JP2002522029A - コートタンパク質の改変によるファージ提示における改良した形質転換効率 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 エレクトロポレーションのトランスフォーメーション収率を、より高いＤＮＡ濃度及びＤＮＡ親和力精製を用いることによって増大させた。ウイルスコートタンパク質異型及び異種ポリペプチドの融合タンパク質は、ファージ提示システムにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の領域 本発明は、ポリペプチドと野生型コートタンパク質ではないウイルスのコート
タンパク質との融合タンパク質に関する。本発明は、融合タンパク質をコードす
る遺伝子を含有する複製可能発現ベクター、発現ベクターを含有する宿主細胞、
ウイルスの表面上に融合タンパク質を提示するウイルス、ウイルス表面上に異な
る融合タンパク質の複数個を提示するウイルスのライブラリー、及びこれらの組
成物を使用する方法にも関する。

【０００２】 本発明は、形質転換効率を改良するため、細胞を電気穿孔することにより細胞
を形質転換する方法にも関する。様々な好ましい実施態様において、形質転換は
、高濃度のＤＮＡの存在下で、高濃度の細胞の存在下で、高度に精製されたＤＮ
Ａを用いて、特定の宿主細胞を用いて、又はこれらの組み合わせを用いて、実施
される。ライブラリー、例えばファージ提示ライブラリーを調製するために使用
される場合には、これらの改良は、従来可能であったものに比べて大きいライブ
ラリーを１回の電気穿孔工程で構築することを可能にする。本発明は、本発明の
方法を用いる宿主細胞を形質転換することにより産物ポリペプチドを作製する方
法にも関する。

【０００３】 背景の説明 バクテリオファージ（ファージ）提示は、異型ポリペプチドがコートタンパク
質との融合タンパク質としてバクテリオファージ粒子の表面上に提示される技術
である（Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249:386）。ファージ
提示の有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質異型（又はランダムにク
ローニングされたｃＤＮＡ）の大きいライブラリーを、高親和性で標的分子と結
合する配列に関して迅速かつ効率的にソートすることができるという事実にある
。ペプチドライブラリー（Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 87:6378）又はタンパク質ライブラリー（Lowman, H. B. et al. (1991)
Biochemistry, 30:10832、Clackson, T. et al(1991) Nature, 352:624、Marks
, J. D. et al. (1991)J. Mol. Biol., 222:581、Kang, A. S. et al. (1991) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）のファージ上の提示は、特異的な結合特
性を有するポリペプチドに関して非常に多数のポリペプチドをスクリーニングす
るために使用されている（Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2
:668）。ランダムな突然変異体のファージライブラリーのソーティングは、多数
の異型を構築し増殖させるための方策、標的受容体を使用したアフィニティ精製
の手法、及び結合強化の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５，２２
３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８
９号、米国特許第５，６６３，１４３号。

【０００４】 典型的には、異型ポリペプチドを、ビリオンの一端に提示される遺伝子IIIタ
ンパク質と融合させる。又は、異型ポリペプチドを、ビリオンの主要コートタン
パク質である遺伝子VIIIタンパク質と融合させてもよい。そのような多価提示ラ
イブラリーは、ファージ遺伝子IIIを、遺伝子IIIタンパク質のアミノ末端と融合
した外来配列をコードするｃＤＮＡと交換することにより構築される。これは、
ファージが複数の点接着によって標的と結合することができるという親和力効果
のため、ライブラリーから高親和性異型をソートすることを困難にする場合があ
る。さらに、遺伝子IIIタンパク質は、宿主、例えばE.coliにおけるファージの
接着及び増殖に必要であるため、融合タンパク質は子孫ファージ粒子の感染性を
劇的に減少させることができる。

【０００５】 これらの問題を克服するため、タンパク質又はペプチドの配列は、遺伝子III
タンパク質の一部分に融合しており、そして野生型遺伝子IIIタンパク質の存在
下では低レベルで発現され、粒子が大多数の野生型遺伝子IIIタンパク質及び１
コピーの融合タンパク質を提示するか又は全く提示しない、一価ファージ提示が
開発された（Bass, S. et al. (1990) Proteins, 8:309、Lowman, H. B. and We
lls, J. A. (1991)Methods: a Companion to Methods in Enzymology, 3:205）
。一価提示は、子孫ファージミド粒子が完全な感染性を保持しているという点で
多価ファージ提示に対して利点を有する。親和力効果が減少するため、ソーティ
ングは固有リガンド親和性に基づき行われ、そしてＤＮＡ操作を単純化するファ
ージミドベクターが使用される。米国特許第５，７５０，３７３号及び米国特許
第５，７８０，２７９号も参照せよ。他の研究者も、タンパク質、特に抗体を提
示するためにファージミドを用いる。米国特許第５，６６７，９８８号、米国特
許第５，７５９，８１７号、米国特許第５，７７０，３５６号、及び米国特許第
５，６５８，７２７号。

【０００６】 Ｍ１３ファージ上に提示されたペプチドライブラリーから高親和性リガンドを
選択するためには、２工程法が使用されている。最初に、主要コートタンパク質
（タンパク質VIII）上に提示された自然の多価ライブラリーから、低親和性リー
ドを選択した。続いて、低親和性選択体を遺伝子III微量コートタンパク質に移
し、一価フォーマットで高親和性に成熟させた。残念なことに、この方法をペプ
チドからタンパク質に拡張することは困難である。タンパク質VIII上の提示レベ
ルは融合体の長さ及び配列によって様々である。一般的に、融合体のサイズが増
加すると、提示は減少する。従って、一価ファージ提示は、多くの異なるタンパ
ク質の親和性成熟のため使用されており、タンパク質VIII上の多価提示は、大部
分のタンパク質骨格に適用可能である。

【０００７】 大部分のファージ提示法が繊維状ファージを用いるは、ラムドイドファージ提
示システム（国際特許公開第９５／３４６８３号；米国特許第５，６２７，０２
４号）、Ｔ４ファージ提示システム（Ren, Z-J. et al. (1998) Gene 215:439、
Zhu, Z. (1997)CAN 33:534、Jiang, J. et al. (1997)can 128:44380、Ren, Z-J
. et al. (1997)CAN 127:215644、Ren, Z-J. et al. (1996)Protein Sci. 5:183
3、Efimov, V. P. et al. (1995)Virus Genes 10:173）及びＴ７ファージ提示シ
ステム（Smith, G. P. and Scott, J. K. (1993)Methods in Enzymology, 217,
228-257;米国特許第５，７６６，９０５号）も既知である。

【０００８】 現在では、基本的なファージ提示概念のその他の多くの改良及び変形が開発さ
れている。これらの改良は、提示システムの、選択された標的分子との結合に関
してペプチドライブラリーをスクリーニングする能力、及び所望の特性に関して
これらのタンパク質をスクリーニングする可能性を有する機能的なタンパク質を
提示する能力を増強する。ファージ提示のためのコンビナトリアル反応装置が開
発され（国際特許公開第９８／１４２７７号）、二分子相互作用（国際特許公開
第９８／２０１６９号、国際特許公開第９８／２０１５９号）及び抑制されたヘ
リックスペプチドの特性（国際特許公開第９８／２００３６号）を分析し調節す
るために、ファージ提示ライブラリーが使用されている。国際特許公開第９７／
３５１９６号は、リガンドが標的分子と結合する１つの溶液及び親和性リガンド
が標的分子と結合しない別の溶液とファージ提示ライブラリーを接触させ、親和
性リガンドを単離し、結合するリガンドを選択的に単離する方法を記載している
。国際特許公開第９７／４６２５１号は、アフィニティ精製された抗体を用いて
ランダムファージ提示ライブラリーをバイオパンニングし、次いで結合ファージ
を単離し、その後高親和性結合ファージを単離するためマイクロプレートウェル
を用いる微小パンニング過程を行う方法を記載している。アフィニティタグとし
てのスタフィロコッカスアウレウス（Staphlylococcus aureus）プロテインＡの
使用も報告されている（Li et al. (1998)Mol Biotech., 9:187）。国際特許公
開第９７／４７３１４号は、ファージ提示ライブラリーであってもよいコンビナ
トリアルライブラリーを用いる酵素の特異性を区別するための基質サブトラクシ
ョンライブラリーの使用を記載している。ファージ提示を用いる界面活性剤にお
ける使用に適した酵素を選択する方法は、国際特許公開第９７／０９４４６号に
記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法は、米国特許第
５，４９８，５３８号、米国特許第５，４３２，０１８号、及び国際特許公開第
９８／１５８３３号に記載されている。

【０００９】 ペプチドライブラリーを生成させ、これらのライブラリーをスクリーニングす
る方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号
、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、及び米
国特許第５，４９８，５３０号に開示されている。米国特許第５，７７０，４３
４号、米国特許第５，７３４，０１８号、米国特許第５，６９８，４２６号、米
国特許第５，７６３，１９２号、及び米国特許第５，７２３，３２３号も参照せ
よ。

【００１０】 ファージの感染性を改変する方法も既知である。国際特許公開第９５／３４６
４８号及び米国特許第５，５１６，６３７号は、宿主細胞のピリンタンパク質と
の融合タンパク質として標的タンパク質を提示する方法（ここで、ピリンタンパ
ク質は、好ましくは提示ファージの受容体である）を記載している。米国特許第
５，７１２，０８９号は、細菌にリガンドを発現するファージミドを感染させ、
次いで野生型タンパク質IIIを含有するがタンパク質IIIをコードする遺伝子は含
有しないヘルパーファージを細菌に重感染させ、その後、産生されたファージ上
に提示された第一リガンドと第二リガンドが結合するようタンパク質III−第二
リガンドを添加することを記載している。国際特許公開第９６／２２３９３号も
参照せよ。非感染性ファージ及び感染性媒介複合体を使用した選択的感染性ファ
ージ系も既知である（米国特許第５，５１４，５４８号）。

【００１１】 リガンドを提示するファージシステムは、リガンドに結合するポリペプチドの
試料（国際特許公開第９７／４４４９１号）及び動物（米国特許第５，６２２，
６９９号）における存在を検出するためにも使用されている。哺乳動物細胞の表
面と選択的に結合するファージを使用した遺伝子治療（国際特許公開第９８／０
５３４４号）及びドラッグデリバリー（国際特許公開第９７／１２０４８号）の
方法も、提唱されている。

【００１２】 さらなる改良は、ファージ提示システムは、抗体及び抗体断片をバクテリオフ
ァージ表面上に発現することを可能にし、特異的な特性、即ち特異的なリガンド
との結合の選択（欧州特許第８４４３０６号、米国特許第５，７０２，８９２号
、米国特許第５，６５８，７２７号）及び抗体ポリペプチド鎖の組み換え（国際
特許公開第９７／０９４３６号）を可能にした。特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体
を認識する抗体を生成させる方法も開発されている（国際特許公開第９７／０２
３４２号）。米国特許第５，７２３，２８７号、米国特許第５，５６５，３３２
号、及び米国特許第５，７３３，７４３号も参照せよ。

【００１３】 米国特許第５，５３４，２５７号は、最大約３０残基の外来エピトープがＭＳ
−２ファージのカプシドタンパク質に組み込まれている発現系を記載している。
このファージは、適切な細菌宿主においてキメラタンパク質を発現し、ファージ
ＲＮＡ及びその他の核酸夾雑物を含まない空のファージ粒子を生じることができ
る。空のファージはワクチンとして有用である。

【００１４】 バクテリオファージ粒子の表面上の融合タンパク質としてのポリペプチドの発
現の程度は様々であり、それは、ある程度ポリペプチドのサイズに依存する。従
来のファージ提示システムは、野生型ファージコートタンパク質を使用し、野生
型アミノ酸配列のアミノ末端又は野生型コートタンパク質配列の断端から生じた
アミノ末端と、異種ペプチドを融合させる。選択及び標的結合を改良するため、
野生型コートタンパク質配列のアミノ末端に、リンカーアミノ酸のセグメントも
付加されている。

【００１５】 ファージ技術の多数の修飾及び改良にもかかわらず、ファージ提示法において
融合タンパク質としてポリペプチドを提示する改良された方法が依然として必要
とされている。

【００１６】 新たなＤＮＡを導入するため細胞を形質転換する方法は、分子生物学及び現代
遺伝子工学において実用上非常に重要である。初期の方法は、金属イオン、一般
的には塩化カルシウムの溶液で細菌を化学的に処理し、その後加熱し、レシピエ
ント細菌として機能することができ、多様な起源に由来する異種ＤＮＡを取り込
むことができるコンピテント細菌を作製することを含んでいた。これらの初期の
プロトコールは、プラスミドＤＮＡ１μg当たり約１０⁵〜１０⁶個の形質転換コ
ロニーという形質転換収率を提供した。異なる陽イオン、より長い処理時間、及
びその他の化学薬品を使用したその後の改良は、最大約１０⁸コロニー／ＤＮＡ
１μgという形質転換効率の改良を可能にした。Sambrook et al., Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual, 第２版, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1. 74頁。

【００１７】 高電圧電気穿孔を用いて、細胞を形質転換することもできる。電気穿孔は、真
核細胞（例えば、動物細胞、植物細胞等）及び細菌、例えばE.coliにＤＮＡを導
入するのに適している。サンブルック（Sambrook）ら（前記）、１．７５、１６
．５４〜１６．５５頁。異なる細胞型は、最適な電気穿孔のため異なる条件を必
要とし、一般的には発現又は形質転換の許容レベルを見出すために予備実験が実
施される。哺乳動物細胞の場合、２５０〜７５０V/cmの電圧により２０〜５０％
の細胞が生存する。１〜４０μg/mlというＤＮＡ濃度を使用した、室温から０℃
以下の温度における、２０〜１００msの電気パルス長は、典型的なパラメータで
ある。トランスフェクション効率は、細胞が非イオン性溶液に懸濁されている場
合に比べて、直鎖状ＤＮＡを使用しそして緩衝塩溶液に懸濁している場合の方が
高いことが報告されている。サンブルックら（前記）、１６．５４〜１６．５５
頁。

【００１８】 Dower et al., 1988, Nucleic Acids Research, 16:6127-6145は、高電圧電気
穿孔によるE.coliの高効率形質転換を詳細に研究した。この研究は、形質転換体
の回収、精度、再現性等に対する電場の強さ及びパルス長の効果、ＤＮＡ濃度及
び細胞濃度の効果のような電気的変数を含む多数のパラメータを評価し、E.coli
細胞の高効率電気形質転換のためのプロトコールを提供した。ダウアー（Dower
）らの最適化されたプロトコールは、少なくとも２×１０¹⁰/mlそして最大４×
１０¹⁰/mlの範囲に濃縮された細胞、約１μg/mlから１０μg/mlのＤＮＡ濃度、
１２．５〜１６．７ｋV/cm、３〜２５μＦを使用し、電気穿孔は０℃（氷温）で
実施される。これらの研究は、高い形質転換効率を与えることが既知である高度
に精製された閉環プラスミドＤＮＡを用いて実施された。ダウアーらは、これら
のパラメータを高度に最適化することにより達成された１０⁹〜１０¹⁰形質転換
体／ＤＮＡ１μgという形質転換効率を報告している。ダウアーらは、ライブラ
リー形成のためには、共形質転換体を最少限に抑えるため、１０ナノグラム/ml
未満のＤＮＡ濃度及び３×１０¹⁰を超える細胞濃度を使用することを提案してい
る。ウォング（Wong）の米国特許第４，９１０，１４０号及び米国特許第５，１
８６，８００号も参照せよ。

【００１９】 電気穿孔装置の設計を改良するため（例えば、米国特許第５，１７３，１５８
号、米国特許第５，０９８，８４３号、米国特許第５，４２２，２７２号、米国
特許第５，２３２，８５６号、及び米国特許第５，２８３，１９４号を参照せよ
）、及び特定の細胞の電気穿孔を改良するため（米国特許第５，１２８，２５７
号を参照せよ）、いくつかの試みがなされた。米国特許第５，１２４，２５９号
は、電気穿孔のための改良された緩衝液を記載している。米国特許第４，９５６
，２８８号は、高コピー数の外来ＤＮＡを含有する細胞を作製するための方法を
記載している。

【００２０】 電気穿孔パラメータを最適化することによる、より高い形質転換効率の達成は
、困難である。より高い電圧及びより長いパルスの使用は、細胞死の増加、形質
転換細胞の総数の減少を引き起こす。高度に最適化された電気穿孔ですら、約５
０〜７５％の細胞死を引き起こす。ダウアーらは、電気穿孔のパラメータの重要
な調査を提示し、この文献に記載されたプロトコールは、より最近の電気穿孔の
基礎を形成した。

【００２１】 電気穿孔を含む細胞形質転換の重要な新たな用途は、ペプチド及びタンパク質
の異型ライブラリーの調製である。これらの適用においては、複製可能転写ベク
ター、例えばプラスミドを、プラスミドＤＮＡが開裂するよう制限酵素と反応さ
せ、それぞれが異なる異型をコードするベクターのライブラリーを形成するため
所望のクローニングＤＮＡをプラスミドとライゲートさせ、一つ又は複数の残基
でアミノ酸配列が異なるポリペプチド異型のライブラリーを調製するため形質転
換ベクターのライブラリーで細胞を形質転換する。ペプチドのライブラリーは、
特定の特性を有するペプチド又は有しないペプチドに関して選択的にパンニング
されうる。一般的な特性は、固体支持体に結合していてもよい細胞表面受容体、
抗体、リガンド又はその他の結合パートナーと結合する異型ペプチドの能力であ
る。異型は、特異的反応を触媒する能力、反応を阻害する能力、酵素を阻害する
能力等に関しても選択されうる。

【００２２】 一つの適用において、ペプチド異型のライブラリーをコードするファージベク
ターＤＮＡで宿主細胞を形質転換することにより、ファージ提示ライブラリーを
作出するため、繊維状ファージのようなバクテリオファージ（ファージ）が使用
される。J. K. Scott and G. P. Smith, Science, (1990), 249:386-390。ファ
ージミドベクターもファージ提示のため使用されうる。Lowman and Wells, 1991
, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205-216。ペプチド及
びタンパク質、例えば抗体のファージ提示ライブラリー及びファージミド提示ラ
イブラリーの調製は、現在当分野において周知である。これらの方法は、一般的
に、ファージ粒子の表面上に提示された異型ペプチド又は異型タンパク質を１コ
ピー又は複数コピー有するファージ粒子としてライブラリーを増殖させるため、
ファージベクターＤＮＡ又はファージミドベクターＤＮＡで細胞を形質転換する
ことを必要とする。例えば、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (19
91), 88:7978-7982、Marks et al., J. Mol. Biol., (1991), 222:581-597、Hoo
genboom and Winter, J. Mol. Biol., (1992), 227:381-388、Barbas et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, (1992), 89:4457-4461、Griffiths et al., EMBO
Journal, (1994), 13:3245-3260、de Kruif et al., J. Mol. Biol., (1995), 2
48:97-105、Bonnycastle et al., J. Mol. Biol., (1996), 258:747-762、及びV
aughan et al., Nature Biotechnology (1996), 14:309-314を参照せよ。ライブ
ラリーＤＮＡは、いくつかの周知の突然変異誘発法、例えばカセット突然変異誘
発法又はオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法のうちの一つにおいて、制限酵
素及びライゲーション酵素を用いて調製される。

【００２３】 特にファージベクターＤＮＡライブラリー又はファージミドベクターＤＮＡラ
イブラリーを用いた、電気穿孔による形質転換に関して繰り返し生じる問題は、
一般的に１０⁷〜１０⁸形質転換／ＤＮＡ１μgの範囲である低い形質転換効率で
ある。低い形質転換効率は、１回の電気穿孔工程により調製されうるライブラリ
ーのサイズを制限する。ボーガン（Vaughan）ら（前記）は、約１０¹⁰個の組換
え体を含むライブラリーを達成するために数百回の電気穿孔を実施した、改変さ
れた方法を記載している。

【００２４】 ＤＮＡ及びＲＮＡの酵素的操作により得られる反応混合物は、所望のＤＮＡ又
はＲＮＡの夾雑物であるタンパク質、塩等を含有する。精製された核酸を得るた
め、これらの混合物を通常フェノール／クロロホルム又は同様の溶媒を用いて抽
出し、次いでエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、ダウアーらにより推奨され
るＤＮＡ濃度を提供するため適当量の水又は緩衝液に再懸濁させる。ボニーキャ
ッスル（Bonnycastle）ら（前記）は、クロロホルム／フェノール／イソアミル
アルコールを用いてライゲーション反応液を抽出し、その後ＤＮＡを水に再懸濁
させ、排除膜での濾過により脱塩することを記載している。この手法は、約２０
μg/mlのＤＮＡ濃度を使用したエレクトロコンピテントＭＣ１０６１E.coli細胞
の電気穿孔を可能にした。

【００２５】 電気穿孔及び形質転換効率に影響を与えるパラメータに関する２０年間にわた
る研究にも関わらず、特にファージＤＮＡベクター及びファージミドＤＮＡベク
ターのライブラリーによる細胞の形質転換のため、改良された電気穿孔が依然と
して必要とされている。

【００２６】 発明の概要 従来のファージ提示法は、おそらくファージ粒子の安定性を増強し、安定なフ
ァージ粒子のコートへの融合タンパク質の取り込みの頻度を増加させるため、野
生型コートタンパク質配列を使用する。ウイルスの野生型コートタンパク質では
ない、即ち一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するウイルスの
コートタンパク質、好ましくは主要コートタンパク質と融合した目的の異種ポリ
ペプチドを含有する融合タンパク質を取り込む安定なウイルス粒子が調製されう
ることは、本発明において発見された。従来のファージ提示技術は、野生型コー
トタンパク質配列を利用しており、融合タンパク質としての異種ポリペプチドの
ファージ粒子への取り込みは、正常なファージのパッケージング及びファージ粒
子産生に対して一般的に有害な効果を有すると予想されるため、この結果は予想
外のものであった。

【００２７】 本発明の目的の一つは、野生型コートタンパク質配列を有しないウイルスのコ
ートタンパク質と融合した異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質を提供す
ることである。さらなる目的は、この融合タンパク質をコードする遺伝子融合体
を含有する複製可能発現ベクターを提供することである。さらなる目的は、複製
可能発現ベクターを含有する宿主細胞を提供することである。

【００２８】 本発明のもう一つの目的は、複製可能発現ベクターのライブラリー（ここで、
ベクターは、複数個の異型融合タンパク質をコードする異なる遺伝子融合体の複
数個を含有する）を提供することである。さらなる目的は、異型融合タンパク質
の複数個を提示するウイルス粒子のライブラリー（ここで、融合タンパク質は、
野生型コートタンパク質配列を有しないコートタンパク質異型を含有する）及び
ベクターライブラリーを含有する宿主細胞を提供することである。

【００２９】 本発明のさらなる目的は、発現ベクター及びウイルス粒子のライブラリーを構
築する方法を提供することである。

【００３０】 さらなる目的は、本発明の融合タンパク質の使用によりファージ粒子又はファ
ージミド粒子の表面上に提示される融合タンパク質の数をモジュレートする方法
を提供することである。

【００３１】 本発明のもう一つの目的は、異種ＤＮＡの存在下でコンピテント細胞を電気穿
孔することにより細胞を形質転換する改良された方法を提供することである。

【００３２】 本発明のさらなる目的は、改良された特徴を有し、電気穿孔による、より高い
形質転換収率を可能にする、改良されたE.coli株を提供することである。

【００３３】 さらなる目的は、本発明の方法を用いる複製可能発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞を培養することにより、産物ポリペプチドを作製する方法、及びこの
過程により作製された産物ポリペプチドを提供することである。

【００３４】 本発明の一つの実施態様は、各々が融合タンパク質をコードする遺伝子融合体
と動作可能に連結した転写制御要素を含有する複製可能発現ベクターの複数個を
含有するライブラリーを構築すること（ここで、遺伝子融合体は第一ポリペプチ
ドをコードする第一遺伝子とファージ主要コートタンパク質をコードする第二遺
伝子とを含有し、ライブラリーは、異型ファージ主要コートタンパク質をコード
する第二遺伝子の複数個を含有する）を含む方法である。その方法は、適切な宿
主細胞をベクターのライブラリーで形質転換すること、及び融合タンパク質を形
成させるために適切な条件下で形質転換された細胞を培養することをさらに含み
うる。好ましくは、ベクターは、ファージＤＮＡ又はファージミドＤＮＡであり
、培養は、表面上に融合タンパク質を提示するファージ粒子又はファージミド粒
子を形成させるために十分なものである。その方法は、粒子の少なくとも一部分
が標的分子と結合するよう、ファージ粒子又はファージミド粒子を標的分子と接
触させること、及び結合しない粒子から結合する粒子を分離することも含みうる
。その方法は、結合粒子を選択すること、複製可能発現ベクターの複数個を含有
する第二ライブラリーを構築すること（ここで、各発現ベクターは第二融合タン
パク質をコードする第二遺伝子融合体と動作可能に連結した転写制御要素を含有
し、第二遺伝子融合体は第二ポリペプチドをコードする第三遺伝子と選択された
結合粒子の表面上に提示された融合タンパク質の主要コートタンパク質異型をコ
ードする第四遺伝子とを含有し、ライブラリーは、異型第二ポリペプチドをコー
ドする第三遺伝子の複数個を含有する）をさらに含みうる。第一ポリペプチド及
び第三ポリペプチドは同一であっても異なっていてもよい。

【００３５】 もう一つの実施態様において、本発明は、下記工程： （ａ）第一融合タンパク質をコードする第一遺伝子融合体と動作可能に連結した
転写制御要素を含む第一複製可能発現ベクターの複数個を含有する第一ライブラ
リーを構築する工程（ここで、第一遺伝子融合体は、第一ポリペプチドをコード
する第一遺伝子とファージ主要コートタンパク質をコードする第二遺伝子とを含
み、第一ライブラリーは、異型ファージ主要コートタンパク質をコードする第二
遺伝子をコードする第一ベクターの複数個を含有する）、 （ｂ）適切な宿主細胞を第一ベクターライブラリーで形質転換し、形質転換され
た細胞をファージ粒子又はファージミド粒子を形成させるために適切な条件下で
培養する工程、 （ｃ）粒子の少なくとも一部分が標的分子と結合するよう、ファージ粒子又はフ
ァージミド粒子を標的分子と接触させる工程、 （ｄ）結合しない粒子から結合する粒子を分離する工程、 （ｅ）粒子を選択する工程、 （ｆ）第二融合タンパク質をコードする第二遺伝子融合体と動作可能に連結した
転写制御要素を含む第二複製可能発現ベクターを構築する工程（ここで、第二遺
伝子融合体は、第二ポリペプチドをコードする第三遺伝子と、選択された結合粒
子の表面上に提示された融合タンパク質の主要コートタンパク質異型をコードす
る第四遺伝子とを含む）、 （ｇ）適切な宿主細胞を第二ベクターで形質転換し、表面上に第二融合タンパク
質を提示するファージ粒子又はファージミド粒子を形成させるために適切な条件
下で、形質転換された細胞を培養する工程、並びに （ｈ）結合しない粒子から結合する粒子を分離する工程を含む方法である。 その方法は、異型第二ポリペプチドをコードする第三遺伝子の複数個を含有する
第二ベクターの第二ライブラリーを構築することも含みうる。その方法は、 （ｉ）粒子を選択する工程、 （ｊ）工程（ｉ）で選択された粒子の第三遺伝子と動作可能に連結した転写制御
要素を含む第三発現ベクターを構築する工程、 （ｋ）適切な宿主細胞を工程（ｊ）で得られた第三ベクターで形質転換し、第二
ポリペプチドを形成させるために適切な条件下で、形質転換された細胞を培養す
る工程をさらに含みうる。

【００３６】 以下の例示的な実施態様の説明の過程を通して明らかとなるであろうこれら及
びその他の目的は、異種ＤＮＡの存在下でコンピテント細胞を電気穿孔すること
により細胞を形質転換する本発明の方法（ここで、ＤＮＡはアフィニティ精製に
より精製されており、好ましくは約１ピコグラム/mlから約５００ピコグラム/ml
という濃度で存在する）により達成された。ＤＮＡは、一般的には２〜３百ナノ
グラム/mlから数百ナノグラム/ml又はそれ以上、好ましくは約１μg/mlから約５
０μg/ml又はそれ以上、さらに好ましくは約７０μg/ml又はそれ以上の濃度で存
在し、１００μg/mlから約５００μg/mlを超える濃度で存在してもよい。

【００３７】 部分的に、本発明は、電気穿孔のためのＤＮＡを調製する従来技術の方法、例
えばフェノール抽出及びエタノール沈殿を使用したクローニング可能組換えＤＮ
Ａの調製は、一般的に許容不可能な程に高いコンダクタンスを有するＤＮＡ溶液
をもたらすという発見にも基づいている。電気穿孔装置は、一般的に、試料を通
る電気パルス時間を調節するため、コンデンサー及び抵抗器（Ｒ２）と平行に試
料セルを有するよう配置されている。理想的には、試料（Ｒ１）の抵抗は、電気
パルスが主にＲ２を介して減少するようＲ２の抵抗よりはるかに大きいべきであ
る。Ｒ２を介して本質的に完全な放電が起こる、好ましい電気穿孔において、時
間定数はＲ１が無限である理論的な最大値に近づくであろう。ＤＮＡはイオン性
分子であり、従って、ＤＮＡ電気穿孔試料は固有のコンダクタンスを有する。さ
らに、タンパク質、塩、緩衝液等のような電荷を有する不純物を含有するＤＮＡ
調製物は、付加的なコンダクタンスを導入する。電気穿孔反応に導入されうるＤ
ＮＡ調製物の容量（従ってＤＮＡの質量）は、調製物のコンダクタンスにより制
限される。試料のコンダクタンスが増加すると、Ｒ１が減少し、Ｒ２と比較して
有意になる、即ち電気パルスの相当の割合がＲ１を介して放電される。これは、
時間定数の減少及び形質転換効率の減少を引き起こす。試料のコンダクタンスが
さらに増加すると、電極を通した電気的アーク放電及び電気穿孔の失敗が引き起
こされる。より高い濃度は電気的アーク放電を引き起こすため、従来技術の方法
を用いて調製されたＤＮＡ溶液の高いコンダクタンスは、電気穿孔反応を低いＤ
ＮＡ濃度に実際に制限する。本発明は、部分的には、アフィニティ精製されたＤ
ＮＡを用いて、及び／又は可能と考えられていたよりもはるかに高いＤＮＡ濃度
において、細胞を電気穿孔する方法を提供することにより、この問題を解決する
。従来技術のＤＮＡ調製物中のＤＮＡは、全コンダクタンスのうちの極一部分に
しか寄与せず、これらの調製物中のコンダクタンスの大部分がイオン性不純物に
よるものであることが発見された。本発明は、イオン性不純物を減少させ、従っ
て単位量のＤＮＡに関連したコンダクタンスを減少させるため、アフィニティＤ
ＮＡ精製を使用する。従来技術は、一般的に、精製されたＤＮＡを電気穿孔に使
用することを提案しており、例えばＤＮＡ沈殿及び膜濾過のようないくつかの標
準的な精製が使用されているは、アフィニティ精製の使用は利用されておらず、
本発明の方法において使用されうる極めて高いＤＮＡ濃度及びその結果得られる
高い形質転換収率は驚くべきものである。

【００３８】 本発明は、ＤＮＡ、例えば組換えクローニング可能ＤＮＡ、好ましくは閉環Ｄ
ＮＡ、より好ましくはファージベクターＤＮＡ又はファージミドベクターＤＮＡ
を高度に精製することにより、細胞を形質転換する改良された方法を提供する。
本発明は、コンダクタンスを増加させ、電気穿孔中の時間定数を短縮する不純物
を除去するための、ＤＮＡのアフィニティ精製の使用により、最大１ml当たり数
百マイクログラムＤＮＡという濃度で、高濃度のＤＮＡ溶液、好ましくは極めて
低いコンダクタンスを有する水性溶液、例えば非緩衝水性溶液又は水／グリセロ
ール溶液を調製することを可能にする。本発明のより高いＤＮＡ濃度を使用した
電気穿孔は、形質転換収率を改良するは、許容不可能な程に高い細胞死又は宿主
細胞の生存率の低下は引き起こさない。本発明の方法は、細胞へ形質転換されう
る異種ＤＮＡ、例えば組換えクローニング可能ＤＮＡの量を増加させる。この宿
主細胞に侵入するＤＮＡの増加は、１回の電気穿孔当たりの形質転換体の数の増
加を提供し、組換えＤＮＡを使用した小さいライブラリーサイズの従来技術の問
題を克服する、より大きなコンビナトリアルライブラリーを調製することを可能
にする。

【００３９】 本発明の方法は、形質転換収率及びコンビナトリアルライブラリーのサイズを
改良するため、従来技術において使用されていたよりも高い宿主細胞濃度を使用
した、改良された形質転換収率も提供する。

【００４０】 本発明は、ファージ提示システムにおいて使用するための異型ペプチド、タン
パク質、及び抗体のファージライブラリー及びファージミドライブラリーの調製
にとって特に有用であるファージＦ′因子を含有する新規なE.coli株も提供する
。

【００４１】好ましい実施態様の詳細な説明 定義 「アフィニティ精製」という用語は、パートナー部分と結合又は吸着している
間に不純物から分子を分離することを可能にする、組み合わせ又は複合体を形成
する、化学物質又は結合パートナーに対する分子の特異的な引力又は結合に基づ
く分子の精製を意味する。

【００４２】 「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に単一のモノクローナル
抗体（アゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性
を有する抗体組成物、親和性の成熟された抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、同じ
く、所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）
２、ｓｃＦｖ及びＦｖ）も包含する。親和性の成熟された抗体は、典型的には、
単離された、若しくは天然の抗体、又はそれらの断片よりも２倍から５００倍増
加した結合親和性を有するであろう。好ましい親和性の成熟された抗体は、受容
体抗原とのナノモル単位又はさらにピコモル単位の親和性を有するであろう。親
和性の成熟された抗体は、当分野において既知の手法により作製される。Marks,
J. D. et al. Bio/Technology 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬのドメイン
シャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワ
ークの残基のランダム突然変異誘発は、Barbas, C. F. et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 91:3809-3813(1994)、Schier, R. et al. Gene 169:147-155(1995
)、Yelton, D. E. et al. J. Immunol. 155:1994-2004(1995)、Jackson, J. R.
et al., J. Immunol. 154(7):3310-9(1995)、及びHawkins, R. E. et al, J. Mo
l. Biol. 226:889-896(1992)に記載されている。ヒト化抗体は、既知である（Jo
nes et al., Nature, 321:522-525(1986)、Reichmann et al., Nature, 332:323
-329(1988)、及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)）。

【００４３】 「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識部位及び結合部位を含有する最小の抗体断片
である。この領域は、強く非共有結合的に相関した１つの重鎖可変領域と１つの
軽鎖可変領域とのダイマーからなる。ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部
位を画定するため、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用するのは、この配
置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を与える。
しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦ
Ｖの半分）ですら、完全な結合部位よりは親和性が低いは、抗原を認識し、それ
と結合する能力を有する。

【００４４】 「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１
）も含有する。Ｆａｂ′断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体
ヒンジ領域由来の一つ又は複数のシステインを含む数個の残基が付加されている
点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、定常ドメインの一つ又は複数の
システイン残基が遊離のチオール基を有しているＦａｂ′についての本明細書に
おける表記である。Ｆ（ａｂ′）２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステイン
を有するＦａｂ′断片の対として作製された。抗体断片の化学的カップリングは
、他にも既知である。

【００４５】 「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、単一のポリペプチド鎖内に存在する
抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、
ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチド
リンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓＦｖの概説につい
ては、PluckthunのThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113巻, Ros
enburg and Moore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照せよ
。

【００４６】 「ダイアボディ（diabodies）」という用語は、同一ポリペプチド鎖内の軽鎖
可変ドメイン（ＶＬ）と接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を
含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片をさす。同一鎖上の２つのド
メインの対形成を可能にすることができない短いリンカーを使用することにより
、ドメインを他の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作出
する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際特許公開第
９３／１１１６１号、及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6444-6448(1993)に、より完全に記載されている。

【００４７】 「直鎖状抗体」という表現は、Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062
(1995)に記載された抗体をさす。簡単に説明すると、これらの抗体は、一対の抗
原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｖ_H−Ｃ_H１
）を含む。直鎖状抗体は二重特異的である場合もあるし、又は単特異的である場
合もある。

【００４８】 「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」は、本発明において交換可能に使
用され、そのような表記は細胞又は細胞系の全ての子孫を含む。従って、例えば
、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」のような用語は、継代の数に関わ
らず、第一の対象細胞及びそれらに由来する培養物を含む。故意又は偶然の突然
変異のため、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一であるわけではない場合もあ
ることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた
のと同一の機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は、含まれる。区別さ
れる表記が意図される場合、それは、文脈から明らかとなろう。

【００４９】 「コンピテント細胞」及び「電気穿孔コンピテント細胞」という用語は、受容
能を有する状態にあり、多様な起源に由来するＤＮＡを取り込むことができる細
胞を意味する。その状態は、一過性であっても永久的であってもよい。電気穿孔
コンピテント細胞は、電気穿孔中にＤＮＡを取り込むことができる。

【００５０】 「制御配列」とは、発現に関して言及される場合、特定の宿主生物における動
作可能に連結したコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核
生物にとって適切な制御配列は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位を
含み、場合によりオペレーター配列を含み、未だ十分に理解されていない配列を
含む可能性もある。原核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及び
エンハンサーを利用することが知られている。

【００５１】 「コートタンパク質」という用語は、少なくとも一部分がウイルス粒子の表面
上に存在するタンパク質を意味する。機能的な見地からは、コートタンパク質は
、宿主細胞におけるウイルス組み立て過程においてウイルス粒子と相関し、他の
宿主細胞に感染するまで組み立てられたウイルスと相関し続けるあらゆるタンパ
ク質である。コートタンパク質は、主要コートタンパク質であってもよいし、又
は微量コートタンパク質であってもよい。「主要」コートタンパク質は、タンパ
ク質１０コピー又はそれ以上でウイルスコート中に存在するコートタンパク質で
ある。主要コートタンパク質は、１ビリオン当たり数十コピー、数百コピー、又
はさらには数千コピーで存在しうる。

【００５２】 特定のアッセイにおける化学的実体の「検出限界」とは、そのアッセイのバッ
クグラウンドレベルより上で検出されうる実体の最小の濃度である。例えば、実
施例５のファージＥＬＩＳＡにおいて、特定のタンパク質（例えばｈＧＨ）を提
示する特定のファージの「検出限界」は、特定のファージがタンパク質を提示し
ない対照ファージにより産生されるシグナルよりも大きいＥＬＩＳＡシグナルを
産生するファージ濃度である。

【００５３】 「電気穿孔」又は「電気穿孔すること」という用語は、外来物質の細胞への取
り込みを可能にするために十分な条件下で細胞に電圧をかけることにより、外来
物質（タンパク質、核酸等）が細胞に導入される過程を意味する。外来物質は典
型的にはＤＮＡである。

【００５４】 「Ｆ因子」又は「Ｆ′エピソーム」とは、細胞内に存在する場合、バクテリオ
ファージが細胞に感染することを可能にするＤＮＡである。エピソームは、他の
遺伝子、例えば選択遺伝子、マーカー遺伝子等を含有しうる。通常のＦ′エピソ
ームは、ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨ５ａｌｐｈａＦ′、ＪＭ１０１（ＪＭ１
０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０と同一）、ＫＳ１００
０、ＸＬ１−ＢＬＵＥ及び７１−１８を含む周知のE.coli株に見出される。これ
らの株及びそれらに含まれるエピソームは市販されており（New England Biolab
s）、多くは、ヴァージニア州マナッサスのＡＴＣＣのような承認された寄託機
関に寄託されている。

【００５５】 「融合タンパク質」とは、各々が異なる特性を有するポリペプチドである互い
に共有結合した２つの部分を有するポリペプチドである。特性は、in vitro又は
in vivoの活性のような生物学的特性でありうる。特性は、標的分子との結合、
反応の触媒等のような化学的又は物理的な特性であってもよい。２つの部分は、
単一のペプチド結合により直接的に連結していてもよいし、又は一つ若しくは複
数のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介して連結していてもよい。一
般的に、２つの部分及びリンカーは、相互にリーディングフレーム内にありうる
。

【００５６】 「異種ＤＮＡ」とは、宿主細胞に導入されるあらゆるＤＮＡである。そのＤＮ
Ａは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びこれらの融合体又は組み合わせ
を含む多様な起源に由来しうる。そのＤＮＡは、宿主若しくはレシピエント細胞
と同一の細胞若しくは細胞型に由来するＤＮＡ、又は例えば哺乳動物若しくは植
物に由来する異なる細胞型に由来するＤＮＡを含みうる。ＤＮＡは、場合により
、選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、温度抵抗性遺伝子等を含みうる。

【００５７】 「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成す
る過程である。２つの断片のライゲーションのためには、断片の末端は、相互に
適合性でなければならない。末端は、エンドヌクレアーゼ消化の後、直接的に適
合性である場合もある。しかし、エンドヌクレアーゼ消化の後一般的に作製され
た付着末端を、ライゲーションのため適合性にするために、平滑末端に変換する
ことがまず必要である場合もある。末端を平滑化するためには、ＤＮＡを、４種
類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、適切な緩衝液中で少なくと
も１５分間１５℃で約１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片又はＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより処理する。次いで、ＤＮＡをフェノール−クロロホルム
抽出及びエタノール沈殿により精製する。共にライゲートすべきＤＮＡ断片を、
約等モルの量で溶液に添加する。また、溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、及び
ＤＮＡ０．５μg当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼも含
有しうる。ＤＮＡをベクターにライゲートさせる場合には、適切な（一つ又は複
数の）制限エンドヌクレアーゼによる消化により、ベクターをまず直鎖化する。
次いで、ライゲーション工程における自己ライゲーションを阻止するため、直鎖
化された断片を、細菌アルカリホスファターゼ又はウシ腸ホスファターゼで処理
する。

【００５８】 「突然変異」とは、野生型配列のような参照ヌクレオチド配列と比較した（一
つ又は複数の）ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換である。

【００５９】 「沈黙突然変異」とは、あるＤＮＡ配列の翻訳されたポリペプチド産物のアミ
ノ酸配列を変化させない突然変異である。

【００６０】 「非沈黙突然変異」とは、あるＤＮＡ配列の翻訳されたポリペプチド産物のア
ミノ酸配列を変化させる突然変異である。

【００６１】 「動作可能に連結した」とは、核酸に関して言及される場合、核酸が他の核酸
配列と機能的な関係に置かれていることを意味する。例えば、プロ配列又は分泌
リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプロタンパク質として発現
される場合には、ポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結しており、プロモーター
又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コーディング配列と
機能的に連結しており、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう位置し
ている場合、コーディング配列と機能的に連結している。一般的に、「動作可能
に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場
合には隣接し、かつリーディング相内にあることを意味する。しかし、エンハン
サーは、隣接している必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーシ
ョンにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌク
レオチドアダプター又はリンカーが通常の実務に従い使用される。

【００６２】 「ファージ提示」とは、異型ポリペプチドは、コートタンパク質との融合タン
パク質として、ファージ、例えば繊維状ファージの粒子の表面上に提示される技
術である。ファージ提示の有用性は、ランダム化されたタンパク質異型の大きい
ライブラリーを、高親和性で標的分子と結合する配列に関して迅速かつ効率的に
ソートすることができるという事実にある。ペプチドライブラリー又はタンパク
質ライブラリーのファージ上の提示は、特異的な結合特性を有するポリペプチド
に関して非常に多数のポリペプチドをスクリーニングするために使用されている
。多価ファージ提示法は、繊維状ファージの遺伝子III又は遺伝子VIIIとの融合
によって、小さなランダムペプチド及び小さなタンパク質を提示するために使用
されている。Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 1992, 3:355-362
及びその中の引用文献を参照せよ。一価ファージ提示においては、タンパク質ラ
イブラリー又はペプチドライブラリーは、遺伝子III又はその一部分と融合して
おり、野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で低レベルに発現され、ファージ粒
子が１コピーの融合タンパク質を提示するか又は全く提示しない。多価ファージ
と比較して親和力効果が減少するため、ソーティングは固有リガンド親和性に基
づき行われ、ＤＮＡ操作を単純化するファージミドベクターが使用される。Lowm
an and Wells, Methods:A companion to Methods in Enzymology, 1991, 3:205-
216。

【００６３】 「ファージミド」とは、細菌の複製開始点、例えばＣｏｌＥ１と、１コピーの
バクテリオファージの遺伝子間領域を有するプラスミドベクターである。ファー
ジミドは、繊維状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む
あらゆる既知のバクテリオファージに基づいている。プラスミドは、抗生物質耐
性のための選択可能マーカーも一般的に含有しうる。これらのベクターにクロー
ニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖させることができる
。これらのベクターを保有する細胞に、ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝
子を供給した場合、プラスミドの複製の様式は、ファージ粒子をパッケージング
するローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの一つの鎖のコピーを
生成させ、ファージ粒子をパッケージする。ファージミドは、感染性又は非感染
性のファージ粒子を形成しうる。これらの用語は、異種ポリペプチドがファージ
粒子の表面上に提示されるよう、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子と
連結したファージコートタンパク質遺伝子又はそれらの断片を含有するファージ
ミドを含む。サンブルックら（前記）、４．１７。

【００６４】 「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含有し、複製能を有する二
本鎖の複製可能型バクテリオファージを意味する。ファージベクターは、ファー
ジ複製及びファージ粒子形成を可能にするファージ複製開始点を有する。ファー
ジは、好ましくは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージのような繊維状バクテ
リオファージ若しくはそれらの誘導体、又はラムダ、２１、pHｉ８０、pHｉ８２
、４２４、４３４等のようなラムドイドファージ若しくはそれらの誘導体である
。

【００６５】 細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養物からプラスミドＤＮＡを
単離することを意味する。通常使用されるＤＮＡ調製法は、サンブルックら（前
記）のセクション１．２５〜１．３３に記載の大規模又は小規模のプラスミド調
製である。ＤＮＡ調製の後、それは、サンブルックら（前記）のセクション１．
４０に記載のような当分野において周知の方法により精製されうる。

【００６６】 「オリゴヌクレオチド」とは、（１９８８年５月４日に公開された欧州特許第
２６６，０３２号に記載のような固相技術を使用した、又はFroehler et al., N
ucl. Acids Res., 14:5399-5407(1986)に記載のようなデオキシヌクレオシドＨ
ホスホン酸中間体を介した、ホスホトリエステル化学、ホスファイト化学、又は
ホスホールアミダイト化学のような）既知の方法により化学的に合成された、短
い一本鎖又は二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法は、以下
に定義されるポリメラーゼ連鎖反応及びその他のオートプライマー（autoprimer
）法及び固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は全て
、Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734(1989)に記載され
ている。これらの方法は、遺伝子の完全な核酸配列が既知であるか、コーディン
グ鎖と相補的な核酸の配列が利用可能である場合に、使用される。又は、標的ア
ミノ酸配列が既知である場合には、各アミノ酸残基に対する既知の好ましいコー
ド残基を用いる、可能性のある核酸配列を推測することができる。次いで、オリ
ゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル上で精製する。

【００６７】 「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、微量の核酸、ＲＮＡ及び／又
はＤＮＡの特定の一片は、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６
８３，１９５号に記載のようにして増幅される手法又は技術をさす。一般的に、
オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、目的領域の末端
由来の配列情報又はそれ以上は、利用可能であることが必要であり、これらのプ
ライマーは、増幅すべき鋳型の反対の鎖と配列が同一であるか、又は類似してい
る。２つのプライマーの５′末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致
していてもよい。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡからの特定のＲＮＡ配列、特定のＤ
ＮＡ配列を増幅するため、及び全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージ又はプラスミ
ドの配列等から転写されるｃＤＮＡを増幅するために使用されうる。一般的には
、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263(1987)、Er
lich編, PCR Technology（Stockton Press, NY, 1989）を参照せよ。本明細書に
おいて使用されるように、ＰＣＲとは、プライマーとしての既知の核酸、及び核
酸の特定の一片を増幅又は生成させるための核酸ポリメラーゼの使用を含む、核
酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の、唯一ではない一例と見
なされる。

【００６８】 ＤＮＡが非核酸不純物から分離されている場合、ＤＮＡは、「精製」されてい
る。不純物は、極性、非極性、イオン性等でありうる。

【００６９】 制限消化物からのＤＮＡの所定の断片の「回収」又は「単離」とは、ポリアク
リルアミドゲル又はアガロースゲル上での電気泳動による消化物の分離、目的の
断片の移動度の、既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度との比較、所望の
断片を含有するゲル区分の取り出し、及びＤＮＡからのゲルの分離を意味する。
この手法は一般的に既知である。例えば、Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9
:6103-6114(1981)及びGoeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)を参
照せよ。

【００７０】 「ＤＮＡとの特異的な結合親和性」を有する化学基又は種とは、タンパク質、
塩、及び脂質を含むその他の細胞成分と形成された結合よりも強い、非共有結合
ではない結合をＤＮＡと形成する分子又はそれらの一部分を意味する。

【００７１】 「生存細胞」とは、形質転換過程の後に生存可能であり続ける細胞である。

【００７２】 「転写制御要素」は、以下の成分：エンハンサー要素、プロモーター、オペレ
ーター配列、リプレッサー遺伝子、及び転写終結配列のうちの一つ又は複数を含
有するであろう。これらの成分は、当分野において周知である。米国特許第５，
６６７，７８０号。

【００７３】 「形質転換体」とは、ＤＮＡと相関した表現型（例えば、ＤＮＡによりコード
されたタンパク質により与えられる抗生物質耐性）の発現により証明されるよう
な、ＤＮＡを取り込み維持している細胞である。

【００７４】 「形質転換」とは、細胞がＤＮＡを取り込み、「形質転換体」となる過程を意
味する。ＤＮＡ取り込みは、永久的であっても、又は一過性であってもよい。

【００７５】 「形質転換効率」とは、形質転換法の後に作製された、ＤＮＡ単位量当たりの
形質転換体の数（例えば、ＤＮＡ１マイクログラム当たりの形質転換体）を意味
する。

【００７６】 「形質転換頻度」とは、生存細胞の数に対する形質転換体の数の比率である。

【００７７】 「形質転換収率」とは、１回の電気穿孔反応で作製される形質転換体の数を意
味する。

【００７８】 出発ポリペプチドの「異型」又は「突然変異体」、例えば、融合タンパク質又
は異種ポリペプチド（ファージに対して異種）とは、１）出発ポリペプチドとは
異なるアミノ酸配列を有し、２）自然又は人工的（人為的）な突然変異誘発によ
って出発ポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。そのような異型は、
例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び
／又は置換を含む。最終的な構築物が所望の機能的特徴を有していることを条件
として、最終的な異型又は突然変異体の構築物に到達するために、欠失、挿入、
及び置換のあらゆる組み合わせが作られうる。アミノ酸変化は、グリコシル化部
位の数又は位置の変化のようなポリペプチドの翻訳後過程を変化させるものであ
ってもよい。ポリペプチドのアミノ酸配列異型を生成させるための方法は、参照
として本明細書に特別に組み込まれる米国特許第５，５３４，６１５号に記載さ
れている。

【００７９】 一般的に、異型コートタンパク質は、少なくとも２０％又は４０％、最大で７
０％又は８５％、より好ましくは最大で９５％又は９９．９％の野生型コートタ
ンパク質との配列同一性を有するであろう。配列同一性の割合は、例えば、最大
の相同性を提供するため配列を整列化した後、Fitch et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 80:1382-1386(1983)、Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-45
3(1970)により記載されたアルゴリズムの型により決定される。ポリペプチドの
アミノ酸配列異型は、ポリペプチドをコードするＤＮＡへ適切なヌクレオチド変
化を導入することにより、又はペプチド合成により、調製される。「改変された
残基」とは、野生型配列のような参照アミノ酸配列と比較したアミノ酸残基の欠
失、挿入又は置換である。

【００８０】 「機能的な」突然変異体又は異型とは、野生型タンパク質によっても検出可能
に示される検出可能な活性又は機能を示すものである。例えば、主要コートタン
パク質の「機能的な」突然変異体又は異型とは、実験的に検出されうるレベルで
ファージコートに安定的に取り込まれるものである。好ましくは、ファージコー
ト取り込みは、ウイルス粒子１０００個当たり約１個の融合体からウイルス粒子
１個当たり約１０００個の融合体という範囲で検出されうる。

【００８１】 「高機能性」の突然変異体又は異型とは、野生型の活性よりも大きい活性を有
する機能的な突然変異体又は異型である。例えば、主要コートタンパク質の高機
能性の突然変異体又は異型とは、同一の環境で野生型タンパク質のレベルよりも
高いレベルでファージコートへ安定的に取り込まれるものである。

【００８２】 「低機能性」の突然変異体又は異型とは、野生型の活性よりも小さい活性を有
する機能的な突然変異体又は異型である。例えば、主要コートタンパク質の低機
能性の突然変異体又は異型とは、同一の環境で野生型タンパク質のレベルよりも
低いレベルでファージコートへ安定的に取り込まれるものである。

【００８３】 「野生型」配列、又は「野生型」のコートタンパク質のようなタンパク質の配
列は、突然変異の導入により異型ポリペプチドが誘導される参照配列である。一
般に、あるタンパク質の「野生型」配列とは、自然界において最も一般的な配列
である。同様に、「野生型」遺伝子配列とは、自然界において最も一般的に見出
される遺伝子の配列である。自然の過程又は人間が誘導した手段のいずれかによ
り、「野生型」遺伝子（そして、従って、それがコードするタンパク質）に突然
変異が導入されうる。そのような過程の産物は、最初の「野生型」のタンパク質
又は遺伝子の「異型」又は「突然変異型」である。

【００８４】 好ましい実施態様の詳細な説明 Ａ．新規な方法及び細胞 本発明は、ＤＮＡアフィニティ精製により精製された異種ＤＮＡの存在下で、
コンピテント細胞を電気穿孔することにより、細胞を形質転換する方法を提供す
る。好ましくは、細菌におけるライブラリー構築のため、ＤＮＡは、２５マイク
ログラム/ml以上の濃度で存在する。好ましくは、ＤＮＡは、約３０マイクログ
ラム/ml以上の濃度、より好ましくは約７０マイクログラム/ml以上の濃度、さら
に好ましくは約１００マイクログラム/ml以上、さらには最大で数百マイクログ
ラム/mlもの濃度で存在する。一般的には、本発明の方法は、約５０から約５０
０マイクログラム/mlの範囲のＤＮＡ濃度を利用しうる。異種ＤＮＡを高度に精
製することにより、ＤＮＡ濃度が極めて高い場合においてさえ、３．０ミリ秒（
ms）を超える電気穿孔中の時間定数が可能であり、高い形質転換効率がもたらさ
れることが発見された。約５０マイクログラム/ml〜約４００マイクログラム/ml
のＤＮＡ濃度範囲にわたり、本発明の方法は、標準的な電気穿孔装置を用いる、
約３．６ms〜約４．４msの範囲の時間定数の使用を可能にする。従って、本発明
は、従来既知であった濃度を超える動的なＤＮＡ濃度範囲を有する方法を提供す
る。

【００８５】 本発明の方法において使用される高いＤＮＡ濃度は、コンピテント細胞を形質
転換するために使用されるＤＮＡを高度に精製することによって得られる。本発
明の方法において、ＤＮＡは、電気穿孔過程において使用されるＤＮＡ溶液のコ
ンダクタンスを増加させる夾雑物を除去するために精製される。ＤＮＡは、あら
ゆる既知の方法により精製されうるは、好ましい精製法は、ＤＮＡアフィニティ
精製の使用である。ＤＮＡ結合樹脂及び親和性試薬を用いる、ＤＮＡ、例えば組
換え直鎖状ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡの精製は、周知であり、あらゆる既知の
方法が本発明において使用されうる（Vogelstein, B. and Gillespie, D., 1979
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:615、Callen, W., 1993, Strategies, 6:52
-53）。市販のＤＮＡ単離キット及び精製キットも、ストラタジーン（Stratagen
e）（CLEARCUT Miniprep Kit）及びライフテクノロジーズ（Life Technologies
）（GLASSMAX DNA単離システム）を含むいくつかの供給元から入手可能である。
適切なＤＮＡ精製法は、これらに限定されないは、カラムクロマトグラフィー（
米国特許第５，７０７，８１２号）、ヒドロキシル化シリカポリマー（米国特許
第５，６９３，７８５号）、シリカゲル再水和物（米国特許第４，９２３，９７
８号）、ホウ化ケイ酸（米国特許第５，６７４，９９７号）、改変グラスファイ
バー膜（米国特許第５，６５０，５０６号、米国特許第５，４３８，１２７号）
、フッ素化吸着剤（米国特許第５，６２５，０５４号、米国特許第５，４３８，
１２９号）、珪藻土（米国特許第５，０７５，４３０号）、透析（米国特許第４
，９２１，９５２号）、ゲルポリマー（米国特許第５，１０６，９６６号）の使
用、及びカオトロピック化合物とＤＮＡ結合試薬との使用（米国特許第５，２３
４，８０９号）を含む。精製後、本発明の濃度で、電気穿孔に使用するため、Ｄ
ＮＡを溶出させるか、又は水、好ましくは蒸留水若しくは脱イオン化水に再懸濁
させる。溶液が低い電気伝導性を有する、即ち約３．０msよりも大きい時間定数
における本発明の高いＤＮＡ濃度の使用と適合性である場合には、低塩緩衝溶液
の使用も企図される。

【００８６】 電気穿孔により形質転換されうるあらゆる細胞は、本発明の方法における宿主
細胞として使用されうる。本発明の方法において異種ＤＮＡで形質転換されうる
適切な宿主細胞は、動物細胞（Neumann et al., EMBO J., (1982), 1:841、Wong
and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun., (1982), 107:584、Potter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984)81:7161、Sugden et al., Mol. Cel
l. Biol., (1985), 5:410、Toneguzzo et al., Mol. Cell. Biol., (1986), 6:7
03、Pur-KＡｓｐa et al., Mol. Cell. Biol., (1986), 6:716）、植物細胞（Fr
omm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985)82:5824、Fromm et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, (1986), 319:791、Ecker and Davis, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, (1986)83:5372）及び細菌細胞（Chu et al., Nucleic Acids Re
s., (1987), 15:1311、Knutson and Yee, Anal. Biochem., (1987), 164:44）を
含む。原核生物は、本発明のための好ましい宿主細胞である。様々な細胞系のた
めのトランスフェクション効率を生じるパラメータを記載しているAndreason an
d Evans, Biotechniques, (1988), 6:650も参照せよ。適切な細菌細胞は、E.col
i（Dower et al. （前記）、Taketo, Biochim. Biophys. Acta, (1988), 149:31
8）、Ｌ．カゼイ（Chassy and Flickinger, FEMS Microbiol. Lett., (1987), 4
4:173）、Ｓｔｒｅｐｔ．ラクチス（Strept. lactis）（Powell et al., Appl.
Environ. Microbiol., (1988), 54:655、Harlander, Streptcoccal Genetics, J
. Ferretti and R. Curtiss編, III, 229頁, American Society for Microbiolo
gy, Washington, D. C., (1987)）、Ｓｔｒｅｐｔ．サーモフィルス（Strept. t
hermophilus）（Somkuti and Steinberg, Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology
, 1987, 1:412）、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）（Mil
ler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1988)85:856）、並びに宿主として
使用されうるバチルスズブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス属細
菌、サルモネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）若しくはセラチアマ
ルセサンス（Serratia marcesans）のような腸内細菌、及び様々なシュードモナ
ス（Pseudomonas）種を含むその他の細菌株（Fielder and Wirth, Anal. Bioche
m., (1988), 170:38）を含む。適切なE.coli株は、ＪＭ１０１、E.coli Ｋ１２
株２９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、E.coli株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２
７，３２５）、E.coli株Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、E.coli Ｘ
Ｌ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene）、及びE.coli Ｂを含むは、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭ
ＲＦ′、ＳＵＲＥ、ＡＢＬＥ Ｃ、ＡＢＬＥ Ｋ、ＷＭ１１００、ＭＣ１０６１、
ＨＢ１０１、ＣＪ１３６、ＭＶ１１９０、ＪＳ４、ＪＳ５、ＮＭ５２２、ＮＭ５
３８、ＮＭ５３９、ＴＧ１のようなその他の多くのE.coli株、並びに原核生物の
他の多くの種及び属も同様に使用されうる。

【００８７】 細胞は、既知の手法を用いてコンピテントにされる。サンブルックら（前記）
、１．７６〜１．８１、１６．３０。

【００８８】 異種ＤＮＡは、好ましくは、比較的簡単に構築し、容易に増幅することができ
るプラスミド、ファージ、又はファージミドのような複製可能な転写ベクター又
は発現ベクターの形態である。これらのベクターは、一般的に、プロモーター、
シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製開始点、及び当業者に既知のその他の必
要な成分を含有する。これらの成分と、一つ又は複数の所望のクローニングされ
たポリペプチドをコードする遺伝子とを含有する適切なベクターの構築は、サン
ブルックら（前記）に記載のような標準的な組み換えＤＮＡ法を用いて調製され
る。ベクターを形成させるために組み合わせられる単離されたＤＮＡ断片は、所
望のベクターを生成させるため、分解され、適合化され、特定の順序及び方向で
共にライゲートさせられる。

【００８９】 所望のポリペプチド（即ち、厳密な二次構造を有するペプチド又はポリペプチ
ド）をコードする遺伝子は、当分野において既知の方法により入手されうる（一
般的には、サンブルックらを参照せよ）。遺伝子の配列が既知である場合には、
遺伝子をコードするＤＮＡを化学的に合成することができる（Merrifield, J. A
m. Chem. Soc., 85:2149(1963)）。遺伝子の配列が既知でない場合、又は遺伝子
が以前に単離されていない場合には、（所望の遺伝子が発現される適切な組織か
ら得られたＲＮＡから作成された）ｃＤＮＡライブラリーからか、又は適切なゲ
ノムＤＮＡライブラリーからクローニングすることができる。次いで、遺伝子を
適切なプローブを用いて単離する。ｃＤＮＡライブラリーのための適切なプロー
ブは、モノクローナル又はポリクローナルの抗体（ｃＤＮＡライブラリーが発現
ライブラリーであることを条件とする）、オリゴヌクレオチド、及び相補的若し
くは相同なｃＤＮＡ、又はそれらの断片を含む。ゲノムＤＮＡライブラリーから
目的の遺伝子を単離するために使用されうるプローブは、同一又は類似の遺伝子
をコードするｃＤＮＡ又はそれらの断片、相同なゲノムＤＮＡ又はＤＮＡ断片、
及びオリゴヌクレオチドを含む。選択されたプローブを用いたｃＤＮＡ又はゲノ
ミックライブラリーのスクリーニングは、サンブルックら（前記）のチャプター
１０〜１２に記載のような標準的な手法を用いて実施される。

【００９０】 目的のタンパク質をコードする遺伝子を単離するための別の手段は、サンブル
ックら（前記）のセクション１４に記載のようなポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣ
Ｒ）の使用である。この方法は、目的の遺伝子とハイブリダイズするであろうオ
リゴヌクレオチドの使用を必要とし、従って、オリゴヌクレオチドを生成させる
ため、この遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部分が既知でなければならない。

【００９１】 遺伝子を単離した後は、それを、サンブルックらに一般的に記載されているよ
うな増幅のための適切なベクター（好ましくは、プラスミド）に挿入することが
できる。

【００９２】 適切な緩衝液中で一つ又は複数の適切な制限酵素を用いてＤＮＡを分解する。
一般的に、約２０μlの緩衝溶液中で、０．２〜１μgのプラスミド又はＤＮＡ断
片は、約１〜２単位の適切な制限酵素と共に使用される。適切な緩衝液、ＤＮＡ
濃度、並びにインキュベーションの時間及び温度は、制限酵素の製造業者により
特定される。一般的に、３７℃における約１又は２時間のインキュベーション時
間が適切であるは、いくつかの酵素はそれよりも高い温度を必要とする。インキ
ュベーションの後、フェノール及びクロロホルムの混合物による消化溶液の抽出
により、酵素及びその他の夾雑物を除去し、エタノール沈殿又はその他のＤＮＡ
精製技術により水性画分からＤＮＡを回収する。

【００９３】 機能的なベクターを形成させるため、ＤＮＡ断片を共にライゲートさせるため
には、ＤＮＡ断片の末端が相互に適合性でなければならない。末端は、エンドヌ
クレアーゼ消化の後、直接的に適合性である場合もある。しかし、エンドヌクレ
アーゼ消化により一般的に作製された粘着末端を、ライゲーションのため適合性
にするために、平滑末端に変換することがまず必要である場合もある。末端を平
滑化するためには、ＤＮＡを、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で
、適切な緩衝液中で少なくとも１５分間１５Ｃで１０単位のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノウ断片（クレノウ）により処理する。次いで、ＤＮＡをフェノール−ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈殿又はその他のＤＮＡ精製技術により精製する
。

【００９４】 切断されたＤＮＡ断片は、ＤＮＡゲル電気泳動を用いてサイズ分離され選択さ
れうる。ＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドのマトリックス上で電気
泳動されうる。マトリックスの選択は、分離すべきＤＮＡ断片のサイズに依存し
うる。電気泳動の後、サンブルックら（前記）のセクション６．３０〜６．３３
に記載のように、電気溶出により、又は低融点アガロースがマトリックスとして
使用されている場合には、アガロースを融解させ、そこからＤＮＡを抽出するこ
とにより、マトリックスからＤＮＡを抽出する。

【００９５】 （ライゲートすべき各断片の末端が適合性であるように適切な制限酵素で予め
消化された）一緒にライゲートすべきＤＮＡ断片を、約等モルの量で溶液に添加
する。溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、及びＤＮＡ０．５μg当たり約１０単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼも含有しうる。ＤＮＡ断片をベクター
にライゲートさせる場合には、適切な（一つ又は複数の）制限エンドヌクレアー
ゼによる切断により、ベクターをまず直鎖化する。次いで、アルカリホスファタ
ーゼ又はウシ腸ホスファターゼで、直鎖化されたベクターを処理する。ホスファ
ターゼ処理は、ライゲーション工程におけるベクターの自己ライゲーションを阻
止する。

【００９６】 ライゲーションの後、今や外来遺伝子が挿入されているベクターを、前記のよ
うにして精製し、既知の市販の電気穿孔装置及び製造業者により概説され、ダウ
アーら（前記）に一般的に記載された手法を使用した電気穿孔により、前記のよ
うな適切な宿主細胞へ形質転換する。本発明は、高い形質転換収率を提供し、単
一の電気穿孔反応は典型的には１×１０¹⁰個を超える形質転換体を生じる。しか
し、宿主細胞へ形質転換されるＤＮＡの量を増加させるため、１回より多い（複
数回の）電気穿孔を実施することもできる。反復的電気穿孔は、当分野において
記載されたようにして実施される。ボーガン（Vaughan）ら（前記）を参照せよ
。付加的な電気穿孔の回数は、数回（２回、３回、４回．．．１０回）から最大
数十回（１０回、２０回、３０回．．．１００回）、さらには数百回（１００回
、２００回、３００回．．．１０００回）まで、所望に応じて様々であってよい
。反復的電気穿孔は、宿主細胞へ形質転換されるコンビナトリアルライブラリー
、例えば抗体ライブラリーのサイズを増加させるために望ましいかもしれない。
複数回の電気穿孔により、少なくとも１．０×１０¹²個、さらには２．０×１０ ¹² 個の異なるメンバー（クローン、ファージ、ファージミド、プラスミド等のよ
うなＤＮＡベクター、細胞等）を有するライブラリーを作製することが可能であ
る。

【００９７】 電気穿孔は、本発明の改良と共に、当分野において既知の、例えば米国特許第
４，９１０，１４０号、米国特許第５，１８６，８００号、米国特許第４，８４
９，３５５号、米国特許第５，１７３，１５８号、米国特許第５，０９８，８４
３号、米国特許第５，４２２，２７２号、米国特許第５，２３２，８５６号、米
国特許第５，２８３，１９４号、米国特許第５，１２８，２５７号、米国特許第
５，７５０，３７３号、米国特許第４，９５６，２８８号に記載された方法、又
はその他のあらゆる既知の回分的又は連続的な電気穿孔を用いて実施されうる。

【００９８】 典型的には、エレクトロコンピテント細胞を所望の濃度で氷温においてＤＮＡ
溶液と混合する。混合物のアリコートをキュベットに添加し、０．２cmという典
型的なギャップを有する電気穿孔装置、例えばジーンパルサー（GENE PULSER）
（Biorad）内に設置する。製造業者により記載されたようにして、各キュベット
を電気穿孔する。典型的な設定は、電圧＝２．５kV、抵抗＝２００オーム、キャ
パシタンス＝２５mFである。次いで、直ちにキュベットを取り出し、ＳＯＣ培地
（Maniatis）を添加し、試料を２５０mlのバッフルフラスコに移す。電気穿孔の
後、いくつかのキュベットの内容物を合わせることができる。次いで、形質転換
された細胞を培養するため、培養物を３７℃で振とうする。

【００９９】 形質転換された細胞は、一般的には、抗生物質、一般的にはベクター内のｔｅ
ｔ及び／又はａｍｐ耐性遺伝子により細胞が耐性となるテトラサイクリン（ｔｅ
ｔ）又はアンピシリン（ａｍｐ）上での増殖により選択される。

【０１００】 形質転換された細胞の選択の後、これらの細胞を培養物中で増殖させ、次いで
ベクターＤＮＡ（外来遺伝子が挿入されているプラスミド又はその他のベクター
）を単離することができる。ベクターＤＮＡは当分野において既知の方法を用い
て単離されうる。２つの適切な方法は、サンブルックら（前記）のセクション１
．２５〜１．３３に記載のような小規模ＤＮＡ調製及び大規模ＤＮＡ調製である
。単離されたＤＮＡは、サンブルックら（前記）のセクション１．４０に記載の
ような、前記のような当分野において既知の方法により精製されうる。次いで、
この精製されたＤＮＡを制限マッピング及び／又はＤＮＡ配列決定により分析す
る。ＤＮＡ配列決定は、一般的には、Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:
309(1981)の方法又はMaxam et al., Meth. Enzymol., 65:499(1980)の方法のい
ずれかにより実施される。

【０１０１】 本発明は、転写中に融合タンパク質が生成されるように、所望のポリペプチド
をコードする遺伝子（遺伝子１）を、第二遺伝子（遺伝子２）と融合させること
も企図する。遺伝子２は、典型的には、繊維状ファージ、好ましくはファージＭ
１３又は関連ファージのコートタンパク質遺伝子であり、その遺伝子は好ましく
はコートタンパク質III遺伝子又はコートタンパク質VIII遺伝子、又はそれらの
断片である。米国特許第５，７５０，３７３号、国際特許公開第９５／３４６８
３号を参照せよ。遺伝子１と遺伝子２の融合は、前記の標準的な技術を用いて、
遺伝子１を含有するプラスミドの特定の部位に遺伝子２を挿入することにより、
又は遺伝子２を含有するプラスミドの特定の部位に遺伝子１を挿入することによ
り、達成されうる。

【０１０２】 又は、遺伝子２は、転写された融合タンパク質を同定及び／又は捕捉及び精製
するための分子タグであってもよい。例えば、遺伝子２は、抗ｇＤ抗体との結合
により融合タンパク質をアフィニティ精製するために使用されうるヘルペス単純
ウイルスの糖タンパク質Ｄ（Paborsky et al., 1990, Protein Engineering, 3:
547-553）をコードしうる。遺伝子２は、金属イオン（Ｎｉ）カラム（キアエク
スプレス（QIAEXPRESS）Ｎｉ−ＮＴＡタンパク質精製系、Quiagen, Inc. ）との
結合により融合タンパク質を同定及び／又は精製するために使用されうるポリヒ
スチジン、例えば（ｈｉｓ）₆（Sporeno et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:1
0991-10995、Stuber et al., 1990, Immunol. Methods, 4:121-152、Waeber et
al., 1993, FEBS Letters, 324:109-112）をコードしてもよい。当分野において
既知のその他のアフィニティタグも使用され、遺伝子２によりコードされうる。

【０１０３】 プラスミドへの遺伝子の挿入には、プラスミドは、遺伝子を挿入すべき正確な
位置で切断されていることが必要である。従って、この位置に制限エンドヌクレ
アーゼ部位（好ましくは、プラスミドが制限エンドヌクレアーゼ消化において単
一の位置でのみ切断されるような独自の部位）が存在しなければならない。前記
のようにして、プラスミドを消化し、ホスファターゼ処理し、精製する。次いで
、２つのＤＮＡを共にライゲートさせることにより、この直鎖化されたプラスミ
ドへ遺伝子を挿入する。ライゲーションは、プラスミドの末端は、挿入すべき遺
伝子の末端と適合性である場合に達成されうる。プラスミドを切断し、挿入すべ
き遺伝子を単離するために使用される制限酵素は、平滑末端又は適合性の粘着末
端を作出する場合には、サンブルックら（前記）のセクション１．６８に記載の
ように、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを使用し、Ａ
ＴＰ及びリガーゼ緩衝液の存在下で１６℃で１〜４時間混合物をインキュベート
することにより、直接的にＤＮＡを共にライゲートさせることができる。末端が
適合性でない場合には、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片又はバクテリオファ
ージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（いずれも、消化されたＤＮＡの突出している一本
鎖末端を埋めるため、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を必要とする）
を使用することにより、まずそれらを平滑化しなければならない。又は、ヌクレ
アーゼＳ１又はリョクトウヌクレアーゼ（いずれも、ＤＮＡの突出している一本
鎖を切断することにより機能する）のようなヌクレアーゼを用いて、末端を平滑
化することもできる。次いで、前記のようなリガーゼを用いてＤＮＡを再ライゲ
ートさせる。コーディング領域のリーディングフレームが改変されるため、挿入
すべき遺伝子の末端を平滑化することが不可能な場合もある。この問題を克服す
るためには、オリゴヌクレオチドリンカーを使用することができる。リンカーは
、挿入すべき遺伝子とプラスミドを接続するためのブリッジとして作用する。こ
れらのリンカーは、標準的な方法を用いる、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡとして合
成により作成されうる。リンカーは、挿入すべき遺伝子の末端と適合性の一つの
末端を有しており、まず、前記のライゲーション法を用いる、リンカーをこの遺
伝子とライゲートさせる。リンカーのもう一方の末端は、ライゲーションのため
プラスミドと適合性となるよう設計される。リンカーの設計においては、挿入す
べき遺伝子のリーディングフレーム、又はプラスミドに含まれる遺伝子のリーデ
ィングフレームを破壊しないよう留意しなければならない。アミノ酸の一部分を
コードするよう、又は一つ若しくは複数のアミノ酸をコードするよう、リンカー
を設計することが必要な場合もある。

【０１０４】 遺伝子１と遺伝子２の間には、終止コドンをコードするＤＮＡを挿入すること
ができ、そのような終止コドンはＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、及
びＵＧＡ（オパール）である（Microbiology, Davis et al. Harper & Row, New
York, 1980, 237, 245-47及び274頁）。野生型宿主細胞において発現される終
止コドンは、遺伝子２タンパク質が接着していない遺伝子１タンパク質産物の合
成を引き起こす。しかし、サプレッサー宿主細胞における増殖は、検出可能な量
の融合タンパク質の合成を引き起こす。そのようなサプレッサー宿主細胞は、ｍ
ＲＮＡの終止コドンの位置にアミノ酸を挿入し、それにより検出可能な量の融合
タンパク質の産生を引き起こすよう修飾されたｔＲＮＡを含有する。E.coliサプ
レッサー株（Bullock et al., BioTechniques 5:376-379〔1987〕）のような、
そのようなサプレッサー宿主細胞は、周知であり、記載されている。融合ポリペ
プチドをコードするｍＲＮＡへそのような終止コドンを置くためには、あらゆる
許容される方法が使用されうる。

【０１０５】 抑圧可能コドンは、ポリペプチドをコードする第一遺伝子とファージコートタ
ンパク質の少なくとも一部分をコードする第二遺伝子との間に挿入されうる。又
は、抑圧可能終止コドンは、ポリペプチドの最後のアミノ酸トリプレット又はフ
ァージコートタンパク質の最初のアミノ酸を交換することにより、融合部位と隣
接して挿入されうる。抑圧可能コドンを含有するプラスミドをサプレッサー宿主
細胞で増殖させた場合、ポリペプチド及びコートタンパク質を含有する融合ポリ
ペプチドの検出可能な産生が引き起こされる。プラスミドを非サプレッサー宿主
細胞で増殖させた場合には、挿入されたＵＡＧ、ＵＡＡ、又はＵＧＡをコードす
る抑圧可能トリプレットにおける終結により、ファージコートタンパク質と実質
的に融合していないポリペプチドが合成される。非サプレッサー細胞においては
、ポリペプチドを宿主細胞に固着させる融合したファージコートタンパク質が存
在しないために、ポリペプチドは合成され宿主細胞から分泌される。

【０１０６】 遺伝子１は、哺乳動物タンパク質をコードしてもよく、好ましくはタンパク質
はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、Ｍ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホ
ルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プ
ロインスリン、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）
のような糖タンパク質ホルモン、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、
グルカゴン、第VIII因子、抗体、肺表面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナ
ーゼ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ボンベシン、第
VII因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含む凝固カスケード因子、トロンビン、
造血系増殖因子、腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ、エンケファリナーゼ、ヒ
ト血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、
ベータラクタマーゼのような微生物タンパク質、組織因子タンパク質、インヒビ
ン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモン又は増殖因子の受容
体、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、プロテインＡ又はＤ、リウマ
トイド因子、ＮＧＦ−アルファのような神経増殖因子、血小板増殖因子、ＴＧＦ
−アルファ及びベータのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、イン
スリン様増殖因子−Ｉ及びインスリン様増殖因子−ＩＩ、インスリン様増殖因子
結合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮａｓｅ、潜伏関連ペプチド、エリスロポエチン
（ＥＰＯ）、骨誘導因子（osteoinductive factors）、インターフェロン−アル
ファ、ベータ、及びガンマのようなインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｇ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２のようなイン
ターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、崩壊促進因子、ウイル
ス抗原、ＧＰ１２０、ＧＰ１４０のようなＨIVエンベロープタンパク質、心房性
ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂ、又はＣ、免疫グロブリン、並びに前掲のタンパ
ク質のいずれかの異型及び断片から選択されうる。

【０１０７】 第一遺伝子は、最低４〜１０アミノ酸残基、最大約５０〜８０残基を含有する
ペプチドをコードしうる。これらの比較的小さいペプチドは、ペプチドの抗原特
性の決定、タンパク質の抗原性部位のマッピング等において有用である。第一遺
伝子は、標的と相互作用することができる複数のアミノ酸を提示する複数の厳密
な二次構造を形成するよう折り畳まれうる、約１００個超のアミノ酸残基を含有
する一つ又は複数のサブユニットのポリペプチドもコードしうる。好ましくは、
第一遺伝子は、厳密な二次構造の完全性が保存されるよう、標的と相互作用する
ことができるアミノ酸のみに対応するコドンで突然変異させる。

【０１０８】 融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体と動作可能に連結した転写制御要
素を含有する異型複製可能ベクターのファミリーを構築すること、適切な宿主細
胞を形質転換すること、表面上に融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を形
成させるため、形質転換された細胞を培養すること、粒子の少なくとも一部分が
標的と結合するよう、組換えファージ粒子を標的分子と接触させること、結合し
ない粒子から結合する粒子を分離することを含む、タンパク質、ペプチド、及び
それらの突然変異した異型のファージ提示は、既知であり、本発明の形質転換法
と共に使用されうる。米国特許第５，７５０，３７３号、国際特許公開第９７／
０９４４６号、米国特許第５，５１４，５４８号、米国特許第５，４９８，５３
８号、米国特許第５，５１６，６３７号、米国特許第５，４３２，０１８号、国
際特許公開第９６／２２３９３号、米国特許第５，６５８，７２７号、米国特許
第５，６２７，０２４号、国際特許公開第９７／２９１８５号、O'boyle et al,
1997, Virology, 236:338-347、Soumillion et al, 1994, Appl. Biochem. Bio
tech., 47:175-190、O'Neil and Hoess, 1995, Curr. Opin. Struct. Biol., 5:
443-449、Makowski, 1993, Gene, 128:5-11、Dunn, 1996, Curr. Opin. Struct.
Biol., 7:547-553、Choo and Klug, 1995, Curr. Opin. Struct. Biol., 6:431
-436、Bradbury and Cattaneo, 1995, TINS, 18:242-249、Cortese et al., 199
5, Curr. Opin. Struct. Biol., 6:73-80、Allen et al., 1995, TIBS, 20:509-
516、Lindquist and Naderi, 1995, FEMS Micro. Rev., 17:33-39、Clarkson an
d Wells, 1994, Tibtech, 12:173-184、Barbas, 1993, Curr. Opin. Biol., 4:5
26-530、McGregor, 1996, Mol. Biotech., 6:155-162、Cortese et al., 1996,
Curr. Opin. Biol., 7:616-621、McLafferty et al., 1993, Gene, 128:29-36を
参照せよ。

【０１０９】 特に好ましい実施態様において、遺伝子１は抗体の軽鎖若しくは重鎖、又はＦ
ａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖状抗体等のような、それらの
断片をコードする。遺伝子１は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）もコードしうる。抗体又
はそれらの断片のライブラリーの調製は当分野において周知であり、本発明の方
法を用いる宿主細胞へ形質転換されうる形質転換ベクターのファミリーを構築す
るため、あらゆる既知の方法を使用することができる。ファージ中の（Huse et
al, 1989, Science, 246:1275）、及びファージ又はファージミド中の融合タン
パク質としての、抗体の軽鎖及び重鎖のライブラリーは、周知であり、既知の手
法に従い調製されうる。前記のボーガン（Vaughan）ら、バーバス（Barbas）ら
、マークス（Marks）ら、フーゲンブーム（Hoogenboom）ら、グリフィス（Griff
iths）ら、デ−クルイフ（de Kruif）ら、及び国際特許公開第９８／０５３４４
号、国際特許公開第９８／１５８３３号、国際特許公開第９７／４７３１４号、
国際特許公開第９７／４４４９１号、国際特許公開第９７／３５１９６号、国際
特許公開第９５／３４６４８号、米国特許第５，７１２，０８９号、米国特許第
５，７０２，８９２号、米国特許第５，４２７，９０８号、国際特許公開第５，
４０３，４８４号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，２７０，
１７０号、国際特許公開第９２／０６１７６号、米国特許第５，７０２，８９２
号を参照せよ。概説も発表されている。Hoogenboom, 1997, Tibtech, 15:62-70
、Neri et al., 1995, Cell Biophysics, 27:47、Winter et al., 1994, Annu.
Rev. Immunol., 12:433-455、Soderlind et al., 1992, Immunol. Rev., 130:10
9-124、Jefferies, 1998, Parasitology, 14:202-206。

【０１１０】 遺伝子１によりコードされることが企図される特定の抗体は、ヒト白血球表面
マーカー、サイトカイン及びサイトカイン受容体、酵素等と結合する抗体を含む
。特定の白血球表面マーカーは、ＣＤ１ａ〜ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｒ、ＣＤ３〜Ｃ
Ｄ１０、ＣＤ１１ａ〜ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１
５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８〜Ｃ４１、ＣＤ４２ａ〜ｄ
、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ａ、ＣＤ４５Ｂ、ＣＤ
４５Ｏ、ＣＤ４６〜ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ〜ｆ、ＣＤ５０〜ＣＤ５１、ＣＤ５２
、ＣＤ５３〜ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ
６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６８〜ＣＤ７
４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ〜ｂ、ＣＤ８
０〜ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５〜ＣＤ８９、ＣＤｗ９０、ＣＤ９１、ＣＤ
ｗ９２、ＣＤ９３〜ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤｗ１０
１、ＣＤ１０２〜ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ〜ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９
、ＣＤ１１５、ＣＤｗ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ〜ｂ、Ｃ
Ｄ１２１ａ〜ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２６〜ＣＤ１２９、及びＣ
Ｄ１３０を含む。その他の抗体結合標的は、相当の相同性を有し、ＷＳＸＷＳド
メインを高頻度に含み、一般的にはサイトカイン受容体スーパーファミリーのメ
ンバーとして分類される密接に関連した糖タンパク質細胞表面受容体の群である
、サイトカイン及びサイトカインスーパーファミリー受容体、造血系増殖因子ス
ーパーファミリー受容体、好ましくはそれらの細胞外ドメインを含む（例えば、
Nicola et al., Cell, 67:1-4(1991)及びSkoda, R. C. et al. EMBO J. 12:2645
-2653(1993)を参照せよ）。一般的には、これらの標的は、インターロイキン（
ＩＬ）又はコロニー刺激因子（ＣＳＦ）の受容体である。スーパーファミリーの
メンバーは、これらに限定されないは、ＩＬ−２（ｂ鎖及びｇ鎖）（Hatakeyama
et al., Science, 244:551-556(1989)、Takeshita et al., Science, 257:379-
382(1991)）、ＩＬ−３（Itoh et al., Science, 247:324-328(1990)、Gorman e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5459-5463(1990)、Kitamura et al.,
Cell, 66:1165-1174(1991a)、Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88:5082-5086(1991b)）、ＩＬ−４（Mosley et al., Cell, 59:335-348(1989)）
、ＩＬ−５（Takaki et al., EMBO J., 9:4367-4374(1990)、Tavernier et al.,
Cell, 66:1175-1184(1991)）、ＩＬ−６（Yamasaki et al., Science, 241:825
-828(1988)、Hibi et al., Cell. 63:1149-1157(1990)）、ＩＬ−７（Goodwin e
t al., Cell, 60:941-951(1990)）、ＩＬ−９（Renault et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 89:5690-5694(1992)）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676(1991)、Hayash
ida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:9655-9659(1990)）、顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（Fukunaga et al., Cell, 61:341-350(1990a)、
Fukunga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706(1990b)、Larsen
et al., J. Ex. Med., 172:1559-1570(1990)）、ＥＰＯ（D'Andrea et al., Cel
l, 57:277-285(1989)、Jones et al., Blood, 76:31-35(1990)）、白血病阻害因
子（ＬＩＦ）（Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848(1991)）、オンコスタ
チンＭ（ＯＳＭ）（Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645(
1991)）を含み、プロラクチン（Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88:7744-7748(1988)、Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-21
16(1989)）、成長ホルモン（ＧＨ）（Leung et al., Nature, 330:537-543(1987
)）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Davis et al., Science, 253:59-63(19
91)）及びｃ−Ｍｐｌ（M. Souyri et al., Cell 63:1137(1990)、I. Vigon et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640(1992)）の受容体も含む。本発明に
より作成された抗体のさらに他の標的は、ｅｒｂ２、ｅｒｂ３、ｅｒｂ４、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５等である。

【０１１１】 所望のポリペプチドをコードする遺伝子１は、一つ又は複数の選択されたコド
ンにおいて改変されうる。改変とは、同ポリペプチドの未改変又は天然の配列と
比較した、ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こす、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子内の一つ又は複数のコドンの置換、欠失、又は挿入と定義される
。好ましくは、改変は、分子の一つ又は複数の領域内の少なくとも一つのアミノ
酸の、他のあらゆるアミノ酸との置換によることができる。改変は、当分野にお
いて既知の多様な方法により作製されうる。これらの方法は、これらに限定され
ないは、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発及びカセット突然変異誘発を含む
。

【０１１２】 オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、遺伝子１の置換異型、欠失異型、及
び挿入異型を調製するための好ましい方法である。この技術は、Zoller et al.,
Nucleic Acids Res., 10:6487-6504(1987)により記載されているように当分野
において周知である。簡単に説明すると、遺伝子１は、所望の突然変異をコード
するオリゴヌクレオチドを、遺伝子１の未改変又は天然のＤＮＡ配列を含有する
一本鎖型のプラスミドであるＤＮＡテンプレートとハイブリダイズさせることに
より改変される。ハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチドプライマーを
取り込み、遺伝子１の選択された改変をコードするであろう鋳型の完全な第二相
補鎖を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて合成する。

【０１１３】 一般的には、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用され
る。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードする（一つ又は複数の）ヌ
クレオチドの片側に、鋳型と完全に相補的な１２〜１５個のヌクレオチドを有す
る。これは、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡテンプレート分子と適切にハイ
ブリダイズすることを保証する。オリゴヌクレオチドは、Crea et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 75:5765(1978)により記載されたような当分野において既
知の技術を用いて容易に合成される。

【０１１４】 ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクタ
ー、又はViera et al., Meth. Enzymol., 153:3(1987)により記載されたような
一本鎖ファージ複製開始点を含有するベクターにより生成される。従って、突然
変位すべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成させるため、これらのベクターのいずれ
かに挿入されうる。一本鎖鋳型の作製は、サンブルックら（前記）のセクション
４．２１〜４．４１に記載されている。

【０１１５】 天然ＤＮＡ配列を改変するため、適切なハイブリダイゼーション条件下で、オ
リゴヌクレオチドを一本鎖鋳型とハイブリダイズさせる。次いで、合成のための
プライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いる、鋳型の相補鎖を合成するため、
ＤＮＡポリメラーゼ、通常Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩ
クレノウ断片を添加する。ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１の突然変異した型をコー
ドし、もう一方の鎖（最初の鋳型）が遺伝子１の天然の未改変の配列をコードす
るヘテロ二重鎖分子は、このようにして形成される。次いで、このヘテロ二重鎖
分子を、適切な宿主細胞、通常E.coli ＪＭ１０１のような原核生物へ形質転換
する。細胞を増殖させた後、それらをアガロースプレート上に置き、突然変異し
たＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定するため、３２−リンで放射性標識され
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングする。

【０１１６】 直前に記載された方法は、プラスミドの両方の鎖が（一つ又は複数の）突然変
異を含有しているホモ二重鎖分子が作出されるよう修飾されうる。修飾は以下の
ようにして実施される。一本鎖オリゴヌクレオチドを、前記のような一本鎖鋳型
とアニールさせる。３種類のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシ
ン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、及びデオキシリボチミ
ジン（ｄＴＴＰ）を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリ
ボシトシン（アマシャム（Amersham）から入手可能）と合わせる。この混合物を
鋳型−オリゴヌクレオチド複合体へ添加する。この混合物へＤＮＡポリメラーゼ
を添加すると、突然変異した塩基を除き鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。さら
に、この新たなＤＮＡ鎖は、それを制限エンドヌクレアーゼ消化から防御するｄ
ＣＴＰ−（ａＳ）を、ｄＣＴＰの代わりに含有するであろう。二本鎖ヘテロ二重
鎖の鋳型鎖に適切な制限酵素でニックを入れた後、鋳型鎖を、突然変異すべき（
一つ又は複数の）部位を含有する領域外で、ＥｘｏIIIヌクレアーゼ又は他の適
切なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、一部分のみが一本鎖である
分子が残留するように、反応を停止させる。次いで、４つの全てのデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ、及びＤＮＡリガーゼの存在下で、ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いる、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二重鎖を形成させる。次いで、このホ
モ二重鎖分子を、前記のように、E.coli ＪＭ１０１のような適切な宿主細胞へ
形質転換することができる。

【０１１７】 置換すべきアミノ酸の複数個を有する突然変異体は、いくつかの方法のうちの
いずれかで作製されうる。アミノ酸がポリペプチド鎖内で近接している場合には
、所望のアミノ酸置換を全てコードする一つのオリゴヌクレオチドを用いる、同
時に突然変異させることができる。しかし、アミノ酸が相互にある程度離れて位
置している（約１０個超のアミノ酸により隔離されている）場合には、所望の変
化を全てコードする単一オリゴヌクレオチドを生成させることは、より困難であ
る。その代わりに、２つの代替法のうちのいずれかを使用することができる。

【０１１８】 第一の方法においては、置換すべき各アミノ酸の別々のオリゴヌクレオチドを
生成させる。次いで、そのオリゴヌクレオチドを同時に一本鎖鋳型ＤＮＡとアニ
ールさせると、鋳型から合成される第二のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換を全て
コードしうる。代替法は、所望の突然変異体を作製するため、２回以上の突然変
異誘発を含む。第１ラウンドは、単一突然変異体の記載と同様に行い、野生型Ｄ
ＮＡを鋳型として使用し、（一つ又は複数の）第一の所望のアミノ酸置換をコー
ドするオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニールさせ、次いで、ヘテロ二重鎖Ｄ
ＮＡ分子を生成させる。第二ラウンドの突然変異誘発は、第１ラウンドの突然変
異誘発において作製された突然変異したＤＮＡを鋳型として利用する。従って、
この鋳型は一つ又は複数の突然変異を既に含有している。次いで、さらなる所望
の（一つ又は複数の）アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを、この鋳
型とアニールさせると、得られたＤＮＡ鎖は第１ラウンドの突然変異誘発及び第
２ラウンドの突然変異誘発の両方に由来する突然変異をコードしている。この結
果得られたＤＮＡを、第３ラウンド等の突然変異誘発において鋳型として使用す
ることができる。

【０１１９】 カセット突然変異誘発も、遺伝子１の置換異型、欠失異型、及び挿入異型を調
製するための好ましい方法である。その方法は、Wells et al., Gene, 34314(19
85)により記載された方法に基づいている。出発材料は、遺伝子１を含むプラス
ミド（又はその他のベクター）、突然変異すべき遺伝子である。突然変異すべき
遺伝子１の（一つ又は複数の）コドンを同定する。同定された（一つ又は複数の
）突然変異部位の片側には独特な制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければ
ならない。そのような制限部位が存在しない場合には、遺伝子１の適切な位置に
それらを導入するため、前記のオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて
それらを生成させることができる。制限部位をプラスミドに導入した後、プラス
ミドをこれらの部位で切断して直鎖化する。制限部位間のＤＮＡ配列をコードす
るは、所望の（一つ又は複数の）突然変異を含有しない二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを、標準的な手法を用いて合成する。２つの鎖を別々に合成し、次いで標準的
な技術を用いて共にハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、
カセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドへ直接的にライゲートするこ
とができるよう、直鎖化されたプラスミドの末端と適合性である３′末端及び５
′末端を有するよう設計される。このプラスミドは、遺伝子１の突然変異したＤ
ＮＡ配列を含有している。

【０１２０】 好ましい実施態様において、遺伝子１を、ファージコートタンパク質の少なく
とも一部分をコードする遺伝子２と連結させる。好ましいコートタンパク質遺伝
子は、Ｍ１３ファージ、ｆ１ファージ及びｆｄファージのようなE.coliに特異的
な繊維状ファージのコートタンパク質３及びコートタンパク質８をコードする遺
伝子である。遺伝子１と遺伝子２との遺伝子融合体をコードする複製可能発現ベ
クターを含有する宿主細胞のトランスフェクション、及び標準的な手法によるフ
ァージ粒子の作製は、ファージ粒子の表面上に遺伝子１によりコードされたポリ
ペプチドが提示されているファージ粒子を提供する。

【０１２１】 発表されているプロトコールは、約１０¹⁰コロニー形成単位（cfu）/mlという
最終細胞濃度を使用することを提案しているは、本発明は、電気穿孔において使
用するための、生存可能生存細胞１ml当たり５×１０¹⁰cfu又はそれ以上という
細胞濃度を得ることを可能にする。好ましくは、本発明の方法において、生存可
能細胞は、約１×１０¹¹cfu/ml〜約４×１０¹¹cfu/mlに濃縮される。この範囲に
濃縮されうる好ましい細胞は、下記のＳＳ３２０細胞である。ダウアーらは、形
質転換体の収率が電気穿孔中に存在する細胞の数と共に増加することを示したは
、約５×１０¹⁰細胞/mlを超える細胞濃度は実際には使用されていないと考えら
れる。いくつかの細胞、特にE.coli株は、以前に提案されていたものと比べては
るかに高い濃度に濃縮されうることは、本発明において発見された。ある株の最
大最終濃度を決定する重要な要因は、エレクトロコンピテント細胞の調製におい
て使用される標準的な洗浄工程に対する株の抵抗性である。洗浄手法を生き残る
細胞の割合は様々である。本発明の一部分として、電気穿孔のための細胞を調製
する従来の方法は、しばしば、より高い非生存可能細胞数及びより低い形質転換
収率をもたらすことが発見された。この実施態様においては、細胞を、標準的な
培養ブロス中での培養により、場合により約６〜４８hr（又はＯＤ₆₀₀＝０．６
〜０．８となるまで）約３７℃において増殖させ、次いで、ブロスを遠心分離し
、上清を除去する（例えば、デカンテーションにより）。一次精製は、好ましく
は、細胞ペレットを緩衝溶液（例えば、ヘペスpH７．４）に再懸濁させ、その後
再遠心分離及び上清の除去を行うことによる。その結果得られた細胞ペレットを
希釈グリセロール（例えば、５〜２０％v/v）に再懸濁させ、細胞ペレットを形
成させるため再び遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを水又は希釈グリ
セロールに所望の濃度で再懸濁させることにより、最終的な細胞濃縮物が得られ
る。前記のように、これらの洗浄工程は、電気穿孔のため使用される濃縮細胞溶
液中の細胞生存率、即ち生存可能細胞の数に対する効果を有することが発見され
ている。洗浄前の出発細胞の数と比較して高い生存比率で洗浄工程及び遠心分離
工程の後に生存している細胞を使用することが好ましい。最も好ましくは、洗浄
前の生存可能細胞数に対する洗浄後の生存細胞数の比率は１．０であり、即ち、
細胞死は全く存在しない。しかし、生存比率は約０．８以上、好ましくは約０．
９〜１．０であってもよい。

【０１２２】 特に好ましいレシピエント細胞は、ファージＦ′エピソームを含有するE.coli
株ＭＣ１０６１である、本発明の電気穿孔コンピテントE.coli株である。その株
におけるファージ複製を可能にするあらゆるＦ′エピソームは、本発明において
使用されうる。適切なエピソームは、ＡＴＣＣに寄託された株から入手可能であ
るか、又は市販されている（ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨ５ａｌｐｈａＦ′、
ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、
ＫＳ１０００、ＸＬ１−ＢＬＵＥ、７１−１８等）。ＳＳ３２０株は、ＸＬ１−
ＢＬＵＥの稔性エピソーム（Ｆ′プラスミド）をＭＣ１０６１細胞に移行させる
ため、ＭＣ１０６１細胞をＸＬ１−ＢＬＵＥと接合させることにより調製された
。一般的に、２つの細胞型の培養物を混合し、混合物を培養培地中で約１時間３
７℃において増殖させることは、接合及びエピソーム移行を起こさせるのに十分
である。新たに得られたE.coli株は、ストレプトマイシン耐性染色体マーカーを
保持するＭＣ１０６１の遺伝子型と、テトラサイクリン耐性を与えるＦ′プラス
ミドの遺伝子型とを有する。この接合の子孫は、両方の抗生物質に対して耐性で
あり、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンの存在下で選択的に増殖しうる
。ＳＳ３２０株は、１９９８年６月１８日にアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA
）に寄託され、受託番号第９８７９５号を付与されている。

【０１２３】 このＳＳ３２０株の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた
。これは、寄託の日から３０年間の生存可能培養物の維持を保証する。生物は、
ブダペスト条約の約定の下でＡＴＣＣにより入手可能にされ、関係のある米国特
許の発行の時点、又はあらゆる米国特許出願若しくは外国特許出願の公衆への公
開の時点のうち早い方の時点における、培養物の子孫の公衆への永久的、非制限
的な入手可能性を保証し、かつ米国特許法（３５ ＵＳＣ）§１２２及びそれに
準ずる長官規則（Commissioner's rules）（８８６ＯＧ６３８を特に参照する３
７ ＣＦＲ§１．１４を含む）に従い米国特許商標庁長官により資格があると決
定された者に対する子孫の入手可能性を保証する、ジェネンテック社（Genentec
h, Inc. ）とＡＴＣＣとの間の合意の下にある。

【０１２４】 本願の管財人は、寄託された培養物は、適切な条件下で培養された場合に死ぬ
か、又は遺失若しくは破壊された場合、通告により同培養物の生存可能試料と迅
速に交換することに同意している。寄託された培養物の入手可能性は、特許法に
より政府の支配下で承認された権利に違反して本発明を実施するための認可と解
釈されるべきではない。

【０１２５】 ＳＳ３２０細胞は、電気穿孔にとって特に好都合な特性を有する。ＳＳ３２０
細胞は、特に強く、ほとんどの他の電気穿孔コンピテント細胞よりも高い細胞生
存率で複数の洗浄工程の後に生存しうることができることが発見された。洗浄工
程の後に生存しているＳＳ３２０細胞の能力は、ダウアーらのプロトコールによ
り提案された細胞濃度よりも高い細胞濃度を調製することを可能にする。より高
い細胞濃度での使用に適したその他の株は、ＴＢ１、ＭＣ１０６１等を含む。こ
れらのより高い細胞濃度は、本発明の過程のための、より高い形質転換効率を提
供する。

【０１２６】 電気穿孔における、より高いＤＮＡ濃度（約１０倍）の使用は、形質転換効率
を増加させ、宿主細胞へ形質転換されるＤＮＡの量を増加させる。より高い細胞
濃度の使用は、効率も増加させる（約１０倍）。より多量の移入されたＤＮＡは
、より大きい多様性を有し、コンビナトリアルライブラリーのより多くの特有の
メンバーを表す、より大きなライブラリーを作製する。本発明の方法は、１回の
電気穿孔イベントで、発現可能コンビナトリアルライブラリーのサイズを約１０
０倍増加させ、比較可能な通常の方法で可能な量よりも１００倍低い量で存在す
る稀なライブラリーメンバーの選択、増幅及び同定を可能にするために有用であ
る。

【０１２７】 ダウアーらは、約１０マイクログラム/mlという閉環ＤＮＡ濃度を用いて、飽
和（電気穿孔のほとんどの生存細胞の形質転換）が達成されうることを証明した
。しかし、ライブラリー、例えば融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子のラ
イブラリーの構築は、ベクターのファミリー又はライブラリーを提供するための
、適切なベクターへのライブラリーを表すＤＮＡ断片の導入を必ず含む。カセッ
ト突然変異誘発の場合、合成ＤＮＡは二本鎖カセットであるは、フィルイン突然
変異誘発においては合成ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡである。いずれの場合にも、ライ
ブラリーを作製するため細胞へ形質転換されうる閉環二本鎖ＤＮＡを含有する反
応産物を得るため、合成ＤＮＡはベクターに取り込まれる。しかし、合成ＤＮＡ
を閉環ＤＮＡに取り込ませるために使用される過程は、一般的に１００％未満の
効率であり、しばしば所望の閉環産物は全ＤＮＡの極一部分のみを表す。ライゲ
ーション又はフィルイン反応による飽和を達成するためには、産物は、純粋な閉
環ＤＮＡを使用した場合に必要な濃度よりも有意に高いＤＮＡ濃度を必要とする
かもしれない。従来の方法は、ＤＮＡを使用した電気穿孔反応において飽和を達
成するために十分なＤＮＡ濃度を用いる、形質転換ベクター、例えばプラスミド
、ファージベクター、ファージミドベクター等に合成ＤＮＡ断片を取り込ませる
ことを可能にしていないし、提案もしていない。

【０１２８】 例えば、以下の実施例６の反応は、本発明の方法を用いて、１９マイクログラ
ム/mlのＤＮＡ濃度が生存細胞の５３％の形質転換を引き起こすことを証明して
いる。この実施例において、フィルイン反応は極めて効率的であり、アガロース
ゲル電気泳動により証明されたように、約９５％の所望の閉環ＤＮＡ産物が得ら
れた。ＤＮＡ濃度は、細胞生存率にも形質転換にも有害な影響を与えることなく
、数百マイクログラム/ml（例えば、３００〜５００マイクログラム/ml）に増加
させることが可能である。最大の形質転換体数は、試験された最大ＤＮＡ濃度よ
りも２０倍低いＤＮＡ濃度で得られ、試験された最も高いＤＮＡ濃度ですら、電
気穿孔反応に対する不利益な効果は有していなかった。本発明は、従来の方法で
可能であった濃度をはるかに超えるＤＮＡ濃度の使用可能なダイナミックレンジ
を提供する。本発明の方法を用いる、所望のクローニング可能ＤＮＡを少量、例
えば１０〜５０％、さらには１〜１０％しか生じない非効率的な形質転換ベクタ
ー形成反応を、最大約４００〜５００マイクログラム/mlのＤＮＡ濃度を使用す
ることにより、電気穿孔生存細胞を飽和させるようにすることが可能である。

【０１２９】 本発明の方法は、所望のベクター（例えば、閉環ＤＮＡ）が調製物中の全ＤＮ
Ａの極一部分にしか相当しないＤＮＡ反応調製物を用いた場合ですら、単一細胞
への２つ以上のベクターの簡便な導入をも可能にする。これは、別々のベクター
中の複数の外来遺伝子、例えば２つ以上のライブラリーの単一の形質転換体への
同時導入を可能にする。ライブラリーの複数メンバーの単一細胞への導入は、形
質転換体の数を超えてライブラリーの多様性を拡大する。例えば、電気穿孔反応
中の形質転換体が平均２つのプラスミドを維持する場合、ライブラリーの多様性
は形質転換体の数の２倍となる。

【０１３０】 あるＤＮＡ調製物の飽和濃度は、ＤＮＡ濃度のさらなる増加は、増加した形質
転換収率を引き起こさない濃度と定義されうる。

【０１３１】 飽和濃度においては、ＤＮＡを取り込み維持することができる全ての細胞が形
質転換されている。ダウアーらは、形質転換効率がＤＮＡ濃度と直接比例するこ
とを示した。ＤＮＡ濃度が増加すると、それに対応して生存細胞１個当たりの特
有プラスミドの平均数が増加する。例えば、あるＤＮＡ濃度において、電気穿孔
が平均１つの特有プラスミドを保持する生存細胞をもたらす場合、ＤＮＡ濃度を
２倍にすると、各々が平均２つの特有プラスミドを保持する生存細胞がもたらさ
れる。

【０１３２】 本発明は、電気穿孔における従来技術の方法で可能であったものと比べて、少
なくとも１桁大きいＤＮＡ濃度の使用を可能にする。次に、このことは、酵素に
より操作されたＤＮＡ調製物を用いた場合ですら、１回の電気穿孔反応における
、２つ以上の特有プラスミド（異なるライブラリーメンバーを含有する）の単一
細胞への同時導入を可能にする。

【０１３３】 単一ライブラリーのいくつかのメンバーを単一の細胞に導入することが可能で
あり、従ってライブラリーの多様性は形質転換体の数を超えて拡大されうる。例
えば、ある電気穿孔反応において作製された形質転換体が平均２つのプラスミド
を維持する場合、ライブラリーの多様性は形質転換体数の２倍となろう。ファー
ジ提示ライブラリーの場合、同一の形質転換体内に維持されたファージＤＮＡ又
はファージミドのパッケージングは、異なるファージＤＮＡ又はファージミドか
ら産生された異なる融合タンパク質のランダムな提示を生じる。従って、同種の
ＤＮＡ配列と相関して提示される融合タンパク質も存在することができ、ランダ
ムな確率により偶然に共形質転換された完全に無関係な配列と相関している融合
タンパク質も存在することができる。

【０１３４】 ファージ粒子１個当たりの取り込まれた融合タンパク質の数が共形質転換され
たファージＤＮＡ又はファージミドの数を大きく超えている高度に多価な提示の
場合（例えば、タンパク質−８上のペプチド提示）は、各ファージ粒子は、他の
無関係な融合タンパク質と共に、同種の融合タンパク質を提示する。これは、無
関係のＤＮＡを含有するファージに関連した融合タンパク質の捕捉のため、第１
ラウンドのソーティングにおけるバックグラウンドの増加を引き起こす。第１ラ
ウンドにおいて捕捉されたファージを、各E.coli細胞がただ一つのファージによ
り感染されるよう低い感染多重度におけるE.coliへの感染により増幅させた場合
、提示された融合タンパク質とそのＤＮＡ配列との相関は保存される。次いで、
第２ラウンドのソーティングは、標的との親和性を有するタンパク質をコードし
ないＤＮＡ配列を排除する。

【０１３５】 融合タンパク質とファージとの比率が１未満である一価提示（例えば、タンパ
ク質−３上のタンパク質提示）の場合、提示された各融合タンパク質は同種ＤＮ
Ａ配列と相関しているかもしれないし、又は無関係の共形質転換されたＤＮＡ配
列と相関しているかもしれない。最初のソーティングで使用されたファージの数
は、少なくともいくつかのＤＮＡ配列が、そのコードする融合タンパク質と連結
していることを保証するために十分に大きいのであれば、ある標的との親和性を
有する融合タンパク質を提示する（そして同種ＤＮＡ配列を含有する）ファージ
は選択可能であろう。多価提示の場合と同様に、融合タンパク質とファージＤＮ
Ａとの不適切な連結は、不適切なＤＮＡ配列の第１ラウンドにおける捕捉を引き
起こすであろうは、これらの配列は前記のように第２ラウンドで排除されうる。

【０１３６】 飽和濃度よりもはるかに高いＤＮＡ濃度の使用は、１回の電気穿孔における異
なるライブラリー由来のプラスミドでの細胞の共形質転換も可能にする。従って
、本発明は、２つ以上のライブラリーを連続的にではなく同時に導入することが
可能であるため、単一の細胞が異なるライブラリー由来の２つ以上のプラスミド
を維持することを必要とするあらゆる方法を容易にし、単純化するために使用さ
れうる。

【０１３７】 例えば、グリフィス（Griffiths）ら（EMBO Juornal 13(14):3245-3260, 1994
）は、ファージ抗体レパートリーのサイズを増加させるため、コンビナトリアル
感染及びin vivo組換えの過程を使用した。その過程は、２つの異なるライブラ
リーを作製するための軽鎖レパートリー及び重鎖レパートリーの別々の電気穿孔
を含んでいた。第三工程は、所望の抗体ライブラリーを得るため、２つのライブ
ラリーを組み合わせた。本発明により達成可能なＤＮＡ濃度は、１回の電気穿孔
における２つのライブラリーの共形質転換を可能にする。

【０１３８】 形質転換された細胞は、一般的に、抗生物質、通常、ベクター内のｔｅｔ及び
／又はａｍｐ耐性遺伝子の存在により細胞が耐性となるテトラサイクリン（ｔｅ
ｔ）又はアンピシリン（ａｍｐ）上での増殖により選択される。

【０１３９】 本発明において使用するための適切なファージベクター及びファージミドベク
ターは、ファージ提示のための全ての既知のベクターを含む。さらなる例は、ｐ
Ｃｏｍｂ８（Gram, J., Marconi, L. A., Barbas, C. F., Collet, T. A., Lern
er. R. A., and Kang, A. S. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-358
0）、ｐＣ８９（Felici, F., Catagnoli, L, Musacchio, A., Jappelli, R., an
d Cesareni, G. (1991)J. Mol. Biol. 222:310-310）、ｐＩＦ４（Bianchi, E.,
Folgori, A., Wallace, A., Nicotra, M., Acali, S., Phalipon, A., Barbaro
, G., Bazzo, R., Cortese, R., Felici, F., and Pessi, A. (1995)J. Mol. Bi
ol. 247:154-160）、ＰＭ４８、ＰＭ５２、及びＰＭ５４（Iannolo, G., Minenk
ova, O., Petruzzelli, R., and Cesareni, G. (1995)J. Mol. Biol. 248:835-8
44）、ｆｄＨ（Greenwood, J., Willis, A. E., and Perham, R. N. (1991)J. M
ol. Biol. 220:821-827）、ｐｆｄ８ＳＨＵ、ｐｆｄ８ＳＵ、ｐｆｄ８ＳＹ、及
びｆｄＩＳＰＬＡＹ８（Malik. P. and Perham, R. N. (1996)Gene, 171:49-51
）、「８８」（Smith, G. P. (1993)Gene, 128:1-2）、ｆ８８．４（Zhong, G.,
Smith, G. P., Berry, J. and Brunham, R. C. (1994)J. Biol. Chem. 269:241
83-24188）、ｐ８Ｖ５（Affymax）、ＭＢ１、ＭＢ２０、ＭＢ２６、ＭＢ２７、
ＭＢ２８、ＭＢ４２、ＭＢ４８、ＭＢ４９、ＭＢ５６（Markland, W., Roberts,
B. L., Saxena, M. J., Guterman, S. K., and Ladner, R. C. (1991)Gene, 10
9:13-19）を含む。同様に、ファージミドベクターがファージ提示システムにお
いて使用される場合には、あらゆる既知のヘルパーファージが使用されうる。適
切なヘルパーファージの例は、Ｍ１３−ＫＯ７（Pharmacia）、Ｍ１３−ＶＣＳ
（Stratagene）、及びＲ４０８（Stratagene）を含む。

【０１４０】 形質転換された細胞の選択の後、これらの細胞を培養により増殖させ、次いで
ベクターＤＮＡを単離することができる。ファージベクターＤＮＡ又はファージ
ミドベクターＤＮＡは、例えばSambrook. et al., Molecular Cloning:A Labora
tory Manual, 第２版, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Harbor, NYに記載されたような、当分野において既知の方法を用いて単離
されうる。単離されたＤＮＡは、サンブルックら（前記）のセクション１．４０
に記載された、前記のような当分野において既知の方法により精製されうる。次
いで、この精製されたＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により分析されうる。ＤＮＡ配
列決定は、Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309(1981)の方法、Maxam e
t al., Meth. Enzymol., 65:499(1980)の方法、又はその他のあらゆる既知の方
法により実施されうる。

【０１４１】 本発明は、複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること〔
ここで、複製可能発現ベクターは、宿主細胞における産物ポリペプチドの発現を
行うことが可能な制御配列と動作可能に連結した産物ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有し、産物ポリペプチドをコードするＤＮＡは、 （ａ）融合タンパク質をコードする遺伝子融合体と動作可能に連結した転写制御
要素を含む異型複製可能プラスミドのファミリーを構築すること（ここで、遺伝
子融合体はポリペプチドをコードする第一遺伝子と、ファージコートタンパク質
の少なくとも一部分をコードする第二遺伝子とを含有し、異型複製可能プラスミ
ドは異型ポリペプチドをコードする異型第一遺伝子を含有する）、 （ｂ）本発明の方法を用いて適切な宿主細胞をプラスミドで形質転換すること、 （ｃ）場合により、プラスミドがファージ粒子を産生するためにヘルパーファー
ジを必要とするファージミドである場合には、形質転換された宿主細胞に、表面
上に融合タンパク質を提示する組換えファージミド粒子を産生するために十分な
量のファージコートタンパク質をコードするヘルパーファージを感染させること
（ここで、好ましくは、微量のファージミド粒子のみが表面上に融合タンパク質
のコピーを一個又は複数個提示する）、 （ｄ）プラスミドの少なくとも一部分を含有し宿主細胞を形質転換することがで
きる組換えファージ粒子を形成させるために適切な条件下で、形質転換された感
染宿主細胞を培養すること、 （ｅ）ファージ粒子の少なくとも一部分が標的分子と結合するよう、組換えファ
ージ粒子を標的分子と接触させること、 （ｆ）標的分子と結合しないファージ粒子から結合するファージ粒子を分離する
こと、 （ｇ）標的分子と結合するファージ粒子又は結合しないファージ粒子中にコード
された異型ポリペプチドの一つを、産物ポリペプチドとして選択し、産物ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを複製可能発現ベクターへクローニングすることを含
む方法により得られたものである〕、並びに発現した産物ポリペプチドを回収す
ることにより得られた産物ポリペプチドを作製することも企図し、さらに、その
過程により作製された産物ポリペプチドも企図する。

【０１４２】 米国特許第５，７５０，３７３号は、複製可能発現ベクター（例えば、ファー
ジミド）で形質転換された宿主細胞を培養することにより産物ポリペプチドを作
製し回収する方法を一般的に記載しているは、その方法においては、通常のヘル
パーファージを用いて前記の工程（ａ）〜（ｆ）によりポリペプチドをコードす
るＤＮＡが得られており、微量のファージ粒子（＜２０％、好ましくは＜１０％
、より好ましくは＜１％）が表面上に融合タンパク質を提示する。組換えファー
ジミド粒子を作製するために、あらゆる適切なヘルパーファージ、例えばＶＣＳ
等が使用されうる。本発明は、高いＤＮＡ濃度を使用した電気穿孔による宿主細
胞の形質転換による改良された方法、及び本発明のその他の実施態様を提供する
。ファージ提示過程により得られた異型ポリペプチドの一つは、宿主細胞におけ
る組換え発現による、より大規模な産生のため選択されうる。宿主細胞における
産物ポリペプチドの発現を行うことができる制御配列と動作可能に連結した選択
された異型である産物ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する複製可能発現
ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、次いで既知の方法を用いて産物ポ
リペプチドを回収することは、本発明の一部分である。

【０１４３】 Ｂ．新規なコートタンパク質、コート融合タンパク質、ベクター、細胞及び方 法 バクテリオファージの表面上のポリペプチドの発現は、数年にわたり開発され
改善されてきた。特に、繊維状バクテリオファージの表面上に組換えのペプチド
、タンパク質、抗原及び抗体を提示するための系が開発されている。E.coliのよ
うなグラム陰性菌に感染することができる多数の繊維状ファージが同定されてい
る。これらのファージは、コートタンパク質のシリンダー内に被包されたわずか
約１０個の遺伝子を含有する、一本鎖の共有結合により閉環したＤＮＡゲノムを
有する。これらのウイルスは比較的単純であり、遺伝子操作が容易であるため、
繊維状ファージはよく研究されている。繊維状ファージの全ての株は、類似した
ビリオン構造及び生活環を有する。感染の際には、ウイルスＤＮＡが細胞に侵入
し、宿主の酵素により二本鎖の複製可能型に変換される。子孫ＤＮＡはローリン
グサークルメカニズムにより複製され、ウイルス複製組み立てタンパク質と共に
伸長されたＤＮＡ／タンパク質複合体へと組み立てられる。ビリオンは、複製組
み立てタンパク質がコートタンパク質により交換されている宿主細胞の膜から押
し出される。ビリオン鞘は、主要コートタンパク質として数千個の同一のα−ヘ
リックスタンパク質を含有する。

【０１４４】 外来ＤＮＡは、別の遺伝子としてウイルス遺伝子間領域に挿入されうる。異種
ＤＮＡが別の遺伝子として挿入された場合には、ウイルス又はウイルス由来プラ
スミド（ファージミド）はクローニングベクターとなる。異種ＤＮＡがウイルス
のコートタンパク質との遺伝子融合体として挿入された場合には、ウイルス又は
ファージミドは、異種ＤＮＡによりコードされたポリペプチドを融合タンパク質
としてビリオンの表面上に提示することができる。既知のファージ提示システム
における使用に適したあらゆるバクテリオファージの主要コートタンパク質の異
型を含有する融合タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。クラスＩ及びクラス
ＩＩの繊維状ファージは、本発明の範囲に含まれる。クラスＩはＦｆ株、ＩＫｅ
株及びＩｆ１株を含み、クラスＩＩはＰｆ１株、Ｐｆ３株及びＸｆ株を含む。Ｆ
ｆファージは、実質的に同一のｆｄ株、ｆ１株及びＭ１３株を含む。

【０１４５】 ファージＤＮＡとコートタンパク質との相互作用を理解するため、及びバクテ
リオファージ粒子へのコートタンパク質のパッキングを行う力を理解するため、
繊維状バクテリオファージの主要コートタンパク質の構造及び機能は、研究され
ている。これらの研究を補助するため、繊維状バクテリオファージの主要コート
タンパク質の点突然変異が調製された。Hunter, E. J. et al., (1987)Nature,
327:252、Greenwood, J. et al., (1991)J. Mol. Biol. 217:223、Deber, C. M.
et al., (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11648、Symmons, M. S. et a
l., (1995)J. Mol. Biol. 245:86、Williams, K. A. et al., (1995)J. Mol. Bi
ol. 252:6、Spruijt, R. B. et al., (1996)Biochemistry 35:10383、Marvin, D
. A. (1998)Current Opinion in Structural Biology 8:150、Haigh, N. G. and
Webster, R. E., (1998)J. Mol. Biol. 279:19。これらの研究は、いくつかの
点突然変異は、ファージにより許容され、突然変異型主要コートタンパク質を含
有するファージ粒子のパッケージングを引き起こすことを示唆した。しかし、こ
れらの研究は、いずれも、異型ファージコートタンパク質との異種ポリペプチド
の融合タンパク質を含んでいない。さらに、ファージコートへの融合タンパク質
の内含は、野生型コートタンパク質配列を使用した場合ですら、ファージのパッ
ケージングを妨害し、低いファージ収率を生じさせ、及び／又はファージの表面
上の融合タンパク質の提示を阻害する場合があることが既知である（Smith, G.
P. (1985), Science, 228:1315）。小さいペプチド（１０〜１５アミノ酸残基）
は一般的に最大でビリオン１個当たり約８００〜１０００コピー、提示されうる
は、全長タンパク質は、はるかに少ない数（ビリオン１個当たり１〜１０コピー
）で提示される。Malik, P. et al. (1996)J. Mol. Biol. 260:9。

【０１４６】 成熟Ｍ１３コートタンパク質VIIIと整列化させた繊維状バクテリオファージの
いくつかの既知の成熟コートタンパク質の配列を、以下の表に示す。欠失又は挿
入を導入せずにＭ１３タンパク質との最大の同一性を提供するため、コートタン
パク質のセグメントをＭ１３タンパク質VIIIと整列化させた。配列の上の番号は
、成熟Ｍ１３タンパク質VIIIの残基をさす。タンパク質配列は、デイホフ（Dayh
off）タンパク質データベースから採用された（登録番号：Ｍ１３、ＣＯＡＢ＿
ＢＰＦＤ；Ｆ１、ＣＯＡＢ＿ＢＰＦＤ；Ｆｄ、ＣＯＡＢ＿ＢＰＦＤ；Ｚｊ−２、
ＣＯＡＢ＿ＢＰＺＪ２；Ｉｆ−１、ＣＯＡＴ＿ＢＰＩＦ１；Ｉ２−２、ＣＯＡＢ
＿ＢＰＩ２２；Ｉｋｅ、ＣＯＡＢ＿ＢＰＩＫＥ）。相同な残基は、ダッシュで示
されている。単一の欠失を有する配列も既知である（国際特許公開第９２／１８
６１９号）。これらのコートタンパク質の配列の間、特にＭ１３コートタンパク
質、ｆ１コートタンパク質、ｆｄコートタンパク質及びＺｊ−２コートタンパク
質の間、並びにＩｆ１コートタンパク質、Ｉ２２コートタンパク質及びＩｋｅコ
ートタンパク質の間には相当の相同性が存在することを理解することができる。

【０１４７】

【表２】

【０１４８】 繊維状ファージ粒子は、ファージ遺伝子が宿主細胞において転写され、翻訳さ
れ、複製された場合に形成される。ファージコートタンパク質は、ペリプラズム
へ向かい、ペリプラズムのコートタンパク質の一部分（ペリプラズムドメイン）
、細胞質のコートタンパク質の一部分（細胞質ドメイン）、及び細胞膜内のコー
トタンパク質の一部分（膜貫通ドメイン）と共に一時的に細胞膜に留まる。ファ
ージ粒子は、ファージ粒子が細胞膜を通過する際、コートタンパク質がファージ
ＤＮＡの周囲で組み立てられる場合に形成される。Ｍ１３主要コートタンパク質
は、３つの領域に分割されうる５０残基を含有する。ペリプラズムドメインは残
基１から２０を含有し、膜貫通ドメインは残基２１から３９を含有し、細胞質ド
メイン残基は４０から５０を含有する（Marvin, D. A. (1998)Current Opinion
in Structural Biology 8:150）。前記の表のその他の主要コートタンパク質は
、類似したドメイン構造を有する。

【０１４９】 驚くべきことに、出願人らは、異種ポリペプチドとバクテリオファージの主要
コートタンパク質の異型との融合タンパク質は、ファージ提示システムにおいて
良好に許容されることも発見した。以前のファージ提示システムは、一般的には
Ｍ１３若しくはその断片、Ｔ４、Ｔ７又はラムダファージのコートタンパク質の
野生型コートタンパク質配列を用いるため、この結果は予想外のものであった。
本発明の一つの面において、ファージ提示及び選択は、一つ又は複数のアミノ酸
の置換、欠失又は付加を有するファージ主要コートタンパク質異型と融合した異
種ポリペプチドである融合タンパク質を表面上に提示するバクテリオファージを
得るため使用された。前記の表のコートタンパク質の異型と連結した異種ポリペ
プチドを有する融合タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。

【０１５０】 Ｍ１３、ｆ１及びｆｄのコートタンパク質VIIIの好ましい異型は、示された位
置に以下のリストから選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含有する。

【０１５１】

【表３】

【０１５２】 これらの表中、文字コードは以下のようなアミノ酸残基を意味する：Ａ（Ａｌ
ａ）アラニン；Ｂ（Ａｓｘ）アスパラギン又はアスパラギン酸；Ｃ（Ｃｙｓ）シ
ステイン；Ｄ（Ａｓｐ）アスパラギン酸；Ｅ（ｇｌｕ）グルタミン酸；Ｆ（Ｐｈ
ｅ）フェニルアラニン；Ｇ（Ｇｌｙ）グリシン；Ｈ（Ｈｉｓ）ヒスチジン；Ｉ（
Ｉｌｅ）イソロイシン；Ｋ（Ｌｙｓ）リシン；Ｌ（Ｌｅｕ）ロイシン；Ｍ（Ｍｅ
ｔ）メチオニン；Ｎ（Ａｓｎ）アスパラギン；Ｏ（Ｘａａ）停止コドン；Ｐ（Ｐ
ｒｏ）プロリン；Ｑ（Ｇｌｎ）グルタミン；Ｒ（Ａｒｇ）アルギニン；Ｓ（Ｓｅ
ｒ）セリン；Ｔ（Ｔｈｒ）トレオニン；Ｖ（Ｖａｌ）バリン；Ｗ（Ｔｒｐ）トリ
プトファン；Ｘ（Ｘａａ）未知又は非標準；Ｙ（Ｔｙｒ）チロシン；Ｚ（Ｇｌｘ
）グルタミン又はグルタミン酸。

【０１５３】 本発明の一部分として、ファージ提示システム及び方法における融合タンパク
質の成分として有用である主要コートタンパク質の突然変異体を産生するために
ファージ主要コートタンパク質のアミノ酸配列を修飾することができるというこ
とが発見された。バクテリオファージの主要コートタンパク質の突然変異体を含
有する融合タンパク質は、完全なウイルス粒子（ビリオン）内に融合タンパク質
をパッケージングするファージの能力に影響を及ぼす。すなわち、主要コートタ
ンパク質の突然変異体は、ウイルス粒子内に取込まれる融合タンパク質の数を変
えるために使用可能である。主要コートタンパク質の高機能性突然変異体は、ウ
イルス粒子内に取込まれる融合タンパク質の数を増加させるために使用可能であ
る。換言すると、低機能性異型は、融合タンパク質取込みを減少させるために使
用可能である。このように、本発明は、望ましいレベルの結合価を達成するべく
ウイルス粒子内への融合タンパク質の取込みを調整するための方法を提供してい
る。このことは、例えば、異種ポリペプチドが５０個以上のアミノ酸、好ましく
は１００個以上のアミノ酸、さらに好ましくは２００個以上のアミノ酸残基を含
んでいる場合、及び同様に異種ポリペプチドが２次及び３次構造をもつタンパク
質である場合といったように、異種ポリペプチドが比較的大きい融合タンパク質
にとって特に重要である。従って、本発明の方法は、バクテリオファージの主要
コートタンパク質を利用しかつ一般にウイルスコート内への限定的な融合タンパ
ク質取込みしか得られない先行技術のファージ提示方法の欠点を克服する１つの
手段を提供している。本発明の融合ポリペプチドは、異種ポリペプチドを用いて
従来使用されている野生型コートタンパク質融合を置換することによって既知の
ファージ提示システム内で機能することができる。本発明の融合ポリペプチドは
、既知のファージ提示システムの各々（融合がウイルスの主要コートタンパク質
とのものである）において、従来の融合タンパク質と同様に機能し、さらに、よ
り高い信頼性を有してファージの表面上に提示される融合タンパク質の数又は結
合価の度合を選択することを可能にする。例えば、U.S.5,223,409、U.S.5,403,4
84；U.S.5,571,689；U.S.5,750,373及びU.S.5,780,279（及び以上で記したその
他のもの）の中で記述されたファージ及びファージミドベクター及びファージ提
示システムを改変して、ペプチド、タンパク質、抗体及びそのフラッグメントの
ファージ表面上での提示を改善するべく本発明の融合タンパク質を使用すること
ができる。ファージは、好ましくはＤＮＡファージである。

【０１５４】 繊維状ファージに加えて、本発明は、ラムダファージ、バキュロウイルス、Ｔ
４ファージ及びＴ７ファージを用いるファージ提示システム内で使用するのに適
している。これらの提示システムの各々において、異種ポリペプチドを提示する
のに使用されるコートタンパク質は、本発明の方法を用いて、コートタンパク質
の異型を形成するために突然変異させ、所望の提示度をもつ異型（高機能性又は
低機能性異型）が選択される。その後、この選択された異型コートタンパク質は
、ウイルス粒子の表面上に提示されるべき異種ポリペプチドとの融合タンパク質
を形成するために使用される。本発明の範囲には、これらのファージ、融合タン
パク質、融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する複製可能な発現ベクター
、融合タンパク質又はベクターを含有するウイルス粒子、ウイルス粒子、融合タ
ンパク質又はベクターを含有する宿主細胞、及びこれらの融合タンパク質、ベク
ター、ビリオン、細胞などの複数の異なる個体を含有するライブラリーを用いた
本発明の方法が内含されている。

【０１５５】 ポリペプチドは、ファージ粒子の頭部又は尾部部分のいずれかの中でコートタ
ンパク質を用いるラムドイドファージ上で提示され得る（U.S.5,627,024）。適
切な頭部タンパク質としては、タンパク質ｐＥ，ｐＤ，ｐＢ，ｐＷ，ｐＦII，ｐ
Ｂ^*（ｐＢの分割産物）、ｐＸＩ及びｐＸ. ２が含まれる。適切な尾部タンパク
質としては、ｐＪ，ｐＶ，ｐＧ，ｐＭ及びｐＴが含まれる。これらのコートタン
パク質の構造及び場所は、周知である。Georgeopoulos, et al. 及び Katsura "
Lambda II"中、R. W. Hendrix et al. eds. Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor, N. Y., １９８３を参照せよ。本発明中で使用するための好
ましいラムダタンパク質は、尾部コートタンパク質，特にｐＶである。U.S.5,62
7,024号は、好ましくはｐＶを用いて、ラムダファージ上でどのようにポリペプ
チドを提示するかについて記述している。従って、本発明の融合タンパク質は、
異種ポリペプチドに融合されたｐＥ，ｐＤ，ｐＢ，ｐＷ，ｐＦII，ｐＢ*，ｐＸ
１，ｐＸ２，ｐＪ，ｐＶ，ｐＧ，ｐＭ及びｐＴの異型の少なくとも一部分を内含
する。

【０１５６】 ポリペプチドは同様にＴ４ファージ上でも提示されうる。Ｔ４ビリオンの構造
は充分に研究されている。「バクテリオファージＴ４」中のEiserlingのC.K.Mat
hews et al.、米国微生物学学会、ワシントンＤＣ，１９８３，ｐ１１〜２４を
参照せよ。ペプチド及び全長タンパク質は、Ｔ４ファージのＳＯＣ（小型外層カ
プシドタンパク質）及びＨＯＣ（高抗原性外層カプシドタンパク質）との融合と
して提示され得る。さらにｗａｘ（whiskerの抗原対照）遺伝子によりコードさ
れた微量Ｔ４繊維状タンパク質フィブリチンは、Ｃ末端において異種ポリペプチ
ドで長くなり、Ｔ４ひげ状結晶タンパク質上で提示される融合タンパク質を形成
することができる。Ren, Z-J, et al. (1998) Gene 215: 439; Zhu, Z. (1997)
CAN33: 534; Jiang. J et al. (1997) can 128: 44380; Ren, Z-J. et al. (199
7) CAN127: 215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833；及び Efimov, V.
P. et al. (1995) Virus Genes 10:173を参照せよ。

【０１５７】 ポリペプチド及びタンパク質を提示するのにＴ７ファージを使用することもで
きる。Smith, G. P. 及び Scott, J. K. (1993) Methods in Enzymology, 217,
228-257; U.S. 5, 766, 905。１０Ｂカプシドタンパク質（３９７アミノ酸）及
び１０Ａカプシドタンパク質（３４４アミノ酸）との融合タンパク質としてのポ
リペプチドの提示のための商業用キット（Novagen からのＴ７Select１−１及び
Ｔ７ Select ４１５−１）が利用可能である。これらのシステムは、使用が容易
であり、高コピー数（１ファージあたり４１５）で最高サイズ約５０アミノ酸ま
でのペプチド及び低コピー数（ファージあたり０．１〜１）で最高約１２００ア
ミノ酸までのタンパク質を提示する能力を有する。Ｔ７は、広範に研究されてき
た２本鎖ＤＮＡファージである（Dunn, J. J. 及び Studier, F. W. (1983) J.
Mol. Biol. 166:477-535; Steven, A. C. 及び Trus, B. L. (1986) Electron M
icroscopy of Proteins 5:1-35）。ファージの組立ては、宿主細胞（大腸菌）細
胞内部で生じ、成熟ファージは、細胞溶解によって放出される。１０Ｂ及び１０
ＡといったＴ７コートタンパク質の突然変異体に対する異種ポリペプチドの融合
タンパク質，融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターなどは、本
発明の範囲内に入る。好ましくは、融合タンパク質は、カプシドタンパク質１０
Ｂの残基１〜３４８のうちの１つ又は複数を改変させることによって、好ましく
は非野生型アミノ酸に突然変異させることによって調製される。

【０１５８】 本発明は同様に、バキュロウイルス コートタンパク質異型と異種ポリペプチ
ドの融合タンパク質をも内含している。バキュロウイルス発現ベクター、特にAu
tographa Californica核多角体病ウイルスに基づくものは、容易に産生され、現
在、培養された昆虫細胞及び昆虫幼虫内の、異種ポリペプチドの発現のために広
く使用されている（Weyer, U.及び Possee, R. D. (1991)J. Gen. Virol. 72:29
67）。これらのウイルスは２本鎖環状ゲノムを含有しており、ここに外来性遺伝
子を容易に挿入することができる。Tarui, H. et al. (1995)J. Fac. Agr. Kyus
u Univ., 40; 45。バキュロウイルスの主要コートタンパク質ｇｐ６４との融合
を用いてか、又は少なくともｇｐ６４の膜固着ドメインのみに対して異種ポリペ
プチドを融合させることによって、バキュロウイルス粒子の表面上にグリコシル
化された真核性タンパク質を提示することが可能である。「超後期」ポリヘドリ
ンプロモータ及び「初期及び後期」ｇｐ６４プロモータを含め、異なるプロモー
タ（ポリヘドリン、塩基性、ｇｐ６４−プロモータ）の効率が検討されてきた。
バキュロウイルスの表面上で効率良く外来性遺伝子を発現するためには、一方で
は充分な量の標的タンパク質を転写し、他方ではウイルス複製サイクル内の充分
早い時期に転写を開始して効率の良いパッケージングを保証し、グリコシル化を
完成させ、折畳みを矯正するような調節プロモータを選択することが必要である
。

【０１５９】 本発明のさらなる態様として、有用な主要コートタンパク質異型及びその融合
タンパク質を生成するべくファージ提示技術を主要コートタンパク質自体に適用
することができるということが発見された。発明のこの側面においては、第１の
ポリペプチドをコードする第１の遺伝子及びファージ提示システムで使用される
バクテリオファージの主要コートタンパク質の異型をコードする第２の遺伝子を
含有し、融合タンパク質をコードする遺伝子融合に対し動作可能に連結された転
写調節要素を発現ベクターが含有される、複製可能な発現ベクターライブラリー
が構築される。すなわち、第２の遺伝子が複数の異型ファージ主要コートタンパ
ク質をコードし、１つのポリペプチドの所望の融合タンパク質表面提示度を与え
る異型配列（単複）を選択するためにファージ提示システム又は方法が使用され
るライブラリーが構築される。異型を産生するための主要コートタンパク質のラ
ンダム化の度合は任意である。すなわち、コートタンパク質内の各アミノ酸残基
をあらゆるアミノ酸にランダム化することもでき、又は予め定められた制約条件
を有する、より限定されたライブラリーを産生するため各々の残基を１つのアミ
ノ酸サブセットに限定することもできる、ライブラリーを構築することができる
。同様に、アミノ酸サブセット内で残基サブセットが突然変異させることができ
るようになっている、すなわち選択された残基が不完全にランダム化されている
ライブラリーを構築することも可能である。例えば、特定の制約条件をもつより
小さなライブラリーを得るため、特定のアミノ酸残基のための異型の範囲を、極
性アミノ酸，疎水性アミノ酸，親水性アミノ酸，芳香族アミノ酸，正又は負に帯
電したアミノ酸，立体的に小型又は大型のアミノ酸，又はアミノ酸の特定の所望
の組合せに限定することが可能である。所望のライブラリーを調製するためにあ
らゆるアミノ酸組合せを使用することができる。

【０１６０】 主要コートタンパク質の所望のセグメント内のアミノ酸残基は、コートタンパ
ク質の規定の領域内にアミノ酸付加、置換又は欠失をもつ主要コートタンパク質
異型ライブラリーを得るように変えられるライブラリーを産生することも同様に
可能である。一例としては、主要コートタンパク質を、あらゆる数のゾーン、一
般に２〜１０ゾーンに分割し、ライブラリーを１つ以上のゾーン内の突然変異体
で構築することが可能である。例えばｆ１及びｆｄファージといったＭ１３の成
熟主要コートタンパク質は５０のアミノ酸を含有し、各々５個のアミノ酸残基か
ら成る１０個のゾーン、又は例えば１５，１０，９及び８個の残基を含むゾーン
といった各ゾーン内に等しくない数の残基を伴うゾーンに分割されうる。コート
タンパク質の細胞質、膜内外及び周辺質領域に対応するゾーンを使用することが
できる。アミノ酸改変が所望されるゾーンの各々について別々のライブラリーを
構築することができる。主要コートタンパク質異型は、例えばゾーン１内のアミ
ノ酸改変を有する融合タンパク質が所望される場合、ゾーン１内のアミノ酸残基
のうちの１つ以上のものが変えられた単一のライブラリーを構築することができ
る。代替的には、２つのゾーンがアミノ酸改変を含む融合タンパク質を産生する
ことが所望される場合もある。２つのゾーンのうちの１つの中に改変を含む各ラ
イブラリーを調製することが可能である。

【０１６１】 異型コートタンパク質融合は、野生型コートタンパク質配列との関係における
置換、付加又は欠失を含む１つ以上の改変を含有することになる。驚くべきこと
に、多数の改変が可能であり、ファージ表面上にポリペプチドを提示する能力を
保持しながらファージによって許容されている。さらに残基の化学的性質を変え
ることもできる。すなわち疎水性残基を親水性残基に改変したり又はその逆を行
なうこともできる。２〜４９個、好ましくは５〜４０個、より好ましくは７〜２
０個の改変済み残基を含有する異型が可能である。以下のタンパク質Ｐ１２の構
築により実証されるように、コートタンパク質の全ての残基を変化させることを
含め、主要コートタンパク質のアミノ酸のいずれでも変化させることができる。
コートタンパク質の野生型配列又はその一部分から変化するあらゆる成熟コート
タンパク質配列又はその一部分を含有する融合タンパク質は、本発明の範囲内に
入る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７
、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９
、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個の
異型残基を含有する主要コートタンパク質異型が可能である。置換又は数個の欠
失のみを含む異型は、野生型コートタンパク質配列とほぼ同じ長さを有すること
になるため好ましい。異種ポリペプチドの表面提示できない異型は、ファージの
提示、パンニング及び選択プロセス中に選択される。

【０１６２】 Ｍ１３主要コートタンパク質のための該ライブラリーの構築については、例３
に記述されている。ｈＧＨ又はＳＡＶの提示を増強させるタンパク質VIII異型の
選択については、例４に示されている。ライブラリー構築のためには、５０残基
のタンパク質VIIIは、およそ１０個の隣接残基を各々包含する５つゾーンへと分
割された。ＰＳ３４９によりコードされたｈＧＨ−タンパク質VIII融合内のタン
パク質VIII半分の各ゾーンについて１つのライブラリーが構築された。大部分の
位置は、完全な改変を受けなかったものの、全ての非リシン残基において改変が
可能であった。１０⁹個の可能なタンパク質VIII異型をコードする各ライブラリ
ーは、少なくとも３×１０⁹個の独立した形質転換体を含有していた。

【０１６３】 ライブラリーを、ｈＧＨｂｐ−コーディングされたプレート上での５ラウンド
の結合選択を通して別々に循環させた。個々のクローンの配列決定により、ゾー
ン１，２，及び３を包含するライブラリーからの選択体が明らかになった（図２
）。ソーン４及びゾーン５種は、その他のライブラリーからの夾雑物を生み出し
た。結果は、ゾーン１、２、３が突然変異に対して、より高い許容性を有し、従
って本発明における使用により適していることを示唆しているは、この結果は、
本発明の目的でゾーン４及び５における突然変異の使用を排除してはおらず、こ
れらのゾーン内での突然変異も本発明の範囲内に入っている。ライブラリー間の
汚染を回避するためさらに用心して実験をくり返すことにより、異種タンパク質
の提示を増強又は低下させる、ゾーン４及び５内の突然変異を伴う異型が生み出
されることになる。

【０１６４】 選択体は、平均して７つの突然変異を含み、野生型配列とは極端に異なってい
た。ゾーン１及び３については、強いコンセンサスは得られなかった。４つのゾ
ーン２の選択体のうちの３つは同一であったは、ストレプトアビジン提示のため
に選択されたそれに続くクローン（以下を参照）は、わずかなコンセンサスしか
生み出さなかった。わずか１つの残基（Ａｌａ１０）だけが野生型として完全に
保存され、６つの残基（Ａｌａ７，Ｌｅｕ１４，Ａｌａ１８，Ｉｌｅ２２，Ｍｅ
ｔ２８及びＶａｌ３０）は野生型に対するコンセンサスを示した。８つの位置が
突然変異体配列（Ｅ２Ｋ，Ｄ４Ｅ，Ｐ６Ｆ，Ｋ８Ｒ，Ｆ１１Ｙ，Ｇ２３Ｒ，Ａ２
７Ｔ，及びＶ２９Ｙ）に対するコンセンサスを示した。

【０１６５】 全ての選択体は、ｈＧＨ提示を増強させた；図２は、各ゾーンからの最良の選
択体についてのファージＥＬＩＳＡデータを示している。タンパク質VIII異型で
のｈＧＨ提示はピコモル以下の範囲のファージ濃度で検出可能なＥＬＩＳＡシグ
ナルを生成した。これとは対照的に、野生型タンパク質VIIIでのｈＧＨ提示は、
ナノモル範囲でのファージ濃度で検出可能なＥＬＩＳＡシグナルを生成した。し
たがって、タンパク質VIII異型は、シグナル強度を少なくとも３桁増大させる（
検出限界を低減させ）。

【０１６６】 ＳＡＶ提示についての選択は、ＳＡＶ−タンパク質VIII融合遺伝子内のタンパ
ク質VIII半分のゾーン１，ゾーン２及びゾーン３用のプールされたライブラリー
を用いて行なわれた。全ての選択体は、ゾーン２のライブラリーからのものであ
ったは、コンセンサスは最小限であった（図１Ｂ）。全ての選択体はＳＡＶ提示
を増強させた。２つの最良の選択体のためのファージＥＬＩＳＡデータは、図４
に示されている。異型は、抗ＳＡＶ抗体又はビオチニル化されたＢＳＡのいずれ
かに対する結合について検定されたときシグナル強度の５０倍の増加を提供する
。

【０１６７】 例８においては、ｈＧＨｂｐに対する低い結合親和力をもつｈＧＨ突然変異体
は、野生型タンパク質VIII 又は異型タンパク質VIII（ｌａ）のいずれかに対す
る融合として提示された。ファージＥＬＩＳＡデータは図３に示されている。予
想された通り、結合親和力の低減は、シグナル強度に対応する減少を生み出す。
野生型タンパク質VIII上で提示されたときには、最低限の親和力の相互作用（Ｋ
ｄ＝８２０mM，野生型の５００分の１）が僅かに検出可能である。同じ相互作用
は、タンパク質VIII異型上で提示されたとき極めて強いシグナルを提供する。実
際には、タンパク質VIII異型上の最低限の親和力の相互作用の提示は、野生型タ
ンパク質VIIIに連結された野生型ｈＧＨのものに比べて少なくとも２桁大きいＥ
ＬＩＳＡシグナルを提供する。

【０１６８】 複数のゾーン内での改変を伴う異型は、上述のとおり可能である。かかる異型
は、まず第１に単一ゾーン（例えばゾーン１）内に改変を伴う異型を得、次にも
う１つのゾーン（例えばゾーン２）が突然変異される第２ラウンドの選択のため
の鋳型としてこの異型を使用することによって得ることができる。したがって、
このプロセスにより得られた異型は、２つのゾーン（例えばゾーン１及び２）内
に突然変異を有することになる。あるいは、異なる異型から単一の異型へと突然
変異を組合せるために、部異特異的突然変異誘発を使用することができる。例え
ば、ゾーン１内に突然変異を有する異型からの突然変異をゾーン２内に突然変異
を有する異型に導入して、ゾーン１及び２の両方に突然変異を有する新しい異型
を産生することができる。この過程は、実施例９に示されている。

【０１６９】 明らかに、両方の方法ともに、主要コートタンパク質配列全体を場合によって
包含し得るあらゆる数のゾーンまで拡大することができる。したがって、野生型
に対し最小限の相同性しかもたない主要コートタンパク質の異型を得ることが可
能である。極端な配列の変動の潜在的可能性は、次には、機能上の極端な変動を
与える。極端に高い機能性から極端に低い機能性に至る範囲の異型を容易に得る
ことができる。したがって、本発明は、コートタンパク質に融合されたあらゆる
異種タンパク質の提示レベルを誂えるために使用することができる。本発明は、
野生型コートタンパク質に対する限定された相同性しかもたないタンパク質の産
生を可能にするものの、新しいタンパク質はなおも野生型タンパク質の異型であ
り（以上の定義を参照せよ）、従って本発明の範囲内である。

【０１７０】 ファージ粒子の表面上での異種ポリペプチドの提示を改善する異型主要コート
タンパク質は、野生型に対する多数の突然変異を含有する場合、新しい異型及び
野生型主要コートタンパク質で得られたレベルの中間のレベルで異種ポリペプチ
ドを提示する異型を得ることも同様に可能である。これは、野生型配列又は別の
改変された残基に異型の突然変異済みアミノ酸の各々を別々に復帰突然変異させ
ることによって達成される。一般には、これらの復帰突然変異は、異種ポリペプ
チドの提示レベルを、異型及び野生型主要コートタンパク質で得られる提示レベ
ルの間で変動するレベルまで低減させることになる。復帰突然変異を組合わせる
ことにより、異型及び野生型主要コートタンパク質で得られるものの間にある１
つの所望のレベルに合わせた提示を誂えることが可能である。この過程は、実施
例１０に示される。

【０１７１】 類似のプロセスによって、野生型コートタンパク質のレベルに比べて低いレベ
ルで提示する異型を得ることが可能である。例えば、１つ以上のゾーン内で突然
変異を行ない、産生されたライブラリーを、弱くしか結合しない（野生型融合を
提示するファージに比べて弱い）ファージについて選別することができる。より
弱い結合ファージは、野生型コートタンパク質融合を提示するファージによって
置換されることになり、既知の方法を用いて分離及び配列決定され得る。

【０１７２】 ウイルスコート内への取込みのためには低機能性でありしたがって野生型コー
トタンパク質との関係における融合タンパク質の提示を低減させる突然変異体コ
ートタンパク質を得ることができる。この場合、突然変異は、高機能性異型につ
いての上述の選択において野生型として保存されやすい残基について行なわれる
（例えば、タンパク質VIII 中のＡｌａ１０，Ａｌａ７，Ｌｅｕ１４，Ａｌａ１
８，Ｉｌｅ２２，Ｍｅｔ２８及びＶａｌ３０）。高機能性異型についての選択の
間に野生型としてこれらの残基を保存することは、これらの残基における突然変
異が充分に寛容されず、低機能性異型を産生する傾向をもつことになる、という
ことを表わしている。これらの部位での突然変異によって得られた異型は、次に
、野生型コートタンパク質提示レベルとの関係において所定の融合タンパク質を
提示させるその能力についてスクリーニングされ得る。融合タンパク質の異種ペ
プチド部分は、結合パートナにより捕捉又は結合されうるあらゆるポリペプチド
又はタンパク質であり得る。適切な融合は、抗体又は結合パートナにより結合さ
れ得るエピトープタグ又はその他のポリペプチドを提示し得る。野生型との関係
における所望の低減したレベルでの融合を提示する低機能性異型は、次に、ファ
ージ提示を目的として融合タンパク質のライブラリーを構築するために使用する
ことができる。低機能性異型の産生のための好ましい残基は、野生型として保存
されたものであるは、コートタンパク質のあらゆる残基を突然変異させ、結果と
して得られた異型を、融合タンパク質の提示を可能にするその能力についてテス
トすることができる。このように、単に適切な高機能性突然変異体を使用するこ
とにより野生型によって付与されるものに比べて低い提示レベルを選択すること
が可能である。上述の高機能性異型の場合と同様に、所望するレベルまでのさら
なる提示の低減を生み出すべく、複数の低機能性突然変異を組合わせることがで
きる。低機能性異型の選択には、選択よりもむしろスクリーニングが必要である
ものの、タンパク質中の大部分の突然変異が活性の増加ではなくむしろ減少をひ
き起こすことから、この方法は、比較的単純であり、適切なスクリーニング手順
は公知である。したがって、コートタンパク質内の大部分の突然変異は、低機能
性異型を結果としてもたらす害のある突然変異であるはずである。

【０１７３】 発現ベクターライブラリーは場合により混合され、ファージ又はファージミド
粒子を形成するのに適した条件下でその後培養される適切な宿主細胞を形質転換
するのに使用される。ファージ又はファージミド粒子は、ファージの表面上に提
示された融合タンパク質のポリペプチド部分に結合する能力をもつ標的分子と接
触させられ、したがって、ファージ粒子の少なくとも一部分が標的分子に結合す
るようになっている。ウイルス粒子上でさらに多い数で提示された融合タンパク
質を含有する粒子は、好ましくは標的分子による結合を受けることになる。結合
しない粒子から標的に結合する粒子を分離することにより、粒子の表面上でより
数多くの異種タンパク質を提示する融合タンパク質を含有する質を高めた粒子の
ライブラリーを得ることが可能となる。このパンニングプロセスは、多数回、一
般的には２〜１０回、好ましくは２〜６回反復され、突然変異体である主要コー
トタンパク質の選択された突然変異体に連結された異種ポリペプチドの融合タン
パク質をコードする融合遺伝子を含有するさらに富化されたライブラリー（ライ
ブラリーは、ファージ提示システム内のウイルスコート内への融合タンパク質の
取込みの改善を可能にする）を得ることができる。この方法により、ファージ粒
子の表面上で特定の異種ポリペプチド、そして場合によりその他のポリペプチド
を融合タンパク質として提示する能力が最も高い主要コートタンパク質異型を選
択することが可能となる。

【０１７４】 上述のプロセスにより選択されたクローンは、ファージ提示システム内でファ
ージの表面上で異種タンパク質を提示する改善された能力を有することになる。
従って、この方法は野生型コートタンパク質アミノ酸配列に基づく融合タンパク
質を用いて提示するのが困難である異種ポリペプチドを提示する上で一般的に有
用である。改善された融合タンパク質は、一価及び／又は多価のファージ提示シ
ステム内で使用することができる。多価の系においては、ファージ粒子上で発現
される融合タンパク質の数を増大させるため又は提示されたタンパク質の数を望
ましい範囲にモジュレーションさせるために、改善された融合タンパク質を使用
することができる。より多数の融合タンパク質を提示するファージ粒子は、標的
分子に対するより大きい親和力をもち、好ましくは、結合され融合タンパク質と
してより少ない異種ポリペプチドを提示する粒子から分離されることになる。こ
れは、リガンドの結合親和力は、ヒト化などによる抗体又は抗体フラッグメント
の成熟といったような既知のタンパク質工学処理技術によってリガンドの結合親
和力が増強させられることになる弱結合性リガンドの発見のためのプロセスにお
いて有用である。多価の提示においては、本発明の融合タンパク質は、ファージ
表面上のわずか数個〜数百個のポリペプチドの提示を可能にする。一般に、適度
の提示システムにおいては、約３〜約５０個のポリペプチドが提示されることに
なる。しかしながら、本発明の融合タンパク質及びファージ提示システムの場合
、高い提示数の能力を有するファージ提示によってコートタンパク質異型を選択
することによって、約５０個、好ましくは１００個〜９００個そして最高約１０
００個以上のポリペプチドを提示することも可能である。

【０１７５】 コートタンパク質に融合された抗原タンパク質を発現するファージに基づくワ
クチン接種技術についてはすでに記述されている。(Fanutti, C., et al. (1998
) Biochem. Soc. Trans., 26:S8; Jiang, J., et al. (1997) Infect. Immun.,
65;4770; Delmastro, P., et al. (1997) Vaccine, 15:1276; Galfre. G., et a
l. (1996) Methods Enzymol., 267:109)本発明は、ファージワクチン接種の有効
性を高めるためにも使用可能である。ファージ表面上のタンパク質融合の発現を
増強させるコートタンパク質の異型は、ファージワクチン接種の抗原性を増強さ
せる。さらに、この方法は、ハプテンとして免疫系を刺激するコートタンパク質
の異型を生成するために使用可能である。あるいは、本発明を、抗原タンパク質
を保有するファージに対する免疫応答を改善するために使用することもできる。

【０１７６】 あるいは、一価の提示システムにおいては、本発明の方法及び融合タンパク質
は、所望の親和力の検出及び富化を可能にするのに充分高いものの、多価性と結
びつけられた結合力効果を回避するのに充分低いレベルに合わせてタンパク質の
提示を精確に誂えるために使用可能である。野生型主要コートタンパク質に対す
る融合として多価で提示するタンパク質を、適切な低機能性主要コートタンパク
質異型に対する融合として一価で提示することが可能である。野生型主要コート
タンパク質上で全く提示されないタンパク質（すなわちファージ関連構成要素と
して検出され得ないタンパク質）は、適切な高機能性主要コートタンパク質異型
に対する融合として一価で提示されうる。

【０１７７】 ファージ粒子の表面上での異種ポリペプチドの提示を改善し／誂える異型主要
コートタンパク質を得た時点で、もともと提示された異種ポリペプチドの異型の
ライブラリーを構築し、例えば結合、酵素活性などの所望の特性について選択す
るべく従来のファージ提示技術を使用することが可能である。所望の提示特性を
提供するファージの主要コートタンパク質の選択された異型を含有する本発明の
融合タンパク質は、従来の融合タンパク質が主要コートタンパク質又はコートタ
ンパク質フラッグメントの野生型アミノ酸配列を含有する従来のファージ提示シ
ステム内で融合タンパク質に置換するために使用することができる。本発明の異
型融合タンパク質で従来の融合タンパク質を置換することにより、ファージ提示
システム内の異種ポリペプチドの提示が改善される。すなわち、コートタンパク
質部分は、融合タンパク質として提示されるポリペプチドのために最適化されて
いる。

【０１７８】 さらに、第２の異なる異種ポリペプチドを用いて上述の通りに得られる新しい
融合タンパク質内の当初の異種ポリペプチドを置換し、ウイルス粒子内への融合
タンパク質の改善された取込みの恩恵を維持することも可能である。例７を参照
せよ。発明のこの態様においては、上述のようなファージ提示、パンニング及び
選択によって得られたもとのポリペプチド／主要コートタンパク質異型の融合を
コードする融合遺伝子は、問題の第２のポリペプチドをコードする遺伝子で第１
のポリペプチドをコードする遺伝子を置換するように改変される。次に、第２の
ポリペプチドの１つ以上の残基は、ファージ提示パンニング及び選択により突然
変異され選択される従来のファージ提示ライブラリーを構築し、所望の（例えば
改善された）結合特性をもつ第２のポリペプチドの異型を得ることができる。こ
の結果は、融合タンパク質の異型コートタンパク質部分が異なる（例えば当初の
）ポリペプチドを提示する能力について当初選択されたものであるため、驚くべ
きものでもある。それでも、異種ポリペプチドの改善された提示について選択さ
れた突然変異体コートタンパク質部分を含有する融合タンパク質が同様に一般に
その他の無関係の異種ポリペプチド，さらには多数のサブユニットを含有するそ
の他のポリペプチドの提示の改善も提供することになるということが発見された
。異型コートタンパク質部分を含有する融合タンパク質はさらに一般的ファージ
提示システム内でも使用可能である。

【０１７９】 本発明のファージ提示システムは、同様に従来の組換え型ＤＮＡ技術を用いて
治療用ポリペプチドとして産生されるポリペプチドを分離するためにも使用可能
である。この実施形態では、上述の方法は、ファージ提示で使用するため所望の
コートタンパク質異型部分を含む融合タンパク質を同定するために使用される。
融合タンパク質の異種ポリペプチド部分は、所望の製品ポリペプチド自体であっ
てもよいし、又は上述のような改善された表面提示を提供するコートタンパク質
異型部分について選択するためにこのファージ提示工程が使用される異なるポリ
ペプチドであってもよい。異種ポリペプチドのための遺伝子と合わせて融合遺伝
子内の選択されたコートタンパク質異型部分のための遺伝子を用いる、このとき
製品ポリペプチド配列を得るべく、異なる潜在的製品異種ポリペプチドのライブ
ラリーから最適化及び選択を行なうためファージ提示を用いることができる。こ
のときこの製品ポリペプチド配列は、製品ポリペプチドをコードする遺伝子融合
に対し動作可能に連結された転写調節要素を含有する発現プラスミドへとクロー
ニングされる。哺乳動物又は細菌の細胞内での遺伝子融合の発現は、周知の組換
え型技術を用いて製品ポリペプチドを生み出す。Sambrook et al. を参照せよ。

【０１８０】 必ずしもポリペプチドを提示するのに使用されたファージの主要コートタンパ
ク質ではない、ファージコートタンパク質の一部分と異種ポリペプチドの融合タ
ンパク質を調製することも、本発明の範囲内に入る。この実施形態においては、
例えば、繊維状ファージのコートタンパク質III といったような小コートタンパ
ク質は突然変異を受けて上述のような融合タンパク質及びファージ異型のファミ
リー及びライブラリーを形成し、異種ポリペプチドとコートタンパク質異型の少
なくとも一部分の融合タンパク質を提示する特異的ファージを得るためにファー
ジ提示選択及びパンニングが使用される。好ましくは、コートタンパク質部分は
、コートタンパク質の細胞質ドメイン内又は膜内外ドメイン内に少なくとも１つ
の改変済み残基をもつ突然変異体である。コートタンパク質IIIに関しては、こ
れらの改変済み残基は、好ましくは、成熟コートタンパク質IIIのアミノ末端か
ら計数したとき３７７〜４０６の残基領域内にくることになる（Marvin D. A.,
繊維状ファージ構造、感染及び組立て、Current Opinion in Structural Biolog
y, 1998, 8: 150-158)。コートタンパク質III異型は、主要コートタンパク質に
ついて一般的に上述したように複数の異型残基を含有することができる。

【０１８１】 ポリペプチドの提示のための適切な遺伝子III ベクターとしては以下のものが
含まれる：ｆＵＳＥ５（Scott, J. K. 及び Smith G. P. (1990)。エピトープラ
イブラリーを用いたペプチドリガンドを探索すること。Science 249, 386-390);
fAFF1(Cwirla., S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., 及び Dower, W. J.
(1990)。ファージのペプチド；リガンドを同定するためのペプチドの莫大な提示
ライブラリー。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 87, 6378-6382); fd-CATI(McC
afferty, J., Griffiths, A., D., Winter, G., 及び CＨｉｓwell, D., J. (19
90)。ファージの抗体：抗体可変ドメインを提示する繊維状ファージ。Nature (L
ondon)348, 552-554); m663(Fowlkes, D., Adams, M., Fowler, V. 及び Kay, B
. (1992). Ｍ１３ウイルス表面上のペプチド発現のための汎用ベクター。Biotec
hniques 13, 422-427); fdtetDOG, pHEN1(Hoogenboom, H., Griffiths, A., Joh
nson, K., CＨｉｓswell, D., Hudson, P., 及び Winter, G(1991)．繊維状ファ
ージの表面上の多重サブユニットタンパク質：抗体（Ｆａｂ）重及び軽鎖を提示
するための方法。Nucleic Acids Res. 19:4133-4137); pComb3(Gram, H., Marco
ni, L. A., Barbas. C. F., Collet, T. A., Lerner, R. A., 及び Kang, A. S.
(1992)。特定の投薬を受けていない組換え免疫グロブリンライブラリーからの
抗体の In vitro 選択及び親和力成熟。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 89, 3
576-3580); pCANTAB5E(Pharmacia); 及び LamdaSurfZap (Hogrefe, H. H., Ambe
rg, J. R., Hay, B. N., Sorge, J. A., 及び Shopes, B. (1993)繊維状ファー
ジ上の結合タンパク質の結合の提示のためのバクテリオファージラムダベクター
内のクローニング。Gene137, 85-91)。

【０１８２】 融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合に動作可能に連結された転写調節要
素を含有する突然変異体複製可能ベクターのファミリーを構築する段階、適切な
宿主細胞を形質転換する段階、ファージ粒子の表面上に融合ポリペプチドを提示
するファージ粒子を形成するべく形質転換済み細胞を培養する段階、組換え型フ
ァージ粒子を標的分子と接触させて粒子の少なくとも一部分が標的に結合するよ
うにする段階、結合する粒子と結合しない粒子から分離する段階を含む、タンパ
ク質、ペプチド及びその突然変異済み突然変異体のためのファージ提示方法は、
既知のものであり、本発明の方法と共に使用することができる。U.S. 5,750,373
; WO 97/09446; U.S. 5,514,548; U.S. 5,498,538; U.S. 5,516,637; U.S. 5,43
2,018; WO 96/22393; U.S. 5,658,727; U.S. 5,627,024; WO 97/29185; O'Boyle
et al., 1997, Virology, 236:338-347; Soumillion et al., 1994, Appl. Bio
chem, Biotech., 47:175-190; O'Neil 及び Hoess, 1995, Curr. Opin. Struct.
Biol., 5:443-449; Makowski, 1993, Gene, 128:5-11; Dunn; 1996, Curr. Opi
n. Struct. Biol., 7:547-553; Choo and Klug, 1995, Curr. Opin. Struct. Bi
ol., 6:431-436; Bradbury and Cattaneo, 1995, TINS, 18:242-249; Cortese e
t al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol., 6:73-80; Allen et al., 1995, TIB
S, 20:509-516; Lindquist 及び Naderi, 1995, FEMS Micro. Rev., 17:33-39;
Clarkson 及び Wells, 1994, Tibtech, 12:173-184; Barbas, 1993, Curr. Opin
. Biol., 4:526-530; MoGregor, 1996, Mol. Biotch., 6:155-162; Cortese et
al., 1996, Curr. Opin. Biol., 7:616-621; McLafferty et al., 1993, Gene,
128:29-36を参照せよ。

【０１８３】 融合タンパク質の異種ポリペプチド部分は、４〜１０個という又は最高２０〜
３０個さらには最高約５０〜８０個といったわずかなアミノ酸残基を含有するこ
とができる。これらの比較的小さいペプチドは、例えばペプチドの抗原特性を決
定する上で、又タンパク質の抗原部位をマッピングする上で有用である。異種ポ
リペプチドは、標的と相互作用する能力をもつ複数のアミノ酸を提示する複数の
剛性二次構造を形成するべく折畳むことのできる少なくとも約１００個のアミノ
酸残基を含有する１つ以上のサブユニットを含んでいてもよい。融合タンパク質
の異種ポリペプチド部分がライブラリーを形成するべく突然変異を受けファージ
提示選択に付される場合、剛性二次構造の無欠性が保存されることになるように
標的と相互作用する能力をもつアミノ酸に対応するコドンにおいてポリペプチド
が突然変異を受けることが好ましい。残基は、例えばアラニン走査突然変異誘発
によって決定できる。U.S. 5,580,723 及びU.S. 5,766,854。

【０１８４】 異種ポリペプチド部分は同様にタンパク質，好ましくは哺乳動物のタンパク質
，例えばサイトカインであってもよく、このタンパク質はヒト成長ホルモン（ｈ
ＧＨ），Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモ
ン、チロキシン、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、プロインシュリン、リ
ラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン例えば
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），ロイチン化ホル
モン（ＬＨ），糖タンパク質ホルモンレセプタ、カルシトニン、グルカゴン、第
VIII因子、抗体、肺表面活性剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織
型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ），ボンベシン、第VII 因子、第IX因子
及び第Ｘ因子を含む凝固カスケード因子、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死
α及びβ因子、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミューラー管阻害物
質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、微生物タンパク質例えばベータラクタ
ーゼ、組織因子タンパク質，インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥ
ＧＦ），ホルモン又は成長因子に対するレセプタ；インテグリン、トロンボポイ
エチン（ＴＰＯ），プロテインＡ又はＤ，リウマチ因子、神経成長因子例えばＮ
ＧＦ−アルファ、血小板成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）例えばＴＧＦ−
アルファ及びＴＧＦ−ベータ、インシュリン様成長因子−Ｉ及び−II，インシュ
リン様成長因子結合タンパク質，ＣＤ−４，ＤNase, 潜伏期間関連ペプチド、エ
リスロポイエチン（ＥＰＯ），骨形成誘発性因子、インタフェロン例えばα−イ
ンタフェロン、アルファコン−１，β及びγ−インタフェロン、コロニー刺激因
子（ＣＳＦ）例えばＭ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ，インタロイキン
（ＩＬ）例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８
，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，スーパーオキサイドジスムターゼ；崩壊加速因子、
ウイルス抗原、ＨIV外被タンパク質例えばＧＰ１２０，ＧＰ１４０，心房ナトリ
ウム排泄増加ペプチドＡ，Ｂ又はＣ，Ａpo２Ｌ，新規赤血球形成刺激タンパク質
（ＮＥＳＰ），アンセスチム、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、脳由来神経
栄養性因子（ＢＤＮＦ），グリア細胞系統由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ），レ
プチン、ＩＬ−１ レセプタアンタゴニスト（ＩＬ−１ra），可溶性腫瘍壊死因
子−ａレセプタ−Ｉ型（ｓＴＮＦ−ＲＩ），免疫グロブリン、ならびに上述のタ
ンパク質のいずれかの突然変異体及びフラッグメントの中から選択することがで
きる。

【０１８５】 異種ポリペプチド部分は同様に、融合タンパク質を同定しかつ／又は捕獲し精
製するためのエピトープタグとしても知られている分子タグをも含むことができ
る。例えば、タグは、抗ｇＤ抗体に対する結合を通して融合タンパク質を親和力
精製するのに使用可能である単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（Paborsky e
t al. 1990, Protein Engineering, 3:547-553），プロテインＡ又はそのフラッ
グメント（Li et al. (1998) Mol Biotech, 9:187），ポリヒスチジンタグ、例
えば金属イオン（Ｎｉ）カラムに対する結合を通して融合タンパク質を同定しか
つ／又は精製するのに使用可能な（Ｈｉｓ)₆ (Sporeno et al., 1994, J. Biol.
Chem, 269:10991-10995; Stuber et al., 1990, Immunol. Methods, 4:121-152
, Waeber et al., 1993, FEBS Letters, 324:109-112）など（ＱＬＡＥＸＰＲＥ
ＳＳ Ｎｉ−ＮＴＡタンパク質精製システム、Quiagen Inc.) であってよい。

【０１８６】 特に好ましい実施形態においては、融合タンパク質の異種ポリペプチド部分は
、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′)₂，Ｆｖ，diabodies, 線状抗体などといった抗体又はそ
のフラッグメントの軽鎖又は重鎖である。ポリペプチドは同様に１本鎖抗体（sc
Ｆv）であってもよい。抗体又はそのフラッグメントのライブラリーの調製は、
当該技術分野において周知のものであり、本発明の方法及び融合タンパク質を用
いて宿主細胞に形質転換されうる形質転換ベクターのファミリーを構築するため
には、既知の方法のいずれを用いてもよい。ファージ又はファージミド内の融合
タンパク質としての及びファージ内の抗体軽鎖及び重鎖のライブラリー（Huse e
t al., 1989, Science, 246:1275）は周知のものであり、既知の手順に従って調
製することができる。上述の Vaughan et al., Barbas et al., Marks et al.,
Hoogenboom et al., Griffiths et al., de Kruif et al., 及び WO 98/05344;W
O 98/15833; WO 97/47314; WO 97/44491; WO 97/35196; WO 95/34648; U.S. 5,7
12,089; U.S. 5,702,892; U.S. 5,427,908; U.S. 5,403,484; U.S. 5,432,018;
U.S. 5,270,170; WO 92/06176; U.S. 5,702,892 を参照せよ。論評も同様に出版
されている。Hoogenboom, 1997, Tibtech, 15: 62-70; Neri et al., 1995, Cel
l Biophysics, 27; 47; Winter et al., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12:433-4
55; Soderlind et al., 1992, Immunol, Rev., 130:109-124; Jefferies, 1998,
Parasitology, 14:202-206.

【０１８７】 ＨＩポリペプチド部分として考慮されている特異的抗体としては、ヒト白血球
表面マーカー、サイトカイン及びサイトカインレセプタ、酵素などに結合する抗
体が含まれる。特異的白血球表面マーカーとしては、ＣＤ１a-c, ＣＤ２，ＣＤ
２Ｒ，ＣＤ３−ＣＤ１０，ＣＤｌ１a-c, ＣＤｗ１２，ＣＤ１３，ＣＤ１４，Ｃ
Ｄ１５，ＣＤ１５s, ＣＤ１６，ＣＤ１６b，ＣＤｗ１７，ＣＤ１８−Ｃ４１，Ｃ
Ｄ４２a-d，ＣＤ４３，ＣＤ４４，ＣＤ４４Ｒ，ＣＤ４５，ＣＤ４５Ａ，ＣＤ４
５Ｂ，ＣＤ４５Ｏ，ＣＤ４６−ＣＤ４８，ＣＤ４９a-f，ＣＤ５０−ＣＤ５１，
ＣＤ５２，ＣＤ５３−ＣＤ５９，ＣＤｗ６０，ＣＤ６１，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２
Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６３，ＣＤ６４，ＣＤｗ６５，ＣＤ６６a-e，ＣＤ６８−
ＣＤ７４，ＣＤｗ７５，ＣＤｗ７６，ＣＤ７７，ＣＤｗ７８，ＣＤ７９a-b，Ｃ
Ｄ８０−ＣＤ８３，ＣＤｗ８４，ＣＤ８５−ＣＤ８９，ＣＤｗ９０，ＣＤ９１，
ＣＤｗ９２，ＣＤ９３−ＣＤ９８，ＣＤ９９，ＣＤ９９Ｒ，ＣＤ１００，ＣＤｗ
１０１，ＣＤ１０２−ＣＤ１０６，ＣＤ１０７a-b，ＣＤｗ１０８，ＣＤｗ１０
９，ＣＤ１１５，ＣＤｗ１１６，ＣＤ１１７，ＣＤ１１９，ＣＤ１２０a-b，Ｃ
Ｄ１２１a-b，ＣＤ１２２，ＣＤｗ１２４，ＣＤ１２６−ＣＤ１２９，及びＣＤ
１３０が含まれる。

【０１８８】 その他の抗体結合標的しては、頻繁にＷＳＸＷＳドメインを含む著しい相同性
を共有し一般にサイトカインレセプタ−スーパーファミリーのメンバーとして分
類されている一群の密に関係する糖タンパク質細胞表面レセプタである、サイト
カイン及びサイトカインスーパファミリーレセプタ、造血成長因子スーパーファ
ミリーレセプタそして好ましくはそれらの細胞外ドメインが含まれる（例えば N
icola et al., Cell, 67: 1-4(1991) 及び Skoda, R. C. et al EMBO J. 12:264
5-2653(1993)を参照せよ）。一般にこれらの標的は、インターロイキン（ＩＬ）
又はコロニー刺激因子（ＣＳＦ）のためのレセプタである。スーパーファミリー
のメンバーとしてはＩＬ−２（ｂ及びｇ鎖）（Hatakeyama et al., Science, 24
4:551-556(1989); Takeshita et al., Science, 257; 379-382(1991))、ＩＬ−
３(Itoh et al., Science, 247; 324-328(1990); Gorman et al., Proc. Natl.
Acad, Sci, USA, 87:5459-5463(1990); Kitamura et al., Cell, 66:1165-1174(
1991a); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086(1991b)
)、ＩＬ−４(Mosley et al., Cell, 59:335-348(1989)）、ＩＬ−５(Takaki et
al., EMBO J., 9:4367-4374(1990); Tavernier et al., Cell, 66:1175-1184(19
91))、ＩＬ−６(Yamasaki et al., Science, 241:825-828(1988); Hibi et al.,
Cell, 63:1149-1157(1990)）、ＩＬ−７(Goodwin et al., Cell, 60:941-951(1
990)）、ＩＬ−９(Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5690-569
4(1992)）、粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Gearing
et al., EMBO J., 8:3667-3676(1991)；Hayashida et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 244:9655-9659(1990)）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）(Fuk
unaga et al., Cell, 61:341-350(1990a); Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA. 87:8702-8706(1990b); Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1
570(1990)）、ＰＯ（D'Andrea et al., Cell, 57:277-285(1989); Jones et al.
, Blood. 76:31-35(1990)）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）(Gearing et al., EMBO
J., 10:2839-2848(1991)）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Rose et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645(1991)）に対するレセプタと同様にプロ
ラクチン（Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748(1988);
Edery et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116(1989)）。成長ホ
ルモン（ＧＨ）（Leung et al., Nature, 330:537-543(1987)）、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）（Davis et al., Science, 253:59-63(1991）及びｃ−ＭＰ
ｌ（M. Souyri et al., Cell 63:1137(1990); L Vigon et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 89:5640(1992)）に対するレセプタが含まれるは、これらに制限される
わけではない。本発明により作られた抗体のためのさらにその他の標的は、erb
２，erb３，erb４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，腫瘍壊
死α因子、トロンビンなどである。突然変異体コートタンパク質融合及び突然変
異体ＨＥポリペプチド及びこれらを含有するライブラリーは、従来の突然変異誘
発技術を用いて調製できる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介突然変
異誘発及びカセット突然変異誘発が含まれるは、これらに制限されるわけではな
い。

【０１８９】 異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを通してコートタンパク質又はその一
部分にリンクされうる。リンカーペプチドセグメントは、一般に約３〜約５０個
のアミノ酸残基、好ましくは５〜３０個、さらに好ましくは１０〜２５個の残基
まで長さが変動する。さらに、リンカーセグメント上の正味電荷は好ましくは正
である。アミノ酸残基の同一性及び順序は任意であるは、リンカーペプチドセグ
メントの１つ以上の特異的配列は一般に異種ポリペプチドに比べて優れた提示を
提供することになる。本発明の方法は同様に、融合されたタンパク質とコートタ
ンパク質の間でリンカーを突然変異させ、所望の提示レベルを付与するリンカー
を選択することによって融合タンパク質の提示レベルをモジュレーションさせる
ためにも使用可能である。この実施形態においては、リンカーセグメント突然変
異体のライブラリーは、リンカー配列鋳型を突然変異させることによって作られ
、ファージ上で最良の提示を与えるリンカー配列は、例えば提示された異種ポリ
ペプチドに対する結合のための親和力選択といったファージ提示選択を用いて選
択される。より多数の提示済みポリペプチドを可能にするリンカーは、親和力マ
トリクスに対する増強された親和力に基づいて選択されることになる。

【０１９０】 これまでのところ、研究者は、所望の属性を提供するために特異的リンカーを
用いてきた。リンカーはＧｌｙ−Ａｌａ₃（Holmes et al. (1996) Protein Pept
. Lett. 3:415-422）又は Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ₃リンカー（Micheal et al. (1996) Im
munotechnology2:47-57）といったように柔軟性を提供するよう（Wung et al. (
1997) J. Immunol. Methods 204:33-41）そして特異的タンパク質分解のための
部位を取込むよう（Lucic, et al. (1998) Australia. J. Biotechnol. 61:95-1
08; Matthews, D. J. and Wells, J. A. (1993) Science, 26:1113-1117）に設
計されてきた。リンカー最適化についての考慮事項としては、なかでも、タンパ
ク質分解に対する耐性、ファージ粒子から融合されたタンパク質までの距離及び
融合タンパク質活性に対するリンカーの立体配座効果が含まれる。関与する多数
の変数は、本発明の選択方法を魅力あるアプローチにしている。例えば、タンパ
ク質VIII 上のｈＧＨの増加した提示のためのリンカーの選択（図７Ａ）は、結
果として、設計された Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（図８Ａ）に比べた提示の増強
をもたらす。ＳＡＶ提示（図８Ｂ）のためのリンカー（図７Ｂ）を選択するため
にも、類似の選択が用いられた。ＳＡＶ提示においては、選択は、以前にＳＡＶ
の増強提示のために選択されたタンパク質VIII異型（タンパク質VIII（le））に
融合されたＳＡＶで行なわれた（例４）。この例は、上述の異なるタンパク質VI
II異型の組合せに類似したやり方で望ましい提示レベルを得るため、例えばタン
パク質VIII異型といったような最適化されたコートタンパク質異型と最適化され
たリンカーを組合せることができるということを立証している。異種ポリペプチ
ド 突然変異体ポリペプチド又は少なくともファージコートタンパク質及び異種
ペプチド又は突然変異体の一部分を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子
を得、それを分離すること、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発及びカセット
突然変異誘発，制限酵素を用いてＤＮＡを分割すること、電気泳動、精製及び形
質転換（例えば電気穿孔）手順を用いたＤＮＡの連結、分離及び選択、ライブラ
リー構築、適切な宿主又はレシピエント細胞及び細胞濃度に関連して以上で記述
した方法及び上記の先行技術方法を、本発明のこの実施形態において使用するこ
とができ、それについての記述はこの実施形態に関して特定的に本書に内含され
ている。

【０１９１】 ｃ．カルボキシル末端提示及びより新しいファージコートタンパク質及びその融 合 本発明のもう１つの態様は、タンパク質III又はタンパク質VIIIとのタンパク
質融合を用いた繊維状ファージの表面上での異種ポリペプチドのカルボキシル末
端（Ｃ末端）提示である。Ｃ末端提示については、Ｍ１３のタンパク質VIについ
て報告されてきた（Jespers, L. et al., 1995, Biotechnology 13:378-382）。
この論文では、タンパク質VIは、Ｃ末端でのポリペプチドの付着を可能にするそ
の能力において、タンパク質III及びVIIIと全く異なっているということが記さ
れている。驚くべきことに、本発明の一部分として、Ｃ末端提示が同様にタンパ
ク質III及びVIIIに対する融合についても可能であるということが発見された。
したがって、本発明は、ファージコートタンパク質のＮ末端における提示（Ｎ末
端提示）に類似した様式で異種ポリペプチド又はポリペプチドライブラリーのＣ
末端提示を可能にする。本発明のこの側面においては、Ｃ末端提示は、上述のと
おりに、ファージ提示プロセスがコートタンパク質配列自体に適用される野生型
タンパク質III/VIII又は突然変異体タンパク質III/VIIIを用いて達成することが
できる。

【０１９２】 コートタンパク質異型及びそれと異種ポリペプチドとのタンパク質融合、該異
型及び融合タンパク質のライブラリー、異型及びタンパク質融合をコードする発
現ベクター、ベクターのライブラリー、ベクターを含有する宿主細胞のライブラ
リーを作り出すファージ又はファージミド提示方法、Ｎ末端提示に関して上述し
た結合ポリペプチドなどを得るためのこれらのものの調製及びパンニング方法の
いずれも、Ｃ末端提示のための本発明のこの側面において同様に使用可能であり
、以上の記述は、ここで本書に内含され、本発明のＣ末端提示の記述の一部分と
みなされるべきものである。

【０１９３】 本発明により、非野生型コートタンパク質及びコートタンパク質融合を含有す
る新しいウイルス粒子を開発することが可能となる。

【０１９４】 異型タンパク質III/VIII融合タンパク質は、野生型コートタンパク質配列との
関係において置換、付加又は欠失を内含する１個以上の改変を含むことになる。
更に、驚くべきことに、多数の改変が可能であり、そしてこの場合には、Ｃ末端
融合として、ファージ表面上でポリペプチドを提示する能力を保持しながらファ
ージによって許容される。残基の化学的性質は変えることができる、すなわち、
疎水性残基を親水性残基に又はその逆に改変することが可能である。２〜５０個
，好ましくは５〜４０個、さらに好ましくは７〜２０個の改変された残基を含む
異型が可能である。コートタンパク質の野生型配列又はその一部分から改変され
たあらゆる成熟コートタンパク質配列又はその一部分を含有する融合タンパク質
は、本発明の範囲内である。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３
６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９又は５０個の異型残基を含む主要コートタンパク質異型は、可能である
。本発明のこの側面は、野生型コートタンパク質以外のあらゆるコートタンパク
質であるコートタンパク質を設計し、ファージ表面上で提示するＣ末端融合タン
パク質を選択することを可能にする。野生型コートタンパク質配列とほぼ同じ長
さを有することから、置換を含む異型が好ましい。ただし、より短かいコートタ
ンパク質及びそのタンパク質融合を誂えるための残基の欠失は、本発明の範囲内
である。好ましくは、最初のいくつかの残基が欠失されることになり、より好ま
しくは、Ｎ末端又はＣ末端残基１〜約５個を欠失させることができる。異種ポリ
ペプチドの表面提示ができない異型は、ファージ提示、パンニング及び選択プロ
セス中に選択される。

【０１９５】 上述のＮ末端提示の場合と同様に、コートタンパク質の規定の領域内にアミノ
酸付加、置換又は欠失を有するコートタンパク質異型のライブラリーを得るため
、コートタンパク質の望ましいセグメント内のアミノ酸残基が改変させられてい
るライブラリーを生成することも可能である。一例としては、一般的に２〜１０
ゾーンのあらゆる数のゾーンにコートタンパク質を分割し、１つ以上のゾーン内
の異型からライブラリーを構築することができる。例えば、Ｍ１３，ｆ１及びｆ
ｄファージの成熟コートタンパク質は、５０個のアミノ酸を含有し、各々５個の
アミノ酸残基の１０ゾーン、又は、各ゾーンが例えば１５，１０，９及び８残基
である、各々のゾーンに不等残基数を有するゾーンに分割することができる。コ
ートタンパク質の細胞質、膜内外及び周辺質領域に対応するゾーンを使用するこ
とができる。アミノ酸改変が所望される各々のゾーンのために、別々のライブラ
リーを構築することができる。例えば、コートタンパク質異型がゾーン１にアミ
ノ酸改変を有する融合タンパク質は、所望される場合、ゾーン１のアミノ酸残基
の１つ以上が突然変異した単一ライブラリーを構築することができる。代替的に
は、２つのゾーンがアミノ酸改変を含む融合タンパク質を産生することが所望さ
れる可能性もある。各々２つのゾーンのうちの１つの中に改変を含む２つのライ
ブラリーを調製することができる。

【０１９６】 好ましくは異種ポリペプチドは、リンカーペプチドを通してコートタンパク質
又はその異型に付着される。リンカーは、Ｃ末端提示を可能にするあらゆる数の
残基を含有していてよく。一般には約４個〜３０個、好ましくは約８〜約２０個
のアミノ酸残基を含有することになる。リンカーは、自然に生ずるあらゆる残基
を含むことができるは、グリシン及び／又はセリンを主に（５０％を超える）含
むリンカーが好ましい。特定のポリペプチドを提示するための最適なリンカー組
成及び長さは、以上で記述し例中で立証されるファージ提示を用いて選択するこ
とができる。例えば、各々種々のリンカー長を含有するファージライブラリーを
構築することができ、異種ポリペプチドの発現及び提示を最適化するあらゆる長
さのリンカーのアミノ酸組成物を分離するために、ファージ選択及びパンニング
を使用することができる。

【０１９７】 上述のＮ末端提示の場合と同様、ファージ粒子の表面上での異種ポリペプチド
の提示を改善する異型コートタンパク質が野生型に関連して複数の突然変異を含
有する場合、同様に、新しい異型及び野生型コートタンパク質で得られるレベル
の間の中間レベルで異種ポリペプチドを提示する異型を得ることも可能である。
これは異型の各々の突然変異されたアミノ酸を野生型配列又はもう１つの改変さ
れた残基に戻るよう別々に復帰突然変異させることによって達成できる。これら
の復帰突然変異は一般に、異種ポリペプチドの提示レベルを、異型及び野生型コ
ートタンパク質で得られる提示レベル間で変動するレベルまで低減させることに
なる。復帰突然変異を組合わせることにより、提示を、異型で得られるものと野
生型コートタンパク質で得られるものの間にある所望のレベルに誂えることが可
能である。

【０１９８】 類似のプロセスにより、野生型コートタンパク質のレベルより低いレベルで提
示する異型を得ることが可能である。例えば、１つ以上のゾーンで突然変異を行
なうことができ、産生されたライブラリーを、弱くしか結合しない（野生型融合
を提示するファージに比べて弱い）ファージについてパンニングすることができ
る。より弱い結合ファージは、野生型コートタンパク質融合を提示するファージ
により置換えられることになり、既知の方法を用いて分離及び配列決定され得る
。

【０１９９】 ウイルスコート内への取込みのためには低機能性でありしたがって野生型コー
トタンパク質との関係における融合タンパク質の提示を低減させる突然変異体コ
ートタンパク質を得ることもできる。この場合、突然変異は、高機能性異型につ
いての上述の選択において野生型として保存される傾向をもつ残基の中で行なわ
れる。高機能性異型についての選択の間に野生型としてこれらの残基の保存は、
これらの残基における突然変異が充分に許容されず、低機能性異型を産生する傾
向をもつことになる、ということを表わしている。これらの部位の突然変異を突
然変異によって得られた突然変異体は、次に、野生型コートタンパク質提示レベ
ルとの関係において所定の融合タンパク質を提示させるその能力についてスクリ
ーニングされ得る。野生型との関係において所望の低減したレベルでの融合を提
示する低機能性異型は、次に、ファージ提示を目的として融合タンパク質のライ
ブラリーを構築するために使用することができる。低機能性異型の産生のための
好ましい残基は、野生型として保存されたものであるは、コートタンパク質のあ
らゆる残基を突然変異させ、結果として得られた突然変異体を、融合タンパク質
の提示を可能にするその能力についてテストすることができる。このように、単
に適切な高機能性突然変異体を使用することにより野生型によって付与されるも
のに比べて低い提示レベルを選択することが可能である。上述の高機能性異型の
場合と同様に、所望されるレベルまでのさらなる提示の低減を生み出すべく、数
個の低機能性突然変異を組合わせることができる。低機能性異型の選択には、選
択よりもむしろスクリーニングスクリーンが必要であるものの、この方法は、タ
ンパク質中の大部分の突然変異が活性の増加ではなくむしろ減少をひき起こすこ
とから比較的単純であり、適切なスクリーニング手順が知られている。したがっ
て、コートタンパク質内の大部分の突然変異は、低機能性異型を結果としてもた
らす有害な突然変異であるはずである。

【０２００】 ファージ粒子の表面上にｃＤＮＡライブラリーを提示するためには、Ｃ末端提
示が有用である。選択された組織源からｍＲＮＡを精製することができ、そして
２本鎖ｃＤＮＡを、標準的な技術を用いて合成することができる（Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第２版 Cold Spring Ha
rbor, New York)。次に、読取り枠を含む（１つ以上の）ファージミド又はファ
ージベクターは、Sambrook et al. 及び上述のファージ及びファージミドの参考
文献の中に開示された充分立証された技術を用いて構築され、そして、ｃＤＮＡ
はコートタンパク質遺伝子の３′末端でベクター内に連結される。その後、宿主
細胞はベクターライブラリーを用いて好ましくは電気穿孔により形質転換され、
ｃＤＮＡライブラリーのメンバーに対応する異種ポリペプチドを提示するファー
ジ粒子が（ファージミドベクタのためのヘルパーファージの重複感染を伴って）
得られる。得られたＣ末端ファージ提示ライブラリーは、従来のファージ提示技
術を用いて、パンニングし分析されうる。

【０２０１】 本発明のＣ末端提示は同様に、Ｎ末端提示を使用した場合には提示が困難であ
る細胞内、好ましくは哺乳動物の細胞内タンパク質又はそのフラッグメント、及
びポリペプチドを提示するためにも有用である。したがって、Ｃ末端提示は、Ｎ
末端提示に対する相補的提示技術である。細胞内タンパク質は、酸化還元環境（
分泌されたタンパク質が折畳まれそしてジスルフィド結合を形成する環境に比べ
て細胞内タンパク質が通常に存在する）における差異に起因して、Ｎ末端提示を
用いる正しく折畳まれた形で提示することが困難であり得る。細胞質は、周辺質
が酸化環境であるのに対し還元環境である。Ｃ末端異種性融合タンパク質は、通
常のファージ粒子組立て部品として周辺質まで移動する。しかしながら、異種ポ
リペプチドは周辺質膜の細胞内側にとどまっていることから、ファージ粒子内へ
の取込みに先立って細胞内ポリペプチドを正しく折畳むことができる。ファージ
又はファージミド粒子の組立て中に、Ｃ末端融合タンパク質は粒子内に取込まれ
、その表面上で異種ポリペプチドを提示する。

【０２０２】 Ｃ末端提示は、Ｎ末端提示システムで遭遇する分泌問題を回避する。Ｎ末端提
示では、一般に、Ｎ末端上の異種ポリペプチドは、膜内にアンカーとしてＣ末端
がとどまっている状態で、周辺質空間に入るために周辺質膜内の孔様構造を通過
しなければならないと考えられている。このとき、融合タンパク質は膜からファ
ージ粒子に組立てられる。Ｃ末端提示を用いると、ファージ粒子を組立てるため
に宿主細胞周辺質内に融合タンパク質を分泌させる必要はない。したがって、Ｃ
末端提示は、あらゆる異種ポリペプチドを提示するために有用であり、Ｎ末端フ
ァージ提示技術を用いて提示し難いポリペプチドを提示するのに特に有用である
。

【０２０３】 ウイルス粒子組立て中に周辺質内に分泌される外来性ポリペプチドを提示する
ためにも、Ｃ末端提示を使用できる。例えば、潜在的膜タンパク質のライブラリ
ーを構築し、コートタンパク質として機能する能力をもつライブラリーのメンバ
ーを選択することにより、ライブラリーに対し選択的圧力を加え、Ｃ末端融合と
して外来性ポリペプチドを有し、かつ外来性ポリペプチドが周辺質にあり融合タ
ンパク質のＮ末端が細胞質内にある状態で細胞膜内において正向するコートタン
パク質を用いることが可能である。該融合タンパク質は、好ましくは、細胞質領
域として正に帯電したＮ末端部分を、また膜貫通領域として疎水性コア部分を有
する。かかる構造は、細菌分泌シグナルに似ている。一部分のライブラリーメン
バーは、分泌シグナルとして機能し、そしてＮ末端が細胞質内に又Ｃ末端が周辺
質内にある状態で細菌膜の中に挿入されることになる（逆コートタンパク質）。
膜内に挿入しうる融合の一部分は、ファージ又はファージミドコートとの有利な
相互作用によって組立てウイルス粒子内に取り込まれることになる。複数の段階
で適切なライブラリーを設計することができる。例えば、コートタンパク質のラ
イブラリーのＣ末端に融合されたエピトープタグを用いることにより潜在的コー
トタンパク質のライブラリー（単複）から逆コートタンパク質を選択することが
可能である。ファージ粒子組立ての後、エピトープタグに結合する抗体を用い、
粒子の表面上でタグを提示するウイルス粒子ライブラリーのメンバーを分離する
。結合する粒子は、従来のファージ提示技術を用いて分離／選択し、そしてクロ
ーニングすることができる。第２工程では、ファージ提示により選択体の１つを
さらに発達させ、粒子コート内への改善された取込みについて選択することがで
きる。また、１つ以上のライブラリーを構築し、エピトープタグを最も良く提示
するようなタンパク質又は粒子の表面上のその他のタンパク質について選択する
ためコートタンパク質の異なる領域を突然変異させることができる。本発明に従
って調製されたコートタンパク質融合及びウイルス粒子は、現在ファージ提示が
使用されている用途全てを含め、ウイルス構造及び組立てプロセスを評価し、抗
体及びそのフラッグメントといった親和力成熟結合タンパク質に対しタンパク質
上のエピトープを結合する抗体をマッピングし、より高い結合親和力をもつ結合
タンパク質を提供し、酵素などの上の活性及びアロステリック部位に結合するポ
リペプチドを産生するのに有用である多様な手段を提供する。

【０２０４】 以上で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体が参考として本書に内含
される。

【０２０５】例 例１−E.coliＳＳ３２０の構築 既知のプロトコール（J. H. Miller, 1972, Experiments in Mobecular Biolo
gy, p190）に従って、ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞からＭＣ１０６１細胞までＦ′エピ
ソームが移送される細菌交配により、新しい細胞系統ＳＳ３２０を調製した。よ
り具体的には、下記工程を用いて、ＳＳ３２０細胞を得ることができる： − ＯＤ６００＝０. ５までＬＢ肉汁中でＭＣ１０６１及びＸＬ１−ＢＬＵＥ
の１. ０mlの培養を成長させる（新たにストリークしたプレートのシングルコロ
ニー。ＭＣ１０６１をＬＢプレート上にストリークした。ＸＬ１−ＢＬＵＥをＬ
Ｂ/テトラサイクリン（１０μg/ml）上にストリークした）。 − 各培養物０. ５mlを混合し、ゆっくりと振とうさせながら（回転振とう機
の上で５０rpm)３７℃で１時間成長させる。１時間の交配の後、交配を分析する
ため２５０rpmで撹拌する。 − ＬＢ/テトラサイクリン（１０μg/ml）/ストレプトマイシン（１０μg/ml
）上に希釈液をプレートする。 − ＭＣ１０６１は、ＸＬ１−ＢＬＵＥのＦ′プラスミドがテトラサイクリン
耐性を付与するのに対し、ストレプトマイシン耐性染色体マーカーを有している
。したがって、ＸＬ１−ＢＬＵＥ Ｆ′エピソームを有する交配子孫（ＭＣ１０
６１）のみは、両方の抗生物質に対する耐性をもつことになる。ＭＣ１０６１と
ＸＬ１−ＢＬＵＥの混合されていない培養は、いずれの親も２重耐性をもたない
ことから、対照として選択培地上にプレートされ得る。 − 結果として得られた菌株（ＳＳ３２０）は、電気穿孔及びファージ産生の
ために使用することができる。

【０２０６】 出発ＭＣ１０６１細胞（Bio-Rad Laboratories, Inc から入手可能）及びＸＬ
−１−ＢＬＵＥエピソーム（ＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞内の Stratagene, Inc. から
入手可能）並びに結果として得られるＳＳ３２０細胞の遺伝子型は、下記： ＸＬ１−ＢＬＵＥ Ｆ′エピソーム F′:: Tn10proA⁺B⁺lacI^qD(lacZ)M15 ＭＣ１０６１ F-araD139D(ara-leu)7696galE15galK16D(lac)X74rpsL(Str^r)hsdR2(r_k ^-m_k ⁺)mcrAm
crB1 ＳＳ３２０ F::Tn10proA⁺B⁺lacI^qD(lacZ)M151 F-araD139D(ara-leu)7696galE15galK16D(lac)X74rpsL(Str^r)hsdR2(r_k ^-m_k ⁺)mcrAm
crB1 の通りである。

【０２０７】 標準的洗浄工程が行なわれた後に、細胞生存及び生存度について異なるE.coli
菌株を評価し、電気穿孔のために細胞を調製した。２５０mlの培養中でE.coliを
成長させ、そして前述のように電気穿孔のため調製した。コロニー形成単位の総
数を、洗浄手順の前後で滴定し、結果は以下に示されている。

【０２０８】

【表４】

【０２０９】 一定濃度のＤＮＡで異なるE.coli菌株を用いて行われる形質転換収量は、電気
穿孔反応における生育可能なE.coli細胞の濃度に依存する。所定の菌株で達成可
能な生細胞の最大濃度は、電気コンピテント細胞の調製に関与する洗浄段階に対
するその菌株の耐性に左右される、ということが今発見された。電気穿孔のため
の特定細菌（例えばE.coli）菌株の適合性は、以下の手順を用いて容易に判定で
きる。

【０２１０】 １Ｌ入りのバッフル付きフラスコ内でＯＤ６００＝０.６まで、２５０mlの細
菌培養を成長させる。小量を取り出し、希釈液を適切な培地上でプレートして、
生細胞の総数を測定する：この数字は、細胞投入量（投入量、Ｉ）である。（使
用される培養の量について適宜縮小された）例２に記述されたように、電気コン
ピテント細胞産生のための標準的手順に従う、生細胞の総数を測定するために適
切な培地上に電気コンピテント細胞の最終調製物の希釈液をプレートする。この
総数は、電気コンピテント細胞調製手順を生きのびた細胞の数である（生存細胞
、Ｓ）ＳをＩで割ると生存細胞対投入量比（Ｓ/Ｉ）が得られる。電気穿孔に理
想的に適した菌株（すなわち、ＤＮＡの定濃度におけるその他の菌株と比較して
最高の形質転換収量を与える菌株）については、Ｓ/Ｉ比は１に等しくなるはず
である。このことはすなわち、投入細胞の全てが電気コンピテント細胞調製手順
を生きのびたということを表わしている。Ｓ/Ｉ比の低下は、電気コンピテント
細胞調製物における生細胞の濃度の減少に対応する。このことは、それ自体形質
転換収量の減少という結果をもたらす。したがって所定のＤＮＡ濃度で最高の形
質転換収量を得るためには、最高のＳ/Ｉ値を伴う菌株が使用されるべきである
。

【０２１１】 例２−電気穿孔のためのE.coliの調製 以下に記述されているように電気穿孔コンピテント細胞を調製した： １．新鮮なＬＢ/tetプレートのＳＳ−３２０を１mlの２ＸＹＴ培地（５mg/ml
）のテトラサイクリン）に接種した。約６時間成長させ、５００ml入りフラスコ
の中に２ｘＹＴ/テトラサイクリンを５０ml接種する：一晩成長させる。 ２．上述の培養の５mlを２Ｌバッフル付きフラスコ内で６×９００mlのSuperb
roth（５mg/mLのテトラサイクリン）に接種し、３７℃、２００rpmでＯＤ₆₀₀＝
０.６−０.８まで細胞を成長させる。 ３．氷上で３個のフラスコを冷やす。さらなる工程を、低温室内において予め
冷やした溶液及び機器を用いて氷上で行なった。 ４．ＳＯＲＶＡＬＬ ＧＳ３ ＲＯＴＯＲ内で５.５K/５分で遠心分離し、全て
の上清をデカントする。残りの３本のフラスコから同じ試験管に培養を加え、再
度スピンさせ、デカントする。 ５．旋回させるか又は撹拌することによりpH７.４で等体積の１mMのＨＥＰＥ
Ｓの中で再懸濁させる。５.５k/１０分で遠心分離に付し、上清をデカントする
。 ６．上記（５）にあるように、等体積の１mMのＨＥＰＥＳ中で再懸濁させる。
５.５k/１０分で遠心分離に付し、上清をデカントする。１００mlの１０％（v/v
）グリセロール中で各ペレットを再懸濁させる（滅菌フィルタ；超純粋グリセロ
ール（Gibco ＢＲＬ＃１５５１４−０１１））。 ７． ５.５k/１５分で遠心分離に付し、全ての上清をデカントする。最小量
の１０％グリセロール中に再懸濁させる。５Ｌの出発培養について約３mlの１０
％グリセロールを用いると、約３〜４×１０¹¹cfu/mlで約１２mlの濃縮細胞が産
生される。

【０２１２】 例３−突然変異誘発の充てん 突然変異誘発反応は、以下に示す変更を伴ってU.S.5,750,373に記述されてい
る手順を用いて行なわれた： １）オリゴのキナーゼ オリゴ４μl（３３０ng/mlのストック、即ち Ａ₂₆₀＝１０） １０×ＴＭ緩衝液４μl（０.５Mのトリス pH７.５、０.1MのＭｇＣｌ₂） １０mMのＡＴＰ ４μl １００mMのＤＴＴ ２μl Ｈ₂Ｏ ２４μl キナーゼ ２μl（ＮＥＢ、１０U/μl） ４０μl − ０.５時間３７℃でインキュベートする。 ２） オリゴ／鋳型のアニール クンケル鋳型 ４０μg キナーゼ化オリゴ １.２μg(上述のキナーゼ反応からの４０μl；オリゴ／鋳
型＝３) １０×ＴＭ緩衝液 ２５μl 最終体積 ２５０μlとなるまでＨ₂Ｏを添加する。 − ２分間９０℃で、３分間５０℃でインキュベートする。 ３）充てん − 以下のものを加える。 １００mMのＡＴＰ １μl ２５mMのｄＮＴＰ １０μl(ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ各２５
mM) １００mM ＤＴＴ １５μl Ｔ４リガーゼ ６μl（ＮＥＢ，４００U/μl） Ｔ７ ポリメラーゼ ３μl（ＮＥＢ， １０U/μl） − ３時間２０℃でインキュベートする。

【０２１３】 例４−E.coli電気穿孔 電気穿孔を以下に記述するとおりに行なった： １．等体積のフェノール／ＣＨＣｌ₃で、充てん反応物を抽出する。等体積の
ＣＨＣｌ₃で抽出する。ＱＬＡクィックゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い
てＤＮＡ（６０マイクログラム）を精製し脱塩する。各反応について２本のカラ
ムを用いる。ＱＩＡＧＥＮで概略説明されているような洗浄及び溶離手順に従う
；Ｈ₂Ｏ３０μlで各カラムを溶離してＨ₂Ｏ ６０μl中の８０μgという充てん
産物（２本鎖に変換された４０μgの１本鎖ＤＮＡ）の理論上の最終収量を得る
。 ２．コンピテントE.coliＳＳ３２０ ３５０μl中にＤＮＡ（６０μl）を電気
穿孔する。２.５kV，２００オーム、２５μFという設定値で０.２cmのギャップ
の細胞を用いる。各反応について２つの細胞を使用する（すなわち各細胞につい
て２００μl）。パルス後、２５mlのＳＯＣ培地まで細胞を移送し、表現型発現
のため培養する。表現型発現の後、選択的及び非選択的培地上での滴定のため少
量のアリコートを取り出す。ファージミド選択のための適切な抗生物質及びＶＣ
Ｓヘルパーファージ（ｍ，ｏ，ｉ＝１０）を含有する５００mlの２ＸＹＴ（２−
Ｌ入りバッフル付きフラスコ）に細胞を移送する。一晩成長させ、朝ファージを
収集する。

【０２１４】 例５−超高ＤＮＡ及びE.coli濃度をもつ大型ライブラリー構築 ２つの異なる１本鎖鋳型（ａ及びｂ）及びミスマッチオリゴヌクレオチドを用
いて例３の充てんプロトコールに従う。１）２０μg，２）３０μg又は３）４０
μgという３つの異なる投入鋳型量を用いた。

【０２１５】 充てん及び精製の後、６０μlの水中で以下の２本鎖ＤＮＡ数量が得られた。

【０２１６】

【表５】

【０２１７】 各反応を用いて３４０μlのＳＳ３２０（３×１０¹¹cfu/ml）を電気穿孔した
。こうして１×１０¹¹個の細胞で合計量４００μlが得られる。各反応を２つの
２００マイクロリットルのアリコートにて電気穿孔した。

【０２１８】

【表６】

【０２１９】 これらの結果は、高いＤＮＡ濃度での電気穿孔についての時間定数が３.０MS
よりもはるかに高く、電気穿孔は高いＤＮＡ濃度で容易に実施されるということ
を表わしている。

【０２２０】 形質転換体の数及び形質転換中の細胞の生存を評価し、下表に示す：

【０２２１】

【表７】

【０２２２】 例６−高濃度ＤＮＡ電気穿孔 １本鎖鋳型及びミスマッチオリゴヌクレオチドで、標準的充てんプロトコー
ルに従った。７５０μg/mlで４００μlのＤＮＡを産生するため７つの同一の反
応を精製しプールした（ＯＤ２６０＝１５.０）。

【０２２３】 異なる量のＤＮＡを、１.５×１０¹¹細胞/mlというE.coli定濃度で２００μl
の最終体積でE.coliＳＳ３２０に電気穿孔した。０.２cmキュベット＠２.５kV/c
m、２００オーム、２５μFという条件を使用した。電気穿孔の後、３０分間１０
mlのＳＯＣ培地内で反応を成長させ、次にＬＢ（生存）及びＬＢ/カルぺニシリ
ン（５０μg/ml）（形質転換）の両方で滴定した。

【０２２４】

【表８】

【０２２５】 例７−超高ＤＮＡ及びE.coli濃度での複数の電気穿孔を用いた極度に大きいラ イブラリーの構築 １本鎖鋳型及びミスマッチオリゴヌクレオチドで、例３の充てんプロトコール
に従った。投入鋳型の数量は４０マイクログラムで、３５回の同一反応が行なわ
れた。

【０２２６】 充てんの後、フェノール／ＣＨＣｌ₃及びＣＨＣｌ₃での抽出が省略されたとい
う点を除き例４で記述されたとおりに精製が行なわれ、各カラムを５０マイクロ
リットルのＨ₂Ｏで溶離した。各反応について２本のカラムを使用し、したがっ
て、各反応についての理論上の最終収量はＨ₂Ｏ １００マイクロリットル中充
てん産物８０マイクログラムであった。

【０２２７】 ７００マイクロリットルのＳＳ３２０（３×１０¹¹cfu/ml）を電気穿孔するた
め各反応を使用した。こうして、２×１０¹¹細胞で８００マイクロリットルの合
計体積が得られる。衝撃の後、５０mlのＳＯＣ培地に細胞を移送したという点を
除いて、例４に記述されている通りに、２つの４００マイクロリットルアリコー
ト中で各反応を電気穿孔した。表現型発現の後、細胞を選択培地上で滴定した。
組合わせた時点で、３５回の独立した反応は、１.７９×１０¹²個の異なるメン
バーというライブラリーサイズを提供した。３５回の独立した反応についての結
果を以下に示す：

【０２２８】

【表９】

【０２２９】 さらなる例のための材料 ジデオキシヌクレオチドのための試薬は、United States Biochemicalsからの
ものであった。酵素及びプラスミドｐＭａｌ−ｐ２は、New England Biolabsか
らのものであった。Maxisorp免疫プレートは、ＮＵＮＣ（Roskilde，デンマーク
）からのものであった。E.coli ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、Stratageneからのもので
あった。E.coli ＳＳ−３２０の構築については以上に記述されている。ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ），Ｔｗｅｅｎ２０及びＯ−フェニレンジアミンジヒドロ
クロリドはSigmaからのものであった。ＨＲＰ/抗Ｍ１３接合体はPharmacia Biot
echからのものであった。Streptomyces avidiniiはＡＴＣＣ（受入れ番号２７４
１９）からのものであった。ヤギ抗ストレプトアビジンポリクローナル抗体は、
Zymed Laboratories (South San Francisco, USA）からのものであった。

【０２３０】 例８−２１のためのオリゴヌクレオチド ＤＮＡ縮重は、ＩＵＢコードで表わされている（Ｋ＝Ｇ/Ｔ，Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｇ/Ｔ
，Ｒ＝Ａ/Ｇ，Ｓ＝Ｇ/Ｃ，Ｗ＝Ａ/Ｔ，Ｙ＝Ｃ/Ｔ）。

【０２３１】

【表１０】

【０２３２】

【表１１】

【０２３３】

【表１２】

【０２３４】

【表１３】

【０２３５】 例８−ｐＳ３４９；タンパク質VIII上のｈＧＨのファージ提示のためのファー ジミド ｈＧＨのための遺伝子を含有するＤＮＡフラッグメントを、ＰＣＲを用いて増
幅させた（プラスミドｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham, B. C., Jhurani, P.
, Ng, P., and Wells, J. A. (1989) Science 243:1330-1336を鋳型として用い
、オリゴヌクレオチドｈＧＨ１及びｈＧＨ−２をプライマとして用いる）。ＤＮ
ＡフラッグメントをＮｓｉＩで消化させ、まず最初にＫasＩで消化されＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理されて平滑末端を産生しその後ＮｓｉＩで消化されたタン
パク質 VIII提示プラスミド内にクローニングした（Lowman, H. B., Chen Y. M.
, Skelton, N. J., Mortensen, D. L., Tomlinson, E. E., Sadick, M. D., Rob
inson. I. C. A. F., and Clark, R. G. (1998)Biochemistry 37:8870-8878）。
結果として得られたファーシミドをｐｓ１３５ａと呼称した。

【０２３６】 Ｐｔａｃプロモータの制御下でマルトース結合タンパク質からのシグナルペプ
チドをコードする遺伝子フラッグメント及びｌａｃＩｑ遺伝子を含有するｐＭａ
ｌ−ｐ２の１.６kbpフラッグメント（New England Biolabs 製品カタログ（1996
-97)p212）を増幅させるため、プライマーＩＰＴＧ−１及びＩＰＴＧ−２と共に
ＰＣＲが用いられた。ＤＮＡフラッグメントをＥcoＲＩ及びＮｓｉＩで消化し、
ｐＳ１３５ａの類似の消化の結果得られた大きなフラッグメントと連結させた。
結果として得られたファージミド（ｐＳ３４９と呼ばれる）は、ＩＰＴＧ誘発可
能なＰｔａｃプロモータ（New England Biolabs)の制御下でE.coliバクテルオフ
ァージＭ１３のタンパク質ＶIII 及び融合産物（マルトース結合タンパク質シグ
ナルペプチドとそれに続くｈＧＨ，及びそれに続くＧｌｙ／Ｓｅｒ-に富むリン
カーペプチド（ＱＳＧＧＧＳＧＳＳＳ）（配列番号７８））をコードする遺伝子
を含有する。さらに、ｐＳ３４９は又、ＩＰＴＧ配列内での有効な転写抑制のた
めのlacＩｑ遺伝子をも含有している。

【０２３７】 例９−ｐｗ２７７ｅ：タンパク質 VIII 上でのＳＡＶのファージ提示のための ファージミド ｐＳ３４９の誘導体を構築し、ｐＳ６５７ａと呼称した。ｐＳ６５７ａは、２
つの点でｐＳ３４９と異なっている。第１に、ｈＧＨをコードする遺伝子は、ペ
ンタペプチドをコードする配列（ＧＧＲＰＶ）（配列番号７９）によって置換さ
れている。第２に、タンパク質VIIIに先行するリンカー内のＸｂａＩ部位の導入
は、グルタミンをコードするコドンをアンバー（ＴＡＧ）停止コドンに変えた。
ＮｓｉＩ及びＸｂａＩでの消化は、ペンタペプチドコーディング配列を切除し、
そしてｐＳ３４９内のｈＧＨ遺伝子のものと類似した位置の中に適切に消化され
たＤＮＡフラッグメントの方向性クローニングを可能にする。

【０２３８】 Streptomyces avidiniiゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、そしてオリゴヌク
レオチドＳＡＶ−１及びＳＡＶ−２をプライマーとして用いて、ＰＣＲを実施し
た。増幅されたＤＮＡフラッグメントは、５′末端にＮｓｉＩ部位か又３′末端
でＸｂａＩ部位がフランキングされたストレプトアビジン（ＳＡＶ）遺伝子読取
り枠のコドン１６から１３３までを含んでいた。フラッグメントを、ＮｓｉＩ及
びＸｂａＩで消化させ、類似の要領で消化されたファージミドｐＳ６５７ａ内に
クローニングした。結果として得られたファージミド（ｐＷ２７７ｅ）は、ｈＧ
ＨがＳＡＶで置換されているという点を除いてｐＳ３４９によりコードされたも
のと類似の融合産物をコードする。同様に、アンバーコドンは、ＳＡＶ及びタン
パク質VIIIをコードするセグメントの間に位置づけされた。

【０２３９】 例１０−突然変異体タンパク質VIIIライブラリーの構築 ライブラリー構築のため、タンパク質VIIIを各々約１０個の隣接残基を包含す
る５つのゾーン（ゾーン１、残基１〜１０；ゾーン２、残基１１〜２０；ゾーン
３、残基２１〜３０；ゾーン４、残基３１〜３９；ゾーン５、残基４０〜５０）
に分割した。以前に記述された方法の修正版（上述のＳＳ３２０）を用いてライ
ブラリーを構築した（Lowman, H. B. (1998）タンパク質足場上でのペプチドラ
イブラリーのファージ提示。出典：Methods in Molecular Biology, 第８７巻：
組合せペプチドライブラリープロトコール。編集：S. Cabilly. Publisher. Hum
ana Press Inc., Totowa, NJ) 。各ゾーンについて簡単に言うと、クンケルの方
法（Kunkel, T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492）を用い、
ゾーン内に２つの連続するＴＧＡ停止コドンを導入するための鋳型としてｐＳ３
４９（ｈＧＨ提示用）又はｐＷ２７７ｃ（ＳＡＶ提示用）のいずれかを用いて、
オリゴヌクレオチド（ｇ８stopn,ここで「ｎ」はゾーン番号）を使用した。結果
として得られたファージミドを、所望の部位で突然変異を導入するように設計さ
れた縮重オリゴヌクレオチド（ｇ８Ｖn,ここで「ｎ」はゾーン番号）でのクンケ
ル方法の第２ラウンドにおいて鋳型として使用した。

【０２４０】 ｐＳ３４９のｈＧＨタンパク質VIII融合産物内で、タンパク質VIII一部分の各
ゾーンについてライブラリーを構築した。これらのライブラリーの多様性は以下
のとおりであった：ゾーン−１、２.５×１０¹⁰；ゾーン−２、２.５×１０¹⁰；
ゾーン−３、２.５×１０¹⁰；ゾーン−４、１.３×１０¹⁰；及びゾーン−５、５
.０×１０⁹。ｐＷ２７７ｅのＳＡＶタンパク質VIII融合産物内で、タンパク質VI
II半分のゾーン−１、ゾーン−２及びゾーン−３についてライブラリーを構築し
た。これらのライブラリーの多様性は以下の通りであった：ゾーン−１、３.０
×１０⁹；ゾーン−２、６.８×１０⁹；及びゾーン−３、８.６×１０⁹。

【０２４１】 融合されたタンパク質とタンパク質VIIIの間でリンカーを変動させるためにも
ライブラリーを構築した。ｈＧＨ提示については、ｈＧＨとタンパク質VIIIの間
のリンカー内に２つの連続するＴＧＡ停止コドンを導入するために、オリゴヌク
レオチドＬstopを使用した。結果として得られたファージミドは、ｐＳ３４９に
よりコードされたＧｌｙ/Ｓｅｒに富むリンカーに代って、（Ｇｌｙ)₃（Ｘａａ) ₁₄ （Ｇｌｙ)₂（ここでＸａａは位置可変である）という形のリンカーを導入する
ように設計された縮重オリゴヌクレオチド（ＬＶ）と共にクンケルの方法の第２
ラウンドで鋳型として使用された。ＳＡＶ提示については、リンカーは、ＳＡＶ
及び突然変異体タンパク質VIII(le)の間で変動した（タンパク質VIII(le)の配列
については、図２を参照せよ）。オリゴヌクレオチドＬstop２を使用し、ＳＡＶ
とタンパク質VIII(le)の間のリンカー内に３つの連続するＴＡＡ停止コドンを導
入した。結果として得られたファージミドは、可変的長さ及び可変的配列のリン
カーと共にライブラリーの産生のための鋳型として使用された。オリゴヌクレオ
チドＬＶ５、ＬＶ１０、ＬＶ１５、ＬＶ２０及びＬＶ２５は、それぞれ５、１０
、１５、２０又は２５個の可変的残基を含むリンカーと共にライブラリーを構築
するために用いられた。

【０２４２】 リンカーライブラリーの多様性は、以下のとおりであった：ｈＧＨ−ＬＶ−タ
ンパク質VIII、１.８×１０¹⁰；ＳＡＶ−ＬＶ５−タンパク質VIII、１.４×１０ ¹⁰ ；ＳＡＶ−ＬＶ１０−タンパク質VIII、９.８×１０⁹；ＳＡＶ−ＬＶ１５−タ
ンパク質VIII、１.２×１０¹⁰；ＳＡＶ−ＬＶ２０−タンパク質VIII、１.１×１
０¹⁰；ＳＡＶ−ＬＶ２５−タンパク質VIII、６.０×１０⁹。

【０２４３】 例１１−融合タンパク質提示を増強させるタンパク質VIII異型の選択 上述のｈＧＨタンパク質VIIIライブラリーのファージを標的として、９６ウェ
ルのMaxisorp免疫プレート上にコーティングされたｈＧＨｂｐを用いた結合選択
ラウンドを反復させた。（Fuh, G. et al. (1990)J. Biol. Chem. 265:3111; Cu
nningham, B. C., Ultsch, M., De Vos, A. M., Mulkerrin, M. G., CＡｌａuse
r, K. R., 及び Wells, J. A. (1991)Science 254:821-825）。全てのライブラ
リーを別々にソートした。Ｍ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene）を用
いて、E.coli ＳＳ３２０細胞内でファージを増殖させた。５回の結合選択ラウ
ンドの後、個々のファージを分離し、そして標的としてｈＧＨｂｐを用いるファ
ージＥＬＩＳＡを用いるｈＧＨ提示について分析した（以下参照）。ファージＥ
ＬＩＳＡにおいて強いシグナルを示したファージを配列決定した（Sanger, F. e
t al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467）。

【０２４４】 ＳＡＶタンパク質VIIIライブラリーはプールされ、そして結合標的が抗ＳＡＶ
ポリクローナル抗体であったという点を除いて、ｈＧＨタンパク質VIIIライブラ
リーについて上述した通りに結合選択が実施された。アンバー停止コドンがグル
タミンとして抑圧されているＳｕｐＥのE.coli菌株ＸＬｌ−ＢＬｕｅ中でファー
ジを増殖させた。（Bullock, W. O., Fernandez, J. M., and Short, J. M. (19
87) Biotechniques 5:376-379）。

【０２４５】 例１２−部位特異的突然変異誘発 突然変異誘発は、クンケルの方法を用いて実施された（Kunkel, et al. (1987
)Meth. Enzymol. 154:367-382）。ヘルパーファージとしてＭ１３−Ｋ０７ファ
ージを有する宿主細胞中で適切なプラスミド（例えば、Ｍ１３遺伝子IIIのカル
ボキシ末端半分に融合されたｈＧＨ遺伝子を含有する）適切なプラスミドを成長
させることによって、鋳型ＤＮＡを調製した。突然変異誘発のために１本鎖ウラ
シル含有ＤＮＡを調製し、ｈＧＨタンパク質VIII遺伝子融合内に所望する突然変
異を導入した。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及び適切なオリゴデオキシヌクレオチド
を用いてオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を実施した。突然変異誘発から
のクローンをジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。

【０２４６】 突然変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８（１ａ）を使用し、ファージミドｐＷ２
７７ｅ内に選択体ｈＧＨタンパク質VIII(１ａ）のタンパク質VIII異型を導入し
た。適切に命名されたオリゴヌクレオチドを用いて突然変異体ｈＧＨ遺伝子を構
築した（例えば、オリゴヌクレオチドＲ６４Ａは、Ａｒｇ６４からＡｌａへの突
然変異をコードする）。

【０２４７】 突然変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ２ｃを使用し、タンパク質VIII(1a)を
コードする遺伝子の中にタンパク質VIII(２ａ）の突然変異体を導入した。突然
変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ３ｃを用い、タンパク質VIII（３ａ）の突然
変異を遺伝子コーディングタンパク質VIII（２ａ）内に導入した。突然変異Ｅ１
２Ｎ、Ｄ１６Ａ、又はＩ１７Ｓを、突然変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ２−
Ｅ１２Ｎ、ｇ８Ｖ２−Ｄ１６Ａ又はｇ８Ｖ２−Ｉ１７Ｓを用いて、タンパク質VI
II(２ａ）をコードする遺伝子内に、突然変異Ｅ１２Ｎ、Ｄ１６Ａ又はＩ１７Ｓ
を導入した。

【０２４８】 例１３−タンパク質VIII及びそのタンパク質VIII異型上での融合タンパク質提 示の相対的レベルを決定するためのファージＥＬＩＳＡ ファージミドを有するE.coliＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Bullock, W. O., Fernandez,
J. M., and Short, J. M. (1987) Biotechniques5: 376-379）の培養を、２Ｙ
Ｔの１ml、５０μg/mlのカルベニシリン、１０μg/mlのテトラサイクリン中で、
３７℃で８時間成長させた。培養物を３７℃での一晩成長のため、同じ培地（適
切な濃度でのＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（１０¹⁰ファージ/ml）及びＩＰ
ＴＧを追加された）３０mlに移した。ＰＥＧ／ＮａＣｌで２回沈降させて培養上
清からファージを収集し（Lowman, H. B., (1998)タンパク質足場上のペプチド
ライブラリーのファージ提示。出典：Methods in Molecular Biology,第８７巻
：Combinatorial Peptide Library Protocols.編集：S. Cabilly. Publisher：H
umana Press Inc., Totowa, NJ）ＰＢＳの１ml、０. ２％のＢＳＡ、０.１％の
Ｔｗｅｅｎ（ＢＳＡブロッキング緩衝液）中で再懸濁させた。分光光度計により
ファージ濃度を決定した（∈２６８＝１.２×１０⁸Ｍ^-1cm^-1）。

【０２４９】 室温で２時間、Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート（９６ウェル）に標的タンパク
質をコーティングした（５０mMの炭酸緩衝液中に５μg/mlで１００μl，pH９.６
）。次に、プレートをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の０.２％のＢＳＡを用いて
１時間ブロックし、次いでＰＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した（８×
）。ＰＢＳ、０.２％ＢＳＡ、０.１％Ｔｗｅｅｎ（ＢＳＡブロッキング緩衝液）
を用いて、ファージ粒子を階段希釈し、次に、コーティングされたウェルにこれ
を移した（１００μl）。１時間後、プレートをＰＢＳ、０.０５％のＴｗｅｅｎ
２０で洗浄し（８×）、３０分間ＢＳＡブロッキング緩衝液中の１：３０００Ｈ
ＲＰ/抗Ｍ１３コンジュゲート１００μlを用いてインキュベートし、その後、Ｐ
ＢＳ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０（８×）及びＰＢＳ（２×）で洗浄した。ｏ−
フェニレンジアミノジヒドロクロリド／Ｈ₂Ｏ₂溶液（１００μl）を用いてプレ
ートを展開させ、２.５MのＨ₂ＳＯ₄（５０μl）で停止させ、４９２nmで分光光
度計により読取りを行なった。Li, B. et al., (1995)Science 270; 165-1660。

【０２５０】 例１４−ｈＧＨの増強された提示について選択されたタンパク質VIII異型上の ＳＡＶの提示 突然変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ２ｂを用いてクンケルの方法（例１２
）を使用し、選択体ｈＧＨ−タンパク質VIII(２ａ）のタンパク質VIII突然変異
をファージミドｐＷ２７７ｅ内に導入した。結果として得られたファージミドは
、融合半分中のタンパク質VIIIが突然変異体タンパク質VIII(２ａ）の突然変異
を含有していたという点を除いて、ＰＷ２７７ｅによりコードされたものと同一
の融合タンパク質をコードした。ＳＡＶ提示は、標的として抗ＳＡＶポリクロー
ナル抗体（図４ａ）又はビオチニル化ＢＳＡ（図４ｂ）のいずれかを用いてファ
ージＥＬＩＳＡ（例１３）によって測定された。

【０２５１】 例１５−減衰した結合親和力をもつｈＧＨ突然変異体の提示及び検出 ｈＧＨｂｐに対する部位１結合親和力が低減したｈＧＨ突然変異（Pierce et
al.,前出）を、野生型タンパク質VIII又は突然変異体タンパク質VIII(１ａ）の
いずれかに対する融合として提示させた。突然変異誘発オリゴヌクレオチド：ｈ
ＧＨ（Ｒ６４Ａ）、オリゴヌクレオチドＲ６４Ａ；ｈＧＨ（Ｄ１７１Ａ）、オリ
ゴヌクレオチドＤ１７１Ａ；ｈＧＨ（Ｙ１６４Ａ/Ｒ１７８Ａ）、オリゴヌクレ
オチドＹ１６４Ａ/Ｒ１７８Ａ；ｈＧＨ（Ｋ１７２Ａ/Ｒ１７８Ａ）、オリゴヌク
レオチドＫ１７２Ａ/Ｒ１７８Ａを用いたクンケルの方法（例１２）を用いて突
然変異体ｈＧＨ遺伝子を構築した。野生型タンパク質VIIIと融合されたｈＧＨの
提示について、突然変異誘発鋳型は、ｐＳ３４９であった。異型タンパク質VIII
(１ａ）と融合されたｈＧＨの提示については、鋳型は、タンパク質VIII(１ａ）
に融合されたｈＧＨから成る融合タンパク質をコードするｐＳ３４９の誘導体で
あった。ｈＧＨ提示は、標的としてｈＧＨｂｐを用いてファージＥＬＩＳＡ（例
１３）によって測定された（図３）。

【０２５２】 例１６−異なるゾーン内での突然変異を組合わせるタンパク質VIII異型を用い たｈＧＨの提示 クンケルの方法（例１２）を使用し、増強されたｈＧＨ提示について独立して
選択されたタンパク質VIII異型の突然変異を組合せた。オリゴヌクレオチドｇ８
Ｖ２ｃを使用し、タンパク質VIII(１ａ）をコードする遺伝子内にタンパク質VII
I(２ａ）の突然変異を導入した。オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ３ｃを使用し、タン
パク質VIII(２ａ）をコードする遺伝子内にタンパク質VIII(３ａ）の突然変異を
導入した。標的として抗−ｈＧＨモノクローナル抗体を用いてファージＥＬＩＳ
Ａ（例１３）によりｈＧＨ提示を測定した（図５）。

【０２５３】 例１７−野生型配列への復帰突然変異によるタンパク質VIII(２ａ）に由来す
るタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨの提示 クンケルの方法（例１２）を使用し、突然変異誘発オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ
２−Ｅ１２Ｎ、ｇ８Ｖ２−Ｄ１６Ａ又はｇ８Ｖ２−Ｉ１７Ｓをそれぞれ用いて、
タンパク質VIII(２ａ）をコードする遺伝子内に突然変異Ｅ１２Ｎ、Ｄ１６Ａ又
はＩ１７Ｓを導入した。標的として抗−ｈＧＨモノクローナル抗体を用いてファ
ージＥＬＩＳＡ（例１３）によりｈＧＨ提示を測定した（図６）。

【０２５４】 例１８−ファージミドｐＳ１６０７でのｈＧＨの提示 さらなる配列分析により、図２、３、５及び８で使用されたｐＳ３４９内に含
有される融合タンパク質VIII遺伝子は、ｈＧＨとタンパク質VIIIの間のリンカー
をコードする最終塩基対及びタンパク質VIIIをコードする最初の４つの塩基対か
ら成る５つの塩基対の欠失を有していたことが明らかになった。この欠失は、ｈ
ＧＨ提示を低減させるフレームシフトを導入した。ｐＳ３４９内のフレームシフ
トを補正するため突然変異誘発オリゴヌクレオチドＬ−wtを用いてクンケルの方
法（例１２）を利用した。結果として得られたファージミドをｐＳ１６０７と呼
称した。ファージミドｐＳ１６０７は、このフレームシフトを補正するための５
つの塩基対の付加においてのみｐＳ３４９と異なっている。ｐＳ３４９では、ｈ
ＧＨ遺伝子に続く配列は以下のとおりである：ＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
ＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴ（下線付きの塩基は、タンパク質VIII
遺伝子の最初の一部分である（配列番号８０）。ｐＳ１６０７では、これに対応
する配列は、以下のとおりである：ＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧ
ＧＡＧＣＴＣＣＡgcgccＧＡＧＧＧＴ（小文字は、オリゴヌクレオチドＬ−wtを
伴う突然変異誘発を通して挿入された塩基を表わしている）（配列番号８１）。
ｈＧＨ提示は、標的としてｈＧＨｂｐを用いて、ファージＥＬＩＳＡ（例１３）
によって測定された（図９）。

【０２５５】 例１９−タンパク質VIII異型でのＦａｂ提示 ファージミドｐＳ１７０５ａは、タンパク質VIIIに触合されたＦａｂ重鎖及び
遊離Ｆａｂ軽鎖の分泌を誘導する。Ｆａｂ重鎖は同様に、特異的モノクローナル
抗体で検出されうるそのＮ末端に融合されたペプチドフラッグ（ＭＡＤＰＮＲＦ
ＲＧＫＤＬ）（配列番号８２）をも含有している。突然変異誘発オリゴヌクレオ
チドＳＩ３Ａ/ＳＩ７Ｉ及び鋳型ｐＳ１７０５ａでクンケルの方法（例１２）を
使用し、結果として得たファージミドをｐＳ１７０９ｂと呼称した。ファージミ
ドｐＳ１７０９ｂは、Ｆａｂ重鎖に連結されたタンパク質VIII遺伝子は、増強ｈ
ＧＨ提示について選択されたタンパク質VIII異型内で観察された突然変異Ｓ１３
Ａ/Ｓ１７Ｉを含有しているという点を除き、ｐＳ１７０５ａと同一である（図
１Ｂ）。Ｆａｂ提示は、標的としてペプチドフラッグ特異的モノクローナル抗体
を用いてファージＥＬＩＳＡ（例１３）により測定された。ｐＳ１７０９ｂでの
Ｆａｂ提示は、ｐＳ１７０５ａでのＦａｂ提示に比べて大きいものであった（図
１０）。したがって、ｈＧＨの増強提示について選択されたタンパク質VIII突然
変異は、Ｆａｂ提示も増強させた。

【０２５６】 例２０−異なるゾーン内での突然変異を組合わせるタンパク質VIII異型を用い たｈＧＨの提示 増強ｈＧＨ提示について独立して選択されたタンパク質VIII異型からの突然変
異を組合せるために、クンケルの方法（例１２）を使用した。オリゴヌクレオチ
ドｇ８Ｖ２ｃを使用し、タンパク質VIII(１ａ）をコードする遺伝子内にタンパ
ク質VIII(２ａ）の突然変異を導入した。オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ３ｃを使用
し、タンパク質VIII(２ａ）をコードする遺伝子内にタンパク質VIII(３ａ）の突
然変異を導入した。オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ３ｂを使用し、タンパク質VIII(
１ａ）をコードする遺伝子内にタンパク質VIII(３ａ）の突然変異を導入した。
オリゴヌクレオチドｇ８Ｖ３ｃを使用し、タンパク質VIII（１ａ）及びタンパク
質VIII（２ａ）の突然変異を含むタンパク質VIIIをコードする遺伝子内にタンパ
ク質VIII（３ａ）の突然変異を導入した。標的として抗−ｈＧＨモノクローナル
抗体を用いてファージＥＬＩＳＡ（例１３）によりｈＧＨ提示を測定した。全て
のタンパク質VIII異型は、野生型タンパク質VIIIと比べてｈＧＨ提示を増強させ
た（図１１）。

【０２５７】 例２１−野生型配列への復帰突然変異による、タンパク質VIII選択体から誘導 されたタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨのモジュレーションされた提示 復帰突然変異走査は、野生型配列に復帰する異型、タンパク質VIIIといったよ
うなコートタンパク質内の各突然変異の独立した転換である。ゾーン１、２又は
３内に突然変異を伴うタンパク質VIII選択体が復帰突然変異走査分析に付された
。タンパク質VIII(１ａ）、タンパク質VIII(２ａ）及びタンパク質VIII(３ａ）
（図１）といった選択体が分析された。野生型配列に戻るよう所定の突然変異体
内の各突然変異を突然変異させるためにクンケルの方法（例１２）を用いた。適
切に設計され命名されたオリゴヌクレオチドを使用した（例えばオリゴヌクレオ
チドＤ１Ａはタンパク質VIII(１ａ）内のＡｓｐＩをＡｌａに突然変異させる）
。さらに、同じく適切に設計され命名されたオリゴヌクレオチドを用いて、２倍
及び３倍の復帰突然変異をタンパク質VIII(２ａ）内に導入した（例えば、オリ
ゴヌクレオチドＡ１３Ｓ/Ｉ１７Ｓは、同時にＡ１３及びＩ１７をＳｅｒに突然
変異させる）。

【０２５８】 標的として抗ｈＧＨモノクローナル抗体を用いてファージＥＬＩＳＡ（例１３
）を用いてｈＧＨ提示を測定した。一部分の復帰突然変異はｈＧＨ提示を低減さ
せ、ｈＧＨ提示のモジュレーションを可能にした（図１２）。

【０２５９】 例２２〜２５用のオリゴヌクレオチド

【０２６０】

【表１４】

【０２６１】

【表１５】

【０２６２】 例２２−タンパク質VIIIのＣ末端に融合されたペプチドの提示のための最適な リンカー長の決定。 標準的分子生物学技術を使用し、ｐＳ１２９０ａと呼称されるファージミドを
構築した。ｐＳ１２９０ａは、ＩＰＴＧ誘発可能なＰｔａｃプロモータ（New En
gland Biolabs)の制御下の読取り枠（ＯＲＦ）が欠失され新しいＯＲＦにより置
換されたという点を除いて、ファージミドｐＳ３４９（例８参照）と同一である
。新しいＯＲＦは、マルトース結合タンパク質シグナルペプチドとそれに続くＳ
ｅｒ残基及びそれに続くE.coliバクテリオファージＭ１３の成熟タンパク質VIII
の残基２−５０から成る融合産物をコードする。ＯＲＦの後には、２つのＴＡＡ
停止コドンが続き、その後には、へプタペプチド（ＨＨＨＨＨＨＡ，ｈｅｘａＨ
ｉｓ）フラッグ又はエピトープタグをコードする配列（ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡ
ＴＣＡＣＣＡＴＧＣＧ）（配列番号１０８）、そしてその後には２つの停止コド
ン（ＴＧＡＴＡＡ）が続く。

【０２６３】 ｐＳ１２９０ａは、クンケルの方法（例１２）を用いて突然変異された。タン
パク質VIIIＣ末端に続く２つのＴＡＡ停止コドン及び第１のＨｉｓコドンは、異
なる数のＧｌｙコドンによって置換された。適切に設計され命名された突然変異
誘発オリゴヌクレオチドが使用された（例えば、オリゴヌクレオチドＧ−６は、
６つのＧｌｙコドンを挿入する）。この結果、変動する数のＧｌｙ残基とそれに
続くｐｅｎｔａＨｉｓフラッグ（ＨＨＨＨＨＡ）を含むリンカーで構成されたＣ
末端融合を伴うタンパク質VIII分子を分泌するように設計されたＯＲＦをコード
する一連のファージミドが構築されることになる。Ｇｌｙ残基の数のゼロ（すな
わちｐｏｌｙＨｉｓフラッグが直接タンパク質VIIIＣ末端に融合された）から２
０まで変動した。捕獲標的として抗（Ｈｉｓ）５抗体（Qiagen）を用いてファー
ジＥＬＩＳＡ（例１３）によりｐｅｎｔａＨｉｓフラッグ提示を測定した。

【０２６４】 例２３−タンパク質VIIIのＣ末端に融合されたペプチドの提示のためのリンカ ー配列の最適化 ｐＳ１２９０ａによりコードされたｈｅｘａＨｉｓフラッグとタンパク質VIII
の間でリンカーを変動させるように、ライブラリーを構築した。ライブラリーは
以前に記述された方法（例１０参照）の改変バージョンを用いて構築した。突然
変異誘発オリゴヌクレオチドを使用し、タンパク質VIIIとｈｅｘａＨｉｓフラッ
グの間の２つのＴＡＡ停止コドンをリンカーライブラリーで置換した。リンカー
の長さは変動し、使用される突然変異誘発オリゴヌクレオチドに依存した：すな
わち、オリゴヌクレオチドＵＨ−Ｌ４、ＵＨ−Ｌ５、ＵＨ−Ｌ６、ＵＨ−Ｌ８，
又はＵＨ−Ｌ１０は、それぞれ４、５、６、８又は１０の残基を含有するリンカ
ーが導入された。リンカーライブラリーの合計多様性は５.７×１０¹⁰であった
。

【０２６５】 上述のリンカーライブラリーからのファージを合わせてプールし、捕獲標的と
して抗（Ｈｉｓ）４抗体（Qiagen）を用いた何ラウンドもの結合選択を反復させ
た。２ラウンドの選択の後、個々のクローンを、標的として抗（Ｈｉｓ）４抗体
を用いたファージＥＬＩＳＡにより、ｈｅｘａＨｉｓフラッグについて検定した
。最強のシグナルを示すクローンをＤＮＡ配列分析に付し、リンカー配列をＤＮ
Ａ配列から演繹し以下に示す。

【０２６６】

【表１６】

【０２６７】 タンパク質VIIIのＣ末端に融合されたペプチドの提示のために選択されたリン
カー。示された配列をタンパク質VIIIの最後の残基とヘプタペプチド（ｈｅｘａ
Ｈｉｓフラッグと呼ばれるＨＨＨＨＨＨＡ）の間に挿入した。各々の選択体につ
いて、ＤＮＡ配列は、下の演繹されたアミノ酸配列と共に示されている。各配列
のための数値的呼称が左側に示されている。

【０２６８】 最適化されたリンカーで達成されたｐｏｌｙＨｉｓフラッグ提示レベルを、捕
獲標的として抗(Ｈｉｓ)５抗体（Qiagen）を用いたファージＥＬＩＳＡにより、
異なる長さのポリグリシンリンカーで達成された提示レベル（例２２）と比較し
た（図１４）。

【０２６９】 例２４−Ｃ末端融合としてのポリペプチドの提示のための新しいファージコー トタンパク質（タンパク質−１２、Ｐ１２）の設計と選択 この例は、ファージコートタンパク質のデノボでの設計及び融合タンパク質を
含むファージ粒子の表面上の問題のタンパク質の提示を実証し、いずれかの異型
ファージコートタンパク質を調製するための本発明の広い範囲を例示している。
ペプチドのレトロ翻訳というのは、一次配列の逆方向読取りであり、結果として
得られるペプチドは、もとのペプチドのレトロペプチドである。例えばペプチド
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕのレトロ翻訳は、レトロペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙである。

【０２７０】 標準的分子生物学技術を使用し、ｐＳ１２０７ａと呼称されるファージミドを
構築した。ｐＳ１２９０ａは、ＩＰＴＧ誘発可能なＰｔａｃプロモータ（New En
gland Biolabs)の制御下のＯＲＦが欠失され新しいＯＲＦにより置換されたとい
う点を除いて、ファージミドｐＳ３４９（例８）と同一である。新しいＯＲＦの
ＤＮＡ配列は以下の通りである。

【０２７１】

【表１７】

【０２７２】 新しいＯＲＦは、以下のポリペプチドをコードする。ＭＳＫＳＴＦＫＫＦＬＫ
ＥＴＡＳＡＱＬＳＮＦＡＡＫＡＰＤＤＧＥＡＡＡＨＨＨＨＨＨＡ.（配列番号１
２０）。

【０２７３】 このＯＲＦは、以下のように設計された。最初の２つの残基は、優れた翻訳開
始を可能にするように選択された（Ｍｅｔ−Ｓｅｒ）であった。このジペプチド
には、Ｍ１３バクテリオファージの成熟タンパク質VIIIの残基４０〜４８のレト
ロ翻訳が続き（ＫＳＴＦＫＫＦＬＫにレトロ翻訳されたＫＬＦＫＫＦＴＳＫ）、
この後に今度はタンパク質VIII残基１〜２０のレトロ翻訳が続いた（ＥＴＡＳＡ
ＱＬＳＮＳＡＡＫＡＰＤＤＧＥＡにレトロ翻訳されたＡＥＧＤＤＰＡＫＡＡＦＮ
ＳＬＱＡＳＡＴＥ）。このポリペプチドのＣ末端には、ノナペプチド（ＡＡＨＨ
ＨＨＨＨＡ）ｈｅｘａＨｉｓフラッグが融合された。したがって、このＯＲＦは
、ジペプチドＭｅｔ−Ｓｅｒとそれに続く、中央疎水性部分（残基２１〜３０）
の欠失した成熟タンパク質VIIIの残基１〜４８のレトロ翻訳、とそれに続くｈｅ
ｘａＨｉｓフラッグで構成されている。

【０２７４】 鋳型としてｐＳ１２０７ａを用いて突然変異オリゴヌクレオチドとしてＰｅｐ
−ｉｎｓを用いて以前に記述された方法の修正版（例１０参照）により、上述の
ＯＲＦの残基１１と１２の間に１９ｍｅｒペプチドのライブラリーを挿入した。
結果として得られたライブラリーは、以下の配列をもつＯＲＦをコードした： ＭＳＫＳＴＦＫＫＦＬＫ−(x)１９-ＥＴＡＳＡＱＬＳＮＦＡＡＫＡＰＤＤＧＥ
ＡＡＡＨＨＨＨＨＨＡ（配列番号１２１）、ここで「（ｘ）１９」はランダム１
９ｍｅｒペプチドライブラリーを表わす。ライブラリー内の各位置で使用された
縮重コドンは、図１５に示されている。ライブラリー多様性は８.３×１０¹⁰で
あった。

【０２７５】 ライブラリーからのファージは、捕獲標的として抗(Ｈｉｓ)４抗体（Qiagen）
を用いて、何ラウンドもの結合選択を反復された。３ラウンド又は４ラウンドの
選択の後、抗(Ｈｉｓ)４抗体又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかを標
的としてファージＥＬＩＳＡを用いてｈｅｘａＨｉｓフラッグ提示について個々
のクローンを検定した。検定された７２のクローンのうち、６つは、ＢＳＡでは
なく抗(Ｈｉｓ)４抗体で捕獲したとき少なくとも２倍のシグナルを示した（図１
６）。これらのクローンをＤＮＡ配列分析に付し、タンパク質配列をＤＮＡ配列
から演繹した。

【０２７６】 これらのタンパク質配列は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−１２」（Ｐ１２）と呼ばれる
新しいクラスのファージコートタンパク質を表わす。個々のユニーククローンは
、付加的な数字により呼称されている（例えばＰｒｏｔｅｉｎ１２−１又はＰ１
２−１）。図１６に示されているように、Ｐ１２のＣ末端に融合されたペプチド
は、Ｍ１３ファージの表面上に提示される。Ｐ１２−１をコードする遺伝子を含
むファージミドは、ｐＳ１２３０ａと命名された。

【０２７７】 例２５−Ｃ末端融合としての大型タンパク質の提示のための第２世代のＰ１２ の選択 Ｐ１２−１をコードする領域とｐｏｌｙＨｉｓフラッグの間でファージミドｐ
Ｓ１２３０ａ内にＮｓｉＩ制限部位とそれに続くＸｂａＩ制限部位を挿入するた
め、突然変異誘発オリゴヌクレオチドａｄｄＮＸと共にクンケルの方法（例１２
）を使用した。結果として得られた配列は、以下の通りであった： …ｇｃｔｇｃｇｇｃｔＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣｃ
ａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔ…（配列番号１２２）挿入された配列は、
ＮｉｓＩ及びＸｂａＩ制限部位と共に、大文字テキストで示されている。挿入さ
れた配列には、Ｐ１２−１の最終残基をコードする配列が先行し、ｐｏｌｙＨｉ
ｓフラッグをコードする配列が後続している（共に小文字テキストで示されてい
る）。新しいファージミドはｐＳ１２３２ａと呼称された。

【０２７８】 ファージミドｐＳ１２３２ａを、ＮｓｉＩ及びＸｂａＩで消化させ、ｈＧＨ結
合タンパク質（ｈＧＨｂｐ）に対する改善された親和力をもつｈＧＨ突然変異体
（ｈＧＨスーパーミュータント、ｈＧＨｓｍ）をコードする同様の形で消化され
たＤＮＡフラッグメントを挿入した。ファージミドはｐＳ１２３９ｂと呼称され
た：これは、Ｐ１２−１をコードするＯＲＦとそれに続くテトラペプチドリンカ
ー（Ａｌａ-Ａｌａ-Ａｓｐ-Ａｌａ），そしてそれに続く以下で示すようなｈＧ
Ｈｓｍを含有する。ｐＳ１２３９ｂＯＲＦのタンパク質産物が描かれている；こ
れは、Ｐ１２−１とそれに続くテトラペプチドリンカー（ＡＡＤＡ）及びそれに
続くｈＧＨｓｍで構成されている。さらに、図示されているようにテトラペプチ
ドリンカーの中央にランダム１４残基ペプチドが挿入されたリンカーライブラリ
ーが構築された。

【０２７９】

【表１８】

【０２８０】 ｐＳ１２３９ｂから産生されたファージ粒子は、捕獲標的としてｈＧＨｂｐを
用いるファージＥＬＩＳＡにおいて検出可能なレベルでｈＧＨｓｍを提示しなか
った。

【０２８１】 Ｃ末端融合としてｈＧＨｓｍを提示する能力をもつＰ１２異型を得るために、
ｐＳ１２３９ｂによりコードされたＰ１２−１の配列を突然変異させるためライ
ブラリーを構築した。ライブラリー構築のためには、以前に記述した方法を使用
した（例１０）。Ｐ１２−１を、各々１区間の隣接残基を含む６個のゾーン（ゾ
ーン１、残基２〜７；ゾーン２、残基６〜１１；ゾーン３、残基１２−２１；ゾ
ーン４、残基２１−３０；ゾーン５、残基３１〜４０；ゾーン６、残基４１〜５
０）に分割した。全２０種の天然アミノ酸をコードする縮重コドンと等しい数（
ＮＮＳ，ここでＮ＝Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴ）をもつゾーン内で全てのコドンを同時に
置換するように、オリゴヌクレオチドを設計した。各々のオリゴヌクレオチドは
、それが突然変異したゾーンに従って命名された（例えば、オリゴヌクレオチド
Ｌｉｂ−ｚｏｎｅＩ突然変異されたゾーン１）。さらに、Ｐ１２−１をｈＧＨｓ
ｍに連結するテトラペプチドリンカーの中央に１４種の縮重コドン（ＶＶＣ、こ
こでＶ＝Ａ、Ｃ又はＧ；Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒをコードする）を挿入するように、オリゴヌクレオチド
（Ｌｉｂ−Ｌｉｎｋｅｒ）を設計した。これらのライブラリーの多様性は、以下
の通りであった：ゾーン１、２.５×１０¹⁰；ゾーン２、２.５×１０¹⁰；ゾーン
３、２.６×１０¹⁰；ゾーン４、２.４×１０¹⁰；ゾーン５、２.４×１０¹⁰；ゾ
ーン６、２.３×１０¹⁰；リンカーライブラリー，２.８×１０¹⁰。

【０２８２】 全てのライブラリーからのファージをプールし、９６ウェルのMaxisorp免疫プ
レート上にコーティングされたｈＧＨｂｐ（例１１）を標的とした何ラウンドも
の結合選択を反復させた。Ｍ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene)を用
いてファージをE.coliＳＳ３２０内で増殖させた。４ラウンドの結合選択の後、
ｈＧＨｓｍ提示について、個々のクローンを分析した。ラウンド２、３及び４の
各々について、２４のクローンを分析した。各クローンからファージを分離し、
ファージＥＬＩＳＡを用いてｈＧＨｓｍ提示を検出した（例１３）。ラウンド２
からの単一クローンは、ＢＳＡでコーティングされたプレートに比べてｈＧＨｂ
ｐでコーティングされたプレートに対して１０倍の結合を示した：その他のクロ
ーンは全く、ｈＧＨｂｐ又はＢＳＡのいずれでコーティングされたプレートに対
しても類似の結合を示した。正のクローンに対応するファージミドはｐＳ１２５
８と呼称された。

【０２８３】 ｐＳ１２５８のＯＲＦをコードするＰ１２−１突然変異体の完全なＤＮＡ配列
を決定し、タンパク質配列を演繹し、以下に示した。アミノ酸番号は右に示され
ている。

【０２８４】

【表１９】

【０２８５】 新しい突然変異体コートタンパク質はＰ１２−７と命名された；その配列は、
ゾーン５内のＰ１２−１とは異なっている。ファージＥＬＩＳＡによって証明さ
れるようにＰ１２−７のＣ末端に対するｈＧＨｓｍの融合により、Ｍ１３ファー
ジの表面上のｈＧＨｓｍの提示が可能となる。

【０２８６】 我々は同様に、例えば野生型ｈＧＨといったその他のタンパク質の提示をＰ１
２−７が可能にするということを実証することをも望んでいた。ｐＳ１２３９ｂ
がＰ１２−１とそれに続く野生型ｈＧＨから成る融合タンパク質をコードすると
いう点を唯一の差異として（例８）、（上で記述した）ｐＳ１２３９ｂに類似し
たファージミドを構築し、これをｐＳ１２３９ａと呼称した。ｐＳ１２３９ａか
ら産生したファージ粒子は、ファージＥＬＩＳＡにおいて検出可能なレベルでｈ
ＧＨを提示しなかった。突然変異誘発オリゴヌクレオチド（add−Ｐ１２−７）
を用いるクンケル方法（例１２）を用い、Ｐ１２−１をコードするｐＳ１２３９
ａＤＮＡ配列を、Ｐ１２−７をコードするＤＮＡ配列に転換した。新しいファー
ジミドをｐＷ９３０ａと呼称した。これは、Ｐ１２−７とそれに続く野生型ｈＧ
Ｈから成る融合タンパク質をコードするＯＲＦを含有している。ファージＥＬＩ
ＳＡによって証明されるように、ｐＷ９３０ａを宿すE.coli培養から分離された
ファージ粒子は、その表面上でｈＧＨを提示した。

【０２８７】 例２６−タンパク質VIIIＣ末端ドメインのＣ末端に融合されたペプチドの提示 のためのリンカー配列の最適化 例２６のためのオリゴヌクレオチド

【０２８８】

【表２０】

【０２８９】 標準的分子生物学技術を使用し、ｐＳ１４２８ｄと呼称されたファージミドを
構築した。ＩＰＴＧ誘発可能なＰｔａｃプロモータ（New England Biolabs)の制
御下のＯＲＦがマルトース結合タンパク質シグナルペプチドとそれに続くＭ１３
タンパク質VIIIのＣ末端ドメインで構成されているという点を除いて、ファージ
ミドｐＳ１４２８ｄはｐＳ１２９０ａと類似している（Lowman et al.,（１９９
１）Biochemistry.３０：１０８３２）。クンケルの方法（例１２）を使用し、
ｐＳ１４２８ｄによりコードされたタンパク質VIIIＣ−末端ドメインのＣ末端に
対しライブラリーを融合させた。ライブラリーは、異なる長さのランダムリンカ
ーとそれに続くｈｅｘａＨｉｓフラッグ（ＨＨＨＨＨＨ）で構成されていた。最
終結果は、タンパク質VIIIのＣ末端ドメインをコードしたＯＲＦとそれに続くラ
ンダムポリペプチドリンカー配列そしてそれに続くｈｅｘａＨｉｓフラッグを含
むライブラリーであった。リンカーの長さは変動し、使用された突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドにより左右された。オリゴヌクレオチドＵＨｇ３−Ｌ６、ＵＨ
ｇ３−Ｌ８又はＵＨｇ３−Ｌ１０は、それぞれ６、８又は１０個の残基を含有す
るリンカーを導入した。ライブラリーの多様性は以下のとおりであった：ＵＨｇ
３−Ｌ６、３.５×１０¹⁰；ＵＨｇ３−Ｌ８、１.２×１０¹⁰；ＵＨｇ３−Ｌ１０
、２.８×１０¹⁰。

【０２９０】 ライブラリーからのファージを合わせてプールし、抗(Ｈｉｓ)４抗体（Qiagen
)を捕獲標的として、結合選択を通して循環させた。２ラウンドの選択の後、抗(
Ｈｉｓ)４抗体を標的としてファージＥＬＩＳＡを用いてｈｅｘａＨｉｓフラッ
グ提示について個々のクローンを検定した。強い信号を示す３つのクローンを、
ＤＮＡ配列分析に付し、選択されたリンカー配列を以下に示す。

【０２９１】

【表２１】

【０２９２】 示された配列を、タンパク質VIIIＣ末端ドメインの最終残基とｈｅｘａＨｉｓ
フラッグの間に挿入した。各選択体について、ＤＮＡ配列は、下に演繹されたア
ミノ酸配列を伴って示されている。各配列についての呼称は左側に示されている
。

【０２９３】 ｐｏｌｙＨｉｓフラッグ提示レベルを、タンパク質VIIIに対するＣ末端又はＮ
末端融合で達成された提示レベルと比較した。興味深いことに、タンパク質III
Ｃ末端ドメインに対するＣ末端融合での提示は、タンパク質VIIIに対するＮ末端
融合での提示と同等であり、タンパク質VIIIに対するＣ末端融合での提示に比べ
て約１０倍高いものであった（図１８）。

【０２９４】 以上に記した明細は、当業者が本発明を実施できるようにするのに充分なもの
と考えられる。寄託された実施形態は本発明の或る態様の別々の例示として意図
されたものであり、機能的に等価のあらゆる培養が本発明の範囲内に入ることか
ら、本発明は、寄託された培養によってその範囲を制限されるものではない。本
書の材料の寄託は、本書に含まれている記述がその最良の形態を含めた本発明の
あらゆる態様の実施を可能にするのに不適切であることの容認を構成するもので
はなく、又クレームの範囲をそれが表わす特定の例示に制限するものとしてみな
されるべきものでもない。実際、本書に示され記述されたものに加えて本発明の
種々の修正は、以上の記述から当業者には明らかとなるはずであり、それらは添
付のクレームの範囲内に入ることになる。

【０２９５】 本発明は必然的に好ましい実施形態と合わせて記述してきたは、当業者であれ
ば、以上の明細書を読んだ上で、その精神及び範囲から逸脱することなく本書に
記された内容に対し種々の変更、等価物の置換及び改正を加えることができるだ
ろう。従って、本発明は、本書に特定的に記述されたもの以外の方法で実施可能
である。従って、それについて特許証によって付与される保護は、添付のクレー
ム及びその等価物によってのみ制限されるということが意図されている。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 増加した融合タンパク質の提示に関して選択されたタンパク質VIII異型。図１
Ａは、タンパク質VIII残基１から１０を包含するゾーン１ライブラリーを示す。
図１Ｂは、タンパク質VIII残基１１から２０を包含するゾーン２ライブラリーを
示す。図１Ｃは、タンパク質VIII残基２１から３０を包含するゾーン３ライブラ
リーを示す。ライブラリー内の各位置における可能性のあるバリエーションは、
野生型配列及び選択された配列の前に示されている。ＤＮＡ配列がイタリック体
で上に示されており、推定アミノ酸配列が普通文字で下に示されている（E.coli
ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいては、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）は、グルタミンと
して抑圧されている）。ＤＮＡ縮重は、ＩＵＢコード（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ
／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）で表されている
。*はストレプトアビジン（ＳＡＶ）提示のため選択された。他は全てｈＧＨ提
示のため選択された。

【図１Ｂ】 増加した融合タンパク質の提示に関して選択されたタンパク質VIII異型。図１
Ａは、タンパク質VIII残基１から１０を包含するゾーン１ライブラリーを示す。
図１Ｂは、タンパク質VIII残基１１から２０を包含するゾーン２ライブラリーを
示す。図１Ｃは、タンパク質VIII残基２１から３０を包含するゾーン３ライブラ
リーを示す。ライブラリー内の各位置における可能性のあるバリエーションは、
野生型配列及び選択された配列の前に示されている。ＤＮＡ配列がイタリック体
で上に示されており、推定アミノ酸配列が普通文字で下に示されている（E.coli
ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいては、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）は、グルタミンと
して抑圧されている）。ＤＮＡ縮重は、ＩＵＢコード（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ
／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）で表されている
。*はストレプトアビジン（ＳＡＶ）提示のため選択された。他は全てｈＧＨ提
示のため選択された。

【図１Ｃ】 増加した融合タンパク質の提示に関して選択されたタンパク質VIII異型。図１
Ａは、タンパク質VIII残基１から１０を包含するゾーン１ライブラリーを示す。
図１Ｂは、タンパク質VIII残基１１から２０を包含するゾーン２ライブラリーを
示す。図１Ｃは、タンパク質VIII残基２１から３０を包含するゾーン３ライブラ
リーを示す。ライブラリー内の各位置における可能性のあるバリエーションは、
野生型配列及び選択された配列の前に示されている。ＤＮＡ配列がイタリック体
で上に示されており、推定アミノ酸配列が普通文字で下に示されている（E.coli
ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいては、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）は、グルタミンと
して抑圧されている）。ＤＮＡ縮重は、ＩＵＢコード（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ
／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）で表されている
。*はストレプトアビジン（ＳＡＶ）提示のため選択された。他は全てｈＧＨ提
示のため選択された。

【図２】 タンパク質VIII及び選択されたタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨ提示に関す
るファージＥＬＩＳＡ。ｈＧＨｂｐが標的として使用された（Ｋｄ＝１．６nM、
Pearce, K. H. Jr., et al. (1997)J. Biol. Chem 272:20595-20602）。提示は
、ｈＧＨ−タンパク質VIII（丸）、ｈＧＨ−タンパク質VIII（１ａ）（四角）、
ｈＧＨ−タンパク質VIII（２ａ）（菱形）、及びｈＧＨ−タンパク質VIII（３ａ
）（三角）について測定された。ファージは、１０ｕＭ ＩＰＴＧで誘導してい
ない培養物（白）又は誘導した培養物（黒）のいずれかから産生された。タンパ
ク質VIII異型の配列は図１に示されている。

【図３】 ｈＧＨ突然変異体の提示に関するファージＥＬＩＳＡ。ｈＧＨｂｐが標的とし
て使用された。提示は、野生型ｈＧＨ（丸、Ｋｄ＝１．６nM）、ｈＧＨ（Ｒ６４
）（四角、Ｋｄ＝１３．８nM）ｈＧＨ（Ｙ１６４Ａ／Ｒ１７８Ａ）（菱角、Ｋｄ
＝１６９nM）、及びｈＧＨ（Ｋ１７２Ａ／Ｒ１７８Ａ）（三角、Ｋｄ＝８２０nM
）について測定された。ｈＧＨは、野生型タンパク質VIII（白）又はタンパク質
VIII（１ａ）（黒）と融合していた。ファージは、１０μMＩＰＴＧで誘導した
培養物から産生された。

【図４Ａ】 ＳＡＶ提示に関するファージＥＬＩＳＡ。図４Ａは、抗ＳＡＶポリクローナル
抗体を標的として使用した結果を示す。図４Ｂは、ビオチン−ＢＳＡ結合体を標
的として使用した結果を示す。提示は、ＳＡＶ−タンパク質VIII（丸）、ＳＡＶ
−タンパク質VIII（２ｅ）（三角）、ＳＡＶ−タンパク質VIII（２ｆ）（菱形）
、及びＳＡＶ−タンパク質VIII（２ａ）（四角）について測定された。ファージ
は、誘導していない培養物から産生された。

【図４Ｂ】 ＳＡＶ提示に関するファージＥＬＩＳＡ。図４Ａは、抗ＳＡＶポリクローナル
抗体を標的として使用した結果を示す。図４Ｂは、ビオチン−ＢＳＡ結合体を標
的として使用した結果を示す。提示は、ＳＡＶ−タンパク質VIII（丸）、ＳＡＶ
−タンパク質VIII（２ｅ）（三角）、ＳＡＶ−タンパク質VIII（２ｆ）（菱形）
、及びＳＡＶ−タンパク質VIII（２ａ）（四角）について測定された。ファージ
は、誘導していない培養物から産生された。

【図５】 異なるゾーンの突然変異を組み合わせたタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨ提
示に関するファージＥＬＩＳＡ。抗ｈＧＨモノクローナル抗体が標的として使用
された。提示は、タンパク質VIII（黒丸）、タンパク質VIII（１ａ）（黒四角）
、タンパク質VIII（２ａ）（黒菱形）、タンパク質VIII（３ａ）（黒三角）、タ
ンパク質VIII（１ａ）及びタンパク質VIII（２ａ）の突然変異を含有するタンパ
ク質VIII（白丸）、又はタンパク質VIII（２ａ）及びタンパク質VIII（３ａ）の
突然変異を含有するタンパク質VIII（白四角）について測定された。

【図６】 タンパク質VIII（２ａ）に由来するタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨ提示に
関するファージＥＬＩＳＡ。抗ｈＧＨモノクローナル抗体が標的として使用され
た。提示は、タンパク質VIII（２ａ）（黒丸）、又は以下の突然変異、Ｅ１２Ｎ
（白四角）、Ｄ１６Ａ（白丸）、若しくはＩ１７Ｓ（白三角）を含有するタンパ
ク質VIII（２ａ）のいずれかとの融合体として提示されたｈＧＨについて測定さ
れた。

【図７Ａ】 ｈＧＨ提示又はＳＡＶ提示のために選択されたリンカー。７Ａ）ｈＧＨの提示
のために選択されたリンカー。リンカーは、（Ｇｌｙ）３（Ｘａａ）１４（Ｇｌ
ｙ）２（ここで、（Ｘａａ）１４は、示された選択された配列である）という形
態であった。７Ｂ）ＳＡＶの提示のために選択されたリンカー。

【図７Ｂ】 ｈＧＨ提示又はＳＡＶ提示のために選択されたリンカー。７Ａ）ｈＧＨの提示
のために選択されたリンカー。リンカーは、（Ｇｌｙ）３（Ｘａａ）１４（Ｇｌ
ｙ）２（ここで、（Ｘａａ）１４は、示された選択された配列である）という形
態であった。７Ｂ）ＳＡＶの提示のために選択されたリンカー。

【図８Ａ】 選択されたリンカーを用いたタンパク質提示に関するファージＥＬＩＳＡ。８
Ａ）Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（ファージミドｐＳ３４９、丸）又はリンカー選択
体リンク１（図７Ａ、四角）のいずれかを用いるタンパク質VIII上に提示された
ｈＧＨ。ファージは、１０ｕＭ ＩＰＴＧで誘導していない培養物（白）又は誘
導した培養物（黒）のいずれかから産生された。ｈＧＨｂｐが標的として使用さ
れた。８Ｂ）Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（白丸）を用いる野生型タンパク質VIII上
に提示された、又はＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（白四角）、リンク１８（黒丸）、
リンク２９（黒四角）、リンク３４（黒菱形）、若しくはリンク３７（黒三角）
のいずれかを用いる異型タンパク質VIII（２ｅ）上に提示されたＳＡＶ。Ｇｌｙ
／Ｓｅｒ配列は、ｐＳ３４９によりコードされたＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーと同一
であった。その他のリンカーの配列は図７Ｂに示されている。ビオチン化された
ＢＳＡが標的として使用された。

【図８Ｂ】 選択されたリンカーを用いたタンパク質提示に関するファージＥＬＩＳＡ。８
Ａ）Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（ファージミドｐＳ３４９、丸）又はリンカー選択
体リンク１（図７Ａ、四角）のいずれかを用いるタンパク質VIII上に提示された
ｈＧＨ。ファージは、１０ｕＭ ＩＰＴＧで誘導していない培養物（白）又は誘
導した培養物（黒）のいずれかから産生された。ｈＧＨｂｐが標的として使用さ
れた。８Ｂ）Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（白丸）を用いる野生型タンパク質VIII上
に提示された、又はＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（白四角）、リンク１８（黒丸）、
リンク２９（黒四角）、リンク３４（黒菱形）、若しくはリンク３７（黒三角）
のいずれかを用いる異型タンパク質VIII（２ｅ）上に提示されたＳＡＶ。Ｇｌｙ
／Ｓｅｒ配列は、ｐＳ３４９によりコードされたＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーと同一
であった。その他のリンカーの配列は図７Ｂに示されている。ビオチン化された
ＢＳＡが標的として使用された。

【図９】 タンパク質VIII及び選択されたタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨ提示に関す
るファージＥＬＩＳＡ。ｈＧＨｂｐが標的として使用された（Ｋｄ＝１．６nM、
Pearce, K. H. Jr., et al. (1997)J. Biol. Chem 272:20595-20602）。提示は
、ファージミドｐＳ１６０７から発現されたｈＧＨ−タンパク質VIII（実施例１
１参照）（丸）、ｈＧＨ−タンパク質VIII（１ａ）（四角）、ｈＧＨ−タンパク
質VIII（２ａ）（菱形）、及びｈＧＨ−タンパク質VIII（３ａ）（三角）につい
て測定された。ファージは、１０ｕＭＩＰＴＧで誘導していない培養物（白）又
は誘導した培養物（黒）のいずれかから産生された。タンパク質VIII異型の配列
は、図１に示されている。

【図１０】 タンパク質VIII及びタンパク質VIII異型を用いたＦａｂ提示に関するファージ
ＥＬＩＳＡ。Ｆａｂ重鎖のＮ末端と融合したペプチドフラッグに特異的なモノク
ローナル抗体が標的として使用された。提示は、Ｆａｂ−タンパク質VIII（丸）
又はＦａｂ−タンパク質VIII（Ｓ１３Ａ／Ｓ１７Ｉ）について測定された。

【図１１】 異なるゾーンの突然変異を組み合わせたタンパク質VIII異型を用いたｈＧＨ提
示に関するファージＥＬＩＳＡ。抗ｈＧＨモノクローナル抗体が標的として使用
された。ｈＧＨは、野生型タンパク質VIII（wt）、ゾーン１、２、若しくは３の
タンパク質VIII選択体（それぞれ、１ａ、２ａ、若しくは３ａ）又はこれらの選
択体由来の突然変異を組み合わせたタンパク質VIII異型（例えば、１ａ＋２ａは
、１ａの残基１から１０と、２ａの残基１１から２０及び野生型の残基２１から
５０とを組み合わせたものである）と融合していた。タンパク質VIII選択体の配
列は図１に示されている。

【図１２Ａ】 タンパク質VIII異型の部位特異的突然変異誘発は、増強された提示のための鍵
となる位置を強調し、モジュレートされたｈＧＨ提示を可能にする。ｈＧＨは、
Ａ）ゾーン１選択体１ａ、Ｂ）ゾーン２選択体２ａ、又はＣ）ゾーン３選択体３
ａに由来する異型と融合していた。各タンパク質VIII選択体について、野生型配
列への全ての可能な単一復帰突然変異を示す（例えば、Ｄ１Ａは、突然変異Ｄ１
Ａを選択体１ａに導入することにより得られたタンパク質VIII異型である）。さ
らに、Ｄ）ｈＧｈ提示をさらにモジュレートするため、ゾーン２選択体２ａへ二
重及び三重の復帰突然変異を導入した。タンパク質VIII選択体の配列は図１に示
されている。

【図１２Ｂ】 タンパク質VIII異型の部位特異的突然変異誘発は、増強された提示のための鍵
となる位置を強調し、モジュレートされたｈＧＨ提示を可能にする。ｈＧＨは、
Ａ）ゾーン１選択体１ａ、Ｂ）ゾーン２選択体２ａ、又はＣ）ゾーン３選択体３
ａに由来する異型と融合していた。各タンパク質VIII選択体について、野生型配
列への全ての可能な単一復帰突然変異を示す（例えば、Ｄ１Ａは、突然変異Ｄ１
Ａを選択体１ａに導入することにより得られたタンパク質VIII異型である）。さ
らに、Ｄ）ｈＧｈ提示をさらにモジュレートするため、ゾーン２選択体２ａへ二
重及び三重の復帰突然変異を導入した。タンパク質VIII選択体の配列は図１に示
されている。

【図１２Ｃ】 タンパク質VIII異型の部位特異的突然変異誘発は、増強された提示のための鍵
となる位置を強調し、モジュレートされたｈＧＨ提示を可能にする。ｈＧＨは、
Ａ）ゾーン１選択体１ａ、Ｂ）ゾーン２選択体２ａ、又はＣ）ゾーン３選択体３
ａに由来する異型と融合していた。各タンパク質VIII選択体について、野生型配
列への全ての可能な単一復帰突然変異を示す（例えば、Ｄ１Ａは、突然変異Ｄ１
Ａを選択体１ａに導入することにより得られたタンパク質VIII異型である）。さ
らに、Ｄ）ｈＧｈ提示をさらにモジュレートするため、ゾーン２選択体２ａへ二
重及び三重の復帰突然変異を導入した。タンパク質VIII選択体の配列は図１に示
されている。

【図１２Ｄ】 タンパク質VIII異型の部位特異的突然変異誘発は、増強された提示のための鍵
となる位置を強調し、モジュレートされたｈＧＨ提示を可能にする。ｈＧＨは、
Ａ）ゾーン１選択体１ａ、Ｂ）ゾーン２選択体２ａ、又はＣ）ゾーン３選択体３
ａに由来する異型と融合していた。各タンパク質VIII選択体について、野生型配
列への全ての可能な単一復帰突然変異を示す（例えば、Ｄ１Ａは、突然変異Ｄ１
Ａを選択体１ａに導入することにより得られたタンパク質VIII異型である）。さ
らに、Ｄ）ｈＧｈ提示をさらにモジュレートするため、ゾーン２選択体２ａへ二
重及び三重の復帰突然変異を導入した。タンパク質VIII選択体の配列は図１に示
されている。

【図１３】 ポリグリシンリンカーを用いるタンパク質VIIIのＣ末端と融合したペプチドの
提示に関するファージＥＬＩＳＡ。示されたような様々な数のＧｌｙ残基を含有
する介在リンカー（リンカー長はＸ軸）を用いて、ヘキサペプチド（ペンタＨｉ
ｓフラッグと呼ばれるＨＨＨＨＨＡ）は、タンパク質VIIIのＣ末端と融合してい
た。リンカー長が８残基から９残基に増加するとき、提示は大きく増加する。フ
ァージは、２×１０¹²ファージ/mlという濃度で使用された。抗（Ｈｉｓ）５抗
体（キアゲン（Qiagen））が捕捉標的として使用された。実施例２２を参照せよ
。

【図１４】 最適化されたリンカー配列を用いるタンパク質VIIIのＣ末端と融合したペプチ
ドの提示に関するファージＥＬＩＳＡ。ポリＨｉｓフラッグは、以下のような介
在リンカー、（Ｇｌｙ）８（白丸）、（Ｇｌｙ）９（四角）、（Ｇｌｙ）１０（
菱形）、（Ｇｌｙ）１２（三角）、又は最適化されたリンカー１（黒丸）を用い
て、タンパク質VIIIのＣ末端と融合していた。最も高いレベルの提示は、最適化
されたリンカーで観察された。ファージは、１０¹³ファージ/mlという出発濃度
から５倍段階希釈された。抗（Ｈｉｓ）５抗体（キアゲン）が捕捉標的として使
用された。実施例２２及び２３を参照せよ。

【図１５】 Ｃ末端融合体としてのポリＨｉｓフラッグの提示に関して選択されたＰ１２異
型。各Ｐ１２の可変領域を示す。各Ｐ１２の完全な配列は以下の通りである。 MSＫＳＴＦＫＫＦＬＫ−（ｘ）１９−ＥＴＡＳＡＱＬＳＮＦＡＡＫＡＰＤＤＧＥ
Ａ（配列番号１） ここで、「（ｘ）１９」は、図に示されたようなライブラリー構築において挿入
された１９残基からなる配列である。ライブラリー内の各位置における可能なバ
リエーションは、選択された配列の前に示されている。ＤＮＡ配列は、下の推定
アミノ酸配列と共に示されている。各配列の記号は、左に示されている。上の番
号は、１９残基のライブラリー挿入配列内の各コドンの位置をさす。実施例２４
を参照せよ。

【図１６】 Ｐ１２異型とのＣ末端融合体としてのポリＨｉｓフラッグの提示に関するファ
ージＥＬＩＳＡ。抗（Ｈｉｓ）４抗体（キアゲン）が捕捉標的として使用された
（白カラム）。陰性対照として、ＢＳＡでブロッキングされたプレートに結合す
るファージも測定された（黒カラム）。ファージは、１０¹³ファージ/mlという
濃度で使用された。実施例２４を参照せよ。

【図１７】 Ｐ１２−７を用いたｈＧＨまたはｈＧＨｓｍに関するファージＥＬＩＳＡ。提
示は、Ｐ１２−７のＣ末端と融合したｈＧＨｓｍ（ファージミドｐＳ１２５８、
白丸）、Ｐ１２−７のＣ末端と融合したｈＧＨ（ファージミドｐＷ９３０ａ、白
四角）、Ｐ１２−１のＣ末端と融合したｈＧＨｓｍ（ファージミドｐＳ１２３９
ｂ、黒丸）、Ｐ１２−１のＣ末端と融合したｈＧＨ（ファージミドｐＳ１２３９
ａ、黒四角）、又はタンパク質VIIIのＮ末端と融合したｈＧＨ（ファージミドｐ
Ｓ１６０７、黒菱形）について測定された。抗ｈＧＨモノクローナル抗体が標的
として使用された。実施例２５を参照せよ。

【図１８】 選択されたリンカーを用いるタンパク質IIIＣ末端ドメインのＣ末端と融合し
たペプチドの提示に関するファージＥＬＩＳＡ。以下のような介在リンカー配列
、リンカーｇ３−１（白丸）、リンカーｇ３−２（白四角）、リンカーｇ３−３
（白菱形）を用いて、ヘキサＨｉｓフラッグが提示された。提示は、タンパク質
VIIIとのＮ末端融合体（黒丸）又は最適化されたリンカー１を使用したタンパク
質VIIIとのＣ末端融合体（黒菱形）として提示されたポリＨｉｓフラッグについ
ても測定された。ポリＨｉｓフラッグをコードしないファージミドに由来するフ
ァージも、陰性対照として含ませた（黒四角）。実施例２６を参照せよ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月４日（２０００．１０．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正内容】

【表１】 から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含有する野生型繊維状ファージ
コートタンパク質の異型である、請求項１の融合タンパク質。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１１

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:92） 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１３３，２９６ (32)優先日 平成11年５月10日(1999．5．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３４，８７０ (32)優先日 平成11年５月19日(1999．5．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 ヴァイス，グレゴリー・エー アメリカ合衆国、カリフォルニア 94010、 バーリンガム、フェアフィールド・ロード ナンバー３ 733 (72)発明者 ウェルズ，ジェームス・エー アメリカ合衆国、カリフォルニア 94010、 バーリンガム、コロンブス・アベニュー 1342 Ｆターム(参考） 4B024 BA21 BA32 BA43 BA63 CA02 CA03 CA07 DA06 EA02 EA03 EA06 GA14 HA01 HA17 4B064 AG02 AG20 AG32 CA02 CA12 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA95X AA95Y AA98X AA98Y AB01 BA03 CA44 CA46 4H045 AA10 AA30 BA41 CA01 CA40 DA01 DA75 EA50 FA73

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスの主要コートタンパク質と融合した異種ポリペプチ
   ドを含む融合タンパク質であって、該主要コートタンパク質が、ウイルスの野生
   型主要コートタンパク質の異型である、融合タンパク質。
2. 【請求項２】 ウイルスが、繊維状ファージ、ラムダファージ、バキュロウ
   イルス、Ｔ４ファージ及びＴ７ファージからなる群から選択される、請求項１の
   融合タンパク質。
3. 【請求項３】 該ファージが、繊維状ファージであり、該主要コートタンパ
   ク質が、ｇｐVIIIであり、そして該異種ポリペプチドが、そのＮ末端又はＣ末端
   と融合している、請求項１の融合タンパク質。
4. 【請求項４】 該主要コートタンパク質が、示された位置において下記のリ
   スト： 【表１】 から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含有する繊維状ファージコート
   タンパク質異型である、請求項１の融合タンパク質。
5. 【請求項５】 繊維状ファージのコートタンパク質の少なくとも一部分と融
   合した異種ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、該コートタンパク質が
   、ファージの野生型コートタンパク質の異型であり、該異型が、コートタンパク
   質の膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインに改変を有する、融合タンパク質。
6. 【請求項６】 該コートタンパク質が、繊維状ファージのｇｐIIIであり、
   そして該異種ポリペプチドが、そのＮ末端又はＣ末端と融合している、請求項５
   の融合タンパク質。
7. 【請求項７】 該異型が、野生型コートタンパク質配列と比較して改変され
   た２〜５０個の残基を有する、請求項１の融合タンパク質。
8. 【請求項８】 該異種ポリペプチドが、抗体若しくはその断片又はサイトカ
   イン若しくはサイトカイン受容体である、請求項１の融合タンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１の融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を含む
   、複製可能発現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９の複製可能発現ベクターの複数個を含むライブラ
    リーであって、該発現ベクターが、融合タンパク質の複数個をコードする異なる
    遺伝子融合体の複数個を含む、ライブラリー。
11. 【請求項１１】 請求項２０のベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 その表面上に請求項１の融合タンパク質を提示するウイル
    ス。
13. 【請求項１３】 その表面上に異なる融合タンパク質の複数個を提示する請
    求項１２のウイルスの複数個を含む、ウイルスのライブラリー。
14. 【請求項１４】 請求項１の融合タンパク質の複数個を提示するファージ粒
    子又はファージミド粒子のライブラリーを構築すること、 ファージ粒子又はファージミド粒子を標的分子と接触させ、該粒子の少なくとも
    一部分を標的分子に結合させること、及び 結合しない粒子から結合する粒子を分離することを含む方法。
15. 【請求項１５】 融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を含有するファ
    ージを利用するファージ提示システムの検出限界を低減させる方法であって、該
    遺伝子融合体が、異種ポリペプチドをコードする第一遺伝子及びファージコート
    タンパク質の少なくとも一部分をコードする第二遺伝子を含み、該方法が、第二
    遺伝子を突然変異させ、ファージの野生型コートタンパク質の異型をコードさせ
    ることを含む方法。
16. 【請求項１６】 異種ＤＮＡを細胞内に入れることを可能にするために適切
    な条件下で、異種ＤＮＡの存在下で、細胞を電気穿孔することを含む、細胞を形
    質転換する方法であって、該異種ＤＮＡが、アフィニティ精製により精製される
    、方法。
17. 【請求項１７】 異種ＤＮＡが、約１ピコグラム/ml〜約５００マイクログ
    ラム/mlの濃度で存在する、請求項１６の方法。
18. 【請求項１８】 １回の電気穿孔工程で少なくとも１×１０¹⁰個の形質転換
    体を得る、請求項１６の方法。
19. 【請求項１９】 該細胞が、約１×１０¹¹〜約４×１０¹¹cfu/mlの濃度で存
    在する、請求項１６の方法。
20. 【請求項２０】 該細胞が、Ｆ′：：Ｔｎ１０ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺ｌａｃＩｑＤ（
    ｌａｃＺ）Ｍ１５／Ｆ−ａｒａＤ１３９Ｄ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９６ｇａｌＥ
    １５ｇａｌＫ１６Ｄ（ｌａｃ）Ｘ７４ｒｐｓＬ（Ｓｔｒ^r）ｈｓｄＲ２（ｒ_k ^-ｍ_k ⁺ ）ｍｃｒＡｍｃｒＢ１であるE.coli細胞である、請求項１９の方法。
21. 【請求項２１】 下記工程： （１）宿主細胞内の産物ポリペプチドの発現をもたらすことが可能な制御配列と
    動作可能に連結した産物ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、複製可能発現
    ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することにおいて、 該産物ポリペプチドをコードするＤＮＡは、下記工程： （ａ）遺伝子融合体が、ポリペプチドをコードする第一遺伝子及びファージコー
    トタンパク質の少なくとも一部分をコードする第二遺伝子を含み、異型複製可能
    プラスミドが、異型ポリペプチドをコードする異型第一遺伝子を含む、融合タン
    パク質をコードする遺伝子融合体と動作可能に連結した転写制御要素を含む異型
    複製可能プラスミドのファミリーを構築すること、 （ｂ）請求項１６の方法を用いて、プラスミドを用いて適切な宿主細胞を形質転
    換すること、 （ｃ）場合により、該プラスミドが、ファージ粒子を産生するためにヘルパーフ
    ァージを必要とするファージミドである場合には、形質転換された宿主細胞を、
    組換えファージミド粒子を産生するために十分な量のファージコートタンパク質
    をコードするヘルパーファージで感染させ、好ましくは、微量のファージミド粒
    子だけがファージミド粒子の表面上に融合タンパク質の１個以上のコピーを提示
    すること、 （ｄ）プラスミドの少なくとも一部分を含有し、そして宿主細胞を形質転換する
    ことができる組換えファージ粒子を形成させるために適切な条件下で、形質転換
    された感染宿主細胞を培養すること、 （ｅ）組換えファージ粒子を標的分子と接触させ、ファージ粒子の少なくとも一
    部分を標的分子に結合させること、 （ｆ）結合しないファージ粒子から標的分子と結合するファージ粒子を分離する
    こと、 （ｇ）標的分子と結合するファージ粒子又は結合しないファージ粒子内のプラス
    ミドによってコードされる異型ポリペプチドの一つを、産物ポリペプチドとして
    選択し、そして産物ポリペプチドをコードするＤＮＡを複製可能発現ベクター内
    にクローニングすることを含む方法によって得られる、並びに （２）発現した産物ポリペプチドを回収することを含む、産物ポリペプチドを産
    生するための方法。
22. 【請求項２２】 カルボキシ末端と融合した異種ポリペプチドを有するタン
    パク質III又はタンパク質VIII繊維状ファージコートタンパク質の少なくとも一
    部分を含む、融合タンパク質。
23. 【請求項２３】 遺伝子融合体を含む複製可能発現ベクターであって、該遺
    伝子融合体が、請求項２２の融合タンパク質をコードする、複製可能発現ベクタ
    ー。
24. 【請求項２４】 請求項２３の複製可能発現ベクターの複数個を含むライブ
    ラリーであって、該発現ベクターが、融合タンパク質の複数個をコードする異な
    る遺伝子融合体の複数個を含む、ライブラリー。
25. 【請求項２５】 請求項２３のベクターを含む宿主細胞。
26. 【請求項２６】 その表面上に請求項２２の融合タンパク質を提示するウイ
    ルス。
27. 【請求項２７】 その表面上に異なる融合タンパク質の複数個を提示する請
    求項２６のウイルスの複数個を含む、ウイルスのライブラリー。
28. 【請求項２８】 その表面上に請求項２２の融合タンパク質の複数個を提示
    するファージ粒子又はファージミド粒子のライブラリーを構築すること、 ファージ粒子又はファージミド粒子を標的分子と接触させ、粒子の少なくとも一
    部分を標的分子と結合させること、及び 結合しない粒子から結合する粒子を分離することを含む方法。