MXPA02001017A

MXPA02001017A - Agente multimerico de formacion de imagenes con especificidad hacia el blanco mediante su union a multiples regiones.

Info

Publication number: MXPA02001017A
Application number: MXPA02001017A
Authority: MX
Inventors: Zhang Zhaoda
Original assignee: Epix Medical Inc
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-08-12
Also published as: KR20020057946A; NZ517017A; CN1626246A; HUP0202635A3; HUP0202635A2; US6652835B1; NO20020474L; JP2003505519A; NO20020474D0; BR0013171A; IS6241A; HK1048952A1; US20040005274A1; YU6502A; CA2384565A1; EP1210124A2; PL353336A1; AU6386000A; CZ2002343A3; IL147854A0

Abstract

La presente invencion se relaciona a los agentes de contraste para la formacion de imagenes para uso en diagnosticos. En particular, esta invencion se relaciona a compuestos multimericos novedosos que exhiben propiedades mejoradas de capacidad de relajacion al momento de unirse a proteinas endogenas o a otros sitios fisiologicamente relevantes. Los compuestos consisten de: (a) dos o mas Entidades Intensificadoras de Imagen (IEM) (o Entidad Generadora de Senal) que comprende multiples subunidades; (b) dos o mas Entidades de Union al Blanco (TBM), lo que proporciona para una localizacion in vivo y una rigidificacion de multimeros; ( c) una estructura de andamiaje para la union de las entidades anteriores; y (d) ligadores opcionales para la union de los IEM al andamiaje. Esta invencion tambien se relaciona a condiciones farmaceuticas que comprenden estos compuestos y a metodos para utilizar los compuestos y composiciones para la intensificacion del contraste en la formacion de imagenes de uso en diagnosticos.

Description

AGENTE MULTIMERICO DE FORMACIÓN DE IMÁGENES CON ESPECIFICIDAD HACIA EL BLANCO MEDIANTE SU UNIÓN A MÚLTIPLES REGIONES CAMPO TÉCNICO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a los agentes de contraste para la formación de imágenes para el diagnóstico. En particular, esta invención se relaciona a compuestos multiméricos novedosos que exhiben una afinidad mejorada para los blancos fisiológicamente relevantes, como proteínas, y propiedades de capacidad de relajación sorprendentemente mejoradas al momento de la unión. Los compuestos comprenden: a) dos o más Entidades Intensificadoras de la Imagen ("IEM" por sus siglas en inglés); b) dos o más Entidades de Unión al Blanco ("TBM", por sus siglas en inglés) , que se proporcionan para la localización y la rigidización del multímero in vivo ; c ) una estructura de andamiaje para que se unan las entidades anteriores ("andamiaje"); d) ligadores opcionales para la unión de los IEM al andamiaje ("ligador"). Esta invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y con métodos para utilizar los compuestos y composiciones para la intensificación del contraste durante la formación de imágenes .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las técnicas para la formación de imágenes para el diagnóstico, la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) , rayos X, formación de imágenes nucleares radiofarmacéuticas, formación de imágenes por luz ultravioleta-visible-infrarroja, ultrasonido, se han usado en el diagnóstico médico durante varios años. Además se ha utilizado el medio de contraste para mejorar e incrementar la resolución de la imagen para proporcionar información a un diagnóstico específico. En algunos casos, como en la formación de imágenes con ultrasonido, la introducción de medios de contraste ha sido reciente. Para ser efectivo, el medio de contraste debe de interferir con la longitud de onda de la radiación electromagnética que se utiliza en la técnica de formación de imágenes, alterar las propiedades físicas del tejido para producir una señal alterada, o en el caso de los productos radiofarmacéuticos, proporcionar la fuente de radiación por sí misma. Los métodos MRI y ópticos para la formación de imágenes son únicos entre las modalidades de formación de imágenes debido a que producen señales complejas que son sensibles a un ambiente químico. ientras que la señal de rayos X o de agentes radionúclidos permanece igual no importando si los agentes se encuentran libres en el plasma, unidos a las proteínas u otros blancos, o atrapados dentro del hueso, ciertos agentes de contraste para MRI y la formación óptica de imágenes tendrán diferentes características de señal en los diferentes ambientes fisiológicos. Un colorante óptico puede exhibir cambios en su absorbancia, reflectancia, fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, difracción u otras propiedades espectrales al momento de la unión. Es importante que el agente de contraste sea lo suficientemente sensible y que esté presente a una concentración lo suficientemente alta para que se puedan observar los cambios de señal.

Intentos de mejorar el contraste al incrementar el número de los IEM Los agentes con especificidad hacia el blanco deben suministrar concentraciones significativas de la entidad formadora de imágenes hacia el blanco para que se pueda observar una mejora suficiente en la señal durante el transcurso de la formación de imágenes. Es un problema significativo el poder lograr la sensibilidad suficiente en particular para el MRI, en donde se requiere concentraciones en la gama de 10-1000 micromolar (µM) de la P 61 entidad intensificadora de imagen para producir una señal adecuada. El problema puede complicarse aún más para los agentes con especificidad hacia el blanco si el blanco deseado se encuentra presente a bajas concentraciones. Por ejemplo, a fin de producir una imagen de receptores biológicos blanco que se encuentran presentes a concentraciones menores a las µM, se requiere una mayor intensificación de la imagen en el sitio del blanco para proporcionar un contraste suficiente de la imagen. Se ha abordado un contraste incrementado al utilizar (1) vehículos para el suministro de fármacos para proporcionar altas concentraciones localizadas del agente de contraste, (2) IEM múltiples en un solo agente de contraste, [ver, por ejemplo, Martin V.V. , et al., Bioconjug. Chem., 6: páginas 616 a 623 (1995); Shu la, R. et al., Mag. Reson, Med., 35: páginas 928 a 931 (1996); Ranganathan, R.S., et al., Invest. Radiol., 33: páginas 779 a 797 (1998)], ó (3) IEM particulares de estructura definida con propiedades mejoradas de intensificación de señal. Para incorporar una gran cantidad de entidades intensificadoras de imagen en un agente de contraste, se han empacado altas concentraciones de agentes de contraste de bajo peso molecular dentro de vehículos adecuados para la administración de fármacos, como vehículos polimerizados o liposomas [Bulte J. W. , et al., J. Magn. Reson.

Imaging, 9: páginas 329 a 335 (1999)]. Desafortunadamente, estos materiales son difíciles de dirigir hacia el blanco. Para incrementar la cantidad de las entidades intensificadoras de imagen, los investigadores han creado polímeros, dendrímeros y compuestos orgánicos en asociación con varios IEM. Grandes cantidades de IEM, como quelatos de Gd (III) para MRI, pueden unirse de manera covalente a los polímeros [Schuhmann-Giampieri, G. et al., J. Invest. Rad., 26: páginas 969 a 974 (1991); Corot, C. et al . Acta Rad., 38:S412 páginas 91 a 99 (1997)] dendrímeros [Jacques, V., et al., J. Alloys Cmpd. , 249: páginas 173 a 177 (1997); Margerum, L.D., et al., J. Alloys Compd. , 249: páginas 185 a 190 (1997); Toth, E., et al., Chem. Eur.

J., 2: páginas 1607 a 1615 (1996)]. Los agentes poliméricos comprenden normalmente una mezcla de especies con una amplia y compleja distribución de pesos moleculares. Estas propiedades heterogéneas afectan adversamente el desempeño del agente y hacen algo difícil su caracterización. Más aún, es sintéticamente difícil introducir de manera selectiva los TBM junto con los diversos IEM. Por lo tanto, existe la necesidad de moléculas homogéneas y bien definidas para utilizarse a manera de agentes de contraste y que puedan proporcionar una intensificación adecuada de la imagen del blanco. Los dendrímeros (como "dendrímeros estrellados", o "polímeros en cascada") ofrecen teóricamente una sola especie de alto peso molecular a la cual se pueden unir de manera covalente varios IEM. [Fischer, M. Et al., Angew. Chem., Int. Ed. Eng., 38/7: páginas 884 a 905 (1999); Weiner, E.C. et al., Mag. Reson. Med., 31: páginas 1 a 8 (1994)]. Sin embargo, los dendrímeros, al igual que los agentes poliméricos, presentan problemas sintéticos significativos, especialmente cuando se introducen de manera selectiva a los grupos dirigidos específicamente hacia los tejidos. Se han sintetizado las moléculas orgánicas con varias entidades intensificadoras de imagen. Los agentes de contraste para MRI de este tipo se refieren en la presente como "quelatos multiméricos" o "multímeros" y comprenden normalmente 2-12 IEM. [Shukla, R. et al., Mag. Reson. Med., 35: páginas 928 a 931 (1996); Shukla, R. B., et al., Acta Radiol., 412: páginas 121 a 123 (1997); Ranganathan, R.S., et al., Invest. Radiol., 33: páginas 779 a 797 1998)]. Las ventajas de los quelatos multiméricos incluyen que: (1) son moléculas homogéneas en el sentido de que tienen una sola estructura y tamaño, a diferencia de los polímeros y los dendrímeros, (2) se pueden sintetizar y purificar fácilmente y (3) los grupos con especificidad por el blanco pueden incorporarse fácilmente. Desafortunadamente, la habilidad de los quelatos multiméricos de mejorar la intensidad de señal del MRI ha sido decepcionantemente baja. Esto es debido a que la intensificación del índice de relajación protónica (o "capacidad de relajación"), y que se correlaciona con la intensificación de señal, disminuye mientras que el número de IEM sea incrementado. Por lo tanto, se necesitan los agentes de contraste en donde la capacidad de relajación no disminuya cuando el número de IEM se incremente para lograr una mayor intensificación de la señal en un blanco.

Intento de mejorar el contraste al disminuir el movimiento giratorio del agente de contraste Se han hecho intentos de incrementar la capacidad de relajación de los agentes multiméricos de contraste para MRI sin especificidad de blanco al restringir el movimiento giratorio. Los intentos para restringir el movimiento giratorio se han enfocado en (1) disminuir la flexibilidad de la molécula ó (2) restringir el movimiento giratorio mediante la unión a un blanco . Por ejemplo, los agentes sin especificidad de blanco se han sintetizado con estructuras rígidas, las cuales se unen a varios quelatos Gd (III) [Shukla, R.B., et al Reson. Med., 35: páginas 928 a 931 (1996); Shukla, R.B., et al., Acta Radiol., 412: páginas 121 a 123 (1997); Rangan than, R.S., et al., Invest. Radiol., 33: páginas 779 a 797 (1998); Jacques, V., et al . , J. Alloys Cmpd. , 249: páginas 173 a 177 (1997)]. Sin embargo, estas estructuras tienen diversos inconvenientes. En primera, las capacidad de relajaciones por ion de Gd (III) que se han logrado para los agentes que contienen más de dos quelatos ha sido menor que la que conserva para los quelatos únicos, tales como el MS-325. Por lo tanto, el movimiento localizado del quelato puede reducirse aún más. Segunda, estos agentes no se encuentran apuntados hacia el blanco. Y con mayor importancia, incluso si tienen especificidad por el blanco, las estructuras rígidas de multímeros incrementarían bastante la señal de fondo indeseada debido a que la intensificación de la señal es significativa sin importar si el agente de contraste está o no unido al blanco. Por lo tanto, existe una necesidad de agentes de contraste que intensifiquen una imagen o el blanco solamente cuando se unan al blanco. El movimiento giratorio de un solo IEM puede limitarse efectivamente al momento de la unión no covalente al blanco, lo que resulta en un incremento de la capacidad de relajación o a las formas unidas al blanco en hasta 5-10 veces [Patente de EE.UU. de EE.UU. No. 4,880,008]. Este incremento en la capacidad de relajación protónica es tan bueno o mejor que el que se observa para los IEM que se unen covalentemente al blanco [Schimiedl, U. , Ogan, M. , P1461 Paajanen, H. , Marotti, M. , Crooks, L.E., Brito, A.C., y Brasch, R.C. Radiology (1987) 162: páginas 205 a 210; Ogan, M.D, Schmiedl, U., Moseley, M.E., Grood, W. , Paajanen, H. , y Brasch, R.C. Invest. Radiol. (1987) 22: páginas 665 a 671] . Los ejemplos de los agentes que explotan este efecto son los agentes de contraste dirigidos hacia las proteínas hepáticas Gd-EOB DTPA [Runge V.M. Crit. Rev. Diagn. Imaging 38: páginas 207 a 230 (1997)] y Gd-BOPTA [Kirchin M.A. , et al., Invest. Radiol., 33: páginas 798 a 809 (1998)] los agentes apuntados hacia la albúmina MS-325 [Lauffer, R.B., et al., Radiology, 207: páginas 529 a 538 (1998)] y MP-2269 [Hofman Mark B.M. et al. Academic Radiology, 5 (suppl 1): S206-S209 (1998)]. Se registran incrementos en la capacidad de relajación de aproximadamente 7 veces para MS-325 (47 mM"1s~1) como resultado de una unión no covalente a la albúmina sérica [Lauffer, R.B., et al., Radiology, 207: páginas 529 a 538 (1998)] .

Figura 1: Estructura Química del Agente de Contraste para P1461 MRI MS-325 Al momento de unirse a la albúmina, el agente monomérico de contraste MS-325, que tiene la estructura química que se muestra en la Figura 1, exhibe un incremento en la intensificación de señal. Cuando se une, el complejo se da volteretas a una velocidad más lenta que en el estado no unido, lo que resulta en una mayor capacidad de relajación. Sin embargo, de manera sorprendente, la adición de varios IEM a los agentes de contraste con especificidad por el blanco, tales como el MS-325, no ha podido intensificar el contraste aún más, debido a que la capacidad de relajación disminuye en los centros individuales de gadolinio en la estructura ultimérica. Por ejemplo, un multímero dirigido hacia la albúmina con cuatro iones Gd(III) exhibe capacidades de relajación molecular por cada Gd(III) de solamente 9-13 mM"1s"1 en comparación a la capacidad de relajación de 47 mM"1s~1 para MS-325, que contiene un solo Gd(III) [Martin V.V. , et al., Bioconjug. Chem., 6: páginas 616 a 623 (1995)]. Por lo tanto, la capacidad de relajación del quelato multimérico con especificidad al blanco es normalmente mucho menor por Gd(III) que la que se observa para un solo quelato análogo con especificidad.

Exposición razonada P1461 # La Tabla 1, demuestra que simplemente el incrementar el número de IEM no es suficiente para mejorar la capacidad de relajación total debido a que la capacidad de relajación por IEM disminuye mientras que el número de IEM se incrementa a pesar de la presencia del grupo que se une al blanco, que comprende dos anillos de fenilo. Para comprender mejor la Tabla 1, es importante definir la magnitud a la cual el agente de contraste MRI que se une al blanco puede lograr su máxima capacidad de relajación posible. Esta máxima capacidad de relajación para un agente de contraste en particular es aproximadamente igual a la capacidad de relajación de la molécula cuando se une al blanco (Rlunido) . tal como la Albúmina Sérica Humana (HSA) . El Rlunido promedio es una medida normalizada de la capacidad de relajación promedio para todos los tipos unidos bajo un grupo estándar de condiciones (tal como blanco específico o concentración de proteínas, concentración del fármaco, temperatura, etc.) que se pondera por la población que se unió de cada especie. Por lo tanto, ya que el valor de Rlunido unido es una cantidad normalizada, se pueden hacer las comparaciones de las capacidad de relajaciones entre las diferentes moléculas en el estado unido al comparar los valores para RlUnido La comparación de los valores calculados para Rlunio proporciona un método conveniente para comparar los P1461 compuestos sin importar sus afinidades por un blanco. Para calcular el promedio de (Rlunido) se requiere cuantificar la capacidad de relajación del quelato libre (Rliibre) así como la capacidad de relajación observada (Rlobs) y el porcentaje de unión del agente a una solución blanco que contiene normalmente 4.5% del blanco, por ejemplo, HSA. El Rl0bs es un promedio ponderado de la fracción molar (x) de Rliibre Y Rl-mido: Rlobs - xl-.breRll?bre + ?XiRlunido, i 1 en donde x^hre + ?x-. = 1 1 y 2JXX = Xunido 1 Por lo tanto : RIUn?do — Rlobs ~ XI íbreRl libre Xunido Las estructuras químicas y las capacidades de relajación unidas de una serie de agentes en contraste con especificidad por la albúmina se muestran en la Tabla 1. En este grupo de compuestos, un compuesto con un solo IEM (es decir, MS-325) se compara con una serie de multímeros que comprenden varios IEM, pero la misma TBM, difenilciclohexil albúmina y el grupo de fosfato de metileno se encuentran presente en todos los compuestos.

P1461 Tabla 1. Estructuras químicas y capacidades de relajación en la unión de una serie de agentes de contraste con especificidad por la albúmina. La entidad de unión con especificidad, difenilciclohexilo, (TBM) permanece constante.

La Figura 2 es una representación gráfica de los mismos datos que se muestran en la Tabla 1. El RIUnido promedio por cada IEM, en este caso un quelato de Gd(III) , a 20MHz, se gráfica contra el número de IEM.

Figura 2. Gráfica de capacidad de relajación unida (por cada gadolinio) para una serie de agentes multiméricos de contraste que contienen un solo grupo de unión a proteína, difenilciclohexilo . ? medida que el tamaño del -multímero se incrementa, los datos indican que la capacidad de relajación por gadolinio disminuye.

Número de quelatos por agente de contraste P1461 . . i . i S En las moléculas de la Tabla 1 y Figura 2, tanto la estructura del quelato de gadolinio (IEM), el grupo de fosfato de metileno, como el grupo de difenilciclohexilo (TBM) permanecen constantes. Los datos de la Tabla 1 y Figura 2 muestran que mientras el número de iones de metales paramagnéticos quelados se incrementa, la capacidad de relajación por ion metálico se reduce. El número de quelatos de Gd(III) varía desde uno (MS-325) hasta cuatro, pero a pesar de este incremento de cuatro veces en el número de IEM, la capacidad de relajación total se incrementa solamente en aproximadamente un 50%, este incremento modesto en la capacidad de relajación total es una consecuencia de la capacidad de relajación disminuida por ion de Gd(III) . Hay que notar que el promedio de RlUmdo po Gd(III) disminuye de 47 mM"1s"1 a 14.9 mM"1s"1 a pesar del agente de contraste que se está uniendo. Esta disminución es debida a un movimiento localizado de quelatos que se incrementa de manera sorprendente con el número de IEM a pesar de los diversos anillos aromáticos en el único TBM. Aparentemente, al incrementar el número de entidades quelantes, también se incrementa la libertad giratoria de la molécula, por lo menos cerca de los sitios de quelación del gadolinio. La diminución de la capacidad de relajación es especialmente notable mientras se va incrementando el tamaño más allá de dos iones quelados de gadolinio por molécula de multímero. Por ejemplo, en el caso de M8-03, la capacidad de relajación total por gadolinio solamente es de aproximadamente 15 mM"1s"1, aproximadamente un tercio de la que se observa para el MS-325. La capacidad de relajación total para el compuesto M8-03 es, por lo tanto, solamente de 60 mM"1s"1, solamente 1.3 veces de MS-325 aunque se encuentran presentes cuatro veces más IEM. Obviamente, este incremento modesto en la capacidad de relajación no justifica la complejidad sintética agregada y el costo agregado para desarrollar estos agentes para una formación de imágenes MR in vivo . Por lo tanto, la combinación simple de las diversas entidades intensificadoras de imagen con una sola entidad de unión al blanco no generan un incremento conmensurado en la capacidad de relajación. Por lo tanto, existe la necesidad de sintetizar agentes de contraste multiméricos para el MRI en donde la capacidad de relajación en cada quelato se mantiene incluso mientras que el número IEM se incrementa. En general, la inmovilización de un agente de contraste unido al objetivo puede ser extraordinariamente efectiva para aumentar la capacidad P1461 de relajación para un solo quelato (por ejemplo, MS-325), pero es más bien ineficaz para los quelatos multiméricos. Esto es, que a fin de aumentar la capacidad de relajación en cada sitio del quelato, es necesario reducir el tiempo general de correlación giratoria para la molécula, para reducir el movimiento localizado del quelato en cada sitio de quelación. Permanece la necesidad de contar con un mecanismo que inmovilice de manera eficiente los agentes de contraste multiméricos que se unen al blanco para que pueda producirse una intensificación de señal más efectiva durante la formación de imágenes. Se necesita un método para mejorar el contraste de la señal en blancos específicos. Se ha abordado el problema al (1) incrementar la cantidad de IEM, ó (2) disminuir la flexibilidad de la molécula. El incrementar la cantidad de IEM ha sido infructuoso debido a que los agentes de contraste no son de un tamaño y estructura homogéneas, tienen dificultades sintéticas, son difíciles de dirigir hacia el blanco, o no pueden incrementar el contraste proporcionalmente con el incremento en la cantidad de IEM. El disminuir la flexibilidad ha sido infructuoso debido a que los agentes rígidos de contraste crean una gran interferencia de trasfondo cuando no están unidos. La P1461 unión de un multímero a un blanco a través de un solo TBM no es suficiente tanto para disminuir la flexibilidad como para incrementar la capacidad de relajación de manera significativa. Por lo tanto, permanece la necesidad de mejorar el contraste en blancos específicos o de incrementar la cantidad de IEM mientras que se disminuye simultáneamente la flexibilidad de la molécula solamente cuando se une al blanco .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención actual proporciona un mecanismo para mejorar por mucho la eficacia de los agentes de contraste in vivo . Son posibles grandes mejoras en el contraste al ruido (señal) del blanco si los agentes multiméricos de contraste son flexibles en el estado no unido (lo que resulta de una baja de capacidad de relajación y un débil señal) y menos flexibles en el estado unido (lo que resulta de una alta capacidad de relajación y una señal fuerte) . Esto es, es más importante rigidizar el agente multimérico de contraste en el estado unido que en el estado no unido ya que esto minimiza el trasfondo en el estado no unido mientras que una alta capacidad de relajación se mantiene en el estado unido. Estos agentes se unen a P1461 la proteína u otros blancos específicos mediante interacciones no covalentes en dos o más regiones. La unión a múltiples regiones logra incorporar dos o más TBM en el agente, cada uno de los cuales tiene algo de afinidad para uno o más sitios en el blanco. Más específicamente, la invención se relaciona al uso de interacciones no covalentes "a múltiples regiones" entre un agente de contraste con IEM múltiples (un "multímero") y un blanco para simultáneamente 1) inducir la unión al blanco (lo cual nos da especificidad), 2) anclar varios IEM al blanco y 3) de esta forma rigidizar la estructura IEM múltiple. Un aspecto clave de la invención es que el agente de contraste es menos flexible en el estado unido que en el estado no unido. La unión del agente de contraste al blanco incrementa la capacidad de relajación y la intensidad de la señal de un IEM de quelato metálico para incrementar el período de tiempo general de la correlación giratoria del ion metálico (vector atómico de formación de imágenes), es decir, al limitar el movimiento giratorio. La unión a múltiples regiones permite una mayor intensificación de la capacidad de relajación o que disminuye la flexibilidad de la estructura de quelatos múltiples en el estado unido, tanto generalmente como en los sitios localizados en P1461 donde ocurre un movimiento de quelato. La flexibilidad de la molécula en el estado no unido proporciona ventajas particulares sobre los agentes MRI multiméricos previamente descritos con estructuras rígidas que ligan los quelatos sin ninguna diferencia en rigidez entre un estado unido y no unido. [Ranganathan, R.S., et al., Invest. Radiol., 33: páginas 779 a 797 (1998)]. El concepto de unión a múltiples regiones para quelatos multiméricos se muestra de manera esquemática en la Figura 3.

Figura 3. Dibujo esquemático que muestra los componentes clave de un agente multimérico de contraste ejemplificativo que se une a un blanco mediante interacciones a múltiples regiones .

-K?dDTPA GdDTPA GdDTPA GdDTPA lEMs P1461 1) Los TMB múltiples separados promueven la unión al blanco (lo cual da especificidad y afinidad mejorada). Los TBM pueden ser los mismos o diferentes. 2) Cuando se unen al blanco, los TBM anclan la estructura multimérica en diversas regiones a lo largo del andamiaje, lo cual hace más rígida la estructura de quelatos múltiples. 3) La capacidad de relajación se intensifica en un mayor grado cuando está unida, que cuando está libre en solución, lo cual mejora el contraste de la formación de imágenes en un blanco específico. Además de las mejoras en el contraste de imagen, esta invención ofrece ventajas sintéticas. Una estructura química sintéticamente rigidizada (tal como un anillo fusionado o un macrociclo complejo) no es necesaria ya que la inmovilización y rigidificación ocurran al momento de las uniones a múltiples regiones en el blanco. Por lo tanto, hay menos limitaciones en la estructura química. Los beneficios adicionales incluyen: a) La unión a múltiples regiones incrementa la afinidad de proteínas y proporciona una mayor especificidad por el blanco en comparación a una sola interacción [Kramer, R.H. y Karpen, J.W., Nature, 395: páginas 710 a 713 (1998); Clackson, T. et al., P1461 _ ¡¡ Proc. Nati. Acad. Sci., 95: páginas 10437 a 10442 (1998); Rao, J. et al., Science, 280: páginas 708 a 711 (1998); Mann, D.A., et al., D.A., et al., J. Am. Chem. Soc, 120: páginas 10,575-10 a 10,582 (1998); Spevak, W. et al., J. Med. Chem., 39: páginas 1018 a 1020. (1996); Lee, R.T. et al., Arch. Biochem. Biophys., 299: páginas 129 a 136 (1992)]. b) La unión a múltiples regiones disminuye la velocidad a la cual el agente se disocia del blanco. Al incrementarse el período de tiempo en que el agente permanece unido se origina un mayor período de utilización de la herramienta de diagnóstico. c) La unión a múltiples regiones disminuye la flexibilidad de la estructura de quelatos múltiples, reduce el movimiento localizado de quelatos, y de esta forma, mejora la capacidad de relajación en cada centro metálico. La rigidificación del agente de contraste en el estado unido en comparación con la molécula libre, ocurre solamente al momento de la unión para producir un mayor contraste en la formación de imágenes. La molécula en estado libre induce un cambio de señal relativamente pequeño en comparación al estado unido; consecuentemente una diferencia sorprendentemente mayor entre la señal inducida por la forma unida en relación a la señal inducida por la molécula en estado libre que P1461 se puede lograr. Los agentes de contraste que son rígidos tanto en el estado unido como no unido carecen de esta propiedad. d) El cambio dependiente de la unión en la intensidad de señal también es aplicable a otras modalidades de formación de imágenes, en donde un cambio de intensidad de señal puede acompañar la unión, tal como en la formación óptica de imágenes. La intensidad de señal puede incrementarse o disminuirse al momento de la unión. En algunos casos, la señal disminuida ha mostrado correlacionarse con la rigidez de la molécula [Rimet, O., Chauvet, M. , Dell'Amico, M., Noat, G., y Bourdeaux, M. Eur. J. Biochem. (1995) 228: páginas 55 a 59] . En otros casos, la señal se incrementa al momento de la unión [Sudlow G., Birkett D.J., y Wade D.N. Mol. Pharmacol. 12: páginas 1052 a 1061 (1976); Sudlow G., Birkett D.J., y Wade D.N. Mol. Pharmacol. 11: páginas 824 a 832 (1975); Kane C.D. 35 y Bernlohr, D.A. Anal. Biochem. 233: páginas 197 a 204; Lakowica, J.R. Principies of Fluorescence Spectroscopy Plenum Press, New York, NY, páginas 211 a 213 (1983)]. La unión a múltiples regiones puede proporcionar ya sea una intensidad de señal muy disminuida (y por lo tanto un contraste de señal muy incrementado) o una intensidad muy incrementada en P1461 comparación con el agente de contraste óptico o solamente un solo TBM. En cualquier caso, el cambio en la intensidad de señal en el sitio blanco resulta en un contraste de señal mejorada como resultado de la unión del agente de contraste. Los agentes de contraste de unión a múltiples regiones de la invención comprenden varios IEM, un andamiaje al cual se unen varios IEM directamente o mediante ligadores opcionales, por lo menos dos TBM separados. Los TBM pueden ser los mismos o diferentes. En algunos casos, el andamiaje puede comprender al propio IEM o parte del IEM, por ejemplo, algunas entidades quelantes también pueden servir a manera del andamiaje o como parte del andamiaje. Estos compuestos aglutinantes multiméricos/de múltiples regiones son únicos en que el movimiento localizado de los IEM está restringido y la capacidad de relajación de unión se intensifica bastante durante una unión no covalente de por lo menos dos TBM al blanco en diversas posiciones separadas a través de la estructura multimérica. Estas interacciones permiten que el multímero se una a la proteína blanco en una forma "pseudo-cíclica" o similar a "cremallera". Este tipo de unión disminuye sorprendentemente la flexibilidad a través del multímero, lo que incluye los P1461 TBM, el andamiaje, los IEM individuales. Por lo tanto, los IEM incluyen los quelatos, el movimiento localizado de quelatos se reduce y se observan señales MRI marcadamente intensificadas con los multímeros ya que la capacidad de relajación se incrementa en cada IEM. Este incremento distingue a los agentes de contraste de la presente invención de aquellos de la técnica anterior que se aglutinan a través de un solo TBM y que, por lo tanto, no están "pseudo-ciclizados " o "en cierre de cremallera" al sitio blanco específico. El contraste se intensifica aún más con estructuras de unión multiméricas/de múltiples regiones ya que también producen una señal relativamente débil en el estado no unido . La invención tiene una tremenda utilidad para todas las aplicaciones ópticas de MRI con especificidad por el blanco, incluyendo la especificidad por el blanco hacia los agentes de intensificación de imagen para estructuras biológicas, tales como la albúmina sérica y otros blancos relevantes en el diagnóstico, tales como coágulos sanguíneos, particularmente en aquellas aplicaciones en donde los diversos sitios de unión para el agente de contraste de unión multimérica/a múltiples regiones existe. Estos sitios de unión no necesitan ser idénticos, simplemente en lo P1461 suficientemente similares para unirse de manera simultánea con los TMBs en el agente de contraste.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el fin de que pueda comprenderse más completamente la invención descrita en la presente, se expone la presente descripción detallada. Las abreviaturas químicas comúnmente utilizadas si no están explícitamente definidas ein esta solicitud pueden hallarse en The American Chemical Society Style Guide; Second Edition; American Chemical Society, Washington, D.C. (1997) o Journal of Organic Chemistry; Guidelines to Authors (Revised May 2000), Copyright © 2000 American Chemical Society also available at . http : / /pubs . acs . org/ instruct / j oceah .pdf .

Las publicaciones que se citan en la presente se incorporan a las referencias . Para los propósitos de esta solicitud, el DTPA se refiere a una estructura de cualquiera de las fórmulas (I) - (IV) : P1461 El término "afinidad específica" como se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad del agente de contraste para poder ser captado o retenido por un componente biológico en particular , o para poder unirse al mismo en un grado substancialmente mayor que los demás P1461 componentes. Los agentes de contraste que tienen esta propiedad se dice que son "dirigidos" específicamente "hacia" el componente "blanco" . Los agentes de contraste que carecen de esta propiedad, se dice que son agentes "no específicos" . El término "capacidad de relajación" como se utiliza en la presente, se refiere al incremento en cualquiera de las cantidades 1/T? ó 1/T2 por concentración milimolar (mM) del ion paramagnético, en donde Ti es el tiempo de relajación longitudinal o espín-red cristalina , T2 es el tiempo de relajación transversal o espín-espín de los protones de agua o de otros núcleos espectroscópicos o de formación de imágenes, incluyendo los protones hallados en las moléculas diferentes al agua. Las unidades de capacidad de relajación son mM~1s"1. El término "sitio abierto de coordinación" como se utiliza en la presente se refiere a un sitio en un quelato metálico que generalmente está ocupado por agua o moléculas de solvente. El término "constante de formación" para los propósitos de la presente, se define como la constante del equilibrio para la reacción que describe la formación del compuesto . El término "multímero" para los propósitos de la presente, se define como un agente de contraste o una P1461 subunidad de éste que comprende dos o más IEM. El término "múltiples regiones" para los propósitos de la invención se refiere a dos o más posiciones de unión covalente de TBM al "andamiaje" (definido a continuación) de un agente de contraste. El término "unión a múltiples regiones" para los propósitos de la invención se refiere a interacciones no covalentes de dos o más TBM con un blanco. Estas interacciones no covalentes son independientes entre sí y pueden ser, inter alia, hidrofóbicas, hidrofílicas, dipolares-dipolares, de apilamiento-pi, o interacciones ácido-base de Lewis. El término "estructura pseudo-cíclica" para los propósitos de la presente, se refiere a un agente de contraste unido aun blanco a través de interacciones no covalentes, en dos diferentes regiones o posiciones mediante dos TBM. (ver Figura 4) .

P1461 Figura 4. Ejemplos representativos de estructuras de unión a múltiples regiones. t indica las interacciones no covalentes estructuras aglutinadoras en "cremallera" El término "estructura de cremallera" para los propósitos de la presente, se refiere a un agente de contraste unido mediante interacciones no covalentes a un blanco en tres o más posiciones diferentes mediante tres o más TBM (ver Figura 4) . La presente invención se refiere a compuestos novedosos que intensifican el contraste en la formación de imágenes para el diagnóstico, luego de una disminución en la flexibilidad al momento de unirse a un blanco. Estos compuestos comprenden: P1461 * t„ai a) dos o más Entidades Intensificadoras de la Imagen ( " IEM" ) ; b) dos o más Entidades de Unión al Blanco (TBM) , se proporcionan para la localización in vivo y la rigidificación de multímeros; c) una estructura de andamiaje para la unión de los anteriores ("andamiaje"); d) ligadores opcionales para la unión de los IEM al andamiaje ("ligador"). Las técnicas para la formación de imágenes para el diagnóstico contemplados para utilizar con esta invención incluyen, en forma irrestricta, el IEM de la formación de imágenes de luz ultravioleta-visible-infrarroja.

Entidad intensificadora de la imagen ("IEM") Según la presente invención, el IEM puede ser un producto químico o substancia que se utiliza para proporcionar la señal o para mejorar el contraste durante la formación de imágenes. Además, el IEM o parte de un IEM puede utilizarse opcionalmente como un andamiaje o parte de un andamiaje y puede poseer una función menor de especificidad hacia el blanco. El IEM puede comprender una molécula orgánica, ion metálico o quelato. Se han descrito varios ejemplos de P1461 los IEM [Bonnemain, B. J. Drug Targer . , 6: páginas 167 a 174 (1998); Swanson, D.P., et al., Pharmaceuticals in Medical Imaging: Radiopague Contrast Media, Radiopharmaceuticals, Enhancement Agents for Magnetic 5 Resonance Imaging and Ultrasound, McGraw Hill, Inc., (1990); Johnson, I. Histochem. J., 30: páginas 123 a 140 (1998) ] . Un IEM particularmente útil es un quelato metálico fisiológicamente compatible con uno o más agentes 10 quelantes orgánicos cíclicos o acíclicos acomplejados con uno o más iones metálicos. Los iones metálicos para la formación óptica de imágenes incluyen aquellos con los números atómicos 13, 21-31, 39-42, 44-50, ó 57-83. Los iones metálicos preferidos para este MRI incluyen aquellos 15 con los números atómicos 21-29, 42, 44, ó 57-83, y más preferiblemente una forma paramagnética de un ion metálico con números atómicos 21-29, 42, 44, ó 57-83. Los iones metálicos paramagnéticos particularmente preferidos se seleccionan a partir del grupo que consiste de Gd(III), 20 Fe(III), Mn(II y III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III y IV), Ho(III), Er(III), Pr(III) y Eu(II y III). El más preferido es Gd(III) . Si el IEM es un quelato metálico, no debe de asociarse en ningún grado significativo durante el paso del 25 agente de formación de imágenes a través del cuerpo, P1461 ^_..*_____t*?6*s_ __*__&__ incluyendo mientras se encuentra unido al tejido blanco. La liberación significativa de iones metálicos libres puede resultar en toxicidad, lo cual generalmente no es aceptable. En general, el grado de toxicidad de un quelato metálico se relaciona con su grado de disociación in vivo antes de su excreción. Generalmente, la toxicidad se incrementa con la cantidad del ion metálico libre, esto es, se prefiere una alta constante de formación para prevenir las concentraciones tóxicas de los iones metálicos libres. Son particularmente preferibles las constantes de formación de por lo menos 1015 M"1 ó de por lo menos 1016 M"1, o por lo menos 1017 M_1, ó por lo menos 1018 M"1, ó por lo menos 1019 M" 1 , ó por lo menos 1020 M"1, ó por lo menos 1022 M"1, ó por lo menos 1024 M_1, o más si la cinética de la disociación del ion metálico es muy lenta, entonces puede ser suficiente un complejo que tenga una constante menor de formación, es decir que lo menos 1010M_1. La toxicidad también es una función del número de sitios de coordinación abierta en el complejo. En general, un menor número de sitios de coordinación del agua disminuyen la tendencia del agente quelante a liberar el metal paramagnético . Preferiblemente, y por lo tanto, el complejo contiene dos, uno o ningún sitio abierto de coordinación. La presencia además de dos sitios abiertos P1461 -ftSf incrementará inaceptablemente la toxicidad debido a la liberación del ion metálico in vivo . La capacidad de relajación es Ri y R2, que se define como incremento en 1/T? ó 1/T2, respectivamente, por mM de ion metálico, cuantifica la habilidad del agente de contraste para intensificar la velocidad de relajación del núcleo espectroscópico o de formación de imágenes. Las unidades de capacidad de relajación son mM"1s"1. Para la forma más común del MRI clínico, MRI de protones de agua, la capacidad de relajación es mayor cuando el ion paramagnético unido al ligando quelante aún tiene uno o más sitios abiertos de coordinación para el intercambio de agua (R.B. Lauffer, Chemical Reviews, 87: páginas 901 a 927 (1987)). Sin embargo, esto debe de balancearse con la estabilidad del quelato metálico, que generalmente disminuye mientras se va incrementando la cantidad de sitios abiertos de coordinación, y la toxicidad como se mencionó con anterioridad. Preferiblemente, y por lo tanto, excepto para los quelatos del hierro, Fe (II) ó Fe (III), el complejo contiene solamente uno o dos sitios abiertos de coordinación. Para el Gd(III) se prefieren en su mayoría uno o dos sitios abiertos de coordinación. A fin de intensificar efectivamente las imágenes MRI, el complejo debe ser capaz de incrementar las velocidades de relajación, o las capacidades de relajación, P1461 1/T?, (longitudinal) , o espín-red cristalina) y/o 1T2 (transverso, o espín-espín) del núcleo espectroscópico . El núcleo espectroscópico es preferiblemente un protón de agua, pero otros núcleos espectroscópicos comunes incluyen 31P 13C, 23Na, 19F y protones hallados en las moléculas diferentes al agua. El núcleo espectroscópico puede comprender el IEM, TBM, u otras moléculas o biomarcadores inyectados . En el caso de los paquetes de contraste para MRI, los incrementos en la capacidad de relajación (es l/Tj. ó 1/T2) generalmente ocurren a través de interacciones dipolo-dipolo entre el ion paramagnético del agente de contraste y del núcleo que experimenta la relajación (por ejemplo, el átomo de hidrógeno en moléculas de agua) . Se sabe que la eficiencia de esta interacción dipolar (es decir, la capacidad de relajación) se mejora si la velocidad a la cual el vector definido por los dos dipolos (es decir, el vector definido por el ion paramagnético y el átomo de hidrógeno del agua) que rotan se hace más lenta (R.B. Lauffer, Chemical Reviews, 87: páginas 901 a 927 (1987) ) . El período de tiempo que tarda el vector en difundir de manera giratoria un radián se refiere como "el tiempo de correlación rotacional", el inverso del tiempo de correlación rotacional es la "velocidad rotacional". En P1461 general, las moléculas grandes giran más lentamente en solución que las moléculas más pequeñas. El método para incrementar la capacidad de relajación es formar un aducto no covalente entre un agente de contraste de pequeñas moléculas y una macromolécula. Al formar un aducto, el tiempo de correlación rotacional del vector dipolar probablemente será el mismo que el de la macromolécula. Sin embargo, la molécula pequeña aún puede ser capaz de rotar aproximadamente uno o más ejes (el llamado "movimiento localizado del quelato"). El tiempo de correlación rotacional del vector dipolar es entonces una función de este movimiento localizado del quelato y del movimiento global del aducto de la macromolécula. Los aductos no covalentes de las macromoléculas tienen tiempos de correlación rotacional que son menores o iguales al de la macromolécula misma; mientras menos movimiento localizado del quelato exista, más cercano será el tiempo de correlación rotacional del aducto no covalente que se acerque al de la macromolécula. En el caso de los agentes de contraste de MRI, los incrementos en la capacidad de relajación ocurren generalmente a través de interacciones dipolo-dipolo entre el ion metálico entre del agente de contraste y núcleo que experimentan las relajaciones (por ejemplo, los átomos de hidrógeno del agua) . Además de incrementar los valores P1461 1/T? ó 1/T2 de los núcleos de tejido por medio de interacciones dipolo-dipolo, los agentes MRI pueden afectar otras dos propiedades magnéticas que incrementan su uso y valor para los propósitos clínicos: 1) un IEM contiene un quelato metálico con una alta susceptibilidad magnética, particularmente los quelatos de Dy, Gd, Tb ó Ho, pueden alterar la intensidad de la señal de MRI del tejido al crear gradientes microscópicos de susceptibilidad magnética (A. Villringer et al, Magn, Reson. Med., 6: páginas 164 a 174 (1988)). No se requieren sitios abiertos de coordinación en quelato para esta aplicación. 2) Un quelato metálico (por ejemplo Tm o Dy) que contiene IEM, también puede utilizarse para cambiar la frecuencia de resonancia del núcleo espectroscópico. El núcleo espectroscópico preferiblemente es un protón de agua, pero otros núcleos espectroscópicos comunes incluyen 31P, 13C, 23Na, 19F y los protones hallados en moléculas diferentes al agua. Los núcleos espectroscópicos pueden comprender el agente de contraste, el blanco o el agua. En la presente, dependiendo del núcleo y la estrategia utilizada, se pueden emplear desde cero a tres sitios abiertos de coordinación. Se pueden utilizar una diversidad de ligandos quelantes a manera de entidades IEM en diversas modalidades P1461 de la invención. Estos ligandos quelantes incluyen, pero no se limitan a los derivados del ácido dietiléntriamina pentaacético (DTPA) y derivados de éste; 1,4, 7-triazaciclononano; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano (Cyclen) y derivados de éstos; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 7-bis (ter-bu-éster del ácido acético) (D02A-t-bu-éster) ; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4, 7-tris (t-bu-éster de ácido acético) (D03A-t-bu-éster) ; 1,4,7, tris (ter-butoxicarbonil) -1,4, 7-tetraazaciclododecano (D03-t-BOC) ; ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4, 7 , 10- tetraacético (DOTA) y derivados de éstos; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4,7, 10-tetrakis (ácido metilenfosfónico) (DOPT) ; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4, 7, 10-a, a', a'1, a''*-tetrakis (ácido metilacético) (DOTMA) ; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1 , 4,8, 11-tetraacético (TETA) ; etilenbis- (2-hidroxi-fenilglicina) (EHPG) y derivados de éstos, incluyendo 5-C1-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu- EHPG, y 5-sec-Bu-EHPG; ácido benzodietiléntriamin-pentaacético (benzo-DTPA) y derivados de éste, incluyendo dibenzo-DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA y dibencil-DTPA; ácido bis-2 (hidroxibencil) -etilén- P1461 ^*- as^a¿ diamindiacético (HBED) y derivados de éstos, el tipo de compuestos macrocíclicos que comprende por lo menos 3 átomos de carbono, más preferiblemente, por lo menos 6, y que comprenden por lo menos dos heteroátomos (0 y/o N) , los compuestos macrocíclicos pueden comprender un anillo, o dos o tres anillos unidos conjuntamente a los elementos del anillo del heteroátomo, por ejemplo, benzo-DOTA, dibenzo-DOTA y benzo-NOTA, en donde NOTA es ácido 1,4-triazaciclononan-N-N' ,N' ' -triacético, benzo-TETA, benzo-DOTMA, benzo-TETMA, en donde TETMA es 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1, 4,8, 11- (ácido metil tetraacético) ; derivados del ácido 1,3-propilendiamintetraacético (PDTA) y ácido trietiléntetraaminohexaacético (TTHA) ; y derivados de 1, 5 , 10-N-N' ,N' ' -tris (2 , 3-dihidroxibenzoil) aminometilbenceno (MECAM) . Se conocen en la técnica varios ligandos quelantes adecuados para los agentes MRI . Estos quelatos metálicos pueden también utilizarse para otras formas de formación biológica de imágenes (por ejemplo, formación óptica de imágenes) . De hecho, se han escrito recientemente una serie de agentes de contraste de detección por fluorescencia [Hüber, M.M et al., Bioconjug Chem., 9: páginas 242 a 249 (1998)]. Para la formación de imágenes de MRI, los IEM preferidos incluyen los quelatos P1461 de gadolinio paramagnético tales como el ácido gadolinio dietiléntriaminopentaacético (GdDTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N'N, "N, " ' -tetraacético de tetramina de gadolinio (GdDOTA) y ácido 1,4,7-10 tetraazaciclododecan-1-, 4, 7-triacético de gadolinio (GdD03A) . Se sabe en la técnica que se pueden substituir otros metales por Gd(III) en ciertas aplicaciones. Un quelante preferido para la invención es el DTPA. Los ejemplos de los quelantes representativos de los grupos quelantes contemplados por la presente invención se describen en WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473 , PCT/US98/20182 y la Patente de EE.UU. de EE.UU. No. 4,899,755, de los cuales la totalidad se incorpora en la presente para su referencia.

Entidad de unión al blanco ("TBM") Según la presente invención, el segundo componente del agente de contraste son dos o más Entidades de Unión al Blanco (TBM) . Los TBM del compuesto (1) permiten que el agente de contraste se una a proteínas u otros blancos y (2) disminuye la flexibilidad de la molécula en el estado unido. Esto crea una concentración incrementada en el agente de formación de imágenes en el sitio del cual se va a formar una imagen e incrementa la P1461 capacidad de relajación en el estado unido. Para la formación de imágenes de la sangre vascular estancada, la albúmina sérica es un blanco preferido. Otros blancos proteicos incluyen, de manera irrestricta, ácido alfa de la glicloproteína, el fibrinógeno, fibrina, y el colágeno. Para la formación de imágenes de coágulos, la fibrina es el blanco preferido. Por lo tanto, el TBM debe seleccionarse para lograr la especificidad y una afinidad de gran unión para la proteína apropiada ya que el HSA se encuentra presente a altas concentraciones en el suero (aproximadamente 0.6 mM) y se une a una gran serie de moléculas con una afinidad razonablemente alta, es la proteína plasmática blanco preferida para los agentes de contraste para el banco de sangre. El HSA es un blanco particularmente preferido para la formación de imágenes cardiovasculares . Una amplia gama de TBM lipofílicos o amfifílicos se unen a diversos blancos, incluyendo la Albúmina Sérica Humana (HSA) . Estos incluyen, pero no se limitan a, los grupos alifáticos, aromáticos y saturados o insaturados con 4-200 átomos de carbono, en donde cada carbono es substituido opcionalmente o se reemplaza opcionalmente por oxígeno, nitrógeno, halógeno, azufre u otros átomos que pueden unirse de manera covalente el carbono . Para unirse a otros blancos proteicos, con una alta especificidad, P1461 normalmente se requieren grupos especiales de especificidad por el blanco. Los grupos de especificidad por el blanco con una afinidad suficientemente alta y especificidad suficientemente alta se pueden identificar utilizando técnicas modernas, tales como la química de combinación, detección de alto desempeño, despliegue de fagos, evolución sistémica de ligandos y mediante un enriquecimiento exponencial (SELEX) y otros métodos como se describe, por ejemplo, en los Nos., de Patente de EE.UU. de EE.UU. 5,475,096, 5,595,877 y 5,270,163 [ver Gold et al. Ann. Rev. Of Biochem., 64: páginas 763 a 797 (1995)], incorporados en la presente para su referencia. El grado de unión de un TBM con un blanco, tal como HSA o fibrina, puede evaluarse mediante una variedad de métodos de unión en equilibrio. Por ejemplo, la unión al HSA puede cuantificarse mediante una ultrafiltración. De una cuantificación típica de unión utilizando ultrafiltración, el grupo blanco se mezcla con 4.5% peso/volumen de HSA en un amortiguador de pH de 7.4. La muestra se carga en un aparato de centrifugación comercialmente disponible equipado con un filtro de separación con peso molecular de 30 KDa (celulosa regenerada de baja unión de 30 KDa mol. peso (Millipore Ultrafree MC catalogo # UFC3LTK00) , el cual es permeable al grupo blanco pero no al HSA. Una pequeña porción (5- P1461 *Á_^ J¿_Á 10%) volumen de la muestra se filtra mediante centrifugación a 2000 x g durante 20 minutos a través del filtro separador, y la concentración del grupo no unido al blanco en la muestra se cuantifica en el producto filtrado. Para cuantificar la unión a la fibrina, se puede formar un coagulo de fibrina en un pocilio de una placa de microtitulación y ponerse en contacto con el grupo de especificidad por el blanco. Luego de un período de tiempo de incubación suficiente para establecer el equilibrio, el sobrenadante se retira mediante aspiración (la fibrina insoluble permanece unida como un coagulo gelificado a la parte inferior del pocilio) . Luego se cuantifica la concentración del grupo no unido con especificidad por el blanco, en el sobrenadante. En ambas metodologías, la concentración del grupo unido con especificidad por el blanco se determina como la diferencia entre la concentración total del grupo con especificidad por el blanco inicialmente presente en la concentración no unida del grupo con especificidad por el blanco, luego de la evaluación de unión. La fracción unida es la concentración del grupo unido con especificidad por el blanco dividida entre la concentración del total del grupo con especificidad por el blanco. Preferiblemente, por lo menos el 10%, con mayor preferencia por lo menos del 50%, y aún con mayor preferencia por lo menos el 80%, y aún P1461 más con mayor preferencia por lo menos el 90% del agente de contraste se une al blanco deseado a concentraciones fisiológicamente relevantes del fármaco y del blanco. Más preferiblemente por lo menos un 92%, incluso más preferiblemente, por lo menos un 94%, con mayor preferencia un 96% más del agente de contraste se une al blanco según los métodos de ultrafiltración o de microtitulación en placa. Para detalles adicionales concernientes a las entidades de unión al blanco que comprenden los péptidos ligantes de fibrina, ver la solicitud de Patente de EE.UU. No. 60/146,425 titulada BINDING MOIETIES FOR FIBRIN; es identificada como DYX-010. Y la solicitud provisional de Patente de EE.UU. No. 60/146,414 enviada al mismo tiempo del mismo día (29 Julio de 1999) de la cual la actual solicitud de utilidad reivindica prioridad; y las continuaciones de éstas, de las cuales todas se incorporan en la presente para su referencia. Los TBM pueden ser muy diversos dependiendo de la naturaleza del blanco y de los requerimientos específicos de la unión. Los ejemplos del TBM útiles incluyen fármacos, moléculas orgánicas lipofílicas o amfifílicas, porfirinas, ligandos receptores, esteroides, lípidos, hormonas, péptidos, oligonucleótidos (ADN, ARN o versiones químicamente modificadas de éstas) , carbohidratos u otras P1461 biomoléculas o substancias que se sabe que se aglutinan con una afinidad suficientemente alta a uno o más de los componentes en el tejido específico deseado para formar la imagen. En ciertas modalidades, un TBM puede tener una mayor afinidad para el blanco de los demás, en cuyo caso el TBM de mayor afinidad se designa como el TBM "principal". Por lo tanto, todos los demás TBM con afinidades de unión menores que la del TBM principal se designan como "secundarios" . Los TBM más preferidos son aquellos que se unen en forma reversible a las proteínas en el plasma, el espacio intersticial (el fluido entre las células) , o el espacio intracelular. Mientras que se pueden usar varias biomoléculas o substancias que se unen a un blanco especificado, las más útiles son aquellas que se unen a las proteínas . Los TBM secundarios pueden ser los mismos o diferentes que los TBM principales. El número de TBM secundarios puede variar desde uno hasta diez o más. El número exacto de TBM secundarios requerido dependerá de la especificidad de los TBM por el blanco y de la afinidad de los TBM por el blanco. Las interacciones adicionales de unión proporcionadas por los TBM secundarios deben ser suficientes para unir el complejo y disminuir el tiempo de correlación rotacional en cada sitio de quelación. La capacidad de relajación incrementada resultante proporciona una intensificación adecuada del contraste de la imagen. Las interacciones secundarias de la unión del TBM y su afinidad por el blanco pueden ser menos específicas que las que se demandan al TBM principal con especificidad por el blanco, ya que la unión inicial de TBM principal hacia el blanco puede proporcionar la especificidad necesaria del reconocimiento del objetivo. En algunos casos como el blanco puede comprender sitios diméricos de unión, en cuyo caso se prefieren dos TBM idénticos. Los blancos para los agentes de contraste descritos en esta solicitud son extensos y variados. El blanco puede ser cualquier compartimento, férula, órgano o tejido corporal o algún componente de éste. Los blancos preferidos son aquellos que son de relevancia diagnóstica y terapéutica, es decir, aquellos que están asociados con estados de enfermedad. Los blancos particularmente preferidos son aquellos que en asociación con los fluidos corporales, particularmente aquellos en asociación con la sangre, plasma, linfa y fluidos del sistema nervioso central. Otros blancos preferidos son las proteínas que existen, ya sea en altas concentraciones o que tienen un gran número de sitios de unión para ciertos ligandos. Los diversos sitios de unión proporcionan contacto para uno o más TBM secundarios. Se incluyen entre estas proteínas P1461 í _* . . ^.^« blanco las enzimas y las glicoproteínas.

El andamiaje para la unión de los IEM y los TBM La presente invención proporciona un tercer componente para los agentes multiméricos de contraste, es decir, una estructura química o "andamiaje" a los cuales pueden unirse los IEM y TBM, como se muestra en Figura 5. El andamiaje es la estructura química entre dos o más TBM a los cuales pueden unirse dos o más IEM en diferentes posiciones de manera directa o mediante ligadores para formar los compuestos de unión multiméricos/de múltiples regiones. Los compuestos novedosos que comprenden estas estructuras de andamiaje restringen el movimiento localizado del quelato mediante una unión no covalente de los TBM a un blanco en diversas posiciones separadas (por lo menos dos) . El agente de contraste multimérico se une a un blanco en una forma "pseudo-cíclica" o "similar a una cremallera", lo cual crea una interacción en dos o más posiciones o regiones. Este tipo de unión crea una rigidez a través de la estructura del agente multimérico de contraste, incluyendo el grupo aglutinante, el andamiaje, y los IEM individuales. En general, las estructuras del andamiaje son moléculas orgánicas muy diversas que pueden incluir desde uno a diez subunidades monoméricas repetidas. El andamiaje puede, ya sea, ser de cadena abierta o cíclica. Los TBM se unen covalentemente al interior o terminales de la estructura. En cada caso, deben haber por lo menos dos TBM separados para asir la molécula al blanco. Los TBM pueden ser los mismos (homogéneos) o diferentes (heterogéneos) . Los TBM heterogéneos pueden exhibir afinidades diferentes o similares de unión al blanco. Tanto los andamiajes de cadena abierta como cíclica, también proporcionan una estructura de soporte para la unión de los IEM. El número de los IEM puede variar desde dos hasta aproximadamente 12. Los IEM pueden intercalarse con los TBM, y los IEM pueden unirse ya sea a la parte interior de una estructura lineal de andamiaje o a los extremos de la estructura, opcionalmente por medio de un ligador, pero por lo menos a dos diferentes posiciones de la estructura. Los IEM pueden ser los mismos (homogéneos) o diferentes (heterogéneos) . Los IEM heterogéneos pueden exhibir ya sea diferentes o similares habilidades generadoras de contraste. Dentro del grupo de andamiajes de cadena abierta, se pueden sintetizar varios tipos de estructuras utilizando las técnicas convencionales. Son particularmente ventajosos los andamiajes que tienen heteroátomos repetidos a intervalos regulares a través de la estructura. Los heteroátomos generalmente permiten una fácil unión de los P1461 j i IEM o TBM. Las modalidades particularmente preferidas son andamiajes oligoméricos de amina de alquileno. Estos andamiajes oligoméricos de aminas de alquileno pueden ser lineales o ramificados. Esto es, las estructuras pueden, ya sea, tener una estructura lineal con IEM y TBM regularmente separados, o la estructura química puede ramificarse para que los grupos de IEM y/o TBM puedan emanar desde un solo sitio en el andamiaje. Los andamiajes, también terminan en heteroátomos tales como el oxígeno (alcoholes) o nitrógeno (aminas) . Las modalidades particulares preferidas de andamiajes de cadena abierta, tanto ramificados como lineales, tienen alcoholes terminales o aminas terminales . La Figura 5, muestra un ejemplo de la unión a múltiples regiones de un multímero en donde la entidad de andamiaje, IEM, TBM, y (opcionalmente) ligadores, están claramente delineadas. Otro ejemplo del multímero con un ligador ramificado se ilustra en la Figura 6. Nuevamente, la entidad de andamiaje, IEM, TBM y (opcional) los ligadores están claramente delineados. En la Figura 6, dos TBM son péptidos unidos a un andamiaje de poliamina, aunque estos componentes de ninguna forma limitan el alcance de la invención.

P1461 Figura 5. Un ejemplo del multímero de unión a múltiples regiones con un ligador lineal. IEM 1EM Figura 6. Un ejemplo del multímero de unión a múltiples regiones con un ligador ramificado.

P1461 Se da por la fórmula (V) una estructura genérica para un andamiaje lineal con una subestructura de amina repetida, X=L-IEM, TBM, o IEM en donde m puede variar desde 1 a 10, n puede variar desde 2 a 10. Preferiblemente, m es l a 2, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, u 8 hasta aproximadamente 10. Preferiblemente, n es 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, u 8 hasta aproximadamente 10. Una estructura genérica para un andamiaje lineal de una subestructura de amina repetida y oxígeno terminales que permiten la formación de TBM ligados al éter será en la fórmula (VI) X =L-IEM,TBM,o EM en donde m puede variar desde 1 hasta aproximadamente 10, y n puede variar desde 2 a 10. Preferiblemente, m es 1 a 2, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, u 8 hasta aproximadamente 10.

P1461 Preferiblemente, n es 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, u 8 hasta aproximadamente 10. Las estructuras de andamiaje no se limitan a subestructuras repetidas con aminas, y se limitan a estructuras que contienen oxígenos terminales o nitrógenos terminales. El andamiaje puede contener cualquier subestructura repetida que permita la unión de los IEM. Opcionalmente, por medio de los ligadores y TBM. Los átomos de carbono que comprenden el andamiaje pueden substituirse opcionalmente o reemplazarse por heteroátomos seleccionados a partir del oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógeno. El andamiaje también puede comprender substituyentes tales como hidrocarburos de cadena corta (1-10 átomos de carbono) . Estas cadenas secundarias de hidrocarburos pueden substituirse opcionalmente o reemplazarse por heteroátomos seleccionados a partir del oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógeno. Estos andamiajes pueden comprender varios grupos orgánicos comunes, como por ejemplo, fosfodiésteres, carbamatos, sulfatos y sulfonilos. Similarmente, los substituyentes que se unen a la estructura de andamiaje también pueden contener varios grupos orgánicos comunes, por ejemplo, fosfodiésteres, carbamatos, sulfatos, sulfonilos y aminoácidos . La Figura 7, muestra algunos ejemplos P1461 _ a,te^..^«af- ilustrativos de andamiajes de poliaminas lineales y ramificadas junto con los ejemplos correspondientes de los agentes de contraste que comprenden estos andamiajes. La Figura 8, proporciona ejemplos de andamiajes oligoméricos junto con los ejemplos correspondientes de los agentes de contraste que comprenden estos andamiajes. Los andamiajes que comprenden heteroátomos son una modalidad preferida de la presente invención ya que los heteroátomos permiten una fácil unión de los IEM y TBM, opcionalmente por medio de ligadores .

Figura 7. Ejemplos de andamiajes de poliaminas lineales y ramificadas .

P1461 Figura 8. Ejemplos de andamiajes oligoméricos.

X = N,0,S L = Ligador 461 específicamente por una enzima. Los andamiajes biodegradables particularmente preferidos son aquellos que pueden degradarse por enzimas de humano. Debido a la amplia gama de actividades enzimáticas que se sabe que existen, la estructura exacta de los grupos biodegradables es variable. Las modalidades particularmente preferidas del grupo biodegradable incluyen, pero no se limitan a los carbonilos, esteres, diésteres, fosfatos, difosfatos, fosfodiésteres, anhídridos, grupos sulfonilo, sulfatos y carbamatos. Estos andamiajes biodegradables permiten un rápido metabolismo del agente multimérico de contraste y disminuyen la probabilidad de toxicidad. Un ejemplo de un andamiaje biodegradable para un multímero se muestra en la Figura 9. En este caso, el andamiaje se forma debido a la condensación de dos ácidos carboxílicos en presencia de una molécula que contiene dos alcoholes terminales. Las condiciones específicas de reacción para esta reacción de condensación se conocen bien en la técnica.

P1461 Figura 9. Ejemplo de un Andamiaje Biodegradable X= Molécula Ligadora Además, el grupo biodegradable puede desdoblarse al momento de un cambio en pH o temperatura, o al momento de la aplicación de ultrasonido o energía luminosa. Estos grupos se conocen bien en la literatura de profármacos. [Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16: páginas 245 a 288 (1999); Dougherty, T.J., Gomer, C.J., Henderson, B.W., Jori, G., Kessel, D. , Korbeli , M. , Moan, J., y Peng, Q. J. Nati. Cáncer Inst. 90: páginas 889 a 905 (1998); Wang, W. , Jiang, J., Ballard, CE., y Wang, B. Curr. Pharm. Des. 5: páginas 265 a 287 (1999)]. Los andamiajes que comprenden elementos cíclicos que quelan los iones metálicos son otro grupo de P1461 modalidades preferidas de la presente invención. Más preferidos son los andamiajes que contienen IEM que quelan el gadolinio o que proporcionan la quelación del gadolinio dentro del andamiaje así como el IEM separados que se unen al andamiaje. Los ejemplos de estos andamiajes se muestran en la Figura 10.

Figura 10. Ejemplos de multímeros que utilizan una parte de complejo de gadolinio a manera de andamiajes La clasificación de andamiajes en grupos cíclicos de cadena abierta no implica una exclusividad mutua entre los grupos. Una amplia variedad de andamiajes de cadena abierta que incorpora elementos cíclicos que inhiben el movimiento también se contemplan. La entidad cíclica del andamiaje puede ser un anillo homocíclico o heterocíclicos. Los anillos pueden ser bastante restringidos como por ejemplo, un anillo de ciclopropilo, o puede ser un anillo menos conformado en su composición tal como un anillo ciclohexilo.

P1461 Tanto las porciones de cadena abierta como las cíclicas del andamiaje pueden sustituirse opcionalmente o reemplazarse por heteroátomos seleccionados a partir del oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógenos. El andamiaje también puede comprender sustituyentes tales como hidrocarburos de cadena corta (1-10 átomos de carbono) . Estas cadenas secundarias de hidrocarburos pueden opcionalmente sustituirse o reemplazarse por heteroátomos seleccionados a partir del oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógenos. Por lo tanto, los andamiajes pueden comprender varios grupos orgánicos comunes tanto en las porciones de cadena abierta como en las cíclicas del andamiaje. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a carbonilos, esteres, diésteres, fosfatos, fosfodiésteres, anhídridos, grupos sulfonilo, sulfatos y carbamatos. Los anillos también pueden incluir derivados de los compuestos cíclicos biológicos comunes tales como carbohidratos. Las modalidades preferidas de los elementos cíclicos incluyen sistemas de anillos múltiples, tales como derivados heterocíclicos de la decalina. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a los anillos carbocíclicos que comprenden de 3 a 7 átomos, en donde hasta 4 átomos se sustituyen opcionalmente con porciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de O, S, C(O), S(O), S(0)2, y NH. Los anillos se sustituyen opcionalmente con grupos de P1461 -Ai--metilo y derivados de éste, alquilo, alquenilo o alquinilo que comprenden de 2-100 átomos de carbono, en donde hasta 10 átomos de carbono se sustituyen opcionalmente con heteroátomos seleccionados a partir de oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógenos o reemplazan por porciones seleccionadas de O, S, , C(0), S(O), S(0)2, y NH. Al igual que algunos andamiajes, tal como los andamiajes basados en aminoácidos, pueden comprender TBM, los andamiajes pueden asimismo comprender IEM. Los IEM pueden ser cualquier molécula orgánica, ion metálico o quelato. Las modalidades preferidas son aquellas con IEM cíclicos, incluso más preferiblemente son los IEM cíclicos que son quelatos metálicos. Los ejemplos particulares de estos andamiajes de combinación lineal cíclica descritos anteriormente se muestran en la Figura 11 junto con los Ejemplos correspondientes de los agentes de contraste que comprenden estos andamiajes.

Figura 11. Ejemplos de andamiajes con elementos cíclicos, 461 LIGADORES OPCIONALES Los agentes de contraste de ciertas modalidades de la presente invención se caracterizan por un ligador opcional a través del cual se unen los IEM a un andamiaje. La entidad intensificadora de imagen (IEM) y la entidad ligante del blanco (TBM) se describen en otra parte de la presente. La entidad ligadora (L) puede ser una pequeña subunidad que comprende de 1 a 30 átomos de carbono conectados covalentemente por enlaces solos o múltiples en donde hasta 10 de los átomos de carbono pueden sustituirse con O, N, P, S, F, Cl, Br, H, ó I. El ligador funciona para conectar los IEM al andamiaje. Los ejemplos de ligadores incluyen alcanos, alquenos o alquinos lineales o ramificados opcionalmente sustituidos con grupos funcionales tales como el carbonilo, éter, amida, amina, urea, tioéter, arilo, fosfato, sulfonamida y similares. Los ligadores preferidos de ciertas modalidades comprenden dos o más grupos químicos funcionales, uno de los cuales se une al andamiaje y los otros se unen a los IEM. Los grupos químicos funcionales pueden ser los mismos o diferentes. Los ejemplos de los grupos funcionales incluyen pero no se limitan a las cetonas, esteres, amidas, éteres, carbonatos, sulfonamidas, alcanos, alquenos, alquinos y carbamatos. Los ejemplos de algunos reactivos para preparar los ligadores son los aminoácidos, especialmente la glicina, alanina, serina, homoserina, treonina, tirosina, cisteína, aminofenilalanina, lisina, carnitina, ácido 2,4-diaminobutílico, ácido diaminopropiónico, hidroxiprolina, ácido aspártico y ácido glutámico, dioles, especialmente el etilenglicol, dihaluros, especialmente el dicloruro de P1461 etileno, 2-mercaptoetanol, 2-aminoetanol, 1,2-diaminoetanol, ácidos dicarboxílicos, especialmente el ácido oxálico, ácido malónico, ácido málico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido glutárico y ácido adípico y otras pequeñas moléculas bifuncionales, trifuncionales y multifuncionales . Aún otros ligadores sin limitación, pueden ser la urea, acetal, cetal, éster doble, carbonilo, tiourea, sulfona, tioéster, éster, éter disulfuro, lactona, imina, fosforilo, o enlaces de fosfodiéster; cadenas de alquilo sustituidas o no sustituidas saturadas e insaturadas; cadenas lineales, ramificadas o cíclicas de aminoácidos de un solo aminoácido o de diferentes aminoácidos (por ejemplo, extensiones del N o C terminal de la entidad de unión a la fibrina) ; ácidos malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico; ácido caproico; diaminas simples y dialcoholes simples. Preferiblemente, el peso molecular del ligador se encuentra bien definido. Los pesos moleculares pueden abarcar en tamaño desde menos de 100 hasta más de 1000. Preferiblemente, el peso molecular del ligador es de menos de 200 e incluso más preferiblemente es menor a 100. Además, puede ser deseable utilizar un ligador que sea biodegradable in vivo para proporcionar rutas eficientes de excreción para los agentes de formación de imágenes de la P1461 presente invención. Dependiendo de su ubicación dentro del ligador, estas funcionalidades biodegradables pueden incluir funcionalidades de éster, diéster, amidas, fosfoéster, éter, acetal y cetal . En general, los métodos conocidos se pueden utilizar para copular el quelato metálico u otros IEM al ligador y el ligador al TBM. Ver, por ejemplo, WO 95/28967, WO 98/18496, WO 98/18497. La presente invención contempla la ligadura del quelato en cualquier posición, con la condición de que el quelato metálico retenga la habilidad de unirse fuertemente al metal a fin de minimizar la toxicidad. Los ejemplos de algunos ligadores se muestran en la Figura 12 omitiendo los átomos de hidrógeno para su simplicidad.

P1461 Figura 12. Ejemplos de ligadores con múltiples puntos de conexión.

X = N, O, S Intensificación del contraste en combinación con interacciones de unión en regiones múltiples La presente invención en sus diferentes modalidades mejora la capacidad de relajación promedio de todos los núcleos de metales paramagnéticos, por ejemplo gadolinio en una estructura de quelato multimérico unida al blanco. Los ejemplos que se muestran en la Tabla 1 y Tabla P1461 2 muestran que la unión al blanco de una estructura IEM a través de un solo TBM fue suficiente para mejorar la capacidad de relajación promedio de unión por Gd(III) al mismo grado que se observa para una sola estructura comparable de IEM . Aunque la unión a través de un solo TBM frena el tiempo general de correlación rotacional del multímero, los quelatos de metales individuales, por ejemplo gadolinio, aparentemente están aún libres para rotar (girar) en una forma más bien desahogada. Este exceso de movimiento reduce la capacidad de relajación en cada centro metálico. De manera sorprendente, se ha descubierto que esto sucede incluso cuando el multímero contiene un TBM con dos anillos aromáticos. En el PCT WO 96/23526, McMurry et al. muestran que la capacidad de relajación unida a la albúmina de los agentes de contraste con un solo IEM se mejora mediante el uso de una entidad de unión a la proteína plasmática (PPBM) que comprende dos o más anillos aromáticos en una orientación no plana. Como se ilustra en la Tabla 1, el uso de este TBM (difenilciclohexilo) proporciona una excelente intensificación de la capacidad de relajación para el caso del único IEM (MS-325) , pero sorprendentemente, una baja capacidad de relajación en estado unido, albúmina a IEM, para los análogos de multímeros. A fin de mejorar aún más la capacidad de relajación de los multímeros con P1461 especificidad por el blanco, el movimiento localizado de los grupos quelantes y del ion quelado debe disminuirse. Esta invención describe los multímeros con especificidad por el blanco que exhiben una gran capacidad de relajación como resultado de interacciones de unión a múltiples regiones y la disminución acompañante en cuanto a flexibilidad. La introducción de dos o más TBM colocados de manera tal que no haya una disminución significativa en la capacidad de relajación por IEM al momento de la unión a un blanco, ha mejorado marcadamente la capacidad de relajación para que así en varios casos, la capacidad de relajación por cada IEM para el agente de contraste en el estado unido sea similar a la que se observa previamente con los IEM solos (intensificación de 7-8 veces) . La mejora en cuanto a capacidad de relajación por IEM resulta debido a la flexibilidad disminuida de la estructura multimérica unida al blanco, incluyendo los IEM unidos. El incremento en la capacidad de relajación como método de unión normalmente es de 1.5 veces o más. La resolución preferida de la imagen es el resultado del incremento de la capacidad de relajación en por lo menos dos o tres veces. Los incrementos más preferidos de capacidad de relajación son de 4 veces, 5 veces y 6 veces. Incluso los incrementos más preferidos en cuanto a capacidad de relajación son de 7-8 veces, 9-10 veces, o más de 10 veces. La capacidad de P1461 relajación preferida a 20 MHz y 37°C es de por lo menos 10 mM"1s"1 por IEM, más preferiblemente por lo menos de 15 mM" 1s~1 por IEM, más preferiblemente de por lo menos 20 mM~1s"1 por IEM, con mayor preferencia de por lo menos 25 mM"1s"1 por IEM, y más preferiblemente en por lo menos 30 mM"1s"1 por IEM, más preferiblemente por lo menos de 35 mM_1s-1 por IEM, y más preferiblemente por lo menos en 40 mM~1s~1 por IEM. Preferiblemente, la capacidad de relajación del agente de contraste en su totalidad es mayor a 60 mM"1s"1 a 20 MHz y 37°C. Los siguientes datos sirven para ilustrar la intensificación del contraste que resulta por una unión a múltiples regiones. Los beneficios de los TBM son evidentes en tres comparaciones específicas que se muestran en la Tabla 2. En la Tabla, los compuestos de la invención comprenden por lo menos dos IEM y por lo menos dos TBM. Los compuestos de la invención se comparan a los compuestos que tienen solo un IEM o un solo TBM. La comparación demuestra la capacidad de relajación incrementada por IEM para los compuestos de la invención. Para las cuantificaciones en esta Tabla, el blanco es la Albúmina Sérica Humana (HSA) . En primera, la comparación entre las moléculas M8-04 y M8-05 muestra que al incrementarse el número de IEM mientras que el número de TBM permanece constante, da como resultado un incremento correspondiente P1461 en la capacidad de relajación total. Específicamente, esta comparación demuestra que los IEM pueden agregarse sin una pérdida conmensurada de capacidad de relajación por ion de Gd(III) con la condición de que por lo menos dos TBM se encuentren presentes y adecuadamente separados en la molécula. Tanto el compuesto M8-04 como el M8-05 contienen dos TBM, cada uno de los cuales contiene un grupo de ciclopentilo benzofusionado, un grupo fenilo, y un grupo fenilo sustituido con alquilo. Estos dos TBM son aparentemente suficientes para sujetar la molécula para que cuando el número de IEM (en este caso porciones DTPA) se incremente de 2 a 4 , la capacidad de relajación por Gd(III) en cada sitio IEM permanezca igual (32 en contra de 32.7 mM_1s_1 a 20 MHz) . Consecuentemente, la capacidad de relajación total para la molécula se duplica en concierto con la duplicación del número de IEM (64 mM"1s"1 para dos IEM contra 131 mM^s"1 para 4 IEM) .

P1461 Tabla 2. Incremento de la capacidad de relajación mediante una unión a múltiples regiones: un solo TBM vs. dos TBM. P1461 61 En segundo lugar, la comparación de las moléculas M8-06 y M8-05 demuestra que al incrementarse el número de TBM mientras que se mantiene constante el número de IEM, da como resultado un incremento en la capacidad de relajación por cada IEM, con la condición de que los TBM se separen adecuadamente. En ambas moléculas, los TBM tienen la misma estructura y la estructura de IEM es la misma entidad DTPA quelada al gadolinio. El compuesto M8-6, sin embargo, contiene solamente un solo TBM mientras que el compuesto M8-05 contiene dos TBM. Los dos TBM en el compuesto M8-05 sujetan más efectivamente a la molécula debido a que la capacidad de relajación por gadolinio se incrementa desde 27.0 mM^s'1 a 32.7 mM^s"1 a 20 MHz. Por lo tanto, al incrementarse el número de TBM se incrementa la capacidad de relajación por IEM con la condición de que los TBM se separen adecuadamente . En tercera, la comparación de las moléculas M8-07 y M8-08 (ver Tabla 2) nuevamente demuestra que al incrementarse el número de TBM adecuadamente separados, mientras que se mantiene el número de IEM constante, resulta en un incremento en la capacidad de relajación por cada IEM. En ambas moléculas, los TBM tienen la misma estructura de difenilo sustituido con alquilo y ambos compuestos tienen el mismo número de IEM, y la estructura IEM es la misma entidad DTPA-Gadolinio . Las estructuras P1461 centrales (andamiajes) también son las mismas tetraaminas para ambas moléculas M8-7 y M8-08. El compuesto M8-07 contiene un solo TBM y cuatro IEM mientras que el compuesto M8-08 contiene dos TBM y cuatro IEM. Nuevamente, los dos TBM en el compuesto M8-08 sujetan más efectivamente la molécula debido a que la capacidad de relajación unida por gadolinio se incrementa de 16.0 mM"1s"1 a 44.1 mM-1s_1 a 20 MHz en presencia de HSA. Consecuentemente, el cálculo revela que la capacidad de relajación total para la molécula más que se dobla en concierto con la duplicación del número de TBM (un incremento de 2.75 veces de 64.0 mM" 1s"1 para un TBM a 176.5 mM"1s"1 para dos TBM). Por otra parte, las capacidades de relajación libres para los compuestos M8-07 y M8-08 son comparables, a decir, 9.2 y 10.3 mM"1s"1 a 20 MHz, respectivamente. Las proporciones de Rlunido hasta Rlubre para el compuesto M8-07 y M8-08 son de 1.7 y 4.3, respectivamente, lo cual indica que el compuesto M8-08 proporciona una mejor intensificación del contraste entre el blanco y el fondo. Ya que el compuesto M8-08 también tiene una afinidad incrementada al HSA y, por lo tanto, una mayor especificidad por el blanco en comparación al M8-07, la intensificación del contraste de este multímero de unión a múltiples regiones debe incluso ser más superior al multímero con un solo TBM. Finalmente, la Tabla también incluye los datos P1461 para los compuestos M8-09 y M8-10. Estos datos se incluyen para proporcionar capacidades de relajación típicas para las moléculas que contienen un solo TBM y diversos IEM. La comparación de las moléculas M8-09 y M8-10 también demuestra que la adición simple de los IEM a una molécula con un cierto TBM no resulta en un incremento proporcionado en la capacidad de relajación total ya que un incremento de tres veces en el número de IEM solamente resulta en un incremento de dos veces en la capacidad de relajación. Por lo tanto, el sujetar la molécula en dos sitios separados sirve para incrementar la capacidad de relajación (es decir, disminuir el período de tiempo de rotación correlacional) tanto para la molécula como un total, como para las regiones localizadas de quelación dentro del agente de contraste. Sin embargo, los TBM deben separarse a una distancia suficiente para que puedan disminuir efectivamente la flexibilidad de la molécula completa cuando la molécula se une al blanco. Esto resulta en valores promedio para el RIunido P?r IEM q e no disminuyen sustancialmente al momento de la adición de hasta 4 IEM. La unión a múltiples regiones limita sorprendentemente la flexibilidad a través de la estructura completa del quelato multimérico. Por lo tanto, en los IEM que incluyen quelatos, el movimiento localizado del quelato se reduce P1461 luego de una unión a múltiples regiones. Como resultado, las señales MRI marcadamente intensificadas se observan en comparación a la intensificación para los compuestos análogos de quelatos multiméricos que se unen a través de solo un TBM y que, por lo tanto, no están "pseudociclizados" o "en cremallera" con el sitio con especificidad por el blanco. La intensificación del contraste se incrementa aún más con estas estructuras de unión multimérica/posiciones múltiples ya que también producen una señal en el estado no unido que es menor a los agentes de contraste que tienen estructuras moleculares rígidas teniendo una afinidad de unión mejorada para el blanco. En breve, la invención actualmente descrita proporciona compuestos, composiciones y métodos para utilizarse en donde la capacidad de relajación por IEM no disminuye al momento de la adición de los IEM como resultado de interacciones de unión a múltiples regiones (TBM múltiples) y, consecuentemente, mejora el contraste.

Usos La formación de imágenes del banco sanguíneo tiene varios beneficios potenciales de diagnóstico y terapéuticos. Las imágenes detalladas del sistema circulatorio pueden proporcionar información que permitirá una detección temprana de, por ejemplo, aneurismas, P1461 . > - ._ ^~ •»• >~>é embolismos o trombosis y otros coágulos, y áreas de flujo sanguíneo restringido tales como las que existen en las arterias coronarias en la arteriosclerosis . Otras enfermedades circulatorias comunes que pueden diagnosticarse con más exactitud con la formación de imágenes de alta resolución del banco sanguíneo son las deficiencias circulatorias asociadas a la diabetes, enfermedades cardíacas, linfoedema, enfermedad vascular periférica, fenómeno de Raynaud, flebitis y otras heridas o lesione al revestimiento de los vasos sanguíneos, soplos cardiacos, venas varicosas y otras enfermedades que se originan por trastornos en las válvulas, y vasculitis. También, los agentes de contraste dirigidos contra blancos específicos puede mejorar el diagnóstico de enfermedades como la neutropenia, que resulta en una deficiencia de neutrófilos. Además, la formación de imágenes MR, ópticas y otras formas, son menos invasivas que las técnicas actuales que requieren incisiones quirúrgicas e inserción de catéter bajo anestesia general. El MRI y los agentes de contraste óptico que se preparan según las descripciones de la presente pueden utilizarse de la misma forma que los agentes convencionales de contraste óptico y MRI . Cuando se forma una imagen de un trombo, pueden preferirse ciertas técnicas MR y secuencias de pulsos para intensificar el contraste de los P1461 trombos en comparación a la sangre y tejidos del fondo. Estas técnicas incluyen, de manera irrestricta, secuencias de angiografía de sangre negra que buscan hacer que la sangre se haga obscura, tal como las ecosecuencias de espín 5 rápido y ecosecuencias de gradiente con flujo detenido. Estos métodos también incluyen técnicas de flujo independiente que intensifican la diferencia en el contraste debido a la diferencia de i entre el trombo de contraste intensificado y el tejido y la sangre, como las 10 secuencias preparadas de recuperación de la inversión o recuperación de la saturación que incrementan el contraste entre el trombo y los tejidos de fondo. Los métodos para la preparación de las técnicas T2 también pueden ser útiles. Finalmente, las preparaciones para las técnicas de 15 transferencia por magnetización también pueden mejorar el contraste con los agentes de la invención. Las composiciones se pueden formular de conformidad con los procedimientos de rutina con una composición farmacéutica adaptada para la administración 20 intravenosa en seres humanos o en sistemas de modelos experimentales en animales. Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones de un amortiguador acuoso isotónico y estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente 25 solubilizante y un anestésico local, como la lignocaína, P1461 M -r - -r ___H_tMMr-?~**>?? - ' ?— para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, a manera de un polvo seco liofilizado o un concentrado libre de agua. La composición puede almacenarse en un contenedor herméticamente sellado, como una ámpula o bolsita que indique la cantidad del agente activo en unidades activas. En donde la composición se administra por infusión, se puede suministrar con una botella de infusión que contenga solución salina o "agua para inyección" estéril y de calidad farmacéutica. Cuando la composición se ha de administrar mediante inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administración. Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden los compuestos de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de éstos, con cualquier ingrediente, excipiente, portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. El agente de contraste de posiciones múltiples con gran capacidad de relajación se administra preferiblemente al paciente en forma de una composición inyectable. El método de administrar el agente de contraste MRI es preferiblemente en forma parenteral, lo P1461 que significa que se hace por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, intersticial y dentro de las cavidades. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar en mamíferos, incluyendo a los humanos en una forma similar a otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. La dosis a ser administrada, y el modo de administración depende de una variedad de factores incluyendo la edad, peso, sexo, condición del paciente y factores genéticos, y finalmente se decidirá por el personal médico subsecuente a las determinaciones experimentales de dosificaciones variables luego de una formación de imágenes como se describe en la presente. En general, la dosis requerida para la sensibilidad diagnóstica o eficacia terapéutica abarca desde aproximadamente 0.001 a 50,000 µg/kg, preferiblemente entre 0.01 a 25.0 µg/kg de la masa corporal del hospedero. La dosis óptima se determina empíricamente siguiendo la descripción en la presente. La síntesis y el uso de las diversas composiciones de alta capacidad de relajación con posiciones múltiples en una modalidad de la invención se ilustra aún más en los siguientes ejemplos. Los parámetros específicos incluidos en los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la práctica de la invención y de ninguna forma limitan el alcance de la invención. Aunque se han descrito P1461 anteriormente una variedad de modalidades y características, se ha de entender por aquellos diestros en la técnica que pueden hacerse modificaciones y variaciones de las modalidades y características descritas sin apartarse ya sea del espíritu de la invención o de su alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque una variedad de modalidades y características se han descrito anteriormente, se ha de entender por aquellos diestros en la técnica que las modificaciones y variaciones de las modalidades descritas y sus características pueden hacerse si apartarse ya sea del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Método para determinar la capacidad de relajación Los compuestos de la presente invención se evalúan EN su capacidad de relajación utilizando un espectrómetro NMR Bruker NMS-120 Minispec que opera a 0.47 Tesla (frecuencia Larmor 20 MHz H-l) a 37°C. Se determina Ti de protones de agua mediante una secuencia de pulsos de recuperación por inversión utilizando los programas de computadora del instrumento. La capacidad de relajación se determina en presencia del blanco (típicamente 4.5% HSA) puede preparar 4 muestras individuales. La primera P1461 contiene solamente 4.5% HSA en solución salina fosfatada (PBS) , y las otras tres contienen ca. 20, 30, y 10 µm de Gd(III), respectivamente, además de 4.5% HSA en PBS. Las muestras se incuban a 37°C durante por lo menos 15 minutos para asegurar el equilibrio de temperatura antes de que se lleve a cabo la cuantificación de Ti. El contenido de Gd(III) de las muestras se determina mediante una espectrometría de masa por plasma inductivamente copulado (ICP-MS) . La capacidad de relajación (por Gd(III) del ion) se determina al graficar la velocidad de relajación (1/T?) en s"1 en contra de la concentración de Gd(III) en mM. La cuesta de un ajuste lineal de los datos proporciona la capacidad de relajación. La capacidad de relajación de los compuestos en ausencia del blanco también se determina en una forma análoga, excepto que no hay ningún blanco presente. La concentración de las especies unidas al blanco bajo estas condiciones se determina en un experimento por separado utilizando por ejemplo ultrafiltración o una diálisis en equilibrio. El conocimiento de la cantidad de especies unidas al blanco, la capacidad de relajación en presencia del blanco y la capacidad de relajación en ausencia del blanco permiten el cálculo del promedio de la capacidad de relajación unida como se describe en la presente.

P1461 Ejemplo 2. Modelo experimental para analizar los agentes de contraste que se unen a la fibrina en la presente invención Un agente de contraste con una gran capacidad de relajación y especificidad para la formación de imágenes de coágulos (trombos como se describe en estos ejemplos puede distinguir entre la fibrina en un coágulo y el fibrinógeno circulante. Puede proporcionar una detección sensible y efectiva de los trombos en diversas etapas del desarrollo. Se puede utilizar para diagnosticar la presencia o ausencia de trombos tempranos o tardíos . Un modelo experimental el animales que puede utilizarse es el modelo del coágulo de la vena yugular en el conejo en donde la vena yugular se sujeta con una grapa. La vena se sujeta en dos ubicaciones, y la sangre de conejo entre las grapas se retira. Se agregan a la vena fibrinógeno humano, eritrocitos de conejo y trombina entre las grapas para generar un coágulo que contenga fibrina humana. El coágulo normalmente se deja reposar durante 30 minutos. En el modelo yugular del conejo, un aparato típico es un Tesla de 1.5 que utiliza un gradiente deteriorado (SPGR) de MRI a 36/5/30 deg) . Alternativamente, se puede utilizar un método formación de imágenes 3D GRE 44/10/30 deg con un aparato Tesla 1.5.

Pl 61 Alternativamente, se pueden emplear los métodos IR 2000/10/700 con un Tesla 1.5.

Ejemplo 3. Compuesto de Ejemplo. Síntesis Una modalidad preferida de la invención es un agente de contraste para la formación de imágenes MRI que tenga una estructura química como se muestra en la Figura 13.

Figura 13. Compuesto M8-11.

El agente de contraste en la Figura 13 comprende 4 moléculas de DTPA-Gd que sirven a manera de los IEM. Los IEM se unen al andamiaje de diamina de etileno a través de ligadores que comprenden una serie de amidas repetidas. Los TBM son dos péptidos que exhiben una alta afinidad por la fibrina. Los péptidos pueden ciclizarse a través de la P1461 formación de un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína. Los TBM se unen al andamiaje mediante un enlace de oxima y amida. La unión del agente prototipo de trombo al fragmento de aminoácido DD (E) de fibrina es de un 51% de unión a 37°C, 10 µ de agente de contraste, 2.5 mg/ml de fibrina, 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM de Ca+, pH 7.4. la capacidad de relajación para el compuesto unido es de 101.4 mM"1s"1 cuantificado a 20 MHz a 37°C que es de 25.4 mM"1s"1 por quelato de Gd. El agente libre de contraste tiene una capacidad de relajación de 67.7 mM"1s"1 que es 16.9 mM"1s"1 por quelato de Gd. La capacidad de relajación del agente incrementa bastante al momento de aglutinarse. La síntesis de un multímero de péptido de trombo como prototipo de agente MR se describe en la Figura 14. Aunque se muestran un agente de contraste y un péptido particular (M8-11) , alguien de destreza ordinaria apreciará que los otros péptidos se pueden sustituir en el compuesto y que los péptidos utilizados en el compuesto no necesitan ser los mismos.

P1461 Figura 14. Síntesis de un agente de contraste multimérico con especificidad de blanco hacia la fibrina humana.

, TEA 1. TFA 2. Péptido aldehido 3. Quelato Gd3* B-11 P1461 -------Jfcttimit- j Sección Experimental Síntesis de DiDde-tetraamina La tetraamina (Fiuka) (1.50 mL) se hace reaccionar con Dde-OH (NovaBiochem) (4.0 g) en 30 mL de EtOH. La solución clara color amarillo pálido se pone en reflujo durante 16 h. Luego del término de la reacción, la mezcla de reacción se concentra in vacuo hasta formar un residuo seco. El residuo se disuelve en 250 mL de éter y 2 N de solución de HCl. La capa acuosa acida color amarillo pálido se separa y una solución de NaOH al 50% hasta alcanzar un pH de 12 y luego se extrae de nuevo con EtOAc . Las capas de EtOAc se lava luego con salmuera, se secan (Na2S0 ) y se filtran. El producto filtrado se evapora in vacuo para producir un sólido grumoso color amarillo pálido (2.9 g) que se purifica en una columna rápida de sílice utilizando EtOAc/MeOH (2:3) y EtOAc/MeOH con 1% NH40H) (2:3) para producir un sólido puro color amarillo pálido en forma del producto deseado (2.3 g) . ^-N R (300 MHz, CDC13) : dl .02 (s, 6H) , 2.34 (s, 4H, 2), 2.56 (s,), 2.79 (s, 2H) , 2.92-2.94 (t, 2H) , 3.48-3.54 (q, 2H) , 198.2. MS: m/z 475.2 (M+H)+ Síntesis de di-Dpr (Boc)2 de DiDde-tetraamina El Boc-Dpr (Boc) -OH.DHCA (4.85 g) se suspenden en P1461 60 mL de EtOAc junto con 12 mL de 2M H2S04. El matraz se agita y la capa de EtOAc. La capa acuosa se extrae nuevamente con EtOAc. Las capas de EtOAc se combinan, se lavan con salmuera, se secan sobre MgS0 anhidro y se filtran. El producto filtrado se evapora in vacuo y el sólido que se obtiene se seca para producir 3.23 g del ácido libre deseado de Boc-Dpr (Boc) -OH, a manera de un sólido cristalino color blanco. ^-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : d 1.35 (s,18H), 3.30 (s, 2H) , 3.96-3.98 (m, 1H) , 6.87-6.90 (d, 1H) . El Boc-Dpr (Boc) -OH a manera de un ácido libre (1.52 g) se disuelve en 5 mL DCM a 0°C. A esto se agrega HOAt (0.68 g) y DIEA (0.35 mL) y a la solución clara se le permite agitar a 0°C. La DiDde-tetraamina anterior luego se agrega a la solución, seguido de una adición de HATU (1.90 g) y 2 mmol de TEA. El DMF anhidro (5 ml) se agrega y la reacción se agita durante 36 h. Los solventes se evaporan in vacuo u los residuos se captan en 150 -mL de EtOAc y se lavan con 1 N HCl, NaHC03 saturado, salmuera, y luego se secan sobre Na2S04 anhidro, se filtran y evaporan in vacuo para dar un sólido color blanco (1.92 g) . este sólido se purifica en una cromatografía rápida en columna de sílice utilizando EtOAc (5% MeOH) para dar el producto deseado a manera de un sólido color blanco (1.3 g) . ^-NMR (300 MHz, CDC13) : d 1.01 (S, 6h) , 1.35 (S, 18h) , 2.34 P1461 _ * (S, 4h,), 2.58 (S, 3h) , 3.30 (S, 2h) , 3.44-3.67 (BM, 6h) , 3.85-4.10 (M, lh) , 5.44-5.52 (D, 2h) , 5.74 (BS, lh) . MS: m/z 1047.7 (M+H)+ Síntesis de sal de DiDde-tetraamin-diDpr .HCl Se disuelve DiDde-tetraamin-diDpr (BOC) 2 en 40 mL 4 n HCl/Dioxano y se agita durante 10 h. La suspensión se tritura con éter frío y se evapora in vacuo para obtener cantidades copiosas de un sólido color blanco. El sólido se seca bajo una bomba al alto vacío para producir el producto deseado en forma de sal de HCl (1.09 g) . MS: m/z 647.3 (M+H)+ Síntesis de DiDde-diDpr-tetra-GlyDTPA-OtBu Se capta el Gly-DTPA Penta-t-Butiléster (Gly- DTPA-O-tBu) (2.37 g) en 10 mL DMF a 0°C. Se agregan el HOAt (0.41 g) y DIEA (0.52 mL) y la solución se agita a 0°C. La sal de Di-Dde-tetraamin-diDpr anterior (0.39 g) se disuelve en 3 mL de DMF y DIEA (0.13 mL) se agregan. Se agrega el HATU (1.14 g) a la mezcla junto con el DIEA (0.09 mL) . La solución color amarillo se agita durante 36h. Los solventes se retiran in vacuo y el residuo se capta en EtOAc. La capa orgánica se lava con 1 N HCl, NaHC03 saturado, salmuera, se seca sobre Na2S04, se filtra y se evapora in vacuo para dar un sólido color amarillo pálido P1461 (3.15 g) . El producto crudo se purifica aún más sobre el preparado de RP-HPLC [C-4, ACN/H20] . Las fracciones que contienen el compuesto deseado se agrupan y se liofilizan para producir un sólido color blanco (1.01 g) . MS: m/z 1244.4 (M+3H)3+ 933.9 (M+4H)4+ Síntesis de Tetraamin-tetra-CN-Gl-GlyDTPA-O-tBu Se disuelve DiDde-tetraamin-diDpr-tetra-GlyDTPA-O-tBu (0.38 g) en 8 mL de hidrazina al 2 % v/v en DMF y se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se concentra in vacuo y el residuo se capta en CH3CN y se purifica en Prep-RP-HPLC [C-4, ACN/H20] . Las fracciones que contienen el compuesto deseado se agrupan y se liofilizan para dar un sólido color blanco (0.25 g) . MS: m/z 1702.1 (M+2H)2+; 1135.1 (M+3H)3+ Síntesis de Di-MeO-tritil-AoA-tetra-Gly-DTPA-0-tBu Se disuelve Tetraamin-tetra-Gly-DPTA-O-tBU (98 mg) en 3 L de DMF a 0°C. El éster de succinimida del ácido metoxitritilaminooxiacético ( (MeO-Trt-AoA-OSu) (29 mg) se agrega junto con el TEA (9 µL) y se agita durante la noche, el MeOH se agrega, los solventes se evaporan, y el residuo se extrae con DCM, se lava con 10% de ácido cítrico acuoso, salmuera y se seca sobre MgS04 anhidro. El producto se Pl 61 ¿^ **_¿?áá purifica aún más en RP-HLC preparado [C-4, ACN/H20] . Las fracciones que tienen el compuesto deseado se agrupan y se liofilizan para dar un sólido color blanco (87 mg) . MS: m/z 2047.5 (M+2H)2+; 1365.3 (M+3H)3+ 5 Síntesis de AoA-tetra-GlyDTPA-OH Se disuelve Di-MeOtritil-AoA-tetra-GlyDTPA-O-tBu (85 mg) en 10 mL de CH3Cl/tioanisol/DCM/TIS (64/16/16/4) y se agitan a 0°C durante 3 h. El TIS es (iPR)3SiH. La 10 mezcla de la reacción se diluye con 20 mL de agua y se extrae con éter. La capa acuosa se purifica aún más en un Prep RP-HPLC [C-18, ACN/NH0ac] . El producto se aisla y se liofiliza dando un sólido color blanco (29 mg) . MS: m/z 1214.4 (M+2H)2+; 809.5 (M+3H)3+ 15 Oxidación de SLPCDYYGTCLD-NH2 El péptido, c[SLPCDYYGTCLD-NH2] , 10 mM en amortiguador NaPi, pH = 6.8 ) se hace reaccionar con NaI0 (20 itiM) . La oxidación se termina con etilenglicol. La 20 reacción se purifica en un cartucho C-18 Sep-Pak. El producto se eluye con 80% CH3CN que contiene 0.1% TFA. Los solventes se retiran en una centrifugadora al vacío y el producto deseado alfa-N-glioxilil-c [LPCDYYGTCLD-NH2] se liofliliza hasta un polvo color blanco. 25 MS : m/ z 1315 . 5 (M+H) + P1461 J_a_a__t_*,. , Ligación Quimioselectiva-Ensamblaje Final: Síntesis de M8- 11 El alfa-N-glioxilil-c[LPCDYYGTCLD-NH2] (13.2 mg) y AoA. tetraDPTA-OH (12.3 mg) se hacen reaccionar en 20 mM de amortiguador de acetato sódico, pH = 4.6 a 22°C. La reacción se purifica en un Semi-Prep RP-HPLC [C-18/5mm NHOAc] . Este material se convierte a un complejo de gadolinio según las técnicas convencionales [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998)]. MS: m/z 1674.6 (M+3H)3+; 1256.3 (M+4H)4+ Ejemplo 4: Síntesis de los agente de contraste con un andamiaje de trietilentetraamina Utilizando la Di-Dde-tetraamin-diDpr y los procedimientos descritos anteriormente junto con las sustituciones para el ligador de etano sustituido con diamino-BOC y el IEM de Gly-DTPA-OtBu, se pueden unir diversos quelatos como se describen anteriormente al andamiaje de trietilentetraamina. Los quelatos pueden ser los mismos o diferentes para producir un agente de contraste de quelato homogéneo o un agente de contraste con quelatos heterogéneos .

P1461 Ejemplo 5: Síntesis de M8-07 A una solución de ácido 4-mesitilbenzoico (0.7 g) y trietilentetraamina (4.26 g) en CH2C12 (200 mL) se agrega HOBt (0.89 g, 5.83 mmol) y DIC (0.74 g) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado resultante se precipita y el solvente se retira bajo una presión reducida para dar un aceite amarillo. La mezcla de reacción se somete a Prep-HPLC en una columna C4 (eluyente: 0.1% TFA/H20/CH3CN) para dar las sales de TFA de la monoamida a manera de una espuma blanca (0.63 g) . LC-MS: (m/e) 369.1 (M+) . A la solución de la monoamida anterior (0.63 g) P1461 en éter (100 mL) y THF (100 mL9 se agrega LAH (1.30 g) lentamente a temperatura ambiente. La mezcla se pone en reflujo durante dos horas y luego se agita a temperatura ambiente durante la noche. A la mezcla se le agrega agua por goteo para finalizar la reacción de LAH. El precipitado resultante se retira mediante iltración y el solvente se retira a presión reducida para dar un aceite incoloro. La mezcla de reacción se somete a Pre-HPLC en columna C4 (eluyente: 0.1% TFA/H20/CH3CN) para dar una sal de amina TFA como una espuma blanca (180 mg) . LC-MS: (m/e) 354.4 (M+) . A una solución de la sal de amina TFA (180 mg) y diisopropiletilamina (287 mg) en DMF (50 ml) se agrega una solución de Gly-DTPA-OtBu (1.88 g) en CH2C12 (50 mL) , HOBt (370 mg) y DIC (301 mg) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se retira a presión reducida para dar un aceite amarillo. La mezcla de la reacción se somete a Prep-HPLC en una columna C4 (eluyente: 0.1% TFA/H20/CH3CN) para dar un producto crudo como un sólido blanco (0.36 g) . LC-MS: (m/e) 1719.4 (M2+) , 1147.2 (M3+) . A una solución de este sólido color blanco (0.19 g) en CH2CI2 (4.5 mL) y anisol (4.5 mL) se agregan por goteo 4.5 mL de 12 N HCl. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 h. A la mezcla se agregan 40 mL de agua P1461 y se lava tres veces con éter. La solución acuosa se liofiliza para dar un producto crudo que se somete a Prep- HPLC en una columna C18 (eluyente: 100 mM AcONH4/CH3CN) para dar un sólido color blanco (50 mg) . LC-MS: (m/e) 171158.6 (M+) , 772.8 (M3+) . Este material se convierte al complejo gadolinio según las técnicas convencionales [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998)].

Ejemplo 6: Síntesis de M8-08 Acido 4-mesitilbenzoico. A una solución de ácido mesitilborónico (10 g) y ácido 4-bromobenzoico (12.9 g) en l-propanol (150 mL) y DME (200 mL) se agrega difenilfosfina P1461 . (0.128 g) , 2M de una solución de carbonato de sodio (37 mL) y agua (30 mL) . A la mezcla se le agrega acetato de paladio (82 mg) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calienta hasta reflujo durante la noche. Luego de que se retira la fuente térmica, se agregan 100 mL de agua y se agitan durante 2.5 horas mientras se enfría a temperatura ambiente. La mezcla oscurecida se diluye con 150 mL de acetato de etilo y las dos fases se separan. La capa orgánica se lava varias veces con una solución saturada de bicarbonato de sodio hasta que el TLC indica que el ácido 4-bromobenzoico (Rf = 0.55, eluyente: CH2C12/CH30H = 5) se retira completamente. La solución se extrae tres veces con 200 mL de una solución de 1 N NaOH. A las capas acuosas combinadas se les agrega aproximadamente 50 mL de 12 N HCl a pH 3. El precipitado resultante se filtra, se lava con aguay se seca para dar ácido 4-mesitilbenzoico a manera de un sólido color blanco (8.81 g) . Rf = 0.75 (eluyente: CH2C12/CH30H = 5) 1H- MR (300 MHz, CDC13) : d 1.997 (s, 6H) , 2.340 (s, 3H) , 6.961 (s, 2H) , 7.274 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 8.177 (d, J = 8.1 Hz, 2H) . A una solución de ácido 4-mesitilbenzoico (1.5 g) y trietilentetramina (0.43 g) en CH2C12 (60 mL) se agrega HOBt (0.96 g) y DIC (0.79 g) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado P1461 resultante se filtra y se seca para dar un sólido color blanco (1.45 g) . LC-MS: (m/e) 591.3 (M+) . A la solución del sólido color blanco (0.45 g) en éter (20 mL) y THF (80 mL) se agrega LAH (0.33 g) lentamente a temperatura ambiente. La mezcla se pone en reflujo durante 2 horas y luego se agita a temperatura ambiente durante la noche. A la mezcla se le agrega agua por goteo para extinguir el LAH. El precipitado resultante se retira mediante filtración, y el solvente se retira a una presión reducida para dar un aceite color amarillo pálido. La mezcla de reacción se somete a Prep-HPLC en una columna C4 (eluyente: 0.1% TFA/H20/CH3CN) para dar la sal TFA a manera de un sólido color blanco (140 mg) . LC-MS: (m/e) 564.6 (M+) . A una solución de la sal TFA (50 mg) y diisopropiletilamina (38 mg) en DMF (30 mL) se agrega una solución de Gly-DTPA-OtBu (193 mg) en CH2C12 (30 mL) , HOBt (37.5 mL) y DIC (31 mg) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se retira a una presión reducida para dar un aceite color café. La mezcla de lar reacción se somete a Prep-HPLC en una columna C4 (eluyente: 0.1% TFA/H0/CH3CN) para dar un producto crudo a manera de un sólido color amarillo pálido. LC-MS: (m/e) 1824.2 (M2+) , 1216.3 (M3+) , 912.5 (M+) .

P1461 A una solución del sólido color amarillo pálido (0.58 g) en CH2C12 (5 mL) y anisol (5 mL) 10 mL de 12 N HCl se agrega por goteo. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 h. A la mezcla de 40 L de agua se agregan, y la mezcla resultante se lava tres veces con éter. La solución acuosa se liofiliza para dar un producto crudo que se somete a Prep-HPLC en una columna C18 (eluyente: 100 mM AcONH4/CH3CN) para dar un sólido color blanco (11 mg) . LC-MS: (m/e) 1263.2 (M2+) , 842.4 (M3+) , 632.2 (M4+) . Este material se convierte al complejo de gadolinio según las técnicas convencionales [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998) ] .

Ejemplo 7: Síntesis General de los multímeros de unión al HSA que comprenden dos TBM idénticos La diamina que comprende cuatro DTPA protegidos por éster de t-butilo se disuelve en dimetilformamida (0.75 mL) . RC02H (3 eq) , que representa una variedad de ácidos P1461 - * * * - -_ ll- í i carboxílicos que comprenden TBM, DIC (0.052 mL, 3.3 eq) y HOBt (0.051 g, 3.3 eq) se agregan. La mezcla de la reacción se enfría a 0°C antes de la adición por goteo de DIEA (0.105 mL, 6 eq) . La mezcla de la reacción se agita durante un total de 8.5 h a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se diluye con CH2C1 y se lava con 0.1 N HCl, NaHC03 saturado y salmuera. La capa orgánica se seca sobre Na2S0 y el solvente residual se retira in vacuo para dar un intermediario protegido por t-butiléster . El producto se capta en DCM, HCl se agrega a 0°C, y se agita durante 3 h. La evaporación del solvente proporciona un sólido color blanco que se hace reaccionar con GdCl3 (4 equiv) y NaOH (12 equiv) para dar el producto final. Una lista de compuestos que tienen dos TBM idénticos 'que se sintetizan según este método junto con las estructuras de los TBM y los datos de la espectrometría de masas se compilan en la Tabla 3.

Tabla 3. Agentes de Contraste con regiones múltiples con dos TBM idénticos.

P1461 *__.___. t i. __. .

Ejemplo 8: Síntesis general de los multímeros unidos al HSA que comprenden dos TBM diferentes La monoamina protegida por CBZ que comprende 4 DTPA protegidos por éster de t-butilo se disuelven en dimetilformamida (0.75 mL) . R1C02H (1.5 eq) , que representa P1461 una variedad de ácidos carboxílicos que comprenden TBMl, DIC (0.0052 mL, 1.5 eq) y HOBt (0.051g, 1.5 eq) se agregan también. La mezcla de la reacción se enfría a 0°C antes de la adición por goteo de DIEA (0.105 mL, 6 eq) . La mezcla de la reacción se agita durante un total de 8.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se diluye con CH2C12 y se lava con 0.1 N HCl, NaHC03 saturado y salmuera. La capa orgánica se seca sobre Na2S04 y el solvente residual se retira in vacuo . El compuesto se disuelve en EtOAc y se hidrogena (5% Pd-C) . Luego de la filtración del catalizador, el producto se hace reaccionar con el segundo ácido carboxílico (R2C?2H, 1.5 equiv), que representa una variedad de ácidos carboxílicos que comprenden TBM2 , DI (0.052 mL, 1.5 equiv) y HOBt (0.051 g, 1.5 eq) . La mezcla de la reacción se agita durante un total de 8.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con CH2C12 y se lava con 0.1 N HCl, NaHC03 saturado y salmuera. La capa orgánica se seca sobre Na2S04 y el solvente residual se retira in vacuo . El producto se vuelve a suspender en DCM, HCl se agrega a 0°C y la reacción se agita durante 3 horas. La evaporación del solvente proporciona un sólido color blanco que se hace reaccionar con GdCl3 (4 equiv) y NaOH (12 equivalentes) para dar el producto final.

P1461 Se compilan en la Tabla 4 una lista de los compuestos sintetizados según este método con las estructuras de TBMl y TBM2. Notar que "R1" en el esquema sintético general corresponde a TBMl y ?R2" en el esquema sintético general corresponde a TBM2.

Tabla 4. Agentes de contraste de múltiples regiones con dos diferentes TBM.

General P1461 Ejemplo 9: Síntesis del M8-01 Se disuelven en tetrahidrofurano (1.5 mL/mmol de fosforamidita) , 1, 2-di (Boc-amino) -3-hidroxipropano (1.0 eq) y fosforamidita de difenilciclohexilo (1.1 eq) y se agita con tamices moleculares durante 30 minutos. A la mezcla se agrega tetrazol 81.2 eq) a temperatura ambiente. La mezcla P1461 se agita durante 45 minutos y 31P NMR indica el término de la reacción. A la mezcla se agrega ter-butilhidroperóxido (1.5 eq) . La mezcla de la reacción se agita durante aproximadamente 1 h hasta que 31P NMR indica el término de la reacción. El precipitado resultante y los tamices moleculares se retiran mediante filtración y luego se agrega el cloruro de metileno en el filtrado. La solución se lava secuencialmente con una solución de tiosulfato sódico, una solución de bicarbonato de sodio y cloruro de sodio saturado, y se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra bajo vacío. Al aceite color amarillo pálido resultante se agregan 2M de amoníaco en metanol. La mezcla se agita durante la noche y luego se retira bajo vacío. La mezcla de la reacción se purifica en una columna de cromatografía de gel de sílice (eluyente de etilacetato/metanol) para dar el fosfodiéster. Este fosfodiéster se desprotege al agitarse en ácido trifluoroacético y cloruro de metileno lego de que la mezcla se liofiliza lo cual produce fosfodiéster de diamina y difenilciclohexilo . Esta diamina se agita durante la noche con 4 equivalentes cada uno de Gly-DTPA-O-tBu, EDC y HOBt en cloruro de metileno al cual se ha agregado diisopropiletilamina para incrementar el pH. La mezcla de la reacción concentrada se purifica mediante un HPLC preparativo en fase inversa. Los esteres de ter-butilo de P1461 las dos unidades de DTPA se desdoblan al agitarse en 4:1:1 de ácido clorhídrico : anisol : cloruro de metileno, y subsecuentemente el quelato de DTPA-gadolinio se forma con GdCl3, en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998)].

Ejemplo 10: Síntesis del M8-02 P1461 La benciloximetilen-N-Boc-aziridina (2.82 g) , que se prepara de N-Boc-O-bencil-serina, y N, N' '-diBoc-dietilenetriamina (3.9 g) se agita en ter-butanol en reflujo durante 2 días después de lo cual el solvente se retira bajo un vacío y los residuos se purifican mediante P1461 una cromatografía rápida (eluyente de metanol y cloruro de metileno) lo que produce 4.54 g del material. La proporción de hidrógenos Boc para hidrógenos aromáticos se verifica mediante la integración del espectro 1H NMR. Este 5 éter de tetraaminobencilo protegido por triBoc (3.8 g) se disuelve en 70 ml de ácido acético al 7% en acetato de etilo con 1.0 g de paladio al 10% sobre carbón. La mezcla de la reacción se coloca bajo una atmósfera de hidrógeno a 48 psi durante 16 horas. El solvente se depura de la 10 mezcla de la reacción bajo un vacío y el residuo se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente de metanol y cloruro de metileno) para producir 3.6 g. El alcohol y la fosforamidita de difenilciclohexilo resultante se hace reaccionar utilizando las condiciones indicadas 15 anteriormente (tetrazol, ter-butilhidroxiperóxido, amonio en metanol) para dar el fosfodiéster correspondiente. Los tres grupos Boc de este fosfodiéster (50 mg) se retiran al agitarse en 1.0 mL de TFA y 1.0 mL de DCM durante 3 h después de lo cual la mezcla se liofiliza lo 20 que produce 54 mL de la triamina. Esta triamina se disuelve en 1.0 mL de cloruro de metileno y se agrega por goteo a una solución que contiene 6 equivalentes cada uno de Gly-DTPA-O-tBu, EDC, y HOBt en 2.0 mL de cloruro de metileno al cual se ha agregado DIEA para ajustar el pH a 25 9.0. La mezcla de la reacción concentrada se purifica P1461 mediante un HPLC preparativo (columna C-4, 20 mL/min, 30:70 de acetonitrilo: agua a un gradiente de 100:0 durante25 minutos, luego se mantiene durante 10 minutos) . El peso molecular del compuesto se verifica mediante una espectrometría de masas. Los esteres de ter-butilo de las subunidades de DTPA se escinden para revelar los ácidos carboxílicos al agitarse en 4:1:1 de ácido clorhídrico : anisol : cloruro de metileno durante 5 horas después de lo cual la solución se depura del solvente bajo un vacío, se disuelven en agua y se liofilizan. Los quelatos de DTPA-Gadolinio se forman fácilmente con GdCl3 en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al . Radiology 207: pp. 529-38 (1998)].

EJEMPLO 11: Síntesis del M8-03 P1461 NHBoc' Gly-DTPA DIC HOBt DIPEA, DMF Se agrega el bencilbromoacetato (11 ml) en 50 mL de acetonitrilo a N, N' '-diBoc-dietilenetriamina (14 g) en P1461 50 mL de acetonitrilo y 19 mL de trietilamina y se agita durante 2 h, después de lo cual el solvente se retira bajo un vacío, y el residuo se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente de hexano/acetato de etilo) para producir 11 g del material. Los dos grupos protectores de Boc de este compuesto se retiran al agitar la totalidad del material en una mezcla 1:1 de ácido trifluoroacético y cloruro de metileno durante 3 h, después de lo cual la solución se depura del solvente bajo vacío, se divide entre agua y éter y se liofiliza para producir 9.2 g de material. Gly-DTPA-O-tBu, DIC, y HOBt (2.2 equivalentes cada uno) se agitan en N, N-dimetilformamida durante 45 minutos y luego esta triamina (l.O g) a manera del bis (amoniotrifluoroacetato) , se disuelve en N, N-dimetilformamida y se agrega al crisol de reacción, y el pH se ajusta a 9.0 mediante la adición de diisopropiletilamina . Luego de agitarse durante 12 horas, la solución se diluye con agua y se extrae con acetato de etilo que se lava subsecuentemente con soluciones acuosas de ácido cítrico, bicarbonato sódico saturado y cloruro de sodio saturado. Las solución de acetato de etilo se concentra bajo un vacío y se somete bajo una cromatografía rápida (eluyente de hexano/acetato de etilo) para producir 845 mg de material confirmado por ser el tetrámero mediante una P1461 espectrometría de masa. El grupo bencilo se retira mediante hidrogenación de 800 mg de este material disuelto en 10 ml de hexano, 9 ml de metanol, y 1 ml de trietilamina con 20% de paladio sobre carbón bajo una atmósfera de hidrógeno durante 3 h después de lo cual la solución se filtra a través de Celite y se concentra bajo un vacío. Este ácido carboxílico (750 mg) se agita en cloruro de metileno con EDC y HOBt (1.2 equivalentes cada uno) durante 30 minutos y la diamino-difenilciclohexil-fosfodiéster descrita anteriormente en la síntesis del M8-01, (80 mg) se disuelve en cloruro de metileno y se agrega al ácido carboxílico y el pH se ajusta a 9.0 mediante la adición de amina de diisopropiletilo . Luego de varias horas, la mezcla se concentra y se purifica mediante un HPLC preparativo (columna C-4, 20 mL/min, 30:70 de acetonitrilo : agua a un gradiente de 100 :a0 durante 25 minutos, luego se mantiene durante 10 minutos) para producir 50 mg de material, el peso molecular el cual se verifica mediante una espectrometría de masa. Los esteres de ter-butilo de las subunidades de DTPA se escinden para revelar los ácidos carboxílicos al agitar dentro 4:1:1 de ácido clorhídrico: anisol : cloruro de metileno durante 5 horas después de las cuales la solución se depura del solvente bajo un vacío, se disuelve en agua y se liofiliza (produciendo 90 mg) . Los quelatos de DTPA-Gadolinio se P1461 forman fácilmente con GdCl3,en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998) ] .

Ejemplo 12: Síntesis del M8-09 A una suspensión de (lr-2s) - (+) -cis-l-amino-2-indanol (15 g) en cloruro de metileno (90 mL) se le agrega diisopropiletilamina (35 mL) y luego bencilbromuro (17.2 g) . La mezcla se agita durante la noche. Las solución se lava con agua y se extrae dos veces con una solución de 0.1 N HCl, y el pH de la capa acuosa combinada se eleva a 8 y la capa acuosa se extae cuatro veces con CH2C12. La capa orgánica combinada se lava con cloruro de sodio saturado, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra para dar l-bencilamino-2-indanol (15.62 g) , el peso P1461 molecular del cual se confirma mediante una espectrometría de masa (m/e = 239.95 para M+) . A una solución de 1-bencilamino-2-indanol (10.5 g) y trietilamina (9.2 mL) en cloruro de metileno (250 mL) se agrega por goteo cloruro de 4-butilbenzoilo (9.1 mL) . La mezcla se agita durante 4 horas y luego se concentra bajo un vacío. El residuo se disuelve en acetato de etilo y se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra , se concentra bajo un vacío, y se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente de hexano/acetato de etilo) para dar l-para-butilbenzoil-l-bencilamino-2-indanol (12.7 g) : XH NMR (CDC13) : d 0.93 (t, 3H) , 1.24-1.4 (m, 2H) , 1.5-1.65 (m, 2H) , 2.6 (t, 2H) , 2.8 (d amplia, 1H) , 3.07 (dd, 1 H) , 4.52 (m, 1 H) , 4.65 (m, 2 H) , 5.13 (1, H) , 7.09-7.32 (m, 11 H) , 7.38-7.62 (m, 2 H) . Se disuelven 1-para-butilbenzoil-l-bencilamino-2-indanol (1.26 g) y DPTA fosforamidita (2.99 g) en tetrahidrofurano (5 mL) y se agita con tamices moleculares durante 30 minutos, después de lo cual se agrega tetrazol (265 mg) , y la mezcla se agita durante 45 minutos. 31 P NMR indica el término de la reacción, y a la mezcla se agrega ter-butilhidroperóxido (0.433 mL) , y la mezcla de la reacción se agita durante 1 h hasta que el 31 P NMR indica el término de la reacción. El precipitado resultante y los tamices moleculares se retiran mediante P1461 filtración y luego se agrega el cloruro de metileno en el producto filtrado. La solución se lava secuencialmente con una solución de tiosulfato de sodio, bicarbonato de sodio y cloruro de sodio saturado, y se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra bajo un vacío. Al aceite color amarillo pálido resultante se agregan 2 M de amoníaco en metanol. La mezcla se agita durante la noche y luego el solvente se retira a una presión reducida. La mezcla de la reacción se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente: acetato de etilo/metanol) para dar el aducto de fosfodiéster como un sólido color blanco: 31 P MR (THF-d8) d -0.28; LC-MS (m/e) 1165.75 (M+) . Los esteres de ter-butilo de las subunidades DTPA se escinden para revelar los ácidos carboxílicos al disolverse en cloruro de metileno y someterse a tratamiento con 12 N de ácido clorhídrico. Luego de varias horas, el pH se ajusta a 1.5, mediante la adición de 5 N de hidróxido de sodio en solución acuosa, y el precipitado resultante color blanco se filtra y se lava dos veces con una solución de ácido clorhídrico (pH = 1.5). El precipitado se liofiliza durante 48 horas para dar el producto a manera de un polvo fino color blanco. LC-MS: (m/e) 885.15 (M+) . Los quelatos de DTPA-Gadolinio se forman fácilmente con GdCl3 en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998)].

P1461 Ejemplo 13; Síntesis del M8-10 Se agita el 3-butino-l-ol (10 g) en éter (250 mL) con 3 , 4-dihidropirano (12 g) y ácido tósico (20 mg) durante 12 h, después de lo cual la solución se concentra bajo un P1461 vacío y el residuo se divide entre acetato de etilo y agua. La solución orgánica se lava con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio, y se concentra a un alcohol protegido con DHP (18.7 g) que se utiliza sin mayor caracterización o purificación. El alcohol-DHP (18.7 g) se disuelve en éter (65 mL) y se enfría a -75°C después de lo cual se agrega por goteo butillitio (50.5 mL de una solución de 2.0 M) mientras que se mantiene a temperatura después de lo cual se agrega paraformaldehído (3.5 g) . Luego de 4 h, a la solución se le permite calentarse a temperatura ambiente y se agrega agua (100 mL) . La capa acuosa se desecha y la capa orgánica se concentra bajo vacío hasta formar un aceite que se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente acetato de etilo/hexano) para producir 5-THP-2-pentin-l, 5-ol (13 g) la estructura del cual se confirma mediante 1H NMR. El alquinol (2.0 g) se convierte primero al mesilato (882 mg de cloruro de mesilo, 1.6 ml de trietilamina, cloruro de metileno) y luego a yoduro (6.2 g de yoduro de sodio, acetona anhidra) mediante métodos convencionales. Este yodoalquino (1.2 g) se agita con triBoc-cicleno (200 mg) y carbonato de sodio (200 mg) en 8 mL de acetonitrilo durante 5 h después de las cuales la mezcla se depura del solvente mediante concentración bajo P1461 un vacío y se purifica mediante una cromatografía rápida (eluyente acetato de etilo/hexano) y la identidad del aducto (240 mg) se verifica mediante XH NMR y LC-MS. El aducto (240 mg) subsecuentemente se desprotege de THP al agitarse en 4:2:1 de ácido acético : tetrahidrofurano : agua (12 mL) a 40°C durante 6 h después de lo cual la reacción se diluye con agua y acetato de etilo y la capa orgánica se extrae secuencialmente con una solución saturada de bicarbonato de sodio acuoso y cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio, y se concentra al alcohol (250 mg) . Se sintetiza un fosfodiéster de este alcohol y 1-para-butilbenzoil-l-bencilamino-2-indanol mediante la química convencional de la fosforamidita descrita en la síntesis anterior para M8-01 (tetrazol, ter-butilhidroperóxido, amonia/metanol) . Los tres grupos protectores Boc en el ciclo se retiran mediante un tratamiento con ácido ácido trifluoroacético en cloruro de metileno) , y las tres aminas resultantes se convierten a las amidas con Gly-DTPA-O-tBu utilizando métodos convencionales (HATU/HOAt, amina de diisopropiletil, cloruro de metileno) como se describe anteriormente. Los esteres de ter-butilo de las subunidades DTPA se escinden para revelar los ácidos carboxílicos agitándose en 4:1:1 de ácido clorhídrico : anisol : cloruro de metileno durante 5 h después P1461 de la cual la solución se depura del solvente bajo un vacío, se disuelve en agua y se liofiliza. Los quelatos de DTPA-Gadolinio se forman fácilmente con GdCl3 en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al . Radiology 207: pp. 529-38 (1998) ] .

P1461 La diamina de etileno se hace reaccionar secuencialmente con éster metílico de N-Boc-glicina y éster metílico de N-Boc-serina para formar una diamida. El alcohol libre y el l-para-butilbenzoil-l-bencilamino-2-indanol se convierten al fosfodiéster mediante el método (tetrazol, ter-butilhidroperóxido, amonia/metanol) discutido anteriormente. El bencil- (3-amino-2-aminometil-2-metil) propanoato y dos equivalentes de Gly-DTPA-O-tBu se hacen reaccionar utilizando las condiciones descritas anteriormente (DCl/HOBt, diisopropiletilamina, cloruro de metileno) para formar la diamida correspondiente. Dos equivalentes de esta diamida se hacen reaccionar con el derivado de diamina de de etileno para formar un tetrámero. Los esteres de ter-butilo de las subunidades DTPA se escinden para revelar los ácidos carboxílicos mediante agitación en 4:1:1 de ácido clorhídrico : anisol : cloruro de metileno durante 5 h después de lo cual la solución se depura del solvente bajo un vacío, se disuelve en agua y se liofiliza. Los quelatos de DTPA-gadolinio se forman fácilmente con GdCl3, en la manera usual [ver por ejemplo, Lauffer R. B., et al. Radiology 207: pp. 529-38 (1998) ] .

P1461 Ejemplo 15: Síntesis del M8-04 La diamina de etileno y 2 equivalentes del éster metílico de N-Boc-serina se hacen reaccionar para formar la P1461 - *-*" - *-**»•*—* >- diamida. La diamida se hace reaccionar aún más para formar el derivado de difosfato como se muestra anteriormente. Los TBM se unen y se desprotegen según el esquema del método sintético que se muestra y utilizando los métodos que se discuten anteriormente en el Ejemplo 14.

Ejemplo 16: Síntesis del M8-05 P1461 El derivado de difosfato de la diamida que se utiliza como la materia prima en esta síntesis es idéntico al intermediario en la síntesis del M8-04 que se muestra en el Ejemplo 15. Los TBM se unen y se desprotegen según el esquema del método sintético que se muestra y utilizando los métodos que se discuten anteriormente en el Ejemplo 14.

P1461 Ejemplo 16 - Unión del M8-11 como se cuantifican mediante el modelo de vena yugular del Conejo La Figura 15 es una fotografía a color de las imágenes que se obtienen en un experimento utilizando la valoración que se da en el Ejemplo 1. El experimento muestra las imágenes al momento anterior a la inyección, al momento de la inyección con un compuesto testigo (control) de Gd-DTPA sin especificidad hacia el blanco, al momento de la inyección con el M8-11 que se da en el Ejemplo 3, inyección con 3 veces la dosis del M8-11, e inyección con un exceso del péptido (en un formato de aminoácidos de una sola letra) de la secuencia LPCDYYGTCLD, que compite para el blanco con el TBM del agente de contraste. El coágulo se le forma específicamente una imagen mediante el M8-11, ya que un agente de contraste que carece del TBM no se aglutina y ya que la unión se invierte en presencia del exceso de péptido.

[Leyendas de la figura] Formación dinámica de imágenes con especificidad de blanco hacia la fibrina (modelo Yugular del Conejo; 1.5 T; SPGR 36/8/30 DEG.) Preinyección Gd-DTPA M8-11 3X M8-11 exceso de péptido P1461 Ejemplo 16 -Agente de formación de imágenes ópticas cercanas al infrarrojo M8-24 El agente fluorescente de formación de imágenes cercano al infrarrojo M8-24 contiene un IEM adecuado para la formación de imágenes ópticas ("R"). El agente se prepara a partir del derivado correspondiente del ácido carboxílico del colorante fluorescente (como se describe en WO 2000/16810) . El derivado del ácido carboxílico se une al derivado de difosfato de la diamida según las condiciones para el paso de la reacción sintética que se P1461 muestra en el Ejemplo 13. En el Ejemplo 13, el paso análogo es la unión del Gly-DTPA TBM al derivado de difosfato de la diamida para formar M8-04. Este agente de contraste infrarrojo con especificidad de blanco hacia la albúmina se utiliza, por ejemplo, en la angiografía oftalmológica y en el diagnóstico de cáncer de la piel. El agente de contraste óptico que se muestra anteriormente puede utilizarse para cualquiera de los usos enumerados para los agentes de MRI del banco de sangre. Más aún, alguien de destreza ordinaria aprecia que los IEM de este agente de formación de imágenes ópticas puede variar al sustituir un derivado diferente del ácido carboxílico de un colorante. El agente por lo tanto puede ajustarse para conformarse a un criterio específico experimental, tal como una particular longitud de onda de excitación.

P1461

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar el contraste utilizando una formación de imágenes óptica o de MRI en donde : (a) un agente de contraste con regiones múltiples se une a un blanco, (b) el contraste en el blanco se intensifica luego de la unión del agente de contraste al blanco, (c) la intensificación del contraste se mejora ya sea por el número de IEM, la rigidez de la molécula o ambos . 2. Un método para incrementar la capacidad de relajación de un agente de contraste en donde: (a) el agente de contraste con regiones múltiples se une a un blanco, (b) la capacidad de relajación del agente de contraste se incrementa al momento de unirse al blanco, (c) la capacidad de relajación por cada IEM del agente de contraste no disminuye al momento de la unión y en donde: el agente de contraste comprende: a) dos o más Entidades Intensificadoras de Imagen (IEM) ; b) dos o más Entidades de Unión al Blanco (TBM) ; c) un andamiaje al cual se unen los TBM e IEM; y
P1461 . £ ,. d) ligadores opcionales para unión de los IEM al andamiaje .
3. Un método para incrementar la capacidad de relajación según la reivindicación 2, en donde la capacidad de relajación es de por lo menos 10 mM"1s"1 por IEM.
4. Un método para incrementar la capacidad de relajación según la reivindicación 2, en donde la capacidad de relajación es de por lo menos 15 mM-1s"1 por IEM.
5. Un método para incrementar la capacidad de relajación según la reivindicación 2, en donde la capacidad de relajación es de por lo menos 20 mM"1s"1 por IEM.
6. Un método para incrementar la capacidad de relajación según la reivindicación 2, en donde la capacidad de relajación es de por lo menos 25 mM"1s"1 por IEM.
7. Un método para incrementar la capacidad de relajación según la reivindicación 2, en donde la capacidad de relajación es de por lo menos 30 mM"1s"1 por IEM.
8. Un método para la formación de imágenes MR de un blanco en un animal o un paciente humano que comprende los pasos de administrar un agente de contraste MRI, permitir que el agente de contraste se una al blanco y formar una imagen de una región del cuerpo del sujeto, en donde se localiza el blanco, en donde: el agente de contraste MRI comprende un andamiaje, por lo menos 2 IEM, cada uno comprende un quelato de un ion de P1461 metal parmagnético y se une covalentemente al andamiaje ya sea en forma directa o mediante uno o más ligadores que intervienen, y por lo menos 2 TBM que tienen afinidad por el blanco y que se unen covalentemente a los átomos del andamiaje que son diferentes de los átomos en los cuales se unen los IEM; en donde la capacidad de relajación del agente de contraste se incrementa al momento de unirse; en donde el blanco es una proteína, un polisacárido, una célula, un fluido, una glicoproteína o un trombo.
9. Un agente de contraste MRI con especificidad hacia un blanco que comprende un andamiaje, 2 a 4 TBM covalentemente unidos al andamiaje; 2 a 4 IEM donde los IEM ya sea que se unen covalentemente al andamiaje o se unen covalentemente a uno o más ligadores, en donde los ligadores si están presentes, se unen covalentemente al andamiaje y en donde: cada IEM comprende un quelato de un ion de metal paramagnético, cada TBM se une covalentemente a los átomos del andamiaje que no se unen covalentemente a un IEM, cada TBM tiene una afinidad por un blanco, y la capacidad de relajación del agente de contraste cuando se une al blanco es por lo menos 2 veces mayor que la capacidad de relajación en el estado no unido. P1461
10. Un método para incrementar la afinidad del agente de contraste hacia su blanco, que comprende una unión en regiones múltiples del agente de contraste hacia el blanco, en donde el agente de contraste comprende: 5 a) dos o más Entidades Intensificadoras de Imagen (IEM) ; b) dos o más Entidades de Unión al Blanco (TBM) ; c) un andamiaje al cual se unen los TBM e IEM; d) ligadores opcionales para la unión de los IEM 10 en el andamiaje.
11. Un agente de contraste con regiones múltiples que tiene la estructura (IX) X = L-IEM, TBM, o IEM en donde m es un número entero de 1 a 10 inclusive; 15 n es un número entero de 2 a 10 inclusive; o es 0 a 1 ; p es 0 a 1 ; cada A se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de O, CH2, C=0, C=NH, NH, NR o CHR; y 20 B se selecciona a partir del grupo que consiste de CH y N; y P1461 _~a*ágUi *?a* A*?l*?A?___- . . . , . . . -. - . , i ¡,??<üi-i?ifrátá 1 R es alquilo C1-C10 de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo C2-C?0 de cadena recta o ramificada, y en donde hasta 4 átomos de carbono son opcionalmente sustituidos con halógeno, 0, N ó S.
12. Un agente de contraste con regiones múltiples que tiene la estructura (V) : X=L-IEM,TBM, o BEM en donde cada m es independientemente un número entero desde 1 a 8 inclusive; A se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de 0, CH2, C=0, C=NH, NH, NR o CHR; R es alquilo Ci-Cio de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo C2-C?o de cadena recta o ramificada, y en donde hasta 4 átomos de carbono son opcionalmente sustituidos con halógeno, 0, N ó S; y N es un número entero de 2 a 10 inclusive.
13. El agente de contraste según la reivindicación 12 en donde A es C=0.
14. El agente de contraste según la reivindicación 12 en donde A es 0.
15. Un agente de contraste de regiones múltiples P1461 que tiene la estructura de la Fórmula (VI) X=L-IEHlBHo EM en donde m es un número entero de 1 a 10 inclusive; n es un número entero de 2 a 10 inclusive; o es 0 a 1; p es 0 a 1 ; cada A se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de O, CH2, C=0, C=NH, NH, NR o CHR; y B se selecciona a partir del grupo que consiste de CH y N; y R es alquilo C?-C?0 de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo C2-C?0 de cadena recta o ramificada, y en donde hasta 4 átomos de carbono son opcionalmente sustituidos con halógeno, O, N ó S.
16. Un agente de contraste de regiones múltiples que tiene la estructura (VII) :
17. El agente de contraste de regiones múltiples según cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 16, en
P1461 donde el TBM comprende un grupo arilo sustituido. 18. El agente de contraste de regiones múltiples según la reivindicación 17, en donde el IEM se selecciona a partir del grupo que consiste de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y derivados de éste; 1,4, 7-triazaciclononano; 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano (Cicleno) y derivados de éste; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 7-bis ( ter-bu-éster de ácido acético) (D02A-t-bu-éster) ; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4, 7-tris ( terc-b-éster de ácido acético) (D03A-t-bu-éster) ; 1,4, 7-tris (ter-butoxicarbonil) -1,4, 7-tetraazaciclododecano
(D03-t-BOC) ; ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan-l, 4, 7, 10-tetraacético
(DOTA) y derivados de éste; 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-l, 4,7, 10-tetrakis (ácido metilenfosfónico) (DOTP) . 19. El agente de contraste según la reivindicación 18, en donde el IEM es el ácido de dietilentriaminopentaacético (DTPA) . 20. El agente de contraste según cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 16, en donde el TBM es un péptido . 21. El agente de contraste según la
P1461 .^^..i_, . i . _ a -i reivindicación 20, en donde el TBM es un "péptido de unión a fibrina" .
22. El agente de contraste según la fórmula: (TBM)q-S-[Lm-IEMn]p en donde : TBM es una entidad de unión al blanco, S es un andamiaje, L es un ligador, IEM es la entidad intensificadora de imagen, y q, m, n y p son todos números enteros independientes en donde : q es un número entero de 2 a 6 inclusive, cada m es independientemente o ó 1, cada n es independientemente un número entero de 2 a 4 inclusive, p es un número entero de 2 a 4 inclusive, y en donde: cada TBM se une covalentemente a S mediante un enlace químico entre los dos átomos, cada L, si está presente, se une covalentemente a un IEM mediante un enlace químico entre los dos átomos, cada L, si está presente, se une covalentemente a S mediante un enlace químico entre los dos átomos, y por lo menos los dos TBM se unen a diferentes átomos del andamiaje.
23. Un agente de contraste para la formación de imágenes ópticas o de MR que comprende: a) dos o más Entidades Intensificadoras de Imagen P1461 (IEM) ; b) dos o más Entidades de Unión al Blanco (TBM) ; c) un andamiaje al cual se unen los TBM e IEM; y d) ligadores opcionales para la unión de los IEM al andamiaje, en donde el andamiaje comprende una estructura de la fórmula (VIII) : y m y n son independientemente números enteros en donde: m es un número entero de 0 a 3 inclusive; n es un número entero de 0 a 2 inclusive; cada A se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de O, CH2, C=0, C=NH, NH, NR o CHR, en donde: R es alquilo C?-C?0 de cadena recta o ramificada, alquenilo o alquinilo C2-C?0 de cadena recta o ramificada, y en donde hasta 4 átomos de carbono son opcionalmente sustituidos con halógeno, O, N ó S. 24. El compuesto M8-
24. P1461 i , -.^ . . -^ . a~ ___. » r ,. . --¿^,1- -T- i») faii i jaaÉa- fif'iiV
25. El compuesto M8-11, 61
26. El compuesto M8-08