TW201730206A - 用於治療神經及其他疾病之結合激動劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於TrkB結合激動劑以及此等激動劑於治療神經病症和其他病症之用途。本發明亦關於包括CDR、可變區、重鏈和輕鏈以及其變體序列之特異性TrkB結合激動劑。

Description

用於治療神經及其他疾病之結合的激動劑
本發明係關於TrkB結合激動劑以及此等激動劑於治療神經病症和其他病症之用途。本發明亦關於包括CDR、可變區、重鏈和輕鏈以及其變體序列之特異性TrkB結合激動劑。
神經病症在全世界的發生率和盛行率逐漸增加，因此迫切需要此等治療。然而，神經病症在家族型和散發型二者上為表型上異質的，且常具有未知的病因。因此以單一病理機制為目標不太可能提供具有顯著臨床利益之疾病緩解，除非此病理機制的本質為此疾病之關鍵「驅動者」。
有數種機制和路徑牽涉神經病症，例如神經疾病，包括神經毒性物質的堆積、發炎、脂質代謝、氧化壓力、自噬作用、蛋白降解和粒線體功能障礙。然而，其是否為疾病的原因或原發性及/或續發性損害之結果仍不清楚。因此，以某些此等個別機制為基礎的治療在臨床上並不成功。有鑑於錯誤摺疊毒性蛋白堆積在腦中被視為是某些神經退化疾病之關鍵病理因素，因此許多開發用於神經疾病的疾病緩解治療之努力係遵循降低毒素之方法。雖然在最近輕度病患中的試驗顯示令人鼓舞的結果，然而，藉由降低毒性蛋白的臨床成功率有限，例如阿茲海默症中的Aβ。
以發病機制(導致疾病狀態的生物機制)為目標可能為適合的預防性或 防止性治療之方法；然而，以病態生理學(在疾病狀態內運行的內生性生物機制)為目標對已存在的神經病症之治療介入可能為一較佳的方法。
藉由以在神經元存活、功能、可塑和體內平衡佔有一席之地的內生性神經營養和神經保護路徑為目標，可能使用此替代的病態生理學治療法。有證據指出，內生性機制在神經病症中可能顯著下調。
神經滋養蛋白(neurotrophin)為調節中樞和周圍神經系統(分別為CNS和PNS)之發展、維護和功能的內生性生長因子。配體的神經生長因子(NGF)家族主要係經由高親和力Trk受體[NGF為TrkA，BDNF(大腦衍生神經滋養因子)而NT-4(神經滋養蛋白4,NT-4/5)為TrkB，NT-3(神經滋養蛋白3)為TrkC]以及亦藉由與低親和力的泛神經滋養蛋白受體p75NTR結合傳遞訊號。經由Trk受體的訊號傳導通常促進細胞存活，而在缺乏Trk受體下經由p75NTR之神經滋養蛋白的訊號傳遞，一般而言係幫助細胞凋亡。
有臨床前的證據支持BDNF-TrkB路徑在活體外和活體內促進CNS神經元之存活和功能上的角色。再者，已在ALS中進行四個使用BDNF的臨床試驗。另外，由於緊急的感官症狀之安全性考量，在皮下注射TrkB激動劑抗體之健康志願者第I期雙盲、安慰劑對照的單一遞增劑量研究(臨床試驗NCT01262690，委託者：Pfizer)已終止(未公開研究成果)。
總言之，對於其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的神經病症和其他病症之治療仍有需求。
本發明係提供一TrkB結合激動劑，其中該激動劑能加強BDNF-引發的及/或NT-4-引發的TrkB致效作用。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其中該激動劑能加強BDNF-引發的TrkB致效作用。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其係與包含在TrkB之D5區的β 摺板A和G內的以及介於β摺板A和A’間的區域之表位結合。在本內文中，術語「表位」係指與TrkB結合蛋白接觸的抗原(TrkB)部份，例如與TrkB結合蛋白相距少於或等於4.5Å之TrkB部份。在一實施例中，此TrkB結合激動劑不會與BDNF競爭。與此TrkB區結合的激動劑可能：a)與一或多個下列人類TrkB之殘基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、Glu341；b)與由下列組成之群中選出的人類TrkB殘基相距少於或等於4.5Å：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375；c)與人類TrkB結合，其中一選自下列之群的殘基：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB係具有改變的親和力；d)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基284-291(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性，或e)與具有SEQ ID NO：71中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其係與包括在TrkB的近膜區(juxta-membrane region)(W381-H430)內的表位結合。在本內文中，術語「表位」係指與TrkB結合蛋白接觸的抗原(TrkB)部份，例如與TrkB結合蛋白相距少於或等於4.5Å之TrkB部份。在一實施例中，此TrkB結合激動劑不會與BDNF競爭。與此區結合的激動劑可能：a)與人類TrkB胞外區結合，其中一個選自下列之群的殘基：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區係帶有改變的親和力； b)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個殘基385-398(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性；或c)與具有SEQ ID NO：69中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
本發明亦提供與參照抗體競爭和TrkB結合之TrkB結合激動劑，該參照抗體係具有：(a)SEQ ID NO：27之重鏈序列和SEQ ID NO：28之輕鏈序列；或(b)SEQ ID NO：29之重鏈序列和SEQ ID NO：30之輕鏈序列；或(c)SEQ ID NO：31之重鏈序列和SEQ ID NO：32之輕鏈序列。在一實施例中，此TrkB結合激動劑不會與BDNF競爭。本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其係維持細胞表面上的TrkB量。在一實施例中，此激動劑係在缺乏BDNF下活化TrkB。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其包括(i)任一CDR或其組合，係選自SEQ ID NO：27之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或SEQ ID NO：28之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或(ii)(i)之CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或3個胺基酸修飾。在特定的實施例中，特定的CDR係如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中所示，而其他的CDR為該等SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中所示之變體。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(c)如SEO ID NO：27或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
本發明亦提供包括任一下列CDR或其組合之TrkB結合激動劑：(a)SEQ ID NO：6之CDRH1；(b)SEQ ID NO：7之CDRH2；(c)SEQ ID NO：8之CDRH3；(d)SEQ ID NO：3之CDRL1；(e)SEQ ID NO：4之CDRL2；及/或(f) SEQ ID NO：5之CDRL3。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其係包括一包含與SEQ ID NO：40序列至少80%相同之序列的VH區及/或一包含與SEQ ID NO：41序列至少76%相同之序列的VL區。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其係包括：(a)與SEQ ID NO：42至少90%相同的重鏈(HC)序列；及/或(b)與SEQ ID NO：43至少85%相同的輕鏈(LC)序列。
本發明亦提供一或多個編碼如文中所定義之TrkB結合激動劑的核酸序列。在一實施例中，本發明係提供編碼如文中所定義之TrkB結合激動劑的核酸序列。
本發明亦提供一或多個表現載體，其係包括一或多個如文中所定義之核酸序列。在一實施例中，本發明係提供一表現載體，其包括編碼如文中所定義之TrkB結合激動劑的核酸序列。
本發明亦提供一重組宿主細胞，其係包括一或多個如文中所定義的核酸序列，或一或多個如文中所定義之表現載體。在一實施例中，本發明係提供一重組宿主細胞，其係包括編碼如文中所定義之TrkB結合激動劑的核酸序列，或包括編碼如文中所定義之TrkB結合激動劑的核酸序列之表現載體。
本發明亦提供一製造如文中所定義之TrkB結合激動劑的方法，該方法係包括於適合表現該核酸序列或載體的條件下培養如文中所定義之宿主細胞。在此方法的一實施例中，此TrkB結合激動劑係經表現並純化。
本發明亦提供由文中所述之方法製造的TrkB結合激動劑。
本發明亦提供一醫藥組成物，其係包括如文中所定義之結合激動劑及醫藥上可接受載劑、賦形劑或稀釋劑的一種或組合。
本發明亦於有此需要的患者中提供治療神經病症的方法，其包括投予該患者一治療上有效量之如文中所定義的TrkB結合激動劑，或如文中所定義的醫藥組成物。在一實施例中，該患者為人類。
本發明亦於有此需要的患者中提供一治療神經病症或其中藉由活化TrkB來修復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症之方法，該方法包括投予該患者一治療上有效量之如文中所定義的TrkB結合激動劑，或如文中所定義的醫藥組成物。在一實施例中，該患者為人類。
本發明亦於有此需要的患者中提供一治療神經病症或其他病症之方法，其包括投予該患者一治療上有效量之BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑。在一實施例中，該患者為人類。
本發明亦於有此需要的患者中提供一治療神經病症或其中藉由活化TrkB來修復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症之方法，該方法包括投予該患者一治療上有效量之BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑。在一實施例中，該患者為人類。
本發明亦提供一如文中所定義之TrkB結合激動劑或如文中所定義之醫藥組成物供治療之用。
本發明亦提供一如文中所定義之TrkB結合激動劑或如文中所定義之醫藥組成物供用於治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症。
本發明亦提供一如文中所定義之TrkB結合激動劑或如文中所定義之醫藥組成物供用於治療神經病症。
本發明亦提供一BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑供治療之用。
本發明亦提供一BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑供用於治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症。
本發明亦提供如文中所定義之TrkB結合激動劑或如文中所定義之醫藥組成物於製造醫藥品供治療神經病症的用途。
本發明亦提供如文中所定義之TrkB結合激動劑或如文中所定義之醫藥組成物於製造醫藥品供治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症之用途。
本發明亦提供BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑於製造醫藥品供治療神經病症的用途。
本發明亦提供BDNF-引發的TrkB致效作用之增強劑於製造醫藥品供治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症之用途，。
本發明亦提供如文中所定義之治療方法、TrkB結合激動劑或用途，其中治療係包括增進：細胞存活及/或神經元修復及/或神經元可塑性。
圖1A：在大鼠皮質神經元中於一段時間內引發TrkB磷酸化和TrkB下游訊號傳遞和TrkB之細胞表面量的BDNF和1G11西方墨點。將培養中大鼠皮質神經元(活體外7天)如所示於37℃以0.8nM BDNF或7.3nM 1G11處理。將細胞溶離物(30μg蛋白)於還原的條件下在SDS-PAGE上解析並如所示以抗體進行免疫墨點。使用甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內部對照。就測量的TrkB細胞表面量，將1G11處理後的大鼠皮質神經元於冰上以sulfo-NHS-生物素處理1小時，接著溶離並使用鏈黴親和素瓊 脂糖微珠分離生物素化蛋白。以抗-TrkB抗體解析分離的蛋白及進行免疫墨點。注意：對照組，未處理的起點對照組培養基有變。
圖1B：於一段時間內BDNF和1G11引發的TrkB細胞表面量與總細胞TrkB成比例。將培養中大鼠皮質神經元(活體外7天)如所示於37℃以0.8nM BDNF或7.3nM 1G11處理。藉由光密度分析測定相較於總TrkB之相對的TrkB細胞表面量。表面TrkB與總TrkB之比率相較於起始時間點的未處理對照組顯示倍數變化。
圖2：顯示代有不同性質之TrkB激動劑抗體的代表性數據-增強劑和非競爭劑(3A3,1G11,8E5)，競爭劑(5D11)，非競爭劑(2A1,3A4,5C7)。100%活性代表在飽和BDNF濃度，亦即10nM EC100之TrkB活化。
圖3：BDNE/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區間的結構相互作用，顯示各種二級結構(β摺板、環、N-端「Nt」和C-端「Ct」)，以公開的結構為基準。
圖4：BDNF/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區及1G11間的結構相互作用。以丙胺酸掃描辨識的殘基係如圖4A所示，而以共結晶X-光晶體學所辨識的殘基係如圖4B所示。
圖5：BDNF/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區及1G11的進一步結構分析顯示，NT-4/BDNF的N-端可能凸出至TrkB和1G11 Fab重鏈間的空間。
圖6：將分子表面加到BDNF/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區及1G11的結構分析顯示，Vκ CDRs L1和L3以及CDRH3與TrkB密切相互作用，且在TrkB和CDRs H1及H2之間有一裂口，其可設想為可能是容納BDNF的N-端。
圖7：BDNF/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區及3A3間的結構相 互作用。以丙胺酸掃描所辨識的殘基顯示，其全部皆在JM區內(C-端至D5區及N-端至跨膜區)。使用β股幾何學延伸JM殘基。
圖8：BDNF/NT-4同型二聚物和二個TrkB D5區及5G11間的結構相互作用。以丙胺酸掃描所辨識的殘基顯示，其係在配體結合處。
圖9係顯示單獨衍生自MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His或與1G11複合之TrkB胜肽間的最新氘之分數階差。
圖10係顯示單獨衍生自MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His或與3A3複合之TrkB胜肽間的最新氘之分數階差。
「TrkB」如文中所用係指天然生成、內生性或重組的TrkB蛋白。TrkB為配體腦-衍生的神經滋養因子(BDNF)或神經滋養蛋白-4(NT-4/NT-4/5)之受體。BDNF和NT-4二者可與TrkB結合，並可活化許多共通的訊號傳遞路徑。此非共價的同型二聚性配體BDNF或NT-4活化了TrkB，其為一種受體酪胺酸激酶。活化的TrkB可調節(a)細胞存活，(b)神經元修復及/或(c)神經元可塑性。
如上所述，TrkB-BDNF訊號傳遞係在中樞神經系統(CNS)和周圍神經系統(PNS)中於增進細胞存活、修復和可塑性上扮演重要角色。雖然在大多數的神經病症中致病因子/機制不同，但可能經歷退化之不同類型細胞的存活和功能係依賴有效能的BDNF-TrkB訊號傳遞機制。因此，藉由使用激動劑活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑預計可提升細胞存活、神經元修復和神經元可塑性而對病症提供差別性治療。活化TrkB可能媒介中樞和周圍二者的作用機制。
已有報告指出BDNF量在許多神經學和病態生理學疾病中為下降的且表現型/缺陷可歸因於此下降。在BDNF缺乏的病態生理條件下，其中TrkB受體量仍維持不變，若投予的治療劑可：(i)活化(激動)TrkB，(ii)不與下降量的BDNF競爭，(iii)加強由生理量下降之BDNF所引發的細胞訊號，及/或(iv)維持TrkB的細胞表面量，則仍可能引發生理細胞/系統反應，其另外可能造成對此治療之暫時性去敏感。
在本發明的內文中，術語「TrkB結合激動劑」係指在缺乏BDNF或NT-4下激動或活化人類全長TrkB(具有SEQ ID NO：2中所述之序列)之分子。TrkB結合激動劑，當與受體結合時，其可產生如同天然配體BDNF/NT-4之類似生物效應。TrkB為一種受體酪胺酸激酶且因而引發多個細胞訊號傳遞路徑。致效作用可藉由TrkB之活化來測量，包括測量增加的TrkB磷酸化量(pTrkB)，增加的Akt磷酸化量(p-Akt)，增加的Erk磷酸化量(p-Erk)，及/或增加的Creb磷酸化量(p-Creb)。例如，TrkB結合激動劑可在缺乏BDNF或NT-4下活化TrkB受體，產生相對於BDNF最大反應(設定為100%)至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%或至少60%的pTrkB量。在一實施例中，此TrkB結合激動劑可在缺乏BDNF或NT-4下活化TrkB受體，產生相對於NT-4最大反應(設定為100%)至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%或至少60%的pTrkB量。
親和力為與一分子結合的強度，例如TrkB結合激動劑，與另外的，例如其目標抗原在一單一結合位置結合。TrkB結合激動劑與TrkB的結合親和力可藉由平衡法來測定(例如，酵素連結免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫分析(RIA))，或動力學(例如BIACORETM分析)。例如，實例1.1(及表1中數據)所述之BiacoreTM法可用來測量結合親和力。
本發明之特定的TrkB結合激動劑對人類TrkB或人類TrkB ECD具有100nM或更低，50nM或更低，25nM或更低，或10nM或更低之平衡解離常數(KD)。KD數值越小，結合越強。KD的倒數(亦即1/KD)為具有M-1單位之平衡結合常數(KA)。熟習技術者應瞭解KA數值越大，結合越強。解離速率常數(kd)或「koff」係描述TrkB結合激動劑：TrkB複合物的安定性，亦即每秒衰敗之複合物分量。例如，特定TrkB激動劑和人類TrkB或人類TrkB ECD間的解離速率常數koff為10x10-4/s或更低，9x10-4/s或更低，8x10-4/s或更低，7x10-4/s或更低，6x10-4/s或更低，5x10-4/s或更低，或4x10-4/s或更低。結合速率常數(ka)或「kon」係描述TrkB結合激動劑：TrkB複合物形成的速率。例如，特定TrkB激動劑和人類TrkB或人類TrkB ECD間的結合速率常數kon為3x104/Ms或更大，4x104/Ms或更大，5x104/Ms或更大，6x104/Ms或更大，或7x104/Ms或更大。
在一實施例中，此TrkB結合激動劑係與全長人類TrkB特異性結合且不會與人類TrkA或人類TrkC或人類p75NTR結合。術語「特異性結合」係指此TrkB結合激動劑與TrkB結合，而不會或顯著與其他(例如，不相關)蛋白結合。文中所述之TrkB結合激動劑可以至少10、25、50、100或1000倍大於其與TrkA、TrkC及/或p75NTR結合的親和力與TrkB結合。應瞭解，此項係區別TrkB結合激動劑與BDNF，BDNF可活化TrkB和p75NTR(其係幫助細胞死亡)二者。
本發明之特定的TrkB激動劑係加強BDNF-引發及/或NT-4-引發的TrkB致效作用。「加強」用於文中係指BDNF-引發的TrkB致效作用及/或NT-4-引發的TrkB致效作用在TrkB激動劑的存在下更有效。BDNF-引發的致效作用可藉由評估TrkB的活化來測量，例如細胞訊號傳遞。BDNF或NT-4的飽和濃度(亦即EC100)可用於缺乏TrkB結合激動劑下各 配體之100%TrkB活化的基準。加強BDNF-引發的致效作用可定義為在TrkB結合激動劑的存在及飽和的BDNF濃度(EC100)下，BDNF-引發的TrkB活化係大於100%。可使用的飽和BDNF濃度為10nM(EC100)。在一實例中，100%的TrkB活化係代表使用10nM EC100之BDNF的TrkB活化。加強NT-4-引發的致效作用可定義為在TrkB結合激動劑的存在及飽和的NT-4濃度(EC100)下，NT-4-引發的TrkB活化係大於100%。TrkB活化可藉由測定磷酸化TrkB(pTrkB)的量來測量。在飽和的BDNF濃度存在下，相較於缺乏TrkB結合激動劑之100%，TrkB之磷酸化在TrkB結合激動劑的存在下可為至少110%。例如，在飽和的BDNF濃度存在下，相較於缺乏TrkB結合激動劑之100%，TrkB之磷酸化在TrkB結合激動劑的存在下可為至少115%，至少120%，至少125%，至少130%，至少135%，至少140%，至少145%或至少150%。在TrkB結合激動劑的存在下及飽和的BDNF濃度存在下，pTrkB量可為約130%。在TrkB結合激動劑的存在下及飽和的BDNF濃度存在下，pTrkB量可為約160%。在TrkB結合激動劑的存在下及飽和的BDNF濃度存在下，pTrkB量可為約120%。
應注意，雖然加強效應僅可在活體外於飽和的BDNF濃度存在下測量，但此飽和的BDNF濃度在臨床設定上並不認為是必要的。假設TrkB結合激動劑的加強效應在任何濃度的BDNF皆可存在。在BDNF缺乏的病態生理條件下，其中TrkB受體量仍維持不變，若TrkB結合激動劑可加強由下降生理量之BDNF所引發的細胞訊號傳遞，則對生理學反應將為有利的。
本發明之特定TrkB激動劑係維持細胞表面之TrkB量。活化的酪胺酸激酶受體典型地歷經內噬作用接著降解，造成細胞表面受體下調，因而暫時對配體變得無反應以維持細胞體內平衡，其為依據TrkB之BDNF活 化效應的情況。TrkB結合激動劑可在激動劑的存在下於一段時間內維持TrkB的細胞表面量。例如，TrkB的細胞表面量可維持至少2小時，至少4小時，至少6小時，至少8小時或至少10小時。TrkB結合激動劑可在激動劑的存在下於一段時間內增加TrkB的細胞表面量。例如，TrkB的細胞表面量可增加5小時，至少10小時，至少15小時，至少20小時或至少25小時。TrkB結合激動劑可增加可藉由激動劑活化之可用的TrkB細胞表面量；及/或(b)抑制活化的TrkB受體內噬作用和降解。在BDNF缺乏的病態生理條件下，其中TrkB受體量仍維持不變，若治療性TrkB結合激動劑在未改變TrkB細胞表面量下可活化TrkB，則對生理學反應將為有利的，其另外可能對TrkB激動劑造成暫時性去敏感。
特定的TrkB結合激動劑不會與BDNF及/或NT-4競爭和TrkB結合。TrkB結合激動劑和BDNF或NT-4之間的競爭可藉由功能性分析來測定用以評估TrkB的活化，例如，藉由在有和無BDNF或NT-4之存在下以TrkB磷酸化測量TrkB結合激動劑對TrkB的活化效應。在一實施例中，不會與BDNF競爭的TrkB結合激動劑在飽和BDNF濃度(例如10nM,EC100)的存在下因激動劑濃度增加，將不會對TrkB磷酸化造成改變。會與BDNF競爭的TrkB結合激動劑在飽和BDNF濃度(例如10nM,EC100)的存在下因激動劑濃度增加，將會造成TrkB磷酸化減少。在一實施例中，此TrkB結合激動劑不會與BDNF競爭，其中磷酸化的TrkB總量在激動劑及飽和濃度BDNF(EC100)的存在下，係與單獨的飽和濃度BDNF(EC100)存在下之磷酸化TrkB量類似，亦即總pTrkB(EC100BDNF+激動劑)總pTrkB(EC100BDNF)。同樣地，在一實施例中，此TrkB結合激動劑不會與NT-4競爭，其中磷酸化的TrkB總量在激動劑及飽和濃度(EC100)NT-4的存在下，係與單獨的飽和濃度NT-4存在下之磷酸化TrkB量類似，亦即總pTrkB (EC100NT-4+激動劑)總pTrkB(EC100NT-4)。其中在激動劑及飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB係在範圍內(在飽和量的BDNF或NT-4的存在下所測量的平均總pTrkB±3個標準偏差)，磷酸化的TrkB量則被視為類似的。在一實施例中，在激動劑及飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB係在範圍內(在飽和量的BDNF或NT-4的存在下所測量的平均總pTrkB±2個標準偏差)。在另外的實施例中，在激動劑及飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB係在範圍內(在飽和量的BDNF或NT-4的存在下所測量的平均總pTrkB±1個標準偏差)。在前述實施例中，磷酸化pTrkB之平均總量係以至少三個讀數的為基準所計算，並使用較大的二個標準偏差(亦即在激動劑存在下所計算的標準偏差和無激動劑下所計算的標準偏差)。在另外的實施例中，當在激動劑及飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB與在飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB相差少於10%時，則磷酸化pTrkB之量被視為類似的。在另外的實施例中，當在激動劑及飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB與在飽和量的BDNF或NT-4之存在下所測量的平均總pTrkB相差少於5%時，則磷酸化pTrkB之量被視為類似的。不會與BDNF或NT-4競爭和TrkB結合之TrkB結合激動劑在臨床設定上為有利的，因為此TrkB激動劑可活化TrkB且不或與下降量的BDNF(或NT-4)競爭。因此，BDNF和NT-4，除了與TrkB結合激動劑結合之外，仍可持續扮演生理角色。
另一種選擇，TrkB結合激動劑與BDNF或NT-4之間的競爭可藉由競爭ELISA、FMAT或BIAcore分析來測定，其係設計用來檢測TrkB結合激動劑和BDNF是否或與相同或重疊的表位結合，是否有立體的結合抑制，或是否第一分子的結合引發TrkB中構形改變其防止或降低了第二分 子的結合。TrkB結合激動劑與BDNF或NT-4之間對TrkB結合的競爭可能沒有或極小(亦即部份的)。在一實施例中，TrkB-ECD可固定在一晶片表面並將BDNF或NT-4注射至流通槽。然後注射TrkB結合激動劑並評估其在BDNF或NT-4的存在下與TrkB-ECD結合的能力。競爭可分類為：「無」，具有低於20%的TrkB激動劑結合；「部份」，具有60%的TrkB激動劑結合；及「有」，具有大於60%的TrkB激動劑結合。
本發明之特定的TrkB結合激動劑可顯現人類TrkB和其他物種TrkB間的交叉反應性。例如，TrkB結合激動劑係特異性結合人類、鼠科、大鼠和獼猴TrkB。此項特別有用，因為藥物開發典型地需要在小鼠系統中測試前導候選藥，之後再於人類中測試此藥。可結合人類、鼠科、大鼠和獼猴物種的藥物提供則得以在這些系統中測試結果並使用相同藥物進行並行的數據比較。此項避免了需要找出例如用於小鼠TrkB的藥物和用於人類TrkB的分開藥物之複雜性，以及避免使用不相同的藥物比較結果之需求。特定的TrkB結合激動劑在人類和大鼠TrkB之磷酸化中就EC50係具有低於或等於5倍差異，或低於或等於2-倍差異。特定的TrkB結合激動劑在人類和小鼠TrkB之磷酸化中就EC50係具有低於或等於5倍差異，或低於或等於2-倍差異。特定的TrkB結合激動劑在人類和獼猴TrkB之磷酸化中就EC50係具有低於或等於5倍差異，或低於或等於2-倍差異。在一實施例中，此EC50值為至少3個實驗的平均值。
TrkB結合激動劑可與緊靠TrkB之BDNF結合位置的TrkB表位結合，特別是靠近與配體N-端結合的特異性補丁(patch)。TrkB結合激動劑可與TrkB結合並增進或穩定BDNF和TrkB間的進一步結合(激動劑：配體：受體的三聚複合物)。TrkB結合激動劑可為TrkB-BDNF增強劑，其與BDNF為非競爭性的。此TrkB結合激動劑可與包括在TrkB之D5區及/ 或TrkB之近膜(JM)區內的特定表位結合；及/或與參照抗體競爭和TrkB結合。與這些表位結合使活化構形的TrkB安定為可能的。TrkB激動劑可(a)增加可用的TrkB細胞表面量；及/或(b)抑制活化的TrkB受體內噬作用和降解。
因此，TrkB結合激動劑係描述為：(i)在無BDNF下活化TrkB，(ii)不會與BDNF競爭，(iii)加強BDNF-引發的或NT-4-引發的TrkB致效作用，及/或(iv)維持TrkB之細胞表面量。
就整個小鼠、大鼠、獼猴和人類，TrkB一級胺基酸序列為高度保守的(95%整體全長序列)，及在胞外區(TrkB-ECD)特別保守。TrkB-ECD係包括5個區(D1-D3：C32-C194；D4：G195-V283；D5：H284-G380)和一短的近膜JM區(W381-H430)。TrkB的D5區可取代全長的TrkB與配體(BDNF/NT-4)結合。在TrkB的配體結合區(LBD)內有二個接觸區：「保守性補丁」和「特異性補丁」。保守性補丁中TrkB D5的接觸殘基係來自AB、C’D和EFβ摺板與D5區C端之間的環。TrkB的保守性補丁係與配體(BDNF/NT-4)的主幹結合。特異性補丁中TrkB D5的接觸殘基係來自ABED β摺板的外表面。TrkB的特異性補丁係與配體(BDNF/NT-4)的N-端結合，其在非配體化形式中為紊亂的並在與TrkB結合後變為秩序化。
大多數的術語「表位」特異性之定義，表位為與結合蛋白，例如TrkB激動劑接觸的抗原之部份(參見，例如Essential Immunology,Sixth Edition,Blackwell Scientific Publishing,1988,Ed.Roitt,Chapter 4)。其他的定義係指與結合蛋白相結合的抗原部份。術語「接觸」和「結合」可能意味一表位應僅適當地由與抗體或片段經由非共價相互作用，例如靜電(氫鍵、離子性)、凡德瓦力(Van de Waalforce)、π-效應和疏水鍵直接相互作用的殘基所組成。在此一嚴格的解釋上，表位不應包括不會相互作用，但在其他方面 對抗原和結合蛋白間的相互作用為重要的殘基。例如，抗原中的特定殘基可能要非常小(例如甘胺酸)以便能促進抗原之其他殘基和抗體(或片段)間直接相互作用所需之密切相互作用。同樣地，特定的殘基(例如脯胺酸)可能對抗體序列採納正確構形以便容許結合為必需的。
事實上，為了辨識「表位」構形典型地所進行之大多數技術並不會(且無法)區別相互作用的殘基和在其他方面重要的殘基。下列技術為常用的：
1.抗體或其片段與衍生自此抗原的胜肽結合(其中展現顯著結合的胜肽被視為含有「該表位」)。
2.氫氘交換(其中相較於未複合的抗原，衍生自複合抗原的胜肽對氘併入具阻抗性，被認為含有「該表位」)
3.突變誘發研究(例如丙胺酸掃描突變誘發，其中抗原中突變的位置明顯改變與結合蛋白的結合，被認為形成「該表位」之部份)。
熟習技術者應瞭解，僅原子能階解析技術(例如X-光晶體學、NMR、電子顯微鏡)能區別相互作用和在其他方面為重要的殘基。然而，即使這些為能夠得到根據嚴格定義之表位資訊的僅有技術，據指出仍有其他技術提供對結合目標為重要的殘基/序列之有用資訊。
實例中所描述的TrkB結合激動劑、1G11具有如下數種所欲的性質：
1. 加強BDNF-引發的和NT-4-引發的致效作用
2. 維持TrkB之細胞表面量
3. 與獼猴TrkB之交叉反應性。
1G11已藉由X光晶體學顯示極靠近殘基T288、F291、K372和E293。T288和T291係位於D5 β摺板A中；E293係位於D5 β摺板A和A’之間； 而K372係位於D5 β摺板G中。例如，TrkB結合激動劑可與包括殘基T288、F291、K372、E293、F285、T290和D370之表位結合。F285和T290係位於D5 β摺板A中。D370係位於D5 β摺板G中。因此，「表位」可能似乎係包括在β摺板A和G內，及介於TrkB之D5區的β摺板A和A’之間的區域。與此相同「表位」接觸的其他TrkB結合激動劑預期可能具有類似的生物活性。此等結合蛋白為極所希望的。
因此，在一實施例中，此TrkB結合激動劑可：a)與一或多個下列人類TrkB之殘基相互作用：Thr290,Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341；b)與由下列組成之群中選出的人類TrkB殘基相距少於或等於4.5Å：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375；c)與人類TrkB胞外區結合，其中一選自：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372(根據全長人類TrkB編號)之群的殘基係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力；d)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基284-291(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性；或e)與具有SEQ ID NO：71中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
在一實施例中，TrkB結合激動劑可與一或多個，二或多個，三或多個下列人類TrkB之殘基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341。在一實施例中，本發明係提供與Glu293及視需要與一或多個，或二或多個由下列組成之群中選出的另外殘基相互作用之TrkB結合激動劑：Thr290、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373、 Glu341。在另外的實施例中，本發明係提供與Thr290和Glu 293，或Glu293和Ser 294，或Thr290、Glu293和Ser294相互作用之TrkB結合激動劑。
在上述實施例中，此相互作用可為直接的相互作用或經由水的間接相互作用。在一實施例中，此相互作用為直接相互作用。在本發明內文中，直接的相互作用為TrkB結合激動劑和全長人類TrkB之代號殘基間的氫建。然而，應注意相互作用殘基上的訊息不需要衍生自全長的人類TrkB。例如，可使用人類TrkB胞外區或人類TrkB之D5-JM區。相互作用殘基可藉由能解析原子能階之技術來辨識。在一實施例中，相互作用殘基係藉由X-光晶體學來辨識。
在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其與一或多個，二或多個，或三或多個由下列組成之群中選出的人類TrkB之殘基相距少於或等於4.5Å：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其與Glu293及視需要一或多個，或二或多個，或三或多個另外由下列組成之群中選出的殘基相距少於或等於4.5Å：T288、I289、T290、F291、L292、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其與Thr290和Glu293，或Glu293和Ser294，或Thr290、Glu293和Ser294相距少於或等於4.5Å。在上述的實施例中，此鄰近分析可於由任何能解析原子能階技術所辨識之結構上進行，例如X-光晶體學。TrkB的殘基係如同其在全長人類TrkB中來編號。然而，應注意，接近TrkB結合激動劑的訊息並不需要衍生自全長的人類TrkB。例如，可使用人類TrkB胞外區或人類TrkB之D5-JM區。
在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：E210、F285、T288、T290、F291、E293、 D370和K372(根據全長人類TrkB編號)係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：E210、T288、F291、E293、D370和K372係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：F291和E293係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。結合可藉由任何適合的方法來評估，例如SPR或ELISA。TrkB可加標記(例如生物素化)以幫助此結合分析，但其序列可能不會因額外的胺基酸延長。術語「改變的親和力」係指其中當相較於人類野生型TrkB胞外區時，TrkB結合激動劑就此突變型展現實質上降低或實質上增加的親和力之狀況。親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去一個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去二個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在另一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去三個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少3-倍。在另外的實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基 準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少5-倍。又在另外的實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少10-倍。親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上一個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上二個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在另一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上三個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少3-倍。在另外的實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少5-倍。又在另外的實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少10-倍。在一實施例中，改變的親和力係指降低的親和力。
在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合蛋白，其係與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基284-291(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽， 對氘併入更具抗性。在一實施例中，氘併入之阻抗性係在稀釋於氘化緩衝液後15至300秒之間的時間點進行評估(例如在15、60或300秒其中之一)。
當來自丙胺酸掃描突變誘發和X-光晶體學的數據指向1G11之非連續表位時，請注意，大多數的相互作用似乎應在此非連續表位的最N-端部份。此亦為防護最強而不被氫氘交換的部份。為此，預期僅與此1G11之表位N-端區結合的結合蛋白可能具有類似1G11之性質。因此，在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其係與具有SEQ ID NO：71所述之胺基酸序列的胜肽(包括抗體1G11之非連續表位N-端區的胜肽)結合。在本內文中，術語「與....結合」需要實質上大於任何等同衍生自人類TrkB胞外區長度的非重疊胜肽所觀察到結合反應。結合可藉由任何適合的方法來評估，例如ELISA。胜肽可加標記(例如生物素化)以幫助結合分析，但序列可能不會因額外的胺基酸而延長。應注意，與具有指定序列的胜肽結合之要求並非一定是指該結合蛋白可能不會與此序列以外的殘基相互作用，或，例如保護其免於，例如氘吸收，其限制條件為達到「全有或全無」的結合反應(亦即由具有此SEQ ID NO：71序列的胜肽所達成的結合量實質上係大於由其他非重疊TrkB胜肽所達成的量)。在本發明內文中實質上較大的結合反應係指其中含有SEQ ID NO：69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去一個標準差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)的情況。在一實施例中，含有SEQ ID NO：71所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去二個標準差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)。在另一實施例中，含有SEQ ID NO：71所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去三個標準 差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)。在一實施例中，含有SEQ ID NO：71所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少3倍。在另外的實施例中，含有SEQ ID NO：71所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少5倍。在另外的實施例中，含有SEQ ID NO：71所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少10倍。
與類似表位結合的1G11和TrkB結合激動劑可能與位於鄰近BDNF/NT4「保守性補丁」配體結合位置(AB、C’D和EF β摺板之間的環，以及D5區之C-端)，及接近BDNF/NT4「特異性補丁」配體結合位(ABED β摺板的外表面)之TrkB D5區的表位結合。BDNF的N-端可能凸出至TrkB與這些TrkB結合激動劑之間的空間。此TrkB結合激動劑除了與TrkB結合之外，可能能夠與BDNF的N-端相互作用，可能使三元複合物穩定，導致BDNF功能性反應強化。另一種選擇，此TrkB結合激動劑可藉由在非配位結合區但靠近配位結合區結合，穩定TrkB和BDNF間的相互作用。
實例中所述的TrkB結合激動劑、3A3和8E5亦能加強BDNF-引發的致效作用。丙胺酸掃描突變誘發辨識出對3A3結合重要的TrkB之特定殘基。因為3A3和8E5共用特定的性質及競爭與TrkB結合，咸信其可能具有重疊的「表位」。以3A3的數據為基準，此「表位」係包括殘基E398、Y397、D399、Y400、D394和I396。例如，TrkB結合激動劑可能與包括殘基E398、Y397、D399和Y400之表位結合。例如，TrkB結合激動劑可能與包括殘基E398、Y397、D399、Y400、D394、I396、V395、N389和 T402之表位結合。這些殘基係落在近膜(JM)區(W381-H430)中。JM區，在缺乏任何晶體結構下，係假定為一長的柔性連接區。一般認為，此JM區對於配體結合亦可能為重要的。與此相同「表位」接觸的其他TrkB結合激動劑可能預期係具有類似的生物活性。此等結合蛋白應為極度希望的。
因此在一實施例中，TrkB結合激動劑可：a)與人類TrkB胞外區結合，其中一選自下列之群的殘基：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區係帶有改變的親和力；b)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基385-398(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應胜肽，對氘併入更具抗性；或c)與具有SEQ ID NO：69中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402(根據全長人類TrkB編號)係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：D394、I396、Y397、E398、D399和Y400係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。在一實施例中，本發明係提供與人類TrkB胞外區結合之TrkB結合激動劑，其中一選自下列之群的殘基：Y397、E398、D399和Y400係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區，係帶有改變的親和力。結合可藉由任何適合的方法來評估，例如SPR或ELISA。TrkB可加標記(例如生物素 化)以幫助此結合分析，但其序列可能不會因額外的胺基酸延長。術語「改變的親和力」係指其中當相較於人類野生型TrkB胞外區時，TrkB結合激動劑就此突變型展現實質上降低或實質上增加的親和力之狀況。親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去一個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去二個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在另一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD減去三個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少3倍。在另外的實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少5倍。又在另外的實施例中，親和力之實質增加為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少10倍。親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上一個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平 均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上二個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在另一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於或等於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD加上三個標準差(應使用野生型或突變型之較大的標準差)。在一實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少3倍。在另外的實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少5倍。又在另外的實施例中，親和力之實質降低為其中以至少3個讀數為基準所測量的此突變型之平均KD係大於以至少3個讀數為基準所測量的人類野生型TrkB胞外區之平均KD至少10倍。在一實施例中，改變的親和力係指降低的親和力。
在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合蛋白，其係與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基385-398(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性。在一實施例中，氘併入之阻抗性係在稀釋於氘化緩衝液後15與60秒之間的時間點進行評估(例如在15或60秒其中之一)。
在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其係與具有SEQ ID NO：69所述之胺基酸序列的胜肽(在含有藉由丙胺酸掃描突變誘發所辨識之所有殘基的近膜區內的胜肽，對與抗體3A3結合為重要的)結合。在本內文中，術語「與....結合」需要實質上大於任何等同衍生自人類TrkB 胞外區長度的非重疊胜肽所觀察到結合反應。結合可藉由任何適合的方法來評估，例如ELISA。胜肽可加標記(例如生物素化)以幫助結合分析，但序列可能不會因額外的胺基酸而延長。在一實施例中，此胜肽可能具有如SEQ ID NO：70所述之序列(一較小的胜肽，仍含有藉由丙胺酸掃描突變誘發所辨識之殘基，對與抗體3A3結合為重要的)。應注意，與具有指定序列的胜肽結合之要求並不一定是指該結合蛋白可能不會與此序列以外的殘基相互作用，或，例如保護其免於，例如氘吸收，其限制條件為達到「全有或全無」的結合反應(亦即由具有此SEQ ID NO：69(或70)序列的胜肽所達成的結合量實質上係大於由其他非重疊TrkB胜肽所達成的量)。在本發明內文中實質上較大的結合反應係指其中含有SEQ ID NO：69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去一個標準差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)的情況。在一實施例中，含有SEQ ID NO：69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去二個標準差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)。在另一實施例中，含有SEQ ID NO：69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於或等於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD減去三個標準差(使用任何胜肽所觀察到的最大標準差)。在一實施例中，含有SEQ ID NO；69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少3倍。在另外的實施例中，含有SEQ ID NO：69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少5倍。在另外的實施例中，含有SEQ ID NO： 69(或70)所述序列的胜肽以至少3個讀數為基準之平均KD係低於以至少3個讀數為基準所測量的非重疊TrkB胜肽之平均KD至少10倍。
雖然TrkB JM區表位似乎不同於TrkB D5表位，但重要的請注意TrkB結合激動劑1G11、3A3和8E5可(至少部份)彼此競爭與TrkB結合，且因此表位可能重疊。近膜(JM)區之長的柔性連接子可能實際上極接近D5 β摺板A和G，及β摺板A和A’之間的區域。當TrkB結合激動劑與JM區表位結合為可能時，其具有某些與BDNF的額外相互作用(例如經由配體的N-端)，及/或同樣地穩定此受體加配體加激動劑之三元複合物。有利地，在近膜區中的殘基D394、I396和Y400賦予人類TrkB受體特異性，因為這些殘基在大鼠TrkB(分別為Glu、Leu、Trp)中為不同的。其他的TrkB結合激動劑結合相同區但接觸點不同可展現交叉反應性為可能的。
在某些實施例中，TrkB上的TrkB結合激動劑表位不與BDNF配體結合區(LBD)重疊。TrkB結合激動劑可能與一TrkB上的表位結合，其使得BDNF得以與TrkB結合而形成三元複合物(TrkB結合激動劑+TrkB+BDNF)。
TrkB上的特定TrkB結合激動劑表位可能與結合參照抗體之TrkB上的表位重疊。在一實施例中，本發明係提供與參照抗體競爭和TrkB結合之TrkB結合激動劑。在一實施例中，TrkB結合激動劑係與參照抗體競爭和TrkB結合，而不會與BDNF競爭和TrkB結合。此參照抗體可能具有(a)SEQ ID NO：27之重鏈序列和SEQ ID NO：28之輕鏈序列；或(b)SEQ ID NO：29之重鏈序列和SEQ ID NO：30之輕鏈序列；或(c)SEQ ID NO：31之重鏈序列和SEQ ID NO：32之輕鏈序列。
TrkB結合激動劑可激動TrkB之細胞訊號傳遞以增進(a)細胞存活，(b)神經元修復及/或(c)神經元可塑性。增進為相較於無激動劑，在激動劑的 存在下提升生物功能或反應。
「細胞存活」包括維持或促進其中表現TrkB之細胞的生長。TrkB係表現在中樞(CNS)和周圍神經系統(PNS)。在CNS中，高量的TrkB係表現在腦皮質、海馬迴、視丘、脈絡叢和小腦顆粒層、腦幹、視網膜和脊椎。在PNS中，TrkB係表現在腦神經節、前庭系統、頜下腺和背根神經節。TrkB廣泛地表現在胎兒腦中。TrkB亦表現在其他組織，例如骨骼肌、腎和胰臟。TrkB亦表現在梅斯納氏小體(Meissner corpuscle)。中樞神經系統(CNS)及骨骼肌中神經肌肉介面中活化的TrkB可調節腦和脊椎運動神經元存活和肌肉祖細胞分化。在一實例中，細胞存活包括神經元細胞存活。
例如，本發明之TrkB結合激動劑可促進神經元存活，例如穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞株的存活。TrkB結合激動劑1G11、人源化1G11、8E5和3A3可用濃度依賴的方式以0.006-0.025之平均EC50促進細胞存活(穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞株)。
TrkB結合激動劑可活化大鼠腦中內生性表現的TrkB受體及/或脊椎衍生的神經元、小鼠腦衍生的神經元及/或CHO細胞中重組表現的獼猴TrkB。
TrkB可調節神經元修復，包括軸突再生和生長、神經突生長、神經髓鞘形成率和延伸及肌肉再生。修復可包為生理學上維持體內平衡(亦即維持回應生物輸入的平衡)，或受傷及/或損害之結果。例如，TrkB結合激動劑可引發神經突生長，例如穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞株中神經突生長。TrkB結合激動劑1G11、人源化1G11和8E5以濃度依賴的方式以0.07-1.58nM之平均EC50引發神經突生長(穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞株)。
TrkB可調節神經元可塑性(神經可塑性)，包括突觸可塑性和非突觸可塑性二者。神經元可塑性係指由於行為、環境和神經處理過程、思考、情緒變化之神經路徑和突觸中的變化，及因受傷及/或損害所造成的變化。例如，TrkB可調節突觸可塑性功能。中樞神經系統(CNS)和骨骼肌之神經肌肉介面中活化的TrkB可穩定神經肌肉接合點(NMJ)，並調節NMJ之乙醯膽鹼(ACh)傳送。
TrkB結合激動劑可為一胜肽、多肽、蛋白、RNA適體或多糖。例如，TrkB結合激動劑為一抗原結合蛋白。術語「抗原結合蛋白」如文中所用係指一抗體，及能與TrkB結合之替代的抗體模式。
術語「抗體」，如文中所用廣義上而言，係指帶有類免疫球蛋白區之分子(例如IgG、gM、IgA、IgD或IgE)並包括單株、重組、合成、多株、嵌合、人類、人源化、多特異性抗體(包括雙特異性)及異源接合抗體；單一可變區、抗原結合抗體片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物連接Fv、單鏈Fv、二硫化物-連接的scFv、雙抗體、TANDABSTM等)，以及任何前述之修飾型。在一實施例中，此抗體係具有一IgG或IgA支架。在一實施例中，此抗體具有一IgG支架，其可為四鏈或二鏈抗體。此IgG支架可包括某些或全部的抗體區(亦即CH1、CH2、CH3、VH、VL)。此抗原結合蛋白可包括選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE之IgG支架。例如，此支架可為IgG1。支架可包括或由抗體之Fc區所組成，或為其部份。TrkB結合激動劑可包括一有缺陷的Fc區。例如，此Fc區可經突變L235A和G237A(EU編號)修飾。此Fc區的修飾減少了抗體與Fcγ受體和C1q之結合，因而降低了抗體引發TrkB陽性細胞因抗體依賴的細胞毒性(ADCC)或補體依賴的細胞毒性(CDC)而耗盡之可能。此一般係描述為Fc-失能(Fc-disablement)。應注意，Fc效應子功能對於TrkB結合激動劑的生物功 能並非緊要的。
術語「區(domain)」係指保留其三級結構之摺疊的蛋白結構，與蛋白的其餘部分無關。一般而言，區係負責蛋白之離散功能性質及在許多情況下，在無喪失此蛋白及/或此區之其餘功能下，可加入、移除或轉移至其他蛋白。術語「單一可變區」係指包括抗體可變區之序列特性的摺疊多肽區。因此其係包括完整的抗體可變區例如VH、VHH和VL及修飾的抗體可變區，例如其中一或多個環係經無抗體可變區特性之序列所取代，或經截短或包括N-或C-端延長的抗體可變區，以及保留至少全長區之結合活性和特異性的可變區摺疊片段。單一可變區能與抗原或表位結合，與不同可變區無關，或區可指一「區域抗體」或「dAb(TM)」。單一可變區可為人類單一可變區，但亦包括來自其他物種的單一可變區，例如嚙齒類、鬚鯊(nurse shark)和駱駝科VHH dAbTM。駱駝科VHH為免疫球蛋白單一可變區多肽，其係衍生自包括駱駝、大羊駝、羊駝、單峰駱駝和駱馬之物種，其係產生天生無輕鏈之重鏈抗體。此等VHH區可根據本項技術中可取得的標準技術人源化，且此等區係視為「單一可變區」。如文中所用VH係包括駱駝科VHH區。
替代的抗體模式為該等其中TrkB結合激動劑之CDR係安排在適合的非免疫球蛋白蛋白支架或骨幹上。非免疫球蛋白支架可衍生自下列組成之群：CTLA-4、脂質運載蛋白(lipocalin)、蛋白A衍生的分子例如蛋白A之Z-區(Affibody,SpA)、A-區(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白例如GroEl和GroES；運鐵蛋白(transferrin)(trans-body)；錨定蛋白(ankyrin)重復蛋白(DARPin)；胜肽適體；C-型凝集素區(Tetranectin)；人類γ-晶體蛋白和人類泛素(affilins)；PDZ區；LDL受體A類區；EGF區；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素kunitz型區；及纖維結合素(fibronectin)/adnectin。
1G11 TrkB結合激動劑的HC和LC區係分別以SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28表示。人源化1G11 TrkB結合激動劑之VH和VL區係分別以SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41表示。
「CDR」係定義為抗原結合蛋白之互補決定區胺基酸序列。這些為免疫球蛋白重鏈和輕鏈之高變區。在免疫球蛋白之可變部分有三種重鏈和三種輕鏈CDR(或CDR區)。
就SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO 4之CDR區可藉由任何編號慣例來定義，例如Kabat、Chothia、AbM和Contact慣例。藉由各種方法所定義的SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO 41之CDR區係列於表1中。請注意，除了以Contact法所定義之CDRH2之外，小鼠1G11和人源化1G11的CDR序列為相同的。在整個說明書中，胺基酸殘基係根據Kabat編號慣例來編號。
1G11 TrkB結合激動劑互補位和推測的人源化1G11 TrkB結合激動劑互補位中的主要結合殘基係在CDR L1(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：RASQ RIS NN LH/SEQ ID NO：3)，L3(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：QQSNSWPLT/SEQ ID NO：5)及H3(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基： R G YE GALDY/SEQ ID NO：8)內。在CDRH2中僅有二個殘基與表位相距4.5Å以內，及僅有一個直接相互作用(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基： R IAPGNTYYNEIFKG/SEQ ID NO：7)。在CDRH1中僅有一個殘基接近或(間接)接觸表位(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：SYYIN/SEQ ID NO：6)及在CDRL2中有單一殘基接近表位(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：YVSQSIS/SEQ ID NO：4)。因此，從排列順序的觀點而言，CDR L1、L3和H3對結合最為重要，接著CDRH2，然後是CDRL2和CDRH1。
在一實施例中，TrkB結合激動劑係包括：(a)如SEQ ID NO：28或其 變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(c)如SEQ ID NO：27或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在一實施例中，CDRL1係如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：66之變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRL1係如SEQ ID NO：3或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRL1內的修飾不在殘基R28、S30和N32(編號來自SEQ ID NO：28)中。在特定的實施例中，除了未經修飾的R28、S30和N32之外，CDRL1內的修飾不在殘基I29及/或殘基N31(編號來自SEQ ID NO：28)中。在一實施例中，CDRL1係如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：66中所示。在一實施例中，CDRL1係如SEQ ID NO：3中所示。
在一實施例中，CDRL3係如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：68之變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRL3係如SEQ ID NO：5或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRL3內的修飾不在殘基N92和S93(編號來自SEQ ID NO：28)中。在特定的實施例中，除了未經修飾的N92和S93之外，CDRL3內的修飾不在殘基S91和W94(編號來自SEQ ID NO：28)中。在一實施例中，CDRL3係如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：68中所示。在一實施例中，CDRL3係如SEQ ID NO：5中所示。
在一實施例中，CDRH3係如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：65，或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：65之變體中所示，該變體係具有1、2或 3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRH3係如SEQ ID NO：8或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRH3內的修飾不在殘基R97、Y99和E100(編號來自SEQ ID NO：27)中。在一實施例中，CDRH3係如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：65中所示。在一實施例中，CDRH3係如SEQ ID NO：8中所示。
在一實施例中，除了包括如上所定義的CDRL1、CDRL3和CDRH3之外，TrkB結合激動劑另外係包括如SEQ ID NO：27或其變體，或SEQ ID NO：40或其變體中所示之CDRH2，其中變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRH2係如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64，或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64之變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRH3係如SEQ ID NO：7或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRH2內的修飾不在殘基R50及/或殘基Y57(編號來自EQ ID NO：27)中。在一實施例中，CDRH2係如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64中所示。在一實施例中，CDRH2係如SEQ ID NO：7所示。
TrkB結合激動劑可包括CDRL1(SEQ ID NO：3)、CDRL3(SEQ ID NO：5)和CDRH3(SEQ ID NO：8)。TrkB結合激動劑可包括CDRL1(SEQ ID NO：3)、CDRL3(SEQ ID NO：5)、CDRH2(SEQ ID NO：7)和CDRH3(SEQ ID NO：8)。
在一實施例中，除了包括如上所定義的CDRL1、CDRL3、CDRH3和CDRH2之外，TrkB結合激動劑另外係包括如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL2，及如SEQ ID NO：27或其變體中所示之CDRH1， 其中變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在一實施例中，CDRL2係如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：67之變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRL2係如SEQ ID NO：4或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRL2內的修飾不在殘基Y50(編號來自SEQ ID NO：28)中。在一實施例中，CDRL2係如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：67中所示。在一實施例中，CDRL2係如SEQ ID NO：4中所示。
在一實施例中，CDRH1係如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在另一實施例中，CDRH1係如SEQ ID NO：6或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。在一實施例中，CDRH1內的修飾不在殘基Y33(編號來自SEQ ID NO：27)中。在特定的實施例中，除了未經修飾的Y33之外，CDRH1內的修飾不在殘基S31(編號來自SEQ ID NO：27)中。在一實施例中，CDRH1係如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62中所示。在一實施例中，CDRH1係如SEQ ID NO：6中所示。
TrkB結合激動劑可包括SEQ ID NO：6之CDRH1；SEQ ID NO：7之CDRH2；SEQ ID NO：8之CDRH3；SEQ ID NO：3之CDRL1；SEQ ID NO：4之CDRL2；及SEQ ID NO：5之CDRL3。
在前述的實施例中，特定的CDR可為帶有至高3個胺基酸修飾之變體序列。各修飾可獨立地為一取代、添加或刪除。例如，變體序列可具有一個添加、一個刪除和一個取代。在一實施例中，各變體序列可具有1個 胺基酸修飾。在另外的實施例中，各變體序列可具有至高2個胺基酸修飾。在一實施例中，此修飾為取代，特別是保守性取代，例如，如表2中所示。
CDR L1、L2、L3、H1和H2趨向結構上展現主鏈構形的有限數之一。CDR之特別的典型結構類別係以CDR的長度和環包覆二者來定義，藉由位在CDR和框架區中關鍵位置的殘基來測定(結構上決定的殘基或CDR)。使用集群分析來定義此CDR組之典型類別，及然後藉由分析埋藏的疏水性、氫鍵殘基和保守的甘胺酸和脯胺酸分析辨識典型範本。抗體序列的CDR可藉由將該等序列與關鍵殘基範本作比較並使用相同性或類似性矩陣評分來分派典型類別。
每個CDR、每個可變區或每條重鏈或輕鏈可能有多個變體CDR典型位置，因此在TrkB結合激動劑中可存有任何的取代組合，其限制條件為需維持此CDR的典型結構使得此激動劑能與TrkB結合。
TrkB結合激動劑CDR變體可包括：(a)一CDRH1之變體，其具有任一或下列組合：經I、H、F、T、N、C、E或D取代之Y32；經V、M或W取代之I34；及經H、E、Q、S、Y或T取代之N35；及/或(b)一CDRH2之變體，其具有經L、V、T、S或N取代之I51；及/或(c)一CDRH3之變體，其具有經H、V、I、S、D或G取代之Y102；及/ 或(d)一CDRL1之變體，其具有任一或下列組合：經M、V、I或F取代之L33；及經A、G、N、S、V或F取代之H34；及/或(e)一CDRL2之變體，其具有經A、T或G取代之V51；及/或(f)一CDRL3之變體，其具有任一或下列組合：經S、G、F或L取代之Q89；經H或N取代之Q90；經P、Y、R、I、W或F取代之L96。
TrkB結合激動劑可包括：一人源化VH區，或一人源化重鏈(HC)序列；及/或一人源化VL區，或一人源化輕鏈(LC)序列。
TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：40或其變體中所述之VH區，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及/或如SEQ ID NO：41或其變體中所述之VL區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：40或其變體中所述之VH區，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及如SEQ ID NO：41或其變體中所述之LH區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體VH區係具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體VL區係具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。
TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：42或其變體中所述之HC，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及/或如SEQ ID NO：43或其變體中所述之LC，該變體具有至高10個胺基酸修飾。TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：42或其變體中所述之HC，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及如SEQ ID NO：43或其變體中所述之LC，該變體具有至高10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體HC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體LC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。
VH、VL、HC和LC之修飾可獨立地為取代、添加或刪除，使得任何特定的變體序列可含有取代、添加或刪除。典型地，此變異為取代，特別是保守性取代，例如，如上表2中所示。
在特定的實施例中，VH、VL、HC和LC之修飾可排除CDR，使得CDR為完整的而變異係在VH、VL、HC或LC序列的其餘部份。變體序列實質上保留未經修飾的TrkB結合激動劑之生物特性。
TrkB結合激動劑可包括一VH區，該VH區係包括與SEQ ID NO：40至少80%相同之序列，及/或一VL區，該VL區係包括與SEQ ID NO：41至少76%相同之序列。在一實施例中，此VH區係包括與SEQ ID NO：40序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。在一實施例中，此VL區係包括與SEQ ID NO：41序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。
TrkB結合激動劑可包括VH區，其中位置47為Cys或Ser。TrkB結合激動劑可包括VH區，其中位置47為Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
查詢的胺基酸序列與主體胺基酸序列間的「相同性百分比」為以百分比表示之「相同性」數值，其為在進行逐對的BLASTP比對後，當主體胺基酸序列與查詢胺基酸序列具有100%的覆蓋度時，以BLASTP演算法所計算。此查詢胺基酸序列和主體胺基酸序列間的逐對BLASTP比對係藉由使用在國家生物科技資訊中心網站可取得的BLASTP演算法之內建設定關閉低重複區域過濾器來進行。
查詢序列與主體序列可為100%相同，或當與主體序列比較時其可包 括至高特定整數的胺基酸或核酸改變，使得相同性%係如上所述低於100%。此等改變包括至少一個胺基酸刪除、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入，且其中該等該變可發生在查詢序列的胺基-或羧基-端位置或介於這些端點位置之間的任何地方，個別地散置在查詢序列之胺基酸或核酸之間，或在查詢序列內的一或多個連續基團中。
相同性%可測定整個全長的查詢序列，包括CDR。另一種選擇，相同性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%相同而相同性%的變異係在查詢序列的其餘部份(亦即SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41)，使得CDR序列為固定/完整的。另一種選擇，CDR序列係如任何前述實施例中所述且相同性%變異係於查詢序列的其餘部份所計算。此變體序列實質上保留未經修飾的TrkB結合激動劑之生物特性。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)一SEQ ID NO：40之VH區；及/或(b)一SEQ ID NO：41之VL區。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)一SEQ ID NO：40之VH區；及(b)一SEQ ID NO：41之VL區。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)與SEQ ID NO：42至少90%相同的重鏈(HC)序列；及/或(b)與SEQ ID NO：43至少85%相同的輕鏈(LC)序列。在一實施例中，此HC係包括與SEQ ID NO：42序列有至少至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。在一實施例中，此LC係包括與SEQ ID NO：42序列有至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。
TrkB結合激動劑可包括HC區，其中位置47為Cys或Ser。TrkB結合激動劑可包括HC區，其中位置47為Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr 或Asn。
「相同性百分比」係如上述所計算。再次，相同性%可測定整個全長的查詢序列，包括CDR。另一種選擇，相同性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%相同而相同性%的變異係在查詢序列的其餘部份(亦即SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41)，使得CDR序列為固定/完整的。另一種選擇，CDR序列係如任何前述實施例中所述且相同性%變異係於查詢序列的其餘部份所計算。此變體序列實質上保留未經修飾的TrkB結合激動劑之生物特性。
本發明亦提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)SEQ ID NO：42之重鏈(HC)序列；及/或(b)SEQ ID NO：43之輕鏈(LC)序列。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其包括：(a)SEQ ID NO：42之重鏈(HC)序列；及(b)SEQ ID NO：43之輕鏈(LC)序列。
3A3 TrkB結合激動劑之HC和LC區分別係如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30中所述。人源化3A3 TrkB結合激動劑之VH和VL區分別係如SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47中所述。
TrkB結合激動劑可包括任一或選自下列之CDR組合：來自SEQ ID NO：29之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或來自SEQ ID NO：30之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或3個胺基酸修飾。例如，TrkB結合激動劑可包括1、2、3、4、5或6個CDR，其係選自SEQ ID NO：29之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或選自SEQ ID NO：30之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或3個胺基酸修飾。在特定的實施例中，特定的CDR係如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中所示，而其他的CDR為該等如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中所示之變體。在一實施例 中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其係包括多個下列CDR之一：(a)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(c)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(d)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(e)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(f)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在一實施例中，TrkB結合激動劑係包括選自下列之群中至少二個CDR，至少三個CDR，至少四個CDR或至少五個CDR或全部六個CDR：(a)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(c)如SEQ ID NO：30或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(d)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(e)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH2，該變體係具有1、2或 3個胺基酸修飾；及(f)如SEQ ID NO：29或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在有關3A3之實施例中，特定的CDR可為帶有至高3個胺基酸修飾之變體序列。各修飾可獨立地為一取代、添加或刪除。例如，變體序列可具有一個添加、一個刪除和一個取代。在一實施例中，各變體CDR可具有1個胺基酸修飾。在另外的實施例中，各變體序列可具有至高2個胺基酸修飾。在一實施例中，此修飾為取代，特別是保守性取代，例如，如上表2中所示。
TrkB結合激動劑可包括任一或下列CDR之組合：SEQ ID NO：12之CDRH1；SEQ ID NO：13之CDRH2；SEQ ID NO：14之CDRH3；SEQ ID NO：9之CDRL1；SEQ ID NO：10之CDRL2；及/或SEQ ID NO：11之CDRL3。例如，TrkB結合激動劑可包括1、2、3、4、5或6個CDR，其係選自SEQ ID NO：12之CDRH1；SEQ ID NO：13之CDRH2；SEQ ID NO：14之CDRH3；SEQ ID NO：9之CDRL1；SEQ ID NO：10之CDRL2；及/或SEQ ID NO：11之CDRL3。TrkB結合激動劑可包括SEQ ID NO：12之CDRH1；SEQ ID NO：13之CDRH2；SEQ ID NO：14之CDRH3；SEQ ID NO：9之CDRL1；SEQ ID NO：10之CDRL2；及SEQ ID NO：11之CDRL3。
TrkB結合激動劑可包括：一人源化VH區，或一人源化重鏈(HC)序列；及/或一人源化VL區，或一人源化輕鏈(LC)序列。
TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：40或其變體中所述之VH區，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及/或如SEQ ID NO：41或其變體中所述之VL區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。TrkB結合激動劑可 包括：如SEQ ID NO：40或其變體中所述之VH區，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及如SEQ ID NO：41或其變體中所述之VL區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體VH區具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體VL區具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。
TrkB結合激動劑可包括：如SEQ ID NO：42或其變體中所述之HC，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及/或如SEQ ID NO：43或其變體中所述之LC區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。TrkB結合激動劑可包括：：如SEQ ID NO：42或其變體中所述之HC，該變體具有至高10個胺基酸修飾；及如SEQ ID NO：43或其變體中所述之LC區，該變體具有至高10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體HC係具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。在一實施例中，該變體LC係具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。
VH、VL、HC和LC之修飾可獨立地為取代、添加或刪除，使得任何特定的變體序列可含有取代、添加或刪除。典型地，此變異為取代，特別是保守性取代，例如，如上表2中所示。
TrkB結合激動劑可包括一VH區，該VH區係包括與SEQ ID NO：46至少80%相同之序列，及/或一VL區，該VL區係包括與SEQ ID NO：47至少80%相同之序列。在一實施例中，此VH區係包括與SEQ ID NO：46序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。在一實施例中，此VLH區係包括與SEQ ID NO：47序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：46之VH區；及/ 或一SEQ ID NO：47之VL區。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：46之VH區；及一SEQ ID NO：47之VL區。
TrkB結合激動劑可包括：與SEQ ID NO：48至少80%相同之重鏈(HC)序列；及/或與SEQ ID NO：49至少80%相同之輕鏈(LC)序列。在一實施例中，此HC係包括與SEQ ID NO：48序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。在一實施例中，此LC係包括與SEQ ID NO：49序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：48之重鏈(HC)序列；及/或一SEQ ID NO：49之輕鏈(LC)序列。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：48之重鏈(HC)序列；及一SEQ ID NO：49之輕鏈(LC)序列。
在有關3A3之實施例中，「相同性百分比」係如上述所計算。再次，相同性%可測定整個全長的查詢序列，包括CDR。另一種選擇，相同性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%相同而相同性%的變異係在查詢序列的其餘部份(亦即SEQ ID NO：46、47、48或49)，使得CDR序列為固定/完整的。另一種選擇，CDR序列係如任何前述有關3A3之實施例中所述且相同性%變異係於查詢序列的其餘部份所計算。此變體序列實質上保留未經修飾的TrkB結合激動劑之生物特性。
8E5 TrkB結合激動劑之HC和LC區分別係如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中所述。
TrkB結合激動劑可包括任一或選自下列之CDR組合：來自SEQ ID NO：31之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或來自SEQ ID NO：32之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或 3個胺基酸修飾。例如，TrkB結合激動劑可包括1、2、3、4、5或6個CDR，其係選自SEQ ID NO：31之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或選自SEQ ID NO：32之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或3個胺基酸修飾。在特定的實施例中，特定的CDR係如SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中所示，而其他的CDR為該等如SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中所示之變體。在一實施例中，本發明係提供一TrkB結合激動劑，其係包括多個下列CDR之一：(a)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(c)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(d)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(e)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(f)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在一實施例中，TrkB結合激動劑係包括至少二個CDR，至少三個CDR，至少四個CDR或至少五個CDR或全部六個CDR，其係選自下列之群：(a)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL2，該變體係具有1、2或 3個胺基酸修飾；(c)如SEQ ID NO：32或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(d)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(e)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(f)如SEQ ID NO：31或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
在有關8E5之實施例中，特定的CDR可為帶有至高3個胺基酸修飾之變體序列。各修飾可獨立地為一取代、添加或刪除。例如，變體序列可具有一個添加、一個刪除和一個取代。在一實施例中，各變體CDR可具有1個胺基酸修飾。在另外的實施例中，各變體序列可具有至高2個胺基酸修飾。在一實施例中，此修飾為取代，特別是保守性取代，例如，如上表2中所示。
TrkB結合激動劑可包括任一或下列CDR之組合：SEQ ID NO：18之CDRH1；SEQ ID NO：19之CDRH2；SEQ ID NO：20之CDRH3；SEQ ID NO：15之CDRL1；SEQ ID NO：16之CDRL2；及/或SEQ ID NO：17之CDRL3。例如，TrkB結合激動劑可包括1、2、3、4、5或6個CDR，其係選自SEQ ID NO：18之CDRH1；SEQ ID NO：19之CDRH2；SEQ ID NO：20之CDRH3；SEQ ID NO：15之CDRL1；SEQ ID NO：16之CDRL2；及/或SEQ ID NO：17之CDRL3。TrkB結合激動劑可包括SEQ ID NO：18之CDRH1；SEQ ID NO：19之CDRH2；SEQ ID NO：20之CDRH3；SEQ ID NO：15之CDRL1；SEQ ID NO：16之CDRL2；及SEQ ID NO： 17之CDRL3。
TrkB結合激動劑可包括：一人源化VH區，或一人源化重鏈(HC)序列；及/或一人源化VL區，或一人源化輕鏈(LC)序列。
TrkB結合激動劑可包括：與SEQ ID NO：31至少80%相同之重鏈(HC)序列；及/或與SEQ ID NO：32至少80%相同之輕鏈(LC)序列。在一實施例中，此HC係包括與SEQ ID NO：48序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。在一實施例中，此LC係包括與SEQ ID NO：49序列有至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同之序列。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：31之重鏈(HC)序列；及/或一SEQ ID NO：32之輕鏈(LC)序列。TrkB結合激動劑可包括一SEQ ID NO：31之重鏈(HC)序列；及一SEQ ID NO：31之輕鏈(LC)序列。
在有關8E5之實施例中，「相同性百分比」係如上述所計算。再次，相同性%可測定整個全長的查詢序列，包括CDR。另一種選擇，相同性%可排除CDR，例如CDR與主體序列為100%相同而相同性%的變異係在查詢序列的其餘部份(亦即SEQ ID NO：31和32)，使得CDR序列為固定/完整的。另一種選擇，CDR序列係如任何前述有關8E5之實施例中所述且相同性%變異係於查詢序列的其餘部份所計算。此變體序列實質上保留未經修飾的TrkB結合激動劑之生物特性。
TrkB結合激動劑可藉由任何許多習用技術來製造。TrkB結合激動劑可從天然表現彼等之細胞純化(例如可從產生該抗體之雜交瘤將其純化)，或於重組表現系統中製造。一般而言，係以編碼此所欲TrkB結合激動劑之重組表現載體轉化宿主細胞。
一或多個編碼此TrkB結合激動劑之核酸序列亦為所欲的。就有關1G11的實施例，單一核酸序列可包括編碼重鏈之SEQ ID NO：44；及/或編碼輕鏈之SEQ ID NO：45，或SEQ ID NO：44。另一種選擇，本發明係提供包括編碼重鏈之SEQ ID NO：44的核酸；及/或包括編碼輕鏈之SEQ ID NO：45的分開核酸。在一實施例中，單一核酸序列可包括編碼重鏈之SEQ ID NO：50；及/或編碼輕鏈之SEQ ID NO：51。在一替代的實施例中，本發明係提供包括編碼重鏈之SEQ ID NO：50的核酸；及/或包括編碼輕鏈之SEQ ID NO：51的分開核酸。
包括編碼TrkB結合激動劑之核酸序列的表現載體亦為所欲的。包括此核酸序列之重組的宿主細胞或表現載體亦為所欲的。宿主細胞可為一分離的宿主細胞。此宿主細胞通常並非多細胞生物體(例如植物或動物)之部份。此宿主細胞可為非人類宿主細胞。可應用廣泛範圍的宿主細胞，包括原核細胞(包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、桿菌屬(Bacilli sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.))，真核細胞包括酵母菌(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris))，真菌(例如麴菌屬(Aspergilus sp.))，或較高等真核細胞包括昆蟲細胞和哺乳動物來源的細胞株(例如CHO、Perc6、HEK293、HeLa、NS0)。適合的宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如CHO(例如CHOK1和CHO-DG44)。適合用於細菌、真菌、酵母菌和哺乳動物細胞宿主之選殖和表現載體以及選殖的方法已為本項技術所知。
用於製造此TrkB結合激動劑的方法已有描述，該方法係包括於適合表現核酸序列或載體的條件下培養宿主細胞。在一實施例中，TrkB結合激動劑係經純化(例如藉由習用的蛋白純化製程)。就由此法所製造的TrkB 結合激動劑亦為所欲的。本發明因此係提供一群實質上無汙染物質，實質上同源的TrkB結合激動劑。
在表現和產生TrkB結合激動劑後，可發生後轉譯修飾。此項可包括裂解特定的前導序列、以各種糖基化模式添加各種糖基團、去醯胺化(例如天門冬醯胺酸或麩醯胺酸殘基)、氧化(例如在甲硫胺酸、色胺酸或遊離半胱胺酸殘基)、雙硫鍵重組、異構物化(例如在天門冬胺酸殘基)、C-端離胺酸剪切(例如來自一或二條重鏈)及N-端麩醯胺酸環化(例如在重鏈及/或輕鏈)。TrkB激動劑可進行或經歷過一或多個後轉譯修飾。此修飾可發生在CDR、可變框架區或恆定區中。此修飾可能造成分子之電荷改變。
去醯胺化為一種主要將天門冬醯胺酸(N)轉化為約3：1比率之異天門冬胺酸和天門冬胺酸(D)的酵素性反應。此去醯胺化反應因此係與天門冬胺酸異構化(D)為異天門冬胺酸有關。天門冬醯胺酸之去醯胺化和天門冬胺酸之異構化二者係涉及中間物琥珀醯亞胺。在較小程度上，去醯胺化可能以類似的方式發生在麩醯胺酸殘基。去醯胺化可發生在CDR、Fab(非-CDR區)或Fc區中。
氧化可發生於製造和儲存期間(亦即在氧化條件的存在下)並產生蛋白之共價修飾，其係直接由活性氧類或間接由二級副產物的氧化壓力之反應所引發。氧化作用主要係發生在甲硫胺酸中，但可能發生在色胺酸和游離的半胱胺酸殘基上。氧化可發生在CDR、Fab(非-CDR區)或Fc區中。
雙硫鍵重組可能發生在製造和鹼性儲存狀況期間。在特定的環境下，雙硫鍵可打斷或錯誤形成，產生不成對的半胱胺酸殘基(-SH)。這些游離(不成對的)硫氫基(-SH)可能增進位移。
重鏈及/或輕鏈中的N-端麩醯胺酸(Q)和麩胺酸(E)可能經由環化形成焦麩胺酸(pGlu)。大部份的pGlu形成係發生在製造生物反應器中，但依照 pH和處理溫度及儲存條件，其可能非酵素性形成。N-端Q或E之環化通常係在天然的人類抗體中觀察到。
C-端離胺酸剪切為一由羧肽酶所催化的酵素性反應，且通常係在重組的和天然的人類抗體中觀察到。此方法的變異包括因來自重組宿主細胞的細胞酵素，從一或二條重鏈移除離胺酸。將TrkB結合激動劑投予人類患者/病患可能造成人類抗體內的任何剩餘C-端離胺酸移除。
在本發明中，上述標準胺基酸序列之後轉譯修飾和改變，典型地不會造成抗原親合力、生物活性、PK/PD、聚集作用、致免疫性或與Fc受體結合之顯著變化。
TrkB結合激動劑可併入醫藥組成物中供用於治療人類疾病。在一實施例中，此醫藥組成物係包括TrkB結合激動劑視需要與一或多種醫藥上可接受載劑及/或賦形劑及/或稀釋劑組合。一醫藥組成物之實例可包括一緩衝劑、鹽、胺基酸、多醇、糖、介面活性劑、清潔劑、抗氧化劑及/或螯合劑或其組合。
醫藥組成物可以批式或間歇式(例如藉由注射或使用持續釋放調配物)或藉由連續輸注來給藥。給藥路徑包括(但不限於)靜脈內、硬膜內、腹膜內、皮內、皮下、局部、經鼓室、耳蝸內、眼內、玻璃體內、肌肉內和門靜脈內。醫藥組成物可為適合局部給藥(其包括，但不限於上皮、吸入、鼻內或眼部給藥)或腸內給藥(其包括，但不限於口服或直腸給藥)。例如，此組成物係適合靜脈內或硬膜內給藥。在另外的實施例中，此組成物係適合玻璃體內給藥。
醫藥組成物可包括介於1mg至10g的TrkB結合激動劑，例如介於5mg至1g之抗原結合蛋白。另一種選擇，此組成物可包括介於5mg至500mg，例如介於5mg至50mg。
用於投予TrkB結合激動劑之有效劑量和治療療法可依照例如病患的年齡、體重和健康狀況及所欲治療的疾病等因子而定。醫藥調配物可為立即釋放調配物和持續釋放調配物。持續釋放調配物對於經鼓室和耳蝸內遞送為特別希望的。
醫藥組成物可包括TrkB結合激動劑部份與其他醫藥品，視需要與使用說明一起之套組。就方便性，此套組可包括預定量之試劑和使用說明。
術語「個體」、「患者」和「病患」在文中可交換使用。在一實施例中，此患者為一哺乳動物，例如靈長類，例如獼猴、狨猿或猴子。在另外的實施例中，此患者為人類。
TrkB結合激動劑亦可用於治療中，例如用於治療或預防之方法中。治療係涵蓋減輕或降低或治癒至少一種病症之態樣或癥狀或生物表徵。
例如，治療係包括：(1)改善病症之一或多個生物表徵(2)干擾(a)導致或造成此病症之一或多個生物聯集點或(b)此病症之一或多個生物表徵，(3)減輕與此病症有關的一或多個癥候或效應，(4)減緩病症的進程或此病症的一或多個生物表徵，及/或(5)減少病症嚴重度或病症之生物表徵的可能性。
防止包括預防性投予藥物以減少發作的可能性或延遲病症或其生物表徵之發生，例如藉由干擾導致或造成此病症之一或多個生物聯集點。
TrkB結合激動劑係以有效量用於所述的方法中。TrkB結合激動劑之治療上有效量為有效改善或降低一或多個病症之癥狀或預防或治癒此病症。
TrkB激動劑可用於中樞性在CNS及周圍性在PNS中促進：細胞存活，及/或神經元修復，及/或神經元可塑性。
TrkB激動劑可用於治療或預防神經病症或其他，其中藉由活化TrkB 來恢復或促進BDNF-TrkB路徑為有利的病症。考量到BDNF-TrkB路徑之作用機制及TrkB係廣泛表現於CNS和PNS中，TrkB結合激動劑可提供患有神經病症、神經退化病症、發展病症和其他病症之患者治療。這些為其中TrkB致效作用預期為有利的病症。
例如，TrkB結合激動劑可在神經肌肉接合點(NMJ)激動TrkB細胞訊號傳遞並增進NMJ發育、穩定和維護。TrkB結合激動劑可在骨骼肌激動TrkB細胞訊號傳遞並調節骨骼肌祖細胞之增生和分化。此項，例如在肌肉受傷和退化後，可能為有利的。TrkB結合激動劑可在施旺氏細胞(Schwann cell)中激動TrkB細胞訊號傳遞並促進軸突再生和生長。此項，例如在神經受傷和退化後，可能為有利的。
病症係包括疾病、症狀、症候群、癥狀和徵象。神經病症包括神經疾病、症狀、症候群、癥狀和徵象。神經病症可包括其中破壞中樞和周圍神經系統之組份的結構或功能之病症，該中樞和周圍神經系統係包括腦、脊椎、腦神經、周圍神經、神經根、自主神經系統、神經肌肉接合點及/或肌肉。神經病症可能為表型上異質性，且常具有未知的病因。數種機制和路徑已牽涉神經病症，例如神經疾病。在這些疾病中，特定的癥狀和結構/功能關係已得以瞭解潛藏的病因。
此病症亦可為其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的病症。例如，涉及表現TrkB細胞之退化或功能不良的病症。
TrkB結合激動劑可用於治療或預防文中所述病症之方法中。更特言之，TrkB結合激動劑可用於治療文中所述病症之方法中。此等病症包括神經退化疾病、視神經病變和視網膜退化症狀、聽力喪失病症、精神病學病症、神經發展病症、體重調節之病症、肌肉病症和其他CNS病症。
神經退化疾病包括：肌萎縮性側索硬化症(ALS)、亨丁頓舞蹈症(HD)、 阿茲海默症(AD)、運動神經元疾病(包括進行性肌肉萎縮)、帕金森氏症、朊毒體疾病包括庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)、路易體疾病、脊肌萎縮、多系統萎縮、失智症(包括額顳葉失智症)及Tau蛋白病變(tauopathy)。更特定的神經退化病症包括ALS、亨丁頓舞蹈症和運動神經元疾病。
在一實例中，ALS的治療係包括提升運動神經元存活和功能。TrkB結合激動劑可能具有神經保護及/或神經修復效應。
在一實例中，有關失智症或阿茲海默症的治療係指：減緩認知功能減退的惡化。TrkB結合激動劑可能提升細胞存活，促進神經突生長及/或調節突觸可塑性。TrkB結合激動劑可預防或延遲阿茲海默症和其他失智症中之神經元功能不良。
在一實例中，有關亨丁頓舞蹈症的治療係指減緩疾病惡化，包括但不限於減緩認知功能減退的惡化。TrkB結合激動劑可能提升細胞存活，促進神經突生長及/或調節突觸可塑性。TrkB結合激動劑可預防或延遲亨丁頓舞蹈症中之神經元功能不良。
視神經病變包括，例如衝擊視網膜神經節細胞(RGC)及/或視神經之症狀。特定的視神經病變包括：青光眼(例如隅角開放性青光眼、廣角性青光眼、隅角閉鎖型青光眼(急性和慢性)、正常眼壓性青光眼)、前部視神經缺血性病變(AION)(例如非動脈型缺血性視神經病變(NAION))、後部缺血性視神經病變、放射性視神經病變、壓迫性視神經病變(例如乳突水腫)、浸潤性視神經病變、創傷性視神經病變、粒線體視神經病變、毒性視神經病變、遺傳性視神經病變(例如顯性遺傳視神經萎縮(ADOA；Kjer型視神經萎縮)、雷伯氏遺傳性視神經病變、Rosenberg Chutorian症候群、Wolfram症候群、視神經發育不良)、視神經炎(例如，視神經脊髓炎)。視網膜退化 病症可包括遺傳性視網膜失養症(例如視網膜色素病變)或後天的症狀，包括老年性黃斑部退化(濕性和乾性)。在一實施例中，視神經病變包括，例如衝擊視網膜神經節細胞(RGC)及/或視神經之症狀。特定的視神經病變包括：青光眼(例如隅角開放性青光眼、廣角性青光眼、原發性隅角閉鎖型青光眼、正常眼壓性青光眼)、前部視神經缺血性病變(AION)、非動脈型缺血性視神經病變(NAION))、創傷性視神經病變和雷伯氏遺傳性視神經病變。視網膜退化病症可包括遺傳或後天的症狀，包括老年性黃斑部退化(濕性和乾性)。
聽力喪失病症包括感覺神經性聽力喪失(SNHL)(雙側、單側和非特定)和混合性聽力喪失(其中有感覺神經性和傳導性喪失元素；雙側、單側和非特定)。感覺神經性聽力喪失包括感官性(耳蝸相關的)或神經性(第8神經有關的)聽力喪失。感覺神經性聽力喪失可由傳感器病灶所致。與感覺神經性聽力喪失有關的傳感器病灶包括：聽覺傷害(由於噪音大於例如85分貝(db))、病毒性內淋巴迷路炎、梅尼爾氏症、第8神經之小腦橋腦角腫瘤、第8神經節之細菌或病毒感染(例如，耳帶狀皰疹感染)、由急性中耳炎所引起的化膿性迷路炎、化膿性腦膜炎、慢性中耳炎、病毒性起源的突發性耳聾，例如由病毒所造成的內淋巴迷路炎，包括流行性腮腺炎、麻疹、流感、水痘、單核細胞增多症和腺病毒)及短暫性局部缺血性耳聾、顳骨骨折延伸到中耳並使鼓膜及可能聽骨鏈破裂、影響耳蝸的骨折，及聽神經瘤，其一般為許旺氏細胞起源的腫瘤係由第8神經的聽覺或前庭區所引起。傳感器病灶聽力喪失可能為先天的，例如由德國麻疹、出生時缺氧、因生產期間的創傷血液流入內耳、投予母體耳毒性藥物、胎兒紅血球母細胞增多症和遺傳性症狀所造成，包括瓦登伯革氏症候群(Waardenburg's syndrome)和賀勒氏症候群(Hurler's syndrome)。感覺神經性聽力喪失另外 可能為老年性，例如老年重聽(包括老年耳聾)，其為一種發生於正常老化部份之感覺神經性聽力喪失。感覺神經性聽力喪失可為耳毒性聽力喪失(由耳毒性藥物所造成的聽力喪失(例如，特定的抗生素、特定的化療劑、特定的水楊酸鹽化合物-特別是阿斯匹靈-特定的利尿劑-常見的環利尿劑-及特定的奎寧)其影響內耳的聽覺部份，特別是柯蒂氏器(organ of Corti))。亦包括突發性感覺神經性聽力喪失、隱藏性聽力喪失(被認為是由內耳中突觸和聽覺喪失所造成)及耳鳴(可能是由柯蒂氏器損傷所致)。
精神病症包括：焦慮、情感病症、憂鬱症(包括重度憂鬱症)、恐慌症、創傷後壓力症病症(PTSD)、注意力缺乏過動症(ADHD)、躁鬱症和精神分裂症。
神經發展病症包括：安格曼症候群(Angelman syndrome)、普拉德-威利症候(Prader-Willi syndrome)、自閉症和雷特氏症候群(Rett syndrome)。
能量平衡係依賴控制攝食行為的二條中央迴路調節：中樞神經系統(CNS)必須協調及整合食慾、覓食行為和體溫調節；及與飽足有關的訊號(例如來自腸子)且整體能量平衡必須在外圍傳導並回饋給CNS。因此體重調節的病症包括：神經性厭食症、惡病質、不欲的體重減輕(包括與癌症治療有關或由其所造成的不欲體重減輕)、肌少症、肥胖症和類鴉片引起的嘔吐。
肌肉病症包括肌少症。
其他的CNS病症包括：糖尿病神經病變、癲癇、多發性硬化症、偏頭痛、神經損傷(包括創傷性腦損傷(TBI)、脊椎損傷和周圍神經損傷)、周圍神經病變、神經肌肉疾病(包括重肌無力症和肌無力症候群)、睡眠障礙及中風。在一實例中，周圍神經病變包括化療引起的周圍神經病變(CIPN)。CIPN為一種許多抗癌藥之主要的劑量限制性副作用。
TrkB結合激動劑可用作神經病症和其他病症之治療，其將顯著減緩/停止/延遲病症之惡化，增進每日生活功能和增加患者的壽命。
在一實施例中，TrkB結合激動劑係用於治療任一下列病症：肌萎縮性側索硬化症(ALS)、亨丁頓舞蹈症(HD)、中風、脊椎損傷、阿茲海默症(AD)、運動神經元疾病、創傷性腦損傷、失智症、Tau蛋白病變、周圍神經病變、神經損傷、周圍神經損傷、帕金森氏症、朊毒體疾病包括庫賈氏病(CJD)、精神病症、精神分裂症、多發性硬化症、雷特氏症候群、路易體疾病、多系統萎縮、重肌無力症、糖尿病神經病變、視網膜退化、青光眼、聽力喪失、體重調節、神經性厭食症、惡質病、神經肌肉疾病、情感和憂鬱病症、創傷後壓力病症、注意力缺乏過動症(ADHD)、躁鬱症、焦慮、自閉症、恐慌症、涉及體重調節的病症、神經性厭食症、惡質病、不欲的體重減輕和類鴉片引起的嘔吐。
當用於治療和預防上述病症時，TrkB結合激動劑可與一或多種活性劑，例如核准可用於治療和預防特定疾病之活性劑，及認為形成現行標準照護之特定藥劑共同給藥。當設想組合治療時，活性劑可用一或多種醫藥組成物同時、分開或先後給藥。
在其中本發明TrkB結合激動劑係用於治療阿茲海默症的實施例中，其可與膽鹼酶抑制劑及/或美金剛(memantine)組合使用。
在其中本發明TrkB結合激動劑係用於治療ALS的實施例中，其可與利魯唑(riluzole)組合使用。
在其中本發明TrkB結合激動劑係用於治療青光眼的實施例中，其可與一或多種下列藥劑組合使用：前列腺素類似物、β阻斷劑、α激動劑和碳酸酐酶抑制劑。在其中本發明TrkB結合激動劑係用於治療青光眼的另外實施例中，其可與選擇性雷射小樑網整型術(SLT)和氬雷射小樑網整型 術(ALT)組合使用。
在一實施例中，本發明之TrkB結合激動劑可與耳蝸植入器組合使用作為治療感覺神經性聽力喪失之共治療。在另外的實施例中，本發明之TrkB結合激動劑其可與類固醇組合使用，用於治療感覺神經性聽力喪失。在另外的實施例中，本發明之TrkB結合激動劑其可與基因治療，例如ATOH1基因治療組合使用，用於治療感覺神經性聽力喪失。
在一特定的實施例中，TrkB結合激動劑係與一耳毒劑組合給藥。熟習技術者應瞭解其可預防因耳毒劑所造成的聽力障礙且可進一步容許較高劑量的耳毒劑投予該病患。
本發明亦具有下列實施例：
實施例1.一種TrkB結合激動劑，其中該激動劑係加強BDNF-引發的TrkB致效作用。
實施例2.如實施例1之TrkB結合激動劑，其中該激動劑不會與BDNF競爭和TrkB結合。
實施例3.如實施例1或2之TrkB結合激動劑，其中該加強BDNF-引發的TrkB致效作用之效應係藉由在飽和濃度的BDNF存在下相較於無TrkB結合激動劑，在TrkB結合激動劑的存在下，增加的TrkB活化所測量。
實施例4.如實施例3之TrkB結合激動劑，其中增加的TrkB活化係藉由增加的TrkB磷酸化量所測量。
實施例5.如實施例4之TrkB結合激動劑，其中在飽和濃度的BDNF存在下，TrkB之磷酸化在無TrkB結合激動劑下為100%，相較於在TrkB結合激動劑的存在下為至少110%。
實施例6.如實施例4或5之TrkB結合激動劑，其中在飽和濃度的 BDNF存在下，TrkB之磷酸化在無TrkB結合激動劑下為100%，相較於在TrkB結合激動劑的存在下為至少115%，至少120%，至少125%，至少130%，至少135%，至少140%，至少145%或至少150%。
實施例7.一種TrkB結合激動劑，其不會與BDNF競爭和TrkB結合，且係與包括在β摺板A和G，及TrkB之D5區β摺板A和A’間的區域內的表位結合。
實施例8.根據實施例7之TrkB結合激動劑，其中該表位係包括殘基T288、F291、K372和E293。
實施例9.一種TrkB結合激動劑其不會與BDNF競爭和TrkB結合，且係與包括在TrkB之近膜區(W381-H430)內的表位結合。
實施例10.根據實施例9之TrkB結合激動劑，其中該表位係包括殘基E398、Y397、D399和Y400。
實施例11.一種TrkB結合激動劑，其不會與BDNF競爭和TrkB結合，而與一參照抗體競爭和TrkB結合，該參照抗體係具有：(a)一SEQ ID NO：27之重鏈序列及SEQ ID NO：28之輕鏈序列；或(b)一SEQ ID NO：29之重鏈序列及一SEQ ID NO：30之輕鏈序列；或(c)一SEQ ID NO：31之重鏈序列及一SEQ ID NO：32之輕鏈序列。
實施例12.根據實施例7至11中任一項之TrkB結合激動劑，其中該TrkB結合激動劑係加強BDNF-引發的TrkB致效作用。
實施例13.一種TrkB結合激動劑，其中該激動劑係在無BDNF下活化TrkB，並維持細胞表面上的TrkB量。
實施例14.根據任一前述實施例中之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑不會與TrkB的配體結合區結合。
實施例15.一種TrkB結合激動劑，係包括： (a)(i)任一或選自下列之CDR組合：來自SEQ ID NO：27之CDRH1、CDRH2、CDRH3，及/或來自SEQ ID NO：28之CDRL1、CDRL2、CDRL3；或(ii)一(i)之CDR變體，其中該變體在各CDR中係具有1、2或3個胺基酸修飾；或(b)一VH區，其係包括與SEQ ID NO：40序列至少80%相同的序列及/或一VL區，其係包括與SEQ ID NO：41序列至少80%相同的序列。
實施例16.一種TrkB結合激動劑，其係包括任一或下列CDR之組合：(a)SEQ ID NO：6之CDRH1；(b)SEQ ID NO：7之CDRH2；(c)SEQ ID NO：8之CDRH3；(d)SEQ ID NO：3之CDRL1；(e)SEQ ID NO：4之CDRL2；及/或(f)SEQ ID NO：5之CDRL3。
實施例17.根據實施例15或16之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑係包括CDRL1、CDRL3和CDRH3。
實施例18.根據實施例17之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑另外係包括CDRH2。
實施例19.根據實施例15至18中任一項之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑係包括：(a)一人源化VH區，或一人源化重鏈(HC)序列；及/或(b)一人源化VL區，或一人源化輕鏈(LC)序列。
實施例20.根據實施例15至19中任一項之TrkB結合激動劑，其中VH位置47為Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
實施例21.一種TrkB結合激動劑，係包括：(a)一SEQ ID NO：40之VH區；及/或(b)一SEQ ID NO：41之VL
實施例22.根據實施例15至21中任一項之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑係包括：(a)與SEQ ID NO：42至少80%相同之重鏈(HC)序列；及/或(b)與SEQ ID NO：43至少80%相同之輕鏈(LC)序列。
實施例23.一種TrkB結合激動劑係包括：(a)SEQ ID NO：42之重鏈(HC)序列；及/或(b)SEQ ID NO：43之輕鏈(LC)序列。
實施例24.根據實施例15至23中任一項之激動人類TrkB受體的rkB結合激動劑，其不會與BDNF競爭並加強BDNF-引發的TrkB之致效作用。
實施例25.根據任一前述實施例中之TrkB結合激動劑，其中該Fc區為失能的。
實施例26.根據任一前述實施例中之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑係包括一合成的序列、一人源化序列或一嵌合的序列。
實施例27.一種核酸序列，其係編碼如任一前述實施例中所定義之TrkB結合激動劑。
實施例28.根據根據實施例27之核酸序列，其中該序列係包括編碼重鏈的SEQ ID NO：44；及/或編碼輕鏈的SEQ ID NO：45。
實施例29.一種表現載體，其係包括如實施例27或28中所定義之核酸序列。
實施例30.一種重組的宿主細胞，其係包括如實施例27或28中所定 義之核酸序列，或如實施例29中所定義之表現載體。
實施例31.一種製造如實施例1至26中任一項所定義之TrkB結合激動劑的方法，該方法係包括於適合表現該核酸序列或載體的條件下培養如實施例30中所定義之宿主細胞，藉以表現及純化該TrkB結合激動劑。
實施例32.一種由實施例31之方法所製造的TrkB結合激動劑。
實施例33.一種醫藥組成物，其係包括如實施例1至26或實施例32中任一項所定義之TrkB結合激動劑及一或多種醫藥上可接受載劑、賦形劑或稀釋劑。
實施例34.一種如實施例1至26或實施例32中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或一種如實施例33所定義之醫藥組成物係用於治療。
實施例35.一種如實施例1至26或實施例32中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或一種如實施例33所定義之醫藥組成物係用於治療神經病症。
實施例36.一種如實施例1至26或實施例32中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或一種如實施例33所定義之醫藥組成物係用於治療神經病症或其他其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB可能為有效的病症。
實施例37.一種根據實施例35或36所使用之TrkB結合激動劑，其中該病症為：神經退化疾病、視神經病變、視網膜退化症狀、涉及聽力喪失病症、精神病病症、神經發展病症、體重調節之病症、肌肉病症和其他CNS病症。
實施例38.一種根據實施例37所使用之TrkB結合激動劑，其中該病症為：肌萎縮性側索硬化症(ALS)、亨丁頓舞蹈症(HD)、阿茲海默症(AD)、運動神經元疾病、帕金森氏症、朊毒體疾病、路易體疾病、脊肌萎縮、多系統萎縮、失智症和Tau蛋白病變、青光眼、前部視神經缺血性病變(AION)、非動 脈型缺血性視神經病變(NAION)、創傷性視神經病變、雷伯氏遺傳性視神經病變、老年性黃斑部退化、神經性耳聾、耳蝸耳聾、耳鳴、感覺神經性聽力喪失、混合性聽力喪失、焦慮、感情病症、恐慌症、創傷後壓力症病症(PTSD)、注意力缺乏過動症(ADHD)、躁鬱症、精神分裂症、安格曼症候群、普拉德-威利症候、自閉症、雷特氏症候群、神經性厭食症、惡病質、不欲的體重減輕、肌少症、肥胖症、類鴉片引起的嘔吐、糖尿病神經病變、癲癇、多發性硬化症、偏頭痛、神經損傷、周圍神經病變、神經肌肉疾病、睡眠障礙及中風。
實施例39.如實施例4、35、36、37或38中任一項之TrkB結合激動劑，其中治療係包括提升：細胞存活，及/或神經元修復，及/或神經元可塑性。
實施例40.一種BDNF-引發的TrkB之致效作用，係用於治療。
實例 1. TrkB激動劑
藉由讓帶有重組的人類TrkB胞外區(以下稱為TrkB-ECD，SEQ ID NO：1，D1-D2-D3-D4-D5-JM，C32-H430，399個胺基酸)之Balb/c小鼠免疫，產生抗TrkB受體之小鼠單株抗體，該重組的人類TrkB胞外區係使用HEK293-6E細胞表現並純化所產生的。用於免疫之TrkB-ECD為經由GSA連接子加標簽的FLAG，並在C-端經具有一His標簽(5個His殘基)(FLAG標簽-GSA-C32-H430-His5)。雜交瘤融合選殖株之篩選(~3000孔)係藉由選擇在(i)直接抗原ELISA(亦即與TrkB-ECD結合)，及(ii)TrkB活化-依賴的NFAT啟動子驅動的報導子分析(亦即TrkB之激動劑)之間顯示相關性的選殖株來進行。此選擇標準辨識出表現鼠科激動劑抗體1G11、3A3(抗體序列與3B3相同)、8E5、5D11(與3E10相同)、5C7(抗體序列與5E6相 同)、3A4和2A1之多雜交瘤選殖株。
1.1 親和力
1G11如表面電漿子共振所測，展現以~42nM(kon=5.66 x 104/Ms,koff=0.00239/s)之親和力與人類TrkB-ECD結合。1G11之親和力，以及所辨識的其他激動劑抗體之親和力係如表3所示。
1.2 受體選擇性
於表現TrkA或TrkB或TrkC之CHO-K1細胞中，使用Trk活化依賴的NFAT啟動子驅動報導子分析之1G11對Trk受體家族的選擇性評估，其顯現在檢測的濃度(0.00006-125nM)下1G11在表現TrkB受體的細胞中，而非在TrkA或TrkC受體表現細胞中選擇性引發報導子基因表現。作為對照組的同源配體(TrkA為NGF，TrkB為BDNF，而TrkC為NT-3)在對應的Trk受體表現細胞中引發了相當程度的報導子基因表現。亦檢測1G11與泛神經滋養蛋白受體p75NTR結合的能力。以細胞為基準的分析顯示未檢出1G11與p75NTR受體之結合。TrkB激動劑的選擇性係彙整於表3中。
1.3 交叉物種反應性
1G11結合並活化嚙齒類(鼠科、大鼠)、獼猴和人類TrkB受體。2A1和5D11亦活化大鼠、小鼠和人類TrkB受體。有利地，3A3和8E5僅活化人類TrkB受體，而不會活化嚙齒類TrkB受體。使用重組表現TrkB受體於異源細胞株或衍生自對應物種的初始細胞或人類iPSC衍生細胞中檢測物種交叉反應性。TrkB激動劑的物種選擇性係彙整於表3中。
1.4 活化TrkB
如TrkB之磷酸化量(pTrkB,Y515)所測，當以1G11處理時，穩定表現人類全長TrkB受體(SEQ ID NO：2)之CHO-K1係以3.1±2.1nM(平均±S.D.,n=8)之平均EC50導致TrkB活化。TrkB激動劑的TrkB活化效應 係彙整於表3中。1G11本身活化了TrkB受體至約30-40%之同源配體BDNF(以及NT-4)最大反應。
1G11在大鼠的皮質神經元中引發持續的TrkB活化及其下游訊號傳遞路徑(高達24小時)其顯示，當暴露於TrkB時，相較於BDNF，1G11可將受體維持在活化狀態持續一段長時間(參見圖1A)。機制上，1G11引發的TrkB活化係不同於BDNF。活化的酪胺酸激酶受體典型地係經歷內噬作用接著降解，造成細胞表面受體下調，因而對配體暫時無反應以便維持細胞的恆定。有利地，如細胞表面生物素化所測，相較於未處理的對照組，儘管總細胞的TrkB受體量下降，1G11在大鼠皮質神經元中不會改變TrkB的表面量至高4小時，然而在24小時的量為增加的(參見圖1B)。
1.5 BDNF競爭
1G11對TrkB受體的活化效應係在有或無BDNF的存在下藉由TrkB的磷酸化所測。在BDNF的存在下，TrkB激動劑的競爭效應係以下降的TrkB磷酸化來定義。在飽和BDNF濃度的存在下(10nM,EC100)，於表現全長TrkB受體之CHO細胞中，就不同濃度的1G11對TrkB磷酸化之效應評估顯示，1G11不會與BDNF競爭TrkB。經辨識不會與BDNF競爭的唯一TrkB激動劑為5D11，其降低了BDNF-引發的TrkB磷酸化~50%。TrkB激動劑的BDNF競爭結果係彙整於表3中。
1.6 TrkB激動劑的競爭分析
為了分析TrkB激動劑mAb之表位結合性質，係設置競爭分析來測定哪些TrkB激動劑會彼此競爭，用以將與TrkB上類似或重疊表位結合的激動劑集合。將TrkB-ECD固定在晶片表面並將單一的TrkB激動劑mAb注射至流體槽中與TrkB結合。然後注射第二TrkB激動劑mAb並評估其在第一TrkB激動劑mAb存在下，與TrkB-ECD的結合能力。競爭性係分 類為：低於20%的第二TrkB激動劑結合為「無」；20-60%的第二TrkB激動劑結合為「部份」；及大於60%的第二TrkB激動劑結合為「有」。因此與第二TrkB激動劑「無」結合係推定為無競爭，且因此有二種TrkB激動劑係與非重疊表位結合，或另外與第一TrkB激動劑結合改變了TrkB-ECD構形，使得第二TrkB激動劑不能結合。「部份」和「有」則推定二種TrkB激動劑係競爭與TrkB上類似或重疊的表位結合。
TrkB激動劑的競爭結果係彙整於表3中(與1G11或3A3或8E5競爭)。表2係顯示1G11、3A3和8E5可共同歸類為彼此競爭與TrkB上類似或重疊的表位結合之TrkB激動劑。
1.7 BDNF加強作用
藉由在BDNF的存在下測量TrkB磷酸化量(pTrkB,Y515)，評估1G11對BDNF-引發的TrkB致效作用之加強效應。在飽和BDNF濃度(10nM,EC100)之存在下，於表現全長TrkB受體(SEQ ID NO：2)之CHO細胞中，就不同濃度的1G11對TrkBE的效應評估在處理後30分鐘促進穩定量的TrkB活化，如反映在最大反應(BDNF-100%；BDNF+1G11-~100%-145%)，如圖2中所示。
在飽和BDNF濃度存在下其他TrkB激動劑之評估顯示，3A3和8E5亦「加強」TrkB受體活化(分別為~100-165%和~100-120%)，如圖2中所示。這些結果係彙整於表3中。
有利地，選質株5C7、5E6、3A4和2A1不會競爭亦不會加強BDNF媒介的TrkB受體活化，其顯示(a)並非所有的抗體皆具有加強性質，及(b)並非所有配體非競爭性抗體皆為增強劑。
圖2係顯示TrkB抗體-增強劑和非競爭劑(3A3、1G11、8E5)，競爭劑(5D11)，非競爭劑(2A1、3A4、5C7)之代表性數據。100%活性代表在飽 和BDNF濃度亦即10nM EC100下之TrkB活化。
已有報告指出BDNF量在大多數的神經和病態生理疾病中為下降的且表現型/缺陷係歸因於此下降。在BDNF缺乏的病態生理條件下，當TrkB受體量仍維持不變，若投予的治療性TrkB激動劑可：(i)活化TrkB受體(例如1G11、3A3、8E5、5D11、5C7、5E6、3A4和2A1)，(ii)不與下降量的BDNF競爭(例如1G11、3A3、8E5、5C7、5E6、3A4和2A1)，(iii)加強由下降生理量之BDNF所引發的細胞訊號(例如1G11、3A3、8E5)，及/或(iv)不改變TrkB的細胞表面量(例如1G11)，則仍可能引發生理細胞/系統反應，其另外可能造成對TrkB激動劑之暫時性去敏感。此數據亦彙整於表3中。
1.8 NT-4加強作用
同樣地，1G11無法與NT-4競爭且在飽和量的NT-4存在下對NT-引發的TrkB致效作用展現「加強」效應(NT-4-100%；NT-4+1G11-~130%；表3)。因此，預期3A3和8E5對NT-4引發的TrkB致效作用亦將具有加強效應。
1.9 細胞存活和修復
1G11在穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞株中用濃度依賴的方式，分別以0.025±0.01nM和0.19±0.06nM之平均EC50提升了軸突存活及引發軸突生長。1G11在大鼠腦中和脊椎衍生的神經元、小鼠腦衍生的神經元和CHO細胞中重組表現的獼猴TrkB，活化了內生性表現的TrkB受體。
同樣地8E5和3A3係分別以0.09±0.06nM(平均±SD)and 0.006±0.001nM(平均±SD)之EC50增進細胞存活。
當8E5用濃度依賴的方式以1.58±0.34nM(平均±SD)之EC50引發軸突生長時，3A3持續地隨增加的抗體濃度展現雙相軸突生長反應，造成其 導出精確EC50之挑戰。
ND：未測定
2. 1G11、3A3和5D11之定序
TrkB激動劑係藉由習用的方法來定序。以Kabat決定CDR並提交1G11、3A3、8E5和5D11於表4中(請注意1G11之CDR區在表1中係以 不同的編號慣例所測)。各1G11(SEQ ID NO：27和28)、3A3(SEQ ID NO：29和30)、8E5(SEQ ID NO：31和32)及5D11(SEQ ID NO：33和34)之全長的鼠科序列(重鏈和輕鏈)亦請參照表4。
2.表位
TrkB標準胺基酸序列在整個小鼠、大鼠、獼猴和人類中為高保守的(95%整個全長序列)，且特別是在其中於實例1結合中所辨識的全部TrkB 激動劑之胞外區為保守的。為了測定TrkB上的結合表位，係藉由區域刪除和丙胺酸掃描突變誘發(使用表面電漿子共振)以及X-光晶體學研究，使用TrkB ECD(SEQ ID NO：1)來進行表位定序研究。TrkB ECD包括5個區(D1-D3：C32-C194；D4：G195-V283；D5：H284-G380)和一短的近膜JM區(W381-H430)。用於表位定序研究之TrkB-ECD為經由GSA連接子加標簽的FLAG，並在C-端具有一His標簽(5 His殘基)(FLAG標簽-GSA-C32-H430-His5)。
產生刪除區變體：D1-D3區變體係包括C32-L196(SEQ ID NO：35)；D4-D5-JM區變體係包括P197-H430(SEQ ID NO：36)，及D5-JM區變體係包括H284-H430(SEQ ID NO：37)。
丙胺酸掃描突變誘發研究(2.2、2.3和2.5)，係在下列所列的TrkB-ECD(SEQ ID NO：1)中製造單一位點突變：N193A；S198A；N200A；L206A；E210A；K212A；S213A；T215A；S217A；D223A；N227A；Y229A；D231A；N234A；V236A；H239A；S244A；T246A；S249A；R251A；Q263A；L271A；Q276A；T288A；F291A；E293A；T296A；D298A；H299A；K308A；K312A；F318A；N325A；K328A；K333A；H335A；H343A；N350A；M354A；K364A；E366A；E371A；K372A；Q373A；H377A；M379A；W381A；D385A；N389A；D394A；E398A；T402A；D406A；T410A；N415A；T420A；D424A；R428A；F285A；T290A；S294A；H300A；S327A；Y329A；C331A；Q347A；D349A；T352A；D370A；D386A；N391A；Y392A；V395A；I396A；Y397A；D399A；Y400A；N405A；D358A；或S375A。
2.1 TrkB和BDNF間的結合
已知TrkB的D5區(殘基286-384)可取代全長的TrkB與配體 (BDNF/NT-4)結合。在TrkB的配體結合位內有二個接觸區：「保守性補丁」和「特異性補丁」。保守性補丁中的TrkB D5之接觸殘基係來自AB、C’D和EF β摺板間的環，及D5區的C-端。TrkB之保守性補丁係與配體(BDNF/NT-4)的主幹結合。特異性補丁中的TrkB D5之接觸殘基係來自ABED β摺板的外表面。TrkB之特異性補丁係與配體(BDNF/NT-4)的N-端結合，其在非配體化形式中為紊亂的並在與TrkB結合後變為秩序化。BDNF/NT-4同源二聚物和二個TrkB D5區間的結構相互作用係彙整於圖3中。
2.2 1G11之表位
帶有不同TrkB區刪除變體之1G11的最初表面電漿子共振結合分析顯示，1G11係與TrkB-ECD(C32-H430)，D4-D5區變體(P197-H430)及D5區變體(H284-H430)結合，但不與D1-D3區變體(C32-L196)結合。
在TrkB-ECD中帶有~80個單點丙胺酸突變，大部份在D4-D5-JM區之1G11的表面電漿子共振結合分析，辨識出8個胺基酸為用於結合的重要殘基，雖然不同程度上顯示最重要的首先為：F291、E293>K372、E210、T288、D370>F285、T290。除了E210係在D4區之外，全部的殘基係來自TrkB的D5區。
1G11嵌合Fab1[來自1G11的可變區與來自人類IgG1的恆定區融合](SEQ ID NOs：38和39)之共晶體結構與TrkB的D5-JM區(SEQ ID NO：37)複合在2.3Å解析度下顯示，TrkB之D5-JM區上的14個殘基極接近IG11(使用4.5Å的截距)。辨識出的14個殘基包括亦以丙胺酸掃描分析辨識的殘基(T288、F291、K372、E293)；以及僅藉由X-光晶體學所辨識之其他緊密靠近的胺基酸殘基(I289、T290、L292、S294、K308、D358、E371、Q373、I374、S375)。使用3.5Å截斷距離於2.3Å解析度辨識出7個殘基 (290、293、294、372、373、374、375)。
涉及表位的相互作用係使用CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(Molecular Operating Environment)來定義。選擇7Å以內的TrkB之D5-JM區上的1G11嵌合Fab1之蛋白殘基，及然後使用帶有內建參數的「配體相互作用」工具來辨識水分子或來自相互作用分子的殘基，其被認為與這些殘基相互作用。請注意，由於這些工具係設計用來定義小分子配體相互作用，而非蛋白殘基，因此係個別計算各所選擇的殘基之「配體相互作用」。以MOE所定義的相互作用係以Excel編輯以便刪除任何鏈內相互作用，及刪除除了形成二鏈間的橋連以外的所有水之相互作用。剩餘的相互作用殘基係如下：o與1G11嵌合Fab1殘基直接相互作用Thr290,Glu293,Ser294,Asp358,Ser375 o與1G11嵌合Fab1殘基直接相互作用，及經由水間接相互作用Lys372,Gln373 o僅經由水間接相互作用Glu341。
共晶體結構分析和丙胺酸掃描突變誘發彼此互補和相互印證，並辨識出與TrkB激動劑相互作用或經由結構相互作用間接影響結合之TrkB D5-JM區中的殘基。
使用丙胺酸掃描數據和X-光數據，其顯示K372和E293最低限度為與1G11結合的TrkB表位。此數據係彙整於表5中。
E293係位於D5 β摺板A和A’之間；而K372係位於D5 β摺板G。殘基T288和T291以丙胺酸掃描和鄰近分析所辨識)係位於D5 β摺板A。
以丙胺酸掃描所辨識的殘基係如圖4A所示，而由共晶體X-光晶體學 鄰近分析所辨識之殘基係如圖4B所示。在圖4中，與TrkB D5結合之來自1G11 Fab的共結晶結構D5 TrkB區係和來自與NT-4同型二聚體結合之公開的人類TrkB區D共晶體結構的相同TrkB區疊合，使TrkB的結合朝向有關1G11 Fab的配體。來自人類BDNF/NT-4同型二聚體之BDNF鏈隨後疊加而顯現BDNF上可能的TrkB結合位置。由於缺乏公開/可取得的晶體結構數據，使用β-股幾何學延伸來自與NT-4同型二聚體結合之公開的人類TrkB區D5共晶體結構的TrkB D5之C-端，用以連結近膜區(JM)及上至跨膜區以驗證此遺失區的長度。使用彩帶底圖模式展現結構且原子係展現在指出為可能的TrkB表位之殘基的結構上。
從圖4A和4B可看出，1G11的表位係位於TrkB D5區上靠近BDNF/NT4「保守性補丁」結合位置者(介於AB、C’D和EF β摺板之間的環，和D5區的C-端)，及接近BDNF/NT4「特異性補丁」配體結合位置(ABED β摺板的外表面)。更特言之，TrkB 5區上的1G11表位似乎是沿著D5 β摺板A，D5 β摺板A和A’及D5 β摺板G之間的區域，接近特異性補丁ABEDβ摺板的外表面。TrkB上的1G11表位不直接與BDNF/NT4配體結合位重疊之事實，據推測能讓1G11與TrkB結合，及讓TrkB亦與BDNF/NT-4結合，形成三元複合物「TrkB激動劑+TrkB+配體」。
進一步的1G11、TrkB、BDNF/NT-4組份之疊置分析顯示，NT-4/BDNF的N-端可能凸出至TrkB和1G11 Fab重鏈間的空間(參見圖5)。將分子表面加導此疊合顯示Vκ CDRs L1和L3，及CDRH3與TrkB緊密相互作用，且在TrkB和CDRs H1與H2之間有一裂縫，其設想可能是容納BDNF的N-端(參見圖6)。在BDNF存在下1G11與TrkB結合因此亦可能包括與BDNF的N-端結合，且此結合可能使三元複合物穩定因而加強了BDNF功能性反應。除了TrkB以外，1G11因此亦可能能與配體(BDNF/NT-4)的 N-端相互作用。另一種選擇，1G11可能藉由不在配體結合位置，但靠近配體結合位置結合來穩定TrkB和配體間的相互作用。
涉及互補位的殘基係藉由共晶體結構分析以鄰近分析(使用4.5Å的截距)及藉由使用CCG(Chemical Computing Group)MOE v2015.1001(Molecular Operating Environment)確定與表位相互作用的殘基來辨識。互補位中主要的結合殘基係在CDR L1(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：RASQ RIS NN LH/SEQ ID NO：3)，L3(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：QQSNSWPLT/SEQ ID NO：5)及H3(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基： R G YE GALDY/SEQ ID NO：8)內。在CDRH2中僅有二個殘基與表位相距4.5Å以內，及僅有一個殘基直接相互作用(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基： R IAPGNTYYNEIFKG/SEQ ID NO：7)。在CDRH1中僅有一個殘基接近或(間接)接觸表位(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：SYYIN/SEQ ID NO：6)及在CDRL2中有單一殘基接近表位(黑體字殘基代表與表位相距4.5Å以內的殘基，加底線的殘基代表直接或間接(經由水)與表位相互作用的殘基：YVSQSIS/SEQ ID NO：4)。因此，從排列順序的觀點而言，CDR L1、L3和H3對結合最為重要，接著CDRH2，然後是CDRL2和CDRH1。
2.3 3A3之表位
TrkB-ECD中帶有~80個單點丙胺酸突變，大部份在D4-D5-JM區之 1G11的表面電漿子共振結合分析，雖然程度不同，但辨識出9個胺基酸為用於結合的重要殘基(E398、Y397、D399、Y400>D394、I396>V395、N389、T402)。此數據係彙整於表5中。這些殘基全部在JM區中，其為TrkB之D5區的C-端及跨膜區的N-端(參見圖7-JM殘基係使用β-股幾何學來延伸)。此近膜(JM)區，在缺乏任何晶體結構下，係假定為一長的柔性連接區。一般認為JM對於與配體結合亦可能為重要的。
雖然與3A3結合的TrkB表位似乎與1G11的表位不同，重要的請注意，3A3係與1G11(和8E5)競爭和TrkB結合，且因此表位可能在某些方面為重疊的(參見上文實例1.6)，或與JM或D5區結合可能造成構形變化，其改變了其他抗體的結合表位。長的柔性連接子之近膜(JM)區實際上可能極接近D5 β摺板A、B和G。
3A3亦顯示強化BDNF引發的TrkB致效作用(參見上文實例1.7)。因此有一可能性，當3A3與TrkB結合時，其亦可能與BDNF/NT-4具有另外相互作用(例如經由配體的N-端)，及/或同樣地使受體加配體的複合物穩定。
有趣地，此研究顯示，近膜區中的殘基D394、I396和Y400賦予人類TrkB受體特異性，因為這些殘基與大鼠TrkB中的不同(分別為Glu、Leu、Trp)，且3A3不會活化大鼠TrkB。
2.4 8E5之表位
並無進行丙胺酸掃描突變誘發或結晶學研究來測定8E5之結合表位。然而，重要的請注意，8E5係與1G11(和3A3)競爭和TrkB結合，且因此表位可能在某些方面為重疊的(參見上文實例1.6)，或與JM或D5區結合可能造成構形變化，其改變了其他抗體的結合表位。8E5亦顯示強化BDNF引發的TrkB致效作用(參見上文實例1.7)。8E5具有人類TrkB特異性， 類似3A3，其意味著表位可能係在JM區中，類似3A3，其中該序列在嚙齒類和人類間為互異的(參見表5)。
2.5 5D11之表位
TrkB-ECD中帶有~80個單點丙胺酸突變，大部份在D4-D5-JM區之5G11的表面電漿子共振結合分析，雖然程度不同，但辨識出6個胺基酸為用於結合的重要殘基(N350>H299、D349>H300、K328、K333)。此數據係彙整於表5中。圖8顯示，5D11之表位係位於配體結合位置(D5區之AB、C’D和EF β摺板間的環；及D β摺板)。如TrkB磷酸化分析中所測，此項完全符合5D11係與BDNF競爭之事實。
ND：未測定
2.6 加強抗體
以實例1和2的結果為基準，其係有(i)與TrkB表位結合的TrkB激動劑係極靠近TrkB的BDNF結合位置，特別是極靠近與配體N-端結合的特異性補丁，並得以與TrkB結合，其在BDNF/NT-4的存在下為增進或穩定的：這些為TrkB-BDNF增強劑；(ii)TrkB激動劑其係在配體結合位置內或接近配體結合位置結合，並使受體和配體間的相互作用不穩定：這些為BDNF競爭劑；及(iii)TrkB激動劑，其係與遠離BDNF結合位置的表位結合，為不具有加強功能的單純激動劑。
1G11、3A3和8E5為增強劑的實例，其與BDNF為非競爭性的且其似乎係與二個表位結合(8E5表位尚未測定)。與這些表位結合使TrkB受體以活化構形在BDNF的存在下穩定為可能的，且又(a)增加可被抗體活化之可用的TrkB細胞表面量；及/或(b)抑制活化的TrkB受體內噬作用和降解。
進行SEC-MALS來評估TrkB之ECD可溶性截短型(TrkB_H284-H430 ECD-6H)與3A3或1G11或BNDF之二元複合物的形成。二元複合物的存在可在所有的情況下偵測。SEC-MALS亦可用於評估此TrkB與BDNF和3A3及/或TrkB、BDNF和1G11建構間是否形成三元複合物物。TrkB、BDNF和3A3實驗並無提供三元複合物存在的明確的證據。在此實驗中並無偵測到二元或三元複合物，其顯示複雜的溶液行為和形成無法以SEC-MALS看出之較高等級物類的可能性。TrkB、BDNF和1G11的實驗數據亦建議有大於簡單二元複合物形成。在此一情況下，可能偵測到某些此等大於簡單二元複合物的物類。然而，並未精確地測定這些較高分子量 物類的組成份。因此，二種抗體的增強作用可能係因形成三元複合物所致，仍為可能的。
2.6 氫氘交換
使用HDX-MS來監測加his標簽的D5-JM TrkB在有或無許多其他潛在蛋白夥伴下之交換率。藉由將個別的組份於50mM磷酸鈉、150mM NaCl pH 7.0之非氘化H2O緩衝液中稀釋，製備下列蛋白溶液：
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；1G11mAb(40μM；以確保所有的TrkB係以二元複合物存在)
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；3A3 mAb(40μM；以確保所有的TrkB係以二元複合物存在)
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；BDNF(40μM；以確保所有的TrkB係以二元複合物存在)
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；1G11 mAb(20μM)；BDNF(20μM)
●TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His(20μM)；3A3 mAb(20μM)；BDNF(20μM)
HDX標定反應係使用標準HDX方法於環境溫度下以20倍稀釋從無氘化至氘化緩衝液(50mM磷酸鈉，100mM NaCl溶於D2O,pH 6.6)來進行。於4個時間點採集交換樣本(1-3重複)：0秒(亦即無非-氘化緩衝液稀釋)、15秒；60秒和300秒。以預冷過的低pH和變性的驟冷緩衝液(400mM磷酸鈉，8M脈HCl，500mM(三(2-羧乙基)膦)，pH 2.2)於4℃將樣本進行驟冷。
將變性驟冷過的樣本注射至帶有240秒消化時間、100μl/min的管柱 流速和0.2%甲酸水溶液之消化緩衝液15℃的固定胃蛋白酶消化管柱(Waters Enzymate BEH,2.1mm X 30mm，部件編號：186007233)。將釋放出的胜肽藉由UPLC-MS於0℃在Acquity UPLC系統上使用1.0 x 100mmUPLC BEH C18管柱(部件編號：186002346)，以典型地15分鐘的運作時間及移動相A：H2O/甲酸(99.8：0.2 v/v)和移動相B：ACN/甲酸(99.8：0.2 v/v)用40μl/min之流速分析。
由非氘化蛋白之蛋白分解所產生的胜肽係使用ProteinLynxGlobal SERVER(http：//www.waters.com/waters/en_GB/ProteinLynx-Global-SERVER%28PLGS%29/nav.htm？cid=513821&locale=en_GB)，或Mascot搜尋引擎，針對僅含有感興趣蛋白序列的資料庫所辨識。各時間點和狀態的氘併入係使用DynamX Analysis Software v 3.0(或HD Examiner)藉由將從PLGS輸入之未氘化胜肽列表與所獲得的氘化樣本之數據相比較來計算。
各胜肽的氘化數據係以手動操作來評估，及從分析中移除帶電狀態或質性低劣的胜肽數據。
結果
TrkB在1G11的存在下就TrkB胜肽所觀察的氘交換率樣貌上顯示明顯的變化。部份氘化最新差異圖(圖9)顯示TrkB胜肽區284-291為最強的氘化保護。此區在所有調查的時間點仍為強力受保護的，其顯示此區對TrkB與1G11之交互作用可能為重要的。更細微的交換保護係在整個TrkB中央區大約316-380觀察到，其顯示此處另外的殘基可能參與相互作用。
TrkB在3A3的存在下就TrkB胜肽所觀察的氘交換率樣貌上顯示明顯的變化，但僅在最早15和60秒的交換點。部份氘化最新差異圖(圖10)顯示含有385-398區之TrkB胜肽區為最強的氘化保護。然而，在300秒的交換時間點時失去此保護。加上此區對TrkB非常快速氘化，此數據顯 示此區可能經溶劑暴露並被快速氘化；經由與3A3相互作用免於氘化的保護為不完整的，且當速率減緩時，即使此較緩慢的速率亦能在300秒內達到飽和氘化。
單獨的TrkB；TrkB-3A3 mAb；TrkB-1G11 mAb在BDNF存在下。添加BDNF，於單獨的TrkB或於TrkB-mAb複合物中，在TrkB氘化上並未得到穩鍵的變化，所以不可能顯示有或無TrkB-mAb-BDNF三元複合物存在。
3. 人源化1G11、3A3、5D11 3.1 人源化
將1G11、3A3和5D11人源化。此等序列係如下：人源化1G11可變重鏈(VH)區-SEQ ID NO：40；可變輕鏈(VL)區-SEQ ID NO：41；重鏈(HC)-SEQ ID NO：42；輕鏈(LC)-SEQ ID NO：43；編碼此HC之DNA-SEQ ID NO：44；編碼此LC之DNA-SEQ ID NO：45。
人源化3A3可變重鏈(VH)區-SEQ ID NO：46；可變輕鏈(VL)區-SEQ ID NO：47；重鏈(HC)-SEQ ID NO：48；輕鏈(LC)-SEQ ID NO：49；編碼此HC之DNA-SEQ ID NO：50；編碼此LC之DNA-SEQ ID NO：51。
人源化5D11可變重鏈(VH)區-SEQ ID NO：52；可變輕鏈(VL)區-SEQ ID NO：53；重鏈(HC)-SEQ ID NO：54；輕鏈(LC)-SEQ ID NO：55；編碼此HC之DNA-SEQ ID NO：56；編碼此LC之DNA-SEQ ID NO：57。
將重鏈和輕鏈之鼠科CDR使用本項技術之標準程式嫁接至適合的人類框架序列：在人類V基因生殖系資料庫上搜尋CDR-遮蔽的可變(V)區序列，以序列類似性為基礎所選擇的V和J基因範本序列。以人類和小鼠間的比較為基準，辨識可能的回復突變。
將1G11重鏈之鼠科CDR嫁接至IGHV1_69重鏈框架並產生三種人 源化重鏈變體：第一種其為CDR之直的嫁接物(H0)，第二種變體其係在kabat位置47(W47C)(H4)併入一回復突變，及第三種其係在位置47(W47S)(H7)併入一絲胺酸殘基。
將1G11輕鏈之鼠科CDR嫁接至IGKV3_11人類框架(Lo1)；及嫁接至在Kabat位置49帶有單一酪胺酸回復突變成離胺酸(Y49K)(Ln1)之IGKV3D-15人類框架。
產生1G11的人源化變體，並就TrkB-ECD之結合及於各種功能分析中進行檢測。相較於Lo1變體，Ln1變體在結合上並未顯示明顯的差異。
然而，在重鏈Kabat位置47(W47)帶有人類框架殘基色胺酸之變體明顯喪失與TrkB之結合。在重鏈Kabat位置47之色胺酸在人類抗體中為100%保守的且係位在重鏈-輕鏈介面。當導入W47C/S回復突變時，則恢復與TrkB結合。半胱胺酸和絲胺酸為大小類似的胺基酸，且二個突變物係類似鼠科親代1G11，保留了人源化1G11之結合和功能性質。因此預期，在重鏈位置47之其他大小類似的胺基酸亦應保留了結合和功能。例如，其他可能的取代包括Gly、Ala、Val、Thr或Asn。亦預期，若色胺酸仍留在重鏈位置47，則應有其他框架改變其可能回復重鏈-輕鏈介面結構並因此恢復與TrkB結合。
人源化1G11為直的嫁接物，其中1G11 CDR係嫁接至在可變重鏈Kabat位置47(H7,Lo1)併入一絲胺酸突變之人類框架。人源化1G11含有一經L235A和G237A(EU編號)突變修飾之人類IgG1 Fc區。此IgG1 Fc區的修飾減低了mAb與Fcγ受體和C1q的結合，因此降低了mAb引發TrkB陽性細胞因抗體依賴的細胞毒性(ADCC)或補體依賴的細胞毒性(CDC)而耗盡之可能。此項一般係描述為Fc-失能。
藉由表面電漿子共振評估人源化1G11與C1q和各種人類及獼猴Fc 受體(FcRn、FcγR I、FcγR IIaH、FcγR IIaR、FcγR IIb、FcγR IIIaV和FcγR IIIaF)結合之能力。結果顯示，如預期，在重鏈導入Fc失能的L235A和G237A突變並不會影響人源化1G11與FcRn結合，但減低了與C1q、FcγR I、FcγR IIaH、FcγR IIaR、FcγR IIb、FcγR IIIaV和FcγR IIIaF之結合。
應注意，人源化1G11為Fc-失能的，而鼠科1G11則不是。Fc效應子功能對於此TrkB激動劑的生物功能並非重要的。
3.2 人源化抗體性質
將人源化1G11與鼠科1G11以許多分析中作比較，包括表面電漿子共振測量抗體與TrkB之結合親和力，以及TrkB磷酸化分析。在這些分析中，人源化1G11與1G11相當，其確定了人源化為成功的。人源化1G11在1：1結合模型中如表面電漿子共振所測，係分別以~55nM和~60nM之親和力與重組的人類和獼猴TrkB-ECD結合。人源化1G11，藉由測量磷酸化TrkB之量所測，在穩定表現人類全長TrkB受體之CHO-K1細胞中以0.65±0.14nM(平均±SD,n=3)之EC50活化人類TrkB受體。人源化1G11選擇性活化人類TrkB受體，但不會活化人類TrkA或TrkC受體；且亦與嚙齒類(鼠科，大鼠)、獼猴和人類TrkB受體交叉反應及將其活化。
人源化1G11不會與BDNF競爭；且其係以0.65±0.14nM(平均±SD,n=3)之EC50活化了CHO-K1細胞中的人類TrkB；保留強化性質(~120% vs BDNF)亦即在飽和濃度BDNF之存在下增進TrkB活化的量。
在活體外，人源化1G11在穩定表現人類全長TrkB受體之大鼠PC12神經母細胞瘤細胞中，用濃度依賴的方式以0.007±0.003nM(平均±S.D.；1G11=0.025±0.01nM)之平均EC50增進了TrkB媒介的細胞存活。在穩定表現人類全長TrkB受體之相同的大鼠PC12神經母細胞瘤細胞中，人源化1G11用濃度依賴的方式以0.07±0.02nM(平均±S.D.；1G11=0.19±0.06 nM)之平均EC50增進了TrkB媒介的軸突生長。
4.活體內效應 神經元存活之SRA大鼠模型
活體中1G11對神經元存活之效應係於撕脫(單側)引發的脊髓運動神經元退化之大鼠模型中評估。簡言之，將來自成年sprague-dawley大鼠第4腰節(L4)的腹根藉由手術撕脫並使其復原1周之後以1G11之靜脈內(單一團注)或鞘內(連續)注入。就連續的鞘內輸注，係將導管經由L4-L5之間的椎間孔插入蛛膜下腔，其中另一端係與alzet 2002微型滲透壓幫浦相連接，該幫浦係以皮下植入頸部後方。將媒劑調配物載入幫浦中並以0.5μl/hr的速率遞送，直到抗體注入。
2種不同劑量1G11(60μg或240μg/天)或BDNF(陽性對照；12μg/天)之連續輸注液，但無媒劑調配物(陰性對照)在大鼠SRA模型中進行2週，增進ChAT表現神經元(以抗-ChAT抗體染色)的存活至類似程度(亦即與對側相比)，相較於媒劑治療組並無不同的劑量依賴反應。神經根撕脫後1週，靜脈內投與1G11(0.03、0.1、0.3、1、3、30mg/kg)或BDNF(陽性對照；12μg/天)，但無同型對照(IgG1,3mg/kg)或媒劑調配物(陰性對照)，如ChAT染色之顯現，顯示暴露-依賴的增進脊髓神經元存活。1、3和30mg/kg之1G11能挽救ChAT+神經元至不同的程度，其中0.3mg/kg的效應可忽略。
總言之，1G11當以單一靜脈內尾靜脈團注射或以連續鞘內輸注時，於受傷後7天在單側(L4腹根)撕脫的大鼠中增進了脊髓ChAT+神經元的存活。
步態功能(hSOD1 G93A 小鼠)
除了1G11對神經元存活的效應外(如上述)，係於同基因型 B6Cg-Tg(hSOD1G93A)1Gur/J基因轉殖小鼠中研究1G11的功能性效應。當疾病發展和惡化時，hSOD1 Tg小鼠在各種步態參數上展現損害。1G11(0.3mg/kg)，但無媒劑調配物(陰性對照)，當於一隊雌性小鼠(~3.5個月大)每隔2週經由尾靜脈團注給藥進行28天時(在幹預期間為二次)，相較於hSOD1-媒劑對照組，顯著地改善hSOD1小鼠中的步態特性至不同程度：跑步速度、節奏(步/秒)、跨步時間和站立時間幾乎與野生型同窩小鼠相當；對步幅相對中度效應；及對擺盪速度有較大降低效應。這些結果顯示，1G11當以靜脈內給藥時可改善hSOD1G93A基因轉殖小鼠中的步態缺陷。
為了進一步評估1G11對步態和神經學評分的效應，係將小鼠(雄性和雌性，大約3.5個月大，在研究開始時每組每種性別至少16隻小鼠)依照表6給劑。此實驗係以隨機、安慰劑和同型對照及雙盲的方式來進行。
媒劑=20mM磷酸緩衝液、130mM NaCl pH 6.0及0.005%聚山梨醇酯20 iv=靜脈內，ip=腹膜內
使用嚙齒類CatWalk系統於8個時間點將動物進行步態分析：第97天(基線)，第99天(第1劑後1天)，第111天(第1劑後13天)，第113天 (第2劑後1天)，第125天(第2劑後13天)，第139天(第3劑後13天)，第146天(第4劑後7天)及在第153天(第4劑後13天)。選擇6種步態參數(跑步速度、步幅、站立時間、跨步時間、節奏和擺盪速度)進行分析。結果顯示，相較於IgG1同型對照，1G11在hSOD1-G93A小鼠二種性別中顯著地改善步態特性，特別是在第125天和第139天。平均上，相較於低劑量組，在高劑組中有較佳的改善。
就所有hSOD1-G93A動物在整個研究時期中監測神經學評分。對數-等級(Log-Rank)試驗顯示，相對於1gG1同型對照，1mg/kg和0.3mg/kg 1G11顯著地延緩雌性小鼠死亡的中位數時間。就雄性小鼠，0.3mg/kg之hSOD1-1G11組顯著地延緩致死的中位數時間，而1mg/kg的hSOD1-1G11組，相對於IgG1同型對照，並未顯示較大的改善。Wilcoxon試驗顯示，就雌性小鼠1mg/kg 1G11，但非0.3mg/kg 1G11，相對於IgG1同型對照，顯著地延緩了腫瘤發作的中位數時間。在雄性小鼠中，相對於IgG1同型對照，1mg/kg和0.3mg/kg 1G11邊際上延緩了腫瘤發作的中位數時間。
總言之，這些結果顯示，1G11當以靜脈內給藥時可在二種性別的hSOD1-G93A基因轉殖小鼠中改善缺陷，於二種性別中延緩腫瘤發作，及僅在雌性hSOD1-G93A基因轉殖小鼠中增進整體「存活」。
運動神經元存活(hSOD1 G93A 小鼠)
為了評估1G11對脊髓ChAT陽性神經元的效應，係將雄性小鼠(大約50天大，在研究開始時每組12隻小鼠)依照表7給劑。此實驗係以隨機、安慰劑和同型對照及雙盲的方式來進行。
媒劑=20mM磷酸緩衝液、130mM NaCl pH 6.0及0.005%聚山梨醇酯20 iv=靜脈內，ip=腹膜內
在給劑期結束時，將小鼠以異氟烷(isoflurane)深度麻醉。經小鼠以冰冷的0.9%食鹽水(120mL)經心臟灌注放掉血液，接著以60mL的4%多聚甲醛(PFA)灌注。收集脊髓及以4% PFA於4℃後固定24小時。於IHC自動染片機(Ventana Discovery Ultra,Roche,USA)上進行膽鹼乙醯移轉酶(ChAT)之免疫組織化學(IHC)。係以ScanScope XT(Leica Biosystems,USA)來捕捉整個切片的影像。
定量及分析在腰脊髓L3-L5中的ChAT陽性細胞。為了精確地計數神經元，從DAB(ImageScope,version 11,Leica Biosystem)分離蘇木素通道及然後僅採用覆蓋整個腹脊椎的DAB影像(10x)進行細胞定量。由獨立觀察者以單盲方式手動計算ChAT陽性MN神經元數目。為了排除偏差及確保一致性，係由另外的獨立審察者隨機檢查影像定量之質性。
ChAT免疫染色的腰脊髓(L3-L5)分析顯示，相較於媒劑治療的野生型小鼠，在媒劑治療的hSOD1-G93A基因轉殖小鼠中ChAT陽性神經元極明顯地減少(減少35%,p<0.0001)。這些數據顯示，相較於野生型小鼠，hSOD1-G93A小鼠脊髓中的運動神經元明顯退化。小鼠IgG1(172.6±31.10)和1G11治療組並未顯示優於媒劑之統計上顯著性(0.3mg/kg：169.1±17.25； 1mg/kg：160.1±28.12)。
序列表
SEQ ID NO：1 TrkB-ECD
SEQ ID NO：2 TrkB全長序列
SEQ ID NO：3 1G11和人源化1G11 CDR L1(Kabat,Chothia,AbM) RASQRISNNLH
SEQ ID NO：4 1G11和人源化1G11 CDR L2(Kabat,Chothia,AbM) YVSQSIS
SEQ ID NO：5 1G11和人源化1G11 CDR L3(Kabat,Chothia,AbM) QQSNSWPLT
SEQ ID NO：6 1G11和人源化1G11 CDR H1(Kabat) SYYIN
SEQ ID NO：7 1G11和人源化1G11 CDR H2(Kabat) RIAPGNTYYNEIFKG
SEQ ID NO：8 1G11和人源化1G11 CDR H3(Kabat,Chothia,AbM) RGYEGALDY
SEQ ID NO：9 3A3 CDR L1(Kabat) KSSQSLLYSGNQKNYLA
SEQ ID NO：10 3A3 CDR L2(Kabat) WASTRES
SEQ ID NO：11 3A3 CDR L3(Kabat) QQYYSYPYT
SEQ ID NO：12 3A3 CDR H1(Kabat) SYWMH
SEQ ID NO：13 3A3 CDR H2(Kabat) YINPSTGYTDYNQKFKD
SEQ ID NO：14 3A3 CDR H3(Kabat) SRAARY
SEQ ID NO：15 8E5 CDR L1(Kabat) RASSSVSSSYLH
SEQ ID NO：16 8E5 CDR L2(Kabat) STSNLAS
SEQ ID NO：17 8E5 CDR L3(Kabat) QQYSGYPLT
SEQ ID NO：18 8E5 CDR H1(Kabat) TYGMS
SEQ ID NO：19 8E5 CDR H2(Kabat) TVSTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO：20 8E5 CDR H3(Kabat) GGYSFAY
SEQ ID NO：21 5D11 CDR L1(Kabat) RASQSVSTSFYSYMH
SEQ ID NO：22 5D11 CDR L2(Kabat) YASNLQS
SEQ ID NO：23 5D11 CDR L3(Kabat) QHSWEIPWT
SEQ ID NO：24 5D11 CDR H1(Kabat) NYLIE
SEQ ID NO：25 5D11 CDR H2(Kabat) VINPGSGGTNYNDKFKG
SEQ ID NO：26 5D11 CDR H3(Kabat) GGNDYGDY
SEQ ID NO：27 1G11 HC
SEQ ID NO：28 1G11 LC
SEQ ID NO：29 3A3 HC
SEQ ID NO：30 3A3 LC
SEQ ID NO：31 8E5 HC
SEQ ID NO：32 8E5 LC
SEQ ID NO：33 5D11 HC
SEO ID NO：34 5D11 LC
SEQ ID NO：35 D1-D3區刪除變體C32-L196
SEQ ID NO：36 D4-D5-JM區刪除變體P197-H430
SEQ ID NO：37 D5區刪除變體H284-H430
SEQ ID NO：38 1G11嵌合的Fab1[來自1G11之可變區(VH)與來自人類IgG1之恆定區(CH1)融合]
SEQ ID NO：39 1G11嵌合的Fab1[來自1G11之可變區(VL)與來自人類 IgG1之恆定區(CL1)融合]
SEQ ID NO：40人源化1G11 VH
SEQ ID NO：41人源化1G11 VL
SEQ ID NO：42人源化1G11 HC
SEQ ID NO：43人源化1G11 LC
SEQ ID NO：44編碼人源化1G11 HC之DNA
SEQ ID NO：45編碼人源化1G11 LC之DNA
SEQ ID NO：46人源化3A3 VH
SEQ ID NO：47人源化3A3 VL
SEQ ID NO：48人源化3A3 HC
SEQ ID NO：49人源化3A3 LC
SEQ ID NO：50編碼人源化3A3 HC之DNA
SEQ ID NO：51編碼人源化3A3 LC之DNA
SEQ ID NO：52人源化5D11 VH
SEQ ID NO：53人源化5D11 VL
SEQ ID NO：54人源化5D11 HC
SEQ ID NO：55人源化5D11 LC
SEQ ID NO：56編碼人源化5D11 HC之DNA
SEQ ID NO：57編碼人源化5D11 LC之DNA
SEQ ID NO：58 1G11和人源化1G11 CDRH1(Chothia) GYTFTSY
SEQ ID NO：59 1G11和人源化1G11 CDRH2(Chothia) APGN
SEQ ID NO：60 1G11和人源化1G11 CDRH1(AbM) GYTFTSYYIN
SEQ ID NO：61 1G11和人源化1G11 CDRH2(AbM) RIAPGNTY
SEQ ID NO：62 1G11和人源化1G11 CDRH1(Contact) TSYYIN
SEQ ID NO：63 1G11 CDRH2(Contact) CIGRIAPGNTY
SEQ ID NO：64人源化1G11 CDRH2(Contact) SMGRIAPGNTY
SEQ ID NO：65 1G11和人源化1G11 CDRH3(Contact) ARRGYEGALD
SEQ ID NO：66 1G11和人源化1G11 CDRL1(Contact) SNNLHWY
SEQ ID NO：67 1G11和人源化1G11 CDRL2(Contact) LLIKYVSQSI
SEQ ID NO：68 1G11和人源化1G11 CDRL3(Contact) QQSNSWPL
SEQ ID NO：69 DGANPNYPDVIYEDYGTAAN
SEQ ID NO：70 NPNYPDVIYEDYGT
SEQ ID NO：71 HFAPTITFLESP
SEQ ID NO：72來自283-291之TRKB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽GHFAPTITF
SEQ ID NO：73來自284-291之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽HFAPTITF
SEQ ID NO：74來自292-316之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽LESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQ
SEQ ID NO：75來自316-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽QWFYNGAIL
SEQ ID NO：76來自317-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽 WFYNGAIL
SEQ ID NO：77來自318-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽FYNGAIL
SEQ ID NO：78來自347-361之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽QLDNPTHMNNGDYTL
SEQ ID NO：79來自349-358之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽DNPTHMNNGD
SEQ ID NO：80來自351-368之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽peptide from PTHMNNGDYTLLAKNEYG
SEQ ID NO：81來自363-378之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽AKNEYGKDEKQISAHF
SEQ ID NO：82來自377-395之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽HFMGWPGIDDGANPNYPDV
SEQ ID NO：83來自379-385之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽MGWPGID
SEQ ID NO：84來自379-395之 TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽MGWPGIDDGANPNYPDV
SEQ ID NO：85來自379-396之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽MGWPGIDDGANPNYPDVI
SEQ ID NO：86來自379-397之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽MGWPGIDDGANPNYPDVIY
SEQ ID NO：87來自379-398之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽MGWPGIDDGANPNYPDVIYE
SEQ ID NO：88來自418-435 TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜肽PSTDVTDKTGREHHHHHH
<110> GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited
<120> 用於治療神經及其他疾病之結合激動劑
<130> PB65743
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人類TrkB-胞外區
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<212> PRT
<213> 人類
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L2(Kabat,Chothia,AbM)
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L2(Kabat,Chothia,AbM)
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR L3(Kabat,Chothia,AbM)
<400> 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H1(Kabat)
<400> 6
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H2(Kabat)
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDR H3(Kabat,Chothia,AbM)
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR L1 (Kabat)
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR L2 (Kabat)
<400> 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR L3 (Kabat)
<400> 11
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR H1 (Kabat)
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR H2 (Kabat)
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 3A3 CDR H3 (Kabat)
<400> 14
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR L1 (Kabat)
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR L2 (Kabat)
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR L3 (Kabat)
<400> 17
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR H1 (Kabat)
<400> 18
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR H2 (Kabat)
<400> 19
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 8E5 CDR H3 (Kabat)
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR L1 (Kabat)
<400> 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR L2 (Kabat)
<400> 22
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR L3 (Kabat)
<400> 23
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR H1 (Kabat)
<400> 24
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR H2 (Kabat)
<400> 25
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 5D11 CDR H3 (Kabat)
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<211> 440
<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 31
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<211> 215
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
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<220>
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<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人類TrkB D4-D5-JM區刪除變體P197-H430
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人類TrkB D5區刪除變體H284-H430
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<211> 221
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11嵌合的Fab1[來自1G11之可變區(VH)與 來自人類IgG1之恆定區(CH1)融合]
<400> 38
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11嵌合的Fab1[[來自1G11之可變區(VL)與 來自人類IgG1之恆定區(CL1)融合]
<400> 39
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化1G11 VH
<400> 40
<210> 41
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化1G11 VL
<400> 41
<210> 42
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化1G11重鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化1G11輕鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化1G11重鏈之DNA
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<210> 45
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化1G11輕鏈之DNA
<400> 45
<210> 46
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化3A3 VH
<400> 46
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化3A3 VL
<400> 47
<210> 48
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化3A3 HC
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<211> 220
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化3A3 LC
<400> 49
<210> 50
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化3A3 HC之DNA
<400> 50
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<211> 660
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化3A3 LC之DNA
<400> 51
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化5D11 VH
<400> 52
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化5D11 VL
<400> 53
<210> 54
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化5D11重鏈
<400> 54
<210> 55
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化5D11輕鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化5D11重鏈之DNA
<400> 56
<210> 57
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 編碼人源化5D11輕鏈之DNA
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1(Chothia)
<400> 58
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH2(Chothia)
<400> 59
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1(AbM)
<400> 60
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH2(AbM)
<400> 61
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH1(Contact)
<400> 62
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11 CDRH2(Contact)
<400> 63
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化1G11 CDRH2(Contact)
<400> 64
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRH3
<400> 65
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL1(Contact)
<400> 66
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL2(Contact)
<400> 67
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1G11和人源化1G11 CDRL3(Contact)
<400> 68
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 衍生自人類TrkB之胜？
<400> 69
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 衍生自人類TrkB之胜？
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 衍生自人類TrkB之胜？
<400> 71
<210> 72
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自283-291之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 72
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自284-291之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<213> 人工的
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<223> 來自292-316之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<223> 來自316-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 75
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<212> PRT
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<223> 來自317-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自318-324之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<223> 來自347-361之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<223> 來自349-358之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<223> 來自351-368之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<213> 人工的
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<223> 來自363-378之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 81
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<223> 來自377-395之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 82
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自379-385之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 來自379-395之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<212> PRT
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<223> 來自379-396之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
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<223> 來自379-397之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 86
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自379-398之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 87
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 來自418-435之TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His胜？
<400> 88

Claims (53)

  1. 一種TrkB結合激動劑，其中該激動劑係加強BDNF-引發的及/或NT-4引發的TrkB致效作用。
  2. 一種TrkB結合激動劑，其係維持細胞表面之TrkB量。
  3. 一種TrkB結合激動劑，其係與包括在TrkB之D5區的β摺板A和G內、及β摺板A和A’間的區域內的表位結合。
  4. 一種TrkB結合激動劑，其係：a)與一或多個下列人類TrkB之殘基相互作用：Thr290、Glu293、Ser294、Asp358、Ser375、Lys372、Gln373和Glu341；b)與由下列組成之群中選出的人類TrkB殘基相距少於或等於4.5Å：T288、I289、T290、F291、L292、E293、S294、K308、D358、E371、K372、Q373、I374和S375；c)與人類TrkB胞外區結合，其中一選自下列之群的殘基：E210、F285、T288、T290、F291、E293、D370和K372(根據全長的人類TrkB編號)係經突變，其相較於不具有突變的人類TrkB係帶有改變的親和力；d)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基284-291(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性；或e)與具有SEQ ID NO：71中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
  5. 一種TrkB結合激動劑，其係與包括在TrkB之近膜區(juxta-membrane region)(W381-H430)內的表位結合。
  6. 一種TrkB結合激動劑，其係：a)與人類TrkB胞外區結合，其中一個選自下列之群的殘基：N389、D394、V395、I396、Y397、E398、D399、Y400和T402係經突變， 其相較於不具有突變的人類TrkB胞外區係帶有改變的親和力；b)與人類TrkB結合並造成含有部份或整個來自殘基385-398(根據全長的人類TrkB編號)序列之衍生自人類TrkB的胜肽，其相較於衍生自非複合性人類TrkB之對應的胜肽，對氘併入更具抗性；或c)與具有SEQ ID NO：69中所述之胺基酸序列的胜肽結合。
  7. 一種TrkB結合激動劑，其係與一參照抗體競爭和TrkB結合，該參照抗體係具有：(a)SEQ ID NO：27之重鏈序列和SEQ ID NO：28之輕鏈序列；或(b)SEQ ID NO：29之重鏈序列和SEQ ID NO：30之輕鏈序列；或(c)SEQ ID NO：31之重鏈序列和SEQ ID NO：32之輕鏈序列。
  8. 一種TrkB結合激動劑，其係包括：(a)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(c)如SEQ ID NO：27或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  9. 根據請求項8之TrkB結合激動劑，其係包括：(a)如SEQ ID NO：3或其變體中所示之CDRL1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：5或其變體中所示之CDRL3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(c)如SEQ ID NO：8或其變體中所示之CDRH3，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  10. 根據請求項8或9之TrkB結合激動劑，其中CDRL1內的修飾不在殘 基R28、S30和N32(編號來自SEQ ID NO：28)中，其中CDRL3內的修飾不在殘基N92和S93(編號來自SEQ ID NO：28)中，及其中CDRH3內的修飾不在殘基R97、Y99和E100(編號來自SEQ ID NO：27)中。
  11. 根據請求項10之TrkB結合激動劑，其中該CDRL1內的修飾不在殘基I29中。
  12. 根據請求項10之TrkB結合激動劑，其中該CDRL1內的修飾不在殘基N31中。
  13. 根據請求項10之TrkB結合激動劑，其中該CDRL3內的修飾不在殘基S91和W94中。
  14. 根據請求項9之TrkB結合激動劑，其係包括：(a)如SEQ ID NO：3所示之CDRL1；(b)如SEQ ID NO：5所示之CDRL3；及(c)如SEQ ID NO：8所示之CDRH3。
  15. 根據請求項8至14任一項中之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑另外係包括如SEQ ID NO：27或其變體，或SEQ ID NO：40或其變體中所示之CDRH2，其中該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  16. 根據請求項15之TrkB結合激動劑，其中CDRH2係如SEQ ID NO：7或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  17. 根據請求項15或16之TrkB結合激動劑，其中CDRH2內的修飾係不在殘基R50中(編號來自SEQ ID NO：27)。
  18. 根據請求項17之TrkB結合激動劑，其中該CDRH2內的修飾不在殘基Y57中(編號來自SEQ ID NO：27)。
  19. 根據請求項16之TrkB結合激動劑，其中CDRH2係如SEQ ID NO：7中所示。
  20. 根據請求項8至19任一項中之TrkB結合激動劑，其中該結合激動劑另外係包括：(a)如SEQ ID NO：28或其變體中所示之CDRL2，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；(b)如SEQ ID NO：27或其變體中所示之CDRH1，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  21. 根據請求項20之TrkB結合激動劑，其中：(a)CDRL2係如SEQ ID NO：4或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾；及(b)CDRH1係如SEQ ID NO：6或其變體中所示，該變體係具有1、2或3個胺基酸修飾。
  22. 根據請求項20或21之TrkB結合激動劑，其中該CDRL2內的修飾係不在殘基Y50中(編號來自SEQ ID NO：28)，且其中該CDRH1內的修飾係不在殘基Y33中(編號來自SEQ ID NO：27)。
  23. 根據請求項20或21之TrkB結合激動劑，其中該CDRH1內的修飾係不在殘基S31中(編號來自SEQ ID NO：27)。
  24. 根據請求項21之TrkB結合激動劑，其中：(a)CDRL2係如SEQ ID NO：4中所示；及(b)CDRH1係如SEQ ID NO：6中所示。
  25. 一種TrkB結合激動劑，其係包括一包含與SEQ ID NO：40序列至少80%相同之序列的VH區及/或一包含與SEQ ID NO：41序列至少76%相同之序列的VL區。
  26. 一種TrkB結合激動劑，其係包括：(a)與SEQ ID NO：42至少90%相同的重鏈(HC)序列；及/或 (b)與SEQ ID NO：43至少85%相同的輕鏈(LC)序列。
  27. 根據請求項25或26之TrkB結合激動劑，其中相當於SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42之位置47為Cys、Ser、Gly、Ala、Val、Thr或Asn。
  28. 根據請求項25至27中任一項之TrkB結合激動劑，其中該CDR序列係如請求項8至24任一項中所定義。
  29. 根據請求項25至27中任一項之TrkB結合激動劑，其中該CDR係如請求項8至24中任一項所定義且該相同性百分比係以排除CDR的序列為基準所計算。
  30. 根據請求項25之TrkB結合激動劑，其係包括：(a)SEQ ID NO：40之VH區；及/或(b)SEQ ID NO：41之VL。
  31. 根據請求項26之TrkB結合激動劑，其係包括：(a)SEQ ID NO：42之重鏈(HC)序列；及/或(b)SEQ ID NO：43之輕鏈(LC)序列。
  32. 根據請求項2至31中任一項之TrkB結合激動劑，其不會與BDNF及/或NT-4競爭和TrkB結合。
  33. 根據請求項3至31中任一項之TrkB結合激動劑，其中該激動劑係加強BDNF-引發的及/或NT-4引發的TrkB致效作用。
  34. 根據請求項1或33之TrkB結合激動劑，其中加強BDNF-引發的及/或NT-4引發的TrkB致效作用係藉由在飽和濃度BDNF或NT-4存在下，相較於無TrkB結合激動劑，在TrkB結合激動劑的存在下之增加的TrkB活化所測量。
  35. 根據請求項34之TrkB結合激動劑，其中該增加的TrkB活化係藉由 增加的TrkB磷酸化量所測量。
  36. 根據請求項35之TrkB結合激動劑，其中在飽和濃度BDNF或NT-4存在下，TrkB的磷酸化量在無TrkB結合激動劑下為100%，相較於在TrkB結合激動劑的存在下為至少110%，至少115%，至少120%，至少125%，至少130%，至少135%，至少140%，至少145%或至少150%。
  37. 根據請求項1或請求項3至36中任一項之TrkB結合激動劑，其係維持細胞表面上之TrkB量。
  38. 根據任何前述請求項之TrkB結合激動劑，其顯示在人類和獼猴TrkB之磷酸化上EC50係具有低於或等於5倍差異。
  39. 一或多種核酸序列，其係編碼如任何前述請求項所定義之TrkB結合激動劑。
  40. 一或多種編碼根據請求項39之TrkB結合激動劑的核酸序列，其係包括編碼一重鏈之SEQ ID NO：44；及/或編碼一輕鏈之SEQ ID NO：45。
  41. 一或多種表現載體，其係包括一或多種如請求項39或40中所定義之核酸序列。
  42. 一種重組的宿主細胞，其係包括一或多種如請求項39或40中所定義之核酸序列，或一或多種如請求項41中所定義之表現載體。
  43. 一種製造如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑之方法，該方法係包括於適合表現該核酸序列或載體的條件下培養如請求項42中所定義之宿主細胞。
  44. 一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑及醫藥上可接受載劑、賦形劑或稀釋劑的一種或組合。
  45. 如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或如請求項44所定義之醫藥組成物，係用於治療。
  46. 如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或如請求項44所定義之醫藥組成物，係用於治療神經病症。
  47. 如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑，或如請求項44所定義之醫藥組成物，係用於治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症。
  48. 一種如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑之用途，係用於製造如請求項44所定義之醫藥組成物，供治療神經病症。
  49. 一種如請求項1至38中任一項所定義之TrkB結合激動劑之用途，係用於製造如請求項44所定義之醫藥組成物，供治療治療神經病症或其中藉由活化TrkB來恢復或促進BDNF-TrkB路徑可能為有利的其他病症。
  50. 根據請求項46或47之所述用途之TrkB結合激動劑或根據請求項48或49之用途，其中該病症為：神經退化疾病、視神經病變、視網膜退化症狀、涉及聽力喪失病症、精神病學病症、神經發展病症、體重調節之病症、肌肉病症和另外的CNS病症。
  51. 一種根據請求項50之所述用途之TrkB之結合激動劑或用途，其中該病症為視神經病變。
  52. 一種根據請求項50之所述用途之TrkB結合激動劑或用途，其中該病症為：肌萎縮性側索硬化症(ALS)、亨丁頓舞蹈症(HD)、阿茲海默症(AD)、運動神經元疾病、帕金森氏症、朊毒體(prion)疾病、路易體疾病、脊肌萎縮、多系統萎縮、失智症和Tau蛋白病變、青光眼、前部視神經缺血性病變(AION)、後部缺血性視神經病變、放射性視神經病變、壓迫性視神經病變、粒線體視神經病變、毒性視神經病變、創傷性視神經病變、遺傳性視神經病變、視神經炎、老年性黃斑部退化、視網膜色素病變、神 經性耳聾、耳蝸耳聾、耳鳴、感覺神經性聽力喪失、混合性聽力喪失、焦慮、感情病症、憂鬱症、恐慌症、創傷後壓力症病症(PTSD)、注意力缺乏過動症(ADHD)、躁鬱症、精神分裂症、安格曼症候群(Angelman syndrome)、普拉德-威利症候群(Prader-Willi syndrome)、自閉症、雷特氏症候群、神經性厭食症、惡病質、不欲的體重減輕、肌少症、肥胖症、類鴉片引起的嘔吐、糖尿病神經病變、癲癇、多發性硬化症、偏頭痛、神經損傷、周圍神經病變、神經肌肉疾病、睡眠障礙及中風。
  53. 根據請求項46至52中任一項之所述用途之TrkB結合激動劑或用途，其中該治療係包括提升：細胞存活，及/或神經元修復，及/或神經元可塑性。
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