KR20000016414A

KR20000016414A - Apl 면역반응성 펩티드, 그것의 콘주게이트 및 apl항체-매개병변의 치료방법

Info

Publication number: KR20000016414A
Application number: KR1019980709997A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 제스 빅토리아; 데이비드 매튜 마르퀴스; 데이비드 에스. 존즈; 린 유
Original assignee: 와이즈먼 앤드루; 라 졸라 파마슈티칼 컴파니
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2000-03-25
Also published as: NO985636D0; CA2256449A1; JP2000512981A; NO985636L; WO1997046251A1; EP0954531A1; AU734638B2; EP0954531A4; AU3640497A

Abstract

aPL 에피토프가 결합하는 B세포에 특이적으로 결합하는 aPL 유사체가 개시되어 있다. T세포 에피토프가 결핍된 최적화된 유사체는 aPL 항체-매개 질환을 치료하기 위한 콘주게이트로서 유용하다. 상기 유사체를 제조 및 확인하는 방법, 상기 유사체를 사용하여 치료하는 방법, 상기 유사체의 콘주게이트를 제조하기 위한 방법 및 조성물, 그리고 aPL 항체에 대한 진단면역분석법이 개시되어 있다.

Description

ａＰＬ 면역반응성 펩티드, 그것의 콘주게이트 및 ａＰＬ항체-매개병변의 치료방법

상호-관련 출원

본 출원은 1996년 6월 6일 출원된 미국일련번호 08/660,092의 일부 계속 출원이고, 이것은 1995년 6월 7일 출원된 미국일련번호 08/482,651의 일부 계속이다.

항인지질 항체는 감염 및 약물요법과 관련해서 뿐만 아니라 전진성 홍반성 낭창(SLE) 및 항인지질 항체 증후군(APS)과 같은 자동면역질환에서 일어난다. APS는 동맥 또는 정맥 혈전증, 혈소판 감소증 및 태 상실과 같은 한가지 이상의 임상적 특징들을 특징으로 한다. APS는 일차적일 수도 있고 또는 다른 상태, 주로 SLE와 관련될 수도 있다(PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES(Harris et al., eds., CRC Press, Boca Raton, FL. 1991); McNeilet al. ADVANCES IN IMMUNOLOGY, Vol.49, pp.193-281 (Austenet al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1991)). SLE를 가진 환자의 대략 30-40%가 aPL을 가지나, aPL항체를 가진 환자의 50%는 SLE를 갖지 않는다. 이 50%는 다른 자동면역 류머티스성 질환, 잡다한 상태들을 가질 수도 있고, 또는 그들은 약물요법, 특히 클로르프로마진 요법을 받아왔을 수도 있다. 일차적인 APS(PAPS)를 가지나 SLE의 증거는 없는, 남자 26명, 여자 44명의 70명의 환자들의 한 연구에서, 다음 특징들이 관찰되었다. 즉, 31명에게서 심한 정맥혈전증(DVT); 31명에서 동맥폐색, 특히 발작적 또는 일시적 허혈; 15명에게서 심근경색; 24명에게서 재발성 태 상실; 32명에게서 혈소판 감소증(TCP); 그리고 10명은 양성쿰스(Coombs) 테스트를 가졌고; 7명에게서 에반스(Evans) 증후군; 32명에게서 항-핵항체(ANA), 그러나 29명에게서는 1:160 미만이었고; 대략 24명은 항미토콘드리아 항체(AMA)를 가졌다(McNeil et al., 상기참조). 추산치는 달라질 수도 있으나 모든 발작환자의 약 5%에서 aPL 항체는 중요한 기여인자인 것으로 생각된다.

VDRL시험에서 검출된 것들과 같은 일시적 aPL항체는 많은 감염의 동안에 일어난다. 지속적인 aPL 항체를 지니는 환자의 대략 30%는 혈전의 경우를 당하였다. aPL 항체의 존재는 한가지 이상의 혈전증, TCP 및 태 상실로 구성되는 임상적 특징들의 증세를 나타내는 SLE를 가진 환자의 특징이다. 전체 SLE에서 이 증세의 위험은 약 25%이고, 이 위험은 aPL항체의 존재하에 40%로 증가하며 aPL항체의 부재하에 15%로 감소한다. aPL항체는 원형질막내 인지질에서 규제되는 것으로 생각되었기 때문에, 그것이 혈소판 또는 내피세포와 같은 세포의 인지질막에서 일어나는 지혈과정을 방해함으로써 생체내에서 직접적인 발병효과를 발휘하는 것으로 가정되었다. PAPS를 가진 환자에서, aPL항체가 존재하는 유일한 위험인자인 것으로 여겨진다는 사실은 또한 이들 항체가 직접적인 발병효과를 갖는다는 증거이다. 사람의 항카르디올리핀 항체로 마우스를 면역시킴으로써 PAPS가 유발하는 것은 아직도 aPL항체가 직접적인 병인이라는 최상의 증거이다(Bakimeret al. 1992J. Clin. Invest. 89: 1558-1563; Blanket al. 1991Proc.Natl.Acad.Sci. 88: 3069-3073).

임상적 환경에서 aPL 항체의 측정은 여전히 불완전한 기술이다. 시중 구입되는 표준항혈청 세트(APL Diagnostics, Inc., Louisville, KY)는 여러 실험실에서 수행된 분석법들의 비교용 표준곡선의 발생을 허용한다. 그러나, 정확한 GPL과 MPL에 관한 이들 실험실에서 얻은 결과들, IgG 및 IgM 항인지질 항체 각각에 대한 측정단위, 주어진 혈청에 대한 등급 그리고 고, 중 또는 저 역가로 분류되는 GPL 및 MPL의 수준들 사이에 커다란 모순이 존재한다. 구할 수 있는 시판 키트는 시중 구입되는 표준에 할당된 값들에 있어서 크게 다르다(Reberet al. (1995)Thrombosis and Haemostat.73:444-452). 이들 제한에도 불구하고, APS, PAPS 그리고 재발성 발작 및 재발성 태 상실을 포함하는 aPL 항체-매개 질환들에 의해 인식되는 에피토프가 β₂-GPI의 5번째 도메인에 위치되며 β₂-GPI의 카르디올리핀에의 결합후 항체에 노출된다는 데에 일반적으로 동의하고 있다.

이제 aPL 항체는 β₂-당단백질 I(β₂-GPI)와 음으로 하전된 인지질, 예를들면, 카르디올리핀으로 이루어진 항원성 복합체를 인식한다는 것이 이제 일반적으로 받아들여지고 있다(McNeilet al. (1990)Proc.Natl.Acad.Sci. 87: 4120-4124; Galliet al. (1990)LancetI:1544-1547)(이후 "aPL 면역원"). β₂-GPI는 유리상태로 발견되고 또 유도지단백질 H(apo H)로도 알려진 지단백질 지질과 회합해 있는 보다 적은 원형질 당단백질이다. 그것은 스시(Sushi)라고도 하는 5개의 독립적 주름형성 도메인 또는 다른 단백질들에서의 유사 도메인들과 닮은 짧은 합치반복 도메인으로 구성된다. β₂-GPI는 인지질을 결합할 때 항원성 및 구조적 변화를 당하는 것으로 보고되었다(Wagenknecktet al. (1993)Thromb.Haemostas. 69:361-365; Joneset al. (1992)Proc. 5th Intl.Symp.Antiphospholipid Antibodies(Abstract S5)). 제5도메인은 지질결합과 aPL 항체결합의 추정상 부위를 함유한다(Hunt J. and S. Krilis, (1994)J.Immunol. 152:653-659; Laueret al. (1993)Immunol. 80:22-28). aPL에 대한 발병 메카니즘은 알려져 있지 않다(McNeil et al., 상기 참조). 대부분의 설명은 내피세포기능 또는 혈소판 수반을 가져온다(Haselaaret al. (1990)Thromb.Haemostas. 63:169-173). 이들 설명은 혈관내피세포 손상 또는 혈소판 활성화후에 음이온성 인지질의 원형질 노출된 표면에의 노출 또는 이중층을 통한 이동이 β₂-GPI-결합을 가져오고 aPL 항체형성을 일으킨다는 것을 제안한다.

aPL 항체는 프로스타사이클린 형성을 감소시킴으로써(Vermylen,J.and J.Amout(1992)J.Clin.Lab.Med. 120:10-12); 응고단백질의 작용을 직접 방해함으로써; 또는 본래의 혈액응고경로, 혈소판 프로트롬비나제활성, 및 ADP-매개 혈소판 응집을 저해하는 β₂-GPI의 능력을 차단함으로써(Arvieuxet al. (1993)Thromb.Haemostas. 60:336-341) 직접 프로트롬빈성일 수도 있다.

리드 화합물에 대한 조사에서 의약화학에서의 주된 새로운 도구는 막대한 분자다양성을 제공하는 조합라이브러리의 출현이었다. 분자다양성은 화학적 합성으로부터 또는 생물학적 시스템으로부터 일어날 수도 있다(Scott., J.K.RATIONAL DRUG DESIGN(CRC Press, Weiner, D.B. and W.V. Williams, eds., Boca, Raton. FL., 1994);Moos et al. (1993)Ann. Reports Med Chem. 28:315-324). 필라멘트상 파지의 표면에 랜덤펩티드를 디스플레이함으로써, 임상적으로 중요한 항체들에 의해 프로브하기 위한 수억개의 클론을 함유하는 에피토프 라이브러리가 만들어졌다(Scott, J.K. and G.P. Smith (1990)Science249:286-390; Cesareni, G. (1992)FEBS Lett. 307:66-70). 이러한 파지 라이브러리는 랜덤화된 올리고누클레오티드 서열을 각 파지의 표면에 독특한 펩티드서열을 코드화하는 파지 게놈, 보통은 pIII유전자에 포함시킴으로써 제조된다. 친화성 정제 및 증폭의 연속되풀이 후, 항체를 결합하는 이들 파지는 E. coli와 바이러스 DNA의 해당코드화 영역을 서열결정함으로써 확인된 결합펩티드에서 전파된다. 대부분의 경우에, 후속 연구에서는 항체를 결합하는 능력을 확립한 후의 대응합성 펩티드를 수반할 것이다. 파지-기재 라이브러리는 불연속 에피토프를 모방하기 위해 사용되었다(Luzzagoet al. (1993)Gene128:51-57; BaLasset al. (1993)Proc.Natl.Acad.Sci. 90:10638-10642). 펩티드-기재 약물의 잠재적인 원형질 불안정성은 N-말단 블로킹에 의해서 또는 아미노산 유사체의 분별있는 사용에 의해서 성공적으로 극복되었다(Powell, M.F. (1993)Ann. Reports Med. Chem. 28:285-293).

현재 aPL 항체의 높은 역가를 나타내는 환자를 위한 선택적인, 면역특이적 요법은 없다. 많은 경우에, 아스피린, 스테로이드 및 와파린(warfarin)과 같은 약물의 사용은 크게 부적당함이 증명되었다(PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES(Harriset al., eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 1991); McNeilet al.,상기참조). (i) T세포를 활성화할 수 없는 능력 (ii) 면역 B세포를 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 합성모방펩티드가 항원특이적 방식으로 B세포를 관용하기 위해 사용된다. 이 기술은 공동소유의 공동계류중인 1993년 9월 8일에 출원된 미국특허출원 일련번호 08/118,055 및 미국특허 제 5,268,454호에 개시되어 있고, 이것은 전부 본문에 참고로 포함된다. 상기 인용된 출원 및 특허에 개시된 바와같이, B세포 관용성은 표면면역글로불린을 교차결합한 후 B세포아네르기 또는 클론성 삭제를 통해 항체생산을 폐기하기 위해 다가의 안정한, 비면역원성 원자가 플랫폼에 콘주게이트된 이러한 펩티드를 투여하는 것을 수반한다.

aPL 항체에 의해 인식되는 표적에피토프의 정확한 분자성질은 알려져 있지 않으나, 에피토프 라이브러리로부터 유도된 펩티드의 사용은 성공적인 관용원의 제조를 허용할 것이다. 사람의 전신성 홍반성 낭창-관련 신염의 치료를 위한 B세포 관용원도 또한 공동소유의 미국특허 제 5,276,013 및 제 5,162,515에 개시되었으며 이것은 전부 본문에 참고로 포함된다.

(발명의 개시)

본 발명은 랜덤 펩티드 파지 라이브러리를 사용하여, PAPS, APS, 그리고 재발성 발작 및 재발성 태 상실과 같은 다른 aPL 항체-매개질환에 걸린 환자에게서 aPL항체에 의해 인식된 중요 에피토프의 유사체를 확인하는 방법의 발견에 있다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 aPL 항체에 의해 인식된 에피토프를 가장 잘 모방하는 펩티드서열을 확인하기 위해서 랜덤 펩티드 파지 라이브러리를 스크리닝 하는 개선된 방법이다. 이 방법은 (a) 본 분야의 공지된 방법으로부터 변형된 방법을 사용하여 라이브러리를 바이오패닝시키는 단계; (b) (i) 단백질 G에 결합된 aPL 항체로 코팅된 마이크로플레이트웰에서 파지를 배양하고, (ii) 미결합 파지를 제거하기 위해 마이크로플레이트웰을 세척하고, (iii) 결합된 파지를 용리하고, (iv) E. coli와 같은 미생물을 용리된 파지로 감염시키고 한천에 플레이팅함으로써 감염된 미생물의 수를 계수함으로써 단계 (a)로부터 스크리닝한 파지를 마이크로패닝함으로써 매우 약하게 결합하는 파지를 제거하는 단계; (c) (i) 마이크로플레이트의 웰을 aPL 항체로 코팅하고, (ii) 코팅된 웰에서 (b)에서 마이크로패닝함으로써 확인된 가장 강하게 결합하는 클론을 배양하고 미결합된 파지를 세척하고, (iii) 비색 ELISA 분석에서 효소-콘주게이트된 염소 항-파지 항체를 사용하여 항체에 결합된 파지의 수를 정량함으로써 파지-포획 ELISA를 통한 평가에 의해 (b)에서 회수된 가장 강하게 결합하는 클론을 결정하는 단계, 그리고 만일 몇개의 대등한 강하게 결합하는 클론이 확인되면 가장 강하게 결합하는 파지포획 ELISA 클론에서 (d)파지-ELISA의 추가의 되풀이를 하는 단계들로 이루어진다.

이점에 있어서, 본 발명은 (a) 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 제조하는 단계; (b) 상기 라이브러리를 aPL 모방에피토프를 확인하기 위해 aPL 항체로 스크리닝하는 단계로 이루어지고, 여기서 상기 스크리닝 단계는 (i) 상기 라이브러리를 바이오패닝에 의해 스크리닝하고, (ii) 마이크로패닝에 의해 (i)에서 바이오패닝에 의해 분리된 파지를 더 스크리닝하고; (iii) 면역분석에 의해 (ii)에서 회수된 aPL 항체 고친화성 결합펩티드를 함유하는 파지를 확인하는 것으로 이루어지는 aPL 항체-매개질환에 걸린 사람으로부터 분리된 aPL 항체를 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체를 확인하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 (a) 친화성-정제된 aPL 항체를 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지와 반응시키는 단계; (b) aPL 항체에 결합하는 랜덤펩티드 삽입체를 지니는 파지를 회수하는 단계; (c) 미생물을 (b)에서 회수된 파지로 감염시키는 단계; 그리고 (d) 감염된 미생물을 파지를 분리하기 위해 항생제함유 배지에서 배양하는 단계로 이루어지는, aPL 항체에 결합하는 펩티드를 확인 및 분리하기 위해 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 바이오패닝하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 (a) 바이오패닝에 의해 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지를 분리하는 단계; (b) 단백질 G에 결합된 aPL 항체로 코팅된 마이크로플레이트 웰에서 단계(a)에서 회수된 파지를 배양하는 단계; (c) 미결합된 파지를 제거하기 위해 마이크로플레이트 웰을 세척하는 단계; (d) 결합된 파지를 용리하는 단계, (e) 미생물을 (d)에서 회수된 파지로 감염시키는 단계, 그리고 (f) 감염된 미생물을 파지를 분리하기 위해 항생제 함유 배지에서 배양하는 단계로 이루어지는, aPL 항체에 높은 결합친화성을 갖는 펩티드를 확인 및 분리하기 위해 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 마이크로패닝하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 상기한 방법으로서, 면역분석이 (a) aPL 항체로 코팅된 마이크로플레이트 웰에서 마이크로패닝함으로써 분리된 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지를 배양하는 단계; (b) 미결합 파지를 세척하는 단계; (c) 효소 표지된 항-파지 항체를 웰에서 배양하는 단계; (d) 미결합된 효소 표지된 항-파지 항체를 세척하는 단계; (e) 비색기질을 가하는 단계; 그리고 (f) 고친화성 결합파지를 확인하기 위해 기질의 흡광도를 측정하는 단계로 이루어지는 파지-포획 ELISA인 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 상기한 방법으로서, (a) 균일한 양의 파지를 마이크로플레이트 웰에 코팅하는 단계; (b) aPL 항체를 웰에서 배양하는 단계; (c) 미결합 항체를 세척하는 단계; (e) 효소 표지된 항-aPL 항체를 결합된 aPL 항체와 함께 배양하는 단계; (f) 미결합 효소표지된 항-aPL 항체를 세척하는 단계; (g) 비색기질을 웰에 가하는 단계; 그리고 (h) 파지의 상대 결합친화성을 측정하기 위해 기질의 흡광도를 측정하는 단계로 이루어지는, 고친화성-결합파지의 추가 파지-포획 ELISA 분석을 수행하는 것을 더 포함하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 상기한 방법으로서, 면역분석이 (a) 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지로 감염된 미생물을 한천함유 배양배지의 제일 위의 니트로셀룰로스 막에서 배양하는 단계; (b) 한천함유 배양배지의 제일 위의 제2의 니트로셀룰로스 막에서 미생물을 블로팅함으로써 (a)에서 배양된 미생물을 복제전사하는 단계; (c) 전사된 미생물을 배양하는 단계; (d) 미생물을 세포용해시키는 단계; (e) 미생물을 리소자임으로 분해시키는 단계; (f) 막을 젤라틴용액으로 블로킹하는 단계; (g) 막을 aPL 항체와 함께 배양하는 단계; (h) 미결합 aPL 항체를 세척하는 단계; (i) 효소표지된 항-aPL 항체를 니트로셀룰로스막과 함께 배양하는 단계; (j) 미결합 효소표지된 항-aPL 항체를 세척하는 단계; (k) 비색기질을 가하는 단계; (l) 고친화성-결합 파지를 확인하기 위해 기질의 흡광도를 측정하는 단계로 이루어지는 콜로니-블롯 면역분석인 방법을 포함한다.

aPL 항체-매개질환에 걸린 사람으로부터 분리된 aPL항체를 특이적으로 결합하는 에피토프를, 친화성 결합특성에 대해 분석 및 등급매기기 위한 방법도 포함되며, 이 방법은 (a) 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰을 카르디올리핀으로 코팅하는 단계; (b) 카르디올리핀에 결합시키기 위해서와 플레이트의 웰에 비특이적 결합을 방지하기 위해 β₂-GPI원으로서 성장한 소 또는 사람 혈청을 첨가하는 단계; (c) 단량체 유사체와 고역가 aPL 항체의 용액을 지정된 시간동안 배양하는 단계; (d) aPL 항체/유사체 혼합물을 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계; (e) 미결합 aPL 항체를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계; (f) 표지(예를들면, 효소)와 콘주게이트된 항-사람 IgG를 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계; (g) 미결합된 항-사람 IgG 콘주게이트를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계; (h) 표지된 콘주게이트에 대한 기질을 첨가하고 지정된 시간동안 기질/표지 반응을 전개시키는 단계; (i) 웰에 결합된 aPL항체의 양을 정량하기 위해 기질/표지반응의 목적생성물을 측정하는 단계; (j) 유사체의 aPL 항체에 대한 친화성을 결정하기 위해, 있다면 aPL 항체의 결합의 백분율 저해를 계산하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 다른 양태는 aPL 항체에 결합하는 펩티드에 대한 분리상수를 측정하기 위한 형광분극 펩티드 결합 분석법을 포함한다. 이 분석법은 펩티드의 aPL 항체에의 직접 결합을 검출한다.

본 발명은 또한 체액샘플을 aPL 항체에 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체와 접촉시키고, 본분야 공지된 방법에 의해서 aPL 항체가 체액에 존재하는지를 결정하고, 만약 존재한다면, 체액에 존재하는 aPL 항체의 양을 정량하는 것으로 이루어지는, aPL 항체-매개 질환에 걸린 것으로 의심이 가는 환자로부터 취한 체액내의 aPL 항체의 존재를 결정하기 위한 진단면역 분석법을 포함한다. 한가지 이러한 면역분석법은 (a) 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰을 aPL 항체를 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체로 코팅하는 단계; (b) 미결합 유사체를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계; (c) 체액의 시험샘플을 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계; (d) 미결합 시험샘플을 제거하기 위해 웰을 삭제하는 단계; (e) 표지와 콘주게이트된 항-사람 IgG를 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계; (f) 미결합된 항-사람 IgG 콘주게이트를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계; (g) 표지된 콘주게이트에 대한 기질을 가하고 지정된 시간동안 기질/표지 반응을 전개시키는 단계; (h) 시험샘플에서 항-aPL 항체의 존재를 결정하기 위해 기질/표지 반응의 목적생성물을 측정하는 단계로 이루어진다. 면역분석이 정량적인 상기한 바와같은 진단면역분석법도 또한 포함된다.

파지-ELISA 분석법은 (i) 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰에 균일한 양의 다른 클론들을 코팅하고 이어서 (ii) 항체를 웰에 가하고 효소표지된 항-사람 IgG 콘주게이트와의 반응을 전개시킴으로써 aPL 항체를 가장 강하게 결합하는 펩티드 삽입체를 확인하는 것으로 구성된다. 파지-ELISA, 콜로니 블롯 또는 파지-포획-ELISA에 의해 측정한 바 aPL 항체에의 높은 결합 친화성을 갖는 파지에 의해 디스플레이된 랜덤펩티드는 aPL-특이적 에피토프의 유사체를 나타낸다. 그다음 이들 펩티드를 합성하고 경쟁분석을 사용하여 결합강도에 대한 등급을 매겼다.

본 발명의 또 다른 양태는 aPL 에피토프가 결합하는 B세포에 특이적으로 결합하는 aPL 항체-결합유사체이다. 최적화된 유사체는 T세포 에피토프를 결핍한다.

본 발명의 여전히 또 다른 양태는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자와, (a) aPL면역원이 결합하는 B세포에 특이적으로 결합하고 (b) T세포 에피토프가 결핍된 aPL 항체-결합유사체의 콘주게이트로 이루어지는 aPL 면역원에의 특이적 B세포 관용성을 유발하기 위한 조성물이다.

본 발명은 면역학의 분야이며, 항 인지질(aPL)항체-매개병변의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 화학적으로 정의된 비면역원성 원자가 플랫폼 분자들과 aPL-결합에피토프의 면역특이적 유사체의 콘주게이트와 또한 이들 콘주게이트를 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 최적화된 유사체는 T세포 에피토프를 결핍한다. 게다가, 본 발명은 생물학적 샘플에서 항인지질 항체의 존재를 검출하고 양을 정량하기 위한 진단분석(diagnostic assays)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 aPL-결합 에피토프의 면역특이적 유사체를 확인하기 위한 랜덤 펩티드 라이브러리를 이용하는 방법에도 관한 것이다.

도 1은 성장한 소혈청을 어류 젤라틴으로 바꾼 것은 시판 aPL 항체표준의 ELISA 분석에서 모든 항카르디올리핀(ACA)을 폐지하였음을 나타낸다. 이 결과는 ACA의 표적에피토프를 정의하는데 있어서, β₂-당단백질 I(β₂-GIP)의 중요성에 관한 McNeil et al.(상기참조)와 Galli et al.(상기참조)의 발견을 지지하였다.

도 2는 수지결합된 유사체 5A 12가 ACA-6501로 칭한 친화성-정제된 IgG에 면역특이적으로 결합함을 나타낸다.

도 3은 ACA-6626으로 스크리닝하는 것으로부터 유도된 aPL항체-결합 유사체는 aPL 항혈청을 결합했으나 정상 혈청은 결합하지 않았음을 도시한다.

도 4는 또한 ACA-6501/5A12 유사체가 ACA-6501 항혈청을 면역특이적으로 결합하여 ACA-6626과는 교차반응성임을 도시한다.

도 4 및 도 5는 또한 본 발명내의 방법으로 스크리닝 하는 것으로부터 유도된 ACA-6501/5A12및 ACA-6626/4D3 aPL 항체-결합유사체는 스크리닝 항체와 선호적으로 결합하는 한편, 상당한 정도의 교차반응성이 검출되었음을 도시한다.

도 6은 ACA-6501 aPL 항체에 대한 GPL값을 계산하는 방법을 도시한다.

도 7은 GPL 표준혈청과 비교한 친화성-분리된 ACA-6501의 활성을 나타낸다.

도 8은 바이오패닝의 제4회에 의한 분리된 클론의 서열다양성에 있어서 극적인 감소를 도시한다.

도 9는 3개의 클론(3A12, 3B3 및 3A5)이 ACA-6635를 사용하는 파지-포획 ELISA에서 매우 강한 면역특이적 신호를 나타낸 한편 시험한 모든 클론은 정상 IgG와 비반응성이었음을 도시한다.

도 10은 ACA-6501을 사용하는 파지-ELISA에서 7개의 클론에 의해 나타난 강한 신호를 나타낸다.

도 11은 ACA-6501을 사용하는 펩티드 5A12, CB2 및 3B10으로 얻은 경쟁적-결합 ELISA의 결과를 나타낸다. 0.16㎍의 펩티드 5A12가 폴리스티렌 마이크로플레이트 웰에 결합된 4가 펩티드 ACA6501/3B10에의 ACA 6501 aPL항체의 결합의 50% 저해를 일으킨 한편 0.08㎍의 CB2 및 0.54㎍의 3B10이 50% 저해를 일으키기 위해 요구되었다.

도 12는 변형된 ACA-6641/3G3 유사체의 비교활성을 도시한다.

도 13은 ACA-6501 aPL 항체를 사용하는 경쟁적-결합 ELISA에서 펩티드 139, 142 및 143에 대한 50% 저해값은 각각 6.9, 0.7 및 0.9㎍이었음을 도시한다.

도 14는 펩티드 3B10에서 3위치, 9위치 및 3과 9위치 둘다에서 α-Me-Pro를 치환하는 효과를 도시한다. 9위치에서 α-Me-Pro의 치환은 "본래" 펩티드와 비교하여 펩티드의 활성을 4배 증가시켰다.

도 15는 펩티드 6641/3G3(LJP688)이 9개의 친화성-정제된 ACA항체와 크게 교차반응성임을 나타낸다.

도 16 및 도 17은 마우스로부터의 비장세포를 각각 100, 20 및 4μM의 LJP 685-MTU-DABA-PEG 콘주게이트(화합물36) 및 LJP 685-ATU-MTU-AHAB-TEG 콘주게이트(화합물35)와 함께 2시간 동안 배양한 후 LJP685-KLH로 면역된 비장세포를 사용하여 10⁸M에서 항-685 항체 ABC에서의 투여량 의존 감소율을 나타낸다.

도 18은 펩티드 925에 대해 밝혀진 9가지 구조의 도심에 가장 가까운 NMR 구조를 표시하며 펩티드 925분자의 형태의 합리적인 표현이다.

도 19는 펩티드 925의 구조(3G3으로서 도면의 밑에 라벨붙임)를 펩티드 5A12의 구조와 비교한다. 두 펩티드는 펩티드 서열에서 대략 같은 위치에서 턴을 갖는다.

도 20a 및 도 20b는 aPL 유사체의 약물단(pharmacophore)이 작은 소수성 기와 양으로 하전된 기로서 잠정적으로 확인되었음을 도시한다. 펩티드 925의 겜-디메틸 및 아미노기는 도 20a에 나타낸 바와같이 이 펩티드의 약물단으로서 잠정적으로 확인된다. 약물단 기들을 어떤 골격에 매는 탄화수소 링커의 길이는 이들 링커가 골격에 부착되어 있는 지점들을 분리시키는 거리와 더불어 도 20a에 명시되었다.

도 21은 희석된 6501 혈청이 있는 6501-유도된 펩티드에 의한 β₂GPI의 저해를 도시한다.

도 22는 CB2^*-F의 ACA-6701 적정; FITCGPCILLARDRCG를 나타낸다.

도 23은 CB2^*-F의 ACA-6501 적정; FITCGPCILLARDRCG를 나타낸다.

도 24는 CB2^*-F의 완전한 ACA-6501 적정; FITCGPCILLARDRCG를 나타낸다.

도 25는 1.04당량의 CB2^*를 사용하여 ACA-6701로부터 CB2^*-F의 치환을 나타낸다.

도 26은 ACA6701로부터 CB2^*-F를 치환하기 위해 CB2^*를 사용하는 cFP 적정을 나타낸다.

27은 ACA6701로부터 CB2^*-F를 치환하기 위해 3B10을 사용하는 cFP 적정을 나타낸다.

도 28은 관용활성에 대한 (LJP685)4/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트의 투여량 반응을 나타낸다.

도 29는 관용활성에 대한 (LJP685)4/MTU-DABA-TEG 콘주게이트의 투여량 반응을 나타낸다.

도 30은 시험관내에서의 모델로 시험한 (LJP685)4/MTU-DABA-TEG 콘주게이트의 관용활성의 투여량 반응을 나타낸다.

도 31은 시험관내에서의 모델로 시험한 (LJP685)4/MTU-DABA-TEG 콘주게이트의 관용활성의 투여량 반응을 나타낸다.

도 32는 여러 투여경로 및 투여량 범위를 비교한 (LJP685)4/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트의 관용성 효과를 나타낸다.

A.정의

본문에 사용된 용어 "aPL 항체"는 질병을 매개하는 β2-GPI를 특이적으로 결합하는 어떤 항체를 의미한다.

본문에 사용된 용어 "B세포 아네르기"는 항체를 생산 및 분비하기 위해 T세포도움을 요하는 이들 B세포의 비반응성을 의도하며, 제한없이 미성숙 및/또는 성숙한 B세포의 클론성 결실 및 또는 B세포가 항체를 생산할 수 없음을 포함한다.

"비반응성"은 면역원에 대한 체액반응에 있어서의 치료학적으로 효과적인 감소를 의미한다. 정량적으로, 감소(항체생산의 감소로 측정됨)는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%이다.

"항체"는 T세포 의존적인 이들 항체를 의미한다.

본문에 사용된 용어 "면역원"은 aPL 항체로 이루어지는 체액 면역 반응을 이끌어내는 실재물을 의미한다. 면역원은 B세포 에피토프와 T세포 에피토프를 모두 갖는다. aPL 항체-매개 병변에 수반되는 aPL 면역원은 치료학적 단백질, 펩티드 및 항체등과 같은 개체에게 맞지 않는 본래의 생물학적 물질을 포함하여 약물과 같은 외부적(개체에게 맞지 않는) 면역원일 수도 있고 또는 항체-매개 고응집력과 연관된 것들(발작)과 같은 자기면역원(자동면역원)일 수도 있다.

면역원의 "유사체"라는 용어는 (a) 면역원이 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고 (b) T세포 에피토프가 결핍된 분자를 의도한다. 유사체는 보통 면역원의 단편 또는 유도체일 것이고 면역원과 같은 화학적 부류일 것이나(예를들면, 면역원도 폴리펩티드이고 유사체도 폴리펩티드이다), 화학적 유사성은 필수적이지 않다. 따라서, 유사체는 그것이 상기한 기능상의 특징 (a) 및 (b)를 갖는 한 면역원과 다른 화학적 부류일 수도 있다(예를들면, 면역원은 탄수화물이고 유사체는 폴리펩티드이다). 유사체는 펩티드, 탄수화물, 지질, 지질다당류, 핵산 또는 다른 생화학적 실재물일 수 있다. 또한, 면역원의 화학구조와 유사체의 화학구조는 본 발명의 목적을 위해 정의되는 것이 필요하지 않다.

면역원의 "유사체"라는 용어는 또한 "미모토프"라는 용어를 포함한다. "미모토프"라는 용어는 항체가 면역원을 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 분자를 의도한다. 그것은 항체를 특이적으로 결합하기 때문에 미모토프는 면역원이 항원 결정기를 모방하는 것으로 생각된다.

여기서 사용된 "원자가 플랫폼 분자"는 분명한 수의 면역원 유사체의 부착을 용이하게 하는 부위를 함유하는 비면역원성 분자를 의미한다.

"비면역원성"은 원자가 플랫폼 분자를 기술하기 위해 사용되고 원자가 플랫폼 분자는 개체에 단독으로 투여될 때 실질적으로 면역반응을 유발하지 않음을 의미한다.

여기서 사용된 "개체"는 포유동물종의 일원을 말하며 사람, 영장류, 마우스 및 소 및 양과 같은 가축, 말과 같은 스포츠용 동물, 그리고 개 및 고양이와 같은 애완동물을 포함한다.

여기서 사용된 "약물단"은 aPL 유사체의 항체 표적에의 결합에 수반된 중요기들의 3차원 배향 및 화학적 성질을 의미한다.

B.aPL 항체-결합 유사체의 확인

aPL 항체-결합 유사체는 그것들이 (a) aPL 항체에 특이적으로 결합하는지 아닌지와 (b) T세포 에피토프가 결핍되었는지 아닌지를 결정하기 위해 후보분자를 스크리닝함으로써 확인될 수도 있다. aPL 항체에의 특이적 결합은 이하 실시예들에 기술된 ELISA 분석법과 같은 종래의 면역분석법을 사용하여 결정될 수 있고 T세포 에피토프의 존재 또는 부재도 실시예들에 기술된 종래의 T세포 활성화 분석에 의해 구해질 수 있다. 이점에 있어서, 혈청항체에 특이적으로 결합하는, 면역원에 대한 유사체는 합리적인 친화성 예를들면 10⁷M^-1을 나타낸다. T세포 에피토프의 존재 또는 부재는 일련번호 08/118,055에 개시된 삼중수소화된 티미딘 포함 분석을 사용하여 구해질 수 있다. T세포 에피토프의 존재는 또한 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 T세포 유도된 림포킨의 분비를 측정함으로써 구해질 수 있다. 백그라운드 위의 티미딘의 통계적으로 유의한 포함을 이끌지 못하는 유사체는 T세포 에피토프가 결핍된 것으로 생각된다. 티미딘 포함의 정량화된 양은 면역원에 따라 다양할 수도 있음이 인식될 것이다. 전형적으로 약 2-3 이하, 더 일반적으로는 약 1-2의 자극지수는 T세포 에피토프의 결핍의 표시이다.

C.콘주게이트의 제조

aPL 항체-결합 유사체는 본 발명의 콘주게이트를 제조하기 위해 비면역원성 원자가 플랫폼 분자에 결합된다. 바람직한 원자가 플랫폼 분자는 생물학적으로 안정화되어 있으며, 즉, 그것들은 치료효험을 초래하기 위해 종종 수시간 내지 수일 내지 수개월의 생체내분비 반감기를 나타내고, 바람직하게는 합성 단일사슬의 정의된 조성물로 구성된다. 그것들은 보통 약 200 내지 약 200,000, 보통 약 200 내지 약 20,000의 범위의 분자량을 가질 것이다. 본 발명내의 원자가 플랫폼 분자의 예들은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리-D-리신, 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체들이다. 바람직한 중합체는 약 200 내지 약 8,000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 기재로 한다.

본 발명에서 사용하는데 적합한 다른 원자가 플랫폼 분자는 전부 본문에 참고로 포함되는 1993년 11월 15일 출원된 공동소유의 공동계류중의 미국특허출원 일련번호 08/152,506에 개시된 화학적으로 정의된, 비중합체 원자가 플랫폼 분자이다. 본 발명에서 사용을 위해 적합한 특히 바람직한 균일한 화학적으로 정의된 원자가 플랫폼 분자는 유도체화된 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민(EDDA) 및 트리에틸렌글리콜(TEG)이다.

추가의 적합한 원자가 플랫폼 분자는 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 테트라아미노펜타에리스리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Cyclam) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Cyclen)을 포함한다.

원자가 플랫폼 분자에 aPL 항체-결합유사체의 콘주게이션은 전형적으로 하나 이상의 가교제와 유사체와 원자가 플랫폼 분자에 대한 작용기를 수반하는 많은 방법들로 실행될 수 있다.

폴리펩티드 유사체는 유사체를 담체에 커플링시키기 위한 부위들로서 제공하게 될 아미노, 카르복실 또는 술프히드릴기와 같은 작용기들을 함유하는 아미노산 측쇄부분을 함유할 것이다. 이러한 작용기를 갖는 잔기들은 유사체가 이미 이들 기를 함유하지 않는다면 유사체에 가해질 수 있다. 이러한 잔기는 고상합성기술 또는 재조합기술에 의해 포함될 수도 있고, 그것들은 모두 펩티드 합성분야에 잘 알려져 있다. 탄수화물 또는 지질유사체의 경우에, 작용성 아미노 및 술프히드릴기는 종래의 화학에 의해 거기에 포함될 수도 있다. 예를들면, 1차 아미노기는 시아노붕수소화나트륨의 존재하에 에틸렌디아민과의 반응에 의해 포함될 수도 있고 술프히드릴은 시스테아민 이염산염의 반응과 이어서 표준 디술피드 환원제로 환원에 의해 도입될 수도 있다. 유사한 방식으로 원자가 플랫폼 분자는 또한 그것이 이미 적당한 작용기를 지니지 않는다면 작용기들을 함유하도록 유도될 수도 있다.

변하기 쉬운 길이의 친수성 링커는 펩티드 또는 다른 생체활성 분자들을 원자가 플랫폼 분자에 연결하는데 유용하다. 적당한 링커는 에틸렌글리콜의 선형올리고머 또는 중합체를 포함한다. 이러한 링커는 화학식 R¹S(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O(CH₂)_mCO₂R²(여기서 n=0-200, m=1 또는 2, R¹=H 또는 트리틸과 같은 보호기, R²=H 또는 알킬 또는 아릴, 예를들면 4-니트로페닐에스테르)을 갖는 링커를 포함한다. 이들 링커는 티오에테르를 통해 할로아세틸, 말레이아미드 등과 같은 티올 반응성기를 함유하는 분자를 아미드결합을 통해 아미노기를 함유하는 제2의 분자에 연결하는데 유용하다. 이들 링커는 부착순서에 관해 탄력적이다. 즉, 티오에테르가 먼저 형성될 수 있고 나중에 형성될 수도 있다.

콘주게이트는 보통 주사 투여를 위해 조제될 것이다(예를들면, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등). 따라서, 그것들은 식염수, 링거용액, 덱스트로스 용액등과 같은 약학적으로 허용되는 부형제와 조합될 것이다. 콘주게이트는 보통 조제의 약 0.01% 내지 10중량%를 구성할 것이다. 콘주게이트는 개체에 "치료학적 유효량", 즉, 수반된 면역원에 B세포 아네르기를 내고 제기되는 항체-매개 상태의 예방, 개선 또는 제거를 행하기에 충분한 양으로 투여된다. 구체적인 투여량 섭생, 즉 투여량, 타이밍 및 반복은 특정 개체와 그 개체의 병력에 의존할 것이다. 보통, 1주에 약 1㎍ 내지 약 100mg 콘주게이트/체중kg, 바람직하게는 약 100㎍ 내지 약 10mg/체중kg의 투여량이 제공될 것이다. 다른 적당한 투여량 스케줄은 개체 또는 질환상태에 따라 매일 또는 주당 3회 투여량 또는 주당 1회 투여량, 또는 매 2내지 4주에 1회 투여량, 또는 월 1회 투여량 또는 보다 더 빈번한 스케줄의 빈도가 될 것이다. B세포 턴오버 속도에 따라 보통 시기가 정해지는 반복투여가 체액 아네르기의 상태를 달성 및/또는 유지하기 위해 요구될 수도 있다. 이러한 반복투여는 전형적으로 항체역가의 증가가 검출되면 매 30 내지 60일 마다, 또는 더 자주 약 1㎍ 내지 약 10mg/체중 kg의 처치를 수반할 것이다. 대안으로, 일부 병변들에 대해서는 콘주게이트의 지속된 연속방출조제를 지시할 수도 있다. 지속방출을 달성하기 위한 여러가지 조제 및 장치가 본 분야에 공지되어 있다.

항-헬퍼 T세포처치가 콘주게이트와 함께 투여될 수도 있다. 이러한 처치는 보통 스테로이드 또는 시클로스포린과 같은 T세포를 저해하는 약제를 사용한다.

D.aPL 항체에 대한 항원의 성질

본 발명자들에 의한 aPL 항체에 대한 초기 연구는 이들 항체에 의해 인식된 항원성 부위의 성질을 연구한 보고서들의 공개된 것과 일치하였다. 초기에, 이들 항체는 VDRL시험에서 검출된 그들 항체와 훨씬 유사한 카르디올리핀 분자를 인식하는 것으로 생각되었다. 도 1에 나타난 바와같이, 항카르디올리핀 항체(ACA) 고상 ELISA에서 성장한 소혈청을 어류 젤라틴으로 바꾼 것은 ACA 표준으로서 시중에서 얻은 항체 제제의 모든 ACA 활성을 본질적으로 폐지하였다. 이 발견은 ACA 항체가 카르디올리핀 자체 보다는 McNeil et al.(상기참조) 및 Galli et al.(상기참조)에 의해 제안된 것과 같은 혈청 단백질에 대한 결정기를 인식함을 가리켰다. 이 단백질은 이들 저자에 의해 β₂-GPI인 것으로 나타났고 따라서 용어 "ACA" 또는 "항-카르디올리핀 항체"는 진정 오칭이나 이들 항체를 말하는 것으로 여전히 사용되고 있다.

자동면역 IgG aPL항체의 대부분은 β₂-GPI분자에 대한 결정기들을 인식한다. 이들 에피토프는 그것이 카르디올리핀(네오 에피토프)에 결합할 때 단지 β₂-GPI상에 형성 또는 노출될 수 있다. 달리는 β₂-GPI상의 에피토프는 β₂-GPI분자당 단일 사본으로 존재할 수도 있고 aPL항체에 대한 낮은 친화성을 가질 수도 있다. 항체-항원 상호작용을 유지하기 위한 충분한 열망은 카르디올리핀에의 결합에 의해 인접 β₂-GPI분자상에 이들 부위중 둘의 배열로만 이를 수 있을 것이다.

β₂-GPI에피토프 구조로의 추가적인 간파는 β₂-GPI의 본래의 에피토프를 모방하는 본 발명내의 aPL 유사체의 핵자기공명(NMR)분석에 의해 얻어졌다. 예를들면, aPL 항체와 크게 교차반응성인 두개의 펩티드 aPL 유사체의 NMR용액구조의 비교는 두 펩티드가 펩티드 서열에서 대략 같은 위치에서 턴을 갖는 것으로 나타났다(도 18 및 도 19참조).

E.ACA ELISA

임상 샘플의 GPL 스코어링과 연관하여 대규모 시험과 연구항체 및 β₂-GPI의 크로마토그래피 정제의 필요성은 최고의 재현성을 갖는 것으로 발견된 디자인(Reber et al., 상기참조)과 유사하고 시판 키트와 가깝게 일치하는 성능을 가진 aPL 항체에 대한 ELISA 분석의 개발을 가져왔다. 변형된 ACA ELISA도 수행되는데, 일정한 마이크로플레이트에 직접 결합된 β₂-GPI는 마이크로플레이트 웰에 먼저 가해진 어떤 카르디올리핀의 부재시에 직접 aPL IgG를 결합하는데 사용된다(Roubey et al. (1996) Arthritis ＆ Rheumatism39: 1606-1607; R.A.S. Roubey(1996) Arthritis ＆ Rheumatism39: 1444-1454 참조).

F.aPL 항체의 면역친화성정제

aPL 항체를 분리하기 위해, 다중라멜라, 카르디올리핀-함유 분산액(리포좀; 콜레스테롤 및 디세틸포스페이트도 함유)을 aPL 혈장(또는 혈청)과 배양하였다. 이들 리포좀을 원심분리에 의해 혈청으로부터 펠릿으로 한다. 세척후, 리포좀 혼합물을 2% 옥틸글루코시드 세제에 의해 분쇄하고 단백질 A-아가로스 컬럼에 적용하였다. 먼저 지질을 제거한 다음 비-IgG 성분을 제거하기 위해 광범위한 세척 후, IgG aPL 항체를 약산으로 단백질 A로부터 용리하고 중화하고, 완충액 교환하고 ACA ELISA에서 시험한다. 이 과정은 토끼 IgG 항-사람 β₂-GPI 항혈청으로 웨스턴 블로팅에 의해 나타낸 바와같이 어떤 오염 β₂-GPI도 없는 10,000배까지 풍부화된 aPL항체를 수득한다. 추가의 친화성정제 단계는 고상 β₂-GPI상에서 친화성-정제된 항체의 크로마토그래피에 의해 수행한다. 이 제2의 친화성-정제 단계는 β₂-GPI에 직접 결합하는 aPL 항체의 큰 임상 관련성을 새롭게 인식한 결과로 권장된다. 또한 오염균, 특히 β₂-GPI가 없이 최종 제조를 보장하는데 더 사용된다.

G.필라멘트상 파지 랜덤 펩티드 라이브러리의 제조

p-III 단백질(파지당 펩티드와 함께 5개의 사본의 p-III)상에 11개의 다른 FTJSE 5 필라멘트상 파지랜덤 펩티드 라이브러리를 제조한다. 이들 라이브러리는 모방 에피토프의 발견을 위한 막대한 배열의 형태 및 구조를 제공한다. "x"라이브러리로 칭한 4개의 라이브러리는 각각 8, 10, 12 및 15개 잔기길이인 펩티드 삽입체를 가지며, 아미노 및 카르복실 단부 둘다에서 프롤린 잔기에 의해 공격받는다. 이들 프롤린 잔기의 목적은 본래의 p-III단백질로부터 일어날 수도 있는 2차 구조에의 어떤 기여도 방해하기 위해서와 삽입체를 용매에 투사하기 위한 것이다. "y'" 라이브러리는 6,7,8,9,11 및 13개의 아미노산 길이인 시스테인 결합된 삽입체를 함유한다. "y" 라이브러리는 6 및 8개의 아미노산 삽입체가 결핍된 것을 제외하고는 "y'" 라이브러리와 같다. "y" 및 "y'" 라이브러리 둘다에 대한 이들 펩티드 삽입체는 아미노 및 카르복실 단부 둘다에서 시스텐인 잔기에 의해 공격받아 고리형의 더욱 단단한 구조를 형성한다. 프롤린 잔기는 상기한 "x"라이브러리에 대한 것들과 유사한 이유로 이들 시스테인 잔기외부에 포함된다. "x","y'", 및 "y"라이브러리는 본래의 p-III단백질의 아미노말단으로부터 5개의 잔기를 위치시킨다. "z" 라이브러리는 p-III단백질의 아미노말단에 위치된 랜덤한 8개의 아미노산 삽입체로 구성되며 어떤 공격하는 프롤린 또는 시스테인 잔기도 함유하지 않는다. "x", "y'" 및 "z" 라이브러리는 11개의 다른 라이브러리를 나타내며 각각 대략 100만개의 다른 펩티드 삽입체를 갖는다.

이들 라이브러리는 표준분자생물학 기술을 사용하여 fUSE 5의 p-III유전자에 원하는 길이의 삽입체를 제공하기에 적당한 길이의 랜덤 올리고누클레오티드의 포함에 의해 제조된다. fUSE 5 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 분해에 이어서, 갭 듀플렉스로서 제공된 과잉의 키나제 올리고누클레오티드가 첨가되고 라이게이션된다. 그다음 DNA는E. coli에 일렉트로포레이션되고 삽입체는 테트라사이클린 함유 배지에서 배양함으로써 선택된다. 이 배양액으로부터의 파지(이것은 펩티드 삽입체를 함유함)는 상청액으로부터 분리하고 세척하고 완충액에 재현탁시킨다. 전형적으로 라이브러리는 8×10¹²개의 형질도입 유니트/ml에서 7×10⁸개의 독립클론을 갖는 것으로 나타나 있다.

H.파지-스크리닝 방법론

스크리닝 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리의 본질은 수십억의 잠재적인 후보 파지를 두드러진 성질을 갖는 상대적인 소수로 붕괴시키는 능력에 있다. Scott, J.K. 및 G.P. Smith, (1990)Science 249:315-324에 의해 권장된 원래의 스크리닝 프로토콜은 여러가지 aPL 항체에 대한 가장 좋은 에피토프의 선별을 용이하게 하기 위해 상당히 변형되어 있다. 이들 과정은 가장 좋은 서열을 나타내는 유용한 수의 클론이 충분히 조사될 수 있는 시점에 이를 때가지 스크린이 진행함에 따라 더 큰 긴축조건의 선별을 적용하도록 디자인되어 있다. 어떤 항체들로는, 라이브러리는 매우 단단히 결합하는 서열을 갖는 것 같지 않으며, 만일 고도의 긴축조건을 갖는 방법이 스크린에 적용되면 특이적인 클론이 생존하지 않는다. 한편, 라이브러리는 항원의 좋은 유사체들을 나타내는 많은 클론을 수득하고 가장 좋은 에피토프를 확인하기 위해 고도의 긴축조건을 갖는 방법을 사용하는 것이 필요하다. 그런 이유로, 에피토프 라이브러리 스크린으로부터 가장 좋은 에피토프를 확인하기 위해 다양한 긴축조건의 정도를 갖는 분석법이 개발되었다. 분석법은 여기서 긴축조건이 증가하는 순서로 열거한다: 바이오패닝〈마이크로패닝〈파지-포획 ELISA〈파지 ELISA=콜로니블롯=펩티드 ELISA.

(i) 바이오패닝

"바이오패닝"은 친화성-정제된 aPL 항체와 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지를 혼합되게 하고 그후 항체특이적 회수물이 결합된 파지를 포획하는 기술을 설명한다. 파지는 테트라사이클린 함유배지에서 전파된 다음 분리되는E. coli에 대한 테트라사이클린 저항성을 준다. 다수회의 바이오패닝은 샘플에서 면역특이적 파지의 수를 풍부하게 한다. 파지는 항상 3 내지 5회의 선별끝에 회수되나 선별항체에 대한 낮은 친화성에서 비특이적으로 결합되는 서열들을 단지 나타낼 수도 있다. 이들 파지를 더 평가하는 방법(마이크로패닝)이 요구된다.

(ii) 마이크로패닝

파지의 aPL 항체에의 결합의 상대적 강도의 추산은 "마이크로패닝"에 의해 결정될 수 있다. 마이크로패닝은 3회 이상의 바이오패닝에 따라 수행되며 바이오패닝 방법에서 사용되는 것과 같은 항체를 사용한다. 방법은 마지막 회의 바이오패닝으로부터 파지의 희석과 마이크로패닝에 의해 50개 이상의 이들 클론을 분석하는 것으로 구성된다. 마이크로패닝은 각 클론을 유사한 밀도로 성장시킨 다음 일정량의 항체로 사전에 코팅된 마이크로타이트레이션 웰에서 최적 단일농도에서 묽은 파지를 배양함으로써 달성된다. 파지의 최적 단일농도는 농도가 가장 넓은 범위의 마이크로패닝 스코어(0 내지 4+)를 꼭 나타내는 농도이며, 따라서 시험할 클론중에서 가장 큰 식별을 허용한다. 그것은 스코어가 계열희석에 의해 얻은 파지의 몇가지 농도 각각에서 결정되는 경우 6개의 랜덤하게 선별된 클론의 마이크로패닝 작용에 기초한다. 항체와의 배양후, 미결합 파지를 씻어내고 결합파지의 양을 항체에 대한 파지삽입체의 친화성의 표시로서 사용한다. 결합된 파지의 양은 약산으로 용리에 이어서 중화 및E. coli의 감염에 의해 결정된다. 그 다음 감염된E. coli의 수를 테트라사이클린을 함유하는 한천플레이트에 미생물을 플레이팅한 다음 각 클론에 의해 달성된 콜로니 밀도를 결정함으로써 정량한다.

(iii) 파지-포획 ELISA

파지포획 ELISA 시험은 마이크로패닝분석의 비교적 낮은 긴축조건과 파지-또는 펩티드-ELISA 분석의 높은 긴축조건간의 갭을 다리놓기 위해 중간수준 분석을 제공하기 위해 개발되었다. 예비연구는 일부 항체제제가 마이크로패닝에 의해 너무 많은 포지티브 클론을 제공하나 파지-ELISA 또는 펩티드-ELISA에 의해 아무것도 제공하지 않음을 나타낸다. 하기한 파지-ELISA의 제한은 p-III의 단지 5개의 사본이 각 파지에 위치되고 웰에 피복된 많은 수의 파지로도 삽입체의 몇개의 사본이 제공된다는 것이고, 검출은 항체가 삽입체에 대해 매우 높은 친화성을 가질 것을 요한다. 파지-포획 ELISA로 신호는 많이 증폭되며 이것은 항체와 삽입체간의 낮은 친화성의 안정한 상호작용의 검출을 용이하게 한다.

파지-포획 ELISA는 다음 단계들로 구성된다. 마이크로타이트레이션 웰은 aPL 항체로 코팅되고 파지 클론은 마이크로패닝 분석에서와 같이 첨가된다. 미결합 파지를 씻어내고 결합파지의 양을 파지의 주 코트 단백질을 결합하는 효소 콘주게이트된 염소항혈청을 사용하여 정량한다. 파지-포획 ELISA를 사용하여 스크리닝된 파지는 많은 aPL 항체와 반응하며 후속 ELISA 분석에서 강한 신호를 제공한다. 이 중간체 수준의 감도는 펩티드 합성 노력에서 더 큰 효율을 허용하는데, 거의 없는 마이크로패닝-포지티브 파지가 파지-포획 ELISA 포지티브이기 때문이다. 그 결과, 포지티브 파지-포획 ELISA 파지로부터 합성된 펩티드는 일반적으로 면역반응성이다.

(iv) 파지-ELISA

파지 선별의 이 방법은 삽입체의 스크리닝 항체에의 매우 단단한 결합을 요한다. 파지는 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰에 직접 코팅되고 스크리닝항체와 함께 배양된다. 미결합 항체를 제거하기 위해 세척후, 항-사람 IgG 알칼리성 포스파타제 콘주게이트를 파지에 결합된 어떤 aPL 항체도 결합하기 위해 첨가한다. 그 다음 aPL 항체를 웰에 비색 기질을 첨가함으로써 검출하는데 이것은 본 분야에 잘 공지된 방법에 따라 알칼리성 포스파타제와 반응할 것이다.

(v) 콜로니 블롯

이 분석은 바이오패닝된 파지에 의해 감염된E. coli의 대규모 콜로니 스크리닝을 허용한다. 이 과정은 면역반응성 클론을 확인하기 위한 파지-ELISA에의 대안이며 시험에 앞서 개개 파지클론의 배양을 요하지 않고 비교할 만한 감도 수준을 나타낸다. 이 분석에서, 1회의 바이오패닝으로부터 파지에 의해 감염된E. coli는 대직경 니트로셀룰로스(NC)막에 펼쳐지고 테트라사이클린을 함유하는 한천 플레이트의 표면에서 하룻밤 배양한다(Barbaset al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 7978-7982). 각 콜로니는 동일한 서열들을 함유하는 파지에 의한 감염을 가져온다. NC상의 몇개의 복제전사 블롯은 이 NC "마스터"를 사용하여 만들어지며 한천판의 표면에서 성장하도록 허용된다. 블롯상의 파지-감염된 콜로니의 화학적 및 효소학적 분쇄후, 파지는 웨스턴 블로팅, 즉 염색 또는 이뮤노블로팅에서 보통 사용되는 기술에 의해 프로브될 수도 있다. 블로킹된 블롯은 스크리닝 aPL 항체와 배양될 수도 있다. 미결합 항체를 제거하기 위한 세척 후, 항-사람 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제 콘주게이트를 파지에 결합되는 어떤 aPL-항체에도 결합하도록 첨가한다. 비색기질의 첨가는 더 이상의 연구를 위해 클로닝될 수도 있는 면역특이적 파지를 나타내는 마스터 플레이트에서 분리된 콜로니를 위치시키도록 해준다.

(vi) 펩티드-ELISA

상기한 분석법에서 가장 잘 반응하는 파지의 펩티드 삽입체 서열을 결정하기 위한 DNA 서열결정에 이어서, 본 분야에 잘 알려져 있는 표준 Fmoc 펩티드 화학을 사용하여 대응펩티드를 만든다. 펩티드-ELISA 분석을 위해, 펩티드는, 예를들어 분지된 4가 분자로서 만들어질 수 있고, 즉 각 분자는 4개의 삽입체 사본을 갖는다. 이러한 분자는 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰을 코팅할 수 있고 여전히 항체에 의한 결합을 허용하기 위해 용액에 노출된 에피토프를 갖는다. 4가 펩티드는 다수 항원성 펩티드(MAPS)(Posnettet al.(1988)J. Biol. Chem 263: 1719-1725)에 대해 사용된 방법과 유사한 처음 두개의 커플링에서 분기점으로서 리신을 포함시킴으로써 합성된다. 글리신-세린-글리신-세린으로 구성되는 스페이서가 각 암에서 리신 다음에 첨가되고 그 다음 파지에서 발견된 골격아미노산을 포함하는 삽입체가 가해지며, 카르복실말단에서 프롤린-글리신 그리고 아미노말단에서 알라닌-글리신-프롤린이 첨가된다. 합성에서 모든 아미노산은 표준 Fmoc 방법을 사용하여 한번에 하나가 첨가된다.

그 다음 이들 펩티드를 ELISA에 의해 분석하는데 이것은 마이크로타이트레이션 웰에 펩티드를 코팅한 다음 그것들의 반응성을 표준 ELISA 포맷에서 aPL 항체와의 그것들의 반응성을 분석함으로써 수행된다. 실제로, 펩티드는 보통 원래의 스크린 항체에 매우 강하게 결합하고 다른 aPL항체와의 어떤 교차반응성을 나타낸다. 비-aPL 항체의 대조표준은 비특이적 결합펩티드를 제거하기 위해 포함된다.

(vii) 경쟁적 결합 펩티드-ELISA

일단 ELISA-포지티브 펩티드가 확인되면, 그것들의 aPL 항체에 대한 상대적인 결합친화성을 정량하고, 두 펩티드가 펩티드-경쟁 ELISA 분석법을 통해 주어진 환자 혈청에서 같은 집단의 항체를 결합하는지의 여부를 결정하는 것이 필요하다. 이 분석법에서, 여러가지 단량체 펩티드가 마이크로타이트레이션 플레이트웰에 코팅된 4가 펩티드와 경쟁한다. 분석을 수행하기 위해, 평가할 펩티드는 단량체로서, 즉 표준 Fmoc 화학을 사용하여 4가 펩티드의 합성에 사용된 리신분지없이 합성된다. 그 다음 단량체 펩티드를 정제하고 기지의 농도들에 용해시킨다. 마이크로 타이트레이션 플레이트의 웰을 aPL 항체에 결합하는 것으로 알려진 4가 펩티드로 코팅한다. 단량체 펩티드의 계열희석액을 aPL 항체의 일정한 희석액과 배양시킨다. aPL 항체의 희석액은 항체를 4가 펩티드에 대해 적정하고 적정곡선의 하향기울기에서의 희석액을 선별함으로써 사전에 결정되었다. 항체와 단량체 펩티드를 한 시간동안 배양한 후, 항체/펩티드 용액을 마이크로타이트레이션 웰에 첨가하고 표준 비색 ELISA를 수행한다. aPL 항체의 4가 펩티드와의 결합을 감소시키는 각 단량체 펩티드의 농도는 각 웰에 대해 얻은 비색판독 내용들을 도시함으로써 결정된다. 50% 저해지점이 단량체 펩티드에 대한 상대적인 결합강도의 척도로서 사용된다.

이 분석법의 변형은 4가 펩티드의 대신에 사람 β₂-당단백질 I/카르디올리핀(β₂-GPI/CL)으로 코팅된 마이크로타이트레이션 플레이트를 사용하고, β₂-GPI/CL에 대한 에피토프에의 aPL 항체의 결합을 차단하는 단량체 펩티드의 능력을 시험한다. 이 분석에서 최적화된 농도에서 IgG 고갈된 사람혈청을 β₂-GPI의 공급원으로서 사용한다. 여러농도에서의 단량체 펩티드를 플레이트기질로서 4가 펩티드를 사용하는 분석법에 유사한 방법으로 최적화된 농도의 aPL항체와 배양한다. (β₂-GPI/CL)플레이트에서 aPL/펩티드의 배양에 이어서, 50% 저해에 요구되는 항체결합 및 펩티드 농도는 4가 분석법에서와 같이 최대흡광도의 절반에서 결정된다.

이 분석의 추가의 변이는 Nunc Maxisorp 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰상에서 직접 코팅된 β₂-GPI에의 aPL 항체 결합을 차단하기 위한 단량체 펩티드의 능력을 시험한다.

(viii) 형광 분극 펩티드결합 분석

이 분석은 aPL 항체에의 펩티드의 직접 결합을 검출한다. aPL 항체는 β₂-GPI(항원)에 결합하기 때문에, ELISA 경쟁적 저해분석은 aPL 항체에의 펩티드 결합으로 인한 저해 뿐만 아니라 β₂-GPI에의 결합으로 인한 저해를 나타낼 수 있다. 항체에의 결합은 펩티드가 관용원으로서 작용하는데 필요하기 때문에, 펩티드가 aPL 항체에 직접 결합할 수 있는 것이 확립되는 것이 본질적이다. 이 분석은 두 개의 aPL 항체, ACA-6501 및 ACA-6701에 결합하는 펩티드에 대한 오염균의 분리측정에 사용된다. 그러나, ELISA 분석은 형광 분극 분석보다 항체에 덜 요구되기 때문에 높은 스루풋 스크리닝에 유용한 반면에, ELISA-포지티브 펩티드는 aPL 항체와 직접 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 형광 분극 분석에 의해 더 평가되어야 한다.

(ix) 치환 및 결실 합성에 의한 결합에의 아미노산 기여도의 평가

관용성 유발에 대한 원하는 에피토프는 가능한 한 많은 aPL 항체와 가능한 한 강한 상호작용을 가져야 하나 어떤 불필요한 잔기도 함유하지 않아야 한다. 에피토프의 최소 구성을 유도하기 위해, 각 펩티드의 유사체는 (i) 주어진 잔기, 예를들면 카르복실 및/또는 아미노말단에서 골격잔기가 결핍된 것이 만들어지거나, 또는 (ii) 에피토프 라이브러리 스크린에서 발견된 서열과 다른 아미노산 치환이 만들어진 것이 만들어진다. 이들 아미노산 치환은 자연적인 것일 수도 있고, 예를들면 루신에 대한 이소루신이고, 또는 비자연적인 것 예를들면 프롤린에 대해 알파메틸프롤린일 수도 있다. 그 다음 이들 결실 및/또는 치환의 효과는 펩티드-경쟁 ELISA를 통해 측정된다.

(x) β₂-GPI의 제5도메인의 돌연변이 유발에 의한 aPL 혈청 특이성의 그루핑

일반적으로 효과적인 관용원에 대해, 대다수의 환자에서 aPL 항체의 주부분을 결합해야 한다. 다른 환자들로부터 몇가지 항체들이, 표적 에피토프를 함유하기 위해 다른 것들에 의해 제안된 β₂-GPI의 84가지 아미노산 제5도메인내에서 동일한 잔기들을 결합하는지를 결정하는 것이 중요하다. 만일 몇가지 항체가 동일한 잔기를 결합한다면, 펩티드의 구조데이타로부터 유도된 단일 미모토프가 제조될 수 있고 이것은 모든 항체와 반응하게 될 것이다. 한편, 만일 항체가 다른 잔기들에 결합한다면, 독특한 관용원이 각 항체에 대해 요구될 것이다. 부위-지향 돌연변이 유발은 aPL 항체결합에 수반된 중요잔기들이 β₂-GPI의 제5도메인에 거주하는지를 확인하기 위해 수행되었다. 결과된 돌연변이 β₂-GPI를 몇개의 aPL 항체와의 반응성에 대해 분석하였다. 결과는 확정적이 아니었다. β₂-GPI와 글루타티오닌 S 트랜스퍼라제(GST)의 제5도메인으로 이루어지는 융합 단백질을 A. Steinkasserer로부터 얻고E.coli에서 발현시켰다(Steinkassereret al.(1992)FEBS Lett. 313: 193-197). 이 융합단백질은 ACA ELISA에서 본래의 β₂-GPI를 성공적으로 치환하였다. 아미노산치환은 표준 부위-지향돌연변이 유발을 사용하여 조작된다.

I.합성 aPL 에피토프의 분리

재발성발작, 태 상실, 낭창 및 3개의 대동맥밸브 대체의 병력이 있는 GPL 스코어 151(고 역가)인 환자로부터의 항체 ACA-6501을 카르디올리핀 리포좀에서 면역친화성 정제하였다. 항체를 xy, xyz, xy'z, 및 특수 pro/cys-결합된 7량체 라이브러리를 사용하여 4개의 별도의 파지라이브러리 스크린에서 사용하였고 여기서 이것의 스크린을 토대로 Arg는 제7위치에 고정되었다. 표 1에 나타낸 바와같이, 마이크로패닝한 파지에서 36개의 서열이 얻어졌다(140개 시험한 것중에서 임). 이것들은 아주 상동이었고 6 및 7위치에서 보존된 DR 잔기가 현저히 눈에 띤다. 합치서열은 CLLLAPDRC이다. 이 상동성에도 불구하고 단지 7개의 파지(표 2참조)가 파지-ELISA 비색시험 후 포지티브이었다. xy'z 파지를 친화성 정제된 ACA-6626(높지만 ACA-6501 보다 낮은 역가를 갖는 환자로 부터임)으로 스크리닝 한 것은 파지-ELISA 시험한 5개의 독특한 서열을 수득하였다. ELISA 면역콘주게이트를 화학발광기질로 전개했을때, 색 포지티브인 것은 없으나 두개가 포지티브이었다. ACA-6626과 연관된 서열 특색은 ACA-6501로 나타난 것과 관련은 있으나 다르다(표 3참조). 두 항체는 열린 프로결합된 서열 보다 시스-결합된(아마도 고리화되고 구속되어 있음) 에피토프가 바람직하다.

ACA-6501 파지 라이브러리 서열

클론	서열	클론	서열
xy 라이브러리
2101	CNILVLDRC
xyz 라이브러리
5A12	CLILAPDRC	3C10	CILLAKNRC
2D7	CLLLAPDRC	3C5	CIVLVPDRC
3B6	CLVLALDRC	2F4	CLVIALDRC
3E4	CLFVALDRC	5B1	CWFRSQSSC
3E7	CILLAHDRC	3E11	CSPILRGNC
2H1	CIILAPGRC	3E8	CHKFFWLTC
xy'z 라이브러리
2A10	CTILAPDRC	2D12	CLVLAADRC
2G12	CLLITPDRC	3B10	CLLLAPDRC
2G11	CLLITHDRC	3F2	CFFHFDHSC
2F10	CNILVLDRC	2D3	CPLHTHHTC
2E3	CPLITHDRC
커스텀(X) ₆ R라이브러리
G11	CTILTPDRC	1A4	CNLLALDRC
2H5	CTILTPDRC	2H6	CNLLAIDRC
2H2	CTILTLDRC	1C3	CLLLAIDRC
2H10	CTLLTPDRC	1D10	CTIITQDRC
2E10	CIQLTPDRC	2H4	CNIITRDRC
1B7	CHLLTPDRC	2G12	CILHAAHRC
2H1	CLILTPDRC	1A9	CSSKSYWRC
2H12	CSILAPDRC
xy'z 라이브러리, 콜로니 블롯 스크리닝 분석
CB2	CILLARDRC

ACA-6501 비색 ELISA-포지티브 파지

클론	서열	클론	서열
5A12	CLILAPDRC	3B6	CLVLALDRC
2H1	CLILTPDRC	2G11	CTILTPDRC
3B10	CLLLAPDRC^*	3E7	CILLAHDRC
2H2	CTILTLDRC
^*는 합치 또는 평균서열에 해당한다.

ACA-6626 xy'z 파지 라이브러리 서열

클론	서열	클론	서열
4B11	CGNAADARC	4G7	CTNLTDSRC
4D3	CTNWADPRC	4A2	CGNPTDVRC
4C7	CGNIADPRC

ACA-6644는 여기 기술된 방법에 따라 푸울화된 P-III 파지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된 또 다른 고 역가의 aPL 항체이다. 다음 서열들이 발견되었다.

ACA-6644/CBe GILLNEFA

ACA-6644/CBd GILTIDNL

ACA-6644/CBf GILALDYV

이들 서열은 모두 N-말단에서 파지 골격 잔기가 결핍된 성분 "z" 에피토프 라이브러리로부터 유도되었다. 펩티드로서 합성했을 때 서열은 ACA-6644 및 ACA-6501을 포함하는 몇개의 ACA 혈청과 면역반응성이었다. 분석은 도 4에 예시된 바와같이 ACA-6501로 사전에 얻어진 서열과 의심없는 상동성을 나타내었다.

ACA-6644/CBd	G ILTID NL
ACA-6501/2H2	CT ILTLD RC
ACA-6644/CBf	G ILALD YV
ACA-6501/2F10	CN ILVLD RC
ACA-6644/CBc	G ILLNE FA
ACA-6501/1D10	CT IITOD RC

이들 두 aPL 항체에 의해 스크리닝된 두개의 매우 유사하지 않은 공급원 라이브러리로부터 수렴서열 상동성은 서열이 본래의 표적항원에서 주된, 아마도 면역지배적인 영역을 모방할 수도 있음을 제안하다.

ACA-6701로 P-III라이브러리의 스크리닝은 고도의 내부상동성을 가지나 다른 aPL 항체로 사전에 얻은 다른 것들과 달리 두개의 독특한 서열을 수득하였다. 서열들은 다음에 나타낸 바와같다.

ACA-6701/3B1 L S D P G Y V R N I F H

ACA-6701/3E1 L T D P R Y T R D I S N F T D

수지 결합된 펩티드로서, 서열은 모혈청(ACA-6701)과 강하게 면역반응성이었고, 다른 aPL 항체와 최소한으로 교차반응성이었다.

친화성 정제된 ACA 항체로 랜덤 pIII파지 라이브러리의 연속 스크리닝은 초기에 시험한 모든 9개의 친화성 정제된 ACA 항체와 상당한 교차반응성을 나타낸 펩티드의 발견을 가져왔다. 이 펩티드 뿐만 아니라 4개의 나머지의 수행을 표 5에 나타낸다. 모든 5개의 펩티드에 대한 펩티드 서열은 표대로이다. 모두 본문에 기재한 대로 CL/β₂-GPI 플레이트를 사용하여 경쟁적 결합 펩티드 ACA ELISA를 사용하여 시험하였다.

펩티드 모노머에 의한 AffACA의 % 저해

펩티드	6626	6638	6641	6644	6701	7004	7005	6903	6501
펩티드	Ave.
6641/3G3	100	100	93	100	100	100	95	100	86
	97
1mg/mL
6501/3B10	76	87	52	55	51	87	47	69	60
	65
1mg/mL
6626/4C7	88	96	45	45	69	99	54	77	39
	68
1mg/mL
6701/3B1	43	65	43	37	96	72	23	51	41
	52
1mg/mL
6644/CBf	37	60	28	18	22	54	57	43	37
	39
200μg/mL
펩티드	서열
ACA-6641/3G3	AGP CLGVLGKLCPG
ACA-6501/3B10	AGP CLLLAPDRCPG
ACA-6626/4C7	AGPDNIADPRCPG
ACA-6701/3B1	AGP LSDPGYVRNIFHPG
ACA-6644/CBf	GILALDYVGG

다음 시험은 서열 AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)을 갖는 이 펩티드, ACA-6641/3G3은 많은 ACA 항혈청과 교차반응성인 것을 측정하였다. 이 펩티드의 화학 최적화는 절단, 합성 아미노산 치환 및 비-디술피드 고리화 연구에 의해 추구되었다.

랜덤 파지 라이브러리 스크리닝으로부터 선택된 몇개의 펩티드의 특색은 이하에 제시되어 있다.

ACA항체	파지 삽입체 서열
6501	CLLLAPDRC(3B10)
6626	CTNWADPRC
6641	CLGVLGKLC(3G3)
6644	GILALDYV
6701	LTDPRYTRDISNFTD
6707	CAHPDWDRC

J.친화성 정제된 IgG aPL항체와 aPL-관련 펩티드의 면역반응성

친화성 정제된 ACA-6501로 얻고 파지-ELISA-포지티브인 것으로 발견된 파지서열은 조합 합성펩티드 라이브러리에 대해 최근에 개발된 고체 지지체에서 합성되었다. 이 지지체, Rapp수지는 높은 펩티드 밀도를 가지며 제 1아미노산이 커플링되기전에 친수성 폴리에틸렌글리콜 스페이서를 사용한다. 합성은 항체결합연구에 이상적으로 적합한 수지결합된 펩티드를 가져왔다. 도 2에 나타낸 바와같이, 펩티드 5A12(서열 CLILAPDRC)는 정상 IgG를 상당히 결합하지 않으면서 미관련 대조구 펩티드 보다 극적으로 성능이 우수하였다. 유사한 결과가 시험한 다른 파지-ELISA-포지티브 펩티드로 얻어졌다. 나타낸 실험에서, 수지펩티드-결합된 친화성 정제된 ACA-6501 aPL항체는 면역 콘주게이트 색반응에 의해 검출되었다.

K.합성펩티드와의 aPL혈청항체 반응성

수지결합된 펩티드가 혈청을 사용하여 면역특이적으로 aPL을 결합할 수 있다는 발견은 aPL항체를 시험하는 능력을 상당히 향상시켰다. 도 3에 나타낸 바와같이, ACA-6626으로 스크리닝 하는 것으로부터 유도된 펩티드는 aPL 항혈청을 결합하였으나 정상혈청의 상당한 결합을 증명하지 않았다. 도 3은 또한 aPL 혈청을 향한 ACA 6501-5A12펩티드의 면역특이적 결합작용을 예시한다. 펩티드 5A12에 정상혈청의 결합은 나타내지 않은 데이타에서 전무이었다.

L.라이브러리 스크리닝 항체의 공급원이 아닌 aPL항혈청을 향한 합성 펩티드의 교차반응성

두개의 펩티드가 aPL혈청시험을 위해 선택되었고, 하나(5A12)는 ACA-6501스크린을 나타내는 것이고, 또 다른 것(4D3)은 ACA-6626스크린을 나타내는 것이었다. 도 4 및 도 5에 나타낸 바와같이, 펩티드의 각각은 스크리닝 항체의 모혈청과 선호적으로 반응하였다. 그러나, 상당한 정도의 교차반응성이 ACA-6501과 ACA-6626 사이에서 특히 검출가능하였다. GPL스코어가 낮거나 없는 19명 환자의 혈청과 중간내지 높은 GPL을 갖는 13개의 병변혈청의 조사를 수행하여 검출가능한 펩티드 결합을 갖는 13개의 병변샘플중 8개가 5A12 수지결합된 펩티드를 나타낸 한편, 19개 대조구샘플중 단지 2개가 낮은 펩티드 결합을 나타내었다. 이들 결과는 합성 펩티드가 발작환자를 돌볼때 진단 또는 예후 분석을 위해 유용하다는 것을 증명한다.

상기 I단원에 나타낸 바와같이, 하나의 합성 펩티드 6641/3G3을 몇개의 고 역가 ACA 항혈청에 대해 시험하였다. 이 펩티드는 도 14에 도시된 바와같이 시험한 막대한 대다수의 ACA 항혈청과 교차반응성임이 발견되었다. 6641/3G3은 1.8mg/mL에서 완전한 저해(〉80%)를 하는 10개의 ACA 항체중 10개와 투여량 의존 교차반응성을 증명하였고 이하 표 5에서 증명하는 바와 같이 ACA 항체에 특이적인 것으로 나타났다.

카르디올리핀/β₂-GPI-코팅된 플레이트와의 AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)ACA 혈청에 대한 교차반응성 데이타

ACA혈청번호	펩티드 LJP 688에 대한 IC₅₀, mg/ml
[1] 6501 RS, RFL[2] 6626 RS[3] 6635 RS[4] 6638 RS[5] 6641 RS[6] 664 RS[7] 6701 RS[8] 6903 RS[9] 7004 RFL[10] 7005 RFL평균±표준편차	0.8991.11.0910.810.89, 0.510.761.070.80.670.750.86±0.16
RS=재발성 발작RFL=재발성 태 상실

M.새로운 합성 펩티드 방법론

aPL 라이브러리 스크리닝에 의한 새로운 후보서열의 확인은 항체 결합에 대한 새로운 합성 펩티드의 시험을 요하였다. 공지의 펩티드 치환의 Rapp 수지로, 방사표지된 aPL IgG를 사용하여 포화결합분석 및 평형측정과 같은 정량적 결합연구를 수행하는 것이 가능하다.

펩티드 합성은 선택적인 합성에 의해 미모토프의 분자절개를 허용한다. 이것은 항체결합을 증강시키는 목적으로 사슬을 따라 각 아미노산의 변형을 포함한다. 선택적인 합성은 서열에서 각 아미노산의 상대적인 중요성을 나타낸다. 필요하다면, 특정잔기 위치에서 선택적인 치환은 T세포분석의 동안에 발견된 어떤 T세포 증식성 반응성을 폐지하면서 B세포 반응성을 유지하도록 디자인될 수 있다.

펩티드 6641/3G3(LJP 688)은 많은 분석을 하였다. 분석은 N-말단 및 C-말단 둘다에서 절단, 디술피드 치환, 2 내지 8위치에서 아미노산에 대한 알라닌과 글리신의 치환, 2,4,5 및 8위치에서 분지된 지방족 아미노산의 치환,,α-메틸아미노산의 치환을 포함하는 펩티드의 구조에 영향을 미치는 아미노산의 치환, 위치 7에서의 염기성 아미노산의 치환, 2내지 9위치에서 D-아미노산의 치환 및 1 내지 9위치에서 N-α-메틸 아미노산의 치환을 포함하였다. 결과를 표 9에 이하에 나타낸다. 이들 치환 및 절단의 구조/활성 관계를 표 8에 나타내었다.

펩티드 3G3의 최적화

약기Hc..... 호모시스테인Cy..... 시클로헥실알라닌tL..... 3차 루신ML..... 알파메틸루신IV..... 알파메틸, 알파아미노부티르산MP..... 알파메틸프롤린mA..... 알파메틸알라닌aiB.... 아미노이소부티르산pG..... 페닐글리신cG..... 시클로프로필글리신dA..... D 알라닌dP..... D 프롤린dL..... D 루신dV..... D 발린dK..... D 리신nC..... N 알파-메틸시스테인nL..... N 알파-메틸류신nG..... N 메틸글리신nV..... N 알파-메틸발린nK..... N 알파-메틸리신mK..... N 엡실론-메틸리신Pe..... 페니실라민By..... 부티로일Pp..... 프로프리오닐Or..... 오미틴

교차반응성 ACA 에피토프의 구조활성관계

구조	상대활성
AGPCLGVLGKLCPG(3G3)(LJP 688)	100
CLGVLGKLC(LJP 690)	3.5
CLGVLAKLC	1.8
CLGVL_PGKLC	1.4
CLG_dV_dLGKLC	5.9
HCLGVLGKLC(티오에테르)	1.6
SLGVLGKLS	∞
CLGVAGKLC	∞
CLGVLGALC	∞

N.펩티드면역 반응성을 증강시키고 프로테아제 공격에의 저항성을 주기 위한 α-메틸아미노산 치환의 사용

프롤린 잔기는 폴리펩티드의 사슬구조에 대한 그것들의 영향으로 인해 특별한 중요성을 갖는다. 그것들은 종종 구형 단백질의 표면에 역 턴으로 일어난다. 본 발명의 파지 에피토프 라이브러리에서 모든 랜덤 펩티드 삽입체는 경계프롤린에 의해 공격받는다. 게다가 ACA-6501로 발견된 대부분의 미모토프는 제3의 프롤린을 갖는데, 이것은 컴퓨터 기초의 예측을 토대로, β-턴의 일부로서 존재하는 것같다. β-턴 모방은 작은 펩티드들로 역 턴 구조의 안정성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 모방은 프롤린 유사체인 ( S )-α-메틸프롤린(α-MePro)이고, 이것은 턴구조를 안정화시키는 데다가, 프로테아제 퇴화에 저항성을 부여한다. 프로테아제 저항성은 원형질에서 작용하도록 디자인된 잠재적 약물에 대한 바람직한 성질이다. 펩티드 ACA-6501/3B10AGP CLLLAPDRC PG(삽입체 진하게)는 합치펩티드이다. 그것은 35개의 다른 상동성 서열과의 비교를 토대로 각 위치에서 가장 우세한 잔기를 특징으로 하는 서열을 갖는다. 그것의 대표적 특성으로 인해, 서열은 많은 체계적인 변형 및 삭제를 받고 그것의 활성은 이어서, aPL 항체 결합에 의해 평가되었다. 가장 중요한 발견중에는 3 및 9위치에서의 프롤린이 활성에 중요하다는 발견이었다. 프롤린-3은 파지골격으로부터 유도되고 랜덤 삽입체의 일부가 아니다. 가장 극적인 효과는 9위치에서 프롤린을 α-MePro로 치환함으로써 얻어졌다. 이 치환은 면역반응성에 있어서 6배 증강을 가져왔다.

펩티드 6641/3G3에서 수행된 α-메틸 및 N-α-메틸아미노산 치환 연구의 결과를 상기 표 8에 나타내었다.

20개의 자연발생 아미노산 및 그것의 호모유사체 및 비유사체 이외에 몇가지 다른 부류의 알파 아미노산이 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 다른 부류의 예로는 d-아미노산,N ^a-알킬 아미노산, 알파-알킬 아미노산, 환식 아미노산, 키메릭 아미노산 및 이종혼합의 아미노산을 들 수 있다. 이들 비자연 아미노산은 생물활성 폴리펩티드를 변형하는데 널리 사용되어 단백질분해 퇴화에 대한 저항성을 증강시키고 또는 구조 억제를 생물활성 개선에 부여하였다(Hrubyet al. (1990)Biochem. J 268:249-262; Hruby and Bonner (1995)Methods in Molecular Biology 35:201-240).

가장 흔한N ^a-알킬 아미노산은N ^a-메틸 시스테인(nC),N ^a-메틸 글리신(nG),N ^a-메틸 루신(nL),N ^a-메틸 리신(nK) 및N ^a-메틸 발린(nV)과 같은N ^a-메틸 아미노산이다. 알파-알킬 아미노산의 예로는 알파-메틸 알라닌(niA), 알파-아미노이소부티르산(aiB), 알파-메틸 프롤린(mP), 알파-메틸 루신(mL), 알파-메틸 발린(mV), 알파-메틸알파-아미노부티르산(tv), 디에틸글리신(deG), 디페닐글리신(dpG) 및 디시클로헥실 글리신(dcG)을 들 수 있다(Balararn (1992)Pure ＆ Appl. Chem. 64:1061-1066; Tonioloet al.(1993)Biopolymers 33: 1061-1072; Hindset al. (1991)Med Chem.34: 1777-1789).

환식 아미노산의 예로는 1-아미노-1-시클로프로판 카르복실산(cG), 1-아미노-1-시클로펜탄 카르복실산(Ac5c), 1-아미노-1-시클로헥산 카르복실산(Ac6c), 아미노인단 카르복실산(ind), 테트라히드로이소퀴놀린 카르복실산(Tic) 및 피페콜린산(Pip)을 들 수 있다(C. Toniolo (1990)Int'l. J. Peptide Protein Res. 35:287-300; Burgesset al.(1995)J. Am. Chem. Soc. 117:3808-3819). 키메릭 아미노산의 예로는 페니실라민(Pe), 시스테인과 발린의 조합, 4R- 및 4S-메르캡토프롤린(Mpt), 호모시스테인 및 프롤린의 조합 및 4R- 및 4S-히드록시프롤린(hyP) 및 호모세린과 프롤린의 조합을 들 수 있다. 이종혼합의 알파 아미노산의 예로는 오미틴(Or),N ^ε-메틸 리신(mK), 4-피리딜 알라닌(pyA), 4-피페리디노 알라닌(piA) 및 4-아미노페닐알라닌과 같은 염기성 아미노산 유사체; 시트룰린(Cit) 및 3-히드록시발린과 같은 산성 아미노산 유사체; 1-나프틸알라닌(1-Nal), 2-나프틸알라닌(2-Nal), 페닐글리신(pG), 3,3-디페닐알라닌(dpA), 3-(2-티에닐)알라닌(TE) 및 할로페닐알라닌(예를들면, 2-플루오로페닐알라닌 및 4-클로로페닐알라닌)과 같은 방향족 아미노산 유사체; t-부틸글리신(즉, 3차 루신(tL)), 2-아미노부티르산(Abu), 시클로헥실알라닌(Cy), 4-테트라히드로피라닐 알라닌(tpA), 3,3-디시클로헥실알라닌(dcA) 및 3,4-데히드로프롤린과 같은 소수성 아미노산 유사체를 들 수 있다.

알파-아미노산 이외에, 베타 아미노산과 같은 다른 것도 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 다른 아미노산의 예로는 2-아미노벤조산(Abz), β-아미노프로판산(β-Apr), γ-아미노부티르산(γ-Abu) 및 6-아미노헥산산(ε-Ahx)을 들 수 있다. 4-클로로부티르산(By) 및 3-클로로프로피온산(Pp)과 같은 카르복실산도 환식 티오에테르 펩티드의 합성에서 N-말단에 제1잔기로서 사용될 수도 있다.

O.환식 티오에테르 유사체의 제조

본 발명의 방법에 의해 확인된 모방 펩티드는 티오에테르 치환을 함유하도록 더 변형될 수 있다. 환식 디술피드 유사체의 환식 티오에테르 유사체로의 변형은 유사체 콘주게이트의 혈장반감기를 연장할 것이며 따라서 더 낮은 투여량을 요한다. 환식 티오에테르 유사체는 또한 환식 디술피드 폴리펩티드로 종종 일어나는 디술피드 결합 교환의 문제를 제거한다. 게다가, 환식 티오에테르 유사체는 또한 T세포에의 MHC 클라스II 표현을 방해할 수도 있고, 따라서 아네르기의 유발을 용이하게 한다. 최종적으로, 환식 티오에테르 유사체는 원자가 플랫폼 분자 콘주게이트의 생산에 사용된 티올의존 콘주게이션 반응에 유용하다.

네개의 환식 티오에테르 유사체는, 전부 여기에 참고로 포함되는 변리사 정리번호 252312006600의 공동소유의 공동계류중인 특허출원에 기술된 방법론에 따라 제조되었다. Rink^TM아미드 4-메틸 벤즈히드릴 아미노 수지나 아니면 MBHA수지를 사용하여 6641/3G3의 전길이 펩티드 유사체를 제조하고 클로로 펩티드로 변환시키고 고체 지지체로부터 절단한 다음 환식으로 하였다. 이하 티오에테르반응식 참조. 적합한 환식 티오에테르 유사체는 이하에 나타낸 유사체를 포함한다.

환식 티오에테르 반응식 1

대안으로, 티오에테르 유사체는 이하 반응식에 따라 제조된다.

환식 티오에테르 반응식 2

다음의 유사체는 고리 티오에테르 반응식 2에 따라 만들어진 유사체로서 대표적인 것이다.

예로 든 환식 티오에테르 유사체는 ACA항체 ACA 6501 및 ACA 6701에 대한 활성에 대해 시험하였다. 결과를 이하 표 10에 나타내었다.

IC₅₀값(μg/0.1mL)

티오에테르	ACA 6501	ACA 6701
CCTE, LJP 698	11.0	5.0
HCTE, LJP 699	4.6	3.0
CHTE, LJP 702	9.2	3.2
HHTE, LJP 703	8.0	3.6
LJP 690	10.0	4.0
CTE A	0.08
CTE B	0.5
CTE C	0.9
CTE D	3.2
CTE E	6.3

HCTE 유사체, LJP 699는 LJP 688인 AGPCLGVLGKLCPG의 절단된 변형인 CLGVLGKLC인 기준 펩티드인 LJP 690을 능가하는 성능을 가졌다.

여기 인용된 기사, 특허 및 특허출원은 전부 본문에 참고로 포함된다. 다음의 실시예는 본 발명과 그것의 독특성을 더욱 예시하는 것을 의도한다. 이들 실시예는 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.

실시예 1:혈청 6501에서 항카르디올리핀 항체(ACA)의 측정

이뮬론 I 마이크로타이트레이션 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA)의 짝수 번호부여된 웰을 웰당 30μL 에탄올중의 50㎍ 카르디올리핀(Sigma Chemical, St. Louis, MO)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 건조시키고 실온(RT)에서 2시간동안 인산-완충염수(ABS/PBS)중의 10% 성체 소혈청(ABS)(Irvine Scientific Co., Santa Ana, CA) 200μL로 차단시켰다. 플레이트를 aPL 표준 및 시험 혈청, ACA-6501 10μL를 첨가하기 전에 트리스-완충 염수(TBS)로 5회 세척하였다. aPL 표준(APL Diagnostics, Inc., Louisville, KY)을 제조자 지시에 따라 재구성하고 10% ABS-PBS로 1:50으로 희석하였다. 10% ABS-PBS로 일련의 희석으로 1:50 내지 1:2,000으로 희석된 시험 혈청, ACA-6501을 선택된 2벌 웰에 첨가하고 RT에서 2시간 배양하였다. 플레이트를 TBS로 5회 세척하고 10% ABS-PBS중의 1:1,000 염소-항-사람-IgG/알칼리성 포스파타제 콘주게이트(Zymed, South San Francisco, CA, Cat. No. 62,8422) 10μL를 첨가하고 RT에서 1시간 배양하였다. 다시, 플레이트를 TBS로 5회 세척하고 탈이온화된 물로 1:26으로 희석시킨 후에 HCl로 pH 10.15로 조정한 0.13M PPMP 및 7.8M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올의 모액으로부터 제조된 페놀프탈레인 모노포스페이트(PPNM) 기질용액(Sigma, Cat. No. P-5758) 100μL를 첨가함으로써 분석을 전개하였다. 약 30분 후에, 반응을 웰당 0.2M 이염기성 인산나트륨(Mallinckrodt, Analytical Reagent) 50μL을 첨가함으로써 차단시켰다. 광학밀도를 마이크로플레이트 자동판독기(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, Model EL311)로 550nm에서 판독하였다. 홀수번호 부여된 대조구 웰(블랭크, 카르디올리핀(CL)없음)의 광학 밀도를 짝수번호 부여된 웰의 광학밀도로부터 감하였다. aPL 표준의 흡광도 판독을 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 도시하여 GPL(IgG 인지질) 표준 곡선을 생성하였다. 희석된 6501 시험 혈청 흡광도 판독을 GPL 표준 곡선에 기초한 GPL 기록을 계산하기 위해 사용하였다.

변형된 ACA ELISA에서, Nunc Maxisorp 마이크로타이트레이션 플레이트를 PBS중에 구성된 100μL/mL β₂-GPI로 코팅하고 나서 실온에서 1시간동안 배양하였다. 이 단계에 이어서, 마이크로플레이트를 실온에서 2시간동안 2% 비지방 우유 및 0.4%(w/v) Tween 80 함유 PBS로 차단시켰다. 희석제 및 차단제로서 비지방 우유/Tween을 사용하지 않고 β₂-GPI로 직접 코팅한 Nunc 마이크로플레이트를 β₂-GPI를 가하기 전에 카르디올리핀으로 먼저 코팅한 Dynatech 마이크로플레이트에 대해 이전에 기재한 대로 ACA IgG 결합 연구에 사용하였다.

실시예 2:혈청 6501로부터 항카르디올리핀 항체(ACA) 정제

25mL 둥근바닥 플라스크(Kontes Scientific Co., Vineland, N.J.)에 카르디올리핀(Sigma Chemical St. Louis, Mo., #C-1649) 1.2mL, 콜레스테롤(Sigma Diag., St. Louis, MO., #965-25) 0.464mL, 클로로포름 mL당 5mg 디세틸포스페이트(Sigma Chemical, St. Louis, MO, D-2631) 0.088mL의 혼합물을 회전증발기(Buchi, Switzerland)에서 약 5분간 건조시켰다. 용매를 제거한 후에, 0.96%(wt./vol.) NaCl(J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ, Baker 분석시약) 2mL를 첨가하고 1분간 Vortex Genie Mixer(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY)에서 혼합하였다. 리포좀 현탁액을 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 그동안, 혈청 6501은 8℃에서 10분간 Sorvall RT 6000 원심분리기(Dupont Co. Wilmington, DE)에서 600×g에서 회전시켰다. 상청액 4mL를 제조된 리포좀 현탁액 1mL가 들어 있는 25mL 둥근바닥 플라스크에 넣고 혼합물을 4℃에서 48시간동안 오비탈 쉐이커, Tektator V(Scientific Products, McGraw Park, IL)에서 중간속도로 교반하면서 배양하고 37℃에서 2시간 더 배양하였다. 냉각한 TBS 20mL을 첨가하고 그 혼합물을 50mL 폴리카보네이트 원심분리관(Nalge Co., Rochester, NY)으로 옮기고 SS-34 로터(Sorvall-Dupont, Wilmington, DE)의 RC3 원심분리기에서 4℃에서 15분간 27,000×g에서 원심분리하였다. 침전물을 RC3 원심분리기를 사용하여 냉각한 0.96% NaCl 25mL로 3회 세척하였다. 펠릿을 TBS중의 n-옥틸-p-D-글루코피라노시드(Calbiochem, La Jolla, CA)의 2%(wt/vol)용액 1mL에 용해하고 1M 아세트산의 15배 층부피로 전세척하고 TBS의 15배 층부피로 평형화된 0.6mL 단백질 A/교차결합된 아가로스(Repligen Corporation, Cambridge, MA)에 적용하였다. 항체-단백질 A/아가로스 칼럼을 2% 옥틸글루코피라노시드 40배 층부피로 세척하여 지질을 제거한 후, 280nm에서 용리액의 광학밀도가 기준선에 도달할 때까지 TBS로 강하게 세척하였다. 결합된 항체를 1M 아세트산으로 용리하였다. 1mL 분획들을 수집하고, 즉시 분획당 0.34mL 3M 트리스(Bio-Rad, 전기영동 구배 시약)로 중화하고 얼음욕에서 유지하였다. 각 분획의 광학밀도를 분광광도계(Hewlett-Packard, 8452A Diode Array Spectrophotometer, Palo Alto, CA)로 280nm에서 측정하였다. 항체를 함유하는 분획들을 푸울화하고 농축하고 제조자의 프로토콜에 의해 Centricon-30 농축기(Amicon Division, W.R. Grace ＆ Co., Beverly, MA)에서 TBS로 4회 세척하였다. 혈청 6501 4mL로부터 정제된 항체의 최종 수율은 분액을 1mg=1.34 0D280인 농도로부터 280nm에서의 광학밀도를 판독함으로써 측정하였다. 얻어진 평균 수율은 혈청 6501 4mL로부터 750㎍ 항체였다. 정제된 항체를 ACA 활성에 대해 시험하고 Laemmli SDS-PAGE로 순도를 체크하였다. β₂-GPI를 함유하는 친화성 흡착제는 시중에서 얻은 정제된 β₂-GPI(Perlmmue, Rockville, MD)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 CNBr-활성화된 아가로스(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ)또는 Affi-Gel 10(BioRad, Richmond, CA)을 사용하여 제조하였다. β₂-GPI 친화성 흡착제 함유 겔 컬럼 1mL에 TBS 1mL중의 리포좀-정제된 aPL IgG 100㎍까지 가하였다. 1시간후에, β₂-GPI를 결합하지 않은 어떤 IgG 및 오염균을 치환하기 위해 컬럼을 완충액으로 강하게 세척하였다. β₂-GPI 결합 IgG를 1M HOAc로 치환하고 분획은 상기한 바와같이 트리스로 중화시켰다. IgG 함유 분획을 푸울화하고 농축하고 상기한 바와 같이 완충교환시켰다.

실시예 3:p-III 라이브러리 벡터 제제의 제작

fUSE 5(Scott, J. K. and G. Smith, 상기 참조)를 p-III 라이브러리의 제작을 위한 벡터로 사용하고 Holmes, D.S. 및 M. Quigley (1981),Anal. Biochem. 144: 193의 방법의 변형을 사용하여 이중가닥 복제형(RF)을 발생시켰다. 간단하게, fUSE 5를 지니는E.coliK802 800mL 배양액을 37등급의 격렬한 교반으로 18시간동안 20㎍/mL 테트라사이클린을 함유하는 2YT 배지(Difco Labs, Ann Arbor, NU)에서 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 75mL의 STET에 재현탁시켰다. STET는 50mM 트리스/HCl pH 8.0, 50mM EDTA 중의 8% 수크로스로 구성되며 0.5% 트리톤 X-100을 함유한다. STET중의 리소자임 10mg/mL를 최종 농도인 1mg/mL로 첨가하였다. RT에서 5분 후에, 세개의 동일한 분액을 3.5분간 일시적 교반을 하면서 비등수욕에 넣었다. 점성 슬러리를 18000×G에서 30분간 원심분리하고 동일부피의 이소프로판올을 상청액에 첨가하였다. 용액을 -20℃로 냉각시키고 핵산을 원심분리로 수집하였다. RF를 Sambrooket al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2d ed., 1989)에 기재된 바와같이 CsCl 구배로부터 분리하였다.

랜덤 삽입체의 제조

삽입을 위한 DNA를 Cwirlaet al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382에 의해 기재된 "갭 듀플렉스" 방법에 의해 생성하였다. 이 방법에서, 중앙의 퇴화부분을 함유하는 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드의 각 말단상의 짧은 일정한 부분으로 둘러싸여 있다. 두개의 짧은 상보적 올리고누클레오티드를 어닐링하여 벡터를 분해하는데 사용된 제한 엔도누클레아제에 의해 생성된 편평말단에 상보적인 돌출을 소유하는 "갭 듀플렉스"를 형성하였다. 이 경우에 긴 퇴화된 올리고누클레오티드는 다음 서열을 가진다: 5'GGGCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG3' 여기서 N=A 또는 C 또는 G 또는 T, K=G 또는 T, 및 x는 랜덤 영역에서의 탄소수이다. EpiGS2를 퇴화 올리고누클레오티드의 5'말단에 대한 염기쌍으로 디자인하였고 서열 5'GGGTCCAGCCCCGT3'을 가진다. 유사하게 EpiGS3를 퇴화 올리고누클레오티드의 3'말단에 어닐링하도록 디자인하였고 서열 5'CAGCCCCCGG3'을 가진다. 정확하게 어닐링될때, 세개의 올리고누클레오티드는 "갭 듀플렉스"를 형성하고 이것은 Sfil로 자른 fUSE 5로 삽입되었을때 5'말단 부위의 랜덤 삽입체를 지닌 p-III의 판독골격을 복구시킨다.

상기 기재한 올리고누클레오티드를 폴리아크릴아미드 겔로부터 잘라냄으로써 제조하였다. 1nmol의 EpiGS2, EpiGS3 및 50pmol의 퇴화 올리고누클레오티드를 66μL 부피로 별도로 키나아제처리하였다. 그후 세개의 올리고누클레오티드를 푸울화하고 NaCl을 50mM에 첨가하고 그 혼합물을 5분간 65℃로 가열한 후 RT로 천천히 냉각시켰다. 어닐링된 올리고누클레오티드를 그후 얼음상에서 냉각시키고 즉시 fUSE5과 라이게이션 반응에 사용하였다. 라이게이션 반응액은 450μL의 총부피중의 Sfil로 완전히 분해된 fUSE 5 DNA 10μg, "갭 듀플렉스"용액 30μL 및 T4리가아제 1000U로 구성하였다. 라이게이션은 16℃에서 18시간 배양하였다. 그후 혼합물을 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시키고 그 침전물을 물 20μL에 용해하였다.

라이브러리 발생 및 증폭

라이게이션된 DNA를 전기영동에 의해E. coli로 도입하였다(Doweret al. (1988)Nucleic Acid Res.16:6127-6145). 동결된 일렉트로컴피덴트 MC 1061 세포(0.1mL)를 냉각한 2mm 큐벳에서 라이게이션된 DNA 4μL와 혼합하고 BTX 전기영동 장치(BTX Corp., San Diego, CA)로 25kV, 5.2mS 펄스를 받게 하였다. 펄스후 즉시 SOC, 세포생장배지(Dower et al., 상기 참조) 1mL를 첨가하였다. 5개의 분리된 전기영동을 수행하고 푸울화하고 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 이때, 샘플을 제거하고 희석하여 발생된 총 클론수를 측정하였다. 혼합물의 밸런스를 20μg/mL 테트라사이클린을 함유하는 2YT(1.6% 펩톤, 140, 1% 효모추출물 및 0.5% NaCl, Difco Labs, Ann Arbor, MI) 1L로 희석시키고 275rpm으로 교반하면서 37℃에서 18시간 성장시켰다. 파지를 PEG/NaCl 침전으로 2회 정제하고 0.02% 나트륨아지드를 함유하는 TBS 1.2mL에 재현탁하였다. 입자 수를 269nm에서 흡광도로 측정하였다. 파지의 역가를 영양결핍시킨E.coli10μL와 파지의 희석액 10μL를 혼합함으로써 측정하였다.

실시예 4:aPL 항체에 의한 p-III 라이브러리 스크리닝

친화성-정제된 ACA-6501(affACA-6501, 10μg; 1.44mg/mL 모액 7μL)를 0.5% 소혈청 알부민(BSA)을 가지는 TBS 100μL, pH 7.4의 최종부피중에 x,y 및 z 라이브러리(epi^xyz)[각각 11μL+8.5μL+2μL; 총부피=21.5μL, ∼10¹⁰클론]로부터 푸울화한 파지와 함께 실리콘화된 1.4mL 마이크로퓨지 폴리프로필렌관에서 RT에서 2시간 배양하였다. 이 배양동안 새롭게 영양결핍시킨E.coli, 균주 K-91을 제조하는 최종 단계들을 수행하였다. 37℃에서 250rpm 교반으로 5시간동안 2YT 배지에서 신선하게 성장시킨E.coli현탁액을 50mL 폴리프로필렌관에서 RT에서 10분간 1000×g에서 회전시켰다. 80mM NaCl 20mL를 채운E.coli펠릿에 가한 후 100rpm으로 37℃에서 45분간 배양하였다. 상기와 같이 원심분리 후에, 영양결핍시킨E.coli펠릿을 50mM 암모늄 포스페이트/80mM NaCl의 1mL에 현탁하고 나중에 파지 증폭에 사용하였다. 단백질 G-아가로스 비드를 TBS/BSA로 2X 세척하고 TBS/0.5% Tween-20으로 2회 세척하고 TBS/Tween 중의 50% 현탁액으로 4℃에서 저장하였다.

다음에 단백질 G-아가로스 비드 현탁액 200μL를 ACA-6501/파지혼합물에 가하고 배양을 RT에서 1시간 더 지속하였다. 이 때에, 혼합물을 냉각하고 냉TBS/Tween으로 3회 세척하고 그 침전물을 냉각실에서 마이크로퓨지에 수집하였다. 세척한 비드를 비-특이적 부착을 막기 위해 TBS/BSA 및 TBS/Tween으로 전세척한 새로운 마이크로퓨지관으로 옮겼다. TBS/Tween으로 세번의 추가 세척후에, 결합된 ACA-6501을 가지는 파지를 지닌 비드를 RT에서 10분간 텀블링함으로써 300μL 0.2N HCl/글리신, pH 2.1로 용리하였다. 16,000×g에서 원심분리후에, 산성 용리 상청액을 수집하고 추가의 용리액 100μL를 비드펠릿에 첨가하고, 그 과정을 반복하였다. 10분후에, 파지-함유 용리액(증폭되지 않은 제 1회 파지를 나타냄)을 푸울화하고(∼400μL) 멸균 17×100mm 폴리프로필렌 세포 배양관에 넣고 50μL 0.5M NaCl을 가한 후 2.5M 트리스 염기(보통 ∼25-35μL)로 pH를 중화하였다. 동일 부피의 영양결핍시킨E. coli현탁액을 즉시 가한후 100rpm으로 37℃에서 10분간 배양하였다. 그후 혼합물을 20μg/mL 테트라사이클린(Tet)을 지닌 25mL 2YT를 함유하는 250mL 멸균 배양 플라스크로 옮기고 250rpm으로 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

하룻밤 배양액으로부터 증폭된 파지를 분리하기 위해서, 현탁액을 폴리카보네이트관에서 10분간 12,000×g에서 원심분리하고 그 펠릿을 버렸다. 폴리프로필렌관에서 30분간 70℃에서 상청액을 가열한 후에, 물질을 폴리카보네이트관에서 다시 회전시키고 그 상청액을 회수했다. 상청액에, 20%(w/v) 폴리에틸렌글리콜, 분자량 8000(PEG 8000)의 1/4부피를 침전파지에 가하였다. 그 용액을 100번 반대로 혼합한 후 2시간동안 4℃에서 배양하였다. 4℃에서 30분간 35,000×g에서 원심분리후에, 파지-함유 펠릿을 ∼0.5mL의 TBS/BSA에 재현탁하고 1.4mL 마이크로퓨지관으로 옮겼다. 16,000×g에서 마이크로퓨지에서 1분간 회전시킨 후에, 상청액을 깨끗한 관으로 옮기고 제 1회 증폭된 파지로 라벨을 붙였다.

바이오패닝의 제 2, 제 3 및 제 4회동안, 전회로부터의 증폭된 파지 75μL를 100μL의 최종 부피로 7μL affACA-6501과 배양하였다. 제5회 파지에 대해 affACA-6501을 먼저 1:1000으로 희석한 후 다른 회에 대해 기술한 바와같이 처리하였다. 모든 후속 단계를 제1회에 대해 기술한 바와같이 수행하였다. 바이오패닝의 5회로부터의 파지를 2YT/Tet 플레이트상에서 스팟-역가 측정하여 파지농도를 측정하였다. 증폭된 파지의 스팟 역가는 TBS/BSA 또는 2YT배지중에 1×10⁶의 초기 파지 희석을 요구한다. 각 회에 대해, 희석한 파지 10μL를 교반없이 37℃에서 10분간 영양결핍시킨E. coli40μL과 배양시켰다. 2YT/희석 Tet(0.2μg/mL) 950μL를 첨가한 후에, 혼합물을 250rpm 교반으로 37℃에서 30-45분간 배양하였다. 순수한 그리고 희석한 파지 용액, 1:10, 1:100 및 1:1000의 분액 10μL를 20μg/mL Tet를 함유한 한천 플레이트를 사용하여 2YT/희석 Tet에 스팟팅하였다.

마이크로패닝

이뮬론형 2 플레이트를 단백질 G로 코팅하였다. 단백질 G는 0.1M NaHCO₃중의 10μg/mL로 제조하고 웰당 100μL를 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰에 가하고 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 플레이트로부터 과량의 단백질 G용액을 버린 후에, 각 웰을 진동플랫폼에서 교반하면서 RT에서 1시간동안 250-300μL 2YT로 차단시켰다. 트리스-완충 염수, pH 7.4/0.5% Tween 20(TBS/Tween)을 자동 플레이트 세척기와 함께 사용하여 웰을 200μL로 4회 세척하였다. 2YT로 2.5μg/mL로 희석한 affACA-6501(또는 대조구 정상 IgG) 100μL를 세척한 웰에 가하였다. 플레이트를 회전플랫폼상에서 RT에서 1시간 배양의 거의 마지막에 냉각실 회전기로 옮겼다.

마이크로패닝으로 시험할 파지를 바이오패닝에 의해 생성된 한천 플레이트로부터 얻었다. 시험할 각 클론을 멸균 이쑤시개를 사용하여 웰당 250μL 2YT/Tet를 함유하는 둥근-바닥 96-웰 마이크로타이트레이션 플레이트(Corning, NY)의 분리한 웰로 옮기고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 클론지정은 항체검색, 오리진 주위를 바이오패닝 및 하룻밤 배양 플레이트에서 클론의 위치에 기초한다. 예를들어, ACA-6501/3B10은 마이크로타이트레이션 플레이트상에서 B10으로 지정된 웰에 위치한 제 3회에서 ACA-6501에 의해 분리된 클론을 말한다. 하룻밤 배양후에, 파지 배양액을 RT에서 10분간 1300×g에서 마이크로타이트레이션 플레이트 홀더를 사용하여 원심분리하였다. 상청액은 "순수한" 파지의 공급원으로 구성되었다.

초기 마이크로패닝을 6클론으로 제한시키고 이것을 1:10 내지 1:10⁶의 인자로 확장된 희석에서 시험하였다. 이 파일럿 클론으로부터의 결과가 각 회에 대한 원료플레이트에서 클론에 대한 등급을 매길 수 있는 결과를 산출하는 적당한 단일 희석을 제안하는데 사용하였다. 바이오패닝의 제3, 제4 및 제5회로부터 배양된, 임의로 선택된 클론을 나타내는 플레이트를 250μL의 웰당 최종부피로 마이크로타이트레이션 플레이트중의 2YT를 사용하여 "순수한" 용액으로부터 1:100,000으로 희석시켰다. 원하는 희석을 나타내는 마지막 플레이트로부터, 100μL를 상기 기술한 바와같이 제조된 단백질 G-결합된 ACA-6501 및 정상 IgG를 함유하는 플레이트에 가하였다. aPL항체 또는 대조 IgG와 희석파지의 배양을 편평한 회전기상에서 4℃에서 2시간 수행하였다. 자동플레이트 세척기에서 TBS/Tween으로 9번 세척한 후에, IgG-결합된 파지를 0.2N HCl-글리신/0.1% BSA, pH 2.2 20μL로 용리하였다. RT에서 10분간 용리배양을 계속하고 그동안, 웰당 새롭게 영양결핍시킨E. coli20μL를 함유하는 새로운 Corning 마이크로타이트레이션 플레이트를 제조냉각하여 유지하였다. 29mM 트리스 140μL를 pH를 중화하기 위해 파지용리액을 함유하는 플레이트에 가한 후 파지 현탁액 20μL를 각 웰로부터 영양결핍시킨E. coli를 함유하는 플레이트의 해당 웰로 옮겼다. 37℃에서 10분 배양후에, 200μL 2YT/희석 Tet를 가하고 배양을 37℃에서 30분 더 수행하였다. 멀티채널 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 10μL을 오리지날 8×12 웰 패턴 및 마지막 마이크로타이트레이션 플레이트로부터 방향을 유지하면서 큰 2YT/Tet 한천 플레이트에 스팟팅하엿다. 스팟을 30분간 건조시킨후에, 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 다음날, 콜로니를 0 내지 4+, 0은 〈10 콜로니를 상징; +/-, 10-20; 1+, 20-50; 2+, 50-70% 합류; 3+, 70-90% 합류; 및 4+는 〉90% 합류 콜로니를 나타내는 것으로 반정량적으로 기록하였다. 1:10⁵의 희석에서 조사한 94개의 클론[제3회로부터 81개, 제4회로부터 6개, 그리고 제5회로부터 7개의 클론을 나타냄]중에서 6개의 클론은 제로의 마이크로패닝을 기록, 3개는 1+을 기록 14개는 2+를 기록, 62개는 3+을 기록, 및 9개는 4+기록을 가졌다. 바이오패닝의 제2에서 제5회를 나타내는 플레이트로부터 랜덤 클론의 검사를 하기 기재된 바와같이 G-트랙 DNA 서열로 수행하였다. 그 결과는 바이오패닝의 제4회에 의해 서열 다양성에서 극적인 감소(도 8참조)를 나타내어, 따라서 제2플레이트를 초기(제2)회로부터의 클론을 함유하는 1:3×10⁵의 희석으로 파지를 사용하여 마이크로패닝하였다. 1×10⁵희석에서 높게 기록된 29개[제3회로부터 26개, 제4회로부터 1개, 그리고 제5회로부터 2개] 플러스 미리 조사되지 않은 제2회로부터 65개의 클론을 포함하여 총 94개의 클론을 검사하였다. 1:3×10⁵의 희석에서 검사한 94개의 클론중에서 26개는 제로를 기록했고, 11개는 +/-를 기록했고, 10개는 1+를 기록했고, 13개는 2+를 기록했고, 34개는 3+를 기록했고 0개는 4+를 기록했다.

G-트랙 DNA 시퀀싱

단일-가닥 바이러스 DNA를 37℃에서 하룻밤 배양한 배양액으로부터 분리하였다. 배양액을 제조하기 위해서 관중의 2mL 또는 마이크로타이트레이션 플레이트 둥근바닥 웰중의 250μL로서 2YT/Tet를 마이크로타이트레이션 플레이트에서 미리 키운 배양액의 스프레드 플레이트로부터의 각 파지와 접종하였다. 페놀-클로로포름 추출 또는 알칼리 변성에 의한 바이러스 DNA의 분리 또는 방출 뿐만 아니라 배양 상청액의 20% PEG/2.5M NaCl 침전에 의한 파지의 정제를 관에서의 배양을 위해 Smith, G.P. 및 J.K. Scott, "Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage"(1993)Meth. Enzymol. 217:228-257에 기재된 바와같이 그리고 마이크로타이트레이션 플레이트에서의 파지를 위해 Haas, S.J. 및 G.P. Smith G.P., "Rapid sequencing of viral DNA from filamentous phage"(1993)BioTechniques 15:422-431에 기재된 바와같이 수행하였다. Sanger 등의 디데옥시 누클레오티드 사슬 종결 DNA 시퀀싱기법(Sanger et al., "DNA sequencing with chain terminating inhibitors" (1970)Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467)을 관 배양파지 DNA를 위해 상기 Smith 및 Scott(상기 참조) 그리고 마이크로타이트레이션 플레이트로부터의 파지 DNA를 위해 상기 Haas 및 Smith(상기 참조)에 기재된 바와같이 시판용 시쿼나제 키트(U.S. Biochemical/Amersharn, Arlington Heights, IL)를 사용하여 수행하였다. ddCTP종결 혼합물만을 사용함으로써 단일 염기(G)로 제안된 G 트랙킹 또는 서열양상을 7% 폴리아크릴아미드/우레아 시퀀싱 겔에서 전기영동후 방사능사진에 노출함으로써 얻었다. 표준 겔 전기영동 및 방사능사진 과정은 다음과 같다(Sambrook et al., 상기참조).

ACA-6501 라이브러리 스크린으로부터 1:1×10⁵의 파지 희석에서 검사된 마이크로패닝 플레이트로부터의 76개의 클론의 G-트랙킹은 11개의 독특한 서열을 드러낸 반면, 1:3×10⁵의 파지 희석에서 검사된 제 2마이크로패닝 플레이트로부터의 64개의 클론은 30개의 독특한 서열을 나타냈다. 모든 네개의 디데옥시누클레오티드 트리포스페이트를 사용한 종래 DNA 시퀀싱을 가장 높은 마이크로패닝 기록 및 독특한 서열을 가지고 파지 클론에 적용하였고 xyz 라이브러리에 대한 표 1에 제시된 12개의 서열을 얻었다.

파지-포획 ELISA

클론 ACA-6635/3A12, 3B3, 3C8, 3A5, 3C9 및 3B7을 3mL 배양액으로 성장시켰다. 친화성 정제된 ACA-6635를 포스페이트-완충된 염수, pH 7.2중에 2.5μg/mL로 희석하고 100μL를 이뮬론-2 마이크로타이트레이션 플레이트 웰에 첨가하였다. 2시간후에, 플레이트를 교반하지 않고 자동 플레이트 세척기에서 TBS/Tween으로 3회 세척하였다. 플레이트를 그후 웰당 PBS중의 150μL 0.1%BSA(글로불린 없음) 150μL로 차단하였다. 4℃에서 1시간후에, 플레이트를 상기 기재한 바와같이 3회 세척하였다. 17,000×g에서 3분간 각 파지 배양액을 원심분리후에, 각 상청액을 0.1% BSA/PBS중의 1:10으로 희석시키고 100μL를 친화성 정제된 ACA-6635로 코팅된 각 웰에 가한 후 4℃에서 2시간동안 배양하였다. 다음에 플레이트를 상기와 같이 TBS/Tween으로 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제-콘주게이션된 양 IgG 항-M13 파지 항체(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ)를 0.1% BSA/PBS중의 1:5,000으로 희석시키고 100μL를 각 웰에 적용하였다. 4℃에서 1시간 배양후에 플레이트를 전과같이 4회 세척하였다. 콘주게이트 제조자의 지시에 따라 제조된 기질 100μL를 각 웰에 가하였다. 19분후에, 각 웰의 405nm에서 흡광도를 자동 마이크로플레이트 흡광도 판독기(Biotek, Winooski, VT)로 판독하였다. ACA-6635 파지 라이브러리 스크린으로부터 검사한 7개의 클론을 이들의 높은 마이크로패닝 기록 및 음성 파지-ELISA 기록(하기참조) 때문에 선택하였다. 도 9에 나타난 바와같이 시험한 7개중 3개의 클론(3A12, 3B3 및 3A5)이 파지-포착 ELISA에서 매우 강한 면역특이적 신호를 나타냈다.

파지-ELISA

3mL 배양액을 대조구로서 사용한 펩티드 삽입체가 결핍된 한개의 fUSE 2파지 클론 뿐만 아니라 몇몇 파지 라이브러리 스크린에서 친화성 정제된 ACA-6501로 앞서 분리한 35개의 클론으로부터 제조하였다. 17,000×g에서 3분간 원심분리후에, 각 파지 상청액(흡광도를 기초로 하여 -2×10¹¹입자/mL로 조정된)으로부터 100μL를 마이크로타이트레이션 플레이트 웰(Falcon, Becton-Dickinson Labware, Lincoln Park, NY)에 가하고 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. TBS 7.4로 4회 세척후에, 플레이트를 RT에서 1시간동안 0.5% BSA/TBS 125μL로 차단시켰다. 다시 TBS로 4회 세척후에, TBS/BSA중의 2.5μg/mL로 앞서 희석된 affACA-6501 100μL를 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간 배양시켰다. 4회 더 세척한 후에, TBS/0.5%Tween중의 1:1000으로 희석된 항-사람 IgG 100μL를 각 웰에 가하였다. RT에서 1시간후에, 효소기질을 가하고 배양을 2시간동안 계속하였다. 0.2M Na₂HPO₄50μL 첨가로 반응을 차단시킨 후에, 흡광도를 자동 플레이트 흡광도 판독기에서 550nm에서 측정하였다. 도 10에 제시된 바와같이, 클론중 7개가 ACA-6501: 5A12, 3B6, 3E7, 3B10(2D7과 동일한 서열), 2G11, 2H1 및 2H2를 가지는 파지-ELISA에서 중요한 신호를 나타냈다. 이들 클론에 대한 서열이 표 2에 제시되어 있다.

펩티드-ELISA

표준 프로토콜에서, 디메틸포름아미드중의 사량체 펩티드의 모액을 pH 9.5 카보네이트 완충액중의 10μg/mL로 1000배 희석하였다. 각 마이크로타이트레이션 플레이트 웰을 희석펩티드 100μL로 4℃에서 하룻밤 코팅한 후에 완충된 알부민으로 차단하였다. 펩티드-코팅된 마이크로타이트레이션 플레이트를 1:50에서 출발하는 몇몇 희석에서 aPL 혈청과 함께 실온에서 1-2시간 배양하였다. 세척후에, 펩티드-결합된 사람 IgG의 존재를 표준 ELISA 과정에 따라 효소-콘주게이션된 항-사람 IgG로 측정하였다.

경쟁적 결합 펩티드-ELISA

(A) 이뮬론 II 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly VA)의 각 웰을 블랭크 대조구로 사용된 3개 웰을 제외하고 RT에서 적어도 1시간동안 35mM 중탄산나트륨(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 시약등급)을 함유하는 50mM 탄산나트륨, pH 9.5중의 4가 펩티드 ACA 6501/3B10 10μg을 함유하는 용액 100μL로 코팅하였다. 다음에 액체를 웰로부터 제거하고 TBS중의 0.5%(wt/vol)BSA(Sigma Chemical, St. Louis, MO, #A7638) 200μL를 차단을 위해 블랭크 웰을 포함하여 웰당 가하고 RT에서 적어도 1시간 동안 배양하였다. 네개의 1.5mL 마이크로퓨지관을 1에서 4까지 번호부여하였다. 다음 시약을 제1마이크로퓨지관(Brinkman Instruments, Westbury, NY)에서 혼합하였다: 5% BSA 30μL; TBS 284μL; TBS중의 약 400-500μg/mL의 단량체 펩티드(ACA-5A12 또는 -CB2 또는 -3B10 또는 음성대조구로서 뒤섞인 -3B10)의 모액 8μL; 및 0.5% BSA-TBS중의 1:10 희석된 혈청 6501 8.2μL. 다음 시약을 제 2마이크로퓨지관에서 혼합하였다: 5% BSA 30μL; TBS 290μL; TBS중의 약 400-500μg/mL의 단량체 펩티드(ACA-5A12 또는 -CB2 또는 -3B10 또는 음성대조구로서 뒤섞인 -3B10)의 모액 2μL; 및 0.5% BSA-TBS중의 1:10희석된 혈청 6501 8.2μL. 다음 시약을 제3마이크로퓨지관에서 혼합하였다: 5% BSA 30μL, 약 400-500μg/mL의 단량체 펩티드(5A12, CB2, 3B10 또는 뒤섞인 서열 3B10 대조구)의 1:10 희석액 287μL, 및 0.5% BSA-TBS중의 1:10으로 미리 희석한 ACA-6501 혈청 8.2μL. 다음 시약을 제4에펜도르프 마이크로퓨지관에서 혼합하였다: 5% BSA 60μL; TBS 584μL 및 0.5% BSA-TBS중의 1:10 희석된 혈청 6501 16.5μL. 차단된 플레이트를 TBS로 5번 세척하였다. 제1마이크로퓨지관의 용액을 3벌 웰에 웰당 100μL로 가했다. 제2, 제3 및 제4마이크로퓨지관의 동일한 양의 용액을 또한 3벌 웰에 가했다. 제4마이크로퓨지관의 용액의 100μL 분액을 마이크로타이트레이션 플레이트의 세개의 차단된 블랭크 웰 각각에 가하였다. 그 플레이트를 오비탈 교반기(American Dade, Miami, FL, Rotator V)에서 40rpm에서 교반하면서 RT에서 1시간동안 배양한 후 TBS로 5회 세척하였다. 0.5% BSA-TBS중의 1:1000 희석된 염소-항-사람-IgG/알칼리성 포스파타제 콘주게이트(Zymed, South San Francisco, CA, Cat. no. 62-8422) 100μL 분액을 첨가하고 RT에서 1시간동안 배양하였다. 다음에 플레이트를 TBS로 5회 세척하고 분석을 실시예 1에 기재한 바와같이 PPMP 희석된 기질용액 100μL를 첨가함으로써 전개시켰다. 20분후에, 반응을 웰당 0.2M N a₂HPO₄(Mallinckrodt, St. Louis, MO., 시약등급) 50μL를 첨가함으로써 차단하였다. 광학밀도를 마이크로플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, Model EL 311)로 550nm에서 판독하였다. 웰당 펩티드 양대 550nm에서의 광학밀도를 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA)으로 도시하였다. 4가 3B10에 혈청 6501의 결합의 50% 저해에 요구되는 펩티드 양을 그래프로부터 계산하였다.

(B) 이뮬론 I^R96-웰, 편평-바닥, 폴리스티렌 마이크로타이트레이션 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA)를 에탄올중의 카르디올리핀(CL, 50μg; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 30μL/웰로 코팅하였다. 두개의 대조 웰은 단지 에탄올 30μL를 주었다. 4℃에서 하룻밤 증발시킨 후에, 각 웰을 RT에서 2시간동안 PBS중의 5%(w/v) 어류 젤라틴 200μL로 차단시켰다. CL-코팅된, 차단된 플레이트를 TBS로 5번 세척한 후 각 웰에 2.3%(PBS중의 v/v) IgG-고갈된 사람 혈청(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 100μL로서 β2-GPI를 가하고 RT에서 2시간 배양하였다.

이 배양동안, 여섯 펩티드 각각의 다양한 양을 1:1 TBS/PBS(1:400의 최종희석)중의 3% 어류 젤라틴으로 희석된 ACA6501 혈청 22μL를 에펜도르프 마이크로퓨지관을 사용하여 최종부피 220μL로 혼합하였다. 구체적으로 관 #1에서 TBS-PBS중의 3% 어류 젤라틴 181.3μL, 펩티드 모액 16.7μL 플러스 3% 어류젤라틴/TBS-PBS중의 40배 희석된 ACA6501 혈청 22μL를 혼합하였다. 모액은 펩티드 #951(디세린 비환식의 음성 대조구), #952(다량의 LJP 690) 및 티오에테르 CCTE-3G3, CHTE-3G3, HCTE-3G3 및 HHTE-3G3에 대해 450-800μg/mL 범위였다. 관 #2에 다음을 가하였다: 어류젤라틴/TBS-PBS 148μL, 펩티드 모액 50μL, 40배 희석된 ACA6501 혈청 22μL. 관 #3은 어류젤라틴/TBS-PBS 48μL, 펩티드 모액 50μL, 40배 희석된 ACA6501 혈청 22μL. 대조구 관 #4는 어류젤라틴/TBS-PBS 396μL 및 40배 희석한 ACA6501 혈청(펩티드 없음) 44μL를 가했다. 각각의 관을 RT에서 약 1시간 배양하였다.

CL/β₂-GPI 마이크로타이트레이션 플레이트를 TBS로 5회 세척하고 항체-펩티드(또는 펩티드 혼합물 없음)를 함유하는 에펜도르프 관 #1,2,3 및 4로부터 중복으로 100μL분액을 웰에 가하였다. 관 #4로부터 100μL 부피를 카르디올리핀이 없는 중복 대조웰에 가하였다. 마이크로타이트레이션 플레이트를 오비탈 교반기(American Scientific, Rotator V)에서 40rpm에서 교반하면서 RT에서 1시간 배양하고 TBS로 5번 세척한 후 0.5%(w/v) BSA-TBS중의 1:1000 염소 항-사람 IgG 알칼리성 포스파타제 콘주게이트(Zymed, Cat No. 62-8422) 100μL를 가하였다. RT에서 1시간 배양후에, 마이크로타이트레이션 플레이트를 다시 TBS로 5회 세척하고 색체계 효소 검출을 PMPP용액(물로 1:26 희석된 100mL 물 모액중의 페놀프탈레인 모노포스페이트 7.8g 플러스 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 69.5g) 100μL를 가함으로써 전개하였다. 21분후에, 반응을 각 웰에 0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrodt) 50μL를 가함으로써 차단시켰다. 550nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments, Model EL 311)로 읽었다. 흡광도 대 첨가된 펩티드를 도 12에 나타낸 바와같이 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Software, Inc.)상에서 도시하였다. ACA 6501 결합을 50% 저해하는 펩티드의 양, IC₅₀을 첨가된 펩티드의 양과 1/2-최대 흡광도의 상호관계로 그래프로부터 계산하였다.

(C) Nunc Maxisorp^R96-웰의 편평한 바닥의 마이크로타이트레이션 플레이트를 PBS중의 100μg/웰에서 100μL/웰의 정제된 사람 P2-당단백질 I(PerImmune, Rockville, MD)로 코팅하였다. 2개의 대조구 웰은 단지 100μL PBS만을 수용하였다. 2시간동안 실온에서 배양한 후에, 액체를 제거하였다. 코팅한 플레이트를 2%(w/v) 비지방 건조유액(Carnation, Glendale, CA) 및 0.4%(w/v) Tween 80(Calbiochem, San Diego, CA)을 함유하는 200μL/웰의 PBS로 실온에서 2시간동안 차단시켰다. 차단 용액을 또한 희석 시약으로 사용하였다.

제2의 배양시간동안에, 가변량의 각 네 개의 시험 펩티드를 에펜도르프 마이크로원심분리기 관을 사용하여 220μL의 fmal 부피의 샘플 희석액으로 희석한 ACA-6501 혈청과 혼합하였다. 특히, 관 #1에, 188μL의 샘플 희석액, 10μL의 펩티드 모액(2mg-4mg/mL 희석액) 및 샘플 희석액중의 1:35로 희석한 22μL의 AC-6501 혈청을 가하였다. 관 #2에, 158μL 샘플 희석액, 40μL 펩티드 모액 및 22μL의 1:35 희석한 ACA-6501 혈청을 가하였다. 관 #3은 38리터의 샘플 희석액, 160μL 펩티드 모액 및 22μL의 1:35 희석된 ACA-6501 혈청을 함유하였다. 대조구 관, 관 94는 396μL 샘플 희석액 및 44μL의 1:35 희석한 ACA-6501 혈청(펩티드 없음)을 함유하였다. 각 관을 실온에서 약 1시간동안 배양하였다.

β₂-GPI 마이크로플레이트를 TBS로 5회 세척하고 에펜도르프 관 91, 2, 3 및 4에 함유된 혼합물 100μL를 마이크로플레이트의 중복 웰에 가하였다. 관 #4의 내용물 100μL를 β₂-GPI를 함유하지 않은 각 중복 대조구 웰에 가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 배양하고, TBS로 5회 세척하고 샘플 희석액 완충액에 희석한 1:1000 염소 항-사람 IgG/A-P 콘주게이트(Zymed, Cat. No. 62-8422) 100μL 가하였다. 실온에서 1시간동안 배양하고, 플레이트를 다시 TBS로 5회 다시 세척하고 열량측정 효소 검출은 약 100μL PPMP 용액(물로 1:26 희석한 100mL 물 모액중의 7.8g 페놀프탈레인 모노포스페이트 및 69.5g 2-아미노-2-메틸-1-프로판올)을 가함으로써 전개시켰다. 22분 후에, 반응은 웰당 가한 0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrodt) 50μL로 중지시켰다. 가한 펩티드에 대한 흡광도를 도 21에 나타낸 대로 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Software, Inc.)상에 플롯화하였다. 50%로 ACA-6501 결합을 억제한 펩티드 양인 IC50을 그래프로부터 가한 펩티드의 양과 반-최대 흡광도의 교차점에서 계산하였다.

실시예 5:펩티드 3B10의 절단 실험 및 생성 펩티드 경쟁 ELISA 결과

마이크로타이트레이션 플레이트(96-웰, 편평 바닥 폴리스티렌, 이뮬론-2, Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA)를 카보네이트 완충액, pH 9.6(15mM Na₂CO₃/35mM NaHCO₃)중의 10μg/mL의 사량체 ACA-6501/3B10 펩티드로 RT에서 1시간동안 100μL/웰로 코팅하였다. 웰로부터 액체를 제거한 후에, 각 웰을 TBS중의 200μL 0.5%(wt/vol)BSA(글로불린 없음, cat. no. A7638, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 RT 에서 1시간동안 차단시켰다. 플레이트상에 세개의 웰을 4가 펩티드로 코팅하지 않은 채로 남겨 블랭크 대조 웰로 제공하였다.

차단단계동안, 시험할 각 수용성, 단량체 펩티드를 각각 30μL 5% BSA/TBS, 8.2μL ACA-6501 혈청 (0.5% BSA/TBS로 1:10 희석액으로), 다양한 부피의 펩티드/-FBS 모액 및 필요한 부피의 TBS 완충액을 함유하는 세개의 시험관(에펜도르프 마이크로 시험관, Brinkmann Instruments, Westbury, NY)에 넣어 330μL의 최종부피를 얻었다. 330μL 부피는 4가 펩티드-코팅된 플레이트에 결합하는 ACA-6501을 차단하는 능력에 대해 시험한 각 펩티드 농도에 대해 3번 100μL 샘플을 발생시키기에 충분했다. 아미노말단에서 절단되었고 정상적으로 시험된 구조 ala-gly가 결핍된 펩티드 139에 대해, 모액의 농도는 약 340-400μg/mL TBS이었으며 19μL, 75μL 및 292μL의 분액을 제거하여 세개의 펩티드 농도 튜브를 제조하였다. 펩티드 142(N-말단 ala만 결핍)및 펩티드 143(절단되지 않음)에 대해, 모액 농도는 TBS중의 400-500μg/mL였다. 1μL, 4μL 및 16μL의 각 모액으로부터 분액을 제거하여 각 펩티드에 대해 세가지 농도 튜브를 설정하였다. 펩티드 단량체 대조구 튜브(펩티드결핍)에 대해, 60μL 5% BSA, ACA-6501의 1:10 희석액 16.5μL 및 583.5μL TBS를 함유하는 최종부피 660μL를 가지는 튜브, 즉, 펩티드를 가지지 않으며 부피를 2배 가지는 330μL 튜브와 동일한 최종농도(0.5% BSA 및 1:400의 ACA-6501혈청)를 제조하였다.

차단 배양후에, 4가 펩티드로 코팅된 플레이트를 TBS로 5회 세척하였다. 다른 농도의 펩티드 139, 142 및 143을 함유하는 각 330μL 튜브로부터 100μL를 코팅한 3벌 웰에 가하였다. 펩티드 없는 660μL 대조구 튜브로부터 세개의 100μL의 분액을 각각 코팅된 웰에 가하고 세개의 추가 100μL 분액을 각각 코팅하지 않은 블랭크 웰에 가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간동안 회전 오비탈 쉐이커(Rotator V, American Dade, Miami, FL)상에서 40rev/분으로 배양한 후 TBS로 5회 세척하였다. BSA/TBS중의 1:1000 희석된 100μL/웰의 염소 항사람 IgG/알칼리성 포스파타제 콘주게이트(Cat. no. 62-8422, Zymed, South San Francisco, CA)를 마이크로플레이트에 가하였다. RT에서 1시간 배양한 후에, 플레이트를 다시 TBS로 5회 세척하였다. 100μL/웰의 신선하게 제조된 희석 PPMP 기질용액을 가함으로써 색전개를 수행하였다. PPMP의 희석용액(페놀프탈레인 모노포스페이트, cat. no. P-5758, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 PPMP 모액(HCl로 pH 10.15로 조정된 0.13M PPMP, 7.8M 아미노-2-메틸-1-프로판올)의 물로 1:26 희석액을 제조함으로써 얻었다. 30분 후에, 반응을 50μL/웰의 0.2M Na₂HPO₃(시약등급, Mallinckrodt, St. Louis, MO)을 가함으로써 중단시켰다. 550nm에서 흡광도 측정을 마이크로플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)상에서 수행하고 A_550nm대 웰당 첨가된 펩티드 결과를 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 도시하였다. 도 11에 나타낸 바와같이, 수평선을 단량체 펩티드 경쟁적 저해 부재시 얻어지는 1/2최대 결합 반응에 해당하게 그었다. 50% 저해에 필요한 펩티드 양을 시험한 각 펩티드에 대한 도시와 이 선의 상관관계로 읽을 수 있다. 50% 저해값이 도 12에 제시되어 있다. 이 결과는 N-말단 Ala의 손실은 음성결과를 가지지 않는 반면, Gly의 추가적 손실은 50% 저해를 달성하기 위해 필요한 농도를 약 8배로 증가시킴을 나타낸다.

실시예 6:알파 메틸 프롤린의 3B10으로의 치환 및 그 결과의 ELISA

펩티드 ACA-6501/3B10 및 3 및 9위치에서 프롤린이 α-Me-Pro로 치환된 유사체의 시험을 실시예 5에 기술한 방법을 사용하여 수행하였다. 펩티드 3B10, 726(3 위치에서 치환된 αMe-Pro), 727(9위치에서 치환된 αMe-Pro)및 728(3 및 9위치에서 치환된 αMe-Pro)을 사량체 펩티드 3B10-코팅된 마이크로타이트레이션 플레이트 및 ACA-6501 혈청을 사용하여 경쟁적-결합 ELISA에서 수용성 단량체 펩티드로서 시험하였다.

마이크로타이트레이션 플레이트를 실시예 5에 기재된 바와같이 사량체 3B10 펩티드로 코팅하였다. 시험한 각각의 네개의 펩티드에 대해, 펩티드 농도를 튜브에서 제조하였다. 실시예 5와같이 이들 12 튜브는 330μL의 최종부피중의 0.5% BSA/TBS 및 1:400의 최종 희석액에 ACA-6501 혈청의 최종농도를 가졌다. 모든 펩티드 모액은 400-500μg/mlTBS였다. 30μL의 5% BSA/TBS 및 8.2μL의 ACA-6501 혈청(0.5% BSA/TBS로 1:10 희석된)을 함유하는 튜브에, 각각 네개의 펩티드 모액의 1μL, 4μL 또는 16μL 분액을 적당한 부피의 TBS에 추가로 첨가하여 최종 부피 330μL를 달성하였다. 경쟁 펩티드를 가지지 않는 대조구 튜브를 실시예 5에 기술된 바와같이 최종부피 660μL로 제조하였다.

4가 펩티드-코팅된 플레이트의 차단 배양후에, 펩티드를 함유하지 않는 대조구 튜브 및 블랭크 대조구 뿐만 아니라 각각 네개 펩티드에 대한 각 펩티드 농도 튜브로부터 3개의 100μL 분액을 실시예 5에 기술한 바와같이 시험하였다. 데이터 처리뿐 아니라 마이크로타이트레이션 플레이트 ELISA 과정을 실시예 5에 기재한 바와같이 수행하였다. 도 13에 제시된 바와같이 위치 9에서 α-Me-Pro가 치환된 펩티드 727은 변형되지 않은 펩티드 3B10 또는 양쪽 프롤린이 변화된 유사체(펩티드 728)보다 상당히 더 활성적이었다. 위치 3에서 치환된 펩티드 726은 치환결과로 활성을 잃었다.

실시예 7:6626 항체 및 그 해당서열로 스크린의 개략적 설명

친화성 정제된 ACA-6626(AffACA-6626)을 이미 기술한 바와같이 ACA-6626 혈장 8mL로부터 친화성 정제에 의해 분리하였다. AffACA-6626(10μg)을 ACA-6501 바이오패닝에 대해 이미 기술한 바와 같이 최종부피 100μL로 모든 p-III 성분 라이브러리의 푸울로 구성된 에피토프 XY'Z 파지 라이브러리와 배양하였다. 3회의 바이오패닝후에, 제2 및 제3회로부터 임의로 선택된 파지를 마이크로패닝으로 시험하였다. 단지 몇몇 클론만이 1:1000 희석액에서 약하게 면역양성을 나타냈다. 추가의 제4회 바이오패닝을 수행하였다. 94개 제4회 클론의 마이크로패닝이 1:100,000 같이 높은 파지 희석액에서 43 면역양성을 나타냈다. 43개의 면역양성 클론의 G-트랙킹 DNA 시퀀싱을 ACA-6501에 대해 이미 기술한 바와 같이 수행하여 5개의 독특한 서열을 드러냈다. 종래 4염기 DNA 시퀀싱후에, 표 3의 번역된 아미노산 서열이 얻어졌다.

실시예 8:환자 6644로부터 ACA에 대해 특이적인 서열동정

epi^xy'z파지 디스플레이 라이브러리를 환자번호 6644로부터 ACA 친화성 정제된 항체로 실시예 4와 유사한 방법을 사용하여 검색하였다. 상기와 같이 콜로니 블롯 분석을 펩티드 합성 전에 최종 동정단계로서 사용하였다. 약 150 콜로니를 원래의 니트로셀룰로스 막상에 플레이팅하고 분석하였다. 환자 6644로부터의 항체를 1㎍/mL 농도로 사용하였다. 니트로셀룰로스 막상에 플레이팅하고 분석한 150 콜로니중에서 4개만이 강한 양성이었고 2개는 이 검색에서 약한 양성이었다. 이 검색에 의해 선별된 6개의 양성 파지의 삽입체의 시퀀싱은 이 삽입체가 모두 유리 아미노-말단(epi^z)을 지닌 8량체 라이브러리로부터 유래되었다는 것을 나타냈다:

Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Gly (3 삽입체)

Gly-Ile-Leu-Thr-Ile-Asp-Asn-Leu-Gly-Gly (1 삽입체)

Gly-Ile-Leu-Leu-Asn-Glu-Phe-Ala-Gly-Gly (2 삽입체)

실시예 9:ACA-6641을 지닌 파지 라이브러리 스크린의 요약

AffACA-6641을 환자번호 6641로부터 얻은 혈장 4mL로부터 분리하였다. AffACA-6641(10㎍)을 상기와 같이 최종부피 100μL중의 푸울화한 p-III 파지 라이브러리와 함께 배양하였다. 4회의 바이오패닝후에, 3회 및 4회로부터 45개의 클론을 마이크로패닝에 의해 시험하였다. 45개중에서 23개가 음성을 나타냈다. 3회 파지로는 4+를 기록한 두 개의 클론, 3+를 기록한 두개 및 2+를 기록한 두 개를 얻었다. 4회로부터 한 클론은 4+를 기록, 한 클론은 3+를 기록 및 세 개는 2+를 기록했다. G-트랙킹 DNA 시퀀싱은 6개의 독특한 서열을 드러냈다. 한 클론 3G3만 파지-포착 ELISA에서 강한 양성을 나타냈다. 네 개의 염기 DNA 시퀀싱은 다음 번역된 펩티드 서열을 제공하였다:

CLGVLGKLC.

실시예 10:비-면역발생적, 다가담체에의 펩티드 접합

B 세포 관용원의 발달에 대한 몇몇 4개 플랫폼을 공동 소유의 공동 계류중인 1993년 9월 8일에 출원된 U.S. 특허 출원 일련번호 08/118,055, 1993년 11월 15일에 출원된 08/152,506 및 US 특허 번호 5,268,454, 5,276,013 및 5,162,515에 기재된 바와 같이 발달시켰으며 모두 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다. 에피토프 라이브러리의 aPL 항체 스크린에 의해 선별된 후보 펩티드를 접합하고 항체결합 같은 면역화학적 행동의 변형에 대해 시험하였다.

아민기를 가지는 비-면역발생적 다가 플랫폼을 다음 반응식에 나타낸 바와같이 합성한다.

플랫폼상의 아민-펩티드상의 카르복실

화합물 2: 무수 EtOH 50mL 및 시클로헥센 35mL중의1의 8.0g(5.7mmol)의 용액을 질소하에 놓고, 탄소상 10% Pd 500mg을 가하였다. 혼합물을 2시간 교반하면서 환류시켰다. 냉각할 때, 혼합물을 셀리트를 통해 여과시키고 농축시켜 오일로서25.0g을 얻었다.¹H NMR(50/50 CDCl₃/CD₃OD) d 1.21(m, 8H), 1.49(m, 8H), 1.62(m, 8H), 2.19(t, J=7.4Hz, 8H), 2.67(t, J=7.4Hz, 8H), 3.36(bd s, 16H), 3.67(s, 4H), 3.71(m, 4H), 4.21(m, 4H).

유리 카르복실로 보호된 펩티드(PHN-펩티드-CO ₂ H)

펩티드를 트리플루오로아세트산(TFA) 안정한 보호기(카르복실기상의 벤질에테르 또는 시클로헥실에테르 및 아미노기상의 카르보벤질옥시(CBZ))를 사용하여 Wang(p-알콕시벤질) 수지상에 FMOC 화학을 사용하여 표준 고상 방법으로 합성한다. 아미노산잔기를 연속적으로 아미노 말단에 가한다. 펩티드를 TFA를 가지는 수지로부터 제거하여 카르복시말단에 하나의 유리 카르복실기를 가지는 펩티드 및 모든 다른 카르복실 및 차단된 아민을 제공한다. 보호 펩티드를 역상 HPLC로 정제한다.

펩티드-플랫폼 콘주게이트, 4

보호 펩티드(0.3mmol)를 디메틸포름아미드(DMF) 1mL중에 용해시키고, 이 용액에 0.3mmol의 디이소프로필카르보디이미드 0.3mmol의 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT)을 가한다. 이 용액을 DMF 1mL 중의 0.025mmol 테트라아미노 플랫폼,2의 용액에 가한다. 종료하였을 때, DMF를 진공하에서 제거하여 미정제의 충분히 보호된 콘주게이트3을 얻는다. 콘주게이트,3을 0℃에서 1시간동안 아니솔의 존재하에서 플루오르화수소산(HF)으로 처리하여 콘주게이트4를 제공한다. 정제를 제조 역상 HPLC로 수행한다.

다음 반응식은 플랫폼상에서 카르복시기에 펩티드의 아미노기의 부착을 나타낸다.

플랫폼상의 카르복실-리간드상의 아민

화합물 5-4개의 카르복실산기를 가지는 플랫폼

무수숙신산(1.0g, 10mmol)을 1/1 디옥산/H₂O 20mL중의2861mg(1.0mmol)및 NaHCO₃252mg(3.0mmol)의 용액에 가하고 그 혼합물을 RT에서 16시간 교반한다. 혼합물을 1N HCl로 산성화하고 농축한다. 농축액을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여5를 제공한다.

유리 아민으로 보호된 펩티드(H ₂ N-펩티드-CONH ₂ )

펩티드를 아미드 수지상에서 표준 고상 방법으로 합성하며 이것은 TFA 안정한 보호기(카르복실기상의 벤질에테르 또는 시클로헥실에테르 및 아미노기상의 CBZ)를 사용하여 수지로부터 분해후에 카르복시 말단 아미드를 얻는다. 아미노산 잔기를 표준 FMOC 화학을 사용하여 아미노말단에 연속적으로 가한다. 펩티드를 트리플루오로아세트산으로 수지로부터 제거하여 유리 아민 링커를 가진 보호된 펩티드를 제공한다. 보호 펩티드를 역상 HPLC로 정제한다.

펩티드-플랫폼 콘주게이트, 7

DMF 1mL중의 유리 아민을 가지는 0.5mmol의 보호 펩티드(H₂N-펩티드-CONH₂), 0.01mmol의 디이소프로필에틸 아민 및 0.01mmol의5용액을 제조한다. BOP 시약(벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트)(0.1mmol)을 가하고 그 혼합물을 분석적 HPLC에 의해 증명되는 바와같이 반응이 종료될 때까지 교반한다. 펩티드 보호기를 0℃에서 아니솔의 존재하에서 HF로 처리함으로써 제거하여 보호기가 제거된 콘주게이트,7을 제공한다. 화합물7을 제조 역상 HPLC로 정제한다.

다음 반응식은 펩티드의 아미노말단에 술피드릴 링커를 부착하고 테트라브로모아세틸화 플랫폼에 펩티드/링커를 부착하여 화합물13을 얻는 방법을 나타낸다.

플랫폼상의 할로아세틸 및 펩티드상의 술프히드릴

화합물 9

농황산(100μL)을 EtOAc 35mL중의 트리페닐 메탄올 4.48g(17.2mmol) 및 3-메르캡토프로피온산 1.62g(15.3mmol, 1.3mL)의 60℃ 용액에 가했다. 혼합물을 10분간 60℃에서 교반하고 실온(RT)으로 냉각하고 1시간동안 얼음에 방치하였다. 결과의 백색고체를 여과로 수집하여94.52g(75%)을 얻었다.

화합물 10

디시클로헥실 카르보디이미드(DCC)(2.41g, 11.7mmol)를 CH₂Cl₂41mL중의92.72g(7.8mmol) 및 p-니트로페놀 1.08g(7.8mmol)의 0℃ 혼합물에 가했다. 혼합물을 16시간 교반시키고 RT로 되게 하였다. 혼합물을 여과하여 N,N-디시클로헥실우레아(DCU)를 제거하고 그 여액을 농축시켰다. 그 잔사를 헥산/CH₂Cl₂로부터 결정화하여 담황색 결정으로서103.17g(86%)을 얻었다.

화합물 11-부착된 메르캡토프로피오닐 링커를 지닌 환식 티오에테르 펩티드

물 및 디옥산중의 환식 티오에테르 펩티드(하나의 황이 CH₂로 치환된 디술피드 고리화 펩티드의 유사체) 및 중탄산나트륨의 용액을 p-니트로페닐 에스테르10으로 처리하였다. 펩티드가 리신을 함유한다면, 이것은 적당히 차단되어야 한다. 결과의 변형된 펩티드를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 티올 링커 변형된 펩티드11을 제공하였다.

화합물 13 - 환식 티오에테르 펩티드 및 브로모아세틸화 플랫폼의 콘주게이트

100mM 붕산나트륨 pH 9 중의 0.10mmol의 티올 변형된 펩티드11의 He 스파징된 용액에 9/1 MeOH/H₂O중의 40mg/mL로서 브로모아세틸화 플랫폼120.025를 가했다. 그 용액을 HPLC에 의해 증명되는 것같이 콘주게이션이 종료될 때까지 N₂분위기하에서 교반시켰다. 콘주게이트를 역상 HPLC로 정제하였다.

실시예 12 : LJP 685의 합성

γ-브로모-N-BOC-α-아미노부티르산 t-부틸 에스테르, 화합물 14: N₂분위기하에서 건조 THF 40mL중의 N-BOC-글루탐산-α-t-부틸 에스테르 4.03g(13.3mmol) 및 N-메틸모르폴린 1.61mL(1.48g, 14.6mmol)의 용액을 15℃로 냉각시켰다. 이소부틸클로로포르메이트(1.73mL, 1.82g, 13.3mmol)를 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 10분간 교반하고 THF 8mL중의 N-히드록시-2-메르캡토피리딘 2.03g(16.0mmol)의 용액을 가한 후 Et₃N 2.23mL(1.62g, 16.0mmol)을 가했다. 혼합물을 호일로 덮어 빛을 차단시키고 1시간 실온에서 교반시켰다. 혼합물을 여과하고 그 여액을 빛에 노출을 최소화하면서 회전 증발기에서 농축시켰다. 농축액을 20mL BrCCl₃에 용해하고 그 용액을 -70℃로 냉각하였다. 고체를 진공하에 방치한 후 N₂로 퍼징하고 실온이 되게 하고 20℃ 수욕에 방치하고 5분간 500W 태양등으로 근접 범위에서 상기로부터 조사하였다. 혼합물을 회전 증발기상에서 농축하고 실리카겔 크로마토그래피(40mm×150mm, 톨루엔을 UV 활성물질이 2% EtOAc/톨루엔(500mL), 5% EtOAc/톨루엔(500mL) 용리를 마무리할 때까지 용리액으로서 사용하였다)로 정제하였다. 불순 분획을 재정제하였다. TLC(R_f0.23, 5% EtOAc/톨루엔)에 의한 순수 분획을 합하고 농축하여 왁스고체로서 화합물143.23g(72%)을 제공하였다.

N-BOC-글리실프롤린-4-니트로페닐 에스테르, 화합물 15: 건조 THF 82mL중의 N-BOC-글리실프롤린 3.0g(11.6mmol)및 4-니트로페놀 1.93g(13.9mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고 DCC 3.34g(16.2mmol)을 가하였다. 그 혼합물을 1시간동안 0℃에서 교반하고, 얼음욕을 제거하고 그 혼합물을 실온에서 16시간 교반하였다. HOAc(579μL)를 혼합물에 가하고 30분간 교반하였다. 혼합물을 30분간 냉동기에 방치하고 진공하에서 여과하였다. 그 여액을 농축하고 실리카겔크로마토그래피(18×150mm층, 2.5% EtOAc/97.5% CH₂CH₂/1% HOAc)로 정제하였다. 미량의 아세트산을 회전 증발기상에서 여러번 디옥산으로부터 농축함으로써 제거하였다. 농축액을 3/1 헥산 Et₂O로 분쇄하고 결과의 백색고체를 여과에 의해 수집하여 백색고체로서 화합물154.1g(90%)을 얻었다: TLC R_f0.09, 40/60/1 EtOAc/헥산/HOAc;¹H NMR(CDCl₃)δ1.09-2.55(m, 4H), 1.48(s, 9H), 3.47-3.77(m, 2H), 4.05(m, 2H), 4.74(m, 1H), 5.45(bd s, 1H), 7.35(d, 2H), 8.30(d, 2H)

N-FMOC-S-t-부틸티오시스테인아미드, 화합물 16: THF 115mL중의 FMOC-S-t-부틸티오시스테인 5.0g(11.6mmol)및 N-히드록시숙신이미드 1.33g(11.6mmol)의 용액을 0℃로 냉각하였다. 이 용액에 DCC 3.58g(17.37mmol)을 가했다. 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하고 물 50mL중의 (NH₄)HCO₃1.6g의 용액 42.9mL를 가했다. 얼음욕을 점차적으로 실온으로 가온하면서 혼합물을 4.5시간 교반시키고 회전증발기상에서 농축하여 THF를 제거하고 백색고체를 가진 수상을 제공하였다. 혼합물을 대부분의 고체가 용해될 때까지 CH₂Cl₂200mL과 함께 교반한 후 1N HCl 용액 100mL과 함께 교반하였다. CH₂Cl₂층을 포화 NaHCO₃용액 100ml로 세척하고 건조(Na₂SO₄)하고 여과하였다. 그 여액을 뜨거운 플레이트상에서 비등시키고 CH₂Cl₂/헥산 300mL로부터 결정화하여 백색고체로서 화합물164.36g(87%)을 얻었다: mp 127°-129℃; TLC R_f0.29, 95/5/1 CH₂Cl₂/CH₃CN/MeOH,¹H NMR (CDCl₃) δ 1.36(s, 9H), 3.06-3.24(m, 2H), 4.25(t, 1H), 4.55(m, 3H), 5.56(bd s, 1H), 5.70(bd s, 1H), 6.23(bd s, 1H);¹³C NMR (CDCl₃) 29.8, 41.9, 47.1, 48.5, 54.2, 67.2, 120.0, 125.0, 127.1, 127.8, 141.3, 143.6, 156.1, 172.2, 분석이론치: C, 61.4%; H, 6.1%; N, 6.5%. 실측치: C, 61.5%; H, 6.0%; N, 6.5%.

화합물 17: 물(16.9mL)을 디옥산 33.8mL중의 화합물162.91g(6.75mmol)에 가하고 그 용액을 5-10분간 질소로 스파징하였다. 혼합물을 질소분위기하에서 유지하고 NaHCO₃1.13g(13.5mmol)을 가한 후 PBu₃1.77mL(1.44g, 7.09mmol)를 가했다. 혼합물을 1시간 실온에서 교반시키고 1×100mL의 1N HCl과 2×100mL의 CH₂Cl₂사이에 분배시켰다. CH₂Cl₂층을 합하고 농축하고 결과의 백색고체를 디옥산 33.8mL중에 부분적으로 용해시켰다. 물(9mL)을 가하고 혼합물을 5-10분간 질소로 퍼징하였다. 혼합물을 질소분위기하에서 방치하고 K₂CO₃2.17g(16.9mmol)을 가한 후 화합물142.63g(8.1mmol)을 가했다. 혼합물을 16시간 교반하고 1×100mL의 1N HCl과 2×100mL의 10% MeOH/CH₂Cl₂사이에 분배시켰다. CH₂Cl₂층을 합하고, Na₂SO₄로 건조하고 여과하고 반고체 잔사로 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그패피(1/3 CH₂CN/CH₂Cl₂)로 정제하여 백색고체로서 화합물173.2g(80%)를 제공하였다; TLC R_f0.27, 1/3 CH₃CN/CH₂Cl₂. 분석샘플의 추가 정제를 헥산/EtOAc로부터 재결정함으로써 수행하였다; mp 104-106.5℃;¹H NMR (CDCl₃)δ 1.47(s, 9H), 1.49(s, 9H), 1.96(m, 1H), 2.11(m, 1H), 2.69(m, 2H), 2.88(m, 1H), 3.03(m, 1H), 4.29(t, 1H), 4.36(m, 2H), 4.50(m, 2H), 5.21(m, 1H), 5.49(m, 1H), 5.81(m, 1H), 6.54(m, 1H), 7.34(t, 2H), 7.42(t, 2H), 7.61(d, 2H), 7.80(d, 2H);¹³C NMR (MeOH)δ 26.1, 26.7, 28.2, 28,7, 34.8, 54.8, 55.7, 68.1, 80.5, 82.7 120.9, 126.3, 128.2, 128.8, 142.6, 145.2, 160.0, 162.7, 173.4, 175.8. C₃₁H₄₁N₃O₇S에 대한 분석이론치: C, 62.08, H, 6.89; N, 7.01. 실측치: C, 62.23; H, 7.12; N, 7.39.

화합물 18: 20/1/1 TFA/H₂O/메르캡토에탄올(23.2mL)의 용액을 화합물171.27g(2.11mmol)에 가하였다. 혼합물을 1시간 실온에서 교반하고 약 3mL의 부피로 농축시켰다. 에테르 50mL을 가하여 생성물을 침전시켰다. 결과의 고체를 에테르로 2번 이상 세척하고 진공하에서 건조하여 고체 812mg을 얻었다. 고체를 디옥산 10.6mL 및 H₂0 10.6mL중에 현탁하였다. NaHCO₃(355mg, 4.22mmol)를 그 혼합물에 가한 후 디옥산 10.5mL중의 화합물151.33g(3.38mmol)의 용액을 가했다. 혼합물을 20시간동안 실온에서 교반시키고 1N HCl 100mL과 CH₂Cl₂3×100mL 사이에 분배시켰다. 합한 CH₂Cl₂층을 건조(Na₂SO₄)시키고 여과하고 농축하였다. 실리카겔 크로마토그래피(35×150mm; 단계 구배, 5/95/1 MeOH/CH₂Cl₂/HOAc(1L) 내지 10/95/1)로 정제하였다. 순수분획을 농축시키고 그 잔사를 에테르로 분쇄하여 화합물18881mg(60%)을 얻었다; TLC R_f0.59, 10/90/1 MeOH/CH₂Cl₂/HOAc; mp 116-117.5℃;¹H NMR (CDCl₃)δ1.41 (s, 9H), 2.00 (m, 2H), 2.18 (m, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.85 (m, 2H), 3.49 (m, 2H), 3.62 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 4.08 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.22 (t, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.49 (m, 2H), 4.61 (m, 2H), 7.78 (d, bd s, 1H), 6.12 (bd s, 1H), 6.43 (bd s, 1H), 7.35 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.61 (d, 2H), 7.78 (d, 2h);¹³C NMR (CDCL₃) δ 25.3, 27.8, 28.6, 29.4, 32.6, 35.1, 44.1, 46.9, 47.3, 52.2, 53.9, 61.2, 67.8, 80.8, 120.8, 125.7, 128.2, 129.0, 142.0, 144.5, 157.6, 157.8, 170.6, 181.2, 182.9, 183.1. C₃₄H₄₃N₅O₉S에 대한 분석 이론치: C, 58.52; H, 6.21; N, 10.03. 실측치: C, 58.38, H, 6.17; N, 10.20.

N-FMOC-L-알라닐-L-2-메틸프롤린, 화합물 19: DMF 6.9mL중의 2-메틸프롤린(Seebachet al. (1983)J. Am. Chem. Soc. 105:5390-5398)(1.00g, 4.76mmol), NaHCO₃4.00g(47.6mmol) 및 HOBT 31mg(0.23mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고 N-FMOC-L-알라닌 3.18g(6.66mmol)을 가했다. 반응액을 0℃에서 1시간 교반한 후 실온에서 18시간 교반하였다. 혼합물을 EtOAc 50mL와 1N HCl 3×50mL 사이에 분배시켰다. EtOAc층을 건조(MgSO₄)시키고 여과하고 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(단계 구배 45/55/1 EtOAc/헥산/HOAc 내지 47/53/1 EtOAc/헥산/HOAc 내지 50/50/1 EtOAc/헥산/HOAc)로 정제하여 백색 고체로서 화합물191.72g(86%)을 제공하였다. 생성물을 디옥산으로부터 여러번 농축시켜 미량의 아세트산을 제거하였다: mp 59-60℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 1.39 (d, 3H), 1.93 (m, 2H), 2.06 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 4.22 (m, 1H), 4.40 (d, 2H), 4.56 (m, 1H), 5.09 (t, 1H), 5.69 (d, 1H), 7.32 (t, 2H), 7.42 (t, 2H), 7.62 (d, 2H), 7.78 (d, 2H);¹³C NMR (CDCl₃) δ 17.8, 21.8, 23.8, 37.9, 47.1, 48.5, 65.9, 67.0, 120.0, 125.1, 127.1, 127.7, 141.3, 144.1, 155.6, 172.9, 175.1.

N-FMOC-L-루신일-HMPB-MBHA 수지: CH₂Cl₂22.5mL 및 DMF 몇방울중의 N-FMOC-L-루신의 용액을 제조하고 0℃까지 냉각시켰다. 이 용액에 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 1.71mL(1.38g, 10.9mmol)을 가하고 혼합물을 0℃에서 20분간 교반하였다. 혼합물을 오일로 농축하였다; 그 동안, 충분한 DMF(약 3mL)를 2.5g (0.87mmol/g, 2.18mmol) HMPB-MBHA 수지(Nova Biochem)에 가하여 수지를 팽창시켰다. 농축된 오일을 최소량의 DMF(약 1mL)에 용해시키고 팽창시킨 수지에 가한 후 약 1mL의 DMF중에 용해된 DMAP 266mg(2.18mmol)의 용액을 가했다. 혼합물을 1시간동안 부드럽게 흔들고 세척(2×DMF, 2×MeOH, 2×DMF, 2×MeOH)하였다. 수지를 진공하에서 건조시켜 2.77g(85%)를 얻었고 그 치환을 Geisen 시험으로 측정하였을 때 0.540mmol/g이었다.

아스파르트산상의 t-부틸 에스테르 및 아르기닌상의 Pmc기 및 티오에테르 삽입체를 지닌 N-FMOC-선형 펩티드, 화합물 20: 이 펩티드를 N-FMOC-L-루신일-HMPB-MBRA 수지상에서 표준 FMOC 합성으로 제조하였다. 3당량의 아미노산, HOBT 및 (DIC)를 화합물18의 커플링단계를 제외하고 각 커플링단계를 위해 사용하였다. 2당량의 화합물18을 3당량의 HOBT 및 디이소프로필카르보디이미드와 함께 사용하였다. 각 단계를 브로모페놀블루 지시약 10μL를 사용하여 검사하였다. 반응의 종료를 또한 닌히드린 시험(1mg으로 미종료 반응에 대해 푸르게 변하는 비드를 피리딘 한방울 및 EtOH중의 5% 닌히드린 한방울 및 EtOH중의 80% 페놀 한방울과 2분간 100℃에서 가열한다)으로 평가하였다. 따라서, 수지 1.13mg(0.613mmol)을 펩티드를 제조하기 위해 사용하였다. 최종 커플링 단계후에, 수지로부터 분해는 2분간 CH₂Cl₂중의 1% 트리플루오로아세트산의 용액 15mL로 처리함으로써 달성하였다. 2분후에, 용액을 MeOH중의 10% 피리딘 30mL로 감압하에서 여과하였다. 이것을 10번 반복하고 HPLC(C18, 구배, 60/40/0.1 CH₃CH/H₂O/TFA 내지 90/10/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA, 210nm, 1mL/분, 4.6mm×250mm 칼럼)에 의해 증명되는 바와 같이 펩티드를 함유한 여액을 합하고 농축하였다. 농축액을 10% HOAc 용액 40mL에 용해시키고 HPLC로 정제하여 펩티드200.528g(49%)을 얻었다.

펩티드 20의 고리펩티드 21로의 전환(FMOC기의 제거, 고리화 및 보호기의 제거): 10mL의 CH₃CN중의 DBU 99μL의 용액을 펩티드2096mg(0.052mmol)에 가했다. 용액을 1시간 교반하고 잔사로 농축하였다. 그 잔사를 2×10mL의 Et₂O로 분쇄하여 백색고체를 제공하였다. 고체를 CH₃CN 100mL 및 CH₃CN중의 디페닐포스포릴아지드(DPPA)의 0.1M 용액 312μL(0.312mmol)에 용해하였다. 혼합물을 20시간 교반하고 회전 증발기에서 농축하였다. 그 잔사를 Et₂O 2×50mL로 분쇄하고 백색 불투명한 잔사를 1시간동안 92/3/2/3 TFA/아니솔/EDT/Me₂S 5mL로 처리하였다. 생성물을 50mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 Et₂O 40mL을 혼합물에 가함으로써 침전시켰다. 침전물을 0℃로 냉각하고 2000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고 그 펠릿을 Et₂O로 세척하고 재원심분리하였다. 펠릿을 건조시키고 50/50 CH₃CN/H₂O 4mL에 용해시켰다. 혼합물을 H₂O/0.1% TFA 36mL로 희석시키고, 여과하고 HPLC(1" C₁₈칼럼, 구배, 10/90/0/1 CH₃CN/H₂O/TFA 내지 35/65/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA, 230nm)로 정제하였다. HPLC에 의해 증명되는 순수분획을 동결건조하여 화합물2152mg(90%)을 얻었다.

실시예 13:LJP 685의 콘주게이트 합성

또한 화합물21로 언급되는 LJP 685를 3-트리틸메르캡토프로피온산의 PNP 에스테르로 처리하고 결과 생성물을 탈트리틸화하여 유리 티올 링커를 가지는 펩티드, 화합물22를 얻었다. 원자가 플랫폼 분자12와 과량의 화합물22를 반응시켜 4가 콘주게이트25를 생성시켰다. 긴 링커, 화합물33(하기 반응식 참조)으로 화합물21을 처리한 후 탈트리틸화로 화합물24를 제공했다. 화합물24를 원자가 플랫폼 분자12와 반응시켜 테트라콘주게이트26을 제공하였다. 두 콘주게이션 반응이 HPLC에 의해 매우 분명하게 나타났다.

LJP 685에 MTU 링커의 부착, 화합물 24의 합성: 화합물21의 15mg(0.013mmol)에 0.5mL의 DMF중의 화합물2329.5mg의 용액 160μL 및 디이소프로필에틸아민 17.5μL을 가하였다. 혼합물을 2시간 교반하고 Et₂O로부터 침전시켰다. 침전물을 건조시키고 1/1/0.056/0.040 TFA/CH₂Cl₂/티오페놀/Me₂S의 용액 650μL에 용해하고 용액을 1시간동안 방치하였다. Et₂O로부터 침전하여 미정제 화합물24를 얻었고 이것을 HPLC(C₁₈, 15-45% CH₃CN/H₂O, 0.1% TFA)로 정제하였다. 순수 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 백색고체로서 화합물248.6mg을 제공하였다.

LJP 685-MTU-AHAB-TEG, 화합물 26: He 스파징된 pH 8.5 200mM 붕산완충액 630μL중의 화합물24의 8.6mg(6.3×10^-6mol)의 용액에 9/1 MeOH/H₂O중의 화합물12의 40mg/mL 용액 40μL를 가하였다. 혼합물을 24시간 교반하고 10% HOAc/H₂O 용액 1mL을 가했다. 혼합물을 HPLC(C₁₈, 구배 25-55% CH₃CN/H₂O, 0.1% TFA)로 정제하여 화합물26(LJP 685-MTU-AHAB-TEG) 8.3mg을 얻었다.

실시예 14:연장된 SH 링커의 전개

티오벤조에이트 에스테르, 화합물28을 화합물27로부터 제조하였다. 화합물28을 부분적으로 화합물29로 전환시켰다. 티오벤조에이트를 에탄올분해로 제거하고 그 결과의 티올을 트리틸화시켰다. 그 다음에 에틸에스테르를 가수분해하여 화합물29를 얻었다. 니트로페닐 포스페이트(PNC) 에스테르, 화합물30을 화합물29로부터 제조하였다. 화합물27을 나트륨 아지드로 처리하고 아민으로 환원시킴으로써 아미노트리옥소우데칸산 에틸에스테르, 화합물31을 제조하였다. 아민31을 화합물30으로 아실화하여 화합물32를 얻었다. 수산화나트륨으로 화합물32를 가수분해하여 유리 카르복실산을 얻었다. 중간체 카르복실산을 p-니트로페놀로 농축하여 파라-니트로페닐(PNP) 에스테르, 화합물33을 얻었다. 링커33을 펩티드에 부착하고 트리틸기를 제거하여 화합물34를 얻고 이것을 MTU-ATU-AHAB-TEG 콘주게이트를 생성하는데 사용하였다.

실시예 15:(LJP685) ₄ /MTU-ATU-AHAB-TEG 콘주게이트, 화합물 35의 합성

4가 콘주게이트35를 아래에 제시한 바와 같이 제조하였다. 링커가 부착된 펩티드, 화합물34를 He 스파징된, pH 8.5, 200mM 붕산 완충액중에 용해시켰다. 0.3몰 당량의 플랫폼화합물12를 이 혼합물에 가하였다. 이 혼합물을 1시간동안 교반하고 그 생성물을 HPLC로 정제하였다.

실시예 16:(LJP685) ₄ /DABA-PEG 콘주게이트, 화합물 36의 합성

IA-DABA-PEG를 8.5 붕산 완충액의 화합물24로 처리하여 콘주게이트36을 얻었다.

실시예 17:활성화에 대한 T 세포 분석

펩티드-자극된 T 세포에 의한 삼중수소화된 티미딘 흡수를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 모니터하였다. 배수 림프 노드세포(마우스) 또는 단리한 말초 혈액 림프구(사람), 5×10⁵의 단일세포 현탄액을 웰당 150μL의 최종부피로 1 내지 30㎍의 펩티드와 혼합시키고 5% CO₂에서 37℃에서 5일간 배양하였다. 그 때에, 1 마이크로 큐리의 표지된 티미딘을 첨가하고 추가적으로 15 내지 24시간동안 배양시켰다. 수집된 세포를 필터상에서 수집하고 액체 신틸레이션 분광광도계로 계산하였다.

실시예 18:시험관내에서의 관용성 유발

각각 5개의 C57B1/6 마우스를 함유하는 8개군에 알룸상의 LJP685-KLH의 콘주게이트 10㎍/마우스와 보조제로서B. pertussis백신을 주입하였다. 3주후에, 비장을 수집하고 단일세포현탁액을 제조하고 밸런스된 염 용액으로 세 번 세척하고 하나의 비장/1.5mL 배지와 동일한 농도로 완전한 RPMI-1640 배지에서 재현탁하였다. 세포현탁액을 2.5mL/페트리디쉬의 분액으로 나누고 (LJP685)₄-DABA-PEG, 화합물36및 (LJP685)₄-TEG, 화합물35를 100μM, 20μM 및 4μM의 농도로 37℃에서 2시간 배양하였다. 일군의 세포를 관용원없이 배양하고 양성 대조구로서 작용하였다. 그후 세포를 다량의 밸런스된 염용액으로 세척하고 2.5mL의 밸런스된 염용액에 재현탁하였다. 그후 세포를 주어진 처리군으로부터의 모든 세포가 5개의 수용체로 나누어지는 방식으로 650R 조사된 동계 수용체로 주사하였다. 양성 대조구를 포함하여 모든 수용 마우스를 그후 복강내로 염수중의 LJP685-KLH 10㎍의 부스터 면역화를 제공하였다. 부스터 면역화의 수일후에, 마우스를 방혈시키고 이들의 혈청을 항-LJP685 항체의 존재하에서 시험하였다. 콘주게이트와 함께 처리는 도 16 및 17에 도시한 바와 같이 항-LJP685의 상당한, 투여량-의존 감소를 생성하였다. 이것은 Iverson, G.M., "Assay forin vitroadoptive immune responses" in HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volume 2, Cellular Immunology(Weir, D.M., ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA, 1986)에 기재한 바와 같이 항체 결합 용량(ABC)에 의해 측정된다.

실시예 19:5A12, CB2 및 3G3 펩티드의 NMR 용액구조분석

상기 실시예에서 기술된 방법론을 사용하여 파지 라이브러리 스크린으로부터 분리된 2개의 펩티드를 NMR분석하였다. 원래의 펩티드는 마지막에서 두번째 위치에 프롤린을 가지지만 2차원(2D)이중양자 여과된 연관분광기(DQE-COSY) NMR 데이터에서 이 위치에 시스 및 트랜스 이성질체로부터의 2가지 다른 구조의 존재가 제안되기 때문에 이 아미노산을 제거했다. 프롤린의 제거로 ACA항체에 결합하기 위하여 50-100nM 범위내의 Kd를 가지며 DQF-COSY 스펙트럼의 지문 영역내에서의 피크의 예상된 수를 갖는 펩티드를 제공하였다. 결과의 고리 펩티드는 5A12(GPCLILAPDRCG)와 CB2(GPCILLARDRCG)였다. 펩티드 사이의 주요한 차이는 더 단단한 펩티드인 5A12로 구성된 CB2의 1D 1H NMR 스펙트럼에서 훨씬 더 적은 분산을 초래하는 위치 8에서 프롤린의 아르기닌으로의 치환이다. 아르기닌 치환은 또한 pKa값으로 반영되는 바와같은 이온화된 아스파르틸 카르복시기의 0.55kcal/mol 안정화를 얻는다. 구조분석을 더욱 순서화된 5A12 펩티드상에서 수행하였다. 비록 중수소 교환과 온도계수 데이터에서 어떤 수소 결합의 증거도 제시되지 않았지만 Nuclear Overhauser Effect(NOE), Rotating Overhauser Effect(ROE)및 커플링 데이터는 하나의 구조로 구성되어 있다. 간격 기하학적 계산으로 50개 구조부류를 얻었다. 최고 15개는 2.1±0.2옹스트롬의 모든 원자에 대하여 제곱평균제곱근 편차(RMSD)를 가졌다. 본 발명자는 펩티드가 분자의 반대편 말단에서 디술피드에서 그리고 시스인 프롤린 8에서 회전을 하는 타원형 모양을 갖는다는 결정하였다. 골격 LIL부위에서 또한 꼬임이 있다. 마지막으로, 카르복시말단 글리신은 양성 잔기내 NOE를 가지고 있는 잔기이기 때문에 매우 유동적이다. 이것은 β₂-GPI상에 ACA 에피토프와 흡사한 펩티드에 대하여 측정된 첫번째 구조적 정보를 나타낸다.

간격 기하학적 계산으로 커플링된 NMR 데이터는 펩티드 925(CLGVLAKLC)의 3차원 구조, 925 펩티드의 6위치에서 글리신에 대하여 치환된 알라닌을 갖는 펩티드 3G3(AGPCLGVLGKLCPG)의 절단 버젼을 측정하기 위해 사용하였다. 펩티드 925의 구조는 pH 3.8 및 25℃에서 물중에서 측정하였다. 총 9개 구조는 모두 NMR 데이터와 일치하게 계산되었다. 모든 비-수소원자에 대한 RMSD는 각 구조를 중심과 비교할 때 2.45±0.36 옹스트롬이었다. 도 18은 총 중심에 가까운 구조를 나타내므로 펩티드 925 분자 모양의 합당한 대표이다. 도 19는 펩티드 925의 구조(도면의 저부에 3G3으로 표지됨)와 펩티드 5A12의 구조를 비교한다. 이 두 펩티드는 펩티드 서열에서의 거의 같은 위치에 회전을 가진다.

펩티드의 약물단을 작은 소수성기 및 양으로 하전된 기로서 시험적으로 동정하였다. 겜-디메틸 및 펩티드 925의 아미노기를 도 20에 도시한 바와 같이 이 펩티드의 약물단으로서 시험적으로 동정하였다. 몇몇 골격에 약물단기를 결합시키는 탄화수소 링커는 도 20에 명기된 길이를 가지며 링커가 골격에 부착되는 위치는 명기된 간격에 의해 분리된다. 마지막으로 두 링커의 상대적 방향을 나타내는 평면각은 22°로 측정되었다.

실시예 20:TEG 카르바메이트 링커의 합성

2-[2-(2- tert -부틸티오에톡시)에톡시]에탄올, 화합물 38: 2-[2-(2-클로로에톡시)에톡시]에탄올(11.0g, 65.24mmol) 및 얼음욕에서 냉각된tert-부틸티올(7.35mL, 65.23mmol)의 혼합물에 1,8-디아자비시클로[5.40]운데스-7-엔(DBU, 9.75mL, 65.23mmol)을 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 다음에 하룻밤 교반하였다. 다음에 이 혼합물을 아세트산에틸로 희석하고 여과하였다. 여액중의 미정제 생성물을 아세트산에틸로 용리한 필터 칼럼상에서 정제하여 황색 오일(14.4g, 64.6mmol, 99%)을 얻었다:¹H NMR(300Mhz, CDCl₃): d 3.73(br s, 2H), 3.69-3.60(m, 8H), 2.75(t, J=7.4, 2H), 2.62(br s, 1H), 1.32(s, 9H);¹³C NMR(75Mhz, CDCl₃): d 72.47, 71.08, 70.33, 70.27, 61.71, 42.09, 30.95, 27.87; MS (ESI): m/e (M+1) C₁₀H₂₃O₃S에 대한 이론치: 223, 실측치: 223.

2-[2-(2- tert -부틸티오에톡시)에톡시]에틸 p-니트로페닐 카보네이트, 화합물 39:

얼음욕에서 냉각시킨 건조 THF 5mL중의 화합물 38(2.0g, 8.98mmol) 및 p-니트로페놀 클로로포르메이트(1.81g, 8.98mmol) 용액에 건조 THF 1mL중의 건조 피리딘(0.73mL, 8.98mmol)을 서서히 가하였다. 백색 침전이 바로 석출되었다. 15분동안 실온에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 에테르 10mL로 희석하고 여과하였다. 여액을 농축하고 더 이상 정제하지 않고 펩티드 합성에 바로 사용하였다.

실시예 21: 4가의 플랫폼 IA/DABA/ATEG, 46 비스-N-(t-부톡시카르보닐)-디아미노벤조산, 화합물 40의 합성: MeOH 5.5mL중의 디-t-부틸디카보네이트 7.18g(32.9mmol) 용액을 H₂O 44.5mL 및 MeOH 22.5mL중의 NaHCO₃2.76g(32.9mmol) 및 3,5-디아미노벤조산 2.5g(16.4mmol) 용액에 서서히 가하고, 혼합물을 24시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 시트르산 6.53g을 가하고 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 EtOAc 층을 건조시키고(MgSO₄), 여과하고 농축하였다. 잔사를 Et₂O 40mL에 용해하고 용액을 용액을 셀리트를 통해 여과하였다. Et₂O층을 HCl 40mL로 2회 추출하였다. Et₂O층을 건조시키고(MgSO₄), 여과하고 농축하여 기포성 핑크색 고체로서403.81g(66%)을 얻었다.

화합물 40의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 화합물 41:

디시클로헥실카르보디이미드(3.34g, 16.2mmol)를 0℃로 냉각시킨 EtOAc 55mL중의 N-히드록시숙신이미드 1.24g(10.8mmol) 및 화합물403.8g(10.8mmol) 용액에 가하고, 얻은 혼합물을 18시간 교반하여 실온으로 하였다. 이 혼합물에 아세트산 0.55mL를 가하였다. 혼합물을 30분동안 교반하고 2시간동안 냉동기에 놓았다. 혼합물을 여과하여 고체를 제거하고 여액을 농축하여 핑크색 기포성 고체 5.80g을 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피(60/40/1 헥산/EtOAc/HOAc)로 정제하여 약간 핑크색인 고체로서 화합물414.30g(89%)을 얻었다.

모노-N-(t-부톡시카르보닐)-에틸렌디아민, 화합물 42: CH₂Cl₂15mL중의 에틸렌디아민 1.5g(25.0mmol) 용액을 0℃로 냉각시키고 디-t-부틸디카보네이트 1.82g(8.33mmol) 용액을 혼합물에 서서히 가하였다. 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하고 여과하고 여액을 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(90/10/1 CH₂Cl₂/MeOH/HOAc)로 정제하여 오일로서 화합물42를 얻었다.

비스-N-(t-부톡시카르보닐)-아미노-TEG, 화합물 43: CH₂Cl₂6mL중의 피리딘 345μL(337mg, 4.25mmol) 및 화합물42750mg(4.25mmol) 용액에 트리에틸렌글리콜 비스-클로로포르메이트 445μL(559mg, 2.02mmol)를 가하였다. 혼합물을 3.5시간동안 교반하고 혼합물을 CH₂Cl₂35mL 및 1N HCl 35mL 사이에 분배하였다. CH₂Cl₂층을 H₂O로 세척하고 건조시키고(Na₂SO₄), 여과하고 농축하여 미정제 화합물431.14g을 얻었고 이것을 다음 단계에 바로 사용하였다.

디아미노-TEG 비스-트리플루오로아세테이트 염, 화합물 44: 화합물43300mg(0.57mmol)을 CH₂Cl₂3.5g에 용해하고 트리플루오로아세트산 3.5mL를 가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하고 용액을 농축하여 미정제 화합물44398mg을 얻었고 이것을 다음 단계에 바로 사용하였다.

화합물 45: 디옥산 6mL중의 화합물41567mg 용액을 미정제 화합물44398mg(est. 316mg, 0.57mmol) 및 NaHCO₃193mg(2.30mmol) 용액에 가하였다. 혼합물을 3시간동안 교반하고 1N HCl로 산성화하고 1N HCl 20mL 및 EtOAc 30mL 사이에 분배하였다. 합한 ETOAc 층을 NaHCO₃포화용액으로 세척하고 건조시키고(MgSO₄), 여과농축하여 백색 기포성 고체로서 미정제 화합물45490mg(86%)을 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피(EtOAc)로 정제하여 백색 기포성 고체로서 화합물45276mg(48%)을 얻었다.

IA/DABA/ATEG, 화합물 46: 화합물45100mg(0.1mmol) 용액을 제조하고 트리플루오로아세트산 1mL를 가하고 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에서 농축하였다. 잔사를 Et₂O로 분쇄하고 진공하에서 건조시켜 백색 결정성 고체를 얻었다. 이 고체를 DMF 1mL에 용해하고 디이소프로필에틸아민 104μL(77mg, 0.6mmol)를 가하고 혼합물을 0℃로 냉각하고 무수 요도아세트산 212mg(0.6mmol)을 가하였다. 얼음욕을 제거하고 혼합물을 2시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 1N H₂SO₄로 산성화하고 1N H₂SO₄10mL 및 8/2 CH₂Cl₂/MeOH 6×20mL 사이에 분배하였다. 합한 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과농축하여 오렌지색 오일 330mg을 얻었다. 제조 HPLC(25cm×22.4cm C₁₈, 구배: 30%B 내지 40%B 0-40분, A=H₂O/0.1% TFA, B=CH₃CN/0.1% TFA, 12mL/분)로 정제하여 백색 고체로서 화합물4619mg을 얻었다.

실시예 22: 4가 플랫폼 BA/PABA/DT/TEG, 51, N-(t-부톡시카르보닐)PABA, 화합물 47의 합성: H₂O 60mL중의 p-아미노벤조산 3.0g(21.9mmol) 용액을 제조하였다. Na₂CO₃(2.16g, 25.7mmol)을 서서히 가한 다음에 MeOH 30mL를 가하였다. 모든 고체가 용해되었을 때, MeOH 10mL중의 디-t-부틸디카보네이트 4.77g(21.9mmol) 용액을 가하고 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물에 시트르산 4.92g(25.6mmol)을 가하고 얻어진 탁한 혼합물을 H₂O 200mL 및 EtOAc 200mL 사이에 분배하였다. EtOAc 층을 0.1N HCl 200mL 및 H₂O 200mL로 연속적으로 세척하고 건조시키고(Na₂SO₄), 여과농축하여 백색 고체로서 화합물473.0g(58%)을 얻었다.

N-(t-부톡시카르보닐)PABA N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 화합물 48: DCC(2.61g, 12.6mmol)를 EtOAc 50mL중의 N-히드록시숙신이미드 0.97g(8.43mmol) 및 화합물472.0g(8.43mmol)의 0℃ 용액에 가하였다. 혼합물을 30분동안 5-7℃에서 그리고 16시간동안 실온에서 교반하였다. 우유빛 혼합물을 H₂O 200mL가 들어 있는 분별 깔때기에 넣고 H₂O 층의 pH를 3M NaOH 용액으로 10으로 조정하고, 혼합물을 4/1 CH₃Cl/MeOH 200mL로 추출하였다. 유기상을 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여 화합물490.971g(40%)을 얻었고 이것은 다음 단계에 사용하기에 충분할 정도로 순수하였다. 수층을 4/1 CH₃Cl/MeOH 100mL씩 6회 추출하였다. 유기층을 합하고 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여 화합물491.08g(44%)을 더 얻었고 이것은 더 정제할 필요가 있었다. 추가의 정제는 실리카 겔 크로마토그래피(구배, 80/20 내지 70/30 CH₃Cl/MeOH)로 수행하였다.

화합물 49: CH₂Cl₂50mL중의 화합물483.00g(8.97mmol) 용액을 얼음욕에서 냉각한 CH₂Cl₂30μL중의 디에틸렌트리아민 485μL 용액에 30분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 30분동안 5-7℃에서 그리고 16시간동안 실온에서 교반하였다. 이 우유빛 혼합물을 H₂O 200mL가 들어 있는 분별 깔때기에 넣고 H₂O층의 pH는 3M NaOH로 10으로 조정하고, 이 혼합물을 4/1 CH₃Cl/MeOH 200mL로 추출하였다. 유기상을 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여 화합물490.971g(40%)을 얻었고, 이것은 다음 단계에 사용하는데 충분할 정도로 순수하였다. 수층을 4/1 CH₃Cl/MeOH 100mL씩 6회 추출하였다. 유기층을 합하고 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여 화합물491.08g(44%)을 더 얻었고 이것은 더 정제할 필요가 있었다. 추가의 정제는 실리카 겔 크로마토그래피(구배, 80/20 내지 70/30 CH₃Cl/MeOH)로 수행하였다.

화합물 50: THF 0.3mL중의 트리에틸렌글리콜 비스-클로로포르메이트 135μL(0.66mmol) 용액을 THF 13mL중의 디이소프로필에틸아민 275μL(1mmol) 및 화합물49855mg(1.58mmol)의 0℃ 용액에 가하였다. 탁한 혼합물은 얼음욕을 제거했을 때 맑아졌다. 혼합물을 전체 3시간동안 실온에서 교반하고 H₂O 25mL 및 EtOAc 25mL 사이에 분배하였다. 수층을 두 번째 EtOAc 25mL로 추출하고, 합한 EtOAc 층을 건조시키고(Na₂CO₃) 여과농축하여 미정제500.986g을 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피(80/4/16 CH₃Cl/디옥산/이소프로판올)로 정제하여 백색 고체로서 화합물50516mg을 얻었다.

BA/PABA/DT/TEG의 제조, 화합물 51: 화합물 50(487mg, 8.79mmol)을 CH₂Cl₂9mL 및 트리플루오로아세트산 5mL에 용해하였다. 혼합물을 1.5시간동안 교반하고 농축하였다. 잔사를 Et₂O 7mL로 분쇄하고 MeOH 5mL 및 48% HBr 용액 1mL에 용해하였다. 혼합물을 농축하고 건조될 때까지 진공하에 두었다. 얻어진 HBr 염을 H₂O 10mL에 용해하고 NaHCO₃191mg(2.27mmol)을 가하였다. 디옥산 10mL중의 무수 브로모아세트산 591mg(2.27mmol) 용액을 혼합물에 가하였다. 디옥산 2mL를 더 세정하는데 사용하였다. 추가의 NaHCO₃을 염기성 pH를 유지하는데 필요한 만큼 가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하고 1N H₂SO₄로 산성화하였다. 혼합물을 EtOAc 3×25mL로 추출하였다. 합한 EtOAc 층을 건조시키고(Na₂SO₄), 여과농축하여 오일 773mg을 얻었다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피(구배, 90/10 내지 85/15 CH₃Cl/MeOH)로 수행하여 백색 고체로서51401mg(77%)을 얻었다.

실시예 23: 4가의 플랫폼 BMP/TEG, 55. 디메틸-5-히드록시이소프탈레이트, 화합물 52의 합성: MeOH 30mL중의 농 HCl 0.5mL 및 5-히드록실소프탈산 2.00g(11mmol) 용액을 5시간동안 환류하였다. 혼합물을 농축하고 얻은 잔사를 EtOAc 100mL에 용해하였다. EtOAc 용액을 NaCl 포화용액 50mL씩 2회, 5% NaHCO₃용액 50mL씩 2회 연속적으로 세척하고 건조시키고(Na₂CO₃) 여과농축하여 백색 결정성 고체로서522.09g(90%)을 얻었다.

화합물 53: 트리에틸렌글리콜 디토실레이트 546mg(1.19mmol)을 CH₃CN 11mL중의 K₂CO₃395mg(2.86mmol) 및 화합물52500mg(2.38mmol)의 현탁액에 가하고 혼합물을 16시간동안 N₂하에서 환류하였다. 혼합물을 농축하고 잔사를 CHCl₃25mL에 용해하고 H₂O 25mL 및 NaCl 포화용액 25mL로 세척하였다. CHCl₃층을 건조시키고(Na₂SO₄) 여과농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(구배, 50/50 헥산/EtOAc 내지 100% EtOAc)로 정제하여 화합물5393mg(41%)을 얻었다.

화합물 54: THF 4mL중의 화합물5393mg(0.18mmol)의 현탁액을 N₂분위기하에서 교반하는 동안 LiBHEt₃의 1M 용액 1.82mL(1.82mmol)를 혼합물에 적가하였다. 맑은 용액을 얻었고 이것을 18시간동안 교반하고 이때 물중의 HOAc의 10% 용액을 pH가 산성이 될 때까지 가하였다. 혼합물을 진공하에서 농축하고 잔사를 물 10mL에 용해하였다. 혼합물을 EtOAc 3×10mL씩으로 추출하고, 합한 EtOAc 층을 건조시키고(Na₂SO₄) 여과하고 농축하였다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피(구배, 90/10 내지 85/15 CH₃Cl/MeOH)로 수행하여 백색 고체로서5420mg(27%)을 얻었다.

화합물 55: Et₂O 5mL 및 THF 1mL중의5420mg(0.048mmol)의 현탁액에 PBr₃9.6μL(0.1mmol)를 가하였다. 혼합물을 3시간동안 교반하고 EtOAc 사이에 분배하였다. EtOAc 층을 건조시키고(Na₂SO₄) 여과농축하고 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(CH₃Cl/MeOH)로 정제하여 화합물55를 얻었다.

실시예 24: 4가의 플랫폼 BA/PIZ/IDA/TEG, 60., 화합물 56의 합성: 0℃로 냉각한 건조 THF 50mL중의 N-히드록시숙신이미드 1.01g(8.75mmol) 및 N-(t-부톡시카르보닐)이미노디아세트산(화합물5, U.S. 5,552,391, Chemically-Defined Non-Polymeric Valency Platform Molecules and Conjugates Thereof)의 용액에 디시클로헥실카르보디이미드 2.26g(10.94mmol)을 가하였다. 혼합물을 16시간동안 교반하여 실온으로 서서히 가온하고 THF 25mL중의 모노-CBZ-피페라진 2.22g(10.1mmol) 용액을 혼합물에 가한 다음에 Et₃N 1.22mL(887mg, 8.75mmol)에 가하였다. 혼합물을 실온에서 7시간동안 교반하고 여과하였다. 여액을 농축하고 잔사를 EtOAc 125mL에 용해하고 1N HCl 2×125mL씩, NaHCO₃포화용액 125mL로 진탕하고 건조시키고(MgSO₄) 여과농축하여 점성의 고체 2.39g을 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피(95/5 CH₂Cl₂/MeOH)로 정제하여561.85g(66%)을 얻었다.

화합물 57: CH₂Cl₂10mL중의 화합물561.74g(2.74mmol) 용액에 트리플루오로아세트산 10mL를 가하고 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하고 혼합물을 농축하고 잔사를 CH₂Cl₂5mL에 용해하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 포화 NaHCO₃100mL를 가하였다. 다음에 혼합물을 CH₂Cl₂100mL씩 4회로 추출하였다. CH₂Cl₂층을 합하고, 건조시키고(MgSO₄) 여과농축하여 점성의 흡습성 고체로서571.46g(99%)을 얻었고 이것을 다음 단계에 바로 사용하였다.

화합물 58: 0℃에서 화합물570.7g(1.3mmol) 및 디이소프로필에틸아민 226μL(168mg, 1.30mmol) 용액에 CH₂Cl₂4mL중의 트리에틸렌글리콜 비스클로로포르메이트 127μL 용액을 가하고 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하고 혼합물을 CH₂Cl₂80mL 및 1N HCl 80mL에 분배하였다. CH₂Cl₂층을 물 80mL씩 2회로 세척하고 건조시키고(MgSO₄) 여과농축하여 결정성 고체로서58736mg(93%)을 얻었다.

화합물 60: 화합물58(61mg, 0.48mmol)을 30% HBr/HOAc 3mL에 용해하고 얻어진 혼합물을 1시간동안 실온에서 교반하고 이 때 Et₂O 5mL를 가하였다. 혼합물을 1시간동안 냉동기에 넣고 원심분리하였다. 얻어진 펠릿을 Et₂O로 세척하고 건조시켜 테트라히드로브로마이드 염59를 얻었고 이것을 H₂O 1mL에 용해하였다. 혼합물에 NaHCO₃49mg(0.58mmol) 및 디옥산 3mL를 가하였다. NaHCO₃을 필요하면 더 가하여 혼합물을 염기성으로 하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 무수 브로모아세트산 748mg(2.89mmol)을 가하였다. 혼합물을 2시간동안 교반하고 1N H₂SO₄20mL 및 80/20 CH₂Cl₂/MeOH 20mL 사이에 분배하였다. 유기층을 건조시키고(Na₂SO₄) 여과농축하여 미정제물60을 얻었고 이것을 실리카 겔 크로마토그래피(CH₂Cl₂/MeOH)로 정제하여60을 얻었다.

실시예 25: 4가의 플랫폼 테트라키스-BAIPIZ/PMA, 63. 화합물 61의 합성: THF 50mL중의 N-히드록시숙신이미드 1.16g(10.1mmol) 및 피로멜리트산 640mg(2.52mmol)의 0℃ 용액에 디시클로헥실카르보디이미드 2.6g(12.6mmol)을 가하고 혼합물을 16시간동안 교반하면서 실온으로 되게 하였다. THF 25mL중의 모노-CBZ-피페라진 2.5g(11.3mmol) 용액을 혼합물에 가한 다음에 Et₃N 1.4mL(1.02g, 10.1mmol)를 가하였다. 잔사를 EtOAc 100mL 및 1N HCl 2×100mL 사이에 분배하고 EtOAc 층을 포화 NaHCO₃100mL, H₂O 100mL, 포화 NaHCO₃100mL로 세척하고 건조시키고(MgSO₄) 여과농축하였다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피(97.5/2.5 CH₂Cl₂/MeOH)로 수행하여 백색 결정성 고체로서 63 1.78g(66%)을 얻었다.

화합물 63: 화합물61을 실시예 23에서58을60으로 전환시키는데 대해 기재한 바와 본질적으로 동일한 방법으로 화합물63으로 전환시킨다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 수행한다.

실시예 26: 4가의 플랫폼 BA/PIZ/IDA/HB/TEG, 68. 화합물 64의 합성:

트리에틸렌글리콜 디토실레이트(1.0g, 2.18mmol)를 에틸 4-히드록시벤조에이트 725mg(4.36mmol) 및 K₂CO₃723mg(5.23mmol) 용액에 가하고 혼합물을 16시간동안 환류하였다. 혼합물을 농축하고 잔사를 물 20mL 및 Et₂O 3×20mL 사이에 분배하였다. 합한 유기층을 NaHCO₃포화용액 2×40mL, NaCl 포화용액 40mL로 세척하였다. 수층을 Et₂O로 세척하고 합한 Et₂O층을 건조시키고(MgSO₄) 여과농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(70/30 헥산/EtOAc)로 정제하여 결정성 고체로서64902mg(93%)를 얻었다.

화합물 65: 화합물64를 2.2당량의 LiOH를 함유하는 아세톤에 용해하고 혼합물을 3시간동안 교반한다(TLC로 확인하여 종료될 때까지). 혼합물을 아세트산으로 산성화하고 농축하고 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여65를 얻는다.

화합물 66: 화합물66은 실시예 23에서 화합물56을 제조하는 방법과 유사하게 제조한다. 화합물65는 N-BOC-이미노아세트산 대신에 사용하고 화합물57은 모노-CBZ-피페라진 대신에 사용한다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 수행한다.

화합물 68: 화합물66을 실시예 23에서58을60으로 전환시키는데 대해 기재한 바와 본질적으로 동일한 방법으로 화합물68로 전환시킨다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 수행한다.

실시예 27: 4가의 플랫폼 BA/PIZ/HIP/TEG, 72.의 합성

화합물 69: 화합물53을 4.4당량의 LiOH를 사용하는 것만 제외하고 실시예 25에서64의 가수분해에 대해 기재한 바와 본질적으로 동일한 방법으로 LiOH로 가수분해한다.

화합물 70: 테트라산인 화합물69는69를 피로멜리트산 대신에 사용하는 것만 제외하고 실시예 24에서 피로멜리트산을61로 전환시키는데 대해 기재한 바와 본질적으로 동일한 방법으로 화합물70으로 전환시킨다.

화합물 72: 화합물70을 실시예 23에서58을60으로 전환시키는데 대해 기재한 바와 본질적으로 동일한 방법으로 화합물72로 전환시킨다. 정제는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 수행한다.

실시예 28: 할로아세틸화된 4가의 화합물의 콘주게이트의 합성

(LJP685) ₄ /MTU/A/DABA/ATEG 콘주게이트 화합물 73의 합성:

헬륨중의 화합물2421mg(15.5μmol) 용액을 pH 8.5 200mM 보레이트 완충액으로 스파징하였다. 이 용액에 IA/DABA/ATEG, 화합물463.25mg(2.6μmol)으로 이루어지는 제2용액을 가하고, MeOH 396μL에 용해하였다. 침전이 형성되고 MeOH 1mL를 가하여 모든 고체를 용해하였다. 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하고 9/1 H₂O/HOAc 6mL를 가하였다. 혼합물을 H₂O/CH₂CN 50mL로 희석하고 HPLC 제조 칼럼상에 적재하였다. 정제는 제조 HPLC(25cm×22.4cm C₁₈구배: 35%B 내지 45%B 0-40분. A=H₂O/0.1% TFA, B=CH₃CN/0.1% TFA, 12mL/분)로 수행하여 동결건조시킨 후에 고체로서 화합물7310.8mg(67%)을 얻었다.

(LP685) ₄ /MTU 콘주게이트, 화합물 74, 75, 76, 77 및 78의 합성:

이들 콘주게이트는 플랫폼 화합물46을 적당한 플랫폼 화합물로 치환함으로써 콘주게이트73의 합성에 기재한 바와 동일한 반응조건에 의해 플랫폼 화합물51,60,63,68및72각각으로부터 제조한다. Pep는 LJP685 또는 다른 적절한 펩티드일 수 있다.

실시예 29: 콘주게이트 4가의 플랫폼 55, 콘주게이트 화합물 79, (LJP685) ₄ /MP/TEG의 합성:

용액은 DMF중의 4당량의 화합물24및 5당량의 Cs₂C₃으로 제조한다. 1당량의 BMP/TEG인 플랫폼 화합물55를 혼합물에 가한 다음에 1시간동안 교반한다. 혼합물을 80/20/10 H₂O/CH₃CN/HOAc로 희석하고 제조 HPLC 칼럼상에 적재한다. 정제는 제조 HPLC(C₁₈, A=H₂O/0.1% TFA, B=CH₃CN/0.1% TFA)로 수행하여 동결건조후 화합물79를 얻는다. Pep는 LJP685 또는 다른 적절한 펩티드일 수 있다.

실시예 30: 콘주게이트 4가의 플랫폼 테트라키스-BMB, 콘주게이트 화합물 80, (LJP685) ₄ /MTU/테트라키스-MB의 합성:

용액은 DMF중의 4당량의 화합물24및 5당량의 Cs₂C₃으로 제조한다. 1당량의 테트라키스-브로모메틸벤젠을 혼합물에 가한 다음에 1시간동안 교반한다. 혼합물을 80/20/10 H₂O/CH₃CN/HOAc로 희석하고 제조 HPLC 칼럼상에 적재한다. 정제는 제조 HPLC(C₁₈, A=H₂O/0.1% TFA, B=CH₃CN/0.1% TFA)로 수행하여 동결건조후 화합물80을 얻는다. Pep는 LJP685 또는 다른 적절한 펩티드일 수 있다.

실시예 30: FITC-GPCILLARDRCG(CB2 ^* )의 형광분극 펩티드 결합분석 합성

탄산나트륨(Na₂CO₃, pH ~10.5) 20mg을 함유하는, ACN/물(1:1) 20mL중의 환식 디술피드 펩티드 GPCILLARDRCG(20.0mg, 14.4μmol) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(5.6mg, 14.4μmol) 용액을 실온에서 교반하였다. 반응을 분석용 HPLC로 모니터하였다. 형광 표지된 시약을 소비한 후에, 미정제 물질을 A는 H₂O중의 0.1%(v/v) TFA이고 B는 CAN중의 0.085%(v/v) TFA인 30 내지 55%B로 40분에 걸쳐 선형 구배하면서 10mL/분에서 용리한 제조 HPLC상에서 정제하였다. FITC 펩티드를 동결건조한 후에 담황색 분말(3.7mg, 15% 수율)로서 얻었다: MS (ESI): m/e(M+1) C₇₃H₁₀₂N₁₉O₂₀S₃에 대한 이론치: 1661, 실측치: 1661.

직접 결합하는 형광 분극의 결합 분석(dbFP)

방법은 Pan Vera Application Guide(1994), Pan Vera Corporation에 기재되어 있다. 요약하면, 미량의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 펩티드(CB2^*-F)를 항체(ACA 6501 또는 6701)로 적정하고 샘플에 대한 분극을 항체 농도에 대해 플롯화한다. 분극은 Pan Vera Beacon 장치로 측정하였다. 데이터를 방정식 1에 대입하였다.

상기 식에서 Y는 Y-축값(밀리-분극단위, mP)이고, R은 항체 리셉터의 전체 농도이고, P_L는 FITC-표지된 펩티드가 없는 분극도(F)이고, P_H는 R과 콤플렉스 한 F에 대한 분극도(FR)이다. K_D는 FR 콤플렉스로부터 F에 대한 분리상수(결합상수)이다. 이들 식이 유효하기 위해서, F〈〈R인 것이 참이어야 한다. 이 적정은 ACA-6701 및 ACA-6501 항체 각각에의 CB2^*-F 결합에 대해 도 22 및 도 23에 도시되어 있다. 완전한 적정은 도 23에 도시된 대로 ACA-6501로 얻어지지 않았으나 사전 적정은 241nM의 K_D을 얻은 도 24에 도시되어 있다. 항체에 대해 약간 초과한 CB2^*(GPCILLARDRCG)를 6701로부터 CB2^*-F를 치환하는데 가하여 배가에(도 25 참조)t_1/2=38초에 대응하는 K_off=0.0184초^-1인 분리속도 상수를 CB2^*-F에 대해 측정하였다. 얻은 K_D256nM은 K_on=3.6×10⁴M^-1초^-1인 회합속도 상수에 대응한다(항체 이가물에 대한 보정후). 따라서, ACA-6701에의 CB2^*-F 결합은 이들 두 분자로만 제한된다.

경쟁적 형광분극 분석(cFP)

상기한 dbFP 분석은 FITC-표지된 펩티드에 대한 결합상수를 제공하고 정제된 항체 약 0.5mg에 필요하다. cFP 분석은 FITC군이 부족한 펩티드에 대한 결합상수를 제공하고 약 10μg 보다 적게 항체를 소비한다. cFP 분석은 50배 적게 항체를 소비하도록 Pan Vera Applications Guide(1994) Pan Vera Corporation에 보고된 대로 변형된다. 요약하면, 항체(ACA 6701)는 미량의 FITC 표지된 펩티드(CB2^*-F)와 혼합하고 평형이 되는데 충분한 시간이 주어진다. 이것은 ACA 6701 및 CB2^*-F에 대해 1시간이었다. 다음에 시험할 증가 농도의 비표지된 펩티드(CB2^*또는 3B10)를 관에 넣었다. 충분한 시간으로 대략 15분동안 각각 넣은 후에 평형이 되게 하고 mP값을 판독하였다. F〈〈R이 되도록 6701^R및 CB2^*-F의 농도(F)를 선택하는 것이 필요하지만, R의 농도는 측정 분극도(P_H)가 P_L보다 현저하게 높도록 충분히 높아야 할 필요가 있다(도 22 참조). 이 Δ(mP) 값은 신뢰성있는 결과를 보장하기 위해 20 이상의 mP 단위여야 한다.

Δ(mP)=P_H-P_I

비표지된 (FITC 없음) 펩티드 (I)를 가하여 F가 R에 결합하는 것을 억제시키고 Y는 P_H의 최대값에서 수학식 1에서와 같은 P_L의 평탄역으로 감소된다. 이들 적정은 CB2^*및 3B10 각각에 의해 ACA-6701로부터 CB2^*-F를 치환하는데 대해 도 26 및 도 27에 도시되어 있다. 이 적정을 기술하는 수학식을 유도하고 이것은 다음과 같다:

상기 식에서 P_L은 수학식 1에서와 같고, I는 비표지된 펩티드 경쟁자의 농도이며, K_I'는 그 펩티드에 대한 겉보기 분리상수이다. 이들 파라미터에 대한 값은 cFP 적정 데이터를 상기 수학식에 대입함으로써 얻었다.

I에 대한 참 분리상수는 수학식 4로부터 얻는다.

K_I=K_I'/(1.0+R/K_D)

상기 식에서 R 및 K_D는 수학식 1에서와 같이 정의된다. R/K_D비는 P_H'(수학식 3으로부터)과 P_H및 P_L(수학식 1로부터)의 값으로부터 수학식 5를 사용하여 얻어진다.

R/K_D=(P_H'-P_L)/(P_H-P_H')

일반적으로, 수학식 5는 수학식 1에 의해 정의된 적정이 "표준 곡선"으로서 수행될 때의 aPL 항체 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, K_I를 측정하는 방법을 제공하는 이외에, 이 방법은 모든 aPL 항체 모액의 농도를 표준화하고 cFP 분석당 항체 5-10μg만을 사용하여 시간에 대한 이들의 결합활성/안정성을 분석하는 방법을 제공한다.

dbFP 및 cFP에 의해 측정된 분리상수

펩티드	항체	서열	K_D ^a또는 K_I
CB2^*-F	6501	FITC-GPCILLARDRCG	482 nM^a
CB2^*-F	6701	FITC-GPCILLARDRCG	512 nM^a
CB2^*	6701	GPEILLARDRCG	35 nM
3B10	6701	AGPCLLLAPDRCPG	313 nM
a는 이가의 항체에서 계산하지 않은 수학식 1로부터 측정한 K_D값을 보정하기 위해 2를 곱한 K_D값이었다.

결과는 CB2^*-F를 두개의 매우 상이한 aPL 항체인 ACA-6501 및 ACA-6701과 교차반응시켜 동일한 고 친화성으로 둘다에 결합하는 것을 입증하고 있다. FITC군의 제거는 CB2^*의 ACA-6701에의 결합을 14배 개선시켰다. 관련 펩티드인 3B10의 결합은 CB2^*의 ACA-6701에의 결합보다 9배 적었다. 이 결과는 3B10상의 추가의 구조잔기로 인할 수 있으나, CB2^*-F에서의 위치 8에서 아르기닌을 프롤린으로 치환한 것에 기인할 수도 있다. 3B10과 유사한 펩티드 5A12의 사전의 NMR 구조연구는 턴위치에 있는 이 프롤린이 구조 견고성을 부여한다는 것을 나타냈다. CB2는 훨씬 더 견고한 펩티드이고 이 위치에 아르기닌을 갖는다. CB2 같은 보다 견고한 펩티드는 주어진 항체 결합부위를 고정시키기 위해 그 형상을 보다 용이하게 조정할 수 있기 때문에 더 교차반응시킬 수 있다. 결합 친화성에 대한 약물 견고함의 관계는 Koehleret al., p.251, GUIDEBOOK ON MOLECULAR MODELING IN DRUG DESIGN(Academic Press, N. Cohen, ed., 1996)에 논의되어 있다.

실시예 31: 펩티드 콘주게이트의 관용성 활성

동일한 펩티드를 함유하는 두가지 상이한 콘주게이트를 생체내에서 항원 특이적 관용성을 유발하기 위한 그 활성에 대해 시험하였다. 요약하면, 마우스를 펩티드-특이적 메모리 B세포를 생성하기 위해 면역원 담체 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 콘주게이트된 펩티드로 면역시켰다. 3주후에 군당 5마리의 마우스의 군을 시험 콘주게이트의 다양한 투여량으로 처치하고 일군의 마우스를 처치하지 않고 대조구로 하였다. 5일 후에, 대조구를 포함하는 모든 마우스를 KLH에 콘주게이트된 펩티드로 증강시키고 7일 후에 모든 마우스를 방혈시켜 그 혈청을 변형된 Farr 분석을 사용하여 항-펩티드 항체에 대해 분석하였다. 항원결합능(ABC)을 G.M.Iverson, "Assay forin vivoadoptive immune response", Volume II, Chapter 67, HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(Blackwell Scientific Publications, Weir et al., eds., 4th ed., Oxford, 1986)에 기재된 방법에 따라 각 개개의 혈청 샘플에 대해 계산하였다. 이들 값을 군의 모든 개개에 대한 평균 및 표준편차를 측정하는데 사용하였다.

콘주게이트중 한 개가 관용성을 유발하면, 그 나머지는 시험한 투여량 범위에 대해 항펩티드 항체를 억제하지 못하였다. 이 차이에 대한 가장 그럴듯한 설명은 나머지 콘주게이트는 생체내에서 짧은 반감기를 갖는다는 것이다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체내에서 관용성을 유발하는 시스템을 사용함으로써 반감기 생각을 무효로 하고 다음에 세포를 조사한 부형제로 운반하였다. 요약하면, KLH에 콘주게이트된 펩티드를 주입한 마우스로부터 비장 세포를 수집하여 시험 콘주게이트의 다양한 투여량으로 37℃에서 2시간동안 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 일군의 세포를 관용원 없이 배양하고 양성 대조구로 하였다. 세포를 세척하고 조사한 친연성 수용체로 전사하고 KLH에 콘주게이트된 펩티드로 증강시켰다. 7일 후에 모든 마우스를 방혈시키고 이들의 혈청을 항-펩티드 항체에 대해 분석하였다. 생체내에서의 모델을 시험하였을 때는 어떤 검출가능한 관용성을 유발하지 않은 콘주게이트가 시험관내에서의 모델로 시험하였을 때는 관용성을 유발하였다. 이 결과는 콘주게이트간의 차이가 콘주게이트의 짧은 반감기로 인한다는 가정을 지지하고 있다. 이 가정을 바로 시험하기 위해, 콘주게이트를 연장된 시간동안 이식된 삼투펌프에 의해 계속 투여하였다. 결과는 이 콘주게이트가 지속방출에 의해 투여되었을 때는 관용을 유발하였으나 볼루스(bolus)로 투여되었을 때는 유발하지 않았다는 것을 도 32에 분명하게 나타내고 있다.

생체내에서의 모델에서 관용성 활성에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-AHAB-TEG의 시험

마우스에 조제로서 알룸 플러스pertussis상의 LJP-685-KLH를 주입하였다. 3주후에, 마우스를 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트의 일련의 투여로 처치하였다. 일군을 처치하지 않고 대조구로 하였다. 5일 후에, 대조구를 포함하는 모든 마우스를 10μg LJP685-KLH로 증강시키고 7일 후에 마우스를 방혈시켰다. 이들의 혈청을 상기한 변형된 Farr분석으로 항-LJP685 항체에 대해 분석하였다. 도 28에 나타낸 결과는 1 내지 50nM의 투여량 범위에 대해 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트로 한 처치가 항-LJP685 반응에 검출가능한 효과를 끼치지 않았다는 것을 입증하고 있다.

생체내에서의 모델에서 관용성 유발에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-DABA-TEG의 시험

마우스에 알룸 플러스pertussis상의 LJP685-KLH를 주입하였다. 3주후에 마우스를 5, 10 또는 50nM의 (LJP685)₄/MTU-DABA-TEG 콘주게이트로 처치하였다. 일군을 처치하지 않고 대조구로 하였다. 5일 후에, 대조구를 포함하는 모든 마우스를 10μg LJP685-KLH로 증강시키고 7일 후에 마우스를 방혈시켰다. 이들의 혈청을 변형된 Farr분석으로 항-LJP685 항체에 대해 분석하였다. 도 29에 나타낸 결과는 (LJP685)₄/MTU-DABA-TEG 콘주게이트가 5nM의 ED₅₀으로 생체내에서의 모델에서 관용성을 유발한다는 것을 입증하고 있다.

시험관내에서의 모델에서 관용성 유발에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-AHAB-TEG의 시험

LJP685-KLH로 3주전에 주입한 마우스로부터 비장세포를 수집하고 4, 20 또는 100μM의 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트로 37℃에서 2시간동안 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 일군의 세포를 관용원 없이 배양하고 양성 대조구로 하였다. 세포를 세척하고 조사한 수용체로 전사하고 10μg의 LJP685-K-LH로 증강시켰다. 7일 후에, 마우스를 방혈시키고 이들의 혈청을 변형된 Farr분석으로 항-LJP685 항체에 대해 분석하였다. 도 30에 나타낸 결과는 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트가 IC₅₀이 〈4μM를 달성하는, 시험관내에서의 모델로 시험하였을 때 관용성을 유발할 수 있다는 것을 분명하게 보여주고 있다.

시험관내에서의 모델에서 관용성 유발에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-DABA-TEG의 시험

LJP685-KLH로 3주전에 주입한 마우스로부터 비장세포를 수집하고 0.4, 1.3 또는 4μM의 (LJP685)₄/MTU-DABA-TEG 콘주게이트로 37℃에서 2시간동안 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 일군의 세포를 관용원 없이 배양하고 양성 대조구로 하였다. 세포를 세척하고 조사한 수용체로 전사하고 10μg의 LJP685-KLH로 증강시켰다. 7일 후에, 마우스를 방혈시키고 이들의 혈청을 변형된 Farr분석으로 항-LJP685 항체에 대해 분석하였다. 도 31에 나타낸 결과는 (LJP685)₄/MTU-DABA-TEG 콘주게이트가 IC₅₀이 〈4μM를 달성하는, 시험관내에서의 모델로 시험하였을 때 관용성을 유발할 수 있다는 것을 분명하게 보여주고 있다.

연속 배출펌프를 사용하여 생체내에서의 관용성 유발에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-AHAB-TEG 콘주게이트의 시험

마우스에 알룸 플러스pertussis상 LJP685-KLH를 주입하였다. 3주후에, 마우스를 군당 5마리의 마우스의 5군으로 분할하였다. 1일째에 한 군을 염수 볼루스로 처치하고 다른 군은 5nM의 (LJP685)₄/MTU-DABA-TEG 콘주게이트를 함유하는 볼루스로 처치하였다. 3개의 잔류군에 삼투펌프를 이식하였다. 한 군에, 펌프를 염수로 채우고 3일동안 1μL/시간으로 배출하였다. 펌프를 수용한 두 개의 잔류군을 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트(50nM)로 채웠다. 한 군은 3일동안 1μL/시간으로 배출하는 펌프를 수용하고 다른 군은 7일동안 0.5μL/시간으로 배출하는 펌프를 수용하였다. 5일째에, 3일동안에 배출하는 펌프를 외과수술로 제거하였다. 7일째에 대조구를 포함하는 모든 마우스를 10μg의 LJP685-KLH로 증강시켰다. 10일째에, 7일동안에 배출하는 펌프를 외과수술로 제거하였다. 14일째에, 모든 마우스를 방혈시켰다. 이들의 혈청을 변형된 Farr분석으로 항-LJP685 항체에 대해 분석하였다. 결과는 도 32에 나타낸다.

생체내에서의 모델에서 관용성 유발에 대한 (LJP685) ₄ /MTU-BMP-TEG 콘주게이트의 시험

마우스에 알룸 플러스pertussis상 LJP685-KLH를 주입하였다. 3주후에, 마우스를 (LJP-펩티드)₄/MTU-BMP-TEG 콘주게이트로 처치하고, 한 군은 처치하지 않고 대조구로 한다. 5일 후에, 대조구를 포함하는 모든 마우스를 10μg의 펩티드-KLH로 증강시키고 7일 후에 마우스를 방혈시킨다. 이들의 혈청을 변형된 Farr 분석으로 항-펩티드 항체에 대해 분석한다. 결과는 (LJP-펩티드)₄/MTU-BMP-TEG 콘주게이트는 (LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG 콘주게이트와 동일하거나 또는 그 이상인 효능으로 생체내에서의 모델에서 관용성을 유발하는 것을 나타낸다.

Claims

aPL 에피토프가 결합하는 B세포에 특이적으로 결합하는 aPL 유사체.
제 1 항에 있어서, 유사체는 T세포 에피토프가 결핍된 것을 특징으로 하는 유사체.
제 1 항에 있어서, 유사체는 펩티드인 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, 펩티드는 서열 CLILAPDRC, CLILTPDRC, CLLLAPDRC, CTILTLDRC, CLVLALDRC, CTILTPDRC, CILLAHDRC, CGNAADARC, CTNWADPRC, CGNIADPRC, CTNLTDSRC, CGNPTDVRC, GILLNEFA, GILTIDNL, GILNALDYV, LSDPGYVRNIFH 또는 LTDPRYTRDISNFTD로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, 펩티드는 서열 AGPCLGVLGKLCPG, GPCLGVLGKLCPG, PCLGVLGKLCPG, CLGVLGKLCPG, AGPCLGVLGKLCG, CLGVLGKLC, GPCILLARDRCG 또는 AGPILLARDRCPG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, 펩티드는 적어도 하나의 프롤린을 함유하고 α-메틸프롤린이 적어도 하나의 상기 프롤린을 치환한 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, D-아미노산이 적어도 하나의 L-아미노산을 치환한 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, 펩티드는 디술피드 결합에 의해 고리화되어 있는 것을 특징으로 하는 유사체.
제 8 항에 있어서, 티오에테르 결합이 디술피드 결합을 치환한 것을 특징으로 하는 유사체.
제 3 항에 있어서, 펩티드가 적어도 하나의 루신을 함유하고 또한 이소루신이 적어도 하나의 상기 루신을 치환한 것을 특징으로 하는 유사체.
비면역원성 원자가 플랫폼 분자와, (a) aPL 면역원이 결합하는 B 세포에 특이적으로 결합하고 (b) 면역원의 T세포 에피토프(들)가 결핍된 aPL 항체-결합유사체의 콘주게이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 aPL 면역원에의 특이적 B세포 관용성을 유발하기 위한 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 서열 CLILAPDRC, CLILTPDRC, CLLLAPDRC, CTILTLDRC, CLVLALDRC, CTILTPDRC, CILLAHDRC, CGNAADARC, CTNWADPRC, CGNIADPRC, CTNLTDSRC, CGNPTDVRC, GILLNEFA, GILTIDNL, GILNALDYV, LSDPGYVRNIFH 또는 LTDPRYTRDISNFTD로 이루어지는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 서열 AGPCLGVLGKLCPG, GPCLGVLGKLCPG, PCLGVLGKLCPG, CLGVLGKLCPG, AGPCLGVLGKLCG, CLGVLGKLC, GPCILLARDRCG 또는 5 AGPILLARDRCPG로 이루어지는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 제 6 항에 따른 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 제 7 항에 따른 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 제 8 항에 따른 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 제 9 항에 따른 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, aPL 항체-결합 유사체는 제 10 항에 따른 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 트리에틸렌글리콜로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 AHAB-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 46, A-DABA-ATEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 51, A-PABA-DT-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 55, MP-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 60, A-PIZ-IDA-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 68, A-PIZ-IDA-HB-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 화합물 72, A-PIZ-MP-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자는 DABA-PEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 테트라아미노벤젠으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 헵타아미노베타시클로덱스트린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 테트라아미노펜타에리스리톨로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Cyclam)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Cyclen)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 화합물 63, 테트라키스-A-PIZ-PMA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 비면역원성 원자가 플랫폼 분자는 화합물 55, MP-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 콘주게이트는 테트라키스-BMB에서 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
AHAB-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 46, IA-DABA-ATEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 51, BA-PABA-DT-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 55, BMP-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 60, BA-PIZ-IDA-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 68, BA-PIZ-IDA-HB-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 72, BA-PIZ-HIP-TEG로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
화합물 63, 테트라키스-BA-PIZ-PMA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비면역원성 원자가 플랫폼 분자.
제 11 항의 조성물 유효량을 필요한 개체에게 투여하는 것으로 이루어지는 aPL 항체-매개질환에 걸린 개체를 치료하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 aPL 항체-매개 질환은 발작인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 aPL 항체-매개 질환은 태 상실인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 aPL 항체-매개 질환은 항인지질 항체증후군(APS)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 aPL 항체-매개 질환은 1차 항인지질 항체증후군(PAPS)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 aPL 항체-매개 질환은 혈전증인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 제조하는 단계;

(b) 상기 라이브러리를 aPL 모방에피토프를 확인하기 위해 aPL 항체로 스크리닝하는 단계로 이루어지고, 여기서 상기 스크리닝 단계는

(i) 상기 라이브러리를 바이오패닝에 의해 스크리닝하고;

(ii) 마이크로패닝에 의해 (i)에서 바이오패닝에 의해 분리된 파지를 더 스크리닝하고;

(iii) 면역분석에 의해 (ii)에서 회수된 aPL 항체 고친화성 결합펩티드를 함유하는 파지를 확인하는 것으로 이루어지는 aPL 항체-매개질환에 걸린 사람으로부터 분리된 aPL 항체를 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체를 확인하는 방법.
(a) 친화성 정제된 aPL 항체를 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지와 반응시키는 단계;

(b) aPL 항체에 결합하는 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지를 회수하는 단계;

(c) 미생물을 (b)에서 회수된 파지로 감염시키는 단계; 그리고

(d) 감염된 미생물을 파지를 분리하기 위해 항생제함유 배지에서 배양하는 단계로 이루어지는, aPL 항체에 결합하는 펩티드를 확인 및 분리하기 위해 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 바이오패닝하는 방법.
(a) 바이오패닝에 의해 랜덤 펩티드삽입체를 지니는 파지를 분리하는 단계;

(b) 단백질 G에 결합된 aPL 항체로 코팅된 마이크로플레이트 웰에서 단계(a)에서 회수된 파지를 배양하는 단계;

(c) 미결합된 파지를 제거하기 위해 마이크로플레이트 웰을 세척하는 단계;

(d) 결합된 파지를 용리하는 단계;

(e) 미생물을 (d)에서 회수된 파지로 감염시키는 단계; 그리고

(f) 감염된 미생물을 파지를 분리하기 위해 항생제 함유 배지에서 배양하는 단계로 이루어지는, aPL 항체에 높은 결합친화성을 갖는 펩티드를 확인 및 분리하기 위해 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 마이크로패닝하는 방법.
제 51 항에 있어서, 면역분석이

(a) aPL 항체로 코팅된 마이크로플레이트 웰에서 마이크로패닝함으로써 분리된 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지를 배양하는 단계;

(b) 미결합 파지를 세척하는 단계;

(c) 표지된 항-파지 항체를 웰에서 배양하는 단계;

(d) 미결합된 표지된 항-파지 항체를 세척하는 단계;

(e) 표지기질을 가하는 단계; 그리고

(f) 고친화성 결합파지를 확인하기 위해 기질의 신호전개를 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 파지-포획 ELISA인 방법.
제 54 항에 있어서, 표지는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 54 항에 있어서, 기질은 비색기질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 54 항에 있어서,

(a) 균일한 양의 파지를 마이크로플레이트 웰에 코팅하는 단계;

(b) aPL 항체를 웰에서 배양하는 단계;

(c) 미결합 항체를 세척하는 단계;

(e) 표지된 항-aPL 항체를 결합된 aPL 항체와 함께 배양하는 단계;

(f) 미결합된 표지된 항-aPL 항체를 세척하는 단계;

(g) 비색기질을 웰에 가하는 단계; 그리고

(h) 파지의 상대 결합친화성을 측정하기 위해 기질의 신호전개를 측정하는 단계로 이루어지는, 고친화성-결합 파지의 추가 파지-포획 ELISA 분석을 수행하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 57 항에 있어서, 표지는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 57 항에 있어서, 기질은 비색기질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 51 항에 있어서, 면역분석이

(a) 랜덤 펩티드 삽입체를 지니는 파지로 감염된 미생물을 한천함유 배양배지의 제일 위의 막에서 배양하는 단계;

(b) 한천함유 배양배지의 제일 위의 제2의 막에서 미생물을 블로팅함으로써 (a)에서 배양된 미생물을 복제전사하는 단계;

(c) 전사된 미생물을 배양하는 단계;

(d) 미생물을 세포용해시키는 단계;

(e) 미생물을 분해시키는 단계;

(f) 막을 블로킹하는 단계;

(g) 막을 aPL 항체와 함께 배양하는 단계;

(h) 미결합 aPL 항체를 세척하는 단계;

(i) 표지된 항-aPL 항체를 막과 함께 배양하는 단계;

(j) 미결합 표지된 항-aPL 항체를 세척하는 단계;

(k) 기질을 가하는 단계;

(l) 고친화성-결합 파지를 확인하기 위해 기질의 신호전개를 측정하는 단계로 이루어지는 콜로니-블롯 면역분석인 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서, 막은 니트로셀룰로스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서, 미생물은 리소자임으로 분해되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서, 블로킹 용액은 젤라틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서, 표지는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서, 기질은 비색기질인 것을 특징으로 하는 방법.
aPL 항체-매개질환에 걸린 사람으로부터 분리된 aPL항체를 특이적으로 결합하는 에피토프를, 친화성 결합특성에 대해 분석 및 등급매기기 위한 방법에 있어서, 이 방법은

(a) 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰을 카르디올리핀으로 코팅하는 단계;

(b) 카르디올리핀에 결합시키기 위해서와 플레이트의 웰에의 비특이적 결합을 방지하기 위해 β₂-GPI원으로서 성장한 소 또는 사람 혈청을 첨가하는 단계;

(c) 단량체 유사체와 고 역가 aPL 항체의 용액을 지정된 시간동안 배양하는 단계;

(d) aPL 항체/유사체 혼합물을 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계;

(e) 미결합 aPL 항체를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계;

(f) 표지와 콘주게이트된 항-사람 IgG를 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계;

(g) 미결합된 항-사람 IgG 콘주게이트를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계;

(h) 표지된 콘주게이트에 대한 기질을 첨가하고 지정된 시간동안 기질/표지 반응을 전개시키는 단계;

(i) 웰에 결합된 aPL항체의 양을 정량하기 위해 기질/표지반응의 목적생성물을 측정하는 단계;

(j) 유사체의 aPL 항체에 대한 친화성을 결정하기 위해, 있다면 aPL 항체의 결합의 백분율 저해를 계산하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 66 항에 있어서, 콘주게이트는 효소로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 66 항에 있어서, 기질은 비색기질인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 체액샘플을 aPL 항체에 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체와 접촉시키는 단계,

(b) 유사체에 결합된 aPL 항체를 검출하는 단계로 이루어지는, aPL 항체-매개 질환에 걸린 것으로 의심이 가는 환자로부터 취한 체액내의 aPL 항체의 존재를 결정하기 위한 진단면역 분석법.
제 69 항에 있어서, 면역분석법은

(a) 마이크로타이트레이션 플레이트의 웰을, aPL 항체를 특이적으로 결합하는 에피토프의 유사체로 코팅하는 단계;

(b) 미결합 유사체를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계;

(c) 체액의 시험샘플을 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계;

(d) 미결합 시험샘플을 제거하기 위해 웰을 세척하는 단계;

(e) 표지와 콘주게이트된 항-사람 IgG를 플레이트의 웰에 가하고 지정된 시간동안 배양하는 단계;

(f) 미결합된 항-사람 IgG 콘주게이트를 씻어내기 위해 웰을 세척하는 단계;

(g) 표지된 콘주게이트에 대한 기질을 가하고 지정된 시간동안 기질/표지 반응을 전개시키는 단계;

(h) 시험샘플에서 항-aPL 항체의 존재를 결정하기 위해 기질/표지 반응의 목적생성물을 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
제 70 항에 있어서, 표지는 효소이고 기질은 비색기질인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 식을 갖는 원자가 플랫폼분자에 펩티드 또는 다른 생체활성분자를 연결하기 위한 친수성 링커.

R¹S(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O(CH₂)_mCO₂R²

상기 식에서, n=0-200, m=1 또는 2, R¹=H 또는 트리틸과 같은 보호기, R²=H 또는 알킬, 4-니트로페닐에스테르와 같은 아릴이다.
제 72 항에 있어서, m=0 내지 2인 것을 특징으로 하는 링커.
제 11 항에 있어서, aPL 유사체가 술프히드릴 함유 부분에 의해 비면역원성 원자가 플랫폼 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 콘주게이트.