DE602004010314T2

DE602004010314T2 - Behandlung von neurodegenerativen erkrankungen durch verwendung von degs-inhibitoren

Info

Publication number: DE602004010314T2
Application number: DE602004010314T
Authority: DE
Inventors: Carsten Hopf; Gerard Drewes; Heinz Ruffner
Original assignee: Cellzome GmbH
Current assignee: Cellzome GmbH
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2024-11-25
Also published as: WO2006015622A1; DE602004010314D1; US20090098105A1; EP1778837B1; CA2575300A1; DE602004013202T2; DE602004013202D1; DK1778837T3; DK1786442T3; EP1786442B1; JP2008509171A; US20070298029A1; EP1786442A1; WO2006015621A1; ES2295949T3; EP1778837A1; ATE392471T1; JP2008509172A; CA2575190A1; ES2304642T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle von DEGS bei der APP-Prozessierung und die Verwendung von DEGS-Inhibitoren bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten.
Die Alzheimer-Krankheit ist ein chronischer Zustand, der Millionen von Individuen weltweit befällt.
Das Gehirn von an Alzheimer-Krankheit Leidenden zeigt eine charakteristische Pathologie von prominenten neuropathologischen Läsionen, wie die initial intrazellulären neurofibrillären Knoten (NFTs) und die extrazellulären Amyloid-reichen senilen Plaques. Diese Läsionen gehen mit massivem Verlust von Populationen an ZNS-Neuronen einher, und ihre Progression begleitet die klinische Demenz, die mit AD zusammenhängt. Die Hauptkomponente von amyloiden Plaques sind die Amyloid-Beta-(A-Beta, Abeta oder Aβ)-Peptide verschiedener Länge. Eine Variante davon, die das Aβ-1-42-Peptid (Abeta-42) ist, ist das hauptsächliche kausative Mittel für die Amyloid-Bildung. Eine weitere Variante ist das Aβ1-40-Peptid (Abeta-40). Amyloid-Beta ist das proteolytische Produkt eines Vorläuferproteins, Beta-Amyloid-Verläuferprotein (Beta-APP oder APP). APP ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das sequentiell durch mehrere verschiedene Membran-assoziierte Proteasen gespalten wird. Die erste Spaltung von APP erfolgt durch eine von zwei Proteasen, Alpha-Sekretase oder Beta-Sekretase. Alpha-Sekretase ist eine Metalloprotease, deren Aktivität sehr wahrscheinlich von einem oder von einer Kombination der Proteine ADAM10 und ADAM17 bereitgestellt wird. Die Spaltung durch Alpha-Sekretase schließt die Bildung von Amyloid-Peptiden aus und wird somit als nicht-amyloidogen bezeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Spaltung von APP durch Beta-Sekretase eine Vorbedingung für die anschließende Bildung von Amyloid-Peptiden. Diese Sekretase, die auch BACE1 (Beta-Stellen-APP-Spaltungsenzym) genannt wird, ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das eine Aspartyl-Proteaseaktivität (nachstehend ausführlich beschrieben) enthält.
Die Beta-Sekretase-(BACE)-Aktivität spaltet APP in die Ektodomäne auf, was zu einer Ausschüttung von sezerniertem löslichen APPb in einem C-terminalen 99-Rest-Transmembranfragment (APP-C99) führt. Vassar et al. (Science 286, 735–741) klonierten eine Transmembran-Aspartat-Protease, die die Merkmale der postulierten Beta-Sekretase von APP aufwies, die sie BACE1 nannten. Gehirn- und primäre kortikale Kulturen aus BACE1-Knockout-Mäusen zeigten keine Beta-Sekretase-Aktivität, und primäre kortikale Kulturen aus BACE-Knockout-Mäusen produzierten weniger Amyloid-Beta aus APP. Dies legt nahe, dass BACE1 eher als sein paraloges BACE2 die hauptsächliche Beta-Sekretase für APP ist. BACE1 ist ein Protein von 501 Aminosäuren, die ein 21-aa-Signalpeptid, gefolgt von einer Proproteindomäne, die aa 22 bis 45 umspannt, enthält. Es gibt alternativ gespleißte Formen, BACE-I-457 und BACE-I-476. Auf die extrazelluläre Domäne des reifen Proteins folgt eine vorausberechnete Transmembrandomäne und ein kurzer zytosolischer C-terminaler Schwanz von 24 aa. BACE1 wird als Typ1-Transmembranprotein vorhergesagt, mit der aktiven Stelle auf der extrazellulären Seite der Membran, wo Beta-Sekretase APP und mögliche andere, noch unidentifizierte Substrate spaltet. Obwohl BACE1 eindeutig ein Schlüsselenzym ist, das für die Prozessierung von APP zu A-Beta erforderlich ist, legen neuere Beweise zusätzliche potentielle Substrate und Funktionen von BACE1 nahe (J. Biol. Chem. 279, 10542–10550). Bisher wurden noch keine BACE1-Wechselwirkungsproteine mit regulatorischen oder modulatorischen Funktionen beschrieben.
Das durch die BACE1-Spaltung erzeugte APP-Fragment, APP-C99, ist ein Substrat für die Gamma-Sekretaseaktivität, die APP-C99 innerhalb der Ebene der Membran zu einem A-Beta-Peptid (wie das amyloidogene Aβ1-t-42-Peptid) und in ein C-terminales Fragment, das APP-intrazelluläre Domäne (AICD) genannt wird (Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 25–51), spaltet. Die Gamma-Sekretaseaktivität sitzt in einem Multiproteinkomplex mit mindestens vier distinkten Untereinheiten. Die erste Untereinheit, die entdeckt wurde, war Presenilin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8208–13). Weitere bekannte Proteinkomponenten des Gamma-Sekretasekomplexes sind Pen-2-Nicastrin und Aph-1a.
Trotz neueren Fortschrittes bei der Aufzeichnung von molekularen Ereignissen, die der Ätiologie von Alzheimer-Krankheit zugrundeliegen, wurden bisher keine krankheitsmodifizierten Therapien entwickelt. Zu diesem Zweck war die Industrie bisher bestrebt, geeignete Leitkomponenten zur Hemmung von BACE1 zu benennen. Außerdem ist bereits bekannt, dass eine zunehmende Anzahl von alternativen Substraten von Gamma-Sekretase existiert, besonders bemerkenswert das Notch-Protein. Folglich verursacht die Hemmung von Gamma-Sekretase wahrscheinlich Mechanismus-basierte Nebenwirkungen. Derzeitige Spitzenarzneimittel (z. B. Aricept^®/Donepezil) versuchen, eine vorübergehende Verbesserung von kognitiven Funktionen durch Hemmung von Acetylcholinesterase zu erreichen, was zu erhöhten Spiegeln des Neurotransmitters Acetylcholin im Gehirn führt. Diese Therapien sind für die späteren Stadien der Krankheit nicht geeignet, sie behandeln nicht die zugrundeliegende Krankheitspathologie, und sie halten die Krankheitsprogression nicht an.
Somit besteht ein unerfüllter Bedarf an der Benennung von neuen Zielen, die neue molekulare Strategien für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit ermöglichen. Zusätzlich besteht ein starker Bedarf an neuen therapeutischen Verbindungen, die die zuvor genannten molekularen Prozesse durch Ausrichtung auf die neuen Ziele modifizieren.
Bei einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines DEGS-Wechselwirkungsmoleküls zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten bereit.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise unter Verwendung von funktionellen Assays festgestellt, dass DEGS ein neues Ziel ist, das neue Therapien zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit ermöglicht.
Die Identifizierung von DEGS als ein Schlüssel-Zielmolekül ermöglicht die Verwendung von DEGS-Wechselwirkungsmolekülen zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten. Dies wird insbesondere in dem Beispielabschnitt (infra) gezeigt, wo gezeigt wird, dass siRNA, die gegen DEGS gerichtet ist, zu einer herabgesetzten oder abgeschwächten Sekretion/Erzeugung von Abeta-42 und, weniger prominent, von Abeta-40 führt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein „DEGS-Wechselwirkungsmolekül" ein Molekül, das mindestens vorübergehend an DEGS bindet und das vorzugsweise die DEGS-Aktivität moduliert.
DEGS (Dihydroceramiddesaturase; IPI von menschlicher DEGS: IP100021147.1) ist auch als Sphingolipid-Δ4-desaturase oder DES1 bekannt. Die Aminosäuresequenz von menschlicher DEGS ist in 3 beschrieben. Menschliche DEGS ist auf dem Chromosom 1q42.12 lokalisiert.
DEGS wandelt Dihydroceramid in Ceramid auf dem Sphingosin-Ceramid-Weg (siehe 5) um. Das entsprechende Gen codiert ein Mitglied der Membran-Fettsäuredesaturase-Familie, welches für die Insertion von Doppelbindungen in spezifische Positionen in Fettsäuren verantwortlich ist. Es wird vorhergesagt, dass das Protein ein multiples Membran-umspannendes Protein ist, das in dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist. Es wird in menschlichen Geweben breit exprimiert. Die Co-Transfektion von DEGS in dem EGF-Rezeptor führte zu einer herabgesetzten Expression des Rezeptors, beeinflusste jedoch nicht die PDGFR-Expression, was eine Rolle einer Fettsäuredesaturase bei der Regulierung der biosynthetischen Prozessierung des EGF-Rezeptors nahelegt.
Das Expressionsmuster von DGS in menschlichem Gewebe wurde bereits beschrieben (Cadena DL, Kurten RC, Gill GN (1997). Das Produkt des MLD-Gens ist ein Mitglied der Membran-Fettsäuredesaturase-Familie: Überexpression von MLD hemmt die EGF-Rezeptor-Biosynthese (Biochemistry 23. 6960–7). In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wurde bestätigt, dass DEGS im Herzen stärker exprimiert wird als in der Niere, Leber oder im Skelettmuskel. Allerdings wurde im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung eine starke Expression auch im Gehirn festgestellt (offenbar im Kontrast zu den veröffentlichten Berichten, Cadena, supra) – insbesondere in Bereichen, die von Alzheimer-Krankheit befallen waren (siehe 1).
Ein verwandtes Enzym, DES2 (Sphingolipid-Δ4-Desaturase/C-4-Hydroxylase DES2; IP100040687.2) zeigt eine ähnliche enzymatische Aktivität. Es zeigt sowohl Δ4-Desaturase- als auch C4-Hydroxylase-Aktivitäten (Ternes P., Franke S., Zahringer U., Sperling P., Heinz E. (2002) Identification and characterization of a sphingolipid delta 4-desaturase family. J. Biol. Chem. 277, 25512–84). Die Expressionsmuster der beiden DES-Familienmitglieder überlappen sich (Mizutani Y. Kibara A., Igarashi Y. (2004) Identification of the human sphingolipid C4-hydroxylase, hDES2, and its up-regulation during keratinocyte differentiation. FEBS Lett. 563(1–3): 93–7). Anscheinend existieren mehrere Transkripte von DES2, einige von ihnen werden prominent im Gehirn exprimiert.
Ein Sequenzabgleich von DEGS and DES2 ist in 4B gezeigt.
Anscheinend kommt ein Ortholog von DEGS in der Maus vor (IPI0011373.1). Ein Sequenzabgleich mit menschlicher DEGS ist in 4A gezeigt.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff „DEGS" nicht nur das Protein, wie in 3 gezeigt, sondern auch ein funktionell aktives Derivat davon oder ein funktionell aktives Fragment davon oder ein Homolog davon oder eine Variante, die von einer Nukleinsäure codiert wird, die mit der Nukleinsäure hybridisiert, die das Protein unter niedrigen Stringenzbedingungen codiert. Vorzugsweise umfassen diese niedrigen Stringenzbedingungen Hybridisierung in einem Puffer, der umfasst 35% Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% BSA, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat für 18–20 h bei 40°C, Waschen in einem Puffer, bestehend aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS für 1–5 h bei 55°C und Waschen in einem Puffer, der aus 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) 5 mM EDTA und 0,1% SDS besteht, für 1,5 h bei 60°C.
Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff „funktionell aktiv", wie hier verwendet, auf ein Polypeptid, nämlich ein Fragment oder Derivat, mit strukturellen regulatorischen oder biochemischen Funktionen des Proteins gemäß der Ausführungsform, mit der dieses Polypeptid, nämlich Fragment oder Derivat, in Zusammenhang steht.
Im Falle von DEGS bedeutet ein funktionell aktives Derivat vorzugsweise ein Derivat, das im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie DEGS ausübt, z. B. verwandelt es Stearat (und Palmitat) in einfach ungesättigte Fettsäuren (meistens Oleat; C18:1) und/oder ist in der Lage, eine ähnliche Rolle wie DEGS bei der Abeta-42-Sekretion zu spielen.
Die Aktivität von DEGS sowie von einem funktionell aktiven Derivat davon kann, wie bei Triola G., Fabrias G., Llebaria A. (2001) Synthesis of a Cyclopropen Analogue of Ceramide, a Potent Inhibitor of Dihydroceramide Desaturase. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 18. Mai; 40(10): 1960–1962 beschrieben, gemessen werden.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff „Aktivität", wie hier verwendet, die Funktion eines Moleküls in ihrem breitesten Sinn. Sie umfasst im Allgemeinen biologische, biochemische, physikalische oder chemische Funktionen des Moleküls, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Sie umfasst beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Fähigkeit, mit anderen Molekülen in Wechselwirkung zu treten und die Fähigkeit die Funktion von anderen Molekülen zu aktivieren, zu erleichtern, zu stabilisieren, zu hemmen, zu unterdrücken oder zu destabilisieren, und die Fähigkeit an bestimmten subzellulären Lokationen zu lokalisieren. Wo anwendbar, betrifft der Begriff auch die Verminderung oder Abschwächung der Sekretion von Abeta-42, wenn das Molekül gehemmt wird.
Erfindungsgemäß umfassen die Begriffe „Derivate" oder „Analoge" von DEGS oder „Varianten", wie hier verwendet, jedoch nicht darauf beschränkt, vorzugsweise Moleküle, die Regionen umfassen, die im Wesentlichen zu der DEGS homolog sind, bei verschiedenen Ausführungsformen, um eine Identität von mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% gegenüber einer Aminosäuresequenz von identischer Größe oder im Vergleich zu einer ausgerichteten Sequenz, in der dem Abgleich durch ein Computerhomolgieprogramm, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, erfolgt, oder dessen codierende Nukleinsäure in der Lage ist, mit einer Sequenz zu hybridisieren, die das Protein unter stringenten, moderat stringenten oder nicht-stringenten Bedingungen codiert. Das heißt, ein Protein, welches das Ergebnis einer Modifikation des natürlich vorkommenden Proteins durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen bzw. -additionen ist, wobei die Derivate immer noch die biologische Funktion des natürlich vorkommenden Proteins aufweisen, obwohl nicht notwendigerweise im selben Ausmaß. Die biologische Funktion von solchen Proteinen kann z. B. durch geeignete zur Verfügung stehende in vitro Assays, wie bei der Erfindung vorgesehen, überprüft werden.
Der Begriff „Fragment", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid von mindestens 10, 20, 30, 40 oder 50 Aminosäuren des Proteins, insbesondere DEGS, gemäß der Ausführungsform. Bei den spezifischen Ausführungsformen sind solche Fragmente nicht länger als 35, 100 oder 200 Aminosäuren.
Der Begriff „Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die ein offenes Leseraster einschließt, das ein, sofern nicht anderweitig angegeben, erfindungsgemäßes Polypeptid einschließlich sowohl Exon- als auch gegebenenfalls von Intron-Sequenzen codiert.
Die Begriffe „homolog" oder „homologe Genprodukte", wie hier verwendet, bedeuten ein Protein in einer anderen Spezies, vorzugsweise in Säugern, welches die gleiche biologische Funktion wie das hier beschriebene Protein, insbesondere DEGS, durchführt. Solche Homologe werden ebenfalls als „orthologe Genprodukte" bezeichnet, der Algorithmus zur Deletion von orthologen Genpaaren aus Menschen und Säugern oder anderen Spezies verwendet das gesamte Genom dieser Organismen.
Zuerst werden paarweise beste Treffer unter Verwendung eines vollen Smith-Waterman-Abgleichs von vorausberechneten Proteinen erreicht. Um die Zuverlässigkeit weiter zu verbessern, werden diese Paare mit paarweise besten Treffern, umfassend Drosophilamelanogaster- und C.-elegans-Proteine, geclustert. Eine solche Auswertung ist z. B. in Nature, 2001, 409: 860–921 angegeben. Die Homologen der erfindungsgemäßen Proteine können entweder auf der Grundlage der Sequenzhomologie der Gene, die die Proteine codieren, die hier bereitgestellt sind, mit den Genen anderer Spezies durch Klonieren des jeweiligen Gens, unter Anwendung herkömmlicher Technologie und Expression des Proteins aus einem solchen Gen oder durch andere allgemein auf dem Fachgebiet bekannte geeignete Verfahren isoliert werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das DEGS-Wechselwirkungsmolekül ein DEGS-Inhibitor.
Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff „Inhibitor" auf eine biochemische oder chemische Verbindung, die vorzugsweise die Aktivität von DEGS hemmt oder herabsetzt. Dies kann z. B. über Suppression der Expression des entsprechenden Gens erfolgen. Die Expression des Gens kann durch RT-PCR- oder Western-Blot-Analyse gemessen werden. Außerdem kann dies über Hemmung der Aktivität, z. B. durch Binden an DEGS, erfolgen.
Beispiele für solche DEGS-Inhibitoren sind Bindungsproteine oder Bindungspeptide, die gegen DEGS gerichtet sind, insbesondere gegen die aktive Stelle von DEGS, und Nukleinsäuren, die gegen das DEGS-Gen gerichtet sind.
Beispiele für Inhibitoren von DEGS umfassen Cyclopropen-Analoge von Ceramid. Ihre Wirkung auf Dihydroceramid-Desaturase wurde bereits unlängst beschrieben (Triola G., Fabrias G., Casas J., Llebaria A. (2003) Synthesis of cylcopropen analogues of ceramide and their effect an dihydroceramide desaturase. J. Org. Chem. 68(26): 9924–32). N-[(1R,2S)-2-Hydroxy-1-hydroxymethyl-2-(2-tridecyl-1-cyclopropenyl)ethyl]octanamid (GT11) ist ein kompetitiver Inhibitor mit einer Ki von 6 μM.
Der Begriff „Nukleinsäuren gegen DEGS" bezieht sich auf doppelsträngige oder einzelsträngige DNA oder RNA oder eine Modifikation oder Derivat davon, welche beispielsweise die Expression des DEGS-Gens oder die Aktivität von DEGS hemmt und ohne Einschränkung Antisense-Nukleinsäuren, Aptamere, siRNAs (kleine interferierende RNAs) und Ribozyme einschließt.
Vorzugsweise wird der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt, die aus Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, siRNA, Niedermolekularen Molekülen (LMWs), Bindungspeptiden, Aptameren, Ribozymen und Peptidomimetika besteht.
LMWs sind Moleküle, die keine Proteine, Peptide, Antikörper oder Nukleinsäuren sind, und die ein Molekulargewicht von weniger als 5000 Da, vorzugsweise weniger als 2000 Da, stärker bevorzugt von weniger als 1000 Da, besonders bevorzugt von weniger als 500 Da aufweisen. Solche LMWs können durch durchsatzstarke Verfahren ausgehend von Bibliotheken identifiziert werden. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden nachstehend ausführlich besprochen.
Diese Nukleinsäuren können direkt einer Zelle verabreicht werden, oder die intrazellulär durch Transkription von exogenen, eingebrachten Sequenzen produziert werden können.
Eine „Antisense"-Nukleinsäure, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, aufgrund von einer gewissen Sequenzkomplementarität mit einem sequenzspezifischen Teil eines Proteins zu hybridisieren, das RNA (vorzugsweise mRNA) codiert. Die Antisense-Nukleinsäure kann mit einer codierenden und/oder nicht-codierenden Region einer mRNA komplementär sein. Solche Antisense-Nukleinsäuren, die Proteinexpression oder -aktivität hemmen, besitzen Brauchbarkeit als Therapeutika und können bei der Behandlung oder Prävention von Störungen, wie hier beschrieben, eingesetzt werden.
Die Antisense-Nukleinsäuren bestehen aus mindestens sechs Nukleotiden und sind vorzugsweise Oligonukleotide im Bereich von 6 bis etwa 200 Nukleotiden. Bei speziellen Aspekten besteht das Oligonukleotid aus mindestens 10 Nukleotiden, mindestens 15 Nukleotiden, mindestens 100 Nukleotiden oder mindestens 200 Nukleotiden.
Die Nukleinsäuren, z. B. die Antisense-Nukleinsäuren oder siRNAs, können chemisch synthetisiert werden, z. B. gemäß dem Phosphortriesterverfahren (siehe beispielsweise Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543–584). Aptamere sind Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid, hier DEGS, binden. Aptamere können durch Selektionsverfahren, wie SELEX (siehe beispielsweise Jayasena (1990) Clin. Chem., 45, 1628–50; Klug und Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97–107; US 5,582,981 ) aus einem großen Pool verschiedener einzelsträngiger RNA-Moleküle isoliert werden. Aptamere können auch in ihrer Spiegelbildform, beispielsweise als L-Ribonukleotid synthetisiert werden (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116–9; Klussmann et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112–5). Formen, die auf diese Weise bereits isoliert wurden, erfreuen sich des Vorteils, dass sie durch natürlich vorkommende Ribonukleasen nicht abgebaut werden und darum eine größere Stabilität besitzen.
Nukleinsäuren können durch Endonukleasen oder Exonukleasen, insbesondere durch DNasen und RNasen abgebaut werden, die in der Zelle gefunden werden können. Es ist darum vorteilhaft, die Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie gegen Abbau zu stabilisieren, wodurch sichergestellt wird, dass eine hohe Konzentration der Nukleinsäure über einen langen Zeitraum in der Zelle aufrechterhalten wird (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch Einbringen von einer oder mehreren Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch Einbringen von einem oder mehreren Nicht-Phosphor-Internukleotiden erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind bei Uhlmann und Peyman (1990), supra, zusammengefasst (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989–94; WO 95/11910 ; WO 98/37240 ; WO 97/29116 ). Modifizierte Internukleotid-Phosphat-Radikale und/oder Nicht-Phosphor-Brücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden können, enthalten beispielsweise Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphoramidat, Phosphordithioat und/oder Phosphatester, wohingegen Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch die Absicht, dass diese Modifikation die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung verbessern sollte, die bei einer der erfindungsgemäßen Anwendungen eingesetzt werden kann. Im Allgemeinen kann das Oligonukleotid an der Basegruppierung, Zuckergruppierung oder am Phosphatskelett modifiziert werden.
Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen einschließen, wie Peptide, Mittel, die den Transport über die Zellmembran erleichtern (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648–652; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 88/09810 ) oder Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/10134 ), durch Hybridisierung ausgelöste Spaltungsmittel (siehe z. B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958–976) oder Interkalationsmittel (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549).
Im einzelnen können die Antisense-Oligonukleotide mindestens eine modifizierte Basengruppierung einschließen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-uridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, D-Galaktosylcheosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-uracil, D-Mannosylcheosin, 5N-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Cheosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxysessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (Acp3)w und 2,6-Diaminopurin einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid eine modifizierte Zuckergruppierung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose umfasst, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Die Verwendung von geeigneten Antisense-Nukleinsäuren ist weiterhin bei Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380–2; Nellen und Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci. 18, 419–23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697–74 oder Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142) beschrieben.
Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2-a-anomeres Oligonukleotid. Ein a-anormeres Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625–6641).
Das Oligonukleotid kann mit einem anderen Molekül konjugiert sein, z. B. einem Peptid, einem durch Hybridisierung ausgelösten Vernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsmittel etc.
Überall in der Erfindung können erfindungsgemäße Oligonukleotide durch auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (wie im Handel von der Fa. Biosearch, Applied Biosystems etc. erhältlich). Als Beispiele können Phosphorothioat-Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl, Acids Res. 16: 3209) synthetisiert werden, Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch Verwendung von kontrollierten Porenglas-Polymerträgern hergestellt werden (Sann et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448–7451) etc.
Bei einer speziellen Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonukleotide katalytische RNAs oder Ribozyme (siehe z. B. internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/11364 ; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225). Bei einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327–330).
Bei einer alternativen Ausführungsform werden erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuren intrazellulär durch Transkription aus einer exogenen Sequenz produziert. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo so eingebracht werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird, innerhalb von der der Vektor oder ein Teil davon transkribiert wird, wobei eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure (RNA) produziert wird. Ein solcher Vektor würde eine Sequenz, die das Protein codiert, enthalten. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Solche Vektoren können durch DNA-rekombinationstechnische Verfahren, die auf dem Fachgebiet Standard sind, konstruiert werden. Vektoren können Plasmidvektoren, virale Vektoren oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren sein, die zur Replikation und Expression in Säugerzellen in der Lage sind. Die Expression der Sequenzen, die die Antisense-RNAs codieren, können durch jeden Promotor erfolgen, von dem auf dem Fachgebiet die Wirkung in Säugerzellen, vorzugsweise menschlichen Zellen, bekannt ist. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die SV40-frühe Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promotor, der in der 3'-langen terminalen Wiederholungseinheit des Rous-Sarkoma-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinasepromotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioningens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42) etc.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren umfassen eine Sequenz, die zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts eines Proteingens, vorzugsweise eines menschlichen Gens, stärker bevorzugt des humanen DEGS-Gens, komplementär ist. Allerdings ist, obwohl bevorzugt, eine absolute Komplementarität nicht erforderlich. Eine Sequenz, „die komplementär zu mindestens einem Teil einer RNA" ist, wie hier bezeichnet, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein, unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs, mit der RNA zu hybridisieren; im Falle von doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein Einzelstrang der Duplex-DNA getestet werden, oder die Triplex-Bildung kann überprüft werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung hängt sowohl von dem Komplementaritätsgrad als auch von der Länge der Antisense-Nukleinsäure ab. Je länger die hybridisierende Nukleinsäure, desto mehr Basen stimmen im Allgemeinen, nicht mit einer RNA überein, die sie enthalten kann, und bilden immer noch einen stabilen Doppelstrang (oder gegebenenfalls Dreifachstrang). Ein Fachmann kann einen tolerierbaren Grad an Fehlpaarung durch Verwendung von Standardverfahrensweisen zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes sicherstellen.
Die Produktion und Verwendung von siRNAs als Werkzeuge für die RNA-Interferenz bei dem Verfahren zur Abregulierung oder zum Ausschalten der Genexpression, hier der DEGS-Genexpression, ist bei Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 oder Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494 beschrieben. Vorzugsweise zeigen siRNAs eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden, wobei die Identitätsspanne des Sense-Strangs des siRNA vorzugsweise mindestens 19 Nukleotide beträgt.
Ribozyme sind ebenfalls geeignete Werkzeuge zur Hemmung der Translation der Nukleinsäuren, hier das DEGS-Gen, da sie in der Lage sind, spezifisch an mRNAs zu binden und sie zu schneiden. Sie sind bei Amarzguioui et al., (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175–202; Vaish et al., (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237–42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921–2 oder Couture und Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510–5 beschrieben.
Pharmazeutische erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer Nukleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, können einem Patienten mit einer Erkrankung oder Störung, die von einem Typ ist, der DEGS exprimiert oder überexprimiert, verabreicht werden.
Die Menge der Nukleinsäure, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Wo möglich ist es erwünscht, die Nukleinsäurezytotoxizität in vitro zu bestimmen und anschließend in geeigneten Tiermodellsystemen vor der Testung und Verwendung bei Menschen zu bestimmen.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren einschließen, über Liposome, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann die Verwendung solcher Zusammensetzungen zum Erreichen einer verzögerten Freisetzung der Nukleinsäuren geeignet sein. Bei einer speziellen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Liposomen zu verwenden, die über Antikörper auf spezielle identifizierbare Zentralnervensystem-Zelltypen gerichtet sind (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2448–2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337–16342).
Der Begriff „Bindungsprotein" oder „Bindungspeptid" bezieht sich auf eine Klasse von Proteinen oder Peptiden, die DEGS binden und hemmen, und umfasst, ohne Einschränkung, polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Proteingerüste, die gegen DEGS gerichtet sind.
Erfindungsgemäß wird der Begriff Antikörper oder Antikörperfragment auch so verstanden, dass Antikörper- oder Antigen-bindende Teile davon gemeint sind, die rekombinant hergestellt wurden und gegebenenfalls modifiziert wurden, wie chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper und F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe beispielsweise EP-B1-0 368 684 , US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649 , WO 93/06213 oder WO 98/24884 ), vorzugsweise hergestellt mit Hilfe einer FAB-Expressionsbibliothek.
Als eine Alternative zu den klassischen Antikörpern ist es beispielsweise auch möglich, Proteingerüste gegen DEGS zu verwenden, z. B. Anticaline, die auf Lipocalin beruhen (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898–1903). Die natürlichen Liganden-bindenden Stellen der Lipocaline, beispielsweise das Retinol-bindende Protein oder das Bilin-bindende Protein, können verändert werden, beispielsweise mittels eines „kombinatorischen Proteindesign"-Ansatzes auf eine solche Weise, dass sie an ausgewählte Haptene, hier an DEGS, binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337–50). Weitere bekannte Proteingerüste sind als Alternativen zu Antikörpern zur molekularen Erkennung bekannt (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167–187).
Die Verfahrensweise zur Herstellung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments wird gemäß Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann wohlbekannt sind, z. B. durch Immunisieren eines Säugers, beispielsweise eines Kaninchens, mit DEGS, gegebenenfalls in Gegenwart von beispielsweise Freund-Adjuvants und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe beispielsweise Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344–1349). Die polyklonalen Antikörper, die in dem Tier als Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebildet werden, können anschließend aus dem Blut unter Verwendung von wohlbekannten Verfahren isoliert und mittels Säulenchromatographie gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können beispielsweise gemäß des bekannten Verfahrens von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293–299) zubereitet werden.
Im Einzelnen können polyklonale Antikörper, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einem Polypeptid als ein Immunogen hergestellt werden. Bevorzugte polyklonale Antikörperzusammensetzungen sind diejenigen, die für Antikörper gewählt wurden, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder gegen erfindungsgemäße Polypeptide gerichtet waren. Besonders bevorzugte polyklonale Antikörperpräparationen sind diejenigen, die nur Antikörper enthalten, die gegen ein gegebenes Polypeptid oder gegebene Polypeptide gerichtet sind. Besonders bevorzugte Immunogenzusammensetzungen sind diejenigen, die keine anderen menschlichen Proteine enthalten, wie beispielsweise Immunogenzusammensetzungen, die unter Verwendung einer nicht-menschlichen Wirtszelle zur rekombinanten Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids hergestellt wurden. Auf eine solche Weise ist das einzige menschliche Epitop oder Epitope, die von den resultierenden Antikörperzusammensetzungen erkannt werden, die gegen dieses Immunogen gezüchtet wurden, als Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder erfindungsgemäßer Polypeptide vorhanden.
Der Antikörpertiter in dem immunisierten Subjekt kann zeitlich durch Standardtechniken überwacht werden, wie mit einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem Polypeptid. Falls gewünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säuger, z. B. aus dem Blut, isoliert und weiter durch wohlbekannte Techniken gereinigt werden, wie Protein-A-Chromatographie, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Alternativ können Antikörper, die spezifisch auf ein erfindungsgemäßes Protein oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid sind, ausselektiert (z. B. teilweise gereinigt) oder durch z. B. Affinitätschromatographie gereinigt werden. Beispielsweise wird ein rekombinant exprimiertes und gereinigtes (oder teilweise gereinigtes) erfindungsgemäßes Protein, wie hier beschrieben, produziert und kovalent oder nicht-kovalent mit einem festen Träger gekoppelt, wie beispielsweise einer Chromatographiesäule. Anschließend kann die Säule zur Affinitätsreinigung der für die erfindungsgemäßen Proteine spezifischen Antikörper aus einer Probe, die Antikörper enthält, die gegen eine große Anzahl verschiedener Epitope gerichtet sind, verwendet werden, wodurch eine im Wesentlichen gereinigte Anikörperzusammensetzung erzeugt wird, z. B. d. h. eine, die im Wesentlichen frei von verunreinigenden Antikörpern ist. Durch ein im Wesentlichen gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Antikörperprobe höchstens nur 30% (Trockengewicht) kontaminierende Antikörper enthält, die gegen Epitope gerichtet sind, die anders sind als diejenigen auf dem gewünschten erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid und vorzugsweise höchstens 20%, noch stärker bevorzugt höchstens 10% und besonders bevorzugt, höchstens 5% (Trockengewicht) der Probe kontaminierende Antikörper sind. Eine gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet, dass mindestens 99 % der Antikörper in der Zusammensetzung gegen das gewünschte erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gerichtet sind.
Eine geeignete Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die spezifischen Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper-produzierende Zellen aus dem Subjekt erhalten und zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Standardtechniken verwendet werden, wie die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495–497 beschrieben wurde, die menschlichen B-Zellen-Hybridom-Technik (Kotbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72), die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., Seiten 77–96) oder die Trioma-Technik. Die Technologie zur Produktion von Hybridomen ist wohlbekannt (siehe allgemein Current Protocols in Immunology 1994, Coligan et al., (Hrsg.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Hybridomzellen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden durch Screening der Hybridom-Kulturüberstände auf Antikörper, die das Polypeptid von Interesse binden, z. B. unter Verwendung eines ELISA-Standardassays, nachgewiesen.
Alternativ kann zur Herstellung monoklonaler Antikörper-sezernierender Hybridomen ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist, durch Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunoglobulin-Bibliothek (z. B. eine Antikörper-Phage-Displaybibliothek) mit dem Polypeptid von Interesse identifiziert und isoliert werden. Testsätze zur Erzeugung und zum Screening von Phage-Display-Bibliotheken sind im Handel erhältlich (z. B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog-Nr. 27.9400-01; und das Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Katalog-Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die insbesondere zur Verwendung bei der Erzeugung und Screening von Antikörper-Display-Bibliotheken zugänglich sind, beispielsweise in der US-Patentschrift Nr. 5,223,409 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18619 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17271 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/20791 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/15679 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/01288 , PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/01407 , PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/09690 ; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02809 ; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1370–1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81–85; Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12: 725–734, gefunden werden.
Zusätzlich liegen rekombinante Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Teile umfassen, die unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden können, im Rahmen der Erfindung. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in welchem sich verschiedene Teile von verschiedenen tierischen Spezies ableiten, wie diejenigen mit einer variablen Region, die von einer Maus-mAB- und einer menschlichen Immunglobulin-konstanten Region abgeleitet werden. (Siehe z. B. Cabilly et al., US Patent Nr. 4,816,567 ; und Boss et al., US-Patent Nr. 4,816,397 , die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit miteingeschlossen sind. Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus nicht-menschlichen Spezies mit einer oder mehreren komplementären Bestimmungsregionen (CDRs) aus der nicht-menschlichen Spezies und mit einer Rahmenregion aus einem menschlichen Immunglobulinmolekül. (Siehe z. B. Queen, US-Patent, Nr. 5,585,089 , die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit eingeschlossen ist). Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch DNA-Rekombinationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/02671 ; der europäischen Patentanmeldung 184,187 ; der europäischen Patentanmeldung 171,496 ; der europäischen Patentanmeldung 173,494 ; der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 ; US-Patent Nr. 4,816,567 ; der europäischen Patentanmeldung 125,023 ; Retter et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985; Nature 314: 446–449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; US-Patent 5,225-539 ; Jones et al., 1986, Nature 321; 552–525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060, beschrieben werden.
Komplett menschliche Antikörper sind besonders zur therapeutischen Behandlung menschlicher Patienten erwünscht. Solche Antikörper können beispielsweise unter Verwendung von transgenen Mäusen produziert werden, die nicht in der Lage sind, endogene Immunglobulin-schwere und -leichte Kettengene zu exprimieren, sondern die menschliche schwere und leichte Ketten-Gene exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden normalerweise mit einem gegebenen Antigen, z. B. alles oder ein Teil eines erfindungsgemäßen Polypeptids immunisiert. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung der herkömmlichen Hybridom-Technologie erhalten werden. Die menschlichen Immunoglobulin-Transgene, die von den transgenen Mäusen beherbergt werden, rearrangieren während der B-Zellen-Differenzierung und durchlaufen anschließend Klassenverschiebung und somatische Mutation. Somit ist unter Verwendung einer solchen Technik die Produktion therapeutisch geeigneter IgG-, IgA- und IgE-Antikörper möglich. Für einen Überblick über diese Technologie zur Produktion von menschlichen Antikörpern siehe Lonberg und Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93). Für eine ausführliche Diskussion dieser Technologie zur Produktion menschlicher Antikörper und menschlicher monoklonaler Antikörper und Protokolle zur Produktion solcher Antikörper siehe z. B. US-Patent 5,625,126 ; US-Patent 5,633,425 ; US-Patent 5,569,825 ; US-Patent 5,661,016 und US-Patent 5,545,806 . Zusätzlich können Firmen, wie Abgenix, Inc. (Freemont, CA), damit betraut werden, menschliche Antikörper bereitzustellen, die gegen ein ausgewähltes Antigen unter Verwendung von Technologie, entsprechend derjenigen, die oben beschrieben ist, bereitzustellen.
Vollständig menschliche Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können unter Verwendung einer als „geführte Selektion" bezeichneten Technik erzeugt werden. Bei diesem Ansatz wird ein ausgewählter, nicht-menschlicher monoklonaler Antikörper, z. B. ein muriner Antikörper, zur Führung der Selektion eines komplett menschlichen Antikörpers, der das Epitop erkennt (Jespers et al., 1994, Bio/Technology 12: 899–903) verwendet.
Antikörperfragmente, die die Idiotypen eines Proteins, insbesondere DEGS, enthalten, können durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind jedoch nicht beschränkt auf, das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls produziert werden kann; das Fab'-Fragment, das durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments hergestellt werden kann; das Fab-Fragment, das durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden kann; und Fv-Fragmente.
Bei der Herstellung von Antikörpern kann das Screening auf den gewünschten Antikörper durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken, z. B. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) erreicht werden. Zur Selektion von Antikörpern, die auf eine bestimmte Domäne des Proteins spezifisch sind, oder ein Derivat davon, können erzeugte Hybridome auf ein Produkt getestet werden, das an das Fragment des Proteins oder ein Derivat davon bildet, das eine solche Domäne enthält.
Die vorgenannten Antikörper können bei auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren verwendet werden, die die Lokalisation und/oder Quantifikation des gegebenen Proteins oder der gegebenen Proteine, z. B. zur Abbildung dieser Proteine, Messen der Spiegel davon in entsprechenden physiologischen Proben (durch Immunassay), in diagnostischen Verfahren etc. betreffen. Dies trifft auch für ein Derivat oder Homolog von DEGS zu.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der DEGS-Inhibitor eine siRNA mit der Sequenz:
UGUGGAAUCGCUGGUUUGG
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der DEGS-Inhibitor eine siRNA mit der Sequenz:
GUUAUCAAUACCGUGGCAC
Wie vorstehend erklärt, wurde überraschenderweise in dem Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass DEGS die Sekretion von Abeta-42 senkt oder abschwächt. Somit regelt sie direkt oder indirekt die Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretaseaktivität. Darum senkt bei einer bevorzugten Ausführungsform der Inhibitor oder ein wechselwirkendes Molekül die Abeta-42-Sekretion oder moduliert die Aktivität von Beta-Sekretase und/oder Gamma-Sekretase.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Modulieren der Aktivität von Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase", dass die Aktivität insofern herabgesetzt ist, als weniger oder kein Produkt gebildet wird (partielle oder vollständige Hemmung) oder dass das jeweilige Enzym ein unterschiedliches Produkt (im Falle von Gamma-Sekretase, z. B. Abeta-40 anstelle von Abeta-42) produziert oder dass die relativen Mengen der Produkte verschieden sind (in dem Fall von Gamma-Sekretase z. B. mehr Abeta-40 als Abeta-42).
Überall in der Erfindung umfasst der Begriff „Modulieren der Aktivität von Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase", dass die Aktivität des Enzyms direkt oder indirekt moduliert wird. Dies bedeutet, dass der DEGS-Modulator entweder auch direkt an das Enzym binden kann oder stärker bevorzugt einen Einfluss auf DEGS ausüben kann, der wiederum, z. B. durch Protein-Protein-Wechselwirkungen oder durch Signaltransduktion über kleine Metaboliten, die Aktivität der Enzyme moduliert.
Ferner ist eingeschlossen, dass der Modulator entweder Gamma-Sekretase oder Beta-Sekretase oder die Aktivität beider Enzyme moduliert.
Überall in der Erfindung ist es bevorzugt, dass der Beta-Sekretasemodulator die Aktivität von Beta-Sekretase entweder vollständig oder partiell hemmt.
Bezüglich des Modulators der Gamma-Sekretase-Aktivität ist es bevorzugt, dass dieser Modulator die Gamma-Sekretaseaktivität hemmt. Allerdings ist es auch bevorzugt, dass die Aktivität von Gamma-Sekretase auf eine Weise verschoben ist, dass mehr Abeta-40 anstelle von Abeta-42 produziert wird.
Die Gamma-Sekretaseaktivität kann z. B. durch Bestimmen des APP-Prozessierens, z. B. durch Bestimmen, ob Abeta-40 oder Abeta-42 produziert wird (siehe Beispielabschnitt, infra) gemessen werden.
Zur Messung der BACE1-Aktivität können Änderungen des Verhältnisses zwischen Alpha- und Beta-C-terminalen APP-Fragmenten durch Western Blot analysiert werden (Blasko et al., J. Neural. Transm. 111, 523); zusätzliche Beispiele für BACE1-Aktivitätsassays umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Verwendung eines zyklisierten Enzymdonor-Peptids, enthaltend eine BACE1-Spaltungsstelle, um die Beta-Galaktosidase-Reporteraktivität zu rekonstituieren und zu messen (Naqvi et al., J. Biomol. Screen. 9, 398); Verwendung von gequenchten fluorimetrischen Peptidsubstraten und Fluoreszenzmessungen (Andrau et al., J. Biol. Chem. 278, 25859); Verwendung von Zell-basierten Assays unter Verwendung von rekombinanten chimären Proteinen, in denen ein Enzym (wie alkalische Phosphatase) über eine Spannung von Aminosäuren, die die BACE1-Rekognitionssequenz enthalten, über ein Golgi-Residenzprotein (Oh et al., Anal. Biochem. 323, 7); Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-(FRET)-basierte Tests (Kennedy et al., Anal. Biochem. 319, 49); ein Zellwachstumsselektionssystem in Hefe (Luthi et al., Biochim. Biophys. Acta 1620, 167).
Vorzugsweise ist die neurodegenerative Krankheit Alzheimer-Krankheit.
Erfindungsgemäß wird das DEGS-Wechselwirkungsmolekül zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet.
Darum stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die an ein Individuum in einer wirksamen Menge verabreicht werden können. Bei einem bevorzugten Aspekt wird das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt. Das Individuum ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tiere, wie Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde etc., und ist bevorzugt ein Säuger und besonders bevorzugt ein Mensch. Bei einer speziellen Ausführungsform ist ein nicht-menschlicher Säuger das Individuum.
Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums eingesetzt werden, z. B. Verkapselung in Liposomen, Mikropartikel und Mikrokapseln; Verwendung von rekombinanten Zellen, die in der Lage sind, die Therapie zu exprimieren; Verwendung von Rezeptor-vermittelter Endozytose (z. b. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432); Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder eines anderen Vektors etc. Verfahren zur Hemmung umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Wege. Die Verbindungen können über jeden zweckmäßigen Weg, beispielsweise durch Infusion, durch Bolus-Injektion, durch Absorption über Epithel- oder Mukokutan-Auskleidungen (z. b. Oral-, Rektal- und Intestinal-Mukosa etc.) verabreicht werden und können zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal sein. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in das Zentralnervensystem über jeden geeigneten Weg, einschließlich intraventrikuläre und intrathekale Injektion, einzubringen; intraventrikuläre Injektion kann erleichtert werden durch einen intraventrikulären Katheter; beispielsweise verbunden mit einem Reservoir, wie einem Ommaya-Reservoir. Die pulmonale Verabreichung kann ebenfalls eingesetzt werden, z. B. durch Verwendung eines Inhalationsgerätes oder eines Verneblers, und Formulierung mit aerosolisierendem Mittel.
Bei einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal an den Bereich, der behandlungsbedürftig ist, zu verabreichen. Dies kann beispielsweise und uneingeschränkt durch lokale Infusion während einer Operation, durch topische Applikation, z. B. in Verbindung mit einer Wundauflage nach einer Operation, durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Suppositoriums oder mittels eines Implantats erreicht werden, wobei das Implantat ein poröses, nicht-poröses oder gelatineartiges Material ist, einschließlich von Membranen, wie sialastische Membranen oder Fasern. Bei einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an die Stelle (oder ehemalige Stelle) eines malignen Tumors oder von neoplastischem oder präneoplastischem Gewebe erfolgen.
Bei einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom (Langer, 1990, Science 249: 1527–1533; Treat et al., 1989, In: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler, Hrsg., Liss, New York, Seiten 353–365; Lopez-Berestein, ibid., Seiten 317–327, siehe allgemein ibid.) verabreicht werden.
Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann das Therapeutikum über ein kontrolliertes Freisetzungssystem verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Pumpe eingesetzt werden (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201–240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507–516; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574–579). Bei einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974: Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball, Hrsg., Wiley, New York, 1984; Ranger und Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; Levy et al., 1985, Science 228: 190–192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351–356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 858–863). Bei wieder einer anderen Ausführungsform kann ein kontrolliertes Freisetzungssystem in der Nähe des therapeutischen Ziels, z. B. des Gehirns, angeordnet werden, wodurch somit nur ein Bruchteil der syntemischen Dosis erforderlich ist (z. B. Goodson, 1984, In: Medical Applications of Controlled Release, supra, Bd. 2, Seiten 115–138). Weitere kontrolliert freisetzende Systeme sind in der Übersicht von Langer (1990, Science 249: 1527–1533) besprochen.
Bei einer speziellen Ausführungsform, wobei das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, die vorzugsweise ein Protein-Therapeutikum codiert, kann die Nukleinsäure in vivo zur Beschleunigung der Expression von seinem codierten Protein durch seine Konstruktion als Teil eines geeignete Nukleinsäure-Expressionsvektors und seine Verabreichung, so dass es intrazellulär wird, z. B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors ( US-Patent Nr. 4,980,286 ) oder durch direkte Injektion oder durch Verwendung von Mikroteilchen-Bombardierung (z. B. eine Genpistole; Biolistic, Dupont) oder durch sein Beschichten mit Lipiden, Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch seine Verabreichung in Verbindung mit einem Homöobox-artigen Peptid, das bekanntlich in den Kern eintritt (z. B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864–1868), etc., verabreicht werden. Alternativ kann ein Nukleinsäure-Therapeutikum intrazellulär eingebracht und durch homologe Rekombination in Wirtszellen-DNA zur Expression eingebaut werden.
Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Bei einer speziellen Ausführungsform bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglich" die Genehmigung durch eine Aufsichtsbehörde der Bundesregierung oder der Länderregierung oder die Auflistung in der US-Pharmacopoeia oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmacopoeia zur Verwendung in Tieren und insbesondere in Menschen. Der Begriff „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Exzipiens oder Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich derjenigen von Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich, jedoch nicht begrenzt, auf Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen sein. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung oral verabreicht wird. Kochsalzlösung und wässrige Dextrose sind bevorzugte Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen werden bevorzugt als flüssige Träger für injizierbare Lösungen eingesetzt. Geeignete pharmazeutische Exzipienten umfassen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Kieselgel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Die Zusammensetzung kann, sofern gewünscht, auch kleinere Mengen von Netz- oder Emulgiermitteln oder von pH-Puffermitteln enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, verzögert freisetzenden Formulierungen und dergleichen einnehmen. Die Zusammensetzung kann als Suppositorium mit traditionellen Bindemitteln und Trägern, wie Triglyceriden, formuliert sein. Eine orale Formulierung kann Standardträger einschließen, wie Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natrium, Saccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. von pharmazeutischer Qualität. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge des Therapeutikums vorzugsweise in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, so dass die Form zur ordnungsgemäßen Verabreichung an den Patienten bereitgestellt wird. Die Formulierung sollte der Verabreichungsweise angepasst sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß Routineverfahrensweisen als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen ausgelegt ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Wo notwendig, kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum, wie Lidocain, zur Schmerzlinderung an der Stelle der Injektion einschließen. Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder getrennt oder miteinander vermischt in einer Dosierungseinheitsform, beispielsweise als trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Beutel, der die Menge an Wirkstoff angibt, geliefert. Wo die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, die steriles Wasser oder Kochsalzlösung von pharmazeutischer Qualität enthält, dispensiert werden. Wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung zur Injektion bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden können.
Die erfindungsgemäßen Therapeutika können als neutrale Form oder als Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie diejenigen, die sich von Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure etc. ableiten, diejenigen, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie diejenigen, die sich von Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc. ableiten, und diejenigen, die sich von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- und Eisen(III)-Hydroxiden etc. ableiten.
Die Menge des erfindungsgemäßen Therapeutikums, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Zusätzlich können in vitro Assays gegebenenfalls zur Unterstützung der Identifizierung optimaler Dosisbereiche eingesetzt werden. Die exakte zu verabreichende Dosis in der Formulierung hängt auch von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Erkrankung oder Störung ab und sollte nach der Beurteilung des praktischen Arztes und jeweils nach den Umständen des Patienten entschieden werden. Allerdings betragen geeignete Dosierungsbereiche zur intravenösen Verabreichung im Allgemeinen etwa 20–500 Mikrogramm aktive Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosisbereiche zur intranasalen Verabreichung betragen im Allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Antwort-Kurven extrapoliert werden, die sich von in vitro oder tierischen Modelltestsystemen ableiten.
Suppositorien enthalten im Allgemeinen Wirkstoff im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%, orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10% bis 95% Wirkstoff.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen pharmazeutischen Testsatz bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gefüllt sind. Gegebenenfalls in Verbindung mit solchen Behälter(n) kann eine Notiz in der Form vorliegen, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei die Notiz die Zulassung durch die Behörde der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
Die erfindungsgemäßen Testsätze können auch ein Expressionsvektor-codierendes DEGS oder ein wechselwirkendes oder bindendes Protein oder Polypeptid enthalten, das zur Expression von DEGS oder des entsprechenden wechselwirkenden oder bindenden Proteins oder Polypeptids verwendet werden kann. Ein solcher Testsatz enthält vorzugsweise auch die erforderlichen Puffer und Reagenzien. Gegebenenfalls in Verbindung mit solchen Behältern) kann eine Notiz in der Form vorliegen, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei die Notiz die Zulassung durch die Behörde der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs zur menschlichen Verabreichung wiedergibt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung, wobei eine wirksame Menge von einem DEGS-Wechselwirkungsmolekül oder Inhibitor oder von einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Individuum verabreicht wird, das an einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, leidet.
Bezüglich dieses erfindungsgemäßen Verfahrens treffen sämtliche Ausführungsformen zu, die nachstehend zur Umsetzung der Erfindung angegeben sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines Gamma-Sekretasemodulators und/oder eines Beta-Sekretasemodulators, umfassend die folgenden Schritte:

a. Identifizierung eines DEGS-Wechselwirkungsmoleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Testverbindung ein DEGS-Wechselwirkungsmolekül ist,
b. Bestimmen, ob das DEGS-Wechselwirkungsmolekül von Schritt a) zur Modulierung der Gamma-Sekretaseaktivität oder der Beta-Sekretaseaktivitätin der Lage ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt a) die Testverbindung mit DEGS in Kontakt gebracht, und die Wechselwirkung von DEGS mit der Testverbindung wird bestimmt. Vorzugsweise wird gemessen, ob das Kandidatenmolekül an DEGS gebunden wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise im Zusammenhang eines durchsatzstarken Assays durchgeführt. Solche Assays sind den Fachleuten bekannt.
Zu screenendes Test- oder Kandidatenmoleküle können als Gemische einer begrenzten Anzahl von festgelegten Verbindungen oder als Verbindungsbibliotheken, Peptidbibliotheken und dergleichen bereitgestellt werden. Mittel/Moleküle, die zu screenen sind, können auch sämtliche Formen von Antiseren, Antisense-Nukleinsäuren etc. einschließen, die die DEGS-Aktivität oder -expression modulieren können. Beispielhafte Kandidatenmoleküle und Bibliotheken zum Screening sind nachstehend aufgeführt.
Das Screening der Bibliotheken kann durch jedes aus einer Vielzahl von allgemein bekannten Verfahren erreicht werden. Siehe z. B. die folgenden Referenzen, die das Screening von Peptid-Bibliotheken offenbaren: Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215–218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386–390; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393–5397; Yu et al., 1994, Cell 76: 933–945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577–580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564–566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988–6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850–852; US-Patent Nr. 5,096,815 , US-Patent Nr. 5,223,409 und US-Patent Nr. 5,198,346 , alle an Ladner et al.; Rebar und Pabo, 1993, Science 263: 671–673; und internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/18318 .
Bei einer speziellen Ausführungsform kann das Screening durch Zusammenbringen der Bibliotheksmitglieder mit einer DEGS, die auf einer festen Phase immobilisiert ist, und Ernten derjenigen Bibliotheksmitglieder, die an das Protein binden (oder die Nukleinsäure oder Derivate codieren), durchgeführt werden. Beispiele für solche Screeningverfahren, die „Panning"-Techniken genannt werden, werden bei Parmley und Smith, 1988; Gene 73: 305–318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422–427; internationale Patentveröffentlichung NR. WO 94/18318 ; und in den hier zuvor zitierten Druckschriften beispielhaft beschrieben.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden DEGS-Fragmente und/oder -Analoge, insbesondere Peptidomimetika, auf Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Gegenwart von DEGS (z. B. DEGS-Expression oder -Stabilität) oder insbesondere auf DEGS-Aktivität in der Zelle gescreent.
Bei einer Ausführungsform können Mittel, die die DEGS-Aktivität modulieren (d. h. hemmen oder aktivieren), für die Verwendung eines Abeta-42-Sekretionsassays gescreent werden, wobei die Mittel auf ihre Fähigkeit zur Modulierung der DEGS-Aktivität unter wässrigen oder physiologischen Bedingungen gescreent werden, wobei DEGS in Abwesenheit des zu testenden Mittels aktiv ist. Vorzugsweise sind die Kandidatenmittel Mittel, die mit DEGS Wechselwirken oder daran binden. Mittel, die mit der Sekretion von Abeta-42 interferieren, werden als Inhibitoren der DEGS-Aktivität identifiziert. Mittel, die die Sekretion von Abetaq-42 beschleunigen, werden als Aktivatoren von DEGS identifiziert.
Vorzugsweise kann ein zweistufiges Verfahren eingesetzt werden, das umfasst (a) Identifizieren von Modulatoren ein einem DEGS-Aktivitätsassay (wie beschrieben bei Triola G., Fabrias G., Llebaria A. (2001), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., vorstehend zitiert) und (b) Testung der Modulatoren auf Abeta-42-senkende oder -abschwächende Aktivität.
Verfahren zum Screening, insbesondere Verfahren zum Screening auf Mittel, die an DEGS binden, können das Markieren von DEGS mit Radioliganden (z. B. ¹²⁵I oder ³H), magnetischen Liganden (z. B. paramagnetischen Kügelchen, die kovalent an Photobiotinacetat gebunden sind), fluoreszierende Liganden (z. B. Fluorescein oder Rhodamin) oder Enzymliganden (z. B. Luciferase oder β-Galactosidase) umfassen. Die Reaktanten, die in Lösung binden, können sodann durch eine von vielen auf dem Fachgebiet bekannten Techniken isoliert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Co-Immunpräzipitation des markierten Proteins unter Verwendung von Antiseren gegen den unmarkierten Bindungspartner (oder den markierten Bindungspartner mit einem unterscheidbaren Marker von demjenigen, der auf dem zweiten markierten Protein verwendet wird), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie und Dichtegradientenzentrifugation. Bei einer Ausführungsform ist der markiere Bindungspartner ein kleines Fragment oder ein Peptidomimentikum, das nicht durch ein im Handel erhältliches Filter zurückgehalten wird. Beim Binden ist dann die markierte Spezies nicht in der Lage, das Filter zu passieren, wobei ein einfacher Bindungsassay bereitgestellt wird.
Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, werden zur Markierung von mindestens einem der Proteine oder Polypeptide eingesetzt. Geeignete Markierungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Radiomarkieren durch Einbau von radioaktiv markierten Aminosäuren, z. B. ³H Leucin oder ³⁵S-Methionin, radioaktives Markieren durch posttranslationale Iodierung mit ¹²⁵I oder ¹³¹I unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens, Bolton-Hunter-Reagentien etc., oder Markieren mit ³²P unter Verwendung von Phosphorylase und anorganischem radioaktiv markiertem Phosphor, Biotin-Markieren mit Photobiotinacetat und Exposition mit Höhensonne, etc. In Fällen, wobei einer der Bindungspartner immobilisiert ist, z. B. wie infra beschrieben, wird die freie Spezies markiert. Wo keine der wechselwirkenden Spezies immobilisiert ist, kann jede mit einem unterscheidbaren Marker markiert werden, derart, dass die Isolierung beider Partner verfolgt werden kann, um eine genauere Quantifizierung bereitzustellen und um die Bildung z. B. eines homomeren von einem heteromeren Binden zu unterscheiden. Verfahren, die akzessorische Proteine verwenden, die an einen der modifizierten Partner binden, um die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern, die Stabilität des Bindens zu erhöhen etc. werden bereitgestellt.
Die gleichen Markierungsverfahren, wie vorstehend beschrieben, können auch zur Markierung z. B. von APP, Abeta-40 oder Abeta-42, beispielsweise zur Bestimmung der Menge an sezerniertem Abeta-40 oder Abeta-42 in einem Abeta-Sekretionsassay verwendet werden.
Typische Bindungsbedingungen liegen beispielsweise, jedoch nicht einschränkend, in einer wässrigen Salzlösung vor von 10–250 mM NaCl, 5–50 mM Tris-HCl, pH 5–8 und 0,5% Triton X-100 oder in einem anderen Detergens, das die Wechselwirkungsspezifität verbessert. Metallchelatbildner und/oder zweiwertige Kationen können zugesetzt werden, um das Binden zu verbessern und/oder die Proteolyse herabzusetzen. Reaktionstemperaturen können 4, 10, 15, 22, 25, 35 oder 42 Grad Celsius umfassen und die Inkubationszeit beträgt typischerweise mindestens 15 Sekunden, jedoch sind längere Zeiten bevorzugt, um den Eintritt des Bindungsgleichgewichts zu ermöglichen. Ein bestimmtes Binden kann unter Verwendung von routinemäßigen Proteinbindungsassays überprüft werden, um die optimalen Bindungsbedingungen für reproduzierbares Binden zu bestimmen.
Die physikalischen Bindungsparameter können durch Quantifizierung des Bindens unter Verwendung von Assayverfahren ausgewertet werden, die für die eingesetzte Markierung spezifisch sind, z. B. Flüssigkeitsszintillationszählen zum Radioaktivitätsnachweis, Enzymaktivität für Enzym-markierte Gruppierungen etc. Die Reaktionsergebnisse werden dann unter Verwendung des Scatchard-Analyse, Hill-Analyse und von anderen allgemein auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (siehe z. B. Proteins, Structures, an Molecular Principles, 2. Ausgabe (1993) Creighton, Hrsg., W. H. Freman und Company, New York) ausgewertet.
Bei einem zweiten allgemeinen Ansatz für Bindungsassays wird eine der bindenden Spezies auf einem Filter, in einer Mikrotiterplattenvertiefung, in einem Teströhrchen, an einer Chromatographiematrix etc. entweder kovalent oder nicht-kovalent immobilisiert. Proteine können unter Verwendung jedes auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahrens kovalent immobilisiert werden, beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf, das Verfahren von Kadonaga und Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889–5893, d. h. Verknüpfung mit einem Cyanogenbromid-derivatisierten Substrat, wie CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Wo notwendig, kann die Verwendung von Spacern sterische Hinderung durch das Substrat herabsetzen. Nicht-kovalente Verknüpfung von Proteinen mit einem Substrat umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Verknüpfen eines Proteins mit einer geladenen Oberfläche, Binden mit spezifischen Antikörpern, Binden an ein drittes unbeteiligtes Wechselwirkungsprotein, etc.
Assays von Mitteln (einschließlich von Zellextrakten oder eines Bibliothekspools), die um das Binden eines gegebenen Moleküls an DEGS konkurrieren, werden zum Screening auf Kompetitoren, Enhancer oder auf Mittel mit speziell erwünschten Bindungsmerkmalen (z. B. niedrigere oder höhere Affinität) im Vergleich mit einem gegebenen Bindungspartner bereitgestellt. Wiederum kann entweder das Molekül oder DEGS mit jedem beliebigen Mittel (z. B. diejenigen Mittel, die vorstehend beschrieben wurden) markiert werden.
Bei speziellen Ausführungsformen sind Blockierungsmittel zur Hemmung des nicht-spezifischen Bindens von Reaktanten an andere Proteine oder Absorptionsverluste von Reagenzien an Kunststoffe, Immobilisierungsmatrices etc. in dem Testgemisch eingeschlossen. Blockierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Rinderserumalbumin, Casein, fettfreie Trockenmilch, Denhardt's Reagenz, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon, nicht-ionische Detergentien (NP40, Triton X-100, Tween 20, Tween 80 etc.), ionische Detergentien (z. B. SDS, LDS etc.), Polyethylenglycol etc. Geeignete Blockierungsmittelkonzentrationen erlauben spezifisches Binden.
Nach Durchführung der Bindung wird ungebundenes markiertes Mittel in dem Überstand entfernt, und das immobilisierte Protein (oder, sofern zutreffend, das immobilisierte Mittel), das jegliches gebundene markierte Mittel zurückhält, wird ausgiebig gewaschen. Die Menge an gebundener Markierung wird anschließend unter Verwendung von Standardverfahren auf dem Fachgebiet quantitativ bestimmt, um die Markierung, wie supra beschrieben, nachzuweisen.
Bei anderen speziellen Ausführungsformen kann das Screening auf Modulatoren des Proteins, wie hier vorgesehen, durch Verknüpfen dieser und/oder der Antikörper, wie hier vorgesehen, mit einem festen Träger durchgeführt werden.
Die Herstellung einer solchen Aneinanderreihung, die verschiedene Typen von Proteinen (einschließlich von Antikörpern) enthält, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und einem Fachmann geläufig (siehe z. B. Ekins et al., 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7: 155–168; Mitchell et al., 2002, Nature Biotechnol. 20: 225–229; Petricoin et al., 2002, Lancet 359: 572–577; Templin et al., 2001, Trends Biotechnol. 20: 160–166; Wilson und Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 81–85; Lee et al., 2002, Science 295: 1702–1705; MacBeath und Schreiber, 2000, Science 289: 1760; Blawas und Reichert, 1998, Biomaterials 19: 595; Kane et al., 1999, Biomaterials 20: 2363; Chen et al., 1997, Science 276: 1425; Vaugham et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 309–314; Mahler et al., 1997, Immunotechnology 3: 31–43; Roberts et al., 1999, Curr. Opin, Chem. Biol. 3: 258–273; Nord et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 772–777; Nord et al., 2001, Eur. J. Biochem. 268: 4269–4277; Brody und Bold, 2000, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5–13; Karstroem und Nygren, 2001, Anal. Biochem. 295: 22–30; Nelson et al., 2000, Electrophoresis 21: 1155–1163; Honore et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 3: 265–274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn. 2: 145–152, Figeys und Pinto, 2001, Electrophoresis 2: 208–216 und Druckschriften in den hier aufgeführten Veröffentlichungen).
Proteine oder andere Mittel können durch verschiedene Mittel an eine Aneinanderreihung angeknüpft werden, wie es einem Fachmann geläufig ist. Proteine können beispielsweise der Aneinanderreihung über ein TAP-Anhängsel (wie in WO/0009716 und bei Rigaut et al., 1999, Nature Biotechnol. 10: 1030–1032 beschrieben), nach dem Reinigungsschritt oder durch ein anderes geeignetes Reinigungsschema, wie es einem Fachmann geläufig ist, zugesetzt werden.
Gegebenenfalls können Funktionstests durchgeführt werden, um die Integrität des an die Matrix gebundenen Proteins zu überprüfen, wie es einem Fachmann geläufig ist, wovon einige beispielhaft hier bereitgestellt sind.
Gegebenenfalls kann eine Anknüpfung der Proteine oder des Antikörpers, wie vorstehend ausgeführt, weiterhin durch diverse Verfahren, die einem Fachmann geläufig sind, dokumentiert werden. Dieses umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Oberflächen-Plasmonresonanz (siehe z. B. McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 572–577; Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19: 217–222; Weinberger et al., 2000, 1: 395–416; Pearson et al., 2000, Ann. Clin. Biochem. 37: 119–145; Vely et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 313–321; Slepak, 2000, J. Mol. Recognit. 13: 20–26.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der Produktion von Abeta-40- und Abeta-42-Peptiden durch ELISA geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Vassar R. et al., 1999, Science, 286: 735–41 beschrieben sind.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der Produktion von C-terminalen APP-Fragmenten in Zelllinien oder transgenen Tieren durch Western-Blot geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Yan R. et al., 1999, Nature, 402: 533–7 beschrieben sind.
Beispielhafte Assays, die zum Messen der proteolytischen Aktivität von Beta- oder Gamma-Sekretasen gegenüber bakteriell exprimierten APP-Fragmenten in vitro geeignet sind (z. B. durch Modifizieren der Expression von DEGS-Proteinen in Zellen mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die das DEGS-Protein codieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Tian G. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 31499–505 beschrieben sind.
Beispielhafte Tests, die zum Messen der Transaktivierung eines Gal4-angetriebenen Reportergens geeignet sind (z. B. durch Modifizieren der Expression von DEGS mittels RNAi (siRNA) und/oder Plasmiden, die DEGS-Protein codieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die bei Cao X. et al., 2001, Science, 293: 115–20 beschrieben sind.
Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Molekül kann auf seine Fähigkeit getestet werden, ein erfindungsgemäßes wechselwirkendes Molekül oder ein erfindungsgemäßer Inhibitor zu sein. Kandidatenmoleküle können einer Zelle, die DEGS exprimiert, direkt bereitgestellt werden, oder im Falle von Kandidatenproteinen können sie durch Bereitstellen ihrer codierenden Nukleinsäuren unter Bedingungen, wobei die Nukleinsäuren rekombinant exprimiert werden, um das Kandidatenprotein zu produzieren, bereitgestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gut zum Screening chemischer Bibliotheken auf Moleküle geeignet, die die Menge oder Aktivität des Proteins, insbesondere von DEGS, modulieren, z. B. hemmen, antagonisieren oder agonisieren. Die chemischen Bibliotheken können Peptidbibliotheken, peptidomimentische Bibliotheken, chemisch synthetisierte Bibliotheken, rekombinante, z. B. Phage-Display-Bibliotheken, und in vitro Translations-basierte Bibliotheken, andere nicht-peptidische, synthetische organische Bibliotheken etc. sein.
Beispielhafte Bibliotheken sind im Handel aus mehreren Quellen (ArQule, Tripos/PanLabs, ChemDesign, Pharmacopoeia) erhältlich. In einigen Fällen werden diese Bibliotheken unter Verwendung von rekombinatorischen Strategien erzeugt, die die Identität eines jeden Mitglieds der Bibliothek auf einem Substrat codieren, an das die Mitgliedsverbindung geknüpft ist, was somit die direkte und unmittelbare Identifizierung eines Moleküls erlaubt, das ein wirksamer Modulator ist. Somit legt bei vielen kombinatorischen Ansätzen die Position auf einer Platte einer Verbindung die Zusammensetzung dieser Verbindung fest. Ebenfalls kann in einem Beispiel eine einzelne Plattenposition 1–20 Chemikalien aufweisen, die durch Verabreichen an eine Vertiefung gescreent werden können, die die Wechselwirkungen von Interesse enthält. Wenn Modulation nachgewiesen wird, können somit immer kleinere Pools von wechselwirkenden Paaren auf die Modulationsaktivität getestet werden. Durch solche Verfahren können viele Kandidatenmoleküle gescreent werden.
Viele Diversitätsbibliotheken, die zur Verwendung geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt und können zur Bereitstellung von erfindungsgemäßen zu testenden Verbindungen eingesetzt werden. Alternativ können Bibliotheken unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert werden. Chemische (synthetische) Bibliotheken, rekombinante Expressionsbibliotheken oder Polysomen-basierte Bibliotheken sind beispielhafte Typen von Bibliotheken, die verwendet werden können.
Die Bibliotheken können rigide oder semi-rigide (mit einem gewissen Grad an struktureller Rigidität) oder linear oder nicht-rigide sein. Die Bibliothek kann eine cDNA- oder genomische Expressionsbibliothek sein, eine statistische Peptidexpressionsbibliothek oder eine chemisch synthetisierte statistische Peptidbibliothek oder eine Nicht-Peptid-Bibliothek sein. Expressionsbibliotheken werden in die Zellen eingebracht, in denen der Test erfolgt, wo die Nukleinsäuren der Bibliothek unter Produktion ihrer codierten Proteine exprimiert werden.
Bei einer Ausführungsform können Peptidbibliotheken, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Bibliotheken sein, die in vitro chemisch synthetisiert werden. Beispiele für solche Bibliotheken sind bei Houghten et al., 1991, Nature 354: 84–86 angegeben, der Gemische von freien Hexapeptiden beschreibt, in denen die ersten und zweiten Reste in jedem Peptid individuell und spezifisch definiert wurden; und bei Lam et al., 1991, Nature 354: 82–84, die einen „Ein-Perlen-, ein Peptid"-Ansatz beschreiben, wobei ein Festphasen-Spaltsyntheseschema eine Bibliothek von Peptiden erzeugte, wobei jede Perle in der Kollektion daran eine einzelne statistische Sequenz von Aminosäureresten immobilisiert hatte; (Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709–710, die Spaltsynthese- und T-Bag-Syntheseverfahren beschreiben; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233–1251. Einfach anhand anderer Beispiele kann eine kombinatorische Bibliothek zur Verwendung nach dem Verfahren von Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922–10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422–11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614–1618; oder Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708–11712 hergestellt werden. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/20242 und Brenner und Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381–5383 beschreiben „codierte kombinatorische chemische Bibliotheken", die Oligonukleotid-Identifizierer für jedes chemische polymere Bibliotheksmitglied enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die gescreente Bibliothek eine biologische Expressionsbibliothek, die eine statistische Peptid-Phage-Display-Bibliothek ist, wobei die statistischen Peptide eingeschränkt sind (z. B. aufgrund des Vorliegens von Disulfid-Bindung).
Weiterhin können auch allgemeine, strukturell eingeschränkte, organische Diversitäts-(z. B. Nicht-Peptid)-Bibliotheken verwendet werden. Beispielsweise kann eine Benzodiazepin-Bibliothek (siehe z. B. Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708–4712) verwendet werden.
Konformationell eingeschränkte Bibliotheken, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die invariante Cysteinreste enthalten, die in einer oxidierenden Umgebung über Disulfid-Bindungen unter Bildung von Cysteinen, modifizierten Peptiden (z. B. Difluor, Metalle, Isotopenmarkierungen einschließen, die phosphoryliert sind etc.), Peptiden, die eine oder mehrere nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, Nicht-Peptid-Strukturen und von Peptiden, die einen nennenswerten Bruchteil an Carboxyglutaminsäure enthalten, vernetzen.
Bibliotheken von Nicht-Peptiden, z. B. Peptidderivaten (beispielsweise die eine oder mehrere nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Ein Beispiel für diese sind Peptoid-Bibliotheken (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367–9371). Peptoide sind Polymere, nicht-natürliche Aminosäuren, die natürlich vorkommende Seitenketten aufweisen, die nicht an den Alpha-Kohlenstoff, sondern an den Hauptketten-Aminostickstoff gebunden sind. Da Peptoide durch menschliche Verdauungsenzyme nicht leicht abgebaut werden, sind sie zweckmäßigerweise leichter der Arzneimittelverwendung anpassbar. Ein weiteres Beispiel einer Bibliothek, die verwendet werden kann, wobei die Amid-Funktionalitäten in Peptiden zur Erzeugung einer chemisch transformierten kombinatorischen Bibliothek permethyliert wurden, ist von Ostresh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11138–11142 beschrieben.
Die Mitglieder der Peptidbibliotheken, die erfindungsgemäß gescreent werden können, sind nicht beschränkt darauf, die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren zu enthalten. Insbesondere erlauben chemisch synthetisierte Bibliotheken und Polysom-basierte Bibliotheken die Verwendung von Aminosäuren zusätzlich zu den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (durch ihren Einschluss in den Vorläuferpool von Aminosäuren, die bei der Bibliothekserstellung verwendet werden). Bei speziellen Ausführungsformen enthalten die Bibliotheksmitglieder eine oder mehrere nicht-natürliche oder nicht-klassische Aminosäuren oder zyklische Peptide. Nicht-klassische Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die D-Isomere der allgemeinen Aminosäuren – Aminoisobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, Abu, 2-Aminobuttersäure; -Abu, -Ahx, 6-Aminohexansäure; Aib, 2-Aminoisobuttersäure; 3-Aminopropionsäure; Ornithin; Norleucin; Norvalin, Hydroxypropolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren, wie β-Methylaminosäuren, C-Methylaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Fluoraminosäuren und Aminosäureanaloge im Allgemeinen. Außerdem kann die Aminosäure D (rechtsrotatorisch) oder L (linksrotatorisch) sein.
Bei einer speziellen Ausführungsform werden Fragmente und/oder Analoge von erfindungsgemäßen Proteinen, insbesondere Peptidomimetika, auf Aktivität als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der DEGS-Expression (z. B. Stabilität) oder -Aktivität gescreent.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die kombinatorische Chemie zur Identifizierung von DEGS-Modulatoren verwendet werden. Die kombinatorische Chemie ist zur Erzeugung von Bibliotheken in der Lage, die hunderttausende von Verbindungen enthält, wovon viele strukturell ähnlich sein können. Obgleich durchsatzstarke Screeiningprogramme in der Lage sind, diese riesigen Bibliotheken auf Affinität gegenüber bekannten Zielen zu screenen, wurden neue Ansätze entwickelt, die kleiner dimensionierte Bibliotheken erreichen, die allerdings eine maximale chemische Diversität bereitstellen (siehe z. B. Matter, 1997, J. Med. Chem. 40: 1219–1229).
Ein Verfahren der kombinatorischen Chemie, das Affinitäts-Fingerprinting, wurde bisher zum Testen einer diskreten Bibliothek von kleinen Molekülen auf Bindungsaffinitäten für ein definiertes Paneel von Proteinen verwendet. Diese durch den Screen erhaltenen Fingerprints werden zur Vorhersage der Affinität der einzelnen Bibliotheksmitglieder für andere Proteine oder Rezeptoren von Interesse, insbesondere von DEGS, verwendet. Die Fingerprints werden mit Fingerprints verglichen, die von anderen Verbindungen erhalten wurden, die bekanntlich mit dem Protein von Interesse reagieren, um vorherzusagen, ob die Bibliotheksverbindung vielleicht ähnlich reagieren könnte. Beispielsweise könnten statt der Testung eines jeden Liganden in einer großen Bibliothek auf Wechselwirkung mit einem Protein nur diejenigen Liganden getestet werden, die einen Fingerprint aufweisen, der anderen Verbindungen entspricht, die bekanntlich diese Aktivität besitzen (siehe z. B. Kauvar et al., 1995, Chem. Biol. 2: 107–118; Kauvar, 1995, Affinity fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International. 8: 25–28; und Kauvar, Toxic-Chemical Detection by PATTERN Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunoassay, Kurtz, Stanker und Skerritt (Hrsg.), 1995, ADAC: Washington, D. C., 305–312).
Kay et al. (1993, Gene 128: 59–65) offenbarten ein Verfahren zur Konstruktion von Peptidbibliotheken, die Peptide einer vollkommen regellosen Sequenz codieren, die länger sind als diejenigen einer bisherigen herkömmlichen Bibliothek. Die bei Kay et al. offenbarten Bibliotheken codieren vollkommen synthetische regellose Peptide von mehr als etwa 20 Aminosäuren Länge. Solche Bibliotheken können zweckmäßigerweise zur Identifizierung von Proteinmodulatoren gescreent werden (siehe auch US-Patentschrift Nr. 5,498,538 , datiert vom 12. März 1996; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/18318 , datiert vom 18. August 1994).
Eine umfassende Übersicht über verschiedene Typen von Peptidbibliotheken kann bei Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233–1251 gefunden werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ergibt die Wechselwirkung der Testverbindung mit DEGS eine Hemmung der DEGS-Aktivität.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase zur Spaltung von APP gemessen. Diese kann gemessen werden, wie vorstehend angegeben.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) die Fähigkeit des DEGS-Wechselwirkungsmoleküls zur Herabsetzung oder Abschwächung der Sekretion von Abeta-42 gemessen.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Identifizieren eines Gamma-Sekretasemodulators und/oder Beta-Sekretasemodulators, vorzugsweise eines Inhibitors nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, und
b) Formulieren des Gamma-Sekretase- oder Beta-Sekretasemodulators, vorzugsweise -Inhibitors, zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

Bezüglich der pharmazeutischen Zusammensetzung treffen hier auch alle Ausführungsformen, wie angegeben, zu.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses erfindungsgemäße Verfahren den Schritt des Mischens des identifizierten Moleküls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie vorstehend erklärt.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen DEGS-Inhibitor, wie vorstehend definiert, umfasst.
Außerdem betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch das obige Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erhältlich ist.
Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, wie Alzheimer-Krankheit, und verwandte neurodegenerative Störungen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, umfassend die Verabreichung an ein Individuum, das einer solchen Behandlung oder Prävention bedarf, eine therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Bezüglich dieses erfindungsgemäßen Verfahrens treffen auch sämtliche Ausführungsformen, wie vorstehend zur erfindungsgemäßen Verwendung beschrieben, zu.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines DEGS-Wechselwirkungsmoleküls zur Modulation, vorzugsweise Hemmung der Beta-Sekretase- und/oder Gama-Sekretase-Aktivität in vitro. Beispielsweise ist innerhalb der Erfindung die Modulation, vorzugsweise Hemmung der Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretase-Aktivität in Zellkulturen durch das DEGS-Wechselwirkungsmolekül eingeschlossen. Sämtliche Ausführungsformen bezüglich des DEGS-Wechselwirkungsmoleküls, wie vorstehend beschrieben, treffen auch auf diese erfindungsgemäße Verwendung zu.
Die Erfindung wird weiterhin in irgendeiner Weise durch die folgenden Figuren und Beispiele erläutert, ist jedoch nicht eingeschränkt:
1: DEGS ist hochexprimiert im menschlichen Gehirn.
5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen (Clontech) wurden revers transkribiert. Gleiche Mengen an cDNA aus jedem Gewebe und DEGS-spezifische Primer wurden zur Bestimmung von relativen Expressionsniveaus von DEGS durch quantitative PCR verwendet. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, und sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normiert.
2: siRNA-vermittelter Knockdown der DEGS-Expression schwächt die Sekretion von Aβ1-42 ab.
(Linkes Bild, 2A) siRNAs, die gegen BACE1, DEGS oder Luc3 gerichtet waren, wurden in H4-Neurogliomzellen transfiziert, die mutantes APPsw überexprimieren. 48 h nach Transfektion wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt und die Konzentrationen von Aβ1-42 durch ELISA (Innogenetics) bestimmt. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden zweifach durchgeführt.
(Rechtes Bild, 2B) siRNA, die gegen DEGS gerichtet war, reduziert die mRNA-Konzentrationen spezifisch. Gesamt-RNA wurde aus H4/APPsw-Zellen hergestellt, die mit siRNA transfiziert waren, die entweder gegen Luc3 oder DEGS gerichtet war. Nach reverser Transkription wurden relative Mengen an DEGS-Transkripten durch quantitative PCR bestimmt. Mindestens zwei unabhängige Experimente wurden durchgeführt.
3: Aminosäuresequenz von menschlicher DEGS, beschrieben in dem Ein-Buchstaben-Code
4: Sequenzabgleiche von (A) menschlicher und Maus-DEGS und (B) von menschlicher DEGS und von DES2.
5: Die Rolle von Dihydroceramiddesaturase auf dem Sphingosin-Ceramid-Weg.
BEISPIELE:
Die folgenden Beispiele betreffen sämtliche Ausführungsformen der Erfindung und insbesondere die Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen beansprucht.
BEISPIEL 1: Bestimmung der DEGS-Gewebeexpressionsniveaus
Um zu bewerten, ob DEGS sich als potentielles Ziel für AD qualifizierte, erforschten wir, ob es im menschlichen Gehirn exprimiert wurde. Zu diesem Zweck bestimmten wir seine Expressionsniveaus in verschiedenen Geweben durch reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Kurz gesagt, wurden 5 μg Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebequellen (Clontech) unter Verwendung von Standardverfahren revers transkribiert. Gleiche Mengen von cDNAs aus jedem Gewebe und DEGS-spezifische Primer wurden zur Bestimmung der relativen Expressionsniveaus von DEGS durch quantitative PCR unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers verwendet. Sämtliche Werte wurden auf eine menschliche Referenz-RNA (Stratagene) normiert.
BEISPIEL 2: siRNA-Hemmung von DEGS
Eine RNAi-Genexpressionsperturbationsstrategie wurde zur funktionellen Validierung von DEGS als Effektor der APP-Prozessierung eingesetzt: Zwei verschiedene siRNAs, die gegen DEGS gerichtet waren, sowie siRNAs, die gegen BACE1 oder Luc3 gerichtet waren, wurden in SKNBE2-Neuroblastom- oder H4-Neurogliomzellen transfiziert.
siRNAs für menschliche DEGS wurden von Dharmacon Research Inc. synthetisiert. Zwei siRNAs entsprechend der folgenden Sequenzen wurden verwendet:
Eine erste Sequenz lautete: UGUGGAAUCGCUGGUUUGG
Eine zweite Sequenz lautete: GUUAUCAAUACCGUGGCAC
Die Transfektion von SK-N-BE2-Zellen wurde unter Verwendung von LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0 × 10⁴ Zellen in einem Endvolumen von 85 μl pro 96-Well 12–16 h vor der Transfektion ausgesät. 25 nM siRNAs wurden mit 8 μl Opti-MEM-Puffer (Gibco) und 60 ng Träger-DNA gemischt, und das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur vor Zugabe zu den Zellen inkubiert. 16 und 48 h nach der Transfektion wurde das Medium durch 100 μl oder 200 μl Wachstumsmedium mit bzw. ohne Serum ersetzt. 72 h nach der Transfektion wurden 100 μl Überstände für Aβ42 ELISA geerntet. Der Assay wurde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Innogenetics) durchgeführt.
Die Transfektion von H4-Zellen wurde unter Verwendung von RNAiFect (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in einer Dichte von 1,0 × 10⁴ Zellen in einem Endvolumen von 100 μl pro 96 Well 12–16 h vor der Transfektion ausgesät. 270 nM (0,375 μg) siRNAs wurden mit 25 μl EC-R-Puffer und 2,3 μl RNAiFect gemischt und 15 min bei Raumtemperatur vor Zugabe zu den Zellen inkubiert. Das Medium auf den Zellen wurde durch 75 μl frisches Wachstumsmedium ersetzt. 5 h nach der Transfektion wurden die Zellen einmal mit Wachstumsmedium gewaschen, und 100 μl wurden zur weiteren Kultivierung zugesetzt. 48 h nach der Transfektion wurde das Medium durch 200 μl serumfreies Wachstumsmedium ersetzt. 72 h nach der Transfektion wurden 100 μl Überstände für Aβ42 ELISA geerntet. Der Test wurde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Innogenetics) durchgeführt.
Die Knockdown-Effizienz von selektierten siRNAs wurde bei der Proteinkonzentration durch co-transfizieren von siRNAs und entsprechenden TAP-markierten cDNA-Expressionsvektoren oder unter Verwendung von Zelllinien, die das jeweilige markierte Protein von Interesse exprimieren, bewertet. 48 h nach der Transfektion wurden die Extrakte hergestellt, die Proteine durch SDS-PAGE abgetrennt und auf Nitrocellulose übergeführt. Western Blots wurden mit Antikörpern, die gegen den Marker und Tubulin gerichtet waren, sondiert.
Wir stellten fest, dass wie siRNAs, die gegen den bekannten Effektor der APP-Prozessierung, BACE1, gerichtet waren, diese Targeting-DEGS eine nennenswerte Abschwächung der Aβ1-42-Sekretion verursachten, wohingegen die Luc3-siRNA keine Wirkung besaß.
Somit konnten wir zeigen, dass DEGS eine funktionelle Rolle bei der Prozessierung von APP spielt. Es wurde gezeigt, dass durch die Hemmung von DEGS die Produktion des Aβ1-42-Peptids herabgesetzt werden konnte.
Wir bestätigten, dass beide DEGS-siRNAs in der Tat mit der Expression der Desaturase auf dem mRNA-Niveau durch RT-PCR-Analyse, wie vorstehend beschrieben, interferierten.
BEISPIEL 3: Bestimmen der DEGS-Aktivität
a) Rattenleber-Mikrosomen-Assay
Triola G., Fabrias G., Llebaria A. (2001) Synthesis of a Cyclopropen Analogue of Ceramide, a Potent Inhibitor of Dihydroceramide Desaturase. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 18. Mai; 40 (10): 1960–1962.
Kurz gesagt, werden Ratten-Mikrosomen-Membranen durch biochemische Standard-Fraktionierungsverfahren erhalten. Die DEGS-Aktivität wird in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) mit D-erythro-N-Octanoylsphingosin als Substrat erhalten. DEGS-Interaktoren, wie kleine Molekülinhibitoren und Substrat (15 nM) werden in (15 nmol BSA in Phosphatpuffer/Ethanol 9:1 Vol./Vol., 100 μl) gelöst, mit den mikrosomalen Membranen (1 mg Protein) und NADH (30 μl, 1 μM in Phosphatpuffer) kombiniert und bis zu einem Endvolumen von 300 μl mit Phosphatpuffer ergänzt. Die Suspension wird 30 min bei 37°C inkubiert, und die Reaktionen werden durch Zugabe von CHCl₃ (0,5 ml), enthaltend D-erythro-N-Hexanoylsphingosin (1 nmol) als ein interner Standard zur Quantifizierung inkubiert. Die Lipide werden mit CHCl₃ (2 × 250 μl) extrahiert, die vereinigten organischen Schichten werden unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und der Rückstand wird mit Bistrimethylsilyltrifluoracetamid derivatisiert (50 μl, 25°C, 60 min). Nach der Derivatisierung wurde CHCl₃ (50 μl) zugesetzt, und die Proben wurden bei –80°C gelagert. Die instrumentelle Analyse kann durch Gaschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (GC-MS) durchgeführt werden.
b) Durchsatzstarke Screeningassays unter Verwendung von synthetischen Fettsäureenzymen (s. WO-03/019146 , Seiten 27 ff).
Der Assay verwendet positionsspezifisch tritiierte Lipidsubstrat-Ester in einem mikrosomalen Assayformat (siehe vorstehend). Das Verfahren weist die Freisetzung von tritiiertem Wasser nach und umgeht die Anforderung von GS-MS-Analysetechniken zur Analyse von Lipidprodukten.
Kurz gesagt, werden die folgenden Komponenten gemischt (Gesamtvolumen: 100 μl): 2 μl nicht-markiertes 1,5 mM unmarkiertes D-erythro-N-Octanoylsphingosin, 1 μl tritiiertes D-erythro-N-Octanoylsphingosin, 10 μl 20 mM NADH, Verbindungen aus DMSO-Stammlösung, 67 μl 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2. 80 μl dieses Gemisches werden 20 μl von Mikrosomen (ca. 20 μg Gesamtprotein) zugesetzt, und die Umsetzung wird 5–30 min bei RT ablaufen gelassen. 10 μl 6-%-Perchlorsäure werden zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. Zur Sedimentation von unverwendetem tritiiertem Substrat werden die Proben mit 100 μl Kohlesuspension verwirbelt und bei 13000 U/min 10 min bei 4°C zentrifugiert. 400 μl Überstand wird in einem Flüssigszintillationszähler analysiert. Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines DEGS-Inhibitors, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Wechselwirkungsmolekül oder der Inhibitor die Aktivität von Gamma-Sekretase und/oder Beta-Sekretase moduliert.
Verfahren zur Identifizierung eines Gamma-Sekretase-Modulators und/oder eines Beta-Sekretase-Modulators, umfassend die folgenden Schritte: a) Identifizieren eines DEGS-Wechselwirkungsmoleküls durch Bestimmen, ob eine gegebene Testverbindung ein DEGS-Wechselwirkungsmolekül ist, b) Bestimmen, ob das DEGS-Wechselwirkungsmolekül aus Schritt a) zur Modulierung der Gamma-Sekretase- und/oder Beta-Sekretase-Aktivität in der Lage ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Schritt a) die Testverbindung mit DEGS in Kontakt gebracht und die Wechselwirkung von DEGS mit der Testverbindung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wechselwirkung der Testverbindung mit DEGS zu einer Hemmung der DEGS-Aktivität führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei in Schritt b) die Fähigkeit der Gamma-Sekretase und/oder der Beta-Sekretase zur Spaltung von APP gemessen wird.
Verwendung eines DEGS-Inhibitors, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Oligonukleotiden, siRNA und Ribozymen zur Modulation der Beta-Sekretase- und/oder Gamma-Sekretase-Aktivität in vitro.