KR102282107B1 - 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 동정방법에 의해 동정된 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49를 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 동정방법에 의해 동정된 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49를 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
단백질은 세포 내에서 다양한 기능을 수행하기 때문에 단백질의 발현과 분해 및 활성 유지는 세포의 항상성에 영향을 크게 미친다. 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 표적 단백질에 유비퀴틴이 결합하는 과정이며, 이 과정으로 프로테아좀이 유비퀴틴을 인식하여 표적 단백질을 분해한다. 뿐만 아니라, 유비퀴틴화는 단백질의 기능 및 활성에도 관여하므로 다양한 신호전달 경로를 조절하여 세포의 운명을 결정한다. 이것을 역으로 조절하는 과정을 탈유비퀴틴화 (deubiquitination)라고 하고, 단백질분해조절 효소(deubiquitinating enzyme, 혹은 탈유비퀴틴화 효소)가 표적 단백질에 결합되어 있는 유비퀴틴을 절단함으로써 프로테아좀에 의해 분해되는 것을 억제하거나 유비퀴틴화에 의해 조절된 단백질의 기능과 활성이 역으로 조절된다. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화는 단백질 항상성 및 세포 운명에 중요한 역할을 하며, 이 시스템이 비정상적으로 작동될 경우, 암 등 다양한 질병을 일으키게 된다.
비정상적인 단백질 발현 양상은 발병의 원인이 된다. 예를 들어, 단백질의 발현이나 기능이 정상적으로 수행되지 않아 세포사멸이 억제되어 과하게 증식하게 되거나 반대로 세포사멸이 과하게 일어나 질병을 일으킬 수 있다. 이 점에서, 단백질분해조절 효소는 단백질의 안정성이나 기능을 조절할 수 있는 핵심 분자로, 질병을 고치는 치료제로써 주목 받고 있다. 따라서, 표적단백질과 단백질분해조절 효소의 상호작용과 이들의 세포 내 신호전달 시스템 내의 역할을 확립하는 것이 중요하다. 이를 위해 표적단백질과 결합하는 단백질분해조절 효소를 발굴 하는 것이 연구의 발판을 마련하는 것이며, 현재 상호작용하는 단백질을 발굴하기 위해선 비용적으로 크게 부담을 안아야 하기 때문에 효율적이고 비교적 저렴한 스크리닝 시스템이 필요하다.
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 벡터 라이브러리를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법을 제공한다.
또한, 상기 동정방법에 의해 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49가 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있는 Bax에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49를 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따라, DNA-결합 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP1을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP2를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP3을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP4를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP5를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP6을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP7를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP8을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP10을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP11을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP12를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP14를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP15를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP16을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP17을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP18을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP19를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP20을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP21을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP25를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP28을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP30을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP33을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP34를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP35를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP36을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP37을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP38을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP39를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP44를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP46을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; 및 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP49를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터가 pGBT9 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 전사활성 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 벡터 라이브러리의 각각의 벡터 및 단계(a)에서 제작된 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 효모를 X-gal을 함유하고 트립토판 및 류신이 비함유된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 전사활성 도메인을 갖는 공 벡터가 pGAD424 벡터일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, (i) 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49 및 Bax 단백질을 과발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 단계(i)의 탈유비퀴틴화 효소는 USP49일 수 있다.
본 발명의 벡터 라이브러리는 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 효율적이고 낮은 비용으로 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 세포 내 다양한 기전을 밝히기 위한 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터 라이브러리를 적용함으로써, 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 및 USP49가 세포사멸 단백질인 Bax에 특이적으로 결합하는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 및 USP49를 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 본 발명의 벡터 라이브러리를 이용하여 Bax 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 벡터 라이브러리를 이용하여 Bax 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝한 후, 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)을 이용하여 재확인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 벡터 라이브러리를 이용하여 NANOG 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝한 후, 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)을 이용하여 재확인 결과를 나타낸다.
도 4은 Bax와 USP12가 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Bax와 USP49가 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Bax와 USP12가 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 Bax와 USP49가 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 NANOG와 USP21이 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 NANOG와 USP21이 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 Flag-USP49 및 Myc-Bax를 HCT116 세포에 형질전환시킨 후 IR 조사하였을 때 IR-유도된 세포사멸 과정에서 USP49가 Bax를 조절하는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다.
도 11은 Flag-USP49 또는 Myc-Bax로 과발현시킨 HCT116 세포를 IR 조사(10 Gy)로 처리한 다음, 6시간 후 세포를 수확하여 USP49가 Bax를 조절하는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다.
도 12는 pGBT9 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 13은 pGAD424 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 벡터 라이브러리를 이용하여 Bax 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝한 후, 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)을 이용하여 재확인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 벡터 라이브러리를 이용하여 NANOG 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝한 후, 음성 대조군(negative control)과 양성 대조군(positive control)을 이용하여 재확인 결과를 나타낸다.
도 4은 Bax와 USP12가 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Bax와 USP49가 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Bax와 USP12가 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 Bax와 USP49가 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 NANOG와 USP21이 세포 내에서 결합함을 면역침전 반응으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 NANOG와 USP21이 직접적으로 결합함을 GST pull-down 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 Flag-USP49 및 Myc-Bax를 HCT116 세포에 형질전환시킨 후 IR 조사하였을 때 IR-유도된 세포사멸 과정에서 USP49가 Bax를 조절하는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다.
도 11은 Flag-USP49 또는 Myc-Bax로 과발현시킨 HCT116 세포를 IR 조사(10 Gy)로 처리한 다음, 6시간 후 세포를 수확하여 USP49가 Bax를 조절하는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다.
도 12는 pGBT9 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 13은 pGAD424 벡터의 개열지도를 나타낸다.
본 발명은 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 DNA-결합 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP1을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP2를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP3을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP4를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP5를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP6을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP7를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP8을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP10을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP11을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP12를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP14를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP15를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP16을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP17을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP18을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP19를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP20을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP21을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP25를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP28을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP30을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP33을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP34를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP35를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP36을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP37을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP38을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP39를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP44를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP46을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; 및 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP49를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 벡터 라이브러리에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인(DNA-binding domain; DNA-BD)을 갖는 공 벡터는 효모에 DNA-결합 도메인을 제공할 수 있는 벡터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 도 12의 개열지도를 갖는 pGBT9 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 삽입은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 적절한 제한효소(restriction enzymes)를 사용하여 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자와 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터와 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자는 모두 진뱅크(Gene Bank)에 공지되어 있다. 또한, 상기 제한효소는 예를 들어, EcoR I, Sma I, BamH I, Sal I, Pst I 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 벡터 라이브러리를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 (a) 전사활성 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 벡터 라이브러리의 각각의 벡터 및 단계(a)에서 제작된 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 효모를 X-gal을 함유하고 트립토판 및 류신이 비함유된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법이 제공된다.
본 발명의 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법에 있어서, 상기 전사활성 도메인(transcription activation domain)을 갖는 공 벡터는 효모에 전사활성 도메인을 제공할 수 있는 벡터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 도 13의 개열지도를 갖는 pGAD424 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전사활성 도메인을 갖는 공 벡터에 표적 단백질을 코딩하는 유전자의 삽입은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 적절한 제한효소(restriction enzymes)를 사용하여 표적 단백질을 코딩하는 유전자와 전사활성 도메인을 갖는 공 벡터와 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 제한효소는 예를 들어, EcoR I, Sma I, BamH I, Sal I, Pst I, Bgl II 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 동정방법에 의해 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49가 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있는 Bax에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.
Bax는 Bcl-2 단백질의 전구세포사멸성 군(proapoptotic group of Bcl-2 proteins)에 속하며, 세포사멸의 유도에 있어서 핵심적인 역할을 한다. Bax는 스트레스를 받지 않은 정상 세포(unstressed cells)에서 단량체로서 세포질에 존재한다. 세포가 스트레스를 받을 경우, Bax는 전구세포사멸성 BH3-단백질에 의해 활성화된다. 활성화된 Bax는 미토콘드리아의 표면으로 이동하여 미토콘드리아 외막(mitochondrial outer membrane, MOM)으로 삽입된다. 이후, Bax는 호모-올리고머화(homo-oligomerization)를 겪게 되고, 이는 MOM에서의 포어 형성(pore formation)으로 이어진다. 이후, 전구세포사멸성 분자인 시토크롬 c가 유리되고 세포사멸이 유도된다. Bax를 코딩하는 유전자가 돌연변이될 경우, 세포는 세포 사멸에 덜 민감하게 될 수 있다. Bax의 발현 수준은 악성 전환(malignant transformation), 종양 생성(tumor progression), 및 전이와 관련되며, 따라서 Bax의 낮은 발현은 암 질환에 있어서 음성 인자(negative factor)로서 간주된다. 감소된 수준의 Bax 분해는 침습적인 전립선암에서 나타난다.
따라서, 상기 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49는 항암 활성을 갖는 물질의 탐색을 위한 신규의 표적(target)으로서 기능할 수 있다. 특히, Bax가 과발현된 세포에서 USP49를 과발현시키더라도 세포가 사멸되지 않고 프로테오좀-비의존성 경로로 Bax를 조절할 수 있으므로 스크리닝 방법에 적합하게 적용될 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다(도 11). 따라서, 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49 및 Bax 단백질을 과발현하는 세포에 후보물질을 처리하고, 배양된 세포의 사멸 여부를 측정함으로써 항암 활성을 갖는 물질을 탐색할 수 있다. 즉, 본 발명은 (i) 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49 및 Bax 단백질을 과발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 단계(i)의 탈유비퀴틴화 효소는 USP49일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 재료 및 시험방법
(1) 세포 배양 및 형질감염
293T 세포는 10% 우태혈청(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 함유하는 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. HCT116 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 형질전환은 150 mM NaCl 및 10 mM 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)을 사용하여 수행하였다.
(2) 항체
단일클론 항-Bax (2D2) (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-β-액틴 (1:1000, Santa Cruz, CA, USA), 항-HA (1:1000, 12CA5, Roche, Basel, Switzerland), 항-Flag (1:1000,Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 항-PARP1 (1:1000, Santa Cruz, CA, USA) 항체들을 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 및 면역조직화학 염색에 사용하였다. 항-K48 (1:500, Cell signaling, Danvers, MA, USA) 및 항-K63 항체(1:100, Cell signaling, Danvers, MA, USA)는 DUB 분석에 사용하였다. 이지 블롯 항체(Easy Blot antibody) (1:1000, GeneTex, TX, USA)를 IgG 사슬 시그날의 감소를 위해 사용하였다.
(3) 발현 벡터의 제조 및
프라이머
Bax (1-219), Bax (220-334) and Bax (335-579)의 결실 돌연변이를 생성하기 위하여, 정방향 프라이머 (5' - GAA TTC GCA TGG ACG GGT - 3'), (5' - GAA TTC CGA TGG AGC TGC A - 3') 및 (5' - GAA TTC GCA AAC TGG TGC TC - 3')를 사용하였다. 또한, 역방향 프라이머 (5' - CTC GAG CGG TTA CTG TCC AG -3'), (5' -CTC GAG CCG CTG GCA AAG - 3') 및 (5' - CTC GAG CGT CAG CCC ATC - 3')을 사용하였다.
USP49 (C262S)의 포인트 돌연변이(point mutation)는 부위-특이적(site-directed) 돌연변이를 통하여 생성하였다. 정방향 프라이머 (5' - CTG GGC AAC ACC AGC TAC ATG - 3') 및 역방향 프라이머 (5' - TGG AGT TCA TGT AGC TGG TGT - 3')를 돌연변이 생성을 위해 사용하였다. PCR 산물의 정제 후, Dpn I (Enzynomics, Daejeon, Korea) 효소를 첨가하였다. 구조체는 서열분석을 통해 확인하였다.
USP49 (1-762), USP49 (763-1131), 및 USP49 (1132-2067)의 결실 돌연변이를 위하여, 정방향 프라이머 (5' - GAA TTC GAT GGA TAG ATG C - 3'), (5' - GAA T TC TCT GCG CAA CCT G - 3'), 및 (5' - TCT AGA ACC CTT CGC CAT GC - 3')를 사용하였고, 또한 역방향 프라이머 (5'- CTC GAG GCC CGT GAC GCC - 3'), (5' - CTC GAG CGA CAC TAG GGC - 3'), 및 (5' - TAC GTA TCA ACC CCT TTC C - 3')를 사용하였다.
shUSP49의 생성을 위하여, USP49에 대한 3종의 shRNAs를 제작하여 pSilencer 3.1 H1 neo 벡터(Ambion, Austin, TX, USA)에 삽입하였다. shUSP49s의 표적 서열은 다음과 같다: #1 (5' - GTC TTC ACT GTA GCT CAA G - 3'), #2 (5' - GGA CTA CGT GCT CAA TGA T - 3') and #3 (5' - GGA CTA CGT GCT CAA TGA T - 3') (UbiProtein Corp, 성남, 대한민국).
RT-PCR을 수행하기 위하여, USP49 표적화를 위하여 정방향 프라이머 (5' - AGG ACT ACG TGC TCA ATG ATA ACC - 3') 및 역방향 프라이머 (5' - GCA GGA GCA GCC GTG CAC TCT - 3')를 사용하였다. 또한, GAPDH 표적화를 위하여 정방향 프라이머 (5' - ATC CCA TCA CCA TCT TCC - 3') 및 역방향 프라이머 (5' - CCA TCA CGC CAC AGT TTC - 3')를 사용하였다.
(4) 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리의 제작
하기 표 1에 나타낸 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 각각의 전장(full-length) cDNAs를 진뱅크(Gene Bank)로부터 입수하여, 적절한 제한효소(restriction enzymes)를 사용하여 pGBT9 벡터(Clontech, Palo Alto, CA, USA)와 함께 인큐베이션하여 각각 클로닝을 수행함으로써, 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 pGBT9-탈유비퀴틴화 효소 라이브러리를 제작하였다.
| 탈유비퀴틴화 효소 | 분자랑 (kDa) |
| USP1 | 90.5 |
| USP2 | 68 |
| USP3 | 59 |
| USP4 | 108 |
| USP5 | 95.8 |
| USP6 | 90 |
| USP7 | 130 |
| USP8 | 123 |
| USP10 | 87 |
| USP11 | 110 |
| USP12 | 60 |
| USP14 | 56 |
| USP15 | 112 |
| USP16 | 47 |
| USP17 | 22 |
| USP18 | 43 |
| USP19 | 145 |
| USP20 | 102 |
| USP21 | 62 |
| USP25 | 126 |
| USP28 | 122 |
| USP30 | 59 |
| USP33 | 107 |
| USP34 | 387 |
| USP35 | 113.4 |
| USP36 | 123 |
| USP37 | 110 |
| USP38 | 117 |
| USP39 | 65 |
| USP44 | 81 |
| USP46 | 42 |
| USP49 | 73 |
(5) 효모 이중 혼성 스크리닝(Yeast two-hybrid screening)
(5-1) pGBT9-탈유비퀴틴화 효소를 효모에 형질전환(1차 형질전환)
효모[사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) AH109]를 YPD(Clontech, Palo Alto, CA, USA) 한천 배지에 스트리킹하여 30℃에서 3-4일 동안 배양하였다. 콜로니를 YPD(Clontech, Palo Alto, CA, USA) 액체 배지에서 배양하여, 배양된 효모의 OD600 값이 0.8-1.0에 이르렀을 때 2500 rpm에서 2분 30초 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다. 증류수 3 ml로 효모를 풀어준 다음, 다시 2500 rpm에서 2분 30초 동안 원심분리하고, 리튬 아세테이트(LiAc) 용액으로 침전된 세포를 풀어준 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 600 μl LiAc 용액으로 세포를 다시 풀어주었다. pGBT9-탈유비퀴틴화 효소 유전자 1 μg 과 효모 100 μl 를 LiAc 용액에서 혼합하고, 쉐이킹 인큐베이터에서 15분 동안 30℃ 조건에서 배양하였다. 그 후, 폴리에틸렌글리콜(PEG)/LiAc 용액을 600 μl 넣어준 후, 쉐이킹 인큐베이터 30℃에서 30분 동안 배양하였다. DMSO 50 μl를 각각 넣어준 후, 42℃에서 15분 동안 열충격(heat-shock)을 가한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상등액을 제거하였다. 새로운 YPD 배지 600 μl를 넣고 세포를 풀어준 후, 1-2시간 동안 배양한 다음, 다시 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상등액 500 μl를 제거하고 -Trp 최소 한천 배지에 스트리킹하여 30℃에서 3-4일 동안 배양하였다.
(5-2) Bax 및 Nanog를 1차 형질전환된 효모에 형질전환 (2차 형질전환)
각 탈유비퀴틴화 효소가 형질전환 된 효모를 -Trp 액체 배지에서 배양하고, 배양된 효모의 OD600 값이 0.8-1.0에 이르렀을 때 2500 rpm에서 2분 30초 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다. 증류수 3 ml로 효모를 풀어준 다음, 다시 2500 rpm에서 2분 30초 동안 원심분리하고, LiAc 용액으로 침전된 세포를 풀어준 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 600 μl LiAc 용액으로 세포를 다시 풀어주었다. 표적단백질 cDNAs (Bax 및 Nanog)를 각각 전사활성 도메인이 포함된 pGAD424 벡터에 삽입하여 pGAD424-Bax 및 pGAD424-Nanog 을 각각 제조하였다. pGAD424-Bax 또는 pGAD424-Nanog 1 μg을 효모 100 μl 와 같이 LiAc 용액에서 각각 혼합하고, 쉐이킹 인큐베이터에서 15분 동안 배양하였다. 그 후, PEG/LiAc 용액을 600 μl 넣어준 후, 쉐이킹 인큐베이터 30분 동안 배양하였다. DMSO 50 μl를 각각 넣어준 후, 42℃에서 15분 동안 열충격(heat-shock)을 가한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상등액을 제거하였다. -Trp 액체 배지 600 μl를 넣고 세포를 풀어준 후, 1-2시간 동안 배양한 다음, 다시 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상등액 500 μl를 제거하고, X-gal이 포함된 -Trp, -Leu 최소 한천 배지((Clontech, Palo Alto, CA, USA)에 스트리킹하여 30℃에서 3-4일 배양하였다. 이 과정에서, 탈유비퀴틴화 효소가 형질전환된 효모에 표적 단백질 cDNA가 형질전환되며, 두 단백질이 결합하는 경우 청색 콜로니를 나타낸다.
(6) 세포
용해물(cell lysates)의
제조,
웨스턴
블롯팅
및
면역침강법
세포를 인산완충식염수로 세척하고, 용해 완충액(lysis buffer)(Tris-HCl [pH 7.5] 50 mM, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, 글리세롤 10%, 트리톤 X-100 1%), CHAPS 완충액(150 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7.4) 및 1.0% CHAPS) 및 NP40 완충액(145.2 mM 염화칼륨, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA 10 mM HEPES (pH 7.4) 및 0.2 % NP40)에서 용해하였다. 샘플을 얼음 상에서 20분간 인큐베이션한 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 상등액을 얻었다.
웨스턴 블롯팅은 8-12% SDS-PAGE 상에서 레인(lane) 당 단백질 20 μg을 로딩하여 수행하였으며, 단백질은 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 마이크로다공성 막(Millipore, Billerica, MA, USA)에 전사하였다. 막은 5% 스킴 밀크(skim milk)를 함유하는 TTBS(20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20)에서 20분간 블록킹한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 블롯을 TTBS로 세척한 다음, 3% 스킴 밀크 및 2차 항체를 함유하는 TTBS에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 다시 TTBS로 세척하고, ECL 시약 용액(Young In Frontier, 서울, 대한민국)으로 시각화하였다.
단백질의 면역침강을 위하여 세포 용해물을 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 단백질 A/G PLUS 아가로오즈 비드(protein A/G PLUS agarose beads)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 세척된 샘플을 SDS 샘플 완충액에서 비등시키고(boiled) 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다.
(7)
GST
pull-down 분석
pGEX-4T-3 벡터 또는 pGEX-4T-3-Bax 로 형질전환된 이 콜라이(E. coli) BL21 세포를 37℃에서 배양하였다. 세포 밀도(OD600 값)가 0.6에 이르렀을 때, 재조합 단백질의 발현을 5 mM IPTG(Promega, Madison, WI, USA)로 31℃에서 4시간 동안 유도하였다. 세포를 용해시키고, 글루타치온-세파로즈 비드(GST bead)(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 단백질을 포함하는 용해물에 혼합하고 회전시켜 GST 비드(beads)가 GST나 GST-Bax와 결합하도록 유도하였다. Myc-USP12나 Flag-USP49로 과발현된 293T 세포를 용해시키고, 세포 추출물을 GST가 tagging 된 GST 및 GST-Bax 와 혼합하였다. 혼합물을 세척하여 GST 및 GST-Bax를 용해물로부터 분리하였다. GST와 GST-Bax에 결합된 단백질은 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였으며, 항-Myc (1:1000 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 항-Flag 항체(1:1000 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 표지하였다. GST 단백질은 코마씨 블루 염색(Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 시각화하였다.
(8) 면역조직화학 염색 및
공초점
현미경분석
HCT116 세포를 12-웰 플레이트에 놓여진 유리 커버슬립(glass coverslips)에 파종하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 2% 노말 고우트 혈정(normal goat serum) 및 1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산완충식염수로 실온에서 1시간 동안 블록킹하였다. 세포를 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, the cells were incubated with Alexa-Fluor-488-컨쥬게이티드 고우트 항-마우스(1:100, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 고우트 항-래빗 1:100 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 공초점 현미경(TCSSP5 II, Leica, Mannheim, Germany)으로 시각화하였다.
(9)
유비퀴틴화
및
탈유비퀴틴화
분석
탈유비퀴틴화 분석을 위하여, HA-유비퀴틴, HA-유비퀴틴(K48R), 및 HA-유비퀴틴(K63R)을 293T cells에 형질전환시켰다. 세포를 수확하고, 세포 용해물을 항-Bax 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용한 면역침강에 사용하였다. 탈유비퀴틴화 분석은 HA- 유비퀴틴 및 Flag- Usp49. 를 사용하여 수행하였다. MG132를 수확 전에 4시간 동안 처리하였다. 항-Bax 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 단백질을 침전시키고, 샘플을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 탈유비퀴틴화 수준은 항-HA 항체(1:1000, 12CA5, Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 검출하였다.
2. 시험결과
도 1은 본 발명에 의해 제작된 벡터 라이브러리를 사용하여 세포사멸 단백질인 Bax를 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 스크리닝 결과, USP1, USP7, USP12, 및 USP49가 형질전환된 콜로니에서 청색을 나타냈다.
도 2는 대조군을 사용하여 도 1의 결과를 재확인한 결과를 나타낸다. DNA가 삽입되어있지 않은 공벡터인 pGBT9과 pGAD424 벡터를 음성 대조군으로, 이미 상호작용하는 것으로 알려진 p53과 SV40 large T antigen을 양성 대조군으로 사용하였다. p53 및 SV40 large T antigen이 형질전환된 효모와 USP49와 Bax가 함께 형질전환 된 효모에서 청색 콜로니가 형성된 반면, 음성 대조군이 들어간 효모에선 콜로니가 자라지 못하였다. 이는 두 단백질이 특이적으로 상호작용함을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 의해 제작된 벡터 라이브러리를 사용하여 스크리닝한 결과를 나타내며, USP21과 NANOG이 특이적으로 상호작용함을 알 수 있으며, 이는 종래의 보고(Xingyu Liu et al., USP21 deubiquitylates Nanog to regulate protein stability and stem cell pluripotency, Signal Transduction and Targeted Therapy (2016), 1 e16024)와 일치한다.
도 4는 Bax와 결합하는 탈유비퀴틴화 효소 중 USP12가 Bax와 세포 내에서 결합하는지를 면역침강법을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 293T 세포에 Myc-USP12를 과발현시킨 후, Myc 혹은 Bax 항체를 이용하여 면역침강시켰다. 침강된 단백질에 결합되어 있는 Bax 혹은 Myc-USP12를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 도 5는 USP49와 Bax가 세포 내에서 결합되는 것을 면역침강법을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 293T 세포에 Flag-USP49를 과발현시킨 후, Flag 혹은 Bax 항체를 이용하여 면역침강시켰다. 침강된 단백질에 결합되어 있는 Bax 혹은 Flag-USP49를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 도 4 및 도 5의 결과는 본 발명에 따라 스크리닝을 수행하여 얻어진 Bax 결합 탈유비퀴틴화 효소 USP12, USP49가 in vivo로 세포 내에서 결합함을 나타낸다.
도 6은 GST pull-down assay를 통해 USP12와 Bax가 직접 결합함을 보여준다. 재조합 단백질 GST-Bax를 Myc-USP12가 과발현된 293T 세포 용해물(lysate)과 혼합하여 GST-Bax에 결합되어 있는 Myc-USP12를 확인하였다. 도 7은 USP49가 Bax와 직접 결합함을 도 6에서와 같이 GST pull-down을 수행한 결과를 나타낸다. 도 8은 도 3에서 확인한 NANOG 결합 탈유비퀴틴화 효소 USP21에 대하여 면역침강법을 수행함으로써 두 단백질이 상호작용함을 보여준다. Flag-USP21과 NANOG를 형질주입한 293T 세포를 용해(lysis)한 후, Flag이나 Myc으로 침강한 단백질에 결합한 단백질을 확인하였다. 도 9는 GST pull-down 분석을 통해 USP21과 NANOG가 직접적으로 결합함을 나타낸다.
도 10은 Flag-USP49 및 Myc-Bax를 HCT116 세포에 형질전환시킨 후 IR 조사(IR irradiation)를 처리하였을 때 IR-유도된 세포사멸 과정에서 USP49가 Bax를 조절하는지 여부를 평가한 결과를 나타내며, 도 11은 Flag-USP49 또는 Myc-Bax로 과발현시킨 HCT116 세포를 IR 조사(10 Gy)로 처리한 다음, 6시간 후 세포를 수확하여 USP49가 Bax를 조절함으로써 세포사멸을 촉진시키는지 여부를 평가한 결과를 나타낸다. HCT116 세포에 IR을 조사하였을 때, PARP1의 절단은 증가하였다(도 11의 레인 1 및 5). 사멸 세포에서 Bax에 대한 USP49의 결합 친화성은 증가하였으며, 이는 USP49가 Bax와의 상호작용을 통하여 IR-유도된 세포사멸에 관여한다는 것을 나타낸다(도 10). 따라서, 본 발명자들은 USP49가 Bax의 탈유비퀴틴화를 통하여 IR-유도된 세포사멸을 촉진하는지 여부를 조사하였다. HCT116 세포에서 USP49의 과발현은 IR 조사 후 PARP1의 절단을 증가시켰다(도 11). 그러나, Bax가 과발현된 세포에서 USP49의 과발현은 PARP1의 절단을 추가로 증가시키지 않았다(도 11). 이러한 결과는 USP49가 Bax와의 IR-유도된 세포사멸을 촉진할 수는 없으나, USP49는 IR-유도된 세포사멸 과정에서 프로테오좀-비의존성 경로로 Bax를 조절할 수 있음을 나타낸다.
3. 고찰
여러 가지 다양한 질병의 원인 및 해결책을 알기 위해, 세포 내 신호전달 경로를 확립하고자 많은 연구가 진행되고 있다. 본 발명자들은 단백질의 분해 및 기능을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소에 초점을 맞추어 효과적인 질병 치료제 개발에 기여하고자 하였다. 다양한 신호경로 내에 존재하는 특정 단백질을 조절하여 세포기전을 조절하고자 상호작용하는 탈유비퀴틴화 효소 발굴이 요구된다. 따라서 본 발명에 따른 벡터 라이브러리가 효율적으로 도움을 줄 수 있을 것이라 기대된다. 본 발명자들은 각각의 탈유비퀴틴화 효소를 효모 내에서 발현할 수 있는 DNA 결합 도메인이 포함된 pGBT9 벡터에 삽입하여 라이브러리를 제작하여 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 시스템을 구축하였다. 이 시스템을 시험하기 위해, 세포사멸에 관여하는 Bax 단백질 cDNA를 이용하여 USP1, USP7, USP12, USP49가 결합 탈유비퀴틴화 효소임을 확인함으로써 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있는 치료제 개발에 기여할 것으로 보인다. 이 중 USP12 와 USP49 세포 내에서 상호작용함을 증명함으로써 in vivo에서도 결합함을 증명하였다. 또한 본 발명자는 NANOG 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 스크리닝하였고, 그 결과 USP21이 NANOG을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소라는 것을 알게 되었으며, 면역침강법과 GST pull-down 분석을 통해 in vivo 및 in vitro로 결합함을 증명하였다. 또한, 스크리닝을 통해 얻은 결과가 면역침강법과 GST-pull down 분석을 수행한 결과와 일치하게 나왔으므로 본 스크리닝 플랫폼은 유효성이 있다. 따라서, 본 발명자들이 제작한 라이브러리는 표적단백질과 결합하는 탈유비퀴틴화 효소를 효율적으로 검출할 수 있도록 하며, 본 검출방법을 적용함으로써 효과적인 세포 치료제 및 항암제 개발에 응용될 수 있다.
Claims (6)
- DNA-결합 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP1을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP2를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP3을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP4를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP5를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP6을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP7를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP8을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP10을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP11을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP12를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP14를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP15를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP16을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP17을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP18을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP19를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP20을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP21을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP25를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP28을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP30을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP33을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP34를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP35를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP36을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP37을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP38을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP39를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP44를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터;
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP46을 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터; 및
DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터에 탈유비퀴틴화 효소 USP49를 코딩하는 유전자를 삽입하여 얻어진 벡터
를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리. - 제1항에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인을 갖는 공 벡터가 pGBT9 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터 라이브러리.
- (a) 전사활성 도메인을 갖는 공(empty) 벡터에 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 벡터를 제작하는 단계;
(b) 제1항 또는 제2항에 따른 벡터 라이브러리의 각각의 벡터 및 단계(a)에서 제작된 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 얻어진 효모를 X-gal을 함유하고 트립토판 및 류신이 비함유된 배지 중에서 배양하는 단계
를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법. - 제3항에 있어서, 상기 전사활성 도메인을 갖는 공 벡터가 pGAD424 벡터인 것을 특징으로 하는 동정방법
- (i) 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49 및 Bax 단백질을 과발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및
(ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계
를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법. - 제5항에 있어서, 단계(i)의 탈유비퀴틴화 효소가 USP49 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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