DE602004008658T2

DE602004008658T2 - Behandlung neurodegenerativer krankheiten

Info

Publication number: DE602004008658T2
Application number: DE602004008658T
Authority: DE
Inventors: Carsten Hopf
Original assignee: Cellzome GmbH
Current assignee: Cellzome GmbH
Priority date: 2003-09-05
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2024-09-03
Also published as: ES2291917T3; EP1670903B1; EP1670903A2; CA2537844A1; DE602004008658D1; WO2005023833A2; WO2005023833A3; ATE371724T1; US20060216292A1; DK1670903T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinkomplexe des APP-Prozessierungsweges, die das FADS2-Protein umfassen, sowie die Verwendung von Inhibitoren dieser Komplexe sowie von FADS2 bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten.
Die Alzheimer-Krankheit ist ein chronisches Leiden, das weltweit Millionen von Individuen befällt.
Das Gehirn von an Alzheimer-Krankheit Leidenden zeigt eine charakteristische Pathologie prominenter neuropathologischer Läsionen, wie die zunächst intrazellulären neurofibrillären Verknotungen (NFTs) und die extrazellulären Amyloid-reichen senilen Plaques. Diese Läsionen gehen mit einem massiven Verlust an Populationen von ZNS-Neuronen einher, und ihre Progression begleitet die mit AK assoziierte klinische Demenz. Die Hauptkomponente von amyloiden Plaques sind die Amyloid-beta-(A-beta)-Peptide verschiedener Länge. Eine Variante davon, die das Aβt-42-Peptid ist, ist das hauptsächliche kausative Mittel der Amyloidbildung. Amyloid-beta ist das proteolytische Produkt eines Vorläuferproteins des beta-Amyloid-Vorläuferproteins (beta-APP oder APP). APP ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das sequenziell durch verschiedene Membran-assoziierte Proteasen gespalten wird. Die erste Spaltung von APP erfolgt durch eine von zwei Proteasen, Alpha-Sekretase oder Beta-Sekretase. Alpha-Sekretase ist eine Metalloprotease, deren Aktivität höchstwahrscheinlich von einem oder von einer Kombination der Proteine ADAM 10 und ADAM17 bereitgestellt wird. Die Spaltung durch Alpha-Sekretase schließt die Bildung von Amyloidpeptiden aus und wird somit als nicht-amyloidogen bezeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Spaltung von APP durch Beta-Sekretase eine Vorbedingung für die nachfolgende Bildung von Amyloidpeptiden. Diese Sekretase, die auch BACE1 (Betastellen-APP-Spaltungsenzym) genannt wird, ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das eine Aspartylproteaseaktivität (nachstehend ausführlich beschrieben) enthält.
Die Beta-Sekretase-(BACE)-Aktivität spaltet APP in der Ektodomäne, was zum Abwerfen von sezerniertem löslichen APPb und zu einem C-terminalen 99-Reste-Transmembranfragment (APP-C99) führt. Vassar et al. (Science 286, 735-741) klonierten eine Transmembran-Aspartamprotease, die die Merkmale der postulierten Beta-Sekretase von APP aufwies, die sie als BACE1 bezeichneten. Die Gehirn- und Primärkortex-Kulturen aus BACE1-Knockout-Mäusen zeigten keine nachweisbare Beta-Sekretase-Aktivität, und Primäkortexkulturen aus BACE-Knockout-Mäusen produzierten viel weniger Amyloid-beta aus APP. Dies legt nahe, dass BACE1, mehr als sein Paralog BACE2, die eigentliche Beta-Sekretase für APP ist. BACE1 ist ein Protein von 501 Aminosäuren, das ein 21-aa-Signalpeptid und eine anschließende Proproteindomäne, die aa 22 bis 45 umspannt, enthält. Alternativ existieren gespleißte Formen, BACE-I-457 und BACE-I-476. Auf die lumenale Domäne des reifen Proteins folgen eine vorhergesagte Transmembrandomäne und ein kurzer zytosolischer C-terminaler Schwanz von 24 aa. BACE1 wird als ein Typ-1-Transmembranprotein mit der aktiven Stelle auf der lumenalen Seite der Membran vorhergesagt, wo Beta-Sekretase APP und mögliche andere, allerdings noch nicht identifizierte Substrate abspaltet. Obwohl BACE1 eindeutig ein Schlüsselenzym ist, das für die Prozessierung von APP zu A-beta erforderlich ist, legen neue Beweise zusätzliche potentielle Substrate und Funktionen von BACE1 nahe (J. Biol. Chem. 279, 10542-10550). Derzeit wurden noch keine BACE1-Wechselwirkungsproteine mit regulatorischer oder modulatorischer Funktion beschrieben.
Das durch die BACE1-Abspaltung erzeugte APP-Fragment, APP-C99, ist ein Substrat für die Gamma-Sekretase-Aktivität, die APP-C99 innerhalb der Ebene der Membran zu einem A-beta-Peptid (wie amyloidogenes Aβ1-42-Peptid) und in ein C-terminales Fragment, das APP-intrazelluläre Domäne (AICD) genannt wird, aufspaltet (Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 25-51). Die Gamma-Sekretase-Aktivität ist innerhalb eines Multiproteinkomplexes mit mindestens vier distinkten Untereinheiten beheimatet. Die erste zu entdeckende Untereinheit war Presenilin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8208-13). Andere bekannte Proteinkomponenten des Gamma-Sekretase-Komplexes sind Pen-2, Nicastrin und Aph-1a.
Trotz des neueren Fortschrittes bei der Aufklärung molekularer Ereignisse, die der Ätiologie von Alzheimer-Krankheit zugrunde liegen, wurden bisher noch keine krankheitsmodifizierenden Therapien entwickelt. Hierzu war die Industrie bestrebt, geeignete Leitverbindungen zur Hemmung von BACE1 zu identifizieren. Ferner wurde erkannt, dass eine wachsende Anzahl alternativer Substrate von Gamma-Sekretase existiert, insbesondere das Notch-Protein. Folglich löst die Hemmung der Gamma-Sekretase wahrscheinlich Mechanismus-basierende Nebenwirkungen aus. Derzeitige Spitzenarzneimittel (z. B. Aricept^®/Donepezil) versuchen eine temporäre Verbesserung der kognitiven Funktionen durch Hemmung der Acetylcholinesterase zu erreichen, was zu erhöhten Konzentrationen des Neurotransmitters Acetylcholin im Gehirn führt. Diese Therapien sind für die späteren Stadien der Krankheit nicht geeignet, sie behandeln nicht die zugrunde liegende Krankheitspathologie, und sie stoppen die Krankheitsprogression nicht.
In WO 01/49871 ist ein Screeningverfahren auf Modulatoren eines Komplexes in vivo offenbart, der Gamma-Sekretase oder Presenilin umfasst.
Somit besteht ein unerfüllter Bedarf zur Identifizierung neuer Ziele, die neue molekulare Strategien zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit erlauben. Zusätzlich besteht ein großer Bedarf an neuen therapeutischen Verbindungen, die die zuvor genannten molekularen Prozesse durch Abzielen auf diese neuen Ziele modifizieren.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass FADS2 einen Teil von verschiedenen intrazellulären Proteinkomplexen bildet, die an der aberranten Prozessierung von APP bei Alzheimer-Krankheit durch Gamma-Sekretase beteiligt sind. Es wurde insbesondere festgestellt, dass FADS2 Teil des Nicastrinkomplexes, des BACE1-Komplexes, des Psen2-Komplexes und des PTK7-Komplexes ist, alles Moleküle, die bekanntlich mit Gamma-Sekretase Wechselwirken. Diese Komplexe werden nach ihrer Schlüsselproteinverbindung benannt.
Die Identifizierung von FADS2 als ein Schlüsselmolekül in diesen Komplexen ermöglicht die Verwendung von FADS2-Wechselwirkungsmolekülen zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten. Dies ist insbesondere in dem Beispielabschnitt (infra) gezeigt, wo gezeigt wird, dass siRNA, die gegen FADS2 gerichtet ist, zum korrekten Prozessieren von APP führt, d. h. zur Bildung von Abeta-40 anstelle von Abeta-42 durch Gamma-Sekretase.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein "FADS2-Wechselwirkungsmolekül" ein Molekül, das mindestens zeitweise an FADS2 bindet und das vorzugsweise die FADS2-Aktivität moduliert.
Fettsäure-Δ6-Desaturase (FADS2) katalysiert bekanntlich den Geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Biosynthese von poly-ungesättigten Fettsäuren (PUFA), die Umwandlung von entweder Linolsäure (C18:2) zu Δ-Linolensäure (gLA; C18:3n-6) auf dem n-6-metabolischen Weg oder von Δ-Linolensäure (aLA; C18:3n-3) zu Stearidonsäure (C18:4n-3) auf dem n-3-metabolischen Weg. gLA wird anschließend verlängert und durch Fettsäure-Δ5-Desaturase (FADS1) zu Arachidonsäure (AA; C20:4n-6) umgewandelt. AA ist der essentielle Vorläufer verschiedener Eicosanoide, wie Prostaglandine und Leukotriene. Auf dem n-3-metabolischen Weg erzeugt FADS1 Eicosapentaensäure (EPA; C20:5n-3), eine PUFA, von der vermutet wurde, dass sie neuroprotektive Wirkungen besitzt (Lynch et al., 2003) und bei der Behandlung von Schizophrenie und Depression günstig ist (Emsley et al., 2003).
Ein weiterer Verlängerungsschritt wandelt EPA in Docosapentaensäure (DPA; C22:5n-3) und weiter in C24:5n-3 um. Diese PUFA und die analoge n-6-Fettsäure, C24:4n-6, sind zusätzliche Substrate von FADS2, die sie zu C24:6n-3 bzw. C24:5n-6 umwandelt. Beide C24-PUFAs werden in den Peroxisomen teilweise oxidiert, um Docosahexaensäure (DHA; C22:6n-3), eine überwiegende Gehirn-PUFA, bzw. C22:5n-6 entstehen zu lassen.
Drei menschliche FADS-Familienmitglieder wurden bereits kloniert (siehe ebenso für Nager (Cho et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 37335-37339; Marquardt, A. (2000), Genomics 66, 175). Alle sind Fusionsprodukte, bestehend aus einer N-terminalen zytochromen b5-artigen Domäne und einem C-terminalen multiplen Membran-umspannenden Desaturase-Teil, die beide durch konservierte His-Motive gekennzeichnet sind. FADS-Gene sind an 11q12-q13.1 geclustert, was wahrscheinlich von einer Gen-Duplikation herrührt. Die Funktion eines verwandten Genprodukts, FADS3, ist unbekannt, allerdings wurde angesichts des hohen Niveaus von Sequenzähnlichkeit zwischen FADS2 und FADS3 vorgeschlagen, dass FADS3 eine alternative Fettsäure-Δ6-Desaturase darstellen kann.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "FADS2" nicht nur das Protein, wie in SEQ ID NO:76 gezeigt, sondern auch ein funktionell aktives Derivat davon oder ein funktionell aktives Fragment davon oder ein Homolog davon oder eine Variante, die von einer Nukleinsäure codiert wird, die mit der Nukleinsäure hybridisiert, die das Protein unter niedrigen Stringenzbedingungen codiert. Vorzugsweise umfassen diese niedrigen Stringenzbedingungen die Hybridisierung in einem Puffer, umfassend 35 % Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 % BSA, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10 % (Gew./Vol.) Dextransulfat 18-20 Stunden bei 40 °C, Waschen in einem Puffer, bestehend aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1 % SDS für 1-5 Stunden bei 55 °C und Waschen in einem Puffer, bestehend aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1 % SDS für 1,5 Stunden bei 60 °C.
Das Gleiche trifft auch auf alle anderen Proteine, die in der vorliegenden Erfindung benannt sind, zu. Darum bezieht sich ein Name für ein gegebenes Protein oder eine gegebene Nukleinsäure nicht mehr auf das Protein oder die Nukleinsäure, wie im Sequenzprotokoll dargestellt, sondern auch auf sein funktionell aktives Derivat oder auf ein funktionell aktives Fragment davon oder ein Homolog davon oder eine Variante, die von einer Nukleinsäure codiert wird, die mit der Nukleinsäure hybridisiert, die das Protein unter niedrigen Stringenzbedingungen codiert, vorzugsweise unter den Bedingungen, wie vorstehend erwähnt.
Ein funktionell aktives Derivat bedeutet ein Derivat, das im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie FADS2 ausübt, d. h. die Umwandlung entweder von Linolsäure (C18:2) in Δ-Linolensäure (gLA; C18:3n-6) auf dem n-6-metabolischen Weg oder von Δ-Linolensäure (aLA; C18:3n-3) in Stearidonsäure (C18:4n-3) auf dem n-3-metabolischen Weg. Die Aktivität von FADS2 sowie von einem funktionell aktiven Derivat davon kann, wie bei Obukowicz M.G. et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (JPET) 287: 157-166 (1998) beschrieben, gemessen werden.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Aktivität", wie hier verwendet, die Funktion eines Moleküls in seinem breitesten Sinn. Er umfasst im Allgemeinen, ist jedoch nicht beschränkt auf, biologische, biochemische, physikalische oder chemische Funktionen des Moleküls. Er umfasst beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit anderen Molekülen und die Fähigkeit zur Aktivierung, Erleichterung, Stabilisierung, Hemmung, Unterdrückung oder Destabilisierung der Funktion von anderen Molekülen, die Stabilität, Fähigkeit zur Lokalisierung an bestimmten subzellulären Lokationen. Wo anwendbar, bezeichnet der Begriff auch die Funktion eines Proteinkomplexes in seinem breitesten Sinn.
Erfindungsgemäß umfassen die Begriffe "Derivate" oder "Analoge von Komponentenproteinen" oder "Varianten", wie hierin verwendet, vorzugsweise Moleküle, die Regionen umfassen, die im Wesentlichen zu den Komponentenproteinen homolog sind, bei verschiedenen Ausführungsformen, durch mindestens 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 99 % Identität über eine Aminosäuresequenz identischer Größe oder bei Vergleich mit einer daneben gelegten Sequenz, wobei das Alignment durch ein Computerhomologieprogramm, das aus der Technik bekannt ist, erfolgt, oder dessen codierende Nukleinsäure in der Lage ist, mit einer Sequenz zu hybridisieren, die das Komponentenprotein unter stringenten, moderat-stringenten oder nicht-stringenten Bedingungen codiert, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Er bezeichnet ein Protein, das das Ergebnis einer Modifikation des natürlich vorkommenden Proteins durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen bzw. -additionen ist, wobei die Derivate immer noch die biologische Funktion des natürlich vorkommenden Proteins aufweisen, obwohl nicht notwendigerweise im gleichen Maß. Die biologische Funktion von solchen Proteinen kann z. B. durch geeignete zur Verfügung stehende in vitro Assays, wie bei der Erfindung bereitgestellt, untersucht werden.
Der Begriff "funktionell aktiv", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Protein, nämlich ein Fragment oder Derivat, mit strukturellen, regulatorischen oder biochemischen Funktionen des Proteins gemäß der Ausführungsform, mit der dieses Polypeptid, nämlich das Fragment oder Derivat, zusammenhängt.
Der Begriff "Fragment", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid von mindestens 10, 20, 30, 40 oder 50 Aminosäuren des Komponentenproteins nach der Ausführungsform. Bei speziellen Ausführungsformen sind solche Fragmente nicht größer als 35, 100 oder 200 Aminosäuren.
Der Begriff "Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die ein offenes Leseraster einschließt, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, sofern nicht anderweitig angegeben, einschließlich sowohl von Exon- und gegebenenfalls Intronsequenzen.
Die Begriffe "Homolog" oder "homologe Genprodukte", wie hier verwendet, bedeuten ein Protein in einer anderen Spezies, vorzugsweise Säuger, welches die gleiche biologische Funktion ausübt wie eine Proteinkomponente des hier weiter beschriebenen Komplexes. Solche Homologe werden auch als "orthologe Genprodukte" bezeichnet. Der Algorithmus zum Nachweis von orthologen Genpaaren aus Menschen und Säugern oder anderen Spezies verwendet das gesamte Genom dieser Organismen. Zuerst werden unter Verwendung eines vollen Smith-Waterman-Alignments von vorausberechneten Proteinen die besten paarweisen Treffer gesammelt. Zur weiteren Verbesserung der Zuverlässigkeit werden diese Paare mit den paarweise besten Treffern geclustert, die Drosophila-melanogaster- und C.-elegans-Proteine einschließen. Eine solche Analyse ist beispielsweise in Nature, 2001, 409: 860-921 angegeben. Die Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können entweder auf der Grundlage der Sequenzhomologie der Gene, die die Proteine codieren, die hier bereitgestellt sind, mit den Genen von anderen Spezies durch Klonieren des jeweiligen Gens, wobei herkömmliche Technologie eingesetzt wird und das Protein aus einem solchen Gen exprimiert wird, oder durch Isolieren von Proteinen der anderen Spezies durch Isolieren des analogen Komplexes nach den hier bereitgestellten Verfahren oder nach anderen geeigneten allgemein auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert werden.
Nach den funktionellen, hier bereitgestellten Assays besitzt Δ5-Desaturase (FADS1) keine Wirkung auf den Metabolismus von APP. Somit sind FADS1 (SEQ ID 122) und die Orthologen davon aus dem Umfang der Erfindung ausgeschlossen. Diese Sequenzen sind somit aus der allgemeinen Definition für FADS2-Homologe, die hier bereitgestellt ist, ausgeschlossen.
Im Gegensatz dazu ist FADS3 (SEQ ID 125) explizit im Umfang der Erfindung als Screeningwerkzeug für Verbindungen zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und/oder zur Modulation von Gamma-Sekretase-Aktivität eingeschlossen.
Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff "Inhibitor" auf eine biochemische oder chemische Verbindung, die vorzugsweise die Aktivität von FADS2 hemmt oder herabsetzt. Dies kann z. B. über Suppression der Expression des entsprechenden Gens erfolgen. Die Expression des Gens kann durch RT-PCR- oder Western-Blot-Analyse gemessen werden. Außerdem kann dies über Hemmung der Aktivität, z. B. durch Binden an FADS2 erfolgen.
Beispiele für solche FADS2-Inhibitoren sind Bindungsproteine oder Bindungspeptide, die gegen FADS2 gerichtet sind, insbesondere gegen die aktive Stelle von FADS2, und Nukleinsäuren, die gegen das FADS2-Gen gerichtet sind.
Vorzugsweise ist der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA, niedermolekularen Molekülen (LMWs), Bindungspeptiden, Aptameren, Ribozymen.
LMWs sind Moleküle, die keine Proteine, Peptid-Antikörper oder Nukleinsäuren sind und die ein Molekulargewicht von weniger als 5.000 Da, vorzugsweise weniger als 2.000 Da, stärker bevorzugt weniger als 2.000 Da, besonders bevorzugt weniger als 500 Da aufweisen. Solche LMWs können durch durchsatzstarke Verfahrensweisen ausgehend von Bibliotheken identifiziert werden. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Begriff "Nukleinsäure gegen FADS2" bezieht sich auf doppelsträngige oder einzelsträngige DNA oder RNA, die beispielsweise die Expression des FADS2-Gens oder die Aktivität von FADS2 hemmt und uneingeschränkt Antisense-Nukleinsäuren, Aptamere, siRNAs (kleine interferierende RNAs) und Ribozyme einschließt.
Eine "Antisense"-Nukleinsäure, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die zur Hybridisierung mit einem sequenzspezifischen Teil einer Komponentenprotein-RNA (vorzugsweise mRNA) aufgrund einer gewissen Sequenzkomplementarität in der Lage ist. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einer codierenden und/oder nicht codierenden Region einer Komponentenprotein-mRNA komplementär sein. Solche Antisense-Nukleinsäuren, die die Komplexbildung oder -aktivität hemmen, besitzen als Therapeutika Anwendung und können bei der Behandlung oder Prävention von Störungen, wie hier beschrieben, eingesetzt werden.
Die Nukleinsäuren, z. B. die Antisense-Nukleinsäuren oder siRNAs können chemisch synthetisiert werden, z. B. gemäß der Phosphotriester-Methode (siehe beispielsweise Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990), Chemical Reviews, 90, 543-584). Aptamere sind Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid, hier FADS2, binden. Aptamere können durch Selektionsverfahren, wie SELEX (siehe beispielsweise Jayasena (1999), Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug und Famulok (1994), M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981 ) aus einem großen Pool verschiedener einzelsträngiger RNA-Moleküle isoliert werden. Aptamere können auch synthetisiert und in ihrer Spiegelbildform selektiert werden, beispielsweise als das L-Ribonukleotid (Nolte et al. (1996), Nat. Biotechnol. 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996), Nat. Biotechnol. 14, 1112-5). Formen, die auf diese Weise isoliert werden, genießen den Vorteil, dass sie nicht durch natürlich vorkommende Ribonukleasen abgebaut werden und darum eine größere Stabilität besitzen.
Die Nukleinsäuren können durch Endonukleasen oder Exonukleasen, insbesondere durch DNasen und RNasen abgebaut werden, die in der Zelle gefunden werden können. Es ist darum vorteilhaft, die Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie gegen Abbau zu stabilisieren, wodurch gewährleistet wird, dass eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle über einen langen Zeitraum beibehalten wird (Beigelman et al. (1995), Nucleic Acids Res., 23: 3989-94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch Einbringen von einer oder mehreren Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch Einbringen von einem oder mehreren Nicht-Phosphor-Internukleotiden erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind bei Uhlmann und Peyman (1990), supra (siehe auch Beigelman et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Wo 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ) zusammengestellt. Modifizierte Intemukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden können, enthalten beispielsweise Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat und/oder Phosphatester, wohingegen Nicht-Phosphor-Intemukleotidanaloge beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, dass diese Modifikation die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung verbessert, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden kann.
Die Verwendung geeigneter Antisense-Nukleinsäuren ist weiterhin beschrieben, z. B. bei Zheng und Kemeny (1995), Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen und Lichtenstein (1993), Trends Biochem. Sci. 18, 419-23; Stein (1992), Leukemia 6, 697-74 oder Yacyshyn, B.R. et al. (1998), Gastroenterology 114, 1142).
Hinsichtlich von Antisense-Molekülen treffen die folgenden speziellen Ausführungsformen zu: Die vorliegende Erfindung stellt die therapeutische oder prophylaktische Verwendung von Nukleinsäuren aus mindestens sechs Nukleotiden bereit, die Antisense sind zu einem Gen oder zu cDNA, die ein Komponentenprotein codiert, oder einem Teil davon.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren können Oligonukleotide sein, die doppel- oder einzelsträngig sind, RNA oder DNA, oder eine Modifikation oder ein Derivat davon sein, das direkt an eine Zelle verabreicht werden kann oder das intrazellulär durch Transkription von exogenen eingebrachten Sequenzen produziert werden kann.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Expression von Komponentenproteinnukleinsäuresequenzen in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, umfassend das Versehen der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die eine Antisense-Nukleinsäure des Komponentenproteins oder ein erfindungsgemäßes Derivat davon einschließt.
Die Antisense-Nukleinsäuren bestehen aus mindestens sechs Nukleotiden und sind vorzugsweise Oligonukleotide im Bereich von 6 bis etwa 200 Nukleotiden. Bei einem speziellen Aspekt ist das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide oder mindestens 200 Nukleotide lang. Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimäre Gemische sein oder Derivate oder modifizierte Versionen davon und entweder einzel- oder doppelsträngig sein. Das Oligonukleotid kann an der Basengruppierung, Zuckergruppierung oder am Phosphatgerüst modifiziert sein. Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen umfassen, wie Peptide, Mittel, die den Transport über die Zellmembran erleichtern (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 88/09810 ) oder Blut-Hirn-Schranke (siehe beispielsweise internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/10134 ), durch Hybridisierung ausgelöste Spaltungsmittel (siehe beispielsweise Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) oder Interkalationsmittel (siehe beispielsweise Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549).
Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein Antisense-Oligonukleotid vorzugsweise als einzelsträngige DNA bereitgestellt. Das Oligonukleotid kann an jeder Position in seiner Struktur mit im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannten Bestandteilen modifiziert sein.
Die Antisense-Oligonukleotide können mindestens eine modifizierte Basengruppierung einschließen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, D-Galactosylchinosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, D-Mannosylchinosin, 5N-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methyl-thio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Chinosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Zuckereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
Bei wieder einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Phosphathauptkette, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal oder einem Analog des Vorgenannten.
Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2-a-anomeres Oligonukleotid. Ein a-anomeres Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge zueinander parallel verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641).
Die Oligonukleotide können mit einem anderen Molekül, z. B. einem Peptid, einem durch Hybridisierung ausgelösten Vernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsmittel etc. konjugiert sein.
Überall in der Erfindung können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide durch auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts (wie sie im Handel von der Firma Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich sind). Als Beispiele können Phosphorothioat-Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) synthetisiert werden, Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch die Verwendung von kontrollierten Porenglaspolymerträgern hergestellt werden (Sarin et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451) etc.
Bei einer speziellen Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonukleotide katalytische RNAs oder Ribozyme (siehe Z. B. internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/11364 ; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225). Bei einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. 1987, FERS Lett. 215: 327-330).
Bei einer alternativen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren intrazellulär durch Transkription aus einer exogenen Sequenz produziert. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo so eingebracht werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird, innerhalb von der der Vektor oder ein Teil davon transkribiert wird, wobei eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure (RNA) produziert wird. Ein solcher Vektor würde eine Sequenz, die das Komponentenprotein codiert, enthalten. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Solche Vektoren können durch DNA-Rekombinationstechniken, die technischer Standard sind, konstruiert werden. Vektoren können Plasmid-Vektoren, virale Vektoren oder andere sein, von denen auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie zur Replikation und Expression in Säugerzellen in der Lage sind. Die Expression dieser Sequenzen, die die Antisense-RNAs codieren, kann durch jeden Promotor erfolgen, von dem auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass er in Säugerzellen, vorzugsweise in menschlichen Zellen, wirkt, erfolgen. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die frühe Promotorregion SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), den Promotor, der in der 3'-langen terminalen Wiederholungseinheit des Roussarkoma-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), den Herpes-Thymidinkinasepromotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42) etc.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren umfassen eine zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts oder eines Komponentenproteingens, vorzugsweise einem menschlichen Gen, komplementäre Sequenz. Allerdings ist, obwohl bevorzugt, absolute Komplementarität nicht erforderlich. Eine Sequenz-"Komplementarität zu mindestens einem Teil einer RNA", wie hier bezeichnet, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein, mit der RNA zu hybridisieren, wobei ein stabiler Doppelstrang gebildet wird; im Falle von doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein Einzelstrang der Doppelstrang-DNA getestet werden, oder es kann die Triplex-Bildung überprüft werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung hängt sowohl vom Komplementaritätsgrad als auch von der Länge der Antisense-Nukleinsäure ab. Je länger die hybridisierende Nukleinsäure, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer Komponenten-Protein-RNA kann sie im Allgemeinen enthalten und immer noch einen stabilen Doppelstrang (oder einen Dreifachstrang, gegebenenfalls) bilden. Ein Fachmann kann ein tolerierbares Fehlpaarungsmaß durch die Verwendung von Standardvorgehensweisen zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes sicherstellen.
Pharmazeutische erfindungsgemäße Zusammensetzungen (siehe Abschnitt "Pharmazeutische Zusammensetzungen und therapeutische/prophylaktische Verabreichung", infra), die eine wirksame Menge einer Proteinkomponenten-Antisense-Nukleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen, können einem Patienten mit einer Krankheit oder Störung verabreicht werden, die von einem Typ ist, der einen erfindungsgemäßen Proteinkomplex exprimiert oder überexprimiert.
Die Menge an Antisense-Nukleinsäure, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Wenn möglich, ist es erwünscht, die Antisense-Zytotoxizität in vitro und dann in den geeigneten Tiermodellsystemen vor der Testung und Verwendung bei Menschen zu bestimmen.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die Antisense-Nukleinsäuren einschließen, über Liposomen, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann die Verwendung solcher Zusammensetzungen zum Erreichen einer verzögerten Freisetzung der Antisense-Nukleinsäuren geeignet sein. Bei einer speziellen Ausführungsform kann die Verwendung von Liposomen wünschenswert sein, die über Antikörper auf spezifische identifizierbare Zentralnervensystemzelltypen gerichtet sind (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337-16342).
Die Herstellung und Verwendung von siRNAs als Werkzeuge zur RNA-Interferenz bei dem Verfahren zur Abregulierung oder zum Ausschalten der Genexpression, hier die FADS2-Genexpression, ist bei Elbashir, S.M. et al. (2001), Genes Dev., 15, 188 oder Elbashir, S.M. et al. (2001), Nature, 411, 493 beschrieben. Vorzugsweise zeigen siRNAs eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden, wobei die Identitätsausdehnung des Sense-Strangs der siRNA vorzugsweise mindestens 19 Nukleotide beträgt.
Ribozyme sind ebenfalls geeignete Werkzeuge zur Hemmung der Translation von Nukleinsäuren, hier das FADS2-Gen, da sie in der Lage sind, spezifisch die mRNAs zu binden und sie zu schneiden. Sie sind z. B. bei Amarzguioui et al. (1998), Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998), Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997), Nat. Biotechnol., 15, 921-2 oder Couture und Stinchcomb (1996), Trends Genet., 12, 510-5 beschreiben.
Der Begriff "Bindungsprotein" oder "Bindungspeptid" bezieht sich auf eine Klasse von Proteinen oder Peptiden, die FADS2 binden und hemmen, uneingeschränkt, polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Proteingerüste, die gegen diese Proteine gerichtet sind.
Erfindungsgemäß wird der Begriff Antikörper oder Antikörperfragment auch so verstanden, dass Antikörper oder Antigen-bindende Teile davon gemeint sind, die rekombinant und, wo angemessen, modifiziert hergestellt wurden, wie chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bispezifische oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper und F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe beispielsweise EP-B1-0 368 684 , US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649 , WO 93/06213 oder WO 98/24884 ), vorzugsweise mit Hilfe einer FAB-Expressionsbibliothek produziert.
Als Alternative zu den klassischen Antikörpern ist es auch beispielsweise möglich, Proteingerüste gegen FADS2 zu verwenden, z. B. Anticaline, die auf Lipocalin beruhen (Beste et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Die natürlichen Ligandenbindenden Stellen der Lipocaline, beispielsweise das Retinol-bindende Protein oder das Bilinbindende Protein, können verändert werden, beispielsweise mittels eines "kombinatorischen Proteinkonstruktions"-Weges auf eine solche Weise, dass sie an ausgewählte Haptene, hier an FADS2, binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Von weiteren bekannten Proteingerüsten ist bekannt, dass sie Alternativen zu Antikörpern zur molekularen Erkennung darstellen (Skerra (2000), J. Mol. Recognit., 13, 167-187).
Das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragmentes wird nach Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann gut bekannt sind, z. B. durch Immunisieren eines Säugers, beispielsweise eines Kaninchens, mit FADS2, gegebenenfalls in Gegenwart von beispielsweise Freund's Adjuvans und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe beispielsweise Diamond, B.A. et al., (1981), The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Die polyklonalen Antikörper, die in dem Tier als Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebildet werden, können anschließend aus dem Blut unter Verwendung allgemeiner Verfahren isoliert und beispielsweise mittels Säulenchromatographie gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach dem bekannten Verfahren von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991), Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.
Im Einzelnen können polyklonale Antikörper wie vorstehend beschrieben durch Immunisierung eines geeigneten Individuums mit einem Polypeptid als ein Immunogen hergestellt werden. Bevorzugte polyklonale Antikörperzusammensetzungen sind diejenigen, die auf Antikörper selektiert wurden, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder gegen erfindungsgemäße Polypeptide gerichtet sind. Besonders bevorzugte polyklonale Antikörperpräparationen sind diejenigen, die nur Antikörper enthalten, die gegen ein gegebenes Polypeptid oder gegen gegebene Polypeptide gerichtet sind. Besonders bevorzugte Immunogenzusammensetzungen sind diejenigen, die keine anderen menschlichen Proteine enthalten, wie beispielsweise Immunogenzusammensetzungen, die unter Verwendung einer nicht-menschlichen Wirtszelle zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids hergestellt wurden. Auf eine solche Weise ist das einzige menschliche Epitop oder Epitope, die von den resultierenden Antikörperzusammensetzungen erkannt werden, die gegen dieses Immunogen gezüchtet wurden, als Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder erfindungsgemäßer Polypeptide vorhanden.
Der Antikörpertiter in dem immunisierten Individuum kann zeitlich auch durch Standardtechniken wie mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem Polypeptid bezeichnet werden. Falls gewünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säuger (z. B. aus dem Blut) isoliert und weiterhin durch gut bekannte Techniken, wie Protein-A-Chromatographie unter Erhalt der IgG-Fraktion, weiter gereinigt werden. Alternativ können Antikörper, die auf ein erfindungsgemäßes Protein oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid spezifisch sind, z. B. für die Affinitätschromatographie selektiert (z. B. teilweise gereinigt) oder durch sie gereinigt werden. Beispielsweise wird ein rekombinant exprimiertes und gereinigtes (oder teilweise gereinigtes) erfindungsgemäßes Protein wie hier beschrieben produziert und kovalent oder nicht kovalent an einen festen Träger, wie beispielsweise eine Chromatographiesäule, gekoppelt. Die Säule kann sodann zur Affinitätsreinigung von Antikörpern, die für die erfindungsgemäßen Proteine spezifisch sind, aus einer Probe verwendet werden, die Antikörper enthält, die gegen eine große Anzahl von verschiedenen Epitopen gerichtet sind, wodurch eine im Wesentlichen aufgereinigte Antikörperzusammensetzung erzeugt wird, d. h. eine, die im Wesentlichen frei ist von verunreinigenden Antikörpern. Durch eine im Wesentlichen gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Antikörperprobe höchstens nur 30 % (bezogen auf das Trockengewicht) von verunreinigenden Antikörpern enthält, die gegen Epitope gerichtet sind, die anders sind als diejenigen auf dem gewünschten erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid, und vorzugsweise sind höchstens 20 %, noch stärker bevorzugt höchstens 10 % und besonders bevorzugt höchstens 5 % (bezogen auf das Trockengewicht) der Probe kontaminierende Antikörper. Eine gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet, dass mindestens 99 % der Antikörper in der Zusammensetzung gegen das gewünschte erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gerichtet sind.
Zu einer angemessenen Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die spezifischen Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper-produzierende Zellen aus dem Individuum erhalten und zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Standardtechniken, wie die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein beschrieben wurde (1975, Nature 256: 495-497), die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72), die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, MonoKlonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96) oder die Triomtechniken, verwendet werden. Die Technik zur Produktion von Hybridomen ist gut bekannt (siehe allgemein Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et al., (Hrsg.) John Wiley & Sons, Inc. New York, NY). Hybridomzellen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden durch Screening der Hybridom-Kulturüberstände auf Antikörper, die das Polypeptid von Interesse binden (z. B. unter Verwendung eines Standard-ELISA-Tests), nachgewiesen.
Alternativ kann zur Herstellung von monoklonalen Antikörper-sezernierenden Hybridomen ein monoklonaler Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid identifiziert und durch Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulin-Bibliothek (z. B. eine Antikörperphage-Displaybibliothek) mit dem Polypeptid von Interesse isoliert werden. Testsätze zur Erzeugung und zum Screening von Phage-Displaybibliotheken sind im Handel erhältlich (z. B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog Nr. 27-9400-01; und das Stratagene SurfZAP Phage-Display-Kit, Katalog Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die zur Verwendung bei der Erzeugung und Screening von einer Antikörper-Displaybibliothek besonders geeignet sind, beispielsweise in US-Patent Nr. 5,223,409 ; PCT-Publikation Nr. WO 92/18619 ; PCT-Publikation Nr. WO 91/17271 ; PCT-Publikation Nr. WO 92/20791 ; PCT-Publikation Nr. WO 92/15679 ; PCT-Publikation Nr. WO 93/01288 ; PCT-Publikation Nr. WO 92/01047 ; PCT-Publikation Nr. WO 92/09690 ; PCT-Publikation Nr. WO 90/02809 ; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281; Griffiths et al., 1993; EMBO J. 12: 725-734 gefunden werden.
Zusätzlich liegen rekombinante Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Teile umfassen, die unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden können, im Umfang der Erfindung. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Teile von verschiedenen Tierarten abstammen, wie diejenigen mit einer variablen Region, die von einer murinen mAb- und einer menschlichen konstanten Immunglobulinregion abstammen. (Siehe beispielsweise Cabilly et al., US-Patentschrift Nr. 4,816,567 ; und Boss et al., US-Patentschrift Nr. 4,816,397 , die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.) Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus nicht-menschlichen Arten mit einer oder mehreren komplementär bestimmenden Regionen (CDRs) aus den nicht-menschlichen Arten und einer Framework-Region aus einem menschlichen Immunglobulinmolekül. (Siehe z. B. Queen, US-Patentschrift Nr. 5,585,089 , die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist.) Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch DNA-Rekombinationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung der in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671 ; Europäische Patentanmeldung 184,187 ; Europäische Patentanmeldung 171,496 ; Europäische Patentanmeldung 173,494 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 ; US-Patentschrift Nr. 4,816,567 ; Europäische Patentanmeldung 125,023 ; Retter et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al., 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207; Oi et al., 1986; Bio/Techniques 4: 214; US-Patentschrift 5,225,539 ; Jones et al., 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060 beschriebenen Verfahren.
Vollständig menschliche Antikörper sind besonders zur therapeutischen Behandlung menschlicher Patienten erwünscht. Solche Antikörper können beispielsweise unter Verwendung von transgenen Mäusen hergestellt werden, die nicht in der Lage sind, schwere- und -leichte Ketten endogener Immunglobulin-Gene zu exprimieren, die allerdings schwere und leichte Ketten menschlicher Gene exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden auf normale Weise mit einem ausgewählten Antigen immunisiert, z. B. mit allen oder einem Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung von herkömmlicher Hybridomtechnik erhalten werden. Die menschlichen Immunglobulin-Transgene, die in den transgenen Mäusen eingeschlossen sind, lagern sich während der B-Zellen-Differenzierung um und durchlaufen anschließend eine Klassenverschiebung und somatische Mutation. Somit ist es unter Verwendung einer solchen Technik möglich, therapeutisch geeignete IgG-, IgA- und IgE-Antikörper zu produzieren. Für einen Überblick über diese Technologie zur Herstellung menschlicher Antikörper siehe Lonberg und Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Für eine ausführliche Besprechung dieser Technologie zur Herstellung menschlicher Antikörper und menschlicher monoklonaler Antikörper und Protokolle zur Herstellung solcher Antikörper siehe z. B. US-Patentschrift 5,625,126 ; US-Patentschrift 5,633,425 ; US-Patentschrift 5,569,825 ; US-Patentschrift 5,661,016 ; und US-Patentschrift 5,545,806 . Zusätzlich können Firmen wie Abgenix, Inc. (Freemont, CA) einbezogen werden, um menschliche Antikörper bereitzustellen, die gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtet sind, wobei eine Technik entsprechend der vorstehend beschriebenen angewandt wird.
Vollständig menschliche Antikörper, die ein selektiertes Epitop erkennen, können unter Anwendung einer als "geführte Selektion" bezeichnete Technik erzeugt werden. Bei diesem Ansatz wird ein selektierter nicht-menschlicher monoklonaler Antikörper, z. B. ein Maus-Antikörper, zur Führung der Selektion eines vollständig menschlichen Antikörpers, der das gleiche Epitop erkennt, verwendet. (Jespers et al., 1994, Bio/Technology 12: 899-903).
Antikörperfragmente, die die Idiotypen des Komplexes enthalten, können durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind jedoch nicht beschränkt auf, das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsin-Abbau des Antikörpermoleküls erzeugt werden kann, das Fab'-Fragment, das durch Reduktion der Disulfid-Brücken des F(ab')2-Fragmentes erzeugt werden kann, das Fab-Fragment, das durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden kann; und Fv-Fragmente.
Die Produktion von Antikörpern, das Screening auf den gewünschten Antikörper können durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken (z. B. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) erreicht werden. Zur Selektion von Antikörpern, die auf eine bestimmte Domäne des Komplexes oder ein Derivat davon spezifisch sind, können generierte Hybridome auf ein Produkt getestet werden, das an das Fragment des Komplexes bindet oder ein Derivat davon bindet, das eine solche Domäne enthält. Zur Selektion eines Antikörpers, der spezifisch einen erfindungsgemäßen Komplex oder ein Derivat oder ein Homolog davon bindet, das aber nicht-spezifisch an die einzelnen Proteine des Komplexes oder ein Derivat oder Homolog davon bindet, kann auf der Grundlage von positivem Binden an den Komplex und einem fehlenden Binden an die einzelnen Proteinkomponenten selektiert werden.
Die vorgenannten Antikörper können bei auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bezüglich der Lokalisierung und/oder Quantifizierung des gegebenen Proteins oder der gegebenen Proteine, z. B. zur Abbildung dieser Proteine, zum Messen der Konzentrationen davon in entsprechenden physiologischen Proben (durch Immunoassay) bei diagnostischen Verfahren etc. eingesetzt werden. Dies trifft auch für ein Derivat oder Homolog eines Komplexes davon zu.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der FADS2-Inhibitor entweder eine siRNA mit den Sequenzen: GCUGAAAUACCUGCCCUAC oder GCAUGGCAUUGAAUACCAG oder die Verbindung SC-26196 (siehe Obukowicz, supra).
Wie vorstehend erläutert, ist FADS2 ein Teil von Proteinkomplexen, die an der Regulierung der Gamma-Sekretase-Aktivität und/oder Beta-Sekretase-Aktivität beteiligt sind. In diesem Zusammenhang bedeutet "Komplex", dass, abgesehen von FADS2, mindestens eines der Proteine aus einem der Komplexe vorhanden ist. Diese Komplexe umfassen die drei Nicastrin-Komplexe (a), (b) und (c), den BACE1-Komplex (a) und (b), den Psen2-Komplex sowie den PTK7-Komplex.
Die Proteinkomplexe wurden bereits als Zusammenfügung von Proteinen identifiziert, die mit den Gamma-Sekretase-Komponenten Nicastrin und Psen-2 und mit Beta-Sekretase-Protein BACE1 sowie mit PTK7, selbst ein Element des BACE1-Komplexes, Wechselwirken.
Preseniline 1 und 2 (Psen1 und Psen2, auch als PS1 bzw. PS2 bezeichnet), sind integrale Membranproteine, die im endoplasmatischen Reticulum, den Golgi-Körpern und auch auf der Zelloberfläche lokalisiert sind (Kovacs, Nat. Med. 2. 224). Sie werden überwiegend als Heterodimere der NTF- und CTF-endoproteolytischen Fragmente festgestellt. Die Protease, die Preseniline spaltet (die "Presenilinase"), ist nicht bekannt, es ist wahrscheinlich, dass der Prozess autokatalytisch ist, auch die funktionelle Signifikanz der PS-(Auto)Proteolyse ist unklar. Preseniline sind an der proteolytischen Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) (De Strooper et al., Nature 391, 387) und dem Notch-Rezeptor beteiligt (De Strooper et al., Nature 398, 518). Zusätzlich sind Preseniline mit den Zelladhäsionsproteinen Alpha- und Beta-Catenin, N-Cadherin und E-Cadherin (Georgakopoulos et al., Mol. Cell 4, 893) und anderen Mitgliedern der Armadillo-Familie assoziiert (Yu et al., J. Biol. Chem. 273, 16470). Die APP-Prozessierung durch Preseniline erfolgt über ihre Wirkungen auf Gamma-Sekretase, die APP spaltet, und das den C-Terminus des A-Beta-Peptids erzeugt. PS1 assoziiert mit den C83- und C99-prozessierten C-terminalen Fragmenten von APP (Xia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8208), Nicastrin (Yu et al., Nature 407, 48) und Pen-2 (Francis et al., Dev. Cell 3, 85). Aph-1 (Francis et al., Dev. Cell 3, 85) ist bei der Presenilin-Prozessierung erforderlich. Es ist nicht klar, ob Preseniline die Gamma-Sekretase-Aktivität direkt regulieren oder ob sie selbst Proteaseenzyme sind (Kopan und Gouate, Genes Dev. 14, 2799). Die Gamma-Sekretase-Aktivität könnte einen multimeren Komplex dieser Proteine einschließen (Yu et al., Nature 407, 48), allerdings ist nicht bekannt, wie die Beziehung zwischen diesen Proteinen die Sekretase-Aktivität beeinflusst.
Nicastrin ist ein Typ-1-Transmembranglycoprotein mit einer konservierten Transmembrandomäne und DYIGS-Motiv (Yu et al., Nature 407, 48), das in Nervenzelllinien konstitutiv exprimiert wird (Satoh und Kuroda, Neuropathology 21, 115). Biochemische Studien haben gezeigt, dass Nicastrin an Preseniline 1 und 2, C-terminale Derivate von APP (Yu et al., Nature 407, 48), Membran-gebundene Formen von Notch (Chen et al., Nat. Cell Biol. 3, 751) bindet und dass es ein Element des Gamma-Sekretase-Komplexes zusammen mit PS1 und PS2 ist. Es wurde gezeigt, dass Nicastrin zur Intramembranspaltung von Notch (Lopez-Schier und St. Johnston, Dev. Cell 2, 79) und APP (Chung und Struhl, Nat. Cell Biol. 3, 1129) erforderlich ist, es kann auch eine Rolle bei der posttranslationalen Stabilisierung von Presenilin (Hu et al., Dev. Cell 2, 69) spielen.
Die Proteintyrosinkinase 7 (PTK7), auch als Dickdarm-Karzinomkinase 4 (CCK4) bezeichnet, ist ein Immunglobulin-Superfamilientransmembran-Glycoprotein, das mit Hühner-KLG und D.-melanogaster-Off-track zusammenhängt. Das Gen wurde auf dem menschlichen Chromosom 6p21.1→p12.2 durch in situ Fluoreszenzhybridisierung kartiert (Banga et al., 1997, Cytogenet. Cell Genet., 1997; 76(1-2): 43-4). PTK7, wovon mehrere Spleißvarianten in menschlichen Geweben existieren, unterscheidet sich von der Rezeptor-Tyrosinkinase-Konsenssequenz in mehreren Positionen, was nahelegt, dass das Protein katalytisch inaktiv ist. (Mossie et al., 1995; Oncogene. 1995 Nov. 16; 11(10):2179-84). PTK7 wird in mehreren menschlichen Geweben exprimiert, allerdings ist seine Funktion unbekannt. Allerdings legt seine Ähnlichkeit mit dem D.-melanogaster-Transmembranprotein Off track/Dtrk, das als Corezeptor von Plexin A für die Semaphorine Sema 1A dient (Winberg et al., Neuron. 2001 Okt. 11; 32(1):53-62) und Sema 6D (Toyofuku et al., Genes Dev. 2004 Feb. 15; 18(4):435-47) dient, nahe, dass PTK7 als Corezeptor eines Plexin-artigen Proteins wirken kann. Im ZNS könnte darum PTK7 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Konnektivität spielen.
Die Beta-Sekretase-(BACE)-Aktivität spaltet APP in der Ektodomäne, was zum Abwerfen von sezerniertem löslichen APPb und zu einem C-terminalen 99-Reste-Transmembranfragment (APP-C99) führt. Vassar et al. (Science 286, 735-741) klonierten eine Transmembran-Aspartamprotease, die die Merkmale der postulierten Beta-Sekretase von APP aufwies, die sie BACE1 genannt haben. Die Hirn- und primäre kortikale Kulturen aus BACE1-Knockout-Mäusen zeigten keine nachweisbare Beta-Sekretase-Aktivität, und primäre kortikale Kulturen aus BACE-Knockout-Mausen produzierten viel weniger Amyloid-beta aus APP. Dies legt nahe, dass BACE1, statt seines Paralogs BACE2, die hauptsächliche Beta-Sekretase für APP ist. BACE1 ist ein Protein von 501 Aminosäuren, das ein 21-aa-Signalpeptid und eine anschließende Proproteindomäne, die aa 22 bis 45 umspannt, enthält. Alternativ existieren gespleißte Formen, BACE-I-457 und BACE-I-476. Auf die lumenale Domäne des reifen Proteins folgen eine vorhergesagte Transmembrandomäne und ein kurzer zytosolischer C-terminaler Schwanz von 24 aa. BACE1 wird als Typ-1-Transmembranprotein mit der aktiven Stelle auf der lumenalen Seite der Membran vorhergesagt, wo Beta-Sekretase APP und mögliche andere, noch nicht identifizierte Substrate abspaltet. Obwohl BACE1 eindeutig ein Schlüsselenzym ist, das für die Prozessierung von APP zu A-Beta erforderlich ist, legen neuere Beweise zusätzliche potentielle Substrate und Funktionen von BACE1 nahe (J. Biol. Chem. 279, 10542-10550). Derzeit wurden noch keine BACE1-wechselwirkenden Proteine mit regulatorischen oder modulatorischen Funktionen beschrieben.
Die Aufklärung dieser Protein-Interaktoren stellt neue Angriffspunkte der Therapie bereit.
Wie vorstehend erklärt, wurde im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung überraschenderweise gefunden, dass FADS2 Teil der Proteinkomplexe ist, die die Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretase-Aktivität regulieren. Darum modelliert bei einer bevorzugten Ausführungsform der Inhibitor oder das wechselwirkende Molekül die Aktivität von Beta-Sekretase und/oder Gamma-Sekretase.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet "Modulieren der Aktivität von Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase", dass die Aktivität insofern herabgesetzt ist, als weniger oder kein Produkt gebildet wird (teilweise oder vollständige Hemmung) oder dass das jeweilige Enzym ein unterschiedliches Produkt erzeugt (im Falle von Gamma-Sekretase, z. B. Abeta-40 anstelle von Abeta-42) oder dass die relativen Mengen der Produkte verschieden sind (im Falle von Gamma-Sekretase, z. B. mehr Abeta-40 als Abeta-42). Außerdem ist eingeschlossen, dass der Modulator entweder die Gamma-Sekretase- oder die Beta-Sekretase- oder die Aktivität von beiden Enzymen moduliert.
Überall in der Erfindung ist es bevorzugt, dass der Beta-Sekretase-Modulator die Aktivität von Beta-Sekretase entweder vollständig oder teilweise hemmt.
Bezüglich des Modulators der Gamma-Sekretase-Aktiviät ist es bevorzugt, dass dieser Modulator die Gamma-Sekretase-Aktivität hemmt. Es ist allerdings auch bevorzugt, dass die Aktivität von Gamma-Sekretase insofern verschoben wird, dass mehr Abeta-40 anstelle von Abeta-42 produziert wird.
Die Gamma-Sekretase-Aktivität kann z. B. durch Bestimmen des APP-Prozessierens, z. B. durch Bestimmen, ob Abeta-40 oder Abeta-42 produziert wird (siehe den Beispielabschnitt, infra), bestimmt werden.
Zum Messen der BACE-1-Aktivität können Änderungen des Verhältnisses zwischen alpha- und beta-C-terminalen APP-Fragmenten durch Western Blot analysiert werden (Blasko et al., J. Neural. Transm. 111, 523); zusätzliche Beispiele für BACE1-Aktivitätstests umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Verwendung eines zyklisierten Enzym-Donorpeptids, das eine BACE1-Spaltungsstelle enthält, um die Beta-Galactosidase-Reporteraktivität zu rekonstituieren und zu messen (Naqvi et al., J. Biomol. Screen. 9, 398); Verwendung von gequenchten Fluorimetrie-Peptidsubstraten und Fluoreszenzmessungen (Andrau et al., J. Biol. Chem. 278, 25859); Verwendung von Zell-basierenden Assays unter Verwendung von rekombinanten chimären Proteinen, in denen ein Enzym (wie alkalische Phosphatase) über eine Spanne von Aminosäuren, die die BACE1-Erkennungssequenz enthalten, mit einem Golgi-residenten Protein verknüpft wird (Oh et al., Anal. Biochem. 323, 7); Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FREI)-basierende Assays (Kennedy et al., Anal. Biochem. 319; 49); ein Zellwachstums-Selektionssystem in Hefe (Luthi et al., Biochim. Biophys. Acta 1620, 167).
Vorzugsweise ist die neurodegenerative Krankheit Alzheimer-Krankheit.
Das FADS2-Wechselwirkungsmolekül kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden.
Die Erfindung beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die an ein Individuum in einer wirksamen Menge verabreicht werden können. Bei einem bevorzugten Aspekt wird das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt. Das Individuum ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tiere, wie Rinder, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde etc., und ist vorzugsweise ein Säuger und am stärksten bevorzugt ein Mensch. Bei einer speziellen Ausführungsform ist das Individuum ein nicht-menschlicher Säuger.
Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums verwendet werden, z. B. Verkapselung in Liposomen, Mikropartikeln und Mikrokapseln: Verwendung von rekombinanten Zellen, die in der Lage sind, das Therapeutikum zu exprimieren; Verwendung von Rezeptor-vermittelter Endozytose (z. B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432); Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder eines anderen Vektors etc. Verfahren zum Einbringen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und andere Wege. Die Verbindungen können durch jeden herkömmlichen Weg, beispielsweise durch Infusion, durch Bolus-Injektion, durch Absorption über epitheliale oder mukokutanöse Auskleidungen (z. B. Oral-, Rektal- und Intestinalschleimhaut etc.), und können zusammen mit anderen biologischen Wirkstoffen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal sein. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in das Zentralnervensystem auf jedem geeigneten Weg einzubringen, einschließlich intraventrikulärer und intrathekaler Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, beispielsweise angeschlossen an ein Reservoir, wie ein Ommaya-Reservoir. Die pulmonale Verabreichung, z. B. durch Verwendung eines Inhalators oder Verneblers, und eine Formulierung mit einem Aerosolbildenden Mittel können ebenso eingesetzt werden.
Es kann wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal an den Bereich, der einer Behandlung bedarf, zu verabreichen. Dies kann beispielsweise durch lokale Infusion während eines operativen Eingriffs, topische Verabreichung, z. B. in Verbindung mit einer Wundauflage nach der Operation, durch Injektion, über einen Katheter, mittels eines Suppositoriums oder mittels eines Implantats, wobei das Implantat ein poröses, nicht-poröses oder Gelatine-artiges Material ist, einschließlich von Membranen, wie sialastischen Membranen oder Fasern erreicht werden, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Verabreichung kann durch direkte Injektion an der Stelle (oder an der ehemaligen Stelle) eines malignen Tumors oder von neoplastischem oder präneoplastischem Gewebe erfolgen.
Das Therapeutikum kann in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, abgegeben werden (Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., 1989, In: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler, Hrsg., Liss, New York, Seiten 353-365; Lopez-Berestein, ibid., Seiten 317-327; s. i. A. ibid.).
Das Therapeutikum kann über ein kontrolliertes Freisetzungssystem abgegeben werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507-516; Saudek et al., 1989; N. Engl. J. Med. 321: 574-579). Polymere Materialien können verwendet werden (Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball, Hrsg., Wiley, New York, 1984; Ranger und Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; Levy et al., 1985, Science 228: 190-192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351-356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 858-863). Ein kontrolliertes Freisetzungssystem kann in der Nachbarschaft des therapeutischen Ziels, d. h. dem Gehirn, platziert werden, was somit nur einen Bruchteil der systemischen Dosis erfordert (beispielsweise Goodson, 1984, In: Medical Applications of Controlled Release, supra, Bd. 2, Seiten 115-138). Weitere kontrollierte Freisetzungssysteme sind in der Übersicht von Langer besprochen (1990, Science 249: 1527-1533).
Wo das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, die ein Protein-Therapeutikum codiert, kann die Nukleinsäure in vivo verabreicht werden, um die Expression ihres codierten Proteins zu beschleunigen, indem sie als Teil eines entsprechenden Nukleinsäureexpressionsvektors konstruiert und derart verabreicht wird, dass sie intrazellulär wird, z. B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors ( US-Patentschrift Nr. 4,980,286 ) oder durch direkte Injektion oder durch die Verwendung von Mikropartikelbombardierung (z. B. eine Genpistole; Biolistic, Dupont) oder durch Überziehen mit Lipiden, Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch ihre Verabreichung in Verknüpfung mit einem Homöoboxartigen Peptid, das bekanntlich in den Kern eindringt (beispielsweise Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868) etc. Alternativ kann ein Nukleinsäure-Therapeutikum intrazellulär eingebracht werden und durch homologe Rekombination in die Wirtszellen-DNA zur Expression eingebaut werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch pharmazeutische Zusammensetzungen. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet von einer Aufsichtsbehörde der Länder- oder einer Bundesstaatsregierung genehmigt oder in der US-Pharmacopeia aufgelistet oder in einer anderen allgemein anerkannten Pharmacopeia zur Verwendung in Tieren und insbesondere in Menschen. Der Begriff "Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Exzipient oder Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich derjenigen aus Erdöl, mit tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung oral verabreicht wird. Kochsalzlösung und wässrige Dextrose sind die bevorzugten Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen werden vorzugsweise als flüssige Träger für injizierbare Lösungen eingesetzt. Geeignete pharmazeutische Exzipienten umfassen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Kieselgel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, Magermilchpulver, Glycerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Die Zusammensetzung kann, sofern gewünscht, auch kleinere Mengen an Netz- oder Emulgiermitteln oder pH-Puffermitteln enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, verzögert freisetzenden Formulierungen und dergleichen annehmen. Die Zusammensetzung kann als Suppositorium mit traditionellen Bindemitteln und Trägern, wie Triglyceriden, formuliert sein. Eine orale Formulierung kann Standardträger, wie Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. von pharmazeutischer Reinheit einschließen. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge des Therapeutikums, vorzugsweise in gereinigter Form zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, so dass dem Patienten die Form zur sachgemäßen Verabreichung bereitgestellt wird. Die Formulierung sollte an die Verabreichungsweise angepasst sein.
Die Zusammensetzung kann gemäß Routineverfahrensweisen als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen ausgelegt ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Wo notwendig, kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum, wie Lidocain, einschließen, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder getrennt oder miteinander vermischt in einer Dosierungseinheitsform geliefert, beispielsweise als trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie eine Ampulle oder ein Beutel, der die Menge des Wirkstoffes angibt. Wo die Zusammensetzung durch Infusion zu verabreichen ist, kann sie mit einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles Wasser oder Kochsalzlösung von pharmazeutischer Reinheit enthält. Wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung zur Injektion bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung vermischt werden können.
Die Therapeutika können als neutrale oder als Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet sind, wie diejenigen, die von Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure etc. stammen, diejenigen, die mit freien Amingruppen gebildet sind, wie diejenigen, die von Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc. abstammen, und diejenigen, die aus Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- und Eisen(III)-hydroxiden etc. stammen.
Die Menge des Therapeutikums, das bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardverfahren bestimmt werden. Zusätzlich können in vitro Assays gegebenenfalls eingesetzt werden, um die Identifizierung optimaler Dosierungsbereiche zu unterstützen. Die exakte in der Formulierung einzusetzende Dosis hängt auch von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Krankheit oder Störung ab und sollte gemäß der Beurteilung des praktischen Arztes und den jeweiligen Umständen des Patienten entschieden werden. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche zur intravenösen Verabreichung im Allgemeinen etwa 20-500 μm aktive Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche zur intranasalen Verabreichung sind im Allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Reaktionskurven, die aus in vitro oder Tiermodell-Testsystemen hergeleitet werden, extrapoliert werden.
Suppositorien enthalten im Allgemeinen Wirkstoff im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10 % bis 95 % Wirkstoff.
Die Erfindung beschreibt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Testsatz, der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen befüllt sind. Solchem(n) Behältern) beigefügt kann gegebenenfalls eine Notiz in der Form sein, die von einer Aufsichtsbehörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei die Notiz die Zulassung durch die Behörde bezüglich Herstellung, Verwendung oder Verkauf zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
Die Testsätze können auch Expressionsvektoren enthalten, die die essentiellen Komponenten der komplexen Maschinerie codieren, wobei die Komponenten nach Expression rekonstituiert werden können, um einen biologisch aktiven Komplex zu bilden. Ein solcher Testsatz kann auch die erforderlichen Puffer und Reagenzien enthalten. Gegebenenfalls können solchen Behältern) Anweisungen zur Verwendung des Testsatzes und/oder eine Notiz in der Form beigefügt sein, die von einer Aufsichtsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei die Notiz die Zulassung durch die Behörde bezüglich Herstellung, Verwendung oder Verkauf zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Behandlung, wobei eine wirksame Menge eines FADS2-wechselwirkenden Moleküls oder eines Inhibitors an ein Individuum verabreicht wird, das an einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, leidet.
Bezüglich dieses Verfahrens treffen sämtliche vorstehend zur Verwendung der Erfindung angegebenen Beschreibungen zu.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines Gamma-Sekretase-Modulators und/oder Beta-Sekretase-Modulators, umfassend die folgenden Schritte:

a) Identifizieren eines FADS2-wechselwirkenden Moleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Testverbindung ein FADS2-wechsewirkendes Molekül ist,
b) Bestimmen, ob das FADS2-wechselwirkende Molekül von Schritt a) in der Lage ist, die Gamma-Sekretase-Aktivität oder Beta-Sekretase-Aktivität zu modulieren.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt a) die Testverbindung mit FADS2 in Kontakt gebracht, und die Wechselwirkung von FADS2 mit der Testverbindung wird bestimmt. Vorzugsweise wird gemessen, ob das Kandidatenmolekül an FADS2 gebunden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise im Zusammenhang eines durchsatzstarken Assays durchgeführt. Solche Assays sind dem Fachmann bekannt.
Test- oder Kandidatenmoleküle, die zu screenen sind, können als Gemische einer begrenzten Anzahl von bestimmten Verbindungen oder als Verbindungsbibliotheken, Peptidbibliotheken und dergleichen bereitgestellt werden. Mittel/Moleküle, die zu screenen sind, können auch sämtliche Formen von Antiseren, Antisense-Nukleinsäuren etc. einschließen, die die komplexe Aktivität oder Bildung modulieren können. Beispielhafte Kandidatenmoleküle und -bibliotheken zum Screening sind nachstehend ausgeführt.
Das Screening der Bibliotheken kann auf eine Vielzahl von im Allgemeinen bekannten Verfahren erreicht werden. Siehe z. B. die folgenden Druckschriften, die das Screening von Peptid-Bibliotheken offenbaren: Parmley und Smith, 1989; Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386-390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg et al., 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76: 933-945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577-580; Bock et al., 1992; Nature 355: 564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850-852; US-Patentschrift Nr. 5,096,815 , US-Patentschrift Nr. 5,223,409 und US-Patentschrift Nr. 5,198,346 , alle von Ladner et al.; Rebar und Pabo, 1993, Science 263: 671-673; und internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/18318 .
Bei einer speziellen Ausführungsform kann das Screening durch Zusammenbringen der Bibliotheks-Elemente mit einem FADS2, das auf einer festen Phase immobilisiert ist, und Ernten derjenigen Bibliothekselemente, die an das Protein binden (oder Nukleinsäure oder Derivate codieren) durchgeführt werden. Beispiele für solche Screeningverfahren, die als "Panning"-Techniken bezeichnet werden, sind bei Parmley und Smith, 1988, Gene 73: 305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/18318 und in den dort zitierten Druckschriften beispielhaft beschrieben.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden FADS2-Fragmente und/oder Analoge, insbesondere Peptidomimetika, auf Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Bildung eines Komplexes von FADS2 mit anderen Proteinen, z. B. den in Tabelle 1 angegebenen Proteinen (Menge an Komplex oder Zusammensetzung von Komplex), oder auf die FADS2-Aktivität in der Zelle, die dadurch die Komplexaktivität oder -bildung in der Zelle hemmt, gescreent.
Bei einer Ausführungsform können Mittel, die die FADS2-Aktivität oder die FADS2-Proteinkomplexbildung modulieren (d. h. antagonisieren oder agonisieren), auf die Verwendung eines Bindungshemmtestes gescreent werden, wobei Mittel auf ihre Fähigkeit gescreent werden, die Bildung eines Komplexes unter wässrigen oder physiologischen bindenden Bedingungen zu modulieren, wobei die Komplexbildung in Abwesenheit des zu testenden Mittels eintritt. Mittel, die in die Bildung von erfindungsgemäßen Komplexen eingreifen, werden als Antagonisten der Komplexbildung identifiziert. Mittel, die die Bildung von Komplexen beschleunigen, werden als Agonisten der Komplexbildung identifiziert. Mittel, die die Bildung von Komplexen vollständig blockieren, werden als Inhibitoren der Komplexbildung identifiziert.
Verfahren zum Screening können das Markieren der Komponentenproteine des Komplexes mit Radioliganden (z. B. ¹²⁵I oder ³H), magnetischen Liganden (paramagnetische Kügelchen, die kovalent an Photobiotinacetat gebunden sind), Fluoreszenzliganden (z. B. Fluorescein oder Rhodamin) oder Enzymliganden (z. B. Luciferase oder β-Galactosidase) umfassen. Die Recktanten, die in Lösung binden, können anschließend durch eine von vielen auf dem Fachgebiet bekannten Techniken isoliert werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Co-Immunpräzipitation der markierten Komplexeinheit unter Verwendung von Antiseren gegen den unmarkierten Bindungspartner (oder den markierten Bindungspartner mit einem unterscheidbaren Marker von demjenigen, der auf der zweiten markierten Komplexeinheit verwendet wird), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie und Gradientendichtezentrifugation. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der markierte Bindungspartner ein kleines Fragment oder Peptidomimetikum, das nicht durch ein im Handel erhältliches Filter zurückgehalten wird. Nach dem Binden ist die markierte Spezies anschließend nicht in der Lage, das Filter zu passieren, was einen einfachen Test der Komplexbildung bereitstellt.
Verfahren, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind, werden zur Markierung von mindestens einer der Komponentenelemente des Komplexes verwendet. Geeignete Markierungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, radioaktives Markieren durch Einbau von radioaktiv markierten Aminosäuren, z. B. ³H-Leucin oder ³⁵S-Methionin, radioaktives Markieren durch posttranslationale Iodierung mit ¹²⁵I oder ¹³¹I unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens, der Bolton-Hunter-Reagenzien etc. oder Markieren mit 321) unter Verwendung von Phosphorylase und anorganischem radioaktiv markierten Phosphor, Biotin-Markierung mit Photobiotinacetat und Sonnenlampen-Exposition etc. In den Fällen, wo eines der Elemente des Komplexes immobilisiert wird, z. B. wie vorstehend beschrieben, wird die freie Spezies markiert. Wo keine der wechselwirkenden Spezies immobilisiert ist, kann jede mit einem unterscheidbaren Marker derart markiert werden, dass die Isolierung beider Einheiten verfolgt werden kann, um eine exaktere Quantifizierung zu liefern und um die Bildung von homomeren aus heteromeren Komplexen zu unterscheiden. Verfahren, die akzessorische Proteine verwenden, die an einen der modifizierten Interaktanten binden, um die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern, die Stabilität des Komplexes zu erhöhen etc. sind bereitgestellt.
Typische Bindungsbedingungen sind beispielsweise in einer wässrigen Salzlösung von 10-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris-HCl, pH 5-8 und 0,5 % Triton X-100 oder ein anderes Detergens, das die Spezifität der Wechselwirkung verbessert, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Metallchelatbildner und/oder zweiwertige Kationen können zur Verbesserung des Bindens und/oder zur Herabsetzung der Proteolyse zugesetzt werden. Reaktionstemperaturen können 4, 10, 15, 22, 25, 35 oder 42 Grad Celsius einschließen, und die Inkubationsdauer beträgt typischerweise mindestens 15 Sekunden, jedoch sind längere Zeiten bevorzugt, um den Eintritt des Bindungsgleichgewichtes zu ermöglichen. Bestimmte Komplexe können unter Verwendung von routinemäßigen Proteinbindungsassays getestet werden, um die optimalen Bindungsbedingungen zum reproduzierbaren Binden zu bestimmen.
Die physikalischen Parameter der Komplexbildung können durch Quantifizierung von Komplexbildung unter Verwendung von Assayverfahren, die für die verwendete Markierung spezifisch sind, z. B. Flüssigkeitszintillationszählung für radioaktiven Nachweis, Enzymaktivität für Enzym-markierte Einheiten etc., analysiert werden. Die Reaktionsergebnisse werden anschließend unter Verwendung der Scatchard-Analyse, Hill-Analyse und anderer Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Proteins, Structures, and Molecular Principles, 2. Ausg. (1993), Creighton, Hrsg., W.H. Freeman and Company, New York) ausgewertet.
Bei einem zweiten allgemeinen Ansatz für Bindungsassays wird eine der bindenden Spezies auf einem Filter, in einer Mikrotiterplattenmulde, in einem Teströhrchen auf einer chromatographischen Matrix etc. entweder kovalent oder nicht kovalent immobilisiert. Die Proteine können unter Verwendung jedes Verfahrens, das auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, kovalent immobilisiert werden, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, das Verfahren von Kadonaga und Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889-5893, d. h. Verknüpfung mit einem Cyanogenbromid-derivatisierten Substrat, wie CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Sofern benötigt, kann die Verwendung von Spacern die sterische Hinderung durch das Substrat herabsetzen. Nicht kovalentes Binden von Proteinen an ein Substrat umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Verknüpfung eines Proteins mit einer geladenen Oberfläche, Binden mit spezifischen Antikörpern, Binden an ein drittes, damit nicht verwandtes wechselwirkendes Protein etc.
Assays für Mittel (einschließlich Zellextrakte oder ein Bibliothek-Pool) zur Konkurrenz um die Bindung von einem Element eines Komplexes (oder von Derivaten davon) mit einem anderen Element des Komplexes, der mit einem beliebigen Mittel (z. B. diejenigen Mittel, die vorstehend beschrieben sind) markiert ist, werden zum Screening auf Kompetitoren oder Verstärker der Komplexbildung bereitgestellt.
Bei speziellen Ausführungsformen sind Blockierungsmittel zur Hemmung des nichtspezifischen Bindens von Reagenzien an andere Proteinkomponenten oder des absorptiven Verlustes von Reagenzien an Kunststoffe, Immobilisierungsmatrizen etc. in dem Assay-Gemisch eingeschlossen. Die Blockierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Rinderserumalbumin, Casein, getrocknete fettfreie Milch, Denhardt's Reagenz, Ficoll, Polyvinylpyrrolidin, nichtionische Detergentien (NP40, Triton X-100, Tween 20, Tween 80 etc.) ionische Detergentien (z. B. SDS, LDS etc.), Polyethylenglycol etc. Geeignete Blockierungsmittelkonzentrationen gestatten die Komplexbildung.
Nach Durchführung des Bindens wird ungebundenes markiertes Protein im Überstand entfernt, und das immobilisierte Protein, das gebundenes markiertes Protein zurückhält, wird ausgiebig gewaschen. Die Menge an gebundener Markierung wird anschließend unter Verwendung von Standardverfahren auf dem Fachgebiet zum Nachweis der Markierung, wie beschrieben, supra, quantifiziert.
Bei anderen speziellen Ausführungsformen kann das Screening auf Modulatoren der Proteinkomplexe/Protein, wie hier bereitgestellt, durch Verknüpfen von diesen und/oder der Antikörper, wie hier bereitgestellt, an einen festen Träger durchgeführt werden.
Die Präparation eines solchen Arrays, das verschiedene Typen von Proteinen, einschließlich Antikörpern, enthält, ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und einem Fachmann klar (siehe z. B. Ekins et al., 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7: 155-168; Mitchell et al. 2002, Nature Biotechnol. 20: 225-229; Petricoin et al., 2002, Lancet 359: 572-577; Templin et al., 2001, Trends Biotechnol. 20: 160-166; Wilson und Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 81-85; Lee et al., 2002, Science 295: 1702-1705; MacBeath und Schreiber, 2000, Science 289: 1760; Blawas und Reichert, 1998, Biomaterials 19: 595; Kane et al., 1999, Biomaterials 20: 2363; Chen et al., 1997, Science 276: 1425; Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 309-314; Mahler et al., 1997, Immunotechnology 3: 31-43; Roberts et al., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268-273; Nord et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 772-777; Nord et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268: 4269-4277; Brody und Gold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5-13; Karlstroem und Nygren, 2001, Anal. Biochem. 295: 22-30; Nelson et al., 2000, Electrophoresis 21: 1155-1163; Honore et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3: 265-274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2: 145-152; Figeys und Pinto, 2001, Electrophoresis 2: 208-216 und Druckschriften in den hier aufgelisteten Veröffentlichungen).
Komplexe können durch verschiedene Mittel, wie es einem Fachmann bekannt ist, an ein Array gebunden sein. Komplexe können beispielsweise über einen TAP-Marker (wie in WO/0009716 und in Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 10: 1030-1032 beschrieben) nach dem Reinigungsschritt oder durch ein anderes geeignetes Reinigungsschema, wie es dem Fachmann klar ist, an das Array addiert werden.
Gegebenenfalls können die Proteine des Komplexes vernetzt werden, um die Stabilität des Komplexes zu verstärken. Verschiedene Verfahren zum Vernetzen von Proteinen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Reaktive Endgruppen von Vernetzungsmitteln umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, -COOH, -SH, -NH₂ oder N-Oxysuccinamat.
Der Spacer des Vernetzungsmittels sollte bezüglich der Größe des zu vernetzenden Komplexes gewählt werden. Für kleine Proteinkomplexe, die nur einige Proteine umfassen, sind relativ kurze Spacer bevorzugt, um die Wahrscheinlichkeit des Vernetzens separater Komplexe in dem Reaktionsgemisch herabzusetzen. Für größere Proteinkomplexe ist die zusätzliche Verwendung längerer Spacer bevorzugt, um das Vernetzen zwischen Proteinen innerhalb des Komplexes zu erleichtern.
Es ist bevorzugt, die Erfolgsrate des Vernetzens vor Verknüpfen des Komplexes mit dem Träger zu überprüfen.
Wie es einem Fachmann bekannt ist, muss die optimale Vernetzungsrate von Fall zu Fall bestimmt werden. Dies kann durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren erreicht werden, wovon einige nachstehend beispielhaft beschrieben sind.
Eine ausreichende Vernetzungsrate kann z. B. durch Analyse des vernetzten Komplexes vs. einen nicht-vernetzten Komplex auf einem denaturierenden Proteingel überprüft werden.
Wurde das Vernetzen erfolgreich durchgeführt, wird erwartet, dass die Proteine des Komplexes in der gleichen Spur festgestellt werden, wohingegen die Proteine des nicht-vernetzten Komplexes erwartungsgemäß je nach ihren individuellen Merkmalen getrennt sind. Gegebenenfalls kann die Gegenwart von sämtlichen Proteinen des Komplexes weiter durch Peptidsequenzieren von Proteinen in den jeweiligen Banden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren, wie Massenspektrometrie und/oder Edman-Abbau, weiter überprüft werden.
Zusätzlich sollte eine Vernetzungsrate, die zu hoch ist, vermieden werden. Wenn die Vernetzung zu intensiv durchgeführt wurde, liegt eine zunehmende Menge von Vernetzung des individuellen Proteinkomplexes vor, was potentiell mit einem Screening auf potentielle Bindungspartner und/oder Modulatoren etc. unter Verwendung der Arrays interferiert.
Die Gegenwart solcher Strukturen kann durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren bestimmt werden und umfasst z. B. Gelfiltrationsexperimente, die die Gelfiltrationsprofillösungen, die vernetzte Komplexe vs. nicht vernetzte Komplexe enthalten, vergleichen.
Gegebenenfalls können funktionelle Assays, wie es einem Fachmann klar ist, wovon einige hier beispielhaft bereitgestellt sind, zur Überprüfung der Integrität des Komplexes durchgeführt werden.
Alternativ können die Proteine oder das Protein als ein einzelnes Fusionsprotein exprimiert und an die Matrix gekoppelt werden, wie es einem Fachmann klar ist.
Gegebenenfalls kann das Anknüpfen des Komplexes oder der Proteine oder des Antikörpers, wie vorstehend ausgeführt, weiterhin durch verschiedene Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, aufgezeichnet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Oberflächenplasmonresonanz (siehe beispielsweise McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 572-577; Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19: 217-222; Weinberger et al., 2000, 1: 395-416; Pearson et al., 2000, Ann. Clin. Biochem. 37: 119-145; Vely et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 313-321; Slepak, 2000, J. Mol. Recognit. 13: 20-26.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der Produktion von Abeta-40- und Abeta-42-Peptiden durch ELISA geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Vassar R. et al., 1999, Science, 286: 735-41 beschrieben sind.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der Produktion von C-terminalen APP-Fragmenten in Zelllinien oder transgenen Tieren durch Western Blot geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Yan R. et al., 1999, Nature, 402: 533-7 beschrieben sind.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der proteolytischen Aktivität von Beta- oder Gamma-Sekretasen gegenüber bakteriell exprimierten APP-Fragmenten in vitro (z. B. durch Modifizieren der Expression von einem oder mehreren wechselwirkenden Proteinen in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das (die) wechselwirkende(n) Protein(e) codieren) des Presenilin-2-Komplexes, Nicastrin-Komplexes, BACE1-Komplexes, PTK7-Komplexes geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen die bei Tian G. et al. 2002, J. Biol. Chem., 277: 31499-505 beschrieben sind.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der Transaktivierung eines Gal-4-angetriebenen Reportergens (z. B. durch Modifizieren der Expression von einem oder mehreren wechselwirkenden Proteinen in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das (die) wechselwirkende(n) Protein(e) codieren) des Presenilin-2-Komplexes, des Nicastrin-Komplexes, des PTK7-Komplexes, des BACE1-Komplexes geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf diejenigen, die bei Cao X. et al., 2001, Science, 293: 115-20 beschrieben sind.
Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Molekül kann auf seine Fähigkeit getestet werden, ein erfindungsgemäßes wechselwirkendes Molekül oder ein erfindungsgemäßer Inhibitor zu sein. Kandidatenmoleküle können einer Zelle, die die FADS2-Komplexmaschinerie exprimiert, direkt bereitgestellt werden, oder sie können, im Falle von Kandidatenproteinen, durch Bereitstellen ihrer codierenden Nukleinsäuren unter Bedingungen, wobei die Nukleinsäuren rekombinant exprimiert werden, um das Kandidatenprotein zu produzieren, bereitgestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zum Screening chemischer Bibliotheken auf Moleküle, die die Menge an, Aktivität von oder Proteinkomponentenzusammensetzung des Komplexes modulieren, z. B. hemmen, antagonisieren oder agonisieren, gut geeignet. Die chemischen Bibliotheken können Peptidbibliotheken, peptidomimetische Bibliotheken, chemisch synthetisierte Bibliotheken, rekombinante, z. B. Phage-Display-Bibliotheken und in vitro Translations-basierende Bibliotheken, andere synthetische, nicht-peptidische, organische Bibliotheken etc. sein.
Beispielhafte Bibliotheken sind aus mehreren Quellen (ArQule, Tripos/PanLabs, ChemDesign, Pharmacopoeia) erhältlich. In einigen Fällen werden diese chemischen Bibliotheken unter Verwendung kombinatorischer Strategien generiert, die die Identität eines jeden Mitglieds der Bibliothek auf einem Substrat codieren, an welches die Mitgliedsverbindung gebunden ist, wodurch somit die direkte und unmittelbare Identifizierung eines Moleküls, das ein wirksamer Modulator ist, erlaubt ist. Somit legt, bei vielen kombinatorischen Ansätzen, die Position einer Verbindung auf einer Platte die Zusammensetzung der Verbindung fest. Bei einem Beispiel kann eine Einzelplattenposition auch 1-20 Chemikalien aufweisen, die durch Verabreichung an eine Mulde, die die Wechselwirkungen von Interesse enthält, gescreent werden. Wenn somit die Modulation nachgewiesen wird, können zunehmend kleinere Pools von Wechselwirkungspaaren auf die modulatorische Aktivität getestet werden. Durch solche Verfahren können viele Kandidatenmoleküle gescreent werden.
Viele verschiedene Bibliotheken, die zur Verwendung auf dem Fachgebiet bekannt sind, können zur Bereitstellung von erfindungsgemäß zu testenden Verbindungen eingesetzt werden. Alternativ können die Bibliotheken unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert werden. Chemische (synthetische) Bibliotheken, rekombinante Expressionsbibliotheken oder Bibliotheken auf Polysomen-Basis sind beispielhafte Typen von Bibliotheken, die eingesetzt werden können.
Die Bibliotheken können Einschränkungen unterliegen oder semirigide (mit einer gewissen Strukturrigidität) oder linear oder nicht eingeschränkt sein. Die Bibliothek kann eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Expressionsbibliothek, eine statistische Peptid-Expressionsbibliothek oder eine chemisch synthetisierte statistische Peptidbibliothek oder eine nicht-peptidische Bibliothek sein. Die Expressionsbibliotheken werden in die Zellen eingebracht, in denen der Assay erfolgt, wo die Nukleinsäuren der Bibliothek exprimiert werden, um ihre codierten Proteine zu produzieren.
Bei einer Ausführungsform können die Peptidbibliotheken, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Bibliotheken sein, die in vitro chemisch synthetisiert werden. Beispiele für solche Bibliotheken sind bei Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86 angegeben, der Gemische von freien Hexapeptiden beschreibt, in denen die ersten und zweiten Reste in jedem Peptid individuell und spezifisch definiert wurden; Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84, der einen "Einbead-, Einpeptid"-Ansatz beschreibt, wobei ein Festphasen-Abspaltsyntheseschema eine Bibliothek von Peptiden erzeugte, wobei jede Perle in der Sammlung an sie immobilisiert eine einzige statistische Sequenz von Aminosäureresten aufwies; Medynski, 1994; Bio/Technology 12: 709-710, der Abspaltsynthese- und T-Bag-Syntheseverfahren beschreibt; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233-1251. Einfach an Hand von anderen Beispielen kann eine kombinatorische Bibliothek zur Verwendung nach den Verfahren von Ohlmeyer et al., 1993; Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618; oder Salmon et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712 hergestellt werden. Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/20242 und Brenner und Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383 beschreiben "codierte kombinatorische chemische Bibliotheken", die für jedes chemische polymere Bibliothekmitglied Oligonukleotid-Identifikatoren enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die gescreente Bibliothek eine biologische Expressionsbibliothek, die eine statistische Peptid-Phage-Display-Bibliothek ist, wobei die statistischen Peptide Einschränkungen unterliegen (z. B. aufgrund des Vorliegens von Disulfid-Bindung).
Außerdem können auch allgemeinere, strukturell eingeschränkte, verschiedenartige (z. B. nicht-peptidische) organische Bibliotheken verwendet werden. Beispielsweise kann eine Benzodiazepin-Bibliothek (siehe z. B. Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712) verwendet werden.
Konformationell eingeschränkte Bibliotheken, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die invariante Cysteinreste enthalten, die in einer oxidierenden Umgebung durch Disulfid-Bindungen unter Bildung von Cystinen, modifizierten Peptiden (z. B. unter Einschluss von Fluor, Metallen, Isotopenmarkem, phosphoryliert etc.) vernetzen, Peptide, die eine oder mehrere nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, nicht-peptidische Strukturen und Peptide enthalten, die eine nenneswerte Carboxyglutaminsäurefraktion enthalten.
Bibliotheken von Nicht-Peptiden, z. B. Peptidderivate (beispielsweise die eine oder mehrere nicht-natürlich vorkommende Aminosäure enthalten) können ebenfalls verwendet werden. Ein Beispiel für diese sind Peptoidbibliotheken (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371). Peptoide sind Polymere von nicht-natürlichen Aminosäuren, die natürlich vorkommende, nicht an den α-Kohlenstoff, allerdings an dem Hauptketten-Aminostickstoff gebundene Seitenketten aufweisen. Da Peptoide durch menschliche Verdauungsenzyme nicht leicht abgebaut werden, werden sie zweckmäßigerweise leichter einer Arzneimittelanwendung anpassbar. Ein weiteres Beispiel einer Bibliothek, die eingesetzt werden kann, wobei die Amid-Funktionalitäten in den Peptiden permethyliert wurden, um eine chemisch transformierte kombinatorische Bibliothek zu erzeugen, ist bei Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11138-11142) beschrieben.
Die Mitglieder der Peptidbibliotheken, die erfindungsgemäß gescreent werden können, sind nicht darauf beschränkt, die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren zu enthalten. Insbesondere gestatten chemisch synthetisierte Bibliotheken und Bibliotheken auf Polysom-Basis die Verwendung von Aminosäuren, zusätzlich zu den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (durch ihren Einschluss in den Vorläufer-Pool von Aminosäuren, der bei der Bibliotheksherstellung verwendet wird). Bei speziellen Ausführungsformen enthalten die Bibliothekmitglieder eine oder mehrere nicht-natürliche oder nicht-klassische Aminosäuren oder zyklische Peptide. Nicht-klassische Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die D-Isomere der üblichen Aminosäuren, Aminoisobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, Abu, 2-Aminobuttersäure; -Abu, -Ahx, 6-Aminohexansäure; Aib, 2-Aminoisobuttersäure; 3-Aminopropionsäure; Ornithin; Norleucin; Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren, wie β-Methylaminosäuren, C-Methylaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Fluoraminosäuren und Aminosäureanaloge im Allgemeinen. Außerdem kann die Aminosäure D (rechtsdrehend) oder L (linksdrehend) sein.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden Fragmente und/oder Analoge von erfindungsgemäßen Komplexen oder Proteinkomponenten davon, insbesondere Peptidomimetika, auf die Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Komplexaktivität oder -bildung gescreent.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die kombinatorische Chemie verwendet werden, um Modulatoren für die Komplexe zu identifizieren. Die kombinatorische Chemie ist in der Lage, Bibliotheken zu erzeugen, die hunderttausende von Verbindungen enthalten, wovon viele strukturell ähnlich sein können. Obgleich durchsatzstarke Screeningprogramme in der Lage sind, diese riesigen Bibliotheken auf Affinität gegenüber bekannten Zielen zu screenen, wurden neue Ansätze entwickelt, die Bibliotheken kleinerer Dimension erzielen, die allerdings eine maximale chemische Verschiedenheit bereitstellen (siehe z. B. Matter, 1997, J. Med. Chem. 40: 1219-1229).
Ein Verfahren der kombinatorischen Chemie, das Affinity Fingerprinting, wurde unlängst zum Testen einer diskreten Bibliothek kleiner Moleküle auf die Bindungsaffinitäten gegenüber einem definierten Panel von Proteinen verwendet. Die durch das Screening erhaltenen Fingerprints werden zur Vorhersage der Affinität der einzelnen Bibliothekselemente für andere Proteine oder Rezeptoren von Interesse (bei der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe und Proteinkomponenten davon) verwendet. Die Fingerprints werden mit Fingerprints verglichen, die von anderen Verbindungen erhalten wurden, die bekanntlich mit dem Protein von Interesse reagieren, um vorherzusagen, ob die Bibliotheksverbindung ähnlich reagieren könnte. Beispielsweise könnten, statt Testung jedes Liganden in einer großen Bibliothek auf Wechselwirkung mit einer Komplex- oder Proteinkomponente, nur diejenigen Liganden mit einem Fingerprint entsprechend anderen Verbindungen, die bekanntlich Aktivität aufweisen, getestet werden. (Siehe beispielsweise Kauvar et al., 1995, Chem. Biol. 2: 107-118; Kauvar, 1995, Affinity Fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International. 8: 25-28; und Kauvar, Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunosassay, Kurtz, Stanker und Skerritt (Hrsg., 1995, ADAC: Washington, D.C., 305-312).
Kay et al. (1993, Gene 128: 59-65) offenbaren ein Verfahren zur Konstruktion von Peptidbibliotheken, die Peptide von vollkommen regelloser Sequenz codieren, die länger sind als diejenigen jeder früheren herkömmlichen Bibliothek. Die bei Kay et al. offenbarten Bibliotheken codierenden vollynthetische regellose Peptide von mehr als etwa 20 Aminosäuren Länge. Solche Bibliotheken können zweckmäßigerweise zur Identifizierung komplexer Modulatoren gescreent werden. (Siehe auch US-Patentschrift Nr. 5,498,538 vom 12. März, 1996; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/18318 vom 18. August 1994).
Eine umfassende Übersicht über die verschiedenen Typen von Peptidbibliotheken kann bei Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233-1251 eingesehen werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform führt die Wechselwirkung der Testverbindung mit FADS2 zu einer Hemmung der FADS2-Aktivität.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase zur Abspaltung von APP gemessen. Diese kann wie vorstehend angegeben gemessen werden.
Weiterhin beschreibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Identifizieren eines Gamma-Sekretase-Modulator und/oder Beta-Sekretase-Modulators durch das erfindungsgemäße Verfahren, und
b) Formulieren des Gamma-Sekretase-Modulators zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

Bezüglich der pharmazeutischen Zusammensetzungen treffen hier auch sämtliche Beschreibungen, wie vorstehend angegeben, zu.
FIGUREN
1: Schematische Darstellung von FADS2-enthaltenden Proteinkomplexen. FADS2 ist eine Komponente der BACE1-, Nicastrin-, und PTK7-Proteinkomplexe.
TAP-markierte BACE1, Nicastrin und PTK7 wurden retroviral in SKNBE2-Neuroblastomzellen transduziert, und die jeweiligen Proteinkomplexe wurden anschließend durch Tandem-Affinitätsreinigung erhalten. Die assoziierten Proteine wurden durch Flüssigkeitschromatographie-MS/MS identifiziert.
2: FADS2 wird im menschlichen Gehirn stark exprimiert.
FADS2-spezifische Primer und gleiche Mengen an Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von FADS2 durch quantitative PCR eingesetzt. 3 unabhängige Experimente wurden durchgefüht, und sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Universal Human Reference RNA, Stratagene, Nr. 740000) normalisiert.
3A+B: Der siRNA-vermittelte Knock-down der FADS2-Expression schwächt die Sekretion von Aβ1-42 aus zwei verschiedenen Zelllinien ab.
(obere Schaubilder) siRNAs, die gegen BACE1, FADS2 (A und B) oder Luc3 gerichtet waren, wurden in SKNBE2-Neuroblastomzellen (3A) oder in H4-Neurogliomzellen transfiziert (3B), die mutantes APPsw überexprimieren. 48 h nach der Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, und die Niveaus von Aβ1-42 durch ELISA (Innogenetics) bestimmt. Mindestens 3 unabhängige Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt.
(untere Schaubilder) siRNAs, die gegen FADS2 (A + B) oder gegen Luc3 gerichtet waren, wurden mit CTAP-FADS2 in SKNBE2-Neuroblastomzellen (3A) oder in H4-Neurogliomzellen (3B) cotransfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert. 30 μg der Lysate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose transfereiert und mit Antikörpern sondiert, die entweder gegen den TAP-Marker oder gegen Tubulin gerichtet waren.
4: SCD4 wird im menschlichen Gehirn sehr stark exprimiert.
5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen (Klontech) wurden revers transkribiert. Gleiche Mengen dieser cDNA und von SCD4-spezifischen Primern wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von SCD4 durch quantitative PCR verwendet. 3 unabhängige Experimente wurden durchgeführt, und sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normalisiert.
5: Der siRNA-vermittelte Knock-down der SCD4-Expression schwächt die Sekretion von Aβ1-42 ab.
(linkes Schaubild) siRNAs, die gegen BACE1, SCD4 oder Luc3 gerichtet waren, wurden in H4-Neurogliomzellen transfiziert, die mutantes APPsw überexprimieren. 48 h nach der Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt und die Niveaus von Aβ1-42 durch ELISA (Innogenetics) bestimmt. Mindestens 3 unabhängige Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt.
(rechtes Schaubild) siRNA, die gegen SCD4 gerichtet ist, reduziert die mRNA-Spiegel spezifisch. Gesamt-RNA wurde aus H4/APPsw-Zellen hergestellt, die mit siRNA transfiziert wurden, die entweder gegen Luc3 oder SCD4 gerichtet war. Nach reverser Transkription wurden die relativen Mengen an SCD4-Transkripten durch quantitative PCR bestimmt. Mindestens 2 unabhängige Experimente wurden durchgeführt.
6: DEGS wird im menschlichen Gehirn stark exprimiert.
5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen Gewebequellen (Klontech) wurden revers transkribiert. Gleiche Mengen dieser cDNA und von DEGS-spezifischen Primern wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von DEGS durch quantitative PCR verwendet. 3 unabhängige Experimente wurden durchgeführt, und sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normalisiert.
7: Der siRNA-vermittelte Knock-down der DEGS-Expression schwächt die Sekretion von Aβ1-42 ab.
(linkes Schaubild) Die siRNAs, die gegen BACE1, DEGS oder Luc3 gerichtet waren, wurden in H4-Neurogliomzellen transfiziert, die mutantes APPsw überexprimieren. 48 h nach der Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt und die Niveaus von Aβ1-42 durch ELISA (Innogenetics) bestimmt. Mindestens 3 unabhängige Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt.
(rechtes Schaubild) siRNA, die gegen DEGS gerichtet war, reduziert spezifisch die mRNA-Niveaus. Gesamt-RNA wurde aus H4/APPsw-Zellen hergestellt, die mit siRNA transfiziert waren, die entweder gegen Luc3 oder DEGS gerichtet war. Nach reverser Transkription wurden die relativen Mengen an DEGS-Transkripten durch quantitative PCR bestimmt. Mindestens 2 unabhängige Experimente wurden durchgeführt.
BEISPIELE:
Die folgenden Beispiele betreffen sämtliche Ausführungsformen der Erfindung und insbesondere die Ausführungsformen, wie sie in den Patentansprüchen dargelegt sind.
Die TAP-Technologie, die in EP 1 105 508 B1 bzw. in Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 17:1030-1032 vollständiger beschrieben ist, wurde, wie nachstehend für die Proteinreinigung beschrieben, verwendet und weiter angepasst.
BEISPIEL 1: Konstruktion eines TAP-markierten Fängers
Die cDNAs, die den vollständigen ORF codieren, wurden durch RT-PCR erhalten. Die Gesamt-RNA wurde aus geeigneten Zelllinien unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (Qiagen) hergestellt. Sowohl die cDNA-Synthese als auch die PCR wurden mit dem SUPERSCRIPT One-Steg RT-PCR Kit für lange Matrizen (Life Technologies), unter Verwendung von genspezifischen Primern, durchgeführt. Nach 35-40 Amplifikationszyklen wurden PCR-Produkte mit der erwarteten Größe mit dem MinElute PCR-Reinigungskit (Qiagen) Gel-gereinigt und, wenn nötig, für die weitere Amplifikation verwendet. Niedrig abundante RNAs wurden vor der Gelreinigung durch geschachtelte PCR amplifiziert. Die Restriktionsstellen für NotI wurden an PCR-Primer angeheftet, um eine SubKlonierung der amplifizierten cDNAs in die retroviralen Vektoren pIE94-N/C-TAP zu gewährleisten, und dadurch N- oder C-terminale Fusionen mit der TAP-Markierung zu erzeugen (Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 17:1030-1032). Die N-terminale Markierung wurde für die folgenden Lockstoffe/Eintrittspunkte ausgewählt: Präsenilin 1, Präsenilin 2, Aph-1a, Aph-1b, Pen-2, APP, Tau, Fe65, Calsenilin. Die C-terminale Markierung wurde für die folgenden Lockstoffe/Eintrittspunkte ausgewählt: Nicastrin, Aph-1a, Aph-1b, BACE1 D215N, APP, APP695SW, APP-C99, Fe65, X11beta.
Die Klone wurden durch Restriktionsspaltung, DNA-Sequenzierung und durch in vitro Translation unter Verwendung des TNT T7 Quick Coupled Transkription/Translation-Systems (Promega inc.) analysiert. Die Gegenwart der Proteine wurde durch Western Blot-Verfahren unter Verwendung des Protein A-Teils der TAP-Markierung zum Nachweis bestätigt. Kurz gesagt, folgte der Trennung der Proteine durch Standard-SDS-PAGE der halbtrockene Transfer auf eine Nitrocellulose-Membran (PROTRAN, Schleicher&Schuell), unter Verwendung der MulitiphorII Blotting-Vorrichtung von Pharmacia Biotech. Der Transferpuffer bestand aus 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 10 % Methanol und 0,0375 % Natrium-Dodecylsulfat. Nach der Blockierung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), angereichert mit 10 % Trockenmilchpulver und 0,1 % Tween 20, wurden die transferierten Proteine mit dem löslichen Peroxidase-Anti-Peroxidase Komplex (Sigma), der in Blocking-Lösung gelöst war, sondiert. Nach intensivem Waschen wurden die immunreaktiven Proteine durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL; Amersham Pharmacia Biotech) sichtbar gemacht.
BEISPIEL 2: Virus-Herstellung und Infektion
Als Vektor wurde ein MoMLV-basiertes rekombinantes Virus verwendet.
Die Herstellung wurde wie folgt durchgeführt:
1. Virus-Herstellung
293 GP-Zellen wurden auf 100 % Konfluenz gezüchtet. Sie wurden 1:5 auf Poly-L-Lysin-Platten (1:5 verdünntes Poly-L-Lysin [0,01 % Stammlösung, Sigma P-4832] in PBS, das mindestens 10 min auf den Platten gelassen wurde) gespalten. Am 2. Tag wurden 63 Mikrogramm retroviraler Vektor-DNA, zusammen mit 13 Mikrogramm DNA eines Plasmids, das eine geeignetes Hüllprotein codiert, in 293 GP-Zellen transfiziert (Somia et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12667-12672; Somia et al., 2000, J. Virol. 74:4420-4424). Am 3. Tag wurde das Medium durch 15 ml DMEM + 10 % FBS pro 15-cm-Platte ersetzt. Am 4. Tag wurde das Medium, das Viren enthielt (Überstand), geerntet (24 Stunden nach dem Austausch des Mediums nach der Transfektion). Wenn ein zweites Sammeln geplant war, wurde den Platten 10 % DMEM FBS zugesetzt, und die Platten wurden weitere 24 Stunden inkubiert. Jedes Sammeln wurde wie folgt durchgeführt: Der Überstand wurde über 0,45-Mikrometer-Filter (Corning GmbH, Cellulose-Acetat, 431155) filtriert. Das Filter wurde in konischen, polyallomeren Zentrifugenröhren (Beckman, 358126) platziert, die in die Becher eines SW 28-Rotors (Beckman) verbracht wurden. Der filtrierte Überstand wurde bei 19400 U/min 2 Stunden bei 21 Grad Celsius in dem SW 28-Rotor ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Viren enthaltende Pellet wurde durch 100maliges Auf-und-Ab-Pipettieren unter Verwendung einer Aerosol-beständigen Spitze in einem kleinen Volumen (zum Beispiel 300 Mikrolitern) Hanks gepufferter Salzlösung [Gibco BRL, 14025-092] resuspendiert. Die Viren wurden wie nachstehend beschrieben für die Transfektion verwendet.
2. Infektion
Zellen, welche infiziert waren, wurden einen Tag vorher in eine Mulde einer Platte mit 6 Mulden ausgestrichen. 4 Stunden vor der Infektion wurde das alte Medium auf den Zellen durch frisches Medium ersetzt. Nur ein minimales Volumen wurde zugesetzt, so dass die Zellen vollständig bedeckt sind (z.B. 700 Mikroliter). Während der Injektion teilten sich die Zellen aktiv.
Eine Beschreibung der Zellen und ihrer Wachstumsbedingungen ist im Folgenden bereit gestellt ("3. Zelllinien").
Dem Virus-Konzentrat wurde Polybren (Hexadimethrin-Bromid; Sigma, H 9268) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 8 Mikrogramm/ml zu erreichen (dies ist 2,4 Mikrolitern der Polybren-Stammlösung von 1 Milligramm/ml pro 300 Mikroliter konzentriertem Retrovirus äquivalent). Das Virus wurde 1 Stunde in Polybren bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Infektion wurde das Virus/Polybren-Gemisch den Zellen zugesetzt und mehrere Stunden (z.B. tagsüber oder über Nacht) bei 37 Grad Celsius bei geeigneter CO₂-Konzentration inkubiert. Nach der Infektion wurde das Medium auf den infizierten Zellen durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden wie üblich überimpft, nachdem sie konfluent wurden. Die Zellen enthalten das Retrovirus in ihre Chromosomen integriert und exprimieren das Gen von Interesse stabil.
3. Zelllinien
Für die Expression wurden SKN-BE2-Zellen verwendet. SKN-BE2-Zellen (American Type Culture Collection-Nr. CRL-2271) wurden in 95 % OptiMEM + 5 % mit Eisen angereichertem Kälberserum gezüchtet.
Das Expressionsmuster der TAP-markierten Proteine wurde durch Immunoblot-Analyse, wie in Beispiel 3, Nr. 3 beschrieben, und/oder durch Immunfluoreszenz, wie in Beispiel 3, Nr. 1 oder 2 beschrieben, überprüft.
BEISPIEL 3: Überprüfung des Expressionsmusters von TAP-markierten Proteinen
Das Expressionsmuster des TAP-markierten Proteins wurde durch Immunoblot-Analyse und/oder durch Immunfluoreszenz überprüft. Die Immunfluoreszenzanalyse wurde entweder gemäß Nr. 1, oder Nr. 2, je nach Typ des TAP-markierten Proteins, durchgeführt. Die Immunoblot-Analyse wurde gemäß Nr. 3 durchgeführt.
1 Protokoll für die indirekte Immunfluoreszenz-Färbung fixierter Säugerzellen für Plasmamembran- und ER-gebundene Proteine
Zellen wurden in FCS-Medien auf mit Polylysin beschichteten Kammer-Objektträgern mit 8 Mulden auf 50 % Konfluenz gezüchtet. Dann wurde die Fixierung der Zellen in 4 % Pararormaldehyd, der in phosphatgepufferter Kochsalz (PBS)-Lösung (0,14 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,4) gelöst war, durchgeführt. Die Zellen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur in 300 Mikrolitern pro Mulde inkubiert. Das Stoppen wurde 2×20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,1 M Glycin in PBS durchgeführt. Die Blockierung wurde mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,3 % Saponin + PBS über mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Inkubation der primären Antikörper wurde in der Blockierungslösung über Nacht bei +4 °C durchgeführt. Die richtige Verdünnung der Antikörper wurde fallweise bestimmt. Die Zellen wurden in PBS, das 0,3 % Saponin enthielt, bei Raumtemperatur 2×20 Minuten gewaschen. Die Inkubation der sekundären Antikörper wird in der Blockierungslösung durchgeführt. Alexa 594 gekoppelter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). Alexa 488 gekoppelter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). DAPI wurde verwendet, um DNA zu markieren. Wenn Phalloidin verwendet wurde, um F-Actin zu markieren, wurde der Wirkstoff 1:500 verdünnt und mit den sekundären Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden dann wiederum 2×20 Minuten bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Der Überschuss an Puffer wurde entfernt, und die Zellen wurden in ein Medium eingeschlossen, das ein Antibleichmittel enthielt (Vectashield, Vector Laboratories).
2 Protokoll für die indirekte Immunfluoreszenz-Färbung fixierter Säugerzellen für nicht an die Plasmamembran gebundene Proteine:
Die Zellen wurden in FCS-Medien auf mit Polylysin beschichteten Kammer-Objektträgern mit 8 Mulden auf 50 % Konfluenz gezüchtet. Die Fixierung der Zellen wurde in 4 % Paraformaldehyd, der in phosphatgepufferter Kochsalz(PBS)-Lösung (0,14 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,4) gelöst war, 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT), 300 Mikroliter pro Mulde, durchgeführt. Das Stoppen wurde 2×20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,1 M Glycin in PBS durchgeführt. Die Permeabilisierung der Zellen wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,5 % Triton X-100 in PBS durchgeführt. Die Blockierung wurde dann in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,3 % Saponin + PBS über mindestens 1 Stunde bei RT durchgeführt (Blockierungslösung). Die Inkubation der primären Antikörper wurde in der Blockierungslösung über Nacht bei +4 °C durchgeführt. Die richtige Verdünnung der Antikörper muss fallweise bestimmt werden. Die Zellen wurden in PBS, das 0,3 % Saponin enthielt, 2×10 Minuten bei RT gewaschen. Die Inkubation der sekundären Antikörper wurde in der Blockierungslösung durchgeführt. Alexa 594 gekoppelter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). Alexa 488 gekoppelter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). DAPI wurde verwendet, um DNA zu markieren. Wenn Phalloidin verwendet wird, um F-Actin zu markieren, wird der Wirkstoff 1:500 verdünnt und mit den sekundären Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden 2×20 Minuten bei RT in PBS gewaschen. Der Überschuss an Puffer wurde entfernt, und die Zellen wurden in ein Medium eingeschlossen, das ein Antibleichmittel enthielt (Vectashield, Vector Laborstories).
3 Immunoblot-Analyse
Um die Expressionsniveaus von TAP-markierten Proteinen zu analysieren, wurde ein Zell-Pellet (von einer Platte mit 6 Mulden) in 60 μl DNAse I-Puffer (5 % Glycerin, 100 mM NaCl, 0,8 % NP-40 (IGEPAL), 5 mM Magnesiumsulfat, 100 μg/ml DNAse I (Roche Diagnostics), 50 mM Tris, pH 7,5, Protease-Inhibitorcocktail) 15 Minuten auf Eis lysiert. Jede Probe wurde in zwei Aliquote gespalten. Die erste Hälfte wurde 5 min bei 13.000 U/min zentrifugiert, um das NP-40-extrahierbare Material im Überstand zu erhalten; die zweite Hälfte (Gesamtmaterial) wurde sorgfältig pulverisiert. Jeweils 50 μg des NP-40-extrahierbaren Materials und des Gesamtmaterials werden 30 min bei 50 °C auf einem Schüttler mit DTT enthaltendem Probenpuffer gemischt und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem vorgefertigten 4-12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen) aufgetrennt. Die Proteine wurden dann unter Verwendung eines Halbtrocken-Verfahrens mit einem diskontinuierlichen Puffersystem auf Nitrocellulose transferiert. Kurz gesagt, wurden Gel und Nitrocellulose-Membran zwischen Filterpapiere gelegt, die entweder in Anoden-Puffer (drei Schichten Puffer A1 (0,3 M Tris-HCl) und drei Schichten Puffer A2 (0,03 M Tris-HCl)) oder in Kathoden-Puffer (drei Schichten 0,03 M Tris-HCl, pH 9,4, 0,1 % SDS, 40 mM ⎕-Aminocapronsäure) eingeweicht waren. Der Elektrotransfer von zwei Gelen auf einmal wurde bei 600 mA über 25 min durchgeführt. Die transferierten Proteine wurden mit Ponceau S-Lösung über 1 min sichtbar gemacht, um den Transferwirkungsgrad zu kontrollieren, und dann in Wasser entfärbt. Die Membran wurde 30 min bei Raumtemperatur in 5 % fettarmem Milchpulver in TEST (TBS, das 0,05 % Tween-20 enthielt) blockiert. Es wurde nacheinander 1 Stunde bei Raumtemperatur mit HRP-gekoppeltem PAP-Antikörper (1:5000 verdünnt in 5 % Milch/TBST) inkubiert und dreimal 10 min in TEST gewaschen. Die Blot-Membran wurde schließlich 2 min lang in chemilumineszentem Substrat (ECL, Roche Diagnostics) eingeweicht und entweder einem Röntgenfilm ausgesetzt oder auf einem Abbildungsgerät analysiert.
BEISPIEL 4: Reinigung von Proteinkomplexen
Die Proteinkomplex-Reinigung wurde der subzellulären Lokalisierung des TAP-markierten Proteins angepasst und wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
1 Lysat-Herstellung für cytoplasmatische Proteine
Etwa 1×10⁹ adhärente Zellen (Durchschnitt) wurden mit einem Zellschaber geerntet und 3 Mal in eiskalter PBS (3 min, 550 g) gewaschen. Die gesammelten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort weiter verarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml CZ Lysepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,4; 5 % Glycerin; 0,2 % IGEPAL; 1,5 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette EDTA-freien Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM, Roche) pro 25 ml Puffer) resuspendiert und durch 10 Schläge eines eng eingepassten Stößels in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde 30 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde 1 Stunde bei 100.000 g einem zusätzlichen Ultrazentrifugationsschritt unterzogen. Der Überstand wurde gewonnen und schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort weiter verarbeitet.
2 Lysat-Herstellung für Membranproteine
Etwa 1×10⁹ adhärente Zellen (Durchschnitt) wurden mit einem Zellschaber geerntet und 3 Mal in eiskalter PBS (3 min, 550 g) gewaschen. Die gesammelten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort weiter verarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml Membran-Lysepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,4; 5 % Glycerin; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette EDTA-freien Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM, Roche) pro 25 ml Puffer) resuspendiert und durch 10 Schläge eines eng eingepassten Stößels in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde 10 min bei 750 g zentrifugiert, der Überstand wurde gewonnen und 1 Stunde einem Ultrazentrifugationsschritt bei 100.000g unterzogen. Das Membran-Pellet wurde in 7,5 ml Membranlysepuffer resuspendiert, der 0,8 % n-Dodecyl-β-D-maltosid enthielt, und 1 Stunde unter konstantem Schütteln bei 4 °C inkubiert. Mit der Probe wurde 1 Stunde bei 100.000 g ein weiterer Ultrazentrifugationsschritt durchgeführt, und das löslich gemachte Material wurde schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort weiter verarbeitet.
3 Lysat-Herstellung für Kernproteine
Etwa 1×10⁹ adhärente Zellen (Durchschnitt) wurden mit einem Zellschaber geerntet und 3 Mal in eiskalter PBS (3 min, 550 g) gewaschen. Die gesammelten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren oder sofort weiter verarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml hypotonischem Lysepuffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette EDTA-freien Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM, Roche) pro 25 ml Puffer) resuspendiert und durch 10 Schläge eines eng eingepassten Stößels in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde 10 min bei 2.000 g zentrifugiert und der entstandene Überstand (S1) auf Eis aufbewahrt. Das Kern-Pellet (P1) wurde in 5 ml Kernlysepuffer (50 mM Tris, pH 7,4; 1,5 mM MgCl₂, 20 % Glycerin; 420 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette EDTA-freien Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM, Roche) pro 25 ml Puffer) resuspendiert; und 30 min auf Eis inkubiert. Die Probe wurde mit S1 vereinigt, mit 7 ml Lösungspuffer (110 mM Tris, pH 7,4; 0,7 % NP40; 1,5 mM MgCl₂; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT) weiter verdünnt, 10 min auf Eis inkubiert, und 1 Stunde bei 100.000g zentrifugiert. Der Endüberstand (S2) wurde schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren.
4 Tandem-Affinitätsreinigung
Das gefrorene Lysat wurde schnell in einem Wasserbad von 37 °C aufgetaut und 20 min bei 100.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und 2 Stunden unter konstantem Schütteln mit 0,2 ml abgesetzten Kaninchen-IgG-Agarose-Beads (Sigma) inkubiert. Die immobilisierten Proteinkomplexe wurden mit 10 ml CZ-Lysepuffer (der 1 Complete^TM-Tablette (Roche) pro 50 ml Puffer enthielt) gewaschen und weiter mit 5 ml TEV Spaltungspuffer (10 ml Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1 % IGEPAL; 0,5 mM EDTA; 1 mM DTT) gewaschen. Die Proteinkomplexe wurden durch einstündige Inkubation bei 16 °C mit 5 μl TEV-Protease (GibcoBRL, Cat.Nr. 10127-017) in 150 μl Spaltungspuffer eluiert. Das Eluat wurde gewonnen und mit 0,2 ml abgesetzten Calmodulin-Affinitäts-Beads (Stratagene) in 0,2 ml CBP-Bindungspuffer (10 ml Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1 % IGEPAL; 2 mM MgAc; 2 mM Imidazol; 1 mM DTT, 4 mM CaCl₂) vereinigt und anschließend 1 Stunde bei 4 °C unter konstantem Schütteln inkubiert. Die immobilisierten Proteinkomplexe wurden mit 10 ml CBP Waschpuffer (10 ml Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1 % IGEPAL; 1 mM MgAc; 1mM Imidazol; 1 mM DTT; 2 mM CaCl₂) gewaschen und durch Zusetzen von 600 μl Elutionspuffer (10 ml Tris, pH 8,0; 5 mM EGTA) 5 min bei 37 °C eluiert. Das Eluat wurde in einem silikonisierten Röhrchen gewonnen und lyophilisiert. Das restliche Calmodulin-Harz wurde 5 min in 50 μl 4× Lämmli-Probenpuffer gekocht. Der Probenpuffer wurde isoliert, mit der lyophilisierten Fraktion vereinigt und auf ein NuPAGE Gradientengel (Invitrogen, 4-12 %, 5 mm, 10 Mulden) geladen.
BEISPIEL 5: Protein-Identifikation durch Massenspektrometrie
1 Proteinspaltung vor der massenspektrometrischen Analyse
Die durch Gel aufgetrennten Proteine wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren, das durch Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68:850-858 beschrieben wurde, reduziert, alkyliert und in Gel verdaut. Kurz gesagt, wurden die durch Gel aufgetrennten Proteine unter Verwendung eines sauberen Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung von 10 mM DTT (in 5 mM Ammonium-Bicarbonat, 54 °C, 45 min) reduziert, und daraufhin mit 55 mM Iodacetamid (in 5 mM Ammonium-Bicarbonat) bei Raumtemperatur im Dunkeln alkyliert (30 min). Die reduzierten und alkylierten Proteine wurden in Gel mit Schweinetrypsin (Promega) bei einer Proteasekonzentration von 12,5 ng/μl in 5 mM Ammonium-Bicarbonat verdaut. Man ließ den Verdau 4 Stunden bei 37 °C ablaufen, und die Reaktion wurde danach unter Verwendung von 5 μl 5 % Ameisensäure gestoppt.
2 Probenpräparation vor der massenspektrometrischen Analyse
Die Gel-Pfropfen wurden zweimal mit 20 μl 1 % TFA extrahiert und mit angesäuerten Verdau-Überstanden vereinigt. Die Proben wurden in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in 13 μl 1 % TFA resuspendiert.
3 Massenspektrometrische Daten-Akquisition
Die Peptidproben wurden in ein nano LC-System (CapLC, Waters, oder Ultimate, Dionex), das entweder direkt mit einem vierpoligen TOF (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass, oder QSTAR Pulsar, Sciex), oder mit einem Ionenfallen (LCQ Deca XP)-Massenspektrometer gekoppelt war, injiziert. Die Peptide wurden unter Verwendung eines Gradienten aus wässrigen oder organischen Lösungsmitteln (siehe unten) aufgetrennt.
Lösungsmittel A war 5 % Acetonitril in 0,5 % Ameisensäure, und Lösungsmittel B war 70 % Acetonitril in 0,5 % Ameisensäure.

Zeit (min) % Lösungsmittel A % Lösungsmittel B

0 95 5

5,33 92 8

35 50 50

36 20 80

40 20 80

41 95 5

50 95 5
Peptide, die außerhalb des LC-Systems eluierten, wurden im Massenspektrometer teilsequenziert.
4. Protein-Identifizierung
Die Peptid-Massen- und -Fragmentierungsdaten, die in den LC-MS/MS-Versuchen erzeugt wurden, wurden verwendet, um Fasta-formatierte Protein- und Nucleotidsequenz-Datenbanken abzufragen, die bei der NCBI (für NCBInr, dbEST und die menschlichen und Maus-Genome) und dem European Bioinformatics Institute (EBI, für die Datenbanken des Proteoms des Menschen, der Maus, von D. melanogaster und C. elegans) aufrechterhalten und regelmäßig aktualisiert werden. Die Proteine werden durch Korrelieren der gemessenen Peptid-Masse- und -Fragmentierungsdaten mit denselben Daten, die aus den Einträgen in der Datenbank errechnet wurden, unter Verwendung des Software-Tools Mascot (Matrix Science; Perkins et al., 1999, Electrophoresis 20:3551-3567), identifiziert. Die Such-Kriterien variierten abhängig von dem Massenspektrometer, der für die Analyse verwendet wurde.
BEISPIEL 6: siRNA-Inhibition von FADS2, DEGS, SCD4
FADS2, DEGS und SCD4 wurden durch siRNA-Expression getrennt gehemmt. Die Ergebnisse sind in der 3, 5, 7 gezeigt.
Eine RNAi-Genexpressions-Störungsstrategie wurde für die funktionale Validierung von FADS2 als Effektor der APP-Prozessierung verwendet: Zwei verschiedene siRNAs, die gegen FADS2 gerichtet waren, sowie siRNAs, die gegen BACE1 oder Luc3 in SKNBE2 gerichtet waren, wurden in Neuroblastom- oder H4-Neurogliomzellen transfiziert.
siRNAs für menschliches FADS2 wurde von Dharmacon Research Inc. synthetisiert. Die für FADS2 verwendeten Sequenzen sind:
GCUGAAAUACCUGCCCUAC und GCAUGGCAUUGAAUACCAG
Die Transfektion der SK-N-BE2-Zellen wurde unter Verwendung von LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), gemäß den Anweisungen des Herstellers, durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0×10⁴ Zellen in einem Endvolumen von 85 μl pro 96 Mulden 12-16 Stunden vor der Transfektion ausgesät. 25 nM siRNAs wurden mit 8 μl Opti-MEM-Puffer (Gibco) und 60 ng Träger-DNA gemischt und vor dem Zusetzen zu den Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 16 und 48 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch 100 μl bzw. 200 μl Wachstumsmedium mit bzw. ohne Serum ersetzt. 72 Stunden nach der Transfektion wurden 100 μl Überstand für Aβ42 ELISA geerntet. Der Test wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Innogenetics).
Die Transfektion von H4-Zellen wurde unter Verwendung von RNAiFect (Qiagen), gemäß den Anweisungen des Herstellers, durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0×10⁴ Zellen, in einem Endvolumen von 100 μl in jeder der 96 Mulden, 12-16 Stunden vor der Transfektion ausgesät. 270 nM (0,375 μg) siRNAs wurden mit 25 μl EC-R-Puffer und 2,3 μl RNAiFect gemischt, und das Gemisch wurde vor dem Zusetzen zu den Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Komplexbildung wurde das Medium auf den Zellen durch 75 μl frisches Wachstumsmedium ersetzt. 5 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen einmal mit Wachstumsmedium gewaschen, und 100 μl wurden zur weiteren Züchtung zugesetzt. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch 200 μl serumfreies Wachstumsmedium ersetzt. 72 Stunden nach der Transfektion wurde 100 μl Überstand für Aβ42 ELISA geerntet. Der Test wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Innogenetics).
Die Knockout-Effizienz ausgewählter siRNAs wurde durch Cotransfektion von siRNAs und entsprechenden TAP-markierten cDNA-Expressionsvektoren, oder durch Verwendung von Zelllinien, die das entsprechende markierte Protein von Interesse stabil exprimieren, auf dem Proteinniveau bestimmt. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Extrakte hergestellt, die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Die Western-Blots wurden mit Antikörpern sondiert, die gegen die Markierung und Tubulin gerichtet waren.
Wir stellten fest, dass, ähnlich wie siRNAs, die gegen den bekannten Effektor der APP-Prozessierung, BACE1, gerichtet waren, jene die auf FADS2 abzielten, eine signifikante Abschwächung der Aβt-42-Sezernierung verursachten, wohingegen die Luc3-siRNA keine Wirkung hatte.
Somit konnten wir zeigen, dass FADS2 überraschenderweise bei der Prozessierung von APP eine funktionale Rolle spielt. Es wurde gezeigt, dass die Produktion des Aβ1-42-Peptids durch die Hemmung von FADS2 verringert werden konnte.
Wir bestätigten, dass beide FADS2-siRNAs durch Cotransfektion eines FADS2-CTAP-Plasmids und von FADS2-, bzw. Luc3-siRNAs in SKNBE2- und H4-Zellen tatsächlich mit der Expression der Desaturase interferierten. 48 Stunden nach der Transfektion bestimmten wir die Expressionsniveaus von FADS2-CTAP durch Western-Blot-Analyse mit Anti-TAP-Antikörpern.
BEISPIEL 7 Bestimmung der FADS2-Aktivität
a) Mikrosomaler Rattenleber-Test
(Obukowicz MG, Raz A, Pyla PD, Rico JG, Wendling JM, Needleman P (1998a) Identification and characterization of a novel delta6/delta5 fatty acid desaturase inhibitor as a potential anti-inflammatory agent. Biochem. Pharmacol. 1;55(7):1045-58; Obukowicz MG, Welsch DJ, Salsgiver WJ, Martin-Berger CL, Chinn KS, Duffin KL, Raz A, Needleman P (1998b). Novel, selective delta6 or delta5 fatty acid desaturase inhibitors as antiinflammatory agents in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 287(1): 157-66).
Die Microsomale Membranen von Ratten werden durch biochemische Standard-Fraktionierungsverfahren erhalten. Die folgenden Bestandteile werden in einer Platte mit 48 Mulden gemischt: a) 150 μl Puffer/Cofaktoren (250 mM Sucrose, 150 mM KCl, 40 mM NaF, 1,3 mM ATP, 1 mg/ml MgCl₂·5 H₂O, 1,5 mM reduziertes Glutathion, 60 μM reduziertes CoA, 330 μM Nicotinamid, 670 μg/ml NADH, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,4); b) 50 μl Rattenleber-Microsomen (~500 μg Gesamtprotein); c) 2,2, μl Test-Verbindung (DMSO-Stammlösung; 1 % DMSO-Endkonzentration); d) 20 μl (0,05 μCi) ¹⁴C-Fettsäuresubstrate.
Das bevorzugte Substrat für FADS2 ist α-Linolensäure (¹⁴C18:3n-3). [Der Test gewährleistet die gleichzeitige Messung der FADS1 (Δ5-Desaturase)- und der SCD-1-Aktivität (Δ9-Desaturase). Die Substrate für diese enzymatischen Aktivitäten sind ¹⁴C20:3n-3 bzw. Stearinsäure (¹⁴C18:0)].
Die Proben werden eine Stunde bei 37 °C inkubiert, und dann werden die Reaktionen gestoppt und die Fettsäureester-Verbindungen durch Inkubation mit 200 μl 2,5 N KOH in Methanol:Wasser (4:1) 4 Stunden bei 65 °C hydrolysiert. Die freien Fettsäuren werden mit 280 μl Ameisensäure protoniert und in die organische Phase (700 μl Hexan) extrahiert. 200 μl der Hexanschicht werden auf AgNO₃-Dünnschichtchromatographie(TLC)-Platten analysiert. Die Platten werden über Nacht getrocknet, und die Aktivität wird durch ein Phopshor-Abbildungsgerät quantifiziert. Als Alternative zur TLC-Analyse könnte eine Trennung der Proben durch HPLC erreicht werden.
b) Zelltest
Eine Zelllinie, die hohe Mengen an FADS2 exprimiert (wie ABMC-7-Mastocytom-Zellen), wird verwendet. Die Zellen werden auf Wachstum in serumfreiem HL-1-Medium, das FADS2-Substrate enthält (wie 10 μM Linolsäure/15 μM fettsäurefreies BSA), adaptiert. Um die FADS2-Aktivität zu messen, werden 2 × 10⁵ Zellen pro 48 Mulden ausgestrichen, und dann in Medium, das 10 μM eines geeigneten Substrats enthält (wie α-Linolensäure (¹⁴C18:3n-3)), inkubiert. Um den Fettsäure-Stoffwechsel zu stoppen, wird die Zellschicht mit PBS gewaschen, und 200 μl 2,5 N KOH in Methanol:Wasser (4:1) werden zugesetzt. Die Proben werden weiter verarbeitet wie vorstehend beschrieben
c) Screening-Tests mit hohem Durchsatz unter Verwendung von synthetischen Fettsäure-Enzymen (s. WO-03/019146 , S. 27 ff.)
Der Test verwendet positionsspezifische tritiierte Fettacyl-CoA-ester in einem microsomalen Testformat (siehe oben). Das Verfahren weist die Freisetzung tritiierten Wassers nach und umgeht das Erfordernis der TCL- oder HPLC-Analyse von mit ¹⁴C markierten Fettsäuren. Für das Screening von FADS2-Inhibitoren sind ³H[6,9,12-Octadecatrien-Säure] (CoA-Konjugat von Linolensäure) und/oder ³H[9,12,15-Octadecatrien-Säure] (CoA-⎕-Linolensäure) geeignete Substrate. Die Markierung sollte positionsspezifisch an C6/C7 sein.
Kurz gesagt, werden die folgenden Bestandteile gemischt (Gesamtvolumen: 100 μl): 2 μl unmarkiertes 1,5 mM Fettacyl-CoA, 1 μl tritiiertes Fettacyl-CoA, 10 μl 20 mM NADH, Verbindungen aus DMSO-Stammlösung; 67 μl 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2. 80 μl dieses Gemischs werden 20 μl Microsomen zugesetzt (~ 20 μg Gesamtprotein), und man lässt die Reaktion 5-30 min bei RT ablaufen. 10 μl 6 % Perchlorsäure werden zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Um nicht verwendetes tritiiertes Substrat zu sedimentieren, werden die Proben mit 100 μl Kohlesuspension verwirbelt und 10 min bei 4 °C bei 13.000 U/min zentrifugiert. 400 μl Überstand wird in einem Flüssigszintillationszähler analysiert.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines Gamma-Sekretase- und/oder eines Beta-Sekretase-Modulators, umfassend die folgenden Schritte: a. Identifizieren eines FADS2-wechselwirkendes Moleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Testverbindung ein FADS2-wechselwirkendes Molekül ist, b. Bestimmen, ob das FADS2-wechselwirkende Molekül aus Schritt a) in der Lage ist, die Gamma-Sekretase- und/oder Beta-Sekretase-Aktivität zu modulieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt a) die Testverbindung mit FADS2 in Kontakt gebracht und die Wechselwirkung von FADS2 mit der Testverbindung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wechselwirkung der Testverbindung mit FADS2 zu einer Hemmung der FADS2-Aktivität führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase und/oder der Beta-Sekretase zur Spaltung von APP gemessen wird.