ES2461492T3 - Péptidos para tratar las beta-amiloidosis - Google Patents

Abstract

Utilización de por lo menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEFKHG(C), TLHEFRH(C), ILFRHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C) y TEFRHKA(C) para producir un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la b-amiloidosis

Description

Péptidos para tratar las beta-amiloidosis.

La presente invención se refiere a la utilización de mimotopos para la prevención, el tratamiento y el diagnóstico de enfermedades asociadas con la formación y/o agregación de β-amiloide (β-amiloidosis).

Diversas enfermedades degenerativas se caracterizan por la polimerización anormal y acumulación de proteínas específicas. Estas denominadas proteopatías incluyen trastornos neurológicos tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington, así como trastornos sistémicos diversos, incluyendo las amiloidosis. La presente invención se refiere a la prevención, al tratamiento y al diagnóstico de proteopatías asociadas con proteínas β-amiloides, resumidas bajo el término β-amiloidosis. La forma más destacada de las βamiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (EA). Otros ejemplos incluyen de manera no limitativa la demencia con cuerpos de Lewy y la demencia en el síndrome de Down.

La EA se caracteriza por la acumulación anormal de placas amiloides extracelulares - estrechamente asociadas con las astrocitosis y microgliosis extensas, así como las neuronas distróficas y la pérdida neuronal. Estas placas amiloides consisten principalmente en los péptidos β-amiloideos (Aβ) Aβ40 y Aβ42 derivados de la proteína precursora amiloide (PPA), que se expresa en varios tipos de células en el sistema nervioso. Se considera que los péptidos Aβ están directamente implicados en la patogenia y progresión de la EA.

La PPA se procesa normalmente mediante dos etapas de escisión para formar las formas actualmente conocidas de Abeta x-40/42/43. La primera escisión se realiza por las denominadas enzimas 1 y 2 que escinden PPA en el punto beta (BACE1 y BACE2); la segunda etapa proteolítica se lleva a cabo por el complejo gamma-secretasa (revisado en De Strooper et al. J Cell Sci 113 (2000): 1857-1870).

Las enzimas BACE reconocen dos sitios en la porción N-terminal del supuesto péptido Aβ: la primera interacción de BACE con PPA conduce a un corte de la secuencia DAEFR (pos. 1 en Aβ) y la formación de Abeta 1-X. Alternativamente, BACE también puede cortar una futura posición 11 en Aβ, dando como resultado el fragmento 11-

X. De este modo, el procesamiento de PPA mediado por BACE crea una variedad de diferentes especies de Aβ con Abeta 1-40/42 de longitud completa como contribuyente principal. La actividad de la gamma-secretasa conduce a la producción de 3 fragmentos principales: Aβ 1-40/42/43. Una vez que estos péptidos se producen, se procesan adicionalmente mediante amino-peptidasas que dan como resultado su degradación gradual subsiguiente. Estas etapas adicionales conducen a la formación de otras formas como por ejemplo Aβ3-40/42 respectivamente. En seres humanos, por término medio, el 60 - 85% de material de placa amiloide está formado por derivados de Aβ40/42 que están truncados N-terminalmente y modificados con frecuencia. Las cantidades relativas de especies Aβ truncadas N-terminalmente son variables con respecto a los niveles de Aβ, mutaciones y actividad de BACE.

Las formas truncadas de Aβ más abundantes son: Aβ3-40/42 y Aβ11-40/42. Ambos péptidos contienen un resto de glutamato N-terminal, que está modificado frecuentemente de forma enzimática a piroglutamato, dando como resultado la formación de Aβ3(pE)-40/42 y Aβ11(pE)-40/42, respectivamente. Debido a que el término amino de los péptidos Abeta 3(pE) y 11(pE) está bloqueado por lactama interna, está protegido de la acción proteolítica de otras aminopeptidasas distintas de las específicas para piroglutamato, y por lo tanto puede permanecer estable en los tejidos.

La forma más prominente de amiloide modificado N-terminalmente truncado está formada por el péptido 3(pE)40/42, que se cree que constituye hasta el 50% de todas las formas truncadas. Esto significa que estas isoformas constituyen el 25-40% de todos los péptidos amiloides en cerebros con EA. Otra forma destacada de péptidos Aβ truncados es Aβ11-40/42: Naslund et al. y Huse et al. pudieron demostrar que hay un nivel significativo de estas especies truncadas detectables en cerebros humanos de pacientes con EA así como en pacientes infraclínicos para EA. Además, estos péptidos sufren deshidratación intramolecular y forman formas (pE) estables con consecuencias similares como se describen para 3(pE)-40/42.

Se ha demostrado anteriormente que los péptidos truncados y modificados son más estables en el tejido nervioso que Aβ de longitud completa. Además, las formas truncadas N-terminalmente de Aβ son más amiloidógenas que los péptidos Aβ sin modificar, aumentando así la cantidad de formación de placas, y además muestran actividad neurotóxica cuando se aplican a las neuronas en cultivo así como en experimentos in vivo. Las formas truncadas de Aβ ya se pueden detectar en agregaciones difusas de Aβ en las etapas iniciales de la EA, y podrían estar involucradas en la formación inicial de placas, actuando como semillas individuales in vivo.

Existen pruebas convincentes de que la aparición de especies Aβ N-terminalmente truncadas está correlacionada con el aumento de la gravedad e inicio temprano de la neurodegeneración en la enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar, así como en pacientes con síndrome de Down. Los efectos agregantes junto con la mayor estabilidad de estos péptidos los hacen un jugador potencialmente peligroso en el desarrollo de EA. El análisis en

pacientes infraclínicos que sufren EA familiar o Síndrome de Down ha mostrado inequívocamente que Aβ 3(pE)-42 se puede detectar durante las etapas más tempranas de la enfermedad, también denominadas las etapas de “germen”. En este momento no se pueden detectar o sólo se pueden detectar síntomas neurológicos menores, aunque se comienzan a acumular placas que poseen la especie peptídica Aβ 3(pE)-42. De este modo, los datos procedentes de estos pacientes implican una relación entre la formación temprana de especies de Aβ truncadas y el comienzo, así como la evolución, de la enfermedad.

A partir de estos hallazgos, parece ser importante disminuir la cantidad de estas especies de péptidos en pacientes con EA para modificar la progresión de la enfermedad y reducir la toxicidad y la disminución cognitiva que la acompaña. Una vacuna contra EA óptima debería provocar de este modo una respuesta inmunitaria que sea capaz de dirigirse a las formas más destacadas de péptidos Aβ presentes en el cerebro de pacientes con EA.

De hecho, el tratamiento inmunoterapéutico que usa estrategias de inmunización activa y pasiva para dirigirse a Aβ de longitud completa, condujo a la reducción de las placas de Aβ y tuvo un impacto beneficioso sobre la progresión de la enfermedad en modelos animales de EA. Los experimentos de vacunación pasiva en modelos de ratón de EA mostraron claramente que anticuerpos dirigidos específicamente contra los términos N y C de Aβ40/42 son capaces de reducir la carga de placas en el cerebro y también mejoran las funciones cognitivas en animales tratados, según se juzga de análisis de comportamiento. Se han realizado observaciones similares en experimentos de vacunación activa, usando diferentes enfoques para inducir respuestas inmunitarias dirigidas contra Aβ40/42 en ratones. Todos estos enfoques usaron Aβ40/42 de longitud completa o fragmentos que contienen la secuencia nativa de Aβ, y la mayoría redujo la carga de amiloides en modelos de ratón transgénico. De forma importante, estos animales también mostraron funciones cognitivas mejoradas. Sorprendentemente, Lemere et al. (Am J Pathol 165 (2004): 283-297) pudo reproducir estos resultados en primates no humanos, que mostraron reducción clara de la deposición de placas y patología asociada en respuesta a la vacunación activa con Aβ de longitud completa. Sin embargo, el primer ensayo de vacunación clínica de fase IIa en pacientes con EA que usa Aβ42 de longitud completa como antígeno tuvo que ser interrumpido debido a efectos secundarios neuroinflamatorios graves, incluyendo la infiltración en el cerebro de linfocitos T autorreactivos. No obstante, los estudios que investigan los efectos clínicos en pacientes tratados con AN-1792 pusieron de manifiesto que los pacientes que desarrollaron una respuesta de anticuerpos contra Aβ42 pero que no padecían de meningoencefalitis respondían mejor a las pruebas cognitivas que los pacientes que no respondían, lo que indica que la inmunoterapia podría ser un enfoque de tratamiento muy útil en EA.

De forma más importante, los resultados recientes obtenidos de los casos de autopsia al analizar pacientes que se sometieron a vacunación con AN1792 mostraban una eliminación del cerebro de especies de Aβ de longitud completa, pero una persistencia de formas N-terminalmente truncadas de Aβ. Esto pone de relieve la necesidad de la invención de nuevas vacunas que se dirijan a Aβ de longitud completa así como de formas truncadas y modificadas N-terminalmente de esta molécula.

La inducción de una respuesta inmunitaria contra péptidos Aβ40/42 en seres humanos pueden interferir con la disminución cognitiva en pacientes con EA, pero una vacuna segura contra el Alzheimer tiene que evitar la formación de linfocitos T autorreactivos. La vacunación usando péptidos Aβ40/42 nativos o fragmentos de los mismos padece el riesgo intrínseco de inducir enfermedad autoinmunitaria en pacientes, ya que la respuesta inmunitaria no puede dirigirse exclusivamente a Aβ.

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar compuestos y medicamentos que se pueden usar para tratar y/o prevenir β-amiloidosis, incluyendo enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos no deberían presentar ninguna o deberían presentar una reducción significativa del riesgo de inducir enfermedades autoinmunitarias cuando se administran a un paciente. Según otro objeto de la presente invención, dicho compuesto puede ser capaz de provocar la formación in vivo de anticuerpos en un individuo que se dirigen a formas truncadas y/o estabilizadas de Aβ, que suelen ser componentes principales de los depósitos amiloides.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a la utilización de al menos un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos

X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o (Fórmula I),

en la que

X1 es isoleucina (I) o valina (V),

X2 es triptófano (W) o tirosina (Y),

X3 es treonina (T), valina (V), alanina (A), metionina (M), glutamina (Q) o glicina (G),

X4 es prolina (P), alanina (A), tirosina (Y), serina (S), cisteína (C) o glicina (G),

X5 es prolina (P), leucina (L), glicina (G) o cisteína (C), X6 es cisteína (C),

n, m y o son, independientemente, 0 o 1, teniendo dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo del péptido beta amiloide (Aβ) que comprende la secuencia de aminoácidos EFRHDSGY y/o pEFRHDSGY para producir un medicamento destinado a la prevención y/o tratamiento de β-amiloidosis.

5 Resultó sorprendente que un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula I es capaz de provocar la formación in vivo de anticuerpos que están dirigidos a las formas de Aβ truncadas AβpE3-40/42 y Aβ340/42. Los anticuerpos formados son capaces de unirse a los fragmentos de Aβ mencionados dando como resultado la disgregración de las placas de Aβ.

10 Las fórmulas I y II y todas las demás moléculas peptídicas descritas en la presente memoria imitan los péptidos Aβ de origen natural y las variantes Aβ1-40/42, AβpE3-40/42, Aβ3-40/42 y Aβ11-40/42, de modo que los compuestos que comprenden las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria son capaces de provocar la formación de anticuerpos respectivos.

15 La invención presentada en la presente memoria se refiere a antígenos que no contienen secuencias del péptido Aβ nativo e imitan la estructura de neo-epítopos no detectables por mimotopos tales como los descritos en el documento WO 2004/062556. Dicha vacuna contra EA a base de mimotopos provoca por lo tanto respuestas de anticuerpos que reaccionan exclusivamente con las moléculas de Aβ patológicas mencionadas aquí, pero no con

20 estructuras parentales como APP. Además, los mimotopos no contienen autoepítopos potenciales de linfocitos T y evitan la inducción de linfocitos T autorreactivos perjudiciales.

“β-amiloidosis”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a diversas enfermedades degenerativas que se caracterizan por la polimerización anormal y acumulación de proteínas específicas denominadas proteopatías. La

25 presente invención se refiere a la prevención, tratamiento y diagnóstico de proteopatías asociadas con proteínas βamiloides resumidas bajo el término de β-amiloidosis. La forma más destacada de β-amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (EA). Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a demencia con cuerpos de Lewy y demencia en el síndrome de Down. Otros ejemplos son la demencia con cuerpos de Lewy, miositis, miositis esporádica con cuerpos de inclusión, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés), angiopatía amiloide cerebral, vasculitis

30 relacionada con Aβ.

Según una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, “β-amiloidosis” es la enfermedad de Alzheimer.

35 Según una realización preferida de la presente invención, el compuesto comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) y IRWDGG(C).

Los compuestos particularmente preferidos de la presente invención comprenden o consisten en las secuencias de

40 aminoácidos anteriormente identificadas, por lo que el término C de dicho péptido puede comprender o no un resto de cisteína (indicado por la utilización de paréntesis) de manera que el compuesto obtenido se puede acoplar, por ejemplo, a una molécula portadora. Sin embargo, desde luego también es posible enlazar al término N de dicho péptido un resto de cisteína.

45 Según una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, la secuencia de aminoácidos es IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C) o IRYDMAG(C).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de al menos un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos 50 EX1WHX2X3(X4)n(X5)m (Fórmula II),

en la que

55 X1 es valina (V), arginina (R) o leucina (L), X2 es arginina (R) o ácido glutámico (E), X3 es alanina (A), histidina (H), lisina (K), leucina (L), tirosina (Y) o glicina (G), X4 es prolina (P), histidina (H), fenilalanina (F), glutamina (Q) o cisteína (C) X5 es cisteína (C),

60 n y m son, independientemente, 0 o 1,

presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo del péptido beta-amiloide (Aβ) que comprende la secuencia de aminoácidos EVHHQKL, para producir un medicamento para la prevención y/o tratamiento de β-amiloidosis.

La administración de un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula II provoca una respuesta inmunitaria contra las formas de Aβ truncadas Aβ11-40/42.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C) y ERWHEK(C), preferiblemente EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C) y ELWHRAF(C).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de al menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), DTYFPRS(C), VELRHSR(C), YSMRHDA(C), AANYFPR(C), SPNQFRH(C), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRHHA(C), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL(C), ATPLFRH(C), QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG (C), SAMRHSL(C), TPLMFWH (C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH (C), QSEFKHW(C), AEFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV (C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH y HEFRH(C) para la producción de un medicamento para prevenir y/o tratar β-amiloidosis.

Cada uno de estos compuestos es capaz de inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos contra Aβ1-40/42, AβpE3-40/42 y Aβ3-40/42. Por lo tanto, estos compuestos son particularmente muy adecuados para tratar y/o prevenir β-amiloidosis, tales como EA, porque la administración un compuesto da como resultado la formación de anticuerpos que son capaces de reconocer las tres formas principales de Aβ Aβ1-40/42, AβpE3-40/42 y Aβ3-40/42.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto comprende o consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), SPNQFRH(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), EELRHSV(C), TEFRHKA(C), (C)SEFKH, SEFKH(C),

(C) HEFRH y HEFRH(C), preferiblemente SEFKHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), ILFRHG(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C), TEFRHKA(C).

Se considera que las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria son mimotopos del epítopo de Aβ que comprende la secuencia de aminoácidos EFRHDSGY, pEFRHDSGY o EVHHQKL. Según la presente invención, el término “mimotopo” se refiere a una molécula con una configuración que tiene una topología equivalente al epítopo del que es una imitación. El mimotopo se une a la misma región de unión al antígeno de un anticuerpo que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno deseado. El mimotopo provocará una respuesta inmunológica en un hospedante que es reactivo con el antígeno para el que es una imitación. El mimotopo también puede actuar como un competidor por el epítopo del que es una imitación en ensayos de inhibición in vitro (por ejemplo, ensayos de inhibición ELISA) que implican el epítopo y un anticuerpo que se une a dicho epítopo. Sin embargo, un mimotopo de la presente invención puede no necesariamente prevenir o competir con la unión del epítopo del que es una imitación en un ensayo de inhibición in vitro, aunque es capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica cuando se administra a un mamífero.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “epítopo” se refiere a una región inmunógena de un antígeno que es reconocido por una molécula de anticuerpo concreta. En general, un antígeno poseerá uno o más epítopos, cada uno capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce el epítopo concreto.

Los mimotopos de la presente invención pueden producirse sintéticamente por métodos de síntesis química que son bien conocidos en la técnica, ya sea como un péptido aislado o como parte de otro péptido o polipéptido. Alternativamente, el mimotopo peptídico puede producirse en un microorganismo que produce el mimotopo peptídico, que se aísla a continuación y, si se desea, se purifica posteriormente. El mimotopo peptídico puede producirse en microorganismos tales como bacterias, levaduras u hongos, en células eucariotas tales como una célula de mamífero o una célula de insecto, o en un vector de virus recombinante, tal como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, virus del bosque de Simliki, baculovirus, bacteriófago, virus sindbis o virus sendai. Las bacterias adecuadas para producir el mimotopo peptídico incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra bacteria que sea capaz de expresar péptidos tal como el mimotopo peptídico. Los tipos adecuados de levadura para expresar el mimotopo peptídico incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar péptidos. Los métodos correspondientes son bien conocidos en la técnica. También los métodos para aislar y purificar péptidos producidos de forma recombinante son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.

Para facilitar el aislamiento del mimotopo peptídico, se puede preparar un polipéptido de fusión en el que el mimotopo peptídico se fusiona en la traducción (se une por enlace covalente) a un polipéptido heterólogo que permite el aislamiento por cromatografía de afinidad. los polipéptidos heterólogos típicos son His-Tag (por ejemplo, His6; 6 restos de histidina), GST-Tag (glutationa-S-transferasa), etc. El polipéptido de fusión facilita no sólo la purificación de los mimotopos sino también puede evitar que el polipéptido del mimotopo se degrade durante la purificación. Si se desea eliminar el polipéptido heterólogo después de la purificación, el polipéptido de fusión puede comprender un sitio de escisión en la unión entre el mimotopo peptídico y el polipéptido heterólogo. El sitio de escisión consiste en una secuencia de aminoácidos que se escinde con una enzima específica para la secuencia de aminoácidos en el sitio (por ejemplo, proteasas).

Los mimotopos de la presente invención también pueden modificarse en o cerca de los términos N y/o C, de modo que en dichas posiciones esté unido a los mismos un resto de cisteína. En una forma de realización preferida se usan restos de cisteína colocados en el terminal (situados en los términos N y C del péptido) para ciclar los péptidos mediante un enlace disulfuro. El resto de cisteína también puede servir para unir a dicho péptido/compuesto una molécula adicional (por ejemplo, un portador).

Los mimotopos de la presente invención también se pueden usar en diversos ensayos y kits, en particular en ensayos inmunológicos y kits. Por lo tanto, se prefiere especialmente que el mimotopo pueda formar parte de otro péptido o polipéptido, en particular de una enzima que se usa como informadora en ensayos inmunológicos. Dichas enzimas informadoras incluyen por ejemplo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.

Los mimotopos según la presente invención son preferentemente polipéptidos antigénicos que en su secuencia de aminoácidos varían de la secuencia de aminoácidos de Aβ o de fragmentos de Aβ. A este respecto, los mimotopos de la invención no sólo pueden comprender sustituciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de origen natural, sino también de uno o más aminoácidos no naturales (es decir, no de los 20 aminoácidos “clásicos”), o pueden estar completamente ensamblados de dichos aminoácidos no naturales. Por otra parte, los antígenos de la invención que inducen anticuerpos dirigidos y que se unen a Aβ1-40/42, AβpE3-40/42, Aβ3-40/42 y Aβ11-40/42 pueden ensamblarse de D-o L-aminoácidos o de combinaciones de DL-aminoácidos y, opcionalmente, pueden haberse cambiado por otras modificaciones, cierres de anillo o modificaciones. Se pueden proporcionar antígenos inductores de anticuerpos adecuados procedentes de librerías de péptidos disponibles comercialmente. Preferentemente, estos péptidos son por lo menos de 7 aminoácidos, y las longitudes preferidas pueden ser de hasta 16, preferentemente de hasta 14 o 20 aminoácidos (por ejemplo 5 a 16 restos de aminoácidos). Según la invención, sin embargo, también pueden emplearse perfectamente péptidos más largos como antígenos inductores de anticuerpos. Además, los mimotopos de la presente invención también pueden formar parte de un polipéptido y, por consiguiente, pueden comprender en su término N y/o C al menos otro resto de aminoácido.

Para la preparación de los mimotopos de la presente invención (es decir, los antígenos inductores de anticuerpos descritos en la presente memoria) también son adecuados las librerías de fagos, las librerías de péptidos, por ejemplo producidos por medio de química combinatoria u obtenidos por medio de técnicas de cribado de alto rendimiento para la mayoría de las estructuras variables (Display: A Laboratory Manual por Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. Diciembre 2002; 50 (6):83754).

Además, según la invención también pueden utilizarse antígenos inductores de anticuerpos anti-Aβ1-40/42, antiAβpE3-40/42, anti-Aβ3-40/42 y anti-Aβ11-40/42 a base de ácidos nucleicos (“aptámeros”), y éstos, también, se pueden encontrar con las librerías más variadas (oligonucleótidos) (por ejemplo con 2 a 180 restos de ácidos nucleicos) (por ejemplo, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc.) En antígenos inductores de anticuerpos a base de ácidos nucleicos, la cadena principal de ácido nucleico puede ser proporcionada, por ejemplo, por los compuestos naturales de fosfodiéster o también por fosforotioatos o combinaciones o variaciones químicas (por ejemplo, como APN), en las que como bases, según la invención, pueden emplearse principalmente U, T, A, C, G, H y mC. Los restos en 2’ de los nucleótidos que pueden usarse según la presente invención son preferentemente H, OH, F, Cl, NH2, O-metilo, O-etilo, O-propilo u O-butilo, en los que los ácidos nucleicos también pueden estar modificados de manera diferente, es decir, por ejemplo, con grupos protectores, como se emplean normalmente en la síntesis de oligonucleótidos. Por lo tanto, los antígenos inductores de anticuerpos a base de aptámeros son también antígenos preferidos inductores de anticuerpos dentro del alcance de la presente invención.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto está acoplado a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana), vacuna antitetánica, proteína de unión a albúmina, albúmina de suero bovino, un dendrímero (MAP; Biol. Chem. 358: 581), enlazadores peptídicos (o regiones flanqueantes), así como las sustancias coadyuvantes descritas en Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (en particular las de la Tabla 1 de ese documento) y O’Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (en particular los compuestos endógenos inmunopotenciadores y sistemas de suministro descritos en la presente memoria), o mezclas de los mismos. La química de conjugación (por ejemplo, por medio de compuestos heterobifuncionales tal como GMBS y por supuesto también otros como los descritos en “Bioconjugate Techniques”, Greg T. Hermanson) en este contexto se pueden seleccionar a partir de reacciones

conocidas por el experto en la materia. Además, la composición de vacuna puede formularse con un adyuvante, preferentemente una composición con aluminio poco soluble, en concreto hidróxido de aluminio. Desde luego, también pueden usarse adyuvantes tales como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), saponinas (por ejemplo, QS21), derivados de MDP, oligos CpG, LPS, MPL, polifosfacenos, emulsiones (por ejemplo, de Freund, SAF), liposomas, virosomas, complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), cocleatos, micropartículas de PLG, partículas de poloxámero, partículas similares a virus, enterotoxina lábil al calor (LT), toxina del cólera (TC), toxinas mutantes (por ejemplo, LTK63 y LTR72), micropartículas y/o liposomas polimerizados.

El compuesto de la presente invención está preferentemente unido al vehículo o adyuvante a través de un enlazador, que se selecciona de entre el grupo que consiste en NHS-poli(óxido de etileno) (PEO) (por ejemplo, NHSPEO4-maleimida).

Una vacuna que comprende el presente compuesto (mimotopo) y el vehículo farmacéuticamente aceptable se pueden administrar por cualquier modo adecuado de aplicación, por ejemplo i.d., i.v., i.p., i.m., por vía intranasal, oral, subcutánea, etc., y en cualquier dispositivo de administración adecuado (O’'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). El compuesto de la presente invención se formula preferentemente para administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular (véase, por ejemplo “Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”, Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc., 2004).

El medicamento (vacuna) según la presente invención contiene el compuesto según la invención en una cantidad comprendida entre 0,1 ng y 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 μg, o, alternativamente, por ejemplo, 100 fmoles a 10 μmoles, preferentemente de 10 pmoles a 1 μmoles, en particular 100 pmoles a 100 nmoles. Por lo general, la vacuna puede contener también sustancias auxiliares, por ejemplo tampones, estabilizantes, etc.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de un compuesto como se ha definido anteriormente para el tratamiento y/o la mejora de los síntomas de sinucleopatía.

Sorprendentemente resultó que los compuestos de la presente invención también se pueden usar para tratar y aliviar los síntomas asociados a sinucleopatías.

Las amiloidosis y sinucleopatías están asociadas a la acumulación cerebral de β-amiloide y α-sinucleína, respectivamente. Algunos pacientes presentan características clínicas y patológicas de ambas enfermedades, aumentando la posibilidad de superposición de las vías patógenas. Estos pacientes también se clasifican en la medida en que padecen un síndrome recién identificado descrito como demencia con cuerpos de Lewy o enfermedad de Parkinson con demencia (DLB/PDD). En un modelo animal transgénico reciente para DLB/PDD, se ha demostrado que la sobreexpresión de ambas, α-sinucleína y proteína precursora amiloide (hPPA), en ratones, da lugar al desarrollo de alteraciones cognitivas y motrices acompañadas por la pérdida de neuronas colinérgicas y la reducción en vesículas sinápticas, formación de placas amiloides extensas e inclusiones fibrilares intraneuronales inmunorreactivas a haSYN. Todas estas características se encuentran también en el síndrome de DLB/PDD. Se ha descrito recientemente que ambas moléculas son potencialmente capaces de interactuar y formar oligómeros híbridos in vitro. También se ha demostrado que la sobreexpresión de la PPA puede emperorar algunos de los efectos patológicos de la sobreexpresión de α-sinucleína. Por el contrario, la α-sinucleína puede aumentar la secreción y la toxicidad de los péptidos beta amiloides, y por lo tanto podría también aumentar los efectos de βamiloide, apoyando la noción de la superposición de las vías patógenas en los procesos neurodegenerativos.

En ambas proteopatías, la acumulación progresiva de oligómeros peptídicos se ha identificado como uno de los episodios tóxicos principales que conducen a diversas alteraciones típicas para sinucleopatías o amiloidosis. A pesar de esta similitud mecánica, se supone que β-sinucleína y Aβ tienen efectos patógenos distintos, así como convergentes, sobre la integridad y la función del cerebro. Se cree que las sinucleínas afectan la función motriz de manera más grave que la función cognitiva, mientras que se describe que los péptidos β-amiloides tienen efectos opuestos. La razón de esta discrepancia es actualmente desconocida, pero excluye una descripción clara de las interdependencias y efectos de ambas moléculas.

El enfoque de tratamiento presentado en la presente invención consiste en describir una inmunoterapia dirigida a Aβ que dará lugar a la eliminación del amiloide principalmente extracelular. Así, se considera que alivia las alteraciones asociadas con amiloides, que comprenden desde la deposición de placas hasta la muerte neuronal, así como a problemas de memoria y deterioro cognitivo. La localización subcelular de sinucleínas indica sin embargo que estas proteínas intracelulares son principalmente activas en la sinapsis, especialmente limitadas a las vesículas sinápticas. Curiosamente, también acumulaciones sinucleína, que son el sello patológico unificador de sinucleopatías, se detectan principalmente en el interior de las células. Además, se cree que el mecanismo patogénico que subyace a las sinucleopatías es atribuible a cambios intraneuronales que comprenden desde la disfunción mitocondrial, la acumulación de proteínas replegadas de forma anormal, omnipresentes o fosforiladas, así como la acumulación de alfa sinucleína. Estas alteraciones están produciendo como consecuencia cambios en las funciones sinápticas,

insuficiencia sináptica y pérdida de neuronas dopaminérgicas, y signos clínicos clásicos de sinucleopatías. Por el contrario, Aβ se puede detectar principalmente fuera de las neuronas y placas amiloides, así como en fibrillas, protofibrillas y oligómeros de beta amiloide pueden ejercer funciones neurotóxicas cuando se aplican fuera de las células o en el interior del cerebro. Por lo tanto, es un hallazgo sorprendente para el experto que un enfoque dirigido principalmente al amiloide extracelular podría reducir los síntomas de sinucleopatías como PD, que están afectando principalmente a procesos intracelulares que conducen a los síntomas típicos descritos a continuación. Es aún más sorprendente, como se cree actualmente, que los efectos de superposición de ambas moléculas son producidos por interacciones directas de las dos proteínas que se producirían principalmente en el interior de las células. Según la presente invención, el término “sinucleinopatía” incluye todos los trastornos neurodegenerativos caracterizados por conjuntos patológicos de sinucleína. Varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad con cuerpos de Lewy (ECL), enfermedad difusa con cuerpos de Lewy (EDCL), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), Parkinson con demencia (PDD), atrofia multisistémica (AMS) y neurodegeneración con acumulación de hierro encefálica tipo I (NBIA tipo I) se agrupan en conjunto como sinucleinopatías.

“Síntomas de sinucleopatía”, como se usa en la presente memoria, se refiere a los síntomas de los sinucleopatías, en particular la enfermedad de Parkinson, que afecta el comportamiento motriz y no motriz de un paciente que padece dicha enfermedad. “Los síntomas motores” incluyen temblor en reposo, bradicinesia, rigidez, inestabilidad ortostática, postura encorvada, distonía, fatiga, habilidad alterada de la motricidad fina y coordinación motriz, coordinación motriz gruesa alterada, pobreza de movimiento (disminución del balanceo del brazo), acatisia, problemas del habla, tales como la debilidad de la voz o dificultad para hablar causada por la falta de control muscular, pérdida de la expresión facial, o “máscara”, micrografía, dificultad para tragar, disfunción sexual, babeo, etc. Los síntomas “no motrices” incluyen dolor, demencia o confusión, alteraciones del sueño, estreñimiento, problemas de piel, depresión, miedo o ansiedad, dificultades de memoria y lentitud de pensamiento, problemas urinarios, fatiga y dolor, pérdida de energía, comportamiento compulsivo, calambres, etc.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, la sinucleopatía se selecciona de entre el grupo de la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica y neurodegeneración con acumulación de hierro encefálica. Es particularmente preferida la enfermedad de Parkinson.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un péptido que tiene o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C), IRWDGG(C), EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), EL-WHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C), ERWHEK(C), QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), DTYFPRS(C), VELRHSR(C), YSMRHDA(C), AANYFPR(C), SPNQFRH(C), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRRHA(C), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL(C), ATPLFRH(C), QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), AEFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH y HEFRH(C). Como se indica mediante el uso de paréntesis, los péptidos de la presente invención pueden comprender o no el resto de cisteína en el término C o N. Por consiguiente, la presente invención comprende también las siguientes secuencias de aminoácidos: IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IRWDTSL, IRWDQP, IRWDG, IRWDGG, EVWHRHQ, ERWHEKHC, EVWHRLQ, ELWHRYP, ELWHRAF, ELWHRA, EVWHRG, EVWHRH, ERWHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NWFPHP, EEFKYS, NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS, VELRHSR, YSMRHDA, AANYFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, EDWFFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRHC, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS, EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFWH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS, SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS, NSSELRH, TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C)SEFKH, SEFKH, HEFRH y HEFRH.

Según una realización preferida, el péptido está acoplado a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana).

Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, que comprende al menos un péptido según la presente invención. Dicha formulación farmacéutica puede utilizarse para tratar individuos que padecen β-amiloidosis, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, o para prevenir la formación de placas Aβ en un individuo, para impedir la formación de β-amiloidosis, incluyendo enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se ilustra además mediante las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

la figura 1 muestra la unión del anticuerpo monoclonal MV-001 a péptidos específicos y proteínas recombinantes;

la figura 2 muestra la unión del anticuerpo monoclonal MV-003 a péptidos específicos y proteínas recombinantes;

la figura 3 muestra la unión del anticuerpo monoclonal MV-004 a péptidos específicos y proteínas recombinantes;

la figura 4 muestra ensayos típicos de unión con mimotopos para β-amiloide y fragmentos de β-amiloide truncados N-terminalmente y/o modificados después de la traducción;

la figura 5 muestra ensayos típicos de inhibición con mimotopos para β-amiloide y fragmentos de β-amiloide truncados N-terminalmente y/o modificados después de la traducción;

la figura 6 muestra ejemplos de caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por vacunación con mimotopo (péptido inyectado/péptido irrelevante);

la figura 7 muestra ejemplos para la caracterización in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por vacunación con mimotopo contra fragmentos de beta amiloide;

la figura 8 muestra ejemplos para la caracterización in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación con mimotopo contra Aβ40/42 de longitud completa;

la figura 9 muestra las áreas ocupadas por placas amiloides. Tg2576 se inyectaron 6 veces con vacunas de mimotopo con hidróxido de aluminio (ALUM) como adyuvante mediante inoculación s.c. una vez al mes. Los ratones de referencia recibieron PBS-ALUM solamente. El área ocupada por las placas amiloides se muestra en porcentaje del grupo de referencia. Gr1... grupo de referencia; Gr2... p4381 recibida; Gr3... p4390 recibida; Gr4... p4715 recibida;

la figura 10 muestra las áreas ocupadas por placas amiloides. Tg2576 se inyectaron 6 veces con vacunas de AFFITOPE con hidróxido de aluminio (ALUM) como adyuvante mediante inoculación s.c. una vez al mes. Los ratones de referencia recibieron PBS-ALUM solamente. El área ocupada por las placas amiloides se muestra en porcentaje del grupo de referencia. Gr1... grupo de referencia; Gr2... p4395 recibida.

Ejemplos

Métodos

Los anticuerpos usados para la identificación de mimotopos según la presente invención detectan secuencias de aminoácidos derivadas de Aβ humano pero no se unen a PPA humana de longitud completa. Las secuencias detectadas incluyen EFRHDS (=aa3-8 del epítopo original de Aβ) y p(E)FRHDS (=epítopo original de los aa3-8 modificados de Aβ), EVHHQK (=aa11-16 del epítopo original de Aβ). El anticuerpo puede ser una preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, o cualquier parte de anticuerpo o derivado del mismo, siendo el único requisito previo que la molécula de anticuerpo reconozca específicamente al menos uno de los epítopos mencionados anteriormente (derivado de Aβ humano), pero que no se una a PPA humana de longitud completa.

Los mimotopos se identifican y se caracterizan además con dichas librerías de anticuerpos monoclonales y de péptidos.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales para detectar específicamente -amiloide y fragmentos de -amiloide N-terminalmente truncados y/o modificados después de la traducción

Ejemplo 1a: Generación de anticuerpo monoclonal MV-001

Se generó un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión de Alz-5 experimental: En Alz-5 experimental, ratones C57/B16 se inmunizaron repetidamente con el epítopo original de Aβ DAEFRHDSGYC acoplado a KLH (hemocianina de lapa californiana) y alumbre (hidróxido de aluminio) como adyuvante. Se detectaron hibridomas productores de anticuerpos, específicos del péptido p4371, mediante ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p1253 y p4371). La Aβ40/42 humana (proteína recombinante) se usó como péptido positivo de referencia: se incluyeron hibridomas que reconocen la proteína recombinante inmovilizada sobre placas de ELISA, debido a que se unen específicamente tanto el péptido como Aβ de longitud completa. Se usó p1454 (Aβ 33-40 humano) como péptido negativo de referencia. Además, se ensayaron hibridomas frente a p4373. Sólo los hibridomas sin unión o con unión limitada a p4373 se usaron para el desarrollo de anticuerpo adicional.

El clon MV-001 de hibridoma (denominación interna 824; IgG1), se purificó y analizó para la detección específica de p1253, p4371, p4373, p1454 y Aβ, respectivamente. MV-001 reconoció el epítopo inyectado (p1253) así como el epítopo específico (p4371) y la proteína Aβ de longitud completa (proteína recombinante; adquirida en Bachem AG,

Bubendorf, Suiza) en ELISA. No obstante, no detectó p1454 en ELISA. Además, los anticuerpos MV-001 no pudieron detectar el péptido p4373 que codifica la versión piroglutamato de Aβ3-10 (título 30 veces menor que los epítopos originales).

Ejemplo 1b: Generación de anticuerpo monoclonal MV-003

Se generó un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión de Alz-16 experimental: En Alz-16 experimental, ratones BalbC se inmunizaron repetidamente con el epítopo p(E)FRHDSC (p4373) acoplado a KLH (hemocianina de lapa californiana) y alumbre (hidróxido de aluminio) como adyuvante. Se detectaron hibridomas productores de anticuerpos, específicos del péptido p4373, mediante ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p4373). Se usaron p1253, p1454 y Aβ40/42 como péptidos negativos de referencia. Además, se ensayaron hibridomas frente a p4371. Sólo los hibridomas sin unión o con unión limitada a p4371 se usaron para el desarrollo de anticuerpo adicional, a fin de garantizar la especificidad por piroglutamato.

El clon MV-003 de hibridoma (denominación interna D129; IgG1), se purificó y analizó para la detección específica de p1253, p4371, p4373, p1454 y Aβ, respectivamente. MV-003 reconoció el epítopo inyectado (p4373) pero no detectó p1454, p1253 o proteína Aβ de longitud completa (proteína recombinante; adquirida en Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. Además, los anticuerpos MV-003 no pudieron detectar el péptido p4371 que codifica la versión normal de Aβ3-10 (título 15 veces menor que el epítopo original).

Ejemplo 1c: Generación de anticuerpo monoclonal MV-004

Se generó un anticuerpo monoclonal derivado de la fusión de Alz-15 experimental: En Alz-15 experimental, ratones BalbC se inmunizaron repetidamente con el epítopo EVHHQKC (p4372) acoplado a KLH (hemocianina de lapa californiana) y alumbre (hidróxido de aluminio) como adyuvante. Se detectaron hibridomas productores de anticuerpos, específicos del péptido p4372, mediante ELISA (placas ELISA recubiertas con péptido p4372). Se usaron p4376, p4378, p1454 y Aβ40/42 como péptidos negativos de referencia. Sólo los hibridomas sin unión o con unión limitada a p4376 y a p4378 se usaron para el desarrollo de anticuerpo adicional, a fin de garantizar la especificidad frente al término N libre en la posición aa11.

El clon MV-004 de hibridoma (denominación interna B204; IgG1), se purificó y analizó para la detección específica de p4372, p4376, p4378, p1454 y Aβ, respectivamente. MV-004 reconoció el epítopo inyectado (p4373) pero no detectó p1454, p4376 y p4378 así como proteína Aβ de longitud completa (proteína recombinante; adquirida en Bachem AG, Bubendorf, Suiza) en ELISA. El fracaso para detectar p4376, p4378 demuestra especificidad por el término N libre en la posición aa11 en Aβ truncado.

Ejemplo 2: Presentación de fagos, ELISA de unión e inhibición in vitro

Las librerías de presentación de fagos usadas en este ejemplo fueron: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (librería de heptámeros lineales). La presentación en fagos se realizó según el protocolo del fabricante (www.neb.com).

Después de 2 o 3 rondas posteriores de adhesión celular sobre plástico, se recogieron los clones de fagos individuales, y los sobrenadantes de los fagos se sometieron a ELISA en placas recubiertas con el anticuerpo que se usó para el procedimiento de adhesión celular sobre plástico. Los clones de fagos que fueron positivos en este ensayo ELISA (señal fuerte para la diana, pero sin señal para la referencia no específica) se secuenciaron. A partir de secuencias de ADN, se dedujeron las secuencias de péptidos. Estos péptidos se sintetizaron y caracterizaron en ELISA de unión e inhibición. Además, se crearon algunos mimotopos nuevos combinando la información de secuencia de los mimotopos identificados en el cribado para ayudar a la identificación de una secuencia de consenso para una vacunación con mimotopos.

1.

Ensayo de unión in vitro (ELISA)

Los péptidos derivados de la presentación en fagos así como sus variantes se acoplaron a BSA y se unieron a placas de ELISA (1 μM; como se indica en las figuras respectivas), y posteriormente se incubaron con el anticuerpo monoclonal que se usó para el procedimiento de cribado para analizar la capacidad de unión de los péptidos identificados.

2.

Ensayo de inhibición in vitro (ELISA)

Diferentes cantidades de péptidos (concentraciones comprendidas entre 10 μg y 0,08 μg; diluciones en serie), procedentes de la presentación del fago, se incubaron con el anticuerpo monoclonal que se usó para el procedimiento de cribado. Los péptidos que disminuyen la unión posterior del anticuerpo al epítopo original revestidos sobre placas de ELISA se consideraron inhibidores en este ensayo.

Ejemplo 3: Ensayo in vivo de mimotopos: análisis de la inmunogenicidad y reactividad cruzada

1. Ensayo in vivo de mimotopos

5 Unos péptidos inhibidores así como no inhibidores se acoplaron a KLH y se inyectaron en ratones (ratones C57/B16 de tipo salvaje; inyección subcutánea en el costado), junto con un adyuvante apropiado (hidróxido de aluminio). Los animales se vacunaron 3 a 6 veces a intervalos quincenales, y los sueros se tomaron quincenalmente también. Los títulos de los péptidos inyectados así como de un péptido irrelevante se determinaron con cada suero. Además, los títulos contra la proteína Aβ humana recombinante, y contra péptidos originales se determinaron respectivamente.

10 En general, los sueros se analizaron por reacción contra péptidos acoplados a albúmina de suero bovino (BSA) y proteínas recombinantes de longitud completa, que se inmovilizaron en placas ELISA. Los títulos se determinaron usando anticuerpos anti-ratón específicos para IgG. Para resultados detallados, véanse las Figuras 6, 7 y 8 respectivamente.

15 2. Resultados

2.1. Identificación de anticuerpos monoclonales específicos (mAB) dirigidos contra formas de Aβ N-terminalmente truncadas y modificadas:

20 La figura 1 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-001 (denominación interna 824; IgG1) procedente de Alz-5 experimental que demuestra la especificidad por Aβ de longitud completa y Aβ truncada en la posición E3.

La figura 2 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-003 (denominación interna D129; IgG1)

25 procedente de Alz-16 experimental que demuestra la especificidad por Aβ truncada y modificada postraduccionalmente en la posición p(E)3.

La figura 3 representa la caracterización del anticuerpo monoclonal MV-004 (denominación interna B204; IgG1) procedente de Alz-15 experimental que demuestra la especificidad por Aβ truncada en la posición E11. 30

2.2. Cribado con mAb específicos dirigidos contra formas truncadas N-terminalmente y modificadas de Aβ:

2.2.1. Librería Ph. D. 7 de presentación de fagos

35 2.2.1.1. Cribado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4373

Se identificaron 8 secuencias cribando librerías de presentación de fagos PhD 7 en este cribado: la Tabla 1A resume los péptidos identificados y su capacidad de unión en comparación con el epítopo original.

40 2.2.1.2. Cribado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4372

Se identificaron 9 secuencias cribando librerías de presentación de fagos PhD 7 en este cribado: la Tabla 1B resume los péptidos identificados y su capacidad de unión en comparación con el epítopo original.

45 2.2.1.3. Cribado con anticuerpo monoclonal dirigido contra p4371 Se identificaron 71 secuencias cribando librerías de presentación de fagos PhD 7 y PhD12 en este cribado: la Tabla

1C resume los péptidos identificados y su capacidad de unión en comparación con el epítopo original. 50 Tabla 1A: mimotopos que se unen al anticuerpo parental MV-003

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de unión

p4395

1 IRWDTPC 2

p4396

2 VRWDVYPC 1

p4397

3 IRYDAPLC 1

p4399

4 IRYDMAGC 1

p4728

5 IRWDTSLC 3

p4756

6 IRWDQPC 3

p4792

7 IRWDGC 1

p4793

8 IRWDGGC 2

Leyenda de la Tabla 1A: la capacidad de unión está codificada por el siguiente código de unión: 1: X describe el factor de dilución de la AB parental.

código de unión

OD semimáx 1:X

0

sin unión : 0

1

unión débil : <16000

2

unión media : 16-60000

3

unión fuerte : >60000

Tabla 1B: mimotopos que se unen al anticuerpo parental MV-004

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de unión

p4417

9 EVWHRHQC 2

p4418

10 ERWHEKHC 3

p4419

11 EVWHRLQC 3

p4420

12 ELWHRYPC 2

p4665

13 ELWHRAFC 2

p4786

14 ELWHRAC 1

p4788

15 EVWHRGC 1

p4789

16 EVWHRHC 1

p4790

17 ERWHEKC 1

Leyenda de la Tabla 1B: la capacidad de unión está codificada por el siguiente código de unión: 1: X describe el factor de dilución de la AB parental.

código de unión

OD semimáx 1:X

0

sin unión : 0

1

unión débil : <24000

2

unión media : 24-96000

3

unión fuerte : >96000

Tabla 1C: mimotopos que se unen al anticuerpo parental MV-001

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de unión

p4380

18 QDFRHYC 2

p4381

19 SEFKHGC 3

p4382

20 TSFRHGC 2

p4383

21 TSVFRHC 3

p4384

22 TPFRHTC 2

p4385

23 SQFRHYC 2

p4386

24 LMFRHNC 3

p4387

25 SAFRHHC 2

p4388

26 LPFRHGC 2

p4389

27 SHFRHGC 2

p4390

28 ILFRHGC 3

p4391

29 QFKHDLC 2

p4392

30 NWFPHPC 1

p4393

31 EEFKYSC 2

p4701

32 NELRHSTC 3

p4702

33 GEMRHQPC 3

p4703

34 DTYFPRSC 2

p4704

35 VELRHSRC 2

p4705

36 YSMRHDAC 2

p4706

37 AANYFPRC 2

p4707

38 SPNQFRHC 3

p4708

39 SSSFFPRC 2

p4709

40 EDWFFWHC 1

p4710

41 SAGSFRHC 3

p4711

42 QVMRHHAC 2

p4712

43 SEF5HSSC 3

p4713

44 QPNLFYHC 1

p4714

45 ELFKHHLC 3

p4715

46 TLHEFRHC 3

p4716

47 ATFRHSPC 2

p4717

48 APMYFPHC 2

p4718

49 TYFSHSLC 2

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de unión

p4719

50 HEPLFSHC 1

p4721

51 SLMRHSSC 2

p4722

52 EFLRHTLC 3

p4723

53 ATPLFRHC 3

p4724

54 QELKRYYC 1

p4725

55 THTDFRHC 3

p4726

56 LHIPFRHC 3

p4727

57 NELFKHFC 2

p4729

58 SQYFPRPC 2

p4730

59 OEHPFRHC 3

p4731

60 MLPFRHGC 2

p4732

61 SAMRHSLC 2

p4733

62 TPLMFWHC 1

p4734

63 LQFKHSTC 2

p4735

64 ATFRHSTC 2

p4736

65 TGLMFKHC 2

p4737

66 AEFSHWHC 2

p4738

67 QSEFKHWC 3

p4739

68 AEFMHSVC 2

p4740

69 ADHDFRHC 3

p4741

70 DGLLFKHC 3

p4742

71 IGFRHDSC 2

p4743

72 SNSEFRRC 3

p4744

73 SELRHSTC 3

p4745

74 THMEFRRC 3

p4746

75 EELRHSVC 3

p4747

76 QLFKHSPC 3

p4748

77 YEFRHAQC 3

p4749

78 SNFRHSVC 3

p4750

79 APIQFRHC 3

p4751

80 AYFPHTSC 2

p4752

81 NSSELRHC 3

p4753

82 TEFRHKAC 3

p4754

83 TSTEMWHC 1

p4755

84 SQSYFKHC 3

p4800

85 CSEFKH 3

p4801

86 SEFKHC 3

p4802

87 CHEFRH 3

p4803

88 HEFRHC 3

Leyenda de la Tabla 1C: la capacidad de unión está codificada por el siguiente código de unión: 1: X describe el factor de dilución de la AB parental.

código de unión

OD semimáx 1:X

0

sin unión : 0

1

unión débil : <4000

2

unión media : 4-000-20000

3

unión fuerte : >20000

2.3. Caracterización in vitro de mimotopos identificados en el cribado de librerías de presentación de fagos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra formas de Aβ N-terminalmente truncadas y modificadas:

Las figuras 4 y 5 muestran ejemplos representativos para ensayos de unión e inhibición usados para caracterizar 10 mimotopos in vitro. Los datos obtenidos se resumen en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Mimotopos de MV-003: De las 8 secuencias presentadas, 6 secuencias inhiben la unión del anticuerpo monoclonal específico para p(E)3-7Aβ en experimentos de competición in vitro. Se identificaron 2 secuencias más que no inhiben la unión del anticuerpo monoclonal en experimentos de competición in vitro, pero que todavía conservan la 15 capacidad de unión al anticuerpo parental (Tabla 2A).

Mimotopos de MV-004: Las 9 secuencias presentadas inhiben la unión del anticuerpo monoclonal, específicamente la unión del término N libre de Aβ truncada en la posición E11 en experimentos de competición in vitro (Tabla 2B).

Mimotopos de MV-001: De las 71 secuencias presentadas, 27 secuencias inhiben la unión del anticuerpo monoclonal específicamente dirigido contra Aβ truncada en la posición E3 en experimentos de competición in vitro: Se identificaron 44 secuencias más que no inhiben la unión del anticuerpo monoclonal en experimentos de

5 competición in vitro, pero que todavía conservan la capacidad de unión al anticuerpo parental (Tabla 2C).

Tabla 2: mimotopos identificados en esta invención que dan resultados positivos en ensayos de inhibición

Tabla 2A: Mimótopos de MV-003 10

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de inhibición

p4395

1 IRWDTPC 1

p4397

3 IRYDAPLC 1

p4728

5 IRWDTSLC 2

p4756

6 IRWDQPC 1

p4792

7 IRWDGC 1

p4793

8 IRWDGGC 1

Leyenda a la Tabla 2A: la capacidad de inhibición está codificada por el siguiente código: Inhibición débil significa que se requiere más péptido para diminuir la unión a AB que con el epítopo original; inhibición fuerte significa que se requieren cantidades de péptido similares para mimotopo y epítopo original para diminuir la unión a AB. Los

15 mimotopos se comparan con el péptido original como patrón. OD a 10 ug de péptido usado en el ensayo se usa para calcular la capacidad de competición en comparación con el péptido original.

Código de competición

0

sin inhibición (OD de 10 ug de péptido por encima de 12 veces del péptido original)

1

más débil que el epítopo original (OD de 10 ug de péptido por debajo de 12 veces del péptido original)

2

Inhibición fuerte (como el epítopo original; OD de 10 ug de péptido por debajo de 5 veces del péptido original)

Tabla 2B: Mimótopos de MV-004

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de inhibición

p4417

9 EVWHRHQC 1

p4418

10 ERWHEKHC 2

p4419

11 EVWHRLQC 2

p4420

12 ELWHRYPC 1

p4665

13 ELWHRAFC 2

p4786

14 ELWHRAC 1

p4788

15 EVWHRGC 1

p4789

16 EVWHRHC 1

p4790

17 ERWHEKC 2

Leyenda a la Tabla 2B: la capacidad de inhibición está codificada por el siguiente código: Inhibición débil significa que se requiere más péptido para diminuir la unión a AB que con el epítopo original; inhibición fuerte significa que se requieren cantidades de péptido similares para mimotopo y epítopo original para diminuir la unión a AB. Los

25 mimotopos se comparan con el péptido original como patrón. OD a 10 ug de péptido usado en el ensayo se usa para calcular la capacidad de competición en comparación con el péptido original.

Código de competición

0

sin inhibición (OD de 10 ug de péptido por encima de 5 veces del péptido original)

1

más débil que el epítopo original (OD de 10 ug de péptido por debajo de 5 veces del péptido original)

2

Inhibición fuerte (como el epítopo original; OD de 10 ug de péptido por debajo de 2 veces del péptido original)

Tabla 2C: Mimótopos de MV-001

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de inhibición

p4380

18 QDFRHYC 1

p4381

19 SEFKHGC

p4382

20 TSFRHGC 1

p4383

21 TSVFRHC

Número de péptido interno

SEC ID Nº Secuencia Capacidad de inhibición

p4384

22 TPFRHTC 1

p4385

23 SQFRHYC

p4386

24 LMFRHNC 1

p4387

25 SAFRHHC 1

p4388

26 LPFRHGC 1

p4389

27 SHFRHGC 1

p4390

28 ILFRHGC

p4391

29 QFKHDLC 1

p4392

30 NWFPHPC

p4393

31 EEFKYSC 1

p4707

38 SPNQFRHC

p4715

46 TLHEFRHC

p4725

55 THTDFRHC

p4730

59 DEHPFRHC 1

p4738

67 QSEFKHWC

p4740

69 ADHDFRHC 1

p4741

70 DGLLFKHC 1

p4746

75 EELRHSVC 1

p4753

82 TEFRHKAC 2

p4800

85 CSEFKH 2

p4801

86 SEFKHC 1

p4802

87 CHEFRH 2

p4803

88 HEFRHC 2

Leyenda a la Tabla 2C: la capacidad de inhibición está codificada por el siguiente código: Inhibición débil significa que se requiere más péptido para diminuir la unión a AB que con el epítopo original; inhibición fuerte significa que se requieren cantidades de péptido similares para mimotopo y epítopo original para diminuir la unión a AB. Los mimotopos se comparan con el péptido original como patrón. OD a 10 ug de péptido usado en el ensayo se usa para calcular la capacidad de competición en comparación con el péptido original.

Código de competición

0

sin inhibición (OD de 10 ug de péptido por encima de 3 veces del péptido original)

1

más débil que el epítopo original (OD de 10 ug de péptido por debajo de 3 veces del péptido original)

2

Inhibición fuerte (como el epítopo original; OD de 10 ug de péptido por debajo de 2 veces del péptido original)

Tabla 3: Péptidos no mimótopos

Número de péptido interno

SEC ID nº Secuencia

p1253

89 DAEFRHDSGYC

p4371

90 EFRHDS-C

p4372

91 EVHHQK-C

p4373

92 p(E)FRHDS-C

p4374

93 p(E)VHHQKLVFC

p4376

94 GYEVHHQKC

p4377

95 EVHHQKLVFC

p4378

96 C-EVHHQKLVFF

p1454

97 CGLMVGGW

Aβ1-40

98 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW

Aβ1-42

99 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA

sAPPalfa

100 Producto de escisión inducida por alfa-secretasa derivado de PPA humana (gi:112927)

2.4. Caracterización in vivo de mimotopos identificados en el cribado de librerías de presentación de fagos con un anticuerpo monoclonal dirigido contra formas N-terminalmente truncadas y modificadas de Aβ:

15 Unos ratones C57/B16 hembra, 5 a 6 por grupo, se inmunizaron por vía subcutánea con 30 μg de péptido acoplado a KLH. A los grupos de referencia se les administraron conjugados de epítopo original-KLH respectivamente. Como adyuvante, se usó alumbre (siempre 1 mg por ratón). Los péptidos administrados fueron todos capaces de unirse a anticuerpos monoclonales específicamente, aunque algunos de los péptidos no inhibieron la unión del epítopo original a su anticuerpo parental in vitro (en un ensayo de inhibición in vitro). El ensayo ELISA in vitro para

determinar el título de anticuerpos se realizó con sueros de cada uno de los ratones después de cada vacunación en un intervalo de dos semanas (véanse las figuras 6 y 7, respectivamente). Los pocillos de la placa ELISA se recubrieron con conjugado de mimotopo-BSA y un conjugado de péptido irrelevante-BSA (referencia negativa). La referencia positiva se realizó mediante la reacción del anticuerpo parental con el conjugado de mimotopo-BSA respectivo. La detección se realizó con anti-IgG de ratón. Además, las proteínas recombinantes se inmovilizaron en placas ELISA y los sueros reaccionaron en consecuencia. Las figuras 6 a 8 muestran ejemplos representativos para ensayos usados para caracterizar mimotopos in vivo.

La figura 6 muestra ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación con mimotopos mediante el análisis de la respuesta inmunitaria contra el péptido inyectado y un péptido irrelevante, que contiene una secuencia no relacionada. En los tres ejemplos mostrados, los epítopos y los mimotopos provocaron respuestas inmunitarias contra los péptidos inyectados, pero no pudieron provocar una respuesta inmunitaria pertinente contra una secuencia no relacionada (p1454).

Como ejemplo para mimotopos de MV-003, el epítopo original p4373 y los mimotopos p4395, p4396, p4397, y p4399 se representan en la Figura 6A. Todas las vacunas montan respuestas inmunitarias similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna del epítopo original p4373 tratada ni los animales tratados con vacunas de los mimotopos p4395, p4396, p4397 o p4399 montaron títulos relevantes contra el péptido irrelevante p1454 (11x -25x menor que péptidos inyectados).

Como ejemplo para mimotopos de MV-004, el epítopo original p4372 y los mimotopos p4417, p4418, p4419, y p4420 se representan en la Figura 6B. Todas las vacunas montan respuestas inmunitarias similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna del epítopo original p4372 tratada ni los animales tratados con vacunas de los mimotopos p4417, p4418, p4419, y p4420 montaron títulos relevantes contra el péptido irrelevante p1454 (20-80x menor que péptidos inyectados).

Como ejemplo para mimotopos de MV-001, el epítopo original p4371 y los mimotopos p4381, p4382, y p4390 se representan en la Figura 6C. Todas las vacunas montan respuestas inmunitarias similares contra sus mimotopos respectivos. Ni la vacuna del epítopo original p4371 tratada ni los animales tratados con vacunas de los mimotopos p4381, p4382, y p4390 montaron títulos relevantes contra el péptido irrelevante p1454 (>10x menor que péptidos inyectados).

La figura 7 muestra ejemplos para caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación con mimotopos contra el epítopo original respectivo del anticuerpo parental así como contra el péptido derivado de otras formas de la especie truncada de Aβ.

Como ejemplo para mimotopos de MV-003, el epítopo original p4373 y los mimotopos p4395, p4396, p4397, y p4399 se representan en la Figura 7A. ¾ de las vacunas de mimotopos indicadas montaron respuestas inmunitarias detectables contra el epítopo original p4373. Se puede detectar un fenómeno similar analizando la reactividad cruzada frente a la forma no modificada como se muestra mediante p4371. La vacuna del epítopo original p4373 y 2/4 de las vacunas de mimotopos montaron títulos relevantes contra p4371. Sorprendentemente, los mimotopos seleccionados mediante MV-003, que se une específicamente a p4373, también inducen una reacción inmunitaria que reacciona de forma cruzada con la forma no modificada del epítopo original.

Como ejemplo para mimotopos de MV-004, el epítopo original p4372 y los mimotopos p4417, p4418, p4 419, y p4420 se representan en la Figura 7B. ¾ de las vacunas de mimotopos mostradas montaron respuestas inmunitarias detectables contra el epítopo original p4372.

Como ejemplo para mimotopos de MV-001, el epítopo original p4371 y los mimotopos p4381, p4382, y p4390 se representan en la Figura 7C. Todas las vacunas de mimotopos indicadas montaron respuestas inmunitarias detectables contra el epítopo original p4371. Se puede detectar un fenómeno similar como se describe para mimotopos derivados de MV-003 analizando la reactividad cruzada frente a la forma modificada por piroglutamato como se muestra mediante p4373. La vacuna del epítopo original p4371 y todas las vacunas de mimotopos montaron títulos relevantes contra p4373. Sorprendentemente, los mimotopos seleccionados mediante MV-001, que se une específicamente a p4371, inducen una reacción inmunitaria que reacciona de forma cruzada mejor con la forma modificada del epítopo original que la reacción inmunitaria inducida por el epítopo original inducido o el anticuerpo parental. De este modo, estos mimotopos pueden ser capaces sorprendentemente de inducir, pero no necesariamente inducen, una reacción inmunitaria más amplia que el anticuerpo parental, y se pueden usar para una selección más amplia de formas de Aβ.

La Figura 8 muestra ejemplos de caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación con mimotopos contra Aβ de longitud completa. Sorprendentemente, los mimotopos seleccionados usando MV-001 y MV-003 inducen una reacción cruzada no sólo con los epítopos cortos truncados o modificados usados para crear los anticuerpos, sino también indujeron reactividad cruzada contra las formas de Aβ de longitud completa, no modificadas, tan buena como la secuencia original, o incluso de manera más eficiente que p4371/p4373. Para el epítopo original de MV-002, así como para los mimotopos identificados, no se pudo detectar tal reactividad cruzada, demostrando una transferencia de especificidad del anticuerpo al término N libre de A211-40/42 sin modificar. De este modo, los mimotopos presentados en la presente invención constituyen nuevas vacunas experimentales optimizadas para dirigirse a un amplio espectro de formas de origen natural de los péptidos Aβ que se han encontrado en el cerebro de pacientes con EA. Las formas incluyen pero no se limitan a Aβ1-40/42, y formas

5 truncadas N-terminalmente como Aβ3-40/42, Aβ(pE) 3-40/42 y Aβ11-40/42 sin modificar, respectivamente.

En la Tabla 4 y 5 se describen otros ejemplos de la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación con mimotopos frente a Aβ de longitud completa usando mimotopos derivados de MV-001 y MV-003.

10 Tabla 4: Caracterización in vivo de mimotopos: MV-001

Número de péptido interno

SEC ID nº Detección de formas de Aβ/truncadas/modificadas

p4381

19 +

p4383

21 +

p4385

23 +

p4386

24 +

p4390

28 +

p4707

38 +

p4714

45 +

p4715

46 +

p4725

55 +

p4730

59 +

p4738

67 +

p4740

69 +

p4748

77 +

p4753

82 +

Todos los péptidos presentados en la Tabla 4 montan reacciones inmunitarias específicas contra formas de Aβ de longitud completa y/o truncadas y modificadas, o fragmentos de las mismas.

Tabla 5: Caracterización in vivo de los mimótopos: MV-003

Número de péptido interno

SEC ID nº Detección de formas de Aβ/truncadas/modificadas

p4395

1 +

p4396

2 +

p4397

3 +

p4399

4 +

Todos los péptidos presentados en la Tabla 5 montan reacciones inmunitarias específicas contra formas de Aβ de 20 longitud completa y/o truncadas y modificadas, o fragmentos de las mismas.

2.5: Caracterización in vivo de mimotopos para determinar la eficacia para reducir la EA como enfermedad en animales transgénicos

25 El modelo de ratón de EA Tg2576 se usó para estudiar la eficacia preclínica de las vacunas con mimotopos. Esta estirpe transgénica expresa PPA humana portadora de la doble mutación sueca en la posición de aa 670/671 bajo el control de un promotor de la proteína del prión de hámster (PrP), que da como resultado la sobreexpresión de la proteína. En la actualidad es uno de los modelos más ampliamente utilizado en la investigación de EA. El modelo Tg2576 resume varias características de la patología de EA, incluyendo la deposición de placas amiloides

30 específicas de la enfermedad y astrocitosis. Como todos los demás sistemas modelo de EA disponibles hasta la fecha, no refleja todas las características neuropatológicas fundamentales de la EA.

Para evaluar si el tratamiento con mimotopos es capaz de evitar la acumulación de Aβ en el cerebro, se inyectó por vía s.c. a ratones Tg2576 6 veces a intervalos mensuales con conjugados de péptido-KLH adsorbidos en alumbre 35 (adyuvante: hidróxido de aluminio) o PBS adsorbida en alumbre (denominada PBS o referencia) solo. Ocho semanas después de la última inmunización, los animales se sacrificaron, se recogieron sus cerebros y se analizó su carga de Aβ (patología tipo EA). Los ratones se sacrificaron bajo anestesia profunda. Posteriormente, se aisló el cerebro, se fijó en PFA al 4% y se deshidrató en series de etanol escalonadas, seguido de la incubación en xileno y empapado en parafina. Cada cerebro embebido en parafina se seccionó a 7μM usando un micrótomo de corte en

40 secciones, y las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio.

Como método para ensayar la patología de tipo EA en animales Tg2576, se analizó el área relativa ocupada por depósitos amiloides en el cerebro de los animales tratados. Este análisis se realizó usando un programa automático de reconocimiento de área. Para identificar las placas, las secciones se tiñeron con el anticuerpo monoclonal (mAb) 3A5 (específico para Aβ40/42). Los animales tratados con mimotopos se compararon con los animales de referencia. Todos los animales se han sacrificado a una edad de 13,5 a 14 meses. Para este análisis, se seleccionaron 3 secciones/animales que cubren la corteza cerebral y el hipocampo, se tiñeron con mAb 3A5 y posteriormente se documentaron usando el sistema Mirax (Zeiss). Para el cálculo del área ocupada por placas amiloides, se analizaron

5 hasta cuatro secciones individuales por portaobjetos, y las secciones portadoras de artefactos de tejido e intensidades de tinción anormales se han excluido después de la inspección de las imágenes resultantes.

Para los mimotopos de MV001, se realizó un análisis de área usando tres candidatos ejemplificativos: El análisis se realizó después de la vacunación repetida utilizando vacunas con conjugado péptido-KLH. El grupo referencia

10 presentó una ocupación media del 0,35% en comparación con 0,11%, 0,14% y 0,22% de los animales tratados con mimotopos respectivamente. Esto corresponde a una reducción después del tratamiento con mimotopos de 67% en el grupo 2, una reducción de 60% en el grupo 3, y una reducción de 36% en el grupo 4 (véase la figura 9).

Se puede detectar una imagen similar para el grupo de mimotopos derivados de MV003. Aquí se representa el

15 ejemplo de p4395. Como se describe para los mimotopos derivados de MV001, se ha realizado un análisis del área ocupada por las placas amiloides tras la vacunación del conjugado peptídico. El grupo de referencia mostró una ocupación media de 0,35% en comparación con 0,21% para los animales tratados con mimotopos respectivamente. Esto corresponde a una reducción después del tratamiento con mimotopos de 38% en el grupo 2 (véase figura 10).

20 De este modo, este conjunto de datos indica claramente un efecto beneficioso del tratamiento con la vacuna de mimotopos sobre la EA como patología en animales transgénicos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Utilización de por lo menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEFKHG(C), TLHEFRH(C), ILFRHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C) y TEFRHKA(C) para producir un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la β-amiloidosis.

2. 2.

   Utilización de por lo menos un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos

   X1RX2DX3(X4)n(X4)m(X6)o (Fórmula I),

   en la que

   X1 es isoleucina (I) o valina (V), X2 es triptófano (W) o tirosina (Y), X3 es treonina (T), valina (V), alanina (A), metionina (M), glutamina (Q) o glicina (G), X4 es prolina (P), alanina (A), tirosina (Y), serina (S), cisteína (C) o glicina (G), X5 es prolina (P), leucina (L), glicina (G) o cisteína (C), X6 es cisteína (C), n, m y o son, independientemente, 0 o 1,

   presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo del péptido beta amiloide (Aβ) que comprende la secuencia de aminoácidos EFRHDSGY y/o pEFRHDSGY

   para producir un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la β-amiloidosis.

3. 3.

   Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque el compuesto comprende un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) e IRWDGG(C).

4. 4.

   Utilización de por lo menos un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos

   EX1WHX2X3(X4)n(X5)m (Fórmula II),

   en la que

   X1 es valina (V), arginina (R) o leucina (L), X2 es arginina (R) o ácido glutámico (E), X3 es alanina (A), histidina (H), lisina (K), leucina (L), tirosina (Y) o glicina (G), X4 es prolina (P), histidina (H), fenilalanina (F), glutamina (Q) o cisteína X5 es cisteína (C), n y m son, independientemente, 0 o 1,

   presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo del péptido beta-amiloide (Aβ) que comprende la secuencia de aminoácidos EVHHQKL,

   para producir un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la β-amiloidosis.

5. 5.

   Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque el compuesto comprende un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG(C), EVWHRH(C) y ERWHEK(C), preferentemente EVWHRHQ(C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ(C), ELWHRYP(C) y ELWHRAF(C).

6. 6.

   Utilización de por lo menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en QDFRHY(C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), DTYFPRS(C), VELRHSR(C), YSMRHDA(C), AANYFPR(C), SPNQFRH(C), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRHHA(C), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL (C), ATPLFRH (C), QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), AEFMHSVC(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH y HEFRH(C) para producir un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de la β-amiloidosis.

7. 7.

   Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque el compuesto comprende un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C),

   5 QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), SPNQFRH(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), EELRHSV(C), TEFRHKA(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH y HEFRH(C), preferentemente SEFKHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), ILFRHG(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C), DEHPFRH(C), QSEFKHW(C), ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C), TEFRHKA(C).

   10 8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el compuesto es un polipéptido que comprende 4 a 20 restos de aminoácidos.
8. 9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el compuesto está acoplado a un

   vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana). 15
9. 10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el compuesto se formula para administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
10. 11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el compuesto se formula con un 20 adyuvante, preferentemente hidróxido de aluminio.
11. 12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el compuesto está contenido en el medicamento en una cantidad de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 10 μg.

    25 13. Utilización de un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para tratar y/o aliviar los síntomas de la sinucleopatía.
12. 14. Utilización según la reivindicación 13, caracterizada porque la sinucleopatía se selecciona de entre el grupo de

    enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica y neurodegeneración con 30 acumulación de hierro encefálica.
13. 15. Péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(C), IRYDMAG(C), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C), IRWDGG(C), EVWHRHQ (C), ERWHEKH(C), EVWHRLQ (C), ELWHRYP (C), ELWHRAF(C), ELWHRA(C), EVWHRG (C), 35 EVWHRH (C), ERWHEK(C), QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH (C), LPFRHG(C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NWFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C), GEMRHQP(C), DTYFPRS(C), VELRHSR(C), YSMRHDA(C), AANYFPR(C), SPNQFRH(C), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRHHA(C), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL(C),

    40 ATPLFRH(C), QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG (C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(C), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), AEFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH y HEFRH(C).
14. 16. Péptido según la reivindicación 15, caracterizado porque el péptido está acoplado a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana).
15. 17. Formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, que comprende por lo menos un péptido según la 50 reivindicación 15 o 16.