JP2002517245A - 治療的および診断的ドメイン１β２ＧＰＩポリペプチドおよびその使用の方法 - Google Patents

治療的および診断的ドメイン１β２ＧＰＩポリペプチドおよびその使用の方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリペプチドの模倣物、およびドメイン１β 2ＧＰＩポリペプチドおよび模倣物を使用する方法を提供する。β2ＧＰＩのドメイン１は、抗カルジオリピン（β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質）抗体に結合することが示されており、これは、いくつかの病理学（例えば、血栓症および胎児損失）に関連する。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、サンプル中のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を検出するために使用され得る。本発明はさらに、これらのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを使用して寛容を誘導する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （政府に助成された研究の下でなされた発明に対する権利の表明） （該当なし）。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、抗リン脂質抗体関連病理、特にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に
関連する病理を診断および処置するためのポリペプチドおよび方法に関する。よ
り詳細には、本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド、ドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチド模倣物、ドメイン１β2ＧＰＩポリヌクレオチド、ならびに、こ
れらのポリペプチドを、特に、検出するためおよび寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ
）として使用するために使用する方法に関する。
【０００３】 （背景） 抗リン脂質（ａＰＬ）抗体は、一般に、原発性抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）と
しての血栓症、再発性胎児損失（ｆｅｔａｌ ｌｏｓｓ）および凝塊血球減少症
（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）ならびに全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）のような自己免疫疾患に関連する自己抗体を記載するために与えられる用語
である。Ｈａｒｒｉｓら（１９８３）Ｌａｎｃｅｔ ２：１２１１−１２１４；
およびＬｏｃｋｓｈｉｎら（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：１
５２−１５６。ＡＰＳは、原発性または続発性であり得、他の状態である原発性
ＳＬＥと関連することを意味する。ＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＤ−ＢＩＮＤＩＮＧ
ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｈａｒｒｉｓら編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１；ＭｃＮｅｉｌら、ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＩＭ
ＭＵＮＯＬＯＧＹ，第４９巻、１９３−２８１頁（Ａｕｓｔｅｎら編、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９１））。ａＰＬ抗体
は、いわゆる抗カルジオリピン（ａＣＬ）自己抗体を含み、これは、以下に議論
される。ａＰＬ抗体（ａＣＬ抗体を含む）は、多くの状態において検出されるが
、自己免疫疾患に関連して見出されるβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のみが、
リン脂質結合血清タンパク質であるβ2ＧＰＩの存在を必要とする。Ｖａａｒａ
ｌａら（１９８６）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，４
１：８−１５。
【０００４】 持続性ａＰＬ抗体を保有する患者の約３０％が、血栓事象に罹患している。ａ
ＰＬ抗体の存在は、ＳＬＥ内の一群の患者を規定し、これらの患者は、１以上の
血栓症、凝塊血球減少症（ＴＣＰ）、および胎児損失からなる臨床的特徴の症候
群を提示する。ＳＬＥ全体におけるこの症候群の危険性は、約２５％である；こ
の危険性は、ａＰＬ抗体の存在下で４０％まで増加し、そしてその非存在下で、
１５％まで減少する。ａＰＬ抗体は、血漿膜中のリン脂質に指向されると考えら
れているので、それらは、血小板または内皮のような細胞のリン脂質膜で生じる
止血プロセスを妨害することによって、インビボで直接病原性効果を及ぼし得る
と想定されている。ＡＰＳを有する患者において、ａＰＬ（ａＣＬを含む）抗体
が存在する唯一の危険因子であるようであるという事実は、これらの抗体が、直
接的な病原性の役割を有するというさらなる証拠である。ヒトａＰＬ抗体を用い
たマウスの受動的な移入によるＡＰＳの誘導は、ａＰＬ抗体が直接的に病原性で
あるというなお最良の証拠である。Ｂａｋｉｍｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１５５８−１５６３；Ｂｌａｎｋら（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：３０６９−３０７３。推定は変化する
が、全ての発作患者の約１５％において、ａＰＬ抗体は、重要な寄与因子である
と考えられている。
【０００５】 多数の障害とこれらの抗体の存在との間の明確な相関関係は、それらの検出お
よび測定に従う。しかし、臨床環境におけるａＰＬ抗体の測定は、なお、不完全
な分野であり、それゆえ、有意な問題を提示する。標準血清の市販のセット（Ａ
ＰＬ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）は、
様々な研究室において実施されるアッセイの比較のための標準曲線の生成を可能
にする。しかし、正確なＧＰＬおよびＭＰＬ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗リン脂質抗
体それぞれについての測定単位は、所定の血清についての格付け、ならびにＧＰ
ＬおよびＭＰＬのレベル（高い（８０以上）、中間（２０〜８０）、低い（１０
〜２０）、または正常（０〜１０）と分類される）に関するこれらの研究室で得
られた結果の間には、大量の不一致が存在する。市販のキットは、市販の標準に
割り当てられた値において、非常に変化する。Ｒｅｂｅｒら（１９９５）Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｔ．７３：４４４−４５２。
【０００６】 ａＰＬ自己抗体の抗原特異性の正確な性質は議論の余地があり、そしてこれら
の抗体に使用される発展中の命名法に反映される。最初は、これらの自己抗体は
、アニオン性リン脂質に対して指向されると考えられており、したがって、「抗
カルジオリピン抗体」と命名されていた。Ｇｈａｒａｖｉら（１９８７）Ａｎｎ
．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４６ｍ：１−６。次いで、β2ＧＰＩが、ａＰＬ（ａＣ
Ｌを含む）抗体の抗原特異性において重要な役割を果たすことが明らかになった
。Ｖｅｒｍｙｌｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２０：１
０，ＭｃＮｅｉｌら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８７：４１２０−４１２４。これらの観察は、これらの抗体が、より適切に
「β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質自己抗体」と呼ばれることを示し、これは、この
明細書中で使用される用語である。
【０００７】 β2ＧＰＩがβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の結合において補因子としての役
割を果たすという報告は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体がβ2ＧＰＩ自体と結
合し得るといういくつかの報告と組み合わせて、これらの抗体によって認識され
る抗原性部位の性質に矛盾する解釈を導いた。しかし、β2ＧＰＩが果たす役割
は不明瞭なままであり、そしていくつかの説明が示唆されている。いくつかのグ
ループは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体が、β2ＧＰＩおよびアニオン性リン
脂質の両方を含む複合体抗原を認識すると結論付けたのに対し、他者は、リン脂
質の非存在下でβ2ＧＰＩに結合するβ2ＧＰＩ依存性依存性抗リン脂質を観察し
た。ＭｃＮｅｉｌら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８７：４１２０−４１２４；Ｇａｌｌｉら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３
５：１５４４；Ｒｏｕｂｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５４（２）：９
５４−９６０；Ａｒｖｉｅｕｘら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ １４３：２２３。多数の説明は、これらの差異を説明するために提供され
てきた。Ｇａｌｌｉらは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体は、β2ＧＰＩに対し
て低い親和性の抗体であるので、それらは、多価の固相抗原によって所定のＩｇ
Ｇ分子上の部位をともに組み合わせる約束を必要とすると想定した。Ｇａｌｌｉ
ら（１９９０）。彼らはさらに、特定の条件下で、例えば、マイクロタイターウ
ェルのγ照射下で、十分なβ2ＧＰＩが固定されて、これらの低い親和性で抗体
が結合することを可能にし得ることを主張する。他者は、潜在性エピトープ（β 2 ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体によって認識される）は、β2ＧＰＩがγ照射され
たウェルまたはカルジオリピンでコートしたウェルのいずれかに結合する場合に
生成することを主張する。Ｍａｔｓｕｕｒａら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１７９：４５７。
【０００８】 β2ＧＰＩは、５０キロダルトンの血漿糖タンパク質であり、抗凝固を規定す
る以下のようないくつかの特徴を提示する：内因性の凝固経路の接触活性化の阻
害、血小板プロトロンビナーゼ活性、およびＡＤＰに誘導される血小板活性化。
Ｒｏｕｂｅｙ（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３９：１４４４；
Ｖａｌｅｓｉｎｉｔら（１９９２）Ａｕｔｏｍｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：１０５
。β2ＧＰＩのアミノ酸配列は決定されている。Ｌｏｚｉｅｒら（１９８４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３６４０；Ｓｔｅｉｎｋ
ａｓｓｅｒｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：３８７。β2ＧＰ
Ｉは、５つの相同ドメインから構成される。それらのうちの４つは、約６０アミ
ノ酸から構成され、高度に保存されたシステイン、プロリンおよびトリプトファ
ンを含む。Ｌｏｚｉｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８１：３６４０；Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：３８７−３９１。このタンパク質構造モチーフは、β2
ＧＰＩにおいて最初に記載され、そしてその長さ、独立した折り畳み、ならびに
２つの内部ジスルフィド結合の形成に関与する４つのハーフシステイン残基；２
つのプロリン；２つのフェニルアラニン、チロシンまたはヒスチジン残基；２つ
のグリシン、および１つのロイシンまたはバリンの相同な位置を有するフレーム
ワークによって特徴付けられる。これらの繰り返しモチーフは、それらの形状に
よりスシ構造と称され、または時には、ショートコンセンサス反復といわれる。
Ｒｅｉｄら（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １０：１７７；Ｉｃｈｉ
ｎｏｓｅら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１３４１１−１４。
第５ドメインは、８２個のアミノ酸残基および６個のハーフシステインを含む。
【０００９】 β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の抗原特異性の性質を取り巻く上記で議論し
た議論に加えて、β2ＧＰＩにおけるβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体によって認
識されるエピトープの性質および位置に関する考慮すべき議論が存在する。β2
ＧＰＩのリン脂質結合部位は、第５ドメインに位置することが示唆されている。
Ｈｕｎｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：２１４１。Ｈｕｎｔらはまた、β2ＧＰＩの活性形態とβ2ＧＰＩの不活性形態
（β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質補因子活性を欠く）との間の構造的差異を報告し
、そしてβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体についての推定エピトープが、おそら
くβ2ＧＰＩの第５ドメインであるようだと結論付けた。Ｈｕｎｔら（１９９４
）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６５３−６５９。他のグループは、組換えβ2
ＧＰＩタンパク質を使用して、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の抗原性部位を
位置付けることを試みた。これらのグループの２つは、様々なドメインがバキュ
ロウイルス発現系で欠失されているβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を生成した。両
グループとも、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体についてのエピトープが潜在性
であり、そしてドメイン４がエピトープの曝露に優先的に関与し得ることを結論
付けた。Ｉｇａｒａｓｈｉら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：３２６２−３２７
０；Ｇｅｏｒｇｅら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３９１７−３９
２３。別のグループは、様々なドメインがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで
欠失されているβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を発現させ、そしてドメイン５が、
β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体によって認識されるエピトープを含むことを結
論付けた。Ｙａｎｇら（１９９７）ＡＰＬＡＲ Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１：
９６−１００。
【００１０】 β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に媒介される状態のための改善された検出シ
ステムおよび寛容原の深刻な必要性が存在する。
【００１１】 本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が、参考として援用され
る。
【００１２】 （発明の開示） 本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド、これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物、組成物
、これらのポリペプチド、ポリヌクレオチド、および模倣物を使用する方法を提
供する。
【００１３】 従って、１つの局面において、本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
を含むポリペプチドを提供し、ここで、このポリペプチドは、β2ＧＰＩ依存性
抗リン脂質抗体に特異的に結合する。ここで、このポリペプチドは、図１（配列
番号１）に示されるインタクトなβ2ＧＰＩのアミノ酸配列からならず、そして
さらに、β2ＧＰＩのドメイン１、２および３またはドメイン１、２、３および
４からならないことが理解される。いくつかの実施態様において、このポリペプ
チドは、表１に示されるような、ドメイン１のフラグメントを含む。他の実施態
様において、このポリペプチドは、コンフォメーションエピトープを含む。なお
他の実施態様において、このポリペプチドはドメイン１からなる。
【００１４】 別の局面において、本発明は、ドメインβ2ＧＰＩポリペプチドを含むポリペ
プチドを提供し、ここでこのポリペプチドは、（検出可能な）Ｔ細胞エピトープ
を欠き、このＴ細胞エピトープは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個
体において、Ｔ細胞を活性化し得る。
【００１５】 本発明はまた、任意のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（または、β2ＧＰＩ
ポリペプチドを含むポリペプチド）の結合体、融合物、および／またはポリマー
形態を提供する。好ましい実施態様において、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ド（特に、Ｔ細胞エピトープを欠くもの）は、適切な多価のプラットホーム（ｐ
ｌａｔｆｏｒｍ）分子に結合体化され、この分子は、タンパク質性であってもよ
く、非タンパク質性であってもよい。
【００１６】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチド実施態様のいずれかをコ
ードするポリヌクレオチド（天然に存在する単離されたポリヌクレオチドおよび
天然に存在しない単離されたポリヌクレオチドを含む）を提供する。このポリヌ
クレオチドは、クローニングベクターまたは発現ベクターにおいて、および／あ
るいは適切な宿主細胞において単離され得る。
【００１７】 別の局面において、本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物を
提供し、この模倣物は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに特異的に結合する
抗体に特異的に結合し得る（すなわち、模倣物は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペ
プチドとのエピトープを共有する）。模倣物は、ポリペプチドまたは本明細書中
に記載される任意の多数の物質であり得、この物質は、有機分子および無機分子
を含む。模倣物は、Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよいし、含んでいなくても
よく、このＴ細胞エピトープは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体
において、Ｔ細胞を活性化し得る。
【００１８】 別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される、任意のポリペプチド
、ポリヌクレオチド、および／または模倣物の実施態様を含む組成物を提供する
。いくつかの実施態様において、この組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤
を含む。いくつかの実施態様において、有効量のポリペプチドまたはポリペプチ
ドが組成物に含まれ、ここで有効量とは、寛容を誘導するに十分な量である。（
検出目的のための）いくつかの実施態様において、有効量は、ドメイン１β2Ｇ
ＰＩポリペプチド（または模倣物）に結合する抗体を検出するに十分な量である
。
【００１９】 別の局面において、本発明は、サンプル中のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
（または、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに特異的に結合する抗体）の検出
のための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）安定な抗原−抗体
複合体の形成を許容する条件下で、このサンプル中の抗体を、ドメイン１β2Ｇ
ＰＩポリペプチド（または、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドまたはドメイン
１β2ＧＰＩ模倣物を含むポリペプチド）と接触させる工程；および（ｂ）もし
あれば、工程（ａ）で形成された安定な複合体を検出する工程。
【００２０】 別の局面において、本発明は、個体において寛容を誘導する方法を提供し、こ
の方法は、有効量のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（特に、Ｔ細胞エピトー
プを欠くドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド）を個体に投与する工程を包含し、
ここで、有効量とは、寛容を誘導するに十分な量である。
【００２１】 （本発明の実行様式） 本発明者らは、β2ＧＰＩのドメイン１が特異的にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体（すなわち、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のエピトープを含む）に結合
することを発見した。この知見は、とりわけ、この結合について重要であるドメ
イン５およびドメイン４のみを記載する先行文献の観点から意味がある。例えば
、Ｇｅｏｒｇｅら（１９９８）、およびＹａｎｇら（１９９７）を参照のこと。
本発明者らはまた、β2ＧＰＩのドメイン１が、少なくとも１００の異なるβ2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体からのβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合するこ
とを発見した。この抗体は、検出／診断ならびに寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）
の状況について特に有意かつ重要である。なぜなら、従ってドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチドは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する広範な集団につい
て有用であり得るからである。さらに、本発明者らは、ドメイン１の特定のペプ
チド（本明細書中に記載）が、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結合
するらしいことを見出した。
【００２２】 従って、本発明は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結合する、ド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチド（単離されたドメイン１を含む）を含むポリペ
プチドを提供する。本発明はまた、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に
結合するドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドから本質的になるポリペプチドを提
供する。本発明のポリペプチドは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の検出のた
めに有用であり（診断的、予後的、および／またはモニタリングの状況において
）、そして寛容原としてもまた有用である。いくつかの実施態様において、特に
、寛容原の状況において、β2ＧＰＩポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープを欠く
か、および／または多価形態である（例えば、プラットホーム分子に結合体化さ
れた形態）。本発明はまた、β2ＧＰＩポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、インビボであるかまたはイン
ビトロであるかに関わらず、β2ＧＰＩポリペプチドを産生するために使用され
得る。本発明はまた、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物を提供し、こ
れらは、認識（すなわち、エピトープ）をβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体と共
有する。本発明はまた、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド、ドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または模倣物を含む組
成物を提供する。本発明はさらに、β2ＧＰＩポリペプチドおよび／または模倣
物を使用する方法（例えば、検出または寛容を誘導（すなわち、Ｂ細胞寛容の誘
導）するための方法）を提供する。
【００２３】 （一般的技術） 本発明の実施は、他に示されない場合には、分子生物学（組換え技術を含む）
、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用し、これらは
、当該分野の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅ
ｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ
ｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９
４）；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）に十分に説明されている。
【００２４】 （定義） 「β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド」は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を
特異的に結合するポリペプチドであり、そして図２（配列番号４；ドメイン１）
に示される少なくとも５の連続するアミノ酸を有する。β2ＧＰＩドメイン１ポ
リペプチドは、当該分野で公知の標準的なアッセイ（例えば、当該分野において
と同様に本明細書中において記載される競合阻害アッセイ）を使用して、β2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結合することが示され得る。用語「β2Ｇ
ＰＩドメイン１ポリペプチド」は、種々の実施態様（それらの多くは本明細書中
で記載される）を含み、それらには、配列番号４；配列番号４のフラグメント；
配列番号４の伸長体、挿入体、および／または欠失体；配列番号４の配列改変体
が挙げられるがこれらに限定されない。従って、用語「β2ＧＰＩドメイン１ポ
リペプチド」は、必須の機能性を示すドメイン１に基づく分子のクラスを記載す
ることを意味する。そのようなものとして、β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド
は、図２（配列番号４）に示される、少なくとも５（上記のように）、少なくと
も６、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少
なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、および／または少なくとも６
０の連続するアミノ酸を有し得る。β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドはまた、
ドメイン１の異なる領域を含み得、その結果、集合的にこれらの領域は、β2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体を特異的に結合し得る（例えば、コンフォメーション
エピトープの生成において）。以下に議論するように、いくつかの実施態様にお
いて、「β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド」はまた、（任意の）検出可能なＴ
細胞エピトープを欠く。本発明の目的のために、このＴ細胞エピトープは、β2
ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体中でＴ細胞を活性化し得ると定義され
る。
【００２５】 抗体に「特異的に結合する」ポリペプチドとは、当該分野で十分に理解されて
いる用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法もまた、当該分野で周
知である。分子は、その分子がより頻繁に、より迅速に、より長い持続期間で、
および／または特定の細胞もしくは物質とのより高い親和性で、反応または会合
する場合に、別の細胞または物質でなされるよりも「特異的な結合」を示すとい
われる。抗体が、より高い親和性で、より高いアビディティーで、より容易に、
および／またはより長い持続時間で結合する場合に、その抗体は、他の物質に結
合するよりも、標的に「特異的に結合する」。
【００２６】 「β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体」は、β2ＧＰＩに特異的に結合する任意の
抗体である。上記で議論したように、臨床的分野において使用される命名法およ
び文献は、これらの抗体について別の名称を使用する（例えば、「ａＰＬ」抗体
および「ａＣＬ」抗体、これらは必須の結合特性が存在する限り、用語「β2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体」の定義に含まれる（すなわち、用語「ａＰＬ」抗体
および「ａＣＬ」抗体は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を含む））。本明細
書中で提供される「抗体」の定義において明確に示されるように、「β2ＧＰＩ
依存性抗リン脂質抗体」は、β2ＧＰＩを特異的に結合する能力が保存される限
り、可変領域を含むフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を含む。以下
に議論されるように、任意のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体への特異的な結合
が十分であるが、１より多い、好ましくは少なくとも２、好ましくは少なくとも
５、より好ましくは少なくとも１０、なおより好ましくは少なくとも２０の異な
るβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合することが、β2ＧＰＩドメイン１ポリ
ペプチドについて好ましくあり得ることが理解される。
【００２７】 「抗体」（交換可能に複数形で用いられる）は、免疫グロブリン分子の可変領
域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって標的（例えば、ポリペプチ
ド）に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される
場合、この用語は、インタクトな抗体のみならず、そのフラグメント（例えば、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦＶ）、その変異体、
融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含有
する任意の他の改変された立体配置の免疫グロブリン分子も含む。
【００２８】 「インタクトなβ2ＧＰＩ」とは、β2ＧＰＩの分子全体のアミノ酸配列（図１
およびＳＥＱ ＩＤ：２に示す）をいう。β2ＧＰＩのポリヌクレオチド配列お
よびポリペプチド配列はまた、文献およびＧｅｎｅＢａｎｋ（登録番号Ｘ５８１
００）において公的に利用可能である。
【００２９】 「融合ポリペプチド」は、天然に存在する位置とは異なる領域を含むポリペプ
チドである。この領域は通常異なるタンパク質に存在し得、そして融合ポリペプ
チド中にまとめられるか、またはこれらは通常同じタンパク質中に存在し得るが
、融合ポリペプチド中の新規の整列に配置される。融合ポリペプチドはまた、ド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチドの重合形態（直鎖形態かまたは分枝された形態
のいずれかにせよ）から生じ得る。
【００３０】 「Ｔ細胞エピトープ」は、当該分野において十分に理解される用語であり、そ
してＴ細胞、より詳細には、Ｔ細胞を活性化するポリペプチド配列または化学構
造についての結合部位を意味する。Ｔ細胞エピトープの存在を決定する方法もま
た、当該分野において周知であり、そして本明細書中に記載される。長時間にわ
たってより感度の高いアッセイが、Ｔ細胞エピトープの存在を検出するために開
発され得ること、およびＴ細胞エピトープの欠失を明示することは、使用される
検出システムの型に依存することが理解される。本発明の目的のために、Ｔ細胞
レセプターを「欠失する」ことは、Ｔ細胞エピトープが、当該分野（詳細には本
明細書の最初の出願時）で標準的なアッセイを用いて検出し得ないという意味に
とられる。これはまた、本発明の目的のために、「Ｔ細胞エピトープ」が、β2
ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体においてＴ細胞を刺激し得るものであ
ることが理解される。
【００３１】 用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」（本明細書中で交換可能に使用され
る）は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである任
意の長さのヌクレオチドの重合形態を言う。これらの用語は、一本鎖ＤＮＡ、二
重鎖ＤＮＡもしくは三重鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリット、またはプリン塩基およびピリミジン塩基を含むポリマー、
あるいは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的ヌクレオチド塩基、生化学的に改
変したヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基もしくは誘導体化されたヌ
クレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（代表的
には、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に見出され得るようなもの）、あるいは改変された
糖もしくはリン酸基、または置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるい
は、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブユニットのポリマー（例えば、ホスホ
ルアミダイト）を含み得、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホスルアミデ
ート（Ｐ−ＮＨ２）または混合されたホスホルアミデートホスホジエステルオリ
ゴマーであり得る。ホスホロチエート結合は、ホスホジエステル結合の置換に用
いられ得る。さらに、二重鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成しそして適切な
条件下で鎖とアニーリングすることによってか、または適切なプライマーを用い
てＤＮＡポリメラーゼを使用してデノボで相補鎖を合成することによってかのい
ずれかで、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得られ得る。
【００３２】 以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子および遺伝子フラグ
メント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、
ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベク
ター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プ
ローブ、およびプライマー。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本
明細書中で用いられる場合、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのみならず
、任意のこれらのアナログまたはこれらの塩基の改変された形態（例えば、メチ
ル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変（例えば、電荷を有さない結合およびチ
オエート）、糖アナログの使用、および改変型および／または代替的の骨格構造
（例えば、ポリアミド）もまた含む。
【００３３】 「天然に存在する」とは、内因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
（すなわち、天然に見出されるもの）をいう。この用語は、対立遺伝子およびコ
ードされたタンパク質の対立遺伝子形態、ならびにプロセスされたポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドとしての完全長を含む。プロセシングは１以上の工程で
生じ得、そしてこれらの用語は、全ての段階のプロセシングを包含する。逆に、
「天然に存在しない」配列とは、全ての他の配列（すなわち、天然に存在しない
もの（例えば、組換え配列）を言う。
【００３４】 「宿主細胞」とは、ベクターについてか、あるいはポリヌクレオチドおよび／
またはタンパク質の取り込みについてのレシピエントであり得るかあるいはその
レシピエントであった個々の細胞または細胞型を含む。宿主細胞は、単一の宿主
細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の変異、偶然の変異、または意図的
変異のために、本来の親細胞に完全に同一（ＤＮＡ相補体全体の形態においてか
、またはＤＮＡ相補体全体のゲノムにおいて）である必要はあり得ない。宿主細
胞は、本発明のポリヌクレオチドを有するインビボでトランスフェクトされた細
胞を含む。
【００３５】 「形質転換」または「トランスフェクション」とは、挿入のために使用される
方法（例えば、リポフェクチン、形質導入、感染またはエレクトロポレーション
）に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性ポリ
ヌクレオチドは、非組込みベクター（例えば、プラスミド）として維持され得る
か、あるいは宿主ゲノム中に組込まれ得る。
【００３６】 本明細書中で用いられる場合、用語「模倣物」（「アナログ」とも呼ばれる）
は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが、特異的に結合するβ2ＧＰＩ依存性坑
リン脂質抗体に特異的に結合する生物学的化合物または化学的化合物を意味する
。「模倣物」は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドとエピトープ、または結合
特異性を共有する。模倣物は、不可欠な結合特性を示す任意の化学物質であり得
、従って、例えば、単純かもしくは複雑な有機分子および単純かもしくは複雑な
無機分子；ポリペプチド；ポリヌクレオチド；炭水化物；脂質；リポポリサッカ
リド；リポタンパク質；あるいは上記の任意の組み合わせ（ポリヌクレオチド含
有ポリペプチド；グリコシル化ポリペプチド；および糖脂質を含むが、これらに
限定されない）であり得る。用語「模倣物」は、当該分野で周知である用語「ミ
モトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）」を含む。
【００３７】 「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物は、家畜、競技用動物、ペット、
霊長類、マウスおよびラットである。
【００３８】 「Ｂ細胞アネルギー」は、当該分野において充分に理解される用語であり、抗
体を産生および分泌するのに役立つＴ細胞を要求するＢ細胞の無応答性を意味し
、そして未成熟Ｂ細胞および／または成熟Ｂ細胞のクローンの欠失、ならびに／
あるいはＢ細胞の抗体を産生できない能力を含むが、これらに限定されない。
【００３９】 「寛容を誘導する」とは、免疫原に対する免疫応答の程度の低下および／また
は安定化を意味する。「免疫応答」は、体液性および／または細胞性であり得、
当該分野で公知の標準的なアッセイを用いて測定され得る。本発明の目的のため
に、免疫応答は、一般にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の存在によって示され
る。定量的に、この低下（抗体産生における低下によって測定される）は、少な
くとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくと
も約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくと
も約９５％、および最も好ましくは１００％である。寛容が抗原特異的であり、
そして本発明の目的のため、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体に適
用することが理解される。「寛容を誘導する」はまた、抗体レベルの増加の速度
を緩徐化することかまたは遅延させることを含む。
【００４０】 「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプル型を含み、そして
診断アッセイまたはモニタリングアッセイに使用され得る。この定義は、生物学
的起源の血液および他の液体サンプル、それら由来の生検標本または組織培養物
もしくは細胞のような固形組織サンプル、およびそれらの子孫を含む。この定義
はまた、サンプルの獲得の後に、任意の方法で（例えば、特定の成分（例えば、
タンパク質またはポリヌクレオチド）に対する試薬での処理、可溶化、または富
化によって）操作されたサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」は、臨床的
サンプルを含み、そしてまた培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿
、生物学的液体、および組織サンプルを含む。
【００４１】 生化学的反応における任意の２つ以上の成分間で形成された「安定な複合体」
とは、二重鎖または複合体の形成と引き続く検出（暫定的に行われ得るいずれか
任意の洗浄工程または他の操作を含む）との間に持続するのに十分な持続性であ
る二重鎖または複合体をいう。
【００４２】 「単離された（した）」または「精製された（した）」ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドは、天然において付随する物質を実質的に含まないものである。
実質的に含まないとは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より
好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、天然に
おいて付随する物質を含まないことが意味される。
【００４３】 そのネイティブの状態において、または当業者に周知の方法によって操作され
る場合に、ポリヌクレオチドがポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する
ために転写および／または翻訳される場合、ポリヌクレオチドはペプチドを「コ
ードする」といわれる。本発明の目的のために、そして相補鎖に対する厄介な照
会を避けるために、このようなポリヌクレオチドのアンチセンス（すなわち、相
補体）鎖もまた、コード配列と呼ばれる；すなわち、ポリペプチドを「コード」
するポリヌクレオチド配列は、従来のコード鎖および相補配列（すなわち、鎖）
の両方を含む。
【００４４】 「有効量」（寛容原の状況において使用される場合）は、有利な臨床的結果ま
たは所望の臨床的結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投
与で投与され得る。本発明の目的のために、有効量のドメイン１β2ＧＰＩポリ
ペプチドは、特にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に関して、寛容を誘導するの
に十分な量である。処置に関して、「有効量」のドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チドは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質関連疾患状態（すなわち、β2ＧＰＩ依存性
抗リン脂質抗体が潜在的な病理かまたは実際の病理を示す状態）の進行を、緩和
、改善、安定化、逆行、退行、緩徐または遅延するのに十分な量である。効力の
指標の検出または測定は、一般にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体および／また
は疾患状態に関連する臨床状態（例えば、動脈血栓または静脈血栓、胎児損失、
一過性脳虚血発作、脳血管障害、一過性黒内障（片眼視（ｍｏｎｏｃｕｌａｒ
ｖｉｓｉｏｎ）、自己免疫溶血性貧血、心臓弁損傷（ｃａｒｄｉａｃ ｖａｌｖ
ｅ ｌｅｓｉｏｎ）、心筋梗塞、血小板減少症、および片頭痛状態）の測定に基
づいている。
【００４５】 本明細書中で用いられる場合、「結合価プラットホーム（ｖａｌｅｎｃｙ ｐ
ｌａｔｆｏｒｍ）分子」は、目立たない数のポリペプチド（本発明において、ド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチド）および／または模倣物の付着を可能にする部
位を含む非免疫原性分子を意味する。
【００４６】 「非免疫原性」とは、多価結合プラットホーム分子を記載するために用いられ
る場合、多価結合プラットホーム分子が、免疫応答を惹起し損なうこと、および
／またはこの分子が単独で個体に投与される場合、十分な免疫応答を惹起し損な
うことを意味する。免疫応答を許容し得る量は、多価プラットホーム分子が用い
られ、そして経験的に決定され得る状況に依存する。
【００４７】 本明細書中で用いられる場合、「ファルマコフォア」は、抗体標的に対するド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチドの結合に関与する鍵となる基（ｋｅｙ ｇｒｏ
ｕｐ）の三次元配向および化学的特性を意味する。
【００４８】 （本発明のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド） 本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを提供する。上記で記載したよ
うに、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、（ａ）ドメイン１を表す図２（配
列番号４）の少なくとも５つ（またはそれ以上）の連続したアミノ酸を含み、そ
して（ｂ）β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体（すなわち、１つ以上のβ2ＧＰＩ依存
抗リン脂質抗体）に特異的に結合する。ドメイン１β2ＧＰＩの３次元構造のモ
デルを図３に示し（ＮＭＲによって決定されたＨ１因子スシドメイン１６の実際
の構造に基づく）（Ｎｏｒｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９
：７１７；Ｂａｒｌｏｗら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９７）、そし
て本明細書中で示されたものを含む、変異原性研究によって決定された、構造の
完全さおよび／または抗体結合に関与し得る残基を示す。本発明の全てのポリペ
プチドの実施態様に関しては、本発明のポリペプチドはネイティブの、インタク
トなβ2ＧＰＩ、またはドメイン欠失変異体（すなわち、ドメイン１、２、３；
ドメイン１、２、３、４）のような、以前に単離および特徴付けられたあらゆる
他の形態のβ2ＧＰＩを含まないことが理解される。
【００４９】 １つの実施態様では、本発明は、このポリペプチドが（ａ）インタクトなβ2
ＧＰＩ（配列番号２）、（ｂ）ドメイン１、２、および３または（ｃ）ドメイン
１、２、３、および４からなっていなければ、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ドを含む（または、ある実施態様ではそれからなる、または本質的にそれからな
る）ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを含む。
【００５０】 １つの実施態様では、本発明はドメイン１を示す図２（配列番号４）に示した
アミノ酸配列からなる（または、ある実施態様では本質的にそれからなる）ポリ
ペプチドを含む。本発明者らは、ドメイン１を含むドメイン欠失β2ＧＰＩポリ
ペプチドのみが、β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に特異的に結合できること、お
よび実施例１で記載するように、ドメイン１単独でβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗
体に結合できることを示した。本発明の目的のために、β2ＧＰＩのドメイン１
は、一般的にβ2ＧＰＩのアミノ酸１あたりからアミノ酸６４あたりまでである
（図１）。あるいは、およびこれも本発明の目的のために、ドメイン１（および
よって本発明のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド）は、（ａ）最初のシステイ
ンあたりから４番目のシステインあたりまで（Ｎ末端から決定した場合）；（ｂ
）Ｎ末端あたりから５番目のシステインあたりまで（より正確には、５番目のシ
ステインの前の最後のアミノ酸）；（ｃ）最初のシステインあたりから５番目の
システインあたりまでの範囲であり得る。ある実施態様では、結合のための反応
基とするために、さらなるシステインをあらゆる適切な位置で付加し得る。よっ
て、さらなるシステイン（ある実施態様ではβ2ＧＰＩの５番目のシステイン）
があらゆる位置に、特にＣ末端またはＮ末端またはその付近に含まれ得る。ドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチドはまた、以下のいずれかを含み得る（またはそれ
らからなる、または本質的にそれらからなる）：（ａ）配列番号４のアミノ酸１
からアミノ酸５９まで；（ｂ）配列番号４のアミノ酸２からアミノ酸６０まで；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸２からアミノ酸６３まで；（ｄ）配列番号１のアミ
ノ酸１からアミノ酸６６まで；（ｅ）配列番号１のアミノ酸４からアミノ酸６６
まで；（ｆ）配列番号４のアミノ酸１あたりからアミノ酸６０あたりまで；（ｇ
）配列番号１のアミノ酸１あたりからアミノ酸６６あたりまで。本発明者らは、
５番目のシステインを含むドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは特に結合のため
に好都合であることを発見した（下記で論ずる）。β2ＧＰＩの最初の４つのシ
ステインを含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））実
施態様に関しては、一般的にシステイン間のアミノ酸配列は適当なジスルフィド
架橋が形成されるようなものであり、一方システインの側面にあるアミノ酸配列
（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸）は（抗体への結合を可能にする必要
な構造が保存されている限り）あらゆる配列であり得ることが理解される。
【００５１】 他の実施態様では、本発明は表１に示したあらゆるポリペプチドを含むポリペ
プチドを含む（配列番号５−１１）。本発明者らの実験（実施例３で記載する）
は、これらのポリペプチドがβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に特異的に結合でき
ることを示す。
【００５２】 本発明の全てのポリペプチド実施態様に関して、ポリペプチドはβ2ＧＰＩ依
存抗リン脂質抗体に特異的に結合する。β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に対する
特異的な結合は、競合結合アッセイのような、当該分野で標準的な技術を用いて
決定され得る。例えば、マイクロタイタープレートをβ2ＧＰＩ（天然に存在す
るまたは組換え体、組換え分子が必要な結合性質を示す限り）でコートし得、そ
してテストポリペプチドを種々の濃度で加える。次いでアフィニティー精製β2
ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体を加え、そして結合を起こさせる。結合した抗体の量
を、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ、または放射活性のような検出シ
ステムで決定する。特異的な結合は、テストポリペプチドのβ2ＧＰＩへの結合
に関して競合する能力によって示される。実施例１および３は、競合的結合を検
出するための、典型的なアッセイを提供する。特異的な結合はまた、直接結合ア
ッセイによって決定され得、それは当該分野で公知であり、そして実施例１およ
び３で例示される。
【００５３】 本発明の目的のために、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが１つより多くの
β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に結合することが望ましくあり得るが（例えば検
出の状況において）、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは１つのβ2ＧＰＩ依存
抗リン脂質抗体に結合することのみが必要であることが理解される。β2ＧＰＩ
依存抗リン脂質抗体の供給源は、一般的に個体由来であり、そして抗体の配列は
個体間で変わり得る。β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体への特異的な結合は、β2Ｇ
ＰＩ依存抗リン脂質抗体のフラグメントまたは他の組換え産物（例えば、Ｆａｂ
フラグメント）または１本鎖可変領域構成物（ｓｃＦｖ）（これは、当該分野で
公知である）を使用することによって示され得ることも理解される。
【００５４】 よって、ある実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは１つより多
くのβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも５
つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０以上）に結合する。これ
らのポリペプチドは、β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体を有し得る個体のより広い
範囲にわたって検出するのに使用され得るので、これらの実施態様は特に検出の
ために有用である。
【００５５】
【表１】
【００５６】 ある実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、スシ構造を含む。
「スシドメイン」は、当業者によって理解され、そして一般的に（ａ）ポリペプ
チド鎖を環状構造にする特定の残基（プロリン、フェニルアラニン、チロシン、
グリシン、ロイシン、バリン、および／またはヒスチジンのような）を含む；（
ｂ）一般的に約６ｋＤの分子量を有する；および（ｃ）β折りたたみ構造を含む
ことによって特徴付けられる。Ｉｃｈｍｏｓｅら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６５：１３４１１． ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが、β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に、コン
フォメーションエピトープによって結合し得ることも理解される。よって、ある
実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、（ａ）図３のアミノ酸５
５、５６、および５８（ｉｌｅ；ａｓｎ；ｌｅｕ）（配列番号４のアミノ酸５５
，５６、および５８）；（ｂ）図３のアミノ酸４３−４５（ａｒｇ；ｌｙｓ；ｐ
ｈｅ）（配列番号４のアミノ酸４３から４５）；（ｃ）配列番号４のアミノ酸４
０から４５（ｇｌｙ；ｇｌｙ；ｍｅｔ；ａｒｇ；ｌｙｓ；ｐｈｅ）、好ましくは
図３のアミノ酸３８−４４（配列番号４のアミノ酸３８から４４）；および／ま
たは（ｄ）図３のアミノ酸１９（ｌｙｓ）（配列番号４のアミノ酸１９）、好ま
しくは（ａ）および（ｂ）；好ましくは（ａ）および（ｃ）；好ましくは（ｂ）
および（ｃ）；好ましくは（ａ）および（ｄ）；好ましくは（ｂ）および（ｄ）
；好ましくは（ｃ）および（ｄ）；好ましくは（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；好
ましくは（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；好ましくは（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）
；好ましくは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；好ましくは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
および（ｄ）を含む。本発明者らは、本発明者らの変異原性試験を通して、これ
らのアミノ酸は集合的または個別的のどちらかで、結合に重大であり得ることを
発見した。
【００５７】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（またはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
を含むポリペプチド）の大きさは、必要な機能性（β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗
体への特異的な結合に基づく）が満たされている限り、大きく変化し得る。例え
ば、β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体への特異的な結合が起こるのに必要な長さは
、例えば５マーアミノ酸配列程度の小ささであり得る。本発明者らのデータは、
６マー程度の小ささのアミノ酸配列がβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に特異的に
結合し得ることを示した（実施例３）。
【００５８】 いくつかの実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（およびドメイ
ン１β2ＧＰＩポリペプチドを含むまたは本質的にそれからなるポリペプチド）
は、長さが約３５０アミノ酸より短く、好ましくは長さが約３００アミノ酸より
短く、好ましくは長さが約２５０アミノ酸より短く、好ましくは長さが約２００
アミノ酸より短く、好ましくは長さが約１６０アミノ酸より短く、好ましくは長
さが約１５０アミノ酸より短く、好ましくは長さが約１２５アミノ酸より短く、
好ましくは長さが約１１５アミノ酸より短く、好ましくは長さが約１１０アミノ
酸より短く、好ましくは長さが約１００アミノ酸より短く、好ましくは長さが約
７５アミノ酸より短く、好ましくは長さが約６０アミノ酸より短く、好ましくは
長さが約５０アミノ酸より短く、好ましくは長さが約２５アミノ酸より短く、好
ましくは長さが約１５アミノ酸より短く、好ましくは長さが約１０アミノ酸より
短い。
【００５９】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、他のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
（これらのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは同じまたは異なる）、およびβ2 ＧＰＩの他のドメインと会合、結合体化、および／または連結し得ることが理解
される。よって、本発明はドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドのポリマーの形を
含む。本明細書中で使用する時、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドのポリマー
の形は、複数の（すなわち１つより多くの）ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
を含む。１つの実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの直鎖状ポリ
マーが提供される。別の実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの分
枝ポリマーが提供される。他の実施態様では、本発明は（ａ）複数のドメイン１
β2ＧＰＩポリペプチド；（ｂ）１つのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドおよび
１つ以上のβ2ＧＰＩの他のドメインを含むポリペプチドを提供する。そのよう
な実施態様の例は、（ａ）ドメイン２；（ｂ）ドメイン３；（ｃ）ドメイン５；
（ｅ）ドメイン３、４および５；（ｆ）ドメイン４および５と結合体化したドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチドを含むがこれに限らない。これらのドメインは、
当業者によって理解され、そして一般的に次のようである（Ｎ末端から）：ドメ
イン２、アミノ酸６５あたりからアミノ酸１２０あたりまで；ドメイン３、アミ
ノ酸１２１あたりからアミノ酸１８１あたりまで；ドメイン４、アミノ酸１８２
あたりからアミノ酸２４４あたりまで；ドメイン５、アミノ酸２４５あたりから
アミノ酸３２６あたりまで（Ｃ末端）。
【００６０】 別の実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩ多重抗原ペプチド（Ｍａｐｓ）が提
供される。Ｍａｐｓは、放射状に分枝するリジン樹状突起を有する小さい免疫学
的に不活性のコアを有し、それに多くのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが固
定され得る（すなわち、共有結合的に結合される）。Ｐｏｓｎｅｔｔら（１９８
８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７１９−１７２５；Ｔａｍ（１９８９
）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１６８：７−１５．その結果は、中心に対するドメイン１
β2ＧＰＩポリペプチドの高いモル比を有する、大きな巨大分子である。Ｍａｐ
ｓは、ＥＬＩＳＡのようなアッセイの有用な、有効な抗原であり、そしてまた、
例えば寛容原の状況においては多価の提示に有用である。Ｍａｐｓは合成的に作
製、および市販で入手し得る（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）。代表的なＭａｐｓ
システムでは、コアマトリックスは３段階のリジンおよびドメイン１β2ＧＰＩ
ポリペプチドを固定する８つのアミノ酸からなる。Ｍａｐｓは当該分野で公知の
あらゆる方法で、例えば固相法、例えばＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６
３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９で合成され得る。
【００６１】 シクロデキストリンのようなあらゆる分枝構造が使用され得ることが理解され
る。分枝構造は、小さくあり得るが、そうである必要はない。寛容を誘導する状
況では、プラットホームはＴ細胞独立抗原として作用しない。
【００６２】 ある配列の変化がドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに導入され得、それはそ
の反応性を保存または増強し得ることもまた理解される。よって、本発明はその
特性に有意な影響を与えないドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する修飾、
および増強された活性を有する改変体を含む。これらの改変体および修飾配列は
、集合的に「機能的に同等の改変体」として示され、それは別のドメイン１β2
ＧＰＩポリペプチドと比較した場合同じ、増強された、または減少した結合を有
し得、そしてそれらはβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体へ特異的に結合する能力を
保持しているので、「同等の」と示される。ポリペプチドの修飾は、当該分野に
おいて日常の作業であり、そして本明細書中で詳しく記載する必要はない。修飾
ポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的な置換、機能的活性を有意に有害に
変化させない１つ以上のアミノ酸の欠失または付加を有するポリペプチド、また
はアルファメチルアミノ酸置換を含む化学的アナログ、非タンパク質の天然に存
在するアミノ酸（例えば、カナバニン、ＤＬメチオニンスルホキシド、デルタヒ
ドロキシリジン塩酸塩、およびアミノイソ酪酸）、および非天然のアミノ酸の使
用を含む。お互いに保存的に置換され得るアミノ酸残基は、グリシン／アラニン
；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン
酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニル
アラニン／チロシンを含むが、これらに限られない。これらのポリペプチドはま
た、糖鎖付加したポリペプチドおよび糖鎖付加していないポリペプチド、および
例えば異なる糖による糖鎖付加、アセチル化、およびリン酸化のような、他の翻
訳後修飾を有するポリペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であ
る。すなわち、置換アミノ酸は、もとのアミノ酸と同様の化学的性質を有する。
そのような保存的置換は当該分野で公知であり、そして例は上記で提供された。
【００６３】 あるアミノ酸の変化（例えば、置換）は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
のβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体への結合に、同じ方法で、または同じ程度に影
響を与えるかもしれないか、または与えないかもしれないことが理解される。さ
らに、置換アミノ酸の性質が結合の様式および／または程度に影響を与え得る。
例えば、本発明者らはグリシン残基を４３位のアルギニン残基の代わりに置換す
ること（配列番号４のアミノ酸４３）は、いく人かの患者の血清において抗体へ
の結合能の喪失を引き起こし、一方他は変わらない（そしてさらに他は変化した
（すなわち中間の）結合能を有する）ことを発見した。別の例として、リジンま
たはスレオニンを４２位のメチオニンの代わりに置換することは、（本発明者ら
が試験した患者においては）結合に影響しないようである。しかし、バリンを４
２位のメチオニンの代わりに置換した場合、全ての患者で結合は無くなるようで
ある。
【００６４】 ２０個の天然に存在するアミノ酸およびそのホモアナログ（ｈｏｍｏａｎａｌ
ｏｇｓ）およびノルアナログ（ｎｏｒａｎａｌｏｇｓ）に加えて、いくつかの他
のクラスのアルファアミノ酸を本発明で採用し得る。これら他のクラスの例は、
ｄ−アミノ酸、Ｎα−アルキルアミノ酸、アルファ−アルキルアミノ酸、環状ア
ミノ酸、キメラアミノ酸、および種々雑多なアミノ酸を含む。これらの非天然ア
ミノ酸は、生物活性のあるポリペプチドを修飾してタンパク質分解に対する抵抗
性を増強するために、および／またはコンフォメーションの制約を伝えて生物学
的活性を改良するために、広く使用されてきた。Ｈｒｕｂｙら（１９９０）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８：２４９−２６２；Ｈｒｕｂｙら（１９９５）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：２０１−２４０． 最も普通のＮα−アルキルアミノ酸は、Ｎα−メチルシステイン（ｎＣ）、Ｎ
α−メチルグリシン（ｎＧ）、Ｎα−メチルロイシン（ｎＬ）、Ｎα−メチルリ
ジン（ｎＫ）、およびＮα−メチルバリン（ｎＶ）のような、Ｎα−メチルアミ
ノ酸である。アルファ−アルキルアミノ酸の例は、アルファ−メチルアラニン（
ｍＡ）、アルファ−アミノイソ酪酸（ａｉＢ）、アルファ−メチルプロリン（ｍ
Ｐ）、アルファ−メチルロイシン（ｍＬ）、アルファ−メチルバリン（ｍＶ）、
アルファ−メチル−アルファ−アミノ酪酸（ｔｖ）、ジエチルグリシン（ｄｅＧ
）、ジフェニルグリシン（ｄｐＧ）、およびジシクロヘキシルグリシン（ｄｃＧ
）を含む。Ｂａｌａｒａｍ（１９９２）Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６
４：１０６１−１０６６；Ｔｏｎｉｏｌｏら（１９９３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｓ ３３：１０６１−１０７２；Ｈｉｎｄｓら（１９９１）Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３４：１７７７−１７８９． 環状アミノ酸の例は、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸（ｃＧ）、
１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（Ａｃ５ｃ）、１−アミノ−１−シ
クロヘキサンカルボン酸（Ａｃ６ｃ）、アミノインダン（ａｍｉｎｏｉｎｄａｎ
ｅ）カルボン酸（ｉｎｄ）、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸（Ｔｉｃ）、
およびピペコリン酸（Ｐｉｐ）を含む。Ｃ．Ｔｏｎｉｏｌｏ（１９９０）Ｉｎｔ
’ｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：２８７−３００；
Ｂｕｒｇｅｓｓら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８０８
−３８１９．キメラアミノ酸の例は、ペニシラミン（Ｐｅ）、システインおよび
バリンの組み合せ、４Ｒ−および４Ｓ−メルカプトプロリン（Ｍｐｔ）、ホモシ
ステインおよびプロリンの組み合せ、および４Ｒ−および４Ｓ−ヒドロキシプロ
リン（ｈｙＰ）、およびホモセリンおよびプロリンの組み合せを含む。種々雑多
なアルファアミノ酸の例は、オルニチン（Ｏｒ）、Ｎα−メチルリジン（ｍＫ）
、４−ピリジルアラニン（ｐｙＡ）、４−ピペリジノアラニン（ｐｉＡ）、およ
び４−アミノフェニルアラニンのような塩基性アミノ酸アナログ；シトルリン（
Ｃｉｔ）、および３−ヒドロキシバリンのような酸性アミノ酸アナログ；１−ナ
フチルアラニン（１−Ｎａｌ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、フェニ
ルグリシン（ｐＧ）、３，３−ジフェニルアラニン（ｄｐＡ）、３−（２−チエ
ニル）アラニン（Ｔｈｉ）、およびハロフェニルアラニン（例えば２−フルオロ
フェニルアラニンおよび４−クロロフェニルアラニン）のような芳香族アミノ酸
アナログ；ｔ−ブチルグリシン（すなわち第３ロイシン（ｔＬ））、２−アミノ
酪酸（Ａｂｕ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｙ）、４−テトラヒドロピラニル
アラニン（ｔｐＡ）、３，３−ジシクロヘキシルアラニン（ｄｃＡ）、および３
，４−デヒドロプロリンのような疎水性アミノ酸アナログを含む。
【００６５】 アルファアミノ酸に加えて、ベータアミノ酸のような他のものも本発明で使用
され得る。これら他のアミノ酸の例は、２−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）、β−ア
ミノプロパン酸（β−Ａｐｒ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、および６−ア
ミノへキサン酸（ε−Ａｈｘ）を含む。４−クロロ酪酸（Ｂｙ）および３−クロ
ロプロピオン酸（Ｐｐ）のようなカルボン酸もまた、環状チオエーテルペプチド
の合成において、Ｎ末端の最初の残基として使用された。
【００６６】 他の修飾方法は、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含むがこれに
限らない、当該分野で公知のカップリング技術を使用することを含む。修飾は、
例えば、ラジオイムノアッセイの放射活性部分を付着するような、イムノアッセ
イの標識を付着するために使用され得る。修飾ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ドは、当該分野で確立した手順を用いて作製され、そして当該分野で公知の標準
的なアッセイを用いてスクリーニングされ得る。それらのいくつかは本明細書中
および実施例で記載される。
【００６７】 本発明はまた、１つ以上のβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドを含む融合タン
パク質を含む。本発明の目的のために、β2ＧＰＩドメイン１融合タンパク質は
、１つ以上のβ2ＧＰＩポリペプチドおよびネイティブの分子では付着していな
い別のアミノ酸配列、例えば異種配列またはβ2ＧＰＩの別のドメインのような
別の領域からの相同配列を含む。有用な異種配列は、宿主細胞からの分泌を提供
する、免疫学的反応性を増強する、またはポリペプチドのイムノアッセイ支持体
または担体へのカップリングを容易にする配列を含むがこれに限らない。例えば
、β2ＧＰＩポリペプチドは、精製を容易にする異種配列と融合され得る。その
ような配列の例は、当該分野で公知であり、そしてＭｙｃ、ＨＡ（インフルエン
ザウイルスヘマグルチニン由来）、Ｈｉｓ−６、またはＦＬＡＧのようなエピト
ープをコードするものを含む。精製を容易にする他の異種配列は、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ま
たは免疫グロブリンのＦｃ部分のようなタンパク質から得られる。
【００６８】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含んでも、または
含まなくてもよい。検出の目的のために、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは
、Ｔ細胞エピトープを含んでも、または含まなくてもよい。なぜなら、この状況
におけるポリペプチドの主要な使用は、β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体の検出の
ためであるからであり、これは、Ｔ細胞エピトープの存在と独立している。しか
し、寛容原の状況では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、β2ＧＰＩ依存抗
リン脂質抗体を有する個体に関して検出できる（あらゆる）Ｔ細胞エピトープを
欠く。従って、いくつかの実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは
、Ｔ細胞エピトープを含まない（すなわち、欠く）（そして、よって、ドメイン
１β2ＧＰＩポリペプチドを含むポリペプチドはＴ細胞エピトープを含まない）
。
【００６９】 Ｔ細胞エピトープの存在を検出する方法は、当該分野で周知である。例えば、
Ｔ細胞の増殖を検出する種々のアッセイ（チミジンの組み込みのような）が使用
され得る。Ｔ細胞エピトープの存在はまた、当該分野で周知の方法によってＴ細
胞由来のリンホカインの分泌を測定することによって決定され得る。チミジンの
組み込みの量は試験されるポリペプチドによって変わり得ることが認められるが
、バックグラウンドより上に、統計学的に有意なチミジンの組み込み（すなわち
、標準的な統計手法を用いて一般的に０．０５より小さいｐ）を誘導できないポ
リペプチドは、一般的にＴ細胞エピトープを欠くと判断される。一般的に、約２
−３の下、より好ましくは約１より少ない刺激指数が、Ｔ細胞エピトープの欠如
を示す。Ｔ細胞エピトープの位置および内容は、経験的に決定される。
【００７０】 寛容原の状況で、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、好ましくはＢ細胞を
表面上でβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に特異的に結合する（すなわち、Ｂ細胞
の表面抗体に結合する、ここで抗体はβ2ＧＰＩ依存抗リン脂質エピトープに特
異的に結合できる）。この結合は、特に架橋と共に、Ｂ細胞アネルギーのきっか
けとなると考えられる。定義によってドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドはβ2Ｇ
ＰＩ依存抗リン脂質抗体に特異的に結合できるので、あらゆるドメイン１β2Ｇ
ＰＩポリペプチドが同様にＢ細胞上で表面β2ＧＰＩ依存抗リン脂質抗体に結合
できることが予期されることが理解される。
【００７１】 下記（およびポリマーの形を論じている上記）で論ずるように、好ましくは、
寛容原の状況で、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、ポリマーの形および／
または適当な結合価プラットホーム分子に結合体化しているかのどちらかで、多
価の形で提示される。 （本発明のポリペプチドの調製） 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の手順によって作製され得る。ポリ
ペプチドは、組換え法によって（すなわち、単一または融合ポリペプチド）、ま
たは化学的合成によって産生され得る。ポリペプチド、特に５０アミノ酸までの
短いポリペプチドは、化学的合成によって簡便に作製される。化学的合成の方法
は、当該分野で公知であり、そして市販で入手可能である。例えば、ポリペプチ
ドは、固相法を採用した自動化ポリペプチド合成機によって産生され得る。ポリ
ペプチドはまた、当該分野で公知の技術を用いた化学的合成によって作製され得
る。
【００７２】 ポリペプチドはまた、組換え法を用いて、発現系によって作製され得る。ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの利用可能性が、インタクトな（すなわ
ちネイティブの）ポリペプチド、その機能的に同等のフラグメント、または組換
え体をコードする発現ベクターの構築を可能にする。融合または成熟した形の、
および分泌を可能にするシグナル配列を含むかまたは含まない、望ましいポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドは、あらゆる簡便な宿主に適当な発現ベク
ターにライゲーションされ得る。真核および原核宿主系がどちらも使用され得る
。次いでポリペプチドは溶解細胞または培養液から単離され、そしてその意図す
る使用に必要な程度まで精製される。宿主系で発現されたポリペプチドの精製ま
たは単離は、当該分野で公知のあらゆる方法によって達成され得る。例えば、イ
ンタクトなポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡを、適切
なプロモーターに作動可能に連結し、発現ベクターに挿入し、そして適切な宿主
細胞にトランスフェクトし得る。次いで宿主細胞を、転写および翻訳が起こるの
を可能にする条件下で培養し、そして望ましいポリペプチドを回収する。ポリペ
プチドを特定の細胞区画へ向ける（すなわち分泌のための）シグナル配列のよう
な、他の制御転写または翻訳セグメントも使用し得る。原核宿主細胞の例は、当
該分野で公知であり、そして例えばＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを
含む。真核宿主細胞の例は、当該分野で公知であり、そして酵母、鳥類、昆虫、
植物、およびＣＯＳ７、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、および他の哺乳類細胞のような動物
細胞を含む。酵母系は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
【００７３】 例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチ
ドを発現させるために（例えばＳＭＤ１１６８およびＳＭＤ１１６８Ｈ株を用い
て）、β2ＧＰＩをコードする全長のｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し、ア
ミノ末端に再構成Ｋｅｘ２シグナルペプチド切断部位を有するドメイン１遺伝子
フラグメントを作製する。フラグメントを発現ベクターｐＰＩＧＺａｌｐｈａ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）にクローニングし、それを制限酵素Ｘｈｏ
ＩおよびＳａｌＩで線状化する。構築した遺伝子は、酵母アルファ因子シグナル
ペプチドによってネイティブのドメイン１シグナルペプチドを置換し、そしてカ
ルボキシル末端の選択されたアミノ酸で終了する。
【００７４】 β2ＧＰＩポリペプチドを産生するために発現系を使用する場合、多くの場合
精製を容易にする融合タンパク質を構築することが好ましい。これら融合タンパ
ク質の構成要素の例は、ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ−６、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンのＦ
ｃ部分を含むがこれに限らない。これらの方法は当該分野で公知である。例えば
、Ｒｅｄｄら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１１９３−１１
１９７を参照のこと。当該分野で公知の技術が、Ｈｉｓ−６のような、融合物か
ら望ましくないアミノ酸を除去するのに採用され得る。例えば、カルボキシペプ
チダーゼＡが、カルボキシル末端のアミノ酸を除去するのに使用され得る。カル
ボキシペプチダーゼＡは、アミノ酸プロリンまたはアルギニンで停止する。精製
の簡便さのために、固相カルボキシペプチダーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）が使用され得
る。
【００７５】 好ましくは、特に診断的目的のために使用する場合、ポリペプチドは他の細胞
構成要素から少なくとも部分的に精製または単離される。好ましくは、ポリペプ
チドは少なくとも５０％の純度である。この状況では、純度は調製物の全タンパ
ク質含有量の重量パーセントとして計算される。より好ましくは、タンパク質は
５０−７５％の純度である。より高度に精製したポリペプチドも得られ得、そし
て本発明に含まれる。臨床的な使用のために、ポリペプチドは好ましくは高度に
、少なくとも約８０％の純度に精製され、そして発熱物質および他の混入物を含
まない。タンパク質の精製方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中では
詳しく記載されない。
【００７６】 ある系では、特にある組換え体の系では、余分の（５番目の）システイン、ま
たは還元される（例えばポリペプチドをプラットホーム分子に結合体化させるた
めに）システインを含む実施態様では、最初の産物は低分子量混合ジスルフィド
を含み、ここで５番目の（または余分の、反応性の）システインは他の比較的低
分子量の部分または複数の部分に共有結合している。これらの例では、余分のシ
ステインの選択的還元が望ましい（他のジスルフィド結合を保持する一方で）。
そのような選択的還元は、アクリルアミドのような固体支持体上のＤＴＴのよう
な固相還元剤を用いて達成され得る（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏのＲＥＤＵＣＴＡＣＲＹＬのような）。
【００７７】 さらに、余分のシステインを有するドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを産生
するために設計および／または使用される系では（すなわち、システインは反応
基として作用する）、システインを合成および／または産生の間保護するために
、配列中にさらなるアミノ酸または複数のアミノ酸を余分のシステインの後に続
くようにポリペプチドを作製することが望ましくあり得る。
【００７８】 好ましくは、特にポリペプチドがプラットホームに結合体化する場合（下記で
論ずる）、化学的合成が使用される。化学的合成は、ＮまたはＣ末端の修飾を可
能にし、それはプラットホーム分子への結合体化を容易にする。
【００７９】 ドメイン１の４つのシステイン（それはジスルフィド結合を形成する）に加え
て余分のシステインを有するもののような、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
を作製する場合、条件は正しいジスルフィド架橋の形成を促進するために選択さ
れるべきである。１つの例として、還元ポリペプチドを、０．５ｍｇ／ｍｌの濃
度になるように、６Ｍの塩酸グアニジニウム（ＧｎＨＣｌ）に溶解することによ
って変性する。フォールディングは室温で以下の再生緩衝液に対して透析するこ
とによって達成される。０．１ＭのＧｎＨＣｌ、０．５ｍＭのトリス塩酸、およ
び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５。正しいジスルフィド架橋の形成を助けるため
に、酸化および還元グルタチオンのそれぞれ０．３ｍＭおよび３ｍＭの混合物を
加える。反応混合物を、ＨＰＬＣによってモニターし、そして異なる産物を質量
分析によって分析する。本発明者らの実験では、環状化の５時間後、分析ＨＰＬ
Ｃは約６５％の転換を示した。そのうち約５０％が正しい質量（Ｍｗ＝７２６０
）を有し、そして約１５％がグルタチオン付加生成物（Ｍｗ＝７５６７）として
存在した。グルタチオンを欠くフォールディングしたタンパク質を次いで逆相Ｈ
ＰＬＣによって精製する。
【００８０】 （ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの結合体化） 本発明はまた、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの結合体を提供する。ある
実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、担体または標識と結合体
化し得る。そのような結合を得るための多くの技術が当該分野で公知であり、そ
して本明細書中で詳しく記載する必要はない。安全であり、そしてそれ自身は宿
主に有害な抗体の産生を誘導しないあらゆる担体が使用され得る。適切な担体は
、タンパク質；ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セル
ロースビーズ等のようなポリサッカライド；ポリグルタミン酸、ポリリジン等の
ようなポリマーのアミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子ま
たはＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような弱毒化細菌のような、代表的には大きく、ゆ
っくり代謝される巨大分子である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミ
ン、カサガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミ
ン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。
【００８１】 標識は当該分野で公知であり、そして本明細書中で詳しく記載する必要はない
。当業者に公知の、多くの異なる標識および標識方法が存在する。本発明で使用
し得る標識の種類の例は、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属
、化学発光化合物、および生物発光化合物を含む。当業者は他の適切な標識を知
り、またはそれを慣用の実験を用いて確かめることができる。さらに、これら標
識の本発明のポリペプチドへの結合は、当業者に一般的な標準的な技術を用いて
実施され得る。
【００８２】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（最も好ましくはＴ細胞エピトープを欠く
）は、非免疫原性の結合価プラットホーム分子（「プラットホーム」とも呼ばれ
る）に結合体化し得、それはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの提示を増強す
る。米国特許第５，１６２，５１５号、第５，２７６，０１３号、第５，５５２
，３９１号。プラットホームは、タンパク質性、または非タンパク質性（すなわ
ち有機的な）であり得る。タンパク質性プラットホームの例は、アルブミン、ガ
ンマグロブリン、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、および卵アルブミンを含むがこれ
に限らない。Ｂｏｒｅｌら（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２
６：１５９−１６８；Ｄｕｍａｓら（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｒ
ｅｓ．２８７：１２３−１２８；Ｂｏｒｅｌら（１９９５）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．
Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：２６４−２６７；Ｂｏｒｅｌら（１
９９６）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７８：８０−８７．最も好まし
くは、プラットホームは多価である（すなわち、１つより多くの結合（または連
結）部位を含む）。好ましくは、多価プラットホームは少なくとも２つ、より好
ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少な
くとも７つ、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも
１２、さらにより好ましくは少なくとも１５の連結部位を含む。しかし、寛容を
誘導する状況において（すなわちプラットホームが適当なドメイン１β2ＧＰＩ
ポリペプチドと共に、免疫寛容をもたらすために使用される場合）、採用される
ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの性質および特定の条件によって、多数の連
結部位のいずれかで十分であり得ることが理解される。プラットホームがＴ細胞
独立抗原でないことも理解される。
【００８３】 好ましい結合価プラットホーム分子は、生物学的に安定化されている（すなわ
ち、治療的有効性を与えるために、それらはインビボで多くの場合数時間から数
日、数ヶ月の排出半減期を示し、そして好ましくは規定された組成物の合成１本
鎖で構成される。それらは一般的に約２００から約２００，０００、好ましくは
約２００から約５０，０００（またはそれより少ない、例えば３０，０００）の
範囲の分子量を有する。本発明の結合価プラットホーム分子の例は、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｄ−リシン、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、Ｄ−グルタミン酸およびＤ−リシン（３：２の比で）のようなポ
リマーである。好ましいポリマーは、約２００から約８，０００の分子量を有す
るポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チドに結合し得る他の分子は、アルブミンおよびＩｇＧである。
【００８４】 本発明での使用に適切な、他の好ましい結合価プラットホーム分子は、共に権
利を有する（ｃｏ−ｏｗｎｅｄ）米国特許第５，５５２，３９１号で開示された
もののような、化学的に規定された、非ポリマーの結合価プラットホーム分子で
ある。前に記載した、より伝統的なプラットホームと対照的に、これらのプラッ
トホームは均一な（すなわち一様な）分子量を有するという利点を有し（多分散
系の分子量とは対照的に）、そして従って「化学的に規定されて」いる。従って
、これらのプラットホームを用いた結合体の集団は、均一な分子量のプラットホ
ームを含み、または本質的に単分散である（すなわち、狭い分子量の分布を有す
る）。プラットホーム分子の試料（組成物および／またはプラットホーム分子の
集団のような）の分子量の、分布の幅の尺度は、試料の多分散性である。多分散
は、ポリマー試料の、分子量の均一性または非均一性の尺度として使用される。
多分散は、重量平均分子量（Ｍｗ）を数量平均分子量（Ｍｎ）で割ることによっ
て計算される。Ｍｗ／Ｍｎの値は、完全に単分散のポリマーでは単一である。多
分散（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル浸透クロマトグラフィーのような、当該分野で利用
可能な方法によって測定される。プラットホーム分子の試料の多分散（Ｍｗ／Ｍ
ｎ）は、好ましくは２未満、より好ましくは１．５未満、または１．２未満、１
．０７未満、１．０２未満、または、例えば約１．０５から１．５、または約１
．０５から１．２である。代表的なポリマーは一般的に２−５、またはある場合
には２０より大きい多分散を有する。分子は本質的に大きさが均一であり、そし
て分子量の広い変動による生物学的活性の変動が最小化されるので、結合価プラ
ットホーム分子の低い多分散性の利点は、改善した生体適合性および生物学的利
用能を含む。低い多分散の分子は、従って薬剤学的に最適に処方され、そして分
析するのに容易である。さらに、試料中の分子集団の調節された結合価が存在す
る。
【００８５】 本発明での使用に適切な、好ましい均一な化学的に規定された結合価プラット
ホーム分子の例は、誘導化２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤ
Ａ）、およびトリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。好ましい均一な化学的
に規定されたプラットホームの他の例は、当該分野におけると同様下記で記載さ
れる。他の実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、アルブミン、
ＩｇＧ、および／またはＰＥＧに結合する。
【００８６】 さらなる適切な結合価プラットホーム分子は、テトラアミノベンゼン、ヘプタ
アミノβシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、１，４，８
，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）および１，４，７，１
０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）を含むがこれに限らない。
【００８７】 一般的に、これらのプラットホームは、標準的な化学的合成技術によって作成
される。ＰＥＧは誘導されそして多価にされなければならない。それは標準的な
技術を用いて達成される。ＰＥＧ、アルブミン、およびＩｇＧのような結合体合
成に適切ないくつかの基質は、市販で入手可能である。
【００８８】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの結合価プラットホーム分子への結合は、
代表的には1つ以上の架橋剤およびポリペプチドおよび結合価プラットホーム分
子上の官能基を含む、あらゆる多くの方法で実施され得る。プラットホームおよ
びドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、適切な結合基を有していなければなら
ない。結合基は、標準的な合成化学技術を用いてプラットホームに加えられる。
結合基は、標準的な固相合成技術または組換え技術のどちらかを用いて、ドメイ
ン１β2ＧＰＩポリペプチドに加えられ得る。組換えアプローチは、リンカーを
結合させるために翻訳後修飾が必要であり得、そしてそのような方法は当該分野
で公知である。
【００８９】 １つの例として、ポリペプチドは、ポリペプチドをプラットホームに結合させ
る部位として作用する、アミノ、カルボキシル、またはメルカプト基のような官
能基を含むアミノ酸側鎖部分を含む。ポリペプチドが既にこれらの基を含んでい
ない場合は、そのような官能基を有する残基がポリペプチドに加えられ得る。そ
のような残基は、固相合成技術または組換え技術によって組み込まれ得る。それ
らはどちらもペプチド合成の分野で周知である。ポリペプチドが糖質の側鎖を有
する場合、アミノ基、スルフヒドリル基、および／またはアルデヒド基がそれに
従来の化学によって組み込まれ得る。例えば、１級アミノ基が、シアノホウ化水
素ナトリウムの存在下でエチレンジアミンと反応することによって組み込まれ得
、スルフヒドリル基は、システアミンジヒドロクロリドの反応、続いて標準的な
ジスルフィド還元剤による還元によって導入され得る。一方、アルデヒド基は過
ヨウ素酸塩酸化の後に生成され得る。同様の方式で、結合価プラットホーム分子
も、それが既に適切な官能基を有していない場合、官能基を含むように誘導化さ
れ得る。
【００９０】 ポリペプチドはまた、逆タンパク質分解と呼ばれる方法によって、そのＣ末端
で部位特異的に修飾され得る。本質的に、逆タンパク質分解は、反応をその方向
へ進める条件を用いることによって、アミド結合形成を触媒するためにタンパク
質分解酵素を使用する。ポリペプチドは、逆タンパク質分解を用いて修飾され、
そのＣ末端にアミド結合によって、ヒドラジドを含むリンカー（Ｒｏｓｅ，Ｋ．
ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１、２、１５４−
１５９）、またはアミノオキシを含むリンカー（Ｒｏｓｅ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６、７、５５２−５５６）を結合
された。そのような修飾ポリペプチドは、反応して、アルデヒド基またはケトン
基を含む他の目的の分子と、ヒドラゾンまたはオキシム結合を形成し得る。それ
に加えて、スルフヒドリル基を含むリンカーのような他のリンカーが、おそらく
逆タンパク質分解によって結合され得る。
【００９１】 種々の長さの親水性リンカーが、ポリペプチド（または他の生物活性分子）を
結合価プラットホーム分子に結合させるのに有用である。適切なリンカーは、エ
チレングリコールの直線状のオリゴマーまたはポリマーを含む。そのようなリン
カーは、式Ｒ1Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ2Ｒ2を有するリ
ンカーを含む。ここで、ｎ＝０−２００、ｍ＝１または２、Ｒ1＝Ｈまたはトリ
チルのような保護基、Ｒ2＝Ｈまたはアルキルまたはアリール、例えば４−ニト
ロフェニルエステルである。これらのリンカーは、チオエーテルによってハロア
セチル、マレイミド等のようなチオール反応基を含む分子を、アミド結合によっ
てアミノ基を含む２番目の分子に結合させるのに有用である。これらのリンカー
は結合の順番に関しては可撓性がある。すなわち、チオエーテルは最初または最
後に形成され得る。
【００９２】 上記で論じたように、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、あらゆる多くの
方法によって、あらゆる多くの適切なプラットホームに結合し得る。好ましい実
施態様では、テトラ−ブロモアセチルプラットホームＰＩＺ／ＩＤＡ／ＴＥＧ−
β2ＧＰＩドメイン１が使用される。他の好ましい実施態様は実施例中にある。
【００９３】 ＰＩＺ／ＩＤＡ／ＴＥＧ（ＰＩＴＧ）プラットホームの誘導体は、下記に示し
たように調製され得る。
【００９４】 ＰＩＴＧプラットホーム上の適合架橋基の例
【００９５】
【化５】
【００９６】 結合体の実施態様の例として、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、固相ペ
プチド合成または組換え法によって、Ｎ末端のチオールリンカーと共に調製され
る。リンカーは、システインまたはＳＨを含む分子であり得る。修飾ポリペプチ
ドは、次いで適切な誘導化プラットホーム（ブロモアセチルまたはヨードアセチ
ルのような）によってアルキル化され得る。
【００９７】 ある実施態様では、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドは、例えばシステイン
上のスルフヒドリル基（チオールまたはＳＨ）によって結合し、結合体にチオエ
ーテル結合を生じる。ある実施態様では、この反応性システインは、β2ＧＰＩ
の５番目のシステインを含むことによって提供される（実施例５）。
【００９８】 ある実施態様では、結合体はオキシム結合によって形成される。オキシム結合
は、例えばドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド上のアルデヒドまたはケトンのよ
うなカルボニル基を、アミノオキシ、アミノオキシアセチル、およびアミノオキ
シアルキルのようなアミノオキシ反応基を含むプラットホームと反応させること
によって形成され得る。アミノオキシ基は、トリエチレングリコールまたはヘキ
シル鎖上にあり得る。しかし、炭素原子、酸素原子、窒素原子または硫黄原子を
含むあらゆる鎖が、−ＯＮＨ2で終わる限り十分である。
【００９９】 これらの結合体を作成するために、ドメインβ2ＧＰＩポリペプチドは選択的
に修飾され、Ｎ末端のようなポリペプチドの特定の位置にアルデヒドまたはケト
ン部分を生成する。２番目に、ポリペプチドはアミノオキシ基を含む多価プラッ
トホームと反応して、プラットホームおよびポリペプチド間にオキシム結合を形
成する。
【０１００】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドのＮ末端は、当該分野で公知のアミノ基転
移反応によってアルデヒドまたはケトンに転換され得る。一般的に、アミノ基転
移反応は、Ｎ末端炭素−窒素単結合を炭素−酸素二重結合に転換する。Ｎ末端の
グリシンは、反応してグリオキシル基、アルデヒドを形成する。他のほとんどの
アミノ酸は、アミノ酸側鎖によって、反応してケトンを形成する。
【０１０１】 Ｎ末端にグリオキシル基を生成する別の方法は、Ｎ末端のセリンまたはスレオ
ニンを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することである。この酸化は、Ｎ末端のセリ
ンまたはスレオニンのヒドロキシルおよびアミノ基間の炭素−炭素結合を切断し
、グリオキシル基を提供する。
【０１０２】 ある実施態様では、アミノオキシルアセチル（ＡＯＡ）反応基を含む多価プラ
ットホームが、選択的に修飾されたポリペプチドをプラットホームに結合させる
ために生成され得る。アミノオキシルアセチル（ＡＯＡ）基は、Ｎ−保護アミノ
オキシアセチル基によるアシル化、続く保護基の除去によって、アミン基を含む
多価プラットホームに簡便に結合され得る。しかし、グリオキシルポリペプチド
とＡＯＡ−誘導化プラットホームとの反応はゆっくり進み、ポリペプチドおよび
プラットホーム間にオキシム結合を形成するのに数日かかる。実施例５は、結合
化合物４４の合成を記載する。それはアミノ基転移したβ2ＧＰＩドメイン１ポ
リペプチドの、アミノアセチル化した４量体のプラットホームへの結合を伴う。
本発明はこの結合体を含む。
【０１０３】 他の実施態様では、アミノオキシアルキル反応基を含むプラットホームが使用
され得る。アミノオキシアルキル基は、最初の炭素上のアミノオキシ基として定
義される。ここで最初の炭素は好ましくはカルボニル基の一部である２番目の炭
素のような、電子求引基に直接結合していない。我々は、アミノオキシアルキル
基は、アミノオキシアセチル基よりも容易にケトンおよびアルデヒドと反応して
オキシムを形成することを観察した。アミノオキシアセチル基は、一般的にカル
ボニルに隣接していない他のアミノオキシ基（アミノオキシアルキル基）よりも
反応性が低いようである。アミノオキシアセチル基のカルボニルが、電子求引効
果によって反応性の低下を引き起こすと考えられる。これらのプラットホームお
よび結合体に関するさらなる情報は、実施例および共に権利を有する米国特許出
願第 号（代理人ｄｏｃｋｅｔ番号２５２３１−２００７４００）に見出
される。実施例５で記載される結合化合物４５は、アミノ基転移したβ2ＧＰＩ
ドメイン１ポリペプチドを、アミノオキシ４量体プラットホームに結合させるこ
とによって合成された。本発明はこの結合体、およびＡＯに基づく合成からでき
たそれらのβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドオキシム結合体を含む。 （本発明のポリヌクレオチド） 本発明はまた、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド（単離した天然に存在する、および天然に存在しないポリヌクレオチドを含
む）を提供する。そのようなポリヌクレオチドは、例えばドメイン１β2ＧＰＩ
ポリペプチドの生成に有用である。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの生成は
、組換えクローニング／発現ベクターおよびタンパク質精製方法のような、当該
分野の標準的な技術を用いて実施され得る。生成がインビボで起こる場合、下記
に列挙したような、適切な発現系が使用される。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チドのアミノ酸配列の知識（標準的なタンパク質配列決定技術を用いて得られる
）によって、その特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが設計され
得る。ポリヌクレオチドは、合成され得、または（適切な場合は）ゲノムまたは
ｃＤＮＡ配列から得ることができる。
【０１０４】 本発明はまた、上記に記載したあらゆるポリヌクレオチドを含むクローニング
ベクターおよび発現ベクターを含む。これらのベクターは当該分野で周知であり
（例えば、インビトロで使用するもの、細菌、哺乳類、酵母および昆虫発現系）
、そして本明細書中で記載する必要はない。例えば、ＧａｃｅｓａおよびＲａｍ
ｊｉ、Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）を参
照のこと。
【０１０５】 本発明はまた、本明細書中で記載された任意のポリヌクレオチドおよび／また
はベクターを含む（すなわち、形質転換された、または含む）宿主細胞を含む。
原核および真核宿主細胞がどちらも使用され得る。原核宿主細胞は、細菌細胞、
例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびミコバクテリアを含む。真
核宿主細胞の中には、菌類（酵母を含む）、昆虫、鳥類、植物および哺乳類細胞
がある。宿主系は当該分野で公知であり、そして本明細書中で詳しく記載する必
要はない。本発明の宿主細胞は、とりわけ上記で記載したポリヌクレオチドの貯
蔵所、および／またはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドのポリヌクレオチドお
よび／またはポリペプチドの生成のビヒクルとして使用され得る。それらはまた
、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドのインビボ伝達のビヒクルとして使用され
得る。
【０１０６】 （本発明のドメイン１β2ＧＰＩ模倣物） 本発明はまた、ドメインＩβ2ＧＰＩ模倣物（またはアナログ）を提供する、
これは、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（ドメイン１全体を含む）が特異的
に結合する、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結合する（すなわち、
この模倣物は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドと、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂
質抗体について特異的なエピトープを共有する）。別の方法では、この模倣物は
、ドメイン１におけるエピトープを模倣する（すなわち、ドメイン１β2ＧＰＩ
ポリペプチドの存在下で、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に競合的に結合する
）。この模倣物は、上記のように、多くの化学物質のうちのいずれかであり得る
。それらの化学的性質に依存して、本発明の模倣物は、化学分野および生化学分
野（生物工学を含む）における標準的な技術を用いて生成され得る。これらの模
倣物は、検出においてそして／または寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）として使用
され得る。寛容原として使用される場合、模倣物は、検出可能なＴ細胞エピトー
プを欠如する。
【０１０７】 本発明の模倣物は、従来の技術を使用して同定され得る。例えば、候補分子を
スクリーニングして、それらが（ａ）β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的
に結合するか否か、および／または（ｂ）Ｔ細胞エピトープを欠如するか否か（
すなわち、Ｔ細胞応答またはＴ細胞関連活性を惹起できない）を決定し得る。こ
れらの活性のいずれかまたは両方の決定は、当該分野および本明細書中で記載さ
れる。候補ポリペプチド模倣物のスクリーニングは、当該分野で公知の（実施例
３を参照のこと）ファージディスプレイ法（マイクロパニングを含む）を使用し
て達成され得る。以下は、これらの技術のいくつかの記述の要約である。
【０１０８】 エピトープライブラリースクリーニングから最も良好なエピトープを同定する
ために、ストリンジェンシーの程度を変化させる種々のアッセイが開発された。
このアッセイは、ストリンジェンシーを増大させるためにここに挙げられる：バ
イオパニング＜マイクロパニング＜ファージ捕捉ＥＬＩＳＡ＜ファージＥＬＩＳ
Ａ＝コロニーブロット＝ペプチドＥＬＩＳＡ。
【０１０９】 「バイオパニング」は、抗体特異的回収が、結合したファージを捕捉した後に
、アフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体およびランダムペプ
チドインサートを保有するファージが混合される技術を記載する。このファージ
は、Ｅ．ｃｏｌｉにテトラサイクリン耐性を付与し、このＥ．ｃｏｌｉは、テト
ラサイクリン含有培地中で増殖し、次いで単離される。複数回のバイオパニング
により、サンプル中の免疫特異性ファージの数が富化される。ファージは、常に
３〜５回の選択の後に回収されるが、選択抗体が低い親和性で非特異的に結合さ
れる配列のみを示し得る。これらのファージをさらに評価する方法（マイクロパ
ニング）が必要とされる。
【０１１０】 マイクロパニングは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に対するファージの結
合の相対強度の評価を提供する。マイクロパニングは、３回以上のバイオパニン
グの後に行われ、そしてバイオパニング法で使用された抗体と同じ抗体を使用す
る。この方法は、最終回のバイオパニングからのファージの希釈およびマイクロ
パニングによりこれらのクローンの５０以上を分析する工程からなる。マイクロ
パニングは、各クローンを同様の密度まで増殖させ、次いで、一定量の抗体で予
めコーティングしたマイクロタイトレーションウェルにおける最適なシグナル濃
度で希釈ファージをインキュベートすることにより達成される。ファージの最適
なシグナル濃度は、マイクロパニングスコアの最も広い範囲（０〜＋４）を明ら
かにし、従って、試験されるクローンの中での最も卓越した選別を可能にする可
能性が最も高い濃度である。このシグナル濃度は、６つの無作為に選択されたク
ローンのマイクロパニング挙動に基づく。ここでこのスコアは、段階希釈により
得られたファージのいくつかの濃度の各々で決定される。抗体とのインキュベー
ションの後に、非結合ファージが洗浄除去され、そして結合したファージの量が
抗体についてのファージインサートの親和性の指標として使用される。結合した
ファージの量は、穏和な酸での溶出、次いで、中和、およびＥ．ｃｏｌｉの感染
により決定される。次いで、感染したＥ．ｃｏｌｉの数は、テトラサイクリン含
有寒天プレート上で微生物をプレートし、次いで、各クローンにより達成された
コロニー密度を決定することにより定量される。
【０１１１】 比較的低ストリンジェンシーのマイクロパニングアッセイと高ストリンジェン
シーのファージＥＬＩＳＡアッセイもしくはペプチドＥＬＩＳＡアッセイとの間
の格差を埋める中間レベルのアッセイを提供するためにファージ捕捉ＥＬＩＳＡ
試験を開発した。予備研究は、いくつかの抗体調製物がマイクロパニングにより
あまりにも多くの陽性クローンを示すが、ファージＥＬＩＳＡアッセイもしくは
ペプチドＥＬＩＳＡアッセイによっては何も示されないことを示す。以下に記載
されるファージＥＬＩＳＡの制限は、わずか５コピーのｐ−ＩＩＩが各ファージ
の上に位置することであり、そしてウェルにコーティングされた多くのファージ
を用いてすら、わずか数コピーのインサートが提示されず、そして検出には、抗
体がインサートに対する非常に高い親和性を有することが必要とされる。ファー
ジ捕捉ＥＬＩＳＡが用いられる場合、このシグナルは数倍に増幅され、これはよ
り低い親和性、抗体とインサートとの間の安定な相互作用の検出を容易にする。
【０１１２】 ファージ捕捉ＥＬＩＳＡは、以下の工程からなる。マイクロタイトレーション
ウェルは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体でコーティングされ、そしてファー
ジクローンは、マイクロパニングアッセイのように添加される。非結合ファージ
は洗浄除去され、そして結合ファージの量は、ファージに結合する酵素結合体化
ヤギ抗血清を用いて定量される。ファージ捕捉ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニン
グされるファージは、多くのａＰＬ抗体と反応し、そして引き続くＥＬＩＳＡア
ッセイにおいて強力なシグナルを提供する。この中間レベルの感受性は、ペプチ
ド合成の取り組みにおけるより大きな効果を可能にする。なぜなら、マイクロパ
ニング陽性ファージは、ほとんどファージ捕捉ＥＬＩＳＡ陽性ではないからであ
る。結果として、陽性のファージ捕捉ＥＬＩＳＡファージから合成されたペプチ
ドは、一般に免疫反応性である。
【０１１３】 ファージＥＬＩＳＡ法の選択は、スクリーニング抗体に対するインサートの非
常にしっかりとした結合を必要とする。ファージは、マイクロタイトレーション
プレートのウェル上に直接コーティングされ、そしてスクリーニング抗体ととも
にインキュベートされる。洗浄して非結合抗体を除去した後、抗ヒトＩｇＧアル
カリホスファターゼ結合体を添加して、ファージに結合する任意のβ2ＧＰＩ依
存性抗リン脂質抗体を結合する。次いで、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体は、
当該分野で周知の方法に従うアルカリホスファターゼと反応する比色定量基質を
ウェルに添加することにより検出される。
【０１１４】 コロニーブロットアッセイは、バイオパニングしたファージに感染したＥ．ｃ
ｏｌｉの大規模コロニースクリーニングを可能にする。この手順は、免疫反応性
クローンを同定するためのファージＥＬＩＳＡの代替であり、そして試験の前に
個々のファージクローンを培養する必要なくして、匹敵したレベルの感受性を示
す。このアッセイにおいて、バイオパニングの回由来のファージに感染したＥ．
ｃｏｌｉは、大きな直径のニトロセルロース（ＮＣ）膜上に広げられ、そしてテ
トラサイクリン含有寒天プレートの表面で一晩培養される。Ｂａｒｂａｓら（１
９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７
９８２。各コロニーは、同一配列を含むファージによる感染から生じる。いくつ
かのＮＣでの複製転写ブロットは、このＮＣ「マスター」を使用して作製され、
そして寒天プレートの表面での増殖を可能にする。ブロット上でのファージ感染
コロニーの化学的破壊および酵素的破壊の後に、このファージは、ウェスタンブ
ロッティング（すなわち、染色またはイムノブロッティング）において一般に使
用される技術によりプローブされ得る。ブロッキングしたブロットは、スクリー
ニングａＰＬ抗体とともにインキュベートされ得る。洗浄して非結合抗体を除去
した後、抗ヒトＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ結合体を添加して、ファージ
に結合される任意のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合する。比色定量基質
の添加により、さらなる研究のためにクローニングされ得る免疫特異性ファージ
を示すマスタープレートにおいて、別個のコロニーを局在させることが可能にな
る。
【０１１５】 ＤＮＡ配列決定して、上記のアッセイにおいて最も反応するファージのペプチ
ドインサート配列を決定した後、対応するペプチドを、当該分野で周知の標準的
Ｆｍｏｃペプチド化学を使用して作製する。ペプチドＥＬＩＳＡアッセイのため
に、このペプチドは、例えば、分岐した四価の分子（すなわち、各分子が４コピ
ーのインサートを有する）として作製され得る。このような分子は、マイクロタ
イトレーションプレートのウェルをコーティングし得、そしてなお、抗体による
結合を可能にする溶液に対して曝されるエピトープを有する。四価のペプチドは
、上記で議論されたＭａｐｓに用いられた方法に類似の最初の２つのカップリン
グで分岐点としてリジンを組み込むことにより合成される。Ｐｏｓｎｅｔｔら（
１９８８）。グリシン−セリン−グリシン−セリンからなるスペーサーは、リジ
ン、次いで、インサート（ファージ中に見出されたフレームワークアミノ酸を含
む）、カルボキシル末端におけるプロリン−グリシンおよびアミノ末端における
アラニン−グリシン−プロリンの後ろの各アーム上に付加される。この合成にお
ける全てのアミノ酸は、標準的なＦｍｏｃ方法を使用して一度に一つ付加される
。
【０１１６】 次いで、これらのペプチドはＥＬＩＳＡによりアッセイされ、ＥＬＩＳＡは、
マイクロタイトレーションウェルにペプチドをコーティングし、次いで、標準的
なＥＬＩＳＡ形式においてａＰＬ抗体とのそれらの反応性をアッセイすることに
より行われる。実際に、このペプチドは、通常は、本来のスクリーニング抗体と
非常に強く結合し、そして他のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体といくつかの交
差反応性を示す。非β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のコントロールは、非特異
的結合ペプチドを排除するために含まれる。
【０１１７】 ペプチド競合結合ＥＬＩＳＡは、２つのペプチドが所定の個体の血清の同じ集
団の抗体に結合し、そしてβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に対する相対的結合
親和性を定量するか否かを決定する。このアッセイにおいて、種々のモノマーペ
プチドがマイクロタイトレーションプレートウェルにコーティングされた四価の
ペプチドと競合する。このアッセイを行うために、評価されるこのペプチドは、
（すなわち、標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、リジン分岐が四価のペプチドの合
成において使用されなければ）モノマーとして合成される。次いで、モノマーペ
プチドは精製され、既知の濃度で溶解される。マイクロタイトレーションプレー
トのウェルは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合することが公知の四価の
ペプチドでコーティングされる。モノマーペプチドの段階希釈物を、β2ＧＰＩ
依存性抗リン脂質抗体の一定希釈物とともにインキュベートする。β2ＧＰＩ依
存性抗リン脂質抗体の希釈物は、四価ペプチドに対する抗体を力価測定し、そし
て滴定曲線の下り勾配で希釈物を選択することにより以前に決定された。抗体お
よびモノマーペプチドを１時間インキュベートした後、抗体／ペプチド溶液をマ
イクロタイトレーションウェルに添加し、そして標準的な比色定量ＥＬＩＳＡを
行う。β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体が四価のペプチドと結合することを減少
させる各モノマーペプチドの濃度は、各ウェルについて得られる比色読みとりを
プロットすることにより決定される。５０％阻害点は、モノマーペプチドに結合
する相対強度の基準として使用される。
【０１１８】 このアッセイのバリエーションは、四価のペプチドの代わりに、β2ＧＰ−１
／カルジオリピンでコーティングしたマイクロタイトレーションプレートを使用
し、そしてモノマーペプチドが、β2ＧＰＩ／ＣＬ上のエピトープに対して、β2 ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の結合を妨げる能力を試験する。このアッセイにお
いて、最適化した濃度でのＩｇＧ枯渇ヒト血清は、β2ＧＰＩの供給源として使
用される。いくつかの濃度でのモノマーペプチドは、プレートの基質として四価
ペプチドを使用するアッセイと類似の様式で、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
の最適化した濃度でインキュベートされる。（β2ＧＰＩ／ＣＬ）プレートにお
けるβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質／ペプチドのインキュベーションの後に、５０
％阻害に必要とされる抗体結合およびペプチド濃度は、四価アッセイと同様に最
大半減吸着で決定される。
【０１１９】 このアッセイのさらなるバリエーションは、モノマーペプチドがＮｕｎｃ Ｍ
ａｘｉｓｏｒｐマイクロタイトレーションプレートのウェルに直接コーティング
されたβ2ＧＰＩに対して、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の結合を妨げる能力
を試験する。このバリエーションにおいて、カルジオリピンの使用は省略され、
そしてフィッシュゼラチンの代わりである、使用される試薬希釈剤およびブロッ
キング剤は、脱脂乳である。
【０１２０】 このアッセイの別のバリエーションは、多価ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ド結合体寛容原分子またはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドモノマーが、Ｎｕ
ｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイトレーションプレートのウェルに直接コー
ティングされたβ2ＧＰＩに対して、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の血清また
は血漿における結合を妨げる能力を試験する。カルジオリピンは、このアッセイ
において使用されない。脱脂乳および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−８０はブロッキン
グ剤および試薬希釈溶液の両方で使用される。
【０１２１】 寛容性誘導のために所望されるエピトープは、できるだけ多くのβ2ＧＰＩ依
存性抗リン脂質抗体との強い相互作用を有するべきであるが、不必要な残基は含
むべきでない。エピトープの最小構成を導き出すために、各ペプチドの模倣物は
、以下によって作製される：（ｉ）所定の残基の欠如（例えば、カルボキシルお
よび／またはアミノ末端でフレームワーク残基が欠失している）、または（ｉｉ
）そこでエピトープライブラリースクリーニングにおいて見出された配列とは異
なるアミノ酸置換が作製される。これらのアミノ酸置換は、天然（例えば、ロイ
シンの代わりにイソロイシン）または非天然（例えば、プロリンの代わりにαメ
チルプロリン）のいずれかであり得る。次いで、これらの欠失および／または置
換の効果は、ペプチド競合ＥＬＩＳＡによって測定される。
【０１２２】 本発明はまた、模倣物の結合体、模倣物を含む組成物、模倣物を含むキット、
および任意のポリペプチド模倣物をコードするポリヌクレオチドを含む。これら
の実施態様を作製および使用する方法は、前節に記載されており、そして同様に
提示される原理および技術を、模倣物に適用する。
【０１２３】 （本発明の組成物） 本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（上記の実施態様の全てのポリ
ペプチド（例えば、融合物、ポリマーポリペプチド、および結合体）を含む）を
含む組成物、ならびにドメイン１β2ＧＰＩをコードするポリヌクレオチドを含
む組成物および模倣物を含む組成物をさらに提供する。これらの組成物は、特に
、寛容の誘導に恩恵を受け得る個体への投与のために有用である。この組成物は
また、検出システムにおける試薬として有用である。
【０１２４】 一般に、寛容を誘導する際の使用のための本発明の組成物は、有効量のドメイ
ン１β2ＧＰＩポリペプチド（または模倣物）を、好ましくは、薬学的に受容可
能な賦形剤とともに含み、そして種々の処方物で存在し得る。当該分野で周知で
あるように、薬学的に受容可能な賦形剤は、比較的不活性な物質であり、この賦
形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする。例えば、賦形剤は、形態ま
たは一貫性を与え得るか、または希釈剤として働き得る。適切な賦形剤としては
、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤
、緩衝剤、および皮膚透過増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経
口および経口（ｎｏｎｐｅｒｅｎｔｅｒａｌ）の薬物送達のための賦形剤ならび
に処方物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ 第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に示される。
【０１２５】 一般に、これらの組成物は、注射による投与（例えば、腹腔内、静脈内、皮下
、筋肉内など）のために処方される。従って、これらの組成物は、好ましくは、
生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などのような薬学的に受容可能
なビヒクルと組み合わせられる。一般に、この結合体は、通常、溶解性および浸
透圧のような実際の経験的要件のために、処方物の約０．０１重量％〜１０重量
％を構成する。特定の投薬量レジメン（すなわち、用量、タイミングおよび反復
）は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。一般に、約１μｇ〜約１０
０ｍｇ結合体／ｋｇ体重の用量、好ましくは、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ
体重の用量が毎週与えられる。経験的要件（例えば、半減期）は、一般に、投与
量の決定に寄与する。他の適切な投薬スケジュールは、個体または疾患状態に依
存して、毎日または１週間あたり３用量、または１週間に１用量、または２〜４
週間毎に１用量、または１ヶ月に１用量以下程度のスケジュールの頻度であり得
る。反復投与（通常は、Ｂ細胞代謝回転速度に従ってタイミングがはかられる）
は、体液性アネルギーの状態を達成および／または維持するために必要とされ得
る。このような反復投与は、抗体ＧＰＬにおけるスコアの上昇が検出される場合
、一般に、３０〜６０日ごとに（もしくは、より早く）約１μｇ〜約１０ｍｇ体
重以上の処置を含む。あるいは、組成物の徐放性連続放出処方物がいくつかの病
理のために示され得る。徐放を達成するための種々の処方物およびデバイスが当
該分野で公知である。
【０１２６】 他の処方物は、キャリア（例えば、リポソーム）を含むがそれに限定されない
当該分野で公知の適切な送達形態を含む。Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒ
ｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９。リポソーム調製物は、サイトフェクチン（
ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多層小胞、および単層小胞を含むがこれらに限定され
ない。
【０１２７】 いくつかの実施態様において、１より多くのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ド（または模倣物）が組成物中に存在し得る。そのような組成物は、少なくとも
１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異
なるドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを含み得る。このような、「カクテル」
は、当該分野においてしばしば示されるように、広範な範囲の個体の集団の処置
に特に有用であり得る。このようなカクテルはまた、一つだけの（すなわち、こ
のカクテルに含まれるよりも少ない）ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを使用
するよりも有効である際に有用であり得る。
【０１２８】 この組成物は、単独でか、または抗ヘルパーＴ細胞処置を含むがそれに限定さ
れないドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの効力を増強および／または補完する
ために供される他の形態の薬剤とともに組み合わせて投与され得る。そのような
処置は、通常、ステロイドまたはシクロスポリンのようなＴ細胞を抑制する薬剤
を利用する。
【０１２９】 そのような組成物を受けるに適切な個体は、当該分野で公知の臨床的パラメー
ター（例えば、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のＧＰＬスコアの決定、特に疾
患状態と関連するβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の存在の決定、および／また
はβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質関連病の症状）を使用して同定され得る。好まし
くは、個体はヒトである。β2ＧＰＩ依存性リン脂質抗体に関して、少なくとも
約１０、好ましくは少なくとも約２０、より好ましくは、少なくとも約４０のＧ
ＰＬスコアは、これらの組成物のいずれかの投与を示し得る。このスコアは、現
在の市販のアッセイ（これは、固相β2ＧＰＩ依存性リン脂質抗体ＥＬＩＳＡ（
例えば、Ｉｎｏｖａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）；Ｔｈｅｒａｔｅｓｔ（Ｃｈｉｃａ
ｇｏ）；ＡＰＬ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ））である）
に基づく。これらの組成物の投与のために、任意のβ2ＧＰＩ依存性リン脂質抗
体の障害（すなわち、疾患）に関連する家族歴を有する個体、または「正常な」
ＧＰＬスコアを有すると考えられるが、長期にわたって増加中のＧＰＬスコアを
示す個体もまた示される。
【０１３０】 一般的に、これらの組成物のいずれかの投与の効力は、上記の臨床的パラメー
ター、特にβ2ＧＰＩ依存性リン脂質ＧＰＬスコアにおけるいかなる変化をも測
定することにより判定される。しかし、処置される状態と関連していると考えら
れるかまたはそのことが示されているすべてのパラメーターの測定が、適切であ
る。
【０１３１】 試薬として使用され得る組成物（例えば、検出アッセイにおいて）に関して、
これらの組成物は、一般的に、検出をもたらすに十分なドメイン１β2ＧＰＩポ
リペプチドの量（すなわち、一つ以上のポリペプチド）を含む。これらの量は、
経験的に容易に決定される。これらの組成物は、検出をもたらす物質（例えば、
緩衝液）をさらに含み得る。これらの組成物はまた、必要に応じて、固相（例え
ば、イムノアフィニティーカラム）のような検出マトリクスに複合体化され得る
。
【０１３２】 （β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドを含むキット） 本発明はまた、一つ以上のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（またはドメイ
ン１β2ＧＰＩポリペプチド模倣物）および必要に応じて、標準物としてドメイ
ン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する抗体を含むキット、好ましくはβ2ＧＰＩ依
存性抗リン脂質抗体の検出のための診断キットを提供する。本発明のドメイン１
β2ＧＰＩポリペプチドを使用する診断およびモニタリング手順は、診断のため
の研究室、実験的研究室、研究者、または私的な個人により実行され得る。本発
明により具体化されるキットは、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する抗
体の存在についてのアッセイ（例えば、本明細書中に開示される任意のアッセイ
）を、誰かが実施することを可能にし、それにより、それらの抗体を検出および
／または定量するキットを含む。本発明により具体化されるキットはまた、例え
ば、エキソビボまたはインビボでトランスフェクトされた細胞においてドメイン
１β2ＧＰＩポリペプチドに対する抗体の検出を可能にするキットを含む。従っ
て、本発明は、生物学的サンプルにおける、抗ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ド抗体、好ましくは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の検出および／または定
量のためのドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを含有するキットを含む。本発明
のキットは、適切なパッケージング形態であり、そして必要に応じて、その手順
に有用な更なる構成成分を提供し得る。これらの、任意の構成成分は、緩衝液、
捕獲試薬、発色剤、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、説明書
および説明の情報を含むがこれらに限定されない。
【０１３３】 抗体の結合を検出する任意の適切な手段は、ヒトβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体の存在が試験される場合、例えば、標識された抗ヒト抗体が利用され得（そ
してキット中に提供され）、ここで標識は、酵素、発蛍光団、化学発光物質、放
射性同位体、補酵素であり得る。一般的に、使用される標識は酵素である。
【０１３４】 β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を検出することに加えて、β2ＧＰＩポリペプ
チド（または一つ以上のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド模倣物）は、凝固（
ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）（凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ））を検出するためのキッ
トの構成成分であり得る。そのようなキットは、（もしあれば）血栓症経路を媒
介するβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の役割を検出することを可能にする。例
えば、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体は、活性化プロテインＣにより活性化第
Ｖａ因子の不化を遅延させるかまたは組織因子の凝固経路を活性化する。本発明
者らは、ドメイン１特異的β2ＧＰＩ抗体が、実施例１１で議論するように、第
Ｖａ因子の不活化を遅延させることを見出した。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チド（および／または模倣物）は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体が媒介する
効果を、第Ｖａ因子の不活化に影響を与える他の機構からのまたは組織因子経路
の活性化と識別することにおいて有用であり得る。さらに、ドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチド（および／または模倣物）は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
または個体由来の血清もしくは血漿が特定の凝固アッセイの結果に影響する他の
機能的凝固（例えば、血栓症）アッセイにおいて有用であり得る。例えば、ドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／または模倣物）の存在が、凝固アッセ
イの結果を（ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／または模倣物）の非
存在下におけるそのようなアッセイの結果と比較した場合）変化させる場合、β 2 ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体は、凝固経路の存在を意味する。この情報は、可
能性のある特定の処置の評価において特に価値のあるものであり得る。
【０１３５】 （ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（およびドメイン１β2ＧＰＩポリペプチ
ド模倣物）を使用する方法） 本発明はまた、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／またはドメイン
１β2ＧＰＩポリペプチド模倣物）を使用する方法を提供する。これは、検出お
よび／または治療的状況に適合し得る。従って、本発明は、生物学的サンプル中
の適切な標的を検出するために、本発明のβ2ＧＰＩポリペプチド（および／ま
たは本発明のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド模倣物）を使用する方法を包含
する。ポリペプチドを使用する診断（すなわち、検出）試験を行うための手順は
、当該分野において広く公知であり、そして当業者にとって慣用的である。一般
的に、本発明の診断（すなわち、検出）の方法を実施するために、本発明のポリ
ペプチドまたは模倣物の１つは（一般的に組成物として）、生物学的サンプル中
で反応する標的を検出するための試薬として提供される。標的は、診断的パラメ
ーターが、測定されるべき個体から適切な生物学的サンプルを得ることにより供
給される。所望であれば、標的は、アッセイが行われる前にサンプルから部分的
に精製されるか、または増幅され得る。本発明はまた、本発明のポリペプチドま
たは模倣物を用いてβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を精製する方法を提供する
。本発明はまた、寛容を誘導するために本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチ
ドおよび／または模倣物を用いる方法を提供する。
【０１３６】 （β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の検出） 一つの実施態様において、本発明は、生物学的サンプル中で、ドメイン１β2
ＧＰＩポリペプチド、好ましくはβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結
合する抗体を検出する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、臨床的設定
、例えば、個体においてβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体レベルを診断および／
またはモニタリングするのに適用される。これらの方法は、抗ドメイン１β2Ｇ
ＰＩ特異的抗体（例えば、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体）とドメイン１β2Ｇ
ＰＩポリペプチドの間の安定な複合体の形成を可能にするに適する条件下で、ド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチド（すなわち、本発明の任意のポリペプチド）と
、サンプルにおける（β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質）抗体を接触させ、そして、
もしあれば、形成された安定な複合体を検出することを包含する。本発明のドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチドは、これらの方法を特に有用にする、これらの抗
体の一般的に、便利または適切なアッセイはまだ開発されていないからである。
多くの免疫アッセイ方法は、当該分野において公知であり、そして詳細に記載さ
れる必要はない。β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を測定するための適切なサン
プルは、血清または血漿（好ましくは血清）および標的組織溶出物を含む生物学
的サンプルである。形成された複合体の検出は、直接的（例えば、複合体に結合
する標識の量の測定）または間接的（例えば、アッセイの間置換される標識され
たリガンドの量の測定）であり得ることが、当該分野において十分理解される。
【０１３７】 個体におけるそのような抗体の検出において本発明のポリペプチドまたは模倣
物を使用するために、免疫アッセイが行われる。このポリペプチドまたは模倣物
が試薬として提供され、そして抗体が、生物学的サンプル中の標的である。例え
ば、血清サンプル中に存在するヒトＩｇＧ抗体分子は、固相プロテインＡで捕獲
され得、次いで標識されたポリペプチド試薬で重層され得る。次いで、抗体の量
は、固相に付着した標識に比例する。あるいは、ポリペプチドを発現する細胞ま
たは組織切片は、まず抗体を含有する試験サンプルで重層され得、次いで検出試
薬（例えば、標識された抗免疫グロブリン）で重層され得る。次いで、抗体の量
は、細胞に付着した標識に比例する。サンプル中で検出された抗体の量は、コン
トロールサンプルで検出された量と比較される。
【０１３８】 本発明の方法において、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物は、
代表的に適切な固相（例えば、アフィニティーカラムパッキング物質）、または
プラスチック表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくは計量棒）上に、
公知の技術により固定化される。適切なアフィニティーカラムパッキング物質に
は、例えば、ビーズ化アガロースマトリクス、ポリアクリルアミド、ガラス、セ
ルロースまたは架橋したデキストランが挙げられる。適切なプラスチック表面に
は、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテレフタラート、
エチレングリコール、ポリエステル、ポリプロピレンなどが挙げられる。一般的
に、任意の標準的なマイクロタイタープレートが使用され得る。あるいは、固相
はドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物が組み込まれているゲルまた
はマトリクスの形態であり得る。
【０１３９】 さらなる例示のために、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに特異的に結合す
る抗体を含有する可能性のある試験サンプル（例えば、β2ＧＰＩ依存性抗リン
脂質抗体）は、一般的に、（例えば、放射性同位体または酵素で）検出可能に標
識された予め決定された非限定的な量のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドと混
合され得る。液相アッセイにおいて、未反応の試薬は、分離技術（例えば、濾過
またはクロマトグラフィー）により取り除かれる。これらの免疫アッセイ技術に
おいて、複合体に結合された標識の量は、サンプル中に存在するβ2ＧＰＩ依存
性抗リン脂質抗体の量と正に相関する。試験サンプル中のβ2ＧＰＩ依存性抗リ
ン脂質抗体が、限定量のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに結合することにつ
いて、標識された抗体と競合する同様のアッセイが設計され得る。ここで、標識
の量は、サンプル中のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の量と負に相関する。
【０１４０】 いくつかの実施態様において、生物学的サンプルは、組織サンプルまたは組織
溶出物であり、そして組織サンプルと結合するβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
の量は、例えば、競合結合アッセイにより測定される。これらの方法は、特定の
組織が、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の存在および／もしくは量について試
験ならびに／またはモニターされるべき状況において、特に有用であり得る。こ
のアッセイの型は、例えば、特定の疾患（または疾患の危険性）が示され得るか
否か（例えば、血栓症または凝固障害の特定の形態）を示し得る。このようなア
ッセイはまた、診断および／またはモニタリング目的のためにβ2ＧＰＩ依存性
抗リン脂質抗体の局在性のより正確なそして感度のよい検出の提供において有用
であり得る。さらに、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質についての局在性の情報はま
た、適切な処置選択肢についての指示を医者に提供し得る。
【０１４１】 これらの検出方法は、種々の臨床状況に適用可能であることが理解される。例
えば、検出を使用して、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質と関連する状態または障害
を発症する危険性を示す個体を同定し得る（次いで、病原と関連する抗体と病原
と関連しない抗体との区別し得ることを生じ得る）。検出をまた使用して、処置
（例えば、上記の任意の組成物の投与）をモニターし得る。検出はまた、病原性
抗体と非病原性抗体との間の識別を補助し得る。検出はまた、最善の処置選択肢
および／または予後の決定において臨床医を補助し得る。
【０１４２】 上記のように、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／または模倣物）
はまた、凝固アッセイ、特にβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体が、特定の凝固ア
ッセイの結果を変化し得るアッセイにおける診断構成成分として使用され得る。
例えば、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／または模倣物）の存在が
、凝固アッセイの結果を変化する（ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（および
／または模倣物）の非存在化におけるそのようなアッセイの結果と比較したとき
に）場合、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体は、凝固経路に関与している。ドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチド（および／または模倣物）は、凝固（例えば、血
栓症）における他の機構からのβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体が媒介する効果
の識別に有用であり得るので、本発明は、（ａ）ドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チド（および／または模倣物）を用いて、個体由来の適切な生物学的サンプルを
使用する凝固アッセイを行なう工程；（ｂ）ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド
（および／または模倣物）を用いずに、個体由来の適切な生物学的サンプルを使
用する凝固アッセイを行なう工程；（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果を比較する工程
（ここで、結果の差異は、凝固におけるβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の関与
を示す）を包含する、凝固（例えば、血栓症）におけるβ2ＧＰＩ依存性抗リン
脂質抗体の関与（媒介）を検出する方法を含む。これらの結果をまた使用して、
凝固におけるβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の媒介および初期検出によって患
者の状態をモニターし得る。これらの方法はまた、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体に関与する（すなわち、それにより媒介される）凝固異常を示すかまたは検
出する。
【０１４３】 これらの方法のために、血漿または血清を使用し得る。あるいは、当該分野に
おいて標準的な方法を使用して単離された、ＩｇＧ画分が使用される。凝固検出
系の例は、実施例１１に提供される。いくつかの実施態様において、活性化第Ｖ
（Ｖａ）因子のレベルは、一般的に、凝固時間の測定により決定される。凝固を
検出するためのアッセイ、装置およびキットは当該分野で公知であり、そして市
販されている。
【０１４４】 （β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の精製） 本発明は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに特異的に結合する抗体（例え
ば、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体）の精製方法もまた包含する。この方法は
、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を含む生物学的サンプルをドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチドまたはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物と、安定な抗
原−抗体複合体の形成が可能である条件下で、接触させる工程、ならびにもし存
在すれば、形成された複合体を獲得する工程を包含する。代表的には、ドメイン
１β2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物は、アフィニティーカラム精製用のアフ
ィニティーマトリクスに結合される。このような方法は、当該分野で慣用的であ
り、そして本明細書中で詳細に記載される必要はない。実施例１はまた、β2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体のアフィニティー精製を記載する。
【０１４５】 （寛容を誘導する方法） 本発明中にはまた、寛容（すなわち、免疫寛容を生じる（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ
ｉｃ）状態）を誘導する方法も包含される。この方法は、個体に、有効量のドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチド（またはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを含む
ポリペプチド）あるいはドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物（これらは
全て、検出可能なＴ細胞エピトープを欠く）を投与する工程を包含する。好まし
くは、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（またはドメイン１β2ＧＰＩポリペプ
チドを含む任意のポリペプチド）あるいは模倣物はまた、上記のように、適切な
プラットホーム分子に結合されている。本発明の目的のために、寛容の誘導を介
して減少される（ならびに／あるいは除去されるか、安定化されるか、および／
または増加の速度が減少される）べき免疫応答は、β2ＧＰＩに対する免疫応答
であることが理解される。従って、誘導される寛容は抗原特異的であり、ここで
、この抗原はβ2ＧＰＩであり、そしてこの寛容は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体を有することが（少なくとも、本発明のポリペプチドおよび／または模倣物
の投与の前に）決定された個体において達成される。
【０１４６】 本発明の適切なポリペプチド（すなわち、Ｔ細胞エピトープを欠くドメイン１
β2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物を含むポリペプチド）は、単独で使用され
得るか、または所望の活性／目的を促進する他の薬剤と組合せて使用され得る。
上記のように、種々のポリペプチドもまた。互いに種々の組合せで使用され得る
。種々の処方物および投与手段が、上記で考察されている。
【０１４７】 寛容が誘導されたか否かの決定は、当該分野で公知の任意の手段で達成され得
る。一般的に、寛容は、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する免疫応答を
測定することによって決定される。ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する
免疫応答は、標準的アッセイを使用して測定され得る。このようなアッセイは、
例えば、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物に結合する抗体のレベ
ルを測定する工程；ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを用いた免疫後のサイト
カイン産生を測定する工程；本発明のβ2ＧＰＩポリペプチドまたは模倣物の投
与後のドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対するＴ細胞応答のインビトロ分析
を、このような投与を受けた個体（すなわち、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
を有する個体）由来のＴ細胞を使用して実施する工程を、含み、これには、例え
ば、抗原提示細胞の状況でドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドとともに提示され
た場合に、Ｔ細胞の増殖を測定するための3Ｈチミジン取り込み標準アッセイ、
ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを提示する細胞の傷害性Ｔ細胞による殺傷を
測定するための標準的51Ｃｒ放出アッセイなどを含む。
【０１４８】 以下の実施例は、本発明を例示はするが、制限はしないように提供される。
【０１４９】 （実施例） （実施例１：β2ＧＰＩのドメイン１は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に免
疫反応性である） （材料および方法） （ドメイン欠失変異体の構築） β2ＧＰＩは、５つの「スシ（ｓｕｓｈｉ）」ドメインから構成される。β2Ｇ
ＰＩの抗原性領域を決定するために、本発明者らは、β2ＧＰＩから１つ以上の
ドメインを選択的に除去した。このアプローチは、Ｉｇａｒａｓｈｉら（（１９
９６）Ｂｌｏｏｄ８７：３２６２〜３２７０）により使用されており、Ｉｇａｒ
ａｓｈｉらは、ドメイン４および５、ドメイン３〜５、ドメイン２〜５、ドメイ
ン１〜４、およびドメイン１〜３を含むヒトβ2ＧＰＩの欠失体を作製した。Ｉ
ｇａｒａｓｈｉらにより記載されたドメイン欠失変異体に加えて、本発明者らは
、ドメイン１および２のみを含むヒトβ2ＧＰＩ変異体を構築した。
【０１５０】 これらの欠失変異体の構築のための開始点は、ｐＢａｃＰＡＫ９（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）にクローニングされたヒトβ2ＧＰＩの全長ｃＤＮＡ（Ｓｔｅｉｎｋａ
ｓｓｅｒｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：３８７〜３９１）で
あり、これはＳ．Ｋｒｉｌｓから寄贈された。最初の工程は、ＧｌｙＨｉｓ6を
Ｃ末端に導入することであった。この工程において、唯一のＭｓｃＩ制限部位（
ＴＧＧＣＣＡ）を、Ｃ末端のＣｙｓコドンをＴＧＣからＴＧＴに変化させ、Ｇｌ
ｙ（ＧＧＣ）およびＨｉｓ（ＣＡＣ）を続けることで作製した。Ｈｉｓ6タグの
目的は、Ｎｉキレート化クロマトグラフィーによる変異体タンパク質の容易な精
製を可能にすることであった。
【０１５１】 ＧｌｙＨｉｓ6を、一本鎖ＤＮＡ部位特異的変異誘発によって導入した。この
方法は、すぐ後の、刊行された手順：Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４：３６７〜３８２を使用した。ヒトβ 2 ＧＰＩについてのｃＤＮＡを挿入したファージミドｐＢａｃＰＡＫ９を含む細
胞をヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７）に感染させた場合、増殖培地から収集し
たファージ粒子は、ｐＢａｃＰＡＫ９の一本鎖ＤＮＡバージョンを優勢に含んだ
。さらに、使用した細胞はｄｕｔ１、ｕｎｇ１遺伝子型（例えば、ＣＪ２３６）
であった場合、このＤＮＡ中のいくつかのチミジンがウリジンで置換されていた
。この一本鎖ＤＮＡを、フェノール抽出およびエタノール沈殿によってファージ
から精製した。
【０１５２】 以下の配列：
【０１５３】
【化６】
【０１５４】 （配列番号１３）を有するオリゴヌクレオチドＡｐｏＨ−Ｇ６Ｈ（いずれの側の
Ｃ末端のＣｙｓ上の領域にも相補的であり、かつＧｌｙＨｉｓ6をコードする）
を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＪ２３６中で増幅したヒトβ2ＧＰＩについての遺伝子を
含むｐＢａｃＰＡＫ９の一本鎖ＤＮＡにアニールした。Ｋｕｎｋｅｌの方法を使
用して、相補的オリゴヌクレオチドを伸長させて二本鎖ＤＮＡを生じた。この反
応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９１に形質転換した。Ｋ９１株は、ｄｕｔ１、ｕｎｇ
１遺伝子型を含まない。これは、ウリジン含有ＤＮＡが分解される結果である。
新規に合成するＧｌｙＨｉｓ6をコードする鎖は、濃縮されるべきである。クロ
ーンを、Ｔ７シーケナーゼキットまたは熱シーケナーゼキット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用するＤＮＡ配列決定により
分析した。
【０１５５】 以下のオリゴヌクレオチドを上記の様式で使用して、ヒトβ2ＧＰＩのドメイ
ン欠失変異体を生成した：
【０１５６】
【化７】
【０１５７】 このオリゴヌクレオチド中の数は、ヒトβ2ＧＰＩのアミノ酸をいう。例えば
、Ｂ２ｄｅｌ３−６０とは、β2ＧＰＩから欠失されているアミノ酸３〜６０を
いう。生じたタンパク質はドメイン２〜５を含む。
【０１５８】 この構築物の要点は以下である：
【０１５９】
【数１】
【０１６０】 ＰＣＲを使用して他の変異体を生成した。この反応の鋳型は、ヒトβ2ＧＰＩ
についてのｃＤＮＡを含むｐＢａｃＰＡＫ９であった。以下の配列：
【０１６１】
【化８】
【０１６２】 （配列番号２５）を有し、そしてｐＢａｃＰＡＫ９中のマルチクローニング領域
の上流にプライムするオリゴヌクレオチドｐＢａｃＰＡＫ９ ＰＣＲ１２７０，
１２９７を５’プライマーとして使用した。ドメイン１のみを有するクローンを
構築するために、以下の配列：
【０１６３】
【化９】
【０１６４】 （配列番号２６）を有するオリゴヌクレオチドＤｏｍａｉｎ１ ＰＣＲ（６４）
Ｍｓｃ Ｉを３’プライマーとして使用した。同様に、ドメイン１および２を含
む変異体を生成するために、以下の配列：
【０１６５】
【化１０】
【０１６６】 （配列番号２７）を有するオリゴヌクレオチドＤｏｍａｉｎ１，２ ＰＣＲ（１
２２）Ｍｓｃ Ｉを３’プライマーとして使用した。２５回のＰＣＲを行った。
生成物を、フェノール抽出し、そしてエタノール沈殿した。そのフラグメントを
、Ｂａｍ ＨＩで５’末端を消化し、そして３’末端をＭｓｃ Ｉで消化した。
消化したＤＮＡフラグメントを、ゲル精製し、そして同じ制限酵素を用いて全長
β2ＧＰＩを切り出したｐＢＡｃＰＡＫ９に連結した。この連結物をＥ．ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅに形質転換し、そしてクローンをＤＮＡ配列決定により特
徴付けた。結果は以下である：
【０１６７】
【数２】
【０１６８】 β2ＧＰＩの全ての欠失変異体を、感染した昆虫細胞の培地から精製した。一
般的に、細胞を遠心分離により除去し、そして培地を、少なくとも１０容量のリ
ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、
４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4）に対して４℃
で１８時間透析した。その翌日、いかなる沈殿物をも遠心分離によって除去した
。透析した培地は５０ｍＭ ＮａＰＯ4（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌに
された。そしてＮｉ−ＮＴＡ樹脂をこの透析した培地に、穏やかに混合しながら
添加した。４℃で１時間の後、この樹脂をＢｕｃｈｎｅｒ漏斗で収集し、そして
４℃に保たれたウォータージャケットカラムに充填した。このカラムを５０ｍＭ
ＮａＰＯ4（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌで、タンパク質が全く検出不
可能になるまで大量に洗浄した。このカラムを、２０ｍＭ、３５ｍＭまたは１０
０ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で連続して溶出した。分析は、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）によった。適
切な画分をプールし、そしてタンパク質を濃縮し、そしてＴｒｉｓ緩衝化生理食
塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
）に対して透析した。
【０１６９】 （アフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体） β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を単離するために、多層状カルジオリピン含
有脂質分散物（コレステロールおよびジセチルホスフェートも含む）を、β2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質血漿（または血清）とともにインキュベートする。これら
のリポソームを、遠心分離によって血清からペレット化する。洗浄後、リポソー
ム混合物を、２％オクチルグルコシド界面活性剤により破壊し、そしてプロテイ
ンＡ−アガロースカラムにアプライする。まず脂質を除去するための広範な洗浄
後、次いで非ＩｇＧコンポーネントを除去するために、ＩｇＧ β2ＧＰＩ依存
性抗リン脂質抗体を、弱酸でプロテインＡから溶出し、中和し、緩衝液交換し、
そしてＡＣＡ ＥＬＩＳＡで試験する。この手順により、１０，０００倍まで濃
縮され、ウサギＩｇＧ抗ヒトβ2ＧＰＩ抗血清を用いるウェスタンブロッティン
グによって示される場合に夾雑β2ＧＰＩが全くないａＰＬ抗体が得られる。こ
の手順の特定の実施例が以下である。
【０１７０】 （血清からのβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の精製） 種々の患者由来の抗体を、以下を含む種々の症状を示す種々の年齢の患者由来
の血清から精製した：ＳＬＥ、ＡＰＳ（以下の種々のＡＰＳの発現を含む：静脈
血栓症、流産、血小板減少症、ＣＶＡ（脳血管障害、すなわち、発作）、ＴＩＡ
（一過性虚血性発作）、および動脈閉塞）。
【０１７１】 ２５ｍＬの丸底フラスコ（Ｋｏｎｔｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｖ
ｉｎｅｌａｎｄ、Ｎ．Ｊ．）において、１ｍＬのクロロホルムあたり、１．２ｍ
Ｌカルジオリピン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、
＃Ｃ−１６４９）、０．４６４ｍＬコレステロール（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇ．、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、＃９６５−２５）、０．０８８ｍＬの５ｍｇジセチル
ホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｄ−
２６３ １）の混合物を、Ｒｏｔａｖａｐ（Ｂｕｃｈｉ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）中で約５分間乾燥させた。溶媒の除去後、２ｍＬの０．９６％（重量／体積
）ＮａＣｌ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）
を添加し、そしてＶｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ Ｍｉｘｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ）中で１１分間混
合した。このリポソーム懸濁物を３７℃で１時間インキュベートした。一方、血
清６５０１を、６００×ｇでＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ ６０００遠心機（Ｄｕｐｏ
ｎｔ Ｃｏ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）中で８℃で１０分間遠心した。４
ｍＬの上清を、１ｍＬの調製したリポソーム懸濁物とともに２５ｍＬ丸底フラス
コに配置し、そしてこの混合物を、オービタルシェーカーのＴｅｋｔａｔｏｒ
Ｖ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ、ＩＬ
）中で中程度の速度で４℃で４８時間かき混ぜながらインキュベートし、３７℃
で２時間さらにインキュベートした。２０ｍＬの冷ＴＢＳを添加し、そしてこの
混合物を５０ｍＬのポリカーボネート遠心分離管（Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．、Ｒｏｃ
ｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に移し、そしてＲＣ３遠心機でＳＳ−３４ローター（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ−Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）において４℃で１５
分間、２７，０００×ｇで遠心した。沈殿物を２５ｍＬの冷０．９６％ ＮａＣ
ｌで３回、ＲＣ３遠心機を使用して洗浄した。ペレットを、ＴＢＳ中２％（重量
／体積）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）溶液１ｍＬに溶解し、そして０．６ｍＬプロテインＡ／
架橋アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ、ＭＡ）カラムにアプライした。このカラムは、ベッド容量の１５倍の１Ｍ
酢酸で予め洗浄しており、そしてベッド容量の１５倍のＴＢＳで平衡化してあっ
た。この抗体−プロテインＡ／アガロースカラムを、ベッド容量の４０倍の２％
オクチルグルコピラノシドで洗浄して脂質を除去し、続いて、溶出物の２８０ nm での光学密度がベースラインに達するまでＴＢＳを用いて広範に洗浄した。結
合した抗体を１Ｍ酢酸で溶出した。１ｍＬの画分を収集し、１画分あたり０．３
４ｍＬの３Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、電気泳動等級）で直に中和し、そし
て氷浴中に保った。各画分の光学密度を、分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ
ｋａｒｄ、８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍ
ｅｔｅｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中２８０ｎｍで決定した。抗体を含む画
分をプールし、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０濃縮機
（Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）中で濃縮し、そしてＴＢＳを用いて４回洗浄した。４ｍＬの血清６
５０１からの精製抗体の最終収量を、この濃縮物からのアリコートの２８０での
光学密度を読み取ることで決定し、ここで１ｍｇ＝１．３４Ａ280nmであった。
得られた平均収量は、４ｍＬの血清６５０１から抗体７５０μｇであった。精製
した抗体をＡＣＡ活性について試験し、そしてＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって純度をチェックした。
【０１７２】 （カルジオリピンに基くＥＬＩＳＡ） マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍ
ｕｌｏｎ １ ＃３３５０）を、３０μｌの、エタノール中の５０μｇ／ｍｌの
カルジオリピン溶液でコートし、４℃で一晩乾燥させ、ＰＢＳ、ｐＨ７．２で３
回洗浄し、そして７５μｌの５％（ｗｔ／ｖ）の魚ゼラチン（Ｈｉｐｕｒｅ Ｌ
ｉｑｕｉｄ Ｇｅｌａｔｉｎ，Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．６
９５ Ｊｏｙｃｅ Ｋｉｌｍｅｒ Ａｖｅ．，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｎ
．Ｊ．，ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間ブロックした。このプレートをＰＢＳ
で３回洗浄し、５％魚ゼラチン中の５０μｌの全長組換えβ2ＧＰＩ（１０μｇ
／ｍｌ）を加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰ
ＢＳで３回洗浄し、５０μｌのアフィニティー精製した、β2ＧＰＩ依存性抗リ
ン脂質抗体（使用したそれぞれの抗体濃度は表２に示す）またはウサギ抗β2Ｇ
ＰＩのいずれかをそれぞれのウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベ
ートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌのアルカリホスファタ
ーゼ結合体化抗免疫グロブリン（抗ヒトＩｇＧ、γ鎖特異的、Ｚｙｍｅｄ ＃６
２−８４２２または抗ウサギＩｇＧ，Ｚｙｍｅｄ ＃３６２−６１２２０（５％
魚ゼラチン中で適切に希釈））を添加し、そして３７℃で１時間インキュベート
した。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌのアルカリホスファターゼ
色素形成基質（ＰＰＭＰ溶液；使用直前に水で１：２６に希釈した１００ｍＬの
水ストック溶液中、７．８ｇフェノールフタレイン一リン酸および６９．５ｇの
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）を添加し、そして室温で３０分間
インキュベートした。５５０ｎｍでの光学密度をマイクロプレートオートリーダ
ー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，モデルＥＬ３１１）でプレー
トを読取ることにより決定した。
【０１７３】 （競合阻害ＥＬＩＳＡ） マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐTM、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．１Ｍ炭酸水素塩ｐＨ９．
５中の５０μｌの全長組換えβ2ＧＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）でコートし、４℃で
一晩インキュベートし、０．１５Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．２で３回洗浄し、そして
７５μｌの２％脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ，２％ ＮＦＤＭ）を用いて室温
で１時間ブロックした。試験インヒビターを２％のＮＦＤＭ中で希釈し、そして
コートされたウェルに、それぞれ２５μｌの希釈液を添加した。アフィニティー
精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を２％ ＮＦＤＭに希釈し、そして一
定濃度の２５μｌを、ウェル（陽性コントロールとして作用するインヒビターを
有さないウェルの群を含む）に添加した。ウェルの内容物を混合し、そしてこの
プレートを３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗
浄し、２％ ＮＦＤＭ中で適切に希釈された５０μｌの、γ鎖特異的なアルカリ
ホスファターゼ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ ＃６２−８４２２）を添加
し、そして３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗
浄し、５０μｌのアルカリホスファターゼＰＰＭＰ色素形成基質溶液を添加し、
そして室温で３０分間インキュベートした。５５０ｎｍでの光学密度をマイクロ
プレートオートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，モデル
ＥＬ３１１）でプレートを読取ることにより決定した。阻害パーセントを、イ
ンヒビターの存在下で得られるＯＤ550をインヒビターなしのウェルから得られ
る平均ＯＤ550で除算し、次いで１００を掛算することにより決定した（より詳
細には、［インヒビターなしのコントロールウェルから得られる平均Ａ550−バ
ックグラウンドのＡ550］−［インヒビター存在下で得られるＡ550−バックグラ
ウンドのＡ550］を［インヒビターなしのコントロールウェルから得られる平均
Ａ550−バックグラウンドのＡ550］で除算し、１００倍する）。
【０１７４】 （ＥＬＩＳＡにより評価される組換えβ2ＧＰＩおよび変異体の直接結合） ニッケルキレートコートしたマイクロウェルプレート（ＮＣＰ ０１０ ００
Ｘｅｎｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．３７４ Ｍｉｄｌａｎｄ Ａｖｅ．Ｓａｄｄｌ
ｅ Ｂｒｏｏｋ，ＮＪ ＵＳＡ）を、種々の組換えβ2ＧＰＩの階段希釈の５０
μｌ（ＰＢＳ中）を用いて、室温で２時間コートした。このプレートをＰＢＳで
３回洗浄し、そして７５μｌのＰＢＳ中、１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ−２
５００）を用いて室温で１時間ブロックした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄
し、５０μｌのアフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体（最大
結合の約８０％を得ることが以前に示されている濃度で）またはウサギ抗β2Ｇ
ＰＩのいずれかを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。このプレ
ートをＰＢＳで３回洗浄し、１％ゼラチン中で適切に希釈した５０μｌのアルカ
リホスファターゼ結合体化抗免疫グロブリン（抗ヒトＩｇＧ、γ鎖特異的、Ｚｙ
ｍｅｄ ＃６２−８４２２）または抗ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ ＃３６２−６
１２２０）を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。このプレート
をＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌのアルカリホスファターゼＰＰＭＰ色素形成基
質溶液を添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。５５０ｎｍでの光
学密度をマイクロプレートオートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ，モデル ＥＬ３１１）でプレートを読取ることにより決定した。
【０１７５】 （阻害研究の結果） ７〜９の異なる組換えβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を用いて、１３例の異なる
患者由来のアフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体調製物の抗
原特異性を決定した。それぞれの変異体組換えβ2ＧＰＩタンパク質を、アフィ
ニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体の、全長組換えβ2ＧＰＩへの
結合を阻害するβ2ＧＰＩタンパク質の能力について、用量依存性様式で試験し
た。代表的アッセイからの結果を図４に示す。１３の全てのアフィニティー精製
したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のアッセイからの結果を表２にまとめる。
以下の値はまた、組換えタンパク質のドメイン１についてのみ観察された（１＿
；意味については表２を参照のこと）：
【０１７６】
【数３】
【０１７７】 ドメイン１を含んだそれらの変異体のみが、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体
の全長組換えβ2ＧＰＩへの結合を阻害した（図４）。これは、１３全てのβ2Ｇ
ＰＩ依存性抗リン脂質抗体の調製物についてあてはまった（表２）。ドメイン１
を含む組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質の全てが９０％を超えて阻害したとい
う事実は、これらの抗体の検出可能な抗β2ＧＰＩ活性の全てがドメイン１に対
して指向されることを示す。
【０１７８】
【表２】
【０１７９】 （カルジオリピンの非存在下における、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体によ
る組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質の直接結合の試験結果） ７〜９つの異なる組換えβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を試験して、それらがア
ニオン性リン脂質の非存在下で、アフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リ
ン脂質抗体調製物の直接結合を支持し得るか否かを決定した。全ての組換え変異
体β2ＧＰＩを、１１例の異なる患者由来のアフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依
存性抗リン脂質抗体調製物を用いてアッセイした。それぞれの変異体組換えβ2
ＧＰＩを用量依存性様式で試験し、そしてＧＳＴ−６ｈｉｓを陰性コントロール
として含んだ。組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質を、それらの６−ｈｉｓテー
ルを介してニッケルコートマイクロタイタープレートに結合させた。試験された
全ての組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質は、ウサギ抗β2ＧＰＩに結合し、これ
はそれらが抗体により評価可能であることを示す（図５）。代表的な結合実験か
らの結果は、ドメイン１を含むタンパク質のみが、アフィニティー精製したβ2
ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合したことを示す（図６）。１１の全てのアフ
ィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体のアッセイからの結果を表
３にまとめる。この結果は、全ての患者の抗体がドメイン１を含有するβ2ＧＰ
Ｉ組換えタンパク質に有意に結合したが、一方、ドメイン１を欠損する組換えタ
ンパク質への特異的結合は、もしあっても、ほとんどなかったことを示す。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】 （カルジオリピンの存在下における、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体による
組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質の直接結合） ７つの異なる組換えβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を試験して、それらがアニオ
ン性リン脂質の存在下で、アフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体調製物の直接結合を支持し得るか否かを決定した。７つの全ての組換え変異
体β2ＧＰＩを、ウサギ抗β2ＧＰＩを用いて、ならびにアフィニティー精製した
β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体調製物を用いてアッセイした。それぞれの変異
体組換えβ2ＧＰＩタンパク質を用量依存性様式で、そしてＧＳＴ−６ｈｉｓを
陰性コントロールとして含んで試験した。組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質を
、カルジオリピンで事前にコートされたマイクロタイタープレートに結合させた
。７つの全ての組換え変異体β2ＧＰＩタンパク質は、ウサギ抗β2ＧＰＩに結合
し、これはそれらがカルジオリピンに結合したこと、および抗体に評価可能であ
ったことを示す（図７）。患者の抗体を用いた代表的な実験からの結果は、ドメ
イン１およびドメイン５の両方を含むタンパク質のみが、アフィニティー精製し
β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合したことを示す（図８）。
【０１８２】 本実施例の上記データに基いて、本発明者らは、特定の条件下で、β2ＧＰＩ
は、ドメイン１上の抗原性エピトープがβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に自由
に接触可能である（ただし、それが非照射プレート（他の多くのブランドのマイ
クロタイタープレート）のような他の表面に結合する場合は自由に接触可能でな
い）ような方法（例えば、照射プレート、カルジオリピンコートプレート、Ｎｕ
ｎｃブランドのマイクロタイタープレートおよびニッケルキレート化プレート（
６−ｈｉｓテールを含む組換えβ2ＧＰＩタンパク質の場合））で固相支持体に
結合されると考える。これらの阻害研究は、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質がリン
脂質の非存在下でβ2ＧＰＩに結合し得るという他の研究者による報告を確認す
る。Ｇａｌｌｉら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３５：１５４４；Ｒｏｕｂｙら
（１９９５）；Ａｒｖｉｅｕｘら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ １４３：２２３。競合阻害アッセイにおいて阻害する同じ５つの組換え変
異体β2ＧＰＩ（ドメイン１を含むもの）は、ニッケルキレート化プレート上の
β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に結合するものと同じである。ニッケルキレー
ト化プレートに結合した組換えβ2ＧＰＩ変異体タンパク質を、９つ全ての組換
えタンパク質に対するウサギ抗β2ＧＰＩの結合能力により確認した。対照的に
、全長組換えβ2ＧＰＩのみ（すなわち、ドメイン１およびドメイン５の両方を
含む、試験された組換えタンパク質のみ）が、カルジオリピンコートプレート上
で容易に検出され得た。カルジオリピンコートプレートに結合した組換えβ2Ｇ
ＰＩ変異体タンパク質を、９つ全ての組換えタンパク質に対するウサギ抗β2Ｇ
ＰＩの結合能力により確認した。
【０１８３】 ニッケルコートプレートでの阻害データ（図４）および直接結合データ（図６
）の両方は、研究された１３のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体調製物の抗原特
異性が、β2ＧＰＩのドメイン１にあるエピトープに対して指向されることを明
白に示す。
【０１８４】 （実施例２：ＡＰＳ患者由来の抗体の特異性） 先の実施例において記載された研究において、エピトープ結合領域の局在化は
、アフィニティー精製した、高力価のＡＰＳ患者由来の抗体の使用に依存した。
ＡＰＳ抗体のアフィニティー精製は、高力価の患者を必要とし、そしてより低力
価の患者または大集団の患者を研究するためにはそれ自身は容易に役立たない。
したがって、本発明者らは、ＡＰＳ患者サンプルにおいて抗体結合ドメインを評
価するための代替のアプローチを開発した。このアプローチは血清ベースであり
、そして多数の患者を評価するために受け入れられる。
【０１８５】 表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により、固定化タンパク質と可溶性分析物との
間の相互作用の定量的測定が提供される。本研究では、固定化β2−ＧＰＩとβ2 −ＧＰＩのドメイン欠損変異体との間の相互作用を、正常患者およびＡＰＳ患者
のコホートからのヒト血漿を用いて測定するためにＳＰＲを適用した。本研究は
、β2−ＧＰＩドメイン１の免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を、
より大きなＡＰＳ患者集団に一般化し得るか否かを決定するために設計された。
【０１８６】 （材料および方法） （試薬） ＣＭ５チップ、ＮＨＳおよびＥＤＣ、ならびにＨＢＳ−ＥＰ緩衝液は、ＢＩＡ
ｃｏｒｅからであった。ヒトハプトグロビン（表現型１−１）（β2ＧＰＩに見
出される短いコンセンサス反復モチーフを含有するタンパク質）を、チップ上の
分離流動セル（ｓｅｐａｒａｔｅ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）に固定し、そしてこれ
をネガティブコントロールとして使用した。組換えβ2ＧＰＩおよびβ2ＧＰＩの
ドメイン欠損変異体を、バキュロウイルスタンパク質発現系を使用してＴｎ５細
胞中で発現させ、そしてこれをニッケルキレートアフィニティーカラムによりそ
の上清から精製した。Ｉｖｅｒｓｏｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１５５４２−１５５４６。正常ヒト血漿サンプル
は、購入した（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）か、または院
内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）で得た。一次または二次（狼瘡に対する）抗リン脂質抗
体症候群のいずれかを有すると診断された個体からの患者血漿サンプルは、多数
の臨床的供給源から入手した。
【０１８７】 本研究において使用される５５個のコントロールは、異種サンプルに由来した
。３０個のコントロールサンプル（男性１５人；女性１５人；平均年齢３４歳（
１９〜４５歳の範囲））を、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ
（Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＫＳ）から購入した。この分析に、地元のボラ
ンティアー５人（男性３人、女性２人）、２個のプールされた市販の供給源、お
よび未知の供給源の１８個の血液バンクドナーを含めた。患者サンプルをいくつ
かの供給源（静脈血栓症、動脈閉塞、脳血管閉塞、多発性流産および血小板減少
症の病歴を有する患者を含む）から採取した。本研究に含まれる全ての患者は、
内部アッセイで２０以上のレベルのＩｇＧ抗リン脂質抗体レベル（ＧＰＬ）を有
した。
【０１８８】 全ＩｇＧ画分を、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＰｌｕｓプロテインＧアガロースビ
ーズ、ならびにＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＩｇＧ結合緩衝液および溶出緩衝液を、
製造業者の推奨（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って使用して、血漿から単離した。
【０１８９】 （表面プラスモン共鳴） 全ての実験は、ＢＩＡｃｏｒｅTM２０００装置を２５℃、１０μＬ／分の流速
で使用して行われた。チップ平衡および結合研究は、脱気したＨＢＳ−ＥＰ緩衝
液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）サーファクタントＰ２０からなる）を用い
て行った。タンパク質リガンドのその遊離アミノ基を介するＣＭ５チップへの共
有結合は、チップ上に４０μＬの０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣを流し
てそのチップを活性化し、次いで、適切なタンパク質リガンドに曝すことにより
達成された。組換えβ2ＧＰＩ（Ｈｉｓ）6、β2ＧＰＩのドメイン欠失変異体、
およびハプトグロビンを、ＮＨＳ活性化ＣＭ５チップ上に５０μＬ（１０ｍＭ酢
酸中２５μｇ／ｍＬの溶液（ｐＨ４．８））を流すことにより固定化した。次い
で、このチップ表面上の過剰の反応基を、４０μＬの１Ｍエタノールアミン（ｐ
Ｈ８．５）を用いてクエンチした。ヒト血漿サンプル（１３０μＬ）をＨＢＳ−
ＥＰで１：１に希釈し、このβ2ＧＰＩチップ上に流し、そして反応値を７８０
秒間収集した。このチップを、サンプル曝露の間、８０μＬの０．１Ｍグリシン
−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）、０．１Ｍ ＮａＣｌで再生した。結合平衡についての
アプローチは、測定期間の間は不完全であるので、結合平衡値（Ｒeq）を、製造
業者のソフトウエア（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン２．２，Ｕｐｐｓ
ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、会合曲線を以下の方程式に一致させること
によって決定した： Ｒt＝Ｒeq（１−ｅ-ks(t-t0)）＋Ｒ0 ここで、Ｒtは時間ｔで測定されたＢＩＡｃｏｒｅ応答であり、Ｒeqは平衡プラ
トー応答であり、ｔは時間であり、ｔ0は開始時間であり、ｋsは見掛けの会合定
数（ｋs＝ｋaＣ＋ｋdis、ここで、ｋaは会合定数であり、Ｃは分析物の濃度、そ
してｋdisは解離定数）であり、およびＲ0は応答オフセットである。いくつかの
実験において、ヒト血漿サンプルからの全ＩｇＧ画分を、プロテインＧに結合さ
せ、そしてそのプロテインＧから酸溶出することによって得た。プロテインＧに
結合させた後に残っている血漿を、新しいプロテインＧビーズと混合し、そして
ＩｇＧ除去（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血漿として単離した。中和したＩｇＧ調製物お
よび緩衝液で１：１に希釈したＩｇＧ除去血漿を、β2ＧＰＩチップ上に上記し
たように流した。
【０１９０】 （結果および考察） ドメイン１−５、２−５およびドメイン１単独を含む組換えヒトβ2−ＧＰＩ
を、バキュロウイルス発現ベクターにクローニングし、そしてＴＮ５細胞中で発
現させた。精製タンパク質のアリコートを、アミノ酸分析により分析しそして定
量した。各タンパク質は単一アミノ末端を含み、そして内部標準をアミノ酸分析
に基いて正確に定量した。
【０１９１】 ＡＰＳ患者コホートを複数のセンターから得、そしてこれは、抗リン脂質抗体
症候群（ＡＰＳ）の症状を有すると診断された、ＧＰＬが２０以上の１０６人の
患者から構成された。患者の病歴は完全ではなかったが、利用可能な病歴には、
静脈血栓、動脈血栓、脳血管障害、多発性流産、未熟分娩および血小板減少症が
含まれていた。ＧＰＬ値は、２０〜８０７（４１３±１６１、平均±ＳＤ）の範
囲であり、平均値は７７であった。正常コントロール集団は、内部ドナー、市販
供給源またはＳａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンクから得られた５５のサンプルから構
成された。
【０１９２】 ＡＰＳ患者およびコントロールからの血清を、緩衝液中に１：１に希釈し、そ
して固定化β2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）への結合について評価した。β2−ＧＰＩ（
Ｄ１−５）との相互作用の大きさを表４に示す。１０６人のＡＰＳ患者および５
５人のコントロール患者についてはそれぞれ、β2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）につい
ての平均Ｒｅｑは７３０および３２８であり、６３５および２０１の中央値を有
した。患者とコントロール群との間の相違は統計学的に有意であった（ｐ＜０．
０１、ステューデントｔ検定）。ＡＰＳおよびコントロール血清のβ2−ＧＰＩ
（Ｄ２−５）との相互作用の大きさは、これらのグループ間で異なっていなかっ
た（表４）。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】 選択性比率を算出して、β2−ＧＰＩドメイン欠失変異体（ドメイン１の存在
のみ異なる）への血清サンプルの相対的結合を記載した。この選択性比率は、β 2 −ＧＰＩ（Ｄ１−５）への結合（Ｒeq）を、β2−ＧＰＩ（Ｄ２−５）への結合
で除算することによって算出された。ドメイン１を含有するネイティブタンパク
質との優先的な相互作用を示す患者を明確にするために、３倍以上の要素を任意
に選択した。β2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）およびβ2−ＧＰＩ（Ｄ２−５）の両方と
の相互作用規模は、コントロール群において低く、そして大部分のコントロール
患者は、固定化されたいずれのタンパク質についても選択性を示さなかった（表
４）。対照的に、ＡＰＳ患者の８８％は、ドメイン１を含有するβ2−ＧＰＩに
ついて３倍以上の選択性を示した。ＡＳＰ患者の４１％（４３／１０６）は、β 2 −ＧＰＩ（Ｄ２−５）とのごく少量の相互作用（Ｒｅq＜９）を有し、その結果
、非常に高い選択性比率を生じた。
【０１９５】 血清中で観察される相互作用がＩｇＧ画分に依るものであり得るか否かを決定
するために、選択性比率３を有する１０人の患者からの血清をさらに特徴付けし
た。全血漿、ＩｇＧ除去血漿、およびβ2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）を有する全血漿
のＩｇＧの結合相互作用を、表５に示す。プロテインＧでの血清からのＩｇＧの
除去は、本質的に全ての、固定化タンパク質との特異的な結合相互作用を除いた
。ＩｇＧ画分をプロテインＧ画分から酸溶出し、そしてタンパク質との相互作用
について試験した（表５に「全ＩｇＧ」と示される；引き続く中和により全血漿
およびＩｇＧ除去血漿に対してＩｇＧ画分を５０％まで希釈する）。ＩｇＧ画分
のみが、β2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）との相互作用を示し、そしてもともとの血清
のβ2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）との相互作用に、その大きさにおいて類似する応答
を生じた（希釈の差に注意のこと）。従って、このアッセイ系において、ドメイ
ン１選択性の患者血清のβ2−ＧＰＩへの結合は、ＩｇＧ画分によって説明され
得る。
【０１９６】
【表５】
【０１９７】 非選択的なＡＰＳ患者のサブグループ（選択比＜３）は、それらの結合がＩｇ
Ｇ画分に起因し得るか否かを決定するために、さらに評価された。その結果を表
６に示す。ドメイン１選択性の患者の場合のように、どちらかの固定化タンパク
質との全ての相互作用は、その血清をプロテインＧで処置してＩｇＧ画分を枯渇
することによって除かれ得る。患者からのＩｇＧ画分は、もともとの血清サンプ
ルにおいて観察された結合を反映するようであった（表６）。
【０１９８】
【表６】
【０１９９】 本研究は、表面プラスモン共鳴を利用して、ＡＰＳ患者の大きな代表的な（ｃ
ｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）集団（ｎ＝１０６；ＧＰＬ≧２０）において抗体結
合ドメインを局在化させた。ＡＰＳ患者血清は、非ＡＰＳコントロールよりも、
有意により大きなβ2−ＧＰＩへの結合を示した。さらに、大部分の患者の血清
は、ネイティブのβ2−ＧＰＩ（Ｄ１−５）を、β2−ＧＰＩのドメイン欠失変異
体（ドメイン１を除く全てのドメインを含む）よりもより大きな程度で結合した
。患者の８８％が、ドメイン１を欠くドメイン欠損変異体に比較して、ドメイン
１含有β2−ＧＰＩに対する３倍以上の特異性を示した。ＡＰＳ患者血清におけ
るドメイン１結合活性は、ＩｇＧ成分を枯渇させることによって完全に除かれ、
そして結合活性は、ＩｇＧ画分において十分に再構成され得る。これらの結果は
、大部分のＡＰＳ患者における免疫ドミナント結合エピトープが、β2−ＧＰＩ
のアミノ末端ドメインに局在化されていることを示す。
【０２００】 （実施例３：β2−ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に対する免疫反応性について
ドメイン１フラグメントを試験する） （ヘキサペプチド合成） Ｗａｎｇ樹脂に結合されたＮ−α−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、全反応時間の３
０分間、アミンを脱保護するために、２０％ ピペリジン（ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）中）中に二度懸濁した。Ｃ末端プロリンを有するヘキサペプチドを
、Ｗａｎｇ樹脂の代わりにクロロトリチル樹脂に結合された保護されていないプ
ロリンを用いて作製して、ジケトピペラジン形成を防止した。
【０２０１】 この樹脂をＤＭＦおよびメチルアルコールで各々二度リンスした。Ｎ−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（６当量）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（
６当量）、および第二のアミノ酸（６当量）ならびにＤＭＦ中のインジケーター
の溶液を、この樹脂に加えた。反応混合物を最低１．５時間室温で攪拌した。次
いで、この樹脂をＤＭＦおよびメチルアルコールで各々二度リンスした。Ｋａｉ
ｓｅｒ試験（２滴の５％ニンヒドリン（エチルアルコール中）＋１滴のピリジン
＋１滴の８０％フェノール（エチルアルコール中））をリンスした樹脂の小部分
について行い、遊離アミンが存在しないことを確認した。
【０２０２】 脱保護およびアミノ酸付加工程を反復して、その配列を終えた。最後のアミノ
酸を上記のように脱保護して、遊離アミンを得た。
【０２０３】 ペプチドを、７．５％（重量）フェノール、２．５％（容積）エタンジチオー
ル、５．０％（容積）水、および５．０％（容積）チオアニソールの溶液（トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）中）を用いてこの樹脂から切断した。この混合物を最低
３時間攪拌した。ＴＦＡを減圧により除去し、そしてペプチドを沈殿させ、そし
てエーテルで二回洗浄した。この固体を、分析のために１：１のアセトニトリル
／水中に溶解した。このペプチドを、１．０×１５０ｍｍ Ｃ１８（５μ，１５
０Å）カラム（Ａ：０．１％ ＴＦＡ，２％ アセトニトリル（水中）；Ｂ：０
．０８％ ＴＦＡ，２％ 水（アセトニトリル中））でのＬＣＭＳにより特徴付
けした。
【０２０４】 アセトニトリルおよび水を、減圧下で、または凍結乾燥によって除去し、そし
てこのペプチドを０℃にて保存した。
【０２０５】 活性を示すペプチドを再び大規模に作製し、そしてＣ１８カラム（Ａ：０．１
％ ＴＦＡ（水中）；Ｂ：０．０８％ ＴＦＡ（アセトニトリル中））を使用し
て精製した。
【０２０６】 （競合阻害ＥＬＩＳＡ） マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐTM，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０μｌの全長の組換えβ2
ＧＰＩ（０．１Ｍ 重炭酸塩（ｐＨ９．５）中１０μｇ／ｍｌ）で被覆し、４℃
にて一晩インキュベートし、０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で三回洗浄し、
そして７５μｌの２％ 脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ，２％ ＮＦＤＭ）を用
いて室温にて１時間ブロックした。試験インヒビターを２％ ＮＦＤＭ中に希釈
し、そして被覆したウェルに２５μｌの各希釈物を加えた。アフィニティー精製
したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を２％ ＮＦＤＭ中に希釈し、ウェル（イ
ンヒビターを有さない１１個のウェルの群を含み、これは、ポジティブコントロ
ールとして作用した）に２５μｌ（一定濃度）を加えた。ウェルの含有物を混合
し、そしてプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。そのプレートをＰ
ＢＳで三回洗浄し、そして２％ ＮＦＤＭ中で適切に希釈された、γ鎖特異性で
あるアルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ ＃６２−８４２２
）を５０μｌ加え、そして３７℃にて１時間インキュベートした。このプレート
をＰＢＳで三回洗浄し、５０μｌのアルカリホスファターゼＰＰＭＰ色素形成基
質溶液を加え、そして３０分間室温でインキュベートした。５５０ｎｍでの光学
密度を、このプレートをマイクロプレートオートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，モデルＥＬ３１１）にて読み取ることによって決定し
た。阻害パーセント（％）は、インヒビターの存在下で得られたＯＤ550を、イ
ンヒビターを有さない１１個のウェルから得られた平均ＯＤ550で除算し、次い
で１００で乗算することにより決定した。
【０２０７】 （阻害研究） ７４個のペプチドを合成し、そして競合阻害ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニン
グした。簡潔には、「粗」ペプチド（すなわち、それらは精製されなかった）を
、３つの異なるアフィニティー精製された抗カルジオリピン抗体に対して１：２
の希釈でスクリーニングした。次いで、１：２の希釈で陽性であったペプチドを
、さらに倍化した希釈で再スクリーニングした。高希釈で阻害した２８個のペプ
チドを再合成し、そして精製した。次いで、これらの精製されたペプチドを、競
合阻害アッセイにおいてアッセイした。組換えβ2ＧＰＩもまた、陽性コントロ
ールとしてアッセイした。
【０２０８】 図９に示される結果は、これらのペプチドのうちのいくつかが、β2ＧＰＩへ
の結合から抗カルジオリピン抗体の結合を阻害し得ることを示す。試験されたペ
プチドの大半は阻害せず、従って、阻害するものに対してある程度の特異性を付
与する。２つを除く全ての陽性ペプチドは、ドメイン１に存在するジスルフィド
結合されたシステインの２つのセットの周囲にクラスター形成される。そのよう
にクラスター形成されない２個のペプチドはまた、阻害において最も貧弱である
。これらのジスルフィド結合されたシステインは、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
抗体によって認識される構造を作製し得る。
【０２０９】 （実施例４：β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体への結合のために重要な、ド
メイン１におけるアミノ酸残基を決定するための、変異誘発およびマイクロパニ
ング（ｍｉｃｒｏｐａｎｎｉｎｇ）データ） （誤りがちなＰＣＲ） 誤りがちなＰＣＲを以下のように実施した。ヒトβ2ＧＰＩのドメイン１を、
Ｔａｑポリメラーゼの誤りの割合を増強する条件下で、ＰＣＲによって増幅した
。プライマーを、アミノ酸１〜６４が増幅されるようにした。Ｓｆｃ１制限部位
を、アミノ酸１の部分として組込んだ。３’末端にて、Ｓａｌ１制限部位は、ア
ミノ酸６４の後ろに組込まれた。ＰＣＲ反応を、０．２５ｍＭのＭｎＣｌ2を用
いて、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１に記載のように
実施した。このＰＣＲ産物をＳｆｃ１およびＳａｌ１で消化し、そしてＡｐａ１
およびＳａｌ１で消化されたｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ２中にクローニングした。こ
れは、ｐＩＩＩシグナル配列の直後のｐＩＩＩのＮ末端にあるドメイン１に位置
する。連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９１中に電気穿孔した。ファージを収集
し、そして標準的方法によって滴定した。得られたファージクローンを、マイク
ロパニング技術を用いてアッセイした。
【０２１０】 （マイクロパニング） Ｉｍｍｕｌｏｎ２型プレートを、プロテインＧでコーティングした。プロテイ
ンＧを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中で５μｇ／ｍＬに調製し、そして１ウェルあ
たり１００μＬをマイクロタイトレーションプレートのウェルに添加し、そして
４℃にて一晩インキュベートした。過剰のプロテインＧ溶液をプレートから捨て
た後、各ウェルを２００μＬの２ＹＴを用いて、１時間室温にて、振動台上で攪
拌しながらブロックした。自動プレート洗浄機と共にＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水
（ｐＨ７．４）／０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を用いて、
２００μＬで４回ウェルを洗浄した。２ＹＴで２．５μｇ／ｍＬに希釈された、
１００μＬのヒトβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質６６２６、６５０１、６７０１、
ウサギβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質、またはコントロールの正常ＩｇＧを、洗浄
したウェルに添加した。プレートを、１時間室温にて回転台上でインキュベート
した。
【０２１１】 マイクロパニングによって試験されるべきファージを、バイオパニング（ｂｉ
ｏｐａｎｎｉｎｇ）によって生成された寒天プレートから得た。試験されるべき
各クローンを、１ウェルあたり２００μＬの２ＹＴ／Ｔｅｔを含有する丸底９６
ウェルマイクロタイトレーションプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、
ＮＹ）の個々のウェルに、滅菌爪楊枝を用いて移し、そして３０℃にて一晩培養
した。一晩のインキュベーションの後に、マイクロタイトレーションプレートホ
ルダーを用いてファージ培養物を１３００×ｇにて１０分間、室温にて遠心分離
した。上清は、「正味の（ｎｅａｔ）」ファージの供給源を構成した。この正味
のファージを、１：１００〜１：１０００に希釈し、そして１００μＬを、上記
のように調製されたプロテインＧ結合β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体−６５０
１および正常ＩｇＧを含有するプレートに添加した。ａＰＬ抗体またはコントロ
ールＩｇＧとの希釈ファージのインキュベーションを、室温で２時間、水平回転
装置上で実施した。自動プレート洗浄機中でのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いた９回
の洗浄後、ＩｇＧ結合ファージを２０μＬの０．２Ｎ ＨＣｌ−グリシン／０．
１％ ＢＳＡ（ｐＨ２．２）で溶出した。溶出インキュベーションを室温で１０
分間続け、その時間の間に、１ウェルあたり２０μＬの新鮮な飢餓させたＥ．ｃ
ｏｌｉを含有する新たなＣｏｒｎｉｎｇマイクロタイトレーションプレートを調
製し、そしてこれを冷却維持した。１４０μＬの２９ｍＭ Ｔｒｉｓを、ファー
ジ溶出物を含有するプレートに添加してｐＨを中和化し、次いで、２０μＬのフ
ァージ懸濁液を各ウェルから、飢餓させたＥ．ｃｏｌｉを含有するプレートにお
ける対応するウェルに移した。３７℃での１０分間のインキュベーションの後、
２００μＬの２ＹＴを添加し、そして３７℃でさらに３０分間インキュベーショ
ンを実施した。多チャンネルピペッターを使用して、最後のマイクロタイトレー
ションプレート由来のもともとの８×１２ウェルパターンおよびの配向を維持し
つつ、各ウェルからの８μＬを、大きな２ＹＴ／Ｔｅｔ寒天プレート上にスポッ
トした。このスポットを３０分間乾燥させた後、プレートを３０℃にて一晩イン
キュベートした。翌日、コロニーを、以下によって０〜４＋で半定量的にスコア
付けした；０は、１０個未満のコロニーを表す；１＋＝１０〜３０；２＋＝３０
個のコロニーから７０％コンフルエントまで；３＋＝７０％〜９０％コンフルエ
ント；４＋＝コンフルエント。
【０２１２】 結果を、表７Ａおよび７Ｂに示す。表７Ａについて、ウサギ抗ヒトβ2ＧＰＩ
を、２つの個別の場合で実施した。変異体を、もともとのアミノ酸、位置の番号
、および変異体においてその位置にあるアミノ酸の正体で列挙する。例えば、Ｓ
３１Ｆは、３１位でＳｅｒがＰｈｅに変異されたことを示す。非変異ドメイン１
は、３＋のスコアを有し、一方、ドメイン５のファージは、−のスコアを与えた
。非表現変異は示されない。クローンはＮ末端で始まり、そしてＣ末端へ向かう
。
【０２１３】 表７Ｂは変異分析の拡大を表し、これは、さらなる抗体に対して試験されたさ
らなる変異体を示す。最終的な４個のファージクローンは、アスタリスクで示さ
れる変異を有する。これは、このファージが複数の変異を有することを示す（３
Ａ４：Ｄ８Ａ、Ｓ１３Ｔ；３Ｆ１２３：Ｌ１０Ｉ、Ｐ１７Ｑ、Ｙ２２Ｃ；３Ｇ１
：Ｒ２Ｗ、Ｓ３８Ｔ；４Ｄ１：Ｎ５６Ｔ、Ｒ６３Ｇ）。
【０２１４】 結果は、特に（以下の参照のこと）、（ａ）このアッセイが一貫していること
；（ｂ）すべての抗体が同じく反応するわけではないこと；（ｃ）同じ位置での
異なる変異が非常に異なる効果を有し得ること（例えば、Ｍｅｔ４２を参照のこ
と）を示す。
【０２１５】 全体の結果は、図３に示されるドメイン１の三次元構造のモデル中で示される
。アミノ酸５５〜５８（ｉｌｅ、ａｓｎ、ｌｅｕ）、アミノ酸４０〜４５（アミ
ノ酸４３〜４５、すなわち、ａｒｇ、ｌｙｓ、ｐｈｅを含む）、およびアミノ酸
１９（ｌｙｓ）は、ａＣＬ抗体への結合のために重要であるようである。
【０２１６】
【表７】
【０２１７】
【表８】
【０２１８】 （実施例５：プラットホームに結合体化されたドメイン１β2ＧＰＩポリペ
プチド） （四価プラットホームＢＡ／ＰＩＺ／ＩＤＡ／ＴＥＧ（ＢＡ／ＰＩＴＧ）の
合成） （化合物１）：５０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の、１．０２ｇ（４．３７ｍｍｏｌ
）のＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−イミノ二酢酸（化合物５（米国特許第５
，５５２，３９１号）、化学的に規定された非重合体結合価プラットホーム分子
およびその結合体）および１．０１ｇ（８．７５ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシス
クシンイミドの溶液（０℃に冷却）に対して、２．２６ｇ（１０．９４ｍｍｏｌ
）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。混合液を緩徐に室温まで暖め
ながら１６時間攪拌し、そして２５ｍＬのＴＨＦ中の２．２２ｇ（１０．１ｍｍ
ｏｌ）のモノ−ＣＢＺ−ピペラジンの溶液をこの混合液に添加し、次いで１．２
２ｍＬ（８８７ｍｇ、８．７５ｍｍｏｌ）のＥｔ3Ｎを添加した。この混合液を
７時間室温にて攪拌し、そして濾過した。濾液を濃縮し、そして残渣を１２５ｍ
ＬのＥｔＯＡｃ中に溶解し、そして２×１２５ｍＬ部分の１Ｎ ＨＣｌ、１２５
ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液と共に振盪し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そ
して濃縮して２．３９ｇの粘着性固体を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（
９５／５ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）による精製は、１．８５ｇ（６６％）の化合
物１を得た。
【０２１９】 （化合物２）：１０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１．７４ｇ（２．７４ｍｍｏｌ）
の化合物１の溶液に対して、１０ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、そして混合
液を室温で３時間攪拌した。混合液を濃縮し、そして残渣を５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2 中に溶解した。混合液を０℃に冷却し、そして１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3を
添加した。次いで、混合液を４つの１００ｍＬ部分のＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2層を組み合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して粘
着性の吸湿性固体として１．４６ｇ（９９％）の化合物２を得た。これは、次の
工程に直接使用された。
【０２２０】 （化合物３）：０．７ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の化合物２および２２６μＬ（
１６８ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンの溶液（０℃）
に対して、４ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中で１２７μＬのトリエチレングリコールビス−
クロロホルメートの溶液を添加した。そして、この混合液を室温で３時間攪拌し
た。この混合液を、８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2と８０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌとの間で分
配した。ＣＨ2Ｃｌ2層を、２つの８０ｍＬ部分の水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮して結晶固体として７３６ｍｇ（９３％）の化合物
３を得た。
【０２２１】 （化合物５）：化合物３（６１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を３ｍＬの３０％
ＨＢｒ／ＨＯＡｃ中に溶解し、そして得られた混合液を室温で１時間攪拌し、そ
の時点で５ｍＬのＥｔ2Ｏを添加した。この混合液をフリーザー中に１時間置き
、そして遠心分離した。得られたペレットをＥｔ2Ｏを用いて洗浄し、そして乾
燥させてテトラヒドロブロミド塩４を得た。これを、１ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解し
た。この混合液に対して、４９ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）のＮａＨＣＯ3および
３ｍＬのジオキサンを添加する。必要であれば、さらなるＮａＨＣＯ3を添加し
、混合物を塩基性にする。この混合液を０℃に冷却し、そして７４８ｍｇ（２．
８９ｍｍｏｌ）の無水ブロモ酢酸を添加する。この混合液を２時間攪拌し、そし
て２０ｍＬの１Ｎ Ｈ2ＳＯ4と２０ｍＬの８０／２０ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨと
の間に分配する。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して粗
化合物５を得る。これを、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯ
Ｈ）によって精製して、化合物５を得る。
【０２２２】
【化１１】
【０２２３】 （ＡＯＡ／ＰＩＴＧ４量体プラットホームおよびβ2ＧＰＩドメイン１ポリペ
プチド結合体化合物４４の合成） ドメイン１（ＴＡ／Ｄ１）のアミノ基転移：水および酢酸ナトリウム緩衝液を
、使用前にヘリウムを用いて散布した。ドメイン１（１０．５５ｍｇ、１．４９
μｍｏｌ）を、ポリプロピレンチューブ中の０．５ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解し、そ
して４．０ｍＬの２Ｍ ｐＨ５．５ ＮａＯＡｃ緩衝液を添加した。０．５ｍＬ
のＨ2Ｏ中の３．７３ｍｇ（１４．９μｍｏｌ）のＣｕＳＯ4の溶液を、この混合
物に添加し、続いて０．５ｍＬの２Ｍ ｐＨ５．５ ＮａＯＡｃ緩衝液中の２．
７５ｍｇ（２９．９μｍｏｌ）のグリオキシル酸の溶液を添加した。この混合物
を、窒素雰囲気下で保持し、そして穏やかに１８時間攪拌し、２８０ｎｍで検出
する、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ、ジフェニルカラム（Ｖｙｄ
ａｃ）を用いる分析ＨＰＬＣ（１ｍＬ／分；勾配２５％〜４５％ Ｂ、０〜２０
分、Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）によれ
ば、この時点で反応は完了したようであった。およその保持時間は以下の通りで
ある：Ｄ、１３．２分；ＴＡ／Ｄ１、１３．７分；酸化ＴＡ／Ｄ１、１３．４分
）。この混合物を、Ｈ2Ｏを用いて２０ｍＬの容量になるように希釈し、濾過し
、そしてＨＰＬＣ（２２．４ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、１０μｍ、ジフェニ
ルカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）（１２ｍＬ／分；勾配２５％
〜４０％ Ｂ、０〜４０分、Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ Ｔ
ＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）によって精製した。分析ＨＰＬＣによって証明される純粋な
ＴＡ／Ｄ１を含む画分をプールし、そして凍結乾燥することにより、５．０ｍｇ
（４８％）のＴＡ／Ｄ１を得た。
【０２２４】
【化１２】
【０２２５】 （アミノオキシアセチル（ＡＯＡ）／ＰＩＴＧプラットホームの合成） ４−ニトロフェニル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキ
シアセテート（２’）：０℃にて、３５ｍＬの無水ＴＨＦ中の１．５ｇ（７．８
５ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシ酢酸（
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（化合
物１’）の攪拌した溶液に、１．０９ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェ
ノールを添加し、続いて１．６２ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）のＤＣＣを添加した。
この混合物を、窒素雰囲気下で０℃にて０．５時間攪拌し、そして室温にて１８
時間攪拌した。この混合物を濾過してジシクロへキシルウレアを除去し、そして
濾液を濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー（９５／５のＣＨＣｌ3／
イソプロピルアルコール）によって精製して２．３０ｇ（９４％）の化合物２’
を白色固体として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．５１（ｓ，９Ｈ）、４
．７３（ｓ，２Ｈ）、７．３６（ｄ，２Ｈ）、７．７３（ｓ，１Ｈ）、８．３２
（ｄ，２Ｈ）。
【０２２６】 ＢＯＣ保護ＡＯＡ／ＰＩＴＧプラットホーム（４’）の合成：化合物３（３０
０ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）を、酢酸中の１．５ｍＬの３０％ ＨＢｒ溶液で
３０分間処理した。得られるテトラアミンのＨＢｒ塩を、ジエチルエーテルの添
加により沈澱させた。この混合物を遠心分離し、そして上清を除去し、そして廃
棄した。残存する固体を、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥し、そして９ｍＬの
ＤＭＦに溶解した。得られる混合物に、２９４μＬ（１．６９ｍｍｏｌ）のジイ
ソプロピルエチルアミンを添加し、続いて３ｍＬのＤＭＦ中の４１０ｍｇ（１．
３１ｍｍｏｌ）の化合物２の溶液を添加した。この混合物を窒素雰囲気下で４時
間攪拌し、そして１５／１のＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨとブラインとの間で分配した
。水層を、１５／１のＣＨＣ１3／ＭｅＯＨで２回洗浄し、そして合わせた有機
層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、そして濃縮して６８０ｍｇの油状物を得た。シリカ
ゲルクロマトグラフィー（段階勾配９５／５〜７５／２５のＣＨＣｌ3／ＭｅＯ
Ｈ）による精製によって、２１５ｍｇ（６５％）の化合物４’が白色固体として
得られた：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４９（ｓ，３６Ｈ）、３．４０〜３
．７３（ｍ，４０Ｈ）、４．２４（ｍ，１２Ｈ）、４．５９（重複一重項，８Ｈ
）、８．２１（ｓ，２Ｈ）、８．３２（ｓ，２Ｈ）。
【０２２７】 ＡＯＡ／ＰＩＴＧプラットホーム（化合物５’）：ＨＣｌガスを、１０／１／
１のＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ中の６７ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）の
化合物４’の攪拌溶液を通して１５分間起泡し、そしてこの混合物をさらに１５
分間攪拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、そして減圧下で１６時間保持して
４３ｍｇ（７８％）の化合物５’を白色固体として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳ
Ｏ）δ３．３３〜３．６７（ｍ，４０Ｈ）、４．０８（ｍ，４Ｈ）、４．１８（
ｓ，８Ｈ）、４．９０（ｓ，８Ｈ）；Ｃ40Ｈ69Ｎ14Ｏ18について計算された質量
スペクトル（ＥＳ）ｍ／ｚ：１０３３。実測値：１０３３。
【０２２８】
【化１３】
【０２２９】 ４価Ｄ１結合体化合物４４の合成：ＴＡ／Ｄ１（０．９０ｍｇ、１．２８×１
０-7ｍｏｌ）を、ポリプロピレンチューブ中の２５０μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ４．６０）緩衝液中に溶解した。この混合物に、０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ４．６０）緩衝液中の１６．６μＬ（１８．９μｇ、１．６０×１０ -8 ｍｏｌ）のＡＯＡ／ＰＩＴＧプラットホーム（化合物５’）０．９７μｍｏｌ
／ｍＬ溶液を添加した。この混合物を、窒素下で６日間穏やかに攪拌し、２８０
ｎｍで検出する４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ、ジフェニルカラム
（Ｖｙｄａｃ）を用いる分析ＨＰＬＣ（１ｍＬ／分；勾配２５％〜４５％ Ｂ、
０〜２０分、Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ
）によれば、この時点でこの反応は完了したようであった。およその保持時間は
以下の通りである：ＴＡ／Ｄ１、１３．７分；化合物４４、１７．２分）。この
混合物を、９５／５の水／アセトニトリルで１ｍＬの容量になるように希釈し、
そしてＨＰＬＣ（１０ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ、ジフェニルカラム
（Ｖｙｄａｃ）（３ｍＬ／分；勾配２５％〜４５％ Ｂ、０〜４０分、Ａ＝０．
１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）によって精製した。
分析ＨＰＬＣによって証明された純粋な結合体化合物４４を含む画分をプールし
、そして凍結乾燥して０．４ｍｇ（２５％）の化合物４４を得た：Ｃ1320Ｈ2032 Ｎ338Ｏ370Ｓ20について計算された質量スペクトル（ＥＳ、平均ｍ／ｚ）：２９
，１９８。実測値：２９，２１８。
【０２３０】
【化１４】
【０２３１】 （４量体ＡＯＴＥＧ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホームおよびβ2ＧＰＩドメイ
ン１ポリペプチド結合体の合成） ２−［２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ］エタノール（７）：２−［２−
（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（１２．６６ｇ、７５．１ｍｍｏ
ｌ）およびヨウ化ナトリウム（３３．７７ｇ、２２５．３ｍｍｏｌ）を、２５０
ｍＬのアセトン中に溶解した。還流コンデンサーをフラスコに取りつけ、そして
この混合物を還流下で１８時間加熱した。冷めたら、この混合物を濃縮し、そし
て残渣を４００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2、ならびに３００ｍＬの水と１００ｍＬの飽和
亜硫酸水素ナトリウム水溶液との混合物とともに振盪した。水層を４００ｍＬ部
分のＣＨ2Ｃｌ2で２回洗浄し、そして合わせたＣＨ2Ｃｌ2層を乾燥し（ＭｇＳＯ 4 ）、濾過し、そして濃縮して１８．３ｇ（９４％）の７を淡黄色油状物として
得た。この油状物を、さらなる精製を行わずに次の工程で用いた：1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）δ２．４３（ｂｒｄ ｓ，１Ｈ）、３．２８（ｔ，２Ｈ）、３．
６１（ｍ，２Ｈ）、３．６８（ｓ，４Ｈ）、３．７８（ｍ，４Ｈ）；Ｃ6Ｈ13Ｏ3 ＩＮａ（Ｍ＋Ｎａ）+について計算された質量スペクトル（ＥＳ）ｍ／ｚ：２８
３．０。実測値：２８３．０。
【０２３２】 ２−［２−（２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシエ
トキシ）エトキシ］エタノール（８）：５．８５ｇ（１．５０ｍｍｏｌ）の２−
［２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ］エタノール（化合物７）に、２．００
ｇ（１．００ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドロキ
シルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）および３．３６ｍＬ
（３．４２ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）のＤＢＵを添加した。この混合物を攪拌して
、触るには熱くなった粘着性の液体を得、そして５５℃の油浴中に１８時間置い
て白色沈澱物を形成させ、この沈澱物は、この混合物を凝固させた。この混合物
を２０ｍＬのＣＨ2Ｃ１2中に溶解し、そして５００ｍＬの攪拌したＥｔＯＡｃに
添加して沈澱物を形成させ、この沈澱物を濾過により除去し、そして濾液を濃縮
して黄褐色の油状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％アセトン／
ヘキサン）による精製によって、２．６１ｇ（６７％）の８を油状物として得た
：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．５０（ｓ，９Ｈ）、３．６５（ｔ，２Ｈ）、
３．７０（ｂｒｄ ｓ，４Ｈ）、３．７６（ｍ，４Ｈ）、４．０６（ｔ，２Ｈ）
、７．８３（ｂｒｄ ｓ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２８．０、６
１．３、６８．９、７０．１、７０．３、７２．５、７２．６、７５．１、８１
．２、１５７．１。
【０２３３】 ２−［２−（２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシエ
トキシ）エトキシ］エチルブロミド（化合物９）：臭素（約０．２８３ｍｍｏｌ
）を、２ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の５０ｍｇ（０．１８８ｍｍｏｌ）の化合物８、７
４ｍｇ（０．２８３ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフィン、および３１μＬ（３
０ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌ）のピリジンの溶液に橙色が持続するまで、滴下し
た。この混合物を室温にて０．５時間攪拌し、そして１ｍＬの飽和亜硫酸水素ナ
トリウム溶液を添加して、過剰な臭素をクエンチした。次いで、この混合物を、
１０ｍＬのＨ2Ｏと２×１５ｍＬのＥｔＯＡｃとの間で分配した。合わせた有機
層を、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮した。シ
リカゲルクロマトグラフィー（３５／６５のアセトン／ヘキサン）による残渣の
精製によって、５４ｍｇの化合物９が油状物として得られた：1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）δ１．４９（ｓ，９Ｈ）、３．４８（ｔ，２Ｈ）、３．６８（ｓ，４
Ｈ）、３．７３（ｍ，２Ｈ）、３．８４（ｔ，２Ｈ）、４．０３（ｔ，２Ｈ）、
７．５０（ｓ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２８．３、３０．４、６
９．４、７０．６（２つのシグナル）、７１．３、７５．５、８１．７、１５６
．９。
【０２３４】 ２−［２−（２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシエ
トキシ）エトキシ］エチルアジド（１０）： 化合物９からの合成：０．２５ｍＬの無水ＤＭＦ中の１００ｍｇ（０．３０５
ｍｍｏｌ）の化合物９の溶液を、０．５ｍＬの無水ＤＭＦ中の１５９ｍｇ（２．
４４ｍｍｏｌ）のアジ化ナトリウムの溶液に添加した。さらに０．２５ｍＬのＤ
ＭＦを用いて残渣９をリンスして反応混合物中に入れ、そしてこの混合物を１１
５℃にて３時間加熱した。冷めたら、この混合物を、３ｍＬのＨ2Ｏと４×３ｍ
ＬのＣＨ2Ｃｌ2との間で分配した。合わせた有機層を、１０ｍＬのＨ2Ｏで洗浄
し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して黄色油状物を得た。シリカ
ゲルクロマトグラフィー（３５／６５のアセトン／ヘキサン）による精製によっ
て、６７ｍｇ（７６％）の１０が油状物として得られた：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）δ１．４７（ｓ，９Ｈ）、３．４１（ｔ，２Ｈ）、３．６９（ｂｒｄ ｓ
，４Ｈ）、３．７３（ｍ，４Ｈ）、４．０３（ｔ，２Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ
）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２８．１、５０．５、６９．１、７０．１、
７０．４（２つのシグナル）、７５．２、８１．３、１５６．７。
【０２３５】 化合物１３からの１０の合成：窒素雰囲気下の５ｍＬのＤＭＦ中の２５８ｍｇ
（０．６９ｍｍｏｌ）の化合物１３の溶液に、３５８ｍｇ（５．５０ｍｍｏｌ）
のアジ化ナトリウムを添加した。この混合物を室温にて１８時間攪拌し、１００
ｍＬの水を添加し、そしてこの混合物を３×５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。
ＥｔＯＡｃ層を合わせ、そして５０ｍＬの水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、
濾過し、そして濃縮して２９４ｍｇの無色の油状物を得た。シリカゲルクロマト
グラフィー（３０／７０ アセトン／ヘキサン）による精製によって、化合物１
０が無色の油状物として得られた。
【０２３６】 化合物１１：（ＭＲ−５０８−１２８）化合物１０（１．３６ｇ、４．７０ｍ
ｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．４８ｇ、５．６４ｍｍｏｌ）を２
４ｍＬのＴＨＦおよび８ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解し、そして得られる溶液を、室温
にて２時間攪拌した。約１６０μＬ（８滴）の１Ｎ ＮａＯＨを添加し、そして
この混合物を１８時間攪拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、そして濃縮物を
シリカゲルクロマトグラフィー（８０／８／２のＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／濃ＮＨ4Ｏ
Ｈ）によって精製して１．１６ｇ（９４％）の１１を黄色油状物として得た：1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．５０（ｓ，９Ｈ）、１．９０（ｂｒｄ，２Ｈ）
、２．８８（ｔ，２Ｈ）、３．５６（ｔ，２Ｈ）、３．６５（ｍ，４Ｈ）、３．
７１（ｍ，２Ｈ）、４．０１（ｍ，２Ｈ）。
【０２３７】 １，２−ビス（２−ヨードエトキシ）エタン（化合物１２）：１１０ｍＬのア
セトン中の１０．０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）の１，２−ビス（２−クロロエトキシ
）エタン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）および１６．０ｇ（１
０７ｍｍｏｌ）のヨウ化ナトリウムの溶液を、還流下で１８時間加熱した。この
混合物を濃縮し、そして残渣をＣＨＣｌ3を用いて粉砕して生成物を溶解したが
、塩は溶解しないままであった。この混合物を濾過し、そして濾液を濃縮して橙
色油状物を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（段階勾配、１０／９０のＥｔ
ＯＡｃ／ヘキサン〜１５／８５のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して１７
．８ｇ（９０％）の橙色油状物を得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．２８（
ｔ，４Ｈ）、３．６７（ｓ，４Ｈ）、３．７８（ｔ，４Ｈ）：13Ｃ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）δ３．６、７０．５、７２．２。
【０２３８】 化合物１３：ＤＢＵ（２８４μＬ、２９０ｍｇ、１．９０ｍｏｌ）を、２６６
ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドロキ
シルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と２．９６ｇ（８．
０ｍｍｏｌ）の化合物１２との混合物に添加し、そしてこの混合物をキャップし
、そして均質になるまで振盪した。１５分後、この混合物を凝固させ、そしてこ
れを４５分間静置した。この混合物に、５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2を添加し、そしてこ
の混合物を再度振盪して固形物を溶解した。得られる溶液を、２００ｍＬのＥｔ
ＯＡｃに添加した。さらに５０ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、そしてこの混合物を
濾過して固形物を除去した。濾液を濃縮して油状物を得、この油状物を１００ｍ
ＬのＥｔＯＡｃと３×５０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液との間で分配した。ＥｔＯＡ
ｃ層を、２×５０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、続いて２×５０ｍＬの５％亜
硫酸水素ナトリウムで洗浄し、そして濃縮して２．６ｇの黄色油状物を得た。シ
リカゲルクロマトグラフィー（段階勾配、２０／８０〜４５／５５のＥｔＯＡｃ
／ヘキサン）によって精製して５１５ｍｇ（６９％）の化合物１３を黄色油状物
として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．５０（ｓ，９Ｈ）、３．２８（ｔ
，２Ｈ）、３．６８（ｓ，４Ｈ）、３．７２（ｍ，４Ｈ）、４．０２（ｔ，２Ｈ
）、７．７２（ｓ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．９、２８．３、
６８．９、６９．４、７０．２、７０．６、７２．０、７５．４、８１．６、１
５６．９。
【０２３９】 （ジエチレングリコール ビス−４−ニトロフェニルカルボネート、化合物６
０）ピリジン（３０．５ｍＬ、３７７ｍｍｏｌ）を、５００ｍＬのＴＨＦ中５．
０ｇ（４７．１１ｍｍｏｌ）のジエチレングリコールおよび２３．７４ｇ（１１
８ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロギ酸の０℃の溶液にゆっくりと添加し
た。冷却浴を除去し、そしてこの混合液を、室温にて１８時間攪拌した。この混
合物を冷却して０℃に戻し、６Ｎ ＨＣｌで酸性化し、そして４００ｍＬの１Ｎ
ＨＣｌと２×４００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2との間に分配した。この合せた有機層を
乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して２４．３ｇの白色固体を得た。
ヘキサン／ＥｔＯＡｃからの結晶化により、１６．０ｇ（７８％）の化合物３７
を白色固体として得た：
【０２４０】
【数４】
【０２４１】 （化合物６１）１７ｍＬのピリジン中の２．５ｇ（５．７３ｍｍｏｌ）の化合
物３７の溶液を、３ｍＬのピリジン中の１．８ｇ（１７．２ｍｍｏｌ）ジエタノ
ールアミンの０℃の溶液に添加した。冷却浴を除去し、そしてこの混合液を室温
にて５時間攪拌し、化合物３８を得た。この化合物３８は、単離されなかったが
、次の工程で使用された。
【０２４２】 （化合物１４）以前の工程からの混合液を、冷却して０℃に戻し、４０ｍＬの
ＣＨ2Ｃｌ2、続いて６０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１１．５５ｇ（５７．３ｍｍｏｌ
）の４−ニトロフェニルクロロギ酸の溶液を添加し、そしてこの混合液を室温に
て２０時間攪拌した。この混合液を冷却して０℃に戻し、１Ｎ ＨＣｌで酸性化
し、そして３００ｍＬの１Ｎ ＨＣｌと２×２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2との間に分
配した。この合せた有機層を、乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、濾過し、そして濃縮し
て１３．６ｇの黄色固体を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／
ＭｅＯＨおよびＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による精製は、４．９１ｇ（８３％）の
化合物３９を、粘着性のアモルファス状固体として提供した：
【０２４３】
【数５】
【０２４４】
【化１５】
【０２４５】 （ＢＯＣ保護ＡＯＴＥＧ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホーム、化合物１５）トリ
エチルアミン（１５７μＬ、１１４ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、続いて２９８ｍ
ｇ（１．１３ｍｍｏｌ）の化合物１１を、１９３ｍｇ（０．１８８ｍｍｏｌ）の
化合物１４（上記および米国特許番号第６０／１１１，６４１号（１９９８年１
２月９日出願）のように調製された）の攪拌した溶液に添加した。この混合液を
、室温になるようにし、そして一晩攪拌した。この混合液を０℃に冷却し、１Ｎ
ＨＣｌで酸性化し、そして２０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌと４×２０ｍＬのＣＨ2Ｃ
ｌ2との間に分配した。この合せた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、乾
燥（ＭｇＳＯ4）させ、濾過し、そして濃縮して２７９ｍｇの黄色の油状物を得
た。シリカゲルクロマトグラフィー（９７／３のＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）による
精製により、１３８ｍｇ（４８％）の１５を油状物として提供した：
【０２４６】
【数６】
【０２４７】 Ｃ62Ｈ117Ｎ10Ｏ33（Ｍ＋Ｈ）+について算定された質量スペクトル（ＥＳ）ｍ／
ｚ：１５２８．８。実測値：１５２８．５。
【０２４８】 （化合物１６）化合物１５（６０ｍｇ、３９．２μｍｏｌ）を、１０ｍＬの１
／９のトリフルオロ酢酸／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、そしてこの混合液を室温にて３
時間維持した。窒素の穏やかな気流を使用して、溶媒をエバポレートし、そして
残渣を最小量のクロマトグラフィー溶媒（濃ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮにつ
いて５／７．５／８７．５）中に溶解し、これを使用して、シリガゲルカラム上
に混合液に充填した。シリカゲルクロマトグラフィー（段階勾配、濃ＮＨ4ＯＨ
／Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮについて５／７．５／８７．５〜５／１０／８５）による精
製により、３６ｍｇ（８２％）の１６を無色の油状物として提供した：
【０２４９】
【数７】
【０２５０】 Ｃ42Ｈ85Ｎ10Ｏ25（Ｍ＋Ｈ）について算定した質量スペクトル（ＥＳ）ｍ／ｚ：
１１２９。実測値：１１２９。
【０２５１】 分析用ＨＰＬＣによる純度を調べる目的のために、テトラ−アセトンオキシム
を、以下のように調製した。化合物１６（０．３８ｍｇ、０．３４μｍｏｌ）を
、ＨＰＬＣサンプルバイアル中の２４０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液に溶
解した。２．０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液中の４９μＬのアセトンの１
０μＬの溶液を、この溶液に添加した。この混合液を、１時間静置させ、そして
アリコートを、ＨＰＬＣ（４．６ｍｍ Ｃ18カラム、１ｍＬ／分、２１０ｎｍ検
出、勾配、２０分にわたって１０〜６０％Ｂ、Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、
Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ、ＴR＝１９分）によって分析した。Ｃ54Ｈ10 1 Ｎ10Ｏ25（Ｍ＋Ｈ）について算定された収集した溶出液（ＥＳ）ｍ／ｚの質量
スペクトル：１２８９。実測値：１２８９。
【０２５２】
【化１６】
【０２５３】 （４価のＤ１結合体化合物４５の合成）ＴＡ／Ｄ１（５．２０ｍｇ、７．３７
×１０-7ｍｏｌ）を、ポリプロピレンチューブ中の２．０ｍＬのＨｅスパージし
た０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６０緩衝液に溶解した。０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ４．６０緩衝液中のＡＯＴＥＧ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホーム（化合
物１６）の８．１４７μｍｏｌ／ｍＬ溶液の１５．０７μＬ（１３９μｇ、１．
２３×１０-7ｍｏｌ）を、この混合液に添加した。この混合液を、窒素下で穏や
かに２３時間攪拌し、この時この反応は、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、
５μｍ、ジフェニルカラム（Ｖｙｄａｃ）を２８０ｎｍでの検出を使用する、分
析ＨＰＬＣ（１ｍＬ／分；勾配２５％〜４５％ Ｂ、０〜２０分、Ａ＝０．１％
ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）により終了するようであ
った。およその保持時間は、以下のようであった：ＴＡ／Ｄ１、１３．７分；結
合体化合物４５、１７．２分）。この混合液を水で希釈し、５ｍＬの容量にし、
ＨＰＬＣ（１０ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ、ジフェニルカラム（Ｖｙ
ｄａｃ）（３ｍＬ／分；勾配２５％〜４５％ Ｂ、０〜４０分、Ａ＝０．１％
ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）により精製した。分析ＨＰ
ＬＣにより明らかにされる、純粋な結合体化合物４５を含む画分をプールし、そ
して凍結乾燥し、１．７３ｍｇ（４８％）の結合体化合物４５を生じた：Ｃ1322 Ｈ2048Ｎ334Ｏ377Ｓ20について算定された質量スペクトル（ＥＳ、平均Ｍ／Ｚ）
：２９，２９４。実測値：２９，２９４。
【０２５４】
【化１７】
【０２５５】 （アルキルハライドプラットホームを有する第５のＣｙｓのアルキル化を介す
る４価Ｄ１結合体化合物６５の調製）ドメイン１は、酸化形態である４つのシス
テインを有し、適切に折り畳まれたドメイン１は、２つのジスルフィド結合を有
する。第５のシステインは、ネイティブなシステインのＮ末端またはＣ末端の外
側の任意の位置に含まれ得る。本実施例において、第５のシステインは、β2Ｇ
ＰＩの第２のドメインにネイティブに含まれる。第５のシステインは、スルフヒ
ドリル基と反応するように設計されたプラットホームと反応するように、そのフ
リーのスルフヒドリル基によって使用され得る。１つのこのようなプラットホー
ムは、化合物２３のようなハロアシル化されたプラットホームである。
【０２５６】 第５のＣｙｓ Ｄ１（４等量）を、ヘリウムでスパージした１００ｍＭ ｐＨ
８．０のホウ酸ナトリウム緩衝液中に溶解する。この溶液を、窒素雰囲気下にて
維持し、そしてブロモアセチル化プラットホーム（化合物２３（１等量）の溶液
を添加する。この混合液を、この反応が終了するまで攪拌し、そして分取ＨＰＬ
Ｃによるこの混合液の精製は、４価の結合体（化合物６５）を提供する。
【０２５７】
【化１８】
【０２５８】 （ＡＯＴＥＧ／ＰＩＺ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホーム（化合物１７）の合成
）ピリジン（６１０μＬ、５９６ｍｇ、７．５４ｍｍｏｌ）を、１４ｍＬのＣＨ 2 Ｃｌ2中の５００ｍｇ（１．８８ｍｍｏｌ）の化合物８および７６０ｍｇ（３．
７７ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルクロロホルメートの攪拌した溶液にゆっく
りと添加し、そしてこの混合液を、室温にて１８時間攪拌した。この混合液を０
℃に冷却し、そして１Ｎ ＨＣｌ溶液で酸性化した。得られた混合液を、１００
ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ水溶液と３×１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2との間に分配した。合
わせた有機層を、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して１．０５ｇの
粘着性固体を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（６／４ ヘキサン／ＥｔＯ
Ａｃ）による精製により、わずかに黄色がかった油として５０５ｍｇ（６２％）
の化合物１７を得た：
【０２５９】
【数８】
【０２６０】 Ｃ18Ｈ26Ｎ2Ｏ10Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）について算定した質量スペクトル（ＥＳ）ｍ
／ｚ：４５３．１。実測値：４５３．０。
【０２６１】 （ＢＯＣ保護ＡＯＴＥＧ／ＰＩＺ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホーム（化合物１
９）炭酸水素ナトリウム水溶液およびジオキサンの混合液中の化合物１８（１９
９８年１２月９日に出願の米国特許番号第６０／１１１，６４１号に記載される
ように調製）の溶液に、ジオキサン中の４等量の化合物１７の溶液を添加する。
反応の終了の際に、この混合液を水とＣＨ2Ｃｌ2との間に分配する。ＣＨ2Ｃｌ2 層を濃縮し、乾燥し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化
合物１９を提供する。
【０２６２】 （ＡＯＴＥＧ／ＰＩＺ／ＤＥＡ／ＤＥＧプラットホーム（化合物２０））ＢＯ
Ｃ保護基を、化合物１６の調製に記載される様式と本質的に類似する様式におい
て、化合物１９から除去し、化合物２０を得る。
【０２６３】
【化１９】
【０２６４】 （ＡＯＴＥＧ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム、Ｓ−アセチル−２−
［２−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノオキシエトキシ）エ
トキシ］−エチルメルカプタン（化合物２１ａ）の合成）３０ｍＬのアセトン中
の５００ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）の化合物９ａの溶液に、１９１ｍｇ（１．６
８ｍｍｏｌ）のチオ酢酸カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
）を添加した。この混合液を、室温にて１８時間攪拌し、そして得られた沈澱を
濾過によって除去した。濾過液を濃縮し、そして３００ｍＬのＥｔＯＡｃと２×
８０ｍＬのブラインとの間に分配した。ＥｔＯＡｃ層を、乾燥（ＮａＳＯ4）し
、濾過し、そして濃縮して、明るい褐色油として４６０ｍｇ（９３％）の化合物
２１ａを得た：
【０２６５】
【数９】
【０２６６】 （２−［２−（２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノオキシエト
キシ）エトキシ］エチルメルカプタン（化合物２２ａ））化合物２１ａを、窒素
雰囲気下で窒素でスパージした４／１ ６Ｎ ＮＨ4ＯＨ／ＣＨ3ＣＮ溶液を用い
て１時間室温で処理する。この混合液を真空下で濃縮し、化合物２２ａを得、こ
の化合物をさらなる精製なしに使用し得る。
【０２６７】 （ＢＯＣ−保護ＡＯＴＥＧ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム、２４ａ
）化合物２３（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５、３８、２１３
８〜２１４４に記載されるように調製される）を、窒素でスパージした１０／９
０ Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ中の４等量の化合物２２ａの溶液に添加する。得られた溶
液に、４等量のジイソプロピルエチルアミンを添加する。反応の終了の際に、こ
の混合液を、水とＣＨ2Ｃｌ2との間に分配する。ＣＨ2Ｃｌ2層を濃縮し、乾燥し
、そしてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４ａを得る。
【０２６８】 （ＡＯＴＥＧ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム（２５ａ））ＢＯＣ保
護基を、化合物１６の調製に記載される様式と本質的に類似の様式において、化
合物２４ａから除去して、化合物２５ａを得る。
【０２６９】
【化２０】
【０２７０】 （ＡＯＨＥＸ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム、１−ヨード−６−（
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシヘキサン、化合物９ｂの
合成）：１４０ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカル
ボニル）ヒドロキシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）お
よび６５８μＬ（１．３５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の化合物１２の不均一混合物
に１４９μＬ（１５２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＢＵを添加した。この混合物
を３０秒間室温で攪拌した。この時点で、この反応混合物は凝固した。この固形
塊を一晩静置させ、そして５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。この溶液を、２×
２５ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ、および３×２５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌで洗浄した。こ
の合わせた塩基性水層を２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、そしてこの合わせた酸
性水層を２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。この合わせたＣＨ2Ｃｌ2層を乾燥（
Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して黄色の油状物を得た。シリカゲルクロ
マトグラフィーでの精製（段階勾配；１／９９／０．１〜１５／８５／０．１の
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＭｅＯＨ）によって、黄色の油状物として２１６ｍｇ（
６８％）の９ｂを得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４０（ｍ，４Ｈ），１
．４８（ｓ，９Ｈ），１．６２（ｍ，２Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），３．２０
（ｔ，２Ｈ），３．８４（ｔ，２Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ）。
【０２７１】 （Ｓ−アセチル−６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキ
シヘキサン−１−チオール、化合物２１ｂ）：化合物９ｂ（２０９ｍｇ（０．６
１ｍｍｏｌ））を１５ｍＬのアセトン中のチオ酢酸カリウム溶液に添加し、そし
てこの混合物を１８時間室温で攪拌した。アセトンを減圧下で除去し、そして残
渣を５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2と３×２５ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨとの間で分配した。
このＣＨ2Ｃｌ2層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して褐色の油状
物を得た。シリカゲルクロマトグラフィーでの精製（１５／８５のＥｔＯＡｃ／
ヘキサン）によって、無色の油状物として１６６ｍｇ（９４％）の化合物２１ｂ
を得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．３９（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９
Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），２，３２（ｓ，３Ｈ），２．８６（ｔ，２Ｈ），
３．８２（ｔ，２Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ）。
【０２７２】 （６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシヘキサン−１
−チオール、化合物２２ｂ）：２２ｂの精製サンプルを以下のように調製した。
化合物２１ｂ（５０ｍｇ、１７２μｍｏｌ）および２２μＬ（１７．４ｍｇ、８
５．８μｍｏｌ）のトリ−ｎ−ブチルホスフィンを窒素下に配置し、そして窒素
でスパージした２ｍＬのＭｅＯＨ中の１Ｍ ＮａＯＨ溶液を、この混合物に添加
した。この混合物を１８時間室温で攪拌し、そして１７２μＬ（１８０ｍｇ、３
ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸を添加した。この混合物を２５ｍＬのＥｔＯＡｃ
と３×２５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌとの間で分配した。この合わせた水層を２５ｍＬ
のＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して油状物
を得た。シリカゲルクロマトグラフィーでの精製（１５／８５／０．１のＥｔＯ
Ａｃ／ヘキサン／ＭｅＯＨ）によって、無色の油状物として２８ｍｇの２２ｂを
得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．３２（ｔ，１Ｈ），１．４０（ｍ，４Ｈ
），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），２．５３（ｄ ｏｆ ｔ，
２Ｈ），３．８４（ｔ，２Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ）。
【０２７３】 （ＢＯＣ保護ＡＯＨＥＸ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム、２４ｂ）
：化合物２１ｂ（１３ｍｇ、４５μｍｏｌ）および６μＬ（４．５ｍｇ、２２．
３μｍｏｌ）のトリ−ｎ−ブチルホスフィンを窒素下に配置し、そして窒素でス
パージした４／１の６Ｎ ＮＨ4ＯＨ／ＣＨ3ＣＮの３ｍＬの溶液を、この混合物
に添加した。この混合物を室温で１時間攪拌し、そして減圧下で濃縮した。残渣
を、窒素でスパージした１０／９０の水／ＣＨ3ＣＮの３ｍＬの溶液に溶解した
。窒素雰囲気下に維持された、得られた溶液に、１０ｍｇ（７．４４μｍｏｌ）
の化合物２３、続いて８μＬ（５．７７ｍｇ、４４．６μｍｏｌ）のジイソプロ
ピルエチルアミンを添加した。この混合物を１８時間攪拌し、減圧下で濃縮した
。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製（多段階勾配；１／９９〜５／９
５〜７．５／９２．５〜１０／９０〜１５／８５のＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）し、
無色の油状物として１４ｍｇ（９３％）の２４ｂを得た：ＴＬＣ（１０／９０の
ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）、Ｒf＝０．３；Ｃ92Ｈ173Ｎ14Ｏ26Ｓ4（Ｍ＋Ｈ）につ
いて算定された質量スペクトル（ＥＳ）ｍ／ｚ：２０１８。実測値：２０１８。
【０２７４】 （ＡＯＨＥＸ／ＳＡ／ＡＨＡＢ／ＴＥＧプラットホーム、２５ｂ）：ＢＯＣ保
護基を、化合物１６の調製について記載された様式と本質的に同様の様式で化合
物２４ｂから除去した。
【０２７５】
【化２１】
【０２７６】 （ＡＯＨＯＣ／ＤＴ／ＴＥＧプラットホーム、６−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ
カルボニルアミノオキシ）ヘキサン−１−オール、２７の合成）：１ｍＬのＣＨ 2 Ｃｌ2中の１７９μＬ（１８３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）のＤＢＵの溶液に、１３
３ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドロ
キシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）および１５７μＬ
（２１７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の６−ブロモヘキサン−１−オール（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）を添加し、そしてこの混合物を室温で１８
時間攪拌した。この混合物を濃縮し黄色の油状物を得た。シリカゲルクロマトグ
ラフィーでの精製（３５／５／６５のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ヘキサン）によっ
て、無色の油状物として１８０ｍｇ（７７％）の化合物２７を得た：1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3）δ１．３９（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．５９（
ｍ，４Ｈ），３．６３（ｔ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ），７．４２（ｓ，１
Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２５．６，２５．８，２８．１，２８．４
，６２．８，７６．８，８１．７，１５７．２。
【０２７７】 （化合物２８）：０℃、２ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１００ｍｇ（０．４２８ｍｍ
ｏｌ）の化合物２７の溶液に、９０μＬ（８８．１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）の
ピリジン、続いて１１３ｍｇ（０．５５７ｍｇ）のｐ−ニトロフェニルクロロホ
ルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）を添加した。この混合
物を室温で４時間攪拌し、０℃に冷却し、１Ｎ ＨＣｌで酸性化し、２０ｍＬの
１Ｎ ＨＣｌおよび３×２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2との間で分配した。この合わせた
ＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、
そして濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーでの精製によって化合物２８を
得た。
【０２７８】 （化合物２９）：ＥｔＯＡｃ中のジエチレントリアミンの溶液に、二当量のジ
イソプロピルエチルアミン、続いて二当量の化合物２８を添加する。この混合物
を、反応が完了するまで攪拌する。溶媒を除去し、そして生成物である、化合物
２９をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７９】 （ＢＯＣ保護ＡＯＨＯＣ／ＤＴ／ＴＥＧプラットホーム、３０）：ピリジン中
のトリエチレングリコールビス−クロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ．Ｃｏ．）の溶液に対して、２当量の化合物２９を添加する。この混合
物を、反応が完了するまで攪拌し、１Ｎ ＨＣｌおよびＣＨ2Ｃｌ2との間で分配
する。ＣＨ2Ｃｌ2層を乾燥および濃縮し、そして生成物をシリカゲルクロマトグ
ラフィーによって精製して、化合物３０を得る。
【０２８０】 （ＡＯＨＯＣ／ＤＴ／ＴＥＧプラットホーム、３１）：ＢＯＣ保護基を、化合
物１６の調製について記載された様式と本質的に同様の様式で化合物３０から除
去する。
【０２８１】
【化２２】
【０２８２】 （ＡＯＴＥＧ／ＩＤＡ／ＴＥＧプラットホーム、化合物３２の合成）：ピリジ
ン中のトリエチレングリコールビス−クロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）の溶液に対して、２当量のイミノ二酢酸（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）を添加する。この混合物を、反応が完了するま
で攪拌し、そして１Ｎ ＨＣｌおよびＣＨ2Ｃｌ2との間で分配する。ＣＨ2Ｃｌ2 層を乾燥および濃縮し、そして生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって
精製して、化合物３２を得る。
【０２８３】 （化合物３３）：ＴＨＦ中の化合物３２の溶液を、６当量のＮＨＳおよび６当
量のＤＣＣで１時間処理する。この混合物に対して、４当量の化合物１１を添加
し、そしてこの混合物を、反応が完了するまで攪拌する。酢酸を添加して、過剰
のＤＣＣをクエンチし、そして得られた固体を濾過によって除去する。濾液を濃
縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物３３を得
る。
【０２８４】 （化合物３４）：ＢＯＣ保護基を、化合物１６の調製について記載された様式
と本質的に同様の様式で化合物３３から除去する。
【０２８５】
【化２３】
【０２８６】 （ＡＯＴＥＧＯ／ＬＥＶ／ＰＩＴＧの合成） （プラットホーム、ｐ−ニトロフェニル−レブリネート、３５）：４．２５ｍ
Ｌのピリジン中の８００ｍｇ（６．８９ｍｍｏｌ）のレブリン酸（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）の溶液に、１．７８ｇ（７．５８ｍｍｏｌ）の
４−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ．Ｃｏ．）を添加した。得られた溶液を１５分間攪拌し、そして２８ｍＬの水
および２×２８ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で分配した。この合わせたＣＨ2Ｃｌ2層を、乾
燥（ＭｇＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー
での濃縮液の精製（段階勾配；２５／７５〜３０／７０のＥｔＯＡｃ／ヘキサン
）によって、１．０６ｇ（７４％）の化合物３５を得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）δ２．２８（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｍ，４Ｈ），７．２９（ｄ，２Ｈ）
，８．２８（ｄ，２Ｈ）。
【０２８７】 （１，２−ビス（２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノオキシエ
トキシ）エタン、化合物３６）： ２４３ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）の化合物１２に対して、２１９ｍｇ（１．６
４ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドロキシルアミン
（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．）、続いて２４６μＬ（２５０ｍ
ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）のＤＢＵを添加した。この混合物を室温で、凝固するま
で（約１時間）攪拌した。さらに１時間の静置後、この混合物を２ｍＬのＣＨ2
Ｃｌ2に溶解し、得られた溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃに添加し、ＤＢＵのヨ
ウ化水素塩を沈殿させた。さらに５０ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、そしてこの混
合物を濾過した。濾液を２×５０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ、２×５０ｍＬの５％亜硫
酸水素ナトリウム溶液、および２５ｍＬのブラインで洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を
、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、そして濃縮して油状物を得た。シリカゲルク
ロマトグラフィーでの精製（段階勾配；４０／６０〜５０／５０〜８０／２０の
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって、無色の油状物として１６４ｍｇ（６５％）の
化合物３６を得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．４８（ｓ，１８Ｈ），３．
６５（ｓ，４Ｈ），３．７２（ｔ，４Ｈ），４．０２（ｔ，４Ｈ），７．８０（
ｓ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２８．２，６９．０，７０．３，７
５．２，８１．３，１５６．８。
【０２８８】 （１，２−ビス（２−アミノオキシエトキシ）エタン、化合物３７）：化合物
３６（５５９ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解し、そ
してＨＣｌガスを３０分間溶液中にバブリングした。この混合物を減圧下で濃縮
して、粘着性残渣として７２ｍｇ（９０％）の化合物３７をＨＣｌ塩として得た
：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．７５（ｓ，４Ｈ），３．８７（ｍ，４Ｈ），４．
２７（ｍ，４Ｈ）；Ｃ6Ｈ17Ｎ2Ｏ4（Ｍ＋Ｈ）について算定された質量スペクト
ル（ＥＳ）ｍ／ｚ：１８１．１。実測値：１８１．１。
【０２８９】 （化合物３８）：化合物３を、酢酸中のＨＢｒの３０％溶液で処理し、ＣＢＺ
保護基を除去し、そしてテトラアミン臭化水素塩を得る。テトラアミンを水およ
びジオキサン中の炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、そして得られた溶液に４当
量の化合物３５を添加する。反応終了時に、混合物を、水とＣＨ2Ｃｌ2の間で分
配する。ＣＨ2Ｃｌ2層を濃縮し、乾燥し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー
で精製して化合物３８を得る。
【０２９０】 （ＡＯＴＥＧＯ／ＬＥＶ／ＰＩＴＧプラットホーム、化合物３９）：０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中の化合物３８の溶液に、２０当量の化
合物３７を添加する。反応終了時に、混合物を、水とＣＨ2Ｃｌ2の間で分配する
。ＣＨ2Ｃｌ2層を濃縮し、乾燥し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーで精製
して化合物３９を得る。
【０２９１】
【化２４】
【０２９２】 （ＡＯ／ＤＥＧＡ／ＤＥＧプラットホーム、化合物４１の合成）：臭素（約６
当量）を、オレンジ色が持続するまで、ＣＨ2Ｃｌ2中の化合物４０、６当量のト
リフェニルホスフィン、および８当量のピリジンの溶液を滴下する。この混合物
を、０．５時間または反応が完了するまで室温で攪拌し、そして亜硫酸水素ナト
リウムの飽和溶液を添加して、過剰な臭素を壊す。次いで、この混合物を、Ｈ2
ＯとＥｔＯＡｃとの間で分配する。この合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾
燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーで
精製して化合物４１を得る。
【０２９３】 （化合物４２）：化合物４１に対して、６当量のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキ
シカルボニル）ヒドロキシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ
．）および６当量のＤＢＵを添加する。必要ならば、この混合物を、反応が完了
するのに十分な時間加熱する。冷却時に、この混合物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、そ
して得られた溶液をＥｔＯＡｃに添加すると、沈殿が形成する。この沈殿を濾過
によって除去し、そして濾液を濃縮する。フラッシュクロマトグラフィーでの精
製によって、８を得る。
【０２９４】 （化合物４３）：ＢＯＣ保護基を、化合物１６の調製について記載された様式
と本質的に同様の様式で化合物４２から除去する。
【０２９５】
【化２５】
【０２９６】 （化合物３７を二官能性リンカーとして使用する、４価結合体を調製する代替
的方法）：アミノ基転移したドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを４価のアミノ
オキシプラットホームと直接的に反応させることの代替の方法として、アミノ基
転移したドメイン１を、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．６）中で
過剰の化合物３７と反応させて、アミノオキシリンカーがオキシム結合を介して
ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに結合している、化合物５３が得られ得る。
化合物５３を、過剰なリンカーと分離し、そして４当量の化合物５３を、１００
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．６）中でプラットホーム３８と反応させ
て第二のセットオキシム結合を形成して、４価結合体である化合物５４を得る。
【０２９７】
【化２６】
【０２９８】 （化合物２１ａを二官能性リンカーに対する前駆体として使用する、４価結合
体を調製する代替的方法）：化合物２１ａを水酸化アンモニウムで処理して、ア
セチル硫黄保護基を除去し、次いでトリフルオロ酢酸で処理して、ＢＯＣ保護基
を除去し、リンカー５５を得る。グリオキシル含有ポリペプチド（この場合、Ｔ
Ａ／Ｄ１）を、化合物５５と反応させて、オキシム結合を介して結合したスルフ
ヒドリルリンカーを有するドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドである、化合物５
６を得る。４当量の化合物５６をプラットホーム２３と反応させて、４価のドメ
イン１β2ＧＰＩポリペプチド結合体である、化合物５７が得られ得る。
【０２９９】
【化２７】
【０３００】 （実施例６；ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド四量体結合体化合物４４の結
合特性） 四量体結合体化合物４４の、２つのアフィニティー精製したヒト抗β2−ＧＰ
Ｉ抗体への結合を、表面プラズモン共鳴を用いて分析した。
【０３０１】 （四量体結合体化合物４４のＫｄ決定のための材料および方法） 試薬。ＣＭ５チップ、ＮＨＳおよびＥＤＣおよびＨＢＳ−ＥＰ緩衝液は、ＢＩ
Ａｃｏｒｅからであった。ヒトのプールした正常なＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）を、離
れたフローセル中でチップ上に固定し、そしてネガティブコントロールとして使
用した。２人の患者（６７０１および６６２６）由来のアフィニティー精製した
β2−ＧＰＩドメイン１特異的抗体を、離れたフローセル中で固定した。
【０３０２】 表面プラズモン共鳴。すべての実験を、ＢＩＡｃｏｒｅTM２０００機器で、２
５℃にて１０μＬ／分の流速で行った。チップ平衡および結合研究を、脱気した
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて行った。この緩衝液は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ
／ｖ）界面活性剤Ｐ２０からなる。タンパク質リガンドの、それらのフリーのア
ミノ基を介するＣＭ５チップへの共有結合を、このチップに４０μＬの０．０５
Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣを流し、このチップを活性化し、続いて適切なタ
ンパク質リガンドに曝露することによって達成した。アフィニティー精製した抗
体および正常なＩｇＧを、ＮＨＳ活性化したＣＭ５チップに、１００μＬの、１
０ｍＭアセテート（ｐＨ４．８）中１００μｇ／ｍＬ溶液を流すことによって固
定した。次いで、チップ表面上の過剰な反応性基を、４０μＬの１Ｍエタノール
アミン（ｐＨ８．５）でクエンチする。
【０３０３】 力価測定。β2−ＧＰＩのバキュウロウイルス発現ドメイン１および四量体化
合物４４を、ＨＢＳ−ＥＰで希釈し、チップに流し、そして応答値を、７８０秒
間収集した。このチップを、サンプル曝露間に、８０μＬの０．１Ｍグリシン−
ＨＣｌ（ｐＨ２．１）、０．１Ｍ ＮａＣｌで再生した。一連の５回の力価測定
を、各サンプルについて行った。結合平衡へのアプローチは、測定期間の間に不
完全であったので、平衡結合値（Ｒeq）を、製造業者のソフトウェア（ＢｉａＥ
ｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン２．２、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ））を用
いて、会合曲線を以下の式に当てはめることによって決定した：
【０３０４】
【数１０】
【０３０５】 ここで、Ｒ1は、時間ｔでの測定されたＢＩＡｃｏｒｅ応答であり、Ｒeqは、平
衡プラトー応答であり、ｔは時間であり、ｔ0は開始時間であり、ｋsは見かけの
会合定数であり（ｋs＝ｋaＣ＋ｋdisであり、ここでｋaは会合定数であり、Ｃは
分析物濃度であり、そしてｋdisは解離定数である）、そしてＲ0は応答オフセッ
トである（Ｍａｒｑｕａｒｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズム）。
【０３０６】 各力価測定会合曲線は、その力価測定のためのそのネガティブコントロール（
正常なＩｇＧ）細胞バックグラウンドを差し引かれている。算定されたＲeqを、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン２．０１を用いて、濃度
に対してプロットした。データを、結合する１つ部位に当てはめ（直角双曲線：
Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／［Ｋｄ＋Ｘ］）、そしてＫｄ値を、モル単位で算定する。ド
メイン１および化合物４４のモル濃度を、２８０ｎｍでの吸光度および１．８５
の吸光係数で決定した。
【０３０７】 （結果および考察） 患者６７０１および６６２６由来のアフィニティー精製した抗体を、別個の微
量流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）チャンバー中で固定し、そして濃度を変化
させたヒトβ2ＧＰＩドメイン１または化合物４４に曝露した。平衡結合値を、
各濃度について決定し、そしてプロットして、見かけの平衡解離定数を決定した
。結合等温線を、図１０および１１に示し（吸光係数＝１．８５；１００μｇ／
ｍｌの固定した抗体）、そして解離定数を表８に示す。
【０３０８】 これらの実験は、アフィニティー精製した抗リン脂質抗体が、β2−ＧＰＩの
ドメイン１に結合することを実証する。さらに、これらの実験は、プラットホー
ムに連結したドメイン１ β2ＧＰＩポリペプチドの四量体結合体もまた、四量
体中に存在するドメイン１のモル濃度以上である親和性でこれらの抗体に結合し
得ることを実証する。
【０３０９】
【表９】
【０３１０】 （実施例７；インビトロでの、競合的抗体結合についてのドメイン１β2ＧＰ
Ｉポリペプチド結合体の試験） Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍＬのβ 2 ＧＰＩを１００μＬ／ウェルでコートし、室温にて２時間インキュベートし、
そして２５０μｌ／ウェルの２％脱脂乳（０．４Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む）で室温にて２時間ブロックした。ＴＢＳ
での５回の洗浄後に、各ウェルに、１ウェルあたり、１：２００の最終希釈の血
漿（患者６５０１由来）、可変量の四量体ドメイン１結合体化合物４４および化
合物４５またはコントロールドメイン１単量体（すべて、０．４％Ｔｗｅｅｎ−
８０を含む２％脱脂粉乳中）を送達するように設計された、１時間未満前に調製
した溶液の１００μＬを添加した。室温での１時間のインキュベーションの後に
、プレートをＴＢＳで５回洗浄した。各ウェルに、１００μＬのアルカリホスフ
ァターゼ結合体化抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（Ｚｙｍｅｄ）（０．４％Ｔｗｅ
ｅｎ−８０を含む２％脱脂乳中の１：１０００希釈）を添加した。室温にて１時
間後に、このプレートをＴＢＳで５回洗浄した。各ウェルに、室温にて、発色の
ための１００μｌ ＰＰＭＰ発色性基質溶液を添加した。１ウェルあたりの光学
的吸光度を、市販のマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ ＥＬ３１１）中でＡ550nmで決定した。図１２に示す結果は、化合
物４４および４５の両方が、血清（患者６５０１）中に存在する抗リン脂質抗体
について効果的に競合することを示す。還元かつアルキル化されたドメイン１は
、そのような競合を示さず、そしてネガティブコントロールである。競合的結合
はまた、通常の単量体ドメイン１によって示され、そしてポジティブコントロー
ルとして含まれる。
【０３１１】 （実施例８：ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド結合体を試験するための、免
疫マウスモデル） ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対する寛容について試験するための免疫
モデルの要件は、以下である：（１）免疫は、ドメイン１を認識する抗体を産生
しなくてはならない、および（２）免疫は、ドメイン１を認識するＴ細胞を産生
してはならない。ドメイン１ポリペプチド−ＫＬＨ結合体での免疫は、ＫＬＨを
認識するが、ドメイン１に対する検出可能な反応性を認識しないＴ細胞を産生す
る。この目的のために、本発明者らは、昆虫細胞系においてカルボキシル末端に
て５番目のシステインを含むドメイン１β2ＧＰＩポリペプチド（配列番号１の
アミノ酸１〜アミノ酸６６）を作製した。この分子は、５番目のシステインを介
してＫＬＨに共有結合した。この結合体を使用して、マウスを免疫した。ドメイ
ン１−ＫＬＨ結合体での免疫は、ＫＬＨを認識するが、ドメイン１に対する検出
可能な反応性を認識しないＴ細胞を産生する。他方で、ドメイン１−ＫＬＨ結合
体での免疫は、ドメイン１特異的抗体の産生を生じる。
【０３１２】 （材料および方法） （抗ドメイン１抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ） ＮＵＮＣマイクロタイターウェルを、一晩、０．１Ｍ炭酸水素塩中（ｐＨ９．
５）５μｇ／ｍｌのβ2ＧＰＩを５０μｌ用いてコートした。このウェルを、Ｐ
ＢＳで洗浄し、次いで２％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で１時間ブロックした。このウ
ェルを洗浄し、そして個々のマウス血清の５０μｌの段階希釈液（２％ＮＦＤＭ
中）を添加し、室温にて１時間インキュベートし、洗浄し、そして５０μｌのア
ルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧを添加し、室温にて１時間インキ
ュベートし、洗浄し、そして５０μｌの基質を添加した。５５０ｎｍでのＯＤを
、３０分後に読み取った。プールを、５０μｇの結合体でプライムしたマウス由
来の血清から作製した。このプールを、すべてのアッセイにおいて試験した。こ
の結果をこの標準プールのパーセントとして示す。
【０３１３】 （競合阻害ＥＬＩＳＡ） ＮＵＮＣマイクロプレートを、０．１Ｍ炭酸水素塩中（ｐＨ９．５）５μｇ／
ｍｌの組換えβ2ＧＰＩを５０μｌ用いてコートし、４℃にて一晩インキュベー
トし、０．１５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、そして７５μｌのＰＢ
Ｓ中２％脱脂粉乳（２％ＮＦＤＭ）で、室温にて１時間ブロックした。試験イン
ヒビターを２％ＮＦＤＭ中に希釈し、そして２５μｌの各希釈液またはＮＦＤＭ
単独を、コートしたウェルに添加した。モノクローナル抗体を２％ＮＦＤＭ中に
希釈し、そして２５μｌの一定濃縮物をこのウェルに添加した。ウェルの内容物
を混合し、そしてこのプレートを室温にて１時間インキュベートした。プレート
をＰＢＳで３回洗浄した後、２％ＮＦＤＭ中に適切に希釈した５０μｌのアルカ
リホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）を添加し、そして３７
℃にて１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、５
０μｌのアルカリホスファターゼ発色性基質を添加し、そしてこのプレートを２
０℃にて３０分間インキュベートした。Ａ550を、マイクロプレートオートリー
ダーで測定した。％阻害を、以下のように決定した：［（インヒビターを含まな
いコントロールウェルから得た平均Ａ550−バックグラウンドのＡ550）−（イン
ヒビターの存在下で得られたＡ550−バックグラウンドのＡ550）／（インヒビタ
ーを含まないコントロールウェルから得た平均Ａ550−バックグラウンドのＡ550 ）］×１００。
【０３１４】 （抗ドメイン１抗体についての免疫マウスモデル） ５匹のＣ５７Ｂ１／６マウスの群を、ミョウバンに吸着された１０、５０また
は１００μｇのいずれかのＫＬＨ−ドメイン１結合体、およびアジュバントとし
ての２×１０9のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ生物でプライムした。３週間後に、すべて
のマウスに、生理食塩水中１０μｇの結合体を追加免疫した。追加免疫の７日後
に、マウスから採血し、血清を収集し、そして抗ドメイン１活性について試験し
た。結果を図１４に示す。ドメイン１−ＫＬＨでの免疫は、ドメイン１特異的抗
体応答を生じなかった。
【０３１５】 （マウス免疫およびＴ細胞増殖アッセイ） Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化した
２５μｇのドメイン１（Ｄ１）−ＫＬＨ結合体を後足蹠において注射した。別の
マウスの群に乳化ＣＦＡ（抗原なし）を、後足蹠において注射した。７日後、各
群の５匹のマウスから膝窩リンパ節を採取した。免疫化されたようなリンパ節を
プールし、そして単一細胞懸濁液を作製した。この細胞を、試験抗原がＤ１−Ｋ
ＬＨ、ＫＬＨおよびドメイン１（結合体化されていない）であることを除いて上
記のように、ヒト細胞について培養した。ＰＰＤを陽性コントロールとして使用
した。４日目に、２５μｌの１μＣｉ含有3Ｈ−チミジンを各ウェルに添加した
。５日目に、ウェルの内容物を採取し、そして各々の放射能の量を決定した。ウ
ェルのＣＰＭを陰性コントロールの平均ＣＰＭで割ることによって、刺激指数（
ＳＩ）を各ウェルについて算出した。それぞれ二連について平均（および標準偏
差）ＳＩを決定した。
【０３１６】 （結果および考察） ポリクローナルマウス抗ＫＬＨ−ドメイン１結合体の特異性を競合阻害ＥＬＩ
ＳＡアッセイにより決定した。β2ＧＰＩでコートされているウェル中で、β2Ｇ
ＰＩの種々の組換え形態を制限量の抗体と混合した。次いで、ウェルに結合した
ままの抗体の量を、アルカリホスファターゼ結合体化二次抗体を用いて検出した
。方法の節で記載されるように、阻害パーセントを決定し、インヒビターのμモ
ル濃度に対してプロットした。この結果を図１５に示す。同じ用量の結合体での
免疫は、ドメイン１に特異的な抗体応答を生じる（図１５）。
【０３１７】 Ｔ細胞増殖に関して、図１３に示される結果は、ドメイン１−ＫＬＨでプライ
ムされたマウス由来の細胞が、ドメイン１−ＫＬＨおよびＫＬＨの両方、ならび
に陽性コントロールＰＰＤに応答して増殖したことを実証している。それらは、
ドメイン１（結合体化されていない）に対して応答しなかった。一方、ＣＦＡの
みでプライムされたマウス由来の細胞は、試験抗原に対して応答しなかったが、
陽性コントロールＰＰＤに対して応答した。
【０３１８】 免疫マウスモデス（すなわち、プライミングが、所定の寛容原を認識するＴ細
胞をプライムしてはいけないが、その寛容原を認識する記憶Ｂ細胞を産生しなけ
ればならない）について、免疫化マウスモデルに関する２つの基本的な必要条件
の両方は、ここで示される免疫化マウスモデルにおいて達成されている。
【０３１９】 （実施例９：ドメイン１β2ＧＰＩポリぺプチドのインビボでの寛容原として
の試験） マウスを上記のように、アジュバントとしてミョウバンおよびｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓに対するキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化されたド
メイン１β2ＧＰＩポリペプチドでプライムする。３週間後、これらのマウスを
ある用量範囲の寛容原で処置する。この寛容原は、プラットホームに結合してい
てもよいし、または結合していなくてもよい。１つの群は処置せず、コントロー
ル群とする。５日後、コントロール群を含む全てのマウスを１０μｇの、ＫＬＨ
に結合体化したドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドでブーストし、そして７日後
これらのマウスから採血する。それらの血清を、任意の公知の方法（例えば、先
の実施例に記載されるようなＥＬＩＳＡを含む）により、抗β2ＧＰ２ドメイン
１抗体について分析する。次いでこれらの値を用いて全ての群の個体についての
平均および標準偏差を決定する。
【０３２０】 （実施例１０：Ｔ細胞反応の試験） ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに対するＴ細胞反応性の喪失の確立は、こ
のペプチドが寛容原として、Ｔ細胞からＢ細胞への第二のシグナルについてのエ
ピトープを全く供給しないことを示す。逆に、寛容原は、Ｔ細胞に増殖（活性化
）シグナルを提供した場合、寛容原はＢ細胞応答を悪化させることが可能である
。
【０３２１】 Ｔ細胞活性化を決定するために、循環するリンパ球を採取し、そして組織培養
物中に置く。試験されるドメイン１β2ＧＰＩポリぺプチドをこの培養物に、約
１週間添加する。この週の終わりに、Ｔ細胞を3Ｈ−チミジンでパルスし、細胞
増殖が起こっているか否かを決定する。必要に応じて、この組織培養上清中のサ
イトカインの存在もまた決定する。
【０３２２】 （実施例１１：抗β2−ＧＰＩ抗体は、第Ｖａ因子の不活化を遅延することに
よる凝固能亢進化に寄与する） （方法） アフィニティー精製した抗体、または抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）と診断され
た患者由来の全ＩｇＧ調製物の存在および非存在下での凝固の開始後に、活性化
第Ｖ因子（第Ｖａ因子）レベルを、正常なヒト血漿中で決定した。このアフィニ
ティー精製抗体は、抗β2−ＧＰＩドメイン１として特徴付けられた。以下に記
載のように、患者の血清から全ＩｇＧを調製した。
【０３２３】 第Ｖａ因子レベルの測定を、以下の通りに、Ａｍｅｌｕｎｇ ＫＣ４Ａ微小凝
固測定器（ｍｉｒｏｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）を用いて、改変した二段階凝固
アッセイにおいて決定した。５０μｌの第Ｖ因子欠損ヒト血漿（Ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｉｘ）を回転マイクロキュベット中で３７℃にて１分間プレインキュベート
した。サンプルを予め温めた（３７℃）Ｏｗｒｅｎ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇ
ｍａ）を用いて１：１０で希釈した。５０μｌの希釈したサンプルを、５０μｌ
のＶ欠損血漿に添加した。凝固を開始するために、１００μｌの３７℃のＴｈｒ
ｏｍｂｏＭＡＸおよびカルシウム（Ｓｉｇｍａ）を添加した。凝固時間を記録し
た。Ｖａ活性の１単位を、正常な参照ヒト血漿（Ａｃｃｕｃｌｏｔ、Ｓｉｇｍａ
）の１：１０希釈物を用いるＶ欠損血漿の凝固時間として規定する。この実験系
における第Ｖａ因子活性の１単位は、約３０秒の凝固時間に対応する。
【０３２４】 抗リン脂質抗体またはＩｇＧの存在または非存在下で経時的に産生される第Ｖ
ａ因子の量を決定するために、以下の系を用いて、上記の標準的アッセイで試験
するサンプルを生成した。以下の試薬を混合して、そして３７℃でインキュベー
トした：一部の正常ヒト参照血漿（Ａｃｃｕｃｌｏｔ、Ｓｉｇｍａ）、一部の２
５ｍＭ ＣａＣｌ2、ならびにホスファチジルセリン試薬（１２５μｇ／ｍｌ）
およびＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）および抗体またはＩｇＧ（所望の濃
度で適用可能である場合）からなるものの一部。ＴＢＳを使用して抗体またはＩ
ｇＧの容量を変化させて補正した。正常な血漿、ホスファチジルセリン、抗体ま
たはＩｇＧ（もしあれば）、およびＴＢＳを混合して、そして３７℃にて２分間
インキュベートし、その後、３７℃のＣａＣｌ2を添加して凝固を開始し、そし
てその凝塊をそれが形成されたときに手動で除去した。サンプル混合物の全量は
、アッセイする時点の数に依存する。各時点において、１２．５μｌのインキュ
ベーションサンプルを取り出し、Ｏｗｒｅｎ’ｓ緩衝液で１：１０で希釈し、そ
して上記の標準第Ｖａ因子アッセイにおいてアッセイする。経時的にサンプル中
で産生されるＶａのレベルを、第Ｖ因子欠損血漿の凝固時間の補正に反映する。
Ｖａレベルのピークは、凝固開始４〜５分後に生じ、そしてそのレベルは、第Ｖ
ａ因子活性の４〜７単位の範囲である。これは、この実験系についての標準的ア
ッセイにおいて約５〜６秒の凝固時間に対応する。
【０３２５】 ＡＰＳ患者のＩｇＧをこのアッセイに添加した場合、全ＩｇＧを、ヒト血清サ
ンプルから、１００μｌ血清（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＩｇＧ結
合緩衝液で１：１に希釈される）を１００μｌのアガロース固定化プロテインＧ
ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｐｌｕｓ）と結合することによ
って調製した。
【０３２６】 この混合物を周囲温度で１０分間ゆっくりと振盪した。プロテインＧは、ヒト
免疫グロブリンＧの、全てのサブクラスのＦｃ領域を結合する。１０分後、この
混合物を短時間遠心分離してビーズをペレット化した。血清混合物上清を廃棄し
た。
【０３２７】 次いで、ＩｇＧが結合したビーズを、２００μｌのＩｇＧ結合緩衝液で３回洗
浄し、吸着したタンパク質を除去した。次いで結合したＩｇＧを、１００μｌの
ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＩｇＧ溶出緩衝液）
で３回、プロテインＧビーズから溶出した。溶出したＩｇＧを、１００μｌの１
Ｍ ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５ですぐに中和し、１００μｌ血漿サンプルから最終
総用量４００μｌのＩｇＧ調製物を得た。中和したＩｇＧ調製物は分析まで４℃
で保存した。
【０３２８】 ＩｇＧ調製物のタンパク質濃度を標準的マイクロプレートＢｒａｄｆｏｒｄ方
法（Ｂｉｏ−Ｒａｄの試薬）により決定した。各プレートにおけるウシ血清アル
ブミンの標準曲線を用いて、各サンプルの５μｌを三連でアッセイした。タンパ
ク質濃度をＫＣ４ソフトウェアにより算出した。
【０３２９】 第Ｖａ因子凝固アッセイにおける分析について、１００μｌのＩｇＧ調製物を
、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ、３０，０００
の分子量カットオフ）で、２５μｌに濃縮した。２５μｌ全部を、単時点の第Ｖ
ａ因子アッセイに使用する。
【０３３０】 （結果） 抗リン脂質患者からの全ＩｇＧの効果および正常なコントロールからのアフィ
ニティー精製抗体の効果を、インビトロ凝固アッセイにおいて、それらの第Ｖａ
因子不活化を遅らせる能力について比較した。全ＩｇＧおよびアフィニティー精
製抗体についての結果を、表９および図１６にそれぞれ示す。正常なコントロー
ル被験体由来のＩｇＧおよびアフィニティー精製抗体は、凝固開始２０分後に観
察された第Ｖａ因子の不活化を変化させなかった。対照的に、抗リン脂質患者由
来のＩｇＧ画分は、第Ｖａ因子の不活化を遅延した（ｐ＜０．０５、スチューデ
ントｔ検定による）。第Ｖａ因子不活化に対する同様の効果が、アフィニティー
精製抗体について観察された。これらのデータは、ヒト抗ｂ２−ＧＰＩ抗体が、
第Ｖａ因子の不活化を遅延することによって、一部で凝固能亢進性状態が生じ得
ることを示唆する。
【０３３１】
【表１０】
【０３３２】
【０３３３】 前述の発明は、理解を明らかにする目的のために説明および実施例により、い
くらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変がなされることは当業者
に明白である。従って、この説明および実施例は、本発明の範囲を限定するよう
に解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲により示される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、β2ＧＰＩのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（
配列番号２）を示す。線の上の番号は、アミノ酸位置を示す。
【図２】 図２は、β2ＧＰＩのドメイン１のヌクレオチド配列（配列番号３）およびア
ミノ酸配列（配列番号４）を示す。線の上の番号は、アミノ酸位置を示す。
【図３】 図３は、β2ＧＰＩのドメイン１の三次構造のモデルであり、これはβ2ＧＰＩ
依存性抗リン脂質抗体への結合の際に重要となるアミノ酸を含む。
【図４】 図４は、ＮＵＮＣマイクロタイタープレート上で実行された競合阻害ＥＬＩＳ
Ａの結果を示すグラフである。プレートを、野生型β2ＧＰＩでコートした。抗
体（患者７１０４由来）結合を、種々の変異体β2ＧＰＩタンパク質で競合させ
た。記号は、以下のように組換えβ2ＧＰＩタンパク質を表す：
【化２８】 組換えタンパク質の表記：ダッシュは、ドメインを欠くことを示し；番号は、こ
のタンパク質に存在するドメインを示す。例えば、「−３４５」は、ドメイン１
および２を欠くが、ドメイン３、４、および５を保持する組換えβ2ＧＰＩタン
パク質である。
【図５】 図５は、種々の組換えヒトβ2ＧＰＩタンパク質へのウサギ抗β2ＧＰＩの結合
のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。ニッケルキレートコートされたマ
イクロタイターウェルを、種々の組換えβ2ＧＰＩタンパク質で、示される濃度
でコートし、次いで、ウサギ抗β2ＧＰＩ抗体の結合する能力について試験した
。記号は、以下のように組換えβ2ＧＰＩタンパク質を表す：
【化２９】
【図６】 図６は、種々の組換えヒトβ2ＧＰＩタンパク質への抗β2ＧＰＩの結合のＥＬ
ＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。ニッケルキレートコートされたマイクロ
タイターウェルを、種々の組換えβ2ＧＰＩタンパク質で、示される濃度でコー
トし、次いで、ヒト抗β2ＧＰＩ抗体６７０１（患者６７０１由来）の結合する
能力について試験した。組換えβ2ＧＰＩについての記号は、図５におけるもの
と同じである。さらなる記号は
【化３０】 である。
【図７】 図７は、カルジオリピン（ＣＬ）コートしたマイクロタイターウェルに最初に
結合した種々の組換えヒトβ2ＧＰＩタンパク質に結合する、ウサギ抗β2ＧＰＩ
抗体の能力を測定したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ＩＭＭＵＬＯＮ（
登録商標）プレートをＣＬでコートし、次いで、示された濃度の組換えβ2ＧＰ
Ｉタンパク質で満たした。組換えβ2ＧＰＩについての記号は、図５におけるも
のと同じである。
【図８】 図８は、ＣＬコートしたマイクロタイターウェルに最初に結合した種々の組換
えヒトβ2ＧＰＩタンパク質に結合する、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体調製物
６６４１（患者６６４１に由来）の能力を測定したＥＬＩＳＡの結果を示すグラ
フである。ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）プレートをＣＬでコートし、次いで、示
された濃度の組換えβ2ＧＰＩタンパク質で満たした。組換えβ2ＧＰＩについて
の記号は、図６におけるものと同じである。
【図９】 図９は、種々のペプチドが、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体への結合から野
生型β2ＧＰＩと競合するそれらの能力について試験された、競合阻害ＥＬＩＳ
Ａの結果を示すグラフである。ペプチドについての記号は、以下である：
【化３１】
【図１０】 図１０Ａおよび図１０Ｂは、種々の濃度のドメイン１ポリペプチド（図１０Ａ
）およびテトラマー性結合体化合物４４（図１０Ｂ）についての、患者６６２６
由来のアフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体への見かけの平
衡結合値を示すグラフである。見かけの平衡解離定数もまた示す。
【図１１】 図１１Ａおよび図１１Ｂは、種々の濃度のドメイン１ポリペプチド（図１１Ａ
）およびテトラマー性結合体化合物４４（図１１Ｂ）についての、患者６７０１
由来のアフィニティー精製したβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体への見かけの平
衡結合値を示すグラフである。
【図１２】 図１２は、β2ＧＰＩ（ＮＵＮＣマイクロタイタープレート上にコートされる
）が患者６５０１由来の血漿、および種々の量のテトラマードメイン（−白菱形
−）１結合体化合物４４（−黒逆三角−）、および化合物４５（−＊−）、なら
びにβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド（−黒菱形−）および、還元されアルキ
ル化されたβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド（−黒四角−）と反応した、競合
結合実験の結果を示すグラフである。
【図１３】 図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＣＦＡ中のβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド−
ＫＨＬ結合体（図１３Ａ）またはＣＦＡ単独（図１３Ｂ）で免疫したマウス由来
の膝窩のリンパ節細胞の用量応答を示すグラフである。記号は以下である：−白
四角−、ＫＬＨ結合体；−黒逆三角−、ＫＬＨと結合体化されていないβ2ＧＰ
Ｉドメイン１ポリペプチド；−黒四角−、ＫＬＨ；白三角、ＰＰＤ。
【図１４】 図１４は、β2ＧＰＩドメイン１ポリペプチド−ＫＬＨ結合体でプライムする
ことの用量応答（抗β2ＧＰＩ抗体による）（１０μｇ、５０μｇ、および１０
０μｇ）を示す棒グラフである。
【図１５】 図１５は、種々のβ2ＧＰＩドメイン変異体（
【化３２】 ）を使用する競合アッセイによって決定されるような、β2ＧＰＩドメイン１ポ
リペプチド−ＫＬＨ結合体に対して惹起されたマウスポリクローナル抗体の特異
性を示すグラフである。
【図１６】 図１６は、種々の患者（６５０１、６６３６、６６４４、７０１１、７０１３
、６７０１、７００１、６６２５、６６４１）由来の血液中の第Ｖａ因子活性、
ならびに正常血漿およびＩｇＧに対する、アフィニティー精製されたβ2ＧＰＩ
依存性抗リン脂質抗体の効果を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 19/00 14/775 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/68 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０９／３２８，１９９ (32)優先日 平成11年６月８日(1999．6．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 アイバーソン， ギルバート エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014， デル マー， ボキータ， ドライブ 13784 (72)発明者 ビクトリア， エドワード ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92104， サン ディエゴ， パーシング アベニ ュー 3503 (72)発明者 ジョーンズ， デイビッド エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92127， サン ディエゴ， フロリンド ロード 11265 (72)発明者 リニック マシュー ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130， サン ディエゴ， トーリー ブラフ ドライブ ナンバー38 12604

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドを含むポリペプチドであ
    って、ここで、該ポリペプチドがβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結
    合し、そしてここで、該ポリペプチドが、配列番号２（図１）；β2ＧＰＩのド
    メイン１、２、および３；ならびにβ2ＧＰＩのドメイン１、２、３、および４
    のポリペプチドからなる群からならない、ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 前記ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが配列番号４（図２
    ）のポリペプチドからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 前記ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが配列番号５〜１２
    からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが配列番号１のほぼ
    アミノ酸１〜ほぼアミノ酸６６を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 前記ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが配列番号４のほぼ
    アミノ酸１〜ほぼアミノ酸５９を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のポリペプチドを含む、重合体ポリペプチド
    。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチドがＴ細胞エピトープを欠失し、該Ｔ細胞エ
    ピトープがβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体においてＴ細胞を活性
    化し得る、請求項１に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のポリペプチドの結合体。
  10. 【請求項１０】 前記結合体が標識を含む、請求項９に記載の結合体。
  11. 【請求項１１】 前記結合体が結合価プラットホーム分子を含む、請求項９
    に記載の結合体。
  12. 【請求項１２】 前記プラットホーム分子がタンパク質である、請求項１１
    に記載の結合体。
  13. 【請求項１３】 前記プラットホーム分子がタンパク質ではない、請求項１
    １に記載の結合体。
  14. 【請求項１４】 前記結合価プラットホーム分子の集団の分子量が均一であ
    る、請求項１１に記載の結合体。
  15. 【請求項１５】 前記プラットホーム分子が、チオエーテル結合によってポ
    リペプチドに結合される、請求項１１に記載の結合体。
  16. 【請求項１６】 前記プラットホーム分子が、オキシム結合によってポリペ
    プチドに結合される、請求項１１に記載の結合体。
  17. 【請求項１７】 前記プラットホーム分子が、 【化１】 である、請求項１１に記載の結合体。
  18. 【請求項１８】 前記プラットホーム分子が、 【化２】 である、請求項１１に記載の結合体。
  19. 【請求項１９】 前記結合体が、 【化３】 であって、ここで、Ｄ１がβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドである、請求項１
    １に記載の結合体。
  20. 【請求項２０】 前記結合体が、 【化４】 であって、ここで、Ｄ１がβ2ＧＰＩドメイン１ポリペプチドである、請求項１
    １に記載の結合体。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、天然に存在
    する単離されたポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、天然に存在
    しないポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 請求項８に記載のポリペプチドをコードする、天然に存在
    する単離されたポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 請求項８に記載のポリペプチドをコードする、天然に存在
    しないポリヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクタ
    ー。
  26. 【請求項２６】 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む、クローニン
    グベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換さ
    れた、宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドの模倣物であって、こ
    こで、該模倣物が、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドが特異的に結合するβ2Ｇ
    ＰＩ依存性抗リン脂質抗体に特異的に結合する、模倣物。
  29. 【請求項２９】 ポリペプチドである、請求項２８に記載の模倣物。
  30. 【請求項３０】 Ｔ細胞エピトープを欠失し、該Ｔ細胞エピトープがβ2Ｇ
    ＰＩ依存性抗リン脂質抗体を有する個体においてＴ細胞を活性化し得る、請求項
    ２９に記載の模倣物。
  31. 【請求項３１】 適切なパッケージングにおいて請求項１に記載のポリペプ
    チドを含む、ドメイン１β2ＧＰＩポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出
    するための、キット。
  32. 【請求項３２】 適切なパッケージングにおいて請求項１に記載のポリペプ
    チドを含む、凝固を検出するための、キット。
  33. 【請求項３３】 請求項８に記載のポリペプチドの有効量を含む組成物であ
    って、ここで、有効量が寛容を誘導するために十分な量である、組成物。
  34. 【請求項３４】 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項３３に記
    載の組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項１に記載のポリペプチドの有効量を含む組成物であ
    って、ここで、有効量がβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体を検出するために十分
    な量である、組成物。
  36. 【請求項３６】 サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結
    合する抗体を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）安定な抗原−抗
    体複合体の形成を許容する条件下で、該サンプル中の抗体を請求項１に記載のポ
    リペプチドと接触させる工程；および（ｂ）もしあれば、工程（ａ）において形
    成される安定な複合体を検出する工程、を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 前記抗体がβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体である、請求
    項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 安定な抗原−抗体複合体の形成を許容する条件下で、生物
    学的サンプルを請求項１に記載のポリペプチドと接触させる工程、およびもしあ
    れば、該形成された複合体を得る工程を包含する、β2ＧＰＩ依存性抗リン脂質
    抗体を精製する、方法。
  39. 【請求項３９】 請求項８に記載のポリペプチドを含む組成物の有効量を個
    体に投与する工程を包含する、該個体において寛容を誘導する、方法。
  40. 【請求項４０】 前記個体がヒトである、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 請求項１１に記載の結合体を含む組成物の有効量を個体に
    投与する工程を包含する、該個体において寛容を誘導する、方法。
  42. 【請求項４２】 前記個体がヒトである、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ポリペプチドが、配列番号４のほぼアミノ酸１〜ほぼ
    アミノ酸６０の配列からなる、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 凝固のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体媒介を検出するた
    めの方法であって、以下の工程： （ａ）個体由来の適切な生物学的サンプルを使用して第１の凝固アッセイを実
    施する工程であって、ここで、請求項１に記載のポリペプチドが該アッセイに添
    加される、工程； （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの非存在下において該個体由来の適切な
    生物学的サンプルを使用して第２の凝固アッセイを実施する工程； （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の該アッセイ結果を比較する工程であって、こ
    こで、該結果における差異が、凝固のβ2ＧＰＩ依存性抗リン脂質抗体媒介を示
    す、工程、 を包含する、方法。
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