DE602004011400T2

DE602004011400T2 - Behandlung von neurodegenerativen krankheiten mit gpr49

Info

Publication number: DE602004011400T2
Application number: DE602004011400T
Authority: DE
Inventors: Carsten Hopf; Gerard Drewes; Heinz Ruffner
Original assignee: Cellzome GmbH
Current assignee: Cellzome GmbH
Priority date: 2004-01-29
Filing date: 2004-11-29
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2024-11-30
Also published as: PT1713501E; ES2300852T3; WO2005074980A1; JP2007525491A; AU2004315111B2; CA2554353A1; WO2005074971A1; ATE383870T1; DE602004011400D1; EP1713501A1; US20080025969A1; AU2004315111A1; EP1713501B1; DK1713501T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinkomplexe des APP-Prozessierungsweges umfassend das GPR49-Protein sowie die Verwendung von Inhibitoren dieser Komplexe und von GPR49 in der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Die Alzheimer'sche Krankheit ist ein chronischer Zustand, der Millionen von Individuen weltweit betrifft.
Die Gehirne der an Alzheimer'schen Krankheit-Leidenden zeigen eine charakteristische Pathologie von prominenten neuropathologischen Läsionen wie beispielsweise die initialen intrazellulären neurofibrillären Tangles (NFTs) und die extrazellulären amyloidreichen senilen Plaques. Diese Läsionen sind mit einem massiven Verlust an Populationen von CNS-Neuronen verbunden, und ihr Fortschreiten wird von klinischer Demenz verbunden mit AD begleitet. Die Hauptkomponenten der Amyloidplaques sind die Amyloid-Beta (A-Beta, Abeta oder Aβ)-Peptide verschiedener Längen. Eine Variante davon, welches das Aβ1-42-Peptid (Abeta-42) ist, ist die Hauptursache der Amyloidbildung. Eine andere Variante ist das Aβ1-40-Peptid (Abeta-40). Amyloid-Beta ist das proteolytische Produkt eines Vorläuferproteins, Beta-Amyloid-Vorläuferprotein (Beta-APP oder APP). APP ist ein Typ-I-Transmembran-Protein, welches schrittweise von mehreren verschiedenen membranassoziierten Proteasen gespalten wird. Die erste Spaltung von APP erfolgt durch eine der zwei Proteasen Alpha-Sekretase oder Beta-Sekretase. Alpha-Sekretase ist eine Metalloprotease, deren Aktivität höchstwahrscheinlich durch eines oder einer Kombination der Proteine ADAM-10 oder ADAM-17 bereitgestellt wird. Die Spaltung durch Alpha-Sekretase beugt der Bildung von Amyloidpeptiden vor und wird somit als nicht amyloidogen bezeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Spaltung von APP durch Beta-Sekretase eine Voraussetzung für die anschließende Bildung der Amyloidpeptide. Diese Sekretase, die auch BACE1 (beta-site APP-cleaving enzyme) genannt wird, ist ein Typ-I-Transmembran-Protein, welches eine Aspartyl-Proteaseaktivität enthält (im Detail nachfolgend beschrieben).
Die Beta-Sekretaseaktivität (BACE) spaltet APP in der Ektodomäne resultierend in dem Freisetzen des sekretierten löslichen APPb und in einem 99-Reste umfassenden C-terminalen Transmembranfragment (APP-C99). Vassar et al. (Science 286, 735–741) klonierten eine transmembrane Asparagin-Protease, die die Charakteristika der postulierten Beta-Sekretase von APP hatte, welche sie BACE1 nannten. Das Gehirn und primäre kortikale Kulturen von BACE1-Knockout-Mäusen zeigten keine detektierbare Beta-Sekretaseaktivität, und primäre kortikale Kulturen von BACE-Knockout-Mäusen produzierten sehr viel weniger Amyloid-Beta aus APP.
Dies legt nahe, dass BACE1, eher als sein Paralog BACE2, die Haupt-Beta-Sekretase für APP ist. BACE1 ist ein Protein aus 501 Aminosäuren (aa) umfassend ein Signalpeptid aus 21 Aminosäuren, welches von einer Prosequenzdomäne umfassend aa 22 bis 45 gefolgt wird. Es gibt alternative Spleißformen, BACE-I-457 und BACE-I-476. Die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins wird von einer postulierten Transmembran-Domäne und einem kurzen cytosolischen C-terminalen Schwanz bestehend aus 24 aa gefolgt. BACE1 ist als ein Typ-I-Transmembran-Protein mit dem aktiven Zentrum auf der extrazellulären Seite der Membran postuliert, wo Beta-Sekretase APP und mögliche andere, bisher noch unidentifizierte Substrate spaltet. Obwohl BACE1 eindeutig ein Schlüsselenzym ist, welches für die Prozessierung von APP zu A-Beta benötigt wird, legt ein jüngster Hinweis die Existenz von zusätzlichen potenziellen BACE1-Substraten und -Funktionen nahe (J. Biol. Chem. 279, 10542–10550). Bis zum heutigen Tage sind keine BACE1-interagierenden Proteine mit regulatorischen oder modulierenden Funktionen beschrieben worden.
Das durch BACE1-Spaltung generierte APP-Fragment, APP-C99, ist ein Substrat für die Gamma-Sekretaseaktivität, welche APP-C99 innerhalb der Membranebene in ein A-Betapeptid (wie das amyloidogene Aβ1-42-Peptid) und in ein C-terminales Fragment namens APP-intrazelluläre Domäne (AICD) schneidet (Annu Rev Cell Dev Biol 19, 25–51). Die Gamma-Sekretaseaktivität befindet sich innerhalb eines Multiprotein-Komplexes mit mindestens vier verschiedenen Untereinheiten. Die erste Untereinheit, die entdeckt wurde, war Präsenilin (Proc Natl Acad Sci USA 94, 8208–13). Andere bekannte Proteinkomponenten des Gamma-Sekretasekomplexes sind Pen-2, Nicastrin und Aph-1a (Aph1a).
Trotz des jüngsten Fortschrittes in dem Beschreiben der molekularen Ereignisse, die der Ätiologie der Alzheimerkrankheit zu Grunde liegen, wurden bisher keine krankheitsmodifizierenden Therapien entwickelt. Daher hat sich die Industrie angestrengt, geeignete Leitstrukturen für die Inhibition von BACE1 zu identifizieren. Darüber hinaus ist erkannt worden, dass eine steigende Anzahl an alternativen Substraten der Gamma-Sekretase existiert, vor allem das Notch-Protein. Folglich verursacht die Inhibition von Gamma-Sekretase wahrscheinlich mechanismusbasierte Nebenwirkungen. Momentane Spitzenmedikamente (z. B. Aricept^®/Donepezil) zielen darauf ab, eine zeitweise Verbesserung der kognitiven Funktionen durch Inhibieren der Acetylcholinesterase zu erreichen, was zu erhöhten Mengen des Neurotransmitters Acetylcholin im Gehirn führt. Diese Therapien sind für die späteren Stadien der Krankheit nicht geeignet, sie behandeln nicht die der Krankheit zu Grunde liegende Pathologie, und sie halten das Fortschreiten der Krankheit nicht auf.
Daher besteht ein bisher unerfüllter Bedarf an der Identifikation neuer Zielmoleküle, die neue molekulare Strategien zur Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit ermöglichen. Zusätzlich existiert ein starker Bedarf an neuen therapeutischen Verbindungen, die die oben genannten molekularen Prozesse durch Angreifen neuer Zielmoleküle modifizieren.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines GPR49-Inhibitors, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung bereit.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass das GPR49 (ebenso bekannt als leucinreiche-Wiederholungssequenz-enthaltender G-Protein-gekoppelter Rezeptor 5 (LGR5); FEX HG38, GPR67) Teil verschiedener Proteinkomplexe ist, die in der abnormalen Prozessierung von APP in der Alzheimer'schen Krankheit vermittelt durch Gamma-Sekretase involviert sind. Speziell wurde gefunden, dass GPR49 Teil des Aphla-Komplexes, des Fe65L2-Komplexes, des APP-C99-Komplexes und des BACE1-Komplexes ist. Diese Komplexe sind nach ihrer jeweiligen Schlüsselproteinkomponente benannt, die als der TAP-Technologie-Eingangspunkt verwendet wurde (siehe unten).
Die Identifizierung von GPR49 als ein Schlüsselmolekül in diesen Komplexen ermöglicht die Verwendung der Moleküle, die mit GPR49 interagieren, zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Dies ist speziell in den Beispielen gezeigt, wo demonstriert ist, dass eine gegen GPR49 gerichtete siRNA in der Attenuierung der Bildung und/oder der Sekretion von Abeta-42 resultiert.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein „GPR49-intergierendes Molekül" ein Molekül, welches zumindest temporär an GPR49 bindet, und welches die GPR49-Aktivität vorzugsweise moduliert und insbesondere inhibiert.
GPR49 ist ein mutmaßliches Mitglied der Glycoproteinhormonrezeptor-Superfamilie – ungewöhnliche G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die durch eine große N-terminale Ektodomäne charakterisiert sind, welche leucinreiche Wiederholungssequenzen enthält, von den in einigen Fällen gezeigt wurde, dass sie für die Interaktion mit Glycoproteinliganden wichtig sind. Eine phylogenetische Analyse der Superfamilienmitglieder legt nahe, dass sie in drei Unterfamilien unterteilt ist – die erste umfasst Rezeptoren für LH, FSH (Follikel stimulierendes Hormon) und TSH (Thyroid stimulierendes Hormon); die zweite enthält die Relaxinrezeptoren LGR7 und LGR8. GPR49/LGR5 zusammen mit LGR4 und LGR6 (4) bilden eine Unterfamilie an Orphanrezeptoren, die nur ~35% Sequenzidentität mit dem FSH-Rezeptor aufweisen (Hsu SY, Liang SG, Hsueh AJ (1998) Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G Protein-coupled, seven-transmembrane region. Mol Endocrinol. 12(12): 1830–45; McDonald T, Wang R, Bailey W, Xie G, Chen F, Caskey CT, Liu Q (1998) Identification and cloning of an orphan G Protein-coupled receptor of the glycoprotein hormone receptor subfamily. Biochem Biophys Res Commun. 247(2): 266–70).
GPR49 ist hauptsächlich im Klettmuskel, in der Plazenta und im Rückenmark und in geringeren Mengen auch im Darm, in der Nebenniere und in verschiedenen Unterregionen des Gehirns exprimiert (Hsu SY, et al. (1998), supra). Im adulten Mäusegehirn sind GPR49-Transkripte hauptsächlich auf das olfaktorische Mark begrenzt, wo sie in neuronalen Zellschichten gefunden werden (Hermey G, Methner A, Schaller HC, Hermans-Borgmeyer I (1999) Identification of a novel seven-transmembrane receptor with homology to glycoprotein receptors and its expression in the adult and developing mouse. Biochem Biophys Res Commun. 254(1): 273–9). Die Funktion von GPR49 im adulten Tier ist nicht gut charakterisiert. Gezielte Deletion des GPR49-Gens in Mäusen resultiert in neonataler Lethalität und ist mit Ankyloglossie und gastrointestinaler Blähung verbunden (Morita H, Mazerbourg S, Bouley DM, Luo CW, Kawamura K, Kuwabara Y, Baribault H, Tian H, Hsueh AJ (2004) Neonatal lethality of LGR5 null mice is associated with ankyloglossia and gastrointestinal distension. Mol Cell Biol. 24(22): 9736–43).
GPR49 wurde kürzlich als ein Gen identifiziert, welches in humanen Leberzell-spezifischen Karzinoma mit Beta-Catenin-Mutationen überexprimiert ist (Yamamoto Y, Sakamoto M, Fujii G, Tsuiji H, Kenetaka K, Asaka M, Hirohashi S (2003) Querexpression of orphan G-Protein-coupled receptor, Gpr49, in human hepatocellular carcinomas with beta-catenin mutations. Hepatology 37(3): 528–33).
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „GPR49" nicht nur das in 3 gezeigte Protein, sondern auch ein funktionell aktives Derivat davon oder ein funktionell aktives Fragment davon oder ein Homolog davon oder eine Variante, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter gering stringenten Bedingungen an die das Protein kodierende Nukleinsäure hybridisiert. Vorzugsweise schließen diese gering stringenten Bedingungen die Hybridisierung in einem Puffer umfassend 35% Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% BSA, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat für 18–Stunden bei 40°C ein, das Waschen in einem Puffer bestehend aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS für 1–5 Stunden bei 55°C, und das Waschen in einem Puffer bestehend aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS für 1,5 Stunden bei 60°C.
Dasselbe trifft auf all die anderen Proteine zu, die in der vorliegenden Erfindung genannt sind. Daher bezieht sich der Name eines gegebenen Proteins oder einer Nukleinsäure nicht nur auf das Protein oder die Nukleinsäure wie in der Sequenzliste aufgeführt, sondern auch auf sein funktionell aktives Derivat oder auf ein funktional aktives Fragment davon, oder ein Homolog davon, oder eine Variante, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, welche unter gering stringenten Bedingungen an die das Protein kodierende Nukleinsäure hybridisiert, vorzugsweise unter den oben genannten Bedingungen.
Der Begriff „funktionell aktiv", wie hierin benutzt, bezieht sich auf ein Polypeptid, und zwar auf ein Fragment oder ein Derivat, welches strukturelle, regulatorische oder biochemische Funktionen des Proteins gemäß der Ausführungsform besitzt, auf die sich dieses Polypeptid, und zwar das Fragment oder Derivat, bezieht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Aktivität", wie hierin benutzt, auf die Funktion eines Moleküls in seinem breitesten Sinne. Er schließt generell biologische, biochemische, physikalische oder chemische Funktionen des Moleküls mit ein, ist jedoch nicht darauf limitiert. Er schließt zum Beispiel die enzymatische Aktivität, die Fähigkeit mit anderen Molekülen zu interagieren und die Fähigkeit, die Funktion anderer Moleküle zu aktivieren, zu erleichtern, zu stabilisieren, zu inhibieren, zu supprimieren oder zu destabilisieren, die Stabilität, und die Fähigkeit, in bestimmten subzellulären Positionen zu lokalisieren, mit ein. Wo anwendbar, bezieht sich der Begriff ebenso auf die Funktion eines Proteinkomplexes in seinem breitesten Sinne.
Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die Begriffe „Derivate" oder „Analoga der Proteinkomponenten" oder „Varianten", wie hierin benutzt, vorzugsweise, sie sind jedoch nicht darauf limitiert, Moleküle umfassend Bereiche ein, die im Wesentlichen zu den Proteinkomponenten homolog sind, in verschiedenen Ausführungsformen durch mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% Identität bzgl. einer Aminosäuresequenz identischer Größe, oder falls mit einer abgeglichenen Sequenz verglichen, bei welcher der Sequenzabgleich mittels eines im Stand der Technik bekannten Computer-Homologie-Programms durchgeführt wird, oder deren kodierende Nukleinsäure in der Lage ist, unter stringenten, moderat stringenten oder nicht stringenten Bedingungen an eine Sequenz zu hybridisieren, die die Proteinkomponente kodiert. Er bezeichnet ein Protein, welches das Ergebnis einer Modifikation durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen bzw. und -additionen des natürlich vorkommenden Proteins ist, deren Derivate immer noch die biologische Funktion des natürlich vorkommenden Proteins aufweisen, jedoch nicht notwendigerweise im selben Ausmaß. Die biologische Funktion solcher Proteine kann z. B. durch geeignete vorhandene In-vitro-Tests, wie die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten, untersucht werden. Der Begriff „Fragment", wie hierin benutzt, bezieht sich auf ein Polypeptid von mindestens 10, 20, 30, 40 oder 50 Aminosäuren der Proteinkomponente gemäß der Ausführungsform. In spezifischen Ausführungsformen sind solche Fragmente nicht länger als 35, 100 oder 200 Aminosäuren.
Der Begriff „Gen", wie hierin benutzt, bezieht sich auf eine Nukleinsäure umfassend einen offenen Leserahmen, der – soweit nicht anders ausgeführt – ein erfindungsgemäßes Polypeptid einschließlich Exon- als auch gegebenenfalls Intronsequenzen kodiert.
Die Begriffe „Homolog" oder „homologe Genprodukte", wie hierin benutzt, beziehen sich auf ein Protein aus anderen Spezies, vorzugsweise Säugern, welches dieselbe biologische Funktion wie eine Proteinkomponente des hierin weiter beschriebenen Komplexes aufweist. Solche Homologe werden auch als „orthologe Genprodukte" bezeichnet. Der Algorithmus zur Detektion solcher orthologen Genpaare aus Menschen oder Säugetieren oder anderen Spezies verwendet das Gesamtgenom dieser Organismen. Zuerst werden unter Verwendung eines vollständigen Smith-Waterman Abgleiches der prognostizierten Proteine paarweise die besten Treffer erfasst. Um die Verlässlichkeit weiter zu verbessern, werden diese Paare mit den besten Treffern umfassend Proteine aus Drosophila melanogaster und C. elegans paarweise angehäuft. Solch eine Analyse ist z. B. in Nature, 2001, 409: 860–921 gegeben. Die Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können entweder basierend auf der Sequenzhomologie der Gene, die die hierin bereitgestellten Proteine kodieren, zu den Genen anderer Spezies durch Klonieren des entsprechenden Gens isoliert werden unter Anwendung konventioneller Technologien und Exprimieren des Proteins von solch einem Gen, oder durch Isolieren der Proteine anderer Spezies mittels Isolieren des analogen Komplexen gemäß der hierin bereitgestellten Verfahren oder anderer geeigneten, im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „GPR49-Inhibitor" auf ein GPR49-interagierendes Molekül, welches eine biochemische oder chemische Verbindung ist, die die Aktivität von GPR49 inhibiert oder reduziert. Dies kann zum Beispiel durch Suppression der Expression des entsprechenden Gens erfolgen. Die Expression des Gens kann mittels RT-PCR oder Western Blot-Analyse gemessen werden. Außerdem kann dies über Inhibition der Aktivität, wie z. B. Bindung zu GPR49, erfolgen.
Beispiele solcher GPR49-Inhibitoren sind Bindungsproteine oder bindende Peptide, die gegen GPR49 gerichtet sind, insbesondere gegen das aktive Zentrum von GPR49, und Nukleinsäuren, die gegen das GPR49-Gen gerichtet sind.
Der Begriff „Nukleinsäuren gegen GPR49" bezieht sich auf Doppelstrang- oder Einzelstrang-DNA oder -RNA oder auf eine Modifikation oder ein Derivat davon, welches z. B. die Expression des GPR49-Gens oder die Aktivität von GPR49 inhibiert, und welches ohne Einschränkung Antisense-Nukleinsäuren, Aptamere, siRNAs (kleine interferierende RNAs) und Ribozyme einschließt.
Der Inhibitor kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA, Molekülen niederen Molekulargewichts (LMWs), bindenden Peptiden, Aptameren, Ribozymen und Peptidomimetika.
Diese Nukleinsäuren können der Zelle direkt zugeführt oder intrazellulär durch Transkription von exogenen, eingeführten Sequenzen erzeugt werden.
Eine „Antisense"-Nukleinsäure wie hierin verwendet bezeichnet eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, an einen sequenzspezifischen Bereich einer Proteinkomponenten-RNA (vorzugsweise mRNA) durch etwas Sequenzkomplementarität zu hybridisieren. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einer kodierenden und/oder nicht-kodierenden Region einer Proteinkomponenten-mRNA komplementär sein. Solche Antisense-Nukleinsäuren, die die Komplexbildung oder Aktivität inhibieren, besitzen Nutzen als Therapeutika und können für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen wie hierin beschrieben verwendet werden.
Die Antisense-Nukleinsäuren bestehen aus mindestens sechs Nukleotiden und sind vorzugsweise Oligonukleotide im Bereich von 6 bis über 200 Nukleotide. In spezifischen Aspekten ist das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide oder mindestens 200 Nukleotide lang.
Die Nukleinsäuren, z. B. die Antisense-Nukleinsäuren oder siRNAs, können chemisch, z. B. gemäß des Phosphotriester-Verfahrens, synthetisiert werden (siehe zum Beispiel Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543–584). Aptamere sind Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid, hier GPR49, binden. Aptamere können durch Selektionsverfahren wie beispielsweise SELEX (siehe z. B. Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628–50; Klug und Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97–107; US 5,582,981 ) aus einem großen Pool von verschiedenen einzelsträngigen RNA-Molekülen isoliert werden. Aptamere können ebenso synthetisiert und in ihrer Spiegelbild-Form selektiert werden, zum Beispiel als die L-Ribonukleotide (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 116–9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112–5). Formen, die auf diesem Wege isoliert wurden, besitzen den Vorteil, dass sie nicht durch natürlich vorkommende Ribonukleasen abgebaut werden und somit eine größere Stabilität besitzen.
Nukleinsäuren können durch Endonukleasen oder Exonukleasen, insbesondere durch DNAsen und RNAsen, die überall in der Zelle gefunden werden können, abgebaut werden. Es ist somit vorteilhaft, die Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie gegenüber Abbau zu stabilisieren, wobei sichergestellt wird, dass eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle über einen langen Zeitraum hin aufrechterhalten wird (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ). Typischerweise kann solch eine Stabilisierung durch Einführen eines oder mehrerer internukleotider phosphorhaltiger Gruppen oder durch Einführen einer oder mehrerer nicht-phosphorhaltiger Internukleotide erzielt werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peyman (1990), supra (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ) zusammengestellt. Modifizierte Internukleotidphosphat-Radikale und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die in einer der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden können, enthalten z. B. Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphoramidat, Phosphordithioat und/oder Phosphatester, wohingegen nicht-phosphorhaltige-Internukleotid-Analoga, zum Beispiel Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist ebenso die Absicht, dass diese Modifikation die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessern sollte. Im Allgemeinen können die Oligonukleotide an ihrem Basenrest, Zuckerrest oder Phosphatrückgrat modifiziert werden.
Die Oligonukleotide können andere angefügte Gruppen wie z. B. Peptide, Agenzien, den Transport über die Zellmembran erleichternde Mittel (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553–6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648–652; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 88/09810 ) oder Bluthimschranke (siehe z. B. internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/10134 ), hybridisierungsausgelöste Spaltagenzien (siehe z. B., Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958–976), interkalierende Agenzien (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549) einschließen.
Im Detail können Antisense-Oligonukleotide mindestens einen modifizierten Basenrest umfassen, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die die folgenden Substanzen umfassen, jedoch nicht darauf limitiert ist: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-uridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, D-Mannosylqueosin, 5N-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methyl-thio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-Oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-Oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
In einer anderen Ausführungsform umfassen das Oligonukleotid mindestens einen modifizierten Zuckerrest, der aus der Gruppe umfassend Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose ausgewählt, jedoch nicht darauf limitiert ist.
Die Verwendung von geeigneten Antisense-Nukleinsäuren ist ferner z. B. in Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380–2; Nellen und Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419–23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697–74 oder Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142) beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2-a-anomeres Oligonukleotid. Ein anomeres Oligonukleotid (2-a-anomer oder a-anomer) bildet spezifische Doppelstranghybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zur den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625–6641).
Die Oligonukleotide können mit anderen Molekülen, so z. B. an ein Peptid, ein hybridisationsausgelöstes Quervernetzungsmittel, einem Transportmittel, ein hybridisationsausgelöstes Spaltagens, etc. konjugiert sein.
In der gesamten Erfindung können erfindungsgemäße Oligonukleotide durch im Stand der Technik bekannter Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. durch Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizern (wie zum Beispiel kommerziell von Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich). Als Beispiele können Phosphorthioat-Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. synthetisiert werden (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209), Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch Verwendung von kontrollierten Porenglass-Polymerträgern hergestellt werden (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448–7451) etc.
In einer spezifischen Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonukleotide katalytische RNAs oder Ribozyme (siehe z. B. die internationale Patentanmeldung Nr. WO 90/11364 ; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225). In einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al., 1987, FERS Lett. 215: 327–330).
In einer alternativen Ausführungsform werden die Antisense-Nukleinsäuren der Erfindung intrazellulär durch Transkription von einer exogenen Sequenz erzeugt. Zum Beispiel kann ein Vektor in vivo eingeführt werden, so dass er von der Zelle aufgenommen wird, wobei der Vektor ein Teil davon innerhalb der Zelle transkribiert wird, und somit Antisense-Nukleinsäure (RNA) der Erfindung herstellt. Solch ein Vektor würde eine Sequenz enthalten, die das Komponentenprotein kodiert. Solch ein Vektor kann episomal verbleiben oder chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu erzeugen. Solche Vektoren können mittels rekombinanter DNA-Technologieverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, konstruiert werden. Vektoren können Plasmide, virale oder andere sein, von denen im Stand der Technik bekannt ist, dass sie zur Replikation und Expression in Säugetierzellen fähig sind. Die Expression der Sequenzen, die die Antisense-RNAs kodieren, kann durch einen beliebigen der im Stand der Technik bekannten Promotoren erfolgen, von dem bekannt ist, dass er in Säugetierzellen, vorzugsweise humanen Zellen funktionsfähig ist. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren schließen die SV40 frühe Promotor-Region ein (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promotor in der 3'langen terminalen Wiederholungssequenz des Rous sarcoma Virus enthaltenen (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thymidine-Kinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., Nature 296: 39–42) etc., sind jedoch nicht darauf limitiert.
Die Antisense-Nukleinsäuren der Erfindung umfassen eine Sequenz, die mindestens zu einem Bereich eines RNA-Transkripts eines Komponentenprotein-Gens, vorzugsweise einem humanen Gen, komplementär ist. Absolute Komplementarität wird jedoch nicht benötigt, obwohl sie bevorzugt ist. Eine Sequenz „komplementär zu mindestens einem Bereich der RNA", auf die sich hierin bezogen wird, bezeichnet eine Sequenz, die ausreichende Komplementarität besitzt, um in der Lage zu sein, mit einer RNA zu hybridisieren und eine stabile Duplex zu bilden; im Falle von Doppelstrang-Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein Einzelstrang der Duplex-DNA getestet werden oder es können Triplex-Formationen untersucht werden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird sowohl von dem Grad der Komplementarität als auch von der Länge der Antisense-Nukleinsäure abhängen. Allgemein gilt, je länger die hybridisierende Nukleinsäure, desto mehr Basen-Fehlanpassungen kann sie mit der Proteinkomponenten-RNA enthalten und immer noch eine stabile Duplex (oder Triplex, wie es der Fall sein kann) bilden. Ein Fachmann kann den tolerierbaren Grad der Fehlanpassungen durch Verwendung von Standardvorgehensweisen ermitteln, indem er den Schmelzpunkt des hybridisierten Komplexes bestimmt.
Die Herstellung und Verwendung von siRNAs als Instrumente für RNA-Interferenz im dem Prozess, Genexpression herunterzuregulieren oder sie vollständig abzuschalten, hier die GPR49-Genexpression, ist zum Beispiel in Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 oder Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494 beschrieben. Vorzugsweise weisen die siRNAs eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden auf, wobei der Identitätsbereich des Sense-Stranges der siRNA vorzugsweise mindestens 19 Nukleotide umfasst.
Ribozyme sind ebenso geeignete Hilfsmittel, um die Translation von Nukleinsäuren, hier das GPR49-Gen, zu inhibieren, da sie in der Lage sind, spezifisch an die mRNAs zu binden und diese zu spalten. Sie sind z. B. in Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175–202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237–42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921–2 oder Couture und Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510–5 beschrieben.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung, die eine wirksame Menge einer Nukleinsäure in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff enthalten, können einem Patienten verabreicht werden, der eine Krankheit oder eine Funktionsstörung besitzt, die derart ist, dass sie einen Proteinkomplex der vorliegenden Erfindung exprimiert oder überexprimiert.
Die Menge der Nukleinsäure, die für die Behandlung einer speziellen Funktionsstörung oder eines Zustandes wirksam sein wird, wird von der Natur der Funktionsstörung oder des Zustandes abhängen, und kann mittels klinischer Standardtechniken bestimmt werden. Wo möglich, ist es wünschenswert, die Nukleinsäure-Zytotoxizität in vitro zu bestimmen, und möglichst vor Einsatz am Menschen in einem geeigneten tierischen Modellsystem zu testen.
In einer speziellen Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassend Nukleinsäuren mittels Liposomen, Mikropartikeln oder Mikrokapseln verabreicht. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann es dienlich sein, solche Zusammensetzungen zu verwenden, um die fortwährende Freisetzung von Nukleinsäuren zu erzielen. In einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Liposome zu verwenden, die mittels Antikörper auf spezifische identifizierbare Zelltypen des zentralen Nervensystems abgezielt werden (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 2448–2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337–16342).
Sogenannte „niedermolekulare Moleküle" (im Folgenden „LMWs" genannt) sind Moleküle, die keine Proteine, Peptide, Antikörper oder Nukleinsäuren sind, und die ein Molekulargewicht von weniger als 5.000 Da, vorzugsweise weniger als 2.000 Da, besonders bevorzugt weniger als 1.000 Da und am stärksten bevorzugt weniger als 500 Da aufweisen. Solche LMWs können in Hochdurchsatzverfahren ausgehend von Bibliotheken identifiziert werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und werden im Detail nachstehend diskutiert.
Die Bezeichnung „bindendes Protein" oder „bindendes Peptid" bezieht sich auf eine Klasse von Proteinen oder Peptiden, die GPR49 binden und inhibieren, und die ohne Einschränkungen polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Proteingrundgerüste einschließen, die gegen GPR49 gerichtet sind.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Antikörper oder Antikörperfragment" ebenfalls verstanden, dass er Antikörper oder antigenbindende Teile davon bezeichnet, welche rekombinant hergestellt und, wo angemessen, modifiziert wurden, wie chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionale Antikörper, bispezifische oder oligospezifische Antikörper, Einzelstrangkörper und F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684 , US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649 , WO 93/06213 oder WO 98/24884 ), vorzugsweise mit der Hilfe einer FAB-Expressionsbibliothek hergestellt.
Als eine Alternative zu den klassischen Antikörpern ist es ebenso möglich z. B. Proteingrundgerüste gegen GPR49 zu verwenden, so z. B. Anticaline, die auf Lipocalin basieren (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898–1903). Die natürlichen Ligandenbindungsstellen der Lipocaline, zum Beispiel das Retinol-bindende Protein oder das Bilin-bindende Protein, können in solch einer Art verändert werden, z. B. durch einen "kombinatorischen Proteindesign"-Ansatz, dass sie an ausgewählte Haptene, hier an GPR49, binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337–50). Andere bekannte Proteingrundgerüste sind bekannt, Alternativen zu Antikörpern für die molekulare Erkennung darzustellen (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167–187).
Die Vorgehensweise zur Herstellung eines Antikörper oder Antikörperfragments erfolgt in Übereinstimmung mit Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, so z. B. durch Immunisierung eines Säugetieres, z. B. eines Hasen, mit GPR49, gegebenenfalls in der Anwesenheit von zum Beispiel Freund'schem Adjuvants und/oder Aluminiumhydroxidgele (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344–1349). Die polyklonalen Antikörper, die in dem Tier ausgebildet werden als ein Resultat der immunologischen Reaktion, können daraufhin aus dem Blut unter Verwendung von gut bekannten Verfahren isoliert und z. B. mittels Säulenchromatographie aufgereinigt werden. Monoklonale Antikörper können z. B. in Übereinstimmung mit dem gut bekannten Verfahren von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293–299) hergestellt werden.
Im Detail können polyklonale Antikörper wie oben beschrieben durch Immunisierung eines geeigneten Subjektes mit einem Polypeptid als ein Immunogen hergestellt werden. Bevorzugte polyklonale Antikörperzusammensetzungen sind diejenigen, die für Antikörper ausgewählt wurden, die gegen ein Polypeptid oder Polypeptide der Erfindung gerichtet sind. Besonders bevorzugte polyklonale Antikörperzubereitungen sind solche, die nur Antikörper enthalten, die gegen ein gegebenes Polypeptid oder Polypeptide gerichtet sind. Besonders bevorzugte immunogene Zubereitungen sind solche, die keine anderen humanen Proteine als z. B. solche immunogenen Zusammensetzungen enthalten, die unter Verwendung einer nicht-humanen Wirtszelle zur rekombinanten Expression eines Polypeptids der Erfindung hergestellt wurden. Auf solche Weise wird das einzige humane Epitop oder Epitope, die durch die resultierenden Antikörperzusammensetzung, die gegen dieses Immunogen gerichtet sind, Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polypeptide sein.
Der Antikörpertiter in dem immunisierten Subjekt kann über Zeit mittels Standardtechniken verfolgt werden, wie beispielsweise mit einem Enzym-gekoppelten-Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisierten Polypeptiden. Falls gewünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säuger isoliert werden (z. B. aus dem Blut) und mittels gut bekannter Techniken wie Protein-A-Chromatographie weiter aufgereinigt werden, um eine IgG-Fraktion zu erhalten. Alternativ dazu können Antikörper selektiert werden, die für ein Protein oder Polypeptid der Erfindung spezifisch sind (z. B. durch partielle Aufreinigung) oder können z. B. durch Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden. Zum Beispiel wird ein rekombinant exprimiertes und aufgereinigtes (oder teilweise aufgereinigtes) Protein der Erfindung wie hierin beschrieben erzeugt und kovalent oder nicht-kovalent an einen festen Träger, wie zum Beispiel eine Chromatographiesäule, gekoppelt. Die Säule kann dann verwendet werden, um Antikörper, die für Proteine der Erfindung spezifisch sind, aus einer Probe affinitätszureinigen, die Antikörper enthält, welche gegen eine große Anzahl von verschiedenen Epitopen gerichtet sind, wobei eine im Wesentlichen aufgereinigte Antikörperzusammensetzung generiert wird, d. h. eine, die im Wesentlichen frei von kontaminierenden Antikörpern ist. Mit einer im Wesentlichen aufgereinigten Antikörperzusammensetzungen ist in diesem Zusammenhang gemeint, dass die Antikörperprobe höchstens 30% (bezogen auf das Trockengewicht) an kontaminierenden Antikörpern enthält, die gegen Epitope gerichtet sind, welche gegen andere Epitope gerichtet sind als die des gewünschten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung, und vorzugsweise sind höchstens 20%, bevorzugterweise höchstens 10% und am stärksten bevorzugt höchstens 5% (bezogen auf das Trockengewicht) der Probe kontaminierende Antikörper. Eine aufgereinigte Antikörperzusammensetzung bezeichnet, dass mindestens 99% der Antikörper in der Zubereitung gegen das gewünschte Protein oder das Polypeptid der Erfindung gerichtet sind.
Zu einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die spezifischen Antikörpertiter am höchsten sind, können die antikörperproduzierenden Zellen aus dem Subjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale Antikörper mittels Standardtechniken wie z. B. der Hybridomatechnik, ursprünglich beschrieben von Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495–497, der humanen B-Zellhybridomatechnik (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72), der EBV-Hybridomatechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96) oder Triomatechniken herzustellen. Die Technologie für die Herstellung von Hybridomas ist wohl bekannt (siehe im Allgemeinen: Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et al. (Hrsg.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Hybridomazellen, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung herstellen, werden mittels Screenen von Hybridomakulturüberständen auf Antikörper, die das Polypeptid von Interesse binden, z. B. unter Verwendung von Standard-ELISA-Tests, bestimmt.
Alternativ zur Erzeugung von monoklonalen-Antikörper-sekretierenden-Hybridomas kann ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein Polypeptid der Erfindung gerichtet ist, mittels Screenen einer rekombinanten, kombinatorischen Immunglobulinbibliothek mit dem Polypeptid von Interesse identifiziert und isoliert werden (z. B. eine Antikörper-Phagendisplay-Bibliothek). Kits zur Erzeugung und zum Screenen von Phagendisplay-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (z. B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Katalog Nr. 240612). Zudem können Beispiele von Verfahren und Reagenzien, besonders geeignet für die Verwendung zum Generieren und Screenen von Antikörper-Display-Bibliotheken, zum Beispiel in den folgenden Patentschriften befunden werden: U. S. Patent Nr. 5,223,409 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18619 ; PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/17271 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/20791 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/15679 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/01288 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/01047 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO. 92/09690 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02809 ; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1370–1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81–85; Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12: 725–734.
Zudem sind rekombinante Antikörper wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl humane als auch nicht-humane Abschnitte umfassen, und welche unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardtechniken hergestellt werden können, im Rahmen der Erfindung. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Abschnitte von verschiedenen tierischen Spezies abstammen, wie solche, die eine variable Region vom murinen mAb und eine humane Immunglobulin-konstante Region haben. (Siehe z. B. Cabilly et al., U. S. Patent No. 4,816,567 ; und Boss et al., U. S. Patent No. 4,816,397 , die hierdurch in Ihrer Gesamtheit durch Inbezugnahme aufgenommen sind). Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus einer nicht-humanen Spezies, die eine oder mehrere komplementäre determinierende Regionen (CDRs) aus den nicht-humanen Spezies sowie eine Grundgerüstregion aus einem humanisierten Immunglobulinmolekül aufweisen (siehe z. B. Queen, U. S. Patent Nr. 5,585,089 , welches hierin in seiner Gesamtheit durch Inbezugnahme aufgenommen ist). Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können mittels rekombinanter DNA-Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, erzeugt werden, z. B. mittels Verwendung der in der PCT-Publikation Nr. WO 87/02671 beschriebenen; und Europäische Patentanmeldung 184,187 ; Europäische Patentanmeldung 171,496 ; Europäische Patentanmeldung 173,494 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 ; U. S. Patent Nr. 4,816,567 ; Europäische Patentanmeldung 125,023 ; Retter et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; U. S. Patent 5,225,539 ; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060.
Vollständig humane Antikörper sind im Besonderen für die therapeutische Behandlung von menschlichen Patienten wünschenswert. Solche Antikörper können z. B. unter Verwendung von transgenen Mäusen produziert werden, die nicht in der Lage sind, endogene Gene der schweren und leichten Immunglobulin-Ketten zu exprimieren, die aber humane Gene der schweren und leichten Kette exprimieren. Die transgenen Mäuse werden in der normalen Weise immunisiert und mit einem Antigen selektiert, z. B. mit einem gesamten oder einem Teil eines Polypeptids der Erfindung. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung der konventionellen Hybridomatechnologie erhalten werden. Die humanen Immunglobulintransgene, die in der transgenen Maus enthalten sind, rearrangieren sich während der B-Zell-Differenzierung und unterlaufen im Folgenden den Klassenswitch und die somatische Mutation. Daher ist es unter Verwendung solch einer Technik möglich, therapeutisch wertvolle IgG-, IgA- und IgE-Antikörper herzustellen. Für einen Überblick über diese Technologie zur Herstellung von humanen Antikörpern siehe Lonberg und Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93. Für eine detaillierte Diskussion dieser Technologie zur Herstellung humaner Antikörper und humaner momoklonaler Antikörper und Protokolle zum Erzeugen solcher Antikörper siehe z. B. U. S. Patent 5,625,126 ; U. S. Patent 5,633,425 ; U. S. Patent 5,569,825 ; U. S. Patent 5,661,016 ; und U. S. Patent 5,545,806 . Zusätzlich können Firmen wie z. B. Abgenix, Inc. (Freemont, CA) engagiert werden, um humane Antikörper, die gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtet sind, zu liefern unter Verwendung von Technologien, die denen oben beschriebenen ähnlich sind.
Vollständig humane Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können unter Verwendung von Techniken erzeugt werden, die als „guided selection" bezeichnet werden. In diesem Ansatz wird ein ausgewählter nicht-humaner monoklonaler Antikörper, z. B. ein muriner Antikörper, als Leitfaden für die Selektion eines vollständig humanen Antikörpers verwendet, der das gleiche Epitop erkennt (Jespers et al., 1994, Bio/technology 12: 899–903).
Antikörperfragmente, welche die Idiotypen von einem Komplex enthalten, können mittels im Stand der Technik bekannter Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente das F(ab')2-Fragment ein, welches durch Pepsinverdau eines Antikörpermoleküls erzeugt werden kann; sind jedoch nicht darauf limitiert; das Fab'-Fragment kann durch Reduzierung der Disulfidbrücken eines F(ab')2-Fragmentes erzeugt werden; das FAB-Fragment kann durch Behandlung eines Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden; und Fv-Fragmente.
In der Herstellung von Antikörpern kann das Screenen eines gewünschten Antikörpers mittels im Stand der Technik bekannten Techniken, z. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) erfolgen, um Antikörper zu selektieren, die für eine bestimmte Domäne des Komplexes, oder eines Derivates davon, spezifisch sind. Man kann generierte Hybridomas auf ein Erzeugnis hin untersuchen, welches an ein Fragment des Komplexes bindet oder an ein Derivat davon, welches solch eine Domäne enthält. Zur Selektion eines Antikörpers, der spezifisch an einen Komplex der vorliegenden Erfindung bindet, oder an ein Derivat oder ein Homolog davon, der aber nicht spezifisch an die individuellen Proteine des Komplexes oder eines Derivates oder eines Homologs davon bindet, kann man auf der Basis von positiver Bindung an den Komplex und auf ein Nicht-Vorhandensein einer Bindung an individuelle Proteinkomponenten selektieren.
Die vorhergehenden Antikörper können in Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und die sich auf die Lokalisation und/oder Quantifizierung des gegebenen Proteins oder Proteine, z. B. auf Sichtbarmachen dieser Proteine, dem Messen ihrer Mengen in entsprechenden physiologischen Proben (durch Immunoassay), in diagnostischen Verfahren etc. beziehen. Dieses trifft ebenfalls auf ein Derivat eines Komplexes oder ein Homolog davon zu.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der GPR49-Inhibitor eine siRNA mit der Sequenz: AACAGCAGTATGGACGACCTT
GPR49 zeigt Ähnlichkeit zu LH-Rezeptoren (luteinisierendes Hormon), Relaxin, IGF, FSH (follikelstimulierendes Hormon) und TSH. Daher könnten LH, Relaxin, IGF, FSH und TSH physiologische Liganden von GPR49 sein. Ferner können Thieno[2,3-d]pyrimidine, identifiziert als LH und FSH-Rezeptorantagonisten in WO-03 020 726
und WO-00 187 287
Antagonisten von GPR49 sein.
Wie bereits oben stehend diskutiert ist GPR49 Bestandteil von Proteinkomplexen, die in die Regulation der Gamma-Sekretase- und/oder Beta-Sekretaseaktivität involviert sind. Daher wirkt das GPR49-interagierende Molekül oder der Inhibitor in einer bevorzugten Ausführungsform auf ein GPR49-Molekül, welches Teil eines Proteinkomplexes, vorzugsweise des Aphla-Komplexes, des Fe65L2-Komplexes, des APP-C99-Komplexes, oder des BACE1-Komplexes ist.
Besagte Proteinkomplexe wurden als Komponenten von Proteinen identifiziert, die mit der Gamma-Sekretaseuntereinheit Aph1a, dem Gamma-Sekretasesubstrat APP-C99 (plus seinem Adapter FE65L2) und mit dem Beta-Sekretaseprotein interagieren.
Preseniline 1 und 2 (Psen1 und Psen2, auch jeweils als PS1 und PS2 bezeichnet) sind integrale Membranproteine, welche im endoplasmatischen Reticulum, dem Golgi und ebenso an der Zelloberfläche lokalisiert sind (Kovacs, Nat Med 2. 224). Sie werden vorwiegend als Heterodimere der NTF und CTF endoproteolytischen Fragmente vorgefunden. Die Protease, die Preseniline spaltet (die „Presenilinase"), ist nicht bekannt; es ist wahrscheinlich, dass der Prozess autokatalytisch ist, ebenso ist die funktionelle Bedeutung von PS-(auto)-Proteolyse unklar. Preseniline sind in die proteolytische Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) (De Strooper et al, Nature 391, 387) und des Notch Rezeptors (De Strooper et al, Nature 398, 518) involviert. Zudem sind Preseniline mit den Zelladhäsionsproteinen alpha- und beta-Catenin, N-cadherin und E-cadherin (Georgakopoulos et al, Mol Cell 4, 893) und anderen Mitgliedern der Armadillofamilie assoziiert (Yu et al, J Biol Chem 273, 16470). APP-Prozessierung durch Preseniline ist durch deren Einwirkungen auf Gamma-Sekretase, welche APP spaltet, vermittelt, die den C-Terminus des A-beta-Peptids generiert. PS1 assoziiert mit den C83- und C99-prozessierten C-terminalen Fragmenten von APP (Xia et al, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 8208), Nicastrin (Yu et al, Nature 407, 48) und Pen-2 (Francis et al, Dev Cell 3, 85).
Aph-1-Proteine wie Aph-1a sind (Francis et al, Dev Cell 3, 85) in dem Prozessieren von Presenilin benötigt. Es ist nicht klar, ob Preseniline die Gamma-Sekretaseaktivität direkt regulieren, oder ob sie selbst Proteaseenzyme sind (Kopan und Gouate, Genes Dev 14, 2799). Die Gamma-Sekretaseaktivität könnte einen multimeren Komplex dieser Proteine umfassen (Yu et al, Nature 407, 48), aber es ist nicht bekannt, wie die Beziehung zwischen diesen Proteinen die Sekretaseaktivität beeinflusst.
Aph-1 und Pen-2 wurden kürzlich in einem Screen für Presenilinverstärker („Pen") in C. elegans kloniert, und es wurde gezeigt, dass sie genetisch mit Aph-2 (Nicastrin) interagieren. Defekte in Aph-1 beeinflussen Notch-Signalprozesse und Nicastrin-Lokalisierung. Aph-1 und Pen-2 werden für Notch-Spaltung, Gamma-Sekretaseaktivität und die Akkumulierung des prozessierten Presenilins benötigt. Francis et al. klonierte die mutmaßlichen humanen Orthologe dieser Gene, Aph-1a, Aph-1b und Pen-2, und kürzlich klonierte Lee et al. ebenso die humanen Aph-1 cDNAs. Die exakten Komponenten des Gamma-Sekretasekomplexes sind nicht bekannt, aber diese zwei neuen Proteine könnten Komponenten oder akzessorische Faktoren des Komplexes sein und direkt mit Presenilin oder mit einem Presenilin/Nicastrin-Komplex interagieren. Nicastrin ist daher ein Mitglied des aktiven Gamma-Sekretasekomplexes, und es gibt jüngste Hinweise darauf, dass es die vollständig glykosylierte Form des Proteins ist, welche in diesem Komplex wichtig ist.
Fe65-ähnliches 2 (Fe65L2) ist ein Homolog des gut charakterisierten intrazellulären APP-interagierenden Adapterproteins Fe65 (Duilio A, Faraonio R, Minopoli G, Zambrano N, Russo T (1998). Fe65L2: a new member of the Fe65 Protein family interacting with the intracellular domain of the Alzheimer's beta-amyloid precursor Protein. Biochem J. 330 (Pt 1): 513–9.). Es ist im Gehirn stark exprimiert und interagiert mit APP durch seine C-terminale PTB-Domäne (Tanahashi H, Tabira T (1999) Molecular cloning of human Fe65L2 and its interaction with the Alzheimer's beta-amyloid precursor Protein. Neurosci Lett. 261 (3): 143–6.). Von Fe65L2 wurde gezeigt, dass es in den Nucleus translokalisiert, und dass es die Transkription reguliert (Bruni P, Minopoli G, Brancaccio T, Napolitano M, Faraonio R, Zambrano N, Hansen U, Russo T (2002). Fe65, a ligand of the Alzheimer's beta-amyloid precursor Protein, blocks cell cycle Progression by down-regulating thymidylate synthase expression. J. Biol. Chem. 277(38): 35481–8.), welches nahe legt, dass es in der "down-stream"-Signalfunktion von APP involviert ist. Überexpression von Fe65L2 unterstützt die Sekretion/Generierung von Abeta in vitro (Tanahashi H, Tabira T (2002) Characterization of an amyloid precursor Protein-binding Protein Fe65L2 and its novel isoforms lacking phosphotyrosine-interaction domains. Biochem J. 367(Pt 3): 687–95.).
Die Beta-Sekretase (BACE)-Aktivität spaltet APP in der Ectodomäne, was in dem Freisetzen des sekretierten, löslichen APPb und in seinem 99-Reste umfassenden C-terminalen Transmembranfragment (APP-C99) resultiert. Vasser et al. (Science 286, 735–741) klonierte eine Transmembranasparaginprotease, welche die Charakteristika der postulierten Beta-Sekretase von APP besaß, die sie BACE1 nannten. Gehirn und primäre kortikale Kulturen von BACE1-Knockout-Mäusen zeigten keine detektierbare Beta-Sekretaseaktivität, und primäre kortikale Kulturen von BACE-Knockout-Mäusen erzeugten sehr viel weniger Amyloid-beta aus APP. Dieses legt nahe, dass BACE1, eher als sein Paralog BACE2, die Haupt-beta-Sekretase für APP darstellt. BACE1 ist ein Protein aus 501 Aminosäuren, welches ein 21-Aminosäure umfassendes Signalpeptid enthält, das von einer Proproteindomäne umspannend Aminosäure 22 bis 45 gefolgt wird. Es gibt alternativ gespleißte Formen, BACE-I-457 und BACE-I-476. Die luminale Domäne des gereiften Proteins wird von einer prognostizierten Transmembrandomäne und einem kurzen cytosolischen C-terminalen Schwanz aus 24 Aminosäuren gefolgt. BACE1 ist ein prognostiziertes Typ 1-Transmembranprotein mit einem aktiven Zentrum auf der luminalen Seite der Membran, wo Beta-Sekretase APP und mögliche bisher noch nicht identifizierte Substrate spaltet. Obwohl BACE1 klar ein Schlüsselenzym ist, welches für das Prozessieren von APP zu A-beta benötigt wird, legt ein jüngster Hinweise nahe, dass es noch zusätzliche potentielle Substrate und Funktionen von BACE1 gibt (J. Biol. Chem. 279, 10542–10550). Bis heute wurden keine BACE1-interagierenden Proteine mit regulatorischen oder modulierenden Funktionen beschrieben.
Wie oben erklärt wurde im Kontext der vorliegenden Erfindung überraschender Weise gefunden, dass GPR49 Teil der Proteinkomplexe ist, welche die proteolytische Prozessierung von APP regulieren, insbesondere durch Beta-Sekretase und/oder Gamma-Sekretaseaktivität. Daher moduliert der Inhibitor oder interagierende Moleküle in einer bevorzugten Ausführungsform die Aktivität von B-Sekretase und/oder Gamma-Sekretase.
In der Erfindung durchgehend schließt die Bezeichnung "Modulieren der Aktivität von Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase" ein, dass die Aktivität des Enzyms direkt oder indirekt moduliert wird. Dies bedeutet, dass der GPR49-Modulator entweder direkt an eins dieser Enzyme binden kann oder bevorzugterweise, dass er seinen Einfluss auf GPR49, welches im Gegenzug z. B. durch Protein-Proteininteraktionen oder durch Signaltransduktionen oder mittels kleiner Metabolite die Aktivität von jedem dieser Enzyme moduliert.
In der gesamten Erfindung ist es bevorzugt, dass der Beta-Sekretase-Modulator die Aktivität von Beta-Sekretase entweder vollständig oder teilweise inhibiert. In der gesamten Erfindung ist die am meisten bevorzugte funktionale Konsequenz eines GPR49-Modulators eine Reduktion in der Abeta-42-Generierung.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Modulieren der Aktivität von gamma-Sekretase und/oder beta-Sekretase, dass die Aktivität reduziert ist, so dass weniger oder gar kein Produkt gebildet wird, am stärksten bevorzugt, dass weniger oder kein Abeta-42 gebildet wird, (partielle oder vollständige Inhibition), oder dass das jeweilige Enzym ein unterschiedliches Produkt erzeugt (im Falle G-Sekretase z. B. Abeta-38 oder andere Abeta-Peptidspezies kürzerer Aminosäuresequenzen – anstelle von Abeta-42), oder dass die relativen Quantitäten oder Mengen der Produkte unterschiedlich sind (im Falle von Gamma-Sekretase z. B. das Verhältnis von Abeta-40 zu Abeta-42, welches verändert und vorzugsweise erniedrigt wird). Des Weiteren ist eingeschlossen, dass der Modulator entweder Gamma-Sekretase oder Beta-Sekretase oder die Aktivität beider Enzyme moduliert.
Im Hinblick auf den Modulator von Gamma-Sekretaseaktivität ist es bevorzugt, dass dieser Modulator die Gamma-Sekretaseaktivität inhibiert. Jedoch ist es ebenso bevorzugt, dass die Aktivität von Gamma-Sekretase in einer Art verändert ist, dass der Gesamtgehalt von Abetapeptidsorten unverändert ist, aber dass mehr Abeta-38 an Stelle von Abeta-42 produziert wird.
Gamma-Sekretaseaktivität kann z. B. durch Bestimmen der APP-Prozessierung, z. B durch Bestimmen der Mengen an produzierten Abeta-Peptidspezies, am wichtigsten der Mengen an Abeta-42, gemessen werden (siehe Abschnitt „Beispiele", infra).
Um BACE1-Aktivität zu messen, können die Veränderungen in dem Verhältnis zwischen alpha- und beta-C-terminalen APP-Fragmenten mittels Western Blotting analysiert werden (Blasko et al., J Neural Transm 111, 523); zusätzliche Beispiele für BACE1-Aktivitiätstests schließen die folgenden mit ein, sind jedoch nicht auf diese limitiert: Verwendung eines zyklisierten Enzymdonorpeptids, welches eine BACE1-Spaltstelle besitzt, um Beta-Galactosidase-Reporteraktivität zu rekonstituieren und zu messen (Naqvi et al., J Biomol Screen. 9, 398); Verwendung von gequenchten fluorimetrischen Peptidsubstraten und Fluoreszenzmessungen (Andrau et al., J. Biol Chem 278, 25859); Verwendung von zellbasierten Tests, die rekombinante chimäre Proteine, in denen ein Enzym (wie alkaline Phosphatase) über einen Bereich von Aminosäuren, der die BACE1-Erkennungssequenz enthält, an ein golgiständiges Protein gekoppelt ist (Oh et al., Anal Biochem, 323, 7); Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)- basierte Tests (Kennedy et al., Anal Biochen 319, 49); ein Zellwachstums-Selektionssystem in Hefe (Luthi et al., Biochim Biophys Acta 1620, 167).
Die neurodegenerative Krankheit ist vorzugsweise Alzheimer'sche Krankheit.
Gemäß der Erfindung wird der GPR-49-Inhibitor verwendet, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Daher stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die einem Subjekt in einer wirksamen Menge verabreicht werden können. In einem bevorzugten Aspekt ist das Therapeutikum im Wesentlichen aufgereinigt. Das Subjekt ist vorzugsweise ein Tier, einschließend aber nicht limitiert auf Tiere wie zum Beispiel Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde etc., und ist vorzugsweise ein Säugetier, und am stärksten bevorzugt ein Mensch. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Subjekt ein nicht-menschliches Säugetier.
Verschiedene Darreichungsformen sind bekannt und können benutzt werden, um ein Therapeutikum der Erfindung zu verabreichen, z. B. Verkapselung in Liposomen, Mikropartikel und Mikrokapseln: Verwendung von rekombinanten Zellen, die in der Lage sind, das Therapeutikum zu exprimieren, Verwendung von rezeptorvermittelter Endocytose (z. B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432); Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder eines anderen Vektors etc. Verfahren zur Einführung schließen ein, sind aber nicht limitiert auf intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Wege. Die Verbindungen können auf einem beliebigen geeigneten Weg verabreicht werden, z. B. durch Infusion, durch Bolusinjektion, durch Absorption, über epitheliale oder mucocutanöse Häute (z. B. orale, rektale oder intestinale Mucosa etc.) und können zusammen mit anderen biologisch aktiven Substanzen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Zudem kann es wünschenswert sein, die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in das zentrale Nervensystem mittels eines beliebigen geeigneten Wegs einzuführen, einschließlich intraventrikulärer und intrathekaler Injektion; intraventrikuläre Injektion kann mittels eines intraventrikulären Katheters, z. B. an ein Reservoir angebracht, wie beispielsweise ein Ommayareservoir, erleichtert werden. Ebenso kann die pulmonale Verabreichung z. B. durch Verwendung eines Inhalators oder Zerstäubers und mittels Formulierung mit einem aerosolierenden Mittel angewendet werden.
In einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung lokal in das Gebiet zu verabreichen, welches der Behandlung bedarf. Dies kann zum Beispiel, ist jedoch nicht darauf beschränkt, durch lokale Infusion während der Operation, topikale Anwendung, z. B. in Verbindung mit einem Wundverband nach der Operation, durch Injektion, durch die Verwendung eines Katheters, durch die Verwendung eines Zäpfchens oder durch die Verwendung eines Implantats erreicht werden, wobei besagtes Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gelatineartigen Material ist, einschließlich Membranen wie zum Beispiel sialastische Membranen oder Faserstoffen. In einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an der Stelle (oder der ursprünglichen Stelle) eines bösartigen Tumors oder eines neoplastischen oder präneoplastischen Gewebes erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum in einem Vesikel geliefert werden, insbesondere einem Liposom (Langer, 1990, Science 249: 1527–1533; Treat et al., 1989, in: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease und Cancer, Lopez-Berestein und Fidler, Hrsg., Liss, New York, Seiten 353–365; Lopez-Berestein, ebenda, Seiten 317–327; siehe allgemein ebenda).
In wieder einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum mittels eines kontrollierten Abgabesystems geliefert werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201–240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507–516; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574–579). In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball, Hrsg., Wiley, New York, 1984; Ranger und Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; Levy et al., 1985, Science 228: 190–192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351–356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 858–863). In wieder einer anderen Ausführungsform kann das kontrollierte Abgabesystem in die Nähe des therapeutischen Ziels, d. h. des Gehirns platziert werden, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosierung benötigt wird (z. B. Goodson, 1984, in: Medical Applications of Controlled Release, supra, Bd. 2, Seiten 115–138). Andere kontrollierbare Abgabesystem werden in dem Übersichtsartikel von Langer (1990, Science 249: 1527–1533) besprochen.
In einer spezifischen Ausführungsform, in der das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, vorzugsweise kodierend für ein Proteintherapeutikum, kann die Nukleinsäure in vivo verabreicht werden, um die Expression seines kodierten Proteins zu begünstigen, indem man es als Teil eines geeigneten Nukleinsäure-Expressionsvektors konstruiert und es so verabreicht, dass es intrazellulär wird, z. B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors ( US-Patent Nr. 4,980,286 ), oder mittels direkter Injektion oder durch Verwendung von Mikropartikelbombardement (z. B. einer Genkanone; Biolistic Dupont) oder durch sein Ummanteln mit Lipiden, Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch seine Verabreichung in Verbindung mit einem homeoboxähnlichen Peptid, von dem bekannt ist, dass es in den Kern geht (z. B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864–1868) etc. Alternativ dazu kann ein Nukleinsäuretherapeutikum intrazellulär eingeführt werden und durch homologe Rekombination innerhalb einer Wirtszell-DNA zur Expression eingebaut werden.
Im Allgemeinen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff. In einer spezifischen Ausführungsform bezeichnet der Begriff „pharmazeutisch akzeptabel" anerkannt durch eine Kontrollbehörde des Bundes oder einer Landesregierung oder in dem US-Arzneibuch oder anderen allgemein anerkannten Arzneibüchern zur Verwendung in Tieren, und insbesondere im Menschen, aufgeführt. Die Bezeichnung „Trägerstoff" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Arzneimittelträger oder ein Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Trägerstoffe können sterile Lösungen wie z. B. Wasser und Öle, einschließlich solcher aus Erdöl, solche tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft sein, einschließlich, aber nicht limitiert auf Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und Ähnliche. Wasser ist ein bevorzugter Trägerstoff, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung oral verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose sind bevorzugte Trägerstoffe, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und lösliche Dextrose und Glycerinlösungen werden bevorzugt als flüssige Träger für injizierbare Lösungen angewandt. Geeignete pharmazeutische Arzneimittelträger schließen Stärke, Glukose, Lactose, Sucrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silikagel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und Ähnliche ein. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch geringe Mengen an nässenden oder emulgierenden Substanzen oder pH-puffernden Substanzen enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pudern, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung und Ähnliche annehmen. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägerstoffen wie zum Beispiel Triglyceriden formuliert werden. Orale Formulierung kann Standardträgerstoffe wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsacharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat, etc. von pharmazeutischem Reinheitsgrads einschließen. Beispiele für geeignete pharmazeutische Trägerstoffe sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen beinhalten eine therapeutisch wirksame Mengen des Therapeutikums, vorzugsweise in aufgereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Menge an Trägerstoff, so dass die Form für geeignete Verabreichungsform am Patienten bereitstellt wird. Die Formulierung sollte sich der Art und Weise der Verabreichungsform anpassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß Routinevorgehensweisen als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die an die intravenöse Verabreichensform am Menschen angepasst ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für intravenöses Verabreichen Lösungen in sterilen isotonischen wässrigen Puffern. Gegebenenfalls kann die Zusammensetzung ebenso ein lösendes Mittel oder ein lokales Anästhetikum wie Lidocain miteinschließen, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Im Allgemeinen werden die Inhaltsstoffe entweder separat oder zusammengemischt in einheitlicher Dosierungsform, zum Beispiel als ein trockenlyophilisiertes Puder oder ein wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch abgedichteten Behälter wie beispielsweise einer Ampulle oder Sachette verabreicht, welches die Menge an aktiver Substanz aufzeigt. Wo die Zusammensetzung als Infusion verabreicht wird, kann sie auch mit einer Infusionsflasche verabreicht werden, die steriles Wasser oder eine sterile Salzlösung pharmazeutischen Reinheitsgrads enthält. Wo die Zusammensetzung mittels Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle an sterilem Wasser oder einer sterilen Salzlösung zur Injektion bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung vermischt werden können.
Die Therapeutika der Erfindung können neutral oder als Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen solche mit ein, die mit freien Carboxylgruppen gebildet sind, wie zum Beispiel solche, die von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure und Weinsäure etc., abgeleitet sind, solche, die mit freien Aminogruppen gebildet sind, wie zum Beispiel solche, die von Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain, etc. abgeleitet sind, und solche, die von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, und Eisenhydroxiden etc. abgeleitet sind.
Die Menge des Therapeutikums der Erfindung, die für die Behandlung einer bestimmten Krankheit oder eines Zustands wirksam ist, hängt von der Natur der Krankheit oder des Zustandes ab und kann mittels klinischer Standardtechniken bestimmt werden. Zudem können In-vitro-Tests optional angewandt werden, um die optimalen Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die präzise Dosierung, die in der Formulierung anzuwenden ist, ist ebenso von der Verabreichungsform und der Schwere der Krankheit oder des Zustandes abhängig, und sollte in Übereinstimmung mit dem Urteil eines Arztes und den Umständen eines jeden Patienten entsprechend entschieden werden. Geeignete Dosierungsbereiche für intravenöse Verabreichung sind jedoch im Allgemeinen etwa 20–500 Mikrogramm der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche für intranasale Verabreichung sind im Allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosierungen können ausgehend von Dosis-Wirkungskurven, abgeleitet von In-vitro- oder tierischen Modelltestsystemen, extrapoliert werden.
Zäpfchen enthalten in der Regel aktive Bestandteile im Bereich von 0,5% bis 10% pro Gewicht; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10% bis 95% aktive Bestandteile.
Die Erfindung stellt ebenso eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, der einen oder mehrere Behälter gefüllt mit einem oder mehreren Bestandteilen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfasst. Wahlweise kann (einem) solchen Behälter(n) ein Hinweiszettel in einer von einer staatlichen Behörde vorgeschriebenen Form beiliegen, welche die Produktion, Verwendung oder Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten reguliert, wobei der Hinweiszettel die Genehmigung der Produktion, Verwendung oder Verkauf zur humane Verabreichung durch diese Behörde wiedergibt.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können ebenfalls Expressionsvektoren enthalten, die die essentiellen Komponenten der komplexen Maschinerie kodieren, deren Komponenten, nachdem sie exprimiert worden sind, rekonstituiert werden können, um einen biologisch aktiven Komplex zu bilden. Solch ein Kit enthält vorzugsweise ebenfalls die benötigten Puffer und Reagenzien. Gegebenenfalls können (einem) solchen Behälter(n) Anleitungen zur Verwendung des Kits und/oder ein Hinweiszettel in einer von einer staatlichen Behörde vorgeschriebenen Form beiliegen, welche die Produktion, Verwendung oder Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten reguliert, wobei dieser Hinweiszettel die Genehmigung der Produktion, Verwendung oder Verkauf zur humanen Verabreichung durch die Behörde wiedergibt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung, wobei eine wirksame Menge eines GPR49-interagierenden Moleküls oder Inhibitors oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung einem Subjekt verabreicht wird, welches an einer neurodegenerativen Erkrankung, vorzugsweise der Alzheimer'schen Erkrankung, leidet.
Hinsichtlich dieses Verfahren der Erfindung treffen alle oben angegebenen Ausführungsformen für die erfindungsgemäße Verwendung zu.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Identifizierung eines Gamma-Sekretase-Modulators und/oder Beta-Sekretase-Modulators, umfassend die folgenden Schritte:

a. Identifizieren eines mit GPR49-interagierenden Moleküls durch Bestimmen, ob eine bestimmte Testverbindung ein mit GPR49 interagierendes Molekül ist,
b. Bestimmen, ob das GPR49-interagierende Molekül von Schritt a) in der Lage ist, die Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase-Aktivität zu modulieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt a) die Testverbindung mit GPR49 in Kontakt gebracht und die Interaktion von GPR49 mit der Testverbindung bestimmt. Vorzugsweise wird gemessen, ob das Kandidatenmolekül an GPR49 gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das in Schritt a) identifizierte GPR49-interagierende Molekül zuerst einem GPR49-Aktivitätstest wie oben beschrieben unterzogen (siehe ebenso Beispiel 3), um herauszufinden, ob es GPR49-Aktivität moduliert oder vorzugsweise inhibiert, und es wird dann dem Verfahrensschritt b) unterzogen (Test auf Abetasenkende Wirkung).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise im Kontext eines Hochdurchsatz-Tests durchgeführt. Solche Tests sind dem Fachmann bekannt.
Test- oder Kandidatenmoleküle, die gescreent werden sollen, können als Mischung einer begrenzten Anzahl spezifizierter Verbindungen bereitgestellt werden oder als Verbindungsbibliotheken, Peptidbibliotheken und Ähnliches. Substanzen/Moleküle, die gescreent werden sollen, können ebenso alle Formen von Antiseren, Antisense-Nukleinsäuren, etc. einschließen, die die Komplexaktivität oder -bildung modulieren können. Exemplarische Beispielsmoleküle und Bibliotheken zum Screenen sind nachfolgend beschrieben.
Das Screenen der Bibliotheken kann durch jedes der verschiedenen, allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden. Siehe z. B. die folgenden Referenzen, die das Screenen von Peptid-Bibliotheken offenbaren: Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215–218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386–390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393–5397; Yu et al., 1994, Cell 76: 933–945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577–580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564–566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988–6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850–852; U. S. Patent Nr. 5,096,815 , U. S. Patent Nr. 5,223,409 , und U. S. Patent Nr. 5,198,346 , alle von Ladner et al.; Rebar und Pabo, 1993, Science 263: 671–673; und die internationale Patentanmeldung Nr. WO 94/18318 .
In einer speziellen Ausführungsform kann das Screenen durch Inkontaktbringen der Bibliotheksmitglieder mit einem auf einer festen Phase immobilisierten GPR49 und durch Ernten dieser Bibliotheksmitglieder durchgeführt werden, die an das Protein binden (oder die Nukleinsäure oder Derivate kodieren). Beispiele solcher Screeningverfahren, genannt „panning"-Techniken, sind anhand eines Beispiels in Parmley und Smith, 1988, Gene 73: 305–318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; und der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 94/18318 , sowie in den darin zitierten Referenzen beschrieben.
In einer spezifischen Ausführungsform werden GPR49-Fragmente und/oder Analoga, insbesondere Peptidomimetika auf ihre Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren für die Bildung des Komplexes von GPR49 mit anderen Proteinen, z. B. den in Tabelle 1 angegebenen Proteinen (Menge des Komplexes oder Zusammensetzungen des Komplexes) oder auf GPR49-Aktivität in der Zelle gescreent, die dadurch Komplex-Aktivität oder Bildung in der Zelle inhibieren.
In einer Ausführungsform können Substanzen, die GPR49-Aktivität oder GPR49-Proteinkomplexbildung modulieren (z. B. entgegenwirken oder verstärken), für die Verwendung eines Bindungsinhibitionstest gescreent werden, wobei Substanzen auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, die Bildung eines Komplexes unter wässrigen oder physiologischen Bindungsbedingungen zu modulieren, in denen Komplexbildung in der Abwesenheit der zu testenden Substanz erfolgt. Substanzen, die mit der Ausbildung der Komplexe interferieren, werden als Antagonisten der Komplexbildung identifiziert. Substanzen, die die Ausbildung der Komplexe unterstützen, werden als Agonisten der Komplexbildung identifiziert. Substanzen, die die Ausbildung der Komplexe vollständig blockieren, werden als Inhibitoren der Komplexbildung identifiziert.
Verfahren zum Screenen können ebenfalls das Markieren der Komponentenproteine des Komplexes mit Radioliganden einbeziehen (z. B. ¹²⁵I oder ³H), magnetische Liganden (z. B. paramagnetische Beads, die kovalent an Photobiotinacetat gekoppelt sind), Fluoreszenzliganden (z. B. Fluorescein oder Rhodamin), oder Enzymliganden (z. B. Luciferase oder β-Galactosidase). Der Reaktionspartner, der in Lösung bindet, kann dann durch eine oder mehrere Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, isoliert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Co-Immunopräzipitation der markierten Komplexuntereinheit unter Verwendung von Antiseren, die gegen unmarkierte Bindungspartner gerichtet sind (oder markierte Bindungspartner mit einem von dem unterscheidbaren Marker, der in einer zweiten markierten Komplexuntereinheit verwendet wird), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie und Dichtegradientenzentrifugation. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der markierte Bindungspartner ein kleines Fragment oder Peptidomimetikum, welches nicht durch einen kommerziell erhältlichen Filter zurückgehalten wird. Nach Bindung sind die markierten Populationen dann nicht mehr in der Lage, durch den Filter zu passieren, wodurch ein einfacher Test der Komplexbildung gegeben ist.
Verfahren, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, werden verwendet, um mindestens eines der Komponentenmitglieder des Komplexes zu markieren. Geeignete Markierungsverfahren schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf die Radiomarkierung durch Inkorporation von radiomarkierten Aminosäuren, z. B. ³H-Leucin oder ³⁵S-Methionin, das Radiomarkieren mittels post-translationaler Iodisierung mit ¹²⁵I oder ¹³¹I unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens, Bolton-Hunter-Reagenzien etc., oder das Markieren mit ³²P unter Verwendung von Phosphorylase und anorganisch radiomarkiertem Phosphor, Biotinmarkierung mit Photobiotinacetat und Sonnenlampenexposition etc. In den Fällen, wo eines der Mitglieder des Komplexes immobilisiert wird, z. B. wie oben stehend beschrieben, ist die freie Spezies markiert. Wo keine der Interaktionsspezies immobilisiert wird, kann jede mit einem unterscheidbaren Marker markiert werden, so dass die Isolierung der beiden Subpopulationen verfolgt werden kann, um eine akkuratere Quantifizierung zu ermöglichen, und die Bildung von homomeren gegenüber heteromeren Komplexen zu unterscheiden. Verfahren, die akzessorische Proteine verwenden, die an einen der modifizierten Interaktionspartner binden, um die Sensitivität der Detektion zu verstärken oder um die Stabilität des Komplexes zu erhöhen etc., werden bereitgestellt.
Typische Bindungsbedingungen sind, zum Beispiel, jedoch nicht limitiert darauf, in einer wässrigen Salzlösung von 10–250 ml NaCl, 5–50 mM Tris-HCl, pH 5–8, und 0,5% Triton X-100 oder ein anderes Detergenz, welches die Spezifität der Interaktion verstärkt. Metallchelatoren und/oder divalente Kationen können hinzugefügt werden, um das Binden zu verstärken und/oder die Proteolyse zu reduzieren. Die Reaktionstemperaturen können 4, 10, 15, 22, 25, 35 oder 42 Grad Celsius einschließen, und die Inkubationszeit ist typischerweise mindestens 15 Sekunden, jedoch werden längere Zeiten bevorzugt, um zu erlauben, dass sich ein Bindungsgleichgewicht einstellt. Besondere Komplexe können mittels routinemäßiger Proteinbindungstests untersucht werden, um die optimalen Bindungsbedingungen für reproduzierbares Binden zu ermitteln.
Die physikalischen Parameter der Komplexbildung können mittels Quantifizierung der Komplexbildung unter Verwendung von Testverfahren analysiert werden, die spezifisch für die verwendete Markierung sind, so z. B. Flüssig-Scintillationszählen der radioaktiven Detektion, Enzymaktivität für enzymmarkierte Untereinheiten etc. Die Reaktionsergebnisse werden dann unter Verwendung von Scarchard-Analyse, Hill-Analyse oder anderen Verfahren analysiert, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind (siehe z. B. Proteins, Structures, and Molecular Principles, 2. Ausgabe (1993) Creighton, Hrsg., W. H. Freeman and Company, New York).
In einem zweiten allgemeinen Ansatz der Bindungstests wird eine der Bindungsspezies auf einem Filter, in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte, in einem Probenröhrchen, auf einer chromatographischen Matrix etc. entweder kovalent oder nicht-kovalent immobilisiert. Proteine können unter Verwendung eines beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren, z. B., aber nicht limitiert auf das Verfahren von Kadonaga und Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889–5893, kovalent immobilisiert werden, so zum Beispiel durch Kopplung an ein Cyanogenbromid-derivatisiertes Substrat, wie CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Gegebenenfalls kann die Verwendung von Abstandshaltern die sterische Hinderung durch das Substrat verhindern. Nicht-kovalente Anheftung der Proteine an ein Substrat schließt, ist jedoch nicht limitiert auf das Anheften eines Proteins an eine geladene Oberfläche, das Binden mit spezifischen Antikörpern, das Binden an ein drittes unbeteiligtes interagierendes Protein, etc. ein.
Substrattests (einschließend Zellextrakte oder einen Bibliothekspool) zur Kompetition der Bindung eines Komplexmitgliedes (oder eines Derivats davon) mit einem anderen Mitglied des Komplexes, markiert durch ein beliebiges Mittel (z. B. die oben beschriebenen Mittel) werden bereitgestellt, um nach Kompetitoren oder Verstärkern der Komplexbildung zu screenen.
In spezifischen Ausführungsformen sind Blockierungssubstanzen, um nicht-spezifisches Binden von Reagenzien an anderen Proteinkomponenten oder Absoptionsverluste der Reagenzien an die Kunststoffe, die Immobilisierungsmatrizen etc. zu verhindern, in die Testmischungen miteinbezogen. Blockierungssubstanzen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Rinderserumalbumin, Kasein, fettfreie Trockenmilch, Denhardt's Reagens, Ficoll, Polyvinylpyrrolidin, nicht-ionische Detergenzien (NP40, Triton X-100, Tween 20, Tween 80 etc.), ionische Detergenzien (z. B. SDS, LDS etc.), Polyethylenglykol etc. Geeignete Blockierungssubstrat-Konzentrationen erlauben die Komplexbildung.
Nachdem das Binden erfolgt ist, wird nicht-gebundenes, markiertes Protein aus dem Überstand entfernt, und wird das immobilisierte Protein, welches jegliches gebundenes, markiertes Protein zurückbehält, intensiv gewaschen. Die Menge an gebundener Markierung wird dann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren quantifiziert, um die Markierung wie oben stehend beschrieben zu detektieren.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform kann das Screenen auf Modulatoren der Proteinkomplexe/des Proteins, wie hierin bereitgestellt, durch Anheften solcher und/oder der hierin bereitgestellten Antikörper an einen festen Träger ausgeführt werden.
Die Herstellung solch eines Arrays, der unterschiedliche Typen an Proteinen, einschließlich Antikörpern, umfasst, ist im Stand der Technik gut bekannt und für einen Fachmann offensichtlich (siehe z. B. Ekins et al., 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7: 155–168; Mitchell et al. 2002, Nature Biotechnol. 20: 225–229; Petricoin et al., 2002, Lancet 359: 572–577; Templin et al., 2001, Trends Biotechnol. 20: 160–166; Wilson und Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 81–85; Lee et al., 2002 Science 295: 1702–1705; MacBeath und Schreiber, 2000, Science 289: 1760; Blawas und Reichert, 1998, Biomaterials 19: 595; Kane et al., 1999, Biomaterials 20: 2363; Chen et al., 1997, Science 276: 1425; Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 309–314; Mahler et al., 1997, Immunotechnology 3: 31–43; Roberts et al., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268–273; Nord et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 772–777; Nord et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268: 4269-4277; Brody und Gold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5–13; Karlstroem und Nygren, 2001, Anal. Biochem. 295: 22–30; Nelson et al., 2000, Electrophoresis 21: 1155–1163; Honore et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3: 265–274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2: 145–152, Figeys und Pinto, 2001, Electrophoresis 2: 208–216 und Referenzen in den hier aufgelisteten Publikationen).
Proteine oder Proteinkomplexe können durch verschiedene Mittel mit einem Array verknüpft werden, wie es für einen Fachmann offensichtlich ist. Komplexe können zum Beispiel an einen Array gekoppelt werden über ein TAP-Tag (wie in WO/0009716 und in Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 10: 1030–1032 beschrieben) nach einem Aufreinigungsschritt oder durch andere geeignete Aufreinigungsschemata, wie es für einen Fachmann offensichtlich ist.
Wahlweise können die Proteine des Komplexes quervernetzt werden, um die Stabilität des Komplexes zu verstärken. Unterschiedliche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt, um Proteine querzuvernetzen. Reaktive Endgruppen von quervernetzten Substanzen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf -COOH, -SH, -NH₂ oder N-Oxysuccinamat.
Die Distanzhalter der Quervernetzungssubstanzen sollten im Hinblick auf die Größe des querzuvernetzenden Komplexes ausgewählt werden. Für kleine Proteinkomplexe, die nur ein paar Proteine umfassen, sind relativ kurze Distanzhalter bevorzugt, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass separate Komplexe in dem Reaktionsgemisch quervernetzt werden. Für größere Proteinkomplexe wird die zusätzliche Verwendung von langen Distanzhaltern bevorzugt, um das Quervernetzen zwischen Proteinen innerhalb eines Komplexes zu erleichtern.
Es wird bevorzugt, die Erfolgsrate des Quervernetzens vor dem Koppeln des Komplexes an den Träger zu überprüfen.
Wie es für einen Fachmann offensichtlich ist, ist die optimale Rate des Quervernetzens von Fall zu Fall zu bestimmen. Dies kann mittels Verfahren erreicht werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, und von denen ein paar exemplarisch nachstehend beschrieben sind.
Eine ausreichende Rate des Quervernetzens kann z. B. durch Analysieren des quervernetzten Komplexes im Vergleich zum nicht-quervernetzten Komplex auf einem denaturierenden Proteingel analysiert werden.
Falls das Quervernetzen erfolgreich durchgeführt wurde, ist zu erwarten, dass die Proteine des Komplexes in der gleichen Spur gefunden werden, während von den Proteinen des nicht-quervernetzten Komplexes erwartet wird, dass sie entsprechend ihrer individuellen Charakteristika aufgetrennt sind. Wahlweise kann die Anwesenheit aller Proteine des Komplexes weiter mittels Peptidsequenzierung der Proteine in der jeweiligen Bande unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren wie Massenspektrometrie und/oder Edman-Abbau geprüft werden.
Zudem sollte eine Quervernetzungsrate verhindert werden, die zu hoch ist. Falls das Quervernetzen zu intensiv durchgeführt wurde, wird es eine steigende Menge an Quervernetzung des einzelnen Proteinkomplexes geben, was möglicherweise mit dem Screenen auf potentielle Bindungspartner und/oder Modulatoren etc. unter Verwendung der Arrays interferiert.
Die Anwesenheit solcher Strukturen kann mittels im Stand der Technik gut bekannter Verfahren bestimmt werden und schließt z. B. Gelfiltrationsexperimente mit ein, in denen die Gelfiltrationsprofillösungen, die quervernetzte Komplexe enthalten, mit nicht-quervernetzten Komplexen verglichen werden.
Gegebenenfalls können funktionelle Tests, wie sie dem Fachmann ersichtlich und von denen einige hier exemplarisch bereitgestellt sind, durchgeführt werden, um die Integrität des Komplexes zu überprüfen.
Alternativ dazu können Proteine oder das Protein als ein einzelnes Fusionsprotein exprimiert und an eine Matrix gekoppelt werden, wie es dem Fachmann offenkundig ist.
Gegebenenfalls kann das Koppeln des Komplexes oder der Proteine oder der Antikörper, wie oben stehend beschrieben, weiter überprüft werden mittels verschiedener Verfahren, die dem Fachmann offenkundig sind. Diese schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Oberflächenplasmonresonanz (siehe z. B. McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 572–577; Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19: 217–222; Weinberger et al., 2000, 1: 395–416; Pearson et al., 2000, Ann. Clin. Biochem. 37: 119–145; Vely et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 313–321; Slepak, 2000, J. Mol Recognit. 13: 20–26).
Beispielhafte Tests, die für das Messen der Abeta-40- und Abeta-42-Peptidproduktion mittels ELISA brauchbar sind, schließen solche wie in Vassar R et al., 1999, Science, 286: 735–41 mit ein, sind jedoch nicht auf diese limitiert.
Beispielhafte Test, die für das Messen der C-terminalen APP-Fragmente in Zelllinien oder transgenen Tieren mittels Western Blot brauchbar sind, schließen solche mit ein, die in in Yan R et al., 1999, Nature, 402: 533–7 beschrieben sind, sind jedoch nicht auf diese limitiert.
Beispielhafte Tests, die für das Messen der proteolytischen Aktivität der Beta- oder Gamma-Sekretasen gegenüber bakteriell exprimierten APP-Fragmenten in vitro brauchbar sind (z. B. durch Modifizieren der Expression eines oder mehrerer interagierender Proteine in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das/die interagierende(n) Protein(e) des BACE1-Komplexes kodieren, schließen solche mit ein, die in Tian G et al., 2002, J Biol Chem, 277: 31499–505 beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf limitiert.
Beispielhafte Tests für das Messen der Transaktivierung des Gal4-gesteuerten Reportergens (z. B. durch Modifizieren der Expression eines oder mehrerer interagierender Proteine in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das/die interagierende(n) Protein(e) des BACE1-Komplexes kodieren, schließen solche mit ein, die in Cao X et al., 2001, Science, 293: 115–20 beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf limitiert.
Jegliches, im Stand der Technik bekanntes Molekül kann auf seine Fähigkeit hin getestet werden, ein interagierendes Molekül oder ein Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung zu sein. Kandidatenmoleküle können direkt für eine Zelle bereitgestellt werden, die die GPR49-Komplexmaschinerie exprimiert, oder im Falle von Kandidatenproteinen können diese durch Bereitstellen ihrer kodierenden Nukleinsäuren unter Bedingungen, in denen die Nukleinsäuren rekombinant exprimiert werden, um das Kandidatenprotein zu erzeugen, bereitgestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gut geeignet, um chemische Bibliotheken an Molekülen zu screenen, welche die Menge an, die Aktivität von, oder die Proteinkomponentenzusammensetzung des Komplexes modulieren, z. B. inhibieren, antagonisieren oder agonisieren. Die chemischen Bibliotheken können Peptidbibliotheken, Peptidomimetik-Bibliotheken, chemisch synthetisierte Bibliotheken, rekombinante Bibliotheken, z. B. Phagen-Display-Bibliotheken, und auf In-vitro-Translation-basierende Bibliotheken, andere nicht-peptidsynthetische, organische Bibliotheken, etc. sein.
Beispielhafte Bibliotheken sind von mehreren Quellen kommerziell erhältlich (ArQule, Tripos/PanLabs, ChemDesign, Pharmaceopoeia). In manchen Fällen sind diese chemischen Bibliotheken unter Verwendung von kombinatorischen Strategien generiert, die die Identität eines jeden Bibliotheksmitglieds auf einem Substrat kodieren, mit welcher die Mitgliedskomponente verknüpft ist, so dass ein direktes und sofortiges Identifizieren des Moleküls erlaubt wird, welches ein wirksamer Modulator ist. Somit spezifiziert die Position auf einer Platte einer Komponente in vielen kombinatorischen Verfahren die Komponentenkomposition. Ebenso kann in einem Beispiel eine einzige Plattenposition 1–20 Chemikalien enthalten, die durch das Verabreichen in eine Vertiefung, welche Interaktionspartner von Interesse enthält, gescreent werden können. So können immer kleinere Pools von interagierenden Paaren auf Modulationsaktivität hin untersucht werden, falls Modulation überhaupt detektiert wird. Mittels solcher Verfahren können viele Kandidatenmoleküle gescreent werden.
Viele unterschiedliche, für die Verwendung geeignete Bibliotheken sind im Stand der Technik bekannt und können verwendet werden, um Verbindungen bereitzustellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung getestet werden. Alternativ dazu können Bibliotheken unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert werden. Chemische (synthetische) Bibliotheken, rekombinante Expressionsbibliotheken oder Polysom-basierte Bibliotheken sind exemplarische Varianten von Bibliotheken, die verwendet werden können.
Die Bibliotheken können starr oder halbstarr (mit einem Grad an struktureller Starrheit) oder linear oder nichtstarr sein. Die Bibliothek kann eine cDNA oder eine genomische Expressionsbibliothek, eine randomisierte Peptidexpressionsbibliothek oder eine chemisch synthetisierte randomisierte Peptidbibliothek oder eine Nicht-Peptid-Bibliothek sein. Expressionsbibliotheken werden in die Zellen eingeführt, in denen der Test stattfindet, wo die Nukleinsäuren der Bibliothek exprimiert werden, um ihre kodierenden Proteine zu exprimieren.
In einer Ausführungsform können Peptid-Bibliotheken, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Bibliotheken sein, die chemisch in vitro synthetisiert werden. Beispiele solcher Bibliotheken sind in Houghten et al., 1991, Nature 354: 84–86 gegeben, welches die Mischungen an freien Hexapeptiden beschreibt, in denen die ersten und die zweiten Reste jedes Peptids individuell und spezifisch definiert sind; Lam et al., 1991, Nature 354: 82–84, beschreibt einen „Ein Bead, ein Peptid"-Ansatz, in dem ein Festphasen-Teilungs-Syntheseschema eine Bibliothek an Peptiden erzeugte, in der jeder Bead in der Sammlung auf einer einzigen, zufallsbedingten Sequenz an Aminosäureresten immobilisiert wurde; Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709–710, worin Teilungssynthese und T-Bag-Syntheseverfahren beschrieben sind; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233–1251. Einfach als weitere Beispiele kann eine kombinatorische Bibliothek gemäß den Verfahren von Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922–10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422–11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614–1618; oder Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712 für die Verwendung hergestellt werden. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/20242 und Brenner und Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381–5383 beschreiben "kodierte kombinatorische chemische Bibliotheken", die Oligonukleotid-Identifikationsmerkmale für jedes der chemischen Polymerbibliotheksmitglieder enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gescreente Bibliothek eine biologische Expressionsbibliothek, die eine randomisierte Peptidphagen-Display-Bibliothek ist, wo randomisierte Peptide (z. B. durch den Besitz von Disulfidbrücken) eingeschränkt sind.
Ferner können im Allgemeinen strukturell eingeschränkte organische Diversitätsbibliotheken (z. B. Nicht-Peptide) verwendet werden. Beispielsweise kann eine Benzodiazepin-Bibliothek (siehe z. B. Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708–4712) verwendet werden.
Konformativ eingeschränkte Bibliotheken, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf solche, die invariante Cysteinreste enthalten, die in einer oxidierenden Umgebung durch Disulfidbrücken quervernetzen, um Cystine zu bilden, modifizierte Peptide (z. B. inkorporierendes Fluor, Metalle, Isotopenmarkierungen, sind phosphoryliert, etc.), Peptide, die ein oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, Nicht-Peptid-Strukturen und Peptide, die einen signifikanten Anteil an Carboxyglutamatsäure enthalten.
Bibliotheken von Nicht-Peptiden, z. B. Peptid-Derivaten (zum Beispiel solche, die eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten) können ebenso verwendet werden. Ein Beispiel dafür sind Peptoid-Bibliotheken (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367–9371). Peptoide sind Polymere von nicht natürlichen Aminosäuren, die natürliche vorkommende Seitenketten haben, welche nicht an Alpha-Carbon, sondern am Aminostickstoff des Rückgrats angebracht sind. Da Peptoide von humanen Verdauungsenzymen nicht einfach abgebaut werden, sind sie vorteilhafterweise einfacher an die Verwendung von Arzneimitteln anpassbar. Ein anderes Beispiel einer Bibliothek, die verwendet werden kann, in der die Amid-Funktionalitäten der Peptide permethyliert wurden, um eine chemisch transformierte kombinatorische Bibliothek zu generieren, ist von Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USa 91: 11138–11142 beschrieben.
Die Mitglieder von Peptidbibliotheken, die gemäß der Erfindung gescreent werden können, sind nicht darauf limitiert, die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren zu enthalten. Inbesondere erlauben chemisch synthetisierte Bibliotheken und Polysom-basierte Bibliotheken die Verwendung von Aminosäuren zusätzlich zu den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (durch ihre Aufnahme in den Vorläuferpool von Aminosäuren, die in der Herstellung der Bibliothek verwendet werden). In spezifischen Ausführungsformen enthalten die Bibliotheksmitglieder eine oder mehrere nicht-natürliche oder nicht-klassische Aminosäuren oder cyclische Peptide. Nicht klassische Aminosäuren schließen ein, sind jedoch nicht auf diese limitiert: die D-Isomere der gewöhnlichen Aminosäuren, Aminoisobutylsäure, 4-Aminobutylsäure, Abu, 2-Aminobutylsäure; -Abu, -Ahx, 6-Aminohexanoidsäure; Aib, 2-Aminoisobutyrylsäure; 2-Aminopropionsäure; Omithin; Norleucin; Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren wie β-Methylaminosäuren, C-Methylaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Fluoraminosäuren und Aminosäuren-Analoga im Allgemeinen. Des Weiteren kann die Aminosäure D (rechtsdrehend) oder L (linksdrehend) sein.
In einer spezifischen Ausführungsform werden Fragmente und/oder Analoga der Komplexe der Erfindung, oder Proteinkomponenten davon, speziell Peptidomimetika, auf Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Komplex-Aktivität oder Bildung hin gescreent.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann kombinatorische Chemie verwendet werden, um Modulatoren von Komplexen zu identifizieren. Kombinatorische Chemie ist in der Lage, Bibliotheken zu schaffen, die Hunderte bis Tausende von Verbindungen enthalten, von denen viele strukturell ähnlich sein können. Während Hochdurchsatz-Screeningprogramme in der Lage sind, diese riesigen Bibliotheken auf Affinität für bekannte Zielverbindungen zu screenen, wurden neue Ansätze entwickelt, die Bibliotheken von kleineren Dimensionen verwirklichen, die jedoch maximale chemische Diversität bereitstellen (siehe z. B. Matter, 1997, J. Med. Chem. 40: 1219–1229).
Ein Verfahren der kombinatorischen Chemie, „affinity fingerprinting", wurde bisher verwendet, um eine bestimmte Bibliothek an kleinen Molekülen auf Bindungsaffinitäten für ein definiertes Panel an Proteinen zu testen. Die Fingerabdrücke, die durch den Screen erhalten wurden, werden verwendet, um die Affinität eines individuellen Bibliotheksmitglieds gegebüber anderen Proteinen oder Rezeptoren von Interesse vorauszusagen (in der vorliegenden Erfindung, die Proteinkomplexe der vorliegenden Erfindung oder Proteinkomponenten davon). Die Fingerabdrücke werden mit den Fingerabdrücken verglichen, die von anderen Verbindungen erhalten wurden, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Protein von Interesse interagieren, um vorherzusagen, ob die Verbindung der Bibliothek möglicherweise ähnlich reagiert. Zum Beispiel könnten so, eher als Testen jedes Liganden in einer großen Bibliothek auf Interaktion mit einem Komplex oder einer Proteinkomponente, nur solche Liganden getestet werden, die einen ähnlichen Fingerabdruck wie andere Komponenten haben, von denen bekannt ist, dass sie Aktivität besitzen. (Siehe z. B. Kauvar, et al., 1995, Chem. Biol. 2: 107–118; Kauvar, 1995, Affinity fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International. 8: 25–28; und Kauvar, Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunoassay, Kurtz, Stanker und Skerritt (Hrsg.), 1995, ADAC: Washington, D. C., 305–312).
Kay et al. (1993, Gene 128: 59–65) offenbarten ein Verfahren zum Konstruieren von Peptidbibliotheken, die Peptide von vollständig randomisierter Sequenz kodieren, welche länger sind als jene der früheren herkömmliche Bibliotheken. Die in Kay et al. offenbarten Bibliotheken kodieren vollständig synthetisch randomisierte Peptide von mehr als etwa 20 Aminosäuren Länge. Solche Bibliotheken können vorteilhafterweise gescreent werden, um Komplexmodulatoren zu identifizieren. (Siehe auch US-Patent Nr. 5,498,538 vom 12. März 1996; und PCT-Publikationsnr. WO 94/18318 vom 18. August 1994).
Eine umfassende Übersicht der verschiedenen Peptid-Bibliothekstypen kann in Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233–1251 gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert die Interaktion der Testverbindung mit GPR49 in einer Inhibition der GPR49-Aktivität.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase gemessen, APP zu spalten. Dies kann wie oben stehend beschrieben gemessen werden. Des Weiteren beschreibt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, möglicherweise Alzheimer'sche Erkrankung, umfassend die folgenden Schritte:

a) Identifizieren eines Gamma-Sekretase-Modulators und/oder Beta-Sekretase-Modulators, vorzugsweise Inhibitors, gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
b) Formulieren des Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase-Modulators, vorzugsweise Inhibitors, zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

Hinsichtlich der pharmazeutische Zusammensetzung treffen alle oben genannten Ausführungsformen ebenso hier zu.
Dieses Verfahren kann weiterhin den Schritt des Mischens des identifizierten Moleküls mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff wie oben stehend erklärt umfassen.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen wie oben definierten GPR49-Inhibitor umfasst.
Des Weiteren beschreibt die Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mittels des oben genannten Verfahrens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erhältlich ist.
Die Erfindung beschreibt auch die pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben für die Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, wie zum Beispiel der Alzheimer'schen Erkrankung und verwandter neurodegenerativer Funktionsstörungen.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Behandeln oder zum Vorbeugen einer neurodegenerativen Erkrankung, vorzugsweise der Alzheimer'schen Erkrankung, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Subjekt wie oben beschrieben umfasst, welches eine solche Behandlung oder Prävention benötigt.
Im Hinblick auf dieses Verfahren treffen alle Ausführungsformen wie oben beschrieben auch auf die Verwendung der Erfindung zu.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines GPR49-Inhibitors wie oben verwendet zur Modulation, vorzugsweise Inhibition von Beta-Sekretase und/oder Gamma-Sekretase-Aktivität in vitro. Zum Beispiel ist in der vorliegenden Erfindung umfasst, Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretase-Aktivität in Zellkulturen durch das GPR49-interagierende Molekül zu modulieren, vorzugsweise zu inhibieren. Alle Ausführungsformen hinsichtlich des GPR49-Inhibitor wie oben beschrieben treffen auch auf die Verwendung der Erfindung zu.
Die folgenden Beispiele beschreiben den Gegenstand der Erfindung mehr im Detail.
Beispiel 1
Die TAP-Technologie, die in EP 1 105 508 B1 bzw. in Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 17: 1030–1032 ausführlicher beschrieben ist, wurde verwendet und wie nachfolgend beschrieben an die Proteinaufreinigung weiter angepasst. Proteine wurden mittels Massenspektrometrie, wie weiter nachfolgend beschrieben, identifiziert.
GPR49 wurde als Mitglied von Proteinkomplexen mit den TAP-Technologie-Eingangsmolekülen Aph1a, APP-C99, BACE1 und Fe65L2 (1) identifiziert.
Teil 1: Konstruktion des TAP-markierten Köderproteins ("bait")
Die cDNAs, die den kompletten ORF kodieren, wurden mittels RT-PCR erhalten. Gesamt-RNA wurde aus geeigneten Zelllinien unter Verwendung des RNeasy-Mini-Kits (Qiagen) hergestellt. Sowohl die cDNA-Synthese als auch die PCR wurden mit dem SUPERSCRIPT One-Step RT-PCR for long templates Kit (Life Technologies) unter Verwendung von genspezifischen Primern durchgeführt. Nach 35–40 Amplifikationszyklen wurden die PCR-Produkte mit der erwarteten Länge mit dem MinElute PCR Purification Kit (Qiagen) gelgereinigt und gegebenenfalls zur weiteren Amplifkation verwendet. Gering abundante RNAs wurden durch verschachtelte PCR vor Gelaufreinigung amplifiziert. Restriktionsschnittstellen für NotI wurden an die PCR-Primer angeheftet, um das Subklonieren der amplifizierten cDNAs in die retroviralen Vektoren pIE94-N/C-TAP zu erlauben, wodurch N- oder C-terminale Fusionen mit dem TAP-Tag erzeugt wurden (Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 17: 1030–1032). N-Terminales Markieren wurde für die folgenden Köder/Ausgangsproteine gewählt: Presenilin 1, Presenilin 2, Aph-1a, Aph-1b, Pen-2, APP, Tau, Fe65, Calsenilin. C-Terminales Markieren wurde für die folgenden Köder/Ausgangsproteine gewählt: Nicastrin, Aph-1a, Aph-1b, BACE1, D215N, APP, APP695SW, APP-C99, Fe65, Fe65L2, X11beta.
Klone wurden mittels Restriktionsverdau, DNA-Sequenzierung und mittels In-vitro-Translation unter Verwendung des TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega inc.) analysiert. Die Anwesenheit der Proteine wurde mittels Western Blotting unter Verwendung des Protein A-Teils des TAP-Tags zur Detektion nachgewiesen. In Kürze, die Auftrennung der Proteine mittels Standard-SDS-PAGE wurde gefolgt von Semi-Dry-Transfer auf eine Nitrocellulose-Membran (PROTRAN, Schleicher & Schuell) unter Verwendung der MultiphorII-Blottingapparturen von Pharmacia Biotech. Der Transferpuffer bestand aus 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 10% Methanol und 0,0375% Natriumdodecylsulfat. Nach Blockieren in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 10% Trockenmilchpulver und 0,1% Tween 20 angereichert war, wurden die transferierten Proteine mit dem Peroxidase-Anti-Peroxidase löslichen Komplex (Sigma), verdünnt in Blockierungslösung, inkubiert. Nach intensivem Waschen wurden die immunreaktiven Proteine durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL; Amersham Pharmacia Biotech) visualisiert.
Teil 2: Herstellung des Virus und Infektion
Als ein Vektor wurde ein MoMLV-basierter rekombinanter Virus verwendet.
Die Herstellung wurde wie folgt durchgeführt:
2.1 Herstellung des Virus
293 gp Zellen wurden bis 100% Konfluenz wachsen gelassen. Sie wurden 1:5 auf Poly-L-Lysin-Platten gesplittet (1:5 verdünntes Poly-L-Lysin [0,01% Stocklösung, Sigma P-4832] in PBS, welches für mindestens 10 Min. auf den Platten gelassen wurde). An Tag 2 wurden 63 Mikrogramm der retroviralen Vektor-DNA zusammen mit 13 Mikrogramm der Plasmid-DNA, die ein geeignetes Hüllprotein kodiert, in 293 gp Zellen transfiziert (Somia et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12667–12672; Somia, et al. 2000, J. Virol. 74: 4420–4424). An Tag 3 wurde das Medium durch 15 ml DMEM + 10% FBS pro 15-cm-Schale ersetzt. An Tag 4 wurde das Viren-enthaltende Medium (Überstand) geerntet (24 Stunden nach dem Mediumwechsel nach Transfektion). Falls ein zweites Ernten geplant war, wurde DMEM 10% FBS auf die Platten gegeben und die Platten wurden für weitere 24 Stunden inkubiert. Alle Ernten wurden wie folgt durchgeführt: Der Überstand wurde durch einen 0,45-Mikrometer-Filter (Corning GmbH, Celluloseacetat, 431155) filtriert. Der Filter wurde in konische Polyallomer-Zentrifugenröhrchen (Beckman, 358126) platziert, die in die Zentrifugationshalterungen des SW-28-Rotors (Beckman) platziert wurden. Der gefilterte Überstand wurde bei 19400 UpM in dem SW-28-Rotor für 2 Stunden bei 21°C ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment, welches die Viren enthält, wurde in einem kleinen Volumen (z. B. 300 Mikroliter) der Hank's Balanced Salzlösung [Gibco BRL, 14025–092] durch 100-maliges Auf- und Abpipettieren unter Verwendung einer Aerosol-sicheren Spitze resuspendiert. Die Viren wurden dann für die Transfektion wie nachfolgend beschrieben verwendet.
2.2 Infektion
Die infizierten Zellen wurden einen Tag vorher in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte ausplattiert. 4 Stunden vor Infektion wurde das alte Medium auf den Zellen durch frisches Medium ersetzt. Es wurde nur ein minimales Volumen hinzugegeben, so dass die Zellen komplett bedeckt sind (z. B. 700 Mikroliter). Während der Infektion teilten sich die Zellen aktiv.
Eine Beschreibung der Zellen und ihrer Wachstumsbedingungen ist weiter unten gegeben („3. Zelllinien").
Polybrene (Hexadimethrinbromid; Sigma, H 9268) wurde zu dem konzentrierten Virus hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 8 Mikrogram/ml zu erreichen (dies ist äquivalent zu 2,4 Mikroliter eines 1-Milligram/ml-Polybren-Stocks pro 300 Mikroliter des konzentrierten Retrovirus). Das Virus wurde in Polybren bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Für die Infektion wurde die Virus/Polybren-Mischung auf die Zellen gegeben und bei 37 Grad Celsius bei der geeigneten CO₂-Konzentration für mehrere Stunden (z. B. über den Tag oder über Nacht) inkubiert. Nach der Infektion wurde das Medium auf den infizierten Zellen durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden wie üblich passagiert, nachdem sie konfluent waren. Die Zellen enthalten den in ihren Chromosomen integrierten Retrovirus und exprimieren das Gen von Interesse stabil.
2.3 Zelllinien
Zur Expression wurden SKN-BE2-Zellen verwendet. SKN-BE2-Zellen (American Type Culture Collection-Nr. CRL-2271) wurden in 95% OptiMEM + 5% Eisen-haltigem Kalbsserum wachsen gelassen.
Teil 3: Überprüfen des Expressionsmusters von TAP-markierten Proteinen
Das Expressionsmuster des TAP-markierten Proteins wurde mittels Immunoblot-Analyse und/oder mittels Immunfluoreszenz überprüft. Die Immunfluoreszenz-Analyse wurde entweder gemäß Nr. 1 oder Nr. 2 durchgeführt, abhängig von dem Typ des TAP-markierten Proteins. Die Immunoblot-Analyse wurde gemäß Nr. 3 ausgeführt.
3.1 Protokoll für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Säugetierzellen für Plasmamembran und ER-gebundene Proteine
Zellen wurden in FCS-Medium auf Polylysin-beschichteten 8-Well-Kammer-Objektträgern bis zu 50% Konfluenz wachsen gelassen. Die Fixierung der Zellen wurde dann in 4% Paraformaldehyd verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,14 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,4) durchgeführt. Die Zellen wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 300 Mikroliter pro Well inkubiert. Das Quenchen wurde in 0,1 M Glycin in PBS für 2 × 20 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Blocken wurde mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,3% Saponin + PBS für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Inkubation der primären Antikörper wurde über Nacht bei 4°C in Blockierungslösung durchgeführt. Die geeignete Verdünnung der Antikörper wurde von Fall zu Fall bestimmt. Zellen wurden in PBS enthaltend 0,3% Saponin für 2 × 20 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Inkubation der sekundären Antikörper wird in Blockierungslösung durchgeführt. Alexa 594-gekoppelter Ziege-Anti-Kaninchen wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). Alexa 488-gekoppelter Ziege-Anti-Maus wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). DAPI wurde zum Markieren von DNA verwendet. Falls Phalloidin zum Markieren von F-actin verwendet wurde, wird der Wirkstoff 1:500 verdünnt und mit den sekundären Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut 2 × 20 Minuten bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Der Überschuss an Puffer wurde entfernt, und die Zellen wurden in ein ein Anti-Bleichmittel enthaltendes Medium gebracht (Vectashield, Vector Laboratories).
3.2 Protokoll für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Säugetierzellen für nicht Plasmamembran-gebundene Proteine:
Zellen wurden in FCS-Medium auf Polylysin-beschichteten 8-Well-Kammer-Objektträgern bis zu 50% Konfluenz wachsen gelassen. Die Fixierung der Zellen wurde in 4% Paraformaldehyd verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,14 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,4) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT), 300 Mikrolitern pro Well durchgeführt. Das Quenchen wurde in 0,1 M Glycin in PBS für 2 × 20 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Permeabilisierung der Zellen wurde mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Blockieren wurde dann in 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,3% Saponin + PBS für mindestens 1 Stunde bei RT (Blockierungslösung) durchgeführt. Die Inkubation der primären Antikörper wurde in der Blockierungslösung bei 4°C über Nacht durchgeführt. Die geeignete Verdünnung der Antikörper muss von Fall zu Fall bestimmt werden. Zellen wurden in PBS enthaltend 0,3% Saponin für 2 × 20 Minuten bei RT gewaschen. Die Inkubation der sekundären Antikörper wurde in Blockierungslösung vorgenommen. Alexa 594-gekoppelter Ziege-Anti-Kaninchen wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes), Alexa 488-gekoppelter Ziege-Anti-Maus wird 1:1000 verdünnt (Molecular Probes). DAPI wurde zum Markieren von DNA verwendet. Falls Phalloidin zum Markieren von F-actin verwendet wird, wird der Wirkstoff 1:500 verdünnt und mit den sekundären Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden 2 × 20 Minuten bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Der Überschuss an Puffer wurde entfernt, und die Zellen wurden in ein ein Anti-Bleichmittel enthaltendes Medium gebracht (Vectashield, Vector Laboratories).
3.3 Immunoblot-Analyse
Um die Expressionslevel an TAP-markierten Proteinen zu analysieren, wurde ein Zellsediment (aus einer 6-Well-Platte) in 60 μl DNAse-1-Puffer (5% Glycerol, 100 mM NaCl, 0,8% NP-40 (IGEPAL), 5 mM Magnesiumsulfat, 100 μg/ml DNAse-I (Roche Diagnostics), 50 mM Tris, pH 7,5, Protease-Inhibitor-Cocktail) für 15 Minuten auf Eis lysiert. Jede Probe wurde in zwei Aliquote geteilt. Die erste Hälfte wurde bei 13000 UpM für 5 Mm. zentrifugiert, um das NP-40-extrahierbare Material in den Überstand zu bekommen; die zweite Hälfte (Gesamtmaterial) wurde sorgfältig pulverisiert. Jeweils 50 μg von jedem NP-40-extrahierbaren Material und das Gesamtmaterial wurden mit DTT-haltigem Probenpuffer für 30 Min. bei 50°C auf einem Schüttler vermischt und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem vorgegossenen 4–12%igen Bis-Tris-Gel (Invitrogen) aufgetrennt. Proteine wurden dann auf Nitrocellulose transferiert unter Verwendung des Semi-Dry-Verfahrens mit einem diskontinuierlichen Puffersystem. In Kürze, die Gel- und Nitrozellulosemembran wurde zwischen Filterpapiere, getränkt in entweder Anodenpuffer (drei Lagen Puffer A1 (0,3 M Tris-HCl) und drei Lagen Puffer A2 (0,03 M Tris-HCl)) oder Kathodenpuffer (drei Lagen von 0,03 M Tris-HCl, pH 9,4, 0,1% SDS, 40 mM ε-Aminocapronsäure), gelegt. Der Elektrotransfer von zwei Gelen gleichzeitig wurde bei 600 mA für 25 Min. durchgeführt. Die transferierten Proteine wurden mit Ponceau-S-Lösung für 1 Min. visualisiert, um die Transfereffizienz zu kontrollieren und dann mit Wasser entfärbt. Die Membran wurde in 5% fettfreiem Milchpulver in TEST (TBS, enthaltend 0,05% Tween-20) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Sie wurde daraufhin mit HRP-gekoppeltem PAP-Antikörper (1:5000 verdünnt in 5% Milch/TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, drei mal für 10 Minuten in TEST gewaschen. Die Blotmembran wurde schließlich in Chemilumineszenz-Substrat (ECL, Roche Diagnostics) für 2 Min. getränkt und entweder gegenüber einem Röntgenstrahlenfilm exponiert oder auf einer bildgebenden Station analysiert.
Teil 4: Aufreinigung der Proteinkomplexe
Die Proteinkomplex-Aufreinigung wurde an die subzelluläre Lokalisation des TAP-markierten Proteins angepasst und wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.
4.1 Lysat-Herstellung von zytoplasmatischen Proteinen
Etwa 1 × 10⁹ adhärente Zellen (Durchschnitt) wurden mit einem Zellkratzer geerntet und 3 Mal in eiskaltem PBS (3 Min., 550 g) gewaschen. Die geernteten Zellen wurden in Flüssigstickstoff eingefroren oder sofort weiterverarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml CZ-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5% Glycerol; 0,2% IGEPAL; 1,5 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette des EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktails (Complete^TM, Roche) pro 25 ml des Puffers) resuspendiert und durch 10 Schübe mit einem eng angepassten Pistill in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert und für 10 Minuten bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde einem weiteren Ultrazentrifugationsschritt für 1 Stunde bei 100.000 g unterzogen. Der Überstand wurde zurückgewonnen und schnell in Flüssigstickstoff eingefroren oder sofort weiterverarbeitet.
4.2 Lysatherstellung für Membranproteine
Etwa 1 × 10⁹ adhärente Zellen (Durchschnitt) wurden mit einem Zellkratzer geerntet und 3 Mal in eiskaltem PBS (3 Min., 550 g) gewaschen. Die geernteten Zellen wurden in Flüssigstickstoff eingefroren oder sofort weiterverarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml Membranlysepuffer (50 mM Tris, pH 7,4; 7,5% Glycerol; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette des EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktails (Complete^TM, Roche) pro 25 ml des Puffers) resuspendiert und durch 10 Schübe mit einem eng angepassten Pistill in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde für 10 Minuten bei 750 g zentrifugiert, der Überstand wurde zurückgewonnen und einem weiteren Ultrazentrifugationsschritt für 1 Stunde bei 100.000 g unterzogen. Das Membranpellet wurde in 7,5 ml eines Membranlysepuffers enthaltend 0,8% N-Dodecyl-D-Maltosid resuspendiert und für 1 Stunde bei 4°C mit konstantem Schütteln inkubiert. Die Probe wurde einem weiteren Ultrazentrifugationsschritt für 1 Stunde bei 100.000 g unterzogen und das gelöste Material schnell in Flüssigstickstoff eingefroren oder sofort weiterverarbeitet.
4.3 Lysatherstellung für nukleare Proteine
Ungefähr 1 × 10⁹ adhärente Zellen (Durchschnittswert) wurden mit einem Zellkratzer geerntet und 3 Mal in eiskaltem PBS (3 Min., 550 g) gewaschen. Die geernteten Zellen wurden in Flüssigstickstoff eingefroren oder sofort weiterverarbeitet. Für die Zelllyse wurde das Zellpellet in 10 ml eines hypotonischen Lysepuffers (10 mM Tris, pH 7,4; 1,5 mM MgCl₂; 10 mM KCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette des EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktails (Complete^TM, Roche) pro 25 ml des Puffers) resuspendiert und durch 10 Schübe mit einem eng angepassten Pistill in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Lysat wurde für 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und der resultierende Überstand (S1) auf Eis aufbewahrt. Das Kernpellet (P1) wurde in 5 ml Kernlysepuffer (50 mM Tris, pH 7,4; 1,5 mM MgCl₂; 20% Glycerol; 420 mM NaCl; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT; enthaltend 1 Tablette des EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktails (Complete^TM, Roche) pro 25 ml des Puffers) resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Probe wurde mit S1 kombiniert, weiter mit 7 ml Verdünnungspuffer (110 mM Tris, pH 7,4; 0,7% NP40; 1,5 mM MgCl₂; 25 mM NaF; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM DTT) verdünnt, für 10 Minuten auf Eis inkubiert und bei 100.000 g für 1 Stunde zentrifugiert. Der finale Überstand (S2) wurde schnell in Flüssigstickstoff eingefroren.
4.4 Tandem-Affinitätsaufreinigung
Das gefrorene Lysat wurde schnell bei 37°C im Wasserbad aufgetaut und für 20 Minuten bei 100.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückgewonnen und mit 0,2 ml abgesetzten Kaninchen-IgG-Agarose-Beads (Sigma) für 2 Stunden unter konstanter Bewegung bei 4°C inkubiert. Immobilisierte Proteinkomplexe wurden mit 10 ml CZ-Lysepuffer (enthaltend 1 Complete^TM-Tablette (Roche) pro 50 ml Puffer) gewaschen und weiter mit 5 ml TEV-Spaltpuffer (10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1% IGEPAL; 0,5 mM EDTA; 1 mM DTT) gewaschen. Proteinkomplexe wurden mittels Inkubation mit 5 μl TEV-Protease (GibcoBRL, Kat.-Nr. 10127-017) für 1 Stunde bei 16°C in 150 μl TEV-Spaltpuffer eluiert. Das Eluat wurde zurückgewonnen und mit 0,2 ml abgesetzten Calmodulin-Affinitätsbeads (Stratagene) in 0,2 ml CBP-Bindungspuffer (10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1% IGEPAL; 2 mM MgAc; 2 mM Imidazol; 1 mM DTT; 4 mM CaCl₂) zusammengefügt, gefolgt von 1 Stunde Inkubation bei 4°C unter konstanter Bewegung. Immobilisierte Proteinkomplexe wurden mit 10 ml CBP-Waschpuffers (10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1% IGEPAL; 1 mM MgAc; 1 mM Imidazol; 1 mM DTT; 2 mM CaCl₂) gewaschen und durch Zugabe von 600 μl CBP-Elutionspuffer (10 mM Tris, pH 8,0; 5 mM EGTA) für 5 Min. bei 37°C eluiert. Das Eluat wurde in einem silikonisierten Röhrchen zurückgewonnen und lyophilisiert. Das verbleibende Calmodulin-Granulat wurde für 5 Minuten in 50 μl 4x-Laemmli-Probenpuffer gekocht. Der Probenpuffer wurde isoliert, mit der lyophilisierten Fraktion zusammengefügt und auf ein NuPAGE-Gradientengel (Invitrogen, 4–12%, 1,5 mm, 10 Taschen) geladen.
Teil 5: Proteinidentifikation mittels Massenspektrometrie
5.1 Proteinverdau vor massenspektrometrischer Analyse
Gelaufgetrennte Proteine wurden reduziert, alkyliert und im Gel verdaut, indem im Wesentlichen die von Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68: 850–858 beschriebene Vorgehensweise befolgt wurde. In Kürze, die gelaufgetrennten Proteine wurden unter Verwendung eines sauberen Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten, mit 10 mM DTT (in 5 mM Ammoniumbicarbonat, 54°C, 45 Minuten) reduziert und daraufhin mit 55 mM Jodacetamid (in 5 mM Ammoniumbicarbonat) bei Raumtemperatur im Dunkeln (30 Minuten) alkyliert. Reduzierte und alkylierte Proteine wurden im Gel mit Schweine-Trypsin (Promega) bei einer Proteasekonzentration von 12,5 ng/μl in 5 mM Ammoniumbicarbonat verdaut. Der Verdau wurde für 4 Stunden bei 37°C fortgeführt, und die Reaktion wurde daraufhin unter Verwendung von 5 μl 5%iger Ameisensäure gestoppt.
5.2 Probenaufbereitung vor der Analyse mittels Massenspektrometrie
Gelstückchen wurden zweimal mit 20 μl 1% TFA extrahiert und mit angesäuerten Verdau-Überständen vereint. Die Proben wurden in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in 13 μl 1% TFA resuspendiert.
5.3 Massenspektrometrische Datenerfassung
Peptidproben wurden in ein Nano-LC-System (CapLC, Waters oder Ultimate, Dionex) injiziert, welches direkt entweder an ein Quadrupol-TOF (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass oder QSTAR Pulsar, Sciex) gekoppelt war oder Ionenfallen-(LCQ Deca XP)-Massenspektrometer. Peptide wurden auf dem LC-System unter Verwendung eines Gradienten von wässrigen und organischen Lösungsmitteln aufgetrennt (siehe unten). Lösungsmittel A war 5% Acetonitril in 0,5% Ameisensäure, und Lösungsmittel B war 70% Acetonitril in 0,5% Ameisensäure.

Zeit (min) % Lösungsmittel A % Lösungsmittel B

0 95 5

5,33 92 8

35 50 50

36 20 80

40 20 80

41 95 5

50 95 5
Die von dem LC-System eluierenden Peptide wurden innerhalb des Massenspektrometers partiell sequenziert.
5.4 Proteinidentifikation
Die Peptidmassen- und Fragmentierungsdaten, die in den LC-MS/MS-Experimenten generiert wurden, wurden verwendet, um Fasta-formatierte Protein- und Nukleinsäure-Datenbanken abzufragen, welche am NCBI instand gehalten und regelmäßig auf den neuesten Stand gebracht werden (für das NCBInr, dbEST und die humanen und Maus-Genome) und am European Bioinformatics Institute (EBI, für die humanen, Maus-, D. melanogaster- und C. elegans-Proteom-Datenbanken). Proteine wurden identifiziert durch Korrelieren der gemessenen Peptidmasse und Fragmentierungsdaten mit denselben Daten, die aus den Einträgen in der Datenbank unter Verwendung des Softwareprogramms Mascot (Matrix Science; Perkins et al., 1999, Electrophoresis 20: 3551–3567) errechnet wurden. Die Suchkriterien variierten abhängig davon, welches Massenspektrometer für die Analyse benutzt wurde.
Beispiel 2: Auswirkung des siRNA-vermittelten Knock-Downs von GPR49 auf Aβ1-42-Gehalte
Ergebnis:
Wir stellten fest, dass ähnlich zu den siRNAs, die gegen die bekannten Effektoren der APP-Prozessierung, BACE1 und Nicastrin, gerichtet sind, die auf GPR49 abgezielte siRNA eine signifikante Attenuierung der Aβ1-42-Sekretion verursachte, wohingegen die Luc3-siRNA keinen Effekt hatte (2A) – dies demonstriert, dass GPR49 eine funktionelle Rolle in der Regulation der Prozessierung/Sekretion von APP spielt.
Wir bestätigten, dass die GPR49-siRNA in der Tat mit der Expression von GPR49 interferierte (2B).
Eine RNAi-Genexpressions-Störungsstrategie wurde für die funktionelle Validierung von GPR49 als ein Effektor der APP-Prozessierung angewandt: Eine gegen GPR49 gerichtete siRNA oder gegen bekannte Effektoren des APP-Prozessierens gerichtete siRNAs, BACE1 oder Nicastrin, oder gegen nicht verwandtes Luc3 wurden in SK-N-BE2-Neuroblastomazellen transfiziert, die humanes APP695 exprimieren. Die siRNA für humanes GPR49 wurde von Dharmacon Research Inc. synthetisiert.
Die für GPR49 verwendete siRNA-Sequenz war: AACAGCAGTATGGACGACCTT.
Transfektion der SK-N-BE2-Zellen wurde unter Verwendung von LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. In Kürze, die Zellen wurden bei einer Dichte von 1,0 × 10⁴ Zellen in einem finalen Volumen von 85 μl pro 96-Well 12–16 Stunden vor der Transfektion ausgesät. 25 nM der siRNAs wurden mit 8 μl Opti-MEM-Puffer (Gibco) und 60 ng Carrier-DNA vermischt, und die Mischung wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur vor Zugabe auf die Zellen inkubiert. 16 und 48 Stunden nach Transfektion wurde das Medium mit 100 μl oder 200 μl an Wachstumsmedium mit bzw. ohne Serum ersetzt. 72 Stunden nach Transfektion wurden 100 μl Überstände für Aβ1-42 ELISA (Ionogenetics) geerntet. Der Assay wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Die Knockdown-Effizienz der ausgewählten siRNAs wurde mittels quantitativer RT-PCR untersucht. In Kürze, 5 × 10⁵ SKNBE2-Zellen pro 6-Well wurden plattiert und am darauffolgenden Tag mit 25 nM siRNA transfiziert. 36 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Gesamt-RNA wurde aufgearbeitet und gemäß Standardvorgehensweisen reverse-transkribiert. Gleiche Mengen an cDNAs und GPR49-spezifischen Primern wurden für Bestimmung der relativen Expressionslevel an GPR49 gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Alle Werte wurden zu einer humanen Referenz-RNA (Stratagene) normalisiert.
Beispiel 3: Bestimmung der GPR49-Aktivität
Signaltransduktionskaskaden, die durch GPR49 ausgelöst werden, sind momentan nicht bekannt. Von anderen Familienmitgliedern jedoch, den humanen Glycohormonrezeptoren sowie dem phylogenetisch entfernten, mutmaßlichen LGR Ortholog in Nematoden (Kudo M, Chen T, Nakabayashi K, Hsu SY, Hsueh AJ. (2000) The nematode leucine-rich repeat-containing, G Protein-coupled receptor (LGR) Protein homologous to vertebrate gonadotropin and thyrotropin receptors is constitutively active in mammalian cells. Mol. Endocrinol. 14(2): 272–84) wurde gezeigt, dass sie vermittelt durch Adenylatcyclase-abhängige Mechanismen signalisieren. Das Letztere verursacht einen konstitutiven Anstieg der zellulären zyklischen Adenosin-Monophosphat-(cAMP)-Gehalte, wenn es in Säugetierzellen heterolog exprimiert wird.
Um zu bestätigen, dass GPR49 an den cAMP-Weg gekoppelt ist, können verschiedene Tests verwendet werden, die der Öffentlichkeit zugänglich sind. Zum Beispiel haben Bresnick et al. (Bresnick JN, Skynner HA, Chapman KL, Jack AD, Zamiara E, Negulescu P, Beaumont K, Patel S, McAllister G (2003) Identification of signal transduction pathways used by orphan g protein-coupled receptors. Assay Drug Dev Technol. 1(2): 239–49.) ein Beta-Lactamase-Reporterkonstrukt verwendet, um die Signaltransduktionswege von Orphan-GPRCs zu identifizieren.
GPR49-Modulatoren werden dann basierend auf ihrer Fähigkeit identifiziert, zelluläre Anstiege an cAMP auszulösen, die in GPR49-exprimierenden, jedoch nicht in GPR49-defizienten Zellen beobachtet werden. Die direkten Messungen von cAMP können zum Beispiel in einem Hochdurchsatzformat unter Verwendung von cAMP-Response-Element(CRE)-Luciferase-Reporter-Zelllinien durchgeführt werden (Gabriel D, Vernier M, Pfeifer MJ, Dasen B, Tenaillon L, Bouhelal R (2003) High throughput screening technologies for direct cyclic AMP measurement. Assay Drug Dev Technol. 1(2): 291–303). Andere Verfahren zur Bestimmung von cAMP-Anstiegen oder cAMP-abhängiges Signalisieren sind dem Fachmann bekannt. Für eine Übersicht an Beispielsfällen für die Identifizierung von kleinen Molekülmodulatoren der vorangegangenen Orphan-GPCRs siehe (Howard AD, McAllister G, Feighner SD, Liu Q, Nargund RP, Van der Ploeg LH, Patchett AA (2001) Orphan G-Protein-coupled receptors and natural ligand discovery. Trends Pharmacol Sci. 22(3): 132–40).
Beispiel 4: Modulation der Aβ1-42-Generierung/Sekretion durch GPR49-Modulatoren
SKNBE2-Zellen (oder eine andere geeignete Zelllinie), die humanes APP695 stabil überexprimiert (SKNBE2/APP695), oder eine geeignete Mutante mit erhöhten Beta-/Gamma-Sekretase-Spaltungskinetiken werden in Wachstumsmedium ausplattiert und für 4 Stunden bis zum nächsten Morgen des Serums entzogen. Ein GPR49-Modulator, vorzugsweise ein Inhibitor, verdünnt in serumfreiem Medium, wird dann hinzugegeben und für geeignete Zeitdauern inkubiert. Zellüberstände werden gesammelt und die Gehalte an Aβ1-42 mittels ELISA bestimmt (Innotest β-Amyloid (1-42) von INNOGENETICS N. V., Belgien).
Die Erfindung ist in den folgenden Abbildungen mehr im Detail beschrieben:
1: Schematische Darstellung der TAP-Eingangspunkte (weiß), von denen gefunden wurde, dass GPR49 mit ihnen interagiert.
2: siRNA-vermittelter Knockdown der GPR49-Expression attenuiert die Generierung/Sekretion von Aβ1-42.
2A: siRNAs gerichtet gegen BACE1, Nicastrin, GPR49 oder Luc3 wurden in SK-N-BE2-Neuroblastoma-Zellen transfiziert, die APP695 überexprimieren. 48 Stunden nach Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Überstände wurden gesammelt und die Gehalte an Aβ1-42 mittels ELISA (Innotest-β-Amyloid (1-42) von INNOGENETICS N. V., Belgien) bestimmt. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden im Duplikat durchgeführt. Ein representatives Beispiel ist gezeigt.
2B: Eine siRNA gerichtet gegen GPR49, aber nicht eine gerichtet gegen unabhängiges Luc3, reduziert spezifisch GPR49-mRNA wie durch quantitative RT-PCR-Analyse untersucht. Die für jede der siRNA gezeigten zwei Balken repräsentieren zwei unabhängige Experimente.
3: Aminosäuresequenz des humanen GPR (LGR5; leucinreiche-Wiederholungssequenz-enthaltender G-Protein gekoppelter Rezeptor 5), angegeben im Ein-Buchstaben-Code.
4: Multipler Sequenzabgleich von humanem LGR4, LGR5/GPR49 und LGR6. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines GPR49-Inhibitors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei GPR49 Teil eines intrazellulären Proteinkomplexes ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Inhibitor die Aktivität der Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase moduliert.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die neurodegenerative Erkrankung die Alzheimer'sche Erkrankung ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Gamma-Sekretase- und/oder eines Beta-Sekretase-Modulators, umfassend die folgenden Schritte: a. Identifizieren eines mit GPR49 interagierenden Moleküls durch Bestimmen, ob eine bestimmte Testverbindung ein mit GPR49 interagierendes Molekül ist, b. Bestimmen, ob das mit GPR49 interagierende Molekül von Schritt a) in der Lage ist, die Gamma-Sekretase- und/oder Beta-Sekretaseaktivität zu modulieren.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei in Schritt a) die Testverbindung in Kontakt mit GPR49 gebracht wird und die Interaktion von GPR49 mit der Testverbindung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Interaktion der Testverbindung mit GPR49 zu einer Inhibition der GPR49-Aktivität führt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, wobei in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase und/oder der Beta-Sekretase APP zu spalten gemessen wird, vorzugsweise wobei die Fähigkeit zum Herstellen von Abeta 42 gemessen wird.
Verwendung eines GPR49-Inhibitors zur Inhibition der Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretaseaktivität in vitro, wobei der Inhibitor ein Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen.