NL2000464C2 - Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist. - Google Patents

Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist. Download PDF

Info

Publication number
NL2000464C2
NL2000464C2 NL2000464A NL2000464A NL2000464C2 NL 2000464 C2 NL2000464 C2 NL 2000464C2 NL 2000464 A NL2000464 A NL 2000464A NL 2000464 A NL2000464 A NL 2000464A NL 2000464 C2 NL2000464 C2 NL 2000464C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
trkb
antibody
human
antibodies
arg
Prior art date
Application number
NL2000464A
Other languages
English (en)
Other versions
NL2000464A1 (nl
Inventor
Arnon Rosenthal
John Chia-Yang Lin
Jennifer Renee Stratton
Original Assignee
Rinat Neuroscience Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rinat Neuroscience Corp filed Critical Rinat Neuroscience Corp
Publication of NL2000464A1 publication Critical patent/NL2000464A1/nl
Application granted granted Critical
Publication of NL2000464C2 publication Critical patent/NL2000464C2/nl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist
5 GEBIED VAN DE UITVINDING
Deze uitvinding heeft betrekking op het gebruik van een trkB-agonist bij de behandeling en/of het voorkomen van ongewenst gewichtsverlies, eetstoornissen of opio-ide-geïnduceerd braken.
10
ACHTERGROND VAN DE UITVINDING
Neurotrofinen zijn een familie van kleine homodimere eiwitten die een essentiële rol spelen bij de ontwikkeling en het onderhoud van het zenuwstelsel. Leden van de 15 neurotrofine-familie omvatten zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afkomstige neu-rotrofe factor (BDNF), neurotrofine-3 (NT-3), neurotrofine-4/5 (NT-4/5), neurotrofine-6 (NT-6) en neurotrofine-7 (NT-7). Overeenkomstig aan andere polypeptide-groeifac-oren beïnvloeden neurotrofinen de doelwitcellen ervan door interacties met receptoren van het celoppervlak. Volgens de huidige kennis dienen twee soorten van transmem-20 braan glycoproteïnen als receptoren voor neurotrofinen. Neurotrofine-reagerende neuronen bezitten een algemene receptor met lage affiniteit (LNGFR) met laag molecuul-gewicht (65-80 kDa) die ook bekend is als p75NTR of p75, die NGF, BDNF, NT-3 en NT-4/5 bindt met een Kd van 2x10'9 M; en receptoren met hoge affiniteit (Kd in het traject van 10'" M) met hoog molecuulgewicht (130-150 kDa) die leden zijn van de 25 trk-familie van receptor-tyrosinekinasen. De geïdentificeerde leden van de Trk-receptor-familie zijn trkA, trkB en trkC.
Zowel BDNF en NT-4/5 binden met overeenkomstige affiniteit aan de trkB en p75NTR-receptoren. Muizen die mutant zijn voor NT-4/5 en BDNF vertonen echter sterk tegengestelde fenotypen. Terwijl NT-4/5'7' muizen levensvatbaar en vruchtbaar 30 zijn met alleen een mild sensorisch defect, overlijden BDNF'7' muizen gedurende vroege postnatale fasen met ernstige neuronale gebreken en symptomen van gedrag. Fan et al., Nat. Neurosci. 3(4):350-7, 2000; Liu et al., Nature 375: 238-241, 1995; Conover et al., Nature 375:235-238, 1995; Emfors et al., Nature 368:147-150, 1994; Jones et al., 2 0 0 C 4 6 4 2
Cell 76:989-999, 1994. Verscheidene publicaties vermelden dat NT-4/5 en BDNF in vivo afzonderlijke biologische activiteiten hebben en suggereren dat de afzonderlijke activiteiten gedeeltelijk kunnen resulteren van verschillende activatie van de trkB-receptor en de stroomafwaartse signaleringsroutes ervan door NT-4/5 en BDNF. Fan et 5 al., Nat. Neurosci. 3(4):350-7, 2000; Minichiello et al., Neuron, 21:335-45, 1998; Wirth et al., Development, 130(23):5827-38, 2003; Lopez et al., Program No. 38.6, 2003 Abstract, Society for Neuroscience.
Het is getoond dat BDNF en NT-4/5 regulerende activiteit hebben voor glucose van bloed en lipide van bloed en anti-obesitas activiteit bij modeldieren voor type II 10 diabetes, zoals C57db/db muizen. Amerikaans octrooischriftnummer 6.391.312; Itakura et al., Metabolism 49:129-33 (2000); Amerikaanse octrooiaanvraag publicatienummer 2005/0209148; WO 2005/082401. Het is ook getoond dat BDNF anti-obesitas activiteit heeft en activiteit heeft bij het verbeteren van leptineresistentie bij muizen die zijn gevoerd met een dieet met hoog vetgehalte. Amerikaanse publicatienummer 2003/-15 036512, Kemie et al., vermelden dat BDNF of NT-4/5 het eetgedrag en zwaarlijvigheid bij heterozygote BDNF knock-out muizen, waarbij expressie van het BDNF-gen was verlaagd, op transiënte wijze kon omkeren. Kemie et al., EMBO J. 19(6):1290-300, 2000. Het is vermeld dat een de novo missense mutatie van Y722C substitutie op humaan trkB in verstoorde fosforylatie van de receptor en signalering naar MAP-kinase 20 resulteert; en deze mutatie lijkt te resulteren in een uniek humaan syndroom van hyper-fage zwaarlijvigheid. Yeo et al., Nat. Neurosci. 7:1187-1189 (2004).
Circulerende niveaus van BDNF bij mensen met zwaarlijvigheid en bij patiënten met anorexia nervosa zijn onderzocht. Monteleone et al., Psychosomatic Medicine 66:744-748, 2004; Nakazato et al., Biol. Psychiatry 54:485-490, 2003. In tegenstelling 25 tot de voorspelling die is gebaseerd op de vindingen dat beschadigingen van productie van BDNF bij muizen is geassocieerd met verhoogde voedselopname, verlaagde energieverbruik en gewichtstoename, is circulerend BDNF aanzienlijk verlaagd bij de patiënten met anorexia nervosa en aanzienlijk verhoogd bij zwaarlijvige patiënten in vergelijking met niet-zwaarlijvige gezonde controles. Het wordt verondersteld dat bij 30 anorexia nervosa, door verlaging van BDNF, het bevorderen van voedselopname, wordt geprobeerd het veranderde gedrag van de patiënt dat tot een negatieve balans leidt te compenseren; en bij zwaarlijvigheid kunnen verhoogde niveaus van BDNF een aanpassend mechanisme vertegenwoordigen om de omstandigheid van een onbalans 3 van positieve energie tegen te werken door energieverbruik te stimuleren en voedselop-name te verlagen. Monteleone et al., Psychosomatic Medicine 66:744-748, 2004.
Alle octrooien, octrooi-aanvragen en publicaties die hierin zijn geciteerd zijn hierin in het geheel door verwijzing opgenomen.
5
KORTE SAMENVATTING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding verschaft werkwijzen voor het verhogen van het lichaamsgewicht en/of voedselopname door perifere toediening van een trkB-agonist, 10 waaronder een trkB-selectieve agonist. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het behandelen of voorkomen van ongewenst gewichtsverlies (zoals cachexie), eetstoornissen (zoals anorexia nervosa) en opioïde-geïnduceerd braken.
In één aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het verhogen van het lichaamsgewicht bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveel-15 heid van een trkB-agonist aan de primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het verhogen van voedselopname bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan de primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het behandelen of 20 voorkomen van cachexie bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan de primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het verbeteren, verminderen van het voorkomen van of vertraging van de ontwikkeling of voortgang van cachexie bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van 25 een trkB-agonist aan de primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het behandelen of voorkomen van anorexia nervosa bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan de primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het verbeteren, ver-30 minderen van het voorkomen van of het vertragen van de ontwikkeling of voortgang van anorexia nervosa bij een primaat die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan de primaat omvat.
4
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het behandelen of voorkomen van opioïde-geïnduceerd braken bij een individu die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan het individu primaat omvat.
In een ander aspect verschaft de uitvinding werkwijzen voor het verbeteren, ver-5 minderen van het voorkomen van of het vertragen van de ontwikkeling of voortgang van opioïde-geïnduceerd braken bij een individu die het perifeer toedienen van een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist aan het individu omvat.
De trkB-agonist wordt perifeer toegediend. De trkB-agonist kan bijvoorbeeld worden toegediend door één van de volgende wijzen: intraveneus, intraperitoneaal, 10 intramusculair, subcutaan, parenteraal, door middel van inhalatie, intra-arterieel, intra-cardiaal, intraventriculair en transdermaal.
Bij sommige uitvoeringsvormen is de primaat een mens. Bij sommige uitvoeringsvormen is het individu een mens.
De trkB-agonist die voor de werkwijzen die hierin zijn beschreven kan worden 15 gebruikt omvat, maar is niet beperkt tot BDNF-polypeptide, NT-4/5-polypeptide en anti-trkB-agonist antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen is de trkB-agonist humaan NT-4/5. In sommige uitvoeringsvormen is de trkB-agonist humaan BDNF. In andere uitvoeringsvormen is de trkB-agonist een anti-trkB-agonist antilichaam, waaronder een anti-trkB-agonist antilichaam dat trkB-selectief is.
20 In een ander aspect verschaft de uitvinding farmaceutische preparaten die een ef fectieve hoeveelheid van een trkB-agonist, waaronder een trkB-selectieve agonist en een farmaceutisch aanvaardbare excipiënt omvatten. De farmaceutische preparaten kunnen worden gebruikt voor het behandelen of voorkomen van elk van de ziekten die hierin zijn beschreven.
25 In een ander aspect verschaft de uitvinding kits die een trkB-agonist, waaronder een trkB-selectief antilichaam, omvatten voor gebruik bij elk van de werkwijzen die hierin zijn beschreven. In sommige uitvoeringsvormen omvatten de kits een houder, een preparaat dat een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist omvat, in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare excipiënt en instructies voor het gebruik van het 30 preparaat in elk van de werkwijzen die hierin zijn beschreven.
In een ander aspect verschaft de uitvinding ook werkwijzen voor het genereren van een monoklonaal antilichaam als agonist die specifiek een receptor bindt en activeert, die de stappen omvat van: (a) het immuniseren van een gastheer-zoogdier met 5 een immunogeen molecuul dat een extracellulair domein van de receptor omvat door tenminste twee keer binnen ongeveer 15 dagen het immunogene molecuul in het zoogdier te injecteren. De werkwijzen kunnen verder de stappen omvatten van het fuseren van lymfecellen van het geïmmuniseerde zoogdier met een onsterfelijk gemaakte cel-5 lijn voor het produceren van hybridoma’s die monoklonale antilichamen uitscheiden; het kweken van de hybridoma’s onder omstandigheden die de uitscheiding van de monoklonale antilichamen mogelijk maken; en het selecteren van een hybridoma die een monoklonaal antilichaam uitscheidt dat de receptor bindt en activeert. In sommige uitvoeringsvormen is de receptor een receptor die dimerisatie voor de activatie vereist.
10
KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN
Figuur 1 is een grafiek die het effect toont van dagelijkse infusie van NT-4/5 op het lichaamsgewicht bij zwaarlijvige vrouwelijke bavianen. De X-as komt overeen met 15 de dagen waarop het lichaamsgewicht werd gemeten en de Y-as komt overeen met het lichaamsgewicht dat werd gemeten als een percentage van de basislijn (lichaamsgewicht voorafgaand aan elke behandeling). Two way ANOVA werd gebruikt voor het vergelijken van de NT-4/5-behandelde groep en de groep die met hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat het lichaamsgewicht van de NT-4/5 -behandelde groep aan-20 zienlijk verschillend was van de met hulpstof behandelde groep (F=50,71, P<0,0001). Bonferroni post test analyse toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen tussen NT-4/5-behandelde groep (dichte driehoeken) met de groep met hulpstof (open vierkanten).
geeft P<0,05 aan; “**” geeft P<0,01 aan; en “***” geeft P<0,001 aan, zoals in de grafiek is aangegeven.
25
Figuur 2 is een grafiek die het effect toont van dagelijkse infusie van NT-4/5 op voedselopname bij zwaarlijvige vrouwelijke bavianen. De X-as komt overeen met de dagen waarop voedselopname werd gemeten en de Y-as komt overeen met het aantal biscuits dat door een baviaan per dag werd gegeten. Two way ANOVA werd gebruikt 30 voor het vergelijken van de met NT-4/5-behandelde groep met de groep die met hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat voedselopname van de met NT-4/5-behandelde groep aanzienlijk verschillend was van de met hulpstof behandelde groep (F=262,5, P<0,0001). Bonferroni post test toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen 6 tussen met NT-4/5 behandelde groep (dichte driehoeken) met de groep met hulpstof (open vierkanten). De getrokken zwarte balk in de grafiek geeft de periode aan wanneer de paarsgewijze vergelijking in P<0,05 of lager resulteerde.
5 Figuur 3 is een grafiek die het effect toont van infusie van NT-4/5 tweemaal per week op het lichaamsgewicht bij zwaarlijvige vrouwelijke bavianen. De X-as komt overeen met de dagen waarop het lichaamsgewicht werd gemeten en de Y-as komt overeen met het lichaamsgewicht dat werd gemeten als een percentage van de basislijn (lichaamsgewicht voorafgaand aan elke behandeling). Two way ANOVA werd ge-10 bruikt voor het vergelijken van de NT-4/5-behandelde groep met de groep die met hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat het lichaamsgewicht van de NT-4/5-behandelde groep aanzienlijk verschillend is van de met hulpstof behandelde groep ((F=34,81, P<0,0001). Bonferroni post test analyse toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen tussen NT-4/5 behandelde groep (dichte driehoeken) met de groep met 15 hulpstof (open vierkanten). geeft P<0,05 aan; en*” geeft PO,01 aan.
Figuur 4 is een grafiek die het effect toont van infusie van NT-4/5 tweemaal per week voedselopname bij zwaarlijvige vrouwelijke bavianen. De X-as komt overeen met de dagen waarop voedselopname werd gemeten en de Y-as komt overeen met het 20 aantal biscuits dat door een baviaan per dag werd genomen.
Figuur 5 is een grafiek die het effect toont van dagelijkse infusie van NT-4/5 en wekelijkse infusie van gepegyleerd NT-4/5 op het lichaamsgewicht bij magere cyno-molgus apen. De X-as komt overeen met de dagen waarop voedselopname werd geme-25 ten en de Y-as komt overeen met het lichaamsgewicht dat werd gemeten als een percentage van de basislijn (lichaamsgewicht voorafgaand aan elke behandeling). Two way ANOVA werd gebruikt voor het vergelijken van de NT-4/5-behandelde groep of de met gepegyleerde NT-4/5 (PEG-NT-4/5) behandelde groep met de groep die met hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat het lichaamsgewicht van de NT-4/5-30 behandelde groep, maar niet de met gepegyleerde NT-4/5 behandelde groep, aanzienlijk verschillend was van de met hulpstof behandelde groep (F=54,98, P<0,0001). Bonferroni post test analyse toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen tussen NT-4/5 behandelde groep (driehoeken) en de groep met hulpstof (vierkanten), maar niet tussen 7 de met gepegyleerd NT-4/5 behandelde groep (omgekeerde driehoeken) en de met hulpstof behandelde groep. “***” geeft P<0,001 aan zoals in de grafiek is aangegeven.
Figuur 6 is een grafiek die het effect toont van dagelijkse infusie van NT-4/5 en 5 wekelijkse infusie van gepegyleerd NT-4/5 op voedselopname bij magere cynomolgus apen. De X-as komt overeen met de dagen waarop voedselopname werd gemeten en de Y-as komt overeen met het aantal biscuits dat door een aap per dag werd gegeten. Two way ANOVA werd gebruikt voor het vergelijken van de met NT-4/5-behandelde groep of de met gepegyleerde NT-4/5 (PEG-NT-4/5) behandelde groep met de groep die met 10 hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat het lichaamsgewicht van de met NT-4/5-behandelde groep maar niet van de met gepegyleerd NT-4/5 behandelde groep aanzienlijk verschillend was van de met hulpstof behandelde groep (F=33,82, P<0,0001). Bonferroni post test toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen (P<0,05 of lager) tussen met NT-4/5 behandelde groep (driehoeken) en de groep met hulpstof (vierkan-15 ten) op dag 15, 16,17, 19, 22, 23, 25 en 30, maar geen aanzienlijk paarsgewijs verschil tussen de met gepegyleerd NT-4/5 behandelde groep (omgekeerde driehoeken) en de groep die met hulpstof is behandeld.
Figuur 7 is een grafiek die het effect toont van dagelijkse subcutane injectie van 20 NT-4/5 en dagelijkse subcutane injectie van gepegyleerd NT-4/5 op het lichaamsge wicht bij magere cynomolgus apen. De X-as komt overeen met de dagen waarop het lichaamsgewicht werd gemeten en de Y-as komt overeen met het lichaamsgewicht dat werd gemeten als een percentage van de basislijn (lichaamsgewicht voorafgaand aan elke behandeling). Two way ANOVA werd gebruikt voor het vergelijken van de NT-25 4/5-behandelde groep of de met gepegyleerde NT-4/5 (PEG-NT-4/5) behandelde groep met de groep die met hulpstof is behandeld. Gegevens geven aan dat het lichaamsgewicht van de NT-4/5-behandelde groep aanzienlijk verschillend was van de met hulpstof behandelde groep (F=19,10, ΡΟ,ΟΟΟΙ). Bonferroni post test analyse toonde aanzienlijke paarsgewijze verschillen tussen de met NT-4/5 behandelde groep (driehoeken) 30 en de groep die met hulpstof is behandeld (vierkanten), en tussen de met gepegyleerd NT-4/5 behandelde groep (omgekeerde driehoeken) en de met hulpstof behandelde groep. “***” geeft P<0,001 aan; en “**” geeft P<0,01 aan.
8
Figuur 8 is een grafiek die het effect toont van een enkele injectie van NT-4/5 op morfine-geïnduceerd braken bij fretten. De X-as komt overeen met het soort geneesmiddel dat werd geïnjecteerd; en de Y-as komt overeen met het aantal keren kokhalzen en braken gedurende een periode van 60 minuten na injectie. One way ANOVA met 5 Dunnetf s posttest werd gebruikt voor statistische analyse. P-waarden zijn in de grafiek aangegeven.
Figuur 9A en Figuur 9B tonen de inductie van c-Fos in de achterhersenen van fretten door NT-4/5. Figuur 9A toont het aantal kernen dat worden gekleurd door anti-10 c-Fos antilichaam in het area postrema. Figuur 9B toont het aantal kernen dat wordt gekleurd door anti-c-Fos antilichaam in de dorsale vagale kern.
Figuur 10 toont het niveau van tyrosinefosforylatie van trkB in de KIRA-test door verscheidene anti-trkB-antilichamen (36D1, 38B8, 37D12, 19H8(1), 1F8, 23B8, 18H6) 15 in vergelijking met humaan NT-4/5.
Figuur 11 toont een grafiek van de overleving van nodosus neuron die wordt ondersteund door verscheidene trkB-agonist-antilichamen. De X-as vertegenwoordigt de verschillende concentraties van anti-trkB-antilichamen die zijn toegevoegd aan de 20 kweek van nodosus neuronen op embryonale dag 15 (El 5) die werd verkregen van Swiss Webster muizen. De Y-as vertegenwoordigt het aantal overlevende neuronen 48 uur na het uitplaten. Elk punt is een gemiddelde van vier bepalingen en de foutenbalken tonen variantie van het gemiddelde van één standaardafwijking. De gegevens geven aan dat sommige van de trkB-antilichamen die werden getest de overleving van nodo-25 sus neuronen kan ondersteunen en dat de 50% effectieve concentratie (EC50) van deze antilichamen onder deze kweekomstandigheden kan variëren van minder dan 0,1 tot meer dan 10 pM (zie Tabel 1).
Figuur 12A en Figuur 12B zijn grafieken die het effect tonen van intracraniale in-30 jecties van anti-trkB agonist antilichamen op het lichaamsgewicht (Figuur 12A) en voedselopname (Figuur 12B) bij muizen. Antilichamen en NT-4/5 werden op dag 0 geïnjecteerd. Lichaamsgewicht en voedselopname werden tot dag 15 gemeten. “***” geeft P<0,001 in vergelijking met IgG controle bij muis aan; “**” geeft P<0,01 in ver-
gelijking met IgG controle bij muis aan; en geeft P<0,05 in vergelijking met IgG
controle bij muis aan.
9
Figuur 13A en Figuur 13B zijn grafieken die het effect tonen van perifere intra-5 veneuze injecties van anti-trkB agonist antilichamen op het lichaamsgewicht (Figuur 13A) en voedselopname (Figuur 13B) bij cynomolgus apen. Antilichamen werden op dag 1 geïnjecteerd. Lichaamsgewicht werd wekelijks gevolgd en voedselopname werd dagelijks gevolgd. “***” geeft P>0,001 in vergelijking met controle met hulpstof aan; “**” geeft P>0,01 aan in vergelijking met controle met hulpstof aan; en geeft 10 P>0,05 in vergelijking met controle met hulpstof aan.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding verschaft werkwijzen voor het behandelen of voor-15 komen van ongewenst gewichtsverlies (zoals cachexie), eetstoornissen (zoals anorexia nervosa) en opioïde-geïnduceerd braken, die het toedienen van een trkB-agonist aan een individu omvat.
I. Algemene technieken 20
Bij de uitvoering van de onderhavige uitvinding zal gebruik worden gemaakt, tenzij anders wordt aangegeven, van gebruikelijke technieken van moleculaire biologie (waaronder recombinante technieken), microbiologie, celbiologie, biochemie en immunologie, die binnen de deskundigheid van het vakgebied vallen. Dergelijke technieken 25 worden volledig uitgelegd in de literatuur zoals Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tweede editie (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, redacteur, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, redacteur, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, redacteur, 1987); Introduction to Cell and Tissue 30 Culture (J.P. Mather en P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths en D.G. Newell, redacteuren, 1993-8) J. Wiley en Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir en C.C. Blackwell, redacteuren); Gene Transfer Vec- 10 tors for Mammalian Cells (J.M. Miller en M.P, Calos, redacteuren, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., redacteuren, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al, redacteuren, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., redacteuren, 1991); Short Protocols in Molecular Biology 5 (Wiley en Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway en P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., redacteur, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd en C. Dean, redacteuren, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow en D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies 10 (M. Zanetti en J.D. Capra, redacteuren, Harwood Academic Publishers, 1995).
II. Definities
Zoals hierin wordt gebruikt is “behandeling” een benaderingswijze voor het ver-15 krijgen van voordelige of gewenste geneeskundige resultaten. Voor doelen van deze uitvinding omvatten voordelige of gewenste geneeskundige resultaten, maar zijn niet beperkt tot, één of meer van de volgende: het verbeteren, verminderen van de ernst, verlichten van één of meer van de symptomen die met een ziekte zijn geassocieerd. Voor bijvoorbeeld behandeling van cachexie omvatten voordelige of gewenste genees-20 kundige resultaten, maar zijn niet beperkt tot, elke verbetering, vermindering van de ernst en/of verlichten van één of meer van de volgende: gewichtsverlies, lipolyse, verlies van spier en visceraal eiwit, anorexia (d.w.z. verlies van eetlust), verminderde opname van voedsel/calorieën, chronische misselijkheid, vermoeidheid en zwakte. Voor behandeling van anorexia nervosa omvatten voordelige of gewenste geneeskundige 25 resultaten, maar zijn niet beperkt tot, één of meer van de volgende: verbetering van eetlust, verminderen van afkeer van voedsel, toename van gewicht, het aanhouden van normale status van voeding, hydratatie en balans van elektrolyten, het aanhouden van een normaal lichaamsgewicht voor de leeftijd en lengte, het verlagen van de frequentie en duur van opname in ziekenhuizen en het verlagen van het risico om te overlijden. 30 Voor behandeling van opioïde-geïnduceerd braken omvatten voordelige of gewenste geneeskundige resultaten, maar zijn niet beperkt tot, het verminderen van de ernst en/of het verkorten van de duur van de misselijkheid en/of het overgeven, waardoor de volle- 11 dige geneeskundige voordelen van verlichting van opioïde-geïnduceerde pijn mogelijk wordt gemaakt.
Het “verbeteren” van een ziekte of één of meer symptomen van de ziekte betekent een vermindering of verbetering van één of meer symptomen die met de ziekte 5 zijn geassocieerd in vergelijking met het niet toedienen van een trkB-agonist. “Verbeteren” omvat ook het verkorten of de verlagen van de duur van een symptoom.
Het “verminderen van het voorkomen” van een ziekte betekent elk van het verminderen van de ernst (die het verlagen van de noodzaak voor en/of hoeveelheid van (bijvoorbeeld blootstelling aan) andere geneesmiddelen en/of therapieën die in het al-10 gemeen voor deze aandoening worden gebruikt omvat), duur en/of frequentie (waaronder bijvoorbeeld het vertragen of verlengen van de tijd voor de volgende episodische aanval bij een individu). Zoals voor de deskundigen in het vakgebied bekend is kunnen individuen variëren in termen van hun reactie op behandeling en als zodanig weerspiegelt bijvoorbeeld een werkwijze voor het verlagen van het voorkomen van een ziekte 15 bij een individu het toedienen van de trkB-agonist op basis van een redelijke verwach ting dat een dergelijke toediening aannemelijk een dergelijke verlaging van het voorkomen bij dat specifieke individu zou kunnen veroorzaken.
Zoals hierin wordt gebruikt betekend het “vertragen” van de ontwikkeling van een ziekte het uitstellen, het verhinderen, het vertragen, het tegenhouden, het stabilise-20 ren en/of het langer uitblijven van de voortgang van de ziekte. Deze vertraging kan gedurende variërende tijdsduur zijn afhankelijk van de geschiedenis van de ziekte en/of de individuen die worden behandeld. Zoals voor de deskundige in het vakgebied duidelijk is kan een voldoende of aanzienlijke vertraging in feite het voorkomen omvatten doordat het individu niet de ziekte (bijvoorbeeld cachexie, anorexia nervosa en opioïde-25 geïnduceerd braken) ontwikkeld. Een werkwijze die ontwikkeling van het symptoom “vertraagd” is een werkwijze die de waarschijnlijkheid van het ontwikkelen van het symptoom in een bepaald tijdskader verlaagt en/of de mate van de symptomen in een bepaald tijdskader verlaagt in vergelijking met het niet gebruiken van de werkwijze. Dergelijke vergelijkingen zijn kenmerkend op klinische studies gebaseerd door het ge-30 bruik van een statistisch significant aantal van patiënten.
“Ontwikkeling” of “voortgang” van een ziekte betekent initiële tekens en/of voortvloeiende voortgang van de stoornis. Ontwikkeling van een ziekte kan detecteerbaar zijn en worden vastgesteld door het gebruik van standaard klinische technieken die 12 in het vakgebied goed bekend zijn. Ontwikkeling kan echter ook verwijzen naar voortgang die niet detecteerbaar is. Voor het doel van deze uitvinding verwijzen ontwikkeling of voorgang naar het biologische verloop van de symptomen. “Ontwikkeling” omvat voorkomen, terugkeer en begin. Zoals hierin wordt gebruikt omvat het “begin” of 5 “voorkomen” van een ziekte het initiële begin en/of terugkeer.
Zoals hierin wordt gebruikt is een “effectieve dosering” of “effectieve hoeveelheid” van geneesmiddel, verbinding of farmaceutisch preparaat een hoeveelheid die voldoende is om voordelige of gewenste resultaten te bewerkstelligen. Voor profylactisch gebruik omvatten voordelige of gewenste resultaten, resultaten zoals het uitsluiten 10 of verlagen van het risico, het verminderen van de ernst of het vertragen van het begin van de ziekte, waaronder biochemische symptomen, histologische symptomen en/of symptomen van gedrag van de ziekte, de complicaties en intermediaire pathologische fenotypen die gedurende de ontwikkeling van de ziekte worden getoond. Voor therapeutisch gebruik omvatten voordelige of gewenste resultaten klinische resultaten zoals 15 het verlagen van de intensiteit, duur of frequentie van een aanval van de ziekte en het verminderen van één of meer van de symptomen die van de ziekte resulteren (biochemisch, histologisch en/of met betrekking tot gedrag) waaronder de complicaties ervan en intermediaire pathologische fenotypen die gedurende de ontwikkeling van de ziekte worden getoond, het verhogen van de kwaliteit van het leven van die personen die aan 20 de ziekte lijden, het verlagen van de dosis van andere geneesmiddelen die nodig zijn om de ziekte te behandelen, het verhogen van het effect van een ander geneesmiddel en/of het vertragen van de voortgang van de ziekte van patiënten. Een effectieve dosering kan in één of meer toedieningen worden toegediend. Voor doelen van deze uitvinding is een effectieve dosering van geneesmiddel, verbinding of farmaceutisch prepa-25 raat een hoeveelheid die voldoende is om profylactische of therapeutische behandeling ofwel direct of indirect uit te voeren. Zoals in de geneeskundige samenhang duidelijk is kan een effectieve dosering van een geneesmiddel, verbinding of farmaceutisch preparaat wel of niet in samenhang met een ander geneesmiddel, verbinding of farmaceutisch preparaat worden verkregen. Een “effectieve dosering” kan aldus worden beschouwd in 30 de samenhang van het toedienen van één of meer therapeutische middelen en een enkel middel kan worden beschouwd bij een effectieve hoeveelheid te worden gegeven indien in samenhang met één of meer andere middelen een gewenst resultaat kan worden of wordt verkregen.
13
Een “individu” of een “patiënt” is een zoogdier met meer voorkeur een mens. Zoogdieren omvatten ook, maar zijn niet beperkt tot, boerderijdieren, sportdieren, huisdieren, primaten (waaronder mensen), paarden, honden, katten, muizen en ratten.
Een “trkB-agonist” verwijst naar een middel dat in staat is te binden en tot het ac-5 tiveren van een trkB-receptor en/of stroomafwaartse route(s) die door de signalerende functie van trkB worden bemiddeld. De agonist kan bijvoorbeeld aan het extracellulaire domein van de trkB-receptor binden en daardoor dimerisatie van de receptor veroorzaken dat in activatie van het intracellulaire katalytische kinasedomein resulteert. Als gevolg kan dit resulteren in de stimulatie van groei en/of differentiatie van cellen die de 10 receptor tot expressie brengen in vitro en/of in vivo. In sommige uitvoeringsvormen bindt een trkB-agonist aan trkB en activeert een biologische activiteit van trkB.
“Biologische activiteit” verwijst, wanneer het in samenhang met de trkB-agonist van de onderhavige uitvinding wordt gebruikt, in het algemeen naar het hebben van het vermogen om te binden aan en het activeren van de trkB-receptor en/of een stroomaf-15 waartse route die door de trkB-signalerende functie wordt bemiddeld. Zoals hierin wordt gebruikt omvat “biologische activiteit” één of meer effectorfuncties die algemeen zijn met die welke worden geïnduceerd door werking van NT-4/5 en/of BDNF, het natieve ligand van trkB, op een cel die trkB tot expressie brengt. Zonder beperking omvat biologische activiteiten één of meer van de volgende: het vermogen van het bin-20 den aan en het activeren van trkB; het vermogen om dimerisatie van de trkB-receptor te bevorderen; het vermogen van het bevorderen van de ontwikkeling, overleving, functie, onderhoud en/of regeneratie van cellen (waaronder beschadigde cellen), in het bijzonder neuronen in vitro en in vivo, waaronder perifere (sympathische, sensorische, motorische en enterogene) neuronen en centrale (hersenen en ruggenmerg) neuronen en 25 niet/neuronale cellen, bijvoorbeeld leukocyten van perifeer bloed, endotheelcellen en vasculaire gladde spiercellen. Een biologische activiteit die in het bijzonder van voorkeur is, is het vermogen om het lichaamsgewicht en/of voedselopname bij een primaat te verhogen wanneer het perifeer wordt toegediend, voor het behandelen (waaronder het voorkomen) van één of meer symptomen van cachexie en anorexia nervosa bij een 30 primaat en/of voor het behandelen (waaronder het voorkomen) van één of meer symptomen van opioïde/geïnduceerd braken bij een zoogdier.
Een “agonist anti-trkB-antilichaam” (onderling uitwisselbaar “anti-trkB-agonist antilichaam” genoemd) verwijst naar een antilichaam dat in staat is te binden aan en het 14 activeren van een trkB-receptor en/of stroomafwaartse route(s) die door de signalerende functie van trkB worden bemiddeld. Het agonist-antilichaam kan bijvoorbeeld aan het extracellulaire domein van een trkB-receptor binden en daardoor dimerisatie van de receptor veroorzaken dat in activering van het intracellulaire katalytische kinase-5 domein resulteert. Als gevolg kan dit resulteren in de stimulatie van groei en/of differentiatie van cellen die de receptor tot expressie brengen in vitro en in vivo. In sommige uitvoeringsvormen bindt een agonist anti-trkB-antilichaam aan trkB en activeert een biologische activiteit van trkB.
Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “perifere toediening” of “perifeer toege-10 diend” naar het introduceren van een middel in een patiënt buiten het centrale zenuwstelsel (CNS) of bloed-hersen barrière (BBB). Perifere toediening omvat elke route van toediening die anders is dan directe toediening aan het ruggenmerg of hersenen. Perifere toediening kan lokaal of systemisch zijn.
Een “antilichaam” is een immunoglobulinemolecuul dat in staat is specifiek te 15 binden aan een doelwit zoals een koolhydraat, polynucleotide, lipide, polypeptide, enzovoort, door middel van tenminste één antigeen-herkenningsplaats die is gelokaliseerd in het variabele gebied van het immunoglobulinemolecuul. Zoals hierin wordt gebruikt omvat de term niet alleen intacte polyklonale of monoklonale antilichamen maar ook fragmenten daarvan (zoals Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), enkele keten (“single chain”; ScFv), 20 mutanten daarvan, fusie-eiwitten die een antilichaamdeel omvatten (zoals domein-antilichamen) en elke andere gemodificeerde configuratie van het immunoglobulinemolecuul dat een antigeen-herkenningsplaats omvat. Een antilichaam omvat een antilichaam van elke klasse zoals IgG, IgA, of IgM (of subklasse daarvan) en het antilichaam hoeft niet van een specifieke klasse te zijn. Afhankelijk van de aminozuurse-25 quentie van het constante domein van de zware ketens van het antilichaam kunnen im-munoglobulinen naar verschillende klassen worden toegewezen. Er zijn vijf voorname klassen van immunoglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG en IgM en verscheidene van deze kunnen verder worden verdeeld in subklassen (isotypen) bijvoorbeeld, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl en IgA2. De constante domeinen van de zware keten die overeenko-30 men met de verschillende klassen van immunoglobulinen worden respectievelijk alfa, delta, epsilon, gamma en mu genoemd. De subeenheid-structuren en driedimensionale configuraties van verschillende klassen van immunoglobulinen zijn goed bekend.
15
Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “monoklonaal antilichaam” naar een antilichaam dat wordt verkregen van een populatie van nagenoeg homogene antilichamen, d.w.z. de afzonderlijke antilichamen die de populatie omvatten zijn identiek behalve mogelijke natuurlijk-voorkomende mutaties die in kleine hoeveelheden aanwezig kun-5 nen zijn. Monoklonale antilichamen zijn zeer specifiek, waarbij ze naar een enkele an-tigene plaats worden gestuurd. In tegenstelling tot preparaten van polyklonale antilichamen die kenmerkend verschillende antilichamen omvatten die tegen verschillende determinanten (epitopen) zijn gericht, is elk monoklonaal antilichaam tegen een enkele determinant van het antigeen gericht. De bepaling “monoklonaal” geeft het kenmerk 10 van het antilichaam als te zijn verkregen van een nagenoeg homogene populatie van antilichamen en moet niet worden beschouwd als het vereisen van de productie van het antilichaam door een specifieke werkwijze. De monoklonale antilichamen die in overeenstemming met de onderhavige uitvinding moeten worden gebruikt kunnen bijvoorbeeld worden gemaakt door de hybridoma-werkwijze die voor het eerst is beschreven 15 door Kohier en Milstein, 1975, Nature, 256:495, of kunnen worden gemaakt door re-combinante DNA-werkwijzen zoals is beschreven in Amerikaans octrooischriftnummer 4.816.567. De monoklonale antilichamen kunnen ook worden geïsoleerd van faagbibli-otheken die zijn gegenereerd door het gebruik van de technieken die bijvoorbeeld zijn beschreven in McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554.
20 Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “gehumaniseerde” antilichamen naar vormen van niet-humane (bijvoorbeeld van muis) antilichamen die specifieke chimere immu-noglobulinen, immunoglobuline-ketens of fragmenten daarvan (zoals Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 of andere antigeen-bindende subsequenties van antilichamen) zijn, die minimale sequentie bevatten die afkomstig is van niet-humane immunoglobuline. Voor het 25 grootste deel zijn gehumaniseerde antilichamen humane immunoglobulinen (ontvangende antilichaam) waarin residuen van een complementariteitsbepalend gebied (CDR) van de ontvanger zijn vervangen door residuen van een CDR van een niet-humane soort (donor antilichaam) zoals muis, rat of konijn die de gewenste specificiteit, affiniteit en biologische activiteit heeft. In sommige gevallen zijn residuen van het Fv-30 skeletgebied (FR) van het humane immunoglobuline vervangen door overeenkomstige niet-humane residuen. Het gehumaniseerde antilichaam kan bovendien residuen omvatten die noch in het ontvangende antilichaam noch in de geïmporteerde CDR of skelet-sequenties worden gevonden, maar zijn opgenomen om de werking van het antilichaam 16 verder te verbeteren en te optimaliseren. Het gehumaniseerde antilichaam zal in het algemeen nagenoeg de gehele van tenminste één en kenmerkend twee variabele domeinen omvatten, waarbij de gehele of nagenoeg de gehele CDR-gebieden overeenkomen met die van een niet-humaan immunoglobuline en de gehele of nagenoeg de gehele FR-5 gebieden zijn die van een consensus sequentie van een humaan immunoglobuline zijn. Het gehumaniseerde antilichaam zal op optimale wijze ook tenminste een deel van een constant gebied of domein (Fc) van een immunoglobuline omvatten, kenmerkend dat van een humaan immunoglobuline. Antilichamen kunnen Fc-gebieden gemodificeerd hebben zoals is beschreven in WO 99/58572. Andere vormen van gehumaniseerde anti-10 lichamen hebben één of meer CDR’s (één, twee, drie, vier, vijf, zes) die met betrekking tot het oorspronkelijke antilichaam zijn veranderd die ook één of meer CDR’s “afkomstig van” één of meer CDR’s van het oorspronkelijke antilichaam worden genoemd.
Zoals hierin wordt gebruikt betekent “humaan antilichaam” een antilichaam dat een aminozuursequentie heeft die overeenkomt met die van een antilichaam dat door 15 een mens wordt geproduceerd en/of is gemaakt door het gebruik van elk van de technieken voor het maken van humane antilichamen die in het vakgebied bekend zijn of hierin zijn beschreven. Deze definitie van een humaan antilichaam omvat antilichamen die tenminste één polypeptide van een humane zware keten of tenminste één polypeptide van een humane lichte keten omvatten. Eén dergelijk voorbeeld is een antilichaam 20 dat polypeptiden van de lichte keten van muis en de humane zware keten omvat. Humane antilichamen kunnen worden geproduceerd door het gebruik van verscheidene technieken die in het vakgebied bekend zijn. In één uitvoeringsvorm is het humane antilichaam gekozen uit een faag-bibliotheek, waarbij die faagbibliotheek humane antilichamen tot expressie brengt (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-25 314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom en Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humane antilichamen kunnen ook worden gemaakt door het introduceren van humane immunoglobuline loei in transgene dieren, bijvoorbeeld muizen waarin de endogene immunoglobuline-genen gedeeltelijk of volledig zijn geïnactiveerd. Deze benaderingswijze is beschreven 30 in de Amerikaanse octrooischriftnummers 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; en 5.661.016. Als alternatief kan het humane antilichaam worden bereid door het onsterfelijk maken van humane B-lymfocyten die een antilichaam produceren dat tegen een doelwitantigeen is gericht (dergelijke B-lymfocyten kunnen worden te- 17 ruggewonnen van een individu of kunnen in vitro zijn geïmmuniseerd). Zie bijvoorbeeld Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, biz. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; en Amerikaans octrooischrift-nummer 5.750.373.
5 Een “variabel gebied” van een antilichaam verwijst naar het variabele gebied van de lichte keten van het antilichaam of het variabele gebied van de zware keten van het antilichaam ofwel alleen of in combinatie. De variabele gebieden van de zware en lichte keten bestaan elk uit vier skeletgebieden (FR) die zijn verbonden door drie comple-mentariteitsbepalende gebieden (CDR’s) die ook bekend zijn als hypervariabele gebie-10 den. De CDR’s in elke keten worden in nauwe samenhang tezamen gehouden door de FR’s en met de CDR’s van de andere keten dragen ze bij aan de vorming van de anti-geen-bindende plaats van antilichamen. Er zijn tenminste twee technieken voor het bepalen van CDR’s: (1) een benaderingswijze die is gebaseerd op variabiliteit van de sequentie tussen soorten (d.w.z. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological 15 Interest, (5de editie, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); en (2) een benaderingswijze die is gebaseerd op studies van kristallografie van antigeen-antilichaam complexen (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Zoals hierin wordt gebruikt kan een CDR verwijzen naar CDR’s die door één van de benaderingswijzen is gedefinieerd of door een combinatie van beide benaderingswijzen.
20 Een “constant gebied” van een antilichaam verwijst naar het constante gebied van de lichte keten van het antilichaam of het constante gebied van de zware keten van het antilichaam, ofwel alleen of in combinatie.
Een epitoop dat “bij voorkeur bindt” of “specifiek bindt” (wordt hierin onderling uitwisselbaar gebruikt) aan een antilichaam of een polypeptide is een term die in het 25 vakgebied goed duidelijk is en werkwijzen voor het bepalen van een dergelijke specifieke of preferentiële binding zijn in het vakgebied ook goed bekend. Een molecuul wordt gezegd “specifieke binding” of “preferentiële binding” te vertonen indien het meer frequent, sneller, gedurende langere tijd en/of met hogere affiniteit reageert of associeert met een specifieke cel of stof dan het met alternatieve cellen of stoffen doet. 30 Een antilichaam “bindt specifiek” of “bindt met voorkeur” aan een doelwit indien het met hogere affiniteit, aviditeit, sneller en/of gedurende langere tijd aan een doelwit bindt dan dat het aan andere stoffen bindt. Een antilichaam dat specifiek of preferentieel aan een trkB-epitoop bindt is bijvoorbeeld een antilichaam dat dit epitoop met hoge- 18 re affiniteit, aviditeit, sneller en/of gedurende langere tijd bindt dan dat het andere trkB-epitopen of niet-trkB-epitopen bindt. Het is bij het lezen van deze definitie ook duidelijk dat een antilichaam (of groep of epitoop) dat specifiek of preferentieel aan een eerste doelwit bindt bijvoorbeeld wel of niet specifiek of preferentieel aan een tweede 5 doelwit kan binden. Als zodanig vereist “specifieke binding”, of “preferentiële binding” niet noodzakelijkerwijs (alhoewel het deze kan omvatten) exclusieve binding. In het algemeen, maar niet noodzakelijkerwijs, betekent verwijzing naar binding preferentiële binding.
De term “Fc-gebied” wordt gebruikt om een C-eindstandig gebied van een zware 10 keten van een immunoglobuline te definiëren. Het “Fc-gebied” kan een Fc-gebied van een natieve sequentie of een variante Fc-gebied zijn. Alhoewel de grenzen van het Fc-gebied van een zware keten van een immunoglobuline kunnen variëren, wordt het Fc-gebied van de zware keten van humaan IgG gewoonlijk gedefinieerd zich uit te strekken van aminozuurresidu op positie Cys226 of van Pro230 tot het carboxyl-uiteinde 15 daarvan. De nummering van de residuen in het Fc-gebied is die van de EU-index zoals in Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5de editie Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Het Fc-gebied van een immunoglobuline omvat in het algemeen twee constante domeinen CH2 en CH3.
Zoals hierin wordt gebruikt beschrijft “Fc-receptor” en “FcR” een receptor die 20 aan het Fc-gebied van een antilichaam bindt. De FcR die van voorkeur is, is een humane FcR met natieve sequentie. Een FcR die van voorkeur is, is bovendien één die een IgG-antilichaam bindt (een ganuna-receptor) en omvat receptoren van de subklassen FcyRI, FcyRII, FcyRIII en FcyRIV, waaronder allelische varianten en alternatief gesplitste vormen van deze receptoren. FcyRII-receptoren omvatten FcyRIIA (een “acti-25 verende receptor”) en FcyRIIB (een “remmende receptor”), die overeen-komstige ami-nozuursequenties hebben die voornamelijk verschillen in de cyto-plasmatische domeinen daarvan. FcR’s zijn samengevat in Ravetch en Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41; Nimmeijahn et al., 2005, Immunity 23:2-4. “FcR” omvat ook 30 de neonatale receptor, FcRn, die verantwoordelijk is voor de overdracht van IgG’s van de moeder vaar de foetus (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; en Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
19 “Complement-afhankelijke cytotoxiciteit” en “CDC” verwijzen naar de lysering van een doelwit in de aanwezigheid van complement. De complement-activatie route wordt geïnitieerd door de binding van het eerste complement van het complementsys-teem (Clq) aan een molecuul (bijvoorbeeld een antilichaam) dat met een verwant anti-5 geen is gecomplexeerd. Voor het bepalen van complement-activatie kan een CDC-test, bijvoorbeeld zoals is beschreven in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), worden uitgevoerd.
Een “functioneel Fc-gebied” bezit tenminste één effectorfunctie van een Fc-gebied met een natieve sequentie. Illustratieve “effectorfïincties” omvatten Clq-bining; 10 complement-afhankelijke cytotoxiciteit (CDC); binding van de Fc-receptor; antili-chaam-afhankelijke cel-bemiddelde cytotoxiciteit (ADCC); fagocytose; neerwaartse regulatie van receptoren van het celoppervlak (bijvoorbeeld B-cel receptor; BCR), enzovoort. Dergelijke effectorfuncties vereisen in het algemeen dat het Fc-gebied wordt gecombineerd met een bindend domein (bijvoorbeeld een variabel domein van een anti-15 lichaam) en kan worden bepaald door het gebruik van verscheidene testen die in het vakgebied bekend zijn voor het beoordelen van dergelijke effectorfuncties van antili-chamen.
Een “Fc-gebied met de natieve sequentie” omvat een aminozuursequentie die identiek is aan de aminozuursequentie van een Fc-gebied die in de natuur wordt gevon-20 den. Een “variante Fc-gebied” omvat een aminozuursequentie die van de sequentie van een Fc-gebied met de natieve sequentie verschilt bij wijze van tenminste één modificatie van aminozuur, maar toch tenminste één effectorfunctie van het Fc-gebied met de natieve sequentie heeft behouden. Het variante Fc-gebied heeft bij voorkeur tenminste één aminozuursubstitutie in vergelijking met een Fc-gebied met de natieve sequentie of 25 met het Fc-gebied van een ouderlijk polypeptide, bijvoorbeeld van ongeveer één tot ongeveer tien aminozuursubstituties en bij voorkeur van ongeveer één tot ongeveer vijf aminozuursubstituties in een Fc-gebied met de natieve sequentie of in het Fc-gebied van het ouderlijke polypeptide. Het variante Fc-gebied dat hierin wordt gebruikt zal bij voorkeur tenminste ongeveer 80% sequentie-overeenkomst met een Fc-gebied met de 30 natieve sequentie en/of een Fc-gebied van een ouderlijk polypeptide bezitten en met meeste voorkeur tenminste ongeveer 90% sequentie-overeenkomst daarmee, met meer voorkeur tenminste ongeveer 95%, tenminste ongeveer 96%, tenminste ongeveer 97%, tenminste ongeveer 98%, tenminste ongeveer 99% sequentie-overeenkomst daarmee.
20
Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “antilichaam-afhankelijke cel-bemiddelde cytotoxiciteit” en “ADCC” naar een cel-bemiddelde reactie waarbij niet-specifieke cy-totoxische cellen die Fc-receptoren (FcR’s) tot expressie brengen (bijvoorbeeld natuurlijke killer (NK) cellen, neutrofielen en macrofagen) gebonden antilichaam op een 5 doelwitcel herkennen en daaropvolgend lysis van de doelwitcel veroorzaken. ADCC-activiteit van een molecuul van belang kan worden bepaald door het gebruik van een in vitro ADCC-test zoals die welke is beschreven in Amerikaanse octrooischriftnummers 5.500.362 of 5.821.337. Bruikbare effectorcellen voor dergelijke testen omvatten mo-nonucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC) en NK-cellen. Als alternatief of in aan-10 vulling kan ADCC-activiteit van het molecuul van belang in vivo worden bepaald, bijvoorbeeld in een dierlijk model zoals die welke is beschreven in Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
Zoals hierin wordt gebruikt omvat “farmaceutisch aanvaardbare drager” of “farmaceutisch aanvaardbare excipiënt” elk materiaal dat, wanneer het met een actief be-15 standdeel wordt gecombineerd het mogelijk maakt dat het bestanddeel de biologische activiteit behoudt en niet-reactief is met het immuunsysteem van de patiënt. Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot elk van de standaard farmaceutische dragers zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing, water, emulsies zoals een emulsie van olie/-water en verscheidene soorten van bevochtigende middelen. Verdunningsmiddelen die 20 van voorkeur zijn voor een aerosol of parenterale toediening zijn fosfaat-gebufferde zoutoplossing of normale (0,9%) zoutoplossing. Preparaten die dergelijke dragers omvatten worden bereid door goed bekende gebruikelijke werkwijzen (zie bijvoorbeeld Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18de editie, A. Gennaro, redacteur, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 25 20s,e editie Mack Publishing, 2000).
De termen “polypeptide”, “oligopeptide”, “peptide” en “eiwit” worden hierin onderling uitwisselbaar gebruikt om te verwijzen naar polymeren van aminozuren met elke lengte. Het polymeer kan lineair of vertakt zijn, het kan gemodificeerde aminozuren omvatten en het kan onderbroken zijn door niet-aminozuren. De termen omvatten 30 ook een polymeer van aminozuren dat van nature of door tussenkomst is gemodificeerd; bijvoorbeeld vorming van disulfidebindingen, glycosylatie, lipidatie, acetylatie, fosforylatie of elke andere behandeling of modificatie zoals conjugatie met een merkend bestanddeel. Ook in de definitie opgenomen zijn bijvoorbeeld polypeptiden die 21 één of meer analoga van een aminozuur bevatten (waaronder bijvoorbeeld nietnatuurlijke aminozuren, enzovoort) alsook andere modificaties die in het vakgebied bekend zijn. Het is duidelijk dat, omdat de polypeptiden van deze uitvinding op een antilichaam zijn gebaseerd, de polypeptiden als enkele ketens of geassocieerde ketens 5 kunnen voorkomen.
“Polynucleotide” of “nucleïnezuur” zoals hierin onderling uitwisselbaar wordt gebruikt, verwijst naar polymeren van nucleotiden met elke lengte en omvat DNA en RNA. De nucleotiden kunnen deoxyribonucleotiden, ribonucleotiden, gemodificeerde nucleotiden of basen en/of de analogen ervan zijn of elk substraat dat in een polymeer 10 kan worden geïncorporeerd door DNA- of RNA-polymerase. Een polynucleotide kan gemodificeerde nucleotiden, zoals gemethyleerde nucleotiden en de analoga ervan omvatten. Indien aanwezig kan voorafgaand of na verzameling van het polymeer de modificatie aan de nucleotidestructuur worden verleend. De sequentie van nucleotiden kan worden onderbroken door bestanddelen die geen nucleotiden zijn. Een polynucleotide 15 kan verder na polymerisatie worden gemodificeerd, zoals door conjugatie met een mer kend bestanddeel. Andere soorten van modificaties omvatten bijvoorbeeld “caps”, substitutie van één of meer van de natuurlijk-voorkomende nucleotiden met een analoog, intemucleotide-modificaties zoals bijvoorbeeld die met ongeladen koppelingen (bijvoorbeeld methylfosfonaten, fosfotriesters, fosfoamidaten, carbamaten, enzovoort) en 20 met geladen koppelingen (bijvoorbeeld fosforothioaten, fosforodithioaten, enzovoort), die welke aanhangende groepen bevatten, zoals bijvoorbeeld eiwitten (bijvoorbeeld nucleasen, toxinen, antilichamen, signaalpeptiden, ply-L-lysine, enzovoort), die met intercalerende middelen (bijvoorbeeld acridine, psoraleen, enzovoort), die welke chele-rende middelen bevatten (bijvoorbeeld, metalen, 25 radioactieve metalen, boor, oxidatieve metalen), die welke alkylerende middelen bevatten, die met gemodiceerde koppeling (bijvoorbeeld alfa anomere nucleïnezuren, enzovoort), alsook niet-gemodificeerde vormen van de polynucleotide(n). Verder kunnen elk van de hydroxylgroepen die gewoonlijk aanwezig zijn in de suikers worden vervangen door bijvoorbeeld fosfonaatgroepen, beschermd door standaard beschermende 30 groepen of geactiveerd voor het bereiden van aanvullende koppelingen aan aanvullende nucleotiden of kunnen aan vaste dragers worden geconjugeerd. De 5’- en 3’-eindstandige OH kan worden gefosforyleerd of gesubstitueerd met aminen of organische bedekkende groepen van 1 tot 20 koolstofatomen. Andere hydroxyls kunnen ook 22 worden gederivatiseerd naar standaard beschermende groepen. Polynucleotiden kunnen ook analoge vormen van ribose- of deoxyribose-suikers die in het vakgebied algemeen bekend zijn bevatten waaronder bijvoorbeeld 2’-0-methyl-, 2’-0-allyl, 2’-fluor- of 2’-azido-ribose, carbocyclische suiker analoga, D-anomerische suikers, epimerische sui-5 kers zoals arabinose, xylosen of lyxosen, pyranose-suikers, furanose-suikers, sedohep-tulosen, acyclische analoga en abasische nucleoside-analoga zoals methylriboside. Eén of meer fosfodiester-koppelingen kunnen worden vervangen door alternatieve koppelende groepen. Deze alternatieve koppelende groepen omvatten maar zijn niet beperkt tot uitvoeringsvormen waarbij fosfaat is vervangen door P(0)S(“thioaat”), P(S)S 10 (“dithioaat”), (0)NR2 (“amidaat”), P(0)R, P(0)0R’, CO of CH2 (“foimacetaal”), waarbij elke R of R’ onafhankelijk H of gesubstitueerd of niet-gesubstueerd alkyl (1-20 C) is die eventueel een ether (-0-) koppeling, aryl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl of araldyl bevat. Het is niet nodig dat alle koppelingen in een polynucleotide identiek zijn. De voorgaande beschrijving is van toepassing op alle polynucleotiden waarnaar hierin 15 wordt verwezen waaronder RNA en DNA.
Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “nagenoeg zuiver” naar materiaal dat tenminste 50% zuiver (d.w.z. vrij van verontreinigingen), met meer voorkeur tenminste 90% zuiver, met meer voorkeur tenminste 95% zuiver, met meer voorkeur tenminste 98% zuiver, met meer voorkeur tenminste 99% zuiver is.
20 Een “gastheercel” omvat een afzonderlijke cel of celkweek die een ontvanger voor vector(en) voor incorporatie van polynucleotide-inserts kan zijn of is geweest. Gastheercellen omvatten het nageslacht van een enkele gastheercel en het nageslacht hoeft niet noodzakelijkerwijs volledig identiek zijn (in morfologie of in genoom DNA complement) aan de oorspronkelijke ouderlijke cel door natuurlijke, toevallige of op-25 zettelijke mutatie. Een gastheercel omvat cellen die in vivo zijn getransfecteerd met een polynucleotide(n) van deze uitvinding.
Zoals hierin wordt gebruikt betekent “vector” een construct dat in staat is één of meer gen(en) of sequentie(s) van belang aan een gastheercel af te leveren en bij voorkeur ze tot expressie te brengen. Voorbeelden van vectoren omvatten, maar zijn niet 30 beperkt tot virale vectoren, expressievectoren van kaal DNA of RNA, plasmide, cosmi-de of faagvectoren, DNA- of RNA-expressievectoren die zijn geassocieerd met kationi-sche condenserende middelen, DNA- of RNA-expressievectoren die in liposomen zijn ingekapseld en bepaalde eukaryote cellen zoals producerende cellen.
23
Zoals hierin wordt gebruikt betekent “expressie regulerende sequentie” een nu-cleïnezuursequentie die transcriptie van een nucleïnezuur aanstuurt. Een expressie regulerende sequentie kan een promoter zijn, zoals een constitutieve of een induceerbare promoter of een versterker. De expressie-regulerende sequentie is functioneel gekop-5 peld aan de nucleïnezuursequentie die getranscribeerd dient te worden.
De term “kon” zoals hierin wordt gebruikt wordt bedoeld te verwijzen naar de snelheidsconstante voor associatie van een antilichaam aan een antigeen.
De term “koff” zoals hierin wordt gebruikt wordt bedoeld te verwijzen naar de snelheidsconstante voor dissociatie van een antilichaam van een complex van antili-10 chaam/antigeen.
De term “Kd” zoals hierin wordt gebruikt wordt bedoeld te verwijzen naar de evenwichtsdissociatieconstante van een interactie van antilichaam-antigeen.
Zoals hierin wordt gebruikt omvat de enkelvoudige vorm “een”, “het” en “de·’ verwijzingen in het meervoud tenzij anders wordt aangegeven.
15 III. Werkwijzen van de uitvinding
De onderhavige uitvinding omvat werkwijzen voor het verhogen van het lichaamsgewicht en/of voedselopname door perifere toediening van een trkB-agonist. 20 Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het behandelen of voorkomen van ongewenst gewichtsverlies (zoals cachexie) en eetstoornissen (zoals anorexia nervosa) bij primaten en opioïde-geïnduceerd braken bij zoogdieren. De werkwijzen omvatten perifere toediening van een effectieve hoeveelheid van één of meer trkB-agonisten aan een individu dat daar behoefte aan heeft (verscheidene indicaties en aspecten zijn hierin 25 beschreven).
Met betrekking tot alle werkwijzen die hierin zijn beschreven omvat verwijzing naar trkB-agonisten ook preparaten die één of meer van deze middelen omvatten. Deze preparaten kunnen verder geschikte excipiënten omvatten zoals farmaceutisch aanvaardbare excipiënten waaronder buffers die in het vakgebied goed bekend zijn. De 30 onderhavige uitvinding kan alleen of in combinatie met andere gebruikelijke werkwijzen van behandeling worden gebruikt.
Cachexie die kan worden behandeld en/of worden voorkomen door de werkwijzen die hierin zijn beschreven kan worden veroorzaakt en/of zijn geassocieerd met één 24 of meer van de volgende: chronische obstructieve pulmonale ziekte (COPD), chronische nierziekte (CKD), chronisch hartfalen (CHF), veroudering, kanker en AIDS. In sommige uitvoeringsvormen hebben de humane patiënten die cachexie behandeld hebben een Body Mass Index (BMI, berekend als lichaamsgewicht per lengte in vierkante 5 meters (kg/m )) van lager dan ongeveer één van 25,0 kg/m , 24,0 kg/m , 23,0 kg/m , 22,0 kg/m2, 21,0 kg/m2, 20,0 kg/m2, 19,0 kg/m2 en 18,5 kg/m2. In sommige uitvoeringsvormen hebben de humane patiënten die behandelde cachexie hebben een dagelijkse voedselopname van lager dan ongeveer 90%, ongeveer 80%, ongeveer 70%, ongeveer 60%, ongeveer 50%, ongeveer 40%, ongeveer 30%, ongeveer 20%, of ongeveer 10 10% van het normale aanbevolen dagelijkse niveau van opname of premorbide niveau.
In sommige uitvoeringsvormen hebben de humane patiënten die anorexia nervosa behandeld hebben met de werkwijzen die hierin zijn beschreven een BMI van lager dan elk van ongeveer 18,5 kg/m2, 17,5 kg/m2 en 16,5 kg/m2. In sommige uitvoeringsvormen hebben de humane patiënten die anorexia nervosa behandeld hebben een dagelijk-15 se voedselopname van lager dan ongeveer 90%, ongeveer 80%, ongeveer 70%, ongeveer 60%, ongeveer 50%, ongeveer 40%, ongeveer 30%, ongeveer 20%, of ongeveer 10% van het normale aanbevolen dagelijkse niveau van opname of pre-morbide niveau.
De trkB-agonist wordt perifeer toegediend. Het is duidelijk dat alhoewel het middel perifeer wordt toegediend een klein percentage van het middel de bloed-hersen bar-20 rière kan passeren en in aflevering aan het centrale zenuwstelsel resulteert afhankelijk van de eigenschappen van het middel. In sommige uitvoeringsvormen krijgt minder dan elk van ongeveer 1%, ongeveer 0,5%, ongeveer 0,25% en ongeveer 0,1% van perifeer toegediende trkB-agonist (bijvoorbeeld trkB-agonist antilichaam) toegang tot het CNS.
25 De trkB-agonist kan aan een individu worden toegediend door middel van elke geschikte perifere route. Het zou voor een deskundige in het vakgebied duidelijk moeten zijn dat de voorbeelden die hierin zijn beschreven niet als beperkend bedoeld zijn maar als illustratief voor de technieken die beschikbaar zijn. Dienovereenkomstig wordt in sommige uitvoeringsvormen de trkB-agonist aan een individu toegediend in 30 overeenstemming met bekende werkwijzen zoals intraveneuze toediening, bijvoorbeeld als een bolus of door continue infusie gedurende een tijdsperiode, door intramusculaire, intraperitoneale, subcutane, intra-articulaire, sublinguale, intrasynoviale of door middel van insufïlatie, orale, inhalatie of topicale routes. Toediening kan systemisch zijn, bij- 25 voorbeeld intraveneuze toediening of gelokaliseerd zijn. In de handel verkrijgbare verstuivers voor vloeibare preparaten, waaronder aangedreven verstuivers en ultrasone verstuivers zijn bruikbaar voor toediening. Vloeibare preparaten kunnen op directe wijze worden verstoven en gevriesdroogd poeder kan na reconstitutie worden verstoven.
5 Als alternatief kan de trkB-agonist als een aërosol worden gevormd door het gebruik van een fluorkoolstof preparaat en een inhaleerinrichting voor een afgemeten dosis of worden geïnhaleerd als een gevriesdroogd en vermalen poeder.
Een trkB-agonist kan worden toegediend door middel van technieken van plaats-specifïeke of doelgerichte lokale aflevering buiten het CNS of de bloed-hersen barrière. 10 Voorbeelden van technieken van plaats-specifieke of doelgerichte locale aflevering omvatten verscheidene implanteerbare depotbronnen van de trkB-agonist of katheters met lokale aflevering, zoals infusie-katheters een verblijfskatheter of een naaldkatheter, synthetische transplantaten, omhulsel van adventitia, shunts en stents of andere implanteerbare inrichtingen, plaats-specifieke dragers, directe injectie of directe toediening. 15 Zie bijvoorbeeld PCT Publicatienummer WO 00/53211 en Amerikaans octrooischrift-nummer 5.981.568.
Verscheidene preparaten van trkB-agonisten kunnen voor toediening worden gebruikt. In sommige uitvoeringsvormen kan een trkB-agonist kaal worden toegediend. In andere uitvoeringsvormen worden een trkB-agonist en een farmaceutisch aanvaarbare 20 excipiënt toegediend en dit kan in verscheidene preparaten zijn. Farmaceutisch aanvaardbare excipiënten zijn in het vakgebied bekend en zijn betrekkelijk inerte stoffen die toediening van een farmacologisch effectieve stof bewerkstelligen. Een excipiënt kan bijvoorbeeld vorm of constitentie geven of als een verdunningsmiddel werken. Geschikte excipiënten omvatten, maar zijn niet beperkt tot stabiliserende middelen, 25 bevochtigende en emulgerende middelen, zouten voor het variëren van de osmolariteit, inkapselende middelen, buffers en huid-penetratie versterkende middelen. Excipiënten alsook preparaten voor parenterale en niet-parenterale aflevering van geneesmiddelen zijn uiteengezet in Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ste editie Mack Publishing (2000). Deze middelen worden in het algemeen bereid voor toediening door 30 injectie (bijvoorbeeld intraperitoneaal, intraveneus, subcutaan, intramusculair, enzovoort), alhoewel andere vormen van toediening (bijvoorbeeld oraal, mucosaal, trans-dermaal, inhalering, enzovoort) ook kunnen worden gebruikt.
26
De specifieke doseringstrategie, d.w.z. de dosis, tijdstip en herhaling, zal afhangen van het specifieke individu en die geneeskundige geschiedenis van dat individu, de specifieke ziekte (bijvoorbeeld cachexia, anorexia nervosa en opioïde-geïnduceerd braken) die behandelt dient te worden en de specifieke trkB-agonist. In het algemeen kan 5 elk van de volgende doses van trkB-agonist (bijvoorbeeld NT-4/5, BDNF en anti-trkB-agonist antilichaam) worden gebruikt: een dosis van tenminste ongeveer 50 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 20 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 10 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 5 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 3 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 2 mg/kg lichaamsgewicht; ten-10 minste ongeveer 1 mg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 750 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 500 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 250 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 100 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 50 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 10 pg/kg lichaamsgewicht; tenminste ongeveer 1 pg/kg lichaamsgewicht of meer wordt toegediend. Empirische 15 beschouwingen zoals de halfwaardetijd, zullen in het algemeen bijdragen aan de bepaling van de dosering. De behandeling wordt afhankelijk van de aandoening voor herhaalde toedieningen gedurende verscheidene dagen of langer, aangehouden totdat een gewenste onderdrukking van ziektesymptomen optreed of totdat voldoende therapeutische niveaus worden bereikt. Dosering van bijvoorbeeld één tot vijf keer per week 20 wordt bijvoorbeeld beschouwd. Andere doseringsstrategieën omvatten een strategie van tot 1 keer per dag, 1 tot 5 keer per week of minder veelvuldig. In sommige uitvoeringsvormen wordt de trkB-agonist ongeveer eenmaal per week, ongeveer 1 tot 4 keer per maand toegediend. Periodieke doseringsstrategie met wisselende doseringen met tussentijden van 2 dagen tot 7 dagen of zelfs 14 dagen kunnen worden gebruikt. In som-25 mige uitvoeringsvormen kan behandeling beginnen met een dagelijkse dosering en later naar wekelijkse en zelfs maandelijkse dosering veranderen. De voortgang van deze therapie wordt eenvoudig gevolgd door gebruikelijke technieken en testen.
Bij sommige individuen kan meer dan één dosis nodig zijn. Frequentie van toediening kan worden bepaald en worden aangepast gedurende het verloop van de thera-30 pie. Frequentie van toediening kan bijvoorbeeld worden bepaald en worden aangepast op basis van het soort en de ernst van de ziekte die behandeld dient te worden, of het middel preventief of voor therapeutische doeleinden wordt toegediend, de voorgaande therapie, de geneeskundige geschiedenis van de patiënt en de reactie op het middel en 27 de oordeelkundigheid van de begeleidende geneesheer. Kenmerkend zal de geneesheer een trkB-agonist toedienen totdat een dosering wordt bereikt die het gewenste resultaat bereikt. In sommige gevallen kunnen preparaten met aanhoudende continue afgifte van de trkB-agonist geschikt zijn. Verscheidene preparaten en inrichtingen voor het verkrij-5 gen van aanhoudende afgifte zijn in het vakgebied bekend. De trkB-agonist kan bijvoorbeeld worden toegediend door middel van een mechanische pomp of in een ma-trix-bed worden ingebed voor aanhoudende of trage afgifte.
In één uitvoeringsvorm kan de dosering van de trkB-agonist empirisch worden bepaald bij individuen die één of meer toedieningen hebben gekregen. Aan individuen 10 worden toenemende doseringen van de trkB-agonist gegeven. Om de werkzaamheid van de trkB-agonist te bepalen kunnen merkers van de toestand van de ziekte worden gevolgd. Het zal voor de deskundige in het vakgebied duidelijk zijn dat de dosering zal variëren afhankelijk van het individu, de fase van de ziekte (zoals cachexie, anorexia nervosa en opioïde-geïnduceerd braken) en de behandelingen die in het verleden zijn 15 gebruikt en de behandelingen die gelijktijdig worden gebruikt.
Toediening van de trkB-agonist in overeenstemming met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan continu of periodiek zijn afhankelijk van bijvoorbeeld de fysiologische conditie van de ontvanger, of het doel van de toediening therapeutisch of profylactisch is en andere factoren die bij de deskundige in het vakgebied bekend 20 zijn. De toediening van een trkB-agonist kan in wezen continu zijn gedurende een vooraf geselecteerde tijdsperiode of kan in een serie van gespreide doses zijn.
Andere preparaten omvatten geschikte vormen voor aflevering die in het vakgebied bekend zijn, waaronder maar niet beperkt tot dragers zoals liposomen. Zie bijvoorbeeld Mahato et al (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Liposomale preparaten omvat-25 ten, maar zijn niet beperkt tot, cytofectinen, multilamellaire vesicles en unilamellaire vesicles.
Bepaling van ziekte wordt uitgevoerd door het gebruik van standaard werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn, bijvoorbeeld door het volgen van de juiste merker(s). Voor cachexie kunnen bijvoorbeeld de volgende merkers worden gevolgd: lichaams-30 gewicht, plasma-albumine, lichaamsvet, lean body mass, vermoeidheid, zwakte en eetlust. Voor anorexia nervosa kunnen de volgende merkers worden gevolgd: lichaamsgewicht, eetlust en angst voor toename van lichaamsgewicht. Voor opioïde-geïndu- 28 ceerd braken kunnen de volgende merkers worden gebruikt: misselijkheid, overgeven, eetlust, lichaamsgewicht en andere geassocieerde geneeskundige complicaties.
IV. Preparaten en werkwijzen voor het maken van de preparaten 5
De werkwijzen van de uitvinding maken gebruik van een trkB-agonist, dat verwijst naar elk molecuul dat bindt aan en daardoor zorgt voor activering van een natieve trkB-receptor en/of stroomafwaartse routes die worden bemiddeld door de signalerende functie van trkB. De trkB-agonist omvat elk natief ligand van een trkB-receptor zoals 10 NT-4/5 en BDNF. De trkB-agonist omvat ook niet-natief ligand (bijvoorbeeld polypep- tiden, van peptide-afkomstige verbinding, cyclische van peptide-afkomstige of niet van peptide afkomstige moleculen) van een trkB-receptor die bindt aan een natieve trkB-receptor en deze activeert waardoor het een biologische activiteit van een natieve ligand van de receptor nabootst. Een voorbeeld van niet-natieve liganden van een trkB-15 receptor is een anti-trkB-agonist antilichaam. TrkB-agonisten omvatten ook nabootsters in de vorm van kleine moleculen of peptiden (bijvoorbeeld peptide-nabootsters van BDNF). Zie bijvoorbeeld O’Leary et al., J. Biol. Chem. 278:25738-44, 2003. In sommige uitvoeringsvormen passeert de trkB-agonist in de vorm van het kleine molecuul niet aanzienlijk de bloed-hersen barrière wanneer het perifeer wordt toegediend.
20 Een trkB-agonist zou één of meer van de volgende kenmerken moeten vertonen: (a) bindt aan de trkB-receptor, (b) bindt aan de trkB-receptor en activeert biologische activiteit(en) van trkB en/of één of meer stroomafwaartse routes die worden bemiddeld door signalerende functie(s) van trkB; (c) bindt aan de trkB-receptor en verhoogt het lichaamsgewicht en/of voedselopname bij een primaat wanneer het perifeer wordt toe-25 gediend; (d) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor behandeling, voorkoming, omkering of verbetering van één of meer symptomen van cachexie bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (e) bindt een de trkB-receptor en zorgt voor behandeling, voorkoming, omkering of verbetering van één of meer symptomen van anorexia nervosa bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (f) bindt aan de trkB-receptor 30 en zorgt voor behandeling, voorkoming, omkering of verbetering van één of meer symptomen van opioïde-geïnduceerd braken bij een zoogdier wanneer het perifeer wordt toegediend; (g) bevordert de dimerisatie en activatie van de trkB-receptor; en (h) verhoogt de trkB-receptor-afhankelijke neuronale overleving en/of uitgroei van neurie- 29 ten. In sommige uitvoeringsvormen bindt trkB en activeert trkB de trkB-receptor maar activeert het niet aanzienlijk of bij voorkeur één of meer van de andere trk-receptoren zoals trkA en/of trkC.
De trkB-agonist kan in de vorm van een preparaat zijn voor gebruik in elk van de 5 werkwijzen die hierin zijn beschreven. Het preparaat dat in de werkwijzen van de uitvinding wordt gebruikt omvat een effectieve hoeveelheid van een trkB-agonist. Het preparaat kan verder farmaceutisch aanvaardbare dragers, excipiënten of stabiliserende middelen omvatten (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20ste editie (2000) Lippincott Williams en Wilkins, redacteur K.E. Hoover.), in de vorm van ge-10 vriesdroogde preparaten of waterige oplossingen. Aanvaardbare dragers, excipiënten of stabiliserende middelen zijn niet-toxisch voor ontvangers bij de doseringen en concentraties en kunnen buffers zoals fosfaat, citraat en andere organische zuren; anti-oxidanten waaronder ascorbinezuur en methionine; conserveringsmiddelen (zoals octa-decyldimethylbenzylammoniumchloride; hexamethoniumchloride; benzalkonium-15 chloride, benzethoniumchloride; fenol, butyl of benzylalcohol; alkylparabenen zoals methyl- of propylparabeen; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; en m-cresol); polypeptiden met laag molecuulgewicht (minder dan ongeveer 10 residuen); eiwitten zoals serumalbumine, gelatine of immunoglobulinen; hydrofiele polymeren zoals polyvinylpyrrolidon; aminozuren zoals glycine, glutamine, asparagine, histidine, 20 arginine, of lysine; monosacchariden, disacchariden, en andere koolhydraten waaronder glucose, mannose, of dextrans; chelerende middelen zoals EDTA; suikers zoals sucrose, mannitol, trehalose of sorbitol; zout-vormende counter-ionen zoals natrium; metaal-complexen (bijvoorbeeld Zn-eiwit complexen); en/of niet-ionische oppervlakte-actieve stoffen zoals TWEEN™, PLURONICS™ of polyethyleenglycol (PEG) omvatten. 25 Farmaceutisch aanvaardbare excipiënten zijn hierin verder beschreven.
TrkB-agonisten die hierin zijn beschreven kunnen voor aanhoudende afgifte worden bereid. Geschikte voorbeelden van preparaten met aanhoudende afgifte omvatten semi-permeabele matrices van vaste hydrofobe polymeren die trkB-agonist bevatten, waarbij de matrices in de vorm zijn van gevormde artikelen, bijvoorbeeld films of mi-30 crocapsules. Voorbeelden van matrices met aanhoudende afgifte omvatten polyesters, hydrogels (bijvoorbeeld poly(2-hydroxyethyl-methacrylaat), of ’poly(vinylalcohol)), polylactiden (Amerikaans octrooischriftnummer 3.773.919), copolymeren van L-glutaminezuur en 7 ethyl-L-glutamaat, niet-afbreekbaar ethyleen-vinylacetaat, afbreek- 30 bare copolymeren van melkzuur-glycolzuur zoals de LUPRON DEPOT™ (injecteerba-re microsferen die zijn samengesteld uit copolymeren van melkzuur-glycolzuur en leu-prolide-acetaat), sucrose-acetaatisobutyraat en poly-D-(-)-3-hydroxyboterzuur. Een ander voorbeeld van een geneesmiddel-afleverend systeem met aanhoudende afgifte die 5 kan worden gebruikt is het ATRIGEL® dat wordt gemaakt door Atrix Laboratories. Zie bijvoorbeeld Amerikaans octrooischriftnummer 6.565.874. Het ATRIGEL® ge-neesmiddel-afleverende systeem bestaat uit biologisch afbreekbare polymeren die overeenkomstig zijn aan die welke in biologisch afbreekbare hechtingen worden gebruikt, opgelost in biologisch verenigbare dragers. TrkB-agonisten kunnen in dit vloei-10 bare afleverende systeem worden gemengd op het moment van bereiding of kan afhankelijk van het product later door de geneesheer worden toegevoegd op het moment van gebruik. Wanneer het vloeibare product subcutaan of intramusculair wordt geïnjecteerd door een naald met smalle gauge of in toegankelijke plaatsen in het weefsel door een canule wordt geplaatst, veroorzaakt verdringing van de drager met water in de weefsel-15 vloeistoffen dat het polymeer precipiteert teneinde een vaste film of implantaat te vormen. TrkB-agonisten die in het implantaat zijn ingekapseld worden vervolgens op een gereguleerde wijze afgegeven als de polymeermatrix gedurende de tijd biologisch afbreekt. Afhankelijk van de geneeskundige behoeften van de patiënt kan het Atrigel-systeem eiwitten gedurende een periode die varieert van dagen tot maanden afleveren. 20 Injecteerbare systemen met aanhoudende afgifte zoals ProLease®, Medisorb®, bereid door Alkermes kunnen ook worden gebruikt.
Bij sommige uitvoeringsvormen verschaft de uitvinding preparaten (die hierin zijn beschreven) voor gebruik bij elk van de werkwijzen die hierin zijn beschreven ofwel in de samenhang van het gebruik als een geneesmiddel en/of gebruik voor de be-25 reiding van een geneesmiddel.
NT-4/5 polypeptiden
De trkB-agonist die in de werkwijzen volgens de uitvinding wordt gebruikt om-30 vat NT-4/5 polypeptiden. Zoals hierin wordt gebruikt omvat “NT-4/5-polypeptide” natuurlijk voorkomend rijp eiwit (onderling uitwisselbaar “NT-4/5” genoemd) zoals rijp humaan NT-4/5 getoond in Tabel 1 hieronder en in Amerikaanse octrooi-aanvraag publicatienummer 2005/0209148 en PCT WO 2005/08240 en Figuur 1 in Amerikaanse 31 octrooi-aanvraag publicatienummer 20030203383 en natuurlijk voorkomende varianten van de aminozuursequentie van NT-4/5; varianten van de aminozuursequentie van NT-4/5; peptidefragmenten van rijp NT-4/5 (zoals humaan) en de varianten van de aminozuursequentie; en gemodificeerde vormen van rijp NT-4/5 en de varianten van de ami-5 nozuursequentie en peptidefragmenten waarbij het polypeptide of peptide covalent is gemodificeerd door substitutie met een groep die anders is dan een natuurlijk voorkomend aminozuur zolang de variant van de aminozuursequentie, peptidefragment en de gemodificeerde vorm daarvan één of meer biologische activiteiten van een trkB-agonist en/of van natuurlijk voorkomend rijp NT-4/5 eiwit toont. De trkB-agonist omvat ook 10 fusie-ei witten en conjugaten die elk van de uitvoeringsvormen van het NT-4/5-polypeptide die hierin zijn beschreven omvatten, bijvoorbeeld een NT-4/5-polypeptide geconjugeerd of gefuseerd aan een groep die de halfwaardetijd verlengt, zoals een PEG, Fc-gebied van IgG, albumine of een peptide. De varianten van de aminozuursequentie, peptidefragmenten (waaronder fragmenten van varianten) of gemodificeerde 15 vormen daarvan onder beschouwing omvatten niet NGF, BDNF of NT-3 van elke dier lijke soort. Varianten, peptidefragmenten en gemodificeerde vormen van natuurlijk voorkomend NT-4/5 zijn beschreven in Amerikaanse octrooi-aanvraag publicatienummers 2003/0203383; 2002/0045576; 2005/0209148; Amerikaanse octrooischriftnum-mers 5.702.906; 6.506.728; 6.566.091; 5.830.858; die hierin in het geheel door verwij-20 zing zijn opgenomen. NT-4/5-polypeptiden omvatten elk van één of meer uitvoeringsvormen die hierin zijn beschreven. NT-4/5-polypeptide omvat bijvoorbeeld een natuur-lijk-voorkomende sequentie met één of meer inserties, deleties of substituties van aminozuren.
32
Tabel 1. Aminozuursequentie van rijp humaan NT-4/5 en de humane nucleotide-sequentie die voor het rijpe humane NT-4/5 codeert
Aminozuursequentie (SEQ ID NO:l): GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLR-QYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQ-GRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA Nucleotidesequentie (SEQ ID NO:2)
GGGGTGAGCG
AAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTC-
AGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA
GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCC
AGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGC
CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGT
ATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATG
CCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTC
TGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCCTGAG
In sommige uitvoeringsvormen is het NT-4/5-polypeptide een zoogdierlijk NT-5 4/5-polypeptide dat een natuurlijk-voorkomend zoogdierlijk NT-4/5 kan zijn of een NT-4/5-polypeptide dat afkomstig is van een natuurlijk voorkomende zoogdierlijke NT-4/5 en een sequentie heeft die niet overeenkomt met elk deel van een natuurlijk-voorkomend niet-zoogdierlijk NT-4/5. In sommige uitvoeringsvormen is het NT-4/5 -polypeptide een humaan NT-4/5-polypeptide dat een natuurlijk-voorkomend humaan 10 NT-4/5 kan zijn of een NT-4/5-polypeptide dat afkomstig is van een natuurlijk- voorkomende humaan NT-4/5 en die een sequentie heeft die niet overeenkomt met een deel van een natuurlijk voorkomende niet-humane NT-4/5.
NT-4/5-polypeptiden waaronder varianten, peptidefragmenten, gemodificeerde vormen van NT-4/5-polypeptiden (waaronder natuurlijk voorkomende NT-4/5), fusie-15 eiwitten en conjugaten van de uitvinding worden gekenmerkt door elk (één of meer) van de volgende kenmerken: (a) bindt aan de trkB-receptor, (b) bindt aan de trkB-receptor en activeert biologische activiteiten) van trkB en/of één of meer stroomafwaartse routes die worden bemiddeld door signalerende functie(s) van trkB; (c) bindt aan de trkB-receptor en verhoogt het lichaamsgewicht en/of voedselopname bij een 20 primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (d) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van cachexie bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (e) 33 bindt een de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van anorexia nervosa bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (f) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer sympto-5 men van opioïde-geïnduceerd braken bij een zoogdier wanneer het perifeer wordt toegediend; (g) bevordert de dimerisatie en activatie van de trkB-receptor; en (h) verhoogt de trkB-receptor-afhankelijke neuronale overleving en/of uitgroei van neurieten. Alle NT-4/5-polypeptiden (waaronder varianten, fragmenten en gemodificeerde vormen) zijn aldus functioneel zoals hierboven is beschreven.
10 Biologische activiteit van varianten kan in vitro en in vivo worden getest door het gebruik van werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn en werkwijzen die hierin zijn beschreven. Werkwijzen die hierin zijn beschreven voor het identificeren van een anti-trkB-agonist kunnen ook worden gebruikt. NT-4/5-polypeptiden kunnen een verhoogde activiteit of verlaagde activiteit hebben in vergelijking met een natuurlijk voorkomend 15 NT-4/5-eiwit. In sommige uitvoeringsvormen hebben functioneel gelijkwaardige varianten tenminste ongeveer elk van 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, of 95% activiteit in vergelijking met het natieve NT-4/5-eiwit waarvan het NT-4/5-polypeptide wordt verkregen met betrekking tot één of meer biologische testen die hierboven zijn beschreven (of in het vakgebied bekend zijn). In sommige uitvoeringsvormen hebben 20 functioneel gelijkwaardige varianten een EC50 (helft van de maximale effectieve concentratie) van lager dan ongeveer elk van 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, of 100 nM bij activatie van de TrkB-receptor in vitro (bijvoorbeeld testen die zijn beschreven in Voorbeeld 6 en in US 2005/0209148 en PCT WO 2005/082401).
Varianten van de aminozuursequentie van NT-4/5 omvatten polypeptiden die een 25 aminozuursequentie hebben die van natuurlijk voorkomend NT-4/5 verschilt bij wijze van de insertie, deletie en/of substitutie van één of meer aminozuurresiduen in de sequentie van natuurlijk voorkomend NT-4/5 (bijvoorbeeld rijp humaan NT-4 getoond in Tabel 1). Varianten van de aminozuursequentie zullen in het algemeen tenminste ongeveer 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, of 99% identiek zijn aan 30 elk natuurlijk voorkomend NT-4/5 (zoals rijp humaan NT-4/5 getoond in SEQ ID NO:l). In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 70% identiek aan de aminozuursequentie van SEQ ID NO:l. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 85% identiek aan de aminozuursequentie van SEQ ID
34 NO:l. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 90% identiek aan de aminozuursequentie van SEQ ID NO:l. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 95% identiek aan de aminozuursequentie van SEQ ID NO:l.
5 Varianten van de aminozuursequentie van NT-4/5 kunnen worden gegenereerd door het maken van vooraf bepaalde mutaties in een daarvoor geïsoleerd DNA voor NT-4/5. Aminozuurvarianten kunnen worden ontworpen en gegenereerd op basis van de kristalstructuur van NT-4/5 en de TrkB-receptor. Banfield et al., Structure 9:1191-9 (2001). Aminozuren die bijvoorbeeld niet direct zijn betrokken bij de interactie tussen 10 monomeren van NT-4/5 en tussen NT-4/5 en de trkB-receptor kunnen worden gemuteerd, bijvoorbeeld om een PEG-bindende plaats te introduceren. Werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn kunnen worden gebruikt om varianten van het NT-4/5-polypeptide te ontwerpen waarvan één of meer biologische activiteiten zijn verhoogd of verlaagd in vergelijking met het natuurlijk voorkomende NT-4/5-eiwit.
15 Er zijn twee voorname variabelen om in overweging te nemen bij het maken van dergelijke vooraf bepaalde mutaties: de locatie van de plaats van mutatie en de aard van de mutatie. De locatie en de aard van de mutatie die wordt gekozen hangt in het algemeen af van het kenmerk van NT-4/5 dat gemodificeerd dient te worden. Gegadigde NT-4/5-antagonisten of super-agonisten kunnen bijvoorbeeld eerst worden geselecteerd 20 door het lokaliseren van aminozuurresiduen die identiek zijn of sterk geconserveerd zijn onder NGF, BDNF, NT-3 en NT-4. Die residuen kunnen vervolgens in serie worden gemodificeerd door bijvoorbeeld (1) het eerst substitueren met conservatieve keuzen en vervolgens met meer radicale selecties afhankelijk van de resultaten die worden verkregen, (2) verwijderen van het residu dat het doelwit is, of (3) het insereren van 25 residuen van dezelfde of verschillende klasse aangrenzend aan de gelokaliseerde plaats of combinaties van opties 1-3.
Eén bruikbare techniek wordt “ala-scanning” genoemd. Hierbij wordt een amino-zuurresidu of een groep van doelwitresiduen geïdentificeerd en gesubstitueerd door alanine of polyalanine. Die domeinen die functionele gevoeligheid voor de alanine-30 substituties tonen worden vervolgens verfijnd door het introduceren van volgende of andere varianten op of voor de plaatsen van alanine-substitutie.
Dergelijke variaties die bijvoorbeeld NT-4/5 omzetten naar NGF, BDNF of NT-3 zijn natuurlijk niet binnen de beschermingsomvang van deze uitvinding opgenomen.
35
Terwijl de plaats voor het introduceren van een variatie van de aminozuursequentie vooraf wordt bepaald hoeft aldus de aard van de mutatie niet vooraf te worden bepaald. Om de uitvoering van een mutatie op een bepaalde plaats te optimaliseren wordt bijvoorbeeld ala-scanning of willekeurige mutagenese op het codon of het gebied dat het 5 doelwit is uitgevoerd en de tot expressie gebrachte varianten van NT-4/5 worden gescreend op de optimale gewenste activiteit.
Deleties van de aminozuursequentie variëren in het algemeen van ongeveer 1 tot 30 residuen, met meer voorkeur ongeveer 1 tot 10 residuen en zijn kenmerkend opeenvolgend. Deleties kunnen in gebieden van lage homologie onder BDNF, NGF, NT-3 en 10 NT-4/5 worden uitgevoerd om de activiteit van NT-4/5 te modificeren. Het zal meer aannemelijk zijn dat deleties van NT-4/5 in gebieden van aanzienlijke homologie met BDNF, NT-3 en NGF de biologische activiteit van NT-4/5 meer aanzienlijk modificeren. Het aantal opeenvolgende deleties kunnen zodanig worden geselecteerd dat de tertiaire structuur van NT-4/5 in het betrokken domein blijft bewaard, bijvoorbeeld 15 bèta-pleated sheet of alfa-helix.
Inserties in de aminozuursequentie omvatten amino- en/of carboxyl-eindstandige fusies die in lengte variëren van één residu tot polypeptiden die een duizend of meer residuen bevatten alsook inserties in de sequentie van enkele of meerdere aminozuurre-siduen. Inserties in de sequentie (d.w.z. inserties in de rijpe sequentie voor NT-4/5) 20 kunnen in het algemeen variëren van ongeveer 1 tot 10 residuen, met meer voorkeur 1 tot 5, met meeste voorkeur 1 tot 3. Een voorbeeld van een eindstandige insertie omvat een fusie van een heterologe N-eindstandige signaalsequentie aan het N-uiteinde van het NT-4/5-molecuul voor het bewerkstelligen van de uitscheiding van rijpe NT-4/5 van de recombinante gastheer. Dergelijke signalen zullen in het algemeen homoloog 25 zijn aan de beoogde gastheercel en omvat STII of Ipp voor E. coli, alfa-factor voor gist en virale signalen zoals herpes gD voor zoogdierlijke cellen. Andere inserties omvatten de fusie van een polypeptide aan de N- of C-uiteinden van NT-4/5.
Een andere groep van varianten omvat die waarbij tenminste één aminozuur-residu in NT-4/5 en bij voorkeur maar één is verwijderd en een ander residu in de 30 plaats ervan is geïnsereerd. Een voorbeeld is de vervanging van arginine en lysine door andere aminozuren om het NT-4/5 resistent te maken tegen proteolyse door serine-proteasen waardoor een variant van NT-4/5 wordt gevormd die meer stabiel is. De plaatsen die van het grootste belang zijn voor substitutionele mutagenese omvatten 36 plaatsen waar de aminozuren die in BDNF, NGF, NT-3 en NT-4 worden gevonden aanzienlijk verschillend zijn in termen van omvang van de zijketen, lading of hydrofo-biciteit, maar waar er ook een hoog niveau van homologie is op de geselecteerde plaats tussen de verscheidene analoga van NGF, NT-3 en BDNF van dieren (bijvoorbeeld 5 onder NGF’s van alle dieren, alle NT-3 van alle dieren en alle BDNF’s van alle dieren). Deze analyse zal residuen benadrukken die betrokken kunnen zijn bij de differentiatie van activiteit van de trofische factoren en daarom kunnen varianten op deze plaatsen dergelijke activiteiten beïnvloeden. Voorbeelden van dergelijke plaatsen in rijp humaan NT-4/5, genummerd vanaf het N-eindstandige uiteinde, en illustratieve substituties om-10 vatten G77 naar K, H, Q of R en R84 naar E, F, P, Y of W van respectievelijk NT-4/5 van SEQ ID NO:l. Andere plaatsen van belang zijn die waarbij de residuen identiek zijn tussen BDNF, NGF, NT-3 en NT-4/5 van alle dierlijke soorten, deze mate van con-formatie suggereert belangrijkheid bij het verkrijgen van biologische activiteit die algemeen is voor alle vier factoren.
15 Substitutie van één of meer aminozuren omvat bijvoorbeeld conservatieve substi tuties. Werkwijzen voor het maken van conservatieve substituties zijn in het vakgebied bekend. Ala (A) kan bijvoorbeeld worden gesubstitueerd door val, leu, ile, bij voorkeur door val; arg (R) kan worden gesubstitueerd door lys, gin, asn, bij voorkeur door lys; asn (N) kan worden gesubstitueerd door gin, his, lys, arg, bij voorkeur door gin; asp (D) 20 kan worden gesubstitueerd door glu; cys (C) kan worden gesubstitueerd door ser; gin (Q) kan worden gesubstitueerd door asn; glu (E) kan worden gesubstitueerd door asp; gly (G) kan worden gesubstitueerd door pro; his (H) kan worden gesubstitueerd door asn, gin, lys, arg; bij voorkeur door arg; ile (I) kan worden gesubstitueerd door leu, val, met, ala, phe, norleucine, bij voorkeur door leu; leu (L) kan worden gesubstitueerd door 25 norleucine, ile, val, met; ala; phe, bij voorkeur door ile; lys (K) kan worden gesubstitueerd door arg; gin, asn, bij voorkeur door arg; met (M) kan worden gesubstitueerd door leu; phe; ile, bij voorkeur door leu; phe (F) kan worden gesubstitueerd door leu, val, ile, ala, bij voorkeur door leu; pro (P) kan worden gesubstitueerd door gly; ser (S) kan worden gesubstitueerd door thr; thr (T) kan worden gesubstitueerd door ser; trp (W) 30 kan worden gesubstitueerd door tyr; tyr (Y) kan worden gesubstitueerd door trp, phe, thr, ser, bij voorkeur door phe; val (V) kan worden gesubstitueerd door ile; leu; met; phe, ala; norleucine, bij voorkeur door leu.
37
Plaatsen die in het bijzonder geschikt zijn voor conservatieve substitutie omvatten, genummerd vanaf het N-uiteinde van het rijpe humane NT-4 (SEQ ID NO:l), Ril, G12, E13, V16, D18, W23, V24, D26, V40, L41, Q54, Y55, F56, E58, T59, G77, R79, G80, H85, W86, A99, L100, T101, WHO, Rill, W112, 1113, R114, 1115, Dl 16 en 5 Al 18. Cysteïne-residuen die niet zijn betrokken bij het aanhouden van de juiste con-formatie van NT-4/5 kunnen ook worden gesubstitueerd, in het algemeen met serine, teneinde de oxidatieve stabiliteit van het molecuul te verbeteren en afwijkende verknoping te voorkomen. Plaatsen die anders zijn dan in deze paragraaf uiteengezet zijn, zijn geschikt voor studies van deletie of insertie die in het algemeen hierboven zijn beschre-10 ven.
Aanzienlijke modificaties in fimctie kunnen worden volbracht door het selecteren van substituties die aanzienlijk verschillen in het effect ervan op het aanhouden van (a) de structuur van het polypeptideskelet in het gebied van de substitutie, bijvoorbeeld als een conformatie in een sheet of een helix, (b) de lading of hydrofobiciteit van het mole-15 cuul op de doelwitplaats, of (c) de omvang van de zij keten. Natuurlijk voorkomende residuen worden in groepen verdeeld op basis van algemene eigenschappen van zijke-tens (sommige van deze kunnen in verscheidene functionele groepen vallen): (1) hydrofoob: norleucine, met, ala, val, leu, ile; 20 (2) neutraal hydrofiel: cys, ser, thr; (3) zuur: asp, glu; (4) basisch: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuen die de oriëntatie van de keten beïnvloeden: gly, pro; en (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
25
Niet-conservatieve substituties zullen het uitwisselen van een lid van één van deze klassen voor een andere met zich meebrengen.
Voorbeelden van varianten van NT-4 omvatten: polypeptide met SEQ ID NO:l met mutatie van E67 naar S of T (dit voegt een N-gekoppelde glycosylatieplaats toe); 30 polypeptide van aminozuurresidu R83 naar Q94, G1 naar C61, G1 naar C17, C17 naar C61, C17 naar C78, C17 naar C90, C17 naar Cl 19, C17 naar C121, R11 naar R27, Ril naar R34, R34 naar R53, C61 naar C78, R53 naar C61, C61 naar Cl 19, C61 naar C78, C78 naar Cl 19, C61 naar C90, R60 naar C78, K62 naar Cl 19, K62 naar K91, R79 naar 38 R98, R83 naar K93, T101 naar Rill, G1 naar C121 van SEQ ID NO:l; polypeptide dat V40-C121 van SEQ ID NO:l omvat, bijvoorbeeld V40-C121 van SEQ ID NO:l gefuseerd aan een polypeptide aan het N-uiteinde en/of C-uiteinde; polypeptide dat SEQ ID NO:l omvat met deletie van C78, C61, Q54-T59, R60-D82, H85-S88, W86-5 T101 (deleties van het aangegeven stel residuen, inclusief); SEQ ID NO:l met mutatie van R53 naar H, van K91 naar H, van V108 naar F, van R84 naar Q, Η, N, T, Y of W, en van Dl 16 naar E, N, Q, Y, S of T. Ook opgenomen is NT-4/5 (SEQ ID NO: 1) waarbij positie 70 is gesubstitueerd met een aminozuurresidu die anders is dan G, E, D of P; positie 71 met andere dan A, P of M; en/of positie 83 met andere dan R, D, S of 10 K; alsook gecycliseerde NT-4 fragmenten.
Twee polynucleotide- of polypeptide-sequenties worden genoemd “identiek” te zijn indien de sequentie van nucleotiden of aminozuren in de twee sequenties dezelfde is wanneer ze worden gepositioneerd op maximale overeenkomst zoals hieronder is beschreven. Vergelijkingen tussen twee sequenties worden kenmerkend uitgevoerd 15 door het vergelijken van de sequenties over een venster van vergelijking voor het identificeren en vergelijken van lokale gebieden op sequentie-overeenkomst. Een “vergelij-kingsvenster” zoals hierin wordt gebruikt verwijst naar een segment van tenminste ongeveer 20 opeenvolgende posities, gewoonlijk 30 tot ongeveer 75, 40 tot ongeveer 50, waarbij een sequentie met een referentiesequentie van hetzelfde aantal van opeenvol-20 gende posities kan worden vergeleken nadat de twee sequenties optimaal zijn gepositioneerd.
Optimale positionering van sequenties voor vergelijking kan worden uitgevoerd door het gebruik van het Megalign programma in het Lasergene reeks van bioinforma-tica software (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), door het gebruik van default parame-25 ters. Dit programma omvat verscheidene schema’s van positionering die in de volgende referenties zijn beschreven: Dayhofï, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (redacteur) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, biz. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to 30 Alignment and Phylogenes biz. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. en Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. en Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A.
39 en Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. en Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Het “percentage van sequentie-overeenkomst” wordt bij voorkeur bepaald door 5 het vergelijken van twee optimaal gepositioneerde sequenties over een venster van vergelijking van tenminste 20 posities, waarbij het deel van de polynucleotide- of polypep-tide-sequentie in het vergelijkingsvenster addities of deleties (d.w.z. tussenruimten) van 20 procent of lager, gewoonlijk 5 tot 15 procent of 10 tot 12 procent kan omvatten in vergelijking met de referentiesequenties (die niet addities en deleties omvatten) voor 10 optimale positionering van de twee sequenties. Het percentage wordt berekend door het bepalen van het aantal posities waarop de identieke nucleïnezuurbasen of aminozuurre-siduen in beide sequenties voorkomen teneinde het aantal van overeenkomstige posities te leveren en het delen van aantal overeenkomstige posities door het totale aantal posities in de referentiesequentie (d.w.z. de grootte van het venster) en het vermenigvuldi-15 gen van de resultaten met 100 teneinde het percentage van sequentie-overeenkomst te leveren.
Varianten van de aminozuursequentie van NT-4/5 kunnen natuurlijk voorkomend zijn of kunnen op synthetische wijze worden bereid, zoals door het introduceren van geschikte nucleotide-veranderingen in een voorafgaand geïsoleerd DNA voor NT-4/5 20 of door in vitro synthese van het gewenste variante polypeptide. Zoals hierboven is aangegeven kunnen dergelijke varianten deleties van, inserties of substituties van één of meer aminozuurresiduen in de aminozuursequentie van rijp NT-4/5 (bijvoorbeeld de sequentie die in Tabel 1 is getoond) omvatten. Elke combinatie van deletie, insertie en substitutie wordt gemaakt voor het verkrijgen van een variant van de aminozuursequen-25 tie van NT-4/5, met dien verstande dat het resulterende variante polypeptide een gewenst kenmerk bezit. De aminozuurveranderingen kunnen ook in andere modificaties van NT-4/5 resulteren bij expressie in recombinante gastheren, bijvoorbeeld het introduceren of verplaatsen van plaatsen voor glycosylatie of het introduceren van sequenties voor een membraananker (in overeenstemming met PCT WO 89/01041, gepubli-30 ceerd op 9 februari, 1989).
In sommige uitvoeringsvormen omvat het NT-4/5-polypeptide een aminozuursequentie die wordt gecodeerd door een nucleïnezuur dat onder stringente omstandig 40 heden hybridiseert aan een nucleïnezuursequentie (bijvoorbeeld SEQ ID NO:2) die voor rijp humaan NT-4/5 codeert.
Variante polynucleotiden kunnen ook, of als alternatief, nagenoeg homoloog zijn aan een natief gen of een deel of complement daarvan. Dergelijke varianten van po-5 lynucleotiden zijn in staat om onder matige stringente omstandigheden te hybridiseren aan een natuurlijk voorkomende DNA-sequentie die voor het polypeptide (of een complementaire sequentie) codeert.
Geschikte “matige stringente omstandigheden” omvatten vooraf wassen in een oplossing van 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridiseren bij 50°C-10 65°C, 5 X SSC, gedurende de nacht; gevolgd door tweemaal wassen bij 65°C geduren de 20 minuten met elk van 2X, 0,5X en 0,2X SSC dat 0,1 % SDS bevat.
Zoals hierin wordt gebruikt zijn “hoge stringente omstandigheden” of “omstandigheden van hoge stringentie” die waarbij: (1) gebruik wordt gemaakt van lage ionsterkte en hoge temperatuur voor wassen, bijvoorbeeld 0,015 M natrium-15 chloride/0,0015 M natriumcitraat/0,1% natriumdodecylsulfaat bij 50°C; (2) gedurende de hybridisatie gebruik wordt gemaakt van een denaturerend middel, zoals formamide, bijvoorbeeld 50% (v/v) formamide met 0,1% runderserumalbumine/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfaatbuffer bij pH 6,5 met 750 mM natrium-chloride, 75 mM natriumcitraat bij 42°C; of (3) gebruik wordt gemaakt van 50% for-20 mamide, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumcitraat), 50 mM natriumfosfaat (pH 6,8), 0,1% natriumpyrofosfaat, 5 x Denhardt’s oplossing, gesoniceerd zalmsperma DNA (50 pg/ml), 0,1% SDS en 10% dextransulfaat bij 42°C, met wassen bij 42°C in 0,2 x SSC (natriumchloride/natriumcitraat) en 50% formamide bij 55°C, gevolgd door een was onder hoge stringentie die bestaat uit 0,1 x SSC die EDTA bevat bij 55°C. Een 25 andere illustratieve stringente omstandigheid voor hybridisatie is in 50% formamide, 5xSSC, 0,1% natriumdodecylsulfaat, 0,1% natriumpyrofosfaat, 50 mM natriumfosfaat pH 6,8, 2 x Denhardt’s oplossing en 10% dextransulfaat bij 42°C, gevolgd door een was in 0,lxSSC en 0,1% SDS bij 42°C. Voor een deskundige in het vakgebied zal het duidelijk zijn hoe de temperatuur, ionsterkte, enzovoort als nodig moeten worden aan-30 gepast voor het aanpassen aan factoren zoals lengte van de probe en dergelijke.
Het zal voor de deskundigen in het vakgebied duidelijk zijn dat als een resultaat van de degeneratie van de genetische code er vele nucleotidesequenties zijn die voor een polypeptide zoals hierin is beschreven coderen. Sommige van deze polynucleotiden 41 dragen minimale homologie aan de nucleotidesequentie van elk natief gen. Niettemin worden polynucleotiden die door verschillen in codongebruik variëren in het bijzonder door de onderhavige uitvinding beschouwd. Allelen van de genen die de polynucleoti-desequenties die hierin worden verschaft omvatten vallen verder binnen de bescher-5 mingsomvang van de onderhavige uitvinding. Allelen zijn endogene genen die zijn veranderd als een resultaat van één of meer mutaties, zoals deleties, addities en/of substituties van nucleotiden. Het resulterende mRNA en eiwit kan, maar dit hoeft niet, een veranderde structuur of functie hebben. Allelen kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van standaard technieken (zoals hybridisatie, amplificatie en/of vergelijking 10 van sequenties van dé gegevensbank).
TrkB-agonisten die in de werkwijzen van de uitvinding worden gebruikt omvatten ook fusie-eiwitten die de aminozuursequentie van NT-4/5 (bijvoorbeeld humaan NT-4/5 die in Tabel 1 is getoond) omvatten of een functioneel peptidefragment daarvan. Biologisch actieve NT-4/5-polypeptiden kunnen worden gefuseerd met sequenties, 15 zoals sequenties die immunologische reactiviteit versterken, de koppeling van het poly peptide aan een ondersteunend middel of een drager bewerkstelligen of het hervouwen en/of zuiveren bewerkstelligen (bijvoorbeeld sequenties die coderen voor epitopen zoals Myc, HA afkomstig van hemagglutinine van influenzavirus, His-6, FLAG). Deze sequenties kunnen aan het N-eindstandige uiteinde of aan het C-eindstandige uiteinde 20 aan NT-4/5-polypeptide worden gefuseerd. In aanvulling kan het eiwit of polynucleotide aan andere polypeptiden worden gefuseerd die de functie ervan verhogen of de locatie ervan in de cel specificeren zoals een sequentie voor uitscheiding. Werkwijzen voor het produceren van recombinante fusie-eiwitten die hierboven zijn beschreven zijn in het vakgebied bekend. Het recombinante fusie-eiwit kan worden geproduceerd, worden 25 hervouwen en worden geïsoleerd door werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn.
NT-4/5-polypeptiden die hierin zijn beschreven kunnen worden gemodificeerd om de halfwaardetijd ervan in een individu te verlengen. Het NT-4/5-polypeptide kan bijvoorbeeld worden gepegyleerd om systemische klaring te verlagen met minimaal verlies van biologische activiteit. De uitvinding verschaft ook preparaten (waaronder 30 farmaceutische preparaten) die een NT-4/5-polypeptide gekoppeld aan een PEG-molecuul omvatten. In sommige uitvoeringsvormen is het PEG-molecuul aan het NT-4/5-polypeptide gekoppeld door middel van een reversibele koppeling. De halfwaardetijd van een gepegyleerd NT-4/5-polypeptide kan met meer dan ongeveer 2-voudig, 5- 42 voudig, 10-voudig, 15-voudig, 20-voudig en 30-voudig van de halfwaardetijd van het niet-gepegyleerde NT-4/5-polypeptide worden verlengd.
Polyethyleenglycol-polymeren (PEG) kunnen aan verscheidene functionele groepen van het NT-4/5-polypeptide worden gekoppeld door het gebruik van werkwijzen 5 die in het vakgebied bekend zijn. Zie bijvoorbeeld Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002); Sakane et al. Pharm. Res. 14:1085-91 (1997). PEG kan worden gekoppeld aan de volgende functionele groepen op het polypeptide: ami-nogroepen, carboxylgroepen, gemodificeerde of natuurlijke N-uiteinden, amine-groepen en thiolgroepen. In sommige uitvoeringsvormen worden één of meer amino-10 zuurresiduen van het oppervlak met PEG-moleculen gemodificeerd. PEG-moleculen kunnen van verschillende grootte zijn (bijvoorbeeld variërend van ongeveer 2 tot 40 KDa). PEG-moleculen gekoppeld aan NT-4/5-polypeptide kunnen een molecuulge-wicht hebben van ongeveer elk van 2000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000 Da. Een PEG-molecuul kan een enkele of een vertakte keten zijn. Voor 15 het koppelen van PEG aan NT-4/5-polypeptide, kan een derivaat van het PEG dat een functionele groep aan één of beide uiteinden heeft worden gebruikt. De functionele groep wordt gekozen op basis van het soort van beschikbare reactieve groep op het NT-4/5-polypeptide. Werkwijzen voor het koppelen van derivaten aan polypeptiden zijn in het vakgebied bekend. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 20 (2002). De koppeling tussen het NT-4/5-polypeptide en de PEG kan ook zodanig zijn dat het kan worden gesplitst of op natuurlijke wijze afbreekt (reversibele of afbreekbare koppeling) in een individu dat de halfwaardetijd kan verbeteren maar verlies van activiteit minimaliseert. Ook kan een koppelingsplaats voor PEG op het NT-4/5-polypeptide worden gevormd door residuen aan het oppervlak te muteren naar een aminozuurresidu 25 dat een PEG-reactieve groep heeft, zoals een cysteïne. De volgende aminozuren van humaan NT-4/5 (SEQ ID NO:l) kunnen bijvoorbeeld worden gemuteerd voor verbinding van PEG: Gl, V2, S3, E4, T5, S9, R10, T25, D26, R28, T29, V31, E37, E39, L41, E43, A46, A47, G48, G49, S50, R53, D64, N65, A66, E67, E68, G69, D82, R83, R84, H85, A104, Q105, G106, R107, V108, S125 en T127. Deze kunnen worden toegepast 30 voor de overeenkomstige residuen in andere soorten.
Verscheidene gepegyleerde NT-4/5 zijn gegenereerd en zijn getoond in Voorbeelden 6 en 7 van Amerikaanse octrooi-aanvragen publicatienummer 2005/0209148 en PCT WO 2005/082401. Serineresidu op positie 50 van het rijpe humane NT-4/5 kan 43 naar cysteïne worden veranderd voor het genereren van NT4-S50C die vervolgens wordt gepegyleerd, waarbij het PEG aan de cysteïne op positie 50 wordt gekoppeld. Eén voorbeeld van een N-eindstandige specifieke verbinding voor PEG is het muteren van het residu op positie 1 naar een serine of threonine, vervolgens gevolgd met 5 pegylatie, waarbij de PEG aan de serine op positie 1 wordt gekoppeld.
NT-4/5-polypeptide kan door middel van recombinante wijzen worden geproduceerd, dat wil zeggen, door expressie van nucleïnezuur dat voor het NT-4/5-polypeptide codeert in recombinante celkweek en eventueel zuivering van het variante polypeptide van de celkweek door bijvoorbeeld biologische testen op de activiteit van de variant of 10 door adsorptie aan een immuno-affiniteitskolom die anti-NT-4/5 polyklonale antili-chamen van konijn omvat (dat aan tenminste één immuun-epitoop van de variant die ook in het natieve NT-4/5 aanwezig is zal binden). Kleine peptide-fragmenten, in de orde van 40 residuen of minder, worden gunstig door in vitro werkwijzen gemaakt.
DNA dat voor NT-4/5-polypeptide codeert kan in een expressievector worden 15 gekloneerd voor expressie van het eiwit in een gastheercel. Voorbeelden van nucleïne-zuren die voor het NT-4/5-polypeptide coderen zijn beschreven in Amerikaanse oc-trooi-aanvraag publicatienummer 2003/0203383. Het DNA dat voor het NT-4/5-polypeptide in de rijpe vorm ervan codeert kan aan het amino-uiteinde ervan aan een uitscheidingssignaal worden gekoppeld. Dit uitscheidingssignaal is bij voorkeur de 20 presequentie van NT-4/5 die op normale wijze de uitscheiding van NT-4/5 van humane cellen in vivo aanstuurt. Geschikte uitscheidingssignalen omvatten echter ook signalen van andere dierlijke NT-4/5, signalen van NGF, NT-2, of NT-3, virale signalen of signalen van uitgescheiden polypeptiden van dezelfde of verwante soorten. Elke gastheercel (zoals E. coli) kan worden gebruikt voor het tot expressie brengen van het eiwit of 25 polypeptide.
NT-4/5-polypeptide dat tot expressie is gebracht kan worden gezuiverd. NT-4/5-polypeptide kan van het kweekmedium worden teruggewonnen als een uitgescheiden eiwit, alhoewel het ook van lysaten van de gastheercellen kan worden teruggewonnen wanneer het direct tot expressie wordt gebracht zonder een uitscheidingssignaal. 30 Werkwijzen van eiwitzuivering die in het vakgebied bekend zijn kunnen worden gebruikt. Werkwijzen voor het produceren van NT-4/5-polypeptide en het zuiveren van het tot expressie gebrachte NT-4/5-polypeptide zijn beschreven in Amerikaanse oc-trooi-aanvraag publicatienummer 2003/0203383 en Amerikaans octrooischrift-nummer 44 6.184.360. NT-4/5-polypeptide kan in E. coli tot expressie worden gebracht en worden hervouwen volgens werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn. Rijp humaan NT-4/5 kan ook in de handel worden verkregen (bijvoorbeeld van R&D Systems, Sigma en Upstate).
5
Anti-trkB-agonist polypeptiden en antilichamen
De trkB-agonist die in de werkwijzen van de uitvinding wordt gebruikt omvat ook anti-trkB-agonist polypeptiden, waaronder anti-trkB-agonist antilichamen. Een 10 anti-trkB-agonist polypeptide (bijvoorbeeld een antilichaam) zou één of meer van de volgende kenmerken moeten vertonen: (a) bindt aan de trkB-receptor, (b) bindt aan de trkB-receptor en activeert biologische activiteit(en) van trkB en/of één of meer stroomafwaartse routes die worden bemiddeld door signalerende functie(s) van trkB; (c) bindt aan de trkB-receptor en verhoogt het lichaamsgewicht en/of voedselopname bij een 15 primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (d) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van cachexie bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (e) bindt een de trkB-receptor en zorgt voor behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van anorexia nervosa bij een primaat wan-20 neer het perifeer wordt toegediend; (f) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van opioïde-geïnduceerd braken bij een zoogdier wanneer het perifeer wordt toegediend; (g) bevordert de dimerisatie en activatie van de trkB-receptor; en (h) verhoogt de trkB-receptor-afhankelijke neuronale overleving en/of uitgroei van neurieten.
25 In sommige uitvoeringsvormen is het anti-trkB-agonist polypeptide (bijvoorbeeld antilichaam) multivalent en bindt aan het extracellulaire domein van een trkB-receptor. Het is getoond dat immunoglobulinen die in staat zijn te binden aan de trk-familie van neurotrofme-receptoren en ze te verknopen of te dimeriseren, deze receptoren activeren en gevolgen in neuronen produceren die overeenkomstig zijn aan de blootstelling aan 30 een neurotrofme. Zie Amerikaans octrooischriftnummer 6.656.465; en PCT WO 01/98361.
De trkB-agonist antilichamen kunnen monoklonale antilichamen, polyklonale antilichamen, antilichaamffagmenten (bijvoorbeeld Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, enzovoort), 45 chimère antilichamen, enkele ketens (ScFv), mutanten daarvan, fusie-eiwitten die een antilichaamdeel omvatten en elke andere gemodificeerde configuratie van het immu-noglobulinemolecuul dat een antigeen-herkenningsplaats met de vereiste specificiteit omvat, omvatten. De antilichamen kunnen van muis, rat, mens of elke andere oor-5 sprong zijn (waaronder gehumaniseerde antilichamen).
In sommige uitvoeringsvormen bindt het polypeptide (waaronder het antilichaam) trkB en vertoont geen aanzienlijke kruisreactie (binding) met andere neurotrofine-receptoren (zoals de verwante neurotrofine-receptoren trkA en/of trkC). Het agonist anti-trkB-polypeptide kan humaan trkB binden. Het agonist anti-trkB-polypeptide kan 10 ook trkB van mens en knaagdier binden. In sommige uitvoeringsvormen kan het agonist anti-trkB-polypeptide trkB van mens en rat binden. In sommige uitvoeringsvormen kan het anti-trkB-polypeptide trkB van mens en muis binden. In één uitvoeringsvorm herkent het polypeptide één of meer epitopen op het extracellulaire domein van humaan trkB. In een andere uitvoeringsvorm is het antilichaam een antilichaam van muis of rat 15 dat één of meer epitopen op het extracellulaire domein van humaan trkB herkent. In sommige uitvoeringsvormen bindt het polypeptide humaan trkB en bindt het niet aanzienlijk aan trkB van een andere zoogdierlijke soort (in sommige uitvoeringsvormen vertebrate soorten). In sommige uitvoeringsvormen bindt het polypeptide humaan trkB alsook één of meer trkB van een andere zoogdierlijke soort (in sommige uitvoerings-20 vormen, vertebrate soorten). In een andere uitvoeringsvorm herkent het polypeptide één of meer epitopen op een trkB die is gekozen uit één of meer van: primaten, hondachti-gen, katachtigen, van paard en van rund.
In sommige uitvoeringsvormen heeft het anti-trkB agonist antilichaam een EC50 (de helft van de maximale effectieve concentratie) van lager dan ongeveer elk van 0,01 25 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, of 100 nM bij TrkB-receptor (bijvoorbeeld humane trkB) activatie in vitro (bijvoorbeeld testen die zijn beschreven in Voorbeeld 6, en in US 2005/0209148 en PCT WO 2005/082401).
De bindingsafïiniteit van anti-trkB-agonist polypeptide (bijvoorbeeld antilichaam) aan trkB kan elk zijn van ongeveer 500 nM, ongeveer 400 nM, ongeveer 300 30 nM, ongeveer 200 nM, ongeveer 100 nM, ongeveer 50 nM, ongeveer 10 nM, ongeveer 1 nM, ongeveer 500 pM, ongeveer 100 pM, of ongeveer 50 pM tot elk van ongeveer 2 pM, ongeveer 5 pM, ongeveer 10 pM, ongeveer 15 pM, ongeveer 20 pM, of ongeveer 40 pM. In sommige uitvoeringsvormen is de bindingsaffmiteit elk van ongeveer 100 46 nM, ongeveer 50 nM, ongeveer 10 nM, ongeveer 1 nM, ongeveer 500 pM, ongeveer 100 pM, of ongeveer 50 pM, of lager dan ongeveer 50 pM. In sommige uitvoeringsvormen is de bindingsaffïniteit lager dan elk van ongeveer 100 nM, ongeveer 50 nM, ongeveer 10 nM, ongeveer 1 nM, ongeveer 500 pM, ongeveer 100 pM of ongeveer 50 5 pM. In nog andere uitvoeringsvormen is de bindingsaffiniteit ongeveer 2 pM, ongeveer 5 pM, ongeveer 10 pM, ongeveer 15 pM, ongeveer 20 pM, ongeveer 40 pM, of hoger dan ongeveer 40 pM. Zoals in het vakgebied goed bekend is kan de bindingsaffiniteit worden uitgedrukt als KD of dissociatieconstante en een verhoogde bindingsaffiniteit komt overeen met een verlaagde KD.
10 Eén wijze voor het bepalen van de bindingsaffiniteit van antilichamen aan trkB is door het meten van de bindingsaffiniteit van monofunctionele Fab-fragmenten van het antilichaam. Voor het verkrijgen van monofunctionele Fab-fragmenten kan een antili-chaam (bijvoorbeeld IgG) met papaïne worden gesplitst of op recombinante wijze tot expressie worden gebracht. De affiniteit van een anti-trkB Fab-fragment van een antili-15 chaam kan worden bepaald door oppervlakte-plasmon resonantie (BLAcore3000™ op-pervlakte-plasmin resonantie (SPR) systeem, BIAcore, INC, Piscataway NJ). CM5 chips kunnen worden geactiveerd met N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi-imidehydrochloride (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) volgens de instructies van de leverancier. Humaan trkB-Fc fusie-eiwit (“htrkB”) (of elke andere trkB, zoals trkB 20 van rat) kan worden verdund in 10 mM natriumacetaat pH 5,0 en over de geactiveerde chip worden geïnjecteerd bij een concentratie van 0,0005 mg/ml. Door het gebruik aan een variabele stroomtijd over de afzonderlijke kanalen van de chip kunnen twee trajecten van dichtheid van antigeen worden verkregen: 200-400 respons eenheden (RU) voor gedetailleerde kinetische studies en 500-1000 RU voor screeningstesten. De chip 25 kan met ethanolamine worden geblokkeerd. Regeneratie studies hebben getoond dat een mengsel van Pierce elutiebuffer (Product No. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) en 4 M NaCl (2:1) op effectieve wijze het gebonden Fab verwijdert terwijl de activiteit van hrtkB op de chip blijft gedurende meer dan 200 injecties. HBS-EP-buffer (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P29) wordt ge-30 bruikt als loopbuffer voor de BIAcore testen. Opeenvolgende verdunningen (0,l-10x geschatte Kq) van gezuiverde Fab-monsters worden gedurende 1 minuut bij 100 μΐ/minuut geïnjecteerd en dissociatietijden van tot 2 uur zijn toegestaan. De concentraties van de Fab-eiwitten wordt bepaald door ELISA en/of SDS-PAGE-elektroforese 47 door het gebruik van een Fab met bekende concentratie (zoals is bepaald door amino-zuuranalyse) als een standaard. Kinetische associatiesnelheden (kon) en dissociatiesnel-heden (kofï) (in het algemeen gemeten bij 25°C) worden gelijktijdig verkregen door het aanpassen van de gegevens aan een 1:1 Langmuir bindingsmodel (Karlsson, R. Roos, 5 H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymoïogy 6:99-110) door het gebruik van het BIAevaluation programma. Evenwichtsdissociatieconstante (Kd) waarden worden berekend als kofl/kon-
In sommige uitvoeringsvormen heeft het anti-trkB agonist polypeptide (waaronder antilichaam) verzwakte effectorftmctie. Zoals hierin wordt gebruikt verwijst een 10 antilichaam of polypeptide dat een “verzwakte effectorftmctie” heeft (onderling uitwisselbaar gebruikt met de term “immunologisch inert”) naar antilichamen of polypeptiden die geen enkele effectorftmctie hebben of verlaagde activiteit of activiteiten van efifec-torftmctie hebben (in vergelijking met antilichaam of polypeptide dat een niet-gemodificeerd of een natuurlijk-voorkomend constant gebied hebben), die bijvoor-15 beeld geen activiteit of verlaagde activiteit hebben bij één of meer van de volgende: a) het opwekken van complement-bemiddelde lysis; b) het stimuleren van antilichaam-afhankelijke cel-bemiddelde cytotoxiciteit (ADCC); en c) het activeren van microglia. De activiteit van effectorftmctie kan worden verlaagd naar ongeveer elk van 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% en 100%. In sommige uitvoerings-20 vormen bindt het antilichaam aan de trkB-receptor zonder aanzienlijke complement-afhankelijke lysis of cel-bemiddelde vernietiging van het doelwit op te wekken. De bindingsplaats van de Fc-receptor op het constante gebied kan bijvoorbeeld worden gemodificeerd of gemuteerd om de bindingsaffmiteit aan bepaalde Fc-receptoren zoals FcyRI, FcyRII, FcyRIII en/of FcyRIV te verwijderen of te verlagen. Voor de eenvoud 25 zal worden verwezen naar antilichamen met de duidelijkheid dat uitvoeringsvormen ook betrekking hebben op polypeptiden. EU-nummeringssysteem (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5de editie, Public Health Service, National Institutes of Healthy, Bethesda, Md., 1991) wordt gebruikt om aan te geven welke aminozuurresidu(en) van het constante gebied (bijvoorbeeld van een IgG-antilichaam) 30 zijn veranderd of gemuteerd. De nummering kan voor een specifiek soort van antilichaam (bijvoorbeeld IgGl) of een soort (bijvoorbeeld mens) worden gebruikt met de duidelijkheid dat overeenkomstige veranderingen tussen soorten van antilichamen en soorten kunnen worden gemaakt.
48
In sommige uitvoeringsvormen omvatten de polypeptiden (waaronder antilicha-men) die specifiek aan een trkB-receptor binden een constant gebied van een zware keten die een verzwakte effectorfunctie heeft. Het constante gebied van de zware keten kan een natuurlijk voorkomende sequentie hebben of is een variant. In sommige uitvoe-5 ringsvormen is de aminozuursequentie van een natuurlijk voorkomend gebied van en zware keten gemuteerd, bijvoorbeeld door aminozuursubstitutie, insertie en/of deletie, waarbij de effectorfunctie van het constante gebied verzwakt is. In sommige uitvoeringsvormen kan de N-glycosylatie van het Fc-gebied van een constant gebied van een zware keten ook zijn veranderd, het kan bijvoorbeeld volledig of gedeeltelijk zijn ver-10 wijderd waarbij de effectorfunctie van het constante gebied verzwakt is.
In sommige uitvoeringsvormen is de effectorfunctie verzwakt door het verwijderen van N-glycosylatie van het Fc-gebied (bijvoorbeeld in het CH2-domein van IgG). In sommige uitvoeringsvormen is N-glycosylatie van het Fc-gebied verwijderd door het muteren van het geglycosyleerde aminozuurresidu of flankerende residuen die deel van 15 de glycosylatie-herkenningssequentie in het constante gebied zijn. De tripeptidesequen-ties asparagine-X-serine (N-X-S), asparagine-X-threonine (N-X-T) en asparagine-X-cysteïne (N-X-C), waarbij X elk aminozuur is behalve proline, zijn de herkenningsse-quenties voor enzymatische verbinding van de koolhydraatgroep aan de zijketen van asparagine voor N-glycosylatie. Het muteren van elk van de aminozuren van de tripep-20 tidesequenties in het constante gebied levert een niet-geglycosyleerd IgG. N-glycosylatieplaats N297 van humaan IgGl en IgG3 kunnen bijvoorbeeld worden gemuteerd naar A, D, Q, K, of H. Zie, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); en Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Het is vermeld dat humaan IgGl en IgG3 met substitutie van Asn-297 met Gin, His, of Lys niet bindt aan de hu-25 mane FcyRI en complement niet activeert waarbij het vermogen van binding van Clq volledig is verloren voor IgGl en dramatisch is verlaagd voor IgG3. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur N in de tripeptidesequenties gemuteerd naar elk van één van de aminozuren A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, T, V, W, Y. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur N in de tripeptide-sequenties gemuteerd 30 naar een conservatieve substitutie. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur X in de tripeptidesequenties gemuteerd naar proline. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur S in de tripeptidesequenties gemuteerd naar A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, V, W, Y. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur T in de tripeptide- 49 sequenties gemuteerd naar A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, V, W, Y. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur C in de tripeptidesequenties gemuteerd naar A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, V, W, Y. In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuur volgend op het tripeptide gemuteerd naar P. In sommige uitvoeringsvormen 5 is de N-glycosylatie in het constante gebied enzymatisch verwijderd (zoals N-glycolase F, endoglycosidase FI, endoglycosidase F2, endoglycosidase F3 en englycosidase H). Het verwijderen van N-glycosylatie kan ook worden bereikt door het produceren van het antilichaam in een cellijn die een deficiëntie voor N-glycosylatie heeft. Wright et al., J Immunol. 160(7):3393-402 (1998).
10 In sommige uitvoeringsvormen is het aminozuurresidu dat interactie vertoont met oligosaccharide dat is verbonden aan de N-glycosylatieplaats van het constante gebied gemuteerd om de bindingsaffïniteit aan FcyRI te verlagen. F241, V264, D265 van humaan IgG3 kunnen bijvoorbeeld zijn gemuteerd. Zie Lund et al., J Immunology 157:4963-4969(1996).
15 In sommige uitvoeringsvormen is de effectorfunctie verzwakt door het modifice ren van gebieden zoals 233-236,297 en/of 327-331 van humaan IgG zoals is beschreven in PCT WO 99/58572 en Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000). Antilichamen die zijn beschreven in PCT WO 99/58572 en Armour et al. omvatten, in aanvulling op een bin-20 dingsdomein dat naar het doelwitmolecuul wordt gestuurd een effectordomein dat een aminozuursequentie heeft die nagenoeg homoloog is aan de gehele of een deel van een constant gebied van een zware keten van een humaan immunoglobuline. Deze antilichamen zijn in staat het doelwitmolecuul te binden zonder aanzienlijke complement-afhankelijke lysis of cel-bemiddelde vernietiging van het doelwit op te wekken. In 25 sommige uitvoeringsvormen heeft het effectordomein een verlaagde affiniteit voor FcyRI, FcyRIIa en FcyRIII. In sommige uitvoeringsvormen is het effectordomein in staat specifiek FcRn en/of FcyRIIb te binden. Deze zijn kenmerkend gebaseerd op chimère domeinen die afkomstig zijn van twee of meer Cn2-domeinen van zware keten van humaan immunoglobuline. Antilichamen die op deze wijze zijn gemodificeerd zijn 30 in het bijzonder geschikt voor gebruik bij chronische antilichaamtherapie om ontstekingen en andere nadelige reacties op gebruikelijke antilichaamtherapie te voorkomen. In sommige uitvoeringsvormen is het constante gebied van de zware keten van het antilichaam een IgGl van een humane zware keten met één van de volgende mutaties: 1) 50 A327A330P331 naar G327S330S331; 2) E233L234L235G236 naar P233V234A235 waarbij G236 is verwijderd; 3) E233L234L235 naar P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 naar P233V234A235G327S330S331 waarbij G236 is verwijderd; 5) E233L234L235A327A330P331 naar 5 P233V234A235G327S330S331; en 6) N297 naar A297 of elk ander aminozuur behal ve N. In sommige uitvoeringsvormen is het constante gebied van de zware keten van het antilichaam een IgG2 van een humane zware keten met de volgende mutaties: A330P331 naar S330S331. In sommige uitvoeringsvormen is het constante gebied van de zware keten van het antilichaam een IgG4 van de humane zware keten met één van 10 de volgende mutaties: E233F234L235G236 naar P233V234A235 waarbij G236 is verwijderd; E233F234L235 naar P233V234A235; en S228L235 naar P228E235.
Het constante gebied kan ook worden gemodificeerd om complement-activatie te verzwakken. Complement-activatie van IgG antilichamen volgend op binding van het Cl-bestanddeel van complement kan worden verlaagd door bijvoorbeeld het muteren 15 van aminozuurresiduen in het constante gebied in een Cl bindingsmotief (bijvoorbeeld Clq-bindingsmotief). Het is vermeld dat Ala-mutatie voor elk van D270, K322, P329, P331 van humaan IgGl het vermogen van het antilichaam om Clq te binden en complement te activeren aanzienlijk verlaagde. Voor IgG2b van muis omvat het Clq-bindingsmotief residuen E318, K320 en K322. Idusogie et al., J. Immunology 20 164:4178-4184 (2000); Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988).
Clq-bindingsmotief E318, K320 en K322, geïdentificeerd voor IgG2b van muis, wordt aangenomen algemeen te zijn voor andere isotypen van antilichamen. Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988). Clq-bindingsactiviteit voor IgG2b kan worden vernietigd door het vervangen van één van de drie gespecificeerde residuen met een residu 25 dat een ongeschikte functionaliteit aan de zijketen ervan heeft. Het is niet noodzakelijk om de ionresiduen alleen met Ala te vervangen om Clq-binding te vernietigen. Het is ook mogelijk andere alkyl-gesubstitueerde niet-ionische residuen te gebruiken zoals Gly, Ile, Leu, of Val, of dergelijke aromatische niet-polaire residuen als Phe, Tyr, Trp en Pro in plaats van één van de drie residuen teneinde Clq-binding uit te sluiten. Het is 30 in aanvulling ook mogelijk om dergelijke polaire niet-ionische residuen als Ser, Thr, Cys en Met te gebruiken in plaats van residuen 320 en 322, maar niet 318, teneinde Clq-bindingsactiviteit uit te sluiten.
51
De uitvinding verschaft ook antilichamen die verzwakte effectorfunctie hebben waarbij het antilichaam een gemodificeerd schamiergebied heeft. Bindingsaffiniteit van humaan IgG voor de Fc-receptoren ervan kan worden gemoduleerd door het modificeren van het schamiergebied. Canfield et al., J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Heza-5 reh et al., J Virol. 75:12161-12168 (2001); Redpath et al., Human Immunology 59:720-727 (1998). Specifieke aminozuurresiduen kunnen worden gemuteerd of worden verwijderd. Het gemodificeerde schamiergebied kan een volledig schamiergebied omvatten dat afkomstig is van een antilichaam van een andere klasse van antilichamen of subklasse van dat van het CH1-domein. Het constante domein (CH1) van een klasse 10 IgG antilichaam kan bijvoorbeeld aan een schamiergebied van een klasse IgG4 antilichaam worden verbonden. Als alternatief kan het nieuwe schamiergebied een deel van een natuurlijke scharnier omvatten of een herhalende eenheid waarbij de eenheid in de herhaling afkomstig is van een natuurlijk schamiergebied. In sommige uitvoeringsvormen is het natuurlijke schamiergebied veranderd door het omzetten van één of meer 15 cysteïne-residuen in een neutraal residu, zoals alanine of door het omzetten van geschikt geplaatste residuen naar cysteïne-residuen. Amerikaans octrooischriftnummer 5.677.425. Dergelijke veranderingen worden uitgevoerd door het gebruik van in het vakgebied bekende eiwitchemie en bij voorkeur technieken van genetische manipulatie en zoals hierin is beschreven.
20 Polypeptiden die op specifieke wijze aan een trkB-receptor binden en zijn gefu seerd aan een constant gebied van een zware keten die verzwakte effectorfuncties heeft kunnen ook voor de werkwijzen die hierin zijn beschreven worden gebruikt. Een voorbeeld van dergelijke fusiepolypeptiden is een immuno-adhesine. Zie bijvoorbeeld Amerikaans octrooischriftnummer 6.153.189.
25 Andere werkwijzen voor het maken van antilichamen die verzwakte effectorfunc tie hebben die in het vakgebied bekend zijn kunnen ook worden gebruikt.
Antilichamen en polypeptiden met gemodificeerde constante gebieden kunnen in één of meer testen worden getest om het niveau van verlaging van biologische activiteit van effectorfunctie in vergelijking met het antilichaam waarvan wordt uitgegaan te be-30 oordelen. Het vermogen van het antilichaam of polypeptide met een veranderd Fc-gebied om complement of Fc-receptoren (bijvoorbeeld Fc-receptoren op microglia) of veranderd schamiergebied te binden kan worden vastgesteld door het gebruik van testen die hierin zijn beschreven alsook elke test die in het vakgebied bekend is. PCT WO
52 99/58572; Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000); Song et al., Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002).
De anti-trkB-agonist antilichamen kunnen worden gemaakt door het gebruik van 5 immunogenen die één of meer extracellulaire domeinen van trkB tot expressie brengen. Eén voorbeeld van een immunogeen zijn cellen met hoge expressie van trkB die kunnen worden verkregen zoals hierin is beschreven. Een ander voorbeeld van een immunogeen dat kan worden gebruikt is een oplosbaar eiwit (zoals een trkB-immunoadhesine) dat het extracellulaire domein of een deel van het extracellulaire do-10 mein van de trkB-receptor bevat.
De route en schema van immunisering van het gastheerdier zijn in het algemeen in overeenstemming met vastgestelde en gebruikelijke technieken voor stimulatie en productie van antilichamen, zoals verder hierin is beschreven. Algemene technieken voor productie van antilichamen van mens en muis zijn in het vakgebied bekend en zijn 15 hierin beschreven.
Het wordt beschouwd dat elke zoogdierlijke patiënt waaronder mensen of antili-chaam-producerende cellen daarvan kunnen worden gemanipuleerd om te dienen als de basis voor de productie van zoogdierlijke, waaronder humane, hybridomacellijnen. Het gastheerdier wordt kenmerkend intraperitoneaal beent met een hoeveelheid immuno-20 geen waaronder zoals hierin is beschreven.
Hybridoma’s kunnen worden bereid van de lymfocyten en onsterfelijk gemaakte myelomacellen door het gebruik van de algemene techniek van hybridisatie van somatische cellen volgens Kohler, B. en Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 of zoals is gemodificeerd door Buck, D. W. et al., (1982) In Vitro, 18:377-381. Verkrijgbare mye-25 loma-cellijnen waaronder maar niet beperkt tot X63-Ag8.653 en die van het Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, kunnen bij de hybridisatie worden gebruikt. De techniek behelst in het algemeen het fuseren van myelomacellen en lymfecellen door het gebruik van een fusogeen zoals polyethyleen-glycol of door middel van elektrische wijzen die bij de deskundigen in het vakgebied goed bekend zijn. 30 Na de fusie worden de cellen van het fusiemedium gescheiden en gekweekt in een selectief groeimedium zoals hypoxanthine-aminopterine-thymidine (HAT) medium, om niet-gehybridiseerde ouderlijke cellen te verwijderen. Elk van de media die hierin zijn beschreven, aangevuld met of zonder serum, kan worden gebruikt voor het kweken van 53 hybridoma’s die monoklonale antilichamen uitscheiden. Als een ander alternatief voor de techniek van celfusie kunnen EBV onsterfelijk gemaakte B-cellen worden gebruikt voor het produceren van de anti-trkB monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding. De hybridoma’s worden uitgebreid en gesubkloneerd, indien gewenst, en 5 supematanten worden getest op anti-immunogeen activiteit door gebruikelijke im-muuntestwerkwijzen (bijvoorbeeld radioactieve immuuntesten, enzym-immuuntesten of fluorescentie-immuuntesten).
Hybridoma’s die als bron van antilichamen kunnen worden gebruikt omvatten alle derivaten, cellen van nageslacht van de ouderlijke hybridoma’s die monoklonale 10 antilichamen produceren die specifiek zijn voor trkB of een deel daarvan.
Hybridoma’s die dergelijke antilichamen produceren kunnen in vitro of in vivo worden gekweekt door het gebruik van bekende werkwijzen. De monoklonale antilichamen kunnen van de kweekmedia of lichaamsvloeistoffen worden geïsoleerd door gebruikelijke werkwijzen van immunoglobulinezuivering zoals ammonium-sulfaat-15 precipitatie, gelelektroforese, dialyse, chromatografie en ultrafiltratie, indien gewenst. Ongewenste activiteit indien die aanwezig is, kan worden verwijderd door bijvoorbeeld het preparaat over adsorberende materialen te laten lopen die zijn gemaakt van het im-munogeen dat aan een vaste-fase is verbonden en het elueren of het vrij maken van de gewenste antilichamen van het immunogeen. Immunisering van een gastheerdier met 20 een trkB-receptor van een mens of een andere soort, of een fragment van de trkB-receptor van de mens of een andere soort of een trkB-receptor of een fragment van een mens of een andere soort die de aminozuursequentie die het doelwit is geconjugeerd heeft aan een eiwit dat immunogeen is in de soort die geïmmuniseerd dient te worden, bijvoorbeeld keyhole limpet hemocyanine, serumalbumine, runderthyroglobuline, of 25 trypsine-remmer van soja door het gebruik van een bifunctioneel of derivatiserend middel, bijvoorbeeld maleïmidobenzoyl-sulfosuccinimide-ester (conjugatie door middel van cysteïneresiduen), N-hydroxy-succinimide (door middel van lysineresiduen), glutaaradehyde, bamsteenzuur-anhydride, SOCI2, of R1N=C=NR, waarbij R en R1 verschillende alkylgroepen zijn, kan een populatie van antilichamen leveren (bijvoor-30 beeld monoklonale antilichamen). Een ander voorbeeld van een immunogeen zijn cellen met hoge expressie van trkB die op recombinante wijze kunnen worden verkregen of door het isoleren of verrijken van cellen van een natuurlijke bron die een hoog niveau van trkB tot expressie brengen. Deze cellen kunnen van oorsprong van mens of 54 ander dier zijn en kunnen worden gebruikt als een immunogeen zoals het direct wordt geïsoleerd of kunnen worden bewerkt zodanig dat immunogeniteit wordt verhoogd of expressie van trkB (van een fragment van trkB) wordt verhoogd of verrijkt. Dergelijke bewerking omvat maar is niet beperkt tot, behandeling van de cellen of fragmenten 5 daarvan met middelen die zijn ontworpen om de stabiliteit of immunogeniteit ervan te verhogen zoals bijvoorbeeld formaldehyde, glutaaraldehyde, ethanol, aceton en/of verscheidene zuren. Ofwel voorafgaand of na een dergelijke behandeling kunnen de cellen verder worden bewerkt teneinde te verrijken op het gewenste immunogeen, in dit geval trkB of een fragment daarvan. Deze stappen van bewerking kunnen technieken van 10 membraan-fractionering omvatten die in het vakgebied goed bekend zijn.
Indien gewenst kan van het anti-trkB-antilichaam (monoklonaal of polyklonaal) van belang de sequentie worden geanalyseerd en de polynucleotidesequentie kan vervolgens in een vector worden gekloneerd voor expressie of uitbreiding. De sequentie die voor het antilichaam van belang codeert kan in een vector in een gastheercel wor-15 den aangehouden en de gastheercel kan vervolgens worden uitgebreid en worden bevroren voor toekomstig gebruik. Als een alternatief kan de polynucleotidesequentie voor genetische manipulatie worden gebruikt om het antilichaam te “humaniseren” of om de affiniteit of andere kenmerken van het antilichaam te verbeteren. Het constante gebied kan bijvoorbeeld worden gemanipuleerd om meer overeen te komen met huma-20 ne constante gebieden voor het voorkomen van een immuunrespons indien het antilichaam in klinische proefnemingen en behandelingen bij mensen wordt gebruikt. Het kan gewenst zijn om de antilichaamsequentie genetisch te manipuleren teneinde een hogere affiniteit voor de trkB-receptor en hogere werkzaamheid bij het activeren van de trkB-receptor te verkrijgen. Het zal voor de deskundige in het vakgebied duidelijk zijn 25 dat één of meer veranderingen van polynucleotiden in het anti-trkB-antilichaam kunnen worden gemaakt en nog steeds het vermogen van binding ervan aan het extracellulaire domein of epitopen van trkB aan te houden.
Er zijn vier algemene stappen om een monoklonaal antilichaam te humaniseren. Deze zijn: (1) het bepalen van de nucleotide- en voorspelde aminozuursequentie van de 30 variabele domeinen van de lichte en zware keten van het antilichaam waarvan wordt uitgegaan, (2) het ontwerpen van het gehumaniseerde antilichaam, d.w.z. het beslissen welk skeletgebied van het antilichaam moet worden gebruikt gedurende de werkwijze van humanisering, (3) de werkelijke werkwijzen/technieken voor humanisering en (4) 55 de transfectie en expressie van het gehumaniseerde antilichaam. Zie bijvoorbeeld Amerikaanse octrooischriftnummers 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; 6.180.370; en 6.548.640. Het constante gebied kan bijvoorbeeld worden gemanipuleerd om meer overeen te komen met huma-5 ne constante gebieden om immuunresponsen te voorkomen indien het antilichaam in klinische proefnemingen en behandelingen bij mensen wordt gebruikt. Zie bijvoorbeeld Amerikaanse octrooischriftnummers 5.997.867 en 5.866.692.
Een aantal “gehumaniseerde” antilichaammoleculen die een antigeen-bindende plaats omvatten die afkomstig is van een niet-humaan immunoglobuline zijn beschre-10 ven waaronder chimere antilichamen die V-gebieden van knaagdieren of gemodificeerde V-gebieden van knaagdieren en de geassocieerde complementariteits-bepalende gebieden (CDR’s) ervan gefuseerd aan humane constante domeinen hebben. Zie bijvoorbeeld Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987) en 15 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987). Andere referenties beschrijven CDR’s van knaagdieren die zijn getransplanteerd in een humaan ondersteunend skeletgebied (FR) voorafgaand aan fusie met een geschikt constant domein van een humaan antilichaam. Zie bijvoorbeeld Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) en Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Een an-20 dere referentie beschrijft CDR’s van knaagdieren die worden ondersteund door op re-combinante wijze gemanipuleerde skeletgebieden van knaagdieren. Zie bijvoorbeeld Europese octrooipublicatie nummer 519.596. Deze “gehumaniseerde” moleculen zijn ontworpen voor het minimaliseren van ongewenste immunologische responsen tegen anti-humane antilichaammoleculen van knaagdieren die de duur en de effectiviteit van 25 therapeutische toepassingen van die groepen bij humane ontvangers beperkt. Het constante gebied van een antilichaam kan zodanig worden gemanipuleerd dat het immunologisch inert is, het wekt bijvoorbeeld geen complement-bemiddelde lysis op of het stimuleert geen antilichaam-afhankelijke cel-bemiddelde cytotoxiciteit (ADCC). In andere uitvoeringsvormen wordt het constante gebied gemodificeerd zoals is beschre-30 ven in Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT Aanvraag nummer PCT/GB99/-01441; en/of UK octrooi-aanvraag nummer 9809951.8.
Zie bijvoorbeeld PCT/GB99/01441; UK octrooi-aanvraag nummer 9809951.8. Andere werkwijzen voor het humaniseren van antilichamen die ook kunnen worden 56 gebruikt zijn beschreven door Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) en in Amerikaanse octrooischriftnummers 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; 6.350.861; en PCT Publicatienummer WO 01/27160.
In nog een ander alternatief kunnen volledig humane antilichamen worden ver-5 kregen door het gebruik van in de handel verkrijgbare muizen die zijn gemanipuleerd om specifieke humane immunoglobuline-eiwitten tot expressie te brengen. Transgene dieren die zijn ontworpen om een meer gewenst (bijvoorbeeld volledige humane antilichamen) of meer robuuste immuunresponsen te produceren kunnen ook worden gebruikt voor het genereren van gehumaniseerde of humane antilichamen. Voorbeelden 10 van een dergelijke technologie zijn Xenomouse™ van Abgenix, Inc. (Fremont, CA) en HuMAb-Mouse® en TC Mouse™ van Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
In een alternatief kunnen antilichamen op recombinante wijze worden gemaakt en tot expressie worden gebracht door het gebruik van elke werkwijze die in het vakgebied bekend is. In een ander alternatief kunnen antilichamen op recombinante wijze worden 15 gemaakt door faag-display technologie. Zie bijvoorbeeld Amerikaanse octrooischriftnummers 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743 en 6.265.150; en Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Als alternatief kan de faag-display technologie (McCaf-ferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) worden gebruikt voor het produceren van humane antilichamen en antilichaamfragmenten in vitro van genrepertoires van het varia-20 bele (V) domein van immunoglobulinen van niet-geïmmuniseerde donors. Volgens deze techniek worden genen voor V-domeinen van antilichamen in het leeskader gekloneerd in een gen voor ofwel een voornaam of minder aanwezig manteleiwit van een filamenteuze bacteriofaag zoals Ml3 of fd en als functionele antilichaamfragmenten vertoond op het oppervlak van het faagdeeltje. Omdat het filamenteuze deeltje een ko-25 pie van enkelstrengs DNA van het faaggenoom bevat resulteren selecties die zijn gebaseerd op de functionele eigenschappen van het antilichaam ook in selectie van het gen dat voor het antilichaam dat die eigenschappen vertoont codeert. De faag bootst aldus sommige van de eigenschappen van de B-cel na. Faag-display kan in een verscheidenheid van formaten worden uitgevoerd; zie voor een samenvatting bijvoorbeeld Johnson, 30 Kevin S. en Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Verscheidene bronnen van V-gen segmenten kunnen voor faagdisplay worden gebruikt. Clackson et ai, Nature 352:624-628 (1991) isoleerden een diverse array van anti-oxazolon antilichamen van een kleine willekeurige combinatoriële bibliotheek van 57 V-genen die afkomstig zijn van de milten van geïmmuniseerde muizen. Een repertoire van V-genen van niet-geïmmuniseerde humane donors kan worden geconstrueerd en antilichamen tegen een diverse array van antigenen (waaronder zelf-antigenen) kunnen worden geïsoleerd in wezen door het volgen van de technieken die zijn beschreven 5 door Mark et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), of Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993). Bij een natuurlijke immuunrespons accumuleren antilichaamgenen mutaties bij een hoge snelheid (somatische hypermutatie). Sommige van de veranderingen die worden geïntroduceerd zullen hogere affiniteit verlenen en B-cellen die irnmu-noglobuline met hoge affiniteit van het oppervlak vertonen worden bij voorkeur gere-10 pliceerd en gedifferentieerd gedurende daaropvolgende provocatie met antigeen. Dit natuurlijke proces kan worden nagebootst door het gebruik van de techniek die bekend is als “chain shuffling” Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Bij deze werkwijze kan de affiniteit van “primaire” humane antilichamen die door faagdisplay worden verkregen worden verbeterd door het opeenvolgend vervangen van de genen voor 15 het V-gebied van zware en lichte keten met reperoires van natuurlijk voorkomende varianten (repertoires) van genen van het V-domein die van niet-geïmmuniseerde donoren zijn verkregen. Deze techniek maakt de productie mogelijk van antilichamen en antilichaamfragmenten met affiniteiten in het traject van pM-nM. Een strategie voor het maken van zeer grote repertoires van faag-antilichaam (ook bekend als de “moeder van 20 alle bibliotheken”) is beschreven door Waterhouse et al, Nucl Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Gene-shuffiing kan ook worden gebruikt voor het verkrijgen van humane antilichamen van antilichamen van knaagdieren waarbij het humane antilichaam overeenkomstige affiniteiten en specificiteiten als het antilichaam van knaagdieren waarvan werd uitgegaan heeft. Volgens deze werkwijze, waarnaar ook wordt verwezen als “epi-25 toop imprinting”, wordt het gen voor het V-domein van de zware of lichte keten van antilichamen van knaagdieren dat is verkregen door de faag-display techniek vervangen met een repertoire van genen voor het humane V-domein waardoor chimeren van knaagdier-mens worden gevormd. Selectie op antigeen resulteert in isolatie van humane variabele gebieden die in staat zijn een functionele antigeen-bindingsplaats te her-30 stellen, d.w.z. het epitoop stuurt (afdruk) van de keuze van de partner. Wanneer de werkwijze wordt herhaald teneinde het resterende V-domein van knaagdier te vervangen wordt een humaan antilichaam verkregen (zie PCT publicatienummer WO 93/06213, gepubliceerd op 1 april, 1993). Anders dan traditionele humanisatie van anti- 58 lichamen van knaagdieren door CDR-transplantatie verschaft deze techniek volledige humane antilichamen die geen skelet of CDR-residuen hebben die van oorsprong van knaagdier zijn. Het is duidelijk dat alhoewel de discussie van hierboven betrekking heeft op gehumaniseerde antilichamen dat de algemene principes die zijn besproken 5 toepasbaar zijn voor het op maat maken van antilichamen voor gebruik bij bijvoorbeeld honden, katten, primaten, paarden en runderen.
Het antilichaam dat een bispecifïek antilichaam kan zijn, een monoklonaal antili-chaam dat bindingsspecificiteiten heeft voor tenminste twee verschillende anti genen, kan worden bereid door het gebruik van de antilichamen die hierin zijn beschreven. 10 Werkwijzen voor het maken van bispecifïeke antilichamen zijn in het vakgebied bekend (zie bijvoorbeeld Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Op traditionele wijze was de recombinante productie van bispecifieke antilichamen gebaseerd op de gezamenlijke expressie van twee paren van zware keten-lichte keten van immu-noglobulinen, waarbij de twee zware ketens verschillende specificiteiten hebben (Mill-15 stein en Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).
Volgens één benaderingswijze voor het maken van bispecifieke antilichamen worden variabele domeinen van antilichamen met de gewenste bindingsspecificiteiten (antilichaam-antigeen combinerende plaatsen) aan sequenties voor het constante domein van een immunoglobuline gefuseerd. De fusie is bij voorkeur met een constant 20 domein van een zware keten van een immunoglobuline die tenminste een deel van de scharnier, CH2- en CH3-gebieden omvat. Het is van voorkeur dat het constante gebied (CH1) van de eerste zware keten, die de plaats bevat die nodig is voor binding van de lichte keten, in tenminste één van de fusies aanwezig is. DNA’s die voor fusies van de zware keten van immunoglobuline en indien gewenst de lichte keten van immunoglo-25 buline coderen worden in afzonderlijke expressievectoren geïnsereerd en worden tezamen in een geschikt gastheerorganisme getransfecteerd. Dit verschaft grote flexibiliteit bij het aanpassen van de wederzijdse verhoudingen van de drie polypeptidefragmenten in uitvoeringsvormen waarbij ongelijke ratio’s van de drie polypeptideketens die bij de constructie worden gebruikt optimale opbrengsten verschaffen. Het is echter mogelijk 30 om de coderende sequenties voor twee of alle drie polypeptideketens in één expressie-vector te insereren wanneer de expressie van tenminste twee polypeptideketens in gelijke verhoudingen in hoge opbrengsten resulteert of wanneer de verhoudingen niet van specifieke betekenis zijn.
59
In één benaderingswijze zijn de bispecifieke antilichamen samengesteld uit een hybride zware keten van immunoglobuline met een eerste bindingsspecificiteit in één arm en een hybride paar van zware keten-lichte keten van immunoglobuline (die een tweede bindingsspecificiteit verschaft) in de andere arm. Deze asymmetrische structuur 5 met een lichte keten van immunoglobuline in maar de helft van het bispecifieke molecuul, bewerkstelligt de scheiding van de gewenste bispecifieke verbinding van ongewenste combinaties van ketens van immunoglobulinen. Deze benaderingswijze is beschreven in PCT publicatienummer WO 94/04690, gepubliceerd op 3 maart, 1994.
Heteroconjugaat antilichamen die twee covalent verbonden antilichamen omvat-10 ten vallen ook binnen de beschermingsomvang van de uitvinding. Dergelijke antilichamen zijn gebruikt om cellen van het immuunsysteem doelgericht naar ongewenste cellen te sturen (Amerikaans octrooischriftnummer 4.676.980) en voor de behandeling van HIV-infectie (PCT Publicatienummers WO 91/00360 en WO 92/200373; en EP 03089). Heteroconjugaat antilichamen kunnen worden gemaakt door het gebruik van 15 elke geschikte werkwijze van verknoping. Geschikte verknopende middelen en technieken zijn in het vakgebied goed bekend en zijn beschreven in Amerikaans octrooischriftnummer 4.676.980.
Antilichamen kunnen op recombinante wijze worden gemaakt door eerst het isoleren van de antilichamen die door gastheerdieren worden gemaakt, het verkrijgen van 20 de gensequentie en het gebruik van de gensequentie voor het tot expressie brengen van het antilichaam op recombinante wijze in gastheercellen (bijvoorbeeld CHO-cellen). Een andere werkwijze die kan worden gebruikt is het tot expressie brengen van de anti-lichaamsequentie in planten (bijvoorbeeld tabak), transgene melk of in andere organismen. Werkwijzen voor het tot expressie brengen van antilichamen op recombinante 25 wijze in planten of melk zijn beschreven. Zie bijvoorbeeld Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. en D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol 3:65; en Pollock et al.
(1999) J Immunol Methods 231:147. Werkwijzen voor het maken van derivaten van antilichamen, bijvoorbeeld gehumaniseerd, single chain, enzovoort, zijn in het vakgebied bekent.
30 Chimere of hybride antilichamen kunnen ook in vitro worden bereid door het ge bruik van bekende werkwijzen van synthetische eiwitchemie, waaronder die welke verknopende middelen behelzen. Immunotoxinen kunnen bijvoorbeeld worden geconstrueerd door het gebruik van een disulfide-uitwisselingsreactie of door het vormen van een 60 thioetherbinding. Voorbeelden van geschikte reagens voor dit doel omvatten iminothio-laat en methyl-4-mercaptobutyrimidaat.
Single chain Fv-fragmenten kunnen ook worden geproduceerd zoals is beschreven in Iliades et al., 1997, FEBSLetters, 409:437-441. Koppeling van dergelijke single 5 chain fragmenten door het gebruik van verscheidene linkers is beschreven in Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433. Een verscheidenheid van technieken voor de recombinante productie en manipulatie van antilichamen zijn in het vakgebied goed bekend.
Antilichamen kunnen worden gemodificeerd zoals is beschreven in PCT Publica-10 tienummer WO 99/58572, gepubliceerd op 18 november 1999. Deze antilichamen omvatten in aanvulling op een bindingsdomein dat naar het doelwitmolecuul wordt gestuurd, een effectordomein dat een aminozuursequentie heeft die nagenoeg homoloog is aan het gehele of een deel van een constant domein van een zware keten van humaan immunoglobuline. Deze antilichamen zijn in staat het doelwitmolecuul te binden zon-15 der aanzienlijke complement-afhankelijke lysis of cel-bemiddelde vernietiging van het doelwit op te wekken. Het effectordomein is bij voorkeur in staat FcRn en/of FcyRIIb specifiek te binden. Deze zijn kenmerkend gebaseerd op chimere domeinen die afkomstig zijn van twee of meer C^-domeinen van zware keten van humaan immunoglobuline. Antilichamen die op deze wijze zijn gemodificeerd zijn van voorkeur voor gebruik 20 bij chronische antilichaamtherapie voor het voorkomen van ontstekingsreacties en andere nadelige reacties op gebruikelijke antilichaamtherapie.
De antilichamen die door ofwel immunisering van een gastheerdier of op recombinante wijze zijn gemaakt zouden één of meer van de trkB-activiteiten die hierin zijn beschreven moeten vertonen.
25 Technieken van immuuntesten en flow-cytometrie sortering zoals fluorescentie- geactiveerde celsortering (FACS) kunnen ook worden gebruikt voor het isoleren van antilichamen die specifiek zijn voor trkB.
De antilichamen kunnen aan vele verschillende dragers worden gebonden. Dragers kunnen actief en/of inert zijn. Voorbeelden van goed-bekende dragers omvatten 30 polypropyleen, polystyreen, polyethyleen, dextran, nylon, amylasen, glas, natuurlijke en gemodificeerde cellulosen, polyacrylamiden, agarosen en magnetiet. Het aard van de drager kan ofwel oplosbaar of onoplosbaar zijn voor de doeleinden van de uitvinding. De deskundigen in het vakgebied zullen andere geschikte dragers voor het binden van 61 antilichamen weten of zullen in staat dergelijke vast te stellen door het gebruik van routine experimenten.
Van DNA dat voor agonist-trkB-antilichamen codeert kan de sequentie worden geanalyseerd zoals in het vakgebied bekend is. Het monoklonale antilichaam wordt in 5 het algemeen eenvoudig geïsoleerd en de sequentie ervan geanalyseerd door het gebruik van gebruikelijke werkwijzen (bijvoorbeeld door het gebruik van oligonucleoti-de-probes die in staat zijn specifiek te binden aan genen die voor de zware en lichte ketens van monoklonale antilichamen coderen). De hybridomacellen dienen als een bron van voorkeur voor dergelijk cDNA. Eenmaal geïsoleerd kan het DNA in expres-10 sievectoren (zoals expressievectoren die zijn beschreven in PCT publicatie-nummer WO 87/04462) worden geplaatst die vervolgens worden getransfecteerd in gastheercellen zoals cellen van E. coli, COS-cellen van aap, eierstokcellen van Chinese hamster (CHO) of myelomacellen die op andere wijze geen immunoglobuline-eiwit produceren, voor het verkrijgen van de synthese van monoklonale antilichamen in recombinante 15 gastheercellen. Zie bijvoorbeeld PCT publicatienummer WO 87/04462. Het DNA kan ook worden gemodificeerd door bijvoorbeeld het substitueren van de coderende sequentie voor de constante domeinen van de humane zware en lichte keten in plaats van de homologe sequenties van muis, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984), of door het op covalente wijze verbinden aan de coderende sequentie van im-20 munoglobuline de gehele of een deel van de coderende sequentie voor een niet-immunoglobuline polypeptide. Op die wijze worden “chimere” of “hybride” antilichamen bereid die de bindingsspecificiteit hebben van een anti-trkB monoklonaal antilichaam van hierin. Het DNA dat voor het agonist anti-trkB-antilichaam codeert (zoals een antigeen-bindend fragment daarvan) kan ook worden gebruikt voor de aflevering 25 en expressie van agonist anti-trkB-antilichaam in een gewenste cel zoals hierin is beschreven. Technieken van DNA-aflevering zijn hierin verder beschreven.
Anti-trkB-anti lichamen kunnen worden gekarakteriseerd door het gebruik van werkwijzen die in het vakgebied goed bekend zijn. Eén werkwijze is bijvoorbeeld het identificeren van het epitoop waar aan het bindt, waaronder het oplossen van de kristal-30 structuur van een complex van antilichaam-antigeen, competitietesten, testen op expressie van genfragmenten en testen die zijn gebaseerd op synthetische peptiden, zoals bijvoorbeeld is beschreven in Hoofdstuk 11 van Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New 62
York, 1999. In een aanvullend voorbeeld kan het in kaart brengen van het epitoop worden gebruikt voor het bepalen van de sequentie waar aan een anti-trkB-antilichaam bindt. Het in kaart brengen van het epitoop is van verschillende bronnen in de handel verkrijgbaar, bijvoorbeeld Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Ne-5 derland). Het epitoop kan een lineair epitoop zijn, d.w.z. aanwezig is een enkel stuk van aminozuren, of een conformationeel epitoop dat wordt gevormd door een driedimensionale interactie van aminozuren die niet noodzakelijkerwijs in een enkel stuk aanwezig kunnen zijn. Peptiden met variërende lengte (bijvoorbeeld een lengte van tenminste 4-6 aminozuren) kunnen worden geïsoleerd of gesynthetiseerd (bijvoorbeeld op recombi-10 nante wijze) en worden gebruikt voor bindingstesten met anti-trkB-antilichaam. In een ander voorbeeld kan het epitoop waar aan het anti-trkB-antilichaam bindt in een systematische screening worden bepaald door het gebruik van overlappende peptiden die afkomstig zijn van de extracellulaire sequentie van trkB en het bepalen van binding door het anti-trkB antilichaam. Volgens testen op expressie van het genfragment wordt 15 het open leeskader dat voor trkB codeert ofwel willekeurig of door specifieke genetische constructies gefragmenteerd en de reactiviteit van de tot expressie gebrachte fragmenten van trkB met het antilichaam dat getest dient te worden wordt bepaald. De genfragmenten kunnen bijvoorbeeld door PCR worden geproduceerd en vervolgens worden getranscribeerd en in vitro naar eiwit worden getranslateerd in de aanwezigheid 20 van radioactieve aminozuren. De binding van het antilichaam aan de radioactief gemerkte trkB-fragmenten wordt vervolgens bepaald door immunoprecipitatie en gelelek-troforese. Bepaalde epitopen kunnen ook worden geïdentificeerd door het gebruik van grote bibliotheken van willekeurige peptidesequenties die op het oppervlak van faag-deeltjes worden vertoond (faagbibliotheken).
25 Nog een andere werkwijze die kan worden gebruikt voor het karakteriseren van een anti-trkB antilichaam is het gebruik van competitietesten met andere antilichamen waarvan bekend is dat ze aan hetzelfde antigeen binden, d.w.z. het extracellulaire domein van trkB om te bepalen of het anti-trkB antilichaam aan hetzelfde epitoop bindt als andere antilichamen. Competitietesten zijn bij de deskundigen in het vakgebied 30 goed bekend. Voorbeelden van antilichamen die bruikbaar zijn in competitietesten omvatten de volgende: antilichamen 6.1.2, 6.4.1, 2345, 2349, 2.5.1, 2344, 2248, 2250, 2253 en 2256. Zie PCT publicatienummer WO 01/98361.
63
Het in kaart brengen van epitopen kan ook worden uitgevoerd door het gebruik van domein-verwisselde mutanten zoals is beschreven PCT Publicatienummer WO 01/98361. In het algemeen is deze benaderingswijze bruikbaar voor anti-trkB antili-chamen die niet aanzienlijk kruisreactie vertonen met trkA of trkC. Domein-5 verwisselde mutanten van trkB kunnen worden gemaakt door het vervangen van extra-cellulaire domeinen van trkB met de overeenkomstige domeinen van trkC of trkA. De binding van elke agonist anti-trkB antilichaam aan verscheidene domein-verwisselde mutanten kan worden beoordeeld en met de binding ervan aan wildtype (natief) trkB worden vergeleken door het gebruik van ELISA of andere werkwijzen die in het vak-10 gebied bekend zijn. In een andere benaderingswijze kan alanine-scanning worden uitgevoerd. Afzonderlijke residuen van het antigeen, de trkB-receptor, worden systematisch gemuteerd naar een ander aminozuur (gewoonlijk alanine) en het effect van de veranderingen wordt bepaald door het testen van het vermogen van het gemodificeerde trkB om aan het antilichaam te binden door het gebruik van ELISA of andere werkwij-15 zen die in het vakgebied bekend zijn.
BDNF-polypeptiden
De trkB-agonist die in de werkwijzen volgens de uitvinding wordt gebruikt om-20 vat BDNF-polypeptiden. Zoals hierin wordt gebruikt omvat “BDNF-polypeptide” natuurlijk voorkomend rijp eiwit (onderling uitwisselbaar “BDNF” genoemd) zoals rijp humaan BDNF getoond in Amerikaans octrooischrift nummer 5.180.820 en natuurlijk voorkomende varianten van de aminozuursequentie van BDNF; varianten van de ami-nozuursequentie van BDNF; peptidefragmenten van rijp BDNF (zoals humaan) en de 25 varianten van de aminozuursequentie; en gemodificeerde vormen van rijp BDNF en de varianten van de aminozuursequentie en peptidefragmenten waarbij het polypeptide of peptide covalent is gemodificeerd door substitutie met een groep die anders is dan een natuurlijk voorkomend aminozuur zolang de variant van de aminozuursequentie, pepti-deffagment en de gemodificeerde vorm daarvan één of meer biologische activiteiten 30 van een trkB-agonist en/of van natuurlijk voorkomend rijp BDNF-eiwit toont. De trkB-agonist omvat ook fusie-eiwitten en conjugaten die elk van de uitvoeringsvormen van het BDNF-polypeptide die hierin zijn beschreven omvatten bijvoorbeeld een BDNF-polypeptide geconjugeerd of gefuseerd aan een groep die de halfwaardetijd verlengt, 64 zoals een PEG of een peptide. De varianten van de aminozuur-sequentie, peptidefrag-menten (waaronder fragmenten van varianten) of gemodificeerde vormen daarvan die worden beschouwd omvatten niet NGF, NT-4/5 of NT-3 van elke dierlijke soort. BDNF-polypeptiden omvatten elk van één of meer uitvoeringsvormen die hierin zijn 5 beschreven. BDNF-polypeptide omvat bijvoorbeeld een natuurlijk-voorkomende sequentie met één of meer inserties, deleties of substituties van aminozuren.
In sommige uitvoeringsvormen is het BDNF-polypeptide een zoogdierlijk BDNF-polypeptide dat een natuurlijk-voorkomend zoogdierlijk BDNF kan zijn of een BDNF-polypeptide dat afkomstig is van een natuurlijk voorkomende zoogdierlijke 10 BDNF en een sequentie heeft die niet overeenkomt met elk deel van een natuurlijk-voorkomend niet-zoogdierlijk BDNF. In sommige uitvoeringsvormen is het BDNF-polypeptide een humaan BDNF-polypeptide dat een natuurlijk-voorkomend humaan BDNF kan zijn of een BDNF-polypeptide dat afkomstig is van een natuurlijk-voorkomende humane BDNF en die een sequentie heeft die niet overeenkomt met elk 15 deel van een natuurlijk voorkomende niet-humane BDNF.
BDNF-polypeptiden waaronder varianten, peptidefragmenten, gemodificeerde vormen van BDNF-polypeptiden (waaronder natuurlijk voorkomende BDNF), fusie-eiwitten en conjugaten van de uitvinding worden gekenmerkt door elk (één of meer) van de volgende kenmerken: 20 (a) bindt aan de trkB-receptor, (b) bindt aan de trkB-receptor en activeert biologische activiteiten) van trkB en/of één of meer stroomafwaartse routes die worden bemiddeld door signalerende functie(s) van trkB; 25 (c) bindt aan de trkB-receptor en verhoogt het lichaamsgewicht en/of voedselop- name bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; (d) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van cachexie bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; 30 (e) bindt een de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van anorexia nervosa bij een primaat wanneer het perifeer wordt toegediend; 65 (f) bindt aan de trkB-receptor en zorgt voor de behandeling, het voorkomen, het omkeren of het verbeteren van één of meer symptomen van opioïde-geïnduceerd braken bij een zoogdier wanneer het perifeer wordt toegediend; (g) bevordert de dimerisatie en activatie van de trkB-receptor; en 5 (h) verhoogt de trkB-receptor-afhankelijke neuronale overleving en/of uitgroei van neurieten. Alle BDNF-polypeptiden (waaronder varianten, fragmenten en gemodificeerde vormen) zijn aldus functioneel zoals hierboven is beschreven.
Biologische activiteit van varianten kan in vitro en in vivo worden getest door het 10 gebruik van werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn en de werkwijzen die hierin zijn beschreven. BDNF-polypeptiden kunnen een verhoogde activiteit of verlaagde activiteit hebben in vergelijking met een natuurlijk voorkomend BDNF-eiwit. In sommige uitvoeringsvormen hebben functioneel gelijkwaardige varianten tenminste ongeveer elk van 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, of 95% activiteit in vergelijking 15 met het natieve BDNF-eiwit waarvan het BDNF-polypeptide wordt verkregen met betrekking tot één of meer biologische testen die hierboven zijn beschreven (of in het vakgebied bekend zijn). In sommige uitvoeringsvormen hebben functioneel gelijkwaardige varianten een EC50 (helft van de maximale effectieve concentratie) van lager dan ongeveer elk van 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, of 100 nM bij activatie van de 20 TrkB-receptor in vitro (bijvoorbeeld testen die zijn beschreven in Voorbeeld 6 en in US 2005/0209148 en PCT WO 2005/082401).
Varianten van de aminozuursequentie van BDNF omvatten polypeptiden die een aminozuursequentie hebben die van natuurlijk voorkomend BDNF verschilt bij wijze van de insertie, deletie en/of substitutie van één of meer aminozuurresiduen in de se-25 quentie van natuurlijk voorkomend BDNF (bijvoorbeeld rijp humaan BDNF). Varianten van de aminozuursequentie zullen in het algemeen tenminste ongeveer 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, of 99% identiek zijn aan elk natuurlijk voorkomend BDNF (zoals rijp humaan BDNF). In sommige uitvoerings-vormen is de variant tenminste ongeveer 70% identiek aan de aminozuursequentie van rijp humaan 30 BDNF. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 85% identiek aan de aminozuursequentie van rijp humaan BDNF. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 90% identiek aan de aminozuur-sequentie van rijp hu- 66 maan BDNF. In sommige uitvoeringsvormen is de variant tenminste ongeveer 95% identiek aan de aminozuursequentie van rijp humaan BDNF.
Dergelijke variaties die bijvoorbeeld BDNF omzetten naar NGF, BDNF of NT-3 zijn natuurlijk niet binnen de beschermingsomvang van deze uitvinding opgenomen.
5 Terwijl de plaats voor het introduceren van een variatie van de aminozuursequentie vooraf wordt bepaald hoeft aldus de aard van de mutatie niet vooraf worden bepaald. Om de werking van een mutatie op een bepaalde plaats te optimaliseren wordt bijvoorbeeld ala-scanning of willekeurige mutagenese op het codon of het gebied dat het doelwit is uitgevoerd en de tot expressie gebrachte varianten van BDNF worden ge-10 screend op de optimale gewenste activiteit.
Deleties van de aminozuursequentie variëren in het algemeen van ongeveer 1 tot 30 residuen, met meer voorkeur ongeveer 1 tot 10 residuen en zijn kenmerkend opeenvolgend. Deleties kunnen in gebieden van lage homologie tussen BDNF, NGF, NT-3 en NT-4/5 worden uitgevoerd om de activiteit van BDNF te modificeren. Deleties van 15 BDNF in gebieden van aanzienlijke homologie met NT-4/5, NT-3 en NGF kunnen meer aannemelijk de biologische activiteit van BDNF meer aanzienlijk modificeren. Het aantal opeenvolgende deleties kan zodanig worden geselecteerd dat de tertiaire structuur van BDNF in het betrokken domein, bijvoorbeeld bèta-pleated sheet of alfa-helix, bewaard blijft.
20 Inserties in de aminozuursequentie omvatten amino- en/of carboxyl-eindstandige fusies die in lengte variëren van één residu tot polypeptiden die een duizend of meer residuen bevatten alsook inserties in de sequentie van een enkele of meerdere amino-zuurresiduen. Inserties in de sequentie (d.w.z. inserties in de sequentie voor rijp BDNF) kunnen in het algemeen variëren van ongeveer 1 tot 10 residuen, met meer voorkeur 1 25 tot 5, met meeste voorkeur 1 tot 3. Een voorbeeld van een eindstandige insertie omvat fusie van een heterologe N-eindstandige signaalsequentie aan het N-uiteinde van het BDNF-molecuul voor het bewerkstelligen van de uitscheiding van rijp BDNF van de recombinante gastheer. Dergelijke signalen zullen in het algemeen homoloog zijn aan de beoogde gastheercel en omvat STII of Ipp voor E. coli, alfa-factor voor gist en virale 30 signalen zoals herpes gD voor zoogdierlijke cellen. Andere inserties omvatten de fusie van een polypeptide aan de N- of C-uiteinden van BDNF.
Een andere groep van varianten omvat die waarbij tenminste één aminozuurresi-du in BDNF en bij voorkeur maar één is verwijderd en een ander residu in de plaats 67 ervan is geïnsereerd. Een voorbeeld is de vervanging van arginine en lysine door andere aminozuren om het BDNF resistent te maken tegen proteolyse door serineproteasen waardoor een variant van BDNF wordt gevormd die meer stabiel is. De plaatsen die van het grootste belang zijn voor substitutionele mutagenese omvatten plaatsen waar de 5 aminozuren die in BDNF, NGF, NT-3 en NT-4/5 worden gevonden aanzienlijk verschillend zijn in termen van omvang van de zijketen, lading of hydrofobiciteit, maar waar er ook een hoog niveau van homologie is op de geselecteerde plaats tussen de verscheidene analoga van NGF, NT-3 en NT-4/5 van verscheidene dieren (bijvoorbeeld onder NGF’s van alle dieren, alle NT-3 van alle dieren en alle BDNF’s van alle dieren). 10 Deze analyse zal residuen benadrukken die betrokken zouden kunnen zijn bij de differentiatie van activiteit van de trofische factoren en daardoor zouden varianten op deze plaatsen dergelijke activiteiten kunnen beïnvloeden. Andere plaatsen van belang zijn die waarbij de residuen identiek zijn tussen BDNF, NGF, NT-3 en NT-4/5 van alle dierlijke soorten, deze mate van conformatie suggereert belangrijkheid bij het verkrij-15 gen van biologische activiteit die algemeen is voor alle vier factoren.
Substitutie van één of meer aminozuren omvat bijvoorbeeld conservatieve substituties. Werkwijzen voor het maken van conservatieve substituties zijn in het vakgebied bekend. Ala (A) kan bijvoorbeeld worden gesubstitueerd door val, leu, ile, bij voorkeur door val; arg (R) kan worden gesubstitueerd door lys, gin, asn, bij voorkeur door lys; 20 asn (N) kan worden gesubstitueerd door gin, his, lys, arg, bij voorkeur door gin; asp (D) kan worden gesubstitueerd door glu; cys (C) kan worden gesubstitueerd door ser; gin (Q) kan worden gesubstitueerd door asn; glu (E) kan worden gesubstitueerd door asp; gly (G) kan worden gesubstitueerd door pro; his (H) kan worden gesubstitueerd door asn, gin, lys, arg; bij voorkeur door arg; ile (I) kan worden gesubstitueerd door leu, val, 25 met, ala, phe, norleucine, bij voorkeur door leu; leu (L) kan worden gesubstitueerd door norleucine, ile, val, met; ala; phe, bij voorkeur door ile; lys (K) kan worden gesubstitueerd door arg; gin, asn, bij voorkeur door arg; met (M) kan worden gesubstitueerd door leu; phe; ile, bij voorkeur door leu; phe (F) kan worden gesubstitueerd door leu, val, ile, ala, bij voorkeur door leu; pro (P) kan worden gesubstitueerd door gly; ser (S) kan 30 worden gesubstitueerd door thr; thr (T) kan worden gesubstitueerd door ser; tip (W) kan worden gesubstitueerd door tyr; tyr (Y) kan worden gesubstitueerd door trp, phe, thr, ser, bij voorkeur door phe; val (V) kan worden gesubstitueerd door ile; leu; met; phe, ala; norleucine, bij voorkeur door leu.
68
Aanzienlijke modificaties in functie kunnen worden volbracht door het selecteren van substituties die aanzienlijk verschillen in het effect ervan op het aanhouden van (a) de structuur van het polypeptideskelet in het gebied van de substitutie, bijvoorbeeld als een conformatie in een sheet of een helix, (b) de lading of hydrofobiciteit van het mole-5 cuul op de doelwitplaats, of (c) de omvang van de zij keten. Natuurlijk voorkomende residuen worden in groepen verdeeld op basis van algemene eigenschappen van zijke-tens (sommige van deze kunnen in verscheidene functionele groepen vallen): (1) hydrofoob: norleucine, met, ala, val, leu, ile; 10 (2) neutraal hydrofiel: cys, ser, thr; (3) zuur: asp, glu; (4) basisch: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuen die de oriëntatie van de keten beïnvloeden: gly, pro; en (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
15
Niet-conservatieve substituties zullen het uitwisselen van een lid van één van deze klassen voor een andere met zich meebrengen.
Varianten van de aminozuursequentie van BDNF kunnen natuurlijk voorkomend zijn of kunnen op synthetische wijze worden bereid, zoals door het introduceren van 20 geschikte nucleotide-veranderingen in een voorafgaand geïsoleerd DNA voor BDNF of door in vitro synthese van het gewenste variante polypeptide. Zoals hierboven is aangegeven kunnen dergelijke varianten deleties van, inserties of substituties van één of meer aminozuurresiduen in de aminozuursequentie van rijp BDNF omvatten (bijvoorbeeld de sequentie die in Tabel 1 is getoond). Elke combinatie van deletie, insertie en 25 substitutie wordt gemaakt voor het verkrijgen van een variant van de aminozuursequentie van BDNF, met dien verstande dat het resulterende variante polypeptide een gewenst kenmerk bezit. De aminozuurveranderingen kunnen in andere modificaties van BDNF resulteren bij expressie in recombinante gastheren, bijvoorbeeld door het introduceren of verplaatsen van plaatsen voor glycosylatie of het introduceren van sequen-30 ties voor een membraananker (in overeenstemming met PCT WO 89/01041 gepubliceerd op 9 februari, 1989).
In sommige uitvoeringsvormen omvat het BDNF-polypeptide een aminozuursequentie die wordt gecodeerd door een nucleïnezuur dat onder stringente omstandighe 69 den hybridiseert aan een nucleïnezuursequentie (bijvoorbeeld SEQ ID NO:2) die voor rijp humaan BDNF codeert.
Varianten van polynucleotiden kunnen ook, of als alternatief nagenoeg homoloog zijn aan een natief gen of een deel of complement daarvan. Dergelijke varianten van 5 polynucleotiden zijn in staat om onder matige stringente omstandigheden te hybridise-ren aan een natuurlijk voorkomende DNA-sequentie die voor een polypeptide (of een complementaire sequentie) codeert.
Het zal voor de deskundigen in het vakgebied duidelijk zijn dat als een resultaat van de degeneratie van de genetische code er vele nucleotidesequenties zijn die voor 10 een polypeptide zoals hierin is beschreven coderen. Sommige van deze polynucleotiden dragen minimale homologie met de nucleotidesequentie van een natief gen. Niettemin worden polynucleotiden die door verschillen in codongebruik variëren in het bijzonder door de onderhavige uitvinding beschouwd. Allelen van de genen die de polynucleoti-desequenties die hierin worden verschaft omvatten vallen verder binnen de bescher-15 mingsomvang van de onderhavige uitvinding. Allelen zijn endogene genen die zijn veranderd als een resultaat van één of meer mutaties, zoals deleties, addities en/of substituties van nucleotiden. Het resulterende mRNA en eiwit kan, maar hoeft niet, een veranderde structuur of functie hebben. Allelen kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van standaard technieken (zoals hybridisatie, amplificatie en/of vergelijking 20 van sequenties van de gegevensbank).
TrkB-agonisten die in de werkwijzen van de uitvinding worden gebruikt omvatten ook fusie-eiwitten die de aminozuursequentie van BDNF omvatten (bijvoorbeeld humaan BDNF) of een functioneel peptidefragment daarvan. Biologisch actieve BDNF-polypeptiden kunnen worden gefuseerd met sequenties, zoals sequenties die 25 immunologische reactiviteit versterken, de koppeling van het polypeptide aan een ondersteunend materiaal of een drager bewerkstelligen of het hervouwen en/of zuiveren bewerkstelligen (bijvoorbeeld sequenties die coderen voor epitopen zoals Myc, HA afkomstig van hemagglutinine van influenzavirus, His-6, FLAG). Deze sequenties kunnen aan het N-eindstandige uiteinde of aan het C-eindstandige uiteinde van het 30 BDNF-polypeptide worden gefuseerd. In aanvulling kan het eiwit of polynucleotide aan andere polypeptiden worden gefuseerd die de functie ervan verhogen of de locatie ervan in de cel specificeren zoals een sequentie voor uitscheiding. Werkwijzen voor het produceren van recombinante fusie-eiwitten die hierboven zijn beschreven zijn in het 70 vakgebied bekend. Het recombinante fusie-eiwit kan worden geproduceerd, worden hervouwen en worden geïsoleerd door werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn.
BDNF-polypeptiden die hierin zijn beschreven kunnen worden gemodificeerd om de halfwaardetijd ervan in een individu te verlengen. Het BDNF-polypeptide kan bij-5 voorbeeld worden gepegyleerd om systemische klaring te verlagen met minimaal verlies van biologische activiteit. De uitvinding verschaft ook preparaten (waaronder farmaceutische preparaten) die een BDNF-polypeptide gekoppeld aan een PEG-molecuul omvatten. In sommige uitvoeringsvormen is het PEG-molecuul aan het BDNF-polypeptide gekoppeld door middel van een reversibele koppeling. De halfwaardetijd 10 van een gepegyleerd BDNF-polypeptide kan met meer dan ongeveer 2-voudig, 5-voudig, 10-voudig, 15-voudig, 20-voudig en 30-voudig van de halfwaardetijd van het niet-gepegyleerde BDNF-polypeptide worden verlengd.
Polyethyleenglycol-polymeren (PEG) kunnen aan verscheidene functionele groepen van het BDNF-polypeptide worden gekoppeld door het gebruik van werkwijzen die 15 in het vakgebied bekend zijn. Zie bijvoorbeeld Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002); Sakane et al. Pharm. Res. 14:1085-91 (1997). PEG kan worden gekoppeld aan de volgende functionele groepen op het polypeptide: amino-groepen, carboxylgroepen, gemodificeerde of natuurlijke N-uiteinden, amine-groepen en thiolgroepen. In sommige uitvoeringsvormen worden één of meer aminozuurresidu-20 en van het oppervlak met PEG-moleculen gemodificeerd. PEG-moleculen kunnen van verschillende grootte zijn (bijvoorbeeld variërend van ongeveer 2 tot 40 KDa). PEG-moleculen gekoppeld aan BDNF-polypeptide kunnen een gewicht hebben van ongeveer elk van 2000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000 Da. Een PEG-molecuul kan een enkele of een vertakte keten zijn. Voor het koppelen van PEG aan 25 BDNF-polypeptide, kan een derivaat van het PEG dat een functionele groep aan één of beide uiteinden heeft worden gebruikt. De functionele groep wordt gekozen op basis van het soort van beschikbare reactieve groep op het BDNF-polypeptide. Werkwijzen voor het koppelen van derivaten aan polypeptiden zijn in het vakgebied bekend. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002). De koppeling tussen 30 het BDNF-polypeptide en de PEG kan ook zodanig zijn dat het kan worden gesplitst of op natuurlijke wijze afbreekt (reversibele of afbreekbare koppeling) in een individu dat de halfwaardetijd kan verbeteren maar verlies van activiteit minimaliseert. Ook kan een koppelingsplaats voor PEG op het BDNF-polypeptide worden gevormd door residuen 71 aan het oppervlak te muteren naar een aminozuurresidu dat een PEG-reactieve groep heeft, zoals een cysteïne.
BDNF-polypeptide kan door middel van recombinante wijzen worden geproduceerd, dat wil zeggen, door expressie van nucleïnezuur dat voor het BDNF-polypeptide 5 codeert in recombinante celkweek en eventueel zuivering van het variante polypeptide van de celkweek door bijvoorbeeld biologische testen op de activiteit van de variant of door adsorptie aan een immuno-affiniteitskolom die anti-BDNF polyklonale antilicha-men van konijn omvat (die aan tenminste één immuun-epitoop van de variant die ook in het natieve BDNF aanwezig is zal binden). Kleine peptide-fragmenten, in de orde 10 van 40 residuen of minder, worden op geschike wijze door in vitro werkwijzen gemaakt.
DNA dat voor BDNF-polypeptide codeert kan in een expressievector worden gekloneerd voor expressie van het eiwit in een gastheercel. Voorbeelden van nucleïnezu-ren die voor het BDNF-polypeptide coderen zijn beschreven in Amerikaanse octrooi-15 aanvraag publicatienummer 2003/0203383. Het DNA dat voor het BDNF-polypeptide in de rijpe vorm ervan codeert kan aan het amino-uiteinde ervan aan een uitscheidings-signaal worden gekoppeld. Dit uitscheidingssignaal is bij voorkeur de presequentie van BDNF die op normale wijze de uitscheiding van BDNF van humane cellen in vivo aanstuurt. Geschikte uitscheidingssignalen omvatten echter ook signalen van andere dier-20 lijke BDNF, signalen van NGF, NT-2, of NT-3, virale signalen of signalen van uitgescheiden polypeptiden van dezelfde of verwante soorten. Elke gastheercel (zoals E. coli) kan worden gebruikt voor het tot expressie brengen van het eiwit of polypeptide.
BDNF-polypeptide dat tot expressie is gebracht kan worden gezuiverd. BDNF-polypeptide kan van het kweekmedium worden teruggewonnen als een uitgescheiden 25 eiwit, alhoewel het ook van lysaten van de gastheercellen kan worden teruggewonnen wanneer het direct tot expressie wordt gebracht zonder een uitscheidingssignaal. Werkwijzen van eiwitzuivering die in het vakgebied bekend zijn kunnen worden gebruikt. Werkwijzen voor het produceren van het BDNF-polypeptide en het zuiveren van het tot expressie gebrachte BDNF-polypeptide zijn in het vakgebied bekend. 30 BDNF-polypeptide kan in E. coli tot expressie worden gebracht en worden hervouwen volgens werkwijzen die in het vakgebied bekend zijn. Rijp humaan BDNF kan ook in de handel worden verkregen (bijvoorbeeld van R&D Systems, Minneapolis, MN).
72
Algemene werkwijzen voor het genereren en produceren van NT-4/5-polypeptiden kunnen ook worden gebruikt voor het genereren en produceren van BDNF -polypeptiden.
5 Identificatie van trkB-agonisten
TrkB-agonisten (zoals antilichamen) kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van in het vakgebied bekende werkwijzen, waaronder één of meer van de volgende werkwijzen. De kinasereceptor activatie (KIRA) test die is beschreven in Ameri-10 kaanse octrooischriftnummers 5.766.863 en 5.891.650 kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt. Deze ELISA soort van test is geschikt voor kwalitatieve of kwantitatieve meting van kinase-activatie door het meten van de autofosforylatie van het kinasedomein van een receptoreiwit-tyrosinekinase (rPTK, bijvoorbeeld trk-receptor), alsook voor de identificatie en karakterisatie van mogelijke agonisten of antagonisten van een geselec-15 teerde rPTK. De eerste fase van de test behelst fosforylatie van het kinasedomein van een kinasereceptor, in het onderhavige geval een trkB-receptor, waarbij de receptor aanwezig is in het celmembraan van een eukaryote cel. De receptor kan een endogene receptor zijn of nucleïnezuur dat voor de receptor codeert of een receptorconstruct kan in de cel worden getransformeerd. Een eerste vaste fase (bijvoorbeeld een putje van een 20 eerste testplaat) wordt kenmerkend met een nagenoeg homogene populatie van dergelijke cellen (gewoonlijk een zoogdierlijke cellijn) bekleed zodat de cellen aan de vaste fase hechten. De cellen zijn vaak hechtend en hechten daardoor van nature aan de eerste vaste fase. Indien een “receptorconstruct” wordt gebruikt omvat het gewoonlijk een fusie van een kinasereceptor en een flag-polypeptide. Het flag-polypeptide wordt her-25 kent door het vangende middel, vaak een vangend antilichaam, in het ELISA-deel van de test. Een analyt, zoals een gegadigde agonist, wordt vervolgens toegevoegd aan de putjes die de hechtende cellen hebben zodanig dat de tyrosinekinase-receptor (bijvoorbeeld trkB-receptor) wordt blootgesteld aan (of in contact wordt gebracht met) het analyt. Deze test maakt identificatie van agonist-liganden voor de tyrosinekinase-receptor 30 van belang (bijvoorbeeld trkB) mogelijk. Volgend op blootstelling aan het analyt worden de hechtende cellen gesolubiliseerd door het gebruik van een lysisbuffer (die daarin een solubiliserend detergens bevat) en voorzichtig schudden waardoor cellysaat wordt 73 afgegeven die op directe wijze aan het ELISA deel van de test kan worden onderworpen zonder de noodzaak van concentratie of klaring van het cellysaat.
Het cellysaat dat aldus is bereid is vervolgens klaar om te worden onderworpen aan de ELISA fase van de test. Als een eerste stap in de ELISA fase wordt een tweede 5 vaste fase (gewoonlijk een putje van een ELISA microtiterplaat) bekleed met een vangend middel (vaak een vangend antilichaam) die op specifieke wijze aan de tyrosineki-nase-receptor of in het geval van een receptorconstruct aan het flag-polypeptide bindt. Bekleding van de tweede vaste fase wordt zodanig uitgevoerd dat het vangende middel aan de tweede vaste fase hecht. Het vangende middel is in het algemeen een monoklo-10 naai antilichaam maar zoals in de voorbeelden hierin is beschreven kunnen polyklonale antilichamen of andere middelen ook worden gebruikt. Het cellysaat dat is verkregen wordt vervolgens blootgesteld aan of in contact gebracht met het hechtende vangende middel zodat de receptor of het receptorconstruct aan de tweede vaste fase hecht (of daarin wordt gevangen). Een wasstap wordt vervolgens uitgevoerd zodat niet-gebonden 15 cellysaat wordt verwijderd waardoor de gevangen receptor of receptorconstruct achter blijft. De gebonden of gevangen receptor of receptorconstruct wordt vervolgens blootgesteld aan of in contact gebracht met een anti-fosfotyrosine antilichaam dat gefosfory-leerde tyrosine-residuen in de tyrosine-kinase-receptor identificeert. In de voorkeursuitvoeringsvorm is het anti-fosfotyrosine antilichaam aan een enzym geconjugeerd (di-20 reet of indirect) dat een kleurverandering van een niet-radioactief kleurmiddel katalyseert. Dienovereenkomstig kan fosforylatie van de receptor worden gemeten door een daaropvolgende kleurverandering van het reagens. Het enzym kan op directe wijze aan het anti-fosfotyrosine antilichaam zijn gebonden of een conjugerend molecuul (bijvoorbeeld biotine) kan aan het anti-fosfotyrosine antilichaam zijn geconjugeerd en het 25 enzym kan daaropvolgend aan het anti-fosfotyrosine antilichaam zijn verbonden door middel van het conjugerende molecuul. Als laatste wordt binding van het anti-fosfotyrosine antilichaam aan de gevangen receptor of het receptorconstruct gemeten door bijvoorbeeld een kleurverandering van het kleurreagens.
Volgend op initiële identificatie kan de agonist-activiteit van een gegadigde (bij-30 voorbeeld een anti-trkB monoklonaal antilichaam) verder worden bevestigd en verfijnd door biologische testen waarvan bekend is dat ze de biologische activiteiten die het doelwit zijn testen. Het vermogen van een gegadigde om een agonistische activiteit op trkB uit te oefenen kan bijvoorbeeld worden getest in de PC 12 neuriet-uitgroei test door 74 het gebruik van PC12-cellen die zijn getransfecteerd met trkB met de volledige lengte (Jian et al, Cell Signal. 8:365-70,1996). Deze test meet de uitgroei van neuriet-uitlopers door phaeochromocytomacellen (PC 12) van rat als reactie op stimulatie door geschikte liganden. Deze cellen brengen endogeen trkA tot expressie en reageren daar-5 door op NGF. Ze brengen echter niet endogeen trkB tot expressie en worden daarom getransfecteerd met het trkB-expressieconstruct teneinde reacties op trkB-agonisten op te wekken. Na het incuberen van de getransfecteerde cellen met de gegadigde wordt neuriet-uitgroei gemeten en cellen waarvan de neurieten bijvoorbeeld 2 keer de diameter van de cel overschrijden worden geteld. Gegadigden (zoals anti-trkB-antilichamen) 10 die uitgroei van neurieten stimuleren bij getransfecteerde PC12-cellen tonen trkB-agonist activiteit.
De activatie van trkB kan ook worden bepaald door het gebruik van verscheidene specifieke neuronen op specifieke fasen van embryonale ontwikkeling. Geschikte geselecteerde neuronen kunnen afhankelijk zijn van trkB activatie voor overleving en zo-15 doende is het mogelijk om de activering van trkB te bepalen door het volgen van de overleving van deze neuronen in vitro. Toevoeging van gegadigden aan primaire kweken van geschikte neuronen zal leiden tot overleving van deze neuronen gedurende een periode van tenminste verscheidene dagen indien de gegadigden trkB activeren. Dit maakt de bepaling mogelijk van het vermogen van de gegadigde (zoals het anti-trkB-20 antilichaam) om trkB te activeren. In één voorbeeld van dit soort van test wordt de no-dosus ganglion van een El5 muizenembryo ontleed, gedissocieerd en de resulterende neuronen worden bij een lage dichtheid in een weefselkweekplaat uitgeplaat. De gegadigde antilichamen worden vervolgens aan de media toegevoegd en de platen worden gedurende 24-48 uur geïncubeerd. Na deze tijd wordt overleving van de neuronen vast-25 gesteld door elk van een verscheidenheid van werkwijzen. Monsters die een agonist kregen zullen kenmerkend een verhoogde mate van overleving vertonen boven monsters die een controle-antilichaam kregen en dit maakt de bepaling mogelijk van de aanwezigheid van een agonist. Zie bijvoorbeeld Buchman et al (1993) Development 118(3):989-1001.
30 TrkB-agonisten kunnen worden geïdentificeerd door het vermogen ervan om stroomafwaartse signalering te activeren in een verscheidenheid van celsoorten die trkB tot expressie brengen, ofwel van nature of na transfectie van DNA dat voor trkB codeert. Dit trkB kan humaan of ander zoogdierlijk (zoals van knaagdier of van primaten) 75 trkB zijn. De stroomafwaartse signaleringscascade kan worden gedetecteerd door veranderingen van een verscheidenheid van biochemische of fysiologische parameters van de cel die trkB tot expressie brengt zoals het niveau van eiwitexpressie of van eiwitfos-forylatie van eiwitten of veranderingen van de metabole- tot groei-fase van de cel 5 (waaronder neuronale overleving en/of uitgroei van neurieten, zoals hierin is beschreven). Werkwijzen voor het detecteren van relevante biochemische of fysiologische parameters zijn in het vakgebied bekend.
V. Kits 10
De uitvinding verschaft ook kits voor gebruik bij de onderhavige werkwijzen. Kits van de uitvinding omvatten één of meer houders die een gezuiverde trkB-agonist (bijvoorbeeld een natuurlijk voorkomende NT-4/5 of BDNF en een anti-trkB agonist antilichaam) omvatten en instructies voor gebruik in overeenstemming met elk van de 15 werkwijzen van de uitvinding die hierin zijn beschreven. In het algemeen omvatten deze instructies een beschrijving van de toediening van de trkB-agonist voor het behandelen van een ziekte zoals cachexie, anorexia nervosa en opioïde-geïnduceerd braken volgens één van de werkwijzen die hierin zijn beschreven. De kit kan verder een beschrijving omvatten voor het selecteren van een individu dat geschikt is voor behan-20 deling op basis van het identificeren of het individu de ziekte heeft en de fase van de ziekte.
De instructies die betrekking hebben op het gebruik van de trkB-agonist omvatten in het algemeen informatie met betrekking tot de dosering, doseringsschema en route van toediening voor de beoogde behandeling. De houders kunnen eenheidsdoses, bulk-25 verpakkingen (bijvoorbeeld verpakkingen voor meerdere doses) of sub-eenheidsdoses zijn. Instructies die bij de kits van de uitvinding worden verschaft zijn kenmerkend geschreven instructies op een etiket of bijsluiter bij de verpakking (bijvoorbeeld een vel papier dat in de kit is bijgesloten), maar machinaal leesbare instructies (bijvoorbeeld instructies die op een magnetische of optische geheugendisc zijn opgeslagen) zijn ook 30 acceptabel.
Het etiket of bijsluiter bij de verpakking geeft aan dat het preparaat wordt gebruikt voor het behandelen van een ziekte die hierin is beschreven (zoals cachexie, 76 anorexia nervosa en opioïde-geïnduceerd braken). Instructies kunnen worden verschaft voor het uitvoeren van elk van de werkwijzen die hierin zijn beschreven.
De kits van deze uitvinding zijn in een geschikte verpakking. Geschikte verpakkingen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, buisjes, flessen, potjes, flexibele verpak-5 kingen (bijvoorbeeld afgesloten Mylar of plastic zakken) en dergelijke. Ook worden verpakkingen voor gebruik in combinatie met een specifieke inrichting beschouwd zoals een inhaleerinrichting, inrichting voor nasale toediening (bijvoorbeeld een verstuiver) of een infuusinrichting zoals een minipomp. Een kit kan een steriele toegangspoort hebben (bijvoorbeeld kan de houder een zak zijn voor een intraveneuze oplossing of 10 een buisje dat een deksel heeft die door een hypodermische injectienaald kan worden doorboord). De houder kan ook een steriele toegangspoort hebben (bijvoorbeeld kan de houder een zak voor een intraveneuze oplossing zijn of een buisje dat een deksel heeft die door een hypodermische injectienaald kan worden doorboord). Tenminste één actief middel in het preparaat is een trkB-agonist. De houder kan verder een tweede farma-15 ceutisch actief middel omvatten.
Kits kunnen eventueel aanvullende bestanddelen verschaffen zoals buffers en verklarende informatie. Op normale wijze omvat de kit een houder en een etiket of een bijsluiter bij de verpakking op of geassocieerd met de houder.
De volgende voorbeelden worden verschaft voor het illustreren maar niet beper-20 ken van de uitvinding.
VOORBEELDEN
Voorbeeld 1: Dagelijkse infusie van NT-4/5 resulteerde in toename van lichaamsgewicht en hvperfagie bij zwaarlijvige bavianen 25
Drie zwaarlijvige vrouwelijke bavianen (lichaamsgewicht varieert van 20-30 kg) kregen intraveneuze (IV) infusie van humaan NT-4/5 bij 2 mg/kg eenmaal per dag van dag 1 tot dag 24. Drie aanvullende zwaarlijvige vrouwelijke bavianen (lichaamsgewicht varieert van 20-30 kg) kregen IV infusie met hulpstof (PBS) eenmaal per dag van dag 1 30 tot dag 24. Voedselopname werd gedurende de eerste 45 dagen dagelijks gemeten. De dieren werden gedurende de eerste 53 dagen eenmaal per week gewogen en werden vervolgens tot respectievelijk dag 81 en dag 109 gevolgd.
77
Figuur 1 toont het effect van dagelijkse infusie van NT-4/5 op het lichaamsgewicht van zwaarlijvige bavianen. Zoals in Figuur 1 is getoond was het lichaamsgewicht van de groep die met NT-4/5 werd behandeld aanzienlijk verlaagd in vergelijking met de groep die met hulpstof werd behandeld; en het lichaamsgewicht in de met NT-4/5 5 behandelde groep was op dag 81 teruggekeerd naar het niveau van de groep die met hulpstof werd behandeld. De gegevens geven aan dat dagelijkse infusie van NT-4/5 in verlengde maar reversibele toename van gewicht resulteerde bij zwaarlijvige bavianen.
Figuur 2 toont het effect van dagelijkse infusie van NT-4/5 op voedselopname bij zwaarlijvige bavianen. Zoals in Figuur 2 is getoond was de voedselopname van de 10 groep die met NT-4/5 is behandeld aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de groep die met hulpstof is behandeld; en voedselopname bij de met NT-4/5 behandelde groep was op dag 33 teruggekeerd naar het niveau van de groep die met hulpstof werd behandeld. De gegevens geven aan dat dagelijkse infusie van NT-4/5 in reversibele hyperfagie resulteerde bij zwaarlijvige bavianen.
15
Voorbeeld 2: Tweemaal per week infusie van NT-4/5 resulteerde in toename van lichaamsgewicht maar geen hyperfagie bij zwaarlijvige bavianen
Drie zwaarlijvige vrouwelijke bavianen (lichaamsgewicht varieert van 20-30 kg) 20 kregen intraveneuze (IV) infusie van humaan NT-4/5 bij 2 mg/kg tweemaal per week van dag 1 tot dag 39. Drie aanvullende zwaarlijvige vrouwelijke bavianen (lichaamsgewicht varieert van 20-30 kg) kregen IV infusie met hulpstof (PBS) tweemaal per week van dag 1 tot dag 39. Voedselopname werd gedurende de eerste 55 dagen dagelijks gemeten. De dieren werden gedurende de eerste 66 dagen wekelijks gewogen en 25 werden vervolgens tot respectievelijk dag 94 en dag 122 gevolgd.
Figuur 3 toont het effect van tweemaal per week infusie van NT-4/5 op het lichaamsgewicht van zwaarlijvige bavianen. Zoals in Figuur 3 is getoond was het lichaamsgewicht van de groep die met NT-4/5 is behandeld aanzienlijk verhoogd in vergelijking met de groep die met hulpstof is behandeld; en lichaamsgewicht in de met 30 NT-4/5 behandelde groep was op dag 94 teruggekeerd naar het niveau van de groep die met hulpstof werd behandeld. De gegevens geven aan dat tweemaal per week infusie van NT-4/5 in reversibele toename van gewicht resulteerde bij zwaarlijvige bavianen.
78
Figuur 4 toont het effect van tweemaal per week infusie van NT-4/5 op voedsel-opname bij zwaarlijvige bavianen. Zoals in Figuur 4 is getoond veranderde de infusie van NT-4/5 tweemaal per week niet aanzienlijk de voedselopname bij zwaarlijvige bavianen met de two way ANOVA analyse. Bonferrini post test analyse van gegevens 5 toonde niet aanzienlijke paargsgewijze verschillen tussen de NT-4/5 groep (dichte driehoeken) met de controlegroep van hulpstof (open vierkanten).
Voorbeeld 3: Dagelijkse infusie van NT-4/5 resulteerde in toename van het lichaamsgewicht en hvperfagie bii magere cynomolgus apen 10
Drie magere vrouwelijke cynomolgus apen (lichaamsgewicht varieert van 3-5 kg) kregen dagelijkse intraveneuze (IV) infusie van humaan NT-4/5 bij 2 mg/kg van dag 1 tot dag 31. Drie magere vrouwelijke cynomolgus apen (lichaamsgewicht varieert van 3-5 kg) kregen IV infusie met gepegyleerd NT-4/5 (gepegyleerd NT4-G1S) bij 0,6 mg/kg 15 eenmaal per week van dag 1 tot dag 31. Gepegyleerd NT-4/5 werd gegenereerd door het introduceren van een mutatie in de glycine 1 positie van de rijpe sequentie van humaan NT-4/5 naar serine en het verbinden van een PEG aan het eerste aminozuur serine, zoals is beschreven in Voorbeeld 7 van Amerikaanse octrooipublicatienummer 2005/0209148 en PCT WO 2005/082401. Drie aanvullende magere cynomolgus apen 20 (lichaamsgewicht varieert van 3-5 kg) kregen IV infusie met hulpstof (PBS) eenmaal per dag van dag 1 tot dag 31. Voedselopname werd dagelijks gemeten gedurende de eerste 50 dagen. De dieren werden eenmaal per week gewogen tot dag 50.
Figuur 5 toont het effect van dagelijkse infusie van NT-4/5 op het lichaamsgewicht bij magere vrouwelijke cynomolgus apen. Zoals in Figuur 5 is getoond was het 25 lichaamsgewicht van de groep die dagelijks met NT-4/5 werd behandeld maar niet bij de groep die wekelijks werd behandeld met gepegyleerd NT-4/5 aanzienlijk verhoogd in vergelijking met de groep die met hulpstof is behandeld. Het lichaamsgewicht van de met NT-4/5 behandelde groep was nog niet volledig teruggekeerd naar het niveau van de groep die met hulpstof werd behandeld. De gegevens geven aan dat dagelijkse infu-30 sie van NT-4/5 bij magere cynomolgus apen in toename van het lichaamsgewicht resulteerde.
Figuur 6 toont het effect van dagelijkse infusie van NT-4/5 op de voedselopname bij magere cynomolgus apen. Zoals in Figuur 6 is getoond was de voedselopname van 79 de groep die dagelijks met NT-4/5 werd behandeld, maar niet bij de groep die wekelijks met gepegyleerd NT-4/5 werd behandeld aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de groep die met hulpstof werd behandeld; en voedselopname bij de met NT-4/5 behandelde groep was op dag 38 teruggekeerd naar het niveau van de groep die met hulp-5 stof werd behandeld. De gegevens geven aan dat dagelijkse infusie van NT-4/5 bij ma gere cynomolgus apen in reversibele hyperfagie resulteerde.
De effecten van NT-4/5 en gepegyleerd NT-4/5 op lichaamsgewicht werden ook getest door subcutane toediening. Drie magere vrouwelijk cynomolgus apen (lichaamsgewicht varieert van 3-5 kg) kregen dagelijks een subcutane (SC) injectie met humaan 10 NT-4/5 bij 2 mg/kg van dag 1 tot dag 21. Drie magere vrouwelijke cynomolgus apen (lichaamsgewicht variërend van 3-5 kg) kregen eenmaal per dag een SC injectie van gepegyleerd NT-4/5 bij 1 mg/kg van dag 1 tot dag 21. Drie aanvullende magere vrouwelijke cynomolgus apen (lichaamsgewicht variërend van 3-5 kg) kregen eenmaal per dag een SC injectie met hulpstof (PBS) van dag 1 tot dag 21. De dieren werden een-15 maal per week gewogen tot dag 21.
Figuur 7 toont het effect van dagelijkse een SC injectie van NT-4/5 en gepegyleerd NT-4/5 op het lichaamsgewicht bij magere vrouwelijke cynomolgus apen. Zoals in Figuur 7 is getoond was het lichaamsgewicht van de met NT-4/5 behandelde groep aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de groep die met hulpstof is behandeld. Het 20 lichaamsgewicht van de groep die met gepegyleerd NT-4/5 is behandeld was in aanvulling ook aanzienlijk verhoogd in vergelijking met de groep die met hulpstof is behandeld.
Voorbeeld 4: Dagelijkse subcutane injectie van NT-4/5 toonde geen aanzienlijk effect 25 op het lichaamsgewicht en voedselopname bij NZW konijnen
Vijf mannelijke en vijf vrouwelijke New Zealand White (NZW) konijnen (lichaamsgewicht variërend van 3-4 kg) kregen dagelijks een subcutane (SC) injectie van humaan NT-4/5 bij 2 mg/kg van dag 1 tot dag 15. Vijf aanvullende mannelijke en vijf 30 vrouwelijke NZW konijnen (lichaamsgewicht variërend van 3-5 kg) kregen eenmaal per dag een SC injectie met hulpstof (PBS) van dag 1 tot dag 15. Voedselopname werd dagelijks gemeten gedurende de eerste 15 dagen. De dieren werden eenmaal per week tot dag 15 gewogen.
80
Geen statistische significante verschillen werden waargenomen tussen de met NT-4/5 behandelde groep en de groep die met hulpstof is behandeld voor het lichaamsgewicht of voedselopname. De vergelijkingen werden gemaakt tussen de met NT-4/5 behandelde mannelijke konijnen en de met hulpstof behandelde mannelijke konijnen en 5 tussen de met NT-4/5 behandelde vrouwelijke konijnen en de met hulpstof behandelde vrouwelijke konijnen.
Voorbeeld 5: Een enkele injectie van NT-4/5 veroorzaakte geen braken maar kan morfine-geïnduceerd braken bij fretten verminderen 10
Het effect van NT-4/5 op braken werd onderzocht bij de volwassen vrouwelijke fretten met een lichaamsgewicht van ongeveer 1 kg (Marshall Farm, CT). Een braakmiddel (0,05 mg/kg van morfine-6-glucuronide, M6G) werd als een positieve controle subcutaan gegeven voor het vaststellen van de basislijn voorafgaand aan de toediening 15 van NT-4/5. Een toenemende dosis van NT-4/5 (0,1, 1, of 10 mg/kg) werd subcutaan alleen in 6 fretten (voor elke dosering) geïnjecteerd om te testen of NT-4/5 nadelige effecten zou kunnen veroorzaken zoals kokhalzen of braken. In aanvulling werden twee doses, 1 mg/kg en 10 mg/kg, van NT-4/5 10 minuten voorafgaand aan M6G gegeven om te testen of NT-4/5 M6G-geïnduceerd braken kon onderdrukken. De dieren werden 20 teruggeplaatst in hun kooien en geobserveerd op de latentie, het aantal keten kokhalzen en het aantal keten braken gedurende een periode van 60 minuten na injectie.
Zoals in Figuur 8 is getoond veroorzaakte een enkele injectie van 0,1, 1 of 10 mg/kg NT-4/5 alleen geen braken bij de fretten, terwijl een enkele SC injectie van 0,05 mg/kg M6G op effectieve wijze braken induceerde. Zowel 1 mg/kg en 10 mg/kg van 25 NT-4/5 verlaagde aanzienlijk het M6G-geïnduceerde braken bij fretten.
Voor het testen van de trkB-activatieplaats die verantwoordelijk zou kunnen zijn voor het anti-braak effect van een SC injectie van NT-4/5 bij fretten werd c-Fos activa-tie van trkB in de hersenstam bij fretten getest. Een enkele dosis van 10 mg/kg van NT-4/5 werd subcutaan geïnjecteerd gevolgd door een intraveneuze injectie van 10 mg/kg 30 cisplatine, 5 minuten later aan vijf vrouwelijke fretten. Een enkele dosis van een injectie met hulpstof gevolgd door cisplatine 5 minuten later werd aan een aanvullende vier vrouwelijke fretten gegeven als een negatieve controle. De dieren werden 1 uur later opgeofferd met natriumpentobarbital (65 mg/kg ip), gefixeerd door intracardiale perfu- 81 sie met 1 1/kg PBS gevolgd door 1 1/kg 4% paraformaldehyde, pH 7,3. Coupes van de hersenstam werd met een dikte van 30 pm gesneden en drijvende coupes werden gedurende 1 uur geïncubeerd in 10% normaal ezelserum (NDS) dat in 0,1% Triton X-100 (in PBS) is verdund gevolgd door incubatie in anti-Fos van schaap (1:1000, OA-11-5 824, Genosys Biotechnologies, Cambridge, UK) in PBS met 0,1% Triton X-100 en 10% NDS gedurende 48 uur bij 4°C. Coupes werden in PBS gewassen en vervolgens geïncubeerd in gebiotinyleerd anti-schaap IgG secundaire antilichaamoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Kleuring werd onthuld door het gebruik van de techniek van het avidine-biotine-complex (Vectastain Elite avidinbiotin complex 10 (ABC) Kit, Vector). In het kort werden coupes gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in ABC-reagens geïncubeerd en vervolgens gedurende 30-60 seconden in een oplossing die 3,3-diaminobenzidine (0,5 mg/ml) bevat. Coupes van de hersenstam werden vervolgens bevestigd op de objectglaasjes om gedurende 24 uur te drogen, gedurende 4 minuten gedehydrateerd in elk van 50, 70, 95, en 100% ethanol en vervolgens 15 schoongemaakt met xyleen waarna ze werden bevestigd en werden bekeken. De gren zen van de nuclei en subnuclei van de nucleus tractus solitarius (NTS) werden bepaald in aangrenzende coupes die met cresylviolet zijn gekleurd. Het aantal c-Fos immunore-actieve neuronale nuclei werd bilateraal bepaald voor de area postrema, dorsale vagale nucleus (DMNX) en alle subnuclei van de NTS op drie niveaus langs de rostrocaudale 20 uitloper van het dorsale vagale complex (DVC), 0,5-1,0 mm rostraal en 0,5 mm caudaal naar obex en op obex. Drie coupes per niveau per dier werden geteld en gemiddeld. Gegevens werden vergeleken door het gebruik van ANOVA met Tukey’s post test (Prism; GraphPadSoftware, San Diego, CA). NT-4/5 behandeling verhoogde dramatisch het aantal c-Fos positieve nuclei in de area postrema in vergelijking met de dieren 25 die met hulpstof zijn geïnjecteerd (Figuur 9A, P=0,0009, Student’s t-test). In tegenstelling verlaagde behandeling met NT-4/5 aanzienlijk het aantal c-Fos positieve nuclei in de dorsale vagale nucleus in vergelijking met de dieren die met hulpstof zijn geïnjecteerd (Figuur 9B, P=0,0047, Student’s t-test). Aan de andere kant veranderde de behandeling met NT-4/5 niet aanzienlijk het aantal van c-Fos positieve nuclei in andere nu-30 clei van hersenstam waaronder de meerdere subnuclei van het NTS alsook de paraven-triculaire nuclei van de hypothalamus.
Area postrema, anders dan de meeste andere gebieden van hersenen ligt buiten de bloed-hersen barrière en heeft volledige toegang tot de circulerende macromoleculen 82 (zie bijvoorbeeld Yang en Ferguson, 2003, Regul. Pept. 112(1-3):9-17). De inductie van c-Fos is een bekende directe vroege gebeurtenis van trkB-activatie door de ligan-den ervan zoals BDNF en NT-4/5 (lp et al. 1993, J. Neurosci. 13(8):3394-405 en Marsh et al. 1993, J. Neurosci. 13(10): 4281-92).
5 Deze gegevens tezamen suggereren dat de area postrema tenminste gedeeltelijk een bona fide “perifeer toegankelijk” doelwit van systemisch afgeleverd NT-4/5 of andere trkB-agonisten vormt. De verlaging van expressie van c-Fos in de dorsale vagale nucleus (Figuur 9B) kan gedeeltelijke verzwakking van het circuit van braken door voorafgaande behandeling met NT-4/5 weerspiegelen.
10
Voorbeeld 6: Generering en screening van trkB-aeonist antilichamen
Immunisering voor het genereren van monoklonale anti-trkB agonist antilichamen: Een enkele Balb/C muis werd met een regelmatig schema 5 keer geïnjecteerd met 15 8 pg humaan extracellulair domein van TrkB als antigeen. His-gemerkt extracellulair domein van humaan TrkB (residuen 31-430) werd tot expressie gebracht door het gebruik vector pTriEx-2 Hygro (Novagen, Madison WI) in 293-cellen. Extracellulair domein van TrkB werd gezuiverd door het gebruik van Ni-NTA hars door middel van instructies van de fabrikant (Qiagen, Valencia, CA). Voor de eerste 4 injecties werd het 20 antigeen bereid door het mengen van humaan TrkB met RIBI adjuvanssysteem en aluin. Acht pg totaal antigeen werd gegeven door middel van injectie in het nekvel, de voetzolen en IP, bij benadering elke 3 dagen gedurende een verloop van 11 dagen. Op dag 13 werd de muis gedood en werd de milt verwijderd. Lymfocyten werden gefuseerd met 8653-cellen voor het maken van de hybridoma-klonen. Klonen werden toe-25 gestaan te groeien vervolgens geselecteerd als anti-TrkB positieven door ELISA-screening met zowel trkB van mens en rat.
ELISA-screening met anti-trkB-antilichamen: Supematanten van groeiende hybridoma-klonen werden gescreend op het vermogen ervan om zowel TrkB van mens en van rat te binden. De testen werden uitgevoerd in platen met 96 putjes die gedurende de 30 nacht zijn bekleed met 100 pl van 0,5 pg/ml van fusie-eiwit van TrkB van rat of mens met Fc. Overmaat reagens werd tussen elke stap van de putjes gewassen met PBS dat 0,05% Tween-20 bevat. Platen werden vervolgens geblokkeerd met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,5% BSA bevat. Supernatant werd aan de platen toegevoegd 83 en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Mierikswortel-peroxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis Fe van geit werd toegevoegd om te binden aan de antili-chamen van muis die aan TrkB zijn gebonden. Tetramethylbenzidine werd vervolgens als het substraat voor HRP toegevoegd voor het detecteren van de hoeveelheid van anti-5 lichaam van muis dat in het supernatant aanwezig is. De reactie werd gestopt en de relatieve hoeveelheid antilichaam werd gekwantificeerd door het lezen van de absorptie bij 450 nm. Vijftig antilichamen werden als positief getoond in de ELISA-test. Onder deze antilichamen werden vijf verder getest en werd getoond dat ze agonist activiteit hebben. Zie Tabel 2 hieronder.
10 KIRA-test: Deze test werd gebruikt voor het screenen van antilichamen die posi tief waren in de ELISA op het vermogen om activatie van de receptortyrosine-kinase voor humaan TrkB te induceren. Sadick et al. (1997) Experimental Cell Research 234(2):354-61. Door het gebruik van een stabiele cellijn die is getransfecteerd met gD-gemerkt humaan TrkB werden gezuiverde antilichamen van muis van de hybridoma-15 klonen getest op het vermogen ervan om de receptor op het oppervlak van de cellen te activeren overeenkomstig aan de activering die wordt waargenomen met de natuurlijke liganden BDNF en NT-4/5. Natuurlijk ligand induceerde zelf-fosforylatie van het kina-sedomein van de trkB-receptor. Nadat de cellen waren blootgesteld aan verscheidene concentraties van de antilichamen werden ze gelyseerd en werd een ELISA uitgevoerd 20 voor het detecteren van fosforylatie van de TrkB-receptor. EC50 (getoond in Tabel 2 hieronder en Figuur 10) werd voor elke vermoedelijke TrkB-agonist bepaald en werd vergeleken met die van het natuurlijke ligand NT-4/5.
El 5 Nodosus neuron overlevingstest: De nodosus ganglion neuronen die werden verkregen van El5 werden ondersteund door BDNF zodanig dat bij verzadigende con-25 centraties van de neurotrofe fecator de overleving bijna 100% was bij 48 uur in kweek. In de afwezigheid van BDNF overleefden minder dan 5% van de neuronen na 48 uur. De overleving van El5 nodosus neuronen is aldus een gevoelige test voor het beoordelen van de agonist-activiteit van anti-TrkB-antilichamen, d.w.z. agonist-antilichamen zullen overleving van El 5 nodosus neuronen bevorderen.
30 Op tijdstip-bevruchte drachtige Swiss Webster vrouwelijke muizen werden ge dood door inhalatie van CO2. De eileiders werden verwijderd en de embryo’s van embryonale fase El 5 werden geëxtraheerd. De nodosus ganglia werden ontleed vervolgens met trypsine behandeld, mechanisch gedissocieerd en uitgeplaat bij een dichtheid 84 van 200-300 cellen per putje is gedefinieerd, serumvrij medium in platen met 96 putjes die zijn bekleed met poly-L-omithine en laminine. De agonist-activiteit van anti-TrkB antilichamen werd in drievoud op een dosis-respons wijze beoordeeld met verwijzing naar humaan BDNF. Na 48 uur in kweek werden de cellen onderworpen aan een geau-5 tomatiseerde immunocytochemisch protocol dat werd uitgevoerd op een Biomek FX liquid handling werkstation (Beekman Coulter). Het protocol omvatte fixatie (4% formaldehyde, 5% sucrose, PBS), permeabilizatie (0,3% Triton X-100 in PBS), het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen (5% normaal geitenserum, 0,1% BSA, PBS) en opeenvolgende incubatie met een primair en secundaire antilichamen voor het detec-10 teren van neuronen. Een polyklonaal anti lichaam van konijn tegen het eiwitproduct van het gen 9.5 (PGP9.5, Chemicon), dat een vastgestelde neuronale fenotypische merker is, werd als een primair antilichaam gebruikt. Alexa Fluor 488 anti-konijn van geit (Molecular Probes) werd als secundair reagens gebruikt tezamen met de nucleaire kleurstof Hoechst 33342 (Molecular Probes) voor het merken van de kernen van alle 15 cellen die in de kweek aanwezig zijn. Het verkrijgen van een beeld en beeldanalyse werden uitgevoerd op een Discovery-1/GenII Imager (Universal Imaging Corporation). Beelden werden automatisch verkregen bij twee golflengten voor Alexa Fluor 488 en Hoechst 33342, waarbij de nucleaire kleuring als een referentiepunt werd gebruikt omdat het aanwezig is in alle putjes voor het beeld-gebaseerde auto focus-systeem van de 20 Imager. Geschikte doelen en aantal plaatsen waarvan per putje een beeld werd gevormd werden geselecteerd om het gehele oppervlak van elk putje te omvatten. Geautomatiseerde beeldanalyse werd opgezet voor het tellen van het aantal neuronen dat aanwezig is in elk putje na 48 in kweek op basis van de specifieke kleuring ervan met het anti-PGP9.5 antilichaam. Zorgvuldige drempelwaarden van het beeld en toepassing van 25 filters voor selectiviteit die zijn gebaseerd op morfologie en fluorescentie-intensiteit resulteerde in een nauwkeurige telling van neuronen per putje. EC50’s (getoond in tabel 2 hieronder en Figuur 11) werden voor elk vermoedelijk TrkB-agonist antilichaam bepaald en werden vergeleken met die van de natuurlijke liganden.
Tabel 2 hieronder toont de vijf anti-trkB antilichamen die zijn geïdentificeerd en de 30 activiteiten ervan op overleving van neuronen van muis en activiteit van fosforylatie op humaan trkB.
85
Tabel 2
Kloon HuTrkB RatTrkB Test op overleving van neuronen van muis Humane K1RA-ELISA EL1SA (geschatte EC50) test (EC50)
18H6 + + 0,01 pM 0,5 nM
38B8 + + 0,2 pM 5 nM
36D1 + + 5pM 5nM
37D12 + + 50 pM 56 nM
23B8 + + 11 pM 50 nM
Intracraniale injecties van anti-trkB-agonist antilichamen in muizen·. Mannelijke C57B6 in rust levende muizen voor het fokken (leeftijd 8-12 maanden) werden verkre-5 gen van Charles River Laboratories (Hollister facility) en toegestaan gedurende tenminste 5 dagen voorafgaand aan injectie te acclimatiseren in een tempera-tuur/vochtigheid gereguleerde omgeving met een cyclus van licht/donker van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water. Elke muis werd met isofluraan verdoofd voor het knippen van een deel van het haar boven de schedel. De muis werd gefixeerd 10 op het stereotaxische chirurgische instrument (Kopf model 900), verdoofd en warm gehouden met een elektrisch verwarmingskussen dat op medium werd ingesteld. Beta-dine werd op het geschoren deel van de schedel gewreven om het gebied te steriliseren. Een smalle mediane-longitudinale insnijding met en lengte van ongeveer 1 cm werd boven het cranium gemaakt die vlak achter de oren begint in de richting van de ogen.
15 De schedel werd geopend en een circulaire ruimte met een diameter van ongeveer 1 cm van het oppervlak van de schedel werd met een wattenpropje schoongemaakt om al het bindweefsel te verwijderen. Het oppervlak werd schoongemaakt met een wattenpropje dat in 30% waterstofperoxide was gedrenkt voor het onthullen van de Bregma. Door het gebruik van de boorpunt als een probe voor het meten van de dikte van de schedel 20 werd het cranium horizontaal en verticaal aangepast om zeker te stellen dat het horizontaal was voorafgaand aan het boren. Afwijking van de dikte (nul bij de Bregma) van 0,5 mm mediaal in vergelijking met 0,5 mm lateraal alsook 0,5 mm voor in vergelijking met 0,5 mm achter werd geminimaliseerd binnen een verschil van ± 0,05 mm. Volgens de atlas van muizenhersenen (Franklin, K. B. J. & Paxinos, G., The Mouse Brain in 25 Stereotaxic Coordinates. Academie Press, San Diego, 1997), waren de coördinaten voor een enkele, laterale, intrahypothalamische injectie als volgt: 1,30 mm posterieur aan de Bregma; -0,5 mm van de middenlijn; Diepte, 5,70 mm van het oppervlak van de 86 schedel (bij de Bregma). Een klein gat werd door de schedel geboord waarbij contact met de hersenen werd voorkomen. De boor werd vervangen door een 26 gauge naald met schuine opening die is verbonden aan een Hamilton spuit (model 84851) en naar dezelfde coördinaten teruggebracht. 2 μΐ van de verbinding werd toenemend gedurende 5 het verloop van 2 minuten in de laterale hypothalamus geïnjecteerd. De naald werd gedurende 30 seconden na injectie in deze positie gehouden, vervolgens 1 mm omhoog gehaald. Na een volgende 30 seconden werd de naald 1 mm omhoog gehaald. 30 Seconden later werd de naald volledig verwijderd. De insnijding werd gesloten en tezamen gehouden met wondklemmen van 2-9 mm (Autoclip, Braintree Scientific, Inc.). 10 De injectie werd op dag 0 uitgevoerd. Lichaamsgewicht en voedselopname werden tot dag 15 gevolgd.
Zoals in Figuur 12A en Figuur 12B is getoond verlaagden de intracraniale injecties van antilichaam 18H6 en 36D1 bij de gespecificeerde dosis aanzienlijk het lichaamsgewicht en de voedselopname bij muizen. Het controle IgG antilichaam en 15 23B8 die bij de gespecificeerde dosis werden gegeven hadden geen aanzienlijke in vloed op ofwel de voedselopname of het lichaamsgewicht. Two way ANOVA met Bonferroni post tests werd gebruikt voor statistische analyse. Dit geeft aan dat anti-trkB agonist antilichamen een effect hebben op het lichaamsgewicht en voedselopname die kwalitatief overeenkomstig is aan NT-4/5, een natuurlijke trkB-agonist, wanneer het 20 direct in het CZS wordt geïnjecteerd.
Voorbeeld 7: Perifere injectie van trkB-agonist antilichaam resulteerde in verhoogde voedselopname en lichaamsgewicht bii apen 25 Volwassen magere, vrouwelijke cynomolgus apen (die 3-5 kg wegen op de basis lijn) kregen intraveneuze injecties van monoklonaal agonist-antilichaam 38B8 van muis en de andere drie dieren kregen tweemaal per week hulpstof. Voedselconsumptie werd dagelijks gevolgd en het lichaamsgewicht werd wekelijks gevolgd. De statistische analysen werden uitgevoerd door het gebruik van PRISM (GraphPad Software Ine., San 30 Diego, CA). Alle gegevens en grafieken werden weergegeven in gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde (SEM). De gegevens werden geanalyseerd door 2-way ANOVA met Dunnet’s post tests (* P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001).
87
De apen die tweemaal per week werden behandeld met injecties van 5 mg/kg van het trkB-agonist anti lichaam 38B8 vertoonden een toename van 40% van cumulatieve voedselopname (Figuur 13A) en 10% toename van het gewicht (Figuur 13B) binnen 2 weken dat aangeeft dat specifieke activatie van de trkB tyrosinekinase-receptor orexi-5 gene effecten bemiddelt en lichaamsgewicht verlaagt.
Het is duidelijk dat de voorbeelden en uitvoeringsvormen die hierin zijn beschreven alleen voor illustratieve doeleinden zijn en dat met het oog daarop verscheidene modificaties of veranderingen door de deskundigen in het vakgebied zullen worden gesuggereerd en binnen de aard en kader van deze aanvraag moeten worden opgeno-10 men. Alle publicaties, octrooien en octrooi-aanvragen die hierin zijn geciteerd zijn hierin in het geheel voor alle doeleinden door verwijzing opgenomen in dezelfde mate alsof elke afzonderlijke publicatie, octrooi of octrooi-aanvraag specifiek en afzonderlijk werd aangegeven door verwijzing te zijn opgenomen.
2000646

Claims (10)

1. Gebruik van een trkB-agonist of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan bij de bereiding van een geneesmiddel voor perifere toediening voor het behandelen van 5 cachexia, anorexia nervosa, ongewenst gewichtsverlies of opioïde-geïnduceerd braken.
2. Gebruik volgens conclusie 1, waarbij de trkB-agonist trkB-selectief is.
3. Gebruik volgens conclusie 1, waarbij de trkB-agonist NT-4/5 of een farmaceu-10 tisch aanvaardbaar zout daarvan is.
4. Gebruik volgens conclusie 1 of 2, waarbij de trkB-agonist een anti-trkB-agonist anti lichaam is.
5. Gebruik volgens één van de conclusies 1-4, waarbij het geneesmiddel voor het behandelen van een zoogdier is.
6. Gebruik volgens conclusie 5, waarbij het zoogdier een primaat is.
7. Gebruik volgens conclusie 6, waarbij de primaat een mens is.
8. Gebruik volgens één van de conclusies 1 - 7, waarbij het geneesmiddel voor het behandelen van cachexie of ongewenst gewichtsverlies is bij een mens met een body mass index van lager dan ongeveer één van 25,0 kg/m2, 24,0 kg/m2, 23,0 kg/m2, 22,0 25 kg/m2,21,0 kg/m2, 20,0 kg/m2,19,0 kg/m2 en 18,5 kg/m2.
9. Gebruik volgens één van de conclusies 1 - 8, waarbij het ongewenste gewichtsverlies met veroudering is geassocieerd.
10. Gebruik volgens één van de conclusies 1 - 7, waarbij het geneesmiddel voor het behandelen van anorexia nervosa is bij een mens met een body mass index van lager dan ongeveer elk van 18,5 kg/m2,17,5 kg/m2 en 16,5 kg/m2. 2000464 SEOUENTIELIJST <11Q> Pfizer Ine. Lin, Chia-Yang Rosenthal, Arnon Stratton, Jennifer R. <120> METHODS FOR TREATING UNWANTED WEIGHT LOSS OR EATING DISORDERS BY ADMINISTERING A TRKB AGONIST <130> PC19516A <1SQ> US 60/765,410 <151> 2006-02-02 <160> 2 <170> Patentin version 3.4 <210> 1 <211> 130 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 1 Gly val Ser Glu Thr Ala Pro Ala ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala val 15 10 15 cys Asp Ala val ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala val Asp 20 25 30 Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp 50 55 60 Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly cys Arg Gly 65 70 25 80 val Asp Arg Arg His Trp val ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin ser Tyr 85 90 35 val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin Gly Arg val Gly Trp Arg Trp 100 105 HO lie Arg lie Asp Thr Ala Cys val cys Thr Leu Leu ser Arg Thr Gly US 120 125 Arg Ala 130 <210» 2 <211» 394 <212» DNA <213» Homo sapi ens 2000464 2 <400> 2 ............* ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60 agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120 ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180 tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240 gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300 accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360 tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc tgag 394 1000464
NL2000464A 2006-02-02 2007-02-01 Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist. NL2000464C2 (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76541006P 2006-02-02 2006-02-02
US76541006 2006-02-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NL2000464A1 NL2000464A1 (nl) 2007-08-03
NL2000464C2 true NL2000464C2 (nl) 2007-09-11

Family

ID=38093467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL2000464A NL2000464C2 (nl) 2006-02-02 2007-02-01 Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist.

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20070248611A1 (nl)
EP (1) EP1988923A1 (nl)
JP (1) JP2009528985A (nl)
KR (1) KR20080091838A (nl)
CN (1) CN101400367A (nl)
AR (1) AR059304A1 (nl)
AU (1) AU2007210862A1 (nl)
BR (1) BRPI0707482A2 (nl)
CA (1) CA2637826A1 (nl)
DO (1) DOP2007000021A (nl)
IL (1) IL193069A0 (nl)
NL (1) NL2000464C2 (nl)
PE (1) PE20071364A1 (nl)
RU (1) RU2008131939A (nl)
TW (1) TW200808352A (nl)
UY (1) UY30128A1 (nl)
WO (1) WO2007088476A1 (nl)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007523196A (ja) * 2004-02-20 2007-08-16 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション Ｎｔ−４／５を用いて肥満または糖尿病を処置する方法
KR20090088896A (ko) * 2006-11-09 2009-08-20 아이알엠 엘엘씨 효현제 ｔｒｋｂ 항체 및 그의 용도
MX2009006794A (es) * 2006-12-20 2009-07-02 Rinat Neuroscience Corp Agonistas del receptor tirosina quinasa b para el tratamiento de trastornos autoinmunes.
JP2011501760A (ja) * 2007-10-23 2011-01-13 ノバルティス アーゲー 呼吸器疾患の処置のためのｔｒｋｂ抗体の使用
WO2010086828A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Rinat Neuroscience Corporation Agonist anti-trkb monoclonal antibodies
FR2942409B1 (fr) * 2009-02-20 2013-07-26 Natacha Voillot Composition pharmaceutique pour la prevention des avortements a repetition.
GB2491106A (en) * 2011-05-18 2012-11-28 Univ Basel Antibodies against tropomyosin-related kinase B receptors
CN102944674B (zh) * 2012-11-05 2014-10-22 武汉远征世纪制药有限公司 一种检测TrkB受体pan-Tyr位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法
TW201730206A (zh) 2015-11-17 2017-09-01 葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 用於治療神經及其他疾病之結合激動劑
US9914781B1 (en) 2016-11-08 2018-03-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
US11066474B2 (en) * 2017-11-30 2021-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-TrkB monoclonal antibodies and methods of use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005082401A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5109113A (en) * 1986-05-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Membrane anchor fusion polypeptides
US4777127A (en) * 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US5219740A (en) * 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5364768A (en) * 1987-07-07 1994-11-15 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Process for the preparation of penems
US5422120A (en) * 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
US5686579A (en) * 1988-06-21 1997-11-11 Hybrisens, Ltd. Use of antibody/antigen interactions to protect biologically active proteins and peptides
ATE219519T1 (de) * 1989-01-23 2002-07-15 Chiron Corp Rekombinanttherapien für infektionen und hyperproliferative störungen
US6673776B1 (en) * 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
JPH03133378A (ja) * 1989-07-19 1991-06-06 Modrovich Ivan E 被験体を安定化させて液体中でのその生物学的活性を保存する方法
US5644034A (en) * 1989-08-07 1997-07-01 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US6506728B2 (en) * 1990-09-25 2003-01-14 Genentech, Inc. Methods using a novel neurotrophic factor, NT-4
US5364769A (en) * 1990-09-25 1994-11-15 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding neurotrophic factor four (NT-4), vectors, host cells and methods of production
WO1992005254A1 (en) * 1990-09-25 1992-04-02 Genentech, Inc. Novel neurothrophic factor
US6566091B1 (en) 1990-09-25 2003-05-20 Genentech, Inc. Neurotrophic factor
DK0487301T3 (da) * 1990-11-20 2000-09-18 Dade Behring Marburg Gmbh Fremgangsmåde til stabilisering af enzymkonjugater
US20030134815A1 (en) * 1991-08-20 2003-07-17 The Govt. Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
WO1993010218A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
NZ255529A (en) * 1992-09-07 1997-05-26 Biotechnology & Biolog Science Antigenic molecules equivalent to part of a natural growth hormone, antibodies therefrom and pharmaceutical compositions
DE69327113D1 (de) * 1992-09-14 1999-12-30 Regeneron Pharma Methode zum erzeugen von analgie mittels neurotrophine
US5349056A (en) * 1992-10-09 1994-09-20 Regeneron Pharmaceuticals Modified ciliary neurotrophic factors
IL109280A0 (en) * 1993-04-15 1994-07-31 Regeneron Pharma Neurotrophins for treatment of depression
ES2188612T3 (es) * 1993-04-22 2003-07-01 Skyepharma Inc Liposomas multivesiculares de ciclodextrina para encapsular compuestos farmacologicos y metodos para su uso.
JP2534968B2 (ja) * 1993-05-27 1996-09-18 チッソ株式会社 フラビン還元酵素遺伝子
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5766627A (en) * 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
US5753225A (en) * 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
US20030191061A1 (en) * 1994-03-31 2003-10-09 Brewitt Barbara A. Treatment methods using homeopathic preparations of growth factors
US6024734A (en) * 1994-03-31 2000-02-15 Brewitt; Barbara A. Treatment methods using homeopathic preparations of growth factors
US6436908B1 (en) * 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
US6013517A (en) * 1994-05-09 2000-01-11 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
WO1995031183A1 (en) * 1994-05-16 1995-11-23 Washington University Cell membrane fusion composition and method
MX9606598A (es) * 1994-06-24 1997-05-31 Behringwerke Ag Procedimiento para la estabilizacion de moleculas, o partes de moleculas, sensibles a la hidrolisis.
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6143718A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Type II diabetes mellutis with amylin agonists
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5840736A (en) * 1996-11-13 1998-11-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5780484A (en) * 1996-11-13 1998-07-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for stimulating neurite growth with piperidine compounds
BR9713055A (pt) 1996-11-15 2000-04-04 Genentech Inc Processo para isolar uma neurotrofina humana recombinante, composição de neurotrofina e processo para purificar uma neurotrofina
WO1998032458A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Remedies for diabetes
US20030105057A1 (en) * 1997-03-19 2003-06-05 Yale University Methods and compositions for stimulating apoptosis and cell death or for inhibiting cell growth and cell attachment
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
WO1999010340A1 (en) * 1997-08-29 1999-03-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds possessing neuronal activity
WO1999018792A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 Johns Hopkins University Gene delivery compositions and methods
US6565874B1 (en) * 1998-10-28 2003-05-20 Atrix Laboratories Polymeric delivery formulations of leuprolide with improved efficacy
EP1409654B1 (en) * 1999-06-16 2008-08-20 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of beta-amyloid levels in vivo
AU5914200A (en) * 1999-07-06 2001-01-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Amino-alkyl derivatives
WO2001002405A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinuclidine derivatives for treatment of neurological disorders
JP2003503476A (ja) * 1999-07-06 2003-01-28 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 環化アミド誘導体
AU5919900A (en) * 1999-07-06 2001-01-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Cyclized amino acid derivatives
EP1196387A1 (en) * 1999-07-06 2002-04-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Azo amino acid derivatives for the treatment of neurological diseases
NZ516888A (en) * 1999-07-30 2004-02-27 Vertex Pharma Acyclic and cyclic amine derivatives
ES2198367T3 (es) * 1999-10-29 2004-02-01 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Uso de gdnf para tratar defectos de la cornea.
AU2001230587A1 (en) * 2000-02-18 2001-08-27 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Drugs for ameliorating impaired glucose tolerance
AU2001232332A1 (en) * 2000-03-06 2001-09-17 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Leptin-resistance ameliorating agents
DK1292680T3 (da) 2000-06-22 2010-03-08 Genentech Inc Agonist-anti-TrkC monoklonale antistoffer
US7060429B2 (en) * 2001-02-22 2006-06-13 University Of Maryland, Baltimore Treatment of neurodegenerative diseases by altering levels of TrkB isoforms and/or TrkC isoforms
CN1529599A (zh) * 2001-06-14 2004-09-15 ��̩��˹ҩ��ɷ����޹�˾ 可用于治疗神经元损伤的无环哌嗪和哌啶衍生物
US6818613B2 (en) * 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005082401A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONTELEONE PALMIERO ET AL: "Opposite changes in the serum brain-derived neurotrophic factor in anorexia nervosa and obesity.", PSYCHOSOMATIC MEDICINE 2004 SEP-OCT, vol. 66, no. 5, September 2004 (2004-09-01), pages 744 - 748, XP002436969, ISSN: 1534-7796 *
PELLEYMOUNTER M A ET AL: "Characteristics of BDNF-induced weight loss", EXPERIMENTAL NEUROLOGY, ACADEMIC PRESS, NEW YORK, NY, US, vol. 131, no. 2, February 1995 (1995-02-01), pages 229 - 238, XP004537470, ISSN: 0014-4886 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1988923A1 (en) 2008-11-12
WO2007088476A1 (en) 2007-08-09
CA2637826A1 (en) 2007-08-09
AR059304A1 (es) 2008-03-26
TW200808352A (en) 2008-02-16
US20070248611A1 (en) 2007-10-25
DOP2007000021A (es) 2007-08-31
RU2008131939A (ru) 2010-02-10
US20090291897A1 (en) 2009-11-26
UY30128A1 (es) 2007-09-28
BRPI0707482A2 (pt) 2011-05-03
KR20080091838A (ko) 2008-10-14
NL2000464A1 (nl) 2007-08-03
CN101400367A (zh) 2009-04-01
JP2009528985A (ja) 2009-08-13
PE20071364A1 (es) 2008-01-30
AU2007210862A1 (en) 2007-08-09
IL193069A0 (en) 2009-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL2000464C2 (nl) Werkwijzen voor het behandelen van ongewenst gewichtsverlies of eetstoornissen door het toedienen van een TRKB-agonist.
JP4584713B2 (ja) 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって術後疼痛を処置するための方法および神経成長因子アンタゴニストを含有する組成物
TWI516501B (zh) Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JP2006504744A5 (nl)
JP2006517524A5 (nl)
JP2006517524A (ja) 神経成長因子アンタゴニストおよびオピオイド鎮痛薬を投与することによって疼痛を処置するための方法、ならびにこれらを含有する組成物
CN101605556A (zh) 治疗自体免疫疾病的trkb激动剂
KR20160005749A (ko) 항-글루카곤 수용체 항체 및 이의 사용 방법
US20100196390A1 (en) Agonist anti-trkb monoclonal antibodies
JP4503617B2 (ja) アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体および該抗体を用いる方法
JP2009525319A (ja) ｔｒｋＢアンタゴニストを投与することにより肥満を治療する方法
US20070031418A1 (en) Methods for treating lower motor neuron diseases and compositions containing the same
EP1581759B1 (en) Methods for treating taxol-induced sensory neuropathy
HK1129064A (en) Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist
MX2008010021A (en) Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist
HK1186127B (en) Methods for treating osteoarthitis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same

Legal Events

Date Code Title Description
AD1B A search report has been drawn up
PD2B A search report has been drawn up
V1 Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20100901