KR20240020743A - 신규의 Bax 변이체 및 이를 포함한 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체; Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법; 및 상기 Bax 단백질 변이체를 포함하는 약학 조성물 및 항암 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 유비퀴틴화를 통한 단백질 분해기작을 억제할 수 있으며, 야생형 Bax에 비해 높은 반감기를 나타낸다.
Description
본 발명은 세포사멸 단백질인 Bax 단백질의 변이체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 Bax 단백질의 하나 이상의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환한 Bax 단백질의 변이체; Bax 단백질의 하나 이상의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법; 및 상기 Bax 단백질 변이체를 포함하는 약학 조성물 및 항암 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포사멸(apoptosis)은 프로그램된 세포사멸로서, 외부 및 내부 신호 전달 경로에 의존한다. 외부 경로는 세포 표면의 사멸 수용체에 의해 개시되는 반면, 내부 경로는 UV 손상, 저산소증, 산화 스트레스 및 DNA 손상과 같은 스트레스 신호에 의해 개시된다. 스트레스 신호는 미토콘드리아 수준에서 전구-세포사멸성 단백질(pro-apoptotic protein)에 의해 시작되는 사포사멸 경로를 유도한다.
Bax 단백질은 Bcl-2 계열에 속하는 전구-세포사멸성 단백질이며, 미토콘드리아에서 세포사멸 유도에 관여한다. 세포질에서 비활성(non-apoptosis) 상태인 Bax는 Bak과의 올리고머화 후에 미토콘드리아 외막의 전위(translocation)를 개시함으로써, 미토콘드리아 외막 투과도(MOMP)를 증가시킨다(Pena-Blanco, A. et al., Bax, Bak and beyond-mitochondrial performance in apoptosis. FEBS J 2018, 285, 416-431, doi:10.1111/febs.14186; Grosse, L. et al., Bax assembles into large ring-like structures remodeling the mitochondrial outer membrane in apoptosis. EMBO J 2016, 35, 402-413, doi:10.15252/embj.201592789). 이후, 내막에 위치한 단백질 시토크롬 C가 세포질로 이동한다(Danial, N.N. et al., Cell death: critical control points. Cell 2004, 116, 205-219, doi:10.1016/s0092-8674(04)00046-7). 시토크롬 C는 프로카스파제 9(pro-caspase-9)의 활성화에 중요한 역할을 하며, 카스파제-3, -6, -7의 활성화 및 세포사멸을 유도한다(Slee, E.A. et al., Serial killers: ordering caspase activation events in apoptosis. Cell Death Differ 1999, 6, 1067-1074, doi:10.1038/sj.cdd.4400601; Kuribayashi, et al., What are caspases 3 and 7 doing upstream of the mitochondria? Cancer Biol Ther 2006, 5, 763-765, doi:10.4161/cbt.5.7.3228).
따라서, Bax 단백질은 내인성(intrinsic) 세포사멸 경로의 개시자이며, Bax의 효과적인 제어는 세포사멸의 제어에 대한 효과적인 접근을 제공할 수 있다. 본 발명자들은 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49가 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있는 Bax 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 밝혀낸 바 있다(대한민국 특허등록 제10-2282107호 등).
본 발명자들은 Bax 단백질의 유비퀴틴화 기전을 밝혀내기 위해 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, Bax 단백질의 특정 아미노산 잔기, 즉 Bax 단백질의 128번 및/또는 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환한 단백질 변이체의 유비퀴틴화(ubiquitination)가 억제될 뿐만 아니라, 반감기가 유의성 있게 증가한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 Bax 단백질 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 Bax 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 Bax 단백질 변이체를 사용한 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체가 제공된다. 상기 Bax 단백질 변이체는 서열번호 3, 5, 또는 6의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 Bax 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 상기 고형암은 위암, 간암, 폐암, 유방암, 난소암, 대장암 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체 및 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 유비퀴틴화를 통한 단백질 분해기작을 억제할 수 있으며, 야생형(wild type) Bax에 비해 유의성 있게 증가한 반감기를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라, 야생형 Bax 단백질을 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체로 전환할 경우 Bax 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 변이체는, 암세포의 효과적인 세포사멸을 통하여, 고형암 치료를 위한 표적 항암제에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 변이체는 암세포의 세포사멸 촉진 및 치료 개발을 위한 표적으로서 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 스크리닝 방법은 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 및 USP49와 Bax 단백질의 상호작용을 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 Bioinformatics 및 PyMol을 이용하여 Bax 단백질의 유비퀴틴화 예상 부위(K128, K189, K190)를 포함한 단백질 구조를 나타낸다.
도 2은 HA-표지된 유비퀴틴 및 Myc로 각각 표지된 야생형 Bax 또는 Bax 변이체(Bax K128R, Bax K189R, 또는 Bax K190R)를 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과(좌측 패널)와 Myc 항체로 면역침강법을 수행한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 3은 야생형 Bax 또는 Bax 변이체(Bax K128R 또는 Bax K190R)를 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 뒤 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)를 처리한 후, 0시간부터 24시간까지의 Bax 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과로부터 0시간부터 24시간까지의 상대적인 Bax 발현량을 계산한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 Mock 벡터, 야생형 Bax, Bax K128R 및 Bax K190R 각각을 HeLa 세포에 형질감염시킨 뒤, 0, 24, 48 시간에 세포를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2은 HA-표지된 유비퀴틴 및 Myc로 각각 표지된 야생형 Bax 또는 Bax 변이체(Bax K128R, Bax K189R, 또는 Bax K190R)를 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과(좌측 패널)와 Myc 항체로 면역침강법을 수행한 결과(우측 패널)를 나타낸다.
도 3은 야생형 Bax 또는 Bax 변이체(Bax K128R 또는 Bax K190R)를 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 뒤 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)를 처리한 후, 0시간부터 24시간까지의 Bax 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과로부터 0시간부터 24시간까지의 상대적인 Bax 발현량을 계산한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 Mock 벡터, 야생형 Bax, Bax K128R 및 Bax K190R 각각을 HeLa 세포에 형질감염시킨 뒤, 0, 24, 48 시간에 세포를 관찰한 결과를 나타낸다.
Bax에서 유비퀴틴화 가능성이 높은 것으로 추정되는 부위를 찾기 위해 BDM PUB(http://bdmpub.biocuckoo.org/), jci-bioinfo(http://www. jci-bioinfo.cn), RUBI(http://old.protein.bio.unipd.it/rubi/) 및 Netchop(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop)을 참조하여 목록화(short-listed)하였으며, PyMol 프로그램(https://pymol.org/2/)을 사용하여 사용하여 Bax 표면의 라이신 잔기들을 최종적으로 선택하였다. 이후, Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/)로부터 Bax 단백질의 구조 분석을 수행하였으며, 선택된 라이신들이 Bax 단백질의 표면에 있음을 확인하여 128번 및 190번의 라이신 부위가 Bax 단백질의 유비퀴틴화와 관련될 수 있다는 것(즉, 유비퀴틴 (ubiquitin)의 C-말단의 글라이신과 결합할 수 있다는 것)을 밝혀냈다.
상기 결과로부터 본 발명자들은 상기 라이신 부위들에 대한 보존적 아미노산 치환, 즉 염기성 측쇄를 포함하는 아르기닌으로의 치환을 수행하였다. 즉, 128번, 189번, 및 190번 라이신을 각각 아르기닌으로 치환한 Bax 변이체[즉, Bax K128R(서열번호 3의 단백질), Bax K189R(서열번호 4의 단백질), 및 Bax K190R(서열번호 5의 단백질)]를 제작하였으며, 이들 변이체 중 Bax K128R(서열번호 3의 단백질) 및 Bax K190R (서열번호 5의 단백질)이 유비퀴틴화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인하였다. 또한, Bax K128R(서열번호 3의 단백질) 및 Bax K190R(서열번호 5의 단백질)을 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)로 처리하여 단백질의 반감기를 확인한 결과, 야생형(wild type) Bax에 비해 높은 반감기를 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 상기 변이체는, 암세포의 효과적인 세포사멸을 통하여, 고형암 치료를 위한 표적 항암제에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명은 Bax 단백질(서열번호 1의 아미노산)의 변이체를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체를 제공한다.
Bax 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기서열은 모두 공지되어 있으며, 예를 들어, Bax 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같고, 이를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2와 같다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서 128번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다.
본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, 하기 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여, Bax 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자)를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 128번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체를 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어, 하기 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여, Bax 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자)를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체를 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 128번의 라이신을 아르기닌으로 치환(즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질을 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체로 전환)하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환(즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질을 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체로 전환)하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환(즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질을 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체로 전환)하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변이체는, 암세포의 효과적인 세포사멸을 통하여, 고형암 치료를 위한 표적 항암제에 유용하게 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 Bax 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 고형암은 위암, 간암, 폐암, 유방암, 난소암, 대장암 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기와 같이 상기 Bax 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 제제학적 방법에 따라 주사제, 주사용 동결건조제제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균된 수용액(예를 들어, 생리식염수 등), 비수성용제 등을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 적절한 안정화제, 등장화제, 보존제 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학조성물에 유효성분으로서 함유되는 상기 Bax 단백질 변이체의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여경로 및 기간에 따라 상이하며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 Bax 단백질 변이체는 1일 투여량으로서 0.1 ∼ 1,000 mg/kg의 투여량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
Bax의 발현 수준은 악성 전환(malignant transformation), 종양 생성(tumor progression), 및 전이와 관련되며, 따라서 Bax의 낮은 발현은 암 질환에 있어서 음성 인자(negative factor)로서 간주된다. 감소된 수준의 Bax 분해는 침습적인 전립선암에서 나타난다. 따라서, 본 발명에 따른 Bax 단백질 변이체는 탈유비퀴틴화 효소(예를 들어, USP1, USP7, USP12, 및 USP49)와 Bax 단백질의 상호작용을 표적으로 하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
즉, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체 및 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 Bax 단백질 변이체는 서열번호 3, 5, 또는 6의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 시험방법
(1)
유비퀴틴화
부위의 선별 및
변이체의
제작
하기 3개의 웹사이트(표 1)를 통하여 bioinformatics 분석을 수행하여 Bax 단백질의 유비퀴틴화 부위 후보군을 분석하고, PyMol 프로그램(https://pymol.org/2/)을 사용하여 사용하여 Bax 표면의 라이신 잔기들을 최종적으로 분석하였다. 분석 결과, 128번, 189번, 및 190번 라이신이 가장 많이 반복적으로 나타나는 아미노산 잔기, 즉 효율이 가장 높은 아미노산 잔기로 나타났으며, 이를 유비퀴틴화 부위 후보군으로 하였다.
| 유비퀴틴화 예측 부위(Ubiquitination Prediction Sites) |
| http://bdmpub.biocuckoo.org/ |
| http://www. jci-bioinfo.cn), RUBI(http://old.protein.bio.unipd.it/rubi/ |
| http://old.protein.bio.unipd.it/rubi/ |
HeLa 세포주로부터 총 RNA를 추출하고, 이를 통해 cDNA를 합성하였다. 이후 하기 표 2의 프라이머 세트(서열번호 13 및 14)를 이용하여 Bax cDNA 밴드를 검출하였다. Bax 유전자(서열번호 2의 유전자)는 pcDNA3.1-6myc 발현벡터에 클로닝하여 사용하였다. 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용하여 Bax 단백질의 128번, 189번, 또는 190번 라이신을 각각 아르기닌으로 치환한 Bax 변이체를 제작하였다. 구체적으로, 각각의 변이체는 야생형 Bax 유전자(서열번호 2의 유전자)를 주형으로 하고, 각각의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. Bax K128R 변이체의 경우, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 68℃에서 5분으로 총 12 사이클을 수행하였다. Bax K189R 변이체 및 Bax K190R 변이체의 경우, 95℃에서 30초, 54.4℃에서 30초, 및 68℃에서 5분으로 총 12 사이클을 수행하였다.
| 변이체 | 서열번호 | 서열 | |
| Bax K128R | 7 | 정방향 | 5'- TGC ACC AGG GTG CCG GAA -3' |
| 8 | 역방향 | 5'- TTC CGG CAC CCT GGT GCC -3' | |
| Bax K189R | 9 | 정방향 | 5'- ATC TGG AGG AAG ATG GGC -3' |
| 10 | 역방향 | 5'- GCC CAT CTT CCT CCA GAT -3' | |
| Bax K190R | 11 | 정방향 | 5'- ATC TGG AAG AGG ATG GGC -3' |
| 12 | 역방향 | 5'- GCC CAT CCT CTT CCA GAT -3' | |
| Bax (야생형) | 13 | 정방향 | 5'- ATG GAC GGG TCC GGG GAG -3' |
| 14 | 역방향 | 5'- TCA GCC CAT CTT CTT CCA -3' | |
(2) 형질감염(transfection)
HeLa 세포를 10% 소태아혈청(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 형질감염을 위해, 600 μl의 NaCl과 폴리에틸렌이민 시약(PEI, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) 14 μl, pcDNA3.1 6myc-Bax의 야생형 또는 변이체 DNA 2 μg을 혼합하여 상온에서 15분 반응시키고, HeLa 세포(1x106 세포)가 담긴 6 ml의 배양액에 혼합액을 넣어준 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
(3) 면역침강
형질감염된 세포를 용액 완충액(lysis buffer)(50 mM Tris-HCl[pH 7.5], 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 300 mM NaCl 및 1% Triton X-100)에 얼음에서 20분간 용해시킨 후, 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 항체(Myc 항체)를 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, A/G PLUS 아가로스 비드(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 넣고 4℃ 로테이터에서 2시간 동안 반응시켰다. 샘플을 세척 완충액(PMSF 및 PIC 1:100이 포함된 용해 완충액)으로 2회 세척하고, 2X SDS 단백질 로딩 완충액과 함께 7분 동안 끓인 후, 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 웨스턴 블롯팅을 진행하였다.
(4) 웨스턴 블롯팅
형질감염된 세포를 용액 완충액(lysis buffer)(50 mM Tris-HCl[pH 7.5], 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 300 mM NaCl 및 1% Triton X-100)에 얼음에서 20분간 용해시킨 후, 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 2X SDS 단백질 로딩 완충액과 함께 7분 동안 끓인 후, 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 폴리비닐리덴 플루오라아드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 미세다공성 막(Millipore, billerica, MA, USA)에 옮겼다. 상기 막을 소혈청 알부민(bovine seum albumin, KE, AU)을 이용하여 1시간 동안 블록킹한 후, 1차 항체(HA 항체 및 Myc 항체)를 상기 막과 함께 4℃에서 밤새 반응시키고, TBS-T(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1%(V/V) Tween 20)로 세척하고, 마우스 2차 항체(SERACARE, Milford, MA, USA)(1:30,000 , 1% Skim milk)를 가하고, 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. ECL 시약 용액(Young In Frontier, Seoul, Korea)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
(5) 항체
야생형 Bax 또는 Bax 변이체를 표지하기 위한 Myc 항체는 9E10 세포를 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 배양액을 모아 0.22 μM 필터에 필터링하여 사용하였다. 또한, 유비퀴틴화 효소를 표지하기 위한 HA 항체는 12CA5 세포를 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 RPMI(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 배양액을 모아 0.22 μM 필터에 필터링하여 사용하였다.
(6) 단백질 반감기 측정
야생형 Bax 단백질과 라이신이 치환된 Bax 단백질들의 반감기를 비교, 측정하기 위해, 야생형과 라이신 치환 Myc-Bax를 HeLa 세포에 형질간염시키고, 24 시간 후에 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드를 100 μM 농도로 처리하여, 0 시간부터 24 시간까지(0, 12, 18, 24 시간) 세포를 모은 후, 웨스턴 블롯팅을 진행하였다.
(7) 세포사멸능 확인
반감기가 증가된 Bax 변이체가 야생형과 유사한 세포사멸 능력을 가졌는지 확인하기 위하여 Mock 벡터, 야생형 Myc-Bax, 변이체 Myc-Bax K128R, Myc-Bax K190R을 HeLa 세포에 형질감염시킨 후, 0, 24, 48 시간에 세포의 상태를 현미경을 통해 관측하였다.
(8) 도출된 결과 확인 및 통계 분석
덴시토메터 분석(Densitometric analysis)은 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 수행하였고, t-test는 GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 수행하였다.
2. 시험결과 및 고찰
(1) 유비퀴틴화 예상 부위(K128, K189, K190)를 포함한 Bax 단백질 구조
도 1은 상기와 같이 Bioinformatics 및 PyMol을 이용하여 Bax 단백질의 유비퀴틴화 예상 부위(K128, K189, K190)를 포함한 단백질 구조를 나타낸다.
(2) 웨스턴 블롯팅/면역침강 분석을 통한 발현 분석
HA-표지된 유비퀴틴화 효소 및 Myc로 각각 표지된 야생형 Bax 또는 Bax 변이체(Bax K128R, Bax K189R, 또는 Bax K190R)를 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과는 도 2와 같다(도 2의 좌측 패널). 또한, Myc 항체를 사용하여 면역침강법을 수행하였으며, 그 결과는 도 2와 같다(도 2의 우측 패널). 도 2의 결과로부터, Bax K128R 및 Bax K190R은 유비퀴틴화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인할 수 있다.
(3) 단백질 합성 억제제 처리에 따른 Bax 발현 분석
야생형 Bax, Bax K128R 및 Bax K190R 각각을 HeLa 세포에 형질감염(transfection)한 뒤 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)와 함께 처리하였다. 0시간부터 24시간까지의 Bax 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 또한, 도 3의 결과로부터 0시간부터 24시간까지의 상대적인 Bax 발현량을 계산한 결과는 도 4와 같다. 도 3 및 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 24시간 때 야생형 Bax의 발현량을 1로 보았을 때, Bax K128R의 발현량은 1.817264, Bax K190R의 발현량은 1.982131로 야생형 Bax에 비해 약 2배 높은 반감기를 나타내었다. 따라서, Bax K128R 및 Bax K190R는 반감기가 더 길게 유지되는 것을 확인할 수 있다.
(4) 야생형 Bax와 Bax 변이체의 세포사멸능 비교 분석
Mock 벡터, 야생형 Bax, Bax K128R 및 Bax K190R 각각을 HeLa 세포에 형질감염(transfection)시킨 뒤, 0, 24, 48 시간에 세포를 관찰한 결과는 각각 도 5a 내지 도 5c와 같다. 세포사멸 기능을 가지는 Bax가 형질감염 되었을 때 시간이 지남에 따라서 Mock 벡터 대조군과 비교하였을 때 세포의 수가 적어지는 것을 확인할 수 있다. 또한, Bax의 라이신 부위를 치환시킨 Bax K128R 및 Bax K190R을 형질감염시킨 실험군에서도 세포사멸이 관측되었다는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Bax의 변이체는 Bax 고유의 세포사멸능을 보유하고 있음을 알 수 있다.
Claims (11)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질 변이체.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 128번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질의 128번 및 190번의 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것을 포함하는 Bax 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 Bax 단백질 변이체를 유효성분으로 포함하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 고형암이 위암, 간암, 폐암, 유방암, 난소암, 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Bax 단백질에 있어서, 128번의 라이신; 190번의 라이신; 또는 128번 및 190번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Bax 단백질 변이체 및 탈유비퀴틴화 효소 USP1, USP7, USP12, 또는 USP49을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및
(ii) 단계(i)에서 배양된 세포의 사멸 여부를 측정하고, 세포의 사멸을 유도하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법.
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