CN109512842A - 重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在制备治疗抗神经退行性病变药物中的应用 - Google Patents

重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在制备治疗抗神经退行性病变药物中的应用 Download PDF

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Abstract

重组慢病毒Lenti‑Drp1‑S579A在制备治疗抗神经退行性病变药物中的应用，本发明通过原代培养的神经元证实了Lenti‑Drp1‑S579A在抗神经退行性改变中的有效性。该病毒通过抑制Aβ引起的神经元轴突树突萎缩、小刺和突触丢失及神经元凋亡情况，改善了神经元的退行性改变。

Description

重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在制备治疗抗神经退行性病变 药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因治疗发明领域，尤其是涉及一种重组慢病毒在抗神经退行性病变中的应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒能够有效感染细胞且该病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。故慢病毒载体已经作为基因转移的有效手段，目前正广泛应用于基因治疗研究等方面。而重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A是通过点突变的方法使线粒体分裂蛋白(Drp1)丝氨酸579位点突变，从而构建一个重组慢病毒使线粒体分裂蛋白(Drp1)去磷酸化。目前主要应用于线粒体形态调节方面的实验性研究。
神经退行性病变是一些与年龄相关的疾病，包括阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)和帕金森病(PD)等，发病率随老龄人的增加而逐年增高。病理学上主要以β淀粉样斑块和神经原纤维缠结为特点，可触发细胞凋亡通路导致神经元大量死亡。目前有研究表明淀粉样蛋白β(Aβ)通过细胞内Ca2+诱导神经细胞凋亡增加，随后细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)的过度活化，细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)激活线粒体分裂蛋白(Drp1)丝氨酸579位点磷酸化，促进线粒体的分裂和神经元的凋亡。
目前神经退行性病变发病机制不明，主要治疗方法为对症治疗，并没有特效的治疗药物及方法。
发明内容
本发明的目的在于提供重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A的新用途，即重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在制备治疗神经退行性病变药物中的应用。
重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在神经退行性病变中治疗的作用机理为：Lenti-Drp1-S579A通过抑制Drp1的磷酸化而抑制Cdk5的激活，从而抑制线粒体分裂及神经元凋亡，从而改善Aβ引起的神经元轴突树突萎缩及小刺和突触丢失情况。
本发明能有效减少Aβ引起的神经元轴突树突萎缩、小刺和突触丢失及神经元凋亡情况。
附图说明
图1：A为倒置荧光显微镜观察Lenti-Drp1-S579A转染效率图。B为Total-Drp1和带His标记的Drp1代表性Western-blot图。重组病毒Lenti-Drp1-S579A感染神经元，随着MOI值的增加，病毒的转染效率也增高。图中；Cont：正常对照；MOI：感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值；β-actin:肌动蛋白，内参；标尺＝50μm。
图2：A为显微镜观察明视野神经元轴突树突变化图。B图分别为轴突、树突的定量分析结果。跟实验组对比，Aβ42处理组神经元轴突变短，树突变少；而重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理组可以明显改善轴突的变短和树突的变少。实验至少重复三次，统计了至少25个神经元，利用轴突的平均长度，树突的平均数量，进行T检验统计分析，数据表示为平均值+标准误，*P﹤0.05，**P﹤0.01,***P﹤0.001。图中；Cont：正常对照；Aβ42：Aβ42处理24小时组；Drp1-S579A+Aβ42：重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理三天后Aβ42处理24小时组,；标尺＝50μm。
图3：A为倒置荧光显微镜观察GFP转染神经元树突棘变化图。B图为小刺的定量分析结果。跟实验组对比，Aβ42处理组树突棘变短变少；而重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理组可以明显改善树突棘的变短变少。实验至少重复三次，统计了至少9-21个神经元，利用树突棘的平均数量，进行T检验统计分析。数据表示为平均值+标准误，*P﹤0.05，**P﹤0.01,***P﹤0.001。图中；Cont：正常对照；Aβ42：Aβ42处理24小时组；Drp1-S579A+Aβ42：重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理三天后Aβ42处理24小时组；标尺＝10μm。
图4：A为倒置荧光显微镜观察突触免疫荧光染色神经元突触变化图。B图为突触的定量分析结果。跟实验组对比，Aβ42处理组突触变少；而重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理组可以显著改善突触的这种变少。实验至少重复三次，统计了至少12个神经元，利用突触的平均数量，进行T检验统计分析。数据表示为平均值+标准误，*P﹤0.05，**P﹤0.01,***P﹤0.001。图中；Cont：正常对照；Aβ42：Aβ42处理24小时组；Drp1-S579A+Aβ42：重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理三天后Aβ42处理24小时组；标尺＝50μm。
图5：A图为Active Caspase-3代表性的Western Blot检测图。B图为ActiveCaspase-3的灰度半定量分析结果。跟实验组对比，Aβ42处理组Active Caspase-3增多；而重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理组可以显著改善这种增多。实验至少重复三次，利用灰度值进行半定量分析，进行T检验统计分析。数据表示为平均值+标准误，*P﹤0.05，**P﹤0.01,***P﹤0.001。图中；Cont：正常对照；Aβ42：Aβ42处理24小时组；Drp1-S579A+Aβ42：重组病毒Lenti-Drp1-S579A预处理三天后Aβ42处理24小时组；β-actin:肌动蛋白，内参。
具体实施方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
为了更好地理解本发明的实质，下面以实验结果来证明重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在抗神经退行性改变中的用途。
一.材料与方法
1.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A购自塞业(广州)生物科技有限公司，质粒编号VB171116-1188qrd。
2.动物
本实验选用健康C57BL/6实验用孕鼠，购买自湖南长沙斯莱克景达有限责任公司，经过中科院上海实验动物中心审核，饲养于南昌大学眼科研究所专用动物房。所有实验动物的喂养及实验程序均严格遵照实验动物保护条款。动物房内环境安静，室温25℃左右，12h/天光照(7：00～19：00)。
3.主要试剂
WesternBright ECL发光试剂(K-12045-D10)(advansta)；DMSO(Dimethylsulfide)(美国Sigma公司)；DMEM培养基(美国HyClone公司)；Neurobasal培养基(美国Gibco公司)；B27神经生长因子(美国Gibco公司)；Amyloidβ1-42(美国Sigma公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素/链霉素抗生素(北京索莱宝公司)。
4.抗体
Drp1(兔)(美国CST公司)；Cleaved Caspase-3(兔)(美国CST公司)；MAP-2抗体(兔)(美国CST公司)；Beta actin antibody(β-actin)(美国Affinity公司)；FITC标记兔抗兔IgG二抗(美国Proteintech公司)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗(CW0103T)(北京康为世纪公司)。
5.主要实验仪器
IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；超声粉碎机(宁波新芝)；垂直电泳系统，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；小型台式离心机(美国Thermo公司)。
6.实验方法
6.1原代神经细胞培养
6.1.1、主要溶液配制
(1)神经细胞Plating培养基的配制：取43.225ml Neurobasal培养基，向其中加入1mL的B27，125μL的200mM谷氨酰胺，50μL的25mM谷氨酸盐，500μL的青霉素和链霉素，100μL的500mM HEPES，5mL的FBS，4℃保存，即为神经细胞Plating培养基。
(2)神经细胞Feeding培养基的配制：取48.275ml Neurobasal培养基，向其中加入1mL的B27，125μL的200mM谷氨酰胺，500μL的青霉素和链霉素，100μL的500mM HEPES，4℃保存，即为神经细胞Feeding培养基。
(3)PBS溶液：分别称量0.2g KCl，8.0g NaCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4，用900mL ddH2O溶解，调节pH值为7.20-7.40，定容至1L，最后高压灭菌并4℃保存。
6.1.2、培养皿的包被
(1)配制1mg/mL多聚-L-赖氨酸的母液，放置-20℃保存。
(2)每个35mm的培养皿加入2mL终浓度为25μg/mL的多聚-L-赖氨酸，并放置37℃细胞培养箱中2个小时以上，包被过夜也可以。
(3)培养皿包被过后，移去多余的多聚-L-赖氨酸，并用灭菌的PBS溶液洗三次，后晾干待用。
6.1.3、皮层神经细胞的提取及分离
(1)开启超净化工作台紫外灯(大约30min)，对超净台进行紫外线除菌。
(2)将怀孕16-18天的C57BL/6母鼠断头处死，并固定在泡沫盒上，喷洒酒精对其表面灭菌。
(3)用之前已经灭菌好的镊子和剪刀将母鼠解剖并取其胚胎，把陪胚胎放入10cm的组织培养皿中。接着将装有胚胎的10cm培养皿置于冰上，并拿到预先灭菌好的超净台。
(4)事先将35mm的组织培养皿加入2mL的4℃的DMEM，然后把胎鼠的大脑取出，接着用剥离器剥离大脑皮层，并将皮层剪碎放入装有4℃DMEM的35mm组织培养皿中。完后，将其全部移入15mL的离心管中，1000rpm，离心3min。
(5)离心完后，移去上清液体，再向其中加入1mL的DMEM和1mL 0.25％的胰酶，37℃消化15min，并且每3min用手指弹匀。
(6)胰酶消化完后，向其离心管中加入2mL的胰酶抑制剂和DNase I的混合液，37℃水浴10min，每5min用手指弹匀。
(7)终止消化后，1000rpm，离心3min，离心完后移去离心管中的上清液体，并加入3mL的神经细胞Plating培养基，用抛光的巴斯德吸管吹打15次以下，最后将细胞悬液接种到35mm的组织培养皿中。并在组织培养皿上标记实验人姓名和细胞接种日期。
(8)细胞悬液接种8-12小时后，神经细胞已经贴壁，然后将Plating培养基全部移去，加入2mL的Feeding培养基。加入培养基的时候一定要沿着组织培养皿的壁慢慢滴入，防止贴壁的细胞被培养基吹打起来。换好培养基后，每隔3-4天半量更换一次Feeding培养基。
(9)神经细胞第3-4天的时候就基本长出树突和轴突，培养到第七天的时候，神经细胞就已经成熟，可以用来实验。
6.2慢病毒感染
(1)神经细胞接种第3天，保证进行病毒感染时细胞融合度为30％-50％，细胞密度多少是影响感染效率高低的关键因素之一，所以每次接种细胞前计数。
(2)计算好MOI值所对应的慢病毒的量，把病毒液加入神经细胞培养基中并轻轻吹打，保证病毒液和培养基能混合均匀。混匀后把液体加入各组培养皿中，使其最终培养体系为1mL。
(3)病毒感染8-12小时后，把各组培养皿中的病毒液移去，换上新鲜的培养基，如果细胞状态不好时，可以提前至4-6小时更换新的培养基。
(4)细胞换上新鲜培养基后，再继续培养。3-4天后，拿到荧光显微镜下观察荧光的强弱和感染荧光的细胞数量，以此来判断慢病毒的感染效率。
6.3.蛋白质免疫印迹
根据实验分组对神经细胞做相应的处理，加入病毒液，使其MOI值分别为1，2，5。病毒感染第3天，提取各实验组的总蛋白，每个35mm培养皿加120μL Loading buffer，100℃煮10min。-20℃保存备用。取适量蛋白样品进行上样、跑胶、转膜、孵育一抗和二抗，最后显影。用Image J软件分析条带灰度值，并与β-actin比较计算结果，每组标本重复实验至少3次。
6.4.GFP转染神经元观察树突棘
神经元培养第五天时，利用lipofectamine 2000转染GFP其中转染体系包括4.5μLlipofectamine 2000，1.5μL质粒GFP(2μg)。转染4-6h后，换上新鲜Feeding培养基。转染两天后按实验分组加入5umol/L的Aβ42处理24h后倒置荧光显微镜观察小刺变化情况。
6.5.MAP2免疫荧光染色
各实验组处理完后，将培养基移去，并用PBS漂洗培养皿2次，漂洗时一定要轻轻摇晃，避免细胞因漂洗过度而漂起来；培养皿漂洗完后，移去多余的PBS，接着用4％多聚甲醛固定15min；固定完后，移去4％多聚甲醛，并用PBS漂洗2次。随后移去多余的PBS，再用5％BSA封闭1h；封闭完后，用一抗MAP2覆盖细胞表面，并4℃过夜；第二天，移去剩余的抗体MAP2，用PBS漂洗2次，并用带有绿色荧光的二抗覆盖细胞表面，室温孵育1h，此时一定要避光；之后倒置荧光显微镜观察。
7.实验结果
7.1.神经元慢病毒感染效率
我们构建了表达靶向Drp1磷酸化位点的重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A，为了探讨慢病毒在原代培养神经元中的转染效率，将实验分为：Cont组、MOI＝1组、MOI＝2组、MOI＝5组；观察阳性细胞量和荧光强度以及Western blot检测总的Drp1、His标记的Drp1的量。实验结果如图1所示：A图：不加慢病毒感染时，没有阳性细胞；慢病毒感染复数MOI＝2条件下，相比于MOI＝1，表达m-cherry的阳性细胞数更多，并且荧光强度更亮；慢病毒感染复数MOI＝5条件下，表达m-cherry的阳性细胞数最多，并且荧光强度最亮。B图：不加病毒感染组，His标记的Drp1表达量为零；慢病毒感染复数MOI＝2条件下，相比于MOI＝1，His标记的Drp1表达量更高；慢病毒感染复数MOI＝5条件下，His标记的Drp1表达量最多。
7.2.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元轴突树突的影响
已有研究表明Aβ42沉积的神经元轴突变短树突变少，为了研究重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元轴突树突的影响，于是我们按分组相应处理神经元后，在显微镜下直接观察神经元的轴突长度及树突数量，并比较各实验组神经元形态的差异。实验分对照组，Aβ42处理组，Lenti-Drp1-S579A+Aβ42处理组。实验结果如图2所示：对照组轴突长且树突多；而Aβ42处理组较对照组轴突显著变短甚至消失，树突变少甚至消失，有些神经元只剩胞体；预先利用重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A处理后，能显著改善Aβ42诱导的轴突变短树突丢失。这些实验结果也都显示，重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对Aβ42沉积的神经元轴突树突有保护作用。
7.3.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元树突棘的影响
已有研究表明Aβ42沉积的神经元树突棘变少，为了研究重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对树突棘的影响，于是我们转染GFP绿色荧光蛋白到神经细胞当中，接着按分组相应处理神经元后，在荧光显微镜下直接观察神经元树突分支上微小功能性突起即树突棘，并比较各实验组神经元树突棘的数量差异。实验分对照组，Aβ42处理组，Lenti-Drp1-S579A+Aβ42处理组。实验结果如图3所示：对照组树突棘多；而Aβ42处理组较对照组树突棘显著降低；预先利用重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A处理后，能显著改善Aβ42诱导的树突棘丢失。这些实验结果也都显示，重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对Aβ42沉积的神经元树突棘有保护作用。
7.4.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元突触的影响
已有研究表明Aβ42沉积的神经元间突触变少，为了研究重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对突触的影响，按分组相应处理神经元后，用突触标志性物质Synapsin-1免疫荧光染色；在荧光显微镜下直接观察神经元间突触密度，并比较各实验组神经元突触的数量差异。实验分对照组，Aβ42处理组，Lenti-Drp1-S579A+Aβ42处理组。实验结果如图4所示：对照组突触丰富；而Aβ42处理组较对照组突触数量显著下降；预先利用重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A处理后，能显著改善Aβ42诱导的突触丢失。这些实验结果也都显示，重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对Aβ42沉积的神经元突触有保护作用。
7.5.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元凋亡的影响
之前的研究表明阿尔茨海默症患者神经元萎缩以及凋亡增多。为了研究重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A对神经元凋亡的影响，按分组相应处理神经元后，利用Western Blot检测Active Caspase-3的表达水平。实验分对照组，Aβ42处理组，Lenti-Drp1-S579A+Aβ42处理组。实验结果如图5所示：对照组Active Caspase-3表达水平较低；而Aβ42处理组较对照组Active Caspase-3表达水平显著增高；预先利用重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A处理后，较Aβ42处理组Active Caspase-3表达水平显著降低。这些实验结果也都显示，重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A可以改善Aβ42诱导的神经元凋亡。

Claims (2)

1.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A在制备治疗神经退行性病变药物中的应用。
2.重组慢病毒Lenti-Drp1-S579A制备的口服、注射、含片或其它局部或全身可用药剂型的药物。
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