JP2007535468A

JP2007535468A - タンパク質結合性のドキソルビシン−ペプチド−誘導体

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Publication number: JP2007535468A
Application number: JP2006504538A
Authority: JP
Inventors: クラッツフェリックス
Original assignee: KTB Tumorforschungs GmbH
Current assignee: KTB Tumorforschungs GmbH
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2024-03-04
Also published as: DE502004011395D1; WO2004078781A1; US20060173161A1; EP1601686B1; DE10310082A1; US7803903B2; ATE473996T1; EP1601686A1; JP4617296B2

Abstract

本発明はタンパク質結合性の基を有し、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９で切断可能なペプチド配列を有する低分子ドキソルビシン−ペプチド−誘導体に関する。

Description

本発明は、マトリックス−メタロプロテイナーゼ２または９により切断可能である、タンパク質結合性のドキソルビシン−ペプチド−誘導体、その製法および使用に関する。

ドキソルビシンを用いて悪性腫瘍疾患を化学療法で治療することは、この作用物質の狭い治療範囲のために副作用と結びついている（Dorr RT, Von Hoff DD,“Cancer Chemotherapy Handbook”第２改訂版、Appleton and Lange, Norwalk, 1994）。従って、効果的な治療のために、この細胞増殖抑制剤の全身性の毒性を減少させることおよび同時に薬理学的な能力を上昇させることが望まれている。一定のプロドラッグを用いて、一方で結合した作用物質を罹患した組織中に、これを標的として搬送することが、他方では標的部位で作用物質を効果的にかつ出来るだけ特異的に遊離させることが、悪性腫瘍組織の生化学的または生理学的な特別性により達成できることは公知である。副作用プロフィールおよび細胞増殖抑制剤の効果の改善のための始めとしては、インビボで内因性の血清タンパク質、特にアルブミンに結合し、かつこのようにして作用物質のマクロ分子搬送型を形成する、タンパク質結合性のものを開発することにある（Kratz,F等, J.Med.Chem.2000, 43, 1253-1256）。

更に、マトリックス−メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、特にＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９、が悪性の腫瘍の進行において重要なプロテアーゼであるとして同定された（Stetler-Stevenson, W.G.等, Annu.Rev.Cell Biol.1993,9,541-573）。

本発明の課題は、ドキソルビシンの治療範囲を拡大するために、静脈内適用の後、循環するアルブミンに共有結合し、ＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９により腫瘍組織中で切断される、この作用物質の誘導体を獲得することである。この課題は、一般式Ｉ：

Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
Ｐ_５−Ｐ′_５は必須アミノ酸２０個の１０個までからなるペプチド配列を表し、かつＰＭはタンパク質結合性の基である。

本発明による化合物は、ドキソルビシン、ペプチド−スペーサーおよびタンパク質結合性の基ＰＭを含有するヘテロ二官能性架橋剤から構成されている。以下に、この構造をより詳細に説明する：
ヘテロ二官能性架橋剤は、一般式ＩＩ

［式中、
Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
ＰＭ＝タンパク質結合性の基を表す］のタンパク質結合性の基を有するカルボン酸−誘導体である。

ｍ＜２およびｎ＝２〜５を有するヘテロ二官能性架橋剤を使用するのが有利である。オキシエチレン−単位は水溶性を高めること、特にｎの大きな値において水溶性を高めることを達成する。

タンパク質結合性の基（ＰＭ）は有利に、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセタミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基、モノアルキルマレアミン酸アミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基、アジリジン基またはマレインイミド基から選択されている。特に有利なタンパク質結合性の基はマレインイミド基である。

ペプチドスペーサーは、ＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９により切断可能である、必須アミノ酸２０個の１０個までからなるペプチド配列Ｐ_５−Ｐ′_５である。有利なペプチドスペーサーはアミノ酸８個からなる。特に有利な配列は次のペプチドである：

このペプチドはＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９によりＰ_１−Ｐ′_１−結合で酵素的に切断される。

最も有利であるのは、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎである。

本発明によるドキソルビシン−ペプチド−誘導体の製造は、有利にドキソルビシンと一般式ＩＩＩ：

［式中、
Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
Ｐ_５−Ｐ′_５は必須アミノ酸２０個の１０個までからなるペプチド配列を表し、かつＰＭはタンパク質結合性の基を表す］のペプチド誘導体とを、ペプチド−誘導体の活性化したカルボキシル基とドキソルビシンのダウノサミン環のアミノ基とを縮合させることにより、反応させることにより実施する。

ペプチド−誘導体のＣ−末端の活性化のための試薬としては、有利にＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェートまたは２−クロロ−１−メチル−ピリジニウムヨージドを、慣用の触媒もしくは補助塩基、例えばトリアルキルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の添加下に使用する。この反応を有利に極性溶剤、例えばＤＭＦ、ＤＭＡもしくはＤＭＳＯ中で、温度−２０℃〜４０℃、有利に０℃〜５℃で実施し、その際反応時間は通常１〜１２０時間であり、有利には２４〜９６時間である。生成物単離は通常の方法、例えば結晶化、シリカゲルでのクロマトグラフィーまたはクロマトグラフィーで実施する。

ペプチド−誘導体の製造は、有利に一般式ＩＩのヘテロ二官能性架橋剤の活性化カルボキシル基とペプチド配列Ｐ_５−Ｐ′_５のＮ末端との反応により実施するのが有利である。その際、架橋剤のカルボキシル基を活性化するための試薬としては、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェートまたは２−クロロ−１−メチル−ピリジニウムヨージドを、慣用の触媒もしくは補助塩基、例えばトリアルキルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の添加下に使用するのが有利である。反応は有利に固相で、かつ生成物単離は一般に逆相クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）により、当業者に慣用の方法により実施する。

本発明によるタンパク質結合性のドキソルビシン−ペプチド−誘導体は、腸管外、有利に静脈内投与する。このためには、本発明によるドキソルビシン−ペプチド−誘導体を溶液、固体物質または凍結乾燥物質として、場合により通常の助剤を使用して調製することができる。そのような助剤は例えばポリソルベート、グルコース、ラクトース、マンニトール、サッカロース、デキストラン、クエン酸、トロメタモール、トリエタノールアミン、アミノ酢酸、および／または合成ポリマーである。本発明によるドキソルビシン−ペプチド−誘導体をｐＨ−範囲２．０〜８．０、有利にｐＨ−範囲５．０〜７．０の等張緩衝液中に溶かし、適用するのが有利である。一般に、本発明によるドキソルビシン−ペプチド−誘導体は、架橋剤中のオキシエチレン単位および／またはペプチド配列中への極性アミノ酸、例えばアルギニン、プロリン、グルタミンおよび／またはグルタミン酸の組み込みにより、十分な水溶性を有する。ドキソルビシン−ペプチド−誘導体の溶解性は、場合により医薬溶剤、例えば１，２−プロパンジオール、エタノール、イソプロパノール、グリセリンおよび／または分子量２００〜６００ｇ／モルを有するポリ（エチレングリコール）、有利には分子量６００ｇ／モルを有するポリ（エチレングリコール）および／または溶解助剤、例えばツウィーン８０、クレモホル（Cremophor）またはポリビニルピロリドンにより改善することができる。

本発明によるドキソルビシン−ペプチド−誘導体の本質的な特徴は、タンパク質結合性の基を介しての血清タンパク質への迅速な共有結合にあり、このことにより作用物質のマクロ分子搬送型が生成される。血清タンパク質、例えばトランスフェリンまたはアルブミンに関しては、腫瘍組織中への上昇した取り込みが公知である（Kratz F.; Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281-299）、こうしてこれは本発明の範囲において細胞増殖抑制剤のための内生キャリヤーとして考慮することができる。特に有利な血清タンパク質は循環性の人血清アルブミン（ＨＳＡ）であり、これは平均濃度３０〜５０ｇ／ｌで、人血液の主要タンパク質成分を形成し（Peters T. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245）、かつタンパク質の表面に遊離のシステイン基（システイン−３４−基）を有し、これはマレインイミドまたはジスルフィドのようなチオール形成基の結合のために好適である（ＷＯ００／７６５５１）。ドキソルビシン−ペプチド−誘導体と血清タンパク質との反応は、生体外でも実施することができ、例えば注入のために予定されているアルブミン、血液量または血清量と反応させることができる。

タンパク質結合したドキソルビシン−ペプチド−誘導体はドキソルビシンに対して変化した生体分布を示し、こうしてそのマクロ分子の特性により腫瘍組織中に富化する。そこで行われるＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９による切断により、低分子のドキソルビシンペプチドが切断され、これが腫瘍組織中で活性成分としてのドキソルビシンを遊離する。驚くべきことには、動物実験においても、タンパク質結合性のドキソルビシン−ペプチド−誘導体が臨床的にスタンダードであるドキソルビシンより高い効果を示した（例１参照）。

実施例
次の実施例は図面と共に本発明をより詳細に説明する。図面中には以下のものが図示されている：
図１は例１の生成物の構造式を示す；
図２は図１の化合物とヒト血漿とのインキュベーションによる生成物のクロマトグラムを示す；
図３は図１の化合物のアルブミン結合型のＭＭＰ−２による切断バッチのクロマトグラムを示す；
図４は切断したドキソルビシンテトラペプチドとＡ３７５−メラノーマ−組織ホモジネートとのインキュベーションバッチのクロマトグラムを示す；
図５は一方ではドキソルビシンでの、他方では図１の化合物でのＡ３７５メラノーマの腫瘍成長のグラフ図を示す。

例１
１の合成（図１参照）：ドキソルビシン−塩酸塩１７５．０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｍａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｍａｌ＝マレインイミドトリエチレングリコール酸）２９８．５ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物４０．５ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン９８．９５μｌ（９１．０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を無水のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌ中で＋５℃で１５分間撹拌した。Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド１３９．３６μｌ（１１３．６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加し、このバッチを＋５℃で７２時間撹拌した。引き続き、この溶剤を高真空（Hochvakuum）下に除去し、残分を最少量のクロロホルム／メタノール４：１中に溶かし、かつシリカゲル６０（Merck,Darmstadt）でのクロロホルム／メタノール４：１を用いるカラムクロマトグラフィーを２回実施することにより、生成物を精製した。得られたフラクションから１を過剰のジエチルエーテルを添加することにより沈殿させ、濾別し、ジエチルエーテル２０ｍｌ×２で洗浄し、新たに遠心分離した。高真空中で乾燥した後に、赤色粉末として１が２５０ｍｇ得られた。質量（MALDI-TOF,Mr1520.7）：ｍ／ｚ１５４３［Ｍ＋Ｎａ］^＋、ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９８％。

１は水溶性で、かつアルブミン結合性の成分としてマレインイミドトリエチレングリコール酸を含有する。１は数分間のうちに選択的に血漿中の内生アルブミンのシステイン−３４−位に結合する（図２参照）。

図２は１とヒト血漿との３７℃でのインキュベーション検査の２分間および５分間後のクロマトグラムを示す。濃度１＝５９μＭ。ＨＰＬＣ：Biorad社、MuenchenのBioLogic Duo-Flow System;Bischoff社のLambda 1000モニター（Λ＝４９５ｎｍ）およびMerck F-1050蛍光分光光度計（EX.４９０ｎｍ、EM.５４０ｎｍ）；２８０ｎｍでのＵＶ検出；カラム：水、３００Å、前カラムを有するシンメトリーＣ１８［４．６×２５０ｍｍ］；流量：１．２ｍｌ／分、可動相Ａ：ＣＨ_３ＣＮ２７．５％、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）７２．５％、可動相Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ、傾斜：０〜２５分、可動相Ａ１００％；２５〜４０分で、ＣＨ_３ＣＮ７０％、２０ｍＭリン酸カリウム３０％に；４０〜５０分ＣＨ_３ＣＮ７０％、２０ｍＭリン酸カリウム３０％；５０〜６０分、可動相Ａ１００％；注入体積：５０μｌ。

クロマトグラムは、インキュベーション２分間の後、すでに１の著しい量がアルブミンに結合して存在していることを示し；５分後に１の全量がアルブミンに結合していることを示す。

例２
１のアルブミン結合型を活性化したＭＭＰ−２２ｍＵと３７℃で、２倍過剰量のＴｉＭＰ−２（ＭＭＰ−２の阻害剤）の不存在または存在下にインキュベートした。次いで、切断バッチのＨＰＬＣを図２で記載したような条件下に実施した。アントラサイクリンの濃度は１００μｍであった。このクロマトグラムを図３に示す。同様な結果は、ＭＭＰ−２の代わりにＭＭＰ−９を使用した際にも達せられた（Calbiochem FRGのＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）。ＴＩＭＰ−２なしで、ＭＭＰ−２を用いたバッチのクロマトグラムは、１．５時間後に１のアルブミン複合体から完全に基Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＤＯＸＯが切断された。ＴＩＭＰ−２によるＭＭＰ−２の抑制においては、非常に僅かな切断のみが行われ、かつ１のアルブミン複合体はほぼ完全に保持される。

例３
例２において記載されたように得られた切断ドキソルビシンテトラペプチド（Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＤＯＸＯ）を用いて、Ａ３７５−メラノーマ−組織ホモジネートとインキュベーション検査を実施した。このインキュベーションは３７℃で実施した。アントラサイクリンの濃度は１００μｍであった。２分間、３０分間および３時間の後、それぞれＨＰＬＣ−クロマトグラフィーを図２の条件下に実施した。この実験に使用したメラノーマ−組織ホモジネートは、１ｍＭモノチオグリセロールを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣＬ−緩衝液ｐＨ７．４中で、Ａ３７５異種移植片−腫瘍を用いて製造した。図４は得られた結果を示す。

例４
皮下に成長するＡ３７５メラノーマ異種移植片の腫瘍成長を図５中に示す。ここでは、ドキソルビシンおよび１［投与量（静脈内）；ドキソルビシン（＝ｄｏｘｏ）：２×１３．３μｍｏｌ／ｋｇ＝２×８ｍｇ／ｋｇドキソルビシン］で８日目および１５日目；１：２×１３．３μｍｏｌ／ｋｇ（＝２×８ｍｇ／ｋｇドキソルビシン−当量）で８日目および１５日目、３×３９．９μｍｏｌ／ｋｇ（＝３×２４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）で８日目、１５日目、２２日目に処置した。この図は記載した時間に関する相対腫瘍体積である。動物：ヌードマウス；ドキソルビシンの原溶液（２ｍｇ／ｍｌ）；１の原溶液：１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース（ｐＨ６．４）中の６ｍｇ／ｍｌ、対照液（緩衝液）：グルコース−リン酸塩緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース−ｐＨ６．４）８日目および１５日目。

図５中の曲線は、ドキソルビシンに比較して、本発明によるドキソルビシン誘導体が著しく優れていることを明らかに示している。その際、ドキソルビシンは、本発明による誘導体での処置に比較して約３倍の大きさの腫瘍体積を示す。このことは、本発明による誘導体により、驚くべき改善された効果が達せられることを示す。

例１の生成物の構造式を示す図である図１の化合物とヒト血漿とのインキュベーションによる生成物のクロマトグラム図である図１の化合物のアルブミン結合型のＭＭＰ−２による切断バッチのクロマトグラム図である切断したドキソルビシンテトラペプチドとＡ３７５−メラノーマ−組織ホモジネートとのインキュベーションバッチのクロマトグラム図であるドキソルビシンおよび図１の化合物を用いた、Ａ３７５メラノーマの腫瘍成長のグラフ図を示す

Claims

一般式Ｉ：

［式中、
Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
Ｐ_５−Ｐ′_５はマトリックス−メタロプロテイナーゼ２または９（ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９）により切断可能な、必須アミノ酸２０個の１０個までからなるペプチド配列を表し、かつＰＭはタンパク質結合性の基であり、かつ

］のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ＰＭが置換されているかまたは非置換のマレインイミド基、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセタミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基、モノアルキルマレアミン酸アミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基またはアジリジン基から選択されている、請求項１記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ＰＭが置換されているかまたは非置換のマレインイミド基である、請求項２記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ｍ＜２およびｎ＝１〜５である、請求項１から３までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
Ｙ＝Ｏである、請求項１から４までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ペプチド配列Ｐ_５−Ｐ′_５はアミノ酸８個を包含する、請求項１から５までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ペプチド配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＧｌｎまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎである、請求項６記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
ペプチド配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎである、請求項６記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体。
請求項１から８までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体の製法において、カルボン酸−活性化剤の存在で、一般式ＩＩ

［式中、
Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
Ｐ_５−Ｐ′_５は必須アミノ酸２０個の１０個までからなるペプチド配列を表し、かつＰＭはタンパク質結合性の基を表す］のペプチド誘導体と反応させることを特徴とする、ドキソルビシン−ペプチド−誘導体の製法。
ＰＭがマレインイミド基である、請求項９記載の製法。
カルボン酸−活性化剤の存在でペプチド配列Ｐ_５−Ｐ′_５と一般式ＩＩＩ

［式中、
Ｙ＝ＯまたはＳ
ｎ＝０〜５
ｍ＝０〜６
ＰＭ＝タンパク質結合性の基を表す］のヘテロ二官能性架橋剤とを反応させることにより一般式ＩＩのペプチド−誘導体を得る、請求項９または１０記載の製法。
カルボン酸活性化剤がＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミドまたは（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート、有利にＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミドから選択される、請求項９から１１までのいずれか１項記載の製法。
請求項１から８までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体を、作用物質として、場合により常用の製薬助剤および／または溶剤と共に含有することを特徴とする薬剤。
ガン疾患を治療するための請求項１から８までのいずれか１項記載のドキソルビシン−ペプチド−誘導体の使用。
ガン疾患の治療のための薬剤を製造する方法において、請求項１から８までのいずれか１項記載の化合物を治療に使用可能な溶液にすることを特徴とする、ガン疾患の治療用薬剤の製法。