MXPA00012040A

MXPA00012040A - Polipeptidos de la beta2gpi del dominio 1, terapeuticos y de diagnostico y metodos para utilizar los mismos

Info

Publication number: MXPA00012040A
Application number: MXPA/A/2000/012040A
Authority: MX
Inventors: David M Marquis; Gilbert M Iverson; Edward J Victoria; David S Jones; Matthew D Linnik
Original assignee: La Jolla Pharmaceutical Co
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 2000-12-05
Publication date: 2002-06-05

Abstract

La presente invención proporciona polipéptidos de la beta2GPI del dominio 1, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, miméicos de estos polipéptidos y los métodos que utilizan los polipéptidos de la beta2GP.I del dominio 1 y los miméticos. Se ha mostrado que la beta2GPI del dominio 1 se une a los anticuerpos anti- cardiolipinas (antifosfolípidos dependientes de la beta2GPI), los cuales están asociados con las diversas patologás, tales como trombosis y pérdida fetal. Los polipéptidos de la beta2GPI del dominio 1 se pueden utilizar para detectar los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la beta2GPI en una muestra. La invención además proporciona métodos para inducir la tolerancia utilizando estos polipéptidos de la beta2GPI del dominio 1.

Description

PO IPEPTIDOS DE LA BETA2GPI DEL DOMINIO 1, TERAPÉUTICOS Y DE DIAGNOSTICO Y MÉTODOS PARA UTILIZAR LOS MISMOS CAMPO TÉCNICO ' Esta invención se refiere a polipéptidos y método para el diagnostico y el tratamiento de patologías asociadas con anticuerpos antifosfolipidos, particularmente aquellas patologías asociadas con los anticuerpos antif ?folipidos dependientes de la ß2GPI . Más específicamente, la invención se refiere a polipéptidos de ß2GPI del dominio 1, miméticos de polipéptidos de ß2GPI del dominio 1, polinucleótidos de ß2GPI del dominio 1, y métodos que utilizan los polipéptidos, especialmente para la detección y para el uso como tolerágenos .

ANTECEDENTES Los anticuerpos antifosfolipidos (aPL) es el término en general dado para describir los autoanticuerpos que están asociados con la trombosis, la pérdida fetal, recurrente y la trombocitopenia como el síndrome de anti -fosfolipidos primario (APS) asi como también enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (SLE) . Harris y colaboradores (1983) Lan cet 2:1211-1214; y Lockshin y colaboradores REF: 125373 (1985) N. Engl . J. Med. 313:152-156. El APS puede ser el significado primario, o secundario, que está asociado con otras condiciones, principalmente el SLE. PHOSPHOLIPID-BI?DI?G A?TIBODIES (Harris y colaboradores, eds. CRC Press, Boca Ratón, FL, 1991; Mc?ein y colaboradores ADVA?CES I? I?MMU?OLOGY, Vol. 49 páginas 193-281 (Austen y colaboradores, eds., Academic Press, San Diego, CA, 1991) ) . Los anticuerpos aPL incluyen los comúnmente llamados autoanticuerpos anticardiolipina (aCL) , los cuales se discuten posteriormente. Los anticuerpos aPL (inclusive los anticuerpos aCL) se detectan en muchas condiciones pero únicamente los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI encontrados en asociación con una enfermedad autoinmune requieren la presencia de la proteina de suero de enlace de fosfolipidos, ß2GPI . Vaarala y colaboradores (1986) Clin . Immunol . Immunopa thol . 41:8-15. Aproximadamente 30% de los pacientes que poseen los anticuerpos aPL persistentes han sufrido un caso trombótico. La presencia de los anticuerpos aPL define un grupo de pacientes dentro del SLE quienes exhiben un síndrome de características clínicas que consisten de una o más de la trombosis, la trombocitopenia (TCP) y la pérdida fetal. El riesgo de este síndrome en el SLE total es alrededor de 25%; este riesgo se incrementa al 40% en la presencia de anticuerpos aPL y disminuye a 15% en su ausencia. Debido a que se piensa que los anticuerpos aPL se dirigen a los fosfolipidos en las membranas del plasma, se ha postulado que los mismos pueden ejercer efectos patogénicos, directos in vivo al interferir con los procesos hemostáticos que toman lugar en las membranas de los fosfolipidos de células tales como plaquetas o el endotelio. En pacientes con el ASP, el hecho que los anticuerpos aPL (inclusive aCL) parezcan ser el único factor de riesgo presente es evidencia adicional que estos anticuerpos tengan un papel patogénico, directo. La inducción del APS mediante la transferencia pasiva de ratones con anticuerpos aPL de humano es la mejor evidencia con todo que los anticuerpos aPL son directamente patogénicos. Bakimer y colaboradores (1992) J. Cl in . Inves t . 89:1558-1563; Blank y colaboradores (1991) Proc . Na ti . Acad. Sci . 88:3069-3073. Los cálculos varian pero en aproximadamente 15% de todos los pacientes con apoplejía, se piensa que los anticuerpos aPL son un factor de contribución importante.

La correlación clara entre la presencia de estos anticuerpos con un número de desórdenes obliga a su detección y medición. Sin embargo, la medición de los anticuerpos aPL en el ambiente clínico es aún una técnica imperfecta y por lo tanto presenta problemas significantes. Un juego o conjunto comercialmente disponible de antisueros normales (APL Diagnosctics, Inc., Louisville, KY) permite la generación de una curva normal para la comparación de ensayos realizados en diversos laboratorios. Sin embargo, existe una gran cantidad de inconsistencia entre los resultados obtenidos en esos laboratorios considerando el GPL y MPL exacto, la unidad de medición para los anticuerpos antifosfolipidos de IgG e IgM, respectivamente, las clasificaciones para los sueros dados y los niveles de GPL y MPL que se categorizan como altos (80 o mayores), medios (20-80), bajos (10-20) o normales (0-10). Los equipos comercialmente disponibles varian grandemente en los valores asignados a los estándares comercialmente disponibles. Reber y colaboradores (1995) Thrombosis and Haemos ta t 73:444-452. La naturaleza exacta de la especificidad antigénica de los autoanticuerpos aPL es controversial, y se refleja en las nomenclaturas en envolución utilizadas por estos anticuerpos. En primer lugar, se pensó que estos autoanticuerpos se dirigían contra los fosfolipidos aniónicos, de aqui el nombre "anticuerpos de anticardiolipina" . Gharavi y colaboradores (1987) Ann . Rheum . Di s . 46m:l-6. Luego llegó a ser aparente que la ß2GPI jugaba un papel importante en la especificidad antigénica de los anticuerpos aPL (inclusive aCL) . Vermylen y colaboradores (1992) J. Lab . Clin . Med. 120:10; McNeil y colaboradores (1990) Proc. Na ti . Acad . Sci . USA 87:4120-4124. Estas observaciones indican que estos anticuerpos son más apropiadamente llamados "autoanticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI", término que se utiliza en esta especificación. Los reportes que la ß2GPI jugaba un papel, como un cofactor, en el enlace del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de- la ß2GPI acoplados con algunos reportes que los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI se podrían enlazar a la ß2GPI misma han conducido a las interpretaciones conflictivas como a la naturaleza del sitio antigénico reconocido por estos anticuerpos. Sin embargo, el papel de que jugaba la ß2GPI ha permanecido no claro, y se han sugerido varias explicaciones. Algunos grupos han concluido que los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI reconocen un antigeno complejo que incluye tanto la ß2GPI y fosfolipidos aniónicos, mientras que otros han observado que el antifosfolipido dependiente de la ß2GPI se enlaza a la ß2GPI en la ausencia del fosfolipido. McNeil y colaboradores (1990) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 87:4120-4124; Galli y colaboradores (1990) Lance t 335:1544; Roubey y colaboradores (1995) J. Immun . 154(2): 954-960; Arvieux y colaboradores (1991) J. Immunol . Methods 143:223. Se han ofrecido un número de explicaciones para aclarar estas diferencias. Galli y colaboradores postulan que debido a que los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI son anticuerpos de baja afinidad a la ß2GPI, éstos requieren el acoplamiento de ambos sitios de combinación en una molécula de IgG dada mediante un antigeno de fase sólida, multivalente. Galli y colaboradores (1990). Estos además argumentan que bajo ciertas condiciones, por ejemplo la irradiación de rayos gamma de pocilios de microtitulo, la ß2GPI suficiente se puede inmovilizar para permitir que éstos anticuerpos de baja afinidad se enlacen. Otros argumentan que un epitope secreto, reconocido por los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI, se genera cuando la ß2GPI se enlaza a ya sea el pocilio irradiado con rayos gamma o a los pocilios revestidos con cardiolipina . Matsuura y colaboradores (1994) J. Exp . Med. 179:457.

La ß2GPI es una glicoproteina de plasma de 50 kilodaltons que exhibe diversas propiedades que definen un anti-coagulante, tal como la inhibición de la activación por contacto de la via de coagulación intrínseca, la actividad de la protrombinasa de plaquetas, y la activación de plaquetas inducida por ADP. Roubey (1996) Arthri tis Rheum . 39:1444; Valesinit y colaboradores (1992) Au tomimmuni ty 14:105. La secuencia de aminoácidos de i ._ ß2GPI ha sido determinada. Lozier y colaboradores (1984) Proc . Na ti . Acad . Sci . EUA 81:3640; Steinkasserer y colaboradores (1991) Biochem . J. 277 : 387. La ß2GPI está compuesta de cinco dominios homólogos. Cuatro de estos están compuestos de aproximadamente 60 aminoácidos que contienen cistinas, prolinas y triptófanos altamente conservados. Lozier y colaboradores (1984) Proc . Na ti . Acad . Sci EUA, 81:3640; Steinkasserer y colaboradores (1991) Biochem , J. 277:387-391. Esca configuración estructural de la proteina fué primero descrita en la ß2GPI y se caracteriza por su longitud, plegamiento independiente y por una estructura con la ubicación homologa de cuatro residuos de media cistina involucrados en la formación de dos puentes de disulfuro internos; dos prolinas; dos fenilalanina, residuos de tirosina o histidina; dos glicinas; y una leucina o valina. Estas configuraciones de repetición fueron designados como estructuras sushi debido a su forma o son algunas veces referidas como repeticiones consensúales, cortas. Reid y colaboradores (1989) Immunol . Today 10:177; Ichinose y colaboradores (1990) J. Biol . Chem . 265:13411-14. El quinto dominio contiene residuos de 82 aminoácidos y 6 medias cistinas. Además de la controversia discutida anteriormente que circunda la naturaleza de la especificidad e,ntigénica de los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI, ha existido una controversia considerable con respecto a la naturaleza y la ubicación de los epitopes reconocidos por los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI en la ß2GPI. Se ha sugerido que el sitio de enlace de fosfolipidos de la ß2GPI se localiza en el quinto dominio. Hunt y colaboradores (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci , EUA 90:2141. Hunt y colaboradores también reportaron sobre las diferencias estructurales entre una forma activa de la ß2GPI y una forma inactiva de la ß2GPI que carecen de actividad del cofactor de antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI y concluyeron que el epitope putativo para los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI era más probable que estuviera en el quinto dominio de la ß2GPI . Hunt y colaboradores (1994) J. Immunol . 152:653-659.

Otros grupos han utilizado proteínas ß2GPI recombinantes para intentar localizar el sitio antigénico de los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Dos de estos grupos produjeron proteínas mutantes de ß2GPI de las cuales han sido suprimidos diversos dominios en un sistema de expresión de baculovirus. Ambos grupos concluyeron que el epitope para los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI fué secreto o misterioso y que el dominio 4 puede estar involucrado dominantemente en la exposición del epitope. Igarashi y colaboradores (1996) Blood 87:3262-3270; George y colaboradores (1998) J. Immunol . 160:3917-3923. Otro grupo expresó proteínas mutantes de ß2GPI de las cuales hablan sido borrados diversos dominios en Escheri chia col i y concluyó que el dominio 5 contenia epitopes reconocidos por los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . Yang y colaboradores (1997) APLAR J. Rheuma tol . 1:96-100. Existe una seria necesidad por sistemas de detección mejorados y tolerágenos para las condiciones mediadas por los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en -su totalidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, miméticos de los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1, composiciones y métodos que utilizan estos polipéptidos, polinucleótidos y miméticos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona polipéptidos que comprenden un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, en donde el polipéptido se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, en donde se entiende que el polipéptido no consiste de la secuencia de aminoácidos de la ß2GPI intacta, representada en la Figura 1 (SEC ID N0:1), y además no consiste de los dominios 1, 2 y 3 o los dominios 1, 2, 3 y 4 de la ß2GPI . En algunas modalidades, el polipéptido comprende fragmentos del dominio 1, tal como se muestran en la Tabla 1. En otras modalidades, el polipéptido comprende un epitope conformacional. Aun en otras modalidades, el polipéptido consiste del dominio 1. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende un polipéptido de la ß2GPI del domino, en donde el polipéptido carece de un epitope de células T (detectable) , el epitope de células T capaz de activar las células T en un individuo que tiene anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. La invención también proporciona conjugados, fusiones y/o formas poliméricas de cualquiera del (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 (o polipéptidos que comprenden polipéptido (s) de la ß2GPI). En las modalidades preferidas, un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (particularmente aquellos que carecen de un epitope de células T) se conjuga a una molécula de plataforma, vulti-valente, apropiada, la cual puede ser proteinácea o no proteinácea. En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos (inclusive polinucleótidos que ocurren naturalmente y que no naturalmente, aislados) que codifican cualquiera de las modalidades de polipéptidos de esta invención. Los polinucleótidos se pueden aislar, en los vectores de clonación o expresión, y/o en células hospedantes, adecuadas. En otro aspecto, la invención proporciona miméticos de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, los miméticos son capaces de enlazarse específicamente a un anticuerpo el cual se enlaza específicamente a un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 (es decir un mimético comparte un epitope con un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1). Un mimético puede ser un polipéptido o cualquier número de sustancias las cuales se describen en la presente, inclusive moléculas orgánicas e inorgánicas. Un mimético puede o no puede contener un epitope de células T, el epitope de células T capaz de activar las células T en un individuo que tiene anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ßzGPI. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de las modalidades de polipéptidos, polinucleótidos y/o miméticos descritas en la presente. En algunas modalidades, las composiciones también contienen un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, una cantidad efectiva del polipéptido o polipéptidos está contenida dentro de una composición, en donde una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para inducir la tolerancia. En algunas modalidades (para los propósitos de detección) , una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para detectar un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 (o mimético) En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la detección de un anticuerpo antiposfolipidos dependiente de la ß2GPI (o un anticuerpo que se enlaza específicamente a un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1) en una muestra que comprenden (a) poner en contacto un anticuerpo en la muestra con un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (o un polipéptido que comprende un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 o un mimético (s) de la ß2GPI del dominio 1) bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de antigenos-anticuerpos, estable; y (b) detectar el complejo estable formado en el paso (a), si existe. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la inducción de la tolerancia en un individuo los cuales comprenden administrar una cantidad efectiva de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 a .un individuo, particularmente un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 que carecen de un epitope de células T, en donde una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para inducir la tolerancia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO:l) y de aminoácidos (SEC ID NO : 2 ) de la ß2GPI. Los números arriba de las lineas indican las posiciones de los aminoácidos. La Figura 2 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO : 3 ) y de aminoácidos (SEC ID NO : 4 ) del dominio 1 de la ß2GPI . Los números arriba de las lineas indican las posiciones de los aminoácidos. La Figura 3 es un modelo de la estructura terciaria del dominio 1 de la ß2GPI, que incluye los aminoácidos clave en el enlace al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. La Figura 4 es una gráfica que representa los resultados de un ELISA de inhibición competitiva realizado en placas de microtitulo NUNC. Las placas se revistieron con la ß2GPI del tipo no cultivado. El enlace de anticuerpos (del paciente 7104) compitió con las diversas proteínas ß2GPI mutantes. Los símbolos representan las proteínas ß2GPI recombinantes como sigue: —D—, 12345; —D—, 1 ; —p—, 12 ; —D—, 123 ; —D—, 1234; —D—, -2345; —A—, —345; —D—, — -45; y —D—, 5. Designaciones de las proteínas recombinantes: los guiones indican la pérdida de dominios; los números indican los dominios presentes en la proteina. Por ejemplo, " 345" es una proteina ß2GPI recombinante que carece de los dominios 1 y 2, pero que retiene los dominios 3, 4 y 5. La Figura 5 es una gráfica que representa los resultados del análisis ELISA de enlace de anti-ß2GPI de conejo a diversas proteínas ß2GPI recombinantes. Los pocilios de microtitulo revestidos con quelato de niquel se revistieron con las diversas proteínas ß2GPI recombinantes en las concentraciones mostradas, luego se sometieron a una prueba para la capacidad del anticuerpo an.ti-ß2GPI de conejo para enlazarse. Los símbolos representan las proteínas ß2GPI recombinantes como sigue: —D—, --345; — D—, --45; —a—, -2345; —D—, 12345; —D—, 1234; —D—, 123--; —A—, 5; y D , GST-6his. La Figura 6 es una gráfica que representa los resultados del análisis ELISA de anti-ß2GPI que se enlaza a diversas proteínas ß2GPI recombinantes. Los pocilios de microtitulo revestidos con quelato de niquel se revistieron con las diversas proteínas ß2GPI recombinantes en las concentraciones mostradas, luego se sometieron a una prueba para la capacidad del anticuerpo anti-ß2GPI de humano 6701 (del paciente 6701) para enlazarse. Los símbolos para la ß2GPI recombinante son como en la Figura 5. Los símbolos adicionales son como sigue: 13 , sin ß2GPI, con el anticuerpo adicionado; + , sin ß2GPI, sin anticuerpo. La Figura 7 es una gráfica que representa los resultados de un ELISA que midió la capacidad de un anticuerpo anti-ß2GPI de conejo para enlazarse a diversas proteínas ß2GPI recombinantes las cuales se enlazaron primero a los pocilios de microtitulo revestidos con cardiolipina (CL) . Las placas IMMULON® se revistieron con CL y luego se cargaron con las concentraciones indicadas de las proteínas ß2GPI recombinantes. Los símbolos para la ß2GPI recombinante son como en la Figura 5. La Figura 8 es una gráfica que representa los resultados de un ELISA que midieron la capacidad de la preparación de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI 6641 (del paciente 6641) para enlazarse a diversas proteínas ß2GPI recombinantes las cuales primero se enlazaron a pocilios de microtitulo revestidos con CL . Las placas IMMULON® se revistieron con CL, luego se cargaron con las concentraciones indicadas de las proteínas ß2GPI recombinantes. Los símbolos para la ß2GPI recombinante son como en la Figura 6. La Figura 9 es una gráfica que representa los resultados de un ELISA de inhibición competitiva en el cual diversos péptidos se sometieron a una prueba para su capacidad para competir con la ß2GPI del tipo no cultivado del enlace a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . Los símbolos para los péptidos son como sigue: —O—, ß2GPI; —D—, CTPRVC; —D—, FSTVVP; —D—, KPDDLP; —D—, GRTCPK; —--.—, TLKCTP; ICPLTG; FICPLT; ITYSCK, GRTCPK. Las Figuras 10A y lOB son . gráficas que representan los valores de enlace de equilibrio aparente para diversas concentraciones del polipéptido del dominio 1 (Figura 10A) y el compuesto de conjugado tetramérico 44 (Figura 10B) a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI purificados por afinidad, del paciente 6626. También se muestran las constantes de disociación de equilibrio aparente. La Figura HA y la Figura 11B son gráficas que representan los valores de enlace de equilibrio aparente para diversas concentraciones del polipéptido del dominio 1 (Figura HA) y el compuesto de conjugado tetramérico 44 (Figura 11B) a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad del paciente 6701. La Figura 12 es una gráfica que representa los resultados de los experimentos de enlace competitivo en los cuales una ß2GPI (revestida en las placas de microtitulo NUNC) se hizo reaccionar con el plasma del paciente 6501 y cantidades variables del compuesto 44 del conjugado del dominio (—O—) 1, tetramérico (— —), y el compuesto 45 (—*—) asi como también el ' polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI (— —) y el polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI que ha sido reducido y alquilado (— U—) . Las Figuras 13A y B son gráficas que representan la respuesta a la dosificación de células del nodo linfático poplíteo de ratones inmunizados con un conjugado de polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI-KLH en CFA (Figura 13A) o CFA solo (Figura 13B) . Los símbolos: —D—, conjugado de KLH; — —, polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI no conjugado a la KLH; —•—, KLH; ?, PPD. La Figura 14 es una gráfica de barras que representa una respuesta a la dosificación (en términos del anticuerpo anti-ß2GPI) del cebado con un conjugado de polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI-KLH (10 µg, 50 µg, y 100 µg) . La Figura 15 es una gráfica que representa la especificidad de los anticuerpos policlonal de ratones producida contra un conjugado del polipéptido del dominio 1 d.e la ß2GPI-KHL, determinada mediante ensayos de competencia utilizando diversos mutantes de dominios de la ß2GPI (—D—, 1 ; —*—, 1 reducido y alquilado; —D—, 12 ; —?—, 1234-; * , -2345; — -D , —345; —A— , 45; —?—, 1 5; —X—, 12345) . La Figura 16 es una gráfica de barras que representa el efecto de los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad sobre la actividad del Factor Va en la sangre de varios pacientes (6501, 6636, 6644, 7011, 7013, 6701, 7001, 6625, 6641) asi como también el plasma y la IgG normal.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Se ha descubierto que el dominio de la ß2GPI se enlaza específicamente al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de 1,. ß2GPI (es decir, contiene un (unos) epitope (s) de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI). Este descubrimiento es especialmente significante en vista de la literatura existente la cual describe solo los dominios 5 y 4 como importantes para este enlace. Ver, por ejemplo, George y colaboradores (1998) y Yang y colaboradores (1997) . También se ha I descubierto que el dominio 1 de la ß2GPI se enlaza a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI de al menos 100 diferentes anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI lo cual es especialmente significante e importante para el contexto de detección/diagnóstico asi como también el contexto de tolerágenos, cuando el (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 pueden ser de esta manera útiles para una amplia gama de la población que lleva los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Además, se encontró que los péptidos particulares del dominio 1 (descritos en la presente) parecen enlazarse al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI específicamente . Por consiguiente, la invención proporciona polipéptidos que comprenden polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 (inclusive el dominio 1 aislado) los cuales se enlazan específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. La invención también proporciona polipéptidos que consisten esencialmente de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 los cuales se enlazan específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI . Los polipéptidos de la invención son útiles para la detección del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI (en el contexto de diagnóstico, pronóstico, y/o monitoreo) , y también son útiles como tolerágenos. En algunas modalidades, particularmente en el contexto de tolerágenos, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI carece (n) de un epitope de células T y/o está(n) en forma multivalente, tal como conjugados a una molécula de plataforma. La invención también proporciona polinucleótidos que codifican el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI . Tales polinucleótidos pueden ser útiles para producir polipéptido (s) de la ß2GPI, ya sea in vitro o in vivo.

La invención también proporciona miméticos de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, los cuales comparten el reconocimiento (es decir, el epitope) con un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI . La invención también proporciona composiciones que comprenden polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, polinucleótidos que codifican el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, y/o el (los) mimético (s). La invención además proporciona métodos que utilizan el (los) polipéptido (s ) de la ß2GPI y/o el (los) mimético (s), tal como para la detección o inducción de la tolerancia (es decir, la inducción de la tolerancia de células B) .

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, las técnicas convencionales de biología molecular (inclusive las técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y colaboradores, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M. P. Calos, eds-., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y colaboradores, eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y colaboradores, eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan y colaboradores, eds., 1991).

Definiciones Un "polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI" es un polipéptido que se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI y tiene al menos cinco aminoácidos contiguos representados en la Figura 2 (SEC ID NO:4; dominio 1). Se puede mostrar que un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI utilizando ensayos normales conocidos en la técnica, tal como ensayos de inhibición competitiva, los cuales se describen en la presente asi como también en la técnica. El término "polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI" abarca diversas modalidades (muchas de las cuales se describen en la presente) , que incluyen, pero no se limitan a, SEC ID NO : 4 ; fragmentos de la SEC ID NO: 4; extensiones, inserciones y/o supresiones de la SEC ID NO: 4; variantes de secuencia de la SEC ID NO: 4. De esta manera, el término "polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI" se da a entender que describe una clase de moléculas en base al dominio 1 las cuales exhiben la funcionalidad necesaria. Como tal, un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI puede tener al menos 5 (como se observó anteriormente), al menos 6, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 y/o al menos 60 aminoácidos contiguos mostrados en la Figura 2 (SEC ID NO: 4) . Un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI también puede comprender diferentes regiones del dominio 1, tal que colectivamente estas regiones son capaces de enlazarse específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI (tal como en la producción de un epitope conformacional). Como se discute posteriormente, en algunas modalidades, un "polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI" también carece de un (algún) epitope de células T detectable. Para propósitos de esta invención, el epitope de células T se definen como capaz de activar las células T en un individuo con los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI .

Un polipéptido que "se enlaza específicamente" a un anticuerpo es un término bien entendido en la técnica, y los métodos para determinar este enlace especifico también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe un "enlace especifico" si la misma reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se enlaza específicamente" a un objetivo si el mismo se enlaza con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que el mismo se enlaza a otras sustancias. Un "anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI" es cualquier anticuerpo el cual se enlaza específicamente a la ß2GPI . Como se discutió anteriormente, la nomenclatura utilizada en las técnicas clínicas y la literatura emplean designaciones alternativas para estos anticuerpos, tal como los anticuerpos "aPL" y "aCL", los cuales se incluyen en la definición del término "anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI", ya que está presente la propiedad de enlace necesaria (es decir, los términos anticuerpos de "aPL" y "aCL" incluyen anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI) . Como se indica claramente en la definición de "anticuerpo" proporcionada en la presente, un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI" abarca los fragmentos que contienen la región variable, tales como los fragmentos Fab, ya que se conserva la capacidad para enlazarse específicamente a la ß2GPI. Como se discute posteriormente, se entiende que en enlace especifico a cualquier anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI es suficiente, aunque puede ser preferible para un polipéptido del definió 1 de la ß2GPI enlazarse a más de uno, en forma preferente al menos dos, en forma más preferente al menos 5, en forma mucho más preferente al menos diez, aun en forma más preferente al menos 20 diferentes anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Un "anticuerpo" (utilizado de manera intercambiable en forma plural) es una molécula de inmunoglobulina capaz de enlazarse específicamente a un objetivo, tal como un polipéptido, a través de al menos un sitio de rec?rocimiento de antigenos, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término abarca no únicamente los anticuerpos intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) una cadena individual (ScFV) , mutantes de los mismos, proteínas de fusión, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antigenos de la especificidad requerida. La "ß2GPI intacta" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la molécula completa de la ß2GPI (representada en la Figura 1 y la SEC ID N0:2). Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de la ß2GPI también son disponibles públicamente en la literatura y en GeneBank (No. de Acceso X58100) . Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende regiones en una posición diferente que ocurren en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y se llevan conjuntamente en el polipéptido de fusión, o las mismas pueden existir normalmente en la misma proteina pero se colocan en un nuevo ordenamiento en el polipéptido de fusión. Un polipéptido de fusión también puede surgir de formas poliméricas, ya sea lineales o ramificadas, del (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio. Un "epitope de células T" es un término bien entendido en la técnica y significa un sitio de enlace para una célula T, más específicamente, una secuencia de polipéptidos o estructura química que activa una(s) célula (s) T. Los métodos para determinar la presencia de los epitopes de células T también son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente. Se entiende que, a través del tiempo, se pueden desarrollar más ensayos sensibles para detectar la presencia de epitopes de células T, y que la especificación de la falta de epitopes de células T es dependiente del tipo del sistema de detección utilizado. Para propósitos de esta invención, la "falta" de un epitope de células T es para dar a entender que un epitope de células T no es detectable utilizando ensayos normales en la técnica, particularmente como de la fecha de presentación inicial de esta solicitud. También se entiende que, para propósitos de esta invención, un "epitope de células T" es uno que es capaz de estimular las células T en un individuo quien tiene anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", utilizados de manera intercambiable en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN de hebra o cadena individual, doble o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido de ADN-ARN, o un polimero que comprende bases.de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, químicamente, bioquímicamente modificados, no naturales o derivatizados . La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos de fosfato (como se puede encontrar típicamente en el ARN o ADN) , o grupos de azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, la cadena principal del polinucleótido puede comprender un polimero de subunidades sintéticas como fosforamidatos y de esta manera puede ser un fosforamidato de oligodesoxinucleósido (P-NH2) o un oligómero de fosforamidato-fosfodiéster mezclado. Se puede utilizar un enlace de fosforotiato en lugar de un enlace de fosfodiéster. Además, se puede obtener un polinucleótido de hebra o cadena doble del producto de polinucleótidos de hebra o cadena individual de la síntesis química ya sea mediante la síntesis de la hebra o cadena complementaria y el fortalecimiento de las hebras o cadenas bajo condiciones apropiadas, o mediante la síntesis de la hebra o cadena complementaria de novo utilizando una polimerasa de ADN con un cebador apropiado. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. En forma preferente, el polinucleótido es el ADN. Como se utiliza en la presente, el "ADN" incluye no únicamente las bases A, T, C y G, sino también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones de internucleótidos tales como enlaces no cargados y tioatos, el uso de análogos de azúcar y estructuras de la cadena principal modificadas y/o alternativas, tales como poliamidas. "Que ocurre naturalmente" se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos endógena, es decir, una encontrada en la naturaleza. El término incluye alelos y formas alélicas de la proteina codificada, asi como también polinucleótidos y polipéptidos procesados como longitud completa. El procesamiento puede ocurrir en uno o más pasos, y estos términos abarcan todas las etapas de procesamiento. A la inversa, una secuencia "que no ocurre naturalmente" se refiere a todas las otras secuencias, es decir, las que no ocurren en la naturaleza, tal como secuencias recombinantes . Una "célula hospedante" incluye una célula ' individual o un cultivo de células el cual puede ser o ha sido un receptor para el (los) vector (es) o para la incorporación de polinucleótidos y/o proteínas. Las células hospedantes incluyen la progenie de una célula hospedante, individual, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en la morfología o en genómico del complemento de ADN total) a la célula madre, original debido a la mutación natural, accidental o deliberada. Una célula hospedante incluye células transfectadas in vivo con un (unos) polinucleótidos (s) de esta invención. La "transformación" o la "trasfección" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedante, sin consideración del método utilizado para la inserción, por ejemplo, lipofección, transducción, infección o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o de manera alternativa, puede ser integrado en el genoma de las célula hospedante. Como se utiliza en la presente, el término "mimético" (también llamado un "análogo") significa un compuesto biológico o químico el cual se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI al cual se enlaza específicamente un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1. Un "mimético" comparte un epitope, o especificidad de enlace, con un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1. Un mimético puede ser cualquier sustancia química la cual exhibe las propiedades de enlace necesarias, y de esta manera puede ser, por ejemplo, una molécula simple o compleja, orgánica o inorgánica; un polipéptido; un polinucleótido; un carbohidrato; un lipido; un lipopolisacárido; una lipoproteina, o cualquier combinación de loó anteriores, que incluye, pero no se limita a, un polipéptido que contiene polinucleótidos; un polipéptido glicosilado; y un glicolipido. El término "mimético" abarca el término "mimotope", el cual es un término bien conocido en la técnica. Un "individuo" es un vertebrado, en forma preferente un mamífero, en forma más preferente un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales de deportes, mascotas, primates, ratones y ratas. La "anergia de las células B" es un término bien entendido en la técnica y significa la indiferencia de aquellas células B que requieren la ayuda de las células T para producir y secretar un anticuerpo e incluye, pero no se limita a, la supresión clonal de las células B inmaduras y/o maduras y/o la incapacidad de las células B para producir anticuerpos.

La "tolerancia de inducción" significa una reducción y/o estabilización del grado de una respuesta inmune a un inmunógeno. Una "respuesta inmune" puede ser humoral y/o celular, y se puede medir utilizando ensayos normales, conocidos en la técnica. Para los propósitos de esta invención, la respuesta inmune se refleja en general por la presencia de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . Cuantitativamente, la reducción (medida por la reducción en la producción de anticuerpos) es al menos aproximadamente 25%, en forma más preferible al menos aproximadamente 50%, en forma mucho más preferible al menos aproximadamente 75%, en forma más preferible al menos aproximadamente 90%, aun en forma más preferible al menos aproximadamente 95% y en forma mucho más preferible 100%. Se entiende que la tolerancia es especifica para los antigenos y se aplica para los propósitos de la invención a aquellos individuos que tienen anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . La "tolerancia de inducción" también incluye disminuir y/o retardar la velocidad del incremento del nivel de anticuerpos. Una "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y se puede utilizar en un ensayo de diagnóstico o monitoreo. La definición abarca sangre y otras muestras liquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tal como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que se han manipulado en cualquier forma después de su obtención, tal como mediante el tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye las células en cultivo, los sobrenadantes de células, los lisados de células, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido. Un "complejo estable" formado entre cualquiera de dos o más componentes en una reacción bioquímica, se refiere a un duplo o complejo que es suficientemente perdurable para persistir entre la formación del duplo o complejo y la detección subsecuente, inclusive cualquier paso de lavado opcional u otra manipulación que pueda tomar lugar en el interim. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" o "purificado" es uno que está sustancialmente libre de los materiales con los cuales está asociado en la naturaleza. Por sustancialmente libre se da a entender al menos 50%, en forma preferente al menos 70%, en forma más preferente al menos 80%, aun en forma más preferente al menos 90% libre de los materiales con los cuales está asociado en la naturaleza. Un polinucleótido es para "codificar" un polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula por los métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, se puede transcribir y/o traducir para producir el polipéptido o un fragmento del mismo. Para propósitos de esta invención, y para evitar las molestas referencias a las cadenas complementarias, la cadena anti-sentido (o complementaria) de este polinucleótido también es para codificar la secuencia; esto es, una secuencia de polinucleótidos que "codifica" un polipéptido incluye tanto la cadena de codificación convencional y la secuencia complementaria (o cadena) . Una "cantidad efectiva" (cuando se utiliza en el contexto toleragénico) es una cantidad suficiente para efectuar resultados benéficos o deseados. Una cantidad efectiva se puede administrar en una o más administraciones. Para propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 es una cantidad suficiente para inducir la tolerancia, particularmente con respecto a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. En términos del tratamiento, una "cantidad efectiva" de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 es una cantidad suficiente para atenuar, mejorar, estabilizar, invertir, disminuir o retardar el progreso de un estado de enfermedad asociado con los antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI (es decir, un estado en el cual los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI indican patología potencial o real) . La detección y medición de los indicadores de la eficacia se basan en general en la medición del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI y/o en los síntomas clínicos asociados con el estado de enfermedad, tal como trombosis arterial o venosa, pérdida fetal, ataque isquémico transiente, accidentes cerebrovasculares, amaurosis fugaz (visión monocular) , anemia hemolitica, autoinmune, lesiones de la válvula cardiaca, infarto miocardiaco, trombocitopenia y condiciones de la migraña . Como se utiliza en la presente "molécula de plataforma de valencia" significa una molécula no inmunogénica que contiene sitios los cuales permiten la unión de un número discreto de polipéptidos (en esta invención, los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1) y/o el (los) mimético (s). "No inmunogénico", cuando se utiliza para describir la molécula de plataforma de valencia, i significa que la molécula de plataforma de valencia falla en producir una respuesta inmune, y/o falla en producir una respuesta inmune suficiente, cuando se administra por si misma a un individuo. El grado de respuesta inmune, aceptable depende del contexto en el cual se utiliza la molécula de plataforma de valencia, y se puede determinar empíricamente. Como se utiliza en la presente "farmacofore" significa las tres propiedades de orientación dimensional y quimicas de los grupos clave involucrados en el enlace de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 al objetivo del anticuerpo.

Polipéptidos de la. ß2GPI del dominio 1 de la invención La invención proporciona el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Como se describe anteriormente, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 (a) contiene al menos cinco (o más) aminoácidos contiguos de la Figura 2 (SEC ID NO:4), los cuales representan el dominio 1; y (b) se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI (es decir, uno o más anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI). Un modelo de la estructura tridimensional de la ß2GPI del dominio 1 se presenta en la Figura 3 (en base a la estructura real del dominio 16 sushi factor 1H determinado mediante la rmn (Norman y colaboradores (1991) -7. Mol . Biol . 219:717; Barlo y colaboradores (1991) Biochem . 30:997) y se indican los residuos que pueden estar involucrados en la integridad estructural y/o enlace de anticuerpos, como se determinó mediante estudios de mutagénesis, inclusive aquellos presentados en la presente. Con respecto a todas las modalidades de polipéptidos de la invención, se entiende que los polipéptidos de la invención no ireluyen la ß2GPI intacta, nativa o cualquier otra forma previamente aislada y caracterizada de la ß2GPI, tal como los mutantes de supresión de dominio (es decir, los dominios 1,2,3; los dominios 1,2,3,4) . En una modalidad, la invención incluye un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 que contiene (o, en algunas modalidades, que consiste de o consiste esencialmente de) un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, con la condición que el polipéptido no consista de (a) la ß2GPI intacta (SEC ID NO : 2 ) , (b) los dominios 1, 2 y 3; o (c) los dominios 1, 2, 3 y 4. En una modalidad, la invención incluye un polipéptido que consiste de (o, en algunas modalidades, que consiste esencialmente de) la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID N0:4), la cual representa el dominio 1. Se ha mostrado que únicamente aquellos polipéptidos de la ß2GPI de supresión de dominio que contienen el dominio 1 son capaces de enlazarse específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI y que el dominio 1 solo es capaz de unirse a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, como se describe en el Ejemplo 1. Para propósitos de esta invención, el dominio 1 de la ß2GPI es en general de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 64 de la ß2GPI (Figura 1). Alternativamente, y también para los propósitos de esta invención, el dominio 1 (y por consiguiente un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 de la invención) puede variar de (a) aproximadamente la primera cisteina a aproximadamente la cuarta cisteina (cuando se determina desde la terminación N) ; (b) aproximadamente la terminación N a aproximadamente la quinta cisteina (más precisamente, el último aminoácido antes de la quinta cisteina) ; (c) aproximadamente la primera cisteina a aproximadamente la quinta cisteina. En algunas modalidades, se puede adicionar una cisteina adicional en cualquier posición adecuada, para servir como un grupo reactivo para la conjugación. Por consiguiente, una cisteina adicional (la cual en algunas modalidades es la quinta cisteina de la ß2GPI) se puede incluir en cualquier posición, particularmente cerca o en la terminación C o la terminación N. Un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 también puede comprender (o consistir de, o consistir esencialmente de) cualquiera de los siguientes: (a) del aminoácido 1 al aminoácido 50 de la SEC ID NO: 4; (b) del aminoácido 2 al aminoácido 60 de la SEC ID NO : 4 ; (c) del aminoácido 2 al aminoácido 63 de la SEC ID NO: 4; (d) del aminoácido 1 al aminoácido 66 de la SEC ID NO:l; (e) del aminoácido 4 al aminoácido 66 de la SEC ID NO : 1 ; (f) aproximadamente del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 60 de la SEC ID NO: 4; (g) aproximadamente del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 66 de la SEC ID NO:l. Se ha encontrado que los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 los cuales contienen la quinta cisteina son particularmente convenientes para la conjugación (discutida posteriormente) . Para aquellas modalidades que contienen (que comprenden) las primeras cuatro cisteinas de la ß2GPI, se entiende que, en general, la secuencia de aminoácidos entre las cisteinas deben ser tal que se formen los puentes de disulfuro apropiados, mientras que las secuencias de aminoácidos que están al lado de o que flanquean las cisteinas (es decir, los aminoácido de la terminación N y la terminación C) pueden ser cualquier secuencia (ya que se conserva la estructura necesaria la cual permite el enlace al anticuerpo) . En otras modalidades, la invención incluye un polipéptido que comprende cualquiera de los polipéptidos mostrados en la Tabla 1 (SEC. ID N0S:5-11). Los experimentos (descritos en el Ejemplo 3) demuestran que estos polipéptidos son capaces de unirse específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. Con respecto a todas las modalidades de polipéptidos de esta invención, el (los) polipéptido ( s ) se enlazan específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos depediente de la ß2GPI. El enlace especifico a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI se puede determinar utilizando técnicas normales en la técnica, tal como ensayos de enlace competitivo. Por ejemplo, las placas de microtitulo se pueden revestir con la ß2GPI (ya sea que ocurre naturalmente o recombinante, ya que la molécula recombinante exhibe las propiedades de enlace necesarias), y el polipéptido de prueba adicionado en concentraciones variantes. El anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad luego se adiciona, y se permite que ocurra el enlace. La cantidad de anticuerpo enlazado se determina mediante los sistemas de detección tales como la IgG anti-humano, conjugada con fosfatasa alcalina, o radioactividad. El enlace especifico se indica mediante la capacidad del polipéptido de prueba para competir por el enlace a la ß2GPI . Los Ejemplos 1 y 3 proporcionan ensayos ejemplares para la detección del enlace competitivo. El enlace especifico también se puede determinar mediante ensayos de enlace directo, los cuales son conocidos en la técnica y se ejemplifican en los Ejemplos 1 y 3. Se entiende que, para los propósitos de esta invención, el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 necesite enlazarse solo a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, aunque puede ser deseable (por ejemplo, en el contexto de detección), para el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 enlazarse a más de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. La fuente del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI es en general de un individuo, y la secuencia del anticuerpo puede variar de individuo a individuo. También se entiende que el enlace específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI se puede demostrar al utilizar un fragmento u otro producto recombinante de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, tal como un fragmento Fab, o construcciones de región variable de cadena individual (scFv) , los cuales son conocidos en la técnica. Por consiguiente, en algunas modalidades, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 se enlaza a más de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI (es decir, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50 o más) . Estas modalidades son especialmente útiles para la detección, cuando este (estos) polipéptido (s) se pueden utilizar para detectar sobre un espectro más amplio de individuos quienes llevan un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI .

Tabla 1. Fragmentos del dominio 1 los cuales se enlazan específicamente al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI En algunas modalidades, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 contiene una estructura sushi. El "dominio sushi" es entendido por aquellos expertos en la técnica y se caracteriza en general por (a) que contiene ciertos residuos (tales como prolina, fenilalanina, triosina, glicina, leucina, valina y/o histidina) los cuales enroscan la cadena de polipéptidos en una estructura circular; (b) que tiene en general un peso molecular de apro..imadamente 6kD; (c) que contiene una estructura doblada ß. Ichmose y colaboradores (1990) J. Biol . Chem . 265:13411. También se entiende que un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 se puede enlazar al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI por medio de un (unos) epitope (s) conformacional (es ) . Por consiguiente, en algunas modalidades, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 ' comprende (a) los aminoácidos 55, 56 y 58 (ile; asn; leu) de la Figura 3 (los aminoácidos 55, 56 y 58 de la SEC. ID NO:4); (b) los aminoácidos 43-45 (arg; lys; phe) de la Figura 3 (los aminoácidos 43 a 45 de SEC ID NO : 4 ) ; (c) los aminoácidos 40 a 45 de la SEC ID NO: 4 (gly; gly; met; arg; lys; phe), en forma preferente los aminoácidos 38-44 de la Figura 3 (los aminoácidos 38 a 44 de la SEC ID NO: 4) y/o (d) el aminoácido 19 (lys) de la Figura 3 (el aminoácido 19 de la SEC ID NO: 4), preferentemente (a) y (b) ; preferentemente (a) y (c) ; preferentemente (b) y (c) ; preferentemente (a) y (d) ; preferentemente (b) y (d) ; preferentemente (c) y (d) ; preferentemente (a), (b) y (d) ; preferentemente (a), (c) y (d) ; preferentemente (b) , (c) y (d) ; preferentemente (a) , (b) y (c) ; preferentemente (a), (b) , (c) y (d) . Se ha encontrado a través de los estudios de mutagénesis que estos aminoácidos pueden ser críticos para el enlace, ya sea colectivamente o individualmente. El tamaño de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 (o un polipéptido que comprende un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 puede variar ampliamente, ya que se cumple la funcionalidad necesaria (en base al enlace especifico a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI). Por ejemplo, la longitud requerida para efectuar un enlace especifico a un anticuerpo antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI podria ser tan pequeña como, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos 5-mer. Los datos han mostrado que las secuencias de aminoácidos tan pequeño como 6-mer se enlazan específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI (Ejemplo 3) . En algunas modalidades, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (y el polipéptido que comprende o que consiste esencialmente de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1) es menor que aproximadamente 530 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que 160 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 125 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 115 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, preferentemente menor que aproximadamente 10 aminoácidos de longitud.

Se entiende que un (unos) polipéptido ( s) de la ß2GPI del dominio 1 pueden estar asociados con, conjugados con, y/o conectados con otro(s) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 (si estos polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 son los mismos o diferentes), asi como también otros dominios de la ß2GPI. Por consiguiente, la invención abarca las formas poliméricas del (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1. Como se utiliza en la presente, una forma polimérica de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 contiene una pluralidad de (es decir, más de 1) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. En una modalidad, se proporcionan polímeros lineales de los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1. En otra modalidad, se proporcionan polímeros ramificados de los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1. En otras modalidades, la invención proporciona (a) una pluralidad de polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1; (b) un polipéptido que comprende un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 y uno o más de otros dominios de la ß2GPI. Los Ejemplos de tales modalidades incluyen, no se limitan a, un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 conjugado (s) con (a) el dominio 2; (b) el dominio 3; (c) el dominio 5; (e) los dominios 3, 4 y 5; (f) los dominios 4 y 5. Estos dominios son entendidos por aquellos expertos en la técnica y son en general como sigue (de la terminación N) : el dominio 2, aproximadamente del aminoácido 65 a aproximadamente el aminoácido 120; el dominio 3, aproximadamente del aminoácido 121 a aproximadamente el aminoácido 181; el dominio 4, aproximadamente del aminoácido 182 a aproximadamente el aminoácido 244; el dominio 5, aproximadamente del aminoácido 245 a aproximadamente el aminoácido 326 (terminación C) . En otra modalidad, se proporcionan péptidos de antigenos múltiples de la ß2GPI del dominio 1 (Maps). Los Maps tienen un núcleo inmunológicamente inerte, pequeño que tiene dendritas de lisina radialmente ramificadas, en las cuales se pueden fijar (es decir, unir covalentemente) un número de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1. Posnett y colaboradores (1988) J. Biol . Chem . 263:1719-1725; Tam (1989) Me th . Enz . 168:7- 15. El resultado es una macromolécula grande que tiene una relación molar alta de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 al núcleo. Los Maps son antigenos eficientes, útiles para ensayos tales como ELISA, y también pueden ser útiles para la presentación multivalente, tal como en el contexto toleragénico. Los Maps se pueden hacer sintéticamente y se pueden obtener comercialmente '(Quality Controlled Biochemicals, Inc. Hopkinton, MA) .

En un sistema de Maps tipico, una matriz de núcleo se hace de tres niveles de lisina y ocho aminoácidos para fijar los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1. El Map se puede sintetizar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, un método de fase sólida, por ejemplo, R.B. Merrifield (1963) J. Am . Chem . Soc . 85:2149. Se entiende que se puede utilizar cualquier estructura ramificada, tal como ciclodextrina. La estructura ramificada puede ser, pero no necesita ser, pequeña. En el contexto de la inducción de la tolerancia, la plataforma no debe actuar como un antigeno independiente de las células T. También se entiende que se pueden introducir ciertas variaciones de secuencia en un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 los cuales pueden conservar o aumentar su reactividad. Por consiguiente, la invención incluye modificaciones al (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 las cuales no afectan significantemente sus propiedades asi como también variantes que tienen actividad aumentada. Estas secuencias de variantes y modificadas son designadas colectivamente como "variantes funcionalmente equivalentes" las cuales pueden tener el mismo, aumentado o disminuido enlace comparado con otro(s) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, y son designadas "equivalentes" debido a que éstas mantienen la capacidad de enlazarse específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. La modificación de los polipéptidos es una práctica de rutina en la técnica y no necesita ser descrita en detalle en la presente. Los Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen los polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos las cuales no cambian significante y deletéreamente la actividad funcional, o el uso de análogos químicos, inclusive las sustituciones de aminoácidos alfa-metilicos, aminoácidos que ocurren naturalmente, no proteináceos (tales como canavanina, sulfóxido de metionina DL, clorhidrato de delta-hidroxilisina, y ácido aminoisobutirico) , y aminoácidos no naturales. Los residuos de aminoácidos que se pueden sustituir conservadoramente entre si incluyen pero uo se limitan a: glicina/alanina; valina/isoleucin /leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina . Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y/o no glicosilados, asi como también polipéptidos con otras modificaciones pos-translacionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. En forma preferente, las sustituciones de aminoácidos serian conservadoras, es decir, el aminoácido sustituido poseerla propiedades quimicas similares como aquellas del aminoácido original. Tales sustituciones conservadoras son conocidas en la técnica, y se han proporcionado ejemplos anteriormente . Se entiende que ciertas variaciones de aminoiácidos (tal como sustituciones) pueden o no pueden afectar el enlace de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI de la misma manera, o al mismo grado. Además, la naturaleza del (los) aminoácido (s) sustitutos podria afectar la manera y/o el grado de enlace. Por ejemplo, se ha encontrado que la sustitución de un residuo de glicina por un residuo de arginina en la posición 43 (aminoácido 43 de la SEC ID NO : 4 ) causa la pérdida de la capacidad para enlazarse al anticuerpo en algunos sueros del paciente, mientras que otros no cambian (y aun otros han cambiado (es decir, un compuesto intermedio) la capacidad para enlazarse. Como otro ejemplo, la sustitución de una lisina o treonina por la metionina en la posición 42 no parece afectar el enlace (en pacientes que han sido sometidos a prueba) ; sin embargo, si una valina es sustituida por metionina en la posición 42 el enlace parece ser anulado en todos los pacientes. Además de los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente y sus homoanálogos y noanálogos, se pueden emplear otras diversas clases de alfa aminoácidos en la presente invención. Los Ejemplos de estas otras clases incluyen d-aminoácidos, aminoácidos N3-alquilicos , aminoácidos alfa-alquilicos, aminoácidos cíclicos, amionácidos quiméricos, y aminoácidos misceláneos. Estos aminoácidos no naturales han sido utilizados ampliamente para modificar los polipéptidos bioactivos para aumentar la resistencia a la degradación proteolitica y/o para impartir restricciones conformacionales para mejorar la actividad biológica. Hruby y colaboradores (1990) Biochem . J. 268:249-262; Hruby y colaboradores (1995) Methods in Mol . Biol . 35:201-240. Los aminoácidos JV^-alquilicos más comunes son los aminoácidos N'-meti l icos , tales como cisteina N3-metílica (nC) , glicina N3-meti l ica (ng) , leucina -Va-metilica (nL) , lisina N'-metilica (nk) , y valina N3-metilica (nV) . Los ejemplos de aminoácidos alfa-alquilicos incluyen alanina alfa-alquilica (mA) , ácido alfa-aminoisobutirico (aiB) , pro.lina alfa-metilica (mP) , leucina alfa-metilica (mL) , valina alfa-metilica (mV) , ácido alfa-metil-alfa-aminobutirico (tv) , dietilglicina (deG) , difenilglicina (dpG) , y glicina diciclohexilica (dcG) . Balaram (1992) Pure & Appl . Chem . 64:1061-1066; Toniolo y colaboradores (1993) Biopolymers 33:1061-1072; Hinds y colaboradores (1991) Med. Chem . 34:1777-1789. Los ejemplos de aminoácido cíclicos incluyen ácido carboxilico de 1-amino-l-ciclopropano (cG) , ácido carboxilico de 1-amino-l-ciclopentano (Ac5c) , ácido carboxilico de 1-amino-l-ciclohexano (Acdc) , ácido carboxilico de aminoindano (ind), ácido carboxilico de tetrahidroisoquinolina (Tic) y ácido pipecolinico (Pip) . C. Toniolo (1990) In t ' l . J. Peptide Protein res . 35:287-300; Burgess y colaboradores (1995) J. Am . Chem . Soc . 117:3808-3819. Los ejemplos de aminoácidos quiméricos incluyen penicilamina (Pe), combinaciones de cisteina con valina, 4R- y 4S-mercaptoprolinas (Mpt) , combinaciones de homocisteina y prolina y 4R y 4S-hidroxiprolinas (hyP) y una combinación de homoserina y prolina. Los ejemplos de alfa aminoácidos misceláneos incluyen análogos de aminoácidos básicos tales como ornitina (Or) , lisina ?^-metilica (mK) , 4-piridil alanina (pyA) , 4-piperidino alanina (piA) , y 4-aminofenilalanina; análogos de aminoácidos acidicos tales como citrulina (Cit) , y 3-hidroxivalina; análogos de aminoácidos aromáticos tales como 1-naftilalanina (1- Nal), 2-naftilalanina (2-Nal), fenilglicina (pG) , 3,3- difenilalanina (dpA) , 3- (2-tienil) alanina (Thi), y halofenilalaninas (por ej empl o, 2-fluorofenilalanina y 4-clorofenilalanina) ; análogos de aminoácidos hidrofóbicos tales como t-butilglicina (es decir, leucina terciaria (tL) ) , ácido 2-aminobutirico (Abu) , ciclohexilalanina (Cy) , 4-tetrahidropiranil alanina (tpA) , 3, 3-diciclohexil alanina (dcA) y 3,4- deshidroprolina . Además de los alfa-aminoácidos, otros de estos beta aminoácidos también se pueden utilizar en la presente invención. Los Ejemplo de estos otros aminoácidos incluyen ácido 2-aminobenzoico (Abz) , ácido ß-aminopropanoico (ß-Apr) , ácido ?-aminobutirico (?-Abu) y ácido 6-aminohexanoico (e-Ahx) . Los ácidos carboxilicos tales como ácido 4-clorobutirico (By) y ácido ,3-cloropropiónico (Pp) también han sido utilizados como el primer residuo en la terminación N en la síntesis de péptidos de tioéter, cíclicos. Otros métodos de modificación incluyen el uso de las técnicas de acoplamiento conocidas en el oficio, inclusive, pero no se limitados a, los medios enzimáticos, la sustitución oxidante y la formación de quelatos. La modificación se puede utilizar, por 'ejemplo, para la unión de etiquetas para el inmunoensayo, tal como la unión de porciones radioactivas para el radioinmunoensayo. El (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, modificado (s ) se hacen utilizando los procedimientos establecidos en la técnica y se pueden seleccionar utilizando ensayos normales, conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en la presente y en los ejemplos. La invención también abarca las proteínas de fusión que comprenden uno o más polipéptidos del dominio 1 de la ß2GPI. Para propósitos de esta invención, una proteina de fusión del dominio 1 de ß2GPI contiene uno o más polipéptidos de la ß2GPI y otra secuencia de aminoácidos a la cual no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región, tal como otro dominio de la ß2GPI . Las secuencias heterólogas, útiles incluyen, pero no se limitan a, las secuencias que proporcionan la secreción de una célula hospedante, aumentan la reactividad inmunológica, o facilitan el acoplamiento del polipéptido a un soporte o un portador del inmunoensayo. Por ejemplo, un polipéptido de la ß2GPI se puede fusionar con una secuencia heteróloga lo cual facilita la purificación. Los ejemplos de tales secuencias son conocidos en la técnica e incluyen aquellos epitopes de codificación tales como Myc, HA (derivado de la hemaglutinina del virus de la influenza), His-6, o FLAG. Otras secuencias heterólogas que facilitan la purificación se derivan de proteínas tales como glutationa S-transferasa (GST) , proteina de enlace de maltosa (MBP) , o la porción Fc de la inmunoglobulina . Un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 puede o no puede contener un epitope de células T. Para los propósitos de detección, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 puede o no puede contener un (unos) epitope (s) de células T, puesto que el uso principal del polipéptido en este contexto es para la detección del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, el cual es independiente de la presencia de epitopes de células T. Sin embargo, en el contexto del tolerágeno un polipéptido de la ß2GPI del domino 1 carece de un (algún) epitope (s) de células T detectable con respecto a un individuo quien tiene anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. De esta manera, en algunas modalidades, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 no contiene (es decir, carece de) un epitope de células T (y, por consiguiente, un polipéptido que comprende un polipéptido de ia ß2GPI del dominio 1 no contiene un epitope de células T) .

Los métodos para detectar la presencia de un epitope de células T son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar diversos ensayos los cuales detectan la proliferación de células T (tal como la incorporación de timidina) . La presencia de los epitopes de células T también se puede determinar al medir la secreción de linfocinas derivadas de las células T por métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos que fallan en inducir la incorporación significante, estadística de timidina sobre el medio (es decir, en general p menos que 0.05 utilizando los métodos estadísticos normales) se consideran en general que carecen de epitopes de células T, aunque será apreciado que la cantidad cuantitativa de la incorporación de timidina puede variar, dependiendo del polipéptido que es sometido a la prueba. En general, un Índice de estimulación abajo de aproximadamente 2-3, en forma más preferente menos que aproximadamente 1, indica la falta de los epitopes de células T. La localización y el contenido de los epitopes de células T se determinan empíricamente . En el contexto del tolerágeno, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 en forma preferente se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI en la superficie de una célula B (es decir, se enlaza a un anticuerpo de la superficie en una célula B, en donde el anticuerpo es capaz de enlazarse específicamente a un epitope antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI) . Este enlace, especialmente en conjunción con el enlace cruzado, se piensa que provoca la anergia de las células B. Se entiende que, debido a que por la definición de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 es capaz de enlazarse específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, se esperarla que cualquier polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 del mismo modo seria capaz de enlazarse a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI de la superficie en una célula B. Como se discute posteriormente (y anteriormente en la discusión de las formas poliméricas), en forma preferente, en el contexto del tolerágeno, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 está presente en una forma multivalente, ya sea por medio de una forma polimérica y/o conjugado a una molécula de plataforma de valencia apropiada.

Preparación de los polipéptidos de esta invención Los polipéptidos de esta invención se pueden hacer mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden producir por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos individuales o de fusión) o mediante la síntesis química. Los polipéptidos, especialmente los polipéptidos más cortos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se hacen convenientemente mediante la síntesis química. Los métodos de la síntesis química son conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles. Por ejemplo, un polipéptido podria ser producido mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado que emplea el método de fase sólida. Los polipéptidos también se pueden hacer mediante la síntesis química utilizando técnicas conocidas en el oficio. Los polipéptidos también se pueden hacer mediante sistemas de expresión, utilizando métodos recombinantes. La disponibilidad de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos permite la construcción de los vectores de expresión que codifican un polipéptido intacto (es decir, nativo), fragmentos funcionalmente equivalentes del mismo, o formas recombinantes. Un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado, ya sea en forma fusionada o madura, y ya sea conteniendo o no una secuencia individual para permitir la secreción, puede estar ligado en los vectores de expresión adecuados para cualquier hospedante conveniente. Se pueden utilizar sistemas hospedantes tanto eucarióticos como procarióticos. El polipéptido luego se aisla de células Usadas o del medio de cultivo y se purifica al grado necesario para su uso propuesto. La purificación o aislamiento de los polipéptidos expresados en los sistemas hospedantes se pueden realizar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el ADNc que codifica un polipéptido intacto o un fragmento del mismo, se puede enlazar operativamente a un promotor adecuado, se puede insertar en un vector de expresión, y se puede transfectar en una célula hospedante, adecuada. Las células hospedantes luego se cultivan bajo condiciones que permiten que ocurra la transcripción y la transducción, y se recupera el polipéptido deseado. También se pueden utilizar otros segmentos de transcripción o traducción de control, tales como las secuencias de señales que dirigen el polipéptido a un compartimiento de células especifico (es decir, para la secreción). Los ejemplos de células hospedantes, procarióticas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, E . col i y B . subtilis . Los ejemplos de células hospedantes, eucarióticas son conocidos en la técnica e incluyen células de levadura, de aves, insectos, plantas y animales tales como COS7, HeLa, CHO y otras células de mamíferos. Los sistemas de levadura incluyen Saccharomyces , cerevisia , schizosaccharomyces pombe y Picha i apstoris . Por ejemplo, para expresar un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI en Pi chia pastoris (utilizando, por ejemplo, las cepas SMD 1168 y SMD1168H), se utiliza un ADNc de longitud completa que codifica la ß2GPI como un modelo de la PCR para crear los fragmentos del gen del dominio 1 con un sitio de división de péptidos de señales Kex2, reconstruido en la terminación amino. Los fragmentos se clonan en el vector de expresión pPICZalpha (Invitrogen Corp.), el cual está linealizado con las enzimas de restricción Xho I y Sal I. Los genes construidos reemplazan el péptido de señales del dominio 1, nativo con el péptido de señales del factor alfa de levadura, y termina en los aminoácidos seleccionados en la terminación carboxi. Cuando se utiliza un sistema de expresión para producir los polipéptidos de la ß2GPI, frecuentemente es preferible construir una proteina de fusión que facilite la purificación. Los ejemplos de los componentes para estas proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, myc, HA, FLAG, His-6, glutationa S-transferasa, proteina de enlace de amaltosa o la porción Fc de la inmunoglobulina. Estos métodos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Redd y colaboradores (1997) J. Biol . Chem . 272:11193-11197. Las técnicas conocidas en el oficio se pueden emplear para eliminar los aminoácidos indeseados de las fusiones, tal como His-6. Por ejemplo, la carboxipeptidasa A se puede utilizar para eliminar los aminoácidos carboxiterminales . La carboxipeptidasa A detiene en los aminoácidos la prolina o la arginina. Por conveniencia de la purificación, se puede utilizar carboxipeptidasa A de fase sólida (Sigma) . En forma preferente, especialmente si se utilizan para propósitos de diagnóstico, los polipéptidos son al menos parcialmente purificados o aislados de otros constituyentes celulares. En forma preferente, los polipéptidos son al menos 50% puros. En este contexto, la pureza se calcula como un porcentaje en peso del contenido total de proteínas de la preparación. Más preferentemente, las proteínas son 50-75% puras. Los polipéptidos más altamente purificados también se pueden obtener y son abarcados por la presente invención. Para el uso clínico, los polipéptidos son en forma preferente altamente purificados, al menos aproximadamente 80% puros, y libres de pirógenos y otros contaminantes. Los métodos de purificación de proteínas son conocidos en la técnica y no se describen en detalle en la presente.

En algunos sistemas, especialmente algunos sistemas recombinantes, para las modalidades las cuales contienen una cisteina extra (quinta) , o una cisteina la cual se debe reducir (a fin de, por ejemplo, conjugar el polipéptido a una molécula de plataforma) , el producto inicial puede comprender disulfuros mezclados de peso molecular bajo, en los cuales la quinta cisteina (o extra, reactiva) se enlaza covalentemente a otra, una porción o porciones de peso molecular relativamente bajo. En estos ejemplos, se desea la reducción selectiva de la cisteina extra (mientras que se mantienen otros enlaces de disulfuro) . Tal reducción selectiva se puede realizar mediante el uso de un agente reductor de fase sólida, tal como DTT; en un soporte sólido, tal como acrilamida (tal como REDUCTACRYL por CalBiochem, San Diego) . Además, en los sistemas los cuales se diseñan y/o se utilizan para producir un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 con una cisteina extra (es decir, la cisteina es para servir como un grupo reactivo) , puede ser deseable hacer el polipéptido tal que un aminoácido adicional o ácidos sigan la cisteina extra en la secuencia, para proteger la cisteina durante la síntesis y/o producción, .

En forma preferente, especialmente si el polipéptido se puede conjugar a una plataforma (discutido posteriormente) , se utiliza la síntesis química. La síntesis química permite la modificación de la terminación N o C, lo cual facilita la conjugación a una molécula de plataforma. Cuando se produce un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, tal como aquellos que tienen una cisteina adicional además de las cuatro cisteinas del dominio 1 (las cuales forman uniones de disulfuro), las condiciones se deben seleccionar para promover la formación correcta de puentes de disulfuro. Como un ejemplo, un polipéptido reducido es desnaturalizado mediante la disolución en clorhidrato de guanidinio 6 M (GnHCl) para producir una concentración de 0.5 mg/ml. El plegamiento se logra mediante la diálisis a temperatura ambiente contra el siguiente amortiguador renaturalizante: GnHCl 0.1 M, Tris-Hcl 0.5 mM y EDTA 1 mM, pH 8.5. Para ayudar en la formación correcta de puentes de disulfuro, se adiciona una mezcla de 0.3 mM y 3 mM de glutationa oxidada y reducida respectivamente. La mezcla de reacción se monitoreó mediante la CLAP y los diferentes productos analizados mediante la espectrometría de masas. En los experimentos, después de 5 horas de ciclización, la CLAP analítica mostró aproximadamente 65% de conversión de la cual ~50% tuvo la masa correcta (pM = 7260) y ~15% existente como un aducto de glutationa (pM = 7567) . La proteína plegada que carece de glutationa luego se purifica mediante la CLAP de fase inversa.

Conjugados del (los) polipéptido (s) de la ß?GPI del dominio 1 La invención también proporciona conjugados del (los) polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1. En algunas modalidades, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 se puede (n) conjugar con el portador o etiqueta. Un número de técnicas para obtener tal enlace son conocidas en la técnica y no necesitan ser descritas en detalle en la presente. Se puede utilizar cualquier portador el cual se asegure y no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos • para el hospedante. Los portadores adecuados son macromoléculas lentamente metabolizadas, típicamente grandes tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa funcionalizada de látex, agarosa, celulosa, cuentas de celulosa y similares: aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares; aminoácidos poliméricos, tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares; copolimeros de aminoácido; y partículas de virus inactivos o bacterias atenuadas, tales como Salmonela. Los substratos de proteínas especialmente útiles son albúminas de suero, hemacianina de lapa de bocallave, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide tetánico y otras proteínas bien conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. Las etiquetas son conocidas en la técnica y no necesitan ser descritas en detalle en la presente. Existen muchas etiquetas diferentes y métodos de etiquetado conocidos para aquellos expertos ordinarios en la técnica. Los ejemplos de los tipos de etiquetas las cuales se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, y compuesto bioluminiscentes . Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica conocerán otras etiquetas adecuadas, o serán capaces de averiguar tales, utilizando la experimentación de rutina. Además, el enlace de estas etiquetas a los polipéptidos de la invención se puede hacer utilizando técnicas normales, comunes para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. El (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (en forma más preferente que carecen de un epitope de células T) se pueden conjugar a una molécula de plataforma de valencia, no inmunogénica (también llamada "plataforma"), la cual aumenta la presentación del (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Las patentes norteamericanas Nos. 5,162,515; 5,276,013; 5,552,391. Una plataforma puede ser proteinácea o no proteinácea (es decir, orgánica) . Los ejemplos de plataformas proteináceas incluyen pero no se limitan a, albúmina, gammaglobulina, inmunoglobulina (IgG) y ovalbumina. Borel y colaboradores (1990) Immunol . Me thods 126:159-168; Dumas y colaboradores (1995) Arch Derma tol . Res . 287-123-128; Borel y colaboradores (1995) In t . Arch .

Allergy Immunol , 107:264-267; Borel y colaboradores (1996) Ann . N. Y. Acad. Sci , 778:80-87. En forma más preferente, una plataforma es multivalente (es decir, contiene más de un sitio de enlace, o de unión) . En forma preferente, una plataforma multivalente contiene al menos dos, preferentemente al menos 3, preferentemente al menos 5, más preferentemente al menos 7, más preferentemente al menos 10, aun más preferentemente al menos 12, aun más preferentemente al menos 15 sitios de enlace. Sin embargo, se entiende que en el contexto de inducción de la tolerancia (es decir, cuando se utiliza una plataforma en conjunción con un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, apropiado para efectuar la inmunotolerancia) , dependiendo de la naturaleza del (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 empleados y la condición particular, cualquiera de un número de sitios de enlace puede ser suficiente. También se entiende que una plataforma no es un antigeno independiente de las células T. Las moléculas de plataforma de valencia preferidas son biológicamente estabilizadas, es decir estas exhiben un periodo de excreción in vivo frecuentemente de horas a dias a meses para conferir la eficacia terapéutica, y están compuestas en forma preferente de una cadena individual, sintética de la composición definida. Estas en general tienen un peso molecular en la gama de aproximadamente 200 a aproximadamente 200,000, en forma preferente aproximadamente 200 a aproximadamente 50,000 (o menos, tal como 30,000). Ejemplos de moléculas de plataforma de valencia dentro de la presente invención son los polímeros (o están comprendidas de los polímeros) tales como polietilenslicol (PEG), poli-D-lisina, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, D-ácido glutámico y D-lisina (en una relación de 3:2). Los polímeros preferidos se basan en polietilen glicoles (PEGs) que tienen un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 8,000. Otras moléculas que se pueden conjugar al (los) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 son albúmina e IgG. Otras moléculas de plataforma de valencia, preferidas adecuadas para el uso dentro de la presente invención son las moléculas de plataforma de valencia, no poliméricas, químicamente definidas tales como aquellas descritas en la patente norteamericana No. 5,552,391. En contraste a las plataformas más tradicionales, descritas previamente, estas plataformas tienen la ventaja de tener un peso molecular homogéneo (es decir uniforme) (como es opuesto al peso molecular polidisperso) , y de esta manera son "químicamente definidas". Por consiguiente, se entiende que una población de conjugados utilizando estas plataformas comprenden una plataforma de peso molecular homogéneo o se monodispersan sustancialmente (es decir, tienen una distribución reducida de peso molecular) . Una medición de la anchura de la distribución de peso molecular de una muestra (tal como una composición y/o población de moléculas de plataforma) de una molécula de plataforma es la polidispersidad de la muestra. La polidispersidad se utiliza como una medida de la homogeneidad o la no homogeneidad del peso molecular de una muestra polimérica. La polidispersidad se calcula al dividir el peso molecular promedio en peso (pM) por el peso molecular promedio en número (nM) . El valor de pM/nM es la unidad para un polímero perfectamente monodisperso . La polidispersidad (pM/nM) se mide por los métodos disponibles en la técnica, tal como la cromatografia de permeación de gel. La polidispersidad (pM/nM) de una muestra de las moléculas de plataforma es en forma preferente menor que 2, más preferentemente menor que 1.5, o menor que 1.2, menor que 1.07, menor que 1.02, o, por ej emplo , aproximadamente 1.05 a 1.5 o aproximadamente 1.05 a 1.2. Los polímeros típicos tienen en general una polidispersidad de 2-5, o en algunos casos, 20 o más. Las ventajas de la propiedad de polidispersidad baja de las moléculas de plataforma de valencia incluyen la biocompatibilidad mejorada y la biodisponibilidad puesto que las moléculas son sustancialmente homogéneas en tamaño, y las variaciones en la actividad biológica debido a que las amplias variaciones en el peso molecular se minimizan. De esta manera, las moléculas de polidispersidad baja se formulan farmacéutica y óptimamente y son fáciles de analizar. Además existe valencia controlada de la población de las moléculas en la muestra. Los ejemplos de las moléculas de plataforma de valencia, químicamente definidas, homogéneas, preferidas, adecuadas para el uso dentro de la presente invención incluyen 2 , 2' -etilendioxidietilamina (EDDA) y trietilen glicol (TEG) derivatizados . Otros ejemplos de plataformas químicamente definidas, homogéneas, preferidas se describen posteriormente, así como también en la técnica. En otras modalidades, un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 se conjuga a la albúmina, la IgG y/o el PEG. Las moléculas de plataforma de valencia, adecuadas, adicionales incluyen, pero no se limitan a, tetraaminobenceno, heptaaminobetaciclodextrina, tetraaminopentaeritritol, 1,4,8, 11-tetraazaciclotetradecano (Ciclam) y 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Cyclen) . En general, estas plataformas se hacen mediante técnicas de síntesis química, normales. El PEG se debe derivatizar y se hace multivalente, lo cual se realiza utilizando técnicas normales.- Algunas sustancias adecuadas para la síntesis de conjugados, tal como el PEG, la albúmina y la IgG son comercialmente disponibles. La conjugación de un (unos) polipéptidos (s) de la ß2GPI del dominio 1 a una molécula de plataforma de valencia se puede efectuar en cualquier número de formas, que involucran típicamente uno o más agentes de reticulación y grupos funcionales en el polipéptido y la molécula de plataforma de valencia. Las plataformas y el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 deben tener grupos de enlace apropiados. Los grupos de enlace se adicionan a las plataformas utilizando las técnicas de química sintética, normales. Los grupos de enlace se pueden adicionar a un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 utilizando cualquier técnica sintética de fase sólida, normal o técnicas recombinantes. Los planteamientos recombinantes pueden requerir la modificación pos-traduccional a fin de unir un enlace, y tales métodos son conocidos en la técnica. Como un ejemplo, los polipéptidos contienen porciones de cadena lateral de aminoácidos que contienen grupos funcionales tales como grupos amino, carboxilo o sulfhidrilo que sirven como sitios para el acoplamiento del polipéptido a la plataforma. Los residuos que tienen tales grupos funcionales se pueden adicionar al polipéptido si el polipéptido no contiene ya estos grupos. Tales residuos se pueden incorporar mediante las técnicas de síntesis de fase sólida o las técnicas recombinantes, ambas de las cuales son bien conocidas en las técnicas de síntesis de péptidos. Cuando el polipéptido tiene una(s) cadena (s) laterales de carbohidratos, se pueden incorporar grupos amino, sulfhidrilo y/o aldehido funcionales en el mismo mediante la química convencional. Por ejemplo, los grupos amino primarios se pueden incorporar mediante la reacción con etilendiamina en la presencia de cianoborohidruro de sodio, los sulfhidrilos se pueden introducir mediante la reacción de diclorhidrato de císteamina seguido por la reducción con un agente de reducción de disulfuro, normal, mientras que los grupos de aldehido se pueden generar después de la oxidación de peryodato. En una forma similar, la molécula de plataforma de valencia también se puede derivatizar para contener los grupos funcionales si no posee ya los grupos funcionales, apropiados. Los polipéptidos también se pueden modificar específicamente en el sitio en sus terminaciones C mediante un proceso llamado proteólisis inversa. Esencialmente, la proteólisis inversa utiliza enzimas proteoliticas para catalizar la formación de uniones de amida al utilizar condiciones las cuales impulsan la reacción en esa dirección. Los polipéptidos han sido modificados utilizando la proteólisis inversa para unirse a la hidrazida que contiene enlaces (Rose, K. y colaboradores, Bioconjugate Chemistry 1991, 2, 154-159) o enlaces que contienen aminooxi (Rose, K. y colaboradores, Bioconjugate Chemistry 1996, 7, 552-556) en sus terminaciones C por medio de las uniones de amida. Tales polipéptidos modificados se pueden hacer reaccionar para formar las uniones de hidrazona u oxima a otras moléculas de interés las cuales contienen grupos aldehido o cetona. Además de otras uniones, tales como los enlaces que contienen sulfhidrilo se podrían unir por medio de la proteólisis inversa. Las uniones hidrofílicas de longitudes variables son útiles para la conexión de los polipéptidos (u rtras moléculas bioactivas) a las moléculas de plataforma de valencia. Las uniones adecuadas incluyen oligómeros lineales o polímeros de etilenglicol. Tales uniones incluyen uniones con la fórmula R*S (CH2CH20) nCH2CH20 (CH2) mC02R2 en donde n = 0-200, m = 1 o 2, R1 = H o un grupo protector tal como tritilo, R2 = H o alquile o arilo, por ej emplo éster 4-nitrofenilico . Estas uniones son útiles en la conexión de una molécula que contiene un grupo reactivo de tiol tal como haloacetilo, maleiamida, etc., por medio de un tioéter a una seg.nda molécula la cual contiene un grupo amino por medio de un enlace de amida. Estas uniones son flexibles con respecto al orden de la unión, es decir, el tioéter se puede formar primero o al último. Como se discutió anteriormente, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 se pueden conjugar a cualquiera de un número de plataformas adecuadas mediante cualquiera de un número de formas. En una modalidad preferida, se utiliza el dominio 1 de la ß2GPI de la plataforma PIZ/IDA/TEG de tetra- bromoacetilo . Otras modalidades preferidas están en los Ej emplos . Los derivados de la plataforma PIZ/IDA/TEG (PITG) se pueden preparar como se muestra a continuación : Los Ejemplo de Grupos de Reticulación Compatible en la Plataforma PITG Plataforma (bromoacetüo-PITG) Conjugado A manera de ejemplo de una modalidad del conjugado, un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 se prepara (n) con una unión de tiol en el la terminación N mediante la síntesis de péptidos de fase sólida o por métodos recombinantes. La unión puede ser cisteína o una porción que contiene SH. El polipéptido modificado luego se puede alquilar mediante una plataforma adecuadamente derivatizada (tal como bromoacetilo o yodoacetilo) . En algunas modalidades, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 se conjuga por medio de un grupo sulfhidrilo (tiol o H) , por ejemplo, en una cisteina, lo que da por resultado una unión de tioéter en el conjugado. En algunas modalidades, esta cisteina reactiva se proporciona al incluir la quinta cisteina de la ß2GPI (Ejemplo 5) . En algunas modalidades, los conjugados se forman por medio de una unión de oxima. Una unión de oxima se puede formar mediante la reacción de, por ejemplo, un grupo carbonilo tal como un aldehido o cetona en un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 con una plataforma que contiene un grupo reactivo de aminooxi, tal como aminooxi, aminooxiacetilo, y aminooxialquilo . Los grupos amiaooxi pueden estar en las cadenas de trietilen glicol o hexilo; sin embargo cualquier cadena que comprenda átomos de carbono, oxigeno, nitrógeno o azufre es suficiente ya que termina en -ONH2. Para hacer estos conjugados, un polipéptido de la ß2GPI del dominio se modifica selectivamente para generar una porción de aldehido o cetona en una posición especifica en el polipéptido, tal como la terminación N. Segundo, el polipéptido se hace reaccionar con una plataforma multivalente la cual contiene grupos aminooxi para formar las uniones de oxima entre la plataforma y el polipéptido. La terminación N del polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 se puede convertir a un aldehido o una cetona mediante una reacción de transaminación, la cual es conocida en la técnica. En general, la reacción de transaminación convierte el enlace individual de carbono-nitrógeno de la terminación N a un enlace doble de oxigeno de carbono. Una glicina en la terminación N se hace reaccionar para formar un grupo glioxilo, un aldehido. Más de otros aminoácidos se hacen reaccionar para formar una cetona en virtud de la cadena lateral de aminoácidos . Otra forma para generar un grupo glioxilo en la terminación N es oxidar una serina o treonina de la terminación N con peryodato de sodio. Esta oxidación divide el enlace de carbono-carbono entre los grupos hidroxilo y amino de la serina o la treonina de la terminación N proporcionando un grupo glioxilo. En algunas modalidades, las plataformas multivalentes que contienen grupos reactivos de aminooxilacetilo (AOA) pueden ser producidas para conectar los polipéptidos selectivamente modificados a las plataformas. Los grupos aminooxilacetilo (AOA) se pueden unir convenientemente a las plataformas multivalentes que contienen los grupos de amina mediante la acilación con un grupo aminooxiacetilo protegido con N seguido por la remoción del grupo protector. Sin embargo, la reacción de polipéptidos de glioxilo con las plataformas derivatizadas de AOA procede lentamente, tomando varias días para formar las uniones de enzimas entre el polipéptido y la plataforma. El Ejemplo 5 describe la síntesis del compuesto del conjugado 44, la cual da por resultado la unión de un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI transaminado a una plataforma tetramérica, aminoacetilada . La invención incluye este conjugado . En otras modalidades, se pueden utilizar plataformas que contengan grupos reactivos de aminooxi alquilo. Los grupos aminooxialquilo se definen como un grupo aminooxi en un primer carbono, en donde en forma preferente el primer carbono no se une directamente a un grupo ávido de electrones tal como un segundo carbono el cual es parte de un grupo carbonilo. Se ha observado que los grupos aminooxi alquilo se hacen reaccionar más fácilmente con cetonas y aldehidos para formar oximas que los grupos aminooxiacetilo. El grupo aminooxiacetilo parece ser en general menos reactivo que otros grupos aminooxi (grupos aminooxialquilo) los cuales no son adyacentes a un carbonilo. El carbonilo del grupo aminooxiacetilo se piensa que causa una disminución de la reactividad debido a los efectos de retiro de electrones. Más información con respecto a estas plataformas y conjugados se encuentra en los Ejemplos y en la solicitud de patente norteamericana No. de serie comúnmente poseída (número de registro del apoderado 25231-2007400) . El compuesto del conjugado 45 descrito en el Ejemplo 5, se sintetizó al unir un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI, transmitido a una plataforma tetramérica de aminooxi. La invención incluye este conjugado, así como también aquellos conjugados de oxima del polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI los cuales surgen de la síntesis en base a AO .

Polinucleótidos de la invención La invención también proporciona polinucleótidos (inclusive polinucleótidos que ocurren naturalmente y que no ocurren naturalmente, aislados) que codifican un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Tales polinucleótidos son útiles para, por ejemplo, la producción del (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio I. La producción del (los) polipéptidos de la ß2GPI del dc-uinio 1 puede ser efectuada utilizando las técnicas normales en el oficio tal como los vectores recombinantes de clonación/expresión y los métodos de purificación de proteínas. Si la producción ocurre in vivo, se utiliza un sistema de expresión apropiado, tal como aquellos listados posteriormente. Con el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de un (unos) polipétido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (la cual se obtiene utilizando técnicas de ordenamiento de secuencias de proteínas, normales), se puede diseñar un polinucleótido el cual se codifique para esa la secuencia de aminoácidos particular. Los polinucleótidos se pueden sintetizar u obtener (cuando sea apropiado) de las secuencias genómicas o de ADNc. La invención también incluye los vectores de clonación y los vectores de expresión que contienen cualquiera de los polinucleótido descritos anteriormente. Estos vectores son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aquellos sistema de expresión de para el uso in vitro, de bacterias, de mamíferos, de levadura y de insectos) y no necesitan ser descritos en la présente. Ver, por ejemplo, Gacesa y Ramji, Vectors , John Wiley & Sons (1994) . La invención también incluye células hospedantes que contienen (es decir son transformadas con, o comprenden) cualquiera de los polinucleótidos y/o vectores descritos en la presente. Se pueden utilizar células tanto procarióticas y eucarióticas. Los hospedantes procarióticos incluyen células bacterianas, por ejemplo E coli , B . subti lis , y micobacterias . Entre los hospedantes eucarióticos están las células de hongos (inclusive levadura), de insectos, de aves, de plantas y de mamíferos. Los sistemas hospedantes son conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos en detalle en la presente. Las células hospedantes de esta invención se pueden utilizar, in ter a lia , como depositarios de los polinucleótidos descritos anteriormente y/o los vehículos para la producción de los polinucleótidos y/o polipéptidos de polipéptido (s ) de la ß2GPI del domino 1. Estos también se pueden utilizar como vehículos para el suministro in vivo del (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1.

Miméticos de la ß2GPI del dominio 1 de la invención La invención también proporciona miméticos (o análogos) de la ß2GPI del dominio 1, los cuales se enlazan específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI al cual se enlaza específicamente un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 (inclusive el dominio 1 completo) (es decir el mimético comparte un epitope específico para un anticuerpo antifosfolípidos depediente de la ß2GPI con un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Poniéndolo de otra manera, los miméticos imitan un epítope en el dominio 1 (es decir se enlazan competitivamente al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI en la presencia de un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1. El (los) mimético (s) pueden ser cualquiera de un número de sustancias quimicas, como se describe anteriormente. Dependiendo de su naturaleza química, los miméticos de la invención se pueden producir utilizando técnicas normales en los oficios químicos o bioquímicos (inclusive la biotecnología) . Estos miméticos se pueden utilizar en la detección y/o tolerágenos. Cuando se utilizan como un tolerágeno, un (unos) mimético (s) carecen de un epítope de células T, detectable. Los miméticos de la invención se pueden identificar utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, las moléculas candidatas se pueden seleccionar para determinar si éstas (a) se enlazan específicamente a los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI y/o (b) carecen de epitopes de células T (es decir, fallan en producir una respuesta de células T o una actividad asociada con las células T) . La determinación de cualquiera o ambas de estas actividades ha sido descrita en la técnica y en la presente. La selección de los miméticos de polipéptidos, candidatos se puede realizar utilizando los métodos de exhibición de bacteriófagos (inclusive el microanálisis en un recipiente) conocidos en la técnica (ver el Ejemplo 3) . La siguiente es una descripción en resumen de algunas de I estas técnicas. Han sido desarrollados diversos ensayos con los grados variantes de exactitud a fin de identificar los mejores epitopes de una selección de genoteca de epítopes. Los ensayos se listan aquí a fin de incrementar la exactitud: Biotratamiento con un recipiente < Microanálisis en un recipiente < ELISA de Captura de Bacteriófagos < ELISA de Bacteriófagos = tratamiento con papel secante de colonias = ELISA de Péptidos . El "biotratamiento con un recipiente" describe la técnica en donde un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad y un bacteriófago que lleva insertos de péptidos aleatorios se dejan mezclar, después de lo cual la recuperación específica del anticuerpo captura el bacteriófago enlazado. El bacteriófago confiere resistencia a la tetraciclina a E . coli que son propagadas en un medio que contiene tetraciclina y luego aisladas. Los múltiples ciclos de biotratamiento con un recipiente enriquecen el número de bacteriófagos inmunoespecíficos en una muestra. Los bacteriófagos se recuperan siempre al final de tres a cinco ciclos de selección pero pueden representar solo las secuencias que son enlazadas no específicamente en bajas afinidades para la selección de anticuerpos. Se requiere un método para la evaluación adicional de estos bacteriófagos (microanálisis en un recipiente) . El microanálisis en un recipiente proporciona una estimación de la resistencia relativa del enlace de los bacteriófagos al anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI. El microanálisis en un recipiente se lleva a cabo después de tres o más ciclos de biotratamiento con un recipiente y utiliza el mismo anticuerpo como el empleado en el método del biotratamiento con un recipiente. El método consiste de 'dilución del bacteriófago del último ciclo de biotratamiento con un recipiente y el análisis de quince o más de estos clones mediante el microanálisis en un recipiente. El microanálisis en un recipiente se realiza mediante el cultivo de cada clon a una densidad similar y luego la incubación del bacteriófago diluido en una concentración individual, óptima en pocilios de microtitulación previamente revestidos con una cantidad constante de anticuerpo. La concentración individual, óptima del bacteriófago es aquella concentración más probable para revelar la gama más amplia de registros del microanálisis en un recipiente (de 0 a 4+ ) y, de esta manera, permitir la diferenciación más grande entre los clones que se someten a una prueba. Esta se basa en el comportamiento del microanálisis en un recipiente de seis clones aleatoriamente seleccionados donde el registro se determina en cada una de las diversas concentraciones de bacteriófagos obtenidas mediante la dilución en serie. Después de la incubación con un anticuerpo, los bacteriófagos no enlazados se lavan y la cantidad de bacteriófagos enlazados se utiliza como una indicación de la afinidad del inserto del bacteriófago por el anticuerpo. La cantidad de bacteriófagos enlazados se determina mediante la elución con ácido suave seguido por la neutralización y la infección de E. coli . El número de E . coli infectado luego se cuantificó mediante el cultivo en placas de los microorganismos en placas con agar que contienen tetraciclina y luego la determinación de las densidades de las colonias logradas por cada clon. La prueba de ELISA de captura de bacteriófagos se desarrolló para proporcionar un ensayo de nivel intermedio para llenar el vacio entre la exactitud relativamente baja del ensayo de microanálisis en un recipiente y la alta exactitud de los ensayos ELISA de bacteriófagos o péptidos. Los estudios preliminares muestran que algunas preparaciones de anticuerpos dan también muchos clones positivos mediante el microanálisis en un recipiente pero ninguno mediante el ELISA de bacteriófagos o el ELISA de péptidos. La limitación del ELISA de bacteriófagos descrito posteriormente es que se localizan solo cinco copias de p-II en cada bacteriófago y aun con un gran número de bacteriófagos revestidos en un pocilio, pocas copias del inserto son representadas y la detección requiere que el anticuerpo tenga una muy alta afinidad por el inserto. Con el ELISA de captura de bacteriófagos, la señal se amplifica muchas veces lo cual facilita la detección de afinidad más baja, las interacciones estables entre el anticuerpo y el inserto.

El ELISA de captura de bacteriófagos consiste de los siguientes pasos. Los pocilios de microtitulación se revisten con el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI y los clones de los bacteriófagos se adicionan como en el ensayo de microanálisis en un recipiente. Los bacteriófagos no enlazados se lavan y la cantidad de bacteriófagos enlazados se cuantifica utilizando un antisuero de cabra conjugado con enzimas, el cual se une a los bacteriófagos. Los bacteriófagos seleccionados utilizando el ELISA de captura de bacteriófagos se hacen reaccionar con muchos anticuerpos aPL y proporcionan una fuerte señal en los ensayos ELISA subsecuentes. Este nivel intermedio de sensibilidad permite mayor eficiencia en el' esfuerzo de síntesis de péptidos puesto que pocos bacteriófagos positivos en el microanálisis en un recipiente son positivos en el ELISA de captura de bacteriófagos. Como resultado, los péptidos sintetizados de los bacteriófagos del ELISA de captura de bacteriófagos son en general inmunorreactivos. El método del ELISA de bacteriófagos de la selección requiere un enlace muy estrecho del inserto al anticuerpo de selección. Los bacteriófagos se revisten directamente sobre los pocilios de una placa de microtitulación y se incuban con el anticuerpo de selección. Después de los lavados para remover el anticuerpo no enlazado, un conjugado de fosfatasa alcalina de IgG anti-humano se adiciona para enlazar cualquier anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI enlazado al bacteriófago. Los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI luego se detectan al adicionar una substrato colorimétrico al pocilio, el cual reaccionará con la fosfatasa alcalina de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. El ensayo de tratamiento con papel secante de las colonias permite la selección de colonias a gran escala de bacterias E. col i infectadas por el bacteriófago biotratado con un recipiente. Este procedimiento es una alternativa para el ELISA de bacteriófagos para identificar los clones inmunorreactivos y exhibe un nivel comparable de sensibilidad sin requerir el cultivo de los clones de los bacteriófagos individuales antes de la prueba. En este ensayo, las bacterias E. coli infectadas con el bacteriófago de un ciclo de biotratamiento con un recipiente se extienden en una membrana de nitrocelulosa (NC) de diámetro grande y se cultivan durante la noche en la superficie de una placa de agar que contiene tetraciclina. Barbas y colaboradores (1991) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 88:7978-7982. Cada colonia resulta de la infección por el bacteriófago que contiene secuencias idénticas. Se hacen varios tratamientos con papel secante de transferencia, duplicados sobre la NC utilizando este "patrón" de NC y se dejan desarrollarse en la superficie de una placa de agar. Después de la disrrupción química y enzimática de las colonias infectadas con bacteriófagos en los papeles secantes, los bacteriófagos se pueden someter a una prueba mediante las técnicas comúnmente utilizadas en el tratamiento con papel secante Western, es decir, teñido o inmunotratamiento con papel secante. Los papeles secantes que han sido bloqueados se pueden incubar con el anticuerpo aPL de la selección. Después de los lavados para remover el anticuerpo no enlazado, se adiciona un conjugado de peroxidasa de rábano picante IgG anti-humano para el enlace a cualquier anticuerpo antifosfolípidos dependiente de Ja ß2GPI que esté enlazado al bacteriófago. La adición de un substrato colorimétrico permite a uno localizar las colonias discretas en la placa de patrón la cual representa los bacteriófagos inmunoespecíficos que se puede clonar para el estudio adicional . Después del ordenamiento de secuencias de ADN para determinar las secuencias del inserto de péptido del bacteriófago de mejor reacción en los ensayos descritos anteriormente, los péptidos correspondientes se hacen al utilizar la química de péptidos Fmoc, normal como es bien conocido en la técnica. Para el ensayo ELISA de péptidos, los péptidos se pueden hacer, por ejemplo, como moléculas tetravalentes, ramificadas, es decir, cada molécula tiene cuatro copias del inserto. Tal molécula puede revestir el pocilio de una placa de microtitulación y aun tener epítopes expuesto a la solución para permitir el enlace por un anticuerpo. Los péptidos tetravalentes se sintetizan al incorporar Usinas como puntos de ramificación en los primeros dos acoplamientos análogos a los métodos utilizados para los Maps, discutidos anteriormente. Posnett y colaboradores (1988) . Un separador que consiste de glicina-serina-glicina-serina se adiciona en cada brazo después de las Usinas y luego el inserto, inclusive los aminoácidos de la estructura encontrados en el bacteriófago, prolina-glicina en la terminación de carboxilo y alanina-glicina-prolina en la terminación de amino. Todos los aminoácidos en esta síntesis se adicionan uno a la vez utilizando métodos de Fmoc, normales. Estos péptidos luego se someten a un ensayo mediante el ELISA el cual se lleva acabo al revestir los péptidos en los pocilios de microtitulación y luego ensayar su reactividad con un anticuerpo aPL en un formato de ELISA normal. En la práctica, los péptidos usualmente se enlazan muy fuertemente al anticuerpo de la selección, original y muestran alguna reactividad cruzada con otros anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI . Los controles de los anticuerpos antifosfolipidos no dependientes de la ß2GPI se incluyen para eliminar los péptidos de enlace, no específicos . Un ELISA de enlace competitivo de péptidos determina si dos péptidos se enlazan a la misma población de anticuerpos en un suero dado del individuo y cuantifica la afinidad de enlace relativa a los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI. En este ensayo, los diversos péptidos monoméricos compiten con los péptidos tetravalentes revestidos en un pocilio de una placa de microtitulación. Para realizar el ensayo, los péptidos a ser evaluados se sintetizan como monoméros, es decir, sin las ramificaciones de lisina empleadas en la síntesis de los péptidos tetravalentes, utilizando la química de Fmoc normal. Los péptidos monoméricos luego se purifican y se disuelven en las concentraciones conocidas. Los pocilios de una placa de microtitulación se revisten con un péptido tetravalente conocido para enlazarse al anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI . Las diluciones en serie de los péptidos monoméricos se incuban con una dilución constante del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. La dilución del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI se determinó previamente al titular el anticuerpo contra el péptido tetravalente y seleccionar una dilución en el declive de la curva de titulación. Después de la incubación del anticuerpo y los péptidos monoméricos durante una hora, las soluciones de anticuerpo/péptido se adicionan a los pocilios de microtitulación y se realiza un ELISA colorimétrico, normal. La concentración de cada péptido monomérico que disminuye el enlace del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI con el péptido tetravalente se determina mediante la representación gráfica de las lecturas colorimétricas obtenidas para cada pocilio. El punto de inhibición de 50% se utiliza como la medida de la resistencia relativa del enlace para los péptidcs monoméricos. Una variación de este ensayo utiliza placas de microtitulación revestidas con ß2GP-l/cardiolipina en lugar del péptiao tetravalente y prueba la capacidad de los péptidos monoméricos para bloquear el enlace del anticuerpo anti osfolípidos dependiente de la ß2GPI al (los) epitope (s) en la ß2GPI/CL. En este ensayo, se utiliza un suero de humano agotado de IgG en una concentración optimizada como una fuente de la ß2GPI. Los péptidos monoméricos en diversas concentraciones se incuban con una concentración optimizada del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI de una manera análoga al ensayo el cual emplea el péptido tetravalente como un substrato de la placa. Después de la incubación del antifosfolipido dependiente de la ß2GPI/péptido en las placas (ß2GPI/CL) , se determina en enlace a los anticuerpos y la concentración de péptidos requerida para el 50% de inhibición en la absorbancia media-máxima como en el ensayo tetravalente. Una variación adicional de este ensayo prueba la capacidad de los péptidos monoméricos para bloquear el enlace del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI a la ß2GPI revestida directamente en los pocilios de placas de microtitulación Nunc Maxisorp. En esta variación, el uso de cardiolipina es omitido y en lugar de gelatina de pescado, el diluyente reactivo y el bloqueador se utiliza leche desgrasada. Otra variación de este ensayo somete a una prueba la capacidad de los conjugados del polipéptidos de la ß2GPI del domino 1, multivalentes, las moléculas de tolerágeno o los monómeros de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 para bloquear el enlace en el suero o plasma del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI a la ß2GPI revestida directamente en los pocilios de las placas de microtitulación Nunc Maxisorp. No se emplea cardiolipina en el ensayo. Se utiliza leche desgrasada más el detergente Tween-80 en las soluciones tanto de bloqueo y de diluyente reactivo. El epítope deseado para la inducción de la tolerancia debe tener una fuerte interacción con tantos anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI como sea posible pero no contener algún residuo innecesario. A fin de deducir la constitución mínima de un epítope, los miméticos de cada péptido se hacen (i) que carezcan de residuos dados, por ejemplo, se suprimen residuos de la estructura en las terminaciones carboxilo y/o amino, o (ii) en los cuales las sustituciones de aminoácidos han sido hechas que difieran de las secuencias encontradas en la selección de la genoteca de epítopes. Estas sustituciones de aminoácidos pueden ser ya sea naturales, por ejemplo, isoleucina por leucina, o no naturales, por ejemplo alfa metil prolina por prolina. El efecto de estas supresiones y/o sustituciones luego se mide por medio de un ELISA competencia de péptidos. La invención también incluye conjugados de un (unos) mimético (s), composiciones que comprenden un (unos) miméticos, equipos que comprenden un (unos) mimético (s), y polinucleótidos que codifican cualquier mimético de polipéptido. Se ha descrito como hacer y utilizar estas modalidades en las secciones anteriores y los principios y técnicas presentadas del mismo modo se aplican a los miméticos.

Composiciones de la invención La presente invención además proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 (inclusive todas las modalidades de los polipéptidos descritas anteriormente, tales como funciones, polipéptidos poliméricos y conjugados) , asi como también composiciones que comprenden polinucleótidos que codifican la ß2GPI del dominio 1 y las composiciones que comprenden el (los) mimético (s). Estas composiciones son especialmente útiles para la administración a aquellos individuos quienes se pueden beneficiar de la inducción de la tolerancia. Las composiciones también son útiles como reactivos en los sistemas de supresión. En general, las composiciones de la invención para el uso en la inducción de la tolerancia comprenden una cantidad efectiva de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (o mimético (s) ) , en forma preferente en un excipiente farmacéuticamente aceptable y pueden estar en diversas formulaciones. Como es bien conocido en la técnica, un excipiente farmacéuticamente aceptable es una sustancia relativamente inerte que facilita la administración de una sustancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes de estabilización, agentes de humectación y de emulsificación, sales para variar la osmolaridad, agentes de encapsulamiento, amortiguadores, y aumentadores de la penetración en la piel. Los excipientes, asi como también las formulaciones para el suministro parenteral y no parenteral de fármacos, se exponen en Remington ' s Pharmaceuti cal Science 19a Ed. Mack Publishing (1995) . En general, estas composiciones se formulan para la administración mediante la inyección (por ejemplo, de manera intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etcétera) . Por consiguiente, esas composiciones se combinan preferentemente con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. En general, el conjugado constituirá normalmente aproximadamente 0.01% a 10% en peso de la formulación debido a las consideraciones empíricas, prácticas tales como la solubilidad y la osmolaridad. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosificación, el cálculo del tiempo y la repetición, dependerá del individuo particular y la historia médica de ese individuo. En general, una dosificación de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 100 mg de conjugado/kg de peso corporal, en forma preferible aproximadamente 100 µg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, será dado semanalmente. Las consideraciones empíricas, tales como el periodo de vida útil, en general contribuirán a la determinación de la dosificación. Otros programas de dosificación apropiados pueden ser tan frecuentes como diariamente o 3 dosificaciones por semana, o una dosificación por semana, o una dosificación cada dos a cuatro semanas, o una dosificación en un mes o un programa menos frecuente dependiendo del individuo o el estado de enfermedad. Las administraciones repetitivas, normalmente cronometradas de acuerdo con la rapidez de renovación de las células B, pueden ser requeridas para lograr y/o mantener un estado de anergia humoral. Tales administraciones repetitivas en general involucran los tratamientos de aproximadamente 1 µ a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal o más alto cada 30 a 60 dias, o más pronto. Si se detecta un incremento en registro de GPL de los anticuerpos. De manera alternativa, las formulaciones de liberación continua, sostenida de las composiciones pueden ser indicadas para algunas patologías. Diversas formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida son conocidos en la técnica. Otras formulaciones incluyen formas de suministro adecuadas, conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, portadores tales como liposomas. Mahato y colaboradores (1997) Pharm . Res . 14:853-859. Las preparaciones liposomales incluyen, pero no se limitan a, citofectinas, vesículas multilaminares y vesículas unilaminares . En algunas modalidades, más de un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 (o mimético (s)) pueden estar presentes en una composición. Tales composiciones pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco diferentes polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Tales "cócteles", cuando estos son frecuentemente representados en la técnica, pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de la gama más amplia de población de individuos. Estos también pueden ser útiles en que son más efectivos que utilizar solo uno (o pocos que están contenidos en el cóctel) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1.

Las composiciones se pueden administrar solas o en conjunción con otras formas de agentes que sirven para aumentar y/o complementar la efectividad de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, que incluye, pero no se limitan a, los tratamientos de células T anti-ayudantes . Estos tratamientos emplean usualmente agentes que suprimen las células T tales como esteroides o ciclosporina. Los individuos apropiados para recibir tales composiciones pueden ser identificadas utilizando los parámetros clínicos conocidos en la técnica, tales como la determinación de registros de GPL de los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI, la determinación de la presencia de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI particularmente asociados con el (los) estado (s) de enfermedad, y/o los síntomas de patologías asociadas con los antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. En forma preferente, el individuo es un humano. Con respecto al anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, un registro de GPL de al menos aproximadamente 10, en forma preferente al menos aproximadamente 20, en forma más preferente al menos 40 puede indicar la administración de cualquiera de estas composiciones. Este registro se basa en el ensayo comercialmente disponible, actualmente que es un ELISA de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de lá ß2GPI de fase sólida (por ejemplo Inova (San Diego) ; Theratest (Chicago) ; APL Diagnostics (Lqusville) ) . También indicados para la administración de estas composiciones son aquellos individuos quienes tienen una historia familiar de cualquier desorden asociado con los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI (es decir, una enfermedad) , o aquellos individuos quienes se consideran que tienen un registro de GPL "normal" pero quienes han exhibido un registro de GPL en incremento durante un período de tiempo . En general, la eficacia de la administración de cualquiera de estas composiciones se ajusta al medir cualquier cambio en los parámetros clínicos descritos anteriormente, particularmente el registro de GPL de antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Sin embargo, es adecuada la medición de cualquier parámetro que se piensa que o se ha mostrado que se asocia con la condición que es tratada. Con respecto a aquellas composiciones las cuales se pueden utilizar como reactivos (tales como en los ensayos de detección) , esas composiciones en general comprenden una cantidad de un (unos) polipéptido ( s) de la ß2GPI del dominio 1 (es decir, uno o más polipéptidos) suficiente para efectuar la detección. Estas cantidades son fácilmente determinadas de manera empírica. Estas composiciones pueden comprender además una sustancia, tal como un amortiguador, para efectuar la detección. Estas composiciones también pueden ser opcionalmente hechas complejas a una matriz de detección, tal como una fase sólida (por ejemplo, en una columna de inmunoafinidad) .

Equipos que comprenden el (los) polipéptido (s) del dominio 1 de la ß2GPX La invención también proporciona equipos que contienen (es decir, que comprenden) uno o más polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (o uno o más miméticos de polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1) y, opcionalmente, anticuerpos para el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 como un patrón, en forma preferente equipos de diagnóstico para la detección del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. Los procedimientos de diagnóstico y de monitoreo que utilizan el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 de esta invención se pueden realizar mediante laboratorios de diagnóstico, laboratorios experimentales, médicos, o individuos privados. Los equipos incorporados por esta invención incluyen aquellos que permiten que alguien conduzca un ensayo por la presencia de anticuerpos para el (los) polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1, tal como cualquiera de aquellos descritos en la presente, para detectar y/o cuantificar de esta manera esos anticuerpos. Los equipos incorporados por esta invención también incluyen equipos que permiten la detección de anticuerpos para el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, en, por ejemplo, células transfectadas ex vivo o in vivo . Por consiguiente, la invención incluye un equipo que contiene el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 para la detección y/o cuantificación de un anticuerpo anti-polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, en forma preferente un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, en una muestra biológica. Los equipos de esta invención están en empaques adecuados, y pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores, reactivos de captura, reactivos de desarrollo, etiquetas, superficies de reacción, medio para la detección, muestras de control, instrucciones, e información interpretativa. Se puede emplear cualquier medio apropiado para detectar el enlace de los anticuerpos (y proporcionado en los equipos) tal* como un anticuerpo anti-humano etiquetado, cuando se somete a una prueba la presencia de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI de humano, en donde la etiqueta puede ser una enzima, un fluoróforo, un radioisótopo de material quimioluminiscente, una coenzima. En general, la etiqueta utilizada será una enzima. Además de detectar los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI (o uno o más miméticos de polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1) puede ser un componente de un equipo para detectar la coagulación. Este equipo haría posible la detección de un papel (si lo hay) de los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI en la mediación de la vía de la trombosis.

Por ejemplo, los anticuerpos antifosfolipidos • dependientes de la ß2GPI retardan la inactivación del Factor Va activado por la proteína activada C o activan la via de coagulación del factor del tejido. Se ha encontrado que los anticuerpos anti-ß2GPI específicos del dominio 1 retardan la inactivación del Factor Va como se discute en el Ejemplo 11. Un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s) ) pueden ser útiles en la diferenciación de los efectos mediados por el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI de otros mecanismos que influyen la inactivación del Factor Va o la activación de la vía del factor de tejido. Además, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s)) pueden ser útiles en otros ensayos de coagulación funcionales (tal como la trombosis) en los cuales los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI o suero o plasma de individuos influyen en el resultado del ensayo de coagulación especifica. Por ejemplo, si la presencia de un (unos) polipéptidos de la ß2GPI del domino 1 (y/o mimético (s)) altera el resultado de un ensayo de coagulación (cuando se compara con los resultados de este ensayo en la ausencia de un (unos) polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s )) , los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI están implicados en la via de la coagulación. Esta información podría ser especialmente valiosa en la valoración de los tratamientos específicos, potenciales.

Métodos para utilizar los polipéptidos de la ß¿GPI del dominio 1 (y los miméticos de los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1) La invención también proporciona métodos que utilizan un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o un (unos) mimético (s) de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1)), los cuales son aplicables en un contexto de detección y/o terapéutico. Por consiguiente, la invención abarca los métodos que utilizan el (los) polipéptido (s ) de la ß2GPI de la invención (y/o mimético (s) de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 de la invención) para detectar objetivos adecuados en una muestra biológica. Los procedimientos para conducir las pruebas de diagnóstico (es decir, detección) utilizando polipéptidos son conocidas extensivamente en la técnica y son de rutina para un profesional de experiencia ordinaria. En general, para realizar un método de diagnóstico (es decir detección) de esta invención, uno de los polipéptidos o miméticos de esta invención (en general como una composición) se proporciona como un reactivo para detectar un objetivo con el cual reacciona en una muestra biológica. El objetivo se suministra al obtener una muestra biológica adecuada de un individuo para quien se puede medir el parámetro de diagnóstico. Si se desea, el objetivo puede ser parcialmente purificado de la muestra o amplificado antes de que se conduzca el ensayo. La invención también proporciona los métodos para la purificación de un anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI utilizando un (unos) polipéptido (s ) o mimético (s) de la invención. La invención también proporciona métodos que utilizan los polipéptidos, polinucleótidos y/o miméticos de esta invención para inducir la tolerancia.

Detección del anticuerpo an ti fos f olípidos dependien te de la ß2GPI En una modalidad, la invención proporciona métodos de detección de un anticuerpo que se enlaza específicamente a un (unos) polipéptido ( s) de la ß2GPI del dominio 1, en forma preferente un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, en una muestra biológica. Estos métodos son aplicables en general en el entorno clínico, por ejemplo, para diagnosticar y/o monitorear los niveles de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI en un individuo. Estos métodos causan el contacto del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI en la muestra con un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (es decir, cualquier polipéptido de esta invención) bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de un complejo estable entre el anticuerpo especifico de la ß2GPI del anti-dominio 1 (tal como un anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI) y un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1, y detectar un complejo estable formado, si hay. El (los) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 de la invención vuelven estos métodos particularmente útiles, ya que aun no ha sido desarrollado un ensayo en general conveniente o adecuado para estos anticuerpos. Un número de métodos de inmunoensayo son conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos en detalle. Las muestras adecuadas para medir el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI son muestras biológicas, inclusive suero o plasma (en forma preferente suero) y eluato del tejido objetivo. En bien entendido en la técnica que la detección de un complejo formado puede ser directa (tal como al medir la cantidad de etiqueta asociada con un complejo) o indirecta (tal como en la medición de la cantidad del ligando etiquetado que se desplaza durante el ensayo) . para utilizar el(los) polipéptido (s ) o mimético (s) de esta invención en la detección de tales anticuerpos en un individuo, se conduce un inmunoensayo. El (los) polipéptido (s) o mimético (s) se proporcionan como un reactivo, y el anticuerpo es el objetivo en la muestra biológica. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo de IgG de humano presentes en una muestra de suero pueden ser capturadas con la proteina A de fase sólida, y luego cubiertas con el reactivo de polipéptidos etiquetados. La cantidad de anticuerpos entonces seria proporcional a la etiqueta unida a la fase sólida. De manera alternativa, las células o secciones de tejido que expresan el polipéptido pueden ser cubiertas primero con la muestra de prueba que contiene el anticuerpo, y luego con un reactivo de detección tal como anti-inmunoglobulina etiquetada. La cantidad del anticuerpo entonces sería proporcional a la etiqueta unida a las células. La cantidad del anticuerpo detectado en la muestra seria comparada con la cantidad detectada en una muestra de control. En los métodos de la invención, el polipéptido o mimético de la ß2GPI del dominio 1 será típicamente inmovilizado, mediante técnicas conocidas, en una fase sólida, adecuada, tal como un material de empaque de columna de afinidad, o una superficie de plástico tal como una placa de microtítulo o una varilla de nivel. Los materiales de empaque de la columna de afinidad, apropiados incluyen, por ejemplo, una matriz de agarosa en cuentas, poliacri-lamida, vidrio, celulosa o dextrano reticulado. Las superficies de plástico, adecuadas incluyen polimetacrilato, poliestireno, polietileno, politereftalato, etilenglicol, poliéster, polipropileno, y similares. En general, puede ser utilizada una placa de microtítulo normal. De manera alternativa, la fase sólida puede estar en la forma de un gel o una matriz en el cual se incorpora el polipéptido o el mimético de la ß2GPI del dominio 1. Para la ilustración adicional, una muestra de prueba que contiene potencialmente un anticuerpo que se enlaza específicamente a un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 (tal como un anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI) se puede mezclar con una cantidad no limitante, predeterminada del (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 el cual está en general etiquetado de manera detectable (tal como con un radioisótopo o una enzima) . En un ensayo de fase liquida, los reactivos sin reaccionar se eliminan mediante una técnica de separación, tal como la filtración o la cromatografia. En estas técnicas de inmunoensayo, la cantidad de etiqueta asociada con el complejo se correlaciona positivamente con la cantidad de anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI presente en la muestra. Se pueden diseñar ensayos similares en los cuales el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI en la muestra de prueba compita con el anticuerpo etiquetado por el enlace a una cantidad limitarte del (los) polipéptido ( s) de la ß2GPI del dominio 1. En la presente, la cantidad de la etiqueta se correlaciona negativamente con la cantidad del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI en la muestra. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido, o un eluato de tejido, y la cantidad del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI asociado con la muestra de tejido se mide mediante, por ejemplo, un ensayo de enlace competitivo. Estos métodos pueden ser útiles especialmente en aquellos contextos en los cuales un tejido particular debe ser sometido a una prueba y/o monitoreado por la presencia y/o la cantidad de anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI. Este tipo de ensayo puede indicar, por ejemplo, si una enfermedad particular (o riesgo de enfermedad) se puede indicar (tal como una forma particular de trombosis o enfermedad de coagulación) . Este ensayo también puede ser útil en proporcionar una determinación más precisa y sensible de la localización del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI para los propósitos de diagnosis y/o monitoreo. Además, la información de localización acerca de los antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI también puede proveer a un clínico con una indicación acerca de las opciones del tratamiento adecuadas. Se entiende que estos métodos de detección son aplicables en una variedad de contextos clínicos. Por ejemplo, la detección se puede utilizar para identificar a individuos quienes muestran riesgo de desarrollar las condiciones o desórdenes asociados con los antifosfolipidos pendientes de la ß2GPI (los cuales pueden a su vez surgir de ser capaces de distinguir los anticuerpos asociados con la patología y aquellos no asociados con la patología) . La detección también puede ser utilizada para monitorear el tratamiento (tal como la administración de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente) . La detección también puede ayudar en la distinción entre los anticuerpos patogénicos de los anticuerpos no patogénicos. La detección también puede ayudar al clínico en decidir las mejores opciones de tratamiento y/o prognosis. Como se discutió anteriormente, también se puede utilizar un (unos) polipéptido ( s ) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s)) como un componente de diagnóstico en un ensayo de coagulación, específicamente un ensayo en el cual los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI puedan modificar el resultado de un ensayo de coagulación especifico. Por ejemplo, si la presencia de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s) ) altera el resultado de un ensayo de coagulación (cuando se compara con los resultados de este ensayo en la ausencia de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s) ) , los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI se implican en la via de coagulación. Debido a que el (los) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético(s)) pueden ser útiles en la diferenciación de los efectos mediados por el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI de otros mecanismos en la coagulación (tal como la trombosis) , la invención incluye métodos para detectar la participación (mediación) de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI en la coagulación (tal como la trombosis) , que comprende (a) realizar un ensayo de coagulación utilizando una muestra biológica adecuada de un individuo, utilizando un (unos) polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s) ) ; (b) realizar un ensayo de coagulación utilizando una muestra . biológica, adecuada de un individuo, sin utilizar un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 (y/o mimético (s )) ; (c) comparar los resultados de (a) y (b) , en donde una diferencia en el resultado indica la participación de un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI en la coagulación. Estos métodos también se pueden utilizar para monitorear el estado de un paciente en términos de mediación de los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI en la coagulación, así como también la detección inicial. Estos métodos también indican, o detectan, una anormalidad de coagulación que involucra (es decir, mediada por) anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI. Para estos métodos, se puede utilizar plasma o suero. De manera alternativa, se utiliza la fracción de IgG, aislada utilizando métodos normales en la técnica. Un ejemplo de un sistema de detección de coagulación se proporciona en el Ejemplo 11. En algunas modalidades, se determinan los niveles del factor V(Va) activado, en general al medir el tiempo para la coagulación. Los ensayos, el' equipo, y los equipos para detectar la coagulación son conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles.

Purificación de los an ticuerpos an ti fos f olípidos dependien tes de la ß?GPI La invención también incluye métodos para la purificación de un anticuerpo el cual se une específicamente a un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (tal como un anticuerpo antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI) que comprende poner en contacto una muestra biológica que contiene el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI con un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 o un mimético de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo estable de antígenos-anticuerpos, y obtener un complejo formado, si lo hay, Típicamente, el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 o mimético (s) se acoplan a una matriz de afinidad para la purificación en columna por afinidad. Tales métodos son de rutina en la técnica y no necesitan ser descritos en detalle en la presente. El Ejemplo 1 también describe la purificación por afinidad del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß GPI.

Métodos para inducir la tolerancia También se incluyen en esta invención los métodos para inducir la tolerancia (es decir, un estado toleragénico) , que comprenden administrar a un individuo una cantidad efectiva de un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 (o un polipéptido el cual comprende un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1) o un mimético de un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1, todos los cuales también carecen de un epitope de células T, detectable. En forma preferente, el (los) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 (o cualquier polipéptido que comprende el (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1) o mimético (s) también se conjuga a una molécula de plataforma adecuada, como se describe anteriormente. Se entiende que, para los propósitos de esta invención, la respuesta inmune a ser reducida (y/o eliminada, estabilizada y/o velocidad de incremento reducida, por medio de la inducción de la tolerancia, es una respuesta inmune a la ß2GPI. Por consiguiente, la tolerancia inducida es el antígeno específico, en donde el antígeno de la ß2GPI, y la tolerancia se logra en un individuo quien ha sido determinado que tiene (al menos antes de la administración del (los) polipéptido (s) y/o mimético (s) de esta invención) anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI . Los polipéptidos apropiados de esta invención (esto es, los polipéptidos que comprenden un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1 o mimético (s) que carece de un epítope de células T) se pueden utilizar solos o en conjunción con otros agentes los cuales promueven la actividad/objetivo deseado. Como se discutió anteriormente, también se pueden utilizar diversos polipéptidos en diversas combinaciones entre sí. Las diversas formulaciones y medios de administración han sido discutidos anteriormente.

Las determinaciones de si la tolerancia ha sido inducida se pueden lograr por cualquier medio conocido en la técnica. En general, la tolerancia se • determina al medir la respuesta inmune a un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1. Una respuesta inmune a un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 se puede medir utilizando ensayos normales, inclusive, por ejemplo, medir los niveles del anticuerpo el cual se enlaza al (los) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 o mimético (s); medir la producción de citocina después de la inmunización con un (unos) polipéptrdo (s ) de la ß2GPI del dominio 1; realizar análisis in vitro de la respuesta de células T a un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 después de la administración de un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI o mimético (s) de la invención utilizando las células T del individuo que recibe tal administración (es decir, un individuo con anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI), inclusive, por ejemplo, ensayos normales de captación de 3H-timidina para medir la proliferación de las células T cuando se presentan con un (unos) polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 en el contexto de una célula que presenta antigenos, ensayos de liberación de 51Cr normales para medir la eliminación por las células T citotóxicas de una célula que presenta un (unos) polipéptido (s ) de la ß2GPI del dominio 1, y similares. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: El dominio 1 de la ß 6PI es inmunorreactivo con los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI Materiales y Métodos Construcción de mutan tes de supresión de dominios La ß2GPI está comprendida de 5 dominios "sushi". Para determinar la(s) región (es) antigénica (s) de la ß2GPI, se separaron selectivamente uno o más dominios de la ß2GPI . Este planteamiento se empleó por Igarashi y colaboradores ((1996) Blood 87:3262-3270) en el cual ellos hicieron supresiones de la ß2GPI de humano la cual contuvo el dominio 4 y 5, los dominios 3 hasta 5, los dominios 2 hasta 5, los dominios 1 hasta 4 y los dominios 1 hasta 3. Además de los mutantes de sapresión de dominios descritos por Igarashi y colaboradores, se construyeron mutantes de la ß2GPI de humano que contenían solo los dominios 1 y 2. El punto de inicio para la construcción de estos mutantes de supresión fue el ADNc de longitud completa de la ß2GPI de humano (Steinkasserer y colaboradores, (1991) Biochem . J. 277:387-391) clonado en pBacPAK9 (Clontech), una donación de S. Krilis. El paso inicial fué para introducir un GlyHis6 en la terminación C. En el proceso, fué creado un único sitio de restricción Msc 1 (TGGCCA) al cambiar el codón Cys de la terminación C de TGC a TGT seguido por Gly (GGC) y His (CAC) . El propósito de la etiqueta Hisß fué para permitir la purificación fácil de las proteínas mutantes mediante la cromatografía de quelación de Ni. El GlyHisß se introdujo mediante la mutagénesis dirigida al sitio de ADN de cadena individual. El método empleado siguió estrechamente los procedimientos publicados de Kunkel y colaboradores, Me thods in Enzymology (1987) 154:367-382. Cuando las células que contienen el fagémido pBacPAK9, en el cual han sido insertado ADNc para la ß2GPI de humano, se infectaron por un bacteriófago ayudante, M13K07, las partículas del bateriófago colectadas de los medios de cultivo contuvieron predominantemente una versión de ADN de cadena individual del pBacPAK9. Además, si las células empleadas fueron del genotipo du t 1 , ung 1 tal como CJ236, alguna timidina en el ADN se reemplazó por uridina. El ADN de cadena individual se purificó del bacteriófago mediante la extracción con fenol y la precipitación de etanol. El oligonucleótido, ApoH-G6H, con la secuencia ' AAACCACCTTAATGGTGATGGTGATGGTGGCCACATGGCTTTACA 3' (SEC ID NO: 13) el cual es complementario para las regiones o cualquier lado de Cys C-terminal y codifica el GlyHiSd se fija al ADN de cadena individual del pBacPAK9 que 1 contiene el gen para la ß2GPI de humano la cual ha sido cultivada en E . col i , CJ236. El método de Kunkel se utilizó para alargar el oligonucleótido complementario dando por resultado el ADN de cadena doble. La reacción se transformó en E . col i K91. La cadena K91 no contiene el genotipo dut 1 , ung 1 con el resultado que el ADN que contiene uridina será degradado. La cadena recientemente sintetizada que codifica el GlyHisß debe ser enriquecida. Los clones se analizaron mediante la secuencia de ADN utilizando ya sea el equipo de secuenasa T7 o el equipo de termo secuenasa (Amersham Life Sciences) . Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron de la manera descrita anteriormente para generar los mutantes de supresión de dominios de la ß2GPI de humano.

B2del3-60 5' GAC ATA CTC TGG GTG TCC GTC CTG CAÁ TAG C 3' (SEC ID NO: 14) B2del3-120 5' TGG AGG GCA GAT GAT CCG TCC TGC AAT AGC 3' (SEC ID NO: 15) B2del3-182 5' GAA TGG GCA TTT TAC TTC CCG TCC TGC AAT AGC 3' (SEC ID NO : 16) B2de l 3 -242 5' AGG TAA TTT ACÁ AGA TGC CCG TCC TGC AAT AGC 3' (SEC ID NO: 17) B2del242-326 5' ATG GTG ATG GTG GCC ACÁ ACT TGG CAT GGC 3' (SEC ID NO: 18) B2dell82-326 5' ATG GTG ATG GTG GCC GCA TTC TGG TAA TTT AG 3' (SEC ID NO: 19) Los números en los oligonucleótidos se refieren a los aminoácidos de la ß2GPI de humano. Por ejemplo, B2del3-60 se refiere a los aminoácido 3-60 que son suprimidos de la ß2GPI . La proteína resultante contiene los dominios 2-5. Sigue un resumen de las construcciones.

Dominio (s) Construcción Secuencia esperada SEC ID NO: de la proteina 2,3,4,5 B2del3-60 GRTPR 20 3,4,5 B2del3-120 GRIIC 21 4,5 B2del3-182 GREVK 22 B2del3-242 GRASC 23 1,2,3,4 B2del242-326 GRTCP 24 1,2,3 B2dell82-326 GRTCP 24 La PCR se utilizó para generar otros mutantes. El modelo para la reacción fué el pBacPAK9 que contiene el ADNc para la ß2GPI de humano. El oligonucleótido, pBacPac9 PCR 1270, 1297, el cual tiene la secuencia 5' CTA TAA ATA CGC ATC CCG GGA ATT CG 3' (SEC ID NO: 25) y los cebadores corriente arriba de la región de multiclonación en el pBacPAK9 se utilizó como el cebador 5' . Para construir los clones con solo el dominio 1, el Dominio 1 del oligonucleótido PCR(64) Mscl, con la secuencia 5' GCA GCT GGC CAÁ CTC TGG GTG TAC ATT TCA GAG TG 3' (SEC ID NO:26) se utilizó como el cebador 3'. De manera similar, para generar un mutante que contiene los dominios 1 y 2 el oligonucleótido, Dominio 1, 2 PCR(122) Msc 1, con la secuencia 5' GCA GCT GGC CAÁ TGA TGG GAG CAC AGA GAG GAA G 3' (SEC ID NO: 27) se utilizó como el cebador 3' . Se realizaron veinticinco ciclos de la PCR. El producto fué extraído con fenol y precipitado con etanol. Los fragmentos se digirieron en el extremo 5' con Bam Hl y Msc 1 en el extremo 3' . Los fragmentos de ADN digerido fueron purificados con gel y ligados en el pBacPAK9 del cual había sido dividida la ß2GPI de longitud completa con las mismas enzimas de restricción. Las ligaciones se transformaron en E . col i XLl-azul y los clones se caracterizaron mediante la formación de secuencias de ADN. Siguen los resultados: Todos los mutantes de supresión de la ß2GPI se purificaron a partir de los medio de las células de insecto infectadas. En general, las células se separaron mediante la centrifugación y los medios se dializaron contra al menos 10 volúmenes de solución salina amortiguada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM , KCl 2.7 mM, Na2HP0 "7H20 4.3 M, KH2P04 1.4 mM) durante 18 horas a 4°C. El siguiente dia, cualquier producto precipitado se separó mediante la centrifugación. Los medios dializados se hicieron NaP04 50 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M y se adicionó resina Ni-NTA a los medios dializados con mezclado suave. Después de 1 hora a 4°C, la resina se colectó con un embudo Buchner y se empaquetó en una columna con camisa exterior de agua mantenida a 4 grados. La columna se lavó extensivamente con NaP0 50 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M hasta que no fué detectable la proteína. La columna se eluyó secuencialmente con el mismo amortiguador que contiene imidazol 20 mM, 35 mM o 100 mM. El análisis fué mediante la electrofóresis de gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS PAGE) . Las fracciones apropiadas se reunieron y la proteína se concentró y se dializó contra solución salina amortiguada con Tris (TBS; TrisCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM) .

Anticuerpos anti fos f olípidos dependien tes de la ß2GPI, puri i cados por afinidad Para aislar los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, se incuban dispersiones de lípidos que contienen cardiolipina, multilaminares (que también contienen colesterol y dicetilfosfato) con plasma de antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI (o suero) . Se forman pelotillas de éstos liposomas del suero mediante la centrifugación. Después del lavado, la mezcla de liposomas se disrrumpe por el detergente de octilglucósido 2% y se aplica a una columna de proteína A-agarosa. Después de los lavados intensivos para separar primero los lipidos y luego separar los componentes diferentes de . IgG, el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI de IgG se eluye de la proteína A con ácido suave, se neutraliza, se intercambia con amortiguador, y se somete a una prueba en el ELISA ACÁ. Este * procedimiento produce un anticuerpo aPL enriquecido hasta 10,000 veces que está libre de cualquier ß2GPI contaminante como se muestra mediante el tratamiento con papel secante Western con antisueros de la ß2GPI anti-humano de IgG de conejo. Sigue un ejemplo especifico de este procedimiento.

Purificación de anticuerpos antif os f olípidos dependientes de la ß?GPI del suero Los anticuerpos de diversos pacientes se purificaron del suero de pacientes de varios genes que exhiben diversos síntomas que incluyen: SLE, APS (que incluye diversas manifestaciones de APS, que incluyen la trombosis venosa, aborto, trombocitopenia, CVA (accidente cerebrovascular, es decir, apoplejía), TÍA (ataques de isquemia transiente)), y oclusión arterial). En un matraz de fondo redondo de 25 mL (Kontes Scientific Co., Vineland, N.J.) una mezcla de 1.2 mL de cardiolipina (Sigma Chemical, San Luis, MO, #C-1649), 0.464 mL de colesterol (Sigma Diag., San Luis, MO., #965-25), 0.088 mL de 5 mg de fosfato de dicetilo (Sigma Chemical, San Luis, MO, D-263 1) por mL de cloroformo se secó durante aproximadamente 5 minutos en un Rotavap (Buchi, Suiza). Después de la remoción del solvente, se adicionaron 2 mL de NaCl 0.96% (p/vol) (J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) y se mezclaron en un Mezclador Vortex Genie (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) durante 11 minutos. La suspensión de liposoma se incubó durante 1 hora a 37°C. Mientras tanto, el suero 6501 se hizo dar vueltas en 600 x g en una centrífuga Sorvall RT 6000 (Dupont Co . Wilmington, DE) durante 10 minutos a 8°C. Se colocaron cuatro mL del sobrenadante en un matraz de fondo redondo de 25 mL con 1 mL de la suspensión de liposoma preparada y la mezcla se incubó con agitación a velocidad media en un agitador orbital, Tektator V (Scientific Products, McGraw Park, IL) durante 48 horas a 4°C, y 2 horas adicionales a 37°C. Se adicionaron veinte mL de TBS frío y la mezcla se transfirió en un tubo de centrífuga de policarbonado de 50 mL (Nalge Co . , Rochester, NY) y se centrifugó a 27,000 x g durante 15 minutos a 4°C en una centrifuga RC3 en un rotor SS-34 (Sorvall-Dupont , Wilmington, DE). El producto precipitado se lavó 3 veces con 25 mL de NaCl frío, 0.96% utilizando la centrífuga RC3. La pelotilla se disolvió en 1 mL de solución 2% (p/vol) de n-octil-ß-D-glucopiranósido (Calbiochem, La Jolla, CA) en TBS y se aplicó a una columna de proteína A/agarosa - reticulada 0.6 mL (Repligen Corporation, Cambridge, MA) la cual ha sido prelavada con 15 veces el volumen del lecho de ácido acético 1M y se equilibró 15 veces los volúmenes del lecho de TBS. La columna de anticuerpo-proteina A/agarosa se lavó con 40 veces el volumen del lecho de octilglucopiranósido 2% para separar los lípidos, seguido por los lavados intensivos con TBS hasta la densidad óptima del eluato a 280nm aproximado a la línea de base. El anticuerpo enlazado se eluyó con ácido acético 1M. Se colectaron fracciones de 1 mL, se neutralizaron inmediatamente con 0.34 mL de Tris 3M (Bio-Rad, grado de electrofóresis) por fracción y se mantuvieron en un baño de hielo. La densidad óptica de cada fracción se determinó a 280 nm en un espectrofotómetro (Hewlett-Parckard, 8452A Diode Array Spectrophotometer, Palo Alto, CA) . Las fracciones que contenían el anticuerpo se reunieron, se concentraron y se lavaron 4 veces con TBS en concentradores Centricon-30 (Amicon División, W.R. Grace & Co . , Beverly, MA) por protocolo del fabricante. El rendimiento final del anticuerpo purificado de 4 mL de suero 6501 se determinó mediante la lectura de la densidad óptica a 280 nm de una alícuota de la concentración, donde 1 mg = 1.34 A28onm- El rendimiento promedio, obtenido fué 750 µg de anticuerpos de 4 mL de suero 6501. El anticuerpo purificado se sometió a una prueba para la actividad de ACÁ y se verificó la pureza con SDS-PAGE Laemmli.

ELISA en base a cardiolipina Las placas de microtitulo (Immulon 1 #3350 de Dynex Technologies) se revistieron con 30 µl de una solución de 50 µg/ml de cardiolipina en etanol, se secaron durante la noche a 4°C, se lavaron tres veces con PBS, pH 7.2, y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 75 µl de gelatina de pescado 5% (p/v), (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc. 695 Joyce Kilmer Ave., New Brunswick N.J., EUA) . Las placas se lavaron tres veces con PBS, se cargaron con 50 µl de la ß2GPI recombinante de longitud completa a 10 µg/ml en gelatina de pescado 5% y se incubaron a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, 50 µl de cualquier anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad (la concentración de cada anticuerpo utilizado se muestra en la Tabla 2, o se adicionó anti-ß2GPI de conejo a cada pocilio y se incubó a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, 50 µl de anti-inmunoglobulina conjugada con fosfatasa alcalina (IgG anti-humano, especifica para la cadena gamma, Zymed #62-8422 o IgG anti-conejo, Zymed #362-61220 diluida apropiadamente en gelatina de pescado 5% se adicionó y se incubó a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de substrato cromogénico de fosfatasa alcalina (solución PPMP; 7.8 g de monofosfato de fenolftaleina más 69.5 g de 2-amino-2-metil-l-propanol en 100 mL de solución madre de agua diluida 1:26 con agua inmediatamente antes del uso) y se incubaron durante 30 minutos, a temperatura ambiente. La densidad óptica, a 550 nm, se determinó al leer las placas en un autolector de microplacas (Bio-Teck Instruments, modelo EL311) .

ELISA de inhibición competi tiva Las placas de microtítulo (MaxiSorpMR, Nalge Nunc International, Dinamarca) se revistieron con 50 µl de la ß2GPI recombinante de longitud completa a 10 µg/ml en bicarbonato 0.1M, pH 9.5, se incubaron durante la noche a 4°C, se lavaron tres veces con PBS 0.15 M, pH 7.2, y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 75 µl de Leche Desgrasada en Polvo 2% (Carnation, NFDM 2%) . Los inhibidores de prueba se diluyeron en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl de cada dilución a las células revestidas. El anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad se diluyó en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl, de una concentración constante, a los pocilios, inclusive un grupo de pocilios que no tuvieron el inhibidor, los cuales actuaron como los controles positivos. Los contenidos de los pocilios se mezclaron y las placas se incubaron a 37 °C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de IgG antihumano, conjugada con fosfatasa alcalina, específica para la cadena gamma, (Zymed #62-8422) diluida apropiadamente en NFDM 2% y se incubaron a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de substrato cromogénico de PPMP de fosfatasa alcalina y se incubaron durante 30 minutos, a temperatura ambiente. La Densidad Óptica, a 550 nm, se determinó al leer las placas en un autolector de microplacas (Bio-Teck Instruments, modelo EL311). El porcentaje de inhibición se determinó al dividir el DO550 obtenido en la presencia del inhibidor por el D055o promedio obtenido de los pocilios sin inhibidor y luego multiplicar por 100 (más particularmente, [la A550 promedio obtenida de los pocilios de control sin el inhibidor menos la A55o del medio] menos [la A550 obtenida en la presencia del inhibidor menos la A550 del medio] dividida por [la A550 promedio obtenida de los pocilios de control sin el inhibidor menos la A550 del medio] 100 veces) .

Enlace directo de la ß?GPI recombinan te y mutantes , valorado mediante el ELISA Las placas de micropocillos revestidos con quelatos de níquel (NCP 010 00 Xenopore Corp. 374 Midland Ave. Saddle Brook, NJ EUA) se revistieron con 50 µl de diluciones en serie de varias ß2GPI recombinantes, en PBS, a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con 75 µl de una gelatina 1% (Sigma #G-2500) en PBS a temperatura ambiente durante una hoja. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de ya sea el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad (en una concentración que ha sido mostrada previamente para dar aproximadamente 80% del enlace máximo) o anti-ß2GPI de conejo y se incubaron a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de anti-inmunoglobulina conjugada con fosfatasa alcalina (IgG anti-humano, especifica para la cadena gamma, Zymed #62-8422) o IgG anti-conejo (Xymed #62-6122) diluida aproximadamente en gelatina 1% y se incubaron a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de solución de substrato cromogénico de PPMP de fosfatasa alcalina y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La densidad óptica, a 550 nm, se determinó al leer las placas en un autolector de microplacas (Bio-Teck Instruments, modelo EL311) .

Resul tados de los estudios de inhibición Se utilizaron siete a nueve diferentes proteínas mutantes de la ß2GPI recombinante para determinar la especificidad antigénica de las preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad de 13 pacientes diferentes. Cada proteína ß2GPI recombinante, mutante se sometió a una prueba, en una forma dependiente de la dosis, para su capacidad para inhibir el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad del enlace a la ß2GPI - recombinante de longitud completa. Los resultados de un ensayo típico se muestran en la Figura 4. Los resultados de los ensayos de todos los 13 anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad se resumen en la Tabla 2. Los siguientes valores también se observaron para la proteina recombinante con únicamente el dominio 1 (1 ; ver la Tabla 2 para las designaciones) .

Ab 6203, Max 20, 50% > 10; Ab 7008, Max 40, 50% > 10; Ab 6501, Max 30, 50% > 10; Ab 6626, Max 50, 50% > 10; Ab 6632, Max 70, 50% 3; Ab 6644, Max 45, 50% > 10; Ab 7015, Max 30, 50% > 10; Ab 7101, Max 20, 50% > 10; Ab 6701, Max 80, 50% 4; Ab 6641, Max 98, 50% > 10; Solo aquellos mutantes que contuvieron el dominio 1 inhibieron los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI del enlace a la ß2GPI recombinante de longitud completa (Figura 4). Esto fué verdadero para todas las 13 preparaciones de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI (Tabla 2). El hecho que todas las proteínas ß2GPI mutantes, recombinantes que contienen el dominio 1 inhibieron más de 90% indica que toda la actividad de la anti-ß2GPI detectable de estos anticuerpos se dirige contra el dominio 1.

Tabla 2 Resumen de los datos de los ensayos de inhibición competitiva utilizando 13 diferentes preparaciones de anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI contra nueve proterinas ß2GPI recombinantes .

Max = inhibición máxima observada en las concentraciones probadas, 50% concentración (µM) para dar 50% de inhibición. ) 12345 1—- 12— 123-- 1234- -2345 -345 —45 —5 No Ab# Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% Max 50% 7104 90 0.8 90 0.8 90 1 98 90 0.7 10 >57 20 >50 >40 >47 6203 75 0.8 60 (20) >10 20 >10 75 1 30 >8 10 >57 10 >50 10 >40 5 >47 7008 90 0.2 70 (40) >10 40 >10 80 0.4 50 >8 20 >57 20 >50 20 >40 20 >47 6501 80 0.2 70 (30) 30 (>10) 30 >10 85 0.8 30 >8 20 >57 15 >50 15 >40 10 >47 6626 80 0.3 85 (50) 8 (>10) 50 >10 90 0.8 40 >8 18 >57 20 >50 15 >40 10 >47 6632 90 0.8 90 (70) 8 (3) 70 3 90 0.2 60 2 20 >57 20 >50 20 >40 10 >47 6644 90 0.2 90 (45) 8 (>10) 45 >10 90 0.7 50 8 10 >57 10 >50 10 >40 10 >47 LO o o m O CM s lO u. 1O m ? ? ? ? O m O o o o co CM co CO o co ? ? ? ? ? ? O lO o O O o CM 00 oo ? o ? o o co co o o o o o o 1? o s> o o co o z O Q Q z Z Z o o ? ? ? o o' o1 éo o e¡. co CM o 00 r— ,_ ,_ O o o o O o O o o o en oo o CD Resul tados de la prueba de enlace directo de las proteínas ß?GPI mutan tes , recombinan tes mediante los anticuerpos antif osf olípidos dependientes de la ß?GPI en la . ausencia de cardiolipina Se examinaron siete a nueve diferentes proteínas mutantes de la ß2GPI recombinante para determinar si éstas podrían soportar en enlace directo de las preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad en la ausencia de un fosfolípido aniónico. Toda la ß2GPI mutante, recombinante se sometió a un ensayo con las preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad de 11 pacientes diferentes. Cada proteína ß2GPI recombinante, mutante se sometió a una prueba, en una forma dependiente de la dosificación y el GST-6his se incluyó como un control negativo. Las proteínas ß2GPI mutantes, recombinantes se enlazaron a placas de microtítulo revestidas con niquel por medio de su cola de 6-his. Todas las proteínas ß2GPI mutantes, recombinantes sometidas a prueba se enlazaron al anti-ß2GPI de conejo mostrando que estas fueron valorables por el anticuerpo (Figura 5) . Los resultados de un experimento de enlace típico muestran que solo aquellas proteínas que contenían el dominio 1 se enlazaron al anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad (Figura 6) . Los resultados de los ensayos de todos los 11 anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad se resumen en la Tabla 3. Los resultados muestran que todos los anticuerpos de los pacientes se enlazaron significantemente a las proteínas recombinantes de la ß2GPI que contienen el dominio 1, mientras que existió poco, si los hay, enlace específico para las proteínas recombinantes que carecen del dominio 1.

Tabla 3 Ensayos de enlace directo utilizando pocilios con quelatos de niquel cargados con la proteina ß2GPI mutante, de supresión, indicada contra 8 diferentes preparaciones de anticuerpos antifos olipidos dependientes de la ß2GPI O.D. máximo para cada combinación de mutante : anticuerpo de supresión 12345 1 — 12— 123-- 1234- -2345 --345 ---45 — 5 Ab# 6501 1.772 0.91 1 0.028 0.909 0.628 0.018 0.030 0.086 0.004 6626 1.527 0.560 0.073 1.250 0.563 0.008 0.022 0.086 0.028 6652 0.640 0.262 ND 0.320 0.135 0.008 0.016 0.013 0.012 6632 1.419 0.351 0.016 0.121 0.003 0.031 0.004 0.000 0.013 7008 1.380 0.195 0.088 0.360 0.149 0.019 0.018 0.030 0.007 6701 0.948 0.388 ND 0.841 0.715 0.002 0.002 0.000 0.000 6203 1.270 1.029 0.119 0.938 0.668 0.074 0.072 0.142 0.044 7015 1.864 1.102 0.063 1.160 0.454 0.1 14 0.042 0.167 0.078 6641 2.555 0.252 0.530 0.145 0.045 0.019 0.1 12 0.018 6644 1.848 0.493 1.020 0.768 0.041 0.048 0.151 0.017 7101 1.257 0.804 0.951 0.843 0.056 0.042 0.167 0.078 Conejo 2.065 1.9737 1.971 1.708 1.873 1.993 1.941 1.663 Enla ce directo de proteínas ß?GPI mutan tes , recombinan tes por los an ti cuerpos an ti fos f olípidos dependien tes de la ß2GPI en la presencia de cardiolipina Se examinaron siete diferentes proteínas mutantes de la ß2GPI recombinante para determinar si éstas podrían soportar el enlace directo de las preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad en la ausencia de un fosfolípido aniónico. Todas las siete ß2GPI mutantes, recombinantes se sometieron a un ensayo con anti-ß2GPI de conejo y con una preparación de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, purificados por afinidad. Cada proteína ß2GPI recombinante, mutante se sometió a una prueba, en una forma dependiente de la dosificación y se incluyó el GST-6his como un control negativo. Las proteínas ß2GPI mutantes, recombinantes se enlazaron a las placas de microtítulo que habían sido revestidas previamente con cardiolipina. Todas las siete proteínas ß2GPI mutantes, recombinantes se enlazaron a la anti-ß2GPI de conejo mostrando que estas se enlazaron a la cardiolipina y que éstas fueron valorables para el anticuerpo (Figura 7). Los resultados de un experimento típico con los anticuerpos de los pacientes muestran que solo aquellas proteínas que contenían tanto el dominio 1 y el dominio 5 se enlazaron al anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad (Figura 8) . En base a los datos anteriores en este ejemplo, se cree que bajo ciertas condiciones la ß2GPI se enlaza a soportes de fase sólida en una forma tal (tal como placas irradiadas, placas revestidas con cardiolipina, placas de microtitulo Nunc brand y placas de quelatos de níquel en el caso de las proteínas ß2GPI recombinantes que contenían una cola 6-his) para permitir que el (los) epítope (s) antigénicos en el dominio 1, sea accesible libremente a los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI, pero no cuando se enlazan a otras superficies tales como placas no irradiadas, muchas otras marcas de placas de microtítulo. Estos estudios de inhibición confirman los reportes por otros que el antifosfolípido dependiente de la ß2GPI se puede enlazar a la ß2GPI en la ausencia de fosfolípidos. Galli y colaboradores (1990) Lancet 335:1544; Rouby y colaboradores (1995); Arvieux y colaboradores (1991) <J. Immunol . Methods 143:223. Las mismas cinco ß2GPI's mutantes, recombinantes que inhiben en el ensayo de inhibición competitiva--aquellas que contienen el dominio 1—son las mismas como aquellas que se enlazan al anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI en las placas de quelatos de níquel. Las proteínas mutantes de ß2GPI recombinante enlazadas a las placas de quelatos de níquel se confirmaron por la capacidad de la anti-ß2GPI de conejo para enlazarse a todas la nueve proteínas recombinantes. En contraste, solo la ß2GPI recombinante de longitud completa (esto es, solo la proteína recombinante sometida a una prueba que contiene tanto el dominio 1 y el dominio 5) podría ser fácilmente detectada en las placas revestidas con cardiolipina. Las proteínas mutantes de ß2GPI recombinante enlazadas a las placas revestidas con cardiolipina se confirmaron por la capacidad de la anti-ß2GPI de conejo para enlazarse a todas las nueve proteínas recombinantes. Tanto los datos de inhibición (Figura 4) y los datos del enlace directo, por medio de las placas revestidas con níquel, (Figura 6) mostraron claramente que la especificidad antigénica de las 13 preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI estudiadas, se dirigen hacia un epítope que está en el dominio 1 de la ß2GPI.

Ejemplo 2: Especificidad de los anticuerpos de pacientes con APS La localización de la región de enlace de epítopes en los estudios descritos en el Ejemplo anterior depende del uso de anticuerpos purificados por afinidad de pacientes con APS de título alto. La purificación por afinidad de los anticuerpos del APS requiere pacientes de título alto y no conduce fácilmente por sí misma al estudio de los paciente con título más bajo o grandes poblaciones de pacientes. Por lo tanto, se desarrolló un planteamiento alternativo para evaluar el (los) dominio (s) de enlace de anticuerpos en muestras de pacientes con APS que son en base a suero y está dispuesto para la evaluación de un número más grande de pacientes. La resonancia de plasmón de la superficie • (SPR) proporciona una medición cuantitativa de la interacción entre la proteína inmobilizada y una sustancia para el análisis, soluble. Los estudios actuales aplicaron la SPR para medir la interacción entre la ß2GPI inmobilizada y los mutantes de supresión de dominios de la ß2GPI con plasma de humano de un grupo humano de pacientes normales y con APS. Los estudios se diseñaron para determinar si la inmunodominancia del dominio 1 de la ß2GPI podría ser generalizada para la población más grande de pacientes con APS.

Materiales y Métodos Reactivos . Los fragmentos pequeños CM5, NHS y EDC y el amortiguador HBS-EP fueron de BIAcore. La haptoglobina de humano (fenotipo 1-1), una proteína que contiene la configuración de repetición consensual, corta encontrada en la ß2GPI, se inmobilizó en una celda de flujo separada en el fragmento pequeño y se utilizó como un control negativo. La ß2GPI recombinante y los mutantes de supresión de dominios de la ß2GPI se expresaron en las células Tn5 utilizando el sistema de expresión de proteina de baculovirus y se purificó de los sobrenadantes mediante la columna de afinidad de quelación de niquel. Iverson y colaboradores (1998) Proc. Na ti . Acad. Sci , EUA 95:15542-15546. Las muestras de plasma de humano, normales se adquirieron (George King Biomedical) o se obtuvieron en casa. Las muestras de plasma de pacientes de individuos diagnosticados con síndrome de anticuerpos antifosfolípidos ya sea primario o secundario (para lupus) se obtuvieron de un número de fuentes clínicas. Los 55 controles utilizados en este estudio se derivaron de una muestra heterogénea. Se incluyeron en el análisis treinta muestras de control (15 masculinas; 15 femeninas; edad promedio de 34 años, intervalo de 19-45 años) adquiridas de George King Bio-Medical (Overland Park, KS) , 5 voluntarios locales (3 masculinos, 2 femeninas), 2 fuentes comerciales reunidas y 18 donadores modelo de sangre de origen desconocido. Las muestras de pacientes se colectaron de diversas fuentes e incluyeron pacientes con historias de trombosis venosa, oclusiones arteriales, oclusiones cerebrovasculares, abortos múltiples y trombocitopenia. Todos los pacientes incluidos en el estudio tuvieron niveles de nivel de anticuerpos antifosfolípidos de IgG (GPL) > 20 por ensayo interno. La fracción de IgG total se aisló del plasma utilizando cuentas de agarosa proteína G Immunopure Plus y amortiguadores de enlace y elución de IgG Inmunopure de acuerdo con la recomendación de los fabricantes (Pierce) . Resonancia de Plasmón de la Superficie. Todos los experimentos se realizaron utilizando un instrumento BIAcoreMR 2000 a 25°C con una velocidad de flujo de 10 µL/minuto. Los estudios de equilibrio y enlace del fragmento pequeño se realizaron con amortiguador de HBS-EP desgasificado, el cual consiste de HEPES 0.01 M pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM y surfactante P20 0.005% (v/v) . El acoplamiento covalente de los ligandos de proteína a través de sus grupos de aminoácidos libres al fragmento pequeño CM5 se realizó al hacer fluir 40 µL de NHS 0.05 M/EDC 0.2M sobre el fragmento pequeño para activar el fragmento pequeño, seguido por la exposición al ligando de proteínas apropiado. La ß2GPI(His)6 recombinante, mutantes de supresión de dominios de la ß2GPI y haptoglobina se inmovilizaron al hacer fluir 50 µg de una solución 25 µg/mL en acetato 10 mM, (pH 4.8) sobre el fragmento pequeño CM5 activado con NHS. Los grupos reactivos en exceso en la superficie del fragmento pequeño luego se enfriaron con 40 µL de etanolamina 1 M, (pH 8.5) . Las muestras de plasma de humano (130 µL) se diluyeron 1:1 con HBS-EP, fluido sobre el fragmento pequeño de la ß2GPI, y los valores de respuesta se colectaron durante 780 segundos. Los fragmentos pequeños se regeneraron entre las exposiciones de la muestra con 80 µL de glicina 0.1 M-HC1 (pH 2.1), NaCl 0.1 M. Puesto que el planteamiento para el equilibrio del enlace fué incompleto durante el período de medición, el valor del enlace de equilibrio (Req) se determinó al ajustar las curvas de asociación a la siguiente ecuación utilizando los elementos de programación de los fabricantes (BiaEvaluation versión 2.2, Uppsala, Suecia) Rt = Req(l-e-ks(t-to,)+Ro donde Rt es la respuesta de Biacore medida en el tiempo t, Req es la respuesta de meseta de equilibrio, t es tiempo, t0 es tiempo inicial, Ks es una constante de asociación aparente ( k3 = KaC + Kdís , donde Ka es la constante de asociación, C es la concentración de la sustancia para el análisis y kdiS es la constante de asociación), y R0 es una desviación de respuesta. En algunos experimentos las fracciones de IgG total de muestras de plasma de humano se obtuvieron del enlace a y la elución de ácido de la proteína G. El plasma que permanece después del enlace a la proteína G se volvió a mezclar con cuentas de proteína G nuevas y se aisló como plasma despojado de IgG. Las preparaciones de IgG neutralizada y el plasma despojado de IgG diluidas 1:1 con el amortiguador se hicieron fluir sobre el fragmento pequeño de la ß2GPI como se describe anteriormente.

Resultados y Discusión Los dominios que contienen la ß2GPI de humano recombinante 1-5, 2-5 y el domino 1 solo se clonaron en los vectores de expresión de baculovirus y se expresaron en las células TN5. Las alícuotas de las proteínas purificadas se analizaron y se cuantificaron mediante el análisis de aminoácidos. Cada proteína contuvo un terminal amino individual y los patrones internos permitieron la -.uantificación precisa en base al análisis de aminoácidos. El grupo humano de pacientes con APS se obtuvo de múltiples centros y consistió de 106 pacientes con GPL > 20 que hablan sido diagnosticados con síntomas del síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS). Las historias de los pacientes no fueron completas, pero las historias disponibles incluyeron la trombosis venosa, trombosis arterial, accidentes cerebrovasculares, abortos múltiples, partos prematuros y trombocitopenia. Los valores de CPL variaron de 20 - 807 (413 ± 161, promedio ± SD) con un valor medio de 77. La población de control normal consistió de 55 muestras obtenidas de donadores internos, fuentes comerciales o del banco de sangre de San Diego. El suero de los pacientes con APS y los controles se diluyeron 1:1 en el amortiguador y se evaluaron por el enlace a la ß2GPI(Dl-5) inmobilizada. La magnitud de la interacción con la ß2GPI(Dl-5) se muestra en la Tabla 4. El Req promedio para la ß2GPI(Dl-5) fué 730 y 328 con un valor promedio de 635 y 201 para los 106 pacientes con APS y 55 pacientes de control, respectivamente. La diferencia entre los pacientes y el grupo de control fué estadísticamente significante (p < 0.01, prueba t de Student) . La magnitud de la interacción del APS y el suero de control con la ß2GPI(D2-5) no fué diferente entre estos grupos (Tabla 4) .

Tabla 4 : Enlace del Suero de los pacientes Pacientes Controles (GPL = 20) Número de sujetos 106 55 RßqD1 -5 (promedio ± sem) 730 ± 42 328 ± 52 RßqD2-5 (promedio ± sem) 158 ± 36 160 ± 26 RßqD1 -5 Promedio 635 201 RßqD2-5 Promedio 24 103 % de D1 selectivo 88% 12% Se calculó una relación de select ividad para describir el enlace relativo de las muestras de suero a los mutantes de supresión de dominios de la ß2GPI que difieren únicamente por la presencia del dominio 1. Esta relación de selectividad se calculó al dividir el enlace (Reg) a la ß2GPI(Dl-5) mediante el enlace a la ß2GPI(D2-5) . Un factor de 3 o mayor fué seleccionado arbitrariamente para definir aquellos pacientes que exhibían una interacción preferencial con la proteína nativa que contenía el dominio 1. La magnitud de interacción con tanto la ß2GPI(Dl-5) y la ß2GPI(D2-5) fué baja en el grupo de control y la mayoría de los pacientes de control no exhibió selectividad por cualquier proteína inmovilizada (Tabla 4). En contraste, 88% de los pacientes con APS exhibieron una selectividad > que 3 veces por la ß2GPI que contenia el dominio 1. Cuarenta y uno por ciento (43/106) de los pacientes con APS tuvieron una interacción insignificante con la ß2GPI(D2-5) (Req < 9) , lo que da por resultado relaciones de selectividad muy altas. El suero de 10 pacientes con relaciones de selectividad 3 se caracterizó adicionalmente para determinar si las interacciones observadas en el suero podrían ser atribuidas a la fracción de la IgG. Las interacciones de enlace de plasma total, el plasma despojado de IgG y la IgG total con ß2GPI(Dl-5) se muestra en la Tabla 5. La remoción de la IgG del suero con la proteína G removió esencialmente todas las interacciones de enlace específico con las proteínas inmovilizadas. La fracción de la IgG fué eluida con ácido de la fracción de la proteína G y se sometió a una prueba para la interacción con las proteínas (asignadas "IgG total" en la Tabla 5; la neutralización subsecuente diluyó la fracción de IgG por 50% con relación al plasma total y el plasma despojado de IgG) . La fracción de IgG solo mostró la interacción con la ß2GPI(Dl-5) y produjo respuestas que fueron similares en magnitud a la interacción del suero original con la ß2GPI(Dl-5) (observar la diferencia de dilución) . De esta manera, el enlace del suero del paciente selectivo por dominio 1 a la ß2GPI se puede explicar por la fracción de IgG en este sistema de ensayo.

Tabla 5 : Valores de Roq BIAcore para las Muestras de Plasma de Pacientes con APS "Selectivos para el DI" aciente Plasma total (1 :2) Plasma despojado de IgG total lgG (1 :2) (1 :4) (d2-5) (d1 -5) (d2-5) (d1 -5) (d2-5) (d1-5) 6501 333 1526 0 0 0 732 6701 199 952 0 0 0 460 6626 37 1622 0 49 0 1 132 6515 259 1024 0 0 0 440 6207 19 1450 0 0 0 480 6642 8 811 0 48 0 480 7015 158 2029 0 0 0 864 6703 65 1001 0 0 0 556 6601 84 792 0 0 0 266 7201 0 603 0 0 0 292 Un subgrupo de los pacientes con PAS no selectivos (relación de selectividad < 3) se evaluaron adicionalmente para determinar si su enlace se podría atribuir a la fracción de IgG. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Como en el caso de los pacientes selectivos por el dominio 1, toda la interacción con cualquier proteína inmovilizada se podría remover mediante el tratamiento del suero con la proteína G para suprimir la fracción de IgG. La fracción de IgG de los pacientes pareció reflejar el enlace observado en la muestra de suero original (Tabla 6) .

Tabla 6: Valores de Rßg BIAcore para Muestras de Plasma de Pacientes con APS "No Selectivos" Paciente Plasma total (1 :2) Plasma despojado de IgG total IgG (1 :2) (1 :4) (d2-5) (d1 -5) (d2-5) (d1-5) (d2-5) (d1 -5) 6117 386 324 0 0 79 120 6194 3197 2046 0 0 688 470 6649 553 758 0 0 127 253 6627 549 324 0 0 182 132 7013 167 241 0 0 75. 115 6611 1002 892 0 0 177 251 El presente estudio empleó la resonancia de plasmón de la superficie para localizar el anticuerpo que se enlaza al domino en una población representativa, grande de pacientes con APS (n = 106; GPL > 20) . El suero de pacientes con APS exhibió un enlace significantemente mayor a la ß2-GPI que los controles sin APS. Además, la mayoría de los sueros de los pacientes se enlazaron a la ß2GPI(Dl-5) nativa a un grado mayor que un mutante de supresión de dominios de la ß2GPI que contiene todos los dominios excepto el domino 1. Ochenta y ocho por ciento de pacientes mostraron tres o más veces especificidad por la ß2GPI que contiene el dominio 1 con relación a un mutante de supresión de dominios que carece del dominio 1. La actividad de enlace del dominio 1 en el suero de pacientes con APS se eliminó completamente mediante la supresión del componente de IgG y la actividad de enlace podría ser completamente reconstituida en la fracción de IgG. Estos resultados indican que los epítopes de enlace inmunodominantes en la mayoría de pacientes con APS se localizan al dominio de la terminal de amino de la ß2GPI.

Ejemplo 3: Prueba de los Fragmentos del dominio 1 para la inmunorreactividad para los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI Sín tesis de Hexapéptidos El aminoácido protegido con N-a-Fmoc unido a la resina Wang se suspendió dos veces en piperidina 20% en dimetilformamida (DMF) durante un tiempo de reacción total de 30 minutos para desproteger la amina. Los hexapéptidos con prolina C-terminal se hicieron con prolina no protegida unida a la resina de clorotritilo en lugar de la resina Wang para impedir la formación de dicetopiperazina. La resina se enjuagó dos veces cada una con DMF y alcohol metílico. Se adicionó a la resina una solución de N-hidroxibenzotriazol (6 equiv.) 1,3-diisopropilcarbodi mida (6 equiv.), y el segundo aminoácido (6 equiv.) más el indicador en DMF. La mezcla de reacción se agitó durante un minimo de 1.5 horas a temperatura ambiente. La resina luego se enjuagó dos veces cada una con DMF y alcohol metílico. La prueba de Kaiser (2 godas de ninhidrina 5% en alcohol etílico + 1 gota de piridina + 1 gota de fenol 80% en alcohol etílico) se realizó en una porción pequeña de la resina enjuagada para verificar la ausencia de amina libre. Los pasos de desprotección y de adición de aminoácidos se repitieron para terminar la secuencia. El aminoácido final se desprotegió como antes para producir la amina libre. Los péptidos se dividieron de la resina con una solución de fenol 7.5% (en peso), etanoditiol 2.5% (en vol.), agua 5.0% (en vol.) y tioanisol 5.0% (en vol.) en ácido trifluoroacético (TFA). La mezcla se agitó durante un minimo de tres horas. El TFA se separó utilizando vacío y el péptido se precipitó y se lavó dos veces con éter. El sólido se disolvió en acetonitrilo/agua 1:1 para el análisis. Los péptidos se caracterizaron mediante la LCMS en una columna C18 de 1.0 x 150 mm (5 µ, 150Á) (A: TFA 0.1%, acetonitrilo 2% en agua; B: TFA 0.08%, agua 2% en acetonitrilo). El acetonitrilo y el agua se separaron bajo vacío o mediante la liofilización y los péptidos se almacenaron a 0°C. Los péptidos que mostraban actividad se rehicieron en una escala más grande y se purificaron utilizando una columna C18 (A: TFA 0.1% en agua; B: TFA 0.08% en acetonitrilo).

ELISA de Inhibición Competi tiva Las placas de microtítulo (MaxiSorpMR, Nalge Nunc International, Dinamarca) se revistieron con 50 µl de la ß2GPI recombinante de longitud completa en 10 µg/ml en bicarbonato 0.1 M, pH 9.5, se incubaron durante la noche a 4°C, se lavaron tres veces con PBS 0.15 M, pH 7.2, y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 75 µl de Leche Desgrasada en Polvo 2% (Carnation, NFDM 2%). Los inhibidores de prueba se diluyeron en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl de cada dilución a los pocilios revestidos. El anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI, purificado por afinidad se diluyó en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl de una concentración constante a los pocilios, inclusive un grupo de 11 pocilios que no tuvieron el inhibidor, los cuales actuaron como los controles positivos. Los contenidos de los pocilios se mezclaron y las placas se incubaron a 37 °C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se adicionaron 50 µl de IgG antihumano conjugada con fosfatasa alcalina, específica para la cadena gamma, (Zymed #62-8422) diluida apropiadamente en NFDM 2% y se incubaron a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de solución de substrato cromogénico de PPMP de fosfatasa alcalina y se incubaron durante 30 minutos, a temperatura ambiente. La Densidad Óptica, a 550 nm, se determinó mediante la lectura de las placas en un autolector de microplacas (Bio-Teck Instruments, modelo EL311) . El porcentaje de inhibición se determinó al dividir el DO550 obtenido en la presencia del inhibidor por el DO550 promedio obtenido de 11 pocilios sin el inhibidor y luego multiplicar por 100.

Estudios de inhibición Se sintetizaron setenta y cuatro péptidos y se seleccionaron en el ELISA de inhibición competitiva. En resumen, los péptidos ''crudos', esto es, éstos no fueron purificados, se seleccionaron en una dilución de 1:2 contra tres anticuerpos anti-cardiolipinas purificados por afinidad. Los polipéptidos que fueron positivos, en una dilución de 1:2, luego se volvieron a seleccionar en diluciones dobles, adicionales. Los veintiocho péptidos, que se inhibieron en una dilución alta, se volvieron a sintetizar y se purificaron. Estos polipéptidos purificados luego se sometieron a un ensayo en el ensayo de inhibición competitiva. La ß2GPI recombinante también se sometió a un ensayo como un control positivo.

Los resultados, mostrados en la Figura 9, muestran que algunos de los péptidos pueden inhibir el enlace de los anticuerpos anti-cardiolipinas del enlace a la ß2GPI. La mayoría de los péptidos probados no se inhibieron, confiriendo de esta manera un grado de especificidad para aquellos que no se inhiben. Todos excepto dos de los péptidos positivos se agrupan alrededor de los dos conjuntos de cisteínas unidas al disulfuro presentes en el dominio 1. Los dos péptidos que no son de este modo agrupados también son los más pobres en la inhibición. Estas cisteínas unidas al disulfuro pueden crear estructuras que son reconocidas por los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de la ß2GPI.

Ejemplo 4: Datos de la mutagénesis y el microanálisis en un recipiente para determinar los residuos de aminoácidos críticos en el domino 1 para el enlace al anticuerpo anti osfolipido dependiente de la ß2GPI PCR propensa a l error La PCR propensa al error se llevó a cabo como sigue: El domino 1 de la ß2GPI de humano se amplificó mediante la PCR bajo condiciones que aumentan el coeficiente de errores de la polimerasa Taq. Los cebadores fueron tales que los aminoácidos 1-64 se amplificaron. Se incorporó un sitio de restricción Sfc 1 como parte del aminoácido 1. En el extremo 3' se incorporó un sitio de restricción Sal 1 después del aminoácido 64. La reacción PCR se hizo como se describió por Leung y colaboradores (1989) Techni que 1:11, utilizando MnCl2 0.25M. El producto de la PCR se digirió con el Sfc 1 y el Sal 1 y se clonó en ft-tet-D0G2 que había sido digerido con Apal 1 y Sal 1. Esto coloca el dominio 1 en la terminación N de pIII inmediatamente después de la secuencia de señales pIII. La reacción de ligación se electroporó en E . coli K91. El bacteriófago se recolectó y se tituló por métodos normales. Los clones de bacteriófagos resultantes se sometieron a un ensayo utilizando una técnica de microanálisis en un recipiente .

Macroanálisis en un recipiente Las placas del tipo 2 inmulon se revistieron con proteína G. La proteína G se preparó en 5 µg/mL en NaHC03 0.1 M, y se adicionaron 100 µL por pocilio a los pocilios de las placas de microtitulación y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de descargar el exceso de la solución de proteína G de las placas, cada pocilio se bloqueó con 200 µL de 2YT durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación en una plataforma de oscilación. La solución salina amortiguada con Tris, pH 7.4/Tween 20 0.5% (TBS/Tween) , se utilizó con una lavador de placas automático para lavar los pocilios 4 veces con 200 µL. Se adicionaron cien µL de antifosfolípido dependiente de la ß2GPI de humano 6626, 6501, 6701, antifosfolípido dependiente de la ß2GPI de conejo, o IgG normal de control, diluido en 2.5 µg/mL con 2YT, a los pocilios lavados. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma de rotación. Los bacteriófagos a ser sometidos a prueba mediante el micrcanálisis en un recipiente se obtuvieron de las placas de agar generadas por la biotratamiento en un recipiente. Cada clon para ser sometido a prueba se transfirió utilizando mondadientes estériles a un pocilio separado de una placa de microtitulación de 96 pocilios, de fondo redondo (Corning, Corning, NY) que contenía 200 µL de 2YT/Tet por pocilio y se cultivó durante la noche a 30°C. Después de la incubación durante la noche, los cultivos de bacteriófagos se centrifugaron utilizando un soporte de placas de microtitulación a 1300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes constituyeron la fuente de bacteriófagos "puros". Los bacteriófagos puros se diluyeron 1:100-1:1000 y se adicionaron 100 µL a la placa que contenía el anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI enlazado a la proteína G-6501 y la IgG normal preparada como se describe anteriormente. La incubación de los bacteriófagos diluidos con el anticuerpo aPL o IgG de control se llevó a cabo durante 2 horas a temperatura ambiente en un dispositivo rotador, plano. Después de 9 lavados con TBS/Tween en un lavador de placas automatizado, los bacteriófagos enlazados a la IgG se eluyeron con 20 µl de HCl 0.2 N-glicina/BSA 0.1%, pH 2.2. La incubación de la elución se continuó durante 10 minutos a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se preparó una nueva placa de microtitulación Corning que contenía 20 µL de E . coli recientemente recolectada por pocilio y se mantuvo fria. Se adicionaron ciento cuarenta µL de Tris 29 mM a la placa que contenía los eluatos de bacteriófagos a fin de neutralizar el pH, después de lo cual se transfirieron 20 µL de suspensión de bacteriófagos de cada pocilio a los pocilios correspondientes en la placa que contenia E . coli recolectada. Después de una incubación de 10 minutos a 37°C, se adicionaron 200 µL de 2YT y la incubación se llevó a cabo 30 minutos adicionales a 37°C. Utilizando pipeteadores de canales múltiples, se colocaron manchas de 8 µL de cada pocilio en una placa grande de agar de 2TY/Tet mientras que retenía el patrón original de 8 x 12 pocilios y la orientación de la última placa de microtitulación. Después de permitir que las manchas se secaran durante 30 minutos, la placa se incubó durante la noche a 30°C. Al siguiente día, las colonias se registraron semicuatitativamente de 0 a 4+, con 0 que simboliza <10 colonias; 1+ = 10.30; 2+ = 30 colonias 70% confluentes; 3+ = 70%-90% confluentes; 4 + = confluentes. Los resultados se muestran en las Tablas 7A y 7B. Para la Tabla 7A, la ß2GPI anti-humano de conejo se realizó en dos ocasiones separadas. Las mutaciones se listan con el aminoácido original, el número de posición, y la identidad del aminoácido en esa posición en el mutante. Por ejemplo, el S31F indica que el Ser en la posición 31 fué mutado a un Phe. El dominio no mutado 1 tiene un registro de 3+, mientras que 'los bacteriófagos del dominio 5 dieron un registro de -. Las mutaciones inactivas no se muestran. Los clones inician en la terminación N y van hacia la terminación C. La Tabla 7B representa una expansión del análisis mutacional, que muestra los mutantes adicionales sometidos a prueba contra los anticuerpos adicionales. Los cuatro clones de bacteriófagos, finales tienen mutaciones representadas por un asterisco, que indica que los bacteriófagos tienen múltiples mutaciones (3A4; D8A; S13T; 3F123; L10I, P17Q, Y22C; 3G1:R2W; S38T; 4D1.-N56T, R63G) . Los resultados indican, inter alia (ver posteriormente) , que (a) el ensayo es consistente; (b) no todos los anticuerpos reaccionan igual; (c) la diferentes mutaciones en la misma posición pueden tener efectos muy diferentes (ver Met 42, por ejemplo). Los resultados totales están representados en el modelo de la estructura terciaria del dominio 1 mostrado en la Figura 3. Parece que los aminoácidos 55-58 (ile, asn, leu), los aminoácidos 40-45 (incluyendo los aminoácidos 43-45, específicamente, arg, Lys, phe) y el aminoácido 19 (lys) son importantes para el enlace a un anticuerpo aCL.

Tabla 7A Microanálisis en recipiente de bacteriófagos del domino 1 , mutantes registro del µrecipiente Clon Mutación 6626 6501 6701 Conejo 2D9 T3P 2 3 3 2 A4 D8A 3 3,3 A10 D8G 2 2,2 H9 F12L D1 T14A 3,3 B6 K19E ND 1 1 2,3 C4 K19L ~ ND ND 1 E3 T20L 2 ND ND 4 2A1 R20S 3 3 3 3 H1 K33E ND ND 2B2 V37E B11 M42K 3 3 3 3,4 2D4 M42T 1 2 3 3 A6 M42V ND 2 2 3,3 C1 R43G 1 ND ND 3 A1 R43T 3 2 __ 2,3 D12 F45L 3 C3 F45S ND ND 4 A7 L52Q 3,3 2C3 P54S D11 N56D ND 2,3 B1 N56T 3 2,3 B2 L58N ND ND Tabla 7 Microanálisis en recipiente de bacterió agos del domino 1, mutantes co Tf CM CO O CM Tf Tf O co Tf CM Tf Tf - CM O Tf O CO Tf CM O CO - CO Tf O o Tf CM Tf Tf - Tf Tf O CO o O CO *- Tf Tf O co Tf CM CM CO "r- *- CM Tf O co Tf *- CM co t— - Tf Tf O Tf Tf Tf •^r Tf Tf O Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf Tf O Tf M OT CM Tf C O ? O LL d Q CO m < CO I O o Tf o e o Q o Ejemplo 5: Polipéptido (s) de la ß2GPI del dominio 1 conjugados a las plataformas Síntesis de la Plataforma Tetravalente BA/PIZ/IDA/TEG (BA/PITG) Compuesto 1; A una solución de 1.02 g (4.37 mmoles) de ácido N- (t-butoxicarbonil) -aminodiacétics (compuesto 5_ en la patente norteamericana No. 5,552,391, Chemically-Defined Non-Polymeric Valency Platform Molecules and Conjugates Thereof) y 1.01 g (8.75 mmoles) de N-hidroxisuccinimida en 50 mL de THF seco, se enfrió a 0°C, se adicionaron 2.26 g (10.94 mmoles) de diciciohexilcarbodiimida. La mezcla se agitó durante 16 horas permitiendo que se calentara / lentamente a temperatura ambiente, y se adicionó una solución de 2.22 g (10.1 mmoles) de mono-CBZ-piperazina en 25 mL de THF a la mezcla seguido por 1.22 mL (887 mg, 8.75 mmoles) de Et3N. La mezcla se agitó durante 7 horas a temperatura ambiente, y se filtró. El producto filtrado se concentró y el residuo se disolvió en 125 mL de EtOAc y se agitó con porciones de 2 X 125 mL de HCl ÍN, 125 L de solución de NaHC03 saturada, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar 2.39 de un sólido espeso. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (95/5 CH2Cl2/MeOH) dio 1.85 g (66%) del compuesto 1.

Compuesto 2: A una solución de 1.74 g (2.74 mmoles) del compuesto 1_ en 10 mL de CH2C12 se adicionaron 10 mL de ácido trifluoroacético, y la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La mezcla se concentró, y la residuo se disolvió en 5 mL de CH2C12. La mezcla se enfrió a 0°C y se adicionaron 100 mL de NaHC03 saturado. La mezcla luego se extrajo con cuatro porciones de 100 mL de CH2C12. Las capas de CH2C12 se combinaron, se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron para dar 1.46 g (99%) del compuesto 2_ como un sólido higroscópico, espeso el cual se utilizó directamente en el siguiente paso. Compuesto 3: A una solución de 0.7 g (1.3 mmoles) del compuesto 2_ y 226 uL (168 mg, 1.30 mmoles) de diisopropiletilamina a 0°C se adicionó una solución de 127 uL de bis-cloroformiato de trietilenglicol en 4 mL de CH2C1 , y la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La mezcla se dividió entre 80 mL de CH2C12 y 80 mL de HCl 1 N. La capa de CH2C12 se lavó con dos porciones de 80 mL de agua, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró para dar 736 mg (93%) del compuesto 3_ como un sólido cristalino. Compuesto 5: El compuesto 3^ (61 mg, 0.48 mmoles) se disolvió en 3 mL de HBr 30%/HOAc y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, tiempo en el cual se adicionaron 5 mL de Et20. La mezcla se colocó en un congelador durante 1 hora y se centrifugó. La pelotilla resultante se lavó con Et20 y se secó para dar la sal de tetrahidrobromuro 4_ la cual se disolvió en 1 mL de H20. A la mezcla se adicionaron 49 mg (0.58 mmoles) de NaHC03 y 3 mL de dioxano. Se adiciona más NaHC03, si es necesario, para hacer básica la mezcla. La mezcla se enfría a 0°C y se adicionan 748 mg (2.89 mmoles) de anhídrido bromoacético . La mezcla se agita durante 2 horas y se divide entre 20 mL de H2S04 1N y 20 mL de CH2Cl2/MeOH 80/20. La capa orgánica se seca (Na2S04) , se filtra y se concentra para dar el compuesto 5_ crudo el cual se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice (CH2Cl2/MeOH) para dar el compuesto 5.

TFA CH2CI2 HBr ácido acético Síntesis del compuesto del conjugado de la plataforma tetramérica de AOA/PITG y el polipéptido del domino 1 de la ß2GPI Transaminación del Dominio 1 (TA/D1) : Se roció agua y amortiguador de acetato de sodio con helio antes del uso. El dominio 1 (10.55 mg, 1.49 µmoles) se disolvió en 0.5 mL de H20 en un tubo de polipropileno, y se adicionaron 4.0 mL de amortiguador de NaOAc 2 M, pH 5.5. Se adicionó a la mezcla una solución de 3.73 mg (14.9 µmoles) de CuS04 en 0.5 mL de H20, seguido por una solución de 2.75 mg (29.9 µmoles) de ácido glicoxílico en 0.5 mL de amortiguador de NaOAc 2 M, pH 5.5. La mezcla se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno y se agitó suavemente durante 18 horas, tiempo en el cual la reacción pareció completarse mediante la CLAP analítica utilizando una columna de difenilo de 4.6 mm X 250 mm, 300 Á (Vydac) con la detección a 280 nm (1 mL/min; gradiente 25%-45% B, 0-20 minutos, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN). Los tiempos de retención aproximados son como sigue: D, 13.2 minutos; TA/D1, 13.7 minutos; TA oxidado/Di, 13.4 minutos). La mezcla se diluyó a un volumen de 20 mL con H20, se filtró y se purificó mediante la CLAP (22.4 mm X 250 mm, 300Á, 10 µm, columna de difenilo (Vydac, Hesperia, CA) (12 mL/min; gradiente 25%-40% de B, 0-40 min, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA O.I/CH3CN). Las fracciones que contienen TA puro/Di, como fué evidente mediante la CLAP analítica, se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 5.0 (48%) de TA/D1.

DI = H2N-GRTCPKPDD PFSTWP KT FYEPGEEITY SCKPGYVSRG GMRKFICPLT GLWPINTLKC TPR-C02H ( SEC I D NO : 28 ) Dominio 1 transamina o (TA D 1 } TA/D1 = glioxil-HN-RTCPKPDDL PFSTWPLKT FYEPGEEITY SCKPGYVSRG GMRKFICPLT GL PINTLKC TPR-C02H (SEC ID NO: 29) Síntesis de la plataforma de aminooxiacetilo (AOA) /PITG 4-Nitrofenil-N- (ter-butiloxicarbonil) aminooxiacetato, 2 ' : A una solución agitada de 1.5 g (7.85 mmoles) de ácido N-(ter-butiloxicarbonil ) aminooxiacético (Aldrich Chemical Co., San Luis, MO) , compuesto 1 > en 35 mL de THF anhidro a 0°C se adicionó 1.09 g (7.85 mmoles) de 4-nitrofenol seguido por 1.62 g (7.85 mmoles) de DCC. La mezcla se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno durante 0.5 horas a 0°C y a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se filtró para separar la diciclohexilurea y el producto filtrado se concentró y se purificó mediante la cromatografía de gel de sílice (CHCl3/alcohol isopropílico 95/5) para dar 2.30 g (94%) del compuesto 2 ' como un sólido color blanco: RMN 1H (CDC13) d 1.51 (s, 9H), 4.73 (s, 2H) , 7.36 (d, 2H) , 7.73 (s, 1H) , 8.32 (d, 2H) .

Síntesis de la plataforma AOA/PITG protegida con BOC, 4 ' : El compuesto 3_ (300 mg, 0.235 mmoles), se trató con 1.5 mL de solución 30% de HBr en ácido acético durante 30 minutos. La sal de HBr- de la tetra-amina resultante se precipitó mediante la adición de éter dietílico. La mezcla se centrifugó y el sobrenadante se separó y se desechó. El sólido restante se lavó con éter, se secó bajo vacío, y se disolvió en 9 mL de DMF.

A la mezcla resultante se adicionaron 294 µL (1.69 mmoles) de diisopropiletilamina seguido por una solución de 410 mg (1.31 mmoles) del compuesto 2 en 3 mL de DMF. La mezcla se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno durante 4 horas y se dividió entre CHCl3/MeOH 15/1 y salmuera. La capa acuosa se lavó dos veces con CHCla/MeOH 15/1, y las capas orgánicas, combinadas se secaron (Na2S04) y se concentraron para dar 680 mg de un aceite. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo de 95/5 a 75/25 de CHCl3/MeOH) dio 215 mg (65%) del compuesto 4/ como un sólido color blanco: RMN XH (CDC13) d 1.49 (s, 36H) , 3.40-3.73 (m, 40H), 4.24 (m, 12H), 4.59 (singuletes superpuestos, 8H) , 8.21 (s, 2H) , 8.32 (s, 2H) . Plataforma AOA/PITG, Compuesto 5' : Se burbujeó gas de HCl a través de una solución agitada de 67 mg (.047 mmoles) del compuesto 4' en EtOAc/CHCl3/MeOH 10/1/1 durante 15 minutos, y la mezcla se agitó durante 15 minutos adicionales. La mezcla se concentró bajo vacío y se mantuvo bajo vacío durante 16 horas para proporcionar 43 mg (78%) del compuesto 5' como un sólido color blanco: RMN H (DMSO) d 3.33-3.67 (m, 40H), 4.08 (m, 4H) , 4.18 (s, 8H) , 4.90 (s, 8H) ; espectro de masas (EM) m/z calculado para C4oH69N?4O?8 : 1033. Encontrado: 1033.

Síntesis del Compuesto del Conjugado del DI Tetravalente 44: El TA/Dl (0.90 mg, 1.28 x 10"7 moles) se disolvió en 250 µL de amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.60, en un tubo de polipropileno. A la mezcla se adicionaron 16.6 µL (18.9 µg, 1.60 x 10~8 moles) de una solución de 0.97 µmoles/mL de la plataforma AOA/PITG, compuesto 5 , en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.60. La mezcla se agitó suavemente bajo nitrógeno durante 6 días, tiempo en el cual la reacción pareció completarse mediante la CLAP analítica utilizando una columna de difenilo de 4.6 mm X 250 mm, 300 Á, 5 µm, (Vydac) con detección a 280 nm (1 mL/min; gradiente 25%-45% de B, 0-20 min, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN). Los tiempos de retención aproximados son como sigue: TA/Dl, 13.7 min; compuesto 44, 17.2 min). La mezcla se diluyó con agua/acetonitrilo 95/5 a un volumen de 1 mL y se purificó mediante la CLAP (10 mm X 250 mm, 300 Á, 5 µm, columna de difenilo (Vydac) (3 mL/min; gradiente 25%-45% de B, 0-40 min, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN). Las fracciones que contenían el compuesto puro del conjugado 44, como evidencia mediance la CLAP analítica, se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 0.4 mg (25%) del compuesto 44: el espectro de masas (ES, m/z promedio) se calculó para C?32oH2o32N33803 oS2o : 29, 198. Encontrado: 29,218.

TA D1-co2H acetato de sodio 100 mM pH 4.6 Síntesis del conjugado de la Plataforma Tetramérica AOTEG/DEA/DEG y el polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI 2- [2- (2-yodoetoxi) etoxi] etanol, 7 : El 2-[2-(2-cloroetoxi) etoxi] etanol (12.66 g, 75.1 mmoles) y el yoduro de sodio (33.77 g, 225.3 mmoles) se disolvieron en 250 L de acetona, ün condensador de reflujo se unió al matraz, y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 horas. Cuando se enfrió, la mezcla se concentró, y el residuo se agitó con 400 mL de CH2C12 y una mezcla de 300 mL de agua y 100 mL de solución de bisulfito de sodio acuoso, saturado. La capa acuosa se lavó dos veces con porciones de 400 mL de CH2C12, y las capas combinadas de CH2C12 se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron para proporcionar 18.3 g (94%) del compuesto 7_ como un aceite color amarillo claro el cual se . utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional: RMN XH (CDC13) d 2.43 (s amplio, 1H) , 3.28 (t, 2H), 3.61 (m, 2H) , 3.68 (s, 4H) , 3.78 (m, 4H) ; espectro de masas (EM) m/z calculado para C6H?303INa (M+Na)+: 283.0. Encontrado: 283.0. 2- [2- (2-N- ( ter-butiloxicarbonil ) aminooxietoxi) etoxi] etanol, 8: A 5.85 g (1.50 mmoles) del 2-[2-(2-yodoetoxi) etoxi] etanol, compuesto 1_, se adicionaron 2.00 g (1.00 mmoles) de N- (ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co . ) y 3.36 mL (3.42 g, 1.50 mmoles) de DBU. La mezcla se agitó para dar un liquido viscoso que llegó a estar caliente al tacto y se colocó en un baño de aceite a 55°C durante 18 horas, lo que dio por resultado la formación de un producto precipitado color blanco el cual solidificó la mezcla. La mezcla se disolvió en 20 mL de CH2C12 y se adicionó a 500 mL del EtOAc agitado, lo que da por resultado la formación de un producto precipitado el cual se separó mediante la filtración, y el producto filtrado se concentró para dar un aceite color café-amarillo. La purificación mediante la cromatografía con evaporación instantánea (acetona 50%/hexano) para dar 2.61 g (67%) del compuesto 8_ como un aceite: RMN 1H (CDC13) d 1.50 (s, 9H) , 3.65 (t, 2H) , 3.70 (s amplio, 4H) , 3.76 (m, 4H) , 4.06 (t, 2H) , 7.83 (s amplio, 1H) ; RMN 13C (CDCI3) d 28.0, 61.3, 68.9, 70.1, 70.3, 72.5, 72.6, 75.1, 81.2, 157.1.

Bromuro de 2- [2- (2-N- (ter-butiloxicarbonil) aminooxietoxi) etoxi] etilo, compuesto 9: Se adicionó gota a gota bromo (aproximadamente 0.283 mmoles) a una solución de 50 mg (0.188 mmoles) del compuesto 8_, 74 mg (0.283 mmoles) de trifenilfosfina, y 31 µL (30 mg, 0.377 mmoles) de piridina en 2 mL de CH2C12 hasta que persistió un color naranja. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0.5 horas y se adicionó 1 mL de una solución saturada de bisulfito de sodio al bromo en exceso, frío. La mezcla luego se dividió entre 10 mL de H20 y 2 x 15 mL de EtOAc. Las capas orgánicas, combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (Na2S04) , se filtraron y se concentraron. La purificación del residuo mediante la cromatografía de gel de sílice (acetona/hexano 35/65) proporcionó 54 mg del compuesto 9_ como un aceite: RMN XH (CDCI3) d 1.49 (s, 9H) , 3.48 (t, 2H) , 3.68 (s, 4H), 3.73 (m, 2H) , 3.84 (t, 2H) , 4.03 (t, 2H) , 7.50 (s, 1H) ; RMN 13C (CDC13) d 28.3, 30.4, 69.4, 70.6 (dos señales), 71.3, 75.5, 81.7, 156.9. 2- [2- (2-N- (ter-butiloxicarbonil) aminooxietoxi ) etoxi] etilazida, 10: Síntesis del compuesto 9: Una solución de 100 mg (0.305 mmoles) del compuesto 9_ en 0.25 mL de DMF anhidro se adicionó a una solución de 159 mg (2.44 mmoles) de azida de sodio en 0.5 mL de DMF anhidro. Se utilizaron 0.25 mL adicionales del DMF para enjuagar el compuesto 9^ residual en la mezcla de reacción, y la mezcla se calentó a 115°C durante 3 horas. Cuando se enfrió, la mezcla se dividió entre 3 mL de H20 y 4 x 3 mL de CH2C12. Las capas orgánicas, combinadas se lavaron con 10 mL de H20, se secaron (Na2S04) , se filtraron, y se concentraron para proporcionar un aceite color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (acetona/hexano 35/65) dio 67 mg (76%) del compuesto 10 como un aceite: RMN 1 (CDC13) d 1.47 (s, 9H) , 3.41 (t, 2H) , 3.69 (s amplio, 4H) , 3.73 (m, 4H) , 4.03 (t, 2H) , 7.50 (s, 1H) ; RMN 13C (CDC13) d 28.1, 50.5, 69.1, 70.1, 70.4 (dos señales), 75.2, 81.3, 156.7. Síntesis del compuesto 10 a partir del compuesto 13: A una solución de 258 mg (0.69 mmoles) del compuesto 1_3 en 5 mL de DMF bajo una atmósfera de nitrógeno se adicionaron 358 mg (5.50 mmoles) de azida de sodio. La mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente, se adicionaron 100 mL de agua, y la mezcla se extrajo con 3 x 50 mL de EtOAc. Las capas de EtOAc se combinaron y se lavaron con 50 mL de agua, se secaron (Na2S04) , se filtraron y se concentraron para proporcionar 294 mg de un aceite incoloro. La purificación mediante la cromatografia de gel de silice (acetona/hexanos 30/70) proporcionó el compuesto 1_0 como un aceite incoloro. Compuesto 11: (MR-508-128) El compuesto 1_0 (1.36 g, 4.70 mmoles) y trifenilfosfina (1.48 g, 5.64 mmoles) se disolvieron en 24 mL de THF y 8 mL de H20, y ' la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se adicionaron aproximadamente 160 µL (ocho gotas) de NaOH 1 N, la mezcla se agitó durante 18 horas. La mezcla se concentró bajo vacío, y el producto concentrado se purificó mediante la cromatografía de gel de sílice (CH3CN/H20/NHOH conc. 80/8/2) para dar 1.16 g (94%) del compuesto 1_1 como un aceite color amarillo: RMN 1R (CDC13) d 1.50 (s, 9H) , 1.90 (d amplio, 2H) , 2.88 (t, 2H) , 3.56 (t, 2H) , 3.65 (m, 4H) , 3.71 (m, 2H) , 4.01 (m, 2H) . 1, 2-Bis (2-yodoetoxi) etano, compuesto 12: Una solución de 10.0 g (5.3 mmoles) de l,2-bis(2- cloroetoxi) etano (Aldrich Chemical Co.) y 16.0 g (107 mmoles) de yoduro de sodio en 110 mL de acetona se calentó a reflujo durante 18 horas. La mezcla se concentró y el residuo se trituró con CHC13 para disolver el producto mientras que las sales permanecieron sin disolver. La mezcla se filtró, y le producto filtrado se concentró para dar un aceite color naranja. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo, EtOAc/hexanos 10/90 a EtOAc/hexanos 15/85) para proporcionar 17.8 g (90%) de un aceite color naranja: RMN *H (CDC13) d 3.28 (t, 4H) , 3.67 (s, 4H), 3.7C (t, 4H) ; RMN 13C (CDC13) d 3.6, 70.5, 72.2. Compuesto 13: Se adicionó DBU (284 µL, 290 mg, 1.90 moles) a una mezcla de 266 mg (2.0 mmoles) de N-(ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co.) y 2.96 g (8.0 mmoles) del compuesto 12 , y la mezcla se tapó y se agitó hasta que fué homogénea. Después de 15 minutos, la mezcla se solidificó y se permitió reposar durante 45 minutos. A la mezcla se adicionaron 5 mL de CH2C12, y la mezcla se agitó nuevamente para disolver los solíaos. La solución resultante se adicionó a 200 mL de EtOAc. Se añadieron 50 mL adicionales de EtOAc, y la mezcla se filtró para separar los sólidos. El producto filtrado se concentró para dar un aceite el cual se dividió entre 100 mL de EtOAc y 3 x 50 mL de solución HCl ÍN. La capa de EtOAc se lavó con 2 x 50 mL de NaOH 1 N seguido por 2 x 50 mL de solución de bisulfito de sodio 5% y se concentró para proporcionar 2.6 g de aceite color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo, EtoAc/hexanos 20/80 a 45/55) dio 515 mg (69%) del compuesto 1_3_ como un sólido color amarillo: RMN 1H (CDC13) d 1.50 (s, 9H) , 3.28 (t, 2H) , 3.68 (s, 4H) , 3.72 (m, 4H) , 4.02 (t, 2H) , 7.72 (s, 1H) ; RMN 13C (CDCI3) d 2.9, 28.3, 68.9, 69.4, 70.2, 70.6, 72.0, 75.4, 81.6, 156.9. Bis-4-nitrofenilcarbonato de dietilenglicol, Compuesto 60: Se adicionó lentamente piridina (30.5 mL, 377 mmoles) a una solución a 0°C de 5.0 g (47.11 mmoles) de dietilenglicol y 23.74 g (118 mmoles) de cloroformiato de 4-nitrofenilo en 500 mL de THF. El baño de enfriamiento se separó, y la mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió nuevamente a 0°C, se acidificó con HCl 6 N y se dividió entre 400 L de HCl 1 N y 2 X 400 mL de CH2C12. Las capas orgánicas, combinadas se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron para dar 24.3 g de un sólido color blanco. La cristalización de hexanos/EtOAc dio 16.0 g (78%) del compuesto 3_7_ como un polvo color blanco: p.f. 110°C; RMN XH (CDC13) d 3.89 (t, 4H) , 4.50 (t, 4H) , 7.40 (d, 4H) , 8.26 (d, 4H) .

Compuesto 61: Se adicionó una solución de 2.5 g (5.73 mmoles) del compuesto 3_7 en 17 mL de piridina a una solución a 0°C de 1.8 g (17.2 mmoles) de dietanolamina en 3 mL de piridina. El baño de enfriamiento se separó, y la mezcla se agitó durante 5 horas a temperatura ambiente para producir el compuesto 38 , el cual no se aisló pero se utilizó como estaba en el siguiente paso. Compuesto 14: La mezcla del paso anterior se enfrió nuevamente a 0°C, se adicionaron 40 mL de CH2C12 seguido por una solución de 11.55 g (57.3 mmoles) de cloroformiato de 4-nitrofenilo en 60 mL de CH2C12, y la mezcla se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió nuevamente a 0°C, se acidificó con HCl 1 N y se dividió entre 300 mL de HCl ÍN y 2 X 200 mL de CH2C12. Las capas orgánicas, combinadas se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron para dar 13.6 g de un sólido color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (CH2Cl2/MeOH y EtOAc/hexanos) proporcionó 4.91 g (83%) del compuesto 3_9 como un sólido amorfo, pegajoso: RMN lH (CDC13) d 3.72 (m, 12H) , 4.31 (t, 4H), 4.48 (m, 8H), 7.40 (m, 8H) , 8.29 (m, 8H) .

HO — (pHJC &k — H pirid¡na/CH2Cl2 piridina /CH2CI2 61 Cl- -O- ~N°2 pir¡dina/CH2Cl2 Plataforma AOTEG/DEA/DEG protegida con BOC, Compuesto 15: Se adicionó trietilamina (157 µL, 114 mg, 1.13 mmoles) a una solución agitada de 193 mg (0.188 mmoles) del compuesto 4 (preparado como se describe anteriormente y en la patente norteamericana No. de Serie 60/111,641, presentada el 9 de Diciembre de 1998) seguido por 298 mg (1.13 mmoles) del compuesto Ll. La mezcla se dejó llegar a la temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla se enfrió a 0°C, se acidificó con HCl 1N, y se dividió entre 20 mL de HCl 1 N y 4 x 20 mL de CH2C12. Las capas orgánicas, combinadas se lavaron con solución saturada de NaHCÜ3, se secaron (MgS0 ) , se filtraron, y se concentraron para dar 279 mg de un aceite color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de silice (CH2Cl2/MeOH 97/3) proporcionó 138 mg (48%) del compuesto 5 como un aceite. RMN 1ti (CDC13) d 1.49 (s, 36H) , 3.35 (m, 8H) , 3.46-3.78 (m, 44H) , 4.04 (t, 8H) , 4.21 ( , 12H) , 5.80 (m, 4H) , 7.91 (s, 4H) ; espectro de masas (EM) m/z calculado para C62H??7N?o033 (M+H)+: 1528.8. Encontrado: 1528.5. Compuesto 1_6: El compuesto 1^ (60 mg, 39.2 µmoles) se disolvió en 10 mL de ácido trifluoroacético/CH2Cl2 1/9, y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 horas. Se utilizó una corriente suave de nitrógeno para evaporar el solvente, y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de solvente de cromatografía (NH4OH con . /H20/CH3CN 5/7.5/87.5) el cual se utilizó para cargar la mezcla en una columna de gel de sílice. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo, NH4OH con/H20/CH3CN 5/7.5/87.5 a 5/10/85) proporcionó 36 mg (82%) del compuesto 1_6 como un aceite incoloro: RMN XH (CDC13) d 3.37 (m, 8H) , 3.58 (m, 16H) , 3.67 (s, 16H) , 3.71 (m, 12H) , 3.86 (m, 8H) , 4.17-4.29 (m, 12H) , 4.93 (d amplio, 8H) , 5.91 (m, 4H) ; RMN 13C (CDC13) d 40.9, 47.7, 48.2, 62.9, 64.7, 69.4, 69.6, 70.2, 70.3, 70.5, 74.8, 156.6; espectro de masas (EM) m/z calculado para C 2H85N10O25 (M+H): 1129. Encontrado: 1129. Para el propósito deverificar la pureza mediante la CLAP analítica, la oxima de tetra-acetona se preparó como sigue. El compuesto 1_6 (0.38 mg, 0.34 µmoles) se disolvió en 240 µL de amortiguador de NaOAc 0.1 M en un frasquito de muestra de la CLAP. A la solución se adicionaron 10 µl de una solución de 49 µL de acetona en 2.0 mL de amortiguador de NaOAc 0.1M. La mezcla se dejó reposar durante 1 hora y se analizó una alícuota mediante la CLAP (columna C?8 de 4.6 mm, 1 mL/min, detección a 210 nm, gradiente, 10-60% de B durante 20 minutos, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN, tR = 19); espectro de masas del eluyente colectado (EM) m/z calculado para C5 H?o_N?o025 (M+H) : 1289. Encontrado 1289.

Acetona reflujo aíCBfCHjOhH ? KCHzCHjOfcH 6 2 ?a?3 BOC?HOH DMF .(CHzCHzOfcCHzCHjl BocH?O(CH.CH20)2CH2CH2l *~ BocH OCCKfeCHjOfeCHzCHj?a 12 8U 13 !° Pha 3 1 THF H20 BocH?OCCHjCMjOfeCH?CHb?Hz 11 Síntesis del Compuesto del Conjugado DI Tetravalente 45: El TA/Dl (5.20 mg, 737 x 10"7 moles) se disolvió en 2.0 ír.L de amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.60, rociado con He en un tubo de polipropileno. A la mezcla se adicionó 15.07 µL (139 µg, 1.23 x 10"7 moles) de una solución de 8.147 µmoles/mL de la plataforma AOTEG/DEA/DEG, compuesto 1_6, en un amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.60. La mezcla se agitó suavemente bajo nitrógeno durante 23 horas, tiempo en el cual la reacción pareció completase mediante la CLAP analítica utilizando una columna de difenilo de 4.6 mm X 250 mm, 300 Á, 5 µm, (Vydac) con la detección a 280 nm (1 mL/min; gradiente 25%-45% de B, 0-20 min, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN). Los tiempos de retención aproximados son como sigue: TA/Dl, 13.7 min; compuesto del conjugado 45, 17.2 minutos). La mezcla se diluyó con agua a un volumen de 5 mL y se purificó mediante la CLAP (10 mm X 250 mm, 300 Á, 5 µm, columna de difenilo (Vydac) (3 mL/min; gradiente 25%-45% de B, 0-40 min, A = TFA 0.1%/H2O, B = TFA 0.1%/CH3CN). Las fracciones que contenían el compuesto puro del conjugado 45, como evidencia mediante la CLAP analítica, se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 1.73 mg (48%) del compuesto del conjugado 45: espectro de masas (ES, m/z promedio) calculado para Ci322H2048 334?377S2o; 29,294. Encontrado: 29,294.

Compuesto 16, Plataforma AOTEG/DEA DEG acetato de sodio 100 mM pH 4.6 45 Preparación del Conjugado de DI Tetravalente por medio de la Alquilación del Quinto Cys con una Plataforma de Haluro de Alquilo, Compuesto 65: El dominio 1 tiene cuatro cisteínas las cuales están en forma oxidada, y el dominio 1 apropiadamente plegado tiene dos enlaces de disulfuro. Una quinta cisteína puede ser incluida en cualquier posición en el exterior de la terminal N o la terminal C de las cisteínas nativas. En este ejemplo, se incluye una quinta cisteína la cual es nativa al segundo dominio de la ß2GPI. La quinta cisteína se puede utilizar, en virtud de su grupo de sulfhidrilo libre, para reaccionar con una plataforma designada para reaccionar con los grupos sulfhidrilo. Una plataforma de esta clase es una plataforma de haloacetilo tal como el compuesto 23. El DI de la quinta Cys (cuatro equivalentes) se disuelve en un amortiguador de borato de sodio 100 mM, pH 8.0, rociado con helio. La solución se mantiene bajo una atmósfera de nitrógeno, y se adiciona una solución de la plataforma bromoacetilada, compuesto 23^ (un equivalente) . La mezcla se agita hasta que la reacción está completa, y la purificación de la mezcla mediante la CLAP preparativa proporciona el conjugado tetravalente, compuesto 65.

Dominio 1 de la quinta Cys de la P2GPI (HS/D1) HS D1=D1 de la quinta Cys = H2N-GRTCPKPDDL PFSTWPLKT FYEPGEEITY SCKPGYVSRG GMRKFICPLT GL PINTLKC TPRVC(SH)-co2H (SEC ID NO:30) Síntesis de la Plataforma AOTEG/PIZ/DEA/DEG, Compuesto 17: La piridina (610 µL, 596 mg, 7.54 mmoles) se adicionó lentamente a una solución agitada de 500 mg (1.88 mmoles) del compuesto 8_ y 760 mg (3.77 mmoles) de cloroformiato de p-nitrofenilo en 14 mL de CH2C12, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se enfrió a 0°C y se acidificó con HCl acuoso 1N. La mezcla resultante se dividió entre 100 mL de HCl acuoso 1 N y 3 x 100 mL de CH2C12. Las capas orgánicas, combinadas se secaron (MgS0 ) , se filtraron, y se concentraron para dar 1.05 g de un sólido pegajoso. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (hexanos/EtOAc 6/4) dio 505 mg (62%) del compuesto 1_7_ como un aceite color ligeramente amarillo: RMN 1H (CDC13) d 1.47 (s, 9H) , 3.67-3.78 (m, 6H) , 3.80 (m, 2H) , 4.02 (m, 2H) , 4.48 (m, 2H) , 7.40 (d, 2H)', 7.50 (s, 1H) , 8.29 (d, 2H) ; espectro de masas (EM) m/z calculado para C?8H26N2O?oNa (M+Na) : 453.1. Encontrado: 453.0. Plataforma OATEG/PIZ/DEA/DEG protegida con BOC, compuesto 19: A una solución del compuesto 1_8_ (preparado como se describe en la patente norteamericana No. de Serie 60/111,641, presentada el 9 de Diciembre de 1998) en una mezcla de bicarbonato de sodio acuoso y dioxano se adiciona una solución de cuatro equivalentes del compuesto 17 en dioxano. En la terminación de la reacción, la mezcla se dividió entre agua y CH2C12. La capa de CH2C12 se concentra, se seca y se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 19. Plataforma AOTEG/PIZ/DEA/DEG, compuesto 20: Los grupos protectores de BOC se separan del compuesto 19 de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 1_6 para proporcionar el ccrrpuesto 20.

Síntesis de la Plataforma OATEG/SA/AHAB/TEG, S-acetil-2- [2- (2-N-ter-butiloxicarbonilaminooxietioxi) etoxi] -etilmercaptano, Compuesto 21a: A una solución de 500 mg (1.52 mmoles) del compuesto 9ja en 30 mL de acetona se adicionaron 191 mg (1.68 mmoles) de tioacetato de potasio (Aldrich Chemical Co.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, y el producto precipitado, resultante se separó por filtración. El producto filtrado se concentró y se dividió entre 300 mL de EtOAc y 2 x 80 mL de salmuera. La capa de EtOAc se secó (NaS04) , se filtró y se concentró para dar 460 mg (93%) del compuesto 21a como un aceite color café claro: RMN 1H (CDC13) d 1.48 (s, 9H) , 2.35 (s, 3H) , 3.12 (t, 2H) , 3.61 (t, 2H) , 3.64 (m, 4H) , 3.73 (m, 2H) , 4.02 (m, 2H) , 5.52 (s, 1H) ; RMN 13C (CDC13) d 28.3, 28.8, 30.6, 69.3, 69.8, 70.2, 70.5, 75.3, 81.5, 156.8, 195.3. 2- [2- (2-N-ter-butiloxicarbonilaminooxietioxi) etoxi] etilmercaptano, Compuesto 22a: El compuesto 21a se trató con una solución rociada con nitrógeno de NH4OH 6N/CH3CN 4/1 en una atmósfera de nitrógeno durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se concentró bajo vacío para proporcionar el compuesto 22a el cual se puede utilizar sin purificación adicional.

Plataforma AOTEG/SA/AHAB/TEG protegida con BOC, 24a: El compuesto 2^ (preparado como se describe; Jones y colaboradores, J. Med. Chem. 1995, 3_8_, 2138-2144) se adiciona a una solución de cuatro equivalentes del compuesto 22a en H20/CH3CN 10/90 rociada con nitrógeno. A la solución resultante se adicionan cuatro equivalentes de diisopropiletilamina. En la terminación de la reacción, la mezcla se divide entre agua y CH2C12. La capa de CH2C12 se concentra, se seca y se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 24a. Plataforma AOTEG/SA/AHAB/TEG, 25a: Los grupos protectores de BOC se separan del compuesto 24a de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 1_6 para proporcionar el compuesto 25a.

Síntesis de la Plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG, l-yodo-6- (N-ter-butiloxicarbonil) aminooxihexano, compuesto 9b: A una mezcla heterogénea de 140 mg (1.05 mmoles) de N- (ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co . ) y 658 µL (1.35 mg, 4.0 mmoles) del compuesto 12^ se adicionaron 149 µL (152 mg, 1.0 mmoles) de DBU. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 segundos, tiempo en el cual la mezcla de reacción se solidificó. La masa sólida se dejó reposar durante la noche y se disolvió en 50 mL de CH2C12. La solución se lavó con 2 x 25 mL de NaOH 1 N y 3 x 25 mL de HCl 1 N. Las capas acuosas, básicas, combinadas se extrajeron con 25 mL de CH2C12, y las capas acuosas, acídicas, combinadas se extrajeron con 25 mL de CH2C12. Las capas de CH2C12 combinadas se secaron (Na2S04) , se filtraron y se concentraron para dar un aceite color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo; EtOAc/hexanos/MeOH 1/99/0.1 a 15/85/0.1) proporcionó 216 mg (68%) del compuesto ^b como un aceite color amarillo: RMN 1H (CDC13) d 1.40 (m, 4H) , 1.48 (s, 9H) , 1.62 (m, 2H) , 1.83 (m, 2H) , 3.20 (t, 2H) , 3.84 (t, 2H) , 7.10 (s, 1H) .

S-acetil-6- (N-ter-butiloxicarbonil) aminooxihexan-1-tiol, Compuesto 21b: El compuesto 9b_ (209 mg (0.61 mmoles) se adicionó a una solución de tioacetato de potasio en 15 mL de acetona y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La acetona se separó bajo vacío, y el residuo se dividió entre 50 mL de CH2C12 y 3 x 25 mL de NaOH ÍN. La capa de CH2C12 se secó (Na2S0 ), se filtró y se concentró para dar un aceite color café. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (EtOAc/hexanos 15/85) proporcionó 166 mg (94%) del compuesto 21b como un aceite incoloro: RMN 1H (CDC13) d 1.39 (m, 4H) , 1.48 (s, 9H), 1.59 (m, 4H), 2.32 (s, 3H) , 2.86 (t, 2H) , 3.82 (t, 2H) , 7.10 (s, 1H) . 6- (N-ter-butiloxicarbonil) aminooxihexan-1-tiol, Compuesto 22b: Una muestra purificada del 22b se preparó como sigue. El compuesto 21b (50 mg, 172 µmoles) y 22 µL (17.4 mg, 85.8 µmoles) de tri-n-butilfosfina se colocó bajo nitrógeno y se adicionaron 2 mL de una solución 1 M rociada con nitrógeno de NaOH en MeOH a la mezcla. La mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente, y se adicionaron 172 µL (180 mg, 3 mmoles) de ácido trifluoroacético. La mezcla se dividió entre 25 mL de EtOAc y 3 x 25 mL de HCl ÍN. Las capas acuosas, combinadas se extrajeron con 25 mL de EtOAc, se secaron (Na2S04) , se filtraron y se concentraron para dar un aceite. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (EtOAc/hexanos/MeOH 15/85/0.1) proporcionó 28 mg del 22b como un aceite incoloro: RMN XH (CDC13) d 1.32 (t, 1H) , 1.40 (m, 4H) , 1.49 (s, 9H) , 1.62 (m, 4H) , 2.53 (d de t, 2H) , 3.84 (t, 2H) , 7.09 (s, 1H) . Plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG Protegida con BOC, 24b: El compuesto 21b (13 mg, 45 µmoles) y 6 µL (4.5 mg, 22.3 µmoles) de tri-n-butilfosfina se colocó bajo nitrógeno, y se adicionaron 3 mL de una solución rociada con nitrógeno de NH0H 6 N/CH3CN 4/1 a la mezcla. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y se concentró bajo vacío. El residuo se disolvió en 3 mL de una solución rociada con nitrógeno de agua/CH3CN 10/90. A la solución resultante, la cual se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno, se adicionaron 10 mg (7.44 µmoles) del compuesto 2_3 seguido por 8 µL (5.77 mg,. 44.6 µmoles) de diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 18 horas y se concentró bajo vacío. El residuo se purificó mediante la cromatografía de gel de silice (gradiente progresivo, múltiple, MeOH/CH2Cl2 1/99 a 5/95 a 7.5/92.5 a' 10/90 a 15/85) para proporcionar 1 1 mg (93%) del compuesto 24b como un aceite incoloro: CCD (MeOH/CH2Cl2 10/90), Rf = 0.3; espectro de masas (EM) m/z calculado para C92H?73N?4026S4 (M+H): 2018. Encontrado: 2018. Plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG, 25b: Los grupos protectores de BOC se separa del compuesto 24b de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 16. tioacetato de potasio NH4OH acuoso BocHNO(CH )ßl BocHNO<CH2)ßSCOCH3 »-- BocHNO(CH2)6SH acetona 9b 21b acetonitrilo 22b Síntesis de la Plataforma AOHOC/DT/TEG, 6- (ter-butiloxicarbonilaminooxi) hexan-1-ol, 27 : A una solución de 179 µL (183 mg, 1.2 mmoles) de DBU en 1 mL de . CH2C12 se adicionaron 133 mg (1.0 mmoles) de N- (ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co.) y 157 µL (217 mg, 1.2 mmoles) de 6-bromohexan-l-ol (Aldrich Chemical Co.), y la mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla se concentró para dar un aceite color amarillo. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (EtOAc/MeOH/hexanos 35/5/65) dio 180 mg (77%) del compuesto 27_ como un aceite incoloro: RMN 1H (CDC13) d 1.39 (m, 4H) , 1.48 (s, 9H), 1.59 (m, 4H), 3.63 (t, 2H), 3.85 (t, 2H), 7.42 (s, 1H) ; RMN 13C (CDC13) d 25.6, 25.8, 28.1, 28.4, 62.8, 76.8, 81.7, 157.2. Compuesto 28 : A una solución de 100 mg (0.428 mmoles) del compuesto 2_7 en 2 mL de CH2C12 a 0°C se adicionaron 90 µL (88.1 mg, 1.11 mmoles) de piridina seguido por 113 mg (0.557 mg) de cloroformiato de p-nitrofenilo (Aldrich Chemical Co.) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, se enfrió a 0°C, se acidificó con HCl ÍN, y se dividió entre 20 mL de HCl ÍN y 3 x 20 mL de CH2C12. Las capas de CH2C12 combinadas se lavaron con una solución -saturada de NaHC0 , se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 28. Compuesto 2_9: A una solución de dietilentriamina en EtOAc se adicionaron dos equivalentes de diisopropiletilamina seguido por dos equivalentes del compuesto 2_8_. La mezcla se agita hasta que se completa la reacción. Los solventes se separaron y el producto, compuesto 29_, se purificó mediante la cromatografía de gel de sílice. Plataforma AOHOC/DT/TEG protegida con BOC, 30: A una solución de bis-cloroformiato de trietilenglicol (Aldrich Chemical Co.) en piridina se adicionan dos equivalentes del compuesto 2_9. La mezcla se agita hasta que se completa la reacción y se divide entre HCl 1 N y CH2C12. La capa de CH2C12 se seca y se concentra, y el producto se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para dar el compuesto 30. Plataforma AOHOC/DT/TEG, 31: Los grupos protectores de BOC se separan del compuesto 3_0_ de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 16. dietilentrl amina J TFA 10% CHjOj Síntesis de la Plataforma AOTEG/IDA/TEG, Compuesto 32: A una solución de bis-cloroformiato de trietilen glicol (Aldrich Chemical Co . ) en piridina se adicionan dos equivalentes de ácido iminodiacético (Aldrich Chemical Co.). La mezcla se agita hasta que se completa la reacción y se divide entre HCl ÍN y CH2C12. La capa de CH2C12 se seca y se concentra, y el producto se purifica mediante la cromatografia de gel de sílice para dar el compuesto 32. Compuesto 33: Una solución del compuesto 3_2 en THF se trata con 6 equivalentes de NHS y 6 equivalentes de DCC durante 1 hora. A la mezcla se adicionan 4 equivalentes del compuesto VL , y la mezcla se agita hasta que se completa la reacción. Se adiciona ácido acético al DCC en exceso, frío, y los sólidos resultantes se separan mediante la filtración. El producto filtrado se concentra y se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 33. Compuesto 34 : Los grupos protectores de BOC se separan del compuesto 3_3 de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 16. ácido imin TFA 10% CH2CI2 Síntesis de la Plataforma AOTEGO/LEV/PITG, p- Nitrofenil-levulinato, 35: A una solución de 800 mg (6.89 mmoles) de ácido levulínico (Aldrich Chemical Co . ) en 4.25 mL de piridina se adicionaron 1.78 g (7.58 mmoles) de trifluoroacetato de 4-nitrofenilo (Aldrich Chemical Co.). La solución resultante se agitó durante minutos y se dividió entre 28 mL de agua y 2 x 28 mL de CH2C12. Las capas de CH2C12, combinadas se secaron (MgS04) , se filtraron, y se concentraron. La purificación del producto concentrado mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo, EtOAc/hexanos 25/75 a 30/70) proporcionó 1.06 g (74%) del compuesto 3_5: RMN 1H (CDC13) d 2.28 (s, 3H) , 2.87 (m, 4H), 7.29 (d, 2H) , 8.28 (d, 2H) . 1, 2-Bis (2- (ter-butiloxicarbonil) aminooxietoxi) etano, compuesto 36: A 243 mg (0.66 mmoles) del compuesto 1_2 se adicionaron 219 mg (1.64 mmoles) de N-(ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co.) seguido por 246 µL (250 mg, 1.64 mmoles) de DBU. La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que se solidificó (aproximadamente 1 hora) . Después del reposo durante una hora adicional, la mezcla se disolvió en 2 mL de CH2C12, y la solución resultante se adicionó a 100 mL de EtOAc para precipitar la sal de yoduro de hidrógeno de DBU. Se añadieron 50 mL adicionales de EtOAc, y la mezcla se filtró. El producto filtrado se lavó con 2 x 50 mL de HCl 1 N, 2 x 50 mL de solución de bisulfito de sodio 5%, y 25 mL de salmuera. La capa de EtOAc se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró para dar un aceite. La purificación mediante la cromatografía de gel de sílice (gradiente progresivo, EtOAc/hexanos 40/60 a 50/50 a 80/20) para dar 164 mg (65%) del compuesto 3_6 como un aceite incoloro: RMN 1H (CDCI3) d 1.48 (s, 18H), 3.65 (s, 4H) ; 3.72 (t, 4H) , 4.02 (t, 4H) , 7.80 (s, 2H) ; RMN 13C (CDC13) d 28.2, 69.0, 70.3, 75.2, 81.3, 156.8. 1, 2-Bis (2-aminooxietoxi) etano, compuesto 37: El compuesto 3_6 (559 mg, 1.47 mmoles) se disolvió en 15 mL de EtOAc, y se burbujeó gas de HCl a través de la solución durante 30 minutos. La mezcla se concentró bajo vacío para proporcionar 72 mg (90%) del compuesto 3_7 como la sal de HCl como un residuo espeso: RMN XH (D20) d 3.75 (s, 4H) , 3.87 (m, 4H) , 4.27 (m, 4H) ; espectro de masas (EM) m/z calculado para C6H?7N204 (M+H): 181.1. Encontrado 181.1. Compuesto 38: El compuesto 3_ se trató con una solución de HBr 30% en ácido acético para separar los grupos protectores de CBZ y proporcionar una sal de bromuro ácido de tetra-amina. La tetra-amina se disuelve en una solución de bicarbonato de sodio en agua y dioxano, y a la solución resultante se adicionan cuatro equivalentes del compuesto 3_5. En la terminación de la reacción, La mezcla se dividió entre agua y CH2C12. La capa de CH2C12 se concentra, se seca y se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 38. Plataforma AOTEGO/LEV/PITG, compuesto 39: A una solución del compuesto 3_8 en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.6 se adicionaron veinte equivalentes del compuesto 3_7_. En la terminación de la reacción, la mezcla se dividió entre agua y CH2C12. La capa de CH2C12 se concentra, se seca y se purifica mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 39. trffluoroacetato de 4-nttrofenilo na Boc HOK OBU BocNHO(CH2CH2?)2CH2CH2?NHB?c^2^-. H2 O{CH2CH2?)2CH2CH2?NH2 12 36 37 D HBriHOAc 2) 3S. MtHCOj?-jO Compuesto 37, amortiguador de NaOAc 100 mM pH 4.ß 39 Síntesis de la Plataforma AO/DEGA/DEG, Compuesto 41: Se adiciona gota a gota bromo (aproximadamente seis equivalentes) a una solución del compuesto 4_0, seis equivalentes de trifenilfosfina, y 8 equivalentes de piridina en CH2C12 hasta que persiste un color naranja. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 0.5 horas o hasta que se completa la reacción, y se adiciona una solución saturada de bisulfito de sodio para destruir el exceso de bromo. La mezcla luego se divide entre H20 y EtOAc. Las capas orgánicas, combinadas se lavan con salmuera, se secan (Na2S0 ), se filtran, se concentran y se purifican mediante la cromatografía de gel de sílice para proporcionar el compuesto 41. Compuesto 42: Al compuesto l_ se adicionan seis equivalentes de N- (ter-butiloxicarbonil) hidroxilamina (Aldrich Chemical Co.) y seis equivalentes de DBU. La mezcla se calienta como sea necesario durante un tiempo suficiente para que la reacción llegue a la terminación. Cuando se enfría, la mezcla se disuelve en CH2C12 y la solución resultante se adiciona a EtOAc lo que da por resultado la formación de un precipitado el cual se separa mediante la filtración, y el producto filtrado se concentra. La purificación mediante la cromatografía con evaporación instantánea proporciona el compuesto 8_. Compuesto 43: Los grupos protectores de BOC se separan del compuesto 42_ de una manera esencialmente similar a aquella descrita para la preparación del compuesto 16.

PPhß/ piridina Br/CH2CI2 Bo HNOH DBU 43 Método Alar-t-peaj-pn tei-ß le 7-t-rte-t-eviép dr zp Conjugado Tetravalente Utilizando el Compuesto 37 como una Unión Bifuncional: Como una alternativa para hacer reaccionar un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, transaminado directamente con una plataforma de aminooxi tetravalente. El dominio 1 transaminado se puede hacer reaccionar con un exceso del compuesto 37 en un amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 4.6, para proporcionar el compuesto 5_3 en el cual un enlace de aminoxi está unido al polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 por medio de un enlace de oxima. El compuesto 53 se separa de la unión en exceso y cuatro equivalentes del compuesto 5_3 se hacen reaccionar con la plataforma 38 en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 4.6, para formar un segundo conjunto de enlaces de oximas para proporcionar un conjugado tetravalente, compuesto 54.

HjNOtCHíCHiOhCHzCHiONHj 37 53 acetato de sodio 100 mM pH 4.0 S* Método Alternativo para la Preparación de un Conjugado Tetravalente que Utiliza el Compuesto 21a como un Precursor para una Unión Bifuncional: El tratamiento del compuesto 21a con hidróxido de amonio para separar el grupo protector de azufre de acetilo, luego con ácido trifluoroacético para separar el grupo protector de BOC proporciona la unión 5_5. Un polipéptido que contiene glioxilo, en este caso TA/Dl, se hace reaccionar con el compuesto 5_5 para proporcionar el compuesto 5_6, el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 con la unión de sulfhidrilo por medio de un enlace de oxima. Cuatros equivalentes del compuesto 5_6 se pueden hacer reaccionar con la plataforma 2_3 para proporcionar un conjugado de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 tetravalente, compuesto 57. tp o O Oí 1) NH40H??ß H 2) TFA HSt^CH^hCH?CHaONI-^ ™>1 *~ HS<CH2CH20>2CH2CH2?-N DI 21a 5d amortiguador de NaOAc 100 mM pH 4.6 56 23 amortiguador de borato d? sodio 100 mM pH 8.0 57 Ejemplo 6: Propiedades de enlace del compuesto del conjugado tetramérico 44 de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 El enlace del compuesto del conjugado tetramérico 44 de dos anticuerpos anti-ß2-GPI de humano, purificados por afinidad se analizó utilizando la resonancia de plasmón de la superficie. Materiales y Métodos para las determinaciones Kd del compuesto del conj ugado tetramérico 44 Reactivos . Los fragmentos pequeños CM5, NHS y EDC y el amortiguador HBS-EP fueron de BIAcore. El IgG normal reunido de humano (Zymed) se inmobilizó en una celda de flujo separada en el fragmento pequeño y se utilizó como un control negativo. Los anticuerpos específicos del dominio 1 de la ß2GPI, purificados por afinidad de 2 pacientes (6701 y 6626) se inmobilizaron en celdas de flujo separadas. Resonancia de Plasmón de la Superficie. Todos los experimentos fueron hechos en un instrumento BIAcoreM 2000 a 25°C con una velocidad de flujo de 10 µL/minuto. Los estudios de equilibrio del fragmento pequeño y de enlace se realizaron con el amortiguador de HBS-EP desgasificado, el cual consiste de HEPES 0.01 M pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM y surfactante P20 0.005% (v/v) . El acoplamiento covalente de ligandos de proteína a través de sus grupos amino libres al fragmento pequeño CM5 se realizó al hacer fluir 40 µL de NHS 0.05 M/EDC 0.2M sobre el fragmento pequeño para activar el fragmento pequeño, seguido por la exposición al ligando de proteína apropiado. Los anticuerpos purificados por afinidad y la IgG normal se inmobilizaron al hacer fluir 100 µL de una solución de 100 µg/mL en acetato 10 mM, (PH 4.8) sobre el fragmento pequeño CM5 activado con NHS. Los grupos reactivos en exceso en la superficie del fragmento pequeño luego se enfrían rápidamente con 40 µL de etanolamina 1 M, (pH 8.5) . Titulaciones . Los baculovirus expresaron el dominio 1 de la ß2-GPI y el compuesto tetramérico 44 se diluyeron con HBS-EP, se hicieron fluir sobre el fragmento pequeño, y los valores de respuesta se colectaron durante 780 segundos. Los fragmentos pequeños se regeneraron entre las exposiciones de la muestra con 80 µL de glicina 0.1 M-HC1 (pH 2.1), NaCl 0.1 M. Se hizo una serie de cinco titulaciones para cada muestra. Puesto que el planteamiento para enlazar el equilibrio fué incompleto durante el período de medición, el valor de enlace de equilibrio (Req) se determinó mediante el ajuste de las curvas de asociación a la siguiente ecuación utilizando los elementos de programación del fabricante (BiaEvaluation versión 2.2, Uppsala, Suecia).

Rt = Req(l-e- s(t-t0)) + Ro donde Rt es la respuesta BIAcore medida en el tiempo t, Teq es la respuesta de meseta de equilibrio, t es tiempo, to es el tiempo inicial, ks es una constante de asociación aparente (Ks = kaC + kdiS, donde ka es la constante de asociación, C es la concentración de la sustancia para el análisis y KdiS es la constante de asociación) , y Ro es una desviación de respuesta, (Marquart-Levenberg algorithm) . Cada curva de asociación de titulación tiene el medio de las células de control negativo (IgG normal) para esa titulación sustraída. Las Req calculadas se representaron gráficamente contra la concentración utilizando los elementos de programación GraphPad Prism versión 2.01. Los datos se ajustan a un enlace del sitio (hipérbole rectangular: Y=Bmax*X/[Kd + X] ) y los valores Kd se calculan en unidades molares. Las concentraciones molares del domino 1 y el compuesto 44 se determinaron mediante la absorbancia a 280 nm y un coeficiente de extinción de 1.85.

Resul tados y Discusión Los anticuerpos purificados por afinidad de los pacientes 6701 y 6626 se inmobilizaron en cámaras microfluídicas, separadas y se expusieron a concentraciones variantes del dominio 1 de la ß2GPI de humano o el compuesto 44. El valor de enlace de equilibrio se determinó para cada concentración y se representó gráficamente para determinar la constante de disociación de equilibrio, aparente. Las isotermas de enlace se muestran en las Figuras 10 y 11 (coeficiente de extinción = 1.85; 100 µg/ml de anticuerpo inmovilizado) y las constantes de disociación se indican en la Tabla 8. Estos experimentos demuestran que los anticuerpos antifosfolípidos, purificados por afinidad se enlazan al dominio 1 del ß2GPI. Además, estos demuestran que los conjugados tetraméricos de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 enlazados a una plataforma también son capaces de enlazarse a estos anticuerpos con afinidades que son equivalentes a, o mayores que, la concentración molar del dominio 1 presente en el tetrámero.

Tabla 8: Constantes de disociación de equilibrio, aparentes para el dominio 1 y el compuesto 44 que se enlaza a los anticuerpos antifosfolipidos, purificados por afinidad Paciente Dominio 1 Compuesto 44 6626 333 + 18 nM 66 ± 23 nM 6701 417 ± 36 nM 24 ±9 Ejemplo 7 : Prueba de los conjugados de polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 para el enlace competitivo de anticuerpos in vitro Las microplacas Nunc Maxisorp (Nalge Nunc International, Dinamarca) se revistieron con 100 µL/pocillo de la ß2GPI en 2.5 µg/mL en PBS, se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, y se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con 250 µl/pocillo de leche desgrasada 2% con T een-80 0.4 (Sigma Chemical Co . ) . Después de cinco lavados con TBS, a cada pocilio se adicionaron 100 µL de una solución preparada menos de una hora antes diseñada para suministrar una dilución final 1:200 por pocilio del plasma del paciente 6501 y cantidades variables del compuesto de conjugados del dominio 1, tetramérico 44 y el compuesto 45 o los monómeros del dominio 1 de control todos en leche desgrasada 2% con Tween-80 0.4%. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5x con TBS. A cada pocilio se adicionaron 100 µL de IgG anti-humano conjugada con fosfatasa alcalina, específica para la cadena gamma (Zymed) diluida 1:1000 en leche desgrasada 2% con T een-80 0.4%. Después de una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5x con TBS. A cada pocilio se adicionaron 100 µl de solución de substrato cromogénico PPMP para el desarrollo de color a temperatura ambiente. La absorbancia óptica por pocilio se determinó en Assonm en un lector de microplacas comercial (Bio-Tek Instruments EL311) . Los resultados mostrados en la Figura 12 indican que tanto los compuestos 44 y 45, compiten de manera efectiva por el anticuerpo antifosfolipidos presente en el suero (paciente 6501) . El dominio 1 reducido y alquilado no exhibe tal competencia y es un control negativo. El enlace competitivo también es exhibido por el dominio 1 monomérico, regular y se incluye como un control positivo .

Ejemplo 8: Modelo de ratón inmunizado para someter a prueba los conjugados de polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 Los requerimientos de un modelo inmunizado para someter a prueba la tolerancia a los polipéptidos de la ß2GPI del dominio 1 son: (1) la inmunización debe procrear los anticuerpos que reconozcan el dominio 1 y (2) la inmunización no debe procrear células T que reconozcan el dominio 1. La inmunización con el conjugado de polipéptidos del dominio 1-KLH procrea células que reconocen la KLH pero no reactividad detectable para el dominio 1. Para este fin se ha hecho, en el sistema de células de insecto, un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 que contiene una quinta cisteína en la terminación carboxilo (aminoácido 1 a aminoácido 66 de la SEC ID NO:l). Esta molécula se ha unido covalentemente al KLH por medio de-la quinta cisteína. Este conjugado ha sido utilizado para inmunizar ratones. La inmunización con el conjugado del dominio 1-KLH procrea células T que reconocen la KLH pero no reactividad detectable para el dominio 1. Por otra parte, la inmunización con el conjugado del dominio 1-KLH da por resultado la producción de anticuerpos específicos para el dominio 1.

Ma teriales y Métodos ELISA para detectar el anticuerpo anti-dominio 1 Los pocilios de microtítulo NUNC se revistieron con 50 µl de la ß2GPI en 5 µg/ml en bicarbonato 0.1 M (pH 9.5), durante la noche. Los pocilios se lavaron con PBS y luego se bloquearon durante una hora con leche desgrasada en polvo 2% (NFDM) . Los pocilios se lavaron y se adicionaron diluciones en serie de 50 µl, en NFDM 2%, de suero de ratón individual, se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron y se adicionaron 50 µl de IgG anti-ratón conjugada con fosfatasa alcalina, se incubaron una hora a temperatura ambiente, se lavaron y se adicionaron 50 µl del substrato. La DO a 550 nm se leyó después de 30 minutos. Se hizo una colección del suero de los ratones que han sido cebados con 50 µg del conjugado. Esta colección se sometió a prueba en todos los ensayos y los resultados se expresan como un porcentaje de esta colección normal.

ELISA de Inhibición Competitiva Las microplacas NUNC se revistieron con 50 µl de la ß2GPI recombinante en 5 µg/ml en bicarbonato 0.1 M, pH 9.5, se incubaron durante la noche a 4°C, se lavaron tres veces con PBS 0.15 M (pH 7.2), y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con 75 µl de Leche Desgrasada en Polvo 2% en PBS (NFDM 2%) . Los inhibidores se diluyeron en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl de cada dilución o NFDM sola a los pocilios revestidos. El anticuerpo monoclonal se diluyó en NFDM 2% y se adicionaron 25 µl de una concentración constante a los pocilios. Los contenidos de los pocilios se mezclaron y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después de que se lavaron placas tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de IgG anti-ratón conjugada con fosfatasa alcalina, especifica para la cadena gamma, diluida apropiadamente en NFDM 2% y se incubaron a 37 °C durante una hora. Después de que las placas se lavaron tres veces con PBS, se adicionaron 50 µl de substrato cromogénico de fosfatasa alcalina y las placas se incubaron durante 30 minutos a 20°C. La A550 se midió en un autolector de microplacas. El porcentaje de inhibición se determinó como sigue [(la A550 promedio obtenida de los pocilios de control sin el inhibidor menos la A550 del medio) -(la A550 obtenida en la presencia del inhibidor menos la A550 del medio) /(la A550 promedio obtenida de los pocilios de control sin inhibidor menos la A550 del medio)] 100 veces.

Modelo de Ratón Inmunizado ara los anticuerpos antidominio 1 Los grupos de 5 ratones C57B1/6 se cebaron con ya sea 10, 50 o 100 µg del conjugado de KLH-dominio 1 adsorbido al alumbre más 2 x 109 organismos pertussi s como un adyuvante. Tres semanas después, todos los ratones se sobrealimentaron con 10 µg del conjugado en solución salina. Siete días después de la sobrealimentación, los ratones se sangraron, el suero se recolectó y sometido a una prueba para la actividad anti-dominio 1. Los resultados se muestran en la Figura 14. La inmunización con el dominio 1-KLH no generó una respuesta del ancicuerpo específico para el dominio 1.

Inmunización del ratón y Ensayo de proliferación de Células T Los ratones C57B1/6 se inyectaron en la pata posterior con 25 µg del conjugado del dominio 1 (DI) -KLH emulsificado en el adyuvante Freunds completo (CFA) . Otro grupo de ratones se inyectaron la pata posterior con el CFA emulsificado (sin antígeno) . Siete días después, los nodos linfáticos, poplíteos se recolectaron de 5 ratones de cada grupo. Los nodos de inmunizaciones similares se reunieron y se hicieron suspensiones de células, individuales. Las células se cultivaron como se describe anteriormente para las células de humano excepto que los antígenos de prueba fueron Dl-KLH, KLH y el dominio 1 (no conjugado) . El PPD se utilizó como un control positivo. En el día 4, se adicionaron a cada pocilio 25 µl de 3H-timidina que contiene 1 µ de Ci. En el día 5, los contenidos de los pocilios se recolectaron y se determinó la cantidad de radioactividad en cada uno. Se calculó un índice de Estimulación (SI) para cada pocilio al dividir el CPM del pocilio por el CPM promedio de los controles negativos. Se determinó el SI promedio (y la desviación normal) para cada uno de los duplicados .

Resul tados y Discusión La especificidad del conjugado anti-KLH-dominio 1 de ratón, policlonal se determinó mediante ensayos ELISA de inhibición competitiva. Las diversas formas recombinantes de la ß2GPI se mezclaron con cantidades limitantes del anticuerpo en pocilios que habían sido revestidos con la ß2GPI. Luego se detectó la cantidad del anticuerpo que permanece enlazado a los pocilios con un segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina. El porcentaje de inhibición se determinó, como se describe en la sección de los métodos, y representó gráficamente contra la concentración µmolar del inhibidor. Los resultados se muestran en la Figura 15. La inmunización con el mismo conjugado genera una respuesta del anticuerpo que es específica para el dominio 1 (Figura 15) . Con respecto a la proliferación de células T, los resultados mostrados en la Figura 13 demuestran que las células de los ratones cebados con el dominio 1-KLH proliferaron en respuesta a tanto el dominio 1-KLH y KLH así como también el PPD de control positivo. Estas no respondieron al dominio 1 (no conjugado) . Por otra parte, las células de los ratones cebados solo con CFA no respondieron a los antígenos de prueba pero respondieron al PPD de control positivo. Por un modelo de ratón inmunizado, específicamente, que el cebado no debe cebar las células T que reconocen un tolerágeno dado pero debe generar las células B de memoria que reconocerán el tolerágeno, ambos de los dos requerimientos básicos para un modelo del ratón inmunizado han sido realizados en el modelo del ratón inmunizado presentado aquí.

Ejemplo 9: Prueba del polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 como un tolerágeno in vivo . Los ratones se ceban con un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 conjugado a hemocianina de lapa en forma de ojo de cerradura (KLH) en alumbre más pertussi s como un adyuvante como se describe anteriormente. Tres semanas después, los ratones se trataron con una gama de dosificaciones del tolerágeno, el cual puede o no puede estar conjugado a una plataforma. Un grupo no se trata y actúa como un grupo de control. Cinco días después, todos los ratones, inclusive el grupo de control, se sobrealimentan con 10 µg del polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 conjugado con KLH y siete días después, los ratones se sangraron. Sus sueros se analizaron por los anticuerpos anti dominio 1 de la ß2GPI por cualquier método conocido, inclusive, por ejemplo, ELISA como se describe en los ejemplos anteriores. Estos valores luego se utilizan para determinar una desviación promedio y normal para todos los individuos de un grupo.

Ejemplo 10 : Prueba de la reacción de las células T El estableciendo de la falta de reactividad de las células T para un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 indicaría que, como un tolerágeno, no administra algún epítope para una segunda señal a las células B de las células T. A la inversa, si el tolerágeno proporciona una señal de proliferación (activación) a las células T, es posible que el tolerágeno exacerbaría la respuesta de las células B.

Para determinar la activación de las células T, los linfocitos circulantes se colectan y se colocan en un cultivo de tejido. El (los) polipéptido ( s) de la ß2GPI del dominio 1 a ser probado (s) se adiciona (n) al cultivo durante aproximadamente una semana. Al final de la semana, las células T se pulsaron con la 3H-timidina para determinar si ha existido proliferación celular. Opcionalmente, también se determina la presencia de citocinas en el sobrenadante del cultivo de tejido.

Ejemplo 11: Los anticuerpos anti ß2-GPI contribuyen a la hipercoagulación al retardar la inactivación del factor Va Métodos Los niveles del factor V activado (factor Va) se determinaron en plasma de humano, normal después de la iniciación de la coagulación en la presencia y ausencia de anticuerpos purificados por afinidad o preparaciones IgG totales de los pacientes diagnosticados con el síndrome de antifosfolipidos (APS) . Los anticuerpos purificados por afinidad se caracterizaron como el dominio 1 anti ß2GPI . La IgG total se preparó del suero del paciente como se describe posteriormente.

La medición de los niveles del factor Va se determinó en un ensayo de coagulación de dos etapas, modificado utilizando un microcoagulómetro Amelung KC4A como sigue. Se preincubaron cincuenta µl de plasma de humano deficiente del factor V (Chromogenix) durante 1 minuto a 37°C en una microcuveta de rotación. Las muestras se diluyeron 1:10 con un amortiguador de O ren precalentado (37°) (Sigma). Se adicionaron cincuenta µl de la muestra diluida a los 50 µl del plasma deficiente del factor V. Se adicionaron cien µl de calcio ThromboMAX plus a 37 °C (Sigma) para iniciar la coagulación. El tiempo de coagulación se registró. Una unidad de actividad Va se define como el tiempo para la coagulación para el plasma deficiente de V con una dilución 1:10 de plasma de humano de referencia, normal (Accuclot, Sigma) . Una unidad de actividad del factor Va en este sistema experimental corresponde a un tiempo de coagulación de aproximadamente 30 segundos. Para determinar la cantidad del factor Va que se genera a través del tiempo en la presencia o ausencia del anticuerpo antifosfolípidos o IgG, se utilizó el siguiente sistema para generar las muestras probadas en el ensayo normal, anterior. Los siguientes reactivos se mezclaron y se incubaron a 37°C: una parte de plasma de referencia de humano, normal (Accuclot, Sigma), una parte de CaCl2 25 mM y una parte que consiste del reactivo de fosfatidil-serina (125 µg/ml) y solución salina amortiguada con Tris (TBS) y anticuerpo o IgG si es aplicable en la concentración deseada) . La TBS se utilizó para corregir los volúmenes variantes del anticuerpo o la IgG. El plasma normal, la fosfatidil-serina, el anticuerpo o la IgG (si está presente) y la TBS se mezclaron y se incubaron a 37 °C durante 2 minutos antes de la adicLón de CaCl2 a 37°C para iniciar la coagulación y el coágulo se separó manualmente cuando se formó. El volumen total de la mezcla de muestra fué dependiente en el número de puntos de tiempo ensayados. En cada punto de tiempo, se separaron 12.5 µl de la muestra de incubación, se diluyeron 1:10 en amortiguador de Owren y se sometió a un ensayo en el ensayo del factor Va normal, anterior. Los niveles de Va generado en la muestra a través del tiempo se reflejan en una corrección del tiempo de coagulación del plasma deficiente del factor V. Los niveles pico del Va ocurren 4-5 minutos después de que se inicia la coagulación y los niveles están en la gama de 4-7 unidades de actividad del factor Va. Esto corresponde a un tiempo de coagulación de aproximadamente 5-6 segundos en el ensayo normal para este sistema experimental.

En los casos donde se adicionó la IgG del paciente con APS al ensayo, la IgG total se preparó a partir de las muestras de suero de humano al combinar 100 µl de suero (diluido 1:1 con el amortiguador de enlacé de la IgG Pierce Immunopure) con 100 µl de cuentas de la proteína G inmovilizada con agarosa (Pierce Immunopure Plus) . La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 10 minutos. La proteína G enlaza la región Fc de todas las subclases de inmunoglobulina G de humano. Después de 10 minutos, la mezcla se centrifugó brevemente para formar pelotillas de las cuentas. El sobrenadante de la mezcla del suero se desecho. Las cuentas con la IgG enlazada luego se lavaron tres veces con 200 µl de amortiguador de enlace de la IgG para separar las proteínas adsorbidas. La IgG enlazada luego se eluyó de las cuentas de la proteína G con 100 µl del amortiguador de elución de la IgG tres veces (amortiguador de elución de la IgG Pierce, Immunopure). La IgG eluída se neutralizó inmediatamente con 100 µl de NaP0 1M, pH 7.5, para un volumen final, total de 400 µl de la preparación de IgG de 100 µl de la muestra de plasma. Las preparaciones de la IgG neutralizada se almacenan a 4°C hasta el análisis.

La concentración de proteínas de las preparaciones de IgG se determinó por el método de Bradfor de microplacas normales (reactivo Bio-Rad) . Se sometieron a un ensayo cinco µl de cada muestra por triplicado, con una curva normal de albúmina de suero bovino en cada placa. Las concentraciones de proteínas se calcularon mediante los elementos de programación KC4. Para el análisis en el ensayo de coagulación del factor Va, se concentraron 100 µl de la preparación de IgG a 25 µl con un dispositivo de filtro centrífugo, Microcon (Amicon, corte del peso molecular de 30,000) . Se utilizan los 25 µl completos para el ensayo del factor Va de puntos de tiempo individuales.

Resul tados El efecto de la IgG total de pacientes con antifosfolípidos y los anticuerpos purificado por afinidad de los controles normales se comparó por su capacidad para retardar la inactivación del factor Va en un ensayo de coagulación in vitro. Los resultados para la IgG total y los anticuerpos purificados por afinidad se muestran en la Tabla 9 y la Figura 16, respectivamente. La IgG y los- anticuerpos purificados por afinidad de los sujetos de control, normales no alteran la inactivación del factor Va observada 20 minutos después de la iniciación de la coagulación. En contraste, la fracción de la IgG de los pacientes con antifosfolípidos retardó la inactivación del factor Va (p < 0.05 mediante la prueba t de estudiante). Se observaron efectos similares en la inactivación del factor Va por los anticuerpos purificados por afinidad. Estos datos sugieren que los anticuerpos anti-b2-GPI de humano pueden crear un estado hipercoagulativo en parte mediante el retardo de la inactivación del factor Va.

Tabla 9 XgG del Paciente con APS I.D. 20" Va igG Actividad (Unidades) (mg) (Unidades/mg) 7308 0.98 0.08 12.25 7309 0.85 0.06 14.17 7310 0.85 0.06 14.17 7311 0.84 0.07 12.00 7312 0^92 0.06 15.33 7313 0.82 0.06 13.67 7314 1.13 0.06 18.83 7315 0.99 0.07 14.14 7316 0.87 0.06 ,14.50 7317 0.92 0.08 11.50 7318 0.81 0.08 10.13 7319 0.95 0.10 9.50 7320 0.83 0.05 16.60 7312 0.84 0.07 12.00 7322 0.81 0.06 13.50 7323 0.83 0.09 9.76 7301 0.83 0.05 16.60 7302 0.87 0.05 17.40 7303 1.05 0.08 13.13 7304 1.44 0.07 20.57 7305 0.79 0.08 9.88 7306 0.90 0.07 12.86 7307 1.10 0.07 15.71 6501 1.16 0.06 19.33 6636 1.21 0.05 24.20 I 6625 0.86 0.10 8.60 6646 0.72 0.05 14.40 6623 1.17 0.07 16.71 6510 0.70 0.05 14.00 promedio 0.93 0.07 14.33 STD 0.17 0.01 3.55 igG Normal 20" Va lgG Unidades I.D. (Unidades) (mg) de actividad/mg N260 0.77 0.06 12.83 N712M 0.69 0.07 9.86 N266F 0.78 0.09 8.67 N199F 0.79 0.08 9.88 N280M 0.76 0.07 10.86 medio 0.76 0.07 10.42 STD 0.039623 0.011402 1.557503 Aunque la invención anterior ha sido descrita más o menos en detalle a manera de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de entendimiento, será aparente para aquellos expertos en la técnica que serán practicados ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no se deben construir como limitantes del alcance de la invención, la cual es delineada por las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Marquis, . David Iverson, M, Gilbert Victoria, J. Edward Jones, S . David Linnik, atthew <120> PO IPEPTIDOS DE LA ß?GPI DEL DOMINIO 1 , TERAPÉUTICOS Y DE DIAGNOSTICO Y MÉTODOS PARA UTILIZAR LOS MISMOS <130> 252312006900 <1 0> Reservado <141> 1999-06-08 <150> 60/088 , 656 <151> 1998-06-09 <150> 60/103, 088 <151> 1998-10-05 <160> 30 <170> FastSEQ para Windows Versión 3, <210> 1 <211> 978 <212> ADN <213> Homo Sapie <220> <221> CDS <222> (1). . (978) <400> 1 gga cgg acc tgt ecc aag cca gat gat tta cca ttt tcc acá gtg gtc 48 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 ceg tta aaa acá ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 20 25 30 aag ceg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt ate tgc cct 144 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 35 40 45 ctc acá gga ctg tgg ecc ate aac act ctg aaa tgt acá ecc aga gta 192 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val 50 55 60 tgt cct ttt gct gga ate tta gaa aat gga gcc gta cgc tat acg act 240 Cys Pro Phe Ala Gly He Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr 65 70 75 80 ttt gaa tat ecc aac acg ate agt ttt tet tgt aac act ggg ttt tat 288 Phe Glu Tyr Pro Asn Thr He Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr 85 90 95 ctg aat ggc gct gat tet gcc aag tgc act gag gaa gga aaa tgg age 336 Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser 100 105 110 ceg gag ctt cct gtc tgt gct ecc ate ate tgc cct cca cca tcc ata 384 Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro He He Cys Pro Pro Pro Ser He 115 120 125 cct acg ttt gca acá ctt cgt gtt tat aag cca tea gct gga aac aat 432 Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn 130 135 140 tcc ctc tat cgg gac ac gca gtt ttt gaa tgt ttg cca caá cat gcg 480 Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala 145 150 155 160 atg ttt gga aat gat acá ?.tt acc tgc acg acá cat gga aat tgg act 528 Met Phe Gly Asn Asp Thr He Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr 165 170 175 aaa tta cca gaa tgc agg gaa gta aaa tgc cca ttc cca tea aga cca 576 Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro 180 185 190 gac aat gga ttt gtg aac tat cct gca aaa cca acá ctt tat tac aag 624 Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys 195 200 205 gat aaa gcc acá ttt ggc tgc cat gat gga tat tet ctg gat ggc ceg 672 Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro 210 215 220 gaa gaa ata gaa tgt acc aaa ctg gga aac tgg tet gcc atg cca agt 720 Glu Glu He Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser 225 230 235 240 tgt aaa gca tet tgt aaa tta cct gtg aaa aaa gcc act gtg gtg tac 768 Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr 245 250 255 caá gga gag aga gta aag att cag gaa aaa ttt aag aat gga atg cta 816 Gln Gly Glu Arg Val Lys He Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu 260 265 270 cat ggt gat aaa gtt tet ttc ttc tgc aaa aat aag gaa aag aag tgt 864 His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys 275 280 285 age tat acá gag gat gct cag tgt ata gat ggc act ate gaa gtc ecc 912 Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys He Asp Gly Thr He Glu Val Pro 290 295 300 aaa tgc ttc aag gaa cac agt tet ctg gct ttt tgg aaa act gat gca 960 Lys Cys Phe Lys Glu Hrs Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala 305 310 315 320 tcc gat gta aag cca tgc 978 Ser Asp Val Lys Pro Cys 325 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Homo Sapien 400> 2 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 20 25 30 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 35 40 45 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val 50 55 60 Cys Pro Phe Ala Gly He Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr 65 70 75 80 Phe Glu Tyr Pro Asn Thr He Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr 85 90 95 Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser 100 105 110 Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro He He Cys Pro Pro Pro Ser He 115 120 125 Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn 130 135 140 Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala 145 150 155 . 160 Met Phe Gly Asn Asp Thr He Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr 165 170 175 Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro 180 185 190 Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys 195 200 205 Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro 210 215 220 Glu Glu He Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser 225 230 235 240 Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr 245 250 255 Gln Gly Glu Arg Val Lys He Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu 260 265 270 His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys 275 280 285 Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys He Asp Gly Thr He Glu Val Pro 290 295 300 Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala 305 310 315 320 Ser Asp Val Lys Pro Cys 325 <210> 3 <211> 192 <212> ADN <213> Home > Sapien <220> <221> CDS <222> (1). (192) <400> 3 gga cgg acc tgt ecc aag cca gat gat tta cca ttt tcc acá gtg gtc 48 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 ceg tta aaa acá ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro .Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 20 25 30 aag ceg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt ate tgc cct 144 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 35 40 45 ctc acá gga ctg tgg eco at.c aac act ctg aaa tgt ac ecc aga gta 192 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val 50 55 60 <210> 4 <211> 64 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 4 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 20 25 30 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 35 40 45 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val 50 55 60 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 5 Cys Thr Pro Arg Val Cys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 6 Phe Ser Thr Val Val Pro 1 " 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapxen <400> 7 Lys Pro Pro Asp Asp Leu Pro 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien ^<400> 8 Gly Arg Thr Cys Pro Lys 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 9 Thr Leu Lys Cys Thr Pro 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 10 He Cys Pro Leu Thr Gly 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 11 Phe He Cys Pro Leu Thr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 12 He Thr Tyr Ser Cys Lys 1 5 <210> 13 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 13 aaaccacctt aatggtgatg gtgatggtgg ccacatggct ttaca 5 <210> 14 <211> 31 . <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 14 gacatactct gggtgtccgt cctgcaatag c 1 <210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 15 tggagggcag atgatccgtc ctgcaatagc 0 <210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 16 gaatgggcat tttacttccc gtectgeaat age 3 <210> 17 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 17 aggtaattta caagatgccc gtectgeaat age 3 <210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 18 atggtgatgg tggccacaac ttggcatggc 0 <-210> 19 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 19 atggtgatgg tggccgcatt ctggtaattt ag 2 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Los aminoácidos 3-60 se suprimieron dé la ß2GPI (SEC ID NO:2) <400> 20 Gly Arg Thr Pro Arg 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Los aminoácidos 3-120 se suprimieron de ia ß2GPI (SEC ID NO:2 <400> 21 Gly Arg He He Cye 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Los aminoácidos 3-182 se suprimieron de la ß?GPI (SEC ID NO : 2 ) <400> 22 Gly Arg Glu Val Lys 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Los aminoácidos 3-242 se suprimieron de la ß?GPI (SEC ID NO: 2) <400> 23 Gly Arg Ala Ser Cys 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Los aminoácidos 242-326 se suprimieron o los aminoácidos 182-326 se suprimieron o los aminoácidos 165-326 se suprimieron o los aminoácidos 123-32.6 se suprimieron de la ß2GPI (SEC ID NO: 2) <400> 24 Gly Arg Thr Cys Pro 1 5 <210> 25 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 25 ctataaatac ggatcccggg aattcg 6 <210> 26 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 26 gcagctggcc aactctgggt gtacatttca gagtg 5 <210> 27 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 27 gcagctggcc aatgatggga gcacagagag gaag 4 <210> 28 • . <211> 63 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 28 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 25 30 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 40 45 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg 50 55 60 <210> 29 <211> 62 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 29 Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val Pro 1 5 10 15 Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys Lys 25 30 Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro Leu 40 45 Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg 50 55 60 <210> 30 <211> 65 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> construcción sintética <400> 30 Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val 1 5 10 15 Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu He Thr Tyr Ser Cys 25 30 Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe He Cys Pro 40 45 Leu Thr Gly Leu Trp Pro He Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val 50 55 60 Cys 65 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, en donde el polipéptido se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos' dependiente de la ß2GPI, y en donde el polipéptido no consiste del grupo que consiste de la SEC ID NO:2 del polipéptido (figura 1 ) ; los dominios 1, 2, y 3 de la ß2GPI; y los dominios 1, 2, 3, y 4 de la ß2GPI .

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 consiste de la SEC ID NO: 4 del polipéptido (figura 2).

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 se selecciona del grupo que consiste de las SECS ID NOS.5-12.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 comprende aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 66 de la SEC ID NO:l.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de la ß2GPI del dominio 1 comprende aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 59 de la SEC ID NO: 4 (figura 2).

6. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

7. Un polipéptido polimérico, caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido carece de un epitope de células T, el epitope de células T capaz de activar las células en un individuo que tiene los anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI.

9. Un conjugado del polipéptido de la reivindicación 8.

10. El conjugado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el conjugado comprende una etiqueta.

11. El conjugado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el conjugado comprende una molécula de plataforma de valencia.

12. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula de plataforma es proteinácea.

13. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de plataforma no es proteinácea.

14. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el peso molecular de una población de las moléculas de la plataforma de valencia es homogéneo.

15. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula de plataforma se enlaza al polipéptido mediante un enlace de tioéter.

16. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula de plataforma se enlaza al polipéptido mediante un enlace de oxima.

17. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula de plataforma es

18. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la molécula de plataforma es

19. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el conjugado es en donde DI es un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI.

20. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el conjugado es donde DI es un polipéptido del dominio 1 de la ß2GPI

21. Un polinucléotido que ocurre naturalmente, aislado, caracterizado porque codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

22. Un polinucleótido que no ocurre naturalmente, caracterizado porque codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

23. Un polinucleótido que ocurre naturalmente, aislado, caracterizado porqué codifica el polipéptido de la reivindicación 8.

24. Un polinucleótido que no ocurre naturalmente, caracterizado porque codifica el polipéptido de la reivindicación 8.

25. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 21.

26. Un vector de clonación, caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 21.

27. Una célula hospedante transformada con el polinucleótido de la reivindicación 21.

28. Un mimético de un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, caracterizado porque el mimético se enlaza específicamente a un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI al cual se enlaza específicamente un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1.

29. El mimético de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque es un polipéptido .

30. El mimético de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque carece de un epitope de células T, el epitope de células T es capaz de activar las células T en un individuo que tiene anticuerpos antifosfolipidos dependientes de la ß2GPI .

31. Un equipo para detectar un anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido de la ß2GPI del dominio 1, caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 1 en un empaquetamiento adecuado .

32. Un equipo para detectar la coagulación, caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 1 en un empaquetamiento adecuado.

33. Una composición que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para inducir la tolerancia .

34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.-

35. Una composición que comprende una cantidad -efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para detectar un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI.

36. Un método para detectar un anticuerpo que se enlaza específicamente al polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 en una muestra, caracterizado porque comprende (a) poner en contacto el anticuerpo en la muestra con el polipéptido de la reivindicación 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de antigeno-anticuerpo, estable; y (b) detectar el complejo estable formado en el paso (a) , si lo hay.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI.

38. Un método para purificar un anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI, caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra biológica con el polipéptid? de la reivindicación 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo, estable, y obtener el complejo formado, si lo hay.

39. Un método para inducir la tolerancia en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efecciva de una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 8 al individuo.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el individuo es un humano.

41. Un método para inducir la tolerancia en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el conjugado de la reivindicación 11 al individuo.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el individuo es un humano.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el polipéptido consiste de la secuencia de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 60 de la SEC ID NO: 4.

44. Un método para detectar la mediación del anticuerpo antifosfolípidos dependiente de la ß2GPI de la coagulación, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) realizar un primer ensayo de coagulación utilizando una muestra biológica, adecuada de un individuo, en donde el polipéptido de la reivindicación 1 se adiciona al ensayo; (b) realizar un segundo ensayo de coagulación utilizando una muestra biológica, adecuada del individuo en la ausencia del polipéptido de la reivindicación 1; (c) comparar los resultados del ensayo de los pasos (a) y (b) , en donde la diferencia en los resultados indica la mediación del anticuerpo antifosfolipidos dependiente de la ß2GPI de la coagulación .