MX2014010943A

MX2014010943A - Proteinas estabilizadas conformacionalmente de ingenieria.

Info

Publication number: MX2014010943A
Application number: MX2014010943A
Authority: MX
Inventors: Yingnan Zhang; Jacob E Corn; Aaron H Phillips
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2014-11-26
Also published as: CN104254541A; JP2015520730A; CA2866835A1; HK1205524A1; KR20140142293A; WO2013137920A1; JP6198807B2; EP2825549A4; EP2825549B1; EP2825549A1; RU2014141617A

Abstract

Aquí se proporcionan proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas y métodos para el uso de las mismas para identificar agentes que se enlazan a la proteína ubiquitina estabilizada o que se enlazan a una proteína que interactúa con o procesa la forma estabilizada de la proteína ubiquitina. También se proporcionan aquí métodos para la detección de proteínas conformacionalmente estabilizadas que tienen una incrementada afinidad de enlace a un ligando en comparación con la afinidad de enlace de la forma de tipo silvestre de la proteína al ligando.

Description

PROTEÍNAS ESTABILIZADAS CONFORMACIONALMENTE DE INGENIERÍA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 61/612,228 presentada en marzo de 2012, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO Aquí se proporcionan métodos para cribar y utilizar formas conformacionalmente estabilizadas de una proteína conformacionalmente dinámica, tal como proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, así como a composiciones que comprenden la misma.

ANTECEDENTES Las proteínas son macromoléculas notablemente dinámicas, con movimientos conformacionales que juegan papeles en diversos procesos, tales como generar trabajo mecánico, llevar a cabo reacciones enzimáticas y mediar transducción de señal. Ya que diversos estados de una molécula pueden potenciar diferentes funciones, hay interés considerable en la capacidad para generar reactivos que reconocen específicamente estados conformacionales discretos.1'2 La ubiquitina es una pequeña proteína regulatoria que se encuentra en casi todos los tejidos (en forma ubicua) en organismos eucarióticos . La ubiquitinación de proteína media numerosos procesos celulares, tales como control de ciclo celular, apoptosis, epigenética y regulación de transcripción. Sin embargo, la ubiquitina probablemente es mejor conocida por el papel que juega en el etiquetado de proteínas que se van a destruir y reciclar por la maquinaria proteolítica de una célula. Cuando una proteína está "etiquetada" covalentemente por ubiquitina, la molécula de ubiquitina dirige la proteína al proteasoma, que es un complejo de proteínas de múltiples componentes grande en la célula que degrada y recicla proteínas etiquetadas para destrucción. La propia proteína ubiquitina consiste de 76 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente 8.5 kDa. Características clave incluyen su cola C-terminal y siete residuos lisina.6 La secuencia de aminoácidos de ubiquitina es altamente conservada entre especies eucarióticas , con ubiquitina humana y de levadura que comparten aproximadamente 96% de identidad de secuencia. En los mamíferos, la ubiquitina está codificada por cuatro genes separados. Los genes UBA52 y RPS27A codifican una sola copia de ubiquitina fusionada a las proteínas ribosomales L40 y S27a, respectivamente, mientras que los genes UBB y UBC codifican las proteínas precursoras de poliubiquitina .

La ubiquitinación es un proceso de modificación post-translacional enzimática en la que la glicina terminal desde el motivo de di-glicina C-terminal de ubiquitina en ubiquitina activada forma un enlace amida con la amina épsilon de un residuo de lisina en una proteina modificada. La ubiquitina se activa en una reacción de dos etapas por una enzima de activación El ubiquitina en un proceso que requiere ATP como fuente de energía. Esto involucra la producción de un intermediario adenilato-ubiquitina seguido por la transferencia de ubiquitina al residuo cisteína de sitio El activo, resultando en un enlace tioéster entre el grupo carboxilo C-terminal de ubiquitina y el grupo sulfhidrilo El cisteína. A continuación, se transfiere ubiquitina desde la enzima El a la enzima de sitio activo de una enzima de conjugación de ubiquitina E2 mediante una reacción trans (tío) esterificación. La etapa final de la cascada de enzima de ubiqutinación crea un enlace isopéptido entre una lisina en la proteína diana y la glicina C-terminal de ubiquitina. En general, esta etapa requiere la actividad de una de los cientos de conocidas ligasas de proteína-ubiquitina E3 (a menudo denominadas simplemente "ubiquitina ligasa").5 Las E3 enzimas funcionan como los módulos de reconocimiento de sustrato del sistema y son capaces de interacción tanto con E2 como el sustrato de proteína modificada.

Siguiendo la adición de una sola ubiquitina a una proteína (monoubiquitinación) , pueden agregarse adicionales proteínas ubiquitina a la primera molécula de ubiquitina en uno o más de sus siete residuos lisina, dando por resultado una cadena poliubiquitina . Además, algunos sustratos se modifican por la adición de moléculas de ubiquitina a múltiples residuos lisina en un proceso denominado multiubiquitinación. Las cadenas de poliubiquitina más estudiadas - proteínas diana enlazadas a lisina48 para proteólisis en el proteosoma. La proteína condenado debe ser modificada por al menos cuatro moléculas de ubiquitina para que sean reconocidas por la maquinaria proteolítica de la célula. Moléculas de ubiquitina se disocian de la proteína inmediatamente antes de destrucción y se reciclan para mayor uso por enzimas que pertenecen a la familia hidrolasa C-terminal ubiquitina (UCH) de desubiquitinasas.

Las desubiquitinasas (DUBs) son una clase de proteasas especializadas que regulan señalización mediada por ubiquitina al desarmar cadenas ubiquitina o retirar monoubiquitinación de sustratos.7 DUBs también se refieren comúnmente como peptidasas de desubiquitinación, isopeptidasas de desubiquitinación, isopeptidasas de desubiquitinación, desubiquitinasas, ubiquitina proteasas, ubiquitina hidrolasas, ubiquitina isopeptidasas, o Dubs. El genoma humano codifica casi 100 DUBs con especificidad para ubiquitina en cinco familias de genes. DUBs pueden actuar como reguladores positivos y negativos del sistema ubiquitina. Además de reciclado de ubiquitina, están involucradas en el procesamiento inicial de precursores de ubiquitina, en la corrección de ubiquitinación de proteina en el desarmado de cadenas ubiquitina inhibitorias. Adicionalmente, DUBs tal como la familia de proteasa de ubiquitina (USP) de DUBs, invierten la ubiquitinación o modificación tipo ubiquitina de proteínas diana mientras que DUBs tales como miembros de la familia UCH de DUBs son responsables por la regeneración de monoubiquitina de poliubiquitina no anclada, es decir poliubiquitina libre que se sintetiza de novo por la maquinaria de conjugación o que se ha liberado de proteínas diana por otras DUBs.

La mayoría de las DUBs aún no se han caracterizado ampliamente. Una excepción es USP7 (HAUSP) , que tiene un papel bien establecido en tumorigénesis . Una función crítica de USP7 es regular la supervivencia celular por desubiquitinación y estabilización de la oncoproteína Mdm2, de esta manera la regulación negativa del supresor de tumor p53.8,9 Ya que USP7 indirectamente desestabiliza p53 y regula supresores de tumor adicionales, incluyendo FOX04 y PTEN, la inhibición de USP7 es una estrategia terapéutica atractiva.8 9 Otro ejemplo es USP14, que se considera juega un papel en degradación de proteínas involucradas en la neurodegeneración amiloidogénica .32 Todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, documentos, nucleótidos y números de acceso de base de datos de secuencia de proteínas, las secuencias a las que se refieren, y artículos citados aquí, todos se incorporan por referencia en su totalidad aquí.

COMPENDIO La invención aquí se proporciona describe Inter alia, composiciones que comprenden proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas y métodos para utilizar las mismas para inhibir la acción de una o más enzimas que enlazan a la forma estabilizada de estas proteínas, así como métodos para identificar agentes que enlazan a estas proteínas estabilizadas. También aquí se proporcionan métodos para cribar una forma estabilizada conformacionalmente de una proteína.

La presente solicitud en un aspecto proporciona una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada que comprende una o más sustituciones de aminoácido respecto a una proteína ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, la una o más sustituciones de aminoácido estabilizan el bucle ß1/ß2 de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tal que el bucle ß1/ß2 se confina a una región dentro de aproximadamente desviación raíz cuadrada media de 1.6 A° de código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada exhibe más lentas dinámicas de conformación en comparación con una proteína ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión RMNR2. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriormente descritas, los valores de microsegundos Rex en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada son hasta 40 veces mayores en comparación con proteína ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión RMN R2. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones aminoácidos en una posición seleccionada del grupo que consiste de A7, A8, A13, A34, A36, A69, y A71, en donde la posición se relaciona a A1-A76 (SEC ID NO: 1) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende (a) sustitución A7 (C) o una sustitución A8 (C) ; y (b) sustitución A69 (C) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T, V, I, M , o P) , A34 (I, F, L, V, S, o T) , A36 (Y, M, L, H, A, V, , I, M o N) y A71 (R , K, A, Q, , G, H, I, R o G) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina estabilizada conformacionalmente comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de A7 (D, F, I, R o S) , A8 (Y, A, G, Q, R o Y) , A13 ( R, Y, E o P) , A34 (I, L o T) , A36 (L, Y, A, o N) , A69 (A, G, WK Y, o í), y A71 (A, R, Q, R, o G) . En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones de aminoácido situadas en A42, A46, A49, A62, A65, A68, A70 o, en donde las posiciones de residuos aminoácidos corresponden a la posiciones en SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones de aminoácidos situadas en A40, A42, A46, A47, A49, A62, A65, A68, A70, A71, A72, A73, A74, A75, A76 o, en donde las posiciones de residuos aminoácidos corresponden a la posición en SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriormente descritas, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada exhibe incrementado enlace a una desubiquitinasa de la familia proteasa específica de ubiquitina (USP) en comparación con la proteína ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriormente descritas, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a la desubiquitinasa con una Kd en el intervalo nanomolar. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriormente descritas, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a la desubiquitinasa con una afinidad que es al menos 1000 veces superior a la de la proteína de tipo salvaje. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriormente descritas, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada inhibe la actividad de la desubiquitinasa. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada no exhibe o exhibe enlace disminuido a una desubiquitinasa de la familia hidrolasa C-terminal de ubiquitina (UCH) en comparación con una proteína ubiquitina de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente .

En un aspecto, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, el vector es un vector de expresión.

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende el ácido nucleico o el vector de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, la célula se elige del grupo que consiste de una célula de animal, una célula bacteriana, una célula de insecto, una célula de nemátodo y una célula de levadura. En algunas modalidades, la célula de animal es una célula de humano o una célula de no humano.

En un aspecto, se proporciona un complejo de proteína que comprende la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente y una desubiquitinasa de un miembro de la familia USP. En algunas modalidades, la desubiquitinasa es USP7, USP5, o USP14. En algunas modalidades, la desubiquitinasa es USP7.

En un aspecto, se proporciona una proteína enlazada covalentemente con una o más de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente.

En un aspecto, se proporciona un soporte sólido que comprende la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente ahí inmovilizada. En algunas modalidades, el soporte sólido es una superficie adecuada para resonancia plasmón de superficie. En algunas modalidades, el soporte sólido es una nanopartícula, una perla o vidrio.

En un aspecto, se proporciona una población de células que comprenden la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, expresada en su superficie .

En un aspecto, se proporciona un método para inhibir una desubiquitinasa de la familia de USP, que comprende poner en contacto la desubiquitinasa con una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, la inhibición es in vivo o in vitro.

En un aspecto, se proporciona un método para identificar un agente que enlaza a una forma conformacional de la proteína ubiquitina que es favorable para enlazar a una desubiquitinasa de la familia de USP, que comprende: a) poner en contacto el agente con una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente; y b) determinar si el agente enlaza a la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada. En algunas modalidades, el agente es un compuesto químico de molécula pequeña, un anticuerpo, una proteína, un ácido nucleico inhibidor o cualquier combinación de los mismos .

En un aspecto, se proporciona un método para identificar un agente que enlaza a un complejo de proteínas que comprende una desubiquitinasa de la familia USP y ubiquitina, el método comprende: a) poner en contacto el agente con el complejo de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 21 -23; y b) determinar si el agente es capaz de enlazar al complejo de proteínas. En algunas modalidades, el agente es un compuesto químico de molécula pequeña, un anticuerpo, una proteína, un ácido nucleico inhibidor, o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el agente disocia la interacción entre la desubiquitinasa y la proteína ubiquitina.

En un aspecto, se proporciona un agente identificado por los métodos de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente.

En un aspecto, se proporciona un método para cribar una forma conformacionalmente estabilizada de una proteína, en donde la forma conformacionalmente estabilizada tiene una incrementada afinidad de enlace a un socio de enlace o ligando o tiene una incrementada habilidad para modular la actividad del ligando en comparación con la proteína de tipo silvestre, el método comprende: a) poner en contacto el ligando con una biblioteca de formas mutantes de la proteína, en donde la biblioteca de formas mutantes se produce al sustituir un residuo aminoácido en una proteína conformacionalmente dinámica con otro residuo aminoácido en una o más ubicaciones previamente selectas, en donde las ubicaciones previamente selectas se sitúan en el interior de la proteína; y b) identificar la forma estabilizada conformacionalmente con base en un enlace al ligando o una habilidad incrementada para modular la actividad del ligando en comparación con la proteína de tipo silvestre. En algunas modalidades, las ubicaciones previamente selectas se eligen con base en la contribución de los residuos aminoácidos en cada ubicación a la dinámica de conformación dentro de la proteína o dentro de una región de la proteína. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la biblioteca es una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican las formas mutantes de proteínas. En algunas modalidades, la biblioteca es una biblioteca de expresión en fago. En algunas modalidades, un vector para la biblioteca de expresión en fago se elige del grupo que consiste de bacteriófago 3 MI, fago fl, fago fd, Ike fago, fago NI, fago de Enterobacteria T4, bacteriófago T7 y fago de enterobacterias ?. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, el método además comprende mutar uno o más residuos aminoácidos en la superficie de la proteína estabilizada conformacionalmente identificada al sustituir el uno o más residuos aminoácidos de superficie con otros residuos aminoácidos y cribar por proteínas que tienen incrementada afinidad de enlace o capacidad de modulación en comparación con proteínas estabilizadas conformacionalmente sin uno o más residuos aminoácidos de superficie substituidos. En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína se elige del grupo que consiste de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) , un receptor de hormona nuclear, un receptor de tirosina quinasa, y un canal de ion activado por ligando. En algunas modalidades, la proteína es ubiquitina. En algunas modalidades, el socio de enlace se elige del grupo que consiste de una desubiquitinasa, una enzima de activación El ubiquitina, una enzima de conjugación E2 ubiquitina, una ligasa de proteína E3 ubiquitina, y uno o más miembros del complejo proteasoma celular. En algunas modalidades, el socio de enlace es desubiquitinasa. En algunas modalidades, la desubiquitinasa es un miembro de la familia proteasa específica de ubiquitina (USP) de desubiguitinasas . En algunas modalidades, la desubiquitinasa se elige del grupo que consiste de USP7, USP5, y USP14. En algunas modalidades, la desubiquitinasa es USP7.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-1D ilustra identificación de dos tipos de variantes de ubiquitina con alta afinidad para USP7 (U7Ubs) para exhibición conformacional . Fig.lA) la exhibición conformacional criba mutaciones núcleo que colapsan un equilibrio conformacional en un solo estado. En el caso de ubiquitina, el equilibrio conformacional preexistente media varias interacciones de proteína y seleccionar una sola conformación se pronostica tanto para reducir el costo entrópico de enlace y proporcionar especificidad. Fig.lB) Superior: La mayoría de U7Ubs contienen un enlace disulfuro entre las posiciones 7 o 8 y la posición 69, resaltando como la estabilización conformacional puede ser mediada a través de un entrelazamiento intramolecular covalente . Fondo : una minoría de U7Ubs no contiene enlaces disulfuro, logrando el mismo punto final a través de reempaque no covalente. Fig.lC) Ambas U7Ubs basadas en disulfuro (por ejemplo - clon 7) y no basadas en enlace disulfuro (por ejemplo - clon 25) enlazan específicamente a USP7 por ELISA por puntos fago. Fig.lD) La variante de U7Ub25 sin enlace disulfuro enlaza al núcleo catalítico de USP7 con una afinidad de 193 + 17,3 nM (?? = -16.67 + 0.1562 kcal/mol, AS = -7.48 kcal/mol, N = 0.92 + 0.0062) .

La Figura 2A-2E ilustra un análisis de desviación de raíz cuadrada media en grupo (RMSD) de la región- ß? ß2 de ubiquitina dentro de complejos de proteína que revela dos distintas conformaciones que influencian enlace DUB. Fig.2A) mapa térmico agrupado de RMSD de región ß1-ß2 de ubiquitina (residuos 6 a 10) en todas las estructuras de alta resolución de complejos de ubiquitina después de alineamiento en pares del resto del núcleo globular (residuos 1-5 y 11-70) . Fig.2B) Sin inspección de RMSD agrupado, las conformaciones adoptadas por la región- ß? ß2 aparecen como una extensión de posibles conformadores. Fig.2C) Comparación de conformadores ß1-ß2 "arriba" y "abajo". Fig.2D) DUBs tipo UCH enlazan a la conformación "arriba" de ß1-ß2 (complejo UCHL3-Ub AP código PDB lxd3) mientras que DUBs tipo USP enlazan al estado "abajo" (complejo USP14-Ub código PDB 2ayo) . Ubiquitina se ilustra en rojo, DUBs se ilustran en azul. Un empaque de residuo DUB contra ß1-ß2 de esta manera restringe su conformación (UCHL3 -Leu220 , USP14-Phel68) se ilustra como una esfera. Fig.2E) Superposición de tres estructuras ubiquitina resueltas en complejo con UCHS (lavanda, códigos PDB lcmx lxd3 y 3ifw) (rosa, AP códigos 2ayo, 2hd5 y 2ibi) . Las cadenas laterales de residuos permiten mutar en la biblioteca fago como se ilustra.

La Figura 3 ilustra desubiquitinasas tipo USP (azul) que hacen contacto a la región bucle ß1-ß2 de ubiquitina (naranja) utilizando químicas de superficie variable. Residuos desubiquitinasa en contacto con ubiquitina y residuos ubiquitina que permiten variar durante la exhibición de conformación, se ilustran como barras. Desubiquitinasas mostradas son USP7 (AP codelNBF) , USP14 (AP código 2AY0) , USP2 (AP código 2IBI) , y USP21 (AP código 3I3T) .

La Figura 4A-4B ilustra Fig.4A) Criba de variantes U7Ub por interferometría de biocapa. Cantidades iguales de mutante de sitio activo de dominio catalítico USP7 (USP7catC223A) se acoplan a cada punta de sensor y sumergen en una concentración constante de cada U7Ub. Variantes se eligen con base en la respuesta de estado estable y aparentes constante de afinidad y constante de disociación. Fig.4B) Titulación de la variante U7Ub7 contra USP7catC223A indica una constante de disociación de aproximadamente 200 nM.

La Figura 5A-5C ilustra maduración de afinidad de la superficie de un U7Ub sin enlace disulfuro mejora adicionalmente la afinidad para USP7. Fig.5A) Secuencias de clon madurado de afinidad con base en el andamio U7Ub25 contienen una pequeña cantidad de mutaciones de superficie . Fig.5B) Clon madurado de afinidad U7Ub25.2540 es el enlazador más potente del dominio catalítico USP7 en un ensayo de ELISA de proteína. Fig.5C) Interferometría de biocapa indica que U7Ub25 enlaza el dominio catalítico de USP7 con una constante de disociación de 90 nM, mientras que U7Ub25.2540 madurado de afinidad tiene una afinidad mejorada 3 veces.

La Figura 6A-6B ilustra densidad de electrones 2F0 -Fc, contorneada en lo, para Fig.6A) U7Ub7 y Fig.6B) U7Ub25.2540. El modelo refinado final se ilustra por referencia.

La Figura 7A-7C ilustra estructuras de cristal de U7Ubs que revelan conformaciones de estructura principal alteradas o empaque núcleo. Fig.7A) La estructura de ubiquitina de tipo silvestre se ilustra por referencia, con posiciones mutadas en las variantes originalmente selectas mostradas como varillas o palitos y la región ß1-ß2 está etiquetada. Fig.7B) La estructura de U7Ub7 revela un enlace disulfuro formado entre las posiciones 8 y 69, que distorsiona la conformación del bucle ß1-ß2. Fig.7C) La conformación de estructura principal de la variante U7Ub25.2540 casi es idéntica a la de la ubiquitina de tipo silvestre pero con empaque alterado alrededor de la región alterada ß1-ß2. Mutaciones de superficie madurada de afinidad se ilustran en amarillo.

La Figura 8A-8C ilustra análisis estructural de variantes U7Ub. Fig.8A) El bucle ß1-ß2 de U7Ub7 está torcido hacia abajo, similar al de la ubiquitina ligada a USP7 y distinto de apo ubiquitina. Fig.8B) Interacciones de empaque y enlaces de hidrógeno entre el extremo C de U7Ub7 y el resto de la protelna. Fig.8C) La conformación del bucle ß1-ß2 de U7Ub25.2540 es similar a la de apo ubiquitina.

La Figura 9 ilustra datos heteronucleares { } H - 15 N NOE que muestran que el extremo C de Ub7.7 es móvil en solución, aunque restringido respecto al tipo silvestre.

La Figura 10 ilustra tanto mutaciones de reempaque de núcleo y expuestas - solvente son necesarias para que U7Ub25 logre alta afinidad. Aunque regresando a la mutación Leu71Arg a su identidad de tipo silvestre en el contexto del núcleo U7Ub25 (U7Ub25_L71 y U7Ub25.2540_L71) disminuye fuertemente la afinidad, la introducción de Arg7l en ubiquitina de tipo silvestre (Ubwt_R71) es insuficiente para un enlace apretado. Similarmente, un núcleo ubiquitina de tipo silvestre con todas las combinaciones de mutaciones de superficie ha comprometido el enlace a USP7 (Ubwt_R71, Ubwt .2540_L71, Ubwt .2540_R71) . Combinar el núcleo reempacado con la superficie de ubiquitina de tipo silvestre (U7Ub25_L71) también es insuficiente para enlace fuerte. Por lo tanto, tanto el núcleo recientemente selecto como la superficie rearreglada se requieren para enlace de alta afinidad (U7Ub25_R71, U7Ub25.2540_R71) .

La Figura 11 ilustra que U7Ub25 posee movimientos de microsegundos similares a ubiquitina de tipo silvestre. U7Ub25 no tiene movimientos detectables en la escala de tiempo de milisegundos como los valores R2 determinados para U7Ub25 no muestran dependencia en la frecuencia de pulsos de reenfoque CPMG (datos no mostrados) .

La Figura 12A-12F ilustra que ensayos enzimáticos revelan que U7Ub25 y U7Ub25.250 son inhibidores potenciales de USP7 íntegra. Fig.l2A) Tanto U7Ub25 como U7Ub25.2540 inhiben fuertemente USP7 de longitud íntegra (IC50 nM y 172 nM 104, respectivamente). La deleción del motivo diglicina C-terminal (U7Ub25dGG) no tiene efecto en potencial inhibitorio. Fig.l2B) Las U7Ubs no inhiben el dominio catalítico USP2 altamente activo. Fig.l2C) USP10, cuya función celular directamente supuesta a la de USP7, no se inhibe por las U7Ubs. Fig.l2D) Aunque USP47 está más cercanamente relacionada a desubiquitinasa a USP7, las U7Ubs son inhibidores mucho menos potentes de este DUB de USP7 (ICSO ~ 10 µ?) . Fig.l2E) Superior: U7Ubs inhibe USP5 de longitud íntegra, con IC50s de 373 nM (U7Ub25) y 253 nm (U7Ub25.2540) . Sin embargo, la deleción de la diglicina C-terminal (U7Ub25dGG) abroga la inhibición de USP5. Inferior: USP5 se activa fuertemente por ubiquitina de tipo silvestre pero no por U7Ubs . Todas las actividades se normalizan a la velocidad inicial a cero concentración de ubiquitina, excepto por "USP5 (máxima velocidad)", que se normaliza a la máxima velocidad medida después de la fase de latencia inicial.

La Figura 13 ilustra variantes anti-USP7 que no se incorporan eficientemente en cualquiera de las cadenas enlazadas -Lys48 o Lys63 por enzimas El y E2. Ni U7Ub3 ni U7Ub7 se incorporan eficientemente en las cadenas enlazadas -K48 o K63 en ensayos de ligación bioquímica utilizando El UBE1 y E2 Cdc34 (que promueve poliubiquitinación K48) o Uevla / UbcH13 (que promueve poliubiquitinación K63) ; el agotamiento del acumulado de ubiquitina de monómero soporta que las variantes parcialmente contactan las enzimas El y/o E2. En contraste, no se logra polimerización detectable con U7Ub25.

La Figura 14A-14E ilustra variantes de U7Ub25.2540 que son inhibidores selectivos de USP7 endógena en el ambiente celular. Fig.l4A) U7Ub25.2540 se incorpora débilmente en cadenas poliubiquitina en células; U7Ub25.2540AGG abroga incorporación de cadena. La investigación de enlaces de cadena ubiquitina específicos se muestra en la Figura 15. Células HCT116 se transfectaron con las construcciones de expresión indicadas y se transfirieron lisados como se indica o fueron inmunoprecipitados con los anticuerpos indicados; el anticuerpo control de isotipo (C) es Herceptina grado cultivo celular. Fig.l4B) U7Ub25.2540AGG enlaza selectivamente USP7 endógena respecto a otras DUBs celulares. Control de anticuerpo isotipo o anti-HA (anti-c-myc) inmunoprecipita o lisados celulares se transfieren con anticuerpos a las proteínas indicadas . La línea celular El HCT116 USP7 - / - se emplea como un control adicional para asociación USP7. Fig.l4C) Expresión de U7Ub25.2540AGG en células promueve poliubiquitinación MDM2, una indicación de inhibición USP7 endógena. Células U20S se transfectaron con las construcciones indicadas y lisados celulares se inmunoprecipitaron con un control (Trastuzumab) o un anticuerpo selectivo de enlace K 8- y transfirieron para revelar ubiquitinación MDM2. Fig.l4D) Expresión de U7Ub25.2540AGG en células aumenta el recambio MDM2 , un reflejo de inhibición de USP7 endógena. Células U20S se transfectaron con las construcciones indicadas, trataron con cicloheximida 100 µ?, recolectada en los puntos en tiempo indicados y lisados se transfirieron con los anticuerpos indicados. Fig.l4E) Expresión de U7Ub25.2540AGG en células estabiliza p53, subsecuentemente regula por incremento el gen de respuesta p53 p21. U20S o células SiHa se transfectaron con las construcciones de expresión indicadas y lisados se transfirieron con los anticuerpos indicados.

La Figura 15 ilustra U7Ub25.2540 que se incorpora débilmente en cadenas poliubiquitina en células; U7Ub25.2540AGG abroga incorporación de cadena. Células HCT116 se transfectaron con las construcciones de expresión indicadas y lisados se inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados; el anticuerpo de control de isotipo (C) es Trastuzumb.

La Figura 16 ilustra enlace de U7Ub25.2540 a USP7 y USP5 endógenas respecto a otras DUBs celulares. Células HCT116 se transfectaron como se indica y anti-HA inmunoprecipita o lisados celulares se transfirieron con anticuerpos a las proteínas indicadas .

La Figura 17 ilustra que U7Ub25.2540AGG enriquece para USP7 endógena en lisados celulares. Los inmunoprecipitados an i-Ha correspondientes a la Figura 14B se analizaron por espectrometría de masas. El número total de péptidos detectados para las DUBs indicadas se muestra con el número de péptidos únicos ilustrados en paréntesis.

La Figura 18A-18C ilustra Fig.l8A) preferencia de secuencia de 23 clones fagos aislados después de cinco rondas de cribado fago contra USP14. Fig.l8B) ELISA de proteínas demuestran que las U14Ubs tienen afinidad incrementada para USP14 con una disminución proporcional en la afinidad para UCHL3 y UCHL1. Curvas de ubiquitina de tipo silvestre se muestran en azul, las diversas U14Ubs en negro. Fig.l8C) titulaciones de interferometría de biocapa de USP14 con U14Ub2 y U14UM4. El componente lento de la velocidad de asociación bifásica muestra una dependencia de la concentración de U14Ub que indica un mecanismo de enlace de ajuste inducido.40 Constantes de disociación determinadas por estado estable y ajustes cinéticos, coinciden.

La Figura 19A-19B2 ilustra dinámicas U14Ub apo se frenan respecto al de tipo silvestre. Fig.l9A) Proporciones de intensidades de resonancias amida en espectros 1H- 15 N HSQC de U14Ubs contra tipo silvestre . Las proporciones se normalizaron a resonancias que no muestran intercambio. El inserto muestra estas proporciones trazadas en estructura de ubiquitina de tipo silvestre (AP código Lubi) ; el cambio más signifícate ocurre en la región ß1-ß2. Fig .19B1-19B2) Movimientos de milisegundos (azul) y microsegundos (rojo) cuantificados por por mediciones Rex para U14Ubl4, U14Ub2 y ubiquitina de tipo silvestre. Insertos en los trazos U14Ubl4 y U14Ub2 exhiben ejemplos de los datos en bruto para las mediciones ms y de Rex, respectivamente. Resonancias que carecen datos debido a ensanchamiento de intercambio o superposición espectral, se denotan con una X. Ubiquitina de tipo silvestre no muestra muestra ms Rex a estas condiciones.

La Figura 20A-20C ilustra perturbación del paisaje de energía de ubiquitina afecta el mecanismo de enlace de USP14 y resulta en variantes de ubiquitina que no pueden soportar el crecimiento in vivo. Fig.20A) Enlace de ubiquitina puede ocurrir ya sea a través de selección de conformación o ajuste inducido. La interconversión entre subestados de conformación de ubiquitina de tipo silvestre es rápida, por lo tanto, la barrera de energía que separa substratos es modesta. Fig.20B) Los movimientos de las U14Ubs son mucho más lentos que las de tipo silvestre, reduciendo el flujo a través del brazo de selección conformacional de la ruta y provocando que el mecanismo de enlace sea dominado por ajuste inducido. Fig.20C) A pesar de su capacidad para ligarse en cadenas enlazadas Lys48, a diferencia de la ubiquitina humana, las U14Ubs no pueden reemplazar ubiquitina endógena en levadura.

La Figura 21 ilustra un mapa térmico agrupado de RMSD ß1-ß2 para todas las estructuras de socio-Ub en PDB.

Las estructuras se alinearon y agruparon como se describe en los resultados y métodos. Complejos citados sobre cada eje están en el formato <código PDBxAP letra de cadena de ubiquitina > - <letra de cadena de socio>. Por ejemplo, 2ibiB-A representa el bucle ß1-ß2 de ubiquitina (cadena B) ligada a USP2 (cadena A) en PDB código 2ibi.

La Figura 22A-22B ilustra resultados de diseño de experimentos de ingeniería de U14Ub. Fig.22A) Preferencia de secuencia de consenso para diseño de estado sencillo y Fig.22B) diseño de múltiples estados.

La Figura 23A-23F ilustra espectros 1H- 15 N HSQC asignados de las cinco U14Ubs y ubiquitina de tipo silvestre. Residuos selectos alrededor de la región ß1-ß2 muestran ensanchamiento de intercambio significante se resalta. U14Ubl4 muestra el ensanchamiento de intercambio más severo, consistente con tener los más grandes valores para ms Rex.

La Figura 24 ilustra modelos CS-Rosetta de todas las cinco U14Ubs . Modelos CS-Rosetta de todas las cinco U14Ubs (cintas) superpuestas con modelos CS-Rosetta de ubiquitina de tipo silvestre (cartón) . Los dos modelos de más baja energía para cada variante se ilustran. U14Ubs se colorean de acuerdo con el esquema en la Figura 19A: 1, en púrpura, 2 en azul, 14 en rojo, 22 en naranj y 24 en verde. El pliegue para cada variante es indistinguible de la ubiquitina de tipo silvestre.

La Figura 25A-25F ilustra valores Rex de microsegundos y milisegundos para todas las variantes. Valores Rex se midieron a 18.8T y 297K. Rex en milisegundo se estima por cada residuo por la diferencia entre R2o bs en campos CPMG de 50 y 950Hz.

La Figura 26A-26C ilustra ajustes de grupo de datos de dispersión R2 en dos campos . Residuos que muestran dispersión R2 que no son muy ruidosos para ajustar, se muestran como esferas naranja cartografiadas en la estructura cristalina de ubiquitina de tipo silvestre para U14Ubl, U14Ub2 y U14Ubl4. Residuos que exhiben significantes valores ms Rex se agrupan en la estructura. Ajustes a las ecuaciones Carver Richards se obtuvieron globalmente para todos los residuos resaltados para U14Ubl y U14Ub2. Los tres grupos de residuos resaltados para U14Ubl4 se ajustaron tanto como grupos independientes debido a su separación espacial y también globalmente, dando por resultado valores similares para kex. El ajuste para U14Ubl4 mostrado aquí es para el grupo de residuos 4, 14 y 15.

La Figura 27 ilustra medidas de estabilidad térmica de U14Ubs y ubiquitina de tipo silvestre, utilizando dispersión de luz estática diferencial que muestra que ninguno de los mutantes se desestabiliza drásticamente respecto al tipo silvestre. La transición de una quinasa se muestra por claridad. Las transiciones de ubiquitina de tipo silvestre y las de U14Ubs no se observan hasta 81°C, el límite de alta temperatura del instrumento. Datos se normalizaron a la intensidad de la línea de referencia de baja temperatura.

La Figura 28A-28C ilustra ajuste de titulaciones por Interferometría de biocapa a un modelo de asociación bifásica. Titulaciones de USP14 con las Ul4Ubs detectada por interferometrla de biocapa (negro) ajustan bien a un modelo de asociación bifásica (rojo) . Las concentraciones de las U14Ubs empleadas en el ensayo son 0, 068, 0, 206, 0, 618, 1, 85, 5, 17, 16, 7 y 50 µ?.

La Figura 29A-29B ilustra KD en equilibrio para respuesta de Estado Estable y trzos de ksiow contra la concentración de U14Ub con ajustes de modelo de ajuste inducido. La fase lenta de la asociación se ajusta bien al modelo de ajuste inducido resaltado por Hammes, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13737-13741 (2009).

La Figura 30A-30B ilustra distribución integrada indicando que el estado de la ubiquitina puede diferenciar desubiquitinasas de tipo USP- y UCH. Fig.30A) Trazos de calificación-vs-Cor para cada combinación de ubiquitina-desubiquitinasa, con el código PDB de cada modelo citado anteriormente de cada trazo. La porción de ubiquitina se enlista primero (<código PDB> Fig.30B) y la desubiquitinasa es segunda (<código PDB> Fig.30A). Por ejemplo, 2ibiB_2ayoA es la ubiquitina de 2ibi (Ub enlazada a USP2) anclada en la desubiquitinasa de 2ayo (USP14) , mientras que lxd3B_2ayoA es la ubiquitina de lxd3 (Ub enlazada a UCHL3) anclada en la desubiquitinasa de 2ayo (USP14) . Se prepararon estructuras y anclaron como se describe en los métodos, excluyendo la cola C-terminal de ubiquitina para evitar el sesgo cristalográfico. Fig.30B) Resumen de resultados de distribución integrada en panel A. Las cinco más bajas RMSDs de cada experimento de distribución integrada se promediaron y se presentan como mapa térmico agrupado. Hay que notar que todas las ubiquitinas de ubiquitinas enlazadas a USP son más fácilmente de distribución integrada en DUBs de tipo USP (menor RMSD) , y ubiquitinas enlazadas a UCH se anclan más fácilmente en DUBs tipo UCH, pero en general no tiene éxito el anclaje a través de familias.

La Figura 31A-31B ilustra la estructura de cristal de U14Ub2. Fig.31A) Superposición de U14Ub2 (azul) con ubiquitina de tipo silvestre (trigo, código PDB: 1UBI) . El pliegue total de U14Ub2 es el mismo que de tipo silvestre, con desviaciones en la región ß1-ß2 probablemente debido empaque de cristal. Fig.31B) Triptófano 71 empaca en el núcleo hidrofóbico de la molécula adyacente en la unidad asimétrica, distorsionando la conformación de ß1-ß2. La estructura de U14Ub2 se ilustra como la representación de superficie en la misma orientación que en el panel A. La molécula adyacente en la unidad asimétrica se ilustra en color salmón.

La Figura 32 ilustra incorporación en las cadenas enlazadas 48. SDS-PAGE de variantes U14Ub muestra incorporación en cadenas enlazadas K48 a una extensión similar que el tipo silvestre por UBE1 y Cdc34. La discrepancia en peso entre Ul4Ubs y la ubiquitina de tipo silvestre se debe a la presencia de la etiqueta 6xHis, que no se ha disociado de los mutantes.

La Figura 33 ilustra clones de alta afinidad derivados de 2a generación de maduración de afinidad de U7Ub25. La expresión "proporción s/n" se refiere a la proporción de señal-a-interferencia : interferencia en donde "señal" es la señal ELISA de fago punto detectada contra USP7catC223A biotinilado capturado por NeutrAvidina revestida en la placa Maxisorp de 384 pozos; "Interferencia" es la señal ELISA contra NeutrAvidin sola. El número de posición en la ubiquitina se indica.

La Figura 34 ilustra rango de afinidad de variantes maduradas de afinidad U7Ub25 por ELISA.

La Figura 35A-35C ilustra titulaciones de Interferometria de Biocapa (negro) que no ajustan a un modelo de disociación de fase sencilla (rojo) . Las concentraciones de las U14Ubs empleadas en el ensayo son 0, 068, 0, 206, 0, 618, 1, 85, 5, 17, 16,7 y 50 µ?.

La Figura 36A-36C ilustra titulaciones de Interferometria de Biocapa (negro) de ajuste a un modelo de disociación de fase sencilla (rojo) . Las concentraciones de las U14Ubs empleadas en el ensayo son 0.068, 0.206, 0.618, 1.85, 5.17, 16.7 y 50 uM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona un método (denominado "Exhibición de conformación" (CD) ) que puede emplearse para identificar y/o cribar proteínas conformacionalmente estabilizadas capaces de enlazar con alta afinidad a uno o más socios de enlace. En contraste con expresión en fago tradicional, que típicamente muta posiciones de aminoácidos en superficie para encontrar nuevos contactos entálpicos, CD proporciona un método para alterar residuos de aminoácidos que están enterradas dentro de la estructura terciaria de una proteína para identificar nuevos arreglos de empaque que resultan en conformaciones óptimas para enlace. Los métodos de la presente solicitud difieren de lo que previamente se ha practicado en la técnica en que los métodos aquí descritos proporcionan la capacidad de modular la energética de las dinámicas de conformación de una proteína y de esta manera representar medio para modular tanto afinidad como selectividad de una interacción proteína-proteina al modular dinámicas de interfase, en vez de sólo contactos entálpicos .

CD se emplea para identificar proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas que tienen sustituciones de aminoácidos situadas en el interior de la proteína ubiquitina, de esta manera alterando la región bucle ß1-ß2 de ubiquitina en una conformación "abajo" respecto al estado de conformación predominante de la proteína de tipo silvestre .

Estas formas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina son capaces de enlazar a una desubiquitinasa de la familia de proteasa específica de ubiquitina (USP) de desubiquitinasas con muy superior afinidad en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. Adicionalmente, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas producidas por CD pueden emplearse como herramientas novedosas para la identificar y cribar uno o más agentes 1) capaces de enlazar a una forma de conformación específica de ubiquitina; 2) que enlaza a una enzima de procesamiento de ubiquitina que de preferencia enlaza a una forma de conformación específica de ubiquitina; o 3) que es capaz de disociar un complejo de desubiquitinasa-USP/proteína ubiquitina .

I . Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la destreza de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura, tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición; (Sambrook et al, 1989.) "Oligonucleotide Synthesis" (MJ Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (RI Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzimology " (Academic Press, Inc.);" Current Protocols in Molecular Biology" (FM Ausubel et al., eds, 1987, y actualizaciones periódicas.); " PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís et al., ed. , 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V. , 1988) .

Oligonucleótidos , polinucleótidos, péptidos, polipéptidos y moléculas pequeñas empleados o descritos en la presente invención pueden ser generados utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad.

II. Definícíones "Aislada", cuando se refiere a una molécula, se refiere a una molécula que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interfieren con los usos de diagnóstico o terapéutico.

Tal como se emplea aquí, el término "polipéptidos" incluye proteínas, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de fusión.

Un polipéptido "activo", o sus fragmentos, retiene una actividad biológica de contraparte nativa o de origen natural del polipéptido activo. Actividad biológica se refiere a una función mediada por la contraparte nativa o de origen natural del polipéptido activo. Por ejemplo, interacción de enlace o proteína-proteína constituye una actividad biológica.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, ubiquitina, tal como una forma conformacionalmente estabilizada de ubiquitina) y su socio de enlace. A menos que se indique de otra forma, como se emplea aquí, "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de enlace. La afinidad de una molécula X por su socio Y en general puede ser representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos aquí descritos. Modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir afinidad de enlace se describen a continuación.

El término "anticuerpo" aquí se utiliza en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitadas a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad de enlace de antígeno deseada. En algunas modalidades, un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado de afinidad.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto, que comprende una porción de un anticuerpo intacto que enlaza al antígeno al cual enlaza el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fab, Fab ' , Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que enlaza al mismo epitopo" como un anticuerpo de referencia, se refiere a un anticuerpo que bloquea el enlace del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo competitivo en 50% o más, y por el contrario el anticuerpo de referencia bloquea el enlace del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más. Un ensayo de competencia ejemplar se proporciona aquí.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas además pueden dividirse en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGi;, IgG2, IgG3, IgG4, IGAI, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente .

Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (?) y lambda (?) , con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes .

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o enlazan al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo que contiene mutaciones de origen natural, o que surgen durante producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estas variantes están presentes en cantidades menores . En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal, típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal, se dirige contra un solo determinante en un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de interpretarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitadas al método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de expresión en fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los sitios de inmunoglobulina humana, estos métodos y otros métodos ejemplares para producir anticuerpos monoclonales, se describen aquí.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especies particulares, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especies diferentes.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoácido de regiones hipervariables no humanas (HVR) y residuos aminoácido de regiones marco humano (FRS) . En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los de HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a aquellos de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FRs corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula de humano o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias de codificación de anticuerpo humano. Esta definición de anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos .

Un anticuerpo "madurado de afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más HVR, en comparación con un anticuerpo precursor que no posee estas alteraciones, estas alteraciones resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno.

Un polipéptido "etiquetado de epítopo" se refiere a un polipéptido quimérico fusionado a un "polipéptido etiqueta" . Estas etiquetas o marcadores proporcionan epítopos contra los cuales Abs puede elaborarse o están disponibles, pero no interfieren sustancialmente con la actividad del polipéptido. Para reducir reactividad anticuerpo anti -etiqueta con epítopos endógenos, el polipéptido de etiqueta usualmente es único. Adecuados polipéptidos de etiqueta generalmente tienen al menos seis residuos aminoácidos, usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos, de preferencia entre 8 y 20 residuos aminoácidos. Ejemplos de secuencia de etiqueta de epítopo incluyen HA de virus de influencia A, GD y c-myc, poli-His y FLAG.

"Polinucleótido" , o "ácido nucleico" como se emplea aquí en forma intercambiable, se refieren a polímeros de nucleótido de cualquier longitud e incluyen ADN y AR . Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que puede ser incorporado en un polímero por ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación a la estructura de nucleótido puede impartirse antes o después de ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótido. Un polinucleótido además puede ser modificado después de síntesis, tal como por conjugación con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen por ejemplo, "tapas", sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótido tales como por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc) , aquellos que contienen porciones secundarias, tales como por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, PLY-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazado por ejemplo por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados a soportes sólidos o semi-sólidos . El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones de grupo de terminación de extremo o tapas orgánicas de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que en general se conocen en la técnica, por ejemplo 2'-0-metil-, 2'-0-alilo, 2'-fluoro o 2 ' -azido ribosa, análogos de azúcar carbocíclica, azúcares -anoméricas , azúcares epiméricas tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas , análogos acíclicos y análogos nucleósido abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternos . Estos grupos de enlace alternos incluyen pero no están limitados a modalidades en donde el fosfato es reemplazado por P (O) S ("tioato"), P (S) S ("ditioato") , "(0) NR 2 ("amidato" ), P (O) R, P (O) OR CO o CH 2 ("formacetal") , en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) substituido o sin substituir que opcionalmente contiene un enlace éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido requieren ser idénticos . La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos aquí referidos incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido" , como se emplea aquí, en general se refiere a polinucleótidos cortos, en general de una sola hebra, en general sintéticos que en general pero no necesariamente tiene menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos aplica igual y completamente a oligonucleótidos .

Como se emplea aquí, "movimiento" o "dinámicas" en el contexto de una proteína o una región de una proteína, se refiere a cambios conformacionales en la estructura de una proteína o una región de una proteína.

Una "proteína conformacionalmente dinámica" , como se emplea aquí, se refiere a una proteína o una región de una proteína que es capaz de someterse uno o más movimientos.

"Conformacionalmente estabilizado" cuando se emplea aquí se refiere a e incluye cualquier proteína o región de una proteína que se altera con respecto a la proteína de tipo silvestre de manera tal que se somete a menos movimiento en comparación con la proteína de tipo silvestre o región de una proteína. Por ejemplo, la extensión de estabilidad conformacional de una estructura principal de proteína puede medirse por experimentos de expresión de R2 (sensible a movimiento en escalas de tiempo de milisegundos) y/o mediciones de HzNzRi , Rex (sensibles a movimiento en escalas de tiempo de microsegundos) .

"Ubiquitina conformacionalmente estabilizada" cuando se emplea aquí, se refiere a e incluye cualquier ubiquitina que existe en uno o más estados de conformación con respecto al movimiento de la región de bucle ß1-ß2 en comparación con el movimiento de esta región en ubiquitina de tipo silvestre.

La expresión "ubiquitina de tipo silvestre" se refiere aquí a un polipéptido de ubiquitina de secuencia nativa. El polipéptido de ubiquitina aquí descrito puede ser aquel que se aisla de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humanos o de otra fuente, o prepara por métodos recombinantes o sintéticos. Un "polipéptido de ubiquitina de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de ubiquitina correspondiente a derivado de la naturaleza.

Un residuo de aminoácido situado en el "interior" de una proteína, como se emplea aquí, significa un residuo de aminoácido que no está en la superficie de la proteína. Ya sea que o no un residuo aminoácido se ubica en la superficie de la proteína puede determinarse, por ejemplo por estudios de accesibilidad de solvente, estudios de cristalografía de rayos X, estructuras RMN o predicción con base en secuencia de aminoácidos primarios .

Una "mutación" incluye una deleción de aminoácidos, una inserción de aminoácidos y una sustitución de aminoácidos de cuando menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos primaria definida. En algunos aspectos, mutación de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos primaria puede resultar en la proteína codificada por esa secuencia de aminoácidos que tiene niveles de actividad o expresión alterados dentro de una célula. En otros aspectos, mutación de uno o más aminoácidos (tal como una mutación conservadora) en una secuencia de aminoácidos primarios puede no resultar en la proteína codificada por esa secuencia de aminoácidos que tiene cambios sustanciales en niveles de actividad o expresión dentro de una célula.

Una "sustitución" de aminoácidos significa que al menos un componente aminoácido de una secuencia de aminoácidos primaria definida, se reemplaza con otro aminoácido. Como se emplea aquí, "una proteína que comprende una sustitución de An (x, y, o z) " significa una proteína que comprende una sustitución de residuo aminoácido situada en la posición n con respecto a una secuencia de aminoácidos definida, el residuo de aminoácido de tipo silvestre se sustituye con x, y, o z.

Una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular por ejemplo menor a aproximadamente 5 kD, menor a aproximadamente 4 kD, y menor a 0.6 kD.

El término "péptido" en general se refiere a una secuencia contigua y relativamente corta de aminoácidos enlazados por enlaces peptidilo. Típicamente, pero no en forma necesaria, un péptido tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 4-40 aminoácidos, o aproximadamente 10-30 aminoácidos. Aunque el término "polipéptido" en general se refiere a formas más largas de un péptido, los dos términos pueden ser y se emplean en forma intercambiable aquí en ciertos contextos.

Los términos "aminoácido" y "residuo" se emplean aquí en forma intercambiable .

Una "región" de un polipéptido es una secuencia contigua de 2 o más aminoácidos. En algunas modalidades, una región tiene al menos aproximadamente cualquiera de 3, 5, 10, 15 aminoácidos contiguos. La "región C-terminal" o sus variantes se refiere a una región de un polipéptido que incluye los 1-5 residuos situados más cercanos al extremo C del polipéptido. La "región N-terminal" o sus variantes se refiere a una región de un polipéptido que incluye los 1-5 residuos situados más cercanos al extremo N del polipéptido. Una región "interna" de un polipéptido se refiere a una región de un polipéptido que ni se ubica en el extremo N del polipéptido ni en el extremo C del polipéptido.

"Porciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de refrencia, se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos aminoácido en la secuencia polipéptdo de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia y no considerar ningunas sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo utilizando soporte lógico de computadora disponible al público, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos sin embargo, valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A., Washington DC, 20559, donde está registrado bajo el Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se ajustan por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B determinada (que en forma alterna puede describirse como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B determinada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento de programa de A y B, y donde Y es un número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.

Una "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que tiene dos porciones enlazadas covalentemente en conjunto, en donde cada una de las porciones se deriva de diferentes proteínas. Las dos porciones pueden estar enlazadas directamente por un solo enlace péptido o a través de un enlazador peptídico que contiene uno o más residuos aminoácido. En general, las dos porciones y el enlazador estarán en marco de lectura entre sí y se producen utilizando técnicas recombinantes .

Un "desorden" o "condición patológica" es cualquier condición que se beneficia de tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye desórdenes o enfermedades crónicas o agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. Ejemplos no limitantes de desórdenes a tratar aquí incluyen tumores malignos y benignos; malignidades linfoides; neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicas y otras glandulares, macrof gicas , epiteliales, estromales y trastornos blastocoélicos; y desórdenes inflamatorios, inmunológicos y otros relacionados con la angiogénesis .

Como se emplea aquí, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales tales como "tratar" o "semejantes") se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos convenientes del tratamiento incluyen pero no están limitados a evitar ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, evitar metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejora o paliado del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado.

La expresión "terapia anti-cáncer" se refiere a una terapia útil para tratar cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anti-cáncer incluyen pero no están limitados por ejemplo a agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes empleados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis , agentes apoptósicos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec (imatinib mesilato) ) , un inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferonas, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que enlazan a una o más de las siguientes dianas PDGFR-beta, BlyS, abril, receptor (es) BCMA, TRAIL/AP02, y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. Sus combinaciones por lo tanto también se incluyen en la invención.

La expresión "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca la destrucción de las células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, A211, l131, l125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes de intercalado, enzimas y sus fragmentos, tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o de animales, incluyendo sus fragmentos y/o variantes, y los diversos agentes antitumor o anticáncer descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN ®) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetllomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocannabinol (Dronabinol, Marinol) ; beta-lapachona; lapachol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, scopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido,- criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina,-pancratistatina; sarcodictina; esponj istatina; mostazas nitrogenadas: tales como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamiciña, especialmente caliqueamicina y caliqueamicina gammall omegall (véase, por ejemplo, Nicolaou et al, Angew Chem Intl Ed Engl, 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de la alfa-4 integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, así como cromóforo neocarzinoestatina y cromoproteína relacionados cromóforos de antibióticos de enedina) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo Adriamycin®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, la inyección de liposomas de doxorrubicina HC1 (DOXIL) , doxorrubicina liposomal TLC D-99 (Myocet®) , doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) , and deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácid micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabine (XELODA®) , una epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácid fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tal como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rebastecedor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatone; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil ; bisantreno edatraxato,- defofamina; d emecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraer ina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida;procarbazina; Complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2 ', 2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, Roridina y anguidina) ,- uretano; vindesina (ELDISINE®, Fildesin®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; Pipobroman; gacitosina ; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®) , albúmina de ingeniería de nanopartículas formulación de paclitaxel (ABRAXANE ™) y docetaxel (Taxotere ®) ; chloranbucil ; 6- tioguanina/mercaptopurina; metotrexato; Tales como agentes de platino, cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, Eloxatin®) y carboplatino; vincas, que impiden la polimerización de tubulina a partir de la formación de los microtúbulos, incluyendo vinblastina (Velban®) , vincristina (Oncovin) , vindesina (ELDISINE® , Fildesin®) , y vinorelbina (Navelbine®) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato ; daunomicina; aminopterina; ibandronato; Inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; Los retinoides tales como el ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (Targretin®) ; Tales como los bifosfonatos clodronato (por ejempl, o Bonefos® OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, el ácido zoledrónico / zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (Aredia®) , tiludronato (Skelid®) o risedronato (Actonel ®) ; troxacitabina (un análogo 1, 3-dioxolano citosina nucleósido) ,- oligonucleótido antisentido, particularmente Thos que inhiben la expresión de los genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; Vacunas Tal THERATOPE® la terapia con vacunas y vacunas de genes, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; Inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECA ®) ; rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ;BAY439006 (sorafenib, Bayer) ; SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer) ; perifosina, inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteasoma (por ejemplo, PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; Bcl-2 Inhibidor Tales como oblimersen (GENASENSE®) ; pixantrona; Inhibidores de EGFR (ver definición más abajo) ; inhibidores de la tirosina quinasa (ver definición más abajo) ; inhibidores de quinasa serina-treonina Tal como rapamicina (sirolimus, Rapamune) ,- Tal como lonafarnib inhibidores de la farnesiltransferasa (SCH 6636, SARASAR ™) ; y farmacéuticamente acceptables sales, ácidos o derivados de cualquiera de las anteriores; asi como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para el Régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN ™) combinado con 5 -FU y leucovorina.

Los agentes quimioterapéuticos como se define en este documento incluyen "agentes anti-hormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos", que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer . Pueden ser las hormonas mismas, incluyendo, pero no limitado a: anti-estrógenos con agonista mixto / perfil antagonista, incluyendo, tamoxifeno (Nolvadex ®) , 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (Fareston®) , idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®) , trioxifeno, keoxifeno, y los moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM) , como SERM3 ; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, como el fulvestrant (Faslodex) , y EM800 (dichos agentes pueden bloquear los receptores de estrógeno (ER) dimerización, inhiben la unión al ADN, aumentar el volumen de rcambio de ER, y/o suprimir los niveles de ER) ; inhibidores de la aromatasa, que incluyen inhibidores de la aromatasa esteroideos tales como formestano y exemestano (Aromasin®) , y los inhibidores de aromatasa no esteroideos tales como anastrozol (Arimidex®) , letrozol (Femara) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de la aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®) , acetato de megestrol (MEGASE®) , fadrozol, y 4 (5) imidazoles; agonistas de la hormona que libera hormonas luteinizantes , incluyendo leuprolida (LUPRON® y Eligard®) , goserelina, buserelina, y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas como el acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilestilbestrol y Premarin, y andrógenos / retinoides como fluoximesterona, todo el ácido transretiónico y fenretinida; onapristona; antiprogestágenos; de receptores de estrógenos-reguladores (ERD) ; antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores .

El término "profármaco" como se emplea en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéutica activa que es menos citotóxica a células de tumor en comparación con el fármaco precursor y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma precursora más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp 375-382, 615a Reunión Belfast (1986) y Stella et al, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Borchardt et al., (editor), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, pero no están limitados a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácidos , profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente substituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos de 5-fluorocitosina y otra 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para utilizar en esta invención, incluyen pero no están limitados a aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y la detención de fase-M. Bloqueadores clásicos de fase M incluyen las vincas (Vincristina y vinblastina) , taxanos, y los inhibidores de la topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se vierten en la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Más información se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds, Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al, (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerígenos derivados ambos del tejo. Docetaxel (Taxotere ®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . El paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos impidiendo despolimerización, lo que resulta en la inhibición de la mitosis en las células .

Por "terapia de radiación" se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir daño suficiente a una célula a fin de limitar su capacidad de funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que habrá muchas maneras conocidas en la técnica para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración de una sola vez y las dosis típicas oscilan de 10 a 200 unidades (Grays) por día.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéutica efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéutica efectiva también es aquella en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos de la sustancia/molécula, agonista o antagonista, son superados por los efectos benéficos terapéuticos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no en forma necesaria, ya que se emplea una dosis profiláctica en sujetos antes de o en etapa previa de la enfermedad, la cantidad profiláctica efectiva será menor que la cantidad terapéutica efectiva.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permita la actividad biológica de un ingrediente activo ahí contenido ser efectivo, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se administrará la formulación.

Un "portador farmacéutico aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente a un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un portador farmacéutico aceptable incluye pero no esá limitado a un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservador.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Mamíferos incluyen, pero no están limitados a animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos, conejos y roedores) (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

El término "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos .

Como se entiende por una persona con destreza en la técnica, referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro aquí incluye (y describe) modalidades que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, descripción referente a "aproximadamente X" incluye descripción de "X" .

Se entiende que aspectos y modalidades de la invención aquí descritos incluyen "consiste" y/o "que consiste esencialmente de" aspectos y modalidades. Como se emplea aquí, la forma en singular "un", "una" y "el/la" incluye referencias en plural a menos que se indique de otra forma .

III. Cowposiciones de la Invención Aquí se proporcionan proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas que tienen una o más sustituciones de aminoácido respecto a la secuencia de aminoácidos de ubiquitina de tipo silvestre. En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada exhibe incrementada afinidad de enlace a una o más enzimas de procesamiento de ubiquitina (tal como, pero no limitado a, uno o más miembros de la familia proteasa específica de ubiquitina (USP) de desubiquitinasas) en comparación con la afinidad de enlace de ubiquitina de tipo silvestre a las enzimas de procesamiento de ubiquitina. En algunos aspectos, la región de bucle ß1/ß2 de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada exhibe más lentas dinámicas conformacionales en comparación con las dinámicas de esta región en ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 de R . También aquí se proporcionan ácidos nucleicos que codifican las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, vectores y células para expresar y aislar las mismas, así como complejos de proteínas que comprenden proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas y socios de enlace que enlazan con alta afinidad a una forma conformacional específica de ubiquitina.

?. Proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas En ciertos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas enlazan a un socio de enlace (por ejemplo, una desubiquitinasa de familia USP) con una Kd en el intervalo nanomolar. En ciertos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas enlazan a un socio de enlace (por ejemplo, una desubiquitinasa de familia USP, tal como USP7) con una afinidad que es al menos 1000 veces superior que la de la proteína de tipo silvestre. En ciertos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de una o más enzimas de procesamiento de ubiquitina o desubiquitinasas . En ciertos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas no exhiben o exhiben disminuida enlace a un socio de enlace (por ejemplo, un miembro de la familia UCH de desubiquitinasas) en comparación con el enlace de la proteína de tipo silvestre .

En algunas modalidades, las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina descritas en este documento tienen una afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace (por ejemplo, una desubiquitinasa de familia USP) de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ , 50µ?, 25 µ , 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ? , 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ? , 40 ??, 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ??, o 1 ??, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de la ubiquitina, tal como, pero no limitado a, cualquier enzimas de procesamiento ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia de USP desubiquitinasas (tales como, pero no limitado a, USP7, USP5, y / o USP14) . En algunas modalidades, la afinidad de enlace se determina por cualquier método conocido en la técnica, en particular los métodos descritos aquí.

En algunos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizados descritas en este documento se unen a un socio de enlace con una afinidad más alta en comparación con la unión del socio de enlace a ubiquitina de tipo silvestre. En algunos aspectos, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada se une a un socio de enlace con al menos cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, o 10,000, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números, mayor afinidad de plegado en comparación con la unión del socio de enlace a ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de la ubiquitina, tal como, pero no limitado a, cualquier enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia de desubiquitinasas USP (tales como, pero no limitado a, USP7, USP5, y / o USP14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, la afinidad de plegado de enlace se determina por cualquier método conocido en la técnica, en particular los métodos descritos aquí .

En algunos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas proporcionadas en este documento no muestran o muestran disminución de la unión a un socio de enlace en comparación con la unión de la proteína de tipo silvestre. En algunas modalidades, las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina se unen a un socio de enlace con al menos cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 , 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, o 10,000, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números, disminución de la afinidad de veces en comparación con el unión del socio de enlace a ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina se unen a un socio de enlace con al menos cualquiera de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, menos afinidad en comparación con la unión del socio de enlace para ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina no se unen al socio de enlace. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como, pero no limitado a, cualquier enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia de UCH desubiquitinasas . En algunas modalidades, las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina proporcionadas en este documento no muestran o disminución de la unión a un miembro de la familia de UCH desubiquitinasas mientras que al mismo tiempo muestran una mayor unión a un miembro de la familia de USP desubiquitinasas en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, la afinidad de enlace como se determina por una Kd se determina por cualquier método conocido en la técnica, en particular los métodos descritos aquí.

En otro aspecto, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas inhiben (por ejemplo, inhiben completamente) la actividad de una o más enzimas de procesamiento de ubiquitina o una o más desubiquitinasas. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de una o más enzimas de procesamiento de ubiquitina (tales como pero no limitadas a enzima de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3) o una o más desubiquitinasas por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocadas por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son incapaces de incorporarse en cadenas de poliubiquitina o para monoubiquitinar una proteína diana. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son capaces de ser incorporadas en cadenas de poliubiquitina o para monoubiquitinar una proteína diana. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son capaces de ser incorporadas en cadenas de poliubiquitina, pero se incorporan por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje intermedio de estos valores, menos eficientemente en comparación con la incorporación de ubiquitina de tipo silvestre en cadenas poliubiquitina.

En algunos aspectos de cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas, la una o más sustituciones de aminoácidos estabilizan el bucle ß1/ß2 de la proteína tal que la dinámica conformacional del bucle ß1/ß2 se frena respecto al movimiento de esta región en la proteína ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas exhibe cualquiera de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, inclusive, incluyendo cualesquiera porcentaje entre estos valores, dinámicas de conformación más lentas en comparación con la dinámica de conformación exhibidas por esta región en la proteína ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6 a 1.8Á a una desviación de raíz cuadrática media (RMSD) del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En algunas modalidades, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación a ubiquitina de tipo silvestre. En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas, son hasta aproximadamente 40 veces mayores en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el grado de más lentas dinámicas conformacionales de la región de bucle ß1/ß2 de las variantes de ubiquitina aquí descritas, se determina por cualquier método conocido en la técnica, en particular los métodos aquí descritos. En una modalidad, el método es disperesión R2 RMN.

Aquí se proporcionan proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas. En algunos aspectos, la proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas tienen una o más sustituciones de aminoácidos en el interior de la estructura terciaria de proteína ubiquitina que estabiliza la proteína en un estado conformacional particular.

En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones en los residuos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de A7, A8, A13, A34, A36, A69, y A71, en donde la posición de residuo de aminoácido es relativa a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una afinidad de enlace como determina por una Kd a un socio de enlace menor que aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ? , 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ??, o 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números . En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como, pero no limitado a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tais como pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualquier cantidad de entre estos valores, de veces mayores en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP 14 pero es incapaz de enlazar a USP7. En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En una modalidad, los valores Rex en microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En algunas modalidades, las sustituciones resultan en la formación de uno o más enlaces disulfuro en la proteína ubiquitina. En otra modalidad, las sustituciones no resultan en la formación de uno o más enlaces disulfuro en la proteína ubiquitina.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones en los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de A7 (C) , A8 (C) , y A69 (C) , en donde la posición de residuo de aminoácido es relativa a SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, la proteína comprende A7 (C) o A8 (C) y A69 (C) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una sustitución adicional en A13. En una modalidad, la sustitución en A13 es a un residuo aminoácido polar. En otra modalidad, la proteína comprende A13 (R, N, D, C, E, Q, H, K, S, T, o Y) . En algunas modalidades, la proteína comprende A13 (N, R, G, K, Y, A, S o H) . Todavía en otra modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una sustitución adicional en A71. En una modalidad, la sustitución en A71 es a un aminoácido básico. En otra modalidad, la proteína comprende A71 (R, K, o H) . En algunas modalidades, la proteína comprende A13 (R o K) . En una modalidad adicional, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene adicionales sustituciones en ambos A13 a A71, en donde la sustitución en A13 es a un residuo aminoácido polar y la sustitución en A71 es a un aminoácido básico. En algunas modalidades, la proteína comprende A13 (R, N, D, C, E, Q, H, K, S, T, o Y) y A71 (R, K, o H) . En otra modalidad, la proteína comprende A13 (N, R, G, K, Y, A, S o H) y A71 (R o K) . En una modalidad adicional, la proteína comprende A7 (C) , A8 (C) , o A69 (C) y puede tener sustituciones adicionales en uno o más de A36 (Y, F, L o H) , A34 (I, F , L o V) , A13 (N, R, G, K, Y, A, S o H) , o A71 (R o K) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una afinidad de enlace como se determina por una Kd de un socio de enlace menor a aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ? , 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ? , 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ? , 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ??, 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como pero no limitado a, cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como, pero no limitado a USP7, USP5, y/o USP14) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína de ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números de entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP 14 pero es incapaz de enlazar a USP7. En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En una modalidad, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre, como se mide por dispersión R2 RMN. En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RM . En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 A RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En algunas modalidades, las sustituciones resultan en la formación de uno o más enlaces disulfuro en la proteína ubiquitina.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en el residuo de aminoácido A71, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A71 (R, K, A, Q, T, W, H, I o R) . En algunas modalidades, la proteína comprende A71 (R) . En algunas modalidades, la proteína comprende A71 (K) . En algunas modalidades, la proteína comprende A71 (W) . En algunas modalidades, la proteína comprende A71 (G) . En algunas modalidades, la proteína con una sustitución en A71 puede tener sustituciones adicionales en una o más de A69 (C, G, A, W, K, Y, V, F O I) , A36 (Y, F, L, H, A, V, W, I, M O N) , A34 (I, F, L, V, S, M o T) , A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H , E, L, T, V, I, M o P) , A8 (T, C, D, R, G, C, T, A, Q, M, L, o Y) y/o A7 (C , N, F, S, R, G, V, o D) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ , 10 µ?, 5 µ?, 1 µ , 900 ??, 800 ??, 700 ? , 600 ??, 500 ??, 400 ? , 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ? , 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ? , 10 ??, 5 ? , o 1 ? , inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, inclusive, incluyendo cualesquiera porcentajes entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como, pero no limitada a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP 14 pero es incapaz de enlazar a USP7. En algunas modalidades, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor de bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre, como se mide por dispersión R2 RM . En una modalidad particular, los valores Rex en microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en el residuo de aminoácido A34, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la sustitución en A34 es un aminoácido hidrofóbico . En algunas modalidades, la proteína comprende A34 (A, V, I, L, M, F, Y o W) . En algunas modalidades, la proteína comprende A34 (I, F, L, V, T, S, M o T) . En algunas modalidades, la proteína con una sustitución en A34 puede tener sustituciones adicionales en una o más de A71 (R, K, A, Q, W, G, H, I, R o G) , A69 (C, G, A , W, K, Y, V, F o I) , A36 (Y, M, L, H, A, W, I, M o N) , A13 (N, R, G, K, Y, A , S, H, E, L, T, V, I, M o P) , A8 (T, C, D, R, G, C, T, A, Q, M, L, O Y) y/o A7 (C, N, F, S, R, G, V, o D) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ , 50 µ?, 25 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ?? , 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ? , o 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% O 100%, inclusive, incluyendo cualesquiera porcentajes entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como pero no limitada a cualesquiera enzimas de procesamiento ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como pero no limitada a USP7, USP5 y/o USP 14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera cantidades entre estos valores, de veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP14, pero es incapaz de enlazar a USP7. En algunas modalidades, los valores ex en microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera cantidades entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre, como se mide por dispersión R2 R N. En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor de bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD del código 3NHE de cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3 NHE cadena B de Protein Data Bank.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en el residuo de aminoácido A7, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la proteína comprende A7 (C, N, F, S, D, F, R, G o V) . En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (G) . En algunas modalidades, la proteína con una sustitución en A7 puede tener sustituciones adicionales en uno o más de A71 (R, K, A, Q, W, G, H, I, R o G) , A69 (C, G, A , W, K, Y, V, F o I), A34 (I, F, L, V, S, M O T) , A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H , E, L, T, V, I, M O P) , A8 (T, C, D, R, G, C, T, A, Q, M, L, O Y) y/o A36 (Y , M, L, H, I, A o N) . En algunas modalidades, la proteina ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ , 10 µ , 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ? , 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ? , 1 ? , inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como, pero no limitado a cualquier de enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En una modalidad, el socio de enlacé es USP7. En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualquiera números entre estos valores, de veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina estabilizada conformacionalmente enlaza a USP14, pero es incapaz de enlazar a USP7. En algunas modalidades, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN . En una modalidad particular, los valores Rex en microsegundos en la región alrededor de bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3NHE cadena B de Protein Data Bank.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en el residuo aminoácido A36, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la sustitución en A36 es un aminoácido aromático. En una modalidad, la proteína comprende A36 ( o Y) . En otra modalidad, la proteína comprende A36 (L, M, W, M, Y, H, I, A o N) . En algunas modalidades, la proteína con una sustitución en A36 puede tener sustituciones adicionales en uno o más de A71 (R, K, A, Q, W, G, H, I, R o G) , A69 (C, G, A , W, K, Y, V, F o I) , A34 (I, F, L, V, S, M o T) , A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H , E, L, T, V, I, M o P) , A8 (T, C, D, R, G, C, T, A, Q, M, L, o Y) y/o A7 (C , N, F, S, R, G, V, o D) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene una afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ? , 40 ? , 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ??, o 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como pero no limitada a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o un desubiquitinasa. En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como, pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera cantidades entre estos valores, de veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP 14, pero es incapaz de enlazar a USP7. En otra modalidad, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor de bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números de entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre, como se mide por dispersión R2 RMN. En una modalidad particular, los valores Rex en microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región del bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD de código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 A RMSD de código 3NHE cadena B de Protein Data Bank.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7 o A8 y A69 a A71, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (C) o A8 (C) y A69 (C) y la sustitución en A71 es a un aminoácido básico. En una modalidad, la proteína comprende A7 (C) , A71 (R o K) , y A8 (T, D, R, G, C, T, A, Q, F, L o Y) . En otra modalidad, la protelna comprende A8 (C) , A71 (R o K) , y A7 (N, M, S, R, T, V o D) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en cualquiera de A34 (I, F, L, V, S, M o T) , A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T , V, I , M o P) , y/o A36 (Y, M, L, H, I, A O N) .

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7 o A8, así como en A69 y A34, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (C) . o A8 (C) , A69 (C) y A34 (I). En una modalidad, la proteína comprende A7 (C) y A8 (T, D, R, G, C, T, A, Q, F, L, o Y) . En otra modalidad, la proteína comprende A8 (C) y A7 (N, M, S, R, T, V o D) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en cualquiera de A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T, V, I, M o P) , A71 (R , K, A, Q, W, G, H, I, R o G) , y/o A36 (Y, F, L, H, I, A o N) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada liga a USP7 pero es incapaz de ligar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada liga a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación a ubiquitina de tipo silvestre.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7 o A8, así como en A69, A34 y A36, en donde la posición de residuo de aminoácidos es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (C) o A8 (C) , A69 (C) , A34 (I) , y la sustitución en A36 es a un aminoácido aromático. En una modalidad, la proteína comprende A7 (C) , A36 (F o Y) , y A8 (T, D, R, G, C, T, A, Q, F, L, o Y) . En una modalidad, la proteína comprende A8 (C) , A36 (F o Y) , y A7 (N, M, S, R, T, V, o D) . Todavía otra modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T, V, I, M o P) y/o A71 (R, K, A, Q, W, G, H, I, R o G) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada liga a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7, A13, y A71, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (F) , A13 (Y) , y A71 (R) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en A34 (I, F, L, V, S, M o T) , A69 (C, G, A, W, K, Y, V, F o I), A8 ( T, C, D, R, G, C, T, A, Q, M, L o Y) y/o A36 (Y, M, L, H, I , A o N) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP14 , pero es incapaz de enlazar a USP7.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7 , A13 , A34, A36, y A71, en donde la posición de residuo de aminoácidos es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (F) , A13 (Y), A71 (R) , A34 (I o L) , y A36 (I o L) . En algunas modalidades, la proteína comprende A34 (L) y A36 (I) . En algunas modalidades, la proteína comprende A34 (I) y A36 (L) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en A69 (C, G, A, , K, Y, V, F o I) , y/o A8 (T, C, D, R , G, C, T, A, Q, M, L o Y) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces i mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina estabilizada conformacionalmente enlaza a USP14, pero es incapaz de enlazar a USP7.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una sustitución en los residuos de aminoácidos A7, A13 , A34, A36, A69, y A71, en donde la posición de residuo de aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (F) , A13 (Y), A71 (R) , A34 (I o L) , A36 (I o L) , y A69 (G o W) . En una modalidad, la proteína comprende A69 G) , A34 (L) , y A36 (I) . En algunas modalidades, la proteína comprende A69 (G) , A34 (I) , y A36 (L) . En una modalidad, la proteína comprende A69 (W) , A34 (L) , y A36 (I) . En otra modalidad, la proteína comprende A69 (W) , A34 (I) , y A36 (L) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una sustitución en A8 (T, C, D, R, G, C, T, A, Q, F, L o Y) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP14, pero es incapaz de enlazar a USP7.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende sustituciones en los residuos aminoácidos A7 y A71, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína comprende A7 (G) y A71 (W) . En una modalidad, la proteína tiene una sustitución adicional en A8 a cualquiera de un F o un L. En algunas modalidades, la proteína comprende A8 (F) . En otra modalidad, la proteína comprende A8 (L) . En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada además comprende una o más sustituciones en A34 (I, F, L, V, S, M o T) , A69 (C, G, A, W, K, Y, V, F o I), A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T, V, I, M o P) , y/o A36 (Y, M, L , H, I, A o N) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7, pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP14 , pero es incapaz de enlazar a USP7.

En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de residuos aminoácidos A7, A8 , A 13 , A34, A36, A69, y A71, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1, y en donde las sustituciones resultan en la formación de al menos un enlace disulfuro. En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (L) , A13 (N) , A34 (I) , A36 (Y) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (T) , A13 (R) , A34 (I) , A36 (F) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (N) , A8 (C) , A13 (G) , A34 (F) , A36 (Y) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (L) , A13 (N) , A34 (I), A36 (Y), A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (D) , A13 (K) , A34 (I) , A36 (L) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (D) , A13 (K) , A34 (I), A36 (F) , A69 (C) , y A71 (K) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (T) , A13 (R) , A34 (I) , A36 (F) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (F), A8 (R) , A13 (Y), A34 (L) , A36 (I), A69 (G) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (T) , A13 (R) , A34 (L) , A36 (F) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (G) , A13 (A) , A34 (V), A36 (H) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (T) , A13 (R) , A34 (L) , A36 (F) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (R) , A13 (S) , A34 (L) , A36 (Y) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (L) , A13 (N) , A34 (I), A36 (Y), A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (D) , A13 (K) , A34 (I) , A36 (F) , A69 (C) , y A71 (K) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (R) , Al3 (S) , A34 (L) , A36 (Y) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (C) , A8 (D) , A13 (K) , A34 (I), A36 (L) , A69 (C) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (S) , A8 (C) , A13 (H) , A34 (I), A36 (Y), A69 (C) , y A71 (R) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En algunos aspectos, la proteína comprende las sustituciones de cualquiera de los clones mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1. clones disulfuro U7Ub Clones U7Ub disulfuro Clon ID A7 AS Al3 A34 A3 A69 A71 wt T L I E I L L U7Ubl C L N I Y C R U7Ub3 C T R I F C R U7Ub4 N C G F Y C R U7Ub7 C L N I Y C R U7Ub9 C D K I L C R U7Ubl5 C D K I F C K U7Ub23 C T R I F C R U7Ub25 F R Y L I G R U7Ub30 C T R L F C R U7Ub38 C G A V H C R U7Ub49 C T R L F C R U7Ub50 C R S L Y C R U7Ub51 C L N I Y C R U7Ub55 C D K I F C K U7Ub59 C R S L Y C R U7Ub74 C D K I L C R U7Ub88 S C H I Y C R En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de residuos aminoácido A7, A8, A 13, A3 , A36, A69 y A71, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1, y en donde las sustituciones no resultan en la formación de al menos un enlace disulfuro. En algunos aspectos, la protexna comprende A7 (D) , A8 (Y) , A13 (R) , A34 (L) , A36 (I), A69 (A), y A71 (A). En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (F) , A8 (A), A13 (Y), A34 (L) , A36 (I) , A69 (G) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (F) , A8 (G) , A13 (Y), A34 (I), A36 (L) , A69 (W) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (F) , A8 (Q) , A13 (Y), A34 (L) , A36 (I), A69 (G) , y A71 (R) .

En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (F) , A8 (R) , A13 (Y), A34 (L) , A36 (I), A69 (G) , y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (R) , A8 (Q) , A13 (E) , A34 (L) , A36 (Y), A69 (K) , y A71 (Q) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (R) , A8 (R) , A13 (P) , A34 (T) , A36 (A) , A69 (Y), y A71 (R) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (S) , A8 (Y), A13 (Y), A34 (I) , A36 (N) , A69 (I) , y A71 (G) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP14. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 con una afinidad que es cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualesquiera números entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre. En algunos aspectos, la proteína comprende las sustituciones de cualquiera de los clones mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2. Clones no disulfuro U7Ub Clones no disulfuro U7Ub Clon ID A7 A8 Al3 A34 A36 A69 A71 Wt T L I E I L L U7Ub551 D Y R L I A A U7Ub490 F A Y L I G R U7Ub511 F G Y I L W R U7Ub432 F Q Y L I G R U7Ub523 (U7Ub25) F R Y L I G R U7Ub526 R Q E L Y K Q U7Ub402 R R P T A Y R U7Ub455 S Y Y I N I G En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de residuos aminoácido A7, A8 , A 13, A34, A36, A69, y A71, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (G) , A8 (L) , A13 (T) , A34 (T) , A36 (L) , A69 (I) , y A71 (W) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (G) , A8 (F) , A13 (L) , A34 (T) , A36 (L) , A69 (S) , y A71 (W) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (G) , A8 (L) , A13 (V) , A34 (V) , A36 (L) , A69 (I) , y A71 (W) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (G) , A8 (L) , A13 (L) , A34 (S) , A36 (L) , A69 (V) , y A71 ( ) . En algunos aspectos, la proteína comprende A7 (G) , A8 (F) , A13 (L) , A34 (T) , A36 (W) , A69 (Y) , y A71 (H) . En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP14, pero es incapaz de enlazar a USP7. En algunos aspectos, la proteína comprende las sustituciones de cualquiera de los clones mostrados en la Tabla 3.

Tabla 3. clones U14Ub Clones U14Ub Clon ID A7 A8 Al3 A34 A36 A69 A71 wt T L I E I L L U14Ubl G L T T L I W U14Ubl4 G F L T L s w U14Ub2 G L V V L I w U14Ub22 G L L s L V w U14Ub24 G F L T W Y H En algunos aspectos, las proteínas conformacionalmente estabilizadas comprenden la sustituciones de cualquiera de los clones U7Ub25, U7Ub7 o U14Ub2.

En un aspecto adicional, cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas puede además tener una o más sustituciones de aminoácido en la superficie de la proteína, que aumenta su afinidad a uno o más socios de enlace. En algunas modalidades, la proteína conformacionalmente estabilizada tiene una o más sustituciones de aminoácido de superficie en A42, A46, A49, A62, A65, A68 o A70, en donde las posiciones de residuos aminoácido corresponden a A1-A76 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene sustituciones de aminoácidos en superficie de uno o más de A42 (K, T o W) , A46 (G o S) , A49 (T, N, L, o R) , A62 ( E) , A65 (T o A) , A68 (R) o A70 (I) . En otra modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene sustituciones de amino ácido de superficie A42 (A49) , (R) , y AS8 (R) . En algunos aspectos, la proteína conformacionalmente estabilizada comprende las sustituciones de clon U7Ub25.2540. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene afinidad de enlace como se determina por una Kd con un socio de enlace menor a aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ , 100 µ?, 50 µ?, 25 µ , 10 µ , 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ? , 600 ??, 500 ? , 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ? , 30 ??, 25 ? , 20 ??, 15 ? , 10 ??, 5 ??, 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizas inhiben selectivamente la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualesquiera porcentajes entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como pero no limitado a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como pero no limitado a, USP7, USP5 y/o USP 14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, los valores Rex en microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualquier número entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD de código 3NHE de cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD del código 3NHE de cadena B de Protein Data Bank. En algunos aspectos, la proteína comprende las sustituciones de cualquiera de los clones mostrados en la Tabla 4.

Tabla 4. Sustituciones de residuo en superficie Clon ID A2 A4 A14 A40 A42 A46 A47 t Q F T Q R A G Ub7.25 / wt Q F T Q R A G ub7v25R151 Q F T Q R G G ub7v25R154 Q F T Q R A G Ub7.25 Q F T Q T S G ub7v25R1558 Q F T Q R G G ub7v25R1554 Q F T Q K A G ub7v25R152 Q F T Q W A G Tabla 4 (continúa) Clon ID A49 A62 A64 A65 A66 A68 A70 Wt Q Q E S T H V Ub7.25 / wt T Q E T T H V ub7v25R151 N Q E S T H V ub7v25R154 Q Q E S T H V Ub7.25 L E E A T H I ub7v25R1558 L E E S T H V ub7v25R1554 Q Q E S T H V ub7v25R152 R Q E S T R V Todavía en otros aspectos, cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas además puede tener una o más sustituciones de aminoácido en la superficie de la región C-terminal de la proteína, que aumenta su afinidad a uno o más socios de enlace. En algunas modalidades, la proteína conformacionalmente estabilizada tiene una o más sustituciones de aminoácido de superficie en A40, A42, A46, A47, A49, A62, A65, A68, A70, A71, A72, A73, A74, A75, A76 en donde las posiciones de residuo aminoácido corresponden a AlA76 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene sustituciones de aminoácidos de superficie en una o más de A42 (M) , A46 (L o N) , A49 (V, Y, L o T) , A62 (G o R) , A65 (A), A68 (Q) , A70 (R) , A72 (W o H) , A73 (A, R o K) , A74 (S, V, G, Y O W) , A75 (A, R, P, E, V, H, O Y) , O A76 (R, S, V, A o L) . En otra modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene sustituciones de aminoácidos de superficie en A42 (M) , A49 (V) , A70 (R) , A72 (W) , A73 (K) , A74 ( ) , A75 (R) , y A76 (V) . En algunos aspectos, la proteína conformacionalmente estabilizada comprende las sustituciones de clon Ub7.25.216. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada tiene afinidad de enlace como se determina por una Kd a un socio de enlace de menos de aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 25 µ?, 10 µ , 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ? , 700 ??, 600 ? , 500 ? , 400 ??, 300 ??, 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ? , 80 ? , 70 ??, 60 ? , 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ??, 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ??, 5 ??, o 1 ??, inclusive, incluyendo cualesquiera valores entre estos números. En algunas modalidades, las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben selectivamente la actividad de uno o más socios de enlace de ubiquitina enzimáticos por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas provocada por ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como, pero no limitado a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como, pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En una modalidad, el socio de enlace es USP7. En algunas modalidades, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta cualquiera de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, inclusive, incluyendo cualquier número entre estos valores, de veces mayores en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RM . En una modalidad particular, los valores Rex de microsegundos en la región alrededor del bucle ß1/ß2 de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas son hasta aproximadamente 40 veces mayor en comparación con ubiquitina de tipo silvestre como se mide por dispersión R2 RMN. En algunas modalidades, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 0.5 a 3 Á, incluyendo cualquiera de aproximadamente 0.7 a 2.7 Á, 1.0 a 2.4 Á, 1.3 a 2.1 Á, 1.6-1.8 Á RMSD del código 3NHE de cadena B de Protein Data Bank. En una modalidad, la región de bucle ß1/ß2 en las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se confina a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD de código 3NHE cadena B de Protein Data Bank. En algunos aspectos, la proteína comprende las sustituciones de cualquiera de los clones mostrados en la Tabla 5.

Tabla 5. Sustituciones de residuos de superficie de la región C-terminal Clon ID A40 A42 A46 A47 A49 A62 A65 Wt Q R A G Q Q S Ub7.25.206 Q R L G Q G A Ub7.25.207 Q R A G Q G S U 7.25.216 Q M A G V Q S Ub7.25.268 Q R A G L Q S Ub7.25.225 Q R A G Y Q S Ub7.25.226 Q R N G Y Q S Ub7.25.227 Q R A G Q Q S Ub7.25.238 Q R A G T R S Üb7.25.251 Q R A G Q Q S Tabla 5 (continúa) Clon ID A68 A70 A72 A73 A74 A75 A7i wt H V R L R 6 6 Ub7.25 .206 H V R A S A R Ub7.25 .207 H V W R R G S Ub7.25 .216 H R W K V R V Ub7.25 .268 Q V W K R P A Ub7.25 .225 H V R K G E R Ub7.25 .226 H V R R Y V L Ub7.25 .227 H V W R S H G Ub7.25 .238 H V H K S Y A Ub7.25 .251 H V W K W V S Además de las sustituciones de residuo aminoácido específicas aquí descritas para estabilizar conformacionalmente una proteína ubiquitina, las proteínas ubiquitina también pueden comprender mutaciones adicionales que no impactan específicamente la estabilidad conformacional . Estas mutaciones resultan en un polipéptido de ubiquitina como se define aquí, que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de polipéptido de ubiquitina de secuencia nativa como se describe aquí . Estas variantes de polipéptido de ubiquitina incluyen, por ejemplo, polipéptidos de ubiquitina en donde se agregan o eliminan uno o más residuos aminoácido, en el extremo N o C-terminal (tal como el motivo de ubiquitina di-glicina C-terminal) de una secuencia de aminoácidos nativos. Ordinariamente, una variante polipéptido de ubiquitina tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, a una secuencia de polipéptido de ubiquitina nativo como se describe aquí. Opcionalmente, polipéptidos variantes de ubiquitina no tendrán más que una sustitución de aminoácido conservador en comparación con una secuencia de polipéptido de ubiquitina nativa, en forma alterna no más que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido de ubiquitina nativa.

En general, variantes de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas incluyen variantes en donde residuos en una posición particular en la secuencia se han sustituido por otros aminoácidos, y además incluye la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos de la proteína/péptido precursor así como la posibilidad de eliminar uno o más residuos de la secuencia precursora o agregar uno o más residuos a la secuencia precursora. Cualquier sustitución, inserción o deleción de aminoácidos puede ser abarcada por la invención. En algunas modalidades, la sustitución es una sustitución conservadora como se describe aquí, de preferencia cuando parte o la conformación de la proteína se conserva y estabiliza.

En algunos aspectos, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas comprenden una deleción de uno o más residuos aminoácido. En algunas modalidades, la proteína comprende las deleciones de A75 y A76, en donde la posición de residuo aminoácido es respecto a SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada enlaza a USP7 pero es incapaz de enlazar a USP5. En otra modalidad, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada inhibe la actividad enzimática de USP7 por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, inclusive, incluyendo cualquiera porcentaje entre estos valores, pero no inhibe la actividad enzimática de USP5. En algunos aspectos, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende las sustituciones y deleciones del clon U7Ub25AAGG.

Sustituciones conservadoras de péptidos/polipéptidos se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 6, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, pueden ser introducidos y los productos cribados.

Tabla 6. Susstituciones de aminoácidos potenciales polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Sustituciones no conservadoras involucrarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo a las propiedades comunes de la cadena lateral : (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe; (7) grandes hidrofóbicos : Norleucina, Met, Val, Leu, lie; En modalidades adicionales, péptidos o polipéptidos de la invención pueden comprender uno o más aminoácidos que no son de origen natural o modificados. Un "residuo aminoácido que no es de origen natural" se refiere a un residuo diferente a aquellos residuos aminoácido de origen natural citados anteriormente, que es capaz de enlazar covalentemente con uno o varios residuos aminoácido adyacentes en una cadena polipéptido. Aminoácidos no naturales incluyen pero no están limitados a homo-lisina, homo-arginina, homo-serina, ácido azetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, 2-aminoheptanoico ácido, ácido 2aminoisobutírico, 3 -aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciaria, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2 , 21 -diaminopimélico, ácido 2 , 3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, citrulina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina. Aminoácidos modificados incluyen aminoácidos naturales y no naturales que están químicamente bloqueados, en forma reversible o irreversible, o modificados en su grupo amino N-terminal o sus grupos de cadena lateral, tal como por ejemplo, D y L aminoácidos N-metilados, grupos funcionales de cadena letaral que se modifican químicamente a otro grupo funcional. Por ejemplo, aminoácidos modificados incluyen sulfóxido de metionina; metionina sulfona; ácido aspártico (éster de beta-metilo) , un aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, un aminoácido modificado de glicina; o carboxamida alanina y un aminoácido modificado de alanina. Adicional no natural y aminoácidos modificados, y los métodos de incorporación en proteínas y péptidos, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sandberg et ah, (1998) J. Med Chem 41: 2481-91; Xie y Schultz (2005) Curr Opin Chem Biol 9: 548-554; Hodgson y Sanderson (2004) Chem Soc Rev. 33: 422-430.

En algunas modalidades de cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas, la proteína puede ser aislada. En algunas modalidades de cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas, la proteína es una proteína sintética o una cadena polipéptido creada a través de síntesis química.

En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas pueden aislarse de células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas estándar. En otra modalidad, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas se producen por técnicas de DNA recombinante . En forma alterna a expresión recombinante, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas pueden ser sintetizadas químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptidos estándar.

En algunas modalidades, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas son polipéptidos sustancialmente aislados (tales como aislados) . Componentes contaminantes incluyen materiales que típicamente interfieren con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros materiales proteináceos o no proteináceos . Preparaciones que tienen de preferencia menos de aproximadamente 30% por peso seco de material contaminante no deseado (contaminantes) , de preferencia menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 10%, y de preferencia menos de aproximadamente 5% de contaminantes, se consideran sustancialmente aislados. Un péptido/polipéptido aislado, recombinantemente producido o su porción biológicamente activa de preferencia está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir medio de cultivo representa de preferencia menos de aproximadamente 20%, de preferencia menos de aproximadamente 10% y de preferencia menos de aproximadamente 5% del volumen de una preparación de péptido/polipéptido . Ejemplos de contaminantes incluyen desechos celulares, medio de cultivo, y sustancias empleadas y producidas durante síntesis in vitro del péptido/polipéptido B. Fusiones de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas Además aquí se proporcionan fusiones de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas que comprenden cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas conjugadas a un portador. En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador al cual la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada se conjuga es un polímero biodegradable . Polímeros biodegradables o biocompatibles pueden emplearse tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico, PEG, polilactida, poliglicólido, policaprolactona, hidratos de carbono, polipéptidos, colágeno, almidones, celulosa, quitinas, ligninas y co-polímeros de los mismos. Estos materiales pueden obtenerse comercialmente de ALZA Corporation (Mountain View, CA) y NOVA Pharmaceuticals , Inc. (Lake Elsinore, CA) , o preparados por una persona con destreza en la especialidad. Suspensiones liposomales también pueden emplearse como portadores farmacéuticamente aceptables . Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por aquellos con destreza en la técnica, tales en (Eppstein et al., Patente de los E.U.A. No. 4,522,811, 1985). En algunas modalidades, el portador es un polipéptido. En alguna modalidad, el polipéptido es albúmina. En algunas modalidades, el polipéptido es un Fe. En algunas modalidades, el portador es PEG.

En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador se conjuga al extremo C de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada. En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador no es conjugado al extremo-N de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada.

En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador se conjuga covalentemente con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada. En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador se conjuga directamente a la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada. En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, el portador se conjuga covalentemente a la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada mediante una secuencia enlazadora. En algunas modalidades, el portador se conjuga como una proteína de fusión con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada.

En algunas modalidades de cualquiera de las fusiones de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, la conjugación de la proteínan ubiquitina conformacionalmente estabilizado al portador aumenta la vida media y/o biodisponibilidad de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada en comparación con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada no conjugada al portador.

C. Complejos de proteínas También aquí se proporcionan complejos de proteínas que comprenden cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas y un socio de enlace. En algunas modalidades, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de ubiquitina, tal como pero no limitado a cualesquiera enzimas de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia USP de desubiquitinasas (tal como pero no limitado a USP7, USP5 y/o USP14) . En algunas modalidades, las proteínas dentro del complejo de proteína se enlazan entre sí con una afinidad como se determina por una Kd menor a aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1.0 mM, 500 µ?, 100 µ?, 50 µ , 25 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 900 ??, 800 ??, 700 ??, 600 ??, 500 ??, 400 ??, 300 ? , 200 ??, 150 ??, 100 ??, 90 ??, 80 ??, 70 ??, 60 ??, 50 ??, 45 ??, 40 ??, 35 ? , 30 ??, 25 ??, 20 ??, 15 ??, 10 ? , 5 ??, o 1 ??, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números. En algunas modalidades, cuando el socio de enlace en una enzima, el enlace de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y la enzima para formar un complejo de proteína, inhibe selectivamente (tal como inhibe completamente) la actividad enzimática de la enzima. En otra modalidad, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada disminuye la actividad enzimática de la enzima en cualquiera de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, cuando la enzima y la ubiquitina conformacionalmente estabilizada forman un complejo de proteína.

También se proporciona aquí complejos de proteína ubiquitinados que comprenden una proteína enlazada directamente (es decir, directamente (por ejemplo, por un enlace covalente) o indirectamente) a cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas. En algunas modalidades, la proteína es monoubiquitinada . En otra modalidad, la proteína es multiubiquitinada en múltiples residuos lisina (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más) . En otra modalidad, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas conectadas a la proteína forman cadenas de poliubiquitina en cualquiera (tal como cualquiera de l, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) de los residuos lisina de la proteína ubiquitina. En algunas modalidades, la cadena de poliubiquitina puede incluir una o más proteínas ubiquitina de tipo silvestre, además de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas .

En algunos aspectos, cualquiera de las proteínas o complejos de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizados pueden inmovilizarse en un soporte sólido utilizando cualquier método conocido en la especialidad. En otro aspecto, una célula o población de células que expresa cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas también puede inmovilizarse en un soporte sólido. La presente solicitud de esta manera también proporciona 1) un soporte sólido acoplado con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas 2) un soporte sólido acoplado a una célula o población de células que expresan cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas .

También aquí se proporcionan soportes sólidos que tienen un complejo de proteína que comprende una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (tal como cualquiera aquí descrita) en complejo con una desubiquitinasa de familia USP (tal como pero no limitada a USP7) . Ejemplos de soportes sólidos convenientes incluyen, pero no están limitados a vidrio, plástico, metal, látex, hule, cerámica, polímeros tales como polipropileno, difluoruro de polivinilideno, polietileno, poliestireno, y poliacrilamida, dextrano, celulosa, nitrocelulosa, PVDF, nylon, amilosa, y similares. Un soporte sólido puede ser plano, cóncavo o convexo, esférico, cilindrico y semejantes, y pueden ser partículas (tales como una nanopartícula) , perlas (tal como una perla magnética) , membranas, hebras, precipitados, geles, hojas, recipientes, pozos, capilares, películas, placas, portaobjetos y soporte de objetos y semejantes. El soporte sólido puede ser magnético o una columna. En algunas modalidades, el soporte sólido es adecuado para realizar resonancia plasmón de superficie. En una modalidad particular, un micromatriz de proteínas puede prepararse en la que cualquiera de las proteínas o complejos de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizada aquí descritas puede ser inmovilizada en una superficie de un soporte sólido. En una modalidad, las proteínas o complejos de proeínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas se modifican para incluir uno o más grupos funcionales que enlazan a una sola proteína, una clase de proteínas funcional o estructural, o proteínas en general, para inmovilización de proteínas a un soporte sólido. Por ejemplo, sistemas de proteína de fusión tales como un parche de tiorredoxina, enfoques basados en inteína u otros métodos pueden ser empleados para inmovilizar una proteína o complejo de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizado. Las proteínas o complejos de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizados pueden ser modificados con succinimidiléster/aldehído (para inmovilización general de proteínas) , glutación (inmovilizar proteínas de fusión GST) , o NTA de metal (para inmovilizar proteínas etiquetadas -His) , o ligandos específicos (tal como una desubiquitinasa de la familia USP de desubiquitinasas) para inmovilizar clases específicas de proteínas. Similarmente , para estudiar interacciones proteína-proteína, incluyendo aislar complejos de proteínas, una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, complejo de proteína o proteína modificada, tal como cualquiera de los aquí descritos, pueden ser inmovilizada en partículas magnéticas o no magnéticas, por ejemplo partículas MagneSil.

D. Ácidos Nucleicos Aquí se proporcionan los ácidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de las proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritos aquí. La descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, en la que la molécula de ácido nucleico codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

E . Vectores Las secuencias de polinucleótidos que codifican cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento pueden obtenerse usando técnicas de síntesis estándar y/o técnicas recombinantes . Secuencias de polinucleótidos deseados pueden ser aisladas y secuenciadas a partir de células de origen adecuadas. Células de origen para anticuerpos, péptidos, polipéptidos y/o incluirían anticuerpo, péptido, y/o polipéptido de la producción de células tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican el anticuerpo, péptido, y/o polipéptido se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en una célula huésped. Muchos vectores que están disponibles y conocidos en la técnica pueden ser utilizados para el propósito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a insertar en el vector y la célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótidos heterólogos, o ambos) y de su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación (en particular cuando se inserta el vector en una célula procariota) , un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma (RBS) , una secuencia de señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción. En algunas modalidades, el vector es un vector de expresión.

En general, los vectores plasmídicos que contienen replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula huésped, se utilizan en conexión con estos huéspedes. El vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por lo tanto proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas.

Además, los vectores de fagos que contienen replicón y secuencias de control que son compatibles con el microorganismo huésped se pueden utilizar como vectores transformantes en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, bacteriófagos tales como AGEM. M. -11 se pueden utilizar en la fabricación de un vector recombinante que se puede utilizar para transformar células huéspedes susceptibles tales como E. coli LE392.

Cualquiera de los promotores constitutivos o inducibles que pueden utilizarse en la presente invención, de acuerdo con las necesidades de una situación particular, puede ser determinado por un experto en la técnica. Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. El promotor seleccionado puede ser unido operativamente al cistrón de ADN que codifica un polipéptido descrito en este documento eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de elección. Tanto la secuencia del promotor nativo como muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para la amplificación y/o expresión directa de los genes diana. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de gen diana expresado en comparación con el promotor de polipéptido diana nativo.

Los promotores adecuados para uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas de ß-galactamasa y promotor lactosa, un sistema de promotor triptóf no (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o trc . Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) son adecuados también. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo así a un técnico ligar operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas de destino (Siebenlist et al (1980) Cell 20: 269) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

En algunas modalidades, cada cistrón dentro de un vector recombinante que comprende un componente de secuencia de señal de secreción dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA del polipéptido diana que se inserta en el vector. La señal de secuencia seleccionada para el propósito de esta invención debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una señal peptidasa) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterologos, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo consistente en la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o líderes de enterotoxina estables al calor II (STII) , LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP.

F. Las células huésped Las células huésped procariotas adecuadas para la expresión de polipéptidos incluyen arqueobacterias y eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivo. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli) , bacilos (por ejemplo, B. subtilis) , Enterobacterias, species Pseudomonas (eg, P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, oro Paracoccus. Preferiblemente, células gram-negativas se emplean. De preferencia la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y adicionalmente inhibidores de proteasa pueden ser convenientemente incorporados en el cutlivo celular.

En una modalidad, la célula huésped es una célula de levadura seleccionada de entre el grupo consistente de Saccharomyces , una Pichia, y una Candida. En otra modalidad, la célula es una célula de nematodo Caenorhabdus elegans. En otra modalidad, la célula es una célula de insecto, tal como una célula de Drosophila. En todavía otra modalidad, la célula es una célula de pez cebra.

Ejemplos de células de mamífero capaces de expresar cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina descritas en este documento se pueden seleccionar del grupo que consiste de una célula de hámster, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de conejo, una célula de gato, una célula de perro, una célula bovina, una célula de cabra, una célula porcina, una célula equina, una célula de oveja, una célula de mono, una célula de chimpancé, y una célula humana. En otra modalidad, la célula animal es una célula neuronal (tales como, pero no limitado a, una célula del sistema nervioso periférico o una célula del sistema nervioso central) , una célula de músculo (tal como una célula del músculo cardíaco, esquelético, o liso) , un gameto (tal como una célula de esperma o un ovocito) , una célula de cáncer, una célula inmune (tal como, pero no limitado a, un macrófago, una célula T o una célula B) , una célula madre (tales como, pero no limitado a, una célula embrionaria vástago o una célula madre adulta) , o una célula endocrina (tal como, pero no limitado a, una célula tiroidea, una célula hipotalámica, una célula pituitaria, una célula suprarrenal, una célula testicular, una célula de ovario, una célula pancreática (tal como una célula ß) , una célula de estómago, o una célula intestinal) . En algunas modalidades, la célula es una célula humana en cultivo celular. En algunas modalidades, la célula es una célula no humana en cultivo celular. En algunas modalidades, la célula es una célula de cáncer.

G. Producción de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizada Las células huésped se transforman o transfectan con los vectores de expresión descritos anteriormente y cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas .

La transfección se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que ninguna de las secuencias codificantes se expresa. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, precipitación y electroporación CAP0 . La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en el huésped procariota para que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio se utiliza generalmente para células bacterianas que contienen barreras sustanciales de pared celular. Otro método para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Sin embargo, otra técnica utilizada es la electroporación.

Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen el caldo de Luria (LB) más suplementos de nutrientes necesarios. En modalidades preferidas, los medios también contiene un agente de selección, elegido en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios para el crecimiento de células que expresan el gen resistente a la ampicilina.

Todos los suplementos necesarios además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico puede incluirse también en concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol .

Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varía de aproximadamente 20°C a aproximadamente 39°C, más preferiblemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37°C, aún más preferiblemente a aproximadamente 30°C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.4, y más preferiblemente aproximadamente 7.0.

Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. Por ejemplo, si un promotor PhoA se utiliza para controlar la transcripción, las células huésped transformadas pueden cultivarse en un medio limitante de fosfato para la inducción. Una variedad de otros inductores puede ser utilizado, de acuerdo con la construcción del vector empleado, como se conoce en la técnica.

Los polipéptidos descritos aquí expresados en un microorganismo puede secretarse en y se recuperan a partir del periplasma de las células huésped. Recuperación de proteínas normalmente implica interrumpir el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos celulares o células enteras se pueden eliminar por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, por resina de afinidad, cromatografía. Alternativamente, las proteínas pueden ser transportados en los medios de cultivo y aisladas del mismo. Las células pueden ser retirados del cultivo y el sobrenadante del cultivo se filtraron y se concentra para una purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden ser más aislado e identificados utilizando métodos comúnmente conocidos, tales como el fraccionamiento en inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; resinas de afinidad hidrófobos, afinidad de ligando utilizando un antígeno adecuado inmovilizado sobre una matriz y ensayo de transferencia Western.

Además de las células huésped procariotas, sistemas de células huésped eucariotas son también bien establecidos en la técnica. Los huéspedes adecuados incluyen líneas celulares de mamífero tales como CHO, y células de insectos tales como los descritos a continuación.

H . Purificación polipéptido/péptido Los polipéptidos/péptidos que se producen se pueden purificar para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para ensayos y usos posteriores. Métodos de purificación de proteínas convencionales conocidos en la técnica se pueden emplear. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento sobre inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque , SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

IV. Métodos de la Invención Aquí se describen métodos para inhibir selectivamente una desubiquitinasa de la familia USP. También se proporcionan en este documento métodos para identificar un agente que 1) se une a una forma conformacional de una proteína ubiquitina (por ejemplo, una forma conformacional de la ubiquitina que se une favorablemente a una desubiquitinasa de la familia de desubiquitinasas USP) ; 2) se une a un complejo de proteínas USP-desubiquitinasa/ubiquitina; 3) se une a un desubiquitinasa de la familia USP; y/o 4) es capaz de interrumpir un complejo de proteínas USP-desubiquitinasa/ubiquitina. Además se proporciona aquí un método para la detección de una forma conformacionalmente estabilizada de una proteína, en donde la forma conformacionalmente estabilizada de la proteína tiene una mayor afinidad de enlace a un socio de enlace en comparación con la forma de tipo silvestre de la proteína. También se proporcionan aquí agentes identificados por los métodos de cualquiera de las reivindicaciones descritas en este documento .

A. Métodos de inhibición selectiva de una Desubiquitinasa de la Familia USP Aquí se describen métodos para inhibir selectivamente la actividad enzimática de una desubiquitinasa de la familia USP de desubiquitinasas. En algunos aspectos, el método comprende poner en contacto la desubiquitinasa con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento. En algunas modalidades, la desubiquitinasa USP es cualquiera de USP 1, USP2, USP3, USP4, USP5, USP6, USP7 , USP8 , USP9X, USP9Y, USP10, USPL 1, USP12, USP13, USP14 , USP15, USP16, USP17, USP17L2, USP17L3 , USP17L4, USP17L5 , USP17L7, USP17L8, USP18, USP19, USP20 , USP21, USP22, USP23, USP24 , USP25, USP26 , USP27X, USP28 , USP29 , USP30 , USP31 , USP32 , USP33 , USP34 , USP35 , USP36 , USP37 , USP38, USP39 , USP40 , USP41 , USP42 , USP43 , USP44, USP45 , o USP46. En otra modalidad, la USP es desubiquitinasa USP7, USP5 , o USP14. En una modalidad, la desubiquitinasa USP es USP7. En algunas modalidades, la desubiquitinasa USP se pone en contacto con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, en donde la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada comprende cualquiera de las sustituciones de aminoácidos descritas en este documento. En una modalidad, la desubiquitinasa USP se pone en contacto con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada in vitro. En otra modalidad, la desubiquitinasa USP se pone en contacto con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada in vivo (tal como, por ejemplo, por la co-expresión de la desubiquitinasa USP con cualquiera de los proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina descritas en este documento por cualquier medio conocido en la técnica o mediante la administración de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada en un vehículo soluble en lípidos) . En otra modalidad, la inhibición es in vivo. En algunas modalidades, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada es una USP desubiquitinasa antagonista. En algunas modalidades, en contacto con la USP desubiquitinasa con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento inhiben selectivamente (como inhibe completamente) la actividad enzimática de la desubiquitinasa USP. En algunas modalidades, en contacto con la USP desubiquitinasa con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento selectivamente inhibe la actividad enzimática de desubiquitinasa de la desubiquitinasa USP por cualquiera de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, inclusive, incluyendo cualquier porcentaje entre estos valores, en comparación con la inhibición de estas enzimas causadas por ubiquitina de tipo silvestre.

B. Métodos para la identificación de agentes que se unen a un formulario conformacional de ubiquitina La presente invención también proporciona métodos para la identificación (o la detección de) uno o más agentes que se unen (tal como se unen preferentemente) a una forma conformacional particular de ubiquitina (por ejemplo, una forma conformacional de la ubiquitina en la que una o más de sustituciones de aminoácidos estabilizan de la región de bucle ß1/ß2 de la proteína ubiquitina de manera que la región del bucle ß1/ß2 se limita a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD de Protein Data Bank Código 3NHE cadena B) . Tales ensayos pueden incluir ensayos susceptibles de cribado de alto rendimiento de bibliotecas (tales como péptido o bibliotecas químicas) .

En algunas modalidades, se proporciona un método para identificar un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a una forma conformacional de la proteína ubiquitina que es favorable para la unión a un compañero de unión, que comprende poner en contacto el agente con una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (tal como cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento) y determinar si el agente es capaz de unirse a dicho conformacionalmente forma de ubiquitina estabilizado.

Proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina útil para el ensayo de unión se pueden estabilizar proteínas ubiquitina o un fragmento de las mismas, siempre y cuando el fragmento es capaz de mantener la misma estabilidad conformacional con respecto a la región del bucle ß1/ß2 como la proteína de longitud completa estabilizada. Alternativamente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada o fragmento de la misma pueden estar contenida dentro de un polipéptido, es decir, el polipéptido utilizado para el ensayo de unión puede comprender residuos de aminoácidos adicionales no presentes en la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada monomérica .

Los ensayos de unión descritos en este documento requieren generalmente poner en contacto los dos componentes a ser probados para la unión (por ejemplo una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, tal como una proteína ubiquitina estabilizado favorable para la unión a un desubiquitinasa de. la familia de desubiquitinasas USP y un agente) en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos componentes interaccionen. El complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad ejemplar, uno de los componentes (por ejemplo, una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, tal como cualquiera descrita aquí) se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, en un lugar de microtitulación, mediante enlaces covalentes o no covalentes . La unión no covalente generalmente se consigue recubriendo la superficie sólida con una solución del agente y secado. Alternativamente, una molécula de afinidad inmovilizada, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el agente a ser inmovilizado, puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado (por ejemplo, un agente) , que puede ser etiquetado por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción es completa, se eliminan los componentes no reactivos, por ejemplo, mediante lavado, y los complejos anclados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente inmovilizada lleva una etiqueta detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se produjo la unión. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, la unión puede ser detectada, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

En algunas modalidades, un agente que inhibe la unión de una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y socio (tal como un miembro de la familia de desubiquitinasas USP) de unión se ensayó como sigue: Una mezcla de reacción se prepara conteniendo la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada o fragmento del mismo y pareja de unión o fragmento de la misma en condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos componentes . Para probar la capacidad de un agente candidato para inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del agente candidato. Además, un placebo puede ser añadido a una mezcla de reacción separado para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el agente candidato, proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y socio de enlace (o equivalente de la misma) se monitorea como se ha descrito anteriormente. La formación de un complejo en la reacción control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto candidato indica que el compuesto candidato inhibe la unión de la proteina ubiquitina conformacionalmente estabilizada al socio de enlace. Además, diferentes cantidades del agente candidato pueden ser examinadas para determinar si la inhibición de la unión es competitiva.

En un método alterno, una reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida, los productos de reacción separados de componentes no reactivos, y los complejos detectarse; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, el socio de enlace o fragmento del mismo (tal como un miembro de la familia de USP desubiquitinasas o fragmento del mismo) , o el agente candidato para anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro componente del posible complejo puede ser utilizado para detectar los complejos anclados. Alternativamente, los ensayos basados en células se pueden utilizar para ensayos de unión. Específicamente, (por ejemplo, células COS, células CHO 3J, fibroblastos, etc.) que se han modificado para expresar una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (por ejemplo, por transfección o transducción con una variante de ADN ubiquitina, etc.) se pueden utilizar líneas celulares.

El agente identificado por los métodos descritos anteriormente adicionalmente puede ensayarse por su especificidad de unión como se describe más adelante. Métodos de identificación de un agente que se une a un sitio de unión específica pueden llevarse a cabo independientemente de los métodos de cribado descritos anteriormente, o en combinación con los ensayos de cribado de la inhibición. En otras palabras, un método para identificar un agente que inhibe (tales como la inhibición parcial o completa) la actividad enzimática de un socio de enlace (tal como un miembro de la familia de desubiquitinasas USP) como se describe en el presente documento se puede llevar a cabo por primera detección de agentes que inhiben (por ejemplo, inhibir competitivamente) la unión de una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada a un socio de enlace (también referido como "el cribado basado en la inhibición"), seguido de la identificación de un agente desde dichos resultados de la evaluación que se unen a un sitio de unión específico sobre la ubiquitina conformacionalmente estabilizada (también referido como "basada en el cribado de enlace") . Alternativamente, se pueden detectar agentes que se unen a un sitio de enlace específico sobre la ubiquitina conformacionalmente estabilizada sin primero llevar a cabo un cribado basado en la inhibición (o es seguido por un ensayo basado en inhibición) .

En algunas modalidades, el cribado basado en la inhibición y/o basados en la unión de detección puede llevarse a cabo en conjunción con un método de detección/identificación basada en una lectura funcional del agente. Lectura funcional de un agente que inhibe la actividad de una enzima conocida para interactuar con la ubiquitina se puede diseñar basado en el conocimiento de las actividades biológicas asociadas con la maquinaria de ubiquitina/proteasoma de procesamiento, incluyendo, pero no limitado a, escisión de ubiquitina de las proteínas diana, remoción o incorporación de monómeros de ubiquitina en las cadenas de poliubiquitina, degradación de la proteína diana a través del complejo proteasoma, o el funcionamiento de las enzimas de procesamiento de ubiquitina. El método/identificación de cribado funcional puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la proyección de inhibición a base de y/o basado en la unión de cribado.

Por lo tanto, en algunos aspectos, proporcionados aquí, métodos para identificar un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a una forma conformacionalmente estabilizado de la ubiquitina, tal como cualquiera de las formas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina descritas en este documento. El agente puede ser un pequeño compuesto químico de la molécula, un ácido nucleico inhibitorio, una proteína (tal como un péptido inhibidor no-anticuerpo o un anticuerpo) , o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, los métodos comprenden poner en contacto el agente con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas aquí y determinar si el agente es capaz de unirse a la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada.

En algunas modalidades, la forma conformacionalmente estabilizada de ubiquitina es una forma conformacional que es favorable para la unión a uno o más socios de enlace específicos. En algunas modalidades, la unión del agente puede inhibir la unión de (por ejemplo, puede interrumpir la interacción entre) una o más de las socios de enlace que se unen (como se unen preferentemente) a la forma conformacional de ubiquitina. En una modalidad, el socio de enlace es una enzima de procesamiento de la ubiquitina, tal como, pero no limitado a, cualquier enzima de procesamiento de ubiquitina El, E2 o E3 o una desubiquitinasa . En algunas modalidades, el socio de enlace es un miembro de la familia de USP de desubiquitinasas (tales como, pero no limitados a, USP7, USP5, y/o USP14) . En algunas formas de modalidad, el agente inhibe competitivamente la unión de un socio de enlace a una forma conformacional específica de ubiquitina (por ejemplo, una forma conformacional de la ubiquitina en la que una o más sustituciones de aminoácidos estabilizan la región del bucle ß1/ß2 de la ubiquitina proteína de tal manera que la región de bucle ß1/ß2 se limita a una región dentro de aproximadamente 1.6 Á RMSD de Protein Data Bank Código 3NHE cadena B) pero no afecta la unión del socio de enlace a otras formas conformacionales de ubiquitina. En modalidades adicionales, el agente compite con la unión de un socio de enlace a una forma conformacional específica de la ubiquitina en un IC50 de menos de aproximadamente 40 nM (por ejemplo, menos de aproximadamente 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, o I M) en ensayo de ELISA competitivo. En algunas modalidades, el agente enlazado a ubiquitina suprime las actividades enzimáticas de uno o más socios de unión, tales como la actividad enzimática de una desubiquitinasa de la familia de USP de desubiquitinasas .

Los agentes también aquí se proporcionan identificados por los métodos de cualquiera de las reivindicaciones descritas en este documento.

C. Métodos para identificar un agente que interrumpe o se une a una ubiquitina/USP- complejo de proteínas desubiquitinasa.

La presente invención también proporciona métodos para identificar (o prueba de) uno o más agentes que se unen a un complejo de proteínas que comprende una desubiquitinasa de la familia USP (tales como, pero no limitadas a, USP7) y ubiquitina. En un aspecto, se proporciona un método para identificar (o la detección de) uno o más agentes que pueden interrumpir una ubiquitina/USP-desubiquitinasa complejo proteico. Tales ensayos pueden incluir ensayos susceptibles de cribado de alto rendimiento de bibliotecas (tales como bibliotecas péptido o químicas) .

En algunos aspectos, se proporciona un método para identificar un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a una desubiquitinasa de la familia USP, que comprende poner en contacto el agente con un complejo de proteína que comprende una desubiquitinasa de la familia USP y cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento y determinar si el agente es capaz de unirse a dicha desubiquitinasa. En algunos aspectos, se proporciona un método para identificar un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a ubiquitina que comprende poner en contacto el agente con un complejo de proteína que comprende una desubiquitinasa de la familia USP y cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas aquí descritas y determinar si el agente es capaz de unirse a ubiquitina.

Complejos de proteína que comprenden una desubiquitinasa de la familia USP y una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada pueden ser cualquiera de los complejos de proteínas descritos en este documento que contienen cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritos en este documento como un componente. El componente desubiquitinasa USP del complejo de la proteína puede ser cualquier miembro de la familia USP, tal como, pero no limitado a, cualquiera de USP 1, USP2 , USP3, USP , USP5 , USP6 , USP7, USP8, USP9X, USP9Y, USP10, USP11, USP12 , USP13, USP14 , USP15 , USP16, USP17, USP17L2 , USP17L3, USP17L4 , USP17L5 , USP17L7, USP17L8 , USP18, USP19, USP20, USP21 , USP22 , USP23, USP24 , USP25, USP26, USP27X, USP28, USP29 , USP30 , USP31 , USP32, USP33, USP34 , USP35 , USP36, USP37, USP38 , USP39 , USP40 , USP41, USP42, USP43 , USP44 , USP45, o USP46. En otra modalidad, la USP es desubiquitinasa USP7, USP5, o USP14. Alternativamente, la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada o fragmento del mismo o la desubiquitinasa USP puede ser contenida dentro de un polipéptido, es decir, cualquiera de los polipéptidos que comprenden el complejo de proteína utilizado para el ensayo de unión puede comprender residuos de aminoácidos adicionales no presentes en el monómero de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizado.

Los ensayos de unión descritos en este documento generalmente requieren ponerse en contacto con los dos componentes a ser probado para enlace (por ejemplo, un complejo de proteína que comprende una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y una desubiquitinasa USP y un agente) en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos componentes interactúen. El complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad ejemplar, uno de los componentes (por ejemplo, un complejo de proteínas, tales como cualquiera descrita en este documento) se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, en un lugar de microtitulación, mediante enlaces covalentes o no covalentes . La unión no covalente generalmente se consigue recubriendo la superficie sólida con una solución del agente y el secado. Alternativamente, una molécula de afinidad inmovilizada, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el agente a ser inmovilizado puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado (por ejemplo, un agente) , que puede ser marcado por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción es completa, se eliminan los componentes no reactivos, por ejemplo, mediante lavado, y los complejos anclados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se produjo el enlace. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, el enlace puede ser detectado, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

En algunas modalidades, un agente que interrumpe un complejo de proteínas formado entre una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y un miembro de la familia de desubiquitinasas USP se ensaya como sigue: Una mezcla de reacción se prepara conteniendo la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada o fragmento de la misma y un miembro de la familia de desubiquitinasas USP en condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos componentes para formar un complejo de proteínas. Para probar la capacidad de un agente candidato para alterar la interacción entre el complejo de proteína que comprende la desubiquitinasa y la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, la reacción se realiza en ausencia y en presencia de un agente candidato. Además, un placebo puede ser añadido a una mezcla de reacción separada para servir como control positivo. La unión entre el agente candidato y la desubiquitinasa USP se controla como se describió anteriormente. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto candidato indica que el compuesto candidato inhibe la unión de la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada al socio de enlace. Además, diferentes cantidades del agente candidato pueden ser examinados para determinar si la inhibición de la unión es competitivo.

En un método alterno, una reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida, los productos de reacción separados de componentes no reactivos, y los complejos detectados; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizado, la desubiquitinasa USP, o el agente candidato para anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro componente del posible complejo se puede utilizar para detectar los complejos anclados. Alternativamente, los ensayos basados en células se pueden utilizar para ensayos de enlace. Específicamente, las líneas celulares (por ejemplo, células COS, células CHO 3J, fibroblastos, etc.) que se han modificado para expresar una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (por ejemplo, por transfección o transducción con un ADN variante de ubiquitina, etc.), así como células que expresan de forma natural o que han sido diseñados para expresar una desubiquitinasa USP se pueden utilizar.

El agente identificado por los métodos descritos anteriormente adicionalmente puede ensayarse por su especificidad de unión como se describe más adelante. Métodos de identificación de un agente que se une a un sitio de enlace específico pueden llevarse a cabo independientemente de los métodos de cribado descritos anteriormente, o en combinación con los ensayos de cribado de la inhibición. En otras palabras, un método para identificar un agente que inhibe (tales como la inhibición parcial o completa) la actividad enzimática de un miembro de la familia de desubiquitinasas USP se puede llevar a cabo por primera selección de agentes que interrumpen un complejo de proteína que comprende la desubiquitinasa y una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada seguido por la identificación de un agente desde dichos resultados de la evaluación que se unen a un sitio de enlace específico en la desubiquitinasa (también referidos como "basada en el cribado de enlace"). Alternativamente, se pueden detectar agentes que se unen a un sitio de enlace específico en la desubiquitinasa sin primero llevar a cabo un cribado basado en la inhibición (o es seguido por un ensayo basado en inhibición) .

En algunas modalidades, el cribado basado en la inhibición y/o basado en la unión de detección puede llevarse a cabo en conjunto con un método de detección/identificación basada en una lectura funcional del agente. Lectura funcional de un agente que inhibe la actividad de una enzima conocida para interactuar con la ubiquitina se puede diseñar basado en el conocimiento de las actividades biológicas asociadas con la maquinaria de procesamiento de ubiquitina/proteasoma, incluyendo, pero no limitado a, escisión de ubiquitina de las proteínas diana, remoción o incorporación de monómeros de ubiquitina en las cadenas de poliubiquitina, o la degradación de proteínas a través del complejo proteasoma. El método de detección/identificación funcional se puede llevar a cabo antes o después de la proyección de inhibición a base de y/o la detección basada en la unión.

Por lo tanto, en algunos aspectos, se proporcionan en este documento métodos para identificar un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a un complejo de proteína que comprende una desubiquitinasa de la familia USP y ubiquitina. El agente puede ser un pequeño compuesto químico de la molécula, un ácido nucleico inhibitorio, una proteína (tal como un péptido inhibidor o un anticuerpo) , o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, los métodos comprenden poner en contacto el agente con cualquiera de los complejos de proteínas que comprenden una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada y una desubiquitinasa USP descrita en este documento y determinar si el agente es capaz de unirse a la desubiquitinasa o a la ubiquitina conformacionalmente estabilizada. En algunas modalidades, el agente altera la interacción entre la ubiquitina conformacionalmente estabilizada y la desubiquitinasa, alterando de esta manera el complejo de proteínas. En algunas modalidades, el componente desubiquitinasa USP del complejo de la proteína puede ser cualquier miembro de la familia USP, tal como, pero no limitado a, cualquiera de USP1, USP2, USP3, USP4, USP5 , USP6 , USP7, USP8 , USP9X, USP9Y , USP10, USP11, USP12 , USP13, USP14 , USP15 , USP16 , USP17, USP17L2 , USP17L3, USP17L4, USP17L5, USP17L7, USP17L8, USP18 , USP19, USP20, USP21, USP22, USP23, USP24, USP25 , USP26, USP27X, USP28, USP29, USP30, USP31 , USP32 , USP33, USP34, USP35, USP36 , USP37 , USP38, USP39 , USP40 , USP41, USP42, USP43, USP44, USP45, o USP46. En algunas modalidades, la USP es desubiquitinasa USP7, USP5, o USP14. En una modalidad, la USP es desubiquitinasa USP7. En algunas modalidades, el agente compite con la unión de la desubiquitinasa a la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizado en IC50 de menos de aproximadamente 40 nM (por ejemplo, menos de aproximadamente 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, o I M) en ensayo ELISA competitivo. En algunas modalidades, el agente enlazado a ubiquitina suprime las actividades enzimáticas de uno o más socios de enlace, tales como la actividad enzimática de una desubiquitinasa de la familia de USP desubiquitinasas .

En algunos aspectos, el agente que se une a una familia de desubiquitinasa USP es un anticuerpo. Los anticuerpos son polipéptidos que se unen (como se unen preferentemente) a cualquiera de la familia de desubiquitinasas USP descritas en este documento. En algunas modalidades, los anticuerpos son antagonistas familia de desubiquitinasa USP (por ejemplo USP7, USP5, o USP 14) .

En algunos aspectos, el agente que se une a una familia de desubiquitinasa USP es un polipéptido de unión no-anticuerpo. Polipéptidos de unión son polipéptidos que se unen (como se unen preferentemente) a cualquiera de la familia de desubiquitinasas USP descritas en este documento. En algunas modalidades, los polipéptidos de unión son antagonistas de familia de desubiquitinasa USP (por ejemplo USP7 , USP5, o USP 14) .

En algunos aspectos, el agente que se une (como se une preferentemente) a una familia desubiquitinasa USP es una pequeña molécula de compuesto químico. Compuestos químicos de moléculas pequeñas son compuestos que se unen (como se unen preferentemente) a cualquiera de las familia de desubiquitinasas USP descritos en este documento. En algunas modalidades, los pequeños compuestos químicos de la molécula son antagonistas de familia de desubiquitinasas USP (por ejemplo USP7, USP5, o USP 14) .

D . Agentes que se unen a proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas, desubiquitinasas USP, o complejos de proteínas de las mismas En algunos aspectos de cualquiera de los métodos proporcionados en este documento, un agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente a) una forma conformacional estabilizada de la proteína ubiquitina (tales como cualquiera de las formas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas proporcionadas en este documento) , que se une (tal como se une preferentemente) a una desubiquitinasa de la familia USP, o que se une a y/o disocia una desubiquitinasa-USP / complejo de proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizado puede ser un anticuerpo, un polipéptido de enlace sin-anticuerpo, o un compuesto químico de molécula pequeña. 1. Anticuerpos En algunos aspectos, el agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a una forma conformacional específica de la proteína ubiquitina (tal como cualquiera de las formas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina proporcionadas en este documento) es un anticuerpo. Los anticuerpos son polipéptidos que se unen a cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritos en este documento. En algunas formas de modalidad, los anticuerpos son antagonistas de enzima ubiquitina de procesamiento (por ejemplo, cualquier miembro de la familia El, E2, E3 o de las enzimas de procesamiento de ubiquitina) . En algunas modalidades, los anticuerpos son antagonistas de desubiquitinasa (tal como un miembro de la familia de desubiquitinasas USP, por ejemplo USP7, USP5, o USP14) .

Las variantes de anticuerpos también se puede hacer en base a la información conocida en la técnica, sin afectar sustancialmente a la actividad de anticuerpo. Por ejemplo, las variantes de anticuerpo pueden tener al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Para los anticuerpos, los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen generalmente las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la región de entramado o marco (FR) .

Para los anticuerpos, un tipo de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo precursor del cual se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes por sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se muestran a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de Mi 3 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes de fagos se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe aquí. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, la mutagénesis de barrido de alanina se puede realizar para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a un examen como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden ser seleccionados para un mayor desarrollo .

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo, se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida por sitio) , mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cásete de una anterior variante preparada o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fe de los polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, generando de este modo una variante de la región Fe . La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 de humano) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que incluyen la de una cisteína bisagra.

En una modalidad, la variante de región Fe puede mostrar afinidad de enlace de receptor Fe neonatal alterado (FcRn) . Tales regiones Fe variantes pueden comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312 , 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat . Variantes de la región Fe con unión reducida a una FcRn, puede comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat . Las variantes de la región Fe con reducido enlace a FcRn pueden comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la región Fe, en el que la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat .

La variante de la región Fe con unión reducida a un Fe (R puede comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat .

Por ejemplo, la región Fe variante puede mostrar unión reducida a una Fe (RI y comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 327 o 329 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat.

La variante de la región Fe puede mostrar unión reducida a una Fe (RII y comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 o 439 de la región Fe, en el que la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat.

La variante de la región Fe de interés puede mostrar unión reducida a una Fe (RUI y comprender una modificación de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la región Fe, en donde la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat.

Variantes de región Fe con alterado (es decir, mejorado o disminuido) enlace Clq y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se describen en la Solicitud de Patente Internacional No.: W099/51642. Tales variantes pueden comprender una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 o 334 de la región Fe. Ver, también, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988) ; Patente de los E.U.A. No. 5,648,260; Patente de los E.U.A. No. 5,624,821; y Solicitud de Patente Internacional No. : W094/29351 relativas a variantes de la región Fe . 2. Polipéptidos sin enlace de anticuerpos En algunos aspectos, el agente que enlaza (por ejemplo, enlaza preferentemente) a una forma conformacional específica de la proteína ubiquitina (tal como cualquiera de las formas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina proporcionadas en este documento) es un polipéptido de enlace que no son anticuerpos . Polipéptidos de enlace son polipéptidos que se unen a cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento. En algunas modalidades, los polipéptidos de enlace son antagonistas de enzimas de procesamiento de ubiquitina (por ejemplo, cualquier miembro de la familia El, E2, E3 o de las enzimas de procesamiento de ubiquitina) . En algunas modalidades, los polipéptidos de enlace son antagonistas de desubiquitinasa (tal como un miembro de la familia de desubiquitinasas USP, por ejemplo USP7, USP5, o USP14) .

Los polipéptidos de enlace se pueden sintetizar químicamente utilizando la metodología de síntesis de polipéptidos conocida o pueden prepararse y purificarse usando tecnología recombinante .

Polipéptidos de enlace son habitualmente de al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98, 99, o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde los polipéptidos de enlace son capaces de unirse a una diana, tales como cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento. Polipéptidos de enlace pueden ser identificados sin excesiva experimentación usando técnicas bien conocidas. En este sentido, cabe señalar que las técnicas para el cribado de bibliotecas de polipéptidos para los polipéptidos que son capaces de unirse a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143, las publicaciones del PCT números WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ; Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Iramunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E . et al . , (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lo man, H.B. et al . , (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al . , (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al . , (1991) Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G . P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668).

En este sentido, expresión de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que le permite a uno seleccionar bibliotecas de polipéptidos grandes para identificar miembro (s) de las bibliotecas que son capaces de unirse a un polipéptido diana, tal como un c-met polipéptido. La expresión en fagos es una técnica mediante la cual se muestran variantes de polipéptidos como proteínas de fusión a la proteína de la cubierta en la superficie de partículas de bacteriófagos (Scott, JK y Smith, GP (1990) Science, 249: 386) . La utilidad de expresión en fagos radica en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorios selectivamente (o ADNc clonado al azar) pueden ser rápida y eficientemente clasifican para aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con alta afinidad. Expresión de péptidos (Cwirla, SE et al, (1990) (Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al., (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en bibliotecas de fagos se han utilizado para el cribado de millones de polipéptidos u oligopéptidos para aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, GP (1991) Current Opin Biotechnol, 2: 668). Clasificación de bibliotecas de fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación de afinidad utilizando el receptor diana, y un medio de evaluación de los resultados de enriquecimiento de enlace. Las patentes de los E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.

Aunque la mayoría de los métodos de expresión en fago han utilizado fago filamentoso, los sistemas de presentación de fagos lambdoide (WO 95/34683, patente de los E.U.A. No. 5,627,024), sistemas de visualización de fago T4 (Ren et al, Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y T7 phage display systems (Smith & Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); patente de los E.U.A. No. 5,766,905), también son conocidos.

Las mejoras adicionales son para la capacidad de los sistemas de visualización para cribar bibliotecas de péptidos para unirse a moléculas diana seleccionadas y para mostrar proteínas funcionales con el potencial de la detección de estas proteínas para las propiedades deseadas . Dispositivos de reacción combinatoria para las reacciones de expresión en fagos se han desarrollado (WO 98/14277) y las bibliotecas de presentación de fagos se han utilizado para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169, WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el que se pone en contacto una biblioteca de expresión en fagos con una solución en la que el ligando se unirá a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se unirá a la molécula diana, para aislar selectivamente los ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de biocribado de una biblioteca de expresión en fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislar el fago de unión, seguido de un proceso de microcribado utilizando pozos de la microplaca para aislar el fago de enlace de alta afinidad. También se ha reportado el uso de proteína A de Staphylococcus aureus como etiqueta de afinidad (Li et al, (1998) Mol Biotech, 9: 187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir las especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de expresión en fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para su uso en detergentes utilizando la expresión en fagos se describe en el documento WO 97/09446. Métodos adicionales de selección de proteínas de enlace específicas se describen en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,498,538, 5.432,018, y WO 98/15833.

Los métodos para generar bibliotecas de péptidos y cribado de estas bibliotecas también se describen en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.

Los polipéptidos de enlace se pueden modificar para mejorar su efecto inhibidor y/o terapéutico (incluyendo, por ejemplo, la afinidad mejorada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como la vida media, la estabilidad, y la tasa de eliminación, la toxicidad reducida, etc.). Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, glicosilación, pegilación, sustitución con aminoácido de origen no natural pero funcionalmente equivalente, grupos de enlace, etc. 3. Moléculas Pequeñas En algunos aspectos, el agente que se une (por ejemplo, se une preferentemente) a una forma conformacional específica de la proteína ubiquitina (tal como cualquiera de las formas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina proporcionadas en este documento) es un compuesto químico de la molécula pequeña. Compuestos químicos de moléculas pequeñas son compuestos que se unen a cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritos en este documento. En algunas modalidades, los pequeños compuestos químicos de la molécula son antagonistas de enzima de procesamiento de ubiquitina (por ejemplo, cualquier miembro de la familia El, E2 , o E3 de las enzimas de procesamiento de ubiquitina) . En algunas modalidades, los pequeños compuestos químicos de la molécula son antagonistas de desubiquitinasa (tal como un miembro de la familia de desubiquitinasas USP, por ejemplo USP7, USP5, o USP14) .

Las moléculas pequeñas son preferiblemente moléculas orgánicas distintas de polipéptidos o anticuerpos de enlace tal como se define en el presente documento que se unen (como se unen preferentemente) a cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento. Pequeñas moléculas Orgánicas se pueden identificar y sintetizar químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo, Publicaciones del PCT Nos. WOOO/00823 y WOOO/39585) . Pequeñas moléculas orgánicas son por lo general de menos de aproximadamente 2000 Daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 Daltons en tamaño, en el que dichas moléculas orgánicas pequeñas que son capaces de unirse a un polipéptido como se describe en el presente documento pueden ser identificadas sin experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este sentido, cabe señalar que las técnicas para cribar bibliotecas de pequeñas moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de unirse a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas orgánicas pequeñas pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas , carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido, o similares.

En algunos aspectos, el compuesto químico de molécula pequeña es un componente de una biblioteca química combinatoria. Bibliotecas químicas combinatorias son una colección de múltiples especies de compuestos químicos formados por subunidades más pequeñas o monómeros. Bibliotecas combinatorias vienen en una variedad de tamaños, que van desde unos pocos cientos a varios cientos de miles de especies diferentes de compuestos químicos. También hay una variedad de tipos de bibliotecas, incluyendo bibliotecas de oligoméricos y poliméricos que comprenden compuestos tales como carbohidratos, oligonucleótidos y moléculas orgánicas pequeñas, etc. Tales bibliotecas tienen una variedad de usos, tales como la inmovilización y la separación cromatográfica de los compuestos químicos, así como utiliza para identificar y caracterizar ligandos capaces de unirse a una molécula aceptora (tal como una proteína c-met) o mediar una actividad biológica de interés (tal como, pero no limitado a, la inhibición de la proliferación celular) .

Son conocidas en la especialidad diversas técnicas para sintetizar bibliotecas de compuestos sobre soportes de fase sólida. Soportes en fase sólida son típicamente objetos poliméricos con superficies que están funcionalizados para unirse con las subunidades o monómeros para formar los compuestos de la biblioteca. Síntesis de una biblioteca típicamente implica un gran número de soportes en fase sólida. Para hacer una biblioteca combinatoria, los soportes en fase sólida se hacen reaccionar con una o más subunidades de los compuestos y con uno o más números de reactivos en una secuencia predeterminada cuidadosamente controlada, de las reacciones químicas. En otras palabras, las subunidades de la biblioteca se "cultivan" sobre los soportes en fase sólida. Cuanto más grande es la biblioteca, mayor será el número de reacciones necesarias, lo que complica la tarea de hacer el seguimiento de la composición química de las múltiples especies de compuestos que componen la biblioteca. En algunas modalidades, las moléculas pequeñas tienen menos de aproximadamente 2000 Daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 Daltons de tamaño.

Los agentes de molécula pequeña descritos en cualquiera de los aspectos en la presente memoria pueden ser derivados de cualquier tipo de reacción química que puede llevarse a cabo sobre un soporte sólido. Tales reacciones químicas incluyen, pero no se limitan a, 2 + 2 cicloadiciones incluyendo captura de butadieno; [2 + 3] cicloadiciones incluyendo síntesis de isoxazolinas, furanos y péptidos modificados; formación de acétales incluyendo inmovilización de dioles, aldehidos y cetonas; la condensación de aldol incluyendo derivatización de aldehidos, síntesis de propanodioles,- la condensación de benzoína incluyendo derivatización de aldehidos; ciclocondensaciones incluyendo benzodiazepinas y hidantoínas, tiazolidinas, miméticos de giro, porfirinas, ftalocianinas ; ciclación Dieckmann incluyendo delación de diésteres; reacción de Diels-Alder incluyendo derivatización de ácido acrílico; Adición electrofílica incluyendo adición de alcoholes a alquenos; Reacción de Grignard incluyendo derivatización de aldehidos; Reacción de Heck incluyendo síntesis de alquenos disustituidos; Reacción Henry incluyendo la síntesis de óxidos de nitrilo in situ (véase 2 + 3 cicloadición) ; hidrogenación catalítica incluyendo síntesis de feromonas y péptidos (hidrogenación de alquenos) ; Reacción de Michael incluyendo síntesis de cetonas sulfañilo, biciclo [2.2.2] octanos; Reacción de Mitsunobu incluyendo síntesis de aril éteres, peptidil fosfonatos y tioéteres; sustituciones aromáticas nucleófilas incluyendo síntesis de quinolonas; oxidación incluyendo la síntesis de aldehidos y cetonas; Cicloadición Pausen-Khand incluyendo ciclación de norbornadieno con pentinol; ciclación fotoquímica incluyendo síntesis de helicenos; reacciones con compuestos organometálicos incluyendo derivatización de aldehidos y cloruros de acilo; reducción con hidruros complejos y compuestos de estaño, incluyendo la reducción de carbonilo, ácidos carboxílieos, ésteres y grupos nitro; Reacción Soai incluyendo la reducción de los grupos carboxilo,- Reacciones de Stille, incluyendo síntesis de derivados de bifenilo; Reacción de Stork incluyendo síntesis de ciclohexanonas substituidas; aminación reductora incluyendo síntesis de quinolonas; Reacción de Suzuki incluyendo síntesis de derivados del ácido fenilacético; y las reacciones de Wittig-Horner incluyendo reacciones de aldehidos, cetonas y feromonas, sulfañilo.

Las referencias que describen la síntesis de bibliotecas químicas, así como la desconvolución de los compuestos individuales de dichas bibliotecas sobre soportes en fase sólida individuales, se puede encontrar en la Solicitud de Patente de los E.U.A. No. 2009/0032592; Needels et al., (1993), Proc . Nati. Acad. Science USA 90: 10.700 a 10704; y WO 97/15390.

E. Métodos para el uso de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas para determinar los componentes de complejos de proteínas de ubiquitina-asociados En algunos aspectos, se proporcionan en este documento métodos para el uso de cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas de ubiquitina descritas en este documento para determinar componentes complejos de proteína ubiquitina-asociados en las células animales. Dada la naturaleza transitoria de las asociaciones de ubiquitina de tipo silvestre con proteínas de enlace a ubiquitina y el procesamiento de las enzimas, las proteínas de ubiquitina estabilizadas descritas anteriormente pueden ser útiles para la determinación de uno o más componentes de los complejos de proteínas de ubiquitina-asociado en las células. Como esencialmente todas las células animales expresan ubiquitina, los métodos son aplicables para su uso en todas las células animales, si los métodos se llevan a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento se puede transfectar en una célula animal. En algunas modalidades, el ácido nucleico se integra en el genoma de una célula animal bajo el control de un promotor o bien inducible o constitutiva. En algunas modalidades, el ácido nucleico está bajo el control de cualquiera de un promotor inducible o constitutivo y se transfecta transitoriamente en la célula animal. En aún otra modalidad, un animal transgénico no humano que comprende el ácido nucleico puede ser producido de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En cualquiera de las modalidades anteriores, el ácido nucleico que codifica la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada puede comprender además una etiqueta de afinidad. En algunas formas de modalidad, la afinidad puede ser, sin limitación, una etiqueta His (por ejemplo, una etiqueta que comprende al menos 6 residuos de histidina) , una etiqueta de proteína de enlace a maltosa, una etiqueta de HA, o una etiqueta de GST. En algunas modalidades, las células animales que comprenden cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento pueden ser lisadas y los complejos de proteínas de ubiquitina-asociados obtenidos a través de cualquier número de métodos conocidos en la técnica. Estos incluyen, sin limitación, inmunoprecipitación, purificación de afinidad, métodos cromatográficos, tales como, pero no limitados a, cromatografía de exclusión por tamaño. La identidad de las proteínas asociadas con cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento puede entonces determinarse mediante métodos bien conocidos tales como, pero no limitado a, electroforesis en gel 2D y espectrometría de masas.

En algunos aspectos, cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento puede ser utilizada como una herramienta genética de ganancia de función para la detección de los componentes corriente abajo de la vía de la ubiquitina de procesamiento/proteólisis . Por ejemplo, cualquiera de las proteínas descritas en este documento puede ser expresada en la levadura para buscar proteínas que interactúan con, por ejemplo, enzimas de la maquinaria de conjugación de ubiquitina, proteasas específicas de ubiquitina, y los componentes del proteosoma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Como tal, se proporciona aquí un método para utilizar una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (tal como cualquiera de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritos en este documento) para determinar los componentes de un complejo de la proteína ubiquitina-asociado . En algunas modalidades, el método comprende 1) que expresa una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada en una célula animal; 2) aislamiento de un complejo de proteína ubiquitina-asociado; y 3) determinar la identidad de una o más proteínas asociadas con la proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada en la célula animal. En algunas modalidades, la célula animal es una célula humana, una célula de primate no humano, una célula de roedor, una célula de levadura, una célula de Drosophila, o una célula de pez cebra. En algunas modalidades, la célula animal es una célula cancerosa. En algunas modalidades, el complejo de la proteína ubiquitina-asociado se aisló por inmunoprecipitación, cromatografía de etiqueta de afinidad, o algún otro método cromatográfico (tal como, pero no limitado a, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba) .

F . Métodos para la detección de una forma conformacionalmente estabilizada de una proteína La presente invención también proporciona métodos para la detección de una forma de una proteína, donde la proteína conformacionalmente estabilizada ha aumentado la afinidad a un socio de enlace o una mayor capacidad para modular la actividad de enlace del socio de enlace (tal como una actividad enzimática) en comparación con la proteína de tipo silvestre conformacionalmente estabilizada. En algunos aspectos, el método comprende poner en contacto el socio de enlace con una biblioteca de formas mutantes de la proteina, en el que la biblioteca de formas mutantes se produce mediante la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de la proteína conformacionalmente dinámica con otros residuos de aminoácidos en una o ubicaciones más preseleccionadaos, en el que dichos lugares preseleccionados se encuentran en el interior de la proteína y la identificación de la proteína conformacionalmente estabilizadas basada en una unión al socio de enlace o un aumento de la capacidad para modular (por ejemplo, para aumentar o disminuir) la actividad (tales como una actividad enzimática) del socio de enlace en comparación con la proteína de tipo silvestre. En una modalidad, la sustitución es una sustitución aleatoria. La proteína puede ser cualquier proteína que exhibe naturalmente múltiples estados conformacionales . En algunas modalidades, múltiples estados conformacionales en una proteína pueden ser evaluados mediante ensayos estructurales, tales como la cristalografía de RMN o por rayos X o ensayos funcionales tales como ensayos de unión. En algunas modalidades, una proteína conformacionalmente dinámica tiene movimiento en su estado apo. En algunas modalidades, una proteína conformacionalmente dinámica tiene movimiento según se evaluó por cristalografía de RMN o de rayos X. Las proteínas que exhiben múltiples estados conformacionales pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas, enzimas ubiquitina (por ejemplo, proteasas del VIH o Ras) , receptores nucleares de hormonas (por ejemplo receptores, el receptor de estrógeno o el receptor de andrógenos) , o acoplado a proteína G ( GPCRs) . En algunas modalidades, las sustituciones resultan en la formación de uno o más enlaces disulfuro en la proteína. En otra modalidad, las sustituciones no resultan en la formación de uno o más enlaces disulfuro en la proteína. En algunas modalidades, las sustituciones adicionales (en lugares al azar o preseleccionados) se hacen en adición a las sustituciones en los residuos preseleccionado en el interior de la proteína.

En algunos aspectos, los residuos de aminoácidos preseleccionados en el interior de la proteína adecuada para la sustitución por otros residuos de aminoácidos pueden ser seleccionados en base a la contribución de los residuos de aminoácidos en cada lugar a la dinámica conformacional global dentro de la proteína o dentro una región de la proteína. En una modalidad, serie de estructuras cristalinas de alta resolución resueltas de la proteína conformacionalmente dinámica puede ser utilizadas para revelar uno o más preferenciales estados conformacionales que la proteína dinámica adopta ya sea en solución o cuando se une a un socio de enlace. Basándose en la posición de la proteína o región de la proteína identificada usando las estructuras cristalinas, los residuos de aminoácidos localizados en el interior de la proteína conformacionalmente dinámica pueden ser identificados mediante una búsqueda computacional . En una modalidad, la búsqueda computacional es un solo estado RosettaDesign. En otra modalidad, la búsqueda computacional es un estado de múltiples RosettaDesign.

Candidatos de proteínas conformacionalmente estabilizadas pueden evaluarse por cualquier número de métodos. Las características de las proteínas conformacionalmente estabilizadas pueden ser evaluadas por la determinación de la capacidad de las proteínas estabilizadas conformacionalmente para modular la interacción entre la proteína de tipo silvestre y un socio de enlace . Una de las características importantes es la unión de afinidad. Las características de enlace de proteínas conformacionalmente estabilizadas candidato de interés pueden estimarse en cualquiera de un número de maneras conocidas en la técnica. Otro método para evaluar a una conformacionalmente estabilizadas candidato es examinar el grado de estabilidad conformacional de su esqueleto de la proteína utilizando técnicas tales como experimentos de dispersión R2 (sensibles al movimiento en escalas de tiempo de milisegundos) y/o mediciones de HZNZ Rx Rex (sensibles al movimiento en escalas de tiempo de microsegundos) .

También se proporciona aquí un método para el cribado de una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, en el que la ubiquitina conformacionalmente estabilizada ha aumentado la afinidad de enlace a un socio de enlace o un incremento en la capacidad para modular (por ejemplo, para aumentar o disminuir) la actividad del socio de enlace en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto el socio de enlace con una biblioteca de formas mutantes de la proteína ubiquitina, en el que la biblioteca de formas mutantes se produce mediante la sustitución al azar de un residuo aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la ubiquitina de tipo silvestre con otro residuo aminoácido en uno o más lugares preseleccionados en el interior de la proteína más y la identificación de la ubiquitina conformacionalmente estabilizada basado en una unión al socio de enlace o una mayor capacidad para modular la actividad del socio de enlace en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el socio de enlace es una desubiquitinasa USP. En algunas modalidades, la ubiquitina conformacionalmente estabilizada inhibe selectivamente (por ejemplo, inhibe completamente) la actividad enzimática de la desubiquitinasa USP. En una modalidad, la desubiquitinasa es USP7. También se proporciona en el presente documento una biblioteca de proteínas de ubiquitina, en el que las proteínas de ubiquitina de la biblioteca comprenden una o más sustituciones aleatorias con otro aminoácido en las posiciones de residuos de aminoácidos situados en A7, A8, A13 , A34 , A36, A69, y A71, en el que la posición del aminoácido es relativa a la SEQ ID NO: 1.

Un paso inicial en el proceso puede incluir la generación de una o más proteínas candidato conformacionalmente estabilizadas que comprenden secuencias de interés, que se muestran a continuación, en condiciones adecuadas para determinar sus características de enlace a un socio de enlace. Por ejemplo, candidatos de proteínas conformacionalmente estabilizadas se pueden mostrar como bibliotecas de presentación de péptidos carboxilo-terminal (C-terminal) sobre la superficie de un fago o fagémido, por ejemplo, un fago filamentoso (medio) usando fusiones de proteínas con una proteína de cubierta tales como p3 o p8. Expresión en C-terminal se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Jespers et al, Biothecnology (NY) . 13: 378-82 y O 00/06717. Estos métodos pueden ser utilizados para preparar los genes de fusión, proteínas de fusión, vectores, partículas de fagos recombinantes , células huésped y bibliotecas de los mismos descritos en este documento. Como se describe aquí, en algunas modalidades, puede ser útil para visualizar candidatos de proteínas conformacionalmente estabilizadas como bibliotecas de presentación de péptidos amino-terminal (N-terminal) sobre la superficie de un fago o fagémido. Métodos de visualización N-terminal de fago (medio) incluyen los descritos en la presente memoria, y los que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los E.U.A No. 5,750,373 (y las referencias allí citadas) . Métodos de caracterizar moléculas ligantes obtenidos por estos métodos también son conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en las referencias citadas anteriormente (Jespers et ah, WO 00/06717 Y la patente de los E.U.A No. 5,750,373) y como se describe aquí. 1. Aislamiento de fago de enlace Una biblioteca de expresión en fagos con el candidato de proteínas conformacionalmente estabilizadas de expresión se pone en contacto con un socio de enlace o fragmento de la misma in vitro para determinar los miembros de la biblioteca que se unen a un polipéptido. Cualquier método conocido por el experto en la técnica puede usarse para el ensayo de enlace a proteínas in vitro. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 o más rondas de selección de enlace (también conocido como "cribado") se pueden realizar, después de lo cual fago individuales están aislados y, opcionalmente, se analizan en un ELISA de fagos. Las afinidades de enlace de las partículas de fago de péptidos que se expresan en polipéptido inmovilizado, se pueden determinar usando un fago ELISA (Barrett et al, Anal Biochem 204: 357-64 (1992)).

En una situación en la que el candidato está siendo evaluada por la capacidad de competir con una conformación conocida estabiliza la proteína de enlace a polipéptido, se proporcionan las condiciones de competencia de enlace apropiadas. Por ejemplo, en una modalidad, análisis/selección/biocribado se pueden realizar en la presencia de una o más concentraciones de la proteína conformacionalmente estabilizada conocida. En otra modalidad, las proteínas conformacionalmente estabilizadas aisladas de la biblioteca pueden ser evaluadas posteriormente en un ensayo de ELISA competitivo en presencia de la proteína conformacionalmente estabilizada conocida. 2. Preparación de las proteínas conformacionalmente estabilizadas Las proteínas conformacionalmente estabilizadas pueden producirse convenientemente como fragmentos de proteínas que contienen un dominio estabilizado o como polipéptidos de fusión, utilizando técnicas de síntesis convencional o recombinantes . Los polipéptidos de fusión son útiles en fago (medio) de visualización en el que el polipéptido es el objetivo, en estudios de expresión, localización celular, bioensayos, ensayos ELISA (incluyendo ensayos de competenca de enlace), etc. La proteína de fusión puede entonces ser purificada de acuerdo con métodos conocidos utilizando cromatografía de afinidad y un reactivo de captura que se une al segundo polipéptido. El polipéptido puede fusionarse a una secuencia de afinidad, por ejemplo, el C-terminal de las secuencias de GST (glutatión S-transferasa) . Tales proteínas de fusión facilitan la purificación del polipéptido recombinante usando, por ejemplo, glutatión unido a un soporte y/o fijación sólida a un soporte sólido (por ejemplo, una matriz para el análisis/selección/biocribado de péptido) . Fusiones ejemplares adicionales se presentan en la Tabla 7, incluyendo algunos usos comunes para este tipo de fusiones .

Las proteínas de fusión se pueden crear fácilmente usando métodos recombinantes . Un ácido nucleico que codifica el polipéptido (o porción del mismo) se puede fusionar en marco con un dominio de segundo ácido nucleico que codifica, en el extremo N, C-terminal o interno del polipéptido. En algunas modalidades, el segundo dominio se fusiona en el extremo C-terminal del polipéptido. Los genes de fusión también pueden sintetizarse por técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Amplificación por PCR usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica también es útil. Muchos vectores están comercialmente disponibles que facilitan la sub-clonación del polipéptido en marco a una proteína de fusión.

Cuadro 7 Útiles segundo polipéptidos para las proteínas de fusión Como un ejemplo de una proteína de fusión, fusión GST-polipéptido se puede preparar a partir de un gen de interés de la siguiente manera. Con el gen de longitud completa de interés como la plantilla, la PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que codifican el polipéptido usando cebadores que introducen sitios de endonucleasas de restricción convenientes para facilitar la sub-clonación. Cada fragmento amplificado se digiere con las enzimas de restricción apropiadas y se clona en un plásmido digerido de manera similar, como pGEX6P-3 o pGEX-4T-3, que contiene GST y está diseñado de tal manera que los fragmentos de sub-clonado estará en marco con el GST y operativamente unido a un promotor, dando como resultado los plásmidos que codifican GST-polipéptido .

Para producir la proteína de fusión, cultivos de E. coli que albergan los plásmidos de expresión apropiados son generalmente cultivadas hasta la fase semilogarítmica (A 60o = 1-0) en caldo LB, por ejemplo a aproximadamente 37°C, y pueden ser inducidos con IPTG. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en PBS y se lisaron por sonicación. La suspensión se centrifugó, y GST-polipéptido se purificó a partir del sobrenadante por cromatografía de afinidad en 0.5 mi de glutatión Sepharose .

Será evidente para un experto en la técnica que muchas variaciones lograrán el objetivo de aislar una proteína conformacionalmente estabilizada y puede ser utilizada en esta invención. Por ejemplo, la proteína conformacionalmente estabilizada fusionado a una etiqueta de epítopo puede ser construida como se describe arriba y las etiquetas que se utilizan para purificar por afinidad la proteína conformacionalmente estabilizadas. Proteína conformacionalmente estabilizada también se puede preparar sin ningún fusión; además, en lugar de utilizar los vectores microbianos para producir la proteína conformacionalmente estabilizada, síntesis química in vitro puede ser utilizada en su lugar. Otras células pueden ser utilizadas para producir proteína conformacionalmente estabilizada, tal como otras bacterias, células de mamífero (tales como COS) , o sistemas de baculovirus . Una amplia variedad de vectores de polinucleótidos para producir una variedad de fusiones está también disponible. La purificación final de una proteína conformacionalmente estabilizada generalmente dependerá de la pareja de fusión; por ejemplo, una fusión de etiqueta de poli-histidina puede purificarse en columnas de níquel. 3. La determinación de la secuencia de la proteina conformacionalmente estabilizada Fago (faguémido) que se unen al socio de enlace con las características deseadas (y, opcionalmente , no se une a secuencias no relacionadas) , se puede someter a análisis de secuencia. Las partículas de fago (faguémidos) que muestran la proteína conformacionalmente estabilizada candidato se amplifican en células huésped, el ADN islado, y la parte apropiadad del genoma (que codifica el péptido candidato) secuenciado utilizando cualquier técnica de secuenciado apropiada conocida. 4. Mejora adicional de la unión a través de la maduración de af nidad En algunos aspectos, la unión de una proteína conformacionalmente estabilizada a un socio de enlace se puede mejorar aún más a través de la maduración de afinidad. En la maduración de afinidad (Levin y Weiss., Mol. BioSyst 02:49, 2006), los residuos en superficie de una proteína son variados usando mutagénesis, y las proteínas mutadas resultantes se seleccionan para mejorar la unión a un socio de enlace. Varios métodos de maduración de afinidad son conocidos en la técnica. Estos incluyen la maduración de afinidad a través de fago (Gram et al PNAS 89: 3576, 1992; Lowman et al, J. Mol Biol, 1993, 234, 564), expresión en ribosomas (Lipovsek et al J. Immunol Methods 290 (2004) , pp 51-67.), expresión en superficie de levadura (Graff et al. Protein Eng. Des. Sel. 17 (2004), pp. 293-304), PCR propensa a error (Schlapschy et al. Proteing Eng. Des Sel 17 (2004), pp 847860) , las cepas bacterianas mutantes (Low et al J. Mol Biol 260: 359, 1996), mutagénesis enfocada por etapas ( u et al PNAS 95:. 6037, 1998) y mutagénesis de saturación (Nishimiya et al. J. Biol. Chem. 275: 12813, 2000; Yang et al. J. Mol. Biol. 254: 392, 1995; Chowdhury and Pastan, Nat . Biotechnol. 17: 568, 1999). Otras técnicas utilizan a menudo barrido de alanina o mutagénesis dirigida de sitio para generar colecciones limitadas de variantes específicas. 5. Ensayos de Enlace La formación de un complejo de una proteína conformacionalmente estabilizada y un socio de enlace facilita la separación de las formas no complejadas de las complejadas de los mismos y de impurezas .' Fusiones de proteínas conformacionalmente estabilizadas pueden formarse en solución o en donde uno de los socios de enlace está unido a un soporte insoluble. El complejo se puede separar de una solución, por ejemplo utilizando cromatografía en columna, y se puede separar mientras está unido a un soporte sólido por filtración, centrifugación, etc., usando técnicas bien conocidas . Enlace de la proteína conformacionalmente estabilizada por lo tanto a un soporte sólido facilita ensayos de alto rendimiento.

Los compuestos de ensayo pueden ser examinados por la capacidad de modular (por ejemplo, incremento) la interacción y/o actividad de una proteína conformacionalmente estabilizada con socio de enlace en presencia y ausencia de un compuesto de enlace candidato, y la detección se puede lograr en cualquier recipiente adecuado, tal como placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. Las proteínas de fusión también se pueden preparar para facilitar las pruebas o la separación, en donde la proteína de fusión contiene un dominio adicional que permite que una o ambas de las proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión GST-proteína conformacionalmente estabilizadas pueden adsorberse sobre perlas de glutatión sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la mezcla se incuba en condiciones que permitan la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH) . Después de la incubación, las perlas o pocilios de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente no unido, la matriz inmovilizada en el caso de perlas, y el complejo determinarse directa o indirectamente. Alternativamente, las fusiones se pueden disociar de la matriz, y el nivel de enlace o actividad se determina utilizando técnicas estándar.

Otras técnicas de polipéptido de fusión para inmovilizar proteínas sobre matrices también se pueden utilizar en ensayos de selección. Cualquiera de una proteína conformacionalmente estabilizada o un socio de enlace se pueden inmovilizar utilizando sistemas de biotina-avidina o biotina-avidina estreptavidina. La biotinilación se puede realizar usando muchos reactivos, tales como biotina-N-hidroxi-succinimida (NHS; Pierce Chemicals, Rockford, IL) , e inmovilizarse en los pocilios de placas de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical) .

Alternativamente, los anticuerpos reactivos con la proteína conformacionalmente estabilizada o el socio de enlace, pero no interfieren con la unión de un péptido de enlace a su molécula diana se puede derivatizar a los pocilios de la placa, y proteína conformacionalmente estabilizada no enlazada o socio de enlace atrapada en los pocilios mediante conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar tales fusiones, además de los descritos para las fusiones inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de fusiones usando anticuerpos reactivos con las parejas de enlace o la proteína conformacionalmente estabilizada. 6. Ensayo para enlace: ELISA Para evaluar las afinidades de enlace de una proteína conformacionalmente estabilizada, ensayos de enlace de competencia pueden ser utilizados, donde la capacidad de la proteína conformacionalmente estabilizada para unirse a un socio de enlace (y la afinidad de enlace, si se desea) se evalúa y se compara con la de un compuesto conocido de obligar a la proteína conformacionalmente estabilizada, por ejemplo, un péptido de enlace de alta afinidad determinado por expresión en fagos como se describe aquí.

Muchos métodos son conocidos y pueden ser utilizados para identificar las afinidades de enlace de proteínas conformacionalmente estabilizadas a un socio de enlace; por ejemplo, las afinidades de enlace pueden determinarse como valores de Kd usando ELISA. Por ejemplo, en ensayos de fase sólida, las placas de ensayo se pueden preparar mediante el recubrimiento de placas de micropocillos (preferiblemente tratados para adsorber eficientemente la proteína) con neutravidina, avidina o estreptavidina. Sitios de enlace no específicos se bloquearon a continuación mediante la adición de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) u otras proteínas (por ejemplo, leche descremada) y luego se lava, preferiblemente con un tampón que contiene un detergente, tal como Tween-20. Una proteína conformacionalmente estabilizada conocida biotinilada (por ejemplo, los péptidos de fagos como fusiones con GST u otra molécula para facilitar la purificación y la detección) se prepara y se une a la placa. Diluciones seriadas del socio de enlace a ensayar se preparan y en contacto con la proteína conformacionalmente estabilizada enlazada. La placa recubierta con la proteína conformacionalmente estabilizada inmovilizada se lava antes de añadir cada reacción de enlace a los pocilios y se incubaron brevemente. Después de un lavado adicional, las reacciones de enlace se detectan, a menudo con un anticuerpo que reconoce la pareja de fusión y un anticuerpo secundario etiquetado (tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina (AP) , o una etiqueta fluorescente tal como fluoresceína) que reconoce el anticuerpo primario. Las placas son luego reveladas con el sustrato apropiado (dependiendo de la etiqueta) y la señal cuantificada, como el uso de un lector de placas espectrofotométrico . La señal de absorción puede estar en forma de una curva de enlace mediante un ajuste por mínimos cuadrados. Así, la capacidad de diversos socios de enlace para unir la proteína conformacionalmente estabilizada se puede medir.

V. Ejemplos de usos La identificación y caracterización de las proteínas conformacionalmente estabilizadas (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) como se describe en este documento, proporcionan información valiosa sobre las funciones celulares de la proteína de tipo silvestre y proporcionan composiciones y métodos para modular las interacciones en vivo entre estas proteínas y su o sus socios de enlace. Por ejemplo, estas proteínas conformacionalmente estabilizadas se pueden utilizar para mejorar en las interacciones de enlace vivo y alterar la actividad (por ejemplo, una actividad enzimática) de uno o más socios de enlace. Los homólogos se pueden generar convenientemente sobre la base de su unión y/o características funcionales relativas a las proteínas conformacionalmente estabilizadas bien caracterizadas proporcionadas en este documento. Estos homólogos de proteínas conformacionalmente estabilizados pueden además ser utilizados para identificar las proteínas celulares asociadas con la de tipo silvestre proteínas conformacionalmente dinámicas y sus parejas de enlace presentes en los complejos de proteínas in vivo.

Proteínas conformacionalmente estabilizadas bien-caracterizadas, de moderada a alta afinidad (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada, como cualquiera de las descritas en el presente documento) se puede utilizar además para dilucidar importantes características estructurales del socio de enlace en sí. La invención proporciona conformacionalmente estabilizadas variantes de la proteína como se describe en este documento que han mejorado la capacidad de unirse y/o activar uno o más socios de enlace diana. Otras variantes pueden ser identificadas de manera similar.

Proteínas conformacionalmente estabilizadas desarrolladas sobre la base de métodos descritos en el presente documento pueden usarse para lograr el efecto modulador de interés. Por ejemplo, tal manipulación puede incluir la activación de la asociación entre la proteína conformacionalmente estabilizada y su socio de enlace afín (por ejemplo, en el caso de la ubiquitina, una desubiquitinasa) . En otro ejemplo, tal manipulación puede incluir modulador (por ejemplo, aumento o disminución) efectos a través de, por ejemplo, la inducción de las funciones celulares como resultado de la unión de la proteína conformacionalmente estabilizada mediante la mejora de asociación entre la proteína conformacionalmente estabilizada y su socio de enlace cognado.

Otros usos de las proteínas conformacionalmente estabilizadas (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) incluyen ensayos de diagnóstico para las enfermedades relacionadas con la forma de tipo silvestre de la proteína (por ejemplo, la forma dinámica conformacionalmente de tipo silvestre de la proteína) y sus socios de enlace, el uso de la forma de la proteína conformacionalmente estabilizada y socios de enlace en las proteínas de fusión como asas de purificación y anclajes a sustratos.

La identificación de proteínas conformacionalmente estabilizadas (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) capaces de unirse a las parejas de enlace (como una desubiquitinasa de la familia USP) a diferentes afinidades, como se describe en el presente documento, proporciona vías útiles para modular las interacciones biológicamente importantes in vivo. Por lo tanto, la identificación de proteínas conformacionalmente estabilizadas que son capaces de modular estas interacciones señala a vías de aplicaciones y estrategias terapéuticas y/o de diagnóstico que no sería posible en 'ausencia de conocimiento de tales moléculas y las interacciones .

Proteínas conformacionalmente estabilizadas (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) pueden ser suministradas en células vivas utilizando rutas apropiadas de administración conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante microinyección, antenapedia péptido o de transfeccion de lípidos reactivos con el fin de modular, y en algunas instancias validan la importancia fisiológica de la forma conformacionalmente estabilizada de la proteína y su interacción con una o más parejas de enlace en un tejido particular, célula, órgano o condición patológica. Existen ensayos adecuados para controlar la interacción de la proteína conformacionalmente estabilizada con un socio de enlace y el efecto fisiológico de la modulación de dicha interacción. Finalmente, proteínas estabilizadas pueden ser suministradas en las células vivas o modelos animales que son modelos para una enfermedad (es decir, ciertas propiedades imitan una enfermedad) para determinar si la unión o la interacción con un socio de enlace de interés, ofrece una solución consistente con las expectativas de beneficio terapéutico.

Los métodos de detección de interacciones proteína-proteína (o péptido) in vivo son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos por Michnick et al. en la patente de los E.U.A. No. 6.270.964 Bl y 6.294.330 Bl se puede utilizar para analizar las interacciones y/o actividad de proteína conformacionalmente estabilizada (incluyendo cualquier descrito en este documento) y un socio de enlace cognado (incluyendo cualquier descrito en este documento) y Proteínas conformacionalmente estabilizadas se pueden utilizar como herramientas para cualquiera de los métodos descritos anteriormente para las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas. Por ejemplo, proteínas conformacionalmente estabilizadas se pueden utilizar como herramientas 1) a la pantalla para los agentes que se unen (como se unen preferentemente) a la proteína conformacionalmente estabilizada; 2) para la detección de agentes que interrumpen una proteína/vinculante complejo proteico socio conformacionalmente estabilizado; 3) para inhibir la actividad enzimática de uno o más socios de enlace; o 4) para determinar la identidad de uno o más componentes de un complejo de proteína que se asocia con la proteína conformacionalmente estabilizada en una célula que expresa la forma de tipo silvestre de la proteína estabilizada) . Además, las proteínas conformacionalmente estabilizadas no se limitan sólo a estos usos, pero también se pueden usar como herramientas de acuerdo con cualquier otro método conocido en la técnica.

Las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento pueden usarse para inhibir la deubiquitinación de una proteína diana desubiquitinasa in vivo. Por ejemplo, una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada que es inhibidora con respecto a la actividad enzimática de una desubiquitinasa específica para una proteína diana se puede utilizar para evitar que desubiquitinación de esa proteína diana si se expresa en una célula animal. El uso de una proteína conformacionalmente estabilizada ubiquitina de esta manera podría aumentar las posibilidades de que la proteína diana podría sufrir la degradación proteolítica en el proteosoma, por ejemplo. Del mismo modo, las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento pueden ser utilizados in vivo para mejorar o mantener el estado ubiquitinado de una o una clase de proteínas diana. Por ejemplo, una de tales proteína diana es la oncoproteína Mdm2, que está implicado en el desarrollo de varios tipos de cánceres, incluyendo sarcomas de tejidos blandos y osteosarcomas, así como los tumores de mama. La desubiquitinasa USP7 desubiquitina específicamente Mdm2, que a su vez conduce a una regulación a la baja de la proteína supresora de tumores p53. Por consiguiente, el uso de una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada (tal como cualquiera de los descritos en este documento) para inhibir la actividad enzimática de USP7 indirectamente podría conducir al mantenimiento de la proteína supresora de tumores P53.

VI . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de una proteína conformacionalmente estabilizada (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) como se describe en el presente documento se preparan mediante la mezcla de tales proteínas conformacionalmente estabilizadas que tienen el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente opcional aceptables (Remington Pharmaceutical Sciences edición 16a , Osol, A. Ed. (1980) ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas . Los vehículos farmacéuticamente aceptables son generalmente tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno,- catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; (menos de aproximadamente 10 residuos) polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG) . Vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos de la presente invención incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas solubles neutro activas de hialuronidasa (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles de humanos, tales como rHuPH20 (Hylenex ¾ , Baxter Internacional, Inc.). Ciertos sHASEGP ejemplares y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de los E.U.A. Nos. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas tales como condroitinasas .

La formulación del presente documento también puede contener más de un ingrediente activo que sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Proteínas conformacionalmente estabilizadas (como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) de hidroximetilcelulosa o, respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .

Preparaciones de liberación sostenida se pueden elaborar. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína conformacionalmente estabilizada (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) , matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas .

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede conseguirse fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles VII. Usos terapéuticos de proteínas conformacionalmente estabilizadas y agentes de residuos del cribado.

VII. Usos terapéuticos de Proteínas Conformacionalmente Estabilizadas y agentes obtenidos de criba Los agentes que tienen la propiedad de aumentar o disminuir la actividad (tales como una actividad enzimática) de un socio de enlace de una proteína conformacionalmente dinámica (por ejemplo, la ubiquitina) , son útiles. Esta modulación de la actividad puede venir sobre en una variedad de maneras, por ejemplo mediante la administración a un sujeto en necesidad del mismo, de una cantidad eficaz de uno o más de las (tal como proteínas conformacionalmente estabilizadas (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) descritas en la presente o mediante la administración de cualquiera de los agentes obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de selección descritos en el presente documento.

Cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas o cualquiera de los agentes obtenidos utilizando cualquiera de los métodos de selección descritos en este documento pueden usarse en métodos terapéuticos . En un aspecto, se proporciona una proteína conformacionalmente estabilizada (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) para uso como un medicamento. En una de tales modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un ser humano. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una proteína conformacionalmente estabilizada (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) en la fabricación o preparación de un medicamento. En una de tales modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.

En otro aspecto, un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección o criba descritos en este documento para su uso como se proporciona un medicamento. En una de tales modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un ser humano. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento en la fabricación o preparación de un medicamento. En una de tales modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

En un aspecto adicional, se proporcionan en este documento formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas (tal como una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) o agentes obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los anteriores métodos terapéuticos. En una modalidad, una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas proporcionados en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de las proteínas conformacionalmente estabilizadas proporcionadas en este documento o un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Las proteínas conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento o cualquiera de los agentes obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento pueden ser utilizados solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, una proteína conformacionalmente estabilizada de la invención puede ser co-administrado con al menos un agente terapéutico adicional .

Tales terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en las mismas o separadas formulaciones) , y la administración separada, en cuyo caso, la administración de las proteínas conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento puede ocurrir antes de, simultáneamente, y/o siguiente a la administración del agente terapéutico adicional.

Proteínas conformacionalmente estabilizadas descritas en este documento (tal como una proteína conformacionalmente estabilizada ubiquitina) o cualquiera de los agentes obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional , administración tópica, o administración intraocular. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Varios programas de dosificación incluyendo, pero no limitados a las administraciones individuales o múltiples en distintos puntos de tiempo, la administración en bolo, infusión y el pulso se contemplan en el presente documento .

Proteínas conformacionalmente estabilizadas (como un proteínas ubiquitina conformacionalmente estabilizadas) y/o agentes obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de selección descritos en este documento debe ser formulado, dosificará y administrará de un modo consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos . La proteína conformacionalmente estabilizada o un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento no necesitan ser, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de la proteína conformacionalmente estabilizada presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y por cualquier vía que sea empíricamente/clínicamente determinado que es apropiado.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de una proteína conformacionalmente estabilizada o un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de selección descritos en el presente documento (cuando se utiliza solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de proteínas conformacionalmente estabilizadas (por ejemplo, una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada) o agente obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento (por ejemplo un anticuerpo o un compuesto químico molécula pequeña) , la gravedad y curso de la enfermedad, si la proteína conformacionalmente estabilizada o agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta a la proteína conformacionalmente estabilizada o agente, y la discreción del médico tratante . La proteína o agente conformacionalmente estabilizado obtenidos a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento, se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg (por ejemplo, 0.01 a aproximadamente 500 mg/kg) de proteína conformacionalmente estabilizada o agente puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Preferiblemente, el nivel de dosificación será de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg/kg por día; más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100 mg/kg por día. Un nivel de dosificación adecuado puede ser de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 250 mg/kg por día, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 mg/kg por día, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg por día. Dentro de este intervalo, la dosificación puede ser de aproximadamente cualquiera de 0.05 a 0.5, 0.5 a 5 o de 5 a 50 mg/kg por día. Para la administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos que contienen aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1000 miligramos del ingrediente activo, en particular acerca de cualquiera de 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, y 1000.0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente a tratar. Los compuestos pueden administrarse en un régimen de 1 a 4 veces por día, preferiblemente una o dos veces por día. Tales dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o, por ejemplo cerca de seis dosis de la proteína conformacionalmente estabilizada. Una dosis inicial de carga más alta, seguida por una o más dosis más bajas pueden ser administradas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se supervisa fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

VIII. Artículos de fabricación En otro, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de la enfermedad y/o los trastornos descritos anteriormente . El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, ampolletas, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la enfermedad y/o trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es una proteína conformacionalmente estabilizada (tal como una proteína conformacionalmente estabilizada de ubiquitina) o un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para tratar la enfermedad y/o trastorno de elección. Por otra parte, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una proteína conformacionalmente estabilizada descrita en el presente documento o un agente obtenido a partir de cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una enfermedad y/o trastorno particular. Alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina tamponada con fosfato, solución de dextrosa y solución de Ringer. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que otras diversas modalidades pueden ponerse en práctica, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplo 1: Ingeniería de una proteína ubiquitina conformacionalmente estabilizada Este ejemplo ilustra la nueva técnica de visualización conformacional para la identificación y la ingeniería de las proteínas conformacionalmente estabilizadas. En contraste con la expresión en fagos tradicional, que típicamente muta posiciones en superficie para encontrar nuevos contactos entálpicos, residuos de aminoácidos enterrados en pantallas de visualización conformacionales para identificar nuevos arreglos de embalaje que resultan en conformaciones óptimas para el enlace . Una molécula flexible con una minoría de con ormaciones de enlace fuerte se convierte de este modo en una molécula estabilizada que adopta principalmente una conformación de alta afinidad (Figura 1A) .

Cascadas de señalización celular convergen con frecuencia en proteínas " interactoma" , que son reconocidas por un gran número de socios de enlace. 23 La ubiquitina es un centro de señalización eucariota altamente conservado, que es después de la traducción, unido a una lisina de proteínas sustrato a través de un enlace isopeptídico con extremo carboxi terminal de la ubiquitina. Cada tipo de enlace de ubiquitina lleva una señal distinta, y el procesamiento estrechamente regulado de las cadenas de ubiquitina se utiliza para transmitir una amplia variedad de información celular. 24 En consecuencia, una regulación deficiente del procesamiento de ubiquitina ha sido implicada en varios estados de enfermedad, incluyendo la oncogénesis y la neurodegeneración. 25-26 La ubiquitina se une a sustratos canónicamente a través de una cascada enzimática de tres partes E1-E2-E3. La eliminación de la ubiquitina es catalizada por varias familias de isopeptidasas conocidas como desubiquitinasas (DUBs) . Hay aproximadamente 100 DUBs humanas, cada una con distintas especificidades de sustrato y propiedades enzimáticas, lo que implica una gran cantidad en gran parte inexplorada de la regulación de la señal . Dos familias prominentes DUB son las enzimas ubiquitina hidrolasa C-terminal (UCH) y la proteasa específica de ubiquitina (USP) . UCHS son responsables principalmente por el reciclaje de ubiquitina mediante la eliminación de pequeños restos tales como nucleófilos intracelulares y péptidos cortos a partir de su extremo carboxilo terminal. PSU actúan típicamente como moduladores de señalización, la regulación de la ubiquitina de longitud de cadena por escisión del enlace isopeptídico que conecta porciones grandes (tales como proteínas completas) a ubiquitina. 27 Recientes estudios de RMN y computacionales de apo ubiquitina, que dependen en gran medida en el análisis exhaustivo de un gran conjunto de acoplamientos dipolares residuales (RDC) , han sugerido que la plasticidad conformacional de ubiquitina puede ser fundamental para su reconocimiento por parte de algunos socios. 28 Este trabajo indicó que la región del bucle ß1-ß2 es móvil en la escala de tiempo rápida de microsegundos y que las parejas de enlace puede seleccionar distintas conformaciones que de aquel equilibrio preexistente, aunque ha habido varios informes de la competencia que las interacciones de ubiquitina no puede atribuirse únicamente a un mecanismo vinculante de selección conformacional . 29-30 A pesar de que estos estudios han puesto de relieve la importancia de la dinámica de conformación en el reconocimiento de la ubiquitina, los patrones por los que estos cambios influyen función biológica en la conformación de las interacciones de la ubiquitina- socios no han sido identificados, ni se han abordado las consecuencias de perturbar tales movimientos .

En el caso de la ubiquitina, ya que las conformaciones de la cadena principal de los padres presumiblemente representan un compromiso por varios socios de enlace con una amplia variedad de pliegues (por ejemplo -desubiquitinasas, ligasas, etc.), la selección de las secuencias que se adaptan a una sola pareja también podría identificar conformaciones de alta afinidad que no se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, este estudio busca en parte, determinar si diferentes DUBs toman ventaja de la dinámica de ubiquitina mediante el reconocimiento de subestados únicos en su conjunto conformacional . Tal distinción sería conceptualmente separar el cubo de ubiquitina de una sola entidad en un conjunto de parejas de enlace relacionadas pero conformacionalmente únicas.

Materiales y Métodos Expresión y purificación de Desubiquitinasa El ADN que codifica las construcciones desubiquitinasa se clona en un vector derivado de pET con un 6 x His-TEV N- terminal escindible y una etiqueta de Avi C-terminal y se expresa en E. coli como proteínas biotiniladas por la co-expresión con un plásmido de expresión que contiene -BirA. Biotinilación se confirmó por espectrometría de masas. Construcciones de dominio catalítico biotiniladas fueron residuos USP7 208-554, residuos USP14 91-494, y residuos UCHL5 1-228. UCHL1 y UCHL3 fueron purificados como proteínas de longitud completa. Mutaciones sitio catalítico fueron USP7 C223A, C114A USP14, UCHL1 C90A, C95A UCHL3 y UCHL5 C88A. Después de la expresión, las proteínas se purifican hasta homogeneidad mediante paso sobre una columna de Ni-NTA, la escisión de la etiqueta His con la proteasa TEV, pasó de nuevo sobre la columna de níquel, y purificación en una columna de filtración en gel S-200 o S-75 (GE Life Sciences) . Para los ensayos enzimáticos, dominios catalíticos no biotinilados USP2 , USP5, USP10, USP47, y USP7 se obtuvieron de Boston Biochem.

Expresión y purificación de variante de ubiquitina El ADN que codifica las variantes de ubiquitina se clona en un vector derivado de pET con un N- terminal de 6 x His y se expresa en E. coli. como se describió anteriormente. 45 Las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA seguido de cromatografía de exclusión de tamaño S75.

Expresión de ubiquitina en fago M13 La ubiquitina se muestra en la superficie del bacteriófago M13 mediante la modificación de un pS2202b fagémido descrito anteriormente. Se utilizaron técnicas estándar de biología molecular para reemplazar el fragmento de codificación pS2202b dominio Erbin PDZ con un fragmento de ADN que codifica para la ubiquitina. El fagémido resultante p8Ub contenía un marco de lectura abierto que codificada para la señal de secreción de la proteína de enlace a maltosa, seguido por etiqueta gD y ubiquitina y terminando con la proteína de cubierta principal p8. E. coli que albergan p8Ub estaban coinfectados con M13-K07 fago auxiliar y se amplificaron siguiendo el protocolo estándar. El fago propagada se purificó según el protocolo estándar y se resuspendió en 1 mi de tampón PBT (PBS, 0.5% de BSA y 0.1% de Tween 20) , resultando en la producción de partículas de fago que encapsulan ADN p8Ub y expresan ubiquitina. El nivel de visualización se analizó utilizando un ELISA de fagos de la siguiente manera: 2 g/ml de anticuerpo anti-gD se inmovilizaron sobre la inmunoplaca Maxisorp y bloquearon, dilución en serie 1: 3 de fago que expresa gD-ubiquitina se se aplicaron a los pocilios. La placa se lavó y los fagos unidos se detectaron por anti-M13-HRP seguido de sustrato de TMB.

Construcción y Clasificación de Biblioteca Bibliotecas de ubiquitina se construyeron utilizando el método de mutagénesis de Kunkel. Los residuos T7, L8, 113, E34, 136, L69 y L71 fueron aleatorizados con el codón NNK. Una plantilla de parada (solo filamento de ADN de p8Ub que contiene tres codones de parada en las regiones T7-113, E34-I36 y L69-L71) se utilizó para construir una biblioteca que contenía ~5 x 1010 miembros únicos. La biblioteca se cicla a través de rondas de selección de enlace en solución contra el dominio catalítico monobiotinilado C-terminal de USP7 (residuos 208-554) con una mutación C223A (designada como USP7catC223A) . Para la primera ronda, 20 g de USP7catC223A biotinilado se incubó con 1 mi de biblioteca de fagos (~1 x 1013 pfu/ml) a 4°C durante 2 h y capturado durante 15 min a temperatura ambiente por 200 µ? de Dynabeads® yOne estreptavidina que se ha bloqueado previamente con tampón de bloqueo (PBS, 1% BSA) . El sobrenadante se desechó y las perlas se lavaron tres veces con PBS, 001% Tween 20. El fago unido se eluyó con 400 µ? HC1 0,1 durante 7 min e inmediatamente se neutralizó con 60 µ? de 1 M Tris, pH 13. El fago eluido se amplificó como se describe por Tonikian et al. 20072 Para la segunda ronda, el protocolo fue el mismo que una ronda excepto que se utilizaron 10 mg biotina USP7catC223A y 100 µ? de Dynabeads. Para tres vueltas y las vueltas cinco, 2 mg de biotina USP7catC223A se incuban con el fago amplificado a partir de la ronda anterior y el fago complejo USP7catC223A fue capturado por placas recubiertas con Neutravidina tratados previamente con tampón de bloqueo. La cuarta ronda fue idéntica a la tercera ronda, excepto por el uso de placas recubiertas con estreptavidina para capturar complejo biotina USP7catC223A-fago . Los fagos se propan en E. coli ???-azul con M13-K07 fago auxiliar a 30 °C siguiendo el protocolo estándar.46 Resultados Dado que todas las DUBs se unen a la región ß1/ß2 de ubiquitina, pero son separables en varias familias estructurales, se planteó la hipótesis de que algunos tipos de DUBs pueden reconocer distintos estados conformacionales de ubiquitina. Para abordar este tema, alineamientos por pares de las 56 estructuras cristalinas de alta resolución disponibles de ubiquitina en el complejo se llevaron a cabo con al menos un socio y los resultados agrupados con base en la desviación media cuadrática (RMSD) de ß1/ß2. El análisis de conglomerados separa el "residuo" aparente de conformaciones de bucle ß1-ß2 (Figura 2A) en familias conformacionales , con sutiles diferencias intrafamillares (Figura 2B) . Estas "instantáneas" atómicas implican que el bucle ß1-ß2 de ubiquitina que tiene acceso a una serie de subestados, con barreras de energía modestas entre cada subestado, de conformidad con las transiciones rápidas entre subestados. 28 El mayor grupo (Grupo 1) representa una conformación "arriba" de la región- ß? ß2 y contiene todas las estructuras de ubiquitina en el complejo con DUBs tipo UCH, lo que indica que UCHS unen la conformación "arriba" (Figura 2C-D) . Por el contrario, el Grupo 2 representa una conformación ß1-ß2 "abajo" y contiene todos los complejos-DUB ubiquitina de tipo USP cristalizado hasta la fecha. Notablemente, DUBs tipo UCH se enlazan típicamente a ubiquitina con afinidades nanomolares y el estado UCH vinculante también grupos con apo ubiquitina, lo que sugiere que el estado "arriba" puede predominar en solución. Por el contrario, DUBs de tipo USP normalmente tienen afinidades elevadas micromolares para ubiquitina y el estado USP vinculante a la vez no es observado en estructuras cristalinas de apo ubiquitina y sólo detectable por RMN medibles sensibles al movimiento en las escalas de tiempo de nanosegundos a microsegundos . 28 Por lo tanto, el estado "abajo" puede ser sólo débilmente poblado en solución. Comparación de las conformaciones "abajo" a "arriba" revela claramente diferenciado embalaje de cada estado, con efectos de largo alcance de transmisión de ß1-ß2 a C-terminal de una manera que también pueden influir en la unión a las DUBs. Por ejemplo, los proyectos de conformación "abajo" Leu8 a Leu71, empujando el extremo C-terminal como un brazo de palanca hacia una conformación que lo posiciona para interactuar con el sitio activo de DUBs de tipo USP (Figura 2E) . Soporte computacional también indica la unión de un DUB ya sea al "arriba" o "abajo" confórmero ubiquitina es mutuamente excluyente: las enzimas de familia-UCH están dispuestas a unirse al estado "arriba" , mientras que las familias de desubiquitinasas USP se enlazan el estado "abajo" (Figura 30B) .

Para estabilizar la ubiquitina en una conformación deseada, ubiquitina humana de larga duración fue exhibida en las proteínas principal (p8) o menor (p3) de revestimiento de fago M13 con una etiqueta gD fusionada a su extremo N-terminal . Los niveles de visualización en ambas proteínas de la cubierta son similares, como se indica por la detección de la etiqueta gD en la superficie del fago (datos no presentados) . Ya que núcleos de proteínas son extensos y cooperantes, Exhibición conformacional efectiva asume un conocimiento de las posiciones que contribuyen a movimiento dentro de la región de interés. Por lo tanto, se utilizó el diseño computacional de proteínas para identificar posiciones de aminoácidos enterrados dentro de la ubiquitina que aparecen no óptimas para adoptar un estado de enlace USP-y ponerse en contacto con superficies variables entre los distintos proveedores del servicio universal (Figura 3) . Las siete posiciones resultantes (Thr7, Leu8, Ilel3, Glu34, Ile36, Leu69, Leu71) y se asignaron al azar en p8 o bibliotecas de expresión de ubiquitina P3 y se selecciona contra un mutante catalíticamente inactivo del dominio catalítico de USP7.

Un total de 69 secuencias únicas fueron identificadas a partir de la biblioteca de la ubiquitina p8-mostrada. Aproximadamente el 90% de estos clones contiene cisteína en las posiciones tanto 7 como 69, con algunos Cys8 sustituyendo Cys7 (Figura IB) . Ya que las posiciones 7/8 y 69 están yuxtapuestas en la estructura terciaria de la ubiquitina, esto sugiere inmediatamente la presencia de un disulfuro que estabiliza una conformación de enlace-USP7. Sólo 7 clones únicos carecían de motivo dicisteína, y están ahora en adelante designados como aglutinantes "sin disulfuro" (Figura IB) . Ambos aglutinantes disulfuro y sin disulfuro presentan varios cambios de secuencia significativa en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre. Un residuo básico (Arg principalmente con algunas Lys) está altamente conservada en la posición 71 en todos los clones; la posición 34 se cambió exclusivamente a los residuos hidrófobos (He, Leu o Val) de tipo silvestre en Glu; y la posición 36 fue principalmente aromáticos (Tyr y Phe) en clones con enlaces disulfuro. Para carpetas que contienen disulfuro, posición 13 prefiere residuos polares (Arg, His, Ser, Lys y Asn) , mientras que los clones no disulfuro prefieren una tirosina.

Para probar la especificidad de los aglutinantes seleccionados conformacionales-USP7 , designados como "U7UbXX" (donde XX es el número de clon) , 24 clones de fagos se ensayaron frente a un panel de DUBs en lugar ELISA de fagos. Como se muestra en la Figura 1C, todos estos clones se unen específicamente a USP7 sin señal de enlace detectable a USP14, UCHL1, UCHL3 y UCHL5.

Table 8. Constantes de disociación en equilibrio (nM) de variantes U7Ub for desubiquitinasas .

Dominio catalítico, mutante sitio activo; ND = no detectable Para cuantificar la unión de las variantes U7Ub como proteínas purificadas, ocho clones se transfirieron a un vector de expresión pET terminal-N marcado His. Después de la expresión y purificación hasta homogeneidad, afinidades relativas a través de la interferometría de biocapa se determinaron por medición de la respuesta de estado estacionario a una sola concentración de la variante de ubiquitina (Figura 4A) . titulaciones de interferometría biocapa de seguimiento reveló que dos de los aglutinantes más cerrados, U7Ub7 (disulfuro) y U7Ub25 (sin-disulfuro) , tienen afinidades por el núcleo catalítico de USP7 de menos de 200 nm (Tablas 8 y 9; Figura 4B) . Calorimetría de titulación isotérmica confirmó que U7Ub25 se une fuertemente al núcleo catalítico de USP7 en un complejo 1: 1 (Figura 1C) y con una afinidad de aproximadamente 190 n . Cabe destacar que la asociación de la ubiquitina de tipo silvestre con USP7 es casi indetectable en concentraciones de hasta 200 µ? (datos no presentados10) , revelando que estas variantes de ubiquitina inicialmente seleccionadas tienen mejoras de afinidad de más de 1,000 veces .

Tabla 9. Constantes de disociación de variantes de ubiquitina para USP7catC223A, obtenidas de estado estable y ajuste cinético de los datos de interferometría capa biológica.

Este ejemplo valida la nueva técnica de Expresión Conformacional e identifica conformacionalmente estabilizadas variantes de la protexna ubiquitina conformacional heteróloga que no se encuentra de otra forma en la naturaleza. Además, esta novedosa protexna ubiquitina estabilizada se enlaza a la desubiquitinasa USP7 con mil veces mayor afinidad en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre.

Ejemplo 2: Maduración de superficie de las proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas Ya que la biblioteca de diseño conformacional no se centra en los residuos en la superficie de la ubiquitina de tipo silvestre, se razonó que el hacerlo podría mejorar aún más la afinidad por USP7. Por tanto, este ejemplo demuestra que la maduración de superficie se puede utilizar para mejorar aún más en enlace de una proteína conformacionalmente estabilizada a un sustrato.

Materiales y métodos Maduración de afinidad de U7Ub25 La biblioteca de maduración de afinidad se construyó usando el método de mutagénesis de Kunkel. Residuos de superficie Q2, F4 , T14 , Q40, R42, A46, G47, Q49, Q62, E64, S65, T66, H68, V70 y R72 fueron "de aleatorización suave" con un codón de adulterado en donde cada posición de base era una mezcla de 70 % de base de tipo silvestre y el 10% de las otras tres bases resultaría en -50% de tasa de mutación a nivel de aminoácidos. Una plantilla de parada (solo filamento de ADN de p8U7Ub25 que contienen tres codones de parada en las regiones de 7- 13, 34-36 y 69-71) se utilizó para construir una biblioteca que contenía ~4 x 1010 miembros únicos. La biblioteca fue ciclada contra USP7catC223A durante 5 rondas como se describió anteriormente, excepto para las rondas 3-5, se empleó menor concentración de USP7catC223A, que es de 10, 5 y 2 nM, respectivamente.

ELISA de puntos fago Después de cinco rondas de selección de enlace, clones de fagos individuales se seleccionaron y se inocularon en 450µ1 de medios 2YT que contienen 50 g/ml de carbenicilina y fago auxiliar M13-K07 en bloques de 96 pozos, que fueron cultivadas a 37 °C durante la noche. Se analizó el sobrenadante con el ELISA de puntos fago como sigue: USP7catC223A biotinilado, USP14 dominio catalítico (C114A) , dominios catalíticos UCHLl, UCHL3, o UCHL5 fueron capturados a recubierta con Neutravidina 384 así inmunoplacas axisorp y fago sobrenadante diluido (1: 3) con tampón PBT se añaden a los pocilios. Las placas se lavaron y el fago unido se detectó con anti-M13-HPvP seguido de sustrato de TMB. En estos ensayos, la unión a NeutrAvidin fago solo se probó en paralelo para evaluar la unión de fondo. Los clones cuyas señales de enlace para USP7catC223A eran más de 5 veces mayor que Neutravidina (fondo) fueron considerados positivos. Los clones positivos se sometieron a análisis de secuencia de ADN.

Calorimetría de titulación isotérmica U7U 25 y USP7catC223A se dializaron durante la noche en 50 mM HEPES pH 7.5 y NaCl 150 mM y se titularon en un MicroCal ITC200. La concentración de U7U 25 en la celda era 200 µ? y la concentración de USP7catC223A en la jeringa era 20 µ?. Los experimentos se realizaron con una inyección inicial 0.2 µ?, desechado durante el análisis de datos, seguido de veinte inyecciones de 2 uL espaciadas 250 s. La celda se agitó a 1000 rpm a 25°C. Las curvas de enlace se ajustaron a un modelo de enlace de un solo sitio en Microcal Origin.

Ensayo de enlace por ELISA USP7catC223A biotinilado se capturó en Placa Maxisorp® recubierta Neutravidina que fue bloqueada previamente por tampón de bloqueo y se incubó con 1: 3 dilución en serie de variantes His-ubiquitina en el rango de concentración de 0-20 µ? durante 1 hora a 4°C en tampón de PBT. La placa se lava con tampón PT y las proteínas marcadas His enlazadas se detectaron por conjugado anti-PentaHis-HRP (Qiagen, Cat . No. 34460, Germantown, MD) , seguido de sustrato TMB.

Medición de afinidad por interferometría de biocapa Las afinidades de enlace de variantes de ubiquitina para USP7catC223A se midieron mediante interferometría de biocapa en un OctetRed 384 (Fortebio, Menlo Park, CA) . Biosensores estreptavidina (Fortebio, Cat. No. 18-5020) se cargaron con USP7catC223A biotinilado en tampón PBS que contenía 0.05% de Tween 20 y 0.1% de BSA, se lavó en el mismo tampón y se transfirieron a pocilios que contienen variantes de ubiquitina en concentraciones que van 0-2 µ? en el mismo tampón. La constante de disociación se obtuvo por ajuste no lineal de las respuestas a un algoritmo de estado estacionario utilizando el programa Octet . Afinidades similares se obtuvieron por ajuste de cinética.

Resultados La afinidad más alta variante sin disulfuro, U7Ub25, que puede lograr alta afinidad y especificidad a través de reenvasado núcleo alrededor de ß1-ß2 se eligió para la maduración de superficie. Una biblioteca de maduración de la afinidad fue diseñada por aleatorizar residuos en la superficie de U7Ub25 prevé que participen en la interacción de USP7 con ubiquitina (Figura 5A) , basado en la estructura cristalina de la ubiquitina de tipo silvestre en complejo con USP7 (código PDB 1NBF15) .

Para aislar aglutinantes mejorados, se seleccionó la biblioteca contra concentraciones decrecientes de USP7. Después de 4 rondas de cribado 6 clones únicos que enlazan fuertemente USP7 fueron identificados (Figura 5A) .Todos los clones de afinidad madurada únicas se expresaron y se purificó como proteína marcada con His y sus afinidades relativas fueron calificados por EC50, medido por ELISA. Como se muestra en la Figura 5B, U7Ub25.2540 es" el más apretado -binder USP7 y contiene tres mutaciones relativas a U7Ub25: Gln42Trp, Gln49Arg, y His68Arg (Figura 5A) . La afinidad de U7Ub25.2540 para el núcleo catalítico de USP7 , medida por interferometría de biocapa, es de aproximadamente 30 nM, lo que representa una mejora de varias veces con respecto a la matriz U7Ub25 (Figura 5C; Tablas 8 y 9) .

Este ejemplo ilustra que se puede lograr aún más la afinidad de enlace de sustrato para variantes de proteínas conformacionalmente estabilizadas a través de la maduración de superficie de residuos de aminoácidos que interactúan directamente con los residuos en la superficie de la proteína sustrato .

Ejemplo 3: Estructuras de cristal de proteínas de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas En este ejemplo, las estructuras de cristal de ambas U7Ub7 (disulfuro) y U7Ub25.2540 (sin disulfuro, madurada de afinidad) se resuelven para entender cómo las mutaciones dentro de las clases disulfuro y sin disulfuro de variantes de enlace USP7 afectan la estructura de estas moléculas .

Materiales y Métodos Cristalización y recolección de datos Pastas celulares se resuspendieron en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 150 mM; agente reductor (TCEP 0.,5 mM) se añadió a lo largo de la purificación de U7Ub25.2540. Las células se purificaron en una columna de afinidad de Ni-quelante y las etiquetas fueron eliminadas mediante una TEV proteasa 6xHis etiquetada durante la noche. Entonces la mezcla escindida se purificó adicionalmente sobre una segunda columna de afinidad de Ni-quelante y finalmente se purificó en una columna de 75 (GE Healthcare) de exclusión por tamaño Superdex™ en 25 mM Tris pH 8.0, NaCl 150 mM.

Cristales con calidad de difracción U7Ub7 U7Ub25.2540 se cultivaron a 18 °C utilizando el método de difusión de vapor de gota suspendida o colocada en pedestal mediante la mezcla de 1 µ? de proteína a 10 mg/ml en tampón de purificación y 1 µ? de solución de cristalización que contiene AmS04 2.4 M y ácido cítrico 0.1 M pH 4.0. Los cristales crecieron después de 3 días y se transfirieron a una solución crioprotectora que contiene AmS04 3.2 M y ácido cítrico 0.1 M de pH 4.0. Los cristales difractan a 1.4Á, y pertenecen a spacegroup P3i2 con 4 moléculas en la unidad asimétrica. Una única cadena de ubiquitina (AP-ID 1UBQ) se utilizó como un modelo de búsqueda para el reemplazo molecular.

Espectroscopia de RMN Se prepararon muestras para espectroscopia de RMN con el etiquetado realizado de acuerdo con el método de Cai et al., 47 con la modificación de que las células se centrifugaron y se transfirieron a medio M9 que contienen U-2 H, 13 C-D-glucosa y 2/3 2H20. Aproximadamente el 50% de deuteración es requerido para la implementación del experimento µ8 Rex. 48 Muestras de RMN contenían 10% de H20 y trimetilsililpropionato 0.1 mM. Incorporación de deuterio determinó aprox. 50% por espectrometría de masas.

Las asignaciones de resonancia de ubiquitina tipo silvestre, U7Ub7 y U7Ub25 se obtuvieron de análisis semiautomático de posiciones de los picos en espectros 1H-15N HSQC, HNCA, HNCACB y HNcoCA usando PINE . 49 Los desplazamientos químicos se refieren al trimetilsililpropionato. Asignaciones casi completas del esqueleto se obtuvieron para ubiquitina de tipo silvestre y las U7Ubs. Las resonancias amida de E24 y G53 son no observadas en todas las proteínas. Todos los conjuntos de datos de RMN se recogen en 18.8T en un espectrómetro Bruker DRX o a 14 TI en un espectrómetro Bruker Avance III . A menos que se indique lo contrario, los experimentos de RMN se realizaron a 24 °C, calibrados para metanol deuterado.50 Los valores NOE heteronucleares {1H}- 15N para ubiquitina de tipo silvestre y 7.7 se determinaron de acuerdo con el método de Grzesiek y Bax.51 El retraso en reciclaje en todos los experimentos y el tiempo de irradiación ? se establece en 5s y ls, respectivamente, valores R ex en microsegundos fueron extraídos de mediciones Hz'NZí Hz'Nz', y HzNzRip donde la prima indica la presencia de un campo de bloqueo de espín durante el retraso de relajación. 48,52 Los campos de bloqueo de giro empleados fueron de 10 kHz y 2 kHz en las frecuencias 1H y 15N, respectivamente. Los tiempos de retardo fueron entre 2 ms y 32 ms para todos los experimentos con espín irradiación de bloqueo de espín y 4 y 128 ms para HzNZí registrado en ausencia de irradiación. Cada uno de estos experimentos se registró como un pseudo-3D con 64 puntos 15N complejos en cada plano y nueve tiempos de retraso de relajación registrados de forma intercalada para aliviar los artefactos potenciales debido a calentamiento de la muestra diferencial. Curvas de evolución se ajustaron utilizando NMRPipe53 y análisis de datos se llevó a cabo de acuerdo con Hansen et al.52 Conjuntos de datos de dispersión R2 se recogieron de acuerdo con la metodología de Tollinger et al.54 con R 2obs determinada a partir de 2 puntos de ajuste con el fin de probar más plenamente la curva de dispersión.55 Conjuntos de datos fueron recolectados como pseudo-3Ds intercalados con 64 puntos 15N complejos en cada plano y aprox. 15 frecuencias CP G. Frecuencias CPMG muestreadas tenían entre 50 y 950 Hz con dos frecuencias repetidas para el análisis de errores. Curvas de dispersión R2 fueron recogidas por 7.25 a los 14. IT y 6°C.

Resultados Como se sospechaba de la fuerte preferencia hacia cisternas en las posiciones 7 y 69, La estructura de 1.8Á de U7Ub7 revela que estos residuos forman un enlace disulfuro en la base del bucle ß1-ß2 (Figuras 6A-7C, Tabla 10) . La orientación de este disulfuro gira ß1-ß2 hacia abajo con relación a la conformación de tipo silvestre apo de una manera similar a la observada para la ubiquitina de tipo silvestre unida a USP7 (Figura 8A) . Ile36Tyr también contribuye a este giro por enlaces de hidrógeno a la cadena principal de Arg71 y formando interacción de apilamiento con Leu73 (Figura 8B) . La pila Tyr36-Leu73 empuja el C-terminal de U7Ub7 de modo que está orientado ortogonalmente a la de la ubiquitina de tipo silvestre y formas de cadena principal enlaces de hidrógeno con el bucle ß1-ß2 (Figura 8A) . Sin embargo, las mediciones de RM heteronuclear NOE que prueban la dinámica de escala de tiempo rápidas indican el C-terminal de U7Ub7 es ligeramente menos móvil que ubiquitina de tipo silvestre, pero no completamente restringida (Figura 9) . Por lo tanto, la ubicación inusual de U7Ub71 s C-terminales no puede desempeñar un papel decisivo en su alta afinidad por USP7.

Tabla 10 Estadísticas de recolección y refinamiento de datos para cristales U7U 7 y U7Ub25.2540.

En contraste con U7Ub7, la estructura de resolución de 1.3 Á de U7Ub25.2540 indica que su columna vertebral es casi idéntica a apo ubiquitina de tipo silvestre (Figuras 8C y 10) . Los residuos del núcleo mutado (Thr7Phe, LeuSArg, Ilel3Tyr, Glu34Leu, Leu69Gly y Leu71Arg) están más apretadas, pero de una manera distinta de tipo silvestre (Figura 7A, C) . Las mutaciones introducidas por la maduración de afinidad (Arg42Trp, Gln49Arg y His68Arg) todas se agrupan en la hoja de contacto-USP7 de la variante y forman una superficie de interacción continua. Puesto que la estructura troncal de U7Ub25.2540 es tan similar a la de la ubiquitina de tipo silvestre, se utilizaron las mediciones de dispersión de relajación para determinar si dinámicas apo del estado habían sido perturbadas, pero no encontraron diferencias significativas en comparación con ubiquitina de tipo silvestre (Figura 11) .

Este ejemplo demuestra que, mientras que las proteínas de ubiquitina U7Ub25 y U7Ub25.2540 conformacionalmente estabilizadas han aumentado significativamente afinidad por USP7 y marcadamente diferente embalaje alrededor del elemento- ? ß2, su columna vertebral están mínimamente afectada frente en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre.

Ejemplo 4: Mutaciones núcleo y de superficie en U7Ub25 cooperan para afinidad hacia USP7 Este ejemplo evalúa si el embalaje alternativo alrededor ß1-ß2 observado para los clones de ubiquitina no-disulfuro conformacionalmente estabilizadas determina afinidad.

.Resultados El enlace de imitantes de reversión y de adición en el contexto de U7Ub25 y ubiquitina de tipo silvestre se midió inicialmente (Figura 10) . Puesto que las variantes U7Ub contienen concertada cambios enterrados dentro de una región local de la estructura terciaria, se esperaría que solo reversión a producir enfrentamientos y producir proteínas mal plegadas. Una excepción es la mutación Leu71Arg, que es compartida entre casi todas las U7Ub2 (Figura IB) , y que es-disolvente expuesta y relativamente independiente de nuevo embalaje alrededor de ß1-ß2 (Figuras 7B-7C) . Por lo tanto, se suma o se resta como una unidad mutacional, así como el cambio de posición 71 a la Arg Leu seleccionada o el núcleo de tipo silvestre no nativo enterrado. La importancia de los residuos de superficie de afinidad de maduración que se encuentran en U7Ub25.2540 también fue investigada. En las siguientes descripciones, el nombre clon indica la identidad de las mutaciones fundamentales, cambios en la superficie si alguno se indican después de un punto, y la identidad del residuo en la posición 71 está precedida por un guión bajo. Por ejemplo, Ubwt .2540_L71 indica un mutante con un núcleo de ubiquitina de tipo silvestre, las mutaciones de superficie madurada de afinidad que se encuentran en U7Ub25.2540, y una leucina (identidad de tipo silvestre) en la posición 71.

En el contexto del núcleo recién empaquetado, Arg71 es crítico para la unión a USP7 (Figura 10, U7Ub25_R71 vs U7Ub25_L71) . Sin embargo, la mutación Arg71 por su cuenta, junto con núcleo de tipo silvestre de ubiquitinas, es insuficiente para el enlace estrecho (Ubwt_L71 vs Ubwt_R71) . Por lo tanto, parece que el embalaje engendrado por mutaciones enterrados alrededor de ß1-ß2 es crítico para la colocación apropiada de Arg71. Del mismo modo, las múltiples mutaciones a través de la superficie madurada por afinidad no imparten alguna afinidad en el contexto del núcleo de tipo silvestre (Figura 10, Ubwt_L71 vs Ubwt .2540_L71) , pero estos cambios son más eficaces en la presencia tanto del núcleo que acompaña reacondicionamiento y Arg71 (Figura 10, Ubwt .2540 L71 vs U7Ub25.2540_Pv71) . En particular, un mutante que lleva todas las mutaciones excepto para el núcleo de reacondicionamiento está fuertemente comprometida en su unión a USP7 (Figura 10, Ubwt .2540_R71 vs U7Ub25.2540_R71) .

En resumen, este ejemplo muestra que las mutaciones enterradas y superficiales que se encuentran en U7Ub25 y U7Ub25.2540 inextricablemente cooperan para producir su aumento potente de afinidad por USP7.

Ejemplo 5: variantes U7Ub de ubiquitina conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad catalítica USP7 Este ejemplo determina si el enlace de U7Ub25 y U7Ub25.2540 a USP7 es inhibidor con respecto a la actividad enzimática proteolítica de desubiquitinasa de USP7.

Materiales y Métodos Las variantes de ubiquitina en un rango de concentración de 0-20 µ? se mezclaron con ubiquitina-AMC 250 nM (Boston Biochem, Boston, MA, Cat. No. U-550) . Un panel de DUBs a los 2, 5, 3 y 5 nM para USP7, USP47, USP2 y USP5, respectivamente, en tampón PBS que contenía 0.05% de Tween 20, 0.1% de BSA y 1 mM de DTT durante 30 minutos, se añadieron a las variantes de ubiquitina-AMC/ubiquitina de la mezcla y la velocidad inicial se midió inmediatamente mediante el control de la fluorescencia excitada a 340 nm y emisión a 465 nm usando SpectraMax®M5e (Molecular Device, Sunnyvale, CA) . Las tasas iniciales se calcularon con base en las pendientes de aumentar la señal de fluorescencia. La actividad enziraática se midió también como intensidad de fluorescencia punto final para USP10 y de longitud completa USP7, en donde el aumento de la concentración de variantes de ubiquitina se incubaron con 20 nM o 1.7 nM USP10 USP7 y 2 µ? ubiquitina-AMC durante 1 hora, a continuación, se midieron la intensidad de fluorescencia . En ambos casos, la velocidad se normaliza a porcentaje de la velocidad máxima (cuando la concentración de inhibidor es cero) y los datos se procesan utilizando KaleidaGraph por ajuste de la ecuación siguiente: en la que v es el porcentaje de velocidad máxima; I es la concentración de inhibidor (variantes de ubiquitina) ; v0 y Vmax son porcentaje mínimo y máximo de la tasa, respectivamente .

Resultados La capacidad de las variantes U7Ub25 y U7Ub25.2540 para competir por la ubiquitina de tipo silvestre en un ensayo de cinética se evaluó. Como se muestra en la Figura 12A, y U7Ub25 U7Ub25.2540 inhibir la actividad de USP7 de longitud completa con similares IC 501 s (250 nM y 160 nM, respectivamente) , lo que representa una mejora mayor que 1000 veces en relación a la capacidad de la ubiquitina de tipo silvestre para inhibir USP7 (Tabla 11) . Esto es consistente con los valores de Kd medidos por interferometría capa biológica y el CCI (Figuras ID, 5C, y en la Tabla 9) .

Tabla 11. IC 50 (nM) de variantes U7Ub contra desubiquitinasas USP §Dominio catalítico; * ensayo de punto final (Métodos) ; ND = no detectable; NT = no ensayado Con el fin de probar la especificidad con la que U7Ub25 y U7Ub25.2540 inhiben enzimas de tipo USP, el IC50 de estas dos variantes de ubiquitina contra USP2 dominio catalítico, se midió USP5, USP10 y USP47 (Figuras 12B-E y 1A Tabla 11) . USP2 fue elegida como una desubiquitinasa altamente activa general, mientras que USP5 fue elegida para contener sitios con funciones dispares de enlace múltiple de ubiquitina. USP47 es la desubiquitinasa más estrechamente relacionados con USP7, y es una prueba rigurosa de especificidad. USP 10 se conoce que desubiquitina y estabiliza p53, y por lo tanto se opone directamente a la acción de USP7. Las moléculas que se dirigen a USP7 para estabilizar por lo tanto p53 debe evitar la reactividad cruzada con USP10.

Ambas U7Ub25 como U7Ub25.2540 no tienen ningún efecto sobre la actividad USP2 y USP 10 en concentraciones de hasta 20 µ? (Figuras 12B, 12C) , y son similares a ubiquitina de tipo silvestre en su inhibición de la USP47 (Figura 5D) . Sorprendentemente, tanto U7Ub25 como U7Ub25.2540 son inhibidores relativamente potentes de USP5 (IC50 = 373 nM y 251 nM, respectivamente) , en comparación con la ubiquitina de tipo silvestre (IC50 = 8.27 µ?) (Figura 12E, arriba). Sin embargo, el mecanismo inhibitorio es diferente para estas dos variantes en comparación con la de tipo silvestre. Concentraciones sub- inhibitorias de ubiquitina activan fuertemente USP5 través de la unión a su dominio de dedo de zinc (ZnF4), una actividad que se propone regular la función celular de USP5 contra las cadenas de ubiquitina lineales. 16 Notablemente, ni U7Ub25 ni U7Ub25.2540 alostéricamente activan USP5 (Figura 12E, abajo) , lo que sugiere que no se dedican al dominio ZnF4 regulatorio, y sólo se unen al dominio USP catalítico. Desde el dominio ZnF4 de USP5 involucra principalmente el C-terminal de ubiquitina, las dos últimas glicinas de U7Ub25 se eliminaron en un intento de abrogar la inhibición USP5. La variante resultante, U7Ub25AGG, conserva su potencia hacia la integral USP7, pero ya no inhibe USP5 (Figuras 12A, Fig.l2E) .

En resumen, este ejemplo demuestra que las variantes de ubiquitina tanto U7Ub25 como U7Ub25.2540 conformacionalmente estabilizadas inhiben la actividad enzimática de USP7 y USP5 mientras que no tiene efecto sobre USP2 o USP10.

Ejemplo 6: La variante de ubiquitina conformacionalmente estabilizada U7Ub25.2540 es un inhibidor potente y selectivo de USP7 en células humanas Puesto que las variantes U7Ub se basan en un andamio ubiquitina, este ejemplo examina si las variantes de ubiquitina estabilizadas interactúan con y/o interfieren con la maquinaria de enlace de ubiquitina celular, así como si las variantes son capaces de ser incorporadas en cadenas de poliubiquitina .

Materiales y Métodos Construcciones de expresión y cultivo celular de mamíferos La construcción de ubiquitina 3XHA-de tipo silvestre fue producida por la síntesis de 3XHA ubiquitina (MCLAB) y la subclonación en pcDNA3.1 (Invitrogen) . La construcción 3XHA-U7Ub25.2540 fue producida por PCR amplificando U7Ub25.2540 de solución de fago y subclonando el producto en un vector pcDNA3.1 modificado (+) (Invitrogen) que incluye un N-terminal de la etiqueta HA 3X. El vector pcDNA3.1 3XHA fue generado mediante ligación en una secuencia 3XHA que incluye la secuencia de Kozak usando sitios de restricción Nhel y HindIII como sigue: gctagcGCCGCCACCatggagTACCCATACGACGTACCAGATTACGCTTACCCATACGA CGTACCAGATTACGCTTACCCATACGACGTACCAGATTACGCTaagc11 La U7Ub25.2540 se clonó luego en el vector 3XHA pcDNA3.1 (+) sando sitios de restricción BamHI y EcoRI . Las versiones AGG (UbAGG y U7Ub25.2540AGG) se generaron mediante la mutación de Gly 75 y 76 (GGTGGT) a codones de parada (TGATGA) . Las líneas de células humanas HEK293T, U20S, y SiHa se obtuvieron de ATCC, mientras que las líneas celulares -/-de precursores y USP7 HCT116 se obtuvieron a partir de Horizon Discovery. Las células se mantuvieron siguiendo protocolos estándar y transfecciones de ADN se lograron utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen) .

Análisis de Immunotransferencia e inmunoprecipitaciones Los anticuerpos generados contra las siguientes proteínas se adquirieron de los proveedores indicados y se utilizaron para la inmunotransferencia utilizando protocolos estándar como se describe anteriormente. 56 HA-HRP (Sigma HA-7) , ubiquitina-HRP (Santa Cruz Biotech P4D1) , USP7 (Bethyl A300-034A) , USP47 (AbCam ab72143), USP14 (Bethyl A300-919A) , USP10 (AbCam ab70895) , USP5 (AbCam ab84695) , UCHLl policlonal de conejo (Invitrogen) , tubulina monoclonal murina (MP biomédica) , MDM2 (Calbiochem Ab-1) , p53 (Neomarkers Ab-8) , p21 (AbCam ab7960) , y GAPDH (Assay Designs, 1D4) . Inmunoprecipitaciones estándar se realizaron como se ha descrito previamente ( ertz et al, Nature 2004) utilizando los anticuerpos indicados o de agarosa conjugada con anticuerpo anti-HA de agarosa (Roche 3F10) o anti-myc (9E10 Covance) . Generación de los anticuerpos de ubiquitina-vinculación selectiva y los protocolos específicos optimizados para inmunoprecipitaciones usando estos anticuerpos, se han descrito 57-59 previamente.

Proteómica y espectrometría de masas Imunoprecipitados anti-HA se purificaron como se ha descrito anteriormente. Complejos de proteínas se eluyeron en tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE, y luego se digirieron con tripsina. Los péptidos se separaron por cromatografía de fase inversa seguido de análisis espectrométrico de masas en tándem en un LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher) . Los datos de MS/MS fueron buscados con Mascot60 (Matrix Science, London, UK) , utilizando una tolerancia de ión precursor de 50 ppm y la especificidad de tripsina completa contra una base de datos de destino señuelo concatenada que contiene proteínas humanas extraídas de la base de datos Uniprot y contaminantes comunes. Correspondencias espectrales de péptidos se filtraron a un 1% FDR usando el análisis discriminante lineal .

Resultados Ni U7Ub3 ni U7Ub7 se incorporan de manera eficiente en las cadenas de K48 o K63 -vinculadas en ensayos de ligación bioquímica que utilizan el UBE1 El y E2 del Cdc34 (que promueve K48 poliubiquitinación) o Uevla/UbcH13 (que promueve poliubiquitinación K63) ; agotamiento del acumulado monómero de ubiquitina apoya que las variantes acoplan parcialmente las enzimas El y/o E2 evaluadas (Figura 13) . En contraste, polimerización no detectable se consigue con U7Ub25 aunque sigue siendo posible que la inclusión de proteínas E3 en el ensayo bioquímico pueden mejorar la polimerización de las variantes U7Ub.

La interacción de las variantes U7Ub con enzimas de ubiquitinación celular fue a continuación explorada. Para este fin versiones de ubiquitina de tipo silvestre, AGG ubiquitina, U7Ub25.2540 etiquetada con epítopo HA, y U7Ub25.2540AGG se expresaron en células humanas (Figura 14A) . Similar a los ensayos bioquímicos, U7Ub25.2540 estaba mal incorporado en las cadenas de poliubiquitina, a pesar de la presencia de las ligasas de ubiquitina expresadas en el medio ambiente celular (Figuras 14A y 15) . No hay cambios en los patrones de ubiquitinación celulares detectables mediante análisis de transferencia Western, lo que indica que la expresión de las variantes U7Ub tiene un impacto mínimo en la maquinaria de enlace de ubiquitina endógena (Figura 14A) .

La selectividad de enlace DUB y la eficacia de inhibición DUB de las U7Ubs en el entorno celular fue luego exploradas. USP7 endógeno falla en asociarse con HA-ubiquitina de tipo silvestre pero no se detectan inmunoprecipitados HA-U7Ub25.2540 de una manera dependiente de dosis (Figura 16) . USP5 fue la única otra DUB detectada en inmunoprecipitados HA-U7Ub25.2540 (Figura 16) .

Ya que eliminar la diglicina C-terminal de U7Ub25 provee especificidad adicional para USP7 en análisis de inhibición enzimática, la C-terminal de la variante madura de afinidad fue removida (U7Ub25.2540AGG) . Cuando se transfecta en líneas celulares humanas este clon específicamente inmunoprecipita la USP7 endógena sin vinculación aparente a USP5 (Figura 14B) . Estos datos son confirmados por el análisis de espectrometría de masas: USP7 es enriquecido substancialmente (hasta 15 veces) en inmunoprecipitantes HA-U7Ub25.2540AGG de dos líneas celulares, mientras que la mayoría de otros DUBs son jalados hacia abajo por él HA-U7Ub25.2540AGG a un alcance igual o menor relativo a la ubiquitina de tipo silvestre de diglicina suprimida. La Figura 17) . Consistente con la vinculación USP7 endógena, la expresión de HA-U7Ub25.2540AGG también inhibe la actividad catalítica USP7 como se indica mediante ubiquitinación MDM2 mejorada (Figura 14C) y recambio (Figura 14D) . El resultado neto de inhibir actividad USP7 y disminuir los niveles de proteína MDM2 es estabilización del supresor de tumor p53 (Figura 14E) .

Por consiguiente este ejemplo muestra que los datos celulares, bioquímicos y biofísicos colectivos demuestran que la Exhibición Conformacional es una herramienta poderosa que puede ser usada para ingeniería de variantes de ubiquitina que se enlazan selectivamente y por consiguiente inhiben la acción celular del DUB USP7 oncogénico.

Ejemplo 7: Uso de Exhibición Conformacional para identificar una variante de ubiquitina enlazada-USP14 estabilizada conformacionalmente Debido a su papel clave en la regulación de señalización intracelular, los DUBs han emergido como objetivos terapéuticos nuevos y prometedores.31 Por ejemplo, una pequeña inhibición de molécula del USP14 DUB asociado a proteasoma se ha demostrado recientemente que mejora la degradación de proteínas involucradas en neurodegeneracion amilodoigenica32 y para previr progresión de tumores.33 el estudio del mecanismo DUB tipo USP y regulación es complicado por su actividad pobre relativamente: el dominio catalítico de los DUBs tipo USP típicamente tiene una eficiencia de enzima de 103 a 105 M"1s1, y afinidades de substrato micromolares altas, que necesitan el uso de "cabezas explosivas" suicidas covalentes en estudios estructurales.34 Por contraste, los DUBs tipo UCH son a menudo altamente activos, con eficiencias de enzima de hasta 108 M"1s"1 y afinidad para ubiquitina en el rango nanomolar bajo.35"36 este ejemplo investida si la exhibición conformacional puede usarse para generar una variante de ubiquitina estabilizada que se enlace firmemente a USP14.

MATERIALES Y METODOS Identificación de conformaciones ß!-ß2 "hacia arriba" y "hacia abajo" Todas las estructuras de cristal de ubiquitina enlazadas a una proteína socio determinada en una resolución mayor que 2.5 Á fueron obtenidas del PDB y separadas en modelos individuales que contienen un solo par de socios de ubiquitina cada una. Dos estructuras de ubiquitina apo (lubi y lubq) fueron también incluidas para determinar la conformación apo dominante de ß1-ß2. Después de inspección manual de cada estructura, los modelos fueron excluidos si el bucle ß1-ß2 fue claramente involucrado en empaquetado de cristal. Las estructuras remanentes 56 (Tabla 12) fueron alineadas en pares en los C ' s del núcleo globular sin ß1-ß2 (residuos 1-5 y 11-70) y el Ca R SD del bucle ß1-ß2 (residuos 6-10) fueron calculados. Estos R SDs en pares fueron organizados en una matriz y agrupados mediante el uso de MATLAB (clustergram, Bioinformatics toolbox) . La inspección visual de estructuras en cada de los dos mayores grupos revelaron que representan conformaciones "hacia arriba" y "hacia abajo" de ß1-ß2. El agrupamiento etiquetado completamente, que contiene códigos PDB para cada identificador de cadena y complejo de cada socio es disponible en la Figura 21.

Tabla 12. PDBs usados para agrupar conformaciones de bucle ß1-ß2 Los nombres están en el formato «ccódigo PDB xletra de cadena de ubiquitina>-<letra cadena de socio lcmxB-A.pdb lnbfC-B.pdb lubi .pdb lubq.pdb luzxB-A.pdb lwr6E-A.pdb lwr6F-B.pdb lwr6G-C.pdb lwr6H-D.pdb lwrdB-A.pdb lxd3B-A.pdb lxd3D-C.pdb lyd8U-H.pdb lyd8V-G.pdb 2ayoB-A.pdb 2c7mB-A.pdb 2c7nB-A.pdb 2c7nD-C.pdb 2c7nF-E .pdb 2c7nH-G.pdb 2c7nJ-I .pdb 2c7nL- .pdb 2d3gA-P.pdb 2d3gB-P.pdb 2fifA-B.pdb 2fifC-D.pdb 2fifE-F.pdb 2g45B-A.pdb 2g45E-D.pdb 2hd5B-A.pdb 2ibiB-A.pdb 2qhoA-B.pdb 2qhoC-D.pdb 2qhoE-F.pdb 2qhoG-H.pdb 2wwzB-C.pdb 2wxOA-C.pdb 2wxOB-C.pdb 2wxOE-G.pd 2wxOF-G.pdb 2znvB-A.pdb 2znvC-A.pdb 2znvE-D .pdb 3alqA-C.pdb 3alqB-C.pdb 3alqD-F.pdb 3alqE-F.pdb 3a33B-A.pdb 3a9jA-C.pdb 3a9kA-C.pdb 3a9kB-C.pdb 3by4B-A.pdb 3c0rB-A.pdb 3c0rD-C.pdb 3ifwB-A.pdb 3nheB-A.pdb Diseño computacional para determinar residuos importantes para la conformación ß!-ß2 Las posiciones que influencian la conformación de ß1-ß2 fueron identificadas que usan una estrategia de diseño computacional. Brevemente, los residuos dentro de la región ß1-ß2 y el núcleo hidrofóbico de ubiquitina se les permitió de manera computacional mutar en cualquiera de los estados hacia arriba o hacia abajo, y posiciones que adoptaron identidades preferidas diferentes comparadas con ubiquitina de tipo silvestre y el estado opuesto fueron consideradas para variación en un experimento de expresión en fago.

Las siguientes estructuras de cristal de plantilla fueron seleccionadas para diseño computacional: ubiquitina de tipo silvestre apo (lubi) , estados enlazados "hacia arriba" (lcmx, lxd3 , 3ifw) , y estados "hacia abajo" enlazados a USP (2ayo, 2hd5, 2ibi) . Ambas estrategias de diseño de un único estado y multiestado fueron empleadas, con posiciones 3, 5, 7, 8, 13, 15, 23, 26, 30, 34, 36, 43, 50, 56, 61, 67, 69, y 71 se les permitió mutar. En el protocolo de estado único, cada plantilla fue diseñada de manera independiente 10,000 veces al usar RosettaDesign (Kuhlman, et al., Science 302, 1364-1368 (2003)) y las mejores 1,000 secuencias por energía de sistema total fueron comparadas con otras plantillas (Figura 22A) . en el protocolo multiestado, cada plantilla fue diseñada al usar un algoritmo genético que se usó para optimizar una función de aptitud que favorecía tres estados positivos "hacia abajo" (2ayo, 2hd5, 2ibi) y desfavorecía tres estados negativos "hacia arriba" (lcmx, lxd3 , 3ifw) a través de una población de 2000 miembros de 150 generaciones (Havranek & Harbury, Nat. Struct. Biol. 10, 45-52 (2003)).

Este protocolo fue repetido de manera independiente tres veces para la plantilla de estructura principal de cada estado positivo y matrices de puntaje de posición especifica fueron construidas con la ponderación de secuencia de aptitud Boltzmann (Figura 22B) Smith & Kortemme, PLoS ONE 6, e20451 (2011) ) . Ambos métodos de estado único y multiestado indicaron que los residuos de tipo silvestre en las posiciones 7, 8, 13, 34, 36, 61, y 71 fueron suboptimas para el estado de vinculación a USP "hacia abajo" (Figura 22A-22B) . Estas posiciones, juntas con la posición colindante 69 fueron aleatorizadas en codones N K en experimentos de expresión en fago.

Anclaje cruzado computacional Las estructuras de ubiquitina enlazadas a desubiquitinasas tipo USP o UCH (códigos PDB 3IFW, 2AYO, 2HD5, 1CMX, 1XD3 , y 2IBI) fueron separadas en componentes de ubiquitina (cadena B) y desubiquitinasa (cadena A) . Solo la porción globular de ubiquitina (residuos 1-70) fue anclada, para evitar sesgo cristalográfico que surge del posicionamiento de la cola C-terminal flexible. La memoria del complejo enlazado fue removida mediante pre empaquetado de todas las cadenas laterales en el estado apo. Cada estructura de ubiquitina fue anclada en el estado de enlace de cada desubiquitinasa mediante alineamiento de la ubiquitina cognada, entonces acoplada en la desubiquitinasa al usar RosettaDock (Gray, et al., J. Mol. Biol . 331, 281-299 (2003)) después de una perturbación aleatoria pequeña de 3Á y 8o. 1,800 trayectorias se corrieron por cada complejo de desubiquitinasa-ubiquitina, y las energías de sistema totales de cada combinación fueron normalizadas relativas al modelo de puntaje más bajo, el cual se fijó a un puntaje de cero. Ca RMSD para residuos 1-70 fue calculado relativo a la estructura cognada de ubiquitina enlazada a la desubiquitinasa en cuestión.

Exhibición de ubiquitina en fago M13 La ubiquitina fue exhibida en la superficie de M13 bacteriófago al modificar un fagomid descrito previamente pS2202d (Skelton, N. J. et al., J. Biol. Chem. 278, 7645-7654 (2003)). Técnicas de biología molecular estándar fueron usadas para remplazar el fragmento de pS2202d que codifica dominio PDZ Erbina con fragmento de ADN que codifica para ubiquitina. El fagomido p3Ub resultante contenido en un marco de lectura abierto que codifica por la señal de secreción de proteína de enlace de maltosa, seguido mediante etiqueta gD y ubiquitina y que finaliza con el dominio C-terminal de proteína de revestimiento menor p3. E. Coli que alberga p3Ub fue co-infectado con fago ayudante M13-K07 y fue amplificado mediante el seguimiento del protocolo estándar (Tonikian et al., Nat Protoc. , 2 (6):1368-86 (2007)). El fago propagado fue purificado de acuerdo con el protocolo estándar (Tonikian et al., Nat Protoc, 2 (6): 1368-86 (2007)) y re suspendido en 1 mi de amortiguador PBT (PBS, 0.5% BSA y 0.1% entre 20), que resulta en la producción de partículas fago que encapsularon el ADN p3Ub y ubiquitina exhibida. El nivel de exhibición fue analizado al usar un fago ELISA.

Construcción y clasificación de biblioteca Las bibliotecas de ubiquitina fueron construidas al usar el método de mutagénesis Kunkel (Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987)). Los residuos de ubiquitina de tipo silvestre T7, L8, T13, E34, 136, L69 y L71 fueron aleatorizados con el codón NNK. Una plantilla de parada (de una única hebra de ADN de p3UB que contiene tres codones de alto en las regiones de 7-13, 34-36 y 69-71) fueron usados para construir una biblioteca que contenía ~2 x 1010 miembros únicos. La biblioteca fue ciclada a través de rondas de selección de enlace en solución contra el dominio catalítico monobiotinilada C-terminal de USP14 (residuos D91-Q494) con una mutación C114A (designada como USP14catC114A) . Para la ronda uno, se incubaron 20 g de USP14catC114A biotinilada con 1 mi de biblioteca fago (~ 1 x 1013pfu/mL) en 4 °C durante 2 horas y capturado por 15 minutos en temperatura ambiente mediante 200 L de Streptavidina Dynabeads® MyOne que fue previamente bloqueada con amortiguador de bloqueo (PBS, 1% BSA) . El supernadante fue descartado y las perlas fueron lavadas tres veces con PBS, 0.1% entre 20. El fago enlazado se eluyó con 400 µ?. HC1 0.1 M durante 7 minutos e inmediatamente neutralizado con 60 µ?? of 1 M Tris, pH 13. El fago eluido fue amplificado como se describe por Tonikian et al., Nat Protoc, 2 (6):1368-86 (2007). Para la ronda dos, el protocolo fue el mismo que la ronda uno excepto por usar 10 µg de USP14catC114A biotinilada y 100 µ?, de Dynabeads . Para la ronda tres y ronda cinco, 2 µg de USP14catC114A biotinilada fueron incubados con el fago amplificado de la ronda previa y el complejo de fago-USP14catC114A de la ronda previa y el complejo de fago-USP14catC114A fue capturado por las placas de NeutrAvidina-recubierta tratadas previamente con amortiguador de bloqueo. La ronda cuatro fue idéntica a la ronda tres excepto por el uso de placas de Strepavidina-recubierta para capturar complejo de fago de biotina USP14catC114A. El fago se propago en E. coli XLl-azul con fago ayudante M13-K07 en 30°C después del protocolo estándar (Tonikian et al., Nat Protoc, 2(6):1368-86 (2007)).

Elisa por puntos fago Después de cinco rondas de selección de enlace, los clones de fago individual fueron recogidos e inoculados en 450 µ? de medio 2YT que contiene 50 g/ml de carbencilina y fago ayudante M13-K07 en bloque de 96-pozos, los cuales crecieron en 37°C durante la noche. El sobrenadante fue analizado con Elisa por puntos fago de la siguiente manera: USP14catC114A biotinilada fue capturada para NeutrAvidina- recubierta inmunoplacas Maxisorp 384 pozos y sobrenadante fago diluido (1:3) con amortiguador PBT fue añadido a los pozos . Las placas fueron lavadas y el fago enlazado fue detectado con anti-Ml3-HRP seguido por substrato TMB. En estas evaluaciones, el enlace de fago a NeutrAvidina sola fue probado en paralelo con enlace de fondo de evaluación. Los clones cuyas señales de enlace para USP14catC114A fueron más de 5 veces mayores que a Neutravidina (fondo) fueron consideradas positivas. Los clones positivos fueron sujetos a análisis de secuencia de ADN.

Expresión y purificación de variante de ubiquitina Las variantes de ubiquitina que codifica ADN fueron clonadas en un vector derivativo pET (vector EitNTH) con una etiqueta 6x His N-terminal y expresada en E. Coli como se describió previamente (Dueber, et al., Science 334, 376-380 (2011)). Brevemente, células de oro (gold) de E. coli BL21 (DE3) fueron transformadas con los plásmidos que contienen U14Ub y cultivadas en medio LB que contiene 50 mg/L de carbenicilina a un OD6oo de ~ 0.7 e inducidas con 0.2-0.5mM isopropil ß-D-l-tiagalactopiranosida durante 16 horas en 16°C y entonces extraídas mediante centrifugación. Las células fueron resuspendidas en inhibidores de proteasa completa PBS plus Roche (sin EDTA) y imidazol 10 iffl y lisado mediante sonicación. La fracción soluble fue cargada en resina Ni-NTA (Qiagen) y lavada con approx. diez volúmenes de columna de PBS más 20mM de imidazol y entonces eluidos con PBS más imidazol 300 m . La etiqueta 6xHis fue entonces disociada desde la cristalografía para proteína y espectroscopia RMN por medio de la adición de proteasa TEV y dializada contra PBS durante la noche a 4°C. Esta solución fue entonces corrida sobre resina Ni-NTA para remover la etiqueta disociada y el TEV. Las muestras fueron concentradas con 3 kDa MWCO dispositivos de filtro centrifuga 15 ultra libre (Amersham) y corrida sobre una columna de filtración de gel (S75 Superdex 16/60, GE Healthcare) . Fracciones fueron entonces combinadas, analizadas mediante SDS-PAGE, y concentradas en 1-20 mg/mL.

Las muestras fueron preparadas para espectroscopia RMN con etiquetado realizado de acuerdo con el método de Cai et al. (J Biomol RMN 11, 97-102 (1998)) con la modificación de que las células fueron giradas hacia abajo y transferidas a medios M9 que contienen glucosa-U-2H, 13C-D y 2/3 de 2H20. Aproximadamente 50% de deuteración es requerida para la implementación del experimento µd Rex (Hansen, et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 11468-11479 (2007)). Las muestras de RMN contenían 10% de 2H20 y O.lmM de trimetisililpropionato. La incorporación de deuterio fue determinada de aprox. 50% por espectrometría de masa.

Evaluación de enlace mediante ELISA La USP14catC114A, UCHL3 , o UCHL1 biotinilada fue capturada en placa Maxisorp® recubierta con NeutrAvidina que fue previamente bloqueada mediante el amortiguador de bloqueo y fue incubada con 1:3 de dilución serial de variantes de ubiquitina de His-etiquetado en el rango de concentración de 0-20µ? durante 1 hora en 4°C en amortiguador PBT. La placa fue entonces lavada con amortiguador PT y las proteínas de his-equiquetada enlazadas fueron detectadas mediante conjugado anti-PentaHis-HRP (Qiagen, Cat . No. 34460, Germantown, MD) seguido por substrato TMB.

Medición de afinidad mediante inferioridad de biocapa Las afinidades de enlace de variantes de ubiquitina a USP14catC114A fueron medidas mediante interferometría de biocapa en un OctetRed 384 (Fortebio, Menlo Park, CA) . Los biosensores de Strepavidina (Fortebio, Cat. No. 18-5020) fueron cargados con biotinilada USP14catC114A en un amortiguador PBS que contiene 0.05% entre 20 y 0.5% BSA, lavados en el mismo amortiguador y transferidos a los pozos que contienen variantes de ubiquitina en concentraciones que oscilan de 0-50 µ en el mismo amortiguador. La señal contra la célula de referencia que contiene amortiguador solo fue sustraída de todos los datos de enlace. Para cada ligando de concentración, dos biosensores, con o sin USP14catC114A biotinilado cargado, fueron usados para detectar enlace en paralelo. La señal detectada mediante el biosensor solo, fue sustraída de la señal de enlace desde el biosensor cargado con USP14catC114A. La constante de disociación, ??? fue obtenida mediante ajuste no lineal de las respuestas a un algoritmo de estado estable mediante el uso del programa Octet .

Para cinéticas, los datos de asociación fueron ajustados mediante el uso del programa KaleidaGraph a la siguiente ecuación para un modelo de asociación bifásica: r = ^ f l -e *"')+ /^(l - «l -e w) ÍEcuación 1 ¾ Rmax es la respuesta máxima ffast es la- fracción de contribución del enlace de fase rápida hacia el total Rmax kfast es la asociación constante para el enlace de fase rápida kfsiow es la asociación constante para el enlace de fase lenta r es la respuesta en cualquier punto de tiempo y t es el tiempo La constante de disociación koff fue obtenida mediante el ajuste de los datos de disociación al modelo 1:1 mediante el uso del programa Octet .

Para la fase rápida, kon= (kfast-k0ff) / [L] (ecuación 2), donde [L] es la concentración de ligandos . Para la fase lenta, kslow=kf+ kr/ (1+ [L]/KD) (ecuación 3) es para el modelo de "selección de conformación" y kslow=kr+ kf/ (1+KD/ [L] ) (ecuación 4) es para el modelo de "ajuste inducido" (Hammes, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 106, 13737-13741 (2009); James et al., Science 299, 1362-1367 (2003)).

La KD derivada de ajuste cinético fue calculada como koff/koni en la cual kon fue calculado desde la ecuación 2 De la forma de la dependencia de kslow obtenida desde la ecuación 1 en varias concentraciones de ligandos, fue claro que el modelo de ajuste inducido (ecuación 4) describe los datos experimentales. En el proceso de ajuste, KD es un parámetro libre y los valores obtenidos desde el ajuste de ksiow fueron comparados con los valores de KD obtenidos desde ambos el estado cinético y el ajuste cinético (Tabla 13) .

Tabla 13. Caracterización de los U14Ubs con la mayor afinidad aparente para USP14. Las secuencias de ELISA basadas basadas en EC50s de las cinco U14Ubs con la afinidad aparente más alta de USP14. (continúa) Mediciones de estabilidad térmica mediante el uso de dispersión de luz diferencial La estabilidad térmica de la U14Ubs fue comparada con ubiquitina de tipo silvestre, un instrumento de dispersión de luz estática diferencial comercial (Stargazer, Harbinger Biotech) como se describe por Vedadi et al [Proc. Nati. Acad. Scí. U.S. A. 103, 15835-15840 (2006). La concentración de cada proteína fue 0.2mg/mL Resultados Para alterar las dinámicas del bucle de ubiquitina ß1-ß2, las posiciones de núcleo donde las mutaciones son predichas para estabilizar el estado "hacia abajo" de enlace de USP fueron buscadas de manera computacional , mediante el uso de RosettaDesign de un único estado y multi estado.37"39 ambos tipos de experimentos de diseño identificaron un conjunto consistente de posiciones donde las mutaciones se predijeron para favorecer el estado de enlace de USP. Esta información fue incorporada en las bibliotecas de expresión en fago de variantes de ubiquitina, las cuales fueron cribadas contra un mutante inactive catalíticamente del dominio USP de USP14 (Figura 22A-22B) .

Seleccionar para variantes de ubiquitina que enlazan a USP14 (U14Ubs) produjo varias preferencias de secuencia fuerte, tal como la casi invariante incorporación de glicina en la posición 7 (Figura 18A) . Más de cuarenta U14Ubs (designados U14UbXX, donde xx denota el número de clon) fueron clonados, expresados, purificados, y escaneados por su habilidad para enlazar USP14, UCHL1, y UCHL3 por medio de ELISA y/o interferometría de biocapa. El análisis fue concentrado en los cinco clones con la afinidad aparente más alta para USP14 : U14Ubl, 2, 14, 22, y 24 (Figura 18B) . Las mediciones de estabilidad termal muestran que las U14Ubs no son significativamente desestabilizados con respecto al tipo silvestre (figura 27) . ELISA y titulaciones de interferómetro de biocapa de estas variantes de ubiquitina revelan que cada una enlaza USP14 con una afinidad mejorada 100-500-veces comparada con ubiquitina de tipo silvestre (Figure 18B) . En cambio, cada variante vincula UCHLl y UCHL3 con afinidad más débil 40-2,000 veces que el tipo silvestre (Figura 18B; Tabla 14) . Una inspección cercana de titulaciones de USP14 con el U14Ubs revelo inicialmente que el ajuste de parámetro único de las cinéticas de asociación es insuficiente para explicar los datos. En lugar de ello, la asociación bifásica fue observada, con una dependencia de un índice más lento en la concentración de U14Ub indicativa de un mecanismo de ajuste inducido de enlace (Figuras 18C y 28A-29B) . 0 Tabla 14. Parámetros cinéticos y de equilibrio para la asociación de Uspl4 con U14Ubs . Los parámetros cinéticos fueron determinados desde los datos de titulación como se discute en los métodos. aLos ajustes cinéticos fueron promediados juntos para la concentración más alta de tres, los errores reportados son la desviación estándar de los valores para las tres concentraciones más altas . (continúa) Si las U14Ubs fueran a enlazarse a USP14 por medio de un mecanismo de selección conformacxonal, deberá esperarse que la población del estado U14Ub competente para enlace a USP14 deberá ser enriquecido relativo al tipo silvestre; en su mayor extremo esto podría resultar en un cambio en la estructura de estado basal de la U14Ubs. Sin embargo, si los U14Ubs se fuesen a enlazar con USP14 por medio de un mecanismo de ajuste inducido, deberá ser apreciado que la transición entre el complejo de encuentro U14Ub-USP14 y el estado completamente enlazado se ha vuelto más favorable. La selección conformacional y modelos de enlace inducidos por ajuste representan dos extremos de un único ciclo de reacción,40 por consiguiente, cualquier perturbación que desfavorece un brazo del camino favorecerá la otra. Mientras ambos mecanismos de enlace parecen jugar un papel en las interacciones del enlace de ubiquitina de tipo silvestre, 29-30 la observación de cinéticas de enlace consistentes con un mecanismo de enlace dominado por un ajuste inducido pueden estar ligadas a una perturbación en las transiciones entre sub estados en el conjunto conformacional U14Ub apo.

Inspección adicional de los títulos de USP14 con el interferometría de biocapa detectada U14Ubs no se ajustan a un modelo de asociación de una sola fase sobre una medición de 1,000 segundos (Figura 35A-35C) . Sin embargo, cuando el tiempo de medición fue extendido a 1,800 segundos, las titulaciones de USP14 con el U14Ubs detectadas mediante interferometría de biocapa se encontraron entonces que se ajustan razonablemente bien a un modelo de disociación de una única fase (Figura 36A-36C) . Existe una pequeña desviación del comportamiento idealizado en puntos de tiempo tempranos y mayores concentraciones de U14Ubs esto es, sin ser enlazado a teoría, probablemente unido a la naturaleza de ajuste del evento de enlace inducido de U14Ub-USP14. Sin embargo, estos datos no se ajustaron al modelo de disociación bifásica debido a los datos limitados disponibles para tomar muestras de manera suficiente la fase más rápida.

Este ejemplo demuestra que la técnica de Exhibición Conformacional puede identificar de manera suficiente una variante de ubiquitina estabilizada conformacionalmente que enlaza a USP14 con afinidad mejorada 100-500-veces comparada con ubiquitina de tipo silvestre. Esta variante de ubiquitina exhibe cinéticas de enlace consistentes con un mecanismo de ajuste inducido con respecto a USP14.

Ejemplo 8: Estructura de cristal de U14Ub2 Este ejemplo investiga la conexión entre el cambio hacia el mecanismo de enlace de ajuste inducido y la estructura y dinámicas de apo U14Ubs .

Materiales y Métodos Cristalografía de rayos-X y determinación de estructura La U14Ub2 para cristalografía fue purificada como se pasó anteriormente con el paso de filtración de gel final realizado en 25 mM HEPES pH 7.2 con NaCllOO mM. La agrupación final fue concentrada en 15 mg/mL y congelada en -80 °C. el U14Ub2 fue cristalizada a 19 °C en gotas colgantes, que consisten de un índice 1:1 de proteína (15 mg/mL) de kucis nadrem suspendido sobre licor madre (MES 0.1 M pH 6.1, 2-Metil-2,4-pentandiol 1%, y sulfato de amonio 3.5 M) . Los cristales aparecieron después de 2 días y crecieron a tamaño completo después de 1 semana. Para recolección de datos los cristales fueron transferidos a licor madre fresco y entonces ultracongelado en nitrógeno líquido. Los cristales se difractaron en 2.54 Á, y pertenecen al grupo de espacio P2i con 8 moléculas en la unidad asimétrica. Una única cadena de ubiquitina (código PDB: 1UBQ) fue usada como un modelo de búsqueda para remplazo molecular. Las estadísticas cristalográficas son presentadas en la Tabla 15.

Tabla 15. Estadísticas cristalográficas Recopilación de datos 50.73 - 2.54 (2.631 Resolución (Á) a - 2.54) Grupo de espacio P 1 21 1 a=50.73, b=55.45, Célula unidad c=94.28 ß=89.99 Reflexiones totales 60870 (509) Reflexiones únicas 17488 (144) Multiplicidad 3.5 (3.5) Completo (%) 99.93 (100.00) I/sigma promedio (I) 7.13 (2.12) Factor-B Wilson 28 R-symb 0.207 (0.341) Refinamiento R-factor/R-freec 0.2668/0.2997 Numero de átomos 4541 agua 47 Residuos de proteína 568 RMS (uniones) 0.005 RMS (ángulos) 0.76 Valores Ramachandran 99 favorecidos (%) Valores extremos 0 Ramachandran ( %) Factor-B promedio Resultados La estructura de cristal de U14Ub2 fue resuelta y las resonancias de estructura principal de RMN de todas las cinco U14Ubs fueron asignadas . Ambos el modelo de la estructura de cristal y el modelo derivado de RMN CS-Rosetta41 indican que el doblez de estado estacionario para cada una de las variantes es indistinguible de tipo silvestre (Figuras 24 y 31A-31B) . Sin embargo, en los espectros 1H/15N HSQC de todas las U14Ubs, muchas resonancias de amida de estructura principal son expandidas relativas a de tipo silvestre (Figura 19A) . Los residuos expandidos son agrupados de manera especial alrededor del bucle ß1-ß2 y en las hebras ß3 y ß5 colindantes, lo que significa una modulación de dinámicas conformacionales en estas regiones. Al contrario, el ^H}-1^ NOE heteronuclear permanece en gran medida sin cambios, lo que indica que los movimientos rápidos, de sub nanosegundo no son perturbados . 42 Tomado junto con la observación de que la región ß1-ß2 de ubiquitina de tipo silvestre es móvil en la escala de tiempo de sub-50 µe,28 la expansión de linea observada en este ejemplo indica el alentamiento de dinámicas conformacionales de gran escala en esta región del apo U14Ubs sin un cambio en movimientos rápidos en escala pequeña.

Ejemplo 9: dinámicas conformacionales de la región ß!-ß2 en variantes de ubiquitina estabilizada conformacionalmente Este ejemplo utiliza experimentos de dispersión R2 para examinar si el diseño estructural ß1-ß2 en proteínas de ubiquitina estabilizada conformacionalmente exhiben dinámicas más lentas en comparación con el movimiento observable en esta región en ubiquitina de tipo silvestre.

Materiales y Métodos Espectroscopia RMN Las asignaciones de resonancia para ubiquitina de tipo silvestre y los U14Ubs fueron obtenidos de análisis semi automatizados de posiciones pico en espectros 1H-15N HSQC, HNCA, HNCACB y HNcoCA mediante el uso de PINE (Bahrami et al., PLoS Comput. Biol. 5, el000307 (2009)). Los cambios químicos fueron referenciados a trimetilsililpropionato . Asignaciones de estructura principal casi completas fueron obtenidas de ubiquitina de tipo silvestre y las U14Ubs . Las resonancias de amidas de E24 y G53 son desapercibidas en todas las proteínas. Como se discute más adelante y mostrado en la Figura 19 y Figura 23A-23F, todas las U14Ubs muestran expansión de resonancias de RMN debido al cambio químico. Esto es más evidente en U14Ubl4, la cual requirió experimentos de triple resonancia conducidos en temperaturas más altas para establecer conectividades entre los residuos. En resumen, además de los residuos 24 y 53 para todas las proteínas, los residuos 9 y 12 son desapercibidos para U14Ubl; los residuos 9 y 73 son inadvertidos para U14Ub2 ; los residuos 8-12, 41 y 72 son desapercibidos para U14Ubl4 ; y los residuos 9 y 10 son desapercibidos para U14Ub24. Junto con la secuencia de aminoácidos, 1H, 15N, 13Ca y 130ß cambios químicos fueron usados como entradas para la generación de modelos CS-Rosetta (Shen, et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 105, 4685-4690 (2008)). Para cada' U14Ub el modelo CS-Rosetta de energía más baja convergió en una única vez que es indistinguible del tipo silvestre (Figura 24) . Todos los conjuntos de datos de RMN fueron recopilados en 18.8T en un espectrómetro Bruker DRX o en 14. IT en un espectrómetro Bruker Avance III. Los experimentos de RMN fueron conducidos en 24°C, calibrados a metanol deuterado (Findeisen, et al., Magn Reson Chem 45, 175-178 (2007)).

Los valores NOE hereronucleares {1H}-15N fueron determinados de acuerdo con el método de Grzesiek y Bax (Grzesiek & Bax, J. Am. Chem. Soc. 115, 12593-12594 (1993)). El retraso de reciclado en todos los experimentos y el tiempo de irradiación 1H se ajustaron a 5s y ls, respectivamente. Los valores de microsegundo Rex fueron extraídos de mediciones HZ'NZ, ????' , HZ'NZ', y HZNZ Rlp donde el primo denota la presencia de un campo de enclavamiento de espín (spin-lock field) durante el retraso de relajación (Hansen, et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 11468-11479 (2007); Hansen et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 16257-16265 (2009)). Los campos de enclavamiento de espín empleados fueron 10 kHz y 2 kHz en las frecuencias ¾ y 15N, respectivamente. Los tiempos de retraso fueron entre 2 ms y 32 ms para todos los experimentos con enclavamiento de espln de irradiación y 4 y 128 ms para HZN2, registrado en ausencia de irradiación. Cada uno de estos experimentos fue registrado como un pseudo 3D con complejo 64 15N puntos en cada plano y nueve tiempos de retraso de relajación registrados en una forma intercalada para aliviar artefactos potenciales debido a calentamiento de muestra diferencial. Las curvas de evolución se ajustaron mediante el uso de R Pipe (Delaglio, et al., J Bíomol RMN 6, 277-293 (1995) ) y el análisis de datos se condujo de acuerdo con Hansen et al. (J. Am. Chem. Soc. 131, 16257-16265 (2009)).

Los conjuntos de datos de dispersión R2 se recopilaron de acuerdo a la metodología de Tollinger et al. (J. Am. Chem. Soc. 123, 11341-11352 (2001)) con R2obs determinada de ajustes de 2 puntos a fin de tomar muestras de manera más completa de la curva de dispersión (Mulder, et al., J. Am. Chem. Soc. 123, 967-975 (2001)). Los conjuntos de datos fueron recopilados como pseudo-3Ds intercalados con complejo 64 15N puntos en cada plano y ca. 15 frecuencias CPMG. Las frecuencias CPMG probadas fueron de entre 50 y 950Hz con dos frecuencias repetidas por análisis de error. Las gráficas de ms Rex contra la secuencia descrita en los resultados y en la Figura 25A-25F son estimados derivados de la diferencia en R2obs determinada en las frecuencias CPMG de 50 y 950 Hz . Las curvas de dispersión R2 fueron recopiladas para todos los U14Ubs en 18.8T y 14. IT. U14Ubl, 2 y 14 tenían suficiente dispersión para ajustarse a la ecuación Carver-Richards (Richards & Carver, Journal of Magnetic Resonance (1972) ) , implementada por medio del programa GUARDD (Kleckner & Foster, J Biomol RMN 52, 11-22 (2012)) dentro de MATLAB. Los datos de dispersión se ajustaron a grupos de residuos que se agrupan de manera física y muestran un comportamiento de intercambio similar (Figura 26A-26C) . Todas las U14Ubs excepto U14Ub2 están en el régimen de intercambio rápido; por consiguiente, las poblaciones y diferencias de cambio químico entre los estados no son separables . Los índices de intercambio determinados para U14Ubl, U14Ub2, y U14Ubl4 son 4700 ± 1200s"1, 1250 ± 260s"1, y 1870 ± 190s"1, respectivamente. La población de estado estacionario de U14Ub2 es 99.6 ± 0.05%. La dispersión R2 fue explorada en temperaturas más bajas, pero los conjuntos de datos generalmente no fueron susceptibles a análisis debido a la expansión incrementada en la región de interés.

Resultados Para confirmar que las variantes de ubiquitina estabilizada exhiben un frenado de dinámicas conformacionales a gran escala en la región ß1-ß2 y para proporcionar una mayor percepción en la naturaleza de estos movimientos, los experimentos de dispersión R2, sensitivos a movimientos en escalas de tiempo de milisegundos (ms Rex) , 42 fueron realizados así como mediciones HZNZ Rip Rex,43 los cuales prueban las dinámicas de amidas de estructura principal en la escala de tiempo de microsegundos (ps Rex) . En estas mediciones los valores Rex más altos implican un intercambio conformacional más lento de un segmento móvil en la escala de tiempo probada por el experimento. Aunque los movimientos presentes en la ubiquitina de tipo silvestre son en su mayoría muy rápidos para observarse mediante el ms Rex,44 varias de las U14Ubs muestran dispersión R2 significativa (ms Rex) en temperatura ambiente, más dramáticamente en U14Ubl4 (Figura 19B) . Los datos de dispersión R2 se ajustan bien a un modelo de intercambio de dos sitios;42 sin embargo, la mayoría de los U14Ubs están en el límite de intercambio rápido, lo que significa que las poblaciones del estado excitado son inseparables de las transformaciones de cambios químicos. La excepción es U14Ub2, la cual podrá ser ajustarse con un estado excitado poblado de manera escasa (0.4 + 0.05%). Los valores Rex en las regiones que rodean el bucle ß1-ß2 en la estructura terciaria son de hasta cuarenta veces más altas en los U14Ubs que las posiciones correspondientes en el tipo silvestre, más notablemente en U14Ub2 (Figura 19B) .

Este ejemplo demuestra que, mientras que el movimiento de ubiquitina de tipo silvestre es demasiado rápido como para requerir un análisis basado en RDC complejo para observar,28 las dinámicas de U14Ubs son dominadas por escalas de tiempo s-ms mucho más lentas. mientras el movimiento en los U14Ubs apo se ha frenado relativo a tipo silvestre, sigue ha incrementado que la barrera de energía entre subestados. Puede ser hipotetizado, sin estar unido a teoría, que esto ha reducido el flujo a través del brazo de selección conformacional del camino que resulta en un mecanismo de enlace denominado mediante ajuste inducido.

Ejemplo 10: incorporación de U14Ub en cadenas de poliubiquitina Tomados juntos, los datos de los ejemplos previos indican que las U14Ubs consiguen cambios de afinidad al modular las dinámicas conformacionales del estado apo en lugar de la estructura de estado estacionario. Las mutaciones, diseñadas para estabilizar la conformación de enlace USP "hacia abajo", han resultado en un incremento en la barrera de energía entre los subestados conformacionales, que por consiguiente accionan la interacción U14Ub-USP14 a través del brazo de ajuste inducido del ciclo de reacción (Figura 20A-20B) . Los experimentos en este ejemplo buscan determinar si las dinámicas conformacionales frenadas en las U14Ubs tienen consecuencias para otros aspectos del procesamiento de ubiquitina. De manera acorde, su habilidad para ser ensamblado en cadenas fue examinada .

Materiales y Métodos Transformación de U14Ub y crecimiento en levadura células de levadura competentes SUB328 (MATa. Iys2-801 leu2-3, 2-112 ura3-52 his3- 200 trpl-1 ubil-?? : : TRPl ubi2-&2: :URA3 ubi3Aub-2 ubi4-A2 : : LEU2) que contienen pUB146 plásmido marcado URA3 que expresa ubiquitina de tipo silvestre en un promotor de galactosa-regulada (Spence, et al., Mol. Cell. Biol. 15, 1265-1273 (1995)) fueron desarrolladas en YPDRafGal en 30°C y preparadas mediante el uso de Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation Kit II. Cada U14Ub y ubiquitina de tipo silvestre fueron clonadas en plásmido Yep96 TRPl-marcado en un promotor inducible de cobre (Hanna & Finley, Mol. Cell. Biol. 23, 9251-9261 (2003)) al usar sitios de restricción BglII/Kpnl. 400 ng de cada plásmido fueron incubados con las células componentes y transformadas por protocolo de conjunto. Las células fueron granuladas y resuspendidas en medio YPDRafGal antes de ser diluidas de manera serial y revestidas por goteo en placas YEPD + 5'FOA para selección de plásmido que expresa Yep96. Las placas fueron incubadas en 30°C durante 3 días y formaron en imagen.

Polimerización de cadena Übl4 La polimerización de cadena de ubiquitina se realizó como se describe previamente (Dong, et al., Structure 19, 1053-1063 (2011) en Tris 100 mM (pH 8), ATP 20 mM, MgCl2 20 mM, y DTT 1.2 mM. Cada reacción contenía 30 µ? de ubiquitina o variante, ÜBE1 125 nM, y Cdc 341.25 µ?. A las reacciones se les permitió proseguir por 20 horas en 37°C, seguido de enfriamiento en amortiguador de carga SDS reductor y visualización por medio de glicina-tris 18% SDS-PAGE Resultados Las U14UBs se ensamblan en cadenas unidas a Lys48 mediante UBE1 y Cdc34 en una proporción similar que la ubiquitina de tipo silvestre (Figura 32) , lo que sugiere que las mutaciones alrededor de ß1-ß2 puede influenciar las interacciones DUB sin perturbar las señales de ubiquitina de manera global. Curiosamente las U14Ubs no son capaces de soportar crecimiento in vivo en levadura a pesar de ser capaz de ser procesada en cadenas de Lys48 unidas, la única unión de cadena requerida para crecimiento45 (Figura 20C) .

Este ejemplo revela por primera vez como la perturbación de un panorama de energía conformacional puede tener consecuencias drásticas in vivo. Por lo tanto, la plasticidad conformacional afinada de manera exquisita de ubiquitina, requerida para mantener su habilidad para interactuar con un grupo diverso de socios de enlace, está unida de manera inextricable a su conservación profunda en eucariotas .

Conclusiones En suma, mientras que la expresión en fago, aunado con mutagénesis selectiva o aleatoria, es una técnica efectiva para seleccionar mutaciones de superficie que mejoran la afinidad entre un andamio y un objetivo de interés, estos acercamientos o enfoques usualmente desprecian la influencia de dinámicas y cambio conformacional sobre interacciones de proteína-proteína, aunque ellas pueden tomar ventaja de manera fortuita de dinámicas para seleccionar por efectos específicos de conformación.18 Se han descrito de manera reciente métodos que usan moléculas pequeñas para "asegurar" un objetivo flexible en un estado dado, lo que permite la ingeniería de anticuerpos que se enlazan a cierta conformación. Sin embargo, esto presupone la existencia de herramientas químicas para influenciar el equilibrio conformacional de una proteina.1"2 se cree que estos estudios representan la primera ocasión donde los métodos de diversidad de secuencia son usados para descubrir secuencias deliberadamente que favorecen una conformación deseada.

Al mutagenizar el núcleo de una proteína y seleccionar interacciones de alta afinidad, la Exhibición Conformacional implícitamente favorece una reducción en entropía del estado apo del objetivo. Ya que las asociaciones macromoleculares a menudo se congelan en una conformación particular, una reducción en entropía del estado de apo conlleva a una sanción entrópica más pequeña sobre formación compleja. Esto es evidente desde la preponderancia de clones U7Ub unidas a disulfuro de manera intramolecular descubrieron el cribado inicial (Figura IB) . De manera notable, la estabilización de sulfuro es reminiscente de una estrategia usada comúnmente en química medicinal, donde moléculas pequeñas con torsiones flexibles son hechas más rígidas mediante la adición de grupos voluminosos, insaturación, o cristalización.19 Ya que las proteínas típicamente tienen muchos más grados de libertad que las moléculas pequeñas, y los determinantes de su flexibilidad de estructura principal están menos bien determinados, la eficiencia de Exhibición Conformacional criba de manera eficiente muchas secuencias para encontrar combinaciones de aminoácidos enterrados que reducen la flexibilidad para promover altas interacciones de afinidad.

De manera adicional, las conformaciones funcionales de ubiquitina que gobiernan su interacción con USP terapéuticamente relevante y desubiquitinasas de tipo UCH se han identificado y el paisaje de energía que conecta estos estados para incrementar la afinidad para USP14 y disminuir la afinidad para otras DUBs se ha modulado- se cree que aquellos representan las primeras mutaciones de función de ganancia para afectar el movimiento conformacional en una interface de proteína.

Ejemplo 11: Segunda generación de maduración de afinidad para U7Ub25 La estructura apo de U7U 7 sugirió que la región C-terminal, puede estar involucrada en enlace a USP7 mediante interacción con la superficie. De manera acorde, maduración adicional de los residuos de superficie fue realizada en esta región.

Materiales y Métodos La maduración de afinidad y ELISA por puntos fago fueron realizadas como se describe anteriormente. La segunda generación de biblioteca de maduración de afinidad fue diseñada al combinar aleatorización suave residuos de superficie (-50% de índice de mutación en cada aminoácido) Q40, R42, A46, G47, Q49, Q62, E64 , S65, T66, H68, V70 y R72 mediante el uso de un codón de adulteración y residuos de C-terminal de aleatorización dura de R72-G76 mediante el uso de un codón NNK. Una plantilla de parada (ADN de una sola hebra de p8U7Ub25 que contiene dos codones de alto en las regiones de 34-36 y 69-76) fueron usadas para construir una biblioteca que contenía ~ 2 x 1010 miembros únicos . La biblioteca fue ciclada contra USP7catC223A por 4 rondas y 61 enlazadores únicos fueron identificados Resultados Diez clones mostraron IC50 en rango de 20nM mediante un ELISA de competencia de puntos fago de (datos nos mostrados) y fueron seleccionados para caracterización adicional (Figura 33) . Cinco de 10 clones fueron expresados y purificados como proteínas y la afinidad fue clasificada mediante el uso de un ELISA, en el cual la dilución serial de U7Ubs etiquetados con his fueron aplicados a la placa inmovilizada con USP7catC223A y las U7Ubs enlazadas fueron detectadas con HRP anti His. Como se muestra en la Figura 34, comparada con U7Ub25, la primera generación U7Ub25 maduradas de afinidad, toda la segunda generación de variantes de U7Ub25 mostradas mejoraron su afinidad de enlace. El enlazador más fuerte, U7Ub25.216 apareció que tiene -100 veces más mejora de afinidad en comparación con U7Ub25.2540.

Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalle mediante ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberán ser interpretados como que limitan el alcance de la invención. Las descripciones de toda la literatura de patentes y científica citadas aquí son incorporadas expresamente en su totalidad por referencia.

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SECUENCIAS Ubiquitina de tipo silvestre MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNI QKESTLHLVLRLRGG

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente, en donde comprende una o más substituciones de aminoácidos relativas a una proteína de ubiquitina de tipo silvestre.

2. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 1, en donde una o más sustituciones de aminoácidos estabiliza (n) el bucle ß1/ß2 de la proteína de modo que el bucle de ß1/ß2 es confinado a una región dentro de aproximadamente de 1.6 Á desviación de raíz cuadrada media del código de Banco de Datos de Proteína 3NHE cadena B.

3. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que la región del bucle ß1/ß2 de la proteína exhibe dinámicas conformacionales más lentas en comparación con proteína de ubiquitina de tipo silvestre como se midió mediante dispersión RM R2.

4. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde los valores de microsegundo Rex en la región alrededor del bucle ß1/ß2 son de hasta 40 veces mayores en comparación a proteína de ubiquitina de tipo silvestre como se midió mediante dispersión de RMN R2.

5. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína comprende una o más substituciones de aminoácidos en una posición seleccionada de un grupo que consiste de of A7, A8 , A13, A34, A36, A69, y A71, donde la posición es relativa a A1-A76 (SEQ ID N0:1) .

6. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 5, en donde comprende (a) sustitución A7 (C) o una sustitución A8 (C) y (b) sustitución A69 (C) .

7. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 6, en donde además comprende una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de A13 (N, R, G, K, Y, A, S, H, E, L, T, V, I, M, O P) , A34 (I, F, L, V, S, M, o T) , A36 (Y, F, L, H, A, V, , I, M o N) , y A71 (R, K, A, Q, , G, H, I, R o G) .

8. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 5, en donde comprende una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de A7(D, F, R, o S) , A8 (Y, A, G, Q, R, o Y), A13 (R, Y, E, o P) , A34 (I, L, o T) , A36 (L, Y, A, o N) , A69 (A, G, W. K. Y, o I) , y A71 (A, R, Q, R, o G) .

9. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde además comprende una o más substituciones de aminoácidos localizadas en A42, A46, A49, A62, A65, A68, o A70, donde las posiciones de residuo de amino acido corresponden a las posiciones en SEQ ID N0:1.

10. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde además comprende una o más substituciones de aminoácidos localizadas en A40, A42, A46, A47, A49, A62, A65, A68, A70, A71, A72, A73, A74, A75, o A76, donde las posiciones de residuo de amino acido corresponden a las posiciones en SEQ ID NO:l.

11. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con la reivindicación 1-10, en donde la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente exhibe enlace incrementado a una familia de Desubiquitinasa de Proteasa Especifica de ubiquitina (USP) comparada con la proteína de ubiquitina de tipo silvestre.

12. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente se enlaza a la desubiquitinasa con un Kd en el índice nanomolar.

13. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente se enlaza a la desubiquitinasa con una afinidad que es de cuando menos 1000 veces más alta que la de la proteína de tipo silvestre.

14. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente inhibe la actividad de la desubiquitinasa .

15. La proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente no exhibe o exhibe enlace disminuido a la familia de desubiquitinasa de la Hidrolasa C-terminal de ubiquitina (UCH) comparada con proteína de ubiquitina de tipo silvestre.

16. Un ácido nucleico que codifica la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Un vector que comprende los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 16.

18. El vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el vector es un vector de expresión.

19. Una célula que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 o el vector de la reivindicación 17 o 18.

20. La célula de conformidad con la reivindicación 19, en donde la célula es seleccionada de un grupo que consiste de célula animal, una célula de bacteria, una célula de insecto, una célula de nemátodo, y una célula de levadura.

21. La célula de conformidad con la reivindicación 20, en donde la célula animal es una célula humana o una célula no humana.

22. Un complejo de proteína que comprende la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y una desubiquitinasa de un miembro de la familia de USP.

23. El complejo de proteína de conformidad con la reivindicación 22, en donde la desubiquitinasa es USP7, USP5, o USP 14.

24. El complejo de proteína de conformidad con la reivindicación 23, en donde la desubiquitinasa es USP7.

25. Una proteína unida de manera covalente a una o más proteínas de ubiquitina estabilizadas conformacionalmente de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

26. Un soporte sólido en donde comprende la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 inmovilizadas ahí.

27. El soporte sólido de conformidad con la reivindicación 26, en donde el soporte sólido es una superficie apropiada para la resonancia plasmón de superficie .

28. El soporte sólido de conformidad con la reivindicación 26, en donde el soporte sólido es una nanopartícula, una perla, o un vidrio.

29. Una población de células caracterizadas porque comprenden la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 expresadas en la superficie de la misma.

30. Un método de inhibición de una desubiquitinasa de la familia USP, en donde comprende contactar la desubiquitinasa con una proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la inhibición es in vivo o in vitro.

32. Un método de identificar un agente que enlaza a una forma conformacional de la proteína de ubiquitina que es favorable para el enlace de una desubiquitinasa de la familia USP, en donde comprende: a) contactar el agente con una proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15; y b) determinar si el agente enlaza a la proteína de ubiquitina estabilizada conformacionalmente

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde el agente es un compuesto químico de molécula chica, un anticuerpo, una proteína, un ácido nucleico inhibidor, o una combinación de las mismas.

34. El método de identificar un agente que se enlaza a un complejo de proteína en donde comprende una desubiquitinasa de la familia de USP y ubiquitina, el método comprende : a) contactar el agente con el complejo de proteína de cualquiera de las reivindicaciones 22-24; y b) determinar si el agente es capaz de enlace al complejo de proteína.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, en donde el agente es un compuesto químico de molécula chica, un anticuerpo, una proteína, un ácido nucleico inhibidor, o cualquier combinación de las mismas.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, en donde el agente interrumpe la interacción entre la desubiquitinasa y la proteína de ubiquitina.

37. Un agente identificado mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 32-36.

38. Un método para cribar para una proteína de una forma estabilizada conformacionalmente, en donde la forma estabilizada conformacionalmente tiene una afinidad de enlace incrementada con un socio de enlace o tiene una habilidad incrementada para modular la actividad del socio de enlace comparada con la proteína de tipo silvestre, el método comprende : a) contactar el socio de enlace una biblioteca de formas mutantes de la proteína, en donde la biblioteca de formas mutantes es producida mediante la sustitución de residuo de amino acido en una proteína dinámica conformacionalmente con otro residuo de amino acido en una o más ubicaciones preseleccionadas, donde las ubicaciones preseleccionadas están ubicadas en el interior de la proteína; y b) identificar la forma estabilizada conformacionalmente con base en un enlace a un socio de enlace o una habilidad incrementada para modular la actividad del socio de enlace comparada con la proteína de tipo silvestre.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde las ubicaciones preseleccionadas son seleccionadas basadas en la contribución de residuos de aminoácidos en cada ubicación a las dinámicas conformacionales dentro de la proteína o dentro de una región de la proteína.

40. El método de conformidad con la reivindicación 38 o 39, caracterizado por que la biblioteca es una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican las formas mutantes de proteínas .

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde la biblioteca es una biblioteca de expresión en fago.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, en donde un vector de la biblioteca de expresión en fago es seleccionado desde el grupo que consiste de bacteriófago M13, fago fl, fago fd, fago ike, fago NI, fago Enterobacteria T4, bacteriófago T7, y fago de enterobacteria ?.

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-42, en donde además comprende mutar uno o más residuos de aminoácidos en la superficie de la proteína estabilizada conformacionalmente identificada al substituir el uno o más residuos de aminoácidos con otros residuos de aminoácidos y cribar para proteínas que tienen afinidad de enlace incrementada o capacidad de modulación en comparación con proteínas estabilizadas conformacionalmente sin uno o más residuos de aminoácidos de superficie substituida.

4 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-43, en donde la proteína es seleccionada de un grupo que consiste de un receptor acoplado a proteína-G (GPCR) , un receptor de hormona nuclear, un receptor de quinasa de tirosina, y un canal de ion activado por ligando.

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-44, en donde la proteína es ubiquitina.

46. El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde el socio de enlace es seleccionado de un grupo que consiste de desubiquitinasa, una enzima que active ubiquitina El, una enzima que conjuga ubiquitina E2, una ligase de proteína de ubiquitina E3 y uno o más miembros de complejo de proteasoma celular.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, en donde el socio de enlace es una desubiquitinasa.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47 en donde la desubiquitinasa es un miembro de una familia de desubiquitinasas de Proteasa Especifica de ubiquitina (USP)

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado por que la desubiquitinasa es seleccionada desde el grupo que consiste de USP7, USP5, Y USP14.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la desubiquitinasa es USP7.