CZ20001189A3 - Diagnostické činidlo pro monitorování intervenčních terapií - Google Patents

Abstract

Řešení se týká diagnostické zobrazovací metody se zvýšeným kontrastem pro monitorování intervenčních terapií. Kontrastní činidlo použité v tomto řešení obsahuje zobrazení zesilující skupinu (IEM) a na stavu závislou skupinu vázající se na tkáň (SDTBM). Tato kontrastní činidla projevují na stavu závislou vazbu k jedné nebo několika složkám cílové tkáně a poskytují detekovatelnou změnu v signálních charakteristikách kontrastního činidla, jakmile je navázáno na cílovou tkáň. V důsledku toho tato činidla projevují vazebnou afinitu, a tudíž obrazový kontrast, pro cílovou tkáň, které se mění s tím, že se mění stav tkáně v průběhu terapie.

Description

Oblast techniky * Předkládaný vynález se týká diagnostické zobrazovací metody se zvýšeným kontrastem. Konkrétně se vynález týká fe způsobů MRI a optického zobrazování, které užívají kontrastní činidlo, které zaměřuje specifickou tkáň nebo složku tkáně a dovoluje monitorovat změny stavu cílové tkáně (např. denaturaci, nekrózy, tkáňovou koagulaci, apoptózu), ke kterým ^Λ dochází v průběhu intervenční terapie nebo po intervenční terapii. Kontrastní činidlo užívané v tomto vynálezu projevuje vazbu k jedné nebo několika složkám cílové tkáně, která je závislá na stavu tkáně, a poskytuje tak detekovatelnou změnu v charakteristikách signálu kontrastního činidla vázaného na tkáň.

Dosavadní stav techniky

Diagnostické zobrazovací metody, jako je např. t zobrazování pomocí magnetické rezonance (MRI), zobrazování ’ Rentgenovým zářením, nukleární zobrazovaní pomocí radiofarmak, optické zobrazování (pomocí ultrafialového, viditelného a/nebo infračerveného světla) a ultrazvukové zobrazování se užívají v lékařské diagnostice již po mnoho let. V některých případech se již také po léta užívá ^Λ kontrastní látka ke zlepšení kvality zobrazení nebo k získání specifické informace. V jiných případech, jako je např.

optické nebo ultrazvukové zobrazování, se kontrastní činidla používají krátce a nebo se teprve začínají používat.

MRI a optické zobrazovací metody jsou mezi zobrazovacími metodami jedinečné, protože poskytují velmi komplexní signály, které jsou citlivé k chemickému prostředí a stavu cílové tkáně. Zatímco signál získaný pomocí Rentgenového « záření nebo radionuklidů zůstává stejný nezávisle na tom, jestli je činidlo volné v plazmě nebo je vázané na proteiny *

nebo zachycené v kostech, určitá činidla pro MRI nebo optické zobrazování poskytují odlišné signální charakteristiky v různém fyziologickém prostředí a pro různé patologické stavy. Tak např. navázáním na složku tkáně kontrastní činidlo » pro MRI může ukázat změny v indukované rychlosti relaxace nebo chemickém posunu vedlejších nebo přilehlých jader. Podobně optické barvivo může po navázání ukázat změny v absorbanci (pohltivosti) , reflektanci (odrazivosti), fluorescenci, fosforescenci, chemiluminiscenci, rozptylu nebo jiných spektrálních vlastnostech.

Obecně lze říci, že kontrastní činidlo, aby poskytlo diagnostické údaje, musí interferovat s vlnovou délkou elektromagnetického záření, které se užívá v daném zobrazovacím způsobu, 'měnit fyzikální vlastnosti tkáně, aby vznikl odlišný signál, nebo jako je tomu v případě ) radiofarmak, činidlo samo je zdrojem záření. K obecně * užívaným materiálům patří organické molekuly, ionty kovů, soli, cheláty, včetně chelátů kovů, částice (zvláště částice železa), značené peptidy, protilátky, proteiny, polymery nebo liposomy.

Po podání některá činidla nespecificky difundují tělními kompartmenty před tím, než jsou metabolizovány a/nebo vyloučeny, tato činidla jsou obecně známa jako nespecifická * činidla. Alternativně, jiná činidla mají specifickou afinitu • · · · • · · · · · · • · · · · · · • · t · · · · * • ·· · · ·· · • · ··· ·· · · · · · · k určitému tělnímu kompartmentu, buňce, buněčné složce, orgánu nebo tkáni, tato činidla se obecně nazývají cílená činidla.

Jednou z aplikací diagnostických zobrazovacích metod je monitorování intervenčních terapií. K všeobecně známé intervenční terapii patří zaměření nežádoucí tkáně nebo ¹ složky tkáně vysokotermální energií pomocí zaostřeného ultrazvuku (např. Cline et al., MR Temperatute Mapping of Focused Ultrasound Surgery, Mag. Resn. Med. 31: 628-636,

1994), radiofrekvenční generátory (např. Rossi et al., Percutaneous RF Interstitial Thermal Ablation in the Treatment of Hepatic Cancer, AJR 167: 759-768, 1996), ' mikrovlnné antény (např. Schwarzmeier et al., Magnetic resonance Imaging of Microwave Induced Tissue heating, Mag. Resn. Med. 33: 729-731, 1995) a lasery (např. Vogl et al.,

Reccurent Nasopharyngela Tumors: Preliminary Cinical Results with Interventional MR Imaging-Controlled Laser-Induced Thermotherapy, Radiology 196: 725-733, 1995), použití kryoablace (tj. kapalného dusíku) a injekce denaturačního roztoku (např. etanolu, horkého roztoku soli) přímo do požadovaného orgánu (např. Nagel et al., Contrast-Enhanced MR Imaging of Hepatic Lessions Treated with Percutaneous Ethanol Ablation Therapy, Radiology 189: 265-270, 1993, a Honda et t al., Percutaneous Hot Salině Injection Therapy for Hepatic

Tumors: An Alternativě to Percutaneous Ethanol Injection )

Therapy, Radiology 190: 53-57, 1994), injekce chemoterapeutických nebo chaotropních činidel do tkáně (např. Pauser et al., Evaluation of Efficient Chemoembolization Mixtures by Magnetic Resonance Imaging of Therapy Monitoring: An Experimental Study on the VX2 Tumor in the Rabbit Liver, Cancer res. 56: 1863 -67, 1996), a fotodynamické terapie, kdy fe se cytotoxické činidlo aktivuje in vivo po ozáření světlem (např. Dodd et al., MRI Monitoring of the Effects of Photodynamic Therapy on Prostatě Tumors, Proč. Soc. Mag. Resn. 3: 1368, ISSN 1065-9889, August 19-25, 1995). Společným cílem všech takových intervenčních terapií je takové ošetření nežádoucí tkáně nebo tkáňové složky (např. nádorů, neoplázických tkání nebo složek tkání), které způsobí nekrózu, ablaci, koagulaci nebo denaturaci takové tkáně.

Aby taková intervenční terapie vedla k maximálnímu prospěchu a minimalizovaly se vedlejší účinky (např. poškození sousedních tkání), je nezbytné monitorovat in vivo účinnost terapie. A skutečně, aby terapie byla účinná, intervenční terapie musí pokračovat tak dlouho, dokud požadovaná tkán nebo tkáňová složka zcela a úplně odumře (tj. je zcela neživotná po odstranění nebo ukončení terapie). Tudíž je potřeba nejen monitorovat přesně průběh terapie, aby se zabránilo nadbytečnému léčení a s tím spojenému případnému poškození sousedních tkání, ale je také třeba přesně odlišit skutečně nekrotickou tkáň od tkáně, která je v určité míře poškozená, ale přesto zůstává životaschopná.

Jednou cestou, jak monitorovat účinnost intervenční terapie, je zobrazovat nežádoucí tkáň nebo složku tkáně v průběhu terapie á také po terapii. Avšak taková diagnostická zobrazovací metoda musí být schopna zvýšit kontrast mezi tkáněmi různého nativní a denaturovanou tkání, tkání), a to takovým způsobem, třídy informací:

1) Detekční data: K nim patří spektroskopické informace nezbytné ke stanovení patologického stavu zobrazované tkáně. Schopnost poskytnout tuto třídu informací souvisí se patologického stavu (mezi mezi živou a nekrotickou aby poskytla dvě základní specifičností a sensitivitou činidla.

2) Zpětná vazba a rozlišení: Tato třída informací poskytuje monitorování intervenčních terapeutických postupů, které vedou k likvidaci nebo degradaci tkáně nebo složky tkáně. Je zjevně, že u některých intervenčních metod je v průběhu terapie výhodná zpětná vazba v reálném čase (kolem 1 až 10 vteřin), zatímco u jiných metod je dostačující vyhodnocení až po terapii. U všech intervenčních terapií je ovšem potřebné přesné prostorové rozlišení (přibližně 1 až 5 mm) ošetřovaných tkání a jakéhokoliv účinku na sousední tkáně v průběhu terapie.

Současné metody založené na MRI pro monitorování účinnosti intervenčních terapií spadají obecně do jedné ze dvou tříd: 1) metody, kdy se neužívá exogenní kontrastní činidlo, ale spoléhá se na jiný pozorovatelný parametr MR (viz výše) a 2) metody, které užívají nespecifické extracelulární kontrastní činidlo. Tyto metody však ve skutečnosti neposkytují žádnou přímou informaci týkající se patologického stavu tkáně nebo složky tkáně podrobující se intervenční terapii (např. zda je nativní nebo denaturovaná, živá nebo nekrotická) . Kromě toho jsou tyto metody silně omezeny v podstatě na monitorování termální ablační terapie a projevují jen omezenou sensitivitu k termálně indukovaným teplotním změnám ve tkáních.

Několik z těchto metod založených na MRI pro monitorování termální ablační terapie se opírá o teplotně závislé parametry NMR jako jsou relaxační časy (Ti a/nebo TJ , frekvence protonové resonance (PRF) vody, fázový posun a difúzní koeficient. Avšak tyto metody trpí celou řadou různých omezení.

Tak např. jedna z těchto metod zahrnuje monitorování účinku teploty na relaxační čas Ti tkáně (viz např. Cline et al., MR Temeprature Mapping of Focused Ultrasound Surgery, • ·

Mag. Resn. Med. 31: 628-636, 1994. Tento přístup však je nedostatečný, neboť každá tkáň má jinou závislost Ti na teplotním profilu a tudíž tato metoda vyžaduje kalibraci Τχ pro každý typ tkáně. Metoda založená na Ti je také omezena svou citlivostí s tkáňově závislou změnou v Ti pouze 0,01 % až 1,5 % na 1 °C.

K další metodě užívající měření teploty patří monitorování účinku teploty na frekvenci protonové rezonance (nebo chemický posun) vody. Tato metoda detekuje změny ve vodíkové vazbě a molekulárním pohybu molekul vody, které jsou indukovány teplotními změnami (viz např. J.D. Poorter et al., Noninvasive MRI Thermometry with the Proton Resonance Frequency (PRF) Method: In Vivo Results in Human Muscle, Mag. Resn. Med. 33: 74-81, 1995). Avšak nízká sensitivita této metody (0,01 ppm/°C) vyžaduje použití velmi silného magnetického pole (tj. > 4,7 T) , což je klinicky nežádoucí. A navíc stanovení chemického posunu vody vyžaduje absolutně stálé magnetické pole a silně závisí na magnetické citlivosti tkáně, která je velmi proměnlivá pro různé druhy tkání. Takže i tato metoda, podobně jako metoda založená na Ti, vyžaduje extenzivní kalibraci pro každý tkáňový typ. A nakonec tato metoda stejně neposkytuje informaci týkající tepelně indukované nekrózy nebo degradace tkáně.

Další známá metoda vyžaduje monitorovat účinek teploty na difúzní koeficient protonu vody (viz např. H. Saint Jalmes, Precision in Temperature Measurement via TI or Diffusion Imaging, Proč, Proč. Soc. Mag. Resn. 2: 1072, ISSN 1065-9889, August 19-25, 1995) . Tato metoda je však také omezena, neboť difúzní koeficient je citlivý k pohybu tkáně a perfúzi.

U všech výše zmíněných metod fyziologické změny ve tkáni způsobené zvýšeným průtokem krve, tkáňovým metabolismem nebo »· ··· · ·· ·· indukovaným edémem, mohou vést k nepředvídaným změnám v signálu (tj. ke změně magnetické citlivosti). Díky těmto účinkům standardní termální kalibrační křivky mají jen malý nebo vůbec žádný význam pro přesné monitorování termální ablační terapie.

Byly popsány i jiné metody, které monitorují účinky teploty na chemický posun jiných magnetických jader. Tak např. NMR chemický posun kobaltu je velmi citlivou sondou na teplotu. Ale nízká receptivita ⁵⁹Co vyžaduje opět velmi silné pole (> 4,7 T) , vysoké koncentrace a dlouhé měřicí časy (viz A.G. Webb et al., Measurement of Microwave Induced Heating of Breast Tumors in Animal Model Using Cobaltbased NMR, Proč. Soc. Mag. Resn. 1: 72, ISSN 1065-9889, August 19-25, 1995).

Kromě toho toxicita kobaltového činidla představuje vážné omezení pro využití in vivo.

Fluorová (^1SF) NMR byla také užita k monitorování teplotně závislých fázových přechodů fluorovaných uhlovodíků enkapsulovaných v liposomech a fluorovaných polymerů (viz např. Webb et al., Microencapsulation of Fluorine Containing Phase Transition Agents for Moninoring Temperature Changes in vivo, , Proč. Soc. Mag. resn. 3: 1574, ISSN 1065-9889,

August 6-12, 1994). ' Klinicky však metoda s (¹⁹F) není užitečná, neboť dochází jen k omezené biologické distribuci polymerních fluorovaných činidel, a také vzhledem k závislosti chemického posunu fluorovaných činidel na pH a typu tkáně a na potřebě silného magnetického pole. Tato činidla neposkytují informace o nekrózách.

Určitá kontrastní činidla paramagnetických kovů byla také účinnosti intervenčních terapií.

termálně indukovaných obsahující komplexy navržena k monitorování Taková činidla mohou indukovat velké změny v chemickém posunu protonů (20 až 40

• · · · ppm) chelatujícího ligandu od normálního rozmezí frekvence rezonance vody. Paramagnetickým posunem rezonancí mimo oblast hlavní rezonance vody in vivo je možné tyto rezonance pozorovat (viz např. Aime et al., Yb(III)DOTMA as Contrast Agent in CSI and Temeperature Probe in MRS, Proč. Soc. Mag. resn. 2: 1109, ISSN 1065-9889, August 19-25, 1995). Ačkoliv tyto mimořádné rezonanční posuny jsou závislé na teplotě, vyžadují použití vysokých koncentrací paramagnetických komplexů a klinicky nevhodné silné magnetické pole k detekci teplotních změn. Tyto komplexy také neposkytují žádné informace o tepelně-indukovaných nekrózách tkání.

Nedávno byla popsána metoda k odlišení normální a nekrotické jaterní tkáně (Dupoas et al., Delineation of Liver Necrosis using Double Contrast-Enhanced MRI, J. MRI Vol. 7 no. 3, pp. 472-77, 1997). Tato metoda však vyžaduje použití nespecifického kontrastního činidla, které omezuje její schopnost specificky monitorovat změny stavu požadované tkáně nebo složky tkáně. Takže i tato metoda vyžaduje podávání několika kontrastních činidel.

Tudíž dosud známé diagnostické zobrazovací metody jsou omezeny tím, že nemohou poskytnout přesnou informaci o stavu specifické tkáně nebo složky tkáně, která je podrobována intervenční terapii (zda-li je tkáň v nativním nebo denaturovaném stavu, zda je tkáň živá nebo nekrotická). Tudíž existuje silná potřeba diagnostické zobrazovací metody, která by neinvazivním způsobem a přesně monitorovala stav specifické tkáně nebo složky tkáně, a která by případně poskytovala i rychlou zpětnou vazbu týkající se tkáňové nekrózy v průběhu intervenčních terapií.

φφ ···· ·· ·· φ · φ · φ · · • · * φ · · · • φ φ · · φφ · φφφφ φφφφ φφ φφ ·· ··

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká diagnostického zobrazení se zvýšeným kontrastem, zvláště MRI a optického zobrazování, a sice specifické tkáně nebo složky tkáně, na které se provádí intervenční terapie. Tento způsob obsahuje kroky, kdy:

a) se podá pacientovi kontrastní činidlo schopné navázat se na cílovou tkáň nebo složku tkáně, která se podrobuje nebo se podrobila intervenční terapii,

b) pacient se podrobí vyšetření jednou ze zobrazovacích metod MRI, pomocí ultrafialového světla, viditelného světla nebo infračerveného záření, a

c) monitoruje se zobrazovací signál charakteristický pro kontrastní činidlo k tomu, aby se stanovilo, zda je intervenční terapie zcela ukončena.

Kontrastní činidlo použité v předkládaném vynálezu obsahuje zobrazení zesilující (nebo signál vytvářející) skupinu (IEM) a skupinu vázající se na tkáň v závislosti na jeho stavu (SDTBM). Tato kontrastní činidla jsou schopna projevit na stavu závislou vazbu k cílové tkáni nebo složce tkáně. Taková vazba vede k detekovatelné změně v signálních charakteristikách kontrastního činidla a tudíž dovoluje stanovit změny stavu cílové tkáně (ablaci, degradaci nebo denaturaci), který se podrobuje nebo podrobil intervenční terapii.

V jednom aspektu předkládaného vynálezu použití kontrastního činidla dovoluje monitorování termálně indukované nekrózy v reálném čase v průběhu termální intervenční terapie. Tato kontrastní činidla vykazují zvýšený kontrast mezi tkáněmi různých stavů.

φφ ΦΦΦ* ·· ** • φ φ φ φ φ φ φ ΦΦΦ* φ ΦΦΦ φ φ * φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ

Popis obrázků

Obr. 1. je grafické znázornění experimentálních dat účinků, které mají změny teploty na pozorovanou relaxivitu (Ri) pro roztok HSA s použitím kontrastního činidla nebo bez něho.

Obr. 2 je grafické znázornění experimentálních dat ztráty intenzity signálu ROI v průběhu času při zobrazování MRI generovaném použitím roztoku HSA s použitím kontrastního činidla nebo bez něho.

Obr. 3 je grafické znázornění experimentálních dat účinků, které mají změny v koncentraci etanolu na pozorovanou relaxivitu (Ri) pro roztok HSA s použitím kontrastního činidla nebo bez něho.

Detailní popis vynálezu

Pro lepší pochopení předkládaného vynálezu je uvedeno následující podrobnější vysvětlení.

Předkládaný vynález se týká neinvazivního způsobu přesného monitorování účinnosti intervenčních terapií (tj. monitorování stavu nežádoucí tkáně nebo složky tkáně). Konkrétně vynález poskytuje diagnostickou zobrazovací metodu, která zahrnuje použití kontrastního činidla, kteréžto činidlo vykazuje vazbu k cílové tkání nebo složce tkáně závislou na jejich stavu, přičemž signální charakteristiky činidla se mění, když se naváže na cílovou tkáň. Zobrazovací metoda vhodná pro uplatnění vynálezu je MRI (kam patří techniky magnetické resonanční spektroskopie) a optické zobrazovací metody.

•r ···· ·· *· » · · 1 > · · <

» · · <

·· ··

Termín „intervenční terapie se zde užívá tak, že označuje jakýkoliv z mnoha způsobů terapie, jejichž cílem je indukovat nebo způsobit nekrózu, ablaci nebo koagulaci nějaké nežádoucí (např. rakovinné tkáně, nádoru, neoplázie) tkáně nebo složky tkáně.

Termín „patologický stav nebo jen „stav se zde užívá široce k označení dvou fyziologických stavů tkáně nebo složky tkáně, která je podrobována intervenční terapii. Jeden z těchto stavů je považován za stav živý, nativní (přirozený) nebo životaschopný. Tento „počáteční stav obvykle popisuje tkáň před započetím jakékoliv intervenční terapie, kdy tkáň a/nebo buněčné mechanismy jako je metabolismus a respirace jsou plně funkční. „Druhý stav, který popisuje tkáň v průběhu terapie nebo poté, co prodělala úspěšnou intervenční terapii, je považován ze neživý, denaturovaný, nekrotický nebo apoptotický, kdy tkáně a/nebo buněčné mechanismy jsou aberantní, nefunkční nebo funkce ustaly.

Způsob podle vynálezu obsahuje kroky, kdy:

a) podá se pacientovi kontrastní činidlo schopné navázat se na cílovou tkáň nebo složku tkáně, která se podrobuje nebo se podrobila intervenční terapii,

b) pacient se podrobí vyšetření jednou ze zobrazovacích metod MRI, pomocí ultrafialového světla, viditelného světla nebo infračerveného záření, a

c) monitoruje se zobrazovací signál charakteristický pro kontrastní činidlo k tomu, aby se stanovilo, zda je intervenční terapie ukončena.

Kontrastní činidlo použité v předkládaném vynálezu obsahuje zobrazení zesilující (nebo signál vytvářející) skupinu (IEM) a skupinu vázající se na tkáň v závislosti na jeho stavu (SDTBM). V důsledku kombinace těchto dvou skupin, které jsou podrobněji popsány dále, jsou kontrastní činidla ···· » ·· ···· ·· ·· ·»· *· · «·«· • · »·· ···· • ··»· ··»·♦· • · * ···· ·»♦· ·· .·· ·· ·· ·· ·· schopna projevit na stavu závislou vazbu k cílové tkáni nebo složce tkáně, a projevují takové signální charakteristiky, které se mění, když dojde k navázání na cíl.

Na stavu závislá vazba se týká relativní afinity, kterou vykazuje kontrastní činidlo pro cílovou tkáň nebo složku tkáně a která je závislá na stavu cílové tkáně. Takže činidlo použité v předkládaném vynálezu má větší nebo menší vazebnou afinitu k jedné nebo několika složkám tkáně v jejich denaturovaném nebo nekrotickém stavu ve srovnání s vazebnou afinitou činidla k nativní nebo živé tkáni.

Tyto na stavu závislé změny ve vazbě vedou k lokalizaci činidla do tkáně v jednom stavu oproti tkáni ve druhém stavu a současně se mění signální charakteristiky činidla, které zesilují detekci změny stavu, ke které dochází. Např. pokud činidlo projevuje vyšší vazebnou afinitu k živé nebo nativní tkáni, když zvýšená vazebná afinita vede k intenzivnějšímu signálu, pak živá tkáň je zobrazena (nebo detekována) jako horké místo („hot spot). V průběhu intervenční terapie toto horké místo „vychládá, jak se živá tkáň mění na nekrotickou, odumřelou, neboť se snižuje vazebná afinita činidla k nekrotické tkáni. Naopak, když činidlo projevuje vyšší vazebnou afinitu k nekrotické nebo neživotaschopné tkáni, pak se z této tkáně stane „hot spot v průběhu intervenční terapie.

Je výhodné, když na stavu závislá vazebná afinita činidla vykazuje vyšší citlivost ke změnám fyziologického stavu. Výhodná činidla jsou taková, která mají vazebnou afinitu a odpovídající změny signálu, které jsou citlivě vyladěny, aby odpovídaly změnám stavu, který ve tkáni nebo složce tkáně probíhají. Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu, monitorováním změn v signálu v průběhu intervenční • •fe· fefe fefefefe fefe fefe fe · · fefe · · » fe · • · fefefe fefe·· • fe··· >··♦♦· • · ···· · · r · fefe ··< ·· fe· »· <*· terapie, je zlepšeno citlivé monitorování v účinnosti a rozsahu ablace tkáně.

reálném čase

Struktura kontrastního činidla

Kontrastní činidla použitá v předkládaném vynálezu musí obsahovat přinejmenším zobrazení zesilující (nebo signál vytvářející) skupinu (IEM) a skupinu vázající se na tkáň v závislosti na jejím stavu (SDTBM). Případně může být užita ještě fyziologicky kompatibilní spojovací skupina (L) k vzájemnému spojení IEM s SDTBM. K příkladům vhodných skupin pro vytvoření spojení patří cyklická alkylová, arylová, polyéterová, polyaminová, peptoidová, fosfátová nebo sulfátová skupina, nebo i jiná fyziologicky kompatibilní skupina. Spojovací skupiny mohou poskytnout důležitou fyzikálněchemickou stabilitu komplexu tím, že zvýší biologický poločas v krvi nebo v jiných tekutinách či kompartmentech. Spojovací skupiny také mohou poskytnout prostředky pro biologickou degradaci a následné vyloučení činidla.

lineární, rozvětvená nebo éterová, polyhydroxylová, heterocyklická, peptidová,

1. Skupina zesilující zobrazení (IEM)

První doménou kontrastního činidla použitého v předkládaném vynálezu je IEM, což může být jakákoliv chemická látka nebo substance použitá k tomu, aby poskytla signál nebo kontrast při zobrazení. IEM musí být schopná tvořit různé signální charakteristiky, když je činidlo navázáno na tkáň nebo složku tkáně ve srovnání s volným činidlem. Při optickém zobrazování to může být změna absorbance, reflektance, fluorescence, rozptylu, fosforescence, chemiluminiscence, zvýšení nebi snížení počtu vrcholů absorbance nebo jakákoliv změna vlnové délky maxim,

nebo jakákoliv jiná změna, která by při vnější detekci odpovídala navázané IEM. Pro MRI to je změna v indukované relaxační rychlosti protonů vody (1/T_X nebo I/T2) nebo jakýchkoliv blízkých jader, nebo posun jednoho nebo několika vrcholů ve spektru NMR buďto IEM nebo vrcholů, které pocházejí z jader ve vazebném místě pro SDTBM.

Tudíž IEM může být organická molekula, kovový ion, sůl nebo chelát, včetně chelátů kovů, kovový klastr nebo částice (zejména železná částice), nebo značený peptid, protein, polymer nebo liposom. Pro optické zobrazování (které užívá ultrafialové, viditelné nebo infračervené světlo) může jako IEM sloužit také jakékoliv organické nebo anorganické barvivo. K příkladům vhodných barviv patří indokyaninová zeleň a fluorescein. K příkladům anorganických barviv patří luminiscenční kovové komplexy jako jsou např. komplex Eu(III), Tb(III) a jiných lanthanidových iontů (atomová čísla 57 až 71)(viz např. W.Dew. Horrocks, M. Albín, Progr. Inorg. Chem. 1984, 31, pp. 1-104).

Zvláště užitečné IEM představují sloučeniny chelátů kovů obsahující jedno nebo několik cyklických nebo acyklických organických chelatujících činidel vytvářejících komplex s jedním nebo několika ionty kovu. Pro optické zobrazování k výhodným iontům kovů patří ty, které mají atomová čísla 13, 21 až 31, 39 až 42, 44 až 50 nebo 57 až 83. Pro MRI k výhodným iontům kovů patří ty, které mají atomová čísla 21 až 29, 42, 44 nebo 57 až 83 a ještě výhodněji paramagnetické formy kovových iontů s atomovými čísly 21 až 29, 42, 44 nebo 57 až 83. Když IEM obsahuje chelát paramagnetického kovu, výhodný paramagnetický kov je vybrán ze skupiny obsahující Gd(III), Fe(III), Mn(II a III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III a IV), Ho(III), Er(III), Pr(III) a Eu(II a III). Nej výhodnější je Gd(III).

··· ·· · · · · · ·

Pokud je IEM chelát kovu, nesmí disociovat ve významné míře zatímco činidlo prochází organismem, včetně cílové tkáně. Významné uvolňování volných iontů kovu, a zvláště volné ionty paramagnetických kovů, mohou vést k toxicitě, která by byla akceptovatelná pouze v patologické tkáni.

Obecně platí, že stupeň toxicity chelátů kovů souvisí se stupněm disociace in vivo před vyloučením. Toxicita se obecně zvyšuje s množstvím volných iontů kovu. Pro komplexy s vysokou kinetickou labilitou je žádoucí vysoká termodynamická stabilita (formační konstanta alespoň 10¹⁵ M'¹ a výhodněji alespoň ΙΟ²⁰ M'¹) aby se minimalizovala disociace a doprovázející toxicita. Pro komplexy, kde kinetická labilita je srovnatelně nižší, disociace může být minimalizována s nižší formační konstantou, tj . ΙΟ¹⁰ M'¹ nebo vyšší.

Toxicita je také funkcí počtu volných koordinančích míst v komplexu. Obecně méně koordinačních míst vody snižuje tendenci chelatačního činidla uvolňovat paramagnetický kov. Proto je výhodný komplex obsahující dvě, jedno nebo žádné volné koordinační místo. Přítomnost více než dvou otevřených koordinačních míst obecně v nepřijatelné míře zvýší toxicitu uvolňováním iontů kovu· in vivo.

Aby se účinně zlepšilo zobrazení MRI, komplex musí být schopen zvýšit relaxační rychlosti l/Τι (podélnou, nebo spin-mřížka) a/nebo I/T2 (příčnou, nebo spin-spin) protonů vody nebo jiných jader užitých ke zobrazení nebo spektroskopii, včetně protonů, P-31, C-13, Na-23 nebo F-19 na IEM, jiných biomolekul nebo injikovaných biomarkerú. Relaxivity jsou zde definovány jako schopnost zvýšit 1/Ti nebo 1/T₂ na 1 mM iontů kovu (tj. mM^-1 s'¹) . Pro nejobvyklejší formu klinické MRI, MRI protonů vody, je relaxivita optimální, když paramagnetický iont navázaný na chelatující • · · · • · ·· ·· · · ·» ligand má ještě jednu nebo několik volných koordinačních míst pro výměnu vody (R. B. Laufer, Chemical Reviews, 87, 901-927, 1987). Avšak ta musí být v rovnováze se stabilitou chelátu kovu (viz výše), která obecně se snižuje s rostoucím počtem volných koordinačních míst. Výhodněji proto komplex obsahuje pouze jedno nebo dvě volná koordinační místa.

Typ chelatujícího ligandu může značně ovlivnit rychlost výměny vody u MRI činidla. Zejména rychlost výměny vody hraje důležitou roli při tkáňovém kontrastu vytvářeném při termální ablační terapii. Obecně vyšší rychlost výměny vody poskytuje vyšší Ri neboť větší počet molekul vody reaguje s paramagnetickým centrem, a naopak, nižší rychlost výměny vede k nižší Ri. Takže komplex chelátu kovu, který má nízkou rychlost výměny vody (kex-298K = 500 až 10 000 ns) obecně povede ke zvýšení l/Τι (Ri) , když poroste teplota, což bude odrážet pozitivní účinek zvýšeného tepelného pohybu molekul vody a zvýšenou rychlost výměny vody v blízkosti paramagnetického centra, Ri pak dosahuje obvykle maximální kontrastní hodnoty při teplotě vyšší než je fyziologická. Při určité teplotě kontrast poklesne na minimum, když je prospěšný účinek zvýšené výměny vody vyvážen nedostatečným časem, který molekuly vody stráví v blízkosti paramagnetického centra.

Chelát kovu s mírně rychlou výměnou vody (kex-298 K = 10 až 100 ns) vykazuje relativně plochou závislost l/Τι (Ri) na teplotě, která poklesne při určité vyšší teplotě, opět z důvodu nedostatečného času, který molekuly vody stráví v blízkosti paramagnetického centra za těchto podmínek.

Chelát kovu s velmi rychlou výměnou vody (kex-298 K = 0,1 až 10 ns) při fyziologických a vyšších teplotách vykazuje sníženou hodnotu l/Tj, neboť zvýšený pohyb molekul vody dále omezuje čas, který molekuly vody stráví v blízkosti

paramagnetického centra. Avšak takový chelát vykazuje zvýšení hodnoty 1/Τχ při nižších teplotách (tj . kryogenních) v důsledku zvýšeného času, který molekuly vody stráví v blízkosti paramagnetického kovu.

Když se způsob podle předkládaného vynálezu užije k monitorování termální ablační terapie, je výhodné jako IEM užít cheláty se středně rychlou výměnou vody, aby se maximalizoval kontrast mezi počátečním nativním nebo živým stavem tkáně stavem tkáně (Rlpcčáteční ) &

(Rldruhý) · Pro denaturovaným nebo nekrotickým terapie využívající kryogenní techniky je výhodné užít cheláty s velmi rychlou výměnou vody, aby se využilo selektivní výhody zvýšení l/Τι (RJ , když se sníží teplota. Při všech způsobech intervenční terapie je výhodné, aby sensitivita profilu R_x vzhledem ke stavu tkáně přesně sledovala denaturační profil sledované tkáně nebo její složky.

Kromě zvýšení hodnot l/Τι nebo 1/T; jader ve tkáni prostřednictvím interakcí dipól-dipól, činidla MRI mohou ovlivnit dvě další magnetické vlastnosti, a být tak klinicky využitelné: 1) Částice železa nebo chelát kovu s vysokou magnetickou citlivostí, zvláště cheláty Dy, Gd nebo Ho, mohou změnit intenzitu signálu MRI tkáně tím, že vytvoří mikroskopické gradienty magnetické citlivosti (A. Villringer et al., Magn. Reson. Med. 6, pp. 164 -174, 1998). Při této aplikaci nejsou potřebná žádná volná koordinační místa chelátu. 2) Částice železa nebo chelát kovu se mohou užít také k posunu rezonanční frekvence protonů vody nebo jiných jader využitých pro zobrazení nebo spektroskopii, včetně protonů, P-31, C-13, Na-23 nebo F-19 na injikovaném činidle nebo složce tkáně, na kterou se váže. V tomto případě lze využít, v závislosti na j>dru a použité strategii, žádné až tři volná koordinační místa.

»· · ·

Organické chelatující ligandy musí být fyziologicky kompatibilní. Molekulární velikost chelatujícího ligandu musí být kompatibilní s velikostí paramagnetického kovu. tak Gd(III) mající krystalový iontový poloměr 0,938 A, vyžaduje větší chelatující ligand než Fe (III), které má krystalový iontový poloměr 0,64 A.

V oboru je známo mnoho chelatujících ligandů pro MRI činidla. Ty mohou být použity pro cheláty kovů pro ostatní formy biologického zobrazování. K výhodným IEm patří následuj ící:

Gd³⁺ /-^C02

CO₂

Magnevist gadopentetátdimeglumin

DTPA

Dotarem gadoteratmeglumin

DOTA

Z \ ch₃ h

/

N

η \:h₃

Omniscan gadodiamid

DTPA-BMA

ProHance gadoteridol

HP-DO3A

V oboru je známo, že při určitých aplikacích je možné nahradit Gd^J+ jinými kovy.

• · · · · <

• · podle tkáň

2. Skupina vázající se na tkáň v závislosti na jejím stavu (SDTBM)

Druhou doménou kontrastního činidla požitého předkládaného vynálezu je skupina vázající se na v závislosti na jejím stavu (SDTBM), která činidlu poskytuje zaměřovači funkci. SDTBM je vysoce variabilní a závislá na požadované aplikaci. Takže specifická struktura SDTBM je závislá na specifické tkáni nebo složce tkáně, na kterou se má vázat. Obecně SDTMB musí vybavit kontrastní činidlo na stavu závislou změnou vazebné afinity k cílové tkáni nebo složce tkáně. Na stavu závislá změna vazebné afinity musí také vést k detekovatelné změně v signálních charakteristikách kontrastního činidla. Změna ve vazebné afinitě musí být dostatečně citlivá a počet vazebných míst dostatečně velký, aby se vytvořil kontrast, když dojde ke změně stavů.

SDTBM může obsahovat malou molekulu nebo alternativně biomolekulu. Biomolekuly se mohou lišit co do molekulové ale všechny j sou z přirozeně se (tj. aminokyselin nebo nukleotidů). K příkladům biomolekul patří receptory ligandů, sacharidy, lipidy, hormony, peptidy, proteiny, nukleotidy a nukleové kyseliny (DNA, RNA) a protilátky včetně fragmentů protilátek a jejich monoklonálních verzí nebo verzí upravených metodami genového inženýrství.

Malé molekuly jsou známé synteticky připravené organické molekuly s relativně nízkou molekulovou hmotností, které jsou chemicky jen málo podobné a nebo nejsou vůbec podobné biomolekulám. Malé molekuly většinou typicky neobsahují podjednotky biomolekul a vazby (např. přirozené aminokyseliny spojené amidovými vazbami). K příkladům malých molekul patří sdílejí základní biologicky odvozeny nebo vyskytujících podjednotek hmotnosti a vlastnost, a syntetizovány velikosti, sice že • ♦ • ·

9 proteinů intracelulárním syntetická léčiva, lipofilní nebo amfifilní organické molekuly a porfyriny.

K výhodnějším SDTBM patří ty, které se reverzibilně váží na plazmatické proteiny, proteiny v intesticiálním prostoru (tekutina mezi buňkami) nebo v mezibuněčném prostoru. I když se může užít jakákoliv biomolekula nebo malá molekula, která se váže na protein, nejužitečnější jsou takové, které se váží na proteiny, které se buďto vyskytují ve vysokých koncentracích nebo mají vysoký počet vazebných míst pro určité ligandy. Jelikož nativní stav mnoha v tkáních, plazmě, intersticiálním nebo prostoru je obvykle lépe strukturně a chemicky definován než ve stavu denaturovaném nebo rozloženém, je výhodným aspektem předkládaného vynálezu navrhnout SDTBM, která se váže s vyšší afinitou k takovým nativním stavům než k odpovídajícím denaturovaným stavům. Tento rozdíl ve vazebné afinitě mezi nativním a denaturovaným stavem vede k detekovatelné změně v signálních charakteristikách činidla.

Kvantitativní měření schopnosti kontrastního činidla relaxovat protony vody a tudíž ovlivňovat zobrazení MRI poskytuje relaxivita. Jak již bylo popsáno výše, relaxivita je závislost intenzity signálu protonů vody na koncentrace paramagnetického iontu kovu v roztoku. Relaxivita je definována jako indukovaná Ti nebo T₂ relaxace na jednotku času (Rj nebo R₂ jednotkách mM^-1 s¹) pozorovaná pro kontrastní činidlo, když je koncentrace činidla vyjádřena jako milimolární (mM).

Fyzikální vlastnosti gadoliniového komplexu ovlivňují relaxivitu kontrastního činidla. Počet molekul vody vázaných ke gadoliniovému komplexu, rychlost výměny s okolním roztokem, relaxační čas sedmi molekul vody nespárovaných elektronů a rotační čas (známý jako rotační korelační čas) «· 9 9 pnspivaji k celkové kontrastního činidla v roztoku pozorované relaxivitě. Změny těchto fyzikálních vlastností mohou dramaticky změnit relaxivitu. Účinek rychlosti výměny vody na relaxivitu byl již diskutován výše. Kromě toho vazba malých a s relativně malou molekulovou hmotností chelátu gadolinia k velkým makromolekulám zpomaluje rotační čas a zvyšuje relaxační zesílení 3 až lOx. Vazba kontrastního činidla na protein způsobuje, že magnetické fluktuace mezi paramagnetickým iontem a protony vody se vyskytují ve stejném časovém měřítku jako Larmorova frekvence, což generuje nejúčinnější možnou podélnou (TJ relaxaci a nejvyšší možnou relaxivitu. Takže na stavu závislá vazba MRI kontrastního činidla k velkým makromolekulám, jako jsou proteiny, je účinnou cestou jak zvýšit signál MRI (a kontrast) jednoho stavu proti druhému. Zobrazovací kontrast je vytvářen mezi oblastmi, které projevují různou hladinu vazby kontrastního činidla. Ve výhodném aspektu vynálezu je zobrazovací kontrast vytvářen mezi oblastmi s vysokou vazebnou afinitou (nativní stav) a nízkou vazebnou afinitou (denaturovaný stav).

K vytvoření kontrastu mezi tkáněmi nebo složkami tkáně různého stavu, je třeba, aby změna vazebné afinity kontrastního činidla byla alespoň 20 % nebo víc při změně stavu tkáně. Tak např. když je činidlo z 90 % navázáno (tj. 10 % je volných) k živému stavu cílové tkáně nebo její složky (tj. HSA), činidlo by mělo být vázáno ze 72% nebo méně za stejných podmínek k neživému (tj . denaturovanému) stavu. Větší kontrast se vytvoří, jestliže rozdíl ve vazebné afinitě bude vyšší. Je tedy žádoucí, aby vazebná afinita kontrastního činidla pro druhý stav tkáně (který vzniká v důsledku intervenční terapie v jejím průběhu nebo po ní) byla 80 % nebo méně z vazebné afinity k prvnímu stavu tkáně, výhodně 50 % nebo méně a nejvýhodněji 10 % nebo méně.

V případě, kdy IEM je vhodný chromofor pro použití při optickém při optickém zobrazování, vynález vyžaduje, aby existoval měřitelný rozdíl mezi optickými vlastnosti léčiva nenavázaného na tkáň a kontrastního činidla navázaného na tkáň. Tak např. maximální absorbance indokyaninové zeleně se posouvá z 770 až 780 nm na 790 až 805 nm po navázání na plazmu nebo krev. Tato na stavu závislá vazba může být využita k detekci tkáňové denaturace monitorováním posunu absorbance barviva, když se tkáň denaturuje a proteiny se již dále neváží. Odborník ocení, že optická činidla užitečná v předkládaném vynálezu obecně mají tendenci poskytovat vyšší citlivost ke stavu tkáně. Proto k vytvoření dostatečného kontrastu optické činidlo nevyžaduje tak velký rozdíl ve vazebné afinitě nebo tak velký rozdíl v signálu pro dva stavy tkáně jako činidla pro MRI podle vynálezu.

Na stavu závislá vazba musí vést ke změnám signálních charakteristik kontrastního činidla. Při MRI tyto změny vlastností signálu se projeví jako změny indukovaných relaxačních rychlostí (l/Τι nebo l/TJ protonů vody nebo relaxivit Ri a R_:. Podle výhodného aspektu předkládaného vynálezu relaxivita činidla ve druhém stavu tkáně (Ridruhý) je 80 % nebo méně relaxivity (Ri_počáte5ní) činidla v počátečním stavu tkáně. Výhodně je Ridruhý 50 % nebo méně hodnoty

Ripočáteíní/ výhodněji 2 0 % nebo méně a nej výhodně ji 10 % nebo méně.

Je také výhodné, aby po té, co je dokončena intervenční terapie a cílová tkáň se navrátí do fyziologických podmínek (např. v případě termální denaturace po té, co se teplota sníží na fyziologickou teplotu) relaxivita Ri činidla byla stále nižší než relaxivita činidla v počátečním stavu tkáně ( (Ripcišr.eír.s) / výhodně 80 % Ri_počáteSní nebo nižší, výhodněji 50 % nebo nižší, ještě výhodněji 20 % nebo nižší a nejvýhodněji • · · · · *·«··· «· · · · · · · · 0 · • · · 0 0 »» · 0 0 0 ·· % Ripcčátečni nebo nižší. Je také žádoucí, aby relaxivita kontrastního činidla, po té, co je intervenční terapie ukončena a cílová tkáň se navrátila do fyziologického stavu, se udržela na relaxivitě činidla měřené bezprostředně po té, co je intervenční terapie ukončena.

Jak bylo již uvedeno výše, specifická struktura SDTBM bude záviset na specifické tkáni nebo složce tkáně, na kterou se má vázat. Tudíž je nezbytné nejdříve stanovit, kterou tkáň nebo její složku je třeba zaměřit.

Lze uvažovat o celé řadě vazebných míst. K takovým vazebným místům patří nukleové kyseliny, glykosaminoglykany (dříve známé jako kyselé mukopolysacharidy), kalcifikovaná tkáň, kost, tuk, synoviální tekutina, buněčné membrány, proteiny, lipoproteiny, enzymy, proteoglykany, amyloidy a ceroidy. Výhodná vazebná místa poskytují proteiny, přičemž nejvýhodnější jsou proteiny séra a strukturní/pojivové proteiny.

Když je cílem protein, pak k vhodným proteinům patří lidský sérový albumin (HSA, 0,7 mM v plazmě, nižší koncentrace v intersticiálním prostoru), protein vázající mastné kyseliny (FABP, známý též jako Z-protein nebo protein A, zhruba 0,1 mM v primárních buňkách jater, ledvinách, srdci a jiných tkáních), glutathion-S-transferáza (GST, známá též jako ligandin, zhruba 0, 1 mM v primárních buňkách jater, ledvinách, srdci a jiných tkáních), alfa-1kyselý glykoprotein (AAG, m.h. 41000, 0,55 až 1,4 g/1) a také lipoproteiny (např. takové, které se koncentrují v aterosklerotických plátech). K dalším příkladům patří strukturální proteiny mezibuněčné hmoty (kolageny, laminin, elastin, fibronektin, entaktin, vitronektin), amyloid (včetně beta-2-amyloidového proteinu (A4) při Alzheimerově nemoci), • · *

9 9 9 ceroid (nebo lipofuscin) a glykopropteiny (např. osteonektin, tenascin a trombospondin).

Výhodným proteinovým cílem je pro pozitivně nabitá kontrastní činidla nebo kontrastní činidla obsahující basické SDTBM je alfa-l-kyselý glykoprotein (AAG). Plazmatické hladiny tohoto pozitivního proteinu akutní fáze se významně liší v závislosti na stavu nemoci. Např. koncentrace AAG se zvyšuje dvakrát až čtyřikrát v důsledku zánětlivého podnětu a plazmatická hladina AAG byla navržena jako prognostická pomůcka pro gliom, metastázy karcinomu prsu i jiných, neonatální infekce a chronické bolesti. Zvýšené hladiny byly pozorovány při ateroskleróze, Crohnově nemoci, infarktu myokardu, nefritidě a bakteriálních, virových nebo postoperačních infekcích. Vysoce rozpustná AAG má jediný polypeptidový řetězec velikosti 183 aminokyselin a charakterizuje ho několik neobvyklých vlastností, včetně vysokého obsahu sacharidů a sialové kyseliny (45 % a 12 %, v uvedeném pořadí) a nízkého isoelektrického bodu pH 2,7. Alfa-l-glykoprotein se účastní vazby mnoha léčiv, jako je např. propranolol (Ka = 11,3 x 10⁵) , imipramin (Ka =

2,4 x 10) a chlorpromazin (Ka = 35,4 x 10“) . Procento volného lidokainu korelovalo s koncentrací AA.G u pacientů (0,4 až 3 g/1), což znamenalo, že lze dosáhnout selektivní vazby k AAG ve srovnání s jinými proteiny v plazmě (např. HSA) při užití metod racionálního návrhu léčiv.

Ligandy pro HSA, FABP a GST jsou výhodnější SDTBM, neboť jsou to negativně nabité molekuly nebo mají tendenci být neutrální s dílčími negativně nabitými skupinami (např. ester, amid nebo karbonylový kyslík ketonu), takové sloučeniny jsou obecně považovány za méně toxické než pozitivně nabité molekuly. Z těchto třech proteinů je v některých případech nejvýhodnější HSA, neboť ligandy pro • · · 9 • 9 ·· · ··

9 9 · · 9 · · ·

9 9 9 9 9 9 9

9 · · 9 9 · 9 9 9 • 9 9 9999 999

9« 999 99 · 9 99

FABP a GST vyžadují určitý intracelulární příjem před navázáním. Obecně se u kontrastních činidel intracelulárnímu příjmu zabraňuje (s výjimkou jater), aby se minimalizovala toxicita. HSA je přítomen v podstatných množstvích v mnoha extracelulárních tekutinách včetně plazmy, intersticiálního prostoru v normální i rakovinné tkáni, synoviální tekutině, cerebrospinálním moku a také v infiltrátu v zánětu nebo abscesu. V mnoha patologických tkáních jako jsou nádory, záněty, aterosklerotické pláty nebo stěny aterosklerotických arterií, prosakují kapiláry, což vede k ještě vyšším hladinám HSA. To může zvýšit užitečnost činidla podle předkládaného vynálezu, neboť velký počet intervenčních terapií se zaměřuje na takové nemocné tkáně.

HSA je výhodný také proto, že je znám dobrou afinitou a vysokou vazebnou kapacitou pro široké spektrum strukturně nepodobných molekul, a to obvykle ve velkém počtu vazebných míst. Tudíž při návrhu kontrastního činidla existuje značná flexibilita.

Pro vazbu k nativnímu stavu HSA je jako SDTBM užitečná celá řada hydrofobních nebo amfifilních látek (U. KraghHansen, Pharm. rev. 33, pp. 17-53, 1981, X.M. He et al. , Nátuře 358, 209-215, '1992, D.C.Carter, Adv. Protein. Chem. 45, 153-203, 1994) . Patří k nim, aniž by tento výčet byl omezující, malé molekuly obsahující alespoň jednu alifatickou skupinu, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, alkykarbonylovou skupinu, alkylkarbonyloxyskupinu, arylovou nebo heterocyklickou skupinu s 1 až 60 atomy uhlíku a případně obsahující jeden nebo několik atomů dusíku, kyslíku, síry, halogenových prvků, alifatických amidů, estersulfonamidů nebo acylových, sulfonátových, fosfátových, hydroxylových skupin nebo organokovových substituentů. Alternativně, ale méně výhodně, SDTBM může být biomolekula jako je peptid obsahující • · · · hydrofobní aminokyselinové zbytky a/nebo substituenty buďto s a nebo bez hydrofobních nebo hydrofilních koncových skupin.

Jak již bylo uvedeno výše, pro vazbu k HSA existuje celá řada hydrofobních sloučenin vhodných jako SDTBM. Obecně vazebná afinita k HSA a případně jiným proteinům roste se zvětšující se hydrofobicitou SDTBM. Teoretická stanovení hydrofobicity substituentů jako je SDTBM lze získat výpočtem příspěvku k log oktanol-voda (nebo oktanol-pufr) rozdělovacího koeficientu (logP) pro samotné TBM užitím Hanschovy 1 konstanty pro substituenty (viz A. Leo a C. Hansch, Partition Coefficiients and Their Uses, Chemical Reviews 71, E525-616, 1971, K.C.Chu, The Quantitative Analysis of Sructure-Activity Relationships, Burger's Medicinal Chemistry, Part 1, s. 393-418, 4th ed., 1980). vazebná afinita poroste se zvyšujícím se příspěvkem k logP. Např. pro substituenty na alifatických skupinách se užijí následující 1 konstanty:

skupina

CH₃ fenylová

1-alifatická 0, 50 2, 15

Pro substituenty na arylových skupinách se užijí následující 1 konstanty:

skupina 1-alifatická

CH₃

CH2CH3 fenylová

0,56 1,02 1, 96 • « » · • · · · • ♦ · · · · 9 · · · · · · ·· 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 ·· ··

Takže příspěvek logP pro p-metylbenzylovou skupinu navázanou na IEM se vypočte následovně (užitím hodnoty 1-alifatická pro CH₃ jako odhad pro skupinu -CH₂-) :

příspěvek logP = 0,50 + 2,15 + 0,56 = 3,2

Při vazbě na HSA je potřebný minimální příspěvek logP v hodnotě 2 (ekvivalent 4 skupin CH₃ nebo jednoho fenylového kruhu), aby bylo dosaženo významné vazby. Výhodnější je příspěvek logP 3 a ještě výhodnější je hodnota logP 4.

Vazba na HSA může být ' vyhodnocena pomocí rovnovážné dialýzy nebo ultrafiltrace použitím 4,5 % HSA (hmot./objem) v pufru s pH 7,4. Výhodně alespoň 10 %, výhodněji alespoň 50 %, ještě výhodněji alespoň 80 % a nej výhodněji alespoň % kontrastního činidla se váže na nativní stav HSA ve fyziologicky relevantních koncentracích (0,01 až 10 mM v plazmě pro MRI a optické zobrazování). Při tomto způsobu měření procenta navázaného kontrastního činidla na HSA je s chybou +/- 5%. Vazba proteinu na jiné proteinu nebo v séru se může hodnotit podobným způsobem.

Připojení lipofilních skupin ke kontrastnímu činidlu pravděpodobně sníží rozpustnost činidla. Aby se udržela účinná rozpustnost kontrastního činidla v klinicky účinné dávce nebo vyšší, je výhodně vnést do SDTBM jednu nebo několik skupin vázajících vodík (kyslík, dusíky apod.).

Čistě alifatické skupiny se mohou užít jako SDTBM, ale nejsou tak výhodné jako smíšené alifaticko-arylové skupiny nebo čistě arylové skupiny. Zvláště když je připojen negativní náboj k čistě alifatickým skupinám, zejména ke dlouhým a flexibilním, kontrastní činidlo pak může interferovat s metabolismem endogenních molekul jako jsou mastné kyseliny nebo s interakcemi mezi membránovými proteiny ····

• · · • fe a lipidy. To může zvyšovat toxicitu činidla. Je tedy výhodné, když SDTBM obsahuje alespoň jeden arylový kruh.

V případě činidla pro MRI vázajícího se na nativní stav HSA pro zvýraznění nádoru nebo tkáně, je zvláště výhodné pro kontrastní činidlo, aby obsahovalo dvě nebo více odlišných lipofilních skupin k úplné imobilizací činidla po navázání na protein. Tyto skupiny mohou být na jednom SDTBM, nebo jako dvě nebo i víc oddělených chemických skupin navázaných na kontrastní činidlo. Vzhledem k jejich rozměrnosti a rigiditě, je výhodné, když dvě nebo více skupin každá obsahuje aromatický kruh, se dvěma nebo více kruhy v celé molekule uspořádanými v rigidní, prostorové (nikoliv rovinné) orientaci.

Magnetická účinnost nebo relaxivita činidla pro MRI je obecně vyšší, když má činidlo rotační korelační čas přibližně shodný s HSA (R.B.Laufer, Chemical Reviews, 87, 901-927, 1987). Zatímco malá molekula jako je např. Gd-DTPA má rotační korelační čas 0,1 nanosekund (ns), HSA má rotační korelační čas delší než 5 až 10 ns, jestliže má takový dlouhý korelační čas chelát, magnetické fluktuace mezi paramagnetickým iontem a protonem vody se objevují ve stejném časovém měřítku jako je Larmorova frekvence a vytvářejí nejúčinnější longitudinální (TJ relaxaci, jaká je možná a tudíž nejvyšší možnou relaxivitu. Jakákoliv flexibilta chelátu, když je navázán na protein, dle očekávání snižuje účinnou dobu rotační korelace a tudíž snižuje relaxivitu. Jelikož jedna strana spojení s proteinem stále může poskytovat flexibilitu v několika směrech, jsou výhodná další místa pro navázání.

Jak již bylo výše uvedeno, vazba závislá na stavu musí také vést ke změnám charakteristik signálu kontrastního činidla. Při MRI se tato změna signálu závislá na stavu projevuje změnou indukované rychlosti (l/Τι nebo 1/TJ protonů vody nebo relaxivit Ri a R₂. Takže pokud je cílem HSA, stupeň, v jakém bylo činidlo vyladěno na maximálně relaxivitu může být vyhodnocen měřením na stavu závislé vázané relaxivity (Ri-vázaná) v přítomnosti HSA v jeho dvou fyziologických stavech: nativním a denaturovaném. Podle výhodného aspektu předkládaného vynálezu je žádoucí, aby relaxivita činidla ve druhém stavu tkáně (Ridruhý) byla 80 % nebo méně z relaxivity (Ripočáteční) činidla v počátečním stavu tkáně. Výhodně je Ridruhý 50 % nebo méně z Ri_počáteční, výhodněji 2 0 % nebo méně a nejvýhodněji 10 % nebo méně.

To vyžaduje měření relaxivity volného chelátu (Ri-v~ir,ý) a také relaxivity (Rezonovaná) a procenta vazby činidla ve 4,5% HSA v obou jeho fyziologických stavech. Ve výhodném aspektu předkládaného vynálezu Ri-_vciný odpovídá hodnotě Ri-pczcr-.vaný ^v denaturovaném stavu. Ri-p_C=cv~var.ý je průměr Ri-_v-;.r,ý a Ri-vázaný vážený molárním zlomkem:

Rl-pozorovaný ⁼ ( Zlomek-volný) * R-l-volný) t ( zlomek-vázaný * Rl-vázaný) , čili

Rl-vázaný ⁼ (Rl-pozorovaný ^— ('Zlomek-vclný * Rl-volný) ) / Zlomek-_Volný

Vazba na HSA závislá na stavu

Jak již bylo uvedeno výše, výhodným cílovým proteinem, který může být využit pro kontrastní činidla podle předkládaného vynálezu, je HSA. Pro takové aplikace je žádoucí, aby kontrastní činidlo vykazovalo zvýšený poločas v krvi, aby se zvýšila doba, po kterou činidlo zůstává v krvi (tj. navázáno na HSA) a je dostupné v průběhu intervenční terapie. Prodlouženého poločasu v krvi lze dosáhnout vložením spojovací skupiny (L) , která účinkuje jako skupina

0000 • · ··· 0 0 0 ·· • 0 0 0 · 0 0 · 0 ·

0 000 0000 • 0 0 0 0 000 00 0

0 0000 0000

000 00 00 00 00 prodlužující poločas v krvi (BHEM), která snižuje rychlost příjmu kontrastního činidla hepatocyty (viz patentová přihláška US 08/382 317, podaná 1. února 1995, na kterou se odkazuje). Skupiny BHEM jsou mimořádně hydrofilní skupiny,které vytvářejí vodíkové vazby s vodou. Přítomnost hydrofilních BHEM na, kontrastním činidle snižuje příjem tohoto činidla hepatocyty.

K příkladům chemických skupin, které mohou sloužit jako BHEM, patří atomy uhlíku, fosforu, wolframu, molybdenu nebo síry mající navázané nabité nebo neutrální heteroatomy jako kyslík, dusík, síru nebo halogenové prvky (zejména fluor), které mají dva nebo více volných elektronových párů (tj. plný nebo částečný negativní náboj) nebo elektropozitivní atomy vodíku (tj . protonovaný amin) pro vodíkové můstky s vodou.

Patří sem skupiny jako je skupina sulfonová, éterová, močovinová, thiomočovinvá, aminsulfonamidová, karbamátová, peptidová, esterová, karbonátová a acetálové skupiny.

K výhodným skupinám patří takové, které mají jeden nebo několik částečných nebo úplných negativních nábojů ve vodném roztoku při fyziologickém pH, když negativně nabité atomy nemohou být částečně nebo plně neutralizovány kovalentní nebo koordinačně kovalentní vazbou na IEM. K příkladům takových výhodných skupin BHEM patří negativně nabité skupiny jako fosfátmonoesterová, fosfátdiesterová, karboxylátová a sulfonátová skupina. Výhodnější jsou takové skupiny, které mají fosfátové skupiny nebo jakékoliv jejich esterové formy. Ještě výhodnější jsou fosfátdiesterové skupiny, neboť a) jsou vysoce hydrofilní s kyslíky se čtyřmi vodíkovými můstky, b) relativně snadno se syntetizují pomocí v oboru známých technik, c) slouží jako vynikající spojovací skupiny mezi IEM a SDTBM a d) jelikož fosfátové sloučeniny existují a jsou ·0«0 ··<· • ·« 00 e 0000 • · » · · · · · · • 0 · · · · 0 · 0« 0

0 0000 0000

000 0· 00 00 00 přirozeně metabolizovány v organismu, lze očekávat, že kontrastní činidlo obsahující fosfátdiestery nebude toxické.

Vložení BHEM do kontrastního činidla podle předkládaného vynálezu vede k prodloužení retence činidla v krvi. Retence v krvi se výhodně určuje tak, že se na základě farmakokinetického experimentu s plazmou potkana vypočte plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plazmě na čase (plocha pod křivkou, AUC-konc.) pro specifické časové období (např. 0 až 10 minut, 0 až 30 minut, 0 až 60 minut, 0 až 120 minut, 0 až nekonečno) . Retence v krvi (měřena jako AUCkonc.) muže být vyhodnocena experimentálně podáváním kontrastního činidla potkanům, králíkům nebo vyšším savcům. Bylo pozorováno, že poločas v krvi je větší u králíků a vyšších savců než u potkanů. V této přihlášce jsou uvedena data z experimentů měření poločasu v krvi jako AUC-konc. u potkanů. Chyba těchto dat je přibližně +/-10 %.

Důvod, proč není užito přímo samotné měření poločasu je ten, že matematická definice této kvantity je často nejasná a výsledná stanovení jsou často různá v závislosti na použitém farmakokinetickém modelu a časových intervalech, ve kterých byly získány vzorky krve.

Například průměrná plazmatická koncentrace pozorovaná po injekci dávky 0,1 mmol/kg Gd-DTPA značeného pomocí Gd¹⁵³ do ocasní žíly u dvou potkanů je ukázána na obrázku uvedeném níže. Pomocí programového vybavení KaleidaGraph pro počítače Macintosh byl vypočtena hodnota AUC-konc. pro 0 až 10 minut na 3,5 mM min.

···« ·· ···· ···· ·· ··

9 0 »6«· • · 6 · · · Λ • · · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 >Φ e

N rt Γ—i ft

Φ o

rt

-P

C

Φ

U c

£

Gd-DTPA; 0.1 mmol/kg; n=2

AUC-conc, 0-10 min. = 3.5 mM min.

Čas (minuty)

Kontrastní činidlo podle předkládaného vynálezu, užitečné v cílení na sérové proteiny jako je např., HSA, vykazuje zvýšení hodnoty AUC-konc. nejméně o 20 % když se přidá BHEM k IEM a SDTBM. Výhodně vykazují zvýšení hodnoty AUC-konc. nejméně o 40 %, výhodněji o 70 % a nej výhodně ji o 100 %. Obecně je zvýšení AUC-konc. způsobené BHEM vyšší, když je významná vazba na plazmu, např. 20 až 50% nebo vyšší. Vypočtené procentuální zvýšení AUC-konc. může být různé pro stanovení AUC-konc. pro různě dlouhá období. Obecně je procentuální zvýšení hodnoty AUC-konc. způsobené BHEM vyšší pro měření AUC-konc. po delší dobu, např. 0 až 30 minut, než pro měření po 0 až 10 minut.

Jelikož struktura a fyzikální vlastnosti celé molekuly kontrastního činidla rozhodují o její vazbě v plazmě, je důležité vybrat takové skupiny IEM a BHEM, které jsou kompatibilní s požadovanou vazbou. Tak např. aby se dosáhlo vazby na pozitivně nabitá vazebná místa na HSA, je výhodné vybrat IEM a BHEM s čistým neutrálním nebo čistým negativním • · nábojem, aby se snížila možnost, že dojde k repulzi nebo dokonce zvýšení vazebné afinity. Pro vazbu k alfa kyselému glykoproteinu, alespoň nějaká část kontrastního činidla by měla být pozitivně nabita. Pro vazbu na globuliny alespoň nějaká část kontrastního činidla by měla být steroidní povahy. Pro navázání na lipoproteiny alespoň nějaká část kontrastního činidla by měla být lipofilní nebo podobná mastným kyselinám.

Lze si představit, že BHEM mohou být uspořádány v mnoha různých pozicích vzhledem k IEM a SDTBM. Avšak pozice skupin by neměla být taková, aby jedna skupina rušila zamýšlenou funkci druhé. Tak např. v kontrastním činidle vázajícím se na HSA umístění skupiny BHEM nesmí blokovat schopnost SDTBM vázat činidlo na HSA. Jelikož hlavní vazebná místa v HSA jsou „ponožkovítého tvaru (X.M.He et al., Nátuře 358, 209-215, 1992, D.C.Carter, Adv. protein Chem. 45, 153-203, 1994, s hydrofobním vnitřkem (zvláště v blízkosti oblasti „prstů) a pozitivně nabitou oblastí „kotníku, vazebná afinita SDTBM by se snížila, jestliže by distální část SDTBM byla extrémně hydrofilní. Jako ilustrativní příklad lze uvést, jestliže SDTBM je fenylový kruh, nejvýhodnější pozicí BHEM na kruhu je ortho a pak hned meta, zatímco hydrofilní skupina v poloze para by redukovala vazebnou afinitu SDTBM k HSA.

Pro IEM, které jsou cheláty kovů, je výhodné, když skupiny BHEM a SDTBM nejsou připojeny k IEM, aby neredukovaly sílu vazby mezi kovovým iontem a chelatujícím ligandem. Např. když je chelatující skupinou acetátová skupina, výhodné je, když ani BHEM ani SDTBM nejsou navázány na acetátový kyslík.

Dalším požadavkem týkajícím se pozice je, aby negativně nabité atomy BHEM nemohly být ani částečně ani plně neutralizovány kovalentní nebo koordinačně kovalentní vazbou na IEM, a to zajišťuje, že ve vodném systému i velmi • · • · · · hydrofilní atomy BHEM jsou silně solvatovány. Např. když je IEM chelát kovu, je důležité umístit negativně nabité atomy BHEM tak, aby nemohly být neutralizovány pozitivně nabitým iontem kovu (Mⁿ⁺) z IEM koordinačně kovalentní vazbou prostřednictvím vytvoření chelátových kruhů s 5 nebo 6 členy, což jsou nejstabilnější velikosti těchto kruhů. Jelikož pětičlenné nebo šestičlenné chelátové kruhy jsou nejstabilnější formy pro kovové ionty zajímavé pro IEM (jako je např. gadolinium) je nejdůležitější zabránit jejich vytvoření. Takže, jak je ukázáno na následujících obrázcích, fosfinátová (-PO?-) nebo fosfonátová (-PO₃-) BHEM nemůže být navázána na atom dusíku v aminokarboxylátovém chelatujícím činidle prostřednictvím spojky -CH — , neboť by to vedlo k vytvoření velmi stabilního 5členného chelátového kruhu. Podobně fosfodiesterová (-OPO3-) BHEM nemůže být navázána k atomu dusíku v aminokarboxylátovém chelatujícím činidle prostřednictvím spojky -CH₂-, neboť by to vedlo k vytvoření velmi stabilního 6členného chelátového kruhu. Avšak obě tyto BHEM mohou být navázány na jiné polohy, jako je např. etylénová kostra ligandu. V některých případech, jak je ukázáno, je výhodné zvětšit délku spojovací skupiny, aby bylo jisté, že se nemůže vytvořit 5členný ani 6členný kruh.

Fosfinátové BHEM

Velmi nevýhodný (5členný chelátový kruh, náboj neutralizován)

\ Λ+ M

Lze uvažovat, že mohou být umístěny v následující struktury:

Nevýhodný (6členný chelátový kruh, náboj neutralizován)

Výhodněj ší (eliminována možnost 5členného nebo 6členného chelátového kruhu či neutralizace náboje) skupiny podle předkládaného vynálezu kontrastní činidle tak, že vzniknou

1) IEM - [ (L)m - { (BHEM) _s - (SDTBM)_o }_p ]_q

2) IEM - [ (SDTBM)~ (BHEM)s ]_r

3) IEM - (SDTBM)o

I (L)_m - (BHEM) s kde m je rovno 0 až 4, s, o a p mohou být shodné či různé a rovné 1 až 4, a • · · · r a q jsou rovné nejméně 1.

Když jsou skupiny podle vynálezu umístěny v kontrastním činidle jako je tomu ve struktuře 1) výše uvedené, BHEM je výhodně sulfonová, močovinová, thiomočovinová, aminová, sulfonamidová, karbamátová, peptidová, esterová, karbonátová, acetálová skupina a ještě výhodněji

Y¹

II

Y³-Z-Y⁴

I

Y~-Rj nebo esterové formy, kde

Z =P, W, Mo nebo S,

Y^:, Y^; = 0 nebo S,

Y^:, Y⁴ = 0 nebo S nebo nejsou přítomny a

R₂ = H, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna.

Nejvýhodněji BHEM je fosfátová skupina.

Jestliže skupiny podle vynálezu jsou umístěny v kontrastním činidle podle struktury 2) výše uvedené, BHEM je výhodně sulfonová, močovinová, thiomočovinová, aminová, sulfonamidová, karbamátová, peptidová, esterová, karbonátová, acetálová skupina a ještě výhodněji má BHEM následujíc vzorec

Y¹

Y³-Z-Y⁴ y²-r₂ nebo esterové formy, kde • · · · «· · · · · ·· ·· «·· · · · · · · · . . »·· ···· • ··» · · · i · · · ·· · ♦»·· ···· •« «· · ·· · · ·· ·*

Z = P, W, nebo Mo

Y^J, Y“ = 0 nebo S,

Y’, Y⁴ = 0 nebo S nebo nejsou přítomny a

R; = H, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna.

Nejvýhodněji BHEM je fosfátová skupina.

Jestliže skupiny podle vynálezu jsou umístěny v kontrastním činidle podle struktury 3) výše uvedené, BHEM je výhodně SO^3- nebo esterové formy, sulfonová, močovinaová, thiomočovinová, aminová, sulfonamidová, karbamátová, peptidová, esterová, karbonátová, acetálová skupina a ještě výhodněj i

Y¹

II

Y³-Z-Y⁴

I

Y²-R₂ nebo esterové formy, kde

Z =P, W, Mo nebo S

Y¹, Y² = 0 nebo S,

Y³, Y⁴ = 0 nebo S nebo nejsou přítomny a

R₂ = H, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna.

Nejvýhodněji BHEM je fosfátová skupina.

Lze uvažovat, že jestliže skupiny podle vynálezu jsou umístěny v kontrastním činidle jako ve struktuře 3) výše uvedené, výhodná kontrastní činidla mají následující vzorce:

• » • · · ι » φ φ « k » φ « • · « ♦ * · · • 6 φ ·

ΦΦΦ*

nebo

kde Ri, R₂, R₃, R4, R5, Rg, R7, Rg, Rg, Rio, R11 a Ri6 mohou být shodné nebo různé a jsou vybrány ze skupiny obsahující H, SDTBM, BHEM a alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, za předpokladu že alespoň jedna z těchto R skupin je SDTBM a alespoň jedna další skupina je BHEM,

R12, R13 a Ri₄ mohou být shodné nebo různé a jsou vybrány ze skupiny obsahující 0' nebo N(H)Rn,

Ris = H, CH₂CH (OH) CH₃, hydroxyalkylová skupina nebo

CH (Rir.) COR₁₂ a

Rn = H nebo alkylová skupin s 1 až 6 atomy uhlíku.

Pro kontrastní činidla obsahující vzorce uvedené výše je BHEM výhodně sulfonová, éterová, močovinová, thiomočovinová, aminová, amidová, sulfonamidová, karbamátová, peptidová, esterová, karbonátová, acetálová skupina a ještě výhodněji C00‘ nebo esterové formy, SO³“ nebo esterové formy a • « · · ♦ * * · * · · · · · . β · « ·* ·· ·♦ ♦· · ·

Υ¹

γ.3__ζ_γ4

Y²-R₂ nebo esterové formy, kde

Z =P, W, Mo nebo S

Y¹, Y² = O nebo S,

Y³, Y⁴ = 0 nebo S nebo nejsou přítomny a

R₂ = H, alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nebo není přítomna.

V případě kontrastního činidla vázajícího se na HSA může být BHEM umístěna mezi IEM a SDTBM jak je ukázáno ve struktuře 1) nebo na IEM vzdálené od SDTBM jak je ukázáno ve struktuře 3) . Tímto způsobem se může projevit plný vazebný potenciál hydrofobních skupin SDTBM bez rušení vlivem hydrofilních skupin BHEM.

Kontrastní činidla užitečná podle předkládaného vynálezu, která projevují na stavu závislou vazbu na HSA, byla uvedena v patentové přihlášce U.S. 08/382 317, podané

1. února 1995. Příklady užitečných činidel jsou uvedeny dále:

O;

» * « · · * • « ·

• « · ·

kde n je rovno 1 až 4

kde R obsahuje alifatickou skupinu a/nebo alespoň arylový kruh, nebo obsahuje peptid obsahující hydrofobní aminokyselinové zbytky a/nebo substituenty buďto s nebo bez přítomnosti hydrofobních nebo hydrofilních koncových skupin. Výhodná kontrastní činidla podle předkládaného vynálezu jsou následuj ící:

KS-322

MS-323

Výhodnější kontrastní činidla s vazbou závislou na stavu HSA jsou MS-317, MS-322, MS-325 a MS-328. Nejvýhodnější je MS-325.

• · · » -r W φ · * · · » * • « * ♦ « · · · « · · * * · · * « 0 · * · * *

Použití kontrastních činidel

Činidla použitá v tomto vynálezu jsou definována tak, aby zahrnovala také své farmaceuticky přijatelné deriváty. Farmaceuticky přijatelný derivát znamená každou farmaceuticky přijatelnou sůl, ester, sůl esteru, nebo jiný derivát sloučeniny tohoto vynálezu, který je při podávání příjemci schopný poskytnout (přímo nebo nepřímo) sloučeninu tohoto vynálezu nebo její inhibičně aktivní metabolit nebo zbytek. Konkrétně výhodné jsou ty, které zvyšují biologickou dostupnost sloučenin tohoto vynálezu, když jsou tyto sloučeniny podávány savci (např. tak, že umožní, že perorálně podávaná sloučenina je snadněji absorbována do krve) nebo které zesilují podávání základní sloučeniny do biologického kompartmentu (např. mozku nebo lymfatického systému).

Je také zamýšleno, že činidla použitá v tomto vynálezu zahrnují farmaceuticky přijatelnou sůl. Farmaceuticky přijatelné soli tohoto vynálezu zahrnují soli pocházející z anorganických nebo organických kyselin a zásad. K takovým kyselým solím patří následující: acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzensulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kafrát, kafrsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, etanšulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetansulfonát, laktát, maleát, metansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenyl-propionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, thiocyanát, tosylát a undekanoát. Bazické soli zahrnují soli amonné, soli alkalických kovů, jako jsou soli sodné a draselné, soli kovů alkalických zemin, jako jsou soli vápenaté, hořečnaté a zinečnaté, soli s organickými bázemi, jako jsou soli dicyklohexylaminové, soli N-metyl-G-glukaminu a soli * · 9 · • 9 9 · · · · · 9 9 · · * « 9 *99 · 9 9 99 · 9999 9999

9· 999 <♦ ·· * * ·* s aminokyselinami, jako jsou arginin, lysin atd. Také bazické skupiny obsahující dusík mohou být kvarternizovány takovými činidly, jako jsou halogenidy nižších alkylových skupin, jako jsou metyl-, etyl-, propyl- a butylchlorid, -bromidy a -jodidy, dialkylsulfáty, jako jsou dimetyl-, dietyl-, dibutyl- a diamylsulfáty, halogenidy s dlouhým řetězcem, jako jsou decyl-, lauryl-, myristyl- a stearylchloridy, -bromidy a -jodidy, aralkylové halogenidy, jako jsou benzyl- a fenetylbromidy a další. Získají se tak produkty rozpustné ve vodě nebo v oleji nebo produkty, které lze dispergovat. Výhodné soli tohoto vynálezu jsou soli N-metyl-D-glukaminu, vápenaté a sodné soli.

Farmaceutické přípravky tohoto vynálezu zahrnují kterýkoliv z komplexů předkládaného vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, spolu s jakýmkoliv farmaceuticky přijatelným nosičem, adjuvans nebo vehikulem. Farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a vehikula, která mohou být použita ve farmaceutických přípravcích tohoto vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na, iontoměriiče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitin, sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin, pufrovací látky, jako jsou fosfáty, glycin, kyselina ·sorbová, sorbát draselný, TRIS (tris(hydroxymetyl)amino-metan), částečné glyceridové směsi saturovaných mastných kyselin rostlinného původu, voda, soli nebo elektrolyty, jako je protaminsulfát, hydrogenfosfát sodný, hydrogenfosfát draselný, chlorid sodný, zinkové soli, koloidní silikát, trisilikát hořečnatý, polyvinylpyrolidon, látky založené na celulóze, polyetylenglykol, karboxymetylcelulóza sodná, polyakryláty, vosky, blokové polymery polyetylen-polyoxypropylenu, polyetylenglykol a tuk z ovčí vlny.

fe k « • ·

Podle tohoto vynálezu mohou být farmaceutické přípravky ve formě sterilního přípravku pro injekce, například sterilní vodná nebo olejnatá suspenze pro injekce. Tato suspenze může být formulována podle technik v oboru známých s použitím vhodných dispergujících nebo smáčecích činidel a suspendujících činidel. Sterilní přípravek pro injekce může být také sterilní injikovatelný roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, například jako je roztok v 1,3-butendiolu. Přijatelná vehikula a rozpouštědla, která mohou být použita, jsou voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Navíc jsou obvykle jako rozpouštědlo nebo suspendující činidlo použity sterilní stálé oleje. Pro tento účel může být použit jakýkoliv směsný stálý olej, včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová a její glyceridové deriváty, jsou použitelné v přípravě přípravků pro injekce, jako jsou přirozené farmaceuticky přijatelné oleje, jako je olivový olej, nebo ricínový olej, zejména ve svých polyoxyetylovaných variantách. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat jako ředidlo nebo jako dispergující činidlo alkohol s dlouhým řetězcem, jako je Ph. Helv. nebo podobný alkohol.

Protože kontrastní činidla tohoto vynálezu se mohou vázat na plazmatické proteiny, v některých případech v závislosti na dávce a rychlosti injekce, mohou se vazebná místa na plazmatických proteinech saturovat. To vede ke snížené vazbě činidla a může být snížen poločas nebo tolerance. Tak může být žádoucí injikovat činidlo předem vázané na sterilní albumin nebo náhradní roztok plazmy. Nebo může být použit přístroj/stříkačka, který obsahuje kontrastní činidlo a smísí jej s krví odebranou do stříkačky, která je pak podána injekcí zpět pacientovi.

·« ···* ·♦ 9 9

9 9 9 9 9 9

Sloučeniny a farmaceutické přípravky předkládaného vynálezu mohou být podávány perorálně, parenterálně, inhalačním sprejem, topicky, rektálně, nazálně, bukálně, vaginálně nebo prostřednictvím lékové formy v implantovaném zásobníku obsahujícím obvyklé netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans, a vehikula. Termín „parenterální, jak se zde používá, zahrnuje subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intraartikulární, intrasynoviální, intrasternální, intrathekální, intrahepatální, intrakraniální injekce a injekce do rány, nebo infúzní techniky.

Když se podávají perorálně, mohou být farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu podávány formulovány v jakékoliv perorálně přijatelné dávkové formě včetně, ale bez omezení, tobolek, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro perorální použití jsou obecně používány nosiče, které zahrnují laktózu a kukuřičný škrob. Typicky jsou také přidávány lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. Pro perorální podávání ve formě tobolky použitelná ředidla zahrnují laktózu a kukuřičný škrob. Když jsou pro perorální užívání žádoucí vodné suspenze, aktivní složka je spojena s emulgujícími a suspendujícími činidly. Je-li žádoucí, mohou být také přidána určitá sladidla, příchutě nebo barviva.

Alternativně, při podávání ve formě čípků pro rektální podávání,' mohou být farmaceutické přípravky tohoto vynálezu připraveny smísením činidla s vhodným nedráždivým excipientem, který je při teplotě místnosti v pevném stavu, ale v rektální teplotě je kapalný, a tudíž v rektu bude tát za uvolnění léčiva. Takové látky zahrnují kakaové máslo, včelí vosk a polyetylenglykoly.

> * · · · ·

Jak bylo již uvedeno výše, farmaceutické přípravky tohoto vynálezu mohou být také podávány lokálně, zejména když cíl ošetření zahrnuje oblasti nebo orgány snadno dostupné lokální aplikací včetně oka, kůže nebo dolní části zažívacího traktu. Pro každou z těchto oblastí nebo orgánů je snadné připravit vhodné lokální přípravky.

Lokální aplikace pro dolní část zažívacího traktu mohou být uskutečněny v přípravku ve formě rektálního čípku (viz výše) nebo v přípravku v podobě vhodného klystýru. Mohou být také použity lokální-transdermální náplasti.

Pro lokální aplikace mohou být farmaceutické přípravky formulovány ve vhodné masti obsahující aktivní složku suspendovanou nebo rozpuštěnou v jednom nebo více nosičích. Nosiče pro lokální podávání sloučenin tohoto vynálezu zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, minerální olej, tekuté petrolátum, bílé petrolátum, propylenglykol, polyoxyetylen, polyoxypropylenové sloučeniny, emulgující vosk a vodu. Alternativně farmaceutické přípravky mohou být formulovány ve vhodném locionu nebo krému obsahujícím aktivní složky suspendované nebo rozpuštěné v jednom nebo více farmaceuticky přijatelných nosičích. Vhodné nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, minerální- olej, sorbitanmonostearát, polysorbát 60, vosk cetylesterů, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a vodu.

Pro oftalmické použití mohou být farmaceutické přípravky formulovány jako mikronizované suspenze v izotonickém sterilním fyziologickém roztoku s upraveným pH, nebo výhodně jako roztoky v izotonickém sterilním fyziologickém roztoku s upraveným pH, buď s konzervačním činidlem nebo bez něj, jako je benzylalkoniumchlorid. Alternativně pro oftalmické použití mohou být farmaceutické přípravky formulovány v masti jako je petrolátum.

• 0 • 0

0

Pro podávání nosním aerosolem nebo inhalací jsou farmaceutické přípravky tohoto vynálezu připraveny podle technik známých v oboru farmaceutických přípravků a mohou být připraveny jako roztoky ve fyziologickém roztoku, s použitím benzylalkoholu nebo jiných vhodných konzervačních činidel, absorpčních promotorů pro zvýšení biologické dostupnosti, fluorovaných uhlovodíků, a/nebo dalších. obvyklých solubilizačních nebo dispergujících činidel.

Dávkování závisí na citlivosti diagnostické zobrazovací přístrojové techniky, a také na přípravku kontrastního činidla. Například pro zobrazování MRI, kontrastní činidlo obsahující vysoce paramagnetickou látku, např. gadolinium (III), obecně vyžaduje nižší dávkování, než kontrastní činidlo obsahující paramagnetickou látku s menším magnetickým momentem, např. železo (III). Výhodně je dávkování v rozmezí přibližně 0,001 až 1 mmol/kg tělesné hmotnosti denně aktivního komplexu kov-ligand. Výhodněji dávkování je v rozmezí přibližně 0,005 až 0,05 mmol/kg tělesné hmotnosti denně.

V případě, že je použito optické zobrazení pro monitorování intervenční terapie, jsou dávky činidla přibližně stejné jako dávky pro MRI (0,001-10 mmol/kg). Také jako u kontrastních činidel pro MRI, je podávání optických činidel v oboru dobře známo.

Ale je třeba rozumět, že specifický režim dávkování pro každého jednotlivého pacienta také závisí na celé řadě faktorů, včetně věku, tělesné hmotnosti, celkovém zdraví, pohlaví, dietě, čase podání, rychlosti vylučování, kombinaci léků a úsudku ošetřujícího lékaře.

Po podání příslušné dávky kontrastního činidla je pak pacient podroben vyšetření buď MRI nebo optickým zobrazovacím systémem (zobrazení ultrafialovým, viditelným nebo • · · 9

9

9 ► · · · •

k 9 • 9 infračerveným světlem). Příslušná nastavení a zobrazovací parametry pro provádění těchto zobrazovacích technik, a také sběr dat a analýza (tj. monitorování signálních charakteristik činidla) jsou dobře známy nebo zahrnují obecně přijaté principy.

Konečný krok způsobu podle tohoto vynálezu je monitorování zobrazovacích signálních charakteristik podávaného kontrastního činidla. Pro optické zobrazování tyto signální charakteristiky zahrnují absorbanci, obrazivost, fluorescenci nebo fosforescenci a/nebo jejich poločas, chemiluminiscenci, rozptyl nebo další spektrální vlastnosti. Pro zobrazování MRI tyto signální charakteristiky zahrnují relaxivity Ri a R₂ (l/Τι a 1/T₂, v příslušném pořadí) .

Ve výhodnějším aspektu tohoto vynálezu je možné monitorování v „reálném čase, kdy vzniká obraz a tudíž signální charakteristika je monitorovaná periodicky po celý průběh intervenční terapie. Četnost, se kterou obrazy vznikají a jsou monitorovány, závisí na typu a trvání terapie.

Aby byl tento vynález lépe vysvětlen, jsou uvedeny následující příklady, které slouží pouze pro účely ilustrace a nemají být považovány žádným způsobem za omezující rozsah vynálezu

Příklady provedení vynálezu

Následuje schéma syntézy výhodných kontrastních činidel použitelným ve způsobu podle vynálezu, a zejména MS-325. Viz patentovou přihlášku U.S. 08/833 745, podanou 11. dubna, 1997, a zahrnutou zde do odkazů. Další použitelné, i když ne tak výhodné, schéma syntézy pro tato kontrastní činidla je

9999

I 9 9 4 > · · « » ♦ · 1

I · · <

·· ·♦ popsáno v patentové přihlášce U.S. 08/382 317, podané

1. února, 1995, a zahrnuté zde do odkazů.

Nejdříve alkohol ROH reaguje s PCL₃, výhodně v molárním poměru 1:1, za vzniku reakčního produktu dichlorfosfinu (I):

PCL₃, rozpouštědlo ROH -► ROPC1' ;n

Skupina R alifatická peptoidová, může být lineární, rozvětvené nebo cyklická skupina, arylová, heterocyklická, peptidová, deoxyribo- nebo ribonukleotidová nebo nukleosidová, nebo cyklická či acyklická skupina organického chelatačního činidla, která může být volitelně substituována jedním nebo více atomy dusíku, kyslíku, síry, halogenového prvku, nebo alifatickou skupinou, amidovou, esterovou, sulfonamidovou, arylovou, acylovou, sulfonátovou, fosfátovou, hydroxylovou skupinou nebo organokovovými substituenty.

Tato reakce probíhá v přítomnosti éterického nebo uhlovodíkového rozpouštědla a provádí se při teplotě od přibližně -50 °C do přibližně 15 °C, výhodně od přibližně 10 °C do přibližně -5 °C, po dobu od přibližně 30 minut do přibližně 3 hodin, výhodně od 1 do 1,5 hodiny. Rozpouštědlo může být jakékoliv éterické nebo uhlovodíkové rozpouštědlo a výhodně může být vybráno ze skupiny skládající se z heptanů, metal-t-butyl éterů, dioxanů, tetrahydrofuranů, dietyléterů a etylenglykoldialkyléterů. Výhodněji je rozpouštědlo tetrahydrofuran.

Dichlorfosfin (I) pak reaguje s přibližně 5 až přibližně 6 ekvivalenty aminové báze za vzniku bis(amin)fosfinového reakčního produktu (II):

fefe fefefefe fefe ·· • · · fefefefe • a ♦ fe · · · • « fefefe · ♦ · amin

Aminová báze, rozpouštědlo /

ROPCI2 -► ROP \ (II) amin

Tato reakce také probíhá v přítomnosti éterického nebo uhlovodíkového rozpouštědla, jak je popsáno výše, a provádí se při teplotě od přibližně -50 °C do přibližně 15 °C, výhodně od přibližně -10 °C do přibližně -5 °C, po dobu od přibližně 30 minut do přibližně 3 hodin, výhodně od 15 do 30 minut. Báze použitá pro vytvoření reakčního produktu (II) může být jakákoliv aminová báze, výhodně báze mající hodnotu pKa od přibližně 5 do přibližně 11 a výhodněji vybraná ze skupiny skládající se z imidazolu, 2,4-dimetylimidazolu, 1Htetrazolu, dialkylaminú (metyl, etyl, butyl), pyridinu, piperazinu, piperidinu, pyrolu, 1H-1,2,3-triazolu, a 1,2,4triazolu. Ve výhodnějším provedení je báze imidazol.

Bis(amin)fosfinová sloučenina (II) pak reaguje s přibližně 0,75 až přibližně 1,0 ekvivalentem druhého alkoholu R^XOH, kde R¹ může být jakýkoliv ze substituentů definovaných výše pro 'skupinu R, za vzniku (amin)fosfinového reakčního produktu (III) :

rozpouštědlo ROP(amin)₂ + R¹OH amin /

> ROP

OR¹ (III)

Tato reakce probíhá v přítomnosti éterického nebo uhlovodíkového rozpouštědla a provádí se při teplotě od přibližně -50 °C do přibližně 15 °C, výhodně od přibližně fefe fefefefe

• · * · · · · • · · fefefe fefe fe fe··· fe··· • fe fefe ·· fefe °C do přibližně -5 °C, po dobu od přibližně 30 minut do přibližně 3 hodin, výhodně od 1 do 1,5 hodiny. Rozpouštědlo může být jakékoliv éterické nebo uhlovodíkové rozpouštědlo a výhodně může být vybráno ze skupiny skládající se z heptanů, metal-t-butyl éterů, dioxanu, tetrahydrofuranů,

1,3-dioxolanů, diglymů, dietyléterů, dialkyléterů a etylenglykoldialkyléterů. Výhodněji je rozpouštědlo tetrahydrofuran.

Nakonec (amin)fosfinová sloučenina (III) reaguje s přibližně jedním ekvivalentem kyselé vody, výhodně mající pH přibližně 2,5 až přibližně 5, a přibližně 1 nebo více ekvivalenty oxidačního činidla za vzniku požadované fosfodiesterové sloučeniny (IV):

.amin

ROP,

ORl voda, oxidační rozpouštědlo činidlo,

O

II —R—O—P—O—R¹ I

OH (IV)

Oxidační činidlo může být jakékoliv oxidační činidlo peroxidového typu a výhodně vybrané ze skupiny skládající se z jodistanů. Výhodněji je oxidační činidlo jodistan sodný.

Výše uvedená hydrolýza a oxidace se provádějí ve směsi rozpouštědla při teplotě od přibližně -15 °C do přibližně 25 °C, výhodně od přibližně 0 °C do přibližně 2 °C, po dobu od přibližně 10 hodin do přibližně 24 hodin, výhodně od 10 do 15 hodin. Směs rozpouštědla zahrnuje jakoukoliv kombinaci rozpouštědel vybraných ze skupiny skládající se z éterických nebo uhlovodíkových rozpouštědel. Výhodně směs rozpouštědel *«*· ··

0000 0 0 0

0·

0 ♦ »0 0· obsahuje tetrahydrofuran, heptan a toluen v objemovém poměru 10:10:1.

V souladu s tímto syntetickým schématem je chelatační ligand v komplexu MS-325 připraven takto.

Příprava kyseliny [(4,4-difenylcyklohexyl)fosfooxymetyl] dietylentriaminpentaoctové

Příprava chelatačního ligandu použitého v komplexu MS325 je ukázána níže ve schématu I:

OH OPCIj

PC1₃, rozpouštědlo

Ph Ph

OP(imido).

imidazol

Ph .OH

OP(imido)j

___ , x /—\ /—COjtBu iBuOOC n ν N tBuOOC^ ^COjlBu ^COjtBu /° q ímido )-\ \ /-CO,tBu íBuOOC Ν Ν N íBuOOC”^ ^COjtBu ^^C°í®^u

Ph

HjO, NaIO<

Ph

cHCl,

V rozpouštědlo

OH ý-\ y-s. >-COjlBu

IBuOOC^n n n ©uOOC^ ^COjlBu ^^COj,Bu toto·· ·· 999 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 toto·· ♦ · · to · · ·· · ··♦♦ · · · · to· ··· ···» ·· ··

Do jedné reakční nádoby, která obsahovala roztok chloridu fosforitého (13,2 ml, 0,151 mol) v tetrahydrofuranu (202 ml) byl přidán roztok 4,4-difenylcyklohexanolu (_1) (38,34 g, 0,152 mol) v tetrahydrofuranu (243 ml) za míchání a udržováni vnitřní teploty -6,2 °C až -5,3 °C po 1,5 hodinu. Směs se pak míchala dalších 34 minut za vzniku dichlorfosfinového reakčního produktu (2) , který měl ³¹P NMR chemický posun 174,23 ppm.

K tomuto roztoku byl přidán imidazol (51,34 g, 0,753 mol) v tetrahydrofuranu (243 ml) za míchání a udržování vnitřní teploty -7,8 °C až -3,6 °C po 37 minut. Výsledná směs se pak míchala dalších 20 minut za vzniku roztoku bis(amin)fosfinového reakčního produktu (3), který měl ³¹P NMR chemický posun 106,36 ppm.

K této směsi byl přidán roztok skládající se z kyseliny 2-(R)-hydroxymetyldietylentriaminpentaoctové, penta-t-butyl esteru (4.) (160,0 g, 0,128 mol, čistota: 56,32 'i (hmotnostních)) v heptanu (114 ml) za míchání a udržování vnitřní teploty -6,8 °C až -4,8 °C po 1 hodinu a 6 minut. Směs se pak míchala dalších 23 minut za vzniku roztoku (5) , který měl ³¹P NMR chemický posun 123,8 ppm.

Nakonec byla po dobu přibližně 1 minuty přidávána voda (202 ml) při udržování vnitřní teploty -6,5 °C až 6,5 °C. Směs se pak míchala 5 minut, po kterých byl během 5 minut přidán heptan (620 ml), toluen (70 ml) a 5N vodná kyselina chlorovodíková (202 ml) při udržování vnitřní teploty 1,0 °C až 12,1 °C. Pak byl po dobu 3 minut přidáván jodistan sodný (22,6 g, 0,106 mol) při udržování vnitřní teploty 10,5 °C. Reakční směs byla zahřáta na teplotu místnosti během 35 minut a míchána dalších 2,5 hodiny za vzniku roztoku (_6) s ³¹P NMR chemický posun 4,27 ppm. Vrstvy byly odděleny a organická

·· ·· »*·· • · · • · · · • · · · • · · « • · ♦ · ·· vrstva byly promyta 10% vodným thiosulfátem sodným (2 x 809 ml).

K výše uvedené organické vrstvě byl přidán bromid tetraoctylamonný (8,21 g, 0,015 mol). Pak byla po dobu 22 minut přidávána koncentrovaná kyselina chlorovodíková (11,51 M, 405 ml) při udržování vnitřní teploty 22,8 °C až 25,0 °C. tato směs byla míchána 16,0 hodin za vzniku sloučeniny (7) s ^ixP NMR chemický posun 7,78 ppm. Vrstvy byly odděleny a organická vrstva byla odstraněna.

K výše uvedené vodné vrstvě byl přidán 8M vodný hydroxid sodný (630 ml) dokud nebylo zaznamenáno pH 6,56. Roztok byl koncentrován za sníženého tlaku (50 °C až 55 °C, vakuum 85 mm Hg) dokud nebylo odebráno 400 ml rozpouštědla (přibližně 1 hodina). Roztok byl ochlazen na teplotu místnosti a byla přidána amberlitová pryskyřice XAD-4 (92,0 g) . Suspenze byla míchána 50 minut při teplotě místnosti a filtrována za vzniku lehce žlutého vodného roztoku (1,1 1).

Výše uvedený roztok byl nanesen na silikagel C-18 s převráceným poměrem fází (271 g, balený vlhký v metanolu a pak promyt 800 ml metanolu, 800 ml metanol/voda, 1:1, a 800 ml vody) a eluován vodou. První odebraný eluent v množství 1,0 1 byl odstraněn a další odebraný eluent v množství 1,3 1 byl zachován. K uchovanému roztoku byla přidána 6N vodná kyselina chlorovodíková (60 ml k pH = 2,15) a 3N vodná kyselina chlorovodíková (30 ml k pH = 1,63). Kašovitá hmota byla míchána 1,25 hodiny a filtrována. Pevná látka byla omyta vodným roztokem o pH 1,67 (500 ml) a usušena (48-50 °C, 4-6 mm Hg) na konstantní hmotnost (18,0 hodin) za zisku špinavě bílé pevné látky, sloučeniny vzorce:

Ph

HOOC''^-

HOOC

‘COOH

COOH COOH (65,5 g, výtěžek: 68,89 %, čistota: 99,45 % (hmotnostní), 98,98 % (plochy), 3,02 % voda a 97,81 % chelatovatelných).

Jako konkrétní příklady provedení vynálezu byly připraveny a vyhodnoceny tři typy vzorků. První byl kontrolní vzorek obsahující lidský sérový albumin (HSA) bez kontrastního činidla. Další dva vzorky obsahovaly HSA a nespecifické činidlo Gd-DTPA a HSA-specifické činidlo MS325.

V těchto příkladech byly monitorovány průběžné relaxivity (Ri, mM^-1 s'¹) a byly získávány ve 20 Mhz určováním relaxační rychlosti (l/TJ protonů vody ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS, 150mM NaCI, lOmM fosfát, pH 7,4), v roztocích PBS- obsahujících 4,5 % (hmotnostní) HSA nebo v gelech obsahujících 4,5 % (hmotnostní) HSA· a 1% agar. Závislost teploty na relaxivitě (Ri) byla sledována pozměňováním teploty vzorků pomocí cirkulující vodní lázně a monitorováním teploty vzorku termoelektrickým článkem.

Příklad 1

Monitorování termální nekrózy 4,5% HSA

Byly připraveny následující tři vzorky v roztocích 4,5% HSA: 1) kontrolní vzorek bez kontrastního činidla, 2) komparativní vzorek s Gd-DTPA a 3) vzorek s MS-325. Vzorky s Gd-DTPA a MS-325 byly připraveny přidáním vodného přípravku (pH = 7) obsahujícího buď Gd-DTPA nebo MS-325 k roztoku 4,5% HSA. Výsledné směsi měly koncentraci 0,3 mM Gd-DTPA a 0,1 mM MS-325.

Tyto tři vzorky pak byly použity k monitorování tepelné denaturace roztoků 4,5% HSA. Za tímto účelem se sbírala data Ti (a tedy data R_x (=1/Ti) ) pro každý vzorek ve 20 MHz v průběhu teplotního rozmezí 20-60 °C. Každý vzorek pak byl odstraněn z NMR a zahříván v 85 °C po dobu 15 minut, aby se vyvolala tepelná denaturace HSA. Pak byly vzorky vráceny do NMR a sbírala se data Ti v této vysoké teplotě, viz tabulku 1 níže a obrázek 1.

Jak ukazují tabulka 1 a obrázek 1, po tepelné denaturaci tří roztoků obsahujících HSA se u vzorku, který obsahoval také HSA-specifické kontrastní činidlo MS-325, projevilo významné snížení v pozorované Ri (ztráta 26,7 mM¹ s^-1) během denaturace HSA, jak měřeno od okamžiku těsně před denaturaci (56,2 °C) po okamžik těsně po denaturaci (85 °C) . Ale vzorek, který obsahoval nespecifické kontrastní činidlo Gd-DTPA, dokonce i v koncentraci třikrát větší než v koncentraci použité pro vzorek MS-325, vykazoval během denaturace malé změny v R_x (ztráta pouze 0,1 mM¹ s'¹) . To ukazuje, že Gd-DTPA neváže ani nativní ani denaturovaný HSA.

Tabulka 1

Teplota (°C)	Ri 4,5% HSA	Ri Gd-DTPA	Ri MS-325
7,3	0, 396	9,4556	31,2
11,7	0, 319	8,8125	33, 4
16,2	0,246	8,0690	36, 0
20, 6	0, 181	7,4182	38,6
25, 0	0, 123	6, 7426	40, 6
29, 5	0, 072	6,2117	42,0
33, 9	0, 033	5,7089	42,8
38, 4	0, 000	5,2984	42,4
42,8	-0,026	4,8917	42,3
47, 3	-0,041	4,5992	41,3
51,7	-0,045	4,3083	39,5
56, 2	-0,056	4,0592	37,5
60, 6	-0,065	3,8806	33,3
85, 0	0, 084	4,2102	10, 8

Poté, co byla získána výše uvedená data, byly denaturované vzorky ponechány vychladnout na fyziologickou teplotu (37 °C) a opět se sbírala Ti data. Vzorek s MS-325 udržoval významnou ztrátu v R· (čistá ztráta 25 mM^-1 s“¹), zatímco vzorek s Gd-DTPA vykazoval pouze malé změny v R_x (čistá ztráta 0,5 mM¹ s¹) .

Příklad 2

Zobrazování MRI tepelné denaturace HSA v 1,0 Tesla připraveny kontrastního vzorek s MSpostačuj ícím mM Gd-DTPA

V 1% následuj ící činidla, 2) gelu obsahujícím 4,5% HSA byly vzorky: 1) kontrolní vzorek bez komparativní vzorek s Gd-DTPA a 3)

325. Kontrastní činidla byla přidána v množství tak, že koncentrace Gd-DTPA a MS-325 byly 0,3 ···· · ·· ···· ·· ·· • φ · ·· · · · · · φ φ Φ·· « · * * • · · * * ······ • Φ · · · · · ···· ·· φφφ Φ· ·· · · ·· a 0, 1 mM MS-325. Tyto agarové gely obsahující 4,5% HSA se nazývaly „fantomy.

Pak byly získány výchozí MRI obrazy agarových fantomů s váženými Ti (FISP-3D, TR=15, TE=4, alfa=30) v 1,0 Tesla při teplotě přibližně 25 °C. Tyto výchozí obrazy odhalily, že fantomy obsahující MS-325 byly jasnější než fantomy obsahující Gd-DTPA (komparativní vzorek) nebo samotný 4,5% HSA (kontrolní vzorek), tento výsledek byl očekáván kvůli specifické vazbě MS-325 na HSA.

Fantomy pak byly zahřátý v cirkulující vodní lázni s dalšími MRI obrazy s váženými T_x získanými v průběhu času. Jak se zvyšovala teplota, fantomy obsahující MS-325 zůstávaly mnohem jasnější (menší ztráta intenzity signálu jak měřeno v % ztráty ROI (oblast zájmu)) než fantomy obsahující Gd-DTPA nebo samotný 4,5% HSA, viz tabulka 2 níže a obrázek 2.

Tabulka 2

Čas (min. )	Teplota (°C)	% ztráty ROI, 4,5% HSA	% ztráty ROI, 0,3 mM Gd-DTPA ve 4,5% HSA	% ztráty ROI, 0,1 mM MS-325 ve 4,5% HSA
0	25, 3	-0,41519	-0,24557	0,0000
10	29, 6	-4,2635	-5,1875	-4,4755
20	38, 3	-6,8972	-12,806	-6, 4144
30	45, 0	-10,360	-18,985	-11,241
40	53, 0	-15,205	-30,964	-26,153
50	64,7	-20,250	-43,833	-49,262
60	72, 8	-20,667	-46, 086	-69,499
70	87, 1	-20,953	-47,529	-76,469
120	35, 5	-4,9098	-10,190	-31,869

Jak byly fantomy zahřátý na více než 50-60 °C, jejich barva tmavla, což odpovídalo tepelné denaturaci HSA. Ve stejnou dobu, jak ukazují tabulka 2 a obrázek 2, byla pozorována překvapivá ztráta intenzity signálu u fantomů, • · · ♦ · · * · · · • · · · · · · · ft • · · 4 9 ··· · · · • · · · · 4 · ···« • · · ·· 44 · · » 4 ·· které obsahovaly MS-325 (76% ztráta intenzity). Ale fantomy, které obsahovaly Gd-DTPA nebo samotný HSA, vykázaly pouze mírnou změnu v intenzitě signálu. Fantomy Gd-DTPA, dokonce i v koncentraci Gd-DTPA, která byla třikrát vyšší než koncentrace použitá pro fantomy MS-325, zůstávaly jako neměně tmavé obrazy během MRI skenování po tepelné denaturaci.

Poté, co byla získána výše uvedená data, byly denaturované vzorky ponechány zchladnout na normální fyziologickou teplotu (37 °C) . Fantomy obsahující MS-325 si ponechávaly svou ztrátu intenzity signálu (32% ztráta). Kontrolní fantomy a fantomy obsahující Gd-DTPA stále vykazoval pouze 5% a 10% sníženi intenzity signálu po denaturaci.

Podle těchto výsledků mohou kontrastní činidla použitelná ve způsobu podle tohoto vynálezu poskytnout velmi citlivou indikaci tepelné denaturace HSA. Vskutku, dokonce i když byla použita trojnásobná koncentrace jiného kontrastního činidla, nemohla tato vyšší koncentrace poskytnout citlivost vyžadovanou pro monitorování tepelné denaturace HSA.

Příklad 3

Etanolová denaturace HSA

Bylý připraveny následující tři vzorky v roztocích 4,5% HSA: 1) kontrolní vzorek bez kontrastního činidla, 2) komparativní vzorek s Gd-DTPA a 3) vzorek s MS-325. Vzorky s Gd-DTPA a MS-325 byly připraveny přidáním vodného přípravku (pH = 7) obsahujícího buď Gd-DTPA nebo MS-325 k roztoku • · • · · ·

♦ 0

0

		62
4,5%	HSA. Výsledné směsi	měly	koncentraci	0,31 mM	Gd-DTPA
a 0,	08 mM MS-325.
	Pak byl ke každému	vzorku	titrován	absolutní	etanol.
Byla	sbírána data Ti (a	tedy	data Ri (=	Ι/TJ) ve	20 MHz
a 37	°C po každém přidání etanolu, viz	tabulku	3 níže

a obrázek 3.

Tabulka 3

Etanol (%)	Ri 4,5% HSA	Etanol (%) pro Gd-DTPA	Ri 0,31 mM Gd-DTPA	Etanol (%) pro MS-325	Ri 0,08 mM MS-325
0,0000	0, 000	0, 0	4,1737	O o	42,216
8,7382	0, 030	16, 1	4,7191	0,9	40,848
16,072	0, 060	27,8	5,0021	1,9	39,541
22,315	0, 090	36, 6	4,9347	2, 8	38,423
27,693	0, 109	43, 5	4,7997	3,7	37,064
32,375	0, 125	49, 0	4,4623	4,5	36,375
36,487	0, 128			5,4	35,234
40,128	0, 142			6, 2	34,576
43,375	0, 153			7,1	33,895
46, 287	0, 168			7,9	33,099
				8,7	32,224
				10, 2	31,689
				11,7	30,403
				16, 4	26, 939
				22, 8	21,456
				28,3	17,428
				33, 1	14,082
				37, 3	11,187
				41, 0	9,6943
				44,2	8,9506
				47,2	8,7970

Jak ukazuje tabulka 3 a obrázek 3, během etanolové ablace roztoků 4,5% HSA, vzorek obsahující MS-325 vykázal • · · · • · · · • · • · • · · «• * ♦ · • · · · • · · » •» fefe významné snížení v pozorované relaxivitě (33 mM^-1 s¹) a tudíž umožnil detekci nekrózy indukované etanolem. Avšak vzorek obsahující Gd-DTPA (dokonce v téměř čtyřnásobné koncentraci MS-325) vykázal pouze malou změnu v pozorované relaxivitě (0, 3 mM'¹ s'¹) .

• φ • «ΦΦΦ ·· φφ φφ φφ » 9 9 9 9 9 9 9

999 9 · 999 9 9 Φ 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 0 • · ···· ····

ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ Φφ ΦΦ

Claims (3)

00 0 • 0 *·* 1 0« ·· • · ♦ · ♦ · * • · 0 · · · · « •0 000 0· ·· ·· ·· PATENTOVÉ NÁROKY
1. *1 9··· 99 99 » 9 «999

   9 9 9 9 ··

   9 999 99 ·

   99 9 9 99 « «9 «9 99 9 · ttooo-ílfi pozorovaná

   Obr. 1 • fe fefe fe fefe ·

   1. Použití kontrastního činidla pro přípravu diagnostického činidla pro diagnostické zobrazení se zvýšeným kontrastem pomocí MRI, ultrafialového světla, viditelného světla nebo infračerveného záření, kdy kontrastní činidlo:

   je schopné navázat se na cílovou tkáň nebo složku tkáně, která právě prochází nebo již prodělala intervenční terapii, má specifickou afinitu pro tuto tkáň nebo složku tkáně, obsahuje skupinu zesilující zobrazení (IEM) a skupinu vázající se na tkáň v závislosti na jejím stavu (SDTBM), přičemž se monitoruje zobrazovací signální charakteristika kontrastního činidla, aby se stanovilo, zda je intervenční terapie zcela dokončena.
2. 2/3 &wZtráta intenzity

   V

   2. Použití podle nároku 1, kdy IEM je vybrána ze skupiny obsahující organické molekuly, ionty, soli a cheláty kovů, částice, klastry, částice železa, značené peptidy, proteiny, polymery, liposomy, organická barviva a anorganická barviva.

   3. Použití podle nároku 1, kdy IEM obsahuje fyziologicky kompatibilní cheláty obsahující alespoň jedno cyklické nebo acyklické organické chelatující činidlo komplexované s jedním nebo několika ionty kovu s atomovými čísly 13, 21 až 34, 39 až 42, 44 až 50 nebo 57 až 83.

   4. Použití podle nároku 3, kdy kovový ion je paramagnetický kov s atomovým číslem 21 až 29, 42, 44 nebo 57 až 83.

   • ··* · ·· ·« 99 99

   9 9 9 9 9 9 9 9

   9 99 9 9 9 99 9 9 9 9 ··· ·· 9 9 · « 9 9

   9 · 9 · · ···· ··· ··· 99 99 99 99

   5. Použití podle nároku ion je vybrán ze skupiny Mn(II), Μη(III) , Cr(III), Ho (III) , Er(III) a Eu(III).

   4, kdy paramagnetický kovový obsahující Gd(III), Fe(III),

   Cu(II), Dy(III), Tb(III),

   6. Použití podle nároku 5, kdy kovový ion je Gd(III).

   7. Použití podle nároku 5, kdy chelatující činidlo je vybráno ze skupiny obsahující DTPA, DOTA, DTPA-BMA a HP-D03A.

   8. Použití podle nároku 1, kdy IEM obsahuje luminiscenční komplex kovu.

   9. Použití podle nároku 1, kdy IEM obsahuje částici železa nebo chelát kovu ze skupiny Dy, Gd a Ho.

   10. Použití podle nároku 1, kdy SDTBM je vybrána ze skupiny obsahující malé molekuly nebo biomolekuly.

   skupinu, nebo

   11. Použití podle nároku 10, kdy SDTBM obsahuje malou molekulu obsahující alespoň jednu alifatickou skupinu, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, alkykarbonylovou alkylkarbonyloxyskupinu, arylovou skupinu heterocyklickou skupinu s 1 až 60 atomy -uhlíku a volitelně obsahující jeden nebo několik dusíkových, kyslíkových, sírových, halogenových, alifatických amidových, estersulfonamidových, acylových, sulfonátových, fosfátových, hydroxylových nebo organokovových substituentů.

   12. Použití podle nároku 11, jeden arylový kruh.

   kdy SDTBM obsahuje alespoň

   «ν·· ·· ·· ·· • ··· ···· • ·» · fe··· « «· · ··· ·· ··· ·· · • ···· ···· ··· ·· ·· ·· ··

   13. Použití podle nároku 12, kdy SDTBM obsahuje alespoň dva arylové kruhy.

   14. Použití podle nároku 13, kdy kontrastní činidlo má následující strukturu:

   15. Použití podle nároku 14, kdy zobrazovací metoda je MRI se zvýšeným kontrastem.

   16. Použití podle nároku 14, kdy intervenční terapie se provádí zaměřeným ultrazvukem.

   17. Použití podle nároku 10, kdy SDTBM obsahuje biomolekulu, která obsahuje peptid obsahující zbytky hydrofobních aminokyselin a/nebo substituenty buďto s nebo bez hydrofobních nebo hydrofilních koncových skupin.

   18. Použití podle nároku 1, kdy kontrastní činidlo projevuje vazebnou afinitu, která je závislá na stavu, ke tkáni nebo složce tkáně v plazmě, intersticiálním prostoru, synoviální tekutině, mozkomíšním moku, zánětlivém výpotku a tekutině v abscesu.

   tt ·«»· ·· ο» ·· ·« »· · · t · ·«·· • »»· · * ··· · · » · • »·« a · · · * aa · a · a a a a a a · a ····«» aa aa aa ta

   19. Použití podle nároku 1, kdy kontrastní činidlo projevuje na stavu závislou vazebnou afinitu k proteinu vybranému ze skupiny obsahující lidský sérový albumin, vazebný protein mastných kyselin, glutathion-S-transferázu a lipoprpoteiny.

   20. Použití podle nároku 1, kdy kontrastní činidlo ještě obsahuje skupinu prodlužující poločas v krvi (BHEM), která má jeden nebo několik úplných nebo parciálních negativních nábojů ve vodném roztoku při fyziologickém pH, přičemž negativní náboj nemůže být ani parciálně ani plně neutralizován kovalentní nebo koordinačně kovalentní vazbou k IEM.

   21. Použití podle nároku 20, kdy kontrastní činidlo projevuje na stavu závislou afinitu k lidskému sérovému albuminu.

   22. Použití podle nároku 21, kdy nejméně 10 % činidla se váže k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   23. Použití podle nároku 22, kdy nejméně 50 % činidla se váže k lidskému sérovému albuminu v jeho nátivním stavu.

   24. Použití podle nároku 23, kdy nejméně 80 % činidla se váže k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   25. Použití podle nároku 24, kdy nejméně 95 % činidla se váže k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   • ···«· ·· ·» ··

   ·· · • • · • · · · • ··· • • ··· • · · · • · • • e · • · · · *·· ··· •e »· ·· 68

   26. Použití podle nároku 21, kdy kontrastní činidlo projevuje vazebnou afinitu k lidskému sérovému albuminu v jeho denaturovaném stavu, která je menší než 80 % vazebné afinity kontrastního činidla k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   27. Použití podle nároku 26, kdy kontrastní činidlo projevuje vazebnou afinitu k lidskému sérovému albuminu v jeho denaturovaném stavu, která je menší než 50 % vazebné afinity kontrastního činidla k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   28. Použití podle nároku 27, kdy kontrastní činidlo projevuje vazebnou afinitu k lidskému sérovému albuminu v jeho denaturovaném stavu, která je menší než 20 % vazebné afinity kontrastního činidla k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   29. Použití podle nároku 28, kdy kontrastní činidlo projevuje vazebnou afinitu k lidskému sérovému albuminu v jeho denaturovaném stavu, která je menší než 10 % vazebné afinity kontrastního činidla k lidskému sérovému albuminu v jeho nativním stavu.

   30. Použití podle nároku 1 nebo 18, kdy kontrastní činidlo, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím denaturovaném stavu, má relaxivitu Ri, která je menší než 80 % relaxivity R_x kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   31. Použití podle nároku 30, kdy kontrastní činidlo, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím

   • ···· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · 9 9 99 9

   9 denaturovaném stavu, má relaxivitu Ri, která je menší než 50 % relaxivity Ri kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   32. Použití podle nároku 31, kdy kontrastní činidlo, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím denaturovaném stavu, má relaxivitu Ri, která je menší než 20 % relaxivity Ri kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   33. Použití podle nároku 32, kdy kontrastní činidlo, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím denaturovaném stavu, má relaxivitu Ri, která je menší než 10 % relaxivity Ri kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   34. Použití podle nároku 1 nebo 18, kdy kontrastní činidlo, když je intervenční terapie dokončena a cílová tkáň nebo složka tkáně se navrátila do fyziologického stavu, má relaxivitu Ri, která je menší než 80 % relaxivity Ri kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním' stavu.

   35. Použití podle nároku 34, kdy kontrastní činidlo, když je intervenční terapie dokončena a cílová tkáň nebo složka tkáně se navrátila do fyziologického stavu, má relaxivitu R_x, která je menší než 50 % relaxivity Ri kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   36. Použití podle nároku 35, kdy kontrastní činidlo, když je intervenční terapie dokončena a cílová tkáň nebo

   • · · · složka tkáně se navrátila do fyziologického stavu, má relaxivitu R_lz která je menší než 20 % relaxivity R_: kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   37. -žpa-s-oto podle nároku 36, kdy kontrastní činidlo, když je intervenční terapie dokončena a cílová tkáň nebo složka tkáně se navrátila do fyziologického stavu, má relaxivitu R_:, která je menší než 10 # relaxivity Rj kontrastního činidla, když je navázáno na tkáň nebo složku tkáně v jejím nativním stavu.

   38. Použití kontrastního činidla pro přípravu diagnostického činidla pro diagnostické zobrazení se zvýšeným kontrastem specifické tkáně nebo tkáňové složky, která právě prochází nebo prodělala intervenční terapii, pomocí MRI, ultrafialového světla, viditelného světla nebo infračerveného záření, kdy kontrastní činidlo má jeden z následujících vzorců:

   o'

   I .

   0=j>—o o / /^C02^_ \IZ

   Gd³⁺

   MS-315

   MS-317

   O—‘

   I o=p—o

   MS-323

   MS-326 • · · · • · • to ··

   Gd^{3 +}

   Gd³⁺ • · · ♦ * · fe fe

   Gd³⁺ ·· ·· ·· ·· • · · · * · · • · ··« to · · * • ·· · · · · · · • · « · · · · <

   »« ·« ·♦ ··

   OR kde n má hodnotu 1 až 4 a R obsahuje alifatickou skupinu a/nebo alespoň jeden arylový kruh, přičemž se monitorují zobrazovací signální charakteristiky kontrastního činidla, aby se stanovilo, zda je intervenční terapie dokončena.
3. 3/3

   Obr. 3 t