩티드를 10 ㎍/㎖의 농도로 3개의 외식편에 첨가하고, 스크램블 대조 펩티드를 10 ㎍/㎖의 농도로 3개의 외식편에 첨가한다. 3개의 대조군 및 3개의 처리된 외식편 의 신경돌기 분지 및 수초발생을 비디오 카메라로 명시야 현미경하에서 평가한다. 8일 째에, 펩티드를 함유하는 배양물이 대조군 배양물보다 더 얇고 더 고루 분산되어 있다. 15일 째에, 펩티드 서열 번호 2로 처리한 배양물은 외식편의 주변에 긴 돌출부를 가진 여러 세포를 포함한다. 이러한 돌출부는 대조 배양물에는 없거나 덜 우세하다. 펩티드(서열 번호 2)로 처리한 배양물은 대조 외식편에 비하여 22일에 피질하 백색 물질내에 현저하게 많은 수초발생 축삭을 포함한다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 생체외에서 분화성 소뇌에 수초발생을 유도한다.

실시예 VII

수초탈락 억제

쉬반(Schwann) 세포 사멸은 수초탈락 억제와 상호관련이 있다. 쉬반 세포는 광범위한 수초를 포함한다. 배양액중 쉬반 세포에 서열 번호 2인 펩티드를 첨가하면 대조군 스크램블 펩티드에서는 관찰되지 않는 용량-의존 방식으로 쉬반 세포 사멸을 감소시킨다. 따라서, 서열 번호 2의 서열을 가지는 본 발명의 펩티드는 수초탈락을 억제할 수 있다.

실시예 VIII

외상 허혈성 CNS 병변의 치료

척수에 외상 병변이 있는 인간에게 무균 염수 용액중에서 또는 병변 부위에서 서서히 연속적으로 펩티드를 유리시킬 수 있는 데포우 형태로 서열 번호 2로 표시되는 펩티드 약 100 ㎍/㎖를 직접 또는 간접적으로 뇌척수내 주입한다. 사지 운동의 증가와 같은 운동 신경 작용으로 개선 정도를 평가한다. 더 이상 개선되지 않을 때까지 치료를 반복한다.

실시예 IX

수초탈락 질환의 치료

MS 초기 단계로 진단받은 환자에게 서열 번호 2로 표시되는 서열을 가지는 펩티드를 뇌척수액내로 실시예 VIII에서와 동일한 범위의 투여양을 사용하여 직접 정맥내 주사한다. 투여량을 매일 또는 매주 반복하고 근육 강도, 근골격 조정 및 수초발생(MRI에 의해 측정)에서 개선이 관찰된다.

실시예 X

감각 신경병의 치료

감각 신경병을 유도하기 위해서 마우스에게 택솔(taxol)을 투여하였다. 택솔로 처리한 마우스에게 프로사포신계 펩티드(서열 번호 2)를 100 ㎍/kg, 200 ㎍/kg 또는 1 ㎎/kg 투여하였다. 감각 신경병의 지표로서 하그레이브스(Hargreaves) 감각 시험 장치를 사용하여 열 감각 상실을 측정하였다. 펩티드(서열 번호 2)의 3가지 각 투여량이 탁솔로 처리한 마우스의 열 감각 상실을 억제하는데 효과적이었다. 프로사포신계 22량체 펩티드(서열 번호 1)를 또한 유사하게 분석하였고 택솔로 처리한 마우스의 열 감각 상실을 억제하는데 효과적이라는 것을 발견하였다. 이들 결과는 프로사포신계 펩티드, 예컨대 서열 번호 1 및 서열 번호 2가 감각 신경병을 억제하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다.

본 발명이 전술한 실시예를 참고로 하여 기술되었지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 각종 변형을 수행할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 본 발명은 하기의 청구항에 의해 한정된다.

서열표

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아

(ii)발명의 명칭 : 프로사포신계 펩티드를 이용한 신경통 경감 방법

(iii) 서열의 수 : 21

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인 : 캠벨 앤드 플로레스

(B) 스트리트 : 슈트 700, 라 졸라 빌리지 드라이브 4370

(C) 도시 : 샌디에고

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국가 : 미국

(F) ZIP : 92122

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC compatible

(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatenIn Release #1.0, Version #1.25

(vi) 선행 출원 자료 :

(A) 출원 번호 :

(B) 출원 일자 : 1997년 5월 5일

(C) 분류 기호:

(viii) 대리인 정보 :

(A) 성명 : 캠벨, 카트린 에이.

(B) 등록번호 : 31,815

(C) 참조번호/문서번호: FP-UD 2474

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화 : (619)535-9001

(B) 팩스 : (619) 535-8949

(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 22 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 1:

(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 14 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ix) 서열의 특징:

(A) 명칭/키: 펩티드

(B) 존재 위치: 2

(D) 기타 정보: /노트= "Xaa는 D-알라닌"

(xi) 서열 : 서열 번호 2:

(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 3:

(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 22 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 4:

(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 21 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 5:

(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 22 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 6:

(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 22 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 7:

(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 22 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 8:

(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 14 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 9:

(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 14 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 10:

(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 11:

(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 15 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 12:

(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 17 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 13:

(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 14:

(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 13 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 15:

(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 17 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 16:

(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 17:

(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 15 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 18:

(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 19:

(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 20:

(2) 서열 번호 21 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 66 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열 번호 21:

Claims

약 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가지고 서열 번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 프로사포신계 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 번호 2로 표시되는 서열을 가지는 펩티드.
약학적으로 허용가능한 담체에 제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드를 포함하는, 신경 조직중 신경 질환 또는 수초탈락 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
제3항에 있어서, 서방형 제제 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 리포좀 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 동결건조된 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 단위 복용형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
프로사포신 활성 단편의 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하여, 검체의 신경통을 경감시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 신경통이 말초 신경 장애에 의해 유발되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 말초 신경 질환이 신경종; 신경 압박; 신경 압착; 신경 신장 및 불완전한 신경 절단; 단발신경병증 및 다발신경병증으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 신경통이 배측 신경절근, 척수, 뇌간, 시상 및 피질의 질환으로 구성된 군에서 선택된 질환으로부터 유래하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 투여 방법이 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 두개내, 뇌척수내, 국소, 경구, 경피, 경점막 또는 비강내 투여로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
검체에게 프로사포신 활성 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 검체의 신경통을 예방하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19중 어느 하나의 서열중에 포함된 활성 향신경성 영역을 포함하고 최대 약 50 개의 아미노산을 가지는 펩티드의 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 검체의 신경통을 경감시키는 방법.
서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19중 어느 하나의 서열중에 포함된 활성 향신경성 영역을 포함하고 최대 약 50 개의 아미노산을 가지는 펩티드의 신경통 치료용 용도.
서열 번호 2로 표시되는 서열을 포함하고 약 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가지는 펩티드의 유효 자극량 또는 유효 억제량을 포함하는 조성물을 뉴런 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경돌기 분지 자극, 신경 세포 사멸 억제, 수초발생 촉진 또는 수초탈락 억제 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물이 서열 번호 2로 표시되는 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 뉴런 세포가 시험관내에서 접촉되는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 뉴런 세포가 생체내에서 접촉되는 것인 방법.
신경 조직의 신경 질환 또는 수초탈락 질환을 치료하기 위한 제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드의 용도.
프로사포신 활성 단편의 유효 억제량을 포함하는 조성물과 뉴런 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여, 감각 신경병 또는 운동 신경병을 억제하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 프로사포신의 활성 단편이 약 14개 내지 약 50개의 아미노산을 가지고 서열 번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 펩티드인 방법.
제24항에 있어서, 상기 프로사포신의 활성 단편이 서열 번호 2로 표시되는 서열을 가지는 펩티드인 방법.
제23항에 있어서, 상기 뉴런 세포가 시험관내에서 접촉되는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 뉴런 세포가 생체내에서 접촉되는 것인 방법.