DE602004013202T2 - Behandlung neurodegenerativer krankheiten durch verwendung von scd4-inhibitoren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle von SCD4 bei der APP-Prozessierung und die Verwendung von SCD4-Inhibitoren bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten.
  • Alzheimer-Krankheit ist ein chronischer Zustand, der Millionen von Individuen weltweit befüllt.
  • Das Gehirn von an Alzheimer-Krankheit Leidenden zeigt eine charakteristische Pathologie von prominenten neuropathologischen Läsionen, wie die initial intrazellulären neurofibrillären Tangles (NFTs) und die extrazellulären amyloidreichen senilen Plaques. Diese Läsionen gehen mit einem massiven Verlust an Populationen von CNS-Neuronen einher, und ihre Progression begleitet die mit AD zusammenhängende klinische Demenz. Die Hauptkomponente der Amyloidplaques sind die Amyloid-Beta (A-Beta, Abeta oder Aβ)-Peptide verschiedener Länge. Eine Variante davon, die das Aβ1-42-Peptid (Abeta-42)-Peptid ist, ist das hauptsächliche kausative Mittel der Amyloidbildung. Eine weitere Variante ist das Aβ1-40-Peptid (Abeta-40). Amyloidbeta ist das proteolytische Produkt eines Vorläuferproteins, beta-Amyloid-Vorläuferprotein (beta-APP oder APP). APP ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das sequenziell durch mehrere verschiedene membranassoziierte Proteasen gespalten wird. Die erste Spaltung von APP erfolgt durch eine von zwei Proteasen, alpha-Sekretase oder beta-Sekretase. alpha-Sekretase ist eine Metalloprotease, deren Aktivität höchstwahrscheinlich durch ein oder eine Kombination der Proteine ADAM10 und ADAM17 bereitgestellt wird. Die Spaltung durch alpha-Sekretase schließt die Bildung von Amyloidpeptiden aus und wird somit als nicht-amyloidogen bezeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Spaltung von APP durch beta-Sekretase eine Vorbedingung für die anschließende Bildung von Amyloidpeptiden. Diese Sekretase, auch BACE1 (Betastellen-APP-Spaltungsenzym) genannt, ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das eine Aspartylproteaseaktivität (im Einzelnen nachstehend beschrieben) enthält.
  • Die beta-Sekretase (BACE)-Aktivität spaltet APP in die Ektodomäne, was zu einer Ausschüttung von sezerniertem löslichem APPb und zu einem C-terminalen 99-Rest- Transmembranfragment (APP-C99) führt. Vassar et al. (Science 286, 735–741) klonierten eine Transmembran-Asparaginprotease, die die Merkmale der postulierten beta-Sekretase von APP aufwies, die sie als BACE1 bezeichneten. Gehirn- und primäre Kortex-Kulturen von BACE1-knockout-Mäusen zeigten keine nachweisbare beta-Sekretase-Aktivität, und primäre Kortex-Kulturen von BACE-knockout-Mäusen produzierten viel weniger Amyloidbeta aus AAP. Dies legt nahe, dass BACE1 die hauptsächliche beta-Sekretase für APP ist, statt sein Paralog BACE2. BACE1 ist ein Protein von 501 Aminosäuren, die ein 21-aa-Signalpeptid, gefolgt von einer Proproteindomäne, die aa 22 bis 45 umspannt, enthält. Alternativ existieren gespleißte Formen (BACE-I-457 und BACE-I-476). Auf die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins folgt eine vorhergesagte Transmembrandomäne und ein kurzer zytosolischer C-terminaler Schwanz von 24 aa. Es wird vorhergesagt, dass BACE1 ein Typ-1-Transmembranprotein ist, mit der aktiven Stelle auf der extrazellulären Seite der Membran, wo beta-Sekretase APP und mögliche andere noch unidentifizierte Substrate spaltet. Obwohl BACE1 eindeutig ein Schlüsselenzym ist, das für die Prozessierung von APP zu A-Beta erforderlich ist, legt ein neuerer Beweis zusätzliche potenzielle Substrate und Funktionen von BACE1 nahe (J. Biol. Chem. 279, 10 542–10 550). Bisher wurden noch keine BACE1-Interaktionsproteine mit regulatorischer oder modulatorischer Funktion beschrieben.
  • Das durch BACE1-Spaltung erzeugte APP-Fragment, APP-C99, ist ein Substrat für die gamma-Sekretase-Aktivität, die APP-C99 innerhalb der Ebene der Membran zu einem Abeta-Peptid (wie das amyloidogene Aβt-42-Peptid) und zu einem C-terminalen APP-Intrazellulärdomäne genannten Fragment (AICD) spaltet (Anno Rev Cell Dev. Biol 19, 25–51). die gamma-Sekretase-Aktivität wohn einem Multiproteinkomplex mit mindestens vier distinkten Untereinheiten inne. Die erste Untereinheit, die entdeckt wurde, war Presenilin (Proc Natl Acad Sci USA 94, 8208–13). Weitere bekannte Proteinkomponenten des gamma-Sekretase-Komplexes sind Pen-2, Nicastrin und Aph-1a.
  • Trotz des jüngsten Fortschritts in der Darstellung molekularer Ereignisse, die der Ätiologie der Alzheimer-Krankheit zugrunde liegen, wurden bisher noch keine krankheitsmodifizierenden Therapien entwickelt. Zu diesem Zweck ist die Industrie bestrebt, geeignete Leitverbindungen zur Hemmung von BACE1 zu identifizieren. Ferner wurde erkannt, dass eine wachsende Anzahl von alternativen Substraten für die gamma-Sekretase existiert, besonders erwähnenswert das Notchprotein. Folglich verursacht die Hemmung von gamma-Sekretase wahrscheinlich Mechanismus-basierte Nebenwirkungen. Derzeitige Spitzenarzneimittel (z. B. Aricept®/Donepezil) versuchen, eine vorübergehende Verbesserung der kognitiven Funktionen durch Hemmung von Acetylcholinesterase zu erreichen, was zu erhöhten Niveaus des Neurotransmitters Acetylcholin im Gehirn führt. Diese Therapien sind für die späteren Stadien der Krankheit nicht geeignet, sie behandeln die zugrunde liegende Krankheitspathologie nicht, und sie stoppen die Krankheitsprogression nicht.
  • Somit besteht ein unerfüllter Bedarf nach der Identifizierung von neuen Zielen, die neue molekulare Strategien für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit erlauben. Zusätzlich besteht ein starker Bedarf nach neuen therapeutischen Verbindungen, die die zuvor genannten molekularen Prozesse durch Ausrichten auf diese neuen Ziele modifizieren.
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines SCD4-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereit, wobei der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen, und wobei der Inhibitor die Aktivität von gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase moduliert.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von Funktionstests überraschenderweise gefunden, dass SCD4 ein neues Ziel ist, das neue Therapien zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit möglich macht.
  • Die Identifizierung von SCD4 als ein Schlüssel-Zielmolekül gestattet die Verwendung von SCD4-Interaktionsmolekülen zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten. Dies wird insbesondere im Beispielabschnitt (infra) gezeigt, wobei gezeigt wird, dass siRNA, die gegen SCD4 gerichtet ist, zu einer herabgesetzten oder abgeschwächten Sekretion/Generation von Abeta-42 führt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein "SCD4-Interaktionsmolekül" ein Molekül, das mindestens zeitweise an SCD4 bindet und das vorzugsweise die SCD4-Aktivität moduliert.
  • Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD) ist das geschwindigkeitslimitieremde Enzym bei der Biosynthese von einfach ungesättigten Fettsäuren. Mindestens vier Isozyme existieren in der Maus (SCD1 bis SCD4). Das Enzym wandelt Stearat (und Palmitat) in einfach ungesättigte Fettsäuren (meistens Oleat; C18:1) um.
  • In Menschen existieren anscheinend nur zwei orthologe SCD-Gene (SCD1 und SCD4). Menschliches SCD4 (siehe 3, auch als Hypothetisches Protein FLJ21032 bekannt) entspricht SCD1 in einer Sequenzspanne, die die katalytische Domäne enthält, ist jedoch ansonsten recht verschieden. Menschliches SCD4 ist auf dem Chromosom 4q21.3 lokalisiert.
  • Ein neuerer Beweis legt nahe, dass menschliches SCD4 ein gehirnspezifisches Enzym in menschlichen Feten ist und dass das Gen in einer Familie mit Hasenscharte unterbrochen ist (Beiraghi S., Zhou M, Talmadge CB, Went-Sumegi N, Davis JR, Huang D, Saal H, Seemager TA, Sumegi J (2003) Identification and characterization of a novel gene disrupted by a percentric inversion inv(4)(p13.1q21.1) in a family with cleft lip. Gene. 309 (1): 11–21). Allerdings fanden Beiraghi et al. keine Expression von SCD4 in einem adulten menschlichen Gewebe.
  • Im Gegensatz dazu wurde im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung gefunden, dass SCD4 stark auf viel höheren Niveaus in einem adulten menschlichen Gehirn exprimiert ist als in jedem anderen analysierten Gewebe (siehe 1).
  • Erfindungsgemäß bedeutet demnach der Begriff "SCD4" nicht nur das Protein, wie in 3 gezeigt, sondern auch ein funktionell aktives Derivat davon oder ein funktionell aktives Fragment davon oder ein Homolog davon oder eine Variante, die von einer Nukleinsäure codiert wird, die an die Nukleinsäure hybridisiert, die das Protein unter niedrigen Stringenzbedingungen codiert. Vorzugsweise umfassen diese niedrigen Stringenzbedingungen die Hybridisierung in einem Puffer, umfassend 35% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% RSA, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat, für 18–20 Stunden bei 40°C, Waschen in einem Puffer, bestehend aus 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS, für 1–5 Stunden bei 55°C und Waschen in einem Puffer, bestehend aus 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS, für 1,5 Stunden bei 60°C.
  • Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff "funktionell aktiv", wie hier verwendet, auf ein Polypeptid, nämlich ein Fragment oder Derivat mit strukturellen, regulatorischen oder biochemischen Funktionen des Proteins gemäß der Ausführungsform, mit der dieses Polypeptid, nämlich dieses Fragment oder Derivat, im Zusammenhang steht.
  • In dem Falle von SCD4 bedeutet ein funktionell aktives Derivat vorzugsweise ein Derivat, das im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie SCD4 ausübt, z. B. wandelt es Stearat (und Palmitat) in einfach ungesättigte Fettsäuren (meistens Oleat; C18:1) um und/oder ist imstande eine ähnliche Rolle wie SCD4 bei der Abeta-42-Sekretion zu spielen.
  • Die Aktivität von SCD4 (als eine Delta-9-Desaturase-Aktivität) sowie eines funktionell aktiven Derivates davon kann gemessen werden, wie bei Obukowicz MG et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (JPET) 287: 157–166 (1998) beschrieben.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff "Aktivität", wie hier verwendet, auf die Funktion eines Moleküls in seinem weitesten Sinne. Er umfasst im Allgemeinen, ist jedoch nicht beschränkt auf, biologische, biochemische, physikalische oder chemische Funktionen des Moleküls. Er umfasst beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Fähigkeit zur Interaktion mit anderen Molekülen und die Fähigkeit zur Aktivierung, Erleichterung, Stabilisierung, Hemmung, Unterdrückung oder Destabilisierung der Funktion von anderen Molekülen, die Stabilität, Fähigkeit zur Lokalisierung an bestimmten subzellulären Lokationen. Wo zutreffend, betrifft der Begriff auch die Herabsetzung oder Abschwächung der Sekretion von Abeta-42, wenn das Molekül gehemmt ist.
  • Erfindungsgemäß umfassen die Begriffe "Derivate" oder "Analoge" von SCD4 oder "Varianten", wie hier verwendet, vorzugsweise Moleküle, die Regionen einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, die im Wesentlichen zu dem SCD4, in verschiedenen Ausführungsformen, homolog sind, eine Identität von mindestens 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% gegenüber einer Aminosäuresequenz von identischer Größe oder im Vergleich mit einer Abgleichssequenz, wobei der Abgleich durch ein Computerhomologieprogramm, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, vorgenommen wird, oder deren codierende Nukleinsäure imstande ist, mit einer Sequenz zu hybridisieren, die das Protein unter stringenten, mäßig stringenten oder nicht-stringenten Bedingungen zu codieren vermag. Die katalytische Domäne kann höher konserviert sein als eine nicht-katalytische Region des Proteins. Darum können die obigen prozentualen Identitäten höher sein, wenn eine Region, die das Gesamte oder einen Teil der katalytischen Domäne umfasst oder daraus besteht, gewählt wird (z. B. 85%, 90%, 95% oder 99%), oder sie können niedriger sein, wenn eine Region, die die katalytische Domäne nicht umfasst, gewählt wird (z. B. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%). Das bedeutet, ein Protein, das das Ergebnis einer Modifikation des natürlich vorkommenden Proteins durch Aminosäuresubstitutionen, Deletionen bzw. Additionen ist, wobei die Derivate immer noch die biologische Funktion des natürlich vorkommenden Proteins aufweisen, obwohl nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß. Die biologische Funktion von solchen Proteinen kann z. B. durch geeignete zur Verfügung stehende in vitro Tests, wie bei der Erfindung bereitgestellt, untersucht werden.
  • Der Begriff "Fragment", wie hier verwendet, bezieht sich gemäß der Ausführungsform auf ein Polypeptid von mindestens 10, 20, 30, 40 oder 50 Aminosäuren des Proteins, insbesondere SCD4. Bei speziellen Ausführungsformen sind solche Fragmente nicht länger als 35, 100 oder 200 Aminosäuren.
  • Der Begriff "Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die ein offenes Leseraster einschließt, das, sofern nicht anderweitig angegeben, ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, einschließlich sowohl von Exon- als auch gegebenenfalls Intron-Sequenzen.
  • Der Begriff "homolog" oder "homologe Genprodukte", wie hier verwendet, bedeutet ein Protein in einer anderen Spezies, vorzugsweise in Säugern, welches die gleiche biologische Funktion wie das hier beschriebene Protein, insbesondere SCD4, ausübt. Solche Homologe werden auch als "orthologe Genprodukte" bezeichnet. Der Algorithmus zum Nachweis von orthologen Genpaaren aus Menschen und Säugern oder anderen Spezies, verwendet das gesamte Genom dieser Organismen. Als Erstes werden die paarweise besten Treffer unter Verwendung eines vollständigen Smith-Waterman-Abgleiches von zuvor berechneten Proteinen zusammengetragen. Um die Zuverlässigkeit weiterhin zu verbessern, werden diese Paare mit den paarweise besten Treffern geclustert, einschließlich von Drosophila melanogaster- und C. elegans-Proteinen. Eine solche Analyse ist zum Beispiel in Nature, 2001, 409: 860–921, angegeben. Die Homologen der erfindungsgemäßen Proteine können entweder auf der Grundlage der Sequenzhomologie der Gene, die die hier bereitgestellten Proteine codieren, mit den Genen von anderen Spezies durch Klonieren des entsprechenden Gens, wobei herkömmliche Technik angewandt wird, und Expression des Proteins aus einem solchen Gen oder durch andere, allgemein auf dem Fachgebiet bekannte geeignete Verfahren isoliert werden.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff "Inhibitor" auf ein SCD4-Interaktionsmolekül, das eine biochemische oder chemische Verbindung ist, die vorzugsweise die Aktivität von SCD4 hemmt oder herabsetzt. Dies kann z. B. über Suppression der Expression des entsprechenden Gens erfolgen. Die Expression des Gens kann durch RT-PCR- oder Westernblot-Analyse gemessen werden. Außerdem kann dies über die Hemmung der Aktivität, z. B. durch Binden an SCD4, erfolgen.
  • Beispiele für solche SCD4-Inhibitoren sind Bindungsproteine oder Bindungspeptide, die gegen SCD4, insbesondere gegen die aktive Stelle von SCD4 gerichtet sind, und Nukleinsäuren, die gegen das SCD4-Gen gerichtet sind.
  • Der Begriff "Nukleinsäuren gegen SCD4" bezieht sich auf doppelsträngige oder einzelsträngige DNA oder RNA oder eine Modifikation oder ein Derivat davon, welches beispielsweise die Expression des SCD4-Gens oder die Aktivität von SCD4 hemmt und, uneingeschränkt, Antisense-Nukleinsäuren, Aptamere, siRNAs (small interfering RNAs) und Ribozyme einschließt.
  • Der Inhibitor kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA, niedermolekularen Molekülen (LMWs), Bindungspeptiden, Aptameren, Ribozymen und Peptidomimetika.
  • LMWs sind Moleküle, die keine Proteine, Peptide, Antikörper oder Nukleinsäuren sind und die ein Molekulargewicht von weniger als 5 000 Da, vorzugsweise von weniger als 2 000 Da, stärker bevorzugt von weniger als 2 000 Da, am stärksten bevorzugt von weniger als 500 Da aufweisen. Solche LMWs können in durchsatzstarken Verfahrensweisen, ausgehend von Bibliotheken, identifiziert werden. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden nachstehend im Einzelnen besprochen.
  • Diese Nukleinsäuren können direkt an eine Zelle verabreicht werden, oder können intrazellulär durch Transkription von exogenen eingeführten Sequenzen produziert werden.
  • Eine "Antisense"-Nukleinsäure, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die imstande ist, an einen sequenzspezifischen Teil einer Protein-codierenden RNA (vorzugsweise mRNA) aufgrund einer gewissen Sequenzkomplementarität zu hybridisieren. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einer codierenden und/oder nicht-codierenden Region einer mRNA sein. Solche Antisense-Nukleinsäuren, die die Proteinexpression oder -aktivität hemmen, besitzen als Therapeutika Anwendung und können bei der Behandlung oder Prävention von Störungen, wie hierin beschrieben, eingesetzt werden.
  • Die Antisense-Nukleinsäuren bestehen aus mindestens sechs Nukleotiden und sind vorzugsweise Oligonukleotide im Bereich von 6 bis etwa 200 Nukleotiden. In speziellen Aspekten ist das Nukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide oder mindestens 200 Nukleotide lang.
  • Die Nukleinsäuren, z. B. die Antisense-Nukleinsäuren oder siRNAs, können chemisch synthetisiert werden, z. B. gemäß dem Phosphotriesterverfahren (siehe beispielsweise Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543–584). Aptamere sind Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid, hier SCD4, binden. Aptamere können durch Selektionsverfahren, wie SELEX (siehe z. B. Jayasena (1999) Clin. Chem. 456, 1 628–50; Klug and Famulok (1994), M. Mol. Biol. Rep., 20, 97–107; US 5 582 981 ) aus einem großen Pool von verschiedenen einzelsträngigen RNA-Molekülen isoliert werden. Aptamere können auch synthetisiert und in ihrer spiegelbildlichen Form selektiert werden, beispielsweise als das L-Ribonukleotid (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1 116–9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1 112–5). Formen, die auf diese Weise isoliert worden sind, erfreuen sich des Vorteils, dass sie durch natürlich vorkommende Ribonukleasen nicht abgebaut werden und darum eine größere Stabilität besitzen.
  • Nukleinsäuren können durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch DNAsen und RNasen abgebaut werden, die in der Zelle gefunden werden können. Es ist darum von Vorteil, die Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie geben Abbau zu stabilisieren, wodurch sichergestellt wird, dass eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle während eines langen Zeitraums beibehalten wird (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3 989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch Einbringen von einer oder mehreren internukleotidischen Phosphorgruppen oder durch Einbringen von einem oder mehrere Nicht-Phosphorinternukleotiden erhalten werden.
  • Geeignete modifizierte Internukleotide sind bei Uhlmann and Peymann (1990), supra (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3 989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ) zusammengetragen. Modifizierte internukleotidische Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden können, enthalten beispielsweise Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat und/oder Phosphatester, wohingegen Nichtphosphor-Internukleotidanaloge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Beabsichtigt ist auch, dass diese Modifikation die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden kann, verbessern sollte. Im Allgemeinen kann das Oligonukleotid an der Raseneinheit, Zuckereinheit oder am Phosphat-Grundgerüst modifiziert werden.
  • Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen einschließen, wie Peptide, Mittel, die den Transport über die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6 553–6 556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acas. Sci. USA 84: 648–652; International Patent Publication No. WO 88/09810 ) oder über die Bluthirnschranke erleichtern (siehe z. B. die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/10134 ), Hybridisierungs-ausgelöste Spaltungsmittel (siehe z. B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958–976) oder Interkalationsmittel (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549) einschließen.
  • Im Einzelnen können die Antisense-Oligonukleotide mindestens eine modifizierte Raseneinheit einschließen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Iospentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, D-Mannosylqueosin, 5N- Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
  • Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Zuckereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, die Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose einschließt, jedoch nicht darauf begrenzt ist.
  • Die Verwendung von geeigneten Antisense-Nukleinsäuren wird weiterhin beschrieben z. B. bei Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380–2; Nellen und Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419–23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697–74 oder Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1 142).
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid eine 2-α-anomere Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten, die Stränge zueinander parallel verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6 625–6 641).
  • Das Oligonukleotid kann mit einem anderen Molekül, z. B. einem Peptid, einem Hybridisierungs-ausgelösten Vernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem Hybridisierungs-ausgelösten Spaltungsmittel etc. konjugiert sein.
  • In der Erfindung können erfindungsgemäße Oligonukleotide durchwegs durch auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. durch die Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (wie im Handel von der Firma Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich). Als Beispiele können Phosphorothioat-Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3 209) synthetisiert werden, Methylphosphonatoligonukleotide können durch die Verwendung von kontrollierten Porenglas-Polymerträgern hergestellt werden (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7 448–7 451) etc.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonukleotide katalytische RNAs oder Ribozyme (siehe die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/11364 ; Sarver et al., 1990, Science 247: 1 222–1 225). Bei einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6 131–6 148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al., 1987, FERS Lett. 215: 327–330).
  • Bei einer alternativen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren intrazellulär durch Transkription aus einer exogenen Sequenz produziert. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo so eingebracht werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird, innerhalb welcher Zelle der Vektor oder ein Teil davon transkribiert wird, wodurch eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure (RNA) produziert wird. Ein solcher Vektor würde eine Sequenz, die das Protein codiert, enthalten. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Solche Vektoren können durch DNA-rekombinationstechnische Verfahren, die auf dem Fachgebiet Standard sind, konstruiert werden. Vektoren können plasmidisch, viral oder anders, wie auf dem Fachgebiet bekannt sein, um in zur Replikation und Expression in Säugerzellen imstande zu sein. Die Expression der Sequenzen, die die Antisense-RNAs codieren, kann durch jeden auf dem Fachgebiet zur Wirkung in Säuger-, vorzugsweise menschlichen Zellen bekannten Promotor erfolgen. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die SV40 frühe Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promotor, der in der 3'-langen terminalen Wiederholungseinheit des Rous sarcoma-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1 441–1 445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42) etc.
  • Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren umfassen eine Sequenz, die zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts eines Proteingens, vorzugsweise eines menschlichen Gens, stärker bevorzugt das menschliche SCD4-Gen, komplementär ist. Allerdings ist absolute Komplementarität, obwohl bevorzugt, nicht erforderlich. Eine Sequenz, die, wie hierin bezeichnet, "zu mindestens einem Teil einer RNA komplementär" ist, bedeutet eine Sequenz mit einer ausreichenden Komplementarität, um imstande zu sein, mit der RNA zu hybridisieren und einen stabilen Doppelstrang zu bilden; im Falle von doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein Einzelstrang der doppelsträngigen DNA getestet werden, oder eine Triplexbildung kann untersucht werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung hängt sowohl von dem Komplementaritätsgrad als auch von der Länge der Antisense-Nukleinsäure ab. Im Allgemeinen gilt, je länger die hybridisierende Nukleinsäure, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer RNA kann sie enthalten und immer noch einen stabilen Doppelstrang (oder gegebenenfalls Dreifachstrang) bilden. Ein Fachmann kann einen tolerierbaren Fehlpaarungsgrad durch die Verwendung von Standardverfahrensweisen zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes sicherstellen.
  • Die Herstellung und Verwendung von siRNAs als Werkzeuge für RNA-Interferenz bei dem Verfahren zur Abregulierung oder zum Abschalten der Genexpression, hier der SCD4-Genexpression, ist z. B. beschrieben bei Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188, oder Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494. Vorzugsweise zeigen siRNAs eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden, wobei die Identitätsspanne des Sense-Stranges der siRNA vorzugsweise mindestens 19 Nukleotide beträgt.
  • Ribozyme sind ebenfalls geeignete Werkzeuge zur Hemmung der Translation von Nukleinsäuren, hier das SCD4-Gen, da sie imstande sind, spezifisch zu binden und die mRNAs zu schneiden. Sie sind z. B. bei Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sic., 54, 1 175–202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5 237–42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921–2 oder Couture und Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510–5 beschrieben.
  • Pharmazeutische erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer Nukleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, können einem Patienten mit einer Krankheit oder einer Störung, die von einem Typ ist, der SCD4 exprimiert oder überexprimiert, verabreicht werden.
  • Die Menge der Nukleinsäure, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Wo möglich, ist es erwünscht, die Nukleinsäure-Zytotoxizität in vitro und dann, vor der Testung und Anwendung bei Menschen, in geeigneten Tiermodellen zu bestimmen.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren umfassen, über Liposome, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann es geeignet sein, solche Zusammensetzungen zu verwenden, um verzögerte Freisetzung der Nukleinsäuren zu erzielen. Bei einer speziellen Ausführungsform kann es erwünscht ist, Liposomen zu verwenden, die über Antikörper auf spezielle identifizierbare Zentralnervensystem-Zelltypen gerichtet werden (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2 448–2 541; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265; 16 337–16 342).
  • Der Begriff "Bindungsprotein" oder "Bindungspeptid" bezieht sich auf eine Klasse von Proteinen oder Peptiden, die SCD4 binden und hemmen, und umfasst, uneingeschränkt, polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Proteingerüste, die gegen SCD4 gerichtet sind.
  • Erfindungsgemäß wird auch der Begriff Antikörper oder Antikörperfragment so verstanden, dass er Antikörper oder Antigen-bindende Teile davon bedeutet, die rekombinant hergestellt und, wo angemessen, modifiziert wurden, wie chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper und F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe beispielsweise EP-B1-0 368 684 , US 4 816 567 , US 4 816 397 , WO 88/01649 , WO 93/06213 oder WO 98/24884 ), die vorzugsweise mithilfe einer FAB-Expressionsbibliothek hergestellt werden.
  • Als eine Alternative zu den klassischen Antikörpern ist es beispielsweise auch möglich, Proteingerüste gegen SCD4 zu verwenden, z. B. Anticaline, die auf Lipocain basieren (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1 898–1 903). Die natürlichen Ligandenbindenden Stellen der Lipocaline, beispielsweise das Retinol-Bindungsprotein oder das Bilin-Bindungsprotein können, beispielsweise mittels eines "kombinatorischen Proteindesign Ansatzes, auf eine solche Weise verändert werden, dass sie an ausgewählte Haptene, hier an SCD4, binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1 482, 337–50). Von weiteren bekannten Proteingerüsten ist bekannt, dass sie Alternativen zu Antikörpern zur Molekülerkennung sind (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167–187).
  • Die Vorgehensweise zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments wird gemäß Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann wohl bekannt sind, z. B. durch Immunisieren eines Saugers, beispielsweise eines Kaninchens, mit SCD4, wo angemessen, in Gegenwart beispielsweise von Freund's Adjuvans und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe beispielsweise Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1 344–1 349). Die polyklonalen Antikörper, die in dem Tier als ein Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebildet werden, können anschließend aus dem Blut unter Verwendung von wohl bekannten Verfahren isoliert und beispielsweise mittels Säulenchromatographie gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können beispielsweise gemäß dem bekannten Verfahren von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293–299) hergestellt werden.
  • Im Einzelnen können polyklonale Antikörper, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisieren eines geeigneten Individuums mit einem Polypeptid als ein Immunogen hergestellt werden. Bevorzugte polyklonale Antikörperzusammensetzungen sind diejenigen, die für Antikörper ausgewählt wurden, die gegen ein Polypeptid oder Polypeptide der Erfindung gerichtet sind. Besonders bevorzugte polyklonale Antikörper-Präparationen sind diejenigen, die nur Antikörper enthalten, die gegen ein gegebenes Polypeptid oder Polypeptide gerichtet sind. Besonders bevorzugte Immunogenzusammensetzungen sind diejenigen, die keine anderen menschlichen Proteine enthalten, wie beispielsweise Immunogenzusammensetzungen, die unter Verwendung einer nicht-humanen Wirtszelle zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids hergestellt wurden. Auf eine solche Weise ist das einzige menschliche Epitop oder Epitope, die von den resultierenden Antikörperzusammensetzungen erkannt werden, die gegen dieses Immunogen gezüchtet wurden, als Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder erfindungsgemäßer Polypeptide vorhanden.
  • Der Antikörpertiter in dem immunisierten Individuum kann zeitlich durch Standardtechniken aufgezeichnet werden, wie mit einem enzym linked immunosorbent Test (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem Polypeptid. Falls gewünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säuger (z. B. aus dem Blut) isoliert und durch wohl bekannte Techniken, wie Protein A-Chromatographie, weiter aufgereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Alternativ kann auf Antikörper, die auf ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid spezifisch sind, selektiert werden (z. B. teilweise gereinigt werden) oder z. B. durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Beispielsweise wird ein erfindungsgemäßes rekombinant exprimiertes und gereinigtes (oder teilweise gereinigtes) Protein wie hier beschrieben hergestellt und kovalent oder nicht-kovalent an einen festen Träger gekoppelt, wie beispielsweise eine Chromatographiesäule. Die Säule kann dann zur Affinitätsreinigung von Antikörpern, die auf die erfindungsgemäßen Proteine spezifisch sind, aus einer Probe, die Antikörper enthält, die gegen eine große Anzahl von verschiedenen Epitopen gerichtet sind, eingesetzt werden, wodurch eine im Wesentlichen aufgereinigte Antikörperzusammensetzung erzeugt wird, d. h. eine Antikörperzusammensetzung, die im Wesentlichen frei von verunreinigenden Antikörpern ist. Mit einer im Wesentlichen gereinigten Antikörperzusammensetzung ist in diesem Zusammenhang gemeint, dass die Antikörperprobe höchstens nur 30% (bezogen auf das Trockengewicht) von verunreinigenden Antikörpern enthält, die gegen Epitope gerichtet sind, die anders sind als diejenigen auf dem gewünschten erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid, und vorzugsweise höchstens 20%, noch mehr bevorzugt höchstens 10% und am stärksten bevorzugt höchstens 5% (bezogen auf das Trockengewicht) der Probe, verunreinigende Antikörper sind. Eine gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet, dass mindestens 99% der Antikörper in der Zusammensetzung gegen das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gerichtet sind.
  • Zu einer entsprechenden Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die spezifischen Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper-produzierende Zellen aus den Individuum erhalten und zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Standardtechniken, wie Hybridomtechniken, die ursprünglich von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495–497, beschrieben sind, die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72), die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) oder die Triomtechniken, verwendet werden. Die Technologie zur Herstellung von Hybridomen ist wohl bekannt (siehe allgemein Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et al. (Hrsg.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Hybridomzellen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden durch Screening der Hybridom-Kulturüberstände auf Antikörper, die das Polypeptid von Interesse binden, z. B. unter Verwendung eines standardmäßigen ELISA-Tests, nachgewiesen.
  • Alternativ können zur Herstellung monoklonaler Antikörper-sezernierender Hybridome ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist, durch Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulinbibliothek (z. B. eine Antikörperphage-Displaybibliothek) mit dem Polypeptid von Interesse identifiziert und isoliert werden. Testsätze zur Erzeugung und zum Screening von Phage-Displaybibliotheken sind im Handel erhältlich (z. B. the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; und the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Katalog Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die für die Verwendung bei der Erzeugung und Screening von einer Antikörper-Displaybibliothek besonders geeignet sind, beispielsweise gefunden werden in der US-Patentschrift Nr. 5 223 409 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18619 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17271 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/20791 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/15679 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/01288 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/01047 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/09690 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02809 ; der Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1 370–1 372; der Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81–85; der Huse et al., 1989, Science 246; 1 275–1 281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12: 725–734.
  • Zusätzlich liegen rekombinante Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl humane als auch nicht-humane Teile einschließen, die unter Verwendung von standardmäßigen DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden können, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem sich verschiedene Teile von verschiedenen Tierspezies ableiten, wie diejenigen mit einer variablen Region, die sich von einer murinen mAb- und einer humanen Immunglobulinkonstanten Region ableiten. (Siehe z. B. Cabilly et al., US-Patentschrift Nr. 4 816 567 ; und Boss et al., US-Patentschrift Nr. 4 816 397 , die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit eingeschlossen sind.) Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus einer nicht-menschlichen Spezies mit einer oder mehreren komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) aus der nicht-menschlichen Spezies und mit einer Gerüstregion aus einem menschlichen Immunglobulinmolektil. (Siehe z. B. Queen, US-Patentschrift Nr. 5 585 089 , die hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme mit umfasst ist.) Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch DNA-Rekombinationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671 ; der europäischen Patentanmeldung 184 187 ; der europäischen Patentanmeldung 171 496 ; der europäischen Patentanmeldung 173 494 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 ; der US-Patentschrift Nr. 4 816 567 ; der europäischen Patentanmeldung 125 023 ; Retter et al., 1988, Science 240: 1 041–1 043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3 439–3 443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3 521–3 526; Sum et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1 005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1 553–1 559); Morrison, 1985, Science 229: 1 202–1 207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; US-Patentschrift 5 225 539 ; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1 534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4 053–4 060, beschrieben sind.
  • Komplett menschliche Antikörper sind besonders für die therapeutische Behandlung von menschlichen Patienten erwünscht. Solche Antikörper können beispielsweise unter Verwendung von transgenen Mäusen produziert werden, die nicht imstande sind, endogenes Immunglobulin-schwere und leichte Ketten-Gene zu exprimieren, die allerdings menschliche schwere und leichte Ketten-Gene exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden auf normale Weise mit einem selektierten Antigen, z. B. alles oder ein Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids, immunisiert. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung herkömmlicher Hybridomtechniken erhalten werden. Die humanen Immunglobulintransgene, die von den transgenen Mäusen beherbergt werden, gehen während der B-Zellendifferenzierung eine Umlagerung ein und durchlaufen anschließend eine Klassenverschiebung und eine somatische Mutation. Somit ist es unter Verwendung einer solchen Technik möglich, therapeutisch geeignete IgG-, IgA- und IgE-Antikörper zu produzieren. Ein Überblick über diese Technik zur Produktion menschlicher Antikörper siehe Lonberg und Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93). Für eine ausführliche Besprechung dieser Technologie zur Produktion menschlicher Antikörper und menschlicher monoklonaler Antikörper und Protokolle zur Produktion solcher Antikörper siehe z. B. US-Patentschrift 5 625 126 ; US-Patentschrift 5 633 425 ; US-Patentschrift 5 569 825 ; US-Patentschrift 5 661 016 und US-Patentschrift 5 545 806 . Zusätzlich können Firmen wie Abgenix, Inc. (Freemont, CA) beauftragt werden, um menschliche Antikörper, die gegen ein selektiertes Antigen gerichtet sind, unter Verwendung einer Technologie entsprechend derjenigen, die vorstehend beschrieben ist, bereitzustellen.
  • Komplett humane Antikörper, die ein selektiertes Epitop erkennen, können unter Verwendung einer Technik erzeugt werden, die als "geführte Selektion" bezeichnet wird. Bei diesem Ansatz wird ein selektierter nicht-humaner monoklonaler Antikörper, z. B. ein muriner Antikörper zur Führung der Selektion eines komplett humanen Antikörpers, der das gleiche Epitop erkennt, eingesetzt (Jespers et al., 1994, Bio/technology 12: 899–903).
  • Antikörperfragmente, die die Idiotypen eines Proteins enthalten, insbesondere SCD4, können durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind jedoch nicht beschränkt auf, das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden kann; das Fab'-Fragment, das durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden kann, das Fab-Fragment, das durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden kann; und Fv-Fragmente.
  • Bei der Produktion von Antikörpern kann das Screening auf den gewünschten Antikörper durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken, z. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent Test) erreicht werden. Zur Selektion von Antikörpern, die auf eine bestimmte Domäne des Proteins, oder auf ein Derivat davon spezifisch sind, können erzeugte Hybridome auf ein Produkt getestet werden, das an das Fragment des Proteins oder eines Derivates davon bindet, das eine solche Domäne enthält.
  • Die vorhergehenden Antikörper können bei Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und die die Lokalisierung und/oder Quantifizierung des gegebenen Proteins oder der gegebenen Proteine betreffen, z. B. zur Abbildung dieser Proteine, zum Messen der Spiegel davon in entsprechenden physiologischen Proben (durch ImmunoTest) bei diagnostischen Verfahren etc. verwendet werden. Dies trifft auch für ein Derivat oder Homologes von SCD4 zu.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der SCD4-Inhibitor eine siRNA mit der Sequenz: AGUACUCAGAGACGGAUGC
  • Wie vorstehend erklärt, wurde überraschenderweise im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gefunden, dass SCD4 die Sekretion von Abeta-42 herabsetzt oder abschwächt. Somit regelt es direkt oder indirekt die beta-Sekretase- und/oder gamma-Sekretase-Aktivität. Darum moduliert der Inhibitor die Aktivität von beta-Sekretase und/oder gamma-Sekretase.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet "Modulierung der Aktivität von gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase", dass die Aktivität insofern herabgesetzt wird, dass weniger oder kein Produkt gebildet wird (teilweise oder vollständige Hemmung) oder dass das jeweilige Enzym ein verschiedenes Produkt produziert (in dem Falle von gamma-Sekretase z. B. Abeta-40 anstelle von Abeta-42) oder dass die relativen Mengen der Produkte verschieden sind (im Falle von gamma-Sekretase z. B. mehr Abeta-40 als Abeta-42).
  • Bei der Erfindung umfasst der Begriff "Modulieren der Aktivität von gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase" durchwegs, dass die Aktivität des Enzyms direkt oder indirekt moduliert wird. Das bedeutet, dass der SCD4-Modulator entweder auch direkt an das Enzym binden kann oder, stärker bevorzugt, einen Einfluss auf SCD4 ausüben kann, der wiederum, z. B. durch Protein-Protein-Interaktionen oder durch Signaltransduktion oder über kleine Metaboliten, die Aktivität des Enzyms moduliert.
  • Es ist weiterhin eingeschlossen, dass der Modulator entweder die gamma-Sekretase oder beta-Sekretase oder die Aktivität beider Enzyme moduliert.
  • Bei der Erfindung ist es durchwegs bevorzugt, dass der beta-Sekretase-Modulator die Aktivität der beta-Sekretase entweder vollständig oder teilweise hemmt.
  • Bezüglich des Modulators der gamma-Sekretase-Aktivität ist es bevorzugt, dass dieser Modulator die gamma-Sekretase-Aktivität hemmt. Es ist allerdings auch bevorzugt, dass die Aktivität der gamma-Sekretase in einer Weise verschoben wird, dass mehr Abeta-40 und/oder Abeta-38 anstelle von Abeta-42 produziert wird.
  • Die gamma-Sekretase-Aktivität kann z. B. durch Bestimmung des APP-Prozessierens, z. B. durch Bestimmen, ob Abeta-40 oder Abeta-42 produziert wird (siehe Beispielabschnitt, infra), gemessen werden.
  • Zum Messen der BACE1-Aktivität können Änderungen des Verhältnisses zwischen alpha- und beta-C-terminalen APP-Fragmenten durch Westernblotting analysiert werden (Blasko et al., J Neural Transm 111, 523); zusätzliche Beispiele für BACE1-Aktivitätstests umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Verwendung eines cyclisierten Enzym-Donorpeptids, das eine BACE1-Spaltungsstelle enthält, um die beta-Galactosidase-Reporteraktivität zu rekonstituieren und zu messen (Naqvi et al., J Biomol Screen. 9, 398); Verwendung von gequenchten fluorimetrischen Peptidsubstraten und Fluoreszenzmessungen (Andrau et al., J. Biol Chem 278, 25 859); Verwendung von zellbasierten Tests unter Verwendung rekombinanter chimärer Proteine, wobei ein Enzym (wie alkalische Phosphatase) über eine Spanne von Aminosäuren, die die BACE1-Erkennungssequenz enthalten, an ein Golgiresidentes Protein gebunden wird (Oh et al., Anal Biochem, 323, 7); Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-basierte Tests (Kennedy et al., Anal Biochem 319, 49); ein zelluläres Wachstumsselektionssystem in Hefe (Luthi et al., Biochim Biophys Acta 1620, 167).
  • Vorzugsweise ist die neurodegenerative Krankheit Alzheimer-Krankheit.
  • Es wird beschrieben, dass SCD4-Interaktionsmoleküle zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können.
  • Darum beschreibt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die einem Individuum in einer wirksamen Menge verabreicht werden können. Bei einem bevorzugten Aspekt ist das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt. Das Individuum ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Tiere, wie Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde etc. und ist bevorzugt ein Säuger und am stärksten bevorzugt ein Mensch. Bei einer speziellen Ausführungsform ist ein nicht-menschlicher Säuger das Individuum.
  • Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können zur Verabreichung eines Therapeutikums verwendet werden, z. B. Verkapselung in Liposome, Mikropartikel und Mikrokapseln: Verwendung von rekombinanten Zellen, die imstande sind, das Therapeutikum zu exprimieren, Verwendung von Rezeptor-vermittelter Endozytose (z. B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4 429–4 432); Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder eines anderen Vektors etc. Verfahren zum Einbringen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Wege. Die Verbindungen können durch jeden zweckmäßigen Weg verabreicht werden, beispielsweise durch Infusion, durch Bolus-Injektion, durch Absorption über Epithel- oder Mukokutan-Auskleidungen (z. B. orale, rektale und intestinale Mucosa etc.) und können zusammen mit anderen biologischen Wirkstoffen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal sein.
  • Zusätzlich kann es erwünscht sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen in das Zentralnervensystem durch jeden geeigneten Weg einzubringen, einschließlich von intraventrikulärer und intrathekaler Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, beispielsweise angeschlossen an ein Reservoir, wie ein Ommaya-Reservoir. Die pulmonale Verabreichung, z. B. durch Verwendung eines Inhalators oder Verneblers und durch Formulierung mit einem aerosolisierenden Mittel, kann auch eingesetzt werden.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform kann es erwünscht sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal an den Bereich, der einer Behandlung bedarf, zu verabreichen. Dies kann beispielsweise und uneingeschränkt erreicht werden durch lokale Infusion während Operation, topische Applikation, z. B. in Verbindung mit einem Wunddressing nach Operation, durch Injektion mittels eines Katheters, mittels einer Suppositorie oder mittels eines Implantats, wobei das Implantat ein nicht-poröses oder gelatinöses Material ist, einschließlich von Membranen, wie sialastische Membranen oder Fasern. Bei einer Ausführungsform kann die Verabreichung die direkte Injektion an der Stelle (oder einer früheren Stelle) eines malignen Tumors oder von neoplastischem oder präneoplastischem Gewebe sein.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, verabreicht werden (Langer, 1990, Science 249; 1 527–1 533; Treat et al., 1989, in: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler, Hrsg., Liss, New York, S. 353–365; Lopez-Berestein, ibid., S. 317–327; siehe allgemein ibid.).
  • Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum über ein kontrolliert Freisetzungssystem abgegeben werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201–240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507–516; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574–579). Bei einer weiteren Ausführungsform können polymere Materialien eingesetzt werden (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball, Hrsg., Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; Levy et al., 1985, Science 228: 190–192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25, 351–356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 858–863). Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann kontrolliertes Freisetzungssystem in Nachbarschaft zu dem therapeutischen Ziel angeordnet werden, d. h. das Gehirn, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosis erforderlich ist (z. B. Goodson, 1984, in: Medical Applications of Controlled Release, supra, Bd. 2, S. 115–138). Weitere kontrollierten Freisetzungssysteme sind im Überblick von Langer (1990, Science 249: 1 527–1 533) besprochen.
  • Teil 2
  • Bei einer speziellen Ausführungsform, wobei das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, die vorzugsweise ein ein Protein codierendes Therapeutikum ist, kann die Nukleinsäure in vivo zur Beschleunigung der Expression von ihrem codierten Protein durch ihre Konstruktion als Teil eines entsprechenden Nukleinsäureexpressionsvektors und ihr Verabreichen, sodass sie intrazellulär wird, z. B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors ( US-Patentschrift Nr. 4 980 286 ) oder durch direkte Injektion oder durch die Verwendung von Mikroteilchenbombardierung (z. B. eine Genpistole; Biolistic, Dupont) oder durch ihr Beschichten mit Lipiden, Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch ihre Verabreichung in Verknüpfung mit einem Homöobox-artigen Peptid, das bekanntermaßen in den Kern eintritt (z. B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1 864–1 868) etc. verabreicht werden. Alternativ kann ein Nukleinsäuretherapeutikum intrazellulär eingebracht und durch homologe Rekombination in Wirtszellen-DNA zur Expression eingebaut werden.
  • Im Allgemeinen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Bei einer speziellen Ausführungsform bedeutet der Begriff "pharmazeutisch verträglich" durch eine Regulierungsbehörde der Bundes- oder Landesregierung genehmigt oder in der US-Pharmakopöe und in anderen allgemein anerkannten Pharmakopöen zur Verwendung in Tieren und insbesondere in Menschen gelistet. Der Begriff "Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Exzipiens oder Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich derjenigen aus Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung oral verabreicht wird. Salzlösung und wässrige Dextrose sind bevorzugte Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen werden vorzugsweise als flüssige Träger für injizierbare Lösungen eingesetzt. Geeignete pharmazeutische Exzipienten umfassen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Silicagel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrockneter Magermilch, Glycerol, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und dergleichen.
  • Die Zusammensetzung kann, sofern gewünscht, auch kleinere Mengen an Netz- oder Emulgiermitteln oder pH-Puffermittel enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, verzögert freisetzenden Formulierungen und dergleichen einnehmen. Die Zusammensetzung kann als Suppositorium mit traditionellen Bindemitteln und Träger, wie Triglyceride, formuliert sein. Die orale Formulierung kann Standardträger einschließen, wie pharmazeutisch reines Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind beschrieben in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin. Solche Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge des Therapeutikums, vorzugsweise in gereinigter Form zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, sodass die Form zur ordnungsgemäßen Verabreichung an den Patienten bereitgestellt wird. Die Formulierung sollte der Verabreichungsweise angepasst sein.
  • Die Zusammensetzung kann gemäß Routineverfahrensweisen als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein, die der intravenösen Verabreichung an Menschen angepasst ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Wo notwendig kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum, wie Lidocain, einschließen, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder separat oder miteinander vermischt in einer Darreichungsform, beispielsweise als ein trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie eine Ampulle oder ein Tütchen, das die Menge des Wirkstoffes angibt, bereitgestellt. Wo die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles pharmazeutisch reines Wasser oder Kochsalzlösung enthält. Wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung zur Injektion bereitgestellt werden, sodass die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden.
  • Die Therapeutika können als neutrale Form oder als Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie diejenigen, die sich von Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure etc. ableiten, diejenigen, die mit freien Amingruppen gebildet werden, wie diejenigen, die sich von Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc. ableiten, und diejenigen, die sich von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- und Eisen(III)-hydroxiden etc. ableiten.
  • Die Menge des Therapeutikums, welche bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Zusätzlich können in vitro Tests gegebenenfalls zur Unterstützung der Identifizierung optimaler Dosierungsbereiche eingesetzt werden. Die exakte zu verabreichende Dosis in der Formulierung hängt auch von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Krankheit oder der Störung ab und sollte gemäß dem Urteil des praktischen Arztes und den jeweiligen Umständen des Patienten entschieden werden. Allerdings betragen geeignete Dosierungsbereiche zur intravenösen Verabreichung im Allgemeinen etwa 20–500 Mikrogramm aktive Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche zur intranasalen Verabreichung sind im Allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Antwortkurven extrapoliert werden, die sich von In-vitro- oder Tiermodell-Versuchssystemen ableiten.
  • Suppositorien enthalten im Allgemeinen Wirkstoff im Bereich von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10 bis 95% Wirkstoff.
  • Die Erfindung beschreibt auch ein pharmazeutisches Paket oder einen pharmazeutischen Testsatz, der einen oder mehrere Behälter, gefüllt mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, einschließt. Gegebenenfalls einem solchen Behälter (solchen Behältern) beigefügt kann eine Notiz in der Form einer Verschreibung durch eine Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei die Notiz die Genehmigung durch die Behörde der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
  • Die Testsätze können auch Expressionsvektoren enthalten, die SCD4 oder ein interagierendes oder bindendes Peptid oder Polypeptid codieren, das zur Expression von SCD4 oder des jeweiligen interagierenden oder bindenden Peptids oder Polypeptids eingesetzt werden kann. Ein solcher Testsatz enthält vorzugsweise auch die gewünschten Puffer und Reagenzien. Gegebenenfalls solchen Behälter(n) beigefügt können Anweisungen zur Verwendung des Testsatzes und/oder eine Notiz in der Form einer Vorschrift durch eine Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, sein, wobei die Notiz die Genehmigung durch die Behörde der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
  • Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Behandlung, wobei eine wirksame Menge eines SCD4-interagierenden Moleküls oder eines Inhibitors oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Individuum verabreicht wird, das an einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise an Alzheimer-Krankheit, leidet.
  • Bezüglich dieses Verfahrens treffen sämtliche Ausführungsformen, die vorstehend zur Verwendung der Erfindung angegeben sind, zu.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines gamma-Sekretasemodulators und/oder eines beta-Sekretasemodulators, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a. Identifizieren eines SCD4-interagierenden Moleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Test-Verbindung ein SCD4-interagierendes Molekül ist,
    • b. Bestimmen, ob das SCD4-interagierende Molekül von Schritt a) imstande ist, die gamma-Sekretase-Aktivität oder die beta-Sekretase-Aktivität zu modulieren.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt a) die Test-Verbindung mit SCD4 in Kontakt gebracht, und die Interaktion von SCD4 mit der Test-Verbindung wird bestimmt. Vorzugsweise wird gemessen, ob das Kandidaten-Molekül an SCD4 gebunden wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise im Zusammenhang mit einem durchsatzstarken Test durchgeführt. Solche Tests sind dem Fachmann bekannt.
  • Die zu screenenden Test- oder Kandidaten-Moleküle können als Gemische einer begrenzten Anzahl festgelegter Verbindungen oder als Verbindungsbibliotheken, Peptidbibliotheken und dergleichen bereitgestellt werden. Zu screenende Mittel/Moleküle können auch alle Formen von Antiseren, Antisense-Nukleinsäuren etc. einschließen, die die SCD4-Aktivität oder -Expression modulieren können. Beispielhafte Kandidaten-Moleküle und -bibliotheken zum Screening sind nachstehend ausgeführt.
  • Das Screening der Bibliotheken kann durch jedes einer Vielzahl von allgemein bekannten Verfahren erreicht werden. Siehe z. B. die folgenden Druckschriften, die das Screening von Peptidbibliotheken offenbaren: Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215–218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386–390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5 393–5 397, Vu et al., 1994, Cell 76: 933–945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577–580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564–566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6 988–6 992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850–852; US-Patentschrift Nr. 5 096 815 , US-Patentschrift Nr. 5 223 409 und US-Patentschrift Nr. 5 198 346 , alle von Ladner et al.; Rebar und Pabo, 1993, Science 263: 671–673; und internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/18318 .
  • Bei einer speziellen Ausführungsform kann das Screening durch Kontaktieren der Bibliotheksmitglieder mit einem auf einer festen Phase immobilisierten SCD4 und Ernten derjenigen Bibliotheksmitglieder, die an das Protein binden (oder Nukleinsäure oder -derivat codieren) durchgeführt werden. Beispiele für solche Screeningverfahren, die "Panning"-Techniken genannt werden, sind beispielhaft bei Parmley und Smith, 1988, Gene 73: 305–318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/18318 und in den hier zuvor zitierten Druckschriften beschrieben.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform werden SCD4-Fragmente und/oder -Analoge, insbesondere Peptidomimetika, auf die Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Gegenwart von SCD4 (z. B. SCD4-Expression oder -Stabilität) oder insbesondere die SCD4-Aktivität in der Zelle gescreent.
  • Bei einer Ausführungsform können Mittel, die die SCD4-Aktivität modulieren (d. h. hemmen oder aktivieren) zur Verwendung eines Abeta-42-Sekretionstests gescreent werden, wobei die Mittel auf ihre Fähigkeit zur Modulierung der SCD4-Aktivität unter wässrigen oder physiologischen Bedingungen gescreent werden, wobei SCD4 in Abwesenheit des zu testenden Mittels aktiv ist. Vorzugsweise sind die Kandidaten-Mittel Mittel, die mit SCD4 interagieren oder daran binden. Mittel, die mit der Sekretion von Abeta-42 interferieren, werden als Inhibitoren der SCD4-Aktivität bezeichnet. Mittel, die die Sekretion von Abeta-42 beschleunigen, werden als SCD4-Aktivatoren bezeichnet.
  • Vorzugsweise kann ein Zwei-Schritt-Verfahren eingesetzt werden, umfassend (a) Identifizierung von Modulatoren in einem SCD4-Aktivitätstest (z. B. ein Test, das die Delta-8-Desaturaseaktivität von SCD4 misst, z. B. wie Obukowicz MG et al., supra, beschrieben) und (b) Testung der Modulatoren auf die Abeta-42-senkende oder -abschwächende Aktivität.
  • Verfahren zum Screening, insbesondere Verfahren zum Screening auf Mittel, die an SCD4 binden, können das Markieren von SCD4 mit Radioliganden (z. B. 125I oder 3H), magnetischen Liganden (z. B. paramagnetische Beads, die kovalent an Photobiotinacetat binden), fluoreszente Liganden (z. B. Fluorescein oder Rhodamin) oder Enzymliganden (z. B. Luciferase oder β-Galactosidase) einschließen. Die Recktanten, die in Lösung binden, können dann durch eine von vielen auf dem Fachgebieten bekannten Techniken isoliert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Coimmunpräzipitation des markierten Proteins unter Verwendung von Antiseren gegen den unmarkierten Bindungspartner (oder den markierten Bindungspartner mit einem von demjenigen unterscheidbaren Marker, der auf dem zweiten markierten Protein verwendet wird), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie und Gradientendichtezentrifugation. Bei einer Ausführungsform ist der markierte Bindungspartner ein kleines Fragment oder Peptidomimetikum, das nicht durch ein im Handel erhältliches Filter zurückgehalten wird. Beim Binden ist dann die markierte Spezies nicht imstande, das Filter zu passieren, was einen einfachen Bindungstest bereitstellt.
  • Verfahren, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind, werden zur Markierung von mindestens einem der Proteine oder Polypeptide verwendet. Geeignete Markierungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Radiomarkieren durch Einbau von radioaktiv markierten Aminosäuren, z. B. 3H-Leucin oder 35S-Methionin, radioaktives Markieren durch posttranslationale Iodierung mit 125I oder 131I unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens, Bolton-Hunter-Reagenzien etc. oder Markieren mit 32P unter Verwendung von Phosphorylase und anorganischem radioaktiv markiertem Phosphor, Biotinmarkierung mit Photobiotinacetat und Höhensonnenexposition etc. In Fällen, wobei einer der Bindungspartner immobilisiert ist, z. B. wie infra beschrieben, wird die freie Spezies markiert. Wo keine der interagierenden Spezies immobilisiert wird, kann jede mit einem unterscheidbaren Marker markiert werden, derart, dass die Isolierung von beiden Partner verfolgt werden kann, um eine exaktere quantitative Bestimmung bereitzustellen und um die Bildung, z. B. des homomeren Bindens von heteromerem Binden, zu unterscheiden. Verfahren, die akzessorische Proteine verwenden, die an einen der modifizierten Partner binden, um die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern, die die Stabilität des Bindens steigern etc., werden bereitgestellt.
  • Die gleichen Markierungsverfahren, wie vorstehend beschrieben, können auch zur Markierung, z. B. von APP, Abeta-40 oder Abeta-42, verwendet werden, beispielsweise zur Bestimmung der Menge an sezerniertem Abeta-40 oder Abeta-42 in einem Abeta-Sekretionstest.
  • Typische Bindungsbedingungen bestehen beispielsweise, jedoch nicht einschränkend, in einer wässrigen Salzlösung von 10–250 mM NaCl, 5–50 mM Tris-HCl, pH 5–8 und 0,5% Triton X-100 oder ein anderes Detergens, das die Spezifität der Interaktion verbessert. Metallchelatoren und/oder zweiwertige Kationen können zur Verbesserung des Bindens und/oder Herabsetzung der Proteolyse zugesetzt werden. Die Reaktionstemperaturen können 4, 10, 15, 22, 25, 35 oder 42 Grad Celsius einschließen, und die Inkubationszeit beträgt typischerweise mindestens 15 Sekunden, jedoch sind längere Zeiten bevorzugt, um das Bindungsgleichgewicht eintreten zu lassen. Ein bestimmtes Binden kann unter Verwendung von routinemäßigen Proteinbindungstests zur Bestimmung der optimalen Bindungsbedingungen zum reproduzieren Binden getestet werden.
  • Die physikalischen Parameter des Bindens können durch Quantifizierung des Bindens unter Verwendung von Testverfahren, die für die verwendete Markierung spezifisch sind, analysiert werden, z. B. Flüssigkeitsszintillationszählen zum Radioaktivitätsnachweis, Enzymaktivität für Enzym-markierte Einheiten etc. Die Reaktionsergebnisse werden dann unter Verwendung der Scatchard-Analyse, Hill-Analyse oder anderer allgemein auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren analysiert (siehe z. B. Proteins, Structures, and Molecular Principles, 2. Ausgabe (1993), Creighton, Hrsg., W. H. Freeman and Company, New York).
  • Bei einem zweiten allgemeinen Ansatz für Bindungstests wird eine der bindenden Spezies auf einem Filter, in einer Mikrotiterplattenvertiefung, in einem Teströhrchen, an einer Chromatographiematrix etc., entweder kovalent oder nicht-kovalent, immobilisiert. Proteine können unter Verwendung von jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren kovalent immobilisiert werden, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt, auf das Verfahren von Kadonaga und Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5 889–5 893, d. h. Verknüpfung mit einem Cyanogenbromid-derivatisierten Substrat, wie CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Wo benötigt, kann die Verwendung von Spacern die sterische Hinderung durch das Substrat herabsetzen. Nicht-kovalentes Verknüpfen von Proteinen mit einem Substrat umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, das Verknüpfen eines Proteins mit einer geladenen Oberfläche, Binden mit spezifischen Antikörpern, Binden an ein drittes unbeteiligtes Interaktionsprotein etc.
  • Tests von Mitteln (einschließlich von Zellextrakten oder eines Bibliothekspools), die um das Binden eines gegebenen Moleküls an SCD4 konkurrieren, werden zum Screening auf Kompetitoren, Verstärker oder Mittel, mit spezifisch erwünschten Bindungsmerkmalen (z. B. geringere oder höhere Affinität) im Vergleich mit einem gegebenen Bindungspartner bereitgestellt. Wiederum kann entweder das Molekül oder SCD4 durch jedes beliebige Mittel (z. B. diejenigen Mittel, die vorstehend beschrieben sind) markiert sein.
  • Bei speziellen Ausführungsformen werden Blockierungsmittel zur Hemmung des nichtspezifischen Bindens von Recktanten an andere Proteine oder absorptiver Verluste von Reagenzien an Kunststoffe, Immobilisierungsmatrizes etc. in das Testgemisch mit eingeschlossen. Blockierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Rinderserum-Albumin, Casein, fettfreie Trockenmilch, Denhardt's Reagens, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon, nicht-ionische Detergenzien (NP40, Triton X-100, Tween 20, Tween 80 etc.), ionische Detergenzien (z. B. SDS, LDS etc.), Polyethylenglykol etc. Entsprechende Blockierungsmittel-Konzentrationen gestatten ein spezifisches Binden.
  • Nach Durchführen des Bindens wird ungebundenes markiertes Mittel in dem Überstand entfernt, und das immobilisierte Protein (oder falls zutreffend das immobilisierte Mittel), das gebundenes markiertes Mittel zurückhält, wird ausgiebig gewaschen. Die Menge an gebundener Markierung wird dann unter Verwendung von Standardverfahren auf dem Fachgebiet zum Nachweis der Markierung, wie vorstehend beschrieben, quantitativ bestimmt.
  • Bei anderen speziellen Ausführungsformen kann das Screening auf Modulatoren des Proteins, wie hier vorgesehen, durch Anknüpfen derjenigen und/oder der Antikörper, wie hier bereitgestellt, an einen festen Träger durchgeführt werden.
  • Die Herstellung eines solchen Arrays, das verschiedene Typen von Proteinen (einschließlich von Antikörpern) enthält, ist auf dem Fachgebiet wohl bekannt und für einen Fachmann klar (siehe z. B. Ekins et al., 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7: 155–168; Mitchell et al. 2002, Nature Biotechnol. 20: 225–229; Petricoin et al., 2002, Lancet 359: 572–577; Templin et al., 2001, Trends Biotechnol. 20: 160–166; Wilson and Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 81–85; Lee et al., 2002 Science 295: 1 702–1 705; MacBeath und Schreiber, 2000, Science 289: 1 760; Blawas und Reichert, 1998, Biomaterials 19: 595; Kane et al., 1999, Biomaterials 20: 2 363; Chen et al., 1997, Science 276; 1 425; Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 309–314; Mahler et al., 1997, Immunotechnology 3: 31–43; Roberts et al., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268–273; Nord et al., 1997, Nature Biotechnol. 15; 772–777; Nord et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268: 4 269–4 277; Brody und Gold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5–13; Karlstroem und Nygren, 2001, Anal. Biochem. 295: 22–30; Nelson et al., 2000, Electrophoresis 21: 1 155–1 163; Honore et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3: 265–274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2: 145–152, Figeys und Pinto, 2001, Electrophoresis 2: 208–216 und die Druckschriften in den hier aufgelisteten Veröffentlichungen).
  • Proteine oder andere Mittel können an ein Array durch verschiedene Mittel, wie es einem Fachmann bekannt ist, angeknüpft werden. Proteine können zum Beispiel an den Array über einen TAP-Marker (wie beschrieben in WO/0009716 und in Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 10: 1 030–1 032) nach dem Reinigungsschritt oder durch ein anderes geeignetes Reinigungsschema, wie es einem Fachmann geläufig ist, addiert werden.
  • Gegebenenfalls können Funktionstests, wie sie einem Fachmann geläufig sind, wovon einige hierbei beispielhaft bereitgestellt sind, zur Überprüfung der Integrität des an die Matrix gebundenen Proteins durchgeführt werden.
  • Gegebenenfalls kann die Anknüpfung der Proteine oder des Antikörpers, wie vorstehend ausgeführt, weiterhin durch verschiedene Verfahren, die einem Fachmann geläufig sind, überwacht werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Oberflächenplasmonresonanz (siehe z. B. McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 572–577; Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19: 217–222; Weinberger et al., 2000, 1: 395–416; Pearson et al., 2000, Arm. Clin. Biochim. 37: 119–145; Vely et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 313–321; Slepak, 2000, J. Mol Recognit. 13: 20–26.
  • Beispielhafte Tests, die zum Messen der Produktion von Abeta-40- und Abeta-42-Peptiden durch ELISA geeignet sind, umfassen diejenigen, die bei Vassar R et al., 1999, Science, 286: 735–41, beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Beispielhafte Tests, die zum Messen der Produktion von C-terminalen APP-Fragmenten in Zelllinien oder transgenen Tieren durch Westernblot geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Van, R. et al., 1999, Nature, 402: 533–7, beschrieben sind.
  • Beispielhafte Tests, die zum Messen der proteolytischen Aktivität von beta- oder gamma-Sekretase gegenüber bakteriell exprimierten APP-Fragmenten in vitro (z. B. durch Modifizieren der Expression von SCD4-Proteinen in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das SCD4-Protein codieren, umfassen, sind jedoch nicht auf diejenigen beschränkt, die bei Tian, G. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 31 499–505, beschrieben sind.
  • Beispielhafte Tests, die zum Messen der Transaktivierung eines Gal4-angetriebenen Reportergens geeignet sind (z. B. durch Modifizieren der Expression von SCD4 mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die SCD4-Protein codieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die bei Cao, X. et al., 2001, Science, 293: 115–20, beschrieben sind.
  • Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Molekül kann auf seine Fähigkeit ein interagierendes Molekül oder ein Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung zu sein, getestet werden. Kandidaten-Moleküle können einer Zelle, die SCD4 exprimiert, direkt bereitgestellt werden oder in dem Fall von Kandidatenproteinen können sie durch Bereitstellen ihrer codierenden Nukleinsäuren unter Bedingungen, wobei die Nukleinsäuren rekombinant exprimiert werden, um das Kandidatenprotein herzustellen, bereitgestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist zum Screening chemischer Bibliotheken auf Moleküle gut geeignet, die die Menge oder Aktivität des Proteins, insbesondere von SCD4, modulieren, z. B. hemmen, antagonisieren oder agonisieren. Die chemischen Bibliotheken können Peptidbibliotheken, peptidomimetische Bibliotheken, chemisch synthetisierte Bibliotheken, rekombinante Bibliotheken, z. B. Phage-Display-Bibliotheken und in-vitrotranslationsbasierte Bibliotheken, andere nicht-peptidische synthetische organische Bibliotheken etc. sein.
  • Beispielhafte Bibliotheken sind im Handel aus mehreren Quellen (ArQule, Tripos/PanLabs, ChemDesign, Pharmacopoeia) erhältlich. In einigen Fällen werden diese chemischen Bibliotheken unter Verwendung von Kombinationsstrategien erzeugt, die die Identität von jedem Mitglied der Bibliothek auf einem Substrat codieren, an das die Mitglieder-Verbindung angeknüpft ist, was somit die direkte und unmittelbare Identifizierung eines Moleküls erlaubt, das ein wirksamer Modulator ist. Bei vielen kombinatorischen Ansätzen legt somit die Position einer Verbindung auf einer Platte die Zusammensetzung dieser Verbindung fest. Auch kann bei einem Beispiel eine einzelne Plattenposition 1–20 Chemikalien aufweisen, die durch Applikation in eine Vertiefung, die die Interaktionen von Interesse enthält, gescreent werden können. Wenn somit die Modulation nachgewiesen wird, können immer kleiner werdende Pools von interagierenden Paaren auf die Modulationsaktivität getestet werden. Durch solche Verfahren können viele Kandidaten-Moleküle gescreent werden.
  • Viele Diversitätsbibliotheken, die zur Verwendung geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt und können zur Bereitstellung von erfindungsgemäß zu testenden Verbindungen eingesetzt werden. Alternativ können Bibliotheken unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert werden. Chemische (synthetische) Bibliotheken, rekombinante Expressionsbibliotheken oder Polysom-basierte Bibliotheken sind beispielhafte Typen von Bibliotheken, die verwendet werden können.
  • Die Bibliotheken können gehindert oder halbstarr (mit einem gewissen Grad an struktureller Starrheit) oder linear oder nicht gehindert sein. Die Bibliothek kann eine cDNA oder eine genomische Expressionsbibliothek, eine statistische Peptidexpressionsbibliothek oder eine chemisch synthetisierte statistische Peptidbibliothek oder eine Nicht-Peptidbibliothek sein. Expressionsbibliotheken werden in die Zellen eingebracht, in der der Test erfolgt, wenn die Nukleinsäuren der Bibliothek zur Produktion ihrer codierten Proteine exprimiert werden.
  • Bei einer Ausführungsform können die Peptidbibliotheken, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Bibliotheken sein, die in vitro chemisch synthetisiert werden. Beispiele für solche Bibliotheken sind angegeben bei Houghten et al., 1991, Nature 354: 84–86, angegeben, der Gemische von freien Hexapeptiden beschreibt, in denen der erste und zweite Rest in jedem Peptid individuell und spezifisch definiert wurden; Lam et al., 1991, Nature 354: 82–84, der einen "Ein-Bead, Ein-Peptid"-Ansatz beschreibt, wobei ein Festphasen-Splitsyntheseschema eine Bibliothek von Peptiden erzeugte, wobei jedes Bead in der Sammlung daran immobilisiert eine einzelne statistische Sequenz von Aminosäureresten aufwies; Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709–710, der die Splitsynthese und T-bag-Syntheseverfahren beschreibt; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1 233–1 251. Einfach anhand von anderen Beispielen kann eine kombinatorische Bibliothek zur Verwendung gemäß den Verfahren von Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10 922–10 926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11 422–11 426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1 614–1 618; oder Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11 708–11 712, hergestellt werden. Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/20242 und Brenner und Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5 381–5 383, beschreiben "kodierte kombinatorische chemische Bibliotheken", die für jedes chemische polymere Bibliotheksmitglied Oligonukleotid-Identifikatoren enthalten.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die gescreente Bibliothek eine biologische Expressionsbibliothek, die eine statistische Peptid-Phagedisplaybibliothek ist, wobei die statistischen Peptide gehindert sind (z. B. aufgrund dessen, dass sie die Sulfidbindung aufweisen).
  • Weiterhin können auch, allgemeiner, strukturell gehinderte organische Diversitäts (z. B. Nicht-Peptid)-Bibliotheken verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Benzodiazepinbibliothek (siehe z. B. Bumin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708–4712) verwendet werden.
  • Konformationell gehinderte Bibliotheken, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf diejenigen, die invariante Cysteinreste enthalten, die, in einer oxidierenden Umgebung, durch Disulfidbindungen unter Bildung von Cystinen, modifizierten Peptiden (z. B. umfassend Fluor, Metalle, Isotopenmarker, die phosphoryliert sind etc.), Peptiden, die eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, Nicht-Peptidstrukturen und Peptiden, die einen signifikanten Bruchteil an Carboxyglutaminsäure enthalten, vernetzen.
  • Bibliotheken von Nicht-Peptiden (beispielsweise Peptidderivate, die eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten) können ebenfalls verwendet werden. Ein Beispiel für diese sind Peptoidbibliotheken (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9 367–9 371). Peptoide sind Polymere nicht-natürlicher Aminosäuren, die natürlich vorkommende Seitenketten aufweisen, die nicht an den α-Kohlenstoff, sondern an den Hauptketten-Aminostickstoff gebunden sind. Da Peptoide nur schwer durch menschliche Verdauungsenzyme abgebaut werden, sind sie zweckmäßigerweise leichter der Arzneimittelverwendung anpassbar. Ein weiteres Beispiel für eine Bibliothek, die verwendet werden kann, wobei die Amidfunktionalität in Peptiden permethyliert wurden, um eine chemisch transformierte kombinatorische Bibliothek zu erzeugen, ist bei Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11 138–11 142) beschrieben.
  • Die Elemente der Peptidbibliotheken, die erfindungsgemäß gescreent werden können, sind nicht darauf beschränkt, dass sie die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren enthalten. Insbesondere gestatten chemisch synthetisierte Bibliotheken und Polysom-basierte Bibliotheken die Verwendung von Aminosäuren zusätzlich zu den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (durch ihren Einschluss in den Vorläuferpool von bei der Bibliotheksherstellung verwendeten Aminosäuren). Bei speziellen Ausführungsformen enthalten die Bibliothekselemente eine oder mehrere nicht-natürliche oder nicht-klassische Aminosäuren oder cyclische Peptide. Nicht-klassische Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die D-Isomere der üblichen Aminosäuren, -Aminoisobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, Abu, 2-Aminobuttersäure, -Abu, -Ahx, 6-Aminohexansäure; Aib, 2-Aminoisobttersäure; 3-Aminopropionsäure; Ornithin; Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren wie β-Methylaminosäuren, C-Methylaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Fluoraminosäuren und Aminosäureanaloge im Allgemeinen. Außerdem kann die Aminosäure D (dextrorotatorisch) oder L (levorotatorisch) sein.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform werden Fragmente und/oder Analoge von erfindungsgemäßen Proteinen, insbesondere Peptidomimetika, auf die Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der SCD4-Expression (z. B. Stabilität) oder Aktivität gescreent.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die kombinatorische Chemie zur Identifizierung von SCD4-Modulatoren verwendet werden. Die kombinatorische Chemie ist imstande, Bibliotheken zu schaffen, die aberhunderte von Verbindungen enthält, wovon viele strukturell ähnlich sein können. Obgleich durchsatzstarke Screeningprogramme imstande sind, diese riesigen Bibliotheken auf Affinität für bekannte Ziele zu screenen, wurden neue Ansätze entwickelt, die Bibliotheken von kleinerer Dimension erzielen, die aber maximale chemische Diversität bereitstellen. (Siehe z. B. Matter, 1997, J. Med. Chem. 40: 1 219–1 229.)
  • Ein Verfahren der kombinatorischen Chemie, das Affinitätsfingerprinting, wurde bisher zum Testen einer diskreten Bibliothek von kleinen Molekülen auf die Brandungsaffinitäten gegenüber einem definierten Panel von Proteinen eingesetzt. Die Fingerprints, die durch den Screen erhalten wurden, werden zur Vorhersage der Affinität der einzelnen Bibliotheksmitglieder gegenüber anderen Proteinen oder Rezeptoren von Interesse, insbesondere von SCD4, verwendet. Die Fingerprints werden mit Fingerprints verglichen, die von anderen Verbindungen erhalten worden, die bekanntermaßen mit dem Protein von Interesse reagieren, um vorherzusagen, ob die Bibliotheksverbindung vielleicht ähnlich reagiert. Beispielsweise können statt der Testung von jedem Liganden in einer großen Bibliothek auf die Interaktion mit einem Protein nur diejenigen Liganden mit einem Fingerprint entsprechend anderen Verbindungen, die bekanntermaßen diese Aktivität aufweisen, getestet werden. (Siehe z. B. Kauvar et al., 1995, Chem. Biol. 2: 107–118; Kauvar, 1995, Affinity fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International, 8: 25–28; und Kauvar, Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical ImmunoTest, Kurtz, Starker and Skerritt (Hrsg.), 1995, ADAC: Washington, D. C., 305–312).
  • Kay et al. (1993, Gene 128: 59–65) offenbarten ein Verfahren zur Konstruktion von Peptidbibliotheken, die Peptide von vollkommen statistischer Sequenz codieren, die länger sind als diejenigen aus jeder bisherigen herkömmlichen Bibliotheken. Die bei Kay et al. offenbarten Bibliotheken codieren voll synthetische statistische Peptide von größer als etwa 20 Aminosäuren Länge. Solche Bibliotheken können zweckmäßigerweise zur Identifizierung von Proteinmodulatoren gescreent werden. (Siehe auch US-Patentschrift Nr. 5 498 538 vom 12. März 1996; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/18318 vom 18. August 1994).
  • Ein umfassender Überblick über verschiedene Typen von Peptidbibliotheken kann bei Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1 233–1 251, gefunden werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform führt die Interaktion der Test-Verbindung mit SCD4 zu einer Hemmung der SCD4-Aktivität.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit der gamma-Sekretase zur Spaltung von APP gemessen. Diese kann, wie vorstehend angegeben, gemessen werden.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit des SCD4-Interaktionsmoleküls zur Senkung oder Abschwächung der Sekretion von Abeta-42 gemessen.
  • Weiterhin beschreibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Identifizieren eines gamma-Sekretasemodulators und/oder beta-Sekretasemodulators, vorzugsweise eines Inhibitors, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, und
    • b) Formulieren des gamma-Sekretase- und/oder beta-Sekretasemodulators, vorzugsweise des Inhibitors, zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Bezüglich der pharmazeutischen Zusammensetzung treffen alle Ausführungsformen, wie vorstehend angegeben, hier ebenfalls zu.
  • Dieses Verfahren kann weiterhin den Schritt des Mischens des identifizierten Moleküls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie vorstehend erläutert, umfassen.
  • Die Erfindung beschreibt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen SCD4-Inhibitor, wie vorstehend definiert, umfasst.
  • Weiterhin beschreibt die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch das obige Verfahren erhältlich ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Die Erfindung beschreibt auch die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit, wie Alzheimer-Krankheit, und verwandter neurodegenerativer Störungen.
  • Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, umfassend die Verabreichung an ein Individuum, das einer solchen Behandlung oder Prävention bedarf, einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben.
  • Bezüglich dieses Verfahrens treffen auch sämtliche Ausführungsformen, wie vorstehend für die Verwendung bei der Erfindung beschrieben, zu.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines SCD4-Inhibitors zur Modulation, vorzugsweise zur Hemmung der beta-Sekretase und/oder gamma-Sekretaseaktivität in vitro, wobei der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen. Beispielsweise ist es in die vorliegende Erfindung mi eingeschlossen, beta-Sekretase und/oder gamma-Sekretase, in Zellkulturen durch den SCD4-Inhibitor zu modulieren, vorzugsweise zu hemmen. Sämtliche Ausführungsformen bezüglich des SCD4-Inhibitors, wie vorstehend beschrieben, treffen auch auf diese Verwendung der Erfindung zu.
  • Die Erfindung wird weiterhin, durch die folgenden Figuren und Beispiele beschrieben, jedoch nicht eingeschränkt:
  • 1: SCD4 ist im menschlichen Gehirn sehr hoch exprimiert.
  • 5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen (Clontech) wurden revers transkribiert. Gleiche Mengen an cDNAs aus jedem Gewebe und von SCD4-spezifischen Primern wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von SCD4 durch quantitative PCR verwendet. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, und alle Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normiert.
  • 2: Der siRNA-vermittelte Knock-down der SCD4-Expression schwächte die Sekretion von Aβ1-42.
  • (linke Tafel) siRNAs, die gegen BACE1, SCD4 oder Luc3 gerichtet sind, wurden in die H4-Neurogliomzellen-überexprimierende Mutante APPsw transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt und die Niveaus von Aβ1-42 durch ELISA (Imnogenetics) bestimmt. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt.
  • (rechte Tafel) siRNA, die gegen SCD4 gerichtet ist, reduziert spezifisch die mRNA-Niveaus. Gesamt-RNA wurde aus H4/APPsw-Zellen hergestellt, die mit siRNA transfiziert waren, die entweder gegen Luc3 oder SCD4 gerichtet waren. Nach der reversen Transkription wurden die relativen Mengen an SCD4-Transkripten durch quantitative PCR bestimmt. Mindestens zwei unabhängige Experimente wurden durchgeführt.
  • 3: Die Aminsäuresequenz von menschlichem SCD4 (SCD4/hypothetisches Protein FLJ21032), beschrieben im Einbuchstabencode.
  • BEISPIELE:
  • Die folgenden Beispiele beziehen sich auf sämtliche Ausführungsformen der Erfindung und speziell auf die Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen beansprucht.
  • BEISPIEL 1: Bestimmung der SCD4-Gewebeexpressionsniveaus
  • Zur Bewertung, ob sich SCD-4 als potenzielles Ziel für AD qualifizierte, untersuchten wir, ob es im menschlichen Gehirn exprimiert war. Zu diesem Zweck bestimmten wir sein Expressionsniveau in verschiedenen Geweben durch reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Kurz gesagt wurden 5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen (Clontech) unter Verwendung von Standardverfahrensweisen revers transkribiert. Gleiche Mengen an cDNAs aus jedem Gewebe und SCD4-spezifische Primer wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von SCD-4 durch quantitative PCR unter Befolgung der Anleitungen des Herstellers verwendet. Sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normiert.
  • BEISPIEL 2: siRNA-Hemmung von SCD4
  • Eine RNAi-Genexpressionspertubationsstrategie wurde zur funktionellen Validierung von SCD-4 als ein Effektor der APP-Prozessierung eingesetzt: Eine siRNAs, die gegen SCD-4 gerichtet war, sowie siRNAs, die gegen BACE1 oder Luc3 gerichtet war, wurde in SKNBE2-Neuroblastom- oder H4-Neurogliomzellen transfiziert. siRNAs für humanes SCD-4 wurden von Dharmacon Research Inc. synthetisiert.
  • Die Sequenz der siRNA, die für SCD-4 verwendet wurde, lautet: AGUACUCAGAGACGGAUGC.
  • Die Transfektion von SK-N-BE2-Zellen wurde unter Verwendung von LipfectAMINE 2000 (Invitrogen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0 × 104 Zellen in einem Endvolumen von 85 μl pro 96-Well 12–16 Stunden vor der Transfektion ausgesät. 25 nM der siRNAs wurden mit 8 μl Opti-MEM-Puffer (Gibco) und 60 ng Träger-DNA vermischt, und das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur vor Zugabe zu den Zellen inkubiert. 16 und 48 Stunden nach Transfektion wurde Medium mit 100 μl oder 200 μl Wachstumsmedium mit bzw. ohne Serum ersetzt. 72 Stunden nach Transfektion wurden 100-μl-Überstände für Aβ42-ELiSA geerntet. Der Test wurde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Imnogenetics) durchgeführt.
  • Die Transfektion von H4-Zellen wurde unter Verwendung von RNaiFect (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0 × 104 Zellen in einem Endvolumen von 100 μl pro 96-Well 12–16 Stunden vor der Transfektion ausgesät. 270 nM (0,375 μg) von siRNAs wurden mit 25 μl EC-R-Puffer und 2,3 μl RNAiFect vermischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur vor Zugabe zu den Zellen inkubiert. Das Medium auf den Zellen wurde mit 75 μl frischem Wachstumsmedium ersetzt. 5 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen einmal mit Wachstumsmedium gewaschen, und 100 μl wurden zur weiteren Kultivierung zugesetzt. 48 Stunden nach Transfektion wurde Medium durch 200 μl serumfreies Wachstumsmedium ersetzt, 72 Stunden nach Transfektion wurden 100-μl-Überstände für Aβ42-ELISA geerntet. Der Test wurde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Innogenetics) durchgeführt.
  • Die Knockdown-Effizienz von ausgewählten siRNAs wurde auf Proteinniveau durch Cotransfizieren von siRNAs und entsprechenden TAP-markierten cDNA-Expressionsvektoren oder unter Verwendung von Zelllinien, die das jeweilige markierte Protein von Interesse stabil exprimierten, bewertet. 48-Stunden-nach-Transfektions-Extrakte wurden hergestellt, die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose übergeführt. Westernblots wurden mit Antikörpern, die gegen den Marker und Tubulin gerichtet waren, sondiert.
  • Wir stellten fest, dass wie siRNAs, die gegen den bekannten Effektor der APP-Prozessierung, BACE1, gerichtet waren, die SCD-4-targeting-siRNA eine signifikante Abschwächung der Aβ1-42-Sekretion hervorriefen, wohingegen die Luc3-siRNA keine Wirkung aufwies.
  • Somit konnten wir zeigen, dass SCD-4 eine funktionelle Rolle bei der Prozessierung von APP spielt. Es wurde gezeigt, dass durch Hemmung von SCD-4 die Produktion des Aβ1-42-Peptids reduziert werden konnte.
  • Wir bestätigten durch RT-PCR-Analyse, wie vorstehend beschrieben, dass die SCD-4 siRNAs in der Tat mit der Expression der Desaturase auf mRNA-Niveau interferieren.
  • BEISPIEL 3: Bestimmung der SCD-4-Aktivität
  • a) Rattenleber-mikrosomaler Test
  • Angepasst der Messung der SCD-4-Aktivität von: (Obukowicz MG, Raz A, Pyla PD, Rico JG, Wendling JM, Needleman P (1988a) Identification and characterization of a novel delta6/delta 5 fatty acid desaturase inhibitor as a potential anti-inflammatory agent. Biochem. Pharmacol. 1; 55(7): 1 045–58, Obukowicz MG, Welsch DJ, Salsgiver, WJ, Martin-Berger CL, Chinn KS, Duffin KL, Raz A, Needleman P (1998b) Novel selective delta6 oder delta5 fatty acid desaturase inhibitors as antiinflammatory agents in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 287(1): 157–66).
  • Ratten-mikrosomale Membranen wurden durch biochemische Standardfraktionierungsverfahren erhalten.
  • In einer 48-Well-Platte werden die folgenden Komponenten vermischt: a) 150 μl Puffer/Cofaktoren (250 mM Saccharose, 150 mM KCl, 40 mM NaF, 1,3 mM ATP, 1 mg/ml MgCl2·5 H2O, 1,5 mM reduziertes Glutathion, 60 μM reduziertes CoA, 330 μM Nicotinamid, 670 μg/ml NADH, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,4; b) 50 μl Rattenleber-Mikrosomen (ca. 500 μg Gesamtprotein); c) 2,2 μl Test-Verbindung (DMSO-Stammlösung; 1% DMSO-Endkonzentration); d) 20 μl (0,05 μCi) 14C-Fettsäuresubstrate.
  • Der Test gestattete die gleichzeitige Messung der SCD1- und SCD4-Aktivität (Δ9-Desaturase). Das Substrat für diese enzymatische Aktvitäten ist Stearinsäure (14C18:0).
  • Die Proben werden 1 Stunde bei 37°C inkubiert, und dann wurden die Reaktionen gestoppt und Fettsäureesterverknüpfungen durch Inkubation mit 200 μl 2,5 N KOH in Methanol:Wasser (4:1) 4 h bei 65°C hydrolysiert. Die freien Fettsäuren werden mit 280 μl Ameisensäure protoniert und in die organische Phase (700 μl Hexan) extrahiert. 200 μl aus der Hexanschicht werden auf AgNO3-Dünnschichtchromatographie(TLC)-Platten analysiert. Die Platten werden über Nacht getrocknet und die Aktivität wird durch Phosphorimager quantifiziert. Als eine Alternative zur TLC-Analyse könnte die Auftrennung der Proben durch HPLC erreicht werden.
  • c) Zelltest
  • Eine Zelllinie, die hohe Niveaus von SCD4 exprimiert, wird verwendet. Die Zellen sind dem Wachstum in einem geeigneten serumfreien Medium angepasst, das SCD4-Substrate (wie 10 μM Stearinsäure/15 μM Fettsäure-freies RSA) enthält. Zur Messung der SCD4-Aktivität werden 2 × 105 Zellen pro 48-Well ausgestrichen und dann in Medium inkubiert, das 10 μM eines geeigneten Substrates (wie Stearinsäure (14C18:0)) enthielt. Zur Bestimmung des Fettsäuremetabolismus wird die Zellschicht mit PBS gewaschen, und 200 μl 2,5 N KOH in Methanol:Wasser (4:1) werden zugesetzt. Die Proben werden weiterhin, wie vorstehend beschrieben, verarbeitet.
  • c) Durchsatzstarke Screeningtests unter Verwendung von synthetischen Fettsäureenzymen (s. WO-03/019146 , S. 27ff.)
  • Der Test verwendet positionsspezifisch tritierte Fettsäureacyl-CoA-Ester in einem mikrosomalen Testformat (siehe vorstehend). Das Verfahren weist die Freisetzung von tritiertem Wasser nach und umgeht das Erfordernis der TLC- oder HPLC-Analyse von 14C-markierten Fettsäuren.
  • Kurz gesagt werden die folgenden Komponenten vermischt (Gesamtvolumen: 100 μl): 2 μl unmarkiertes 1,5 mM Fettsäureacyl-CoA, 1 μl tritiertes Fettsäureacyl-CoA, 10 μl 20 mM NADH, Verbindungen aus DMSO-Stammlösung, 67 μl 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2. 80 μl dieses Gemisches werden zu 20 μl Mikrosomen (ca. 20 μg Gesamtprotein) zugesetzt, und die Reaktion wird 5–30 min bei RT ablaufen gelassen. 10 μl 6% Perchlorsäure werden zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. Zur Sedimentierung von unverbrauchtem tritiertem Substrat werden die Proben mit 100 μl Kohlesuspension verwirbelt und bei 13 000 U/min 10 min bei 4°C zentrifugiert. 400 μl Überstand werden in einem Flüssigszintillationszähler analysiert.

Claims (6)

  1. Verwendung eines SCD4-Inhibitors für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung der Alzheimerkrankheit, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen, und wobei der Inhibior die Aktivität von gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase moduliert.
  2. Verfahren zum Identifizieren eines gamma-Sekretase und/oder eines beta-Sekretase Modulators, umfassend die folgenden Schritte: a. Identifizieren eines SCD4-interagierenden Moleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Test-Verbindung ein SCD4-interagierendes Molekül ist. b. Bestimmen, ob das SCD4-interagierende Molekül von Schritt a) imstande ist, gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase zu modulieren.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt a) die Test-Verbindung mit SCD4 in Kontakt gebracht wird, und die Interaktion von SCD4 mit der Test-Verbindung bestimmt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Interaktion der Test-Verbindung mit SCD4 in einer Inhibition der SCD4-Aktivität resultiert.
  5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4, wobei in Schritt b) die Fähigkeit der gamma-Sekretase und/oder der beta-Sekretase, APP zu spalten, gemessen wird.
  6. Verwendung eines SCD4-Inhibitors für die Modulation der beta-Sekretase- und/oder gamma-Sekretase Aktivität in vitro, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen.
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