KR20180081522A - 신경계 및 다른 장애의 치료를 위한 결합 효능제 - Google Patents

신경계 및 다른 장애의 치료를 위한 결합 효능제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TrkB 결합 효능제, 및 신경계 장애 및 다른 장애의 치료에서의 이러한 효능제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CDR, 가변 영역, 중쇄 및 경쇄, 및 그의 변이체 서열을 포함하는 특정한 TrkB 결합 효능제에 관한 것이다.

Description

신경계 및 다른 장애의 치료를 위한 결합 효능제
본 발명은 TrkB 결합 효능제, 및 신경계 장애 및 다른 장애의 치료에서의 이러한 효능제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CDR, 가변 영역, 중쇄 및 경쇄, 및 그의 변이체 서열을 포함하는 특정한 TrkB 결합 효능제에 관한 것이다.
신경계 장애는 전세계적으로 발생률 및 유병률이 증가하고 있어, 요법이 절박하게 요구되고 있다. 그러나, 신경계 장애는 가족성 및 산발성 형태 둘 다에서 표현형상으로 이종성이며, 종종 알려지지 않은 병인을 갖는다. 따라서, 병리학적 메카니즘의 성질이 질환의 주요 "동인"이 아닌 한, 단일 병리학적 메카니즘을 표적화하는 것이 질환 변형을 제공할 가능성이 낮으면서 유의한 임상 이익을 갖는다.
신경독성 물질의 축적, 염증, 지질 대사, 산화성 스트레스, 자가포식, 단백질 분해 및 미토콘드리아 기능장애를 포함한, 여러 메카니즘 및 경로가 신경계 질환과 같은 신경계 장애에 연루되어 왔다. 그러나, 이들이 질환의 원인인지 또는 원발성 및/또는 속발성 상해의 결과인지는 여전히 불분명하다. 결과적으로, 이들 개별 메카니즘의 일부에 기반한 요법은 임상적으로 성공적이지 않았다. 뇌에서의 미스폴딩된 독성 단백질의 축적이 일부 신경변성 질환에 있어서 주요 발병 인자인 것으로 간주되는 것을 고려하여, 신경계 질환에 대한 질환-변형 요법을 개발하기 위한 많은 노력은 독소-감소 접근법을 따랐다. 그러나, 알츠하이머병에서의 Aβ와 같이 독성 단백질을 줄이는 것에 의한 임상적 성공은 제한적이었고, 그럼에도 불구하고 경도 질환을 갖는 환자에 대한 최근 시험은 고무적인 결과를 제시한다.
발병기전 (이환 상태로 이어지는 생물학적 메카니즘(들))의 표적화가 예방적 또는 방지적 치료를 위한 적합한 접근법일 수 있지만; 병리생리상태 (이환 상태 내에서 작동하는 내인성 생물학적 메카니즘)의 표적화는 이미 존재하는 신경계 장애에서의 치료적 개입을 위한 보다 우수한 접근법일 수 있다.
뉴런 생존, 기능, 가소성 및 항상성에 있어서 어떤 역할을 하는 내인성 신경영양 및 신경보호 경로를 표적화함으로써 이러한 대안적 병리생리학적 치료 접근법을 사용할 수 있다. 내인성 메카니즘이 신경계 장애에서 유의하게 하향 조절될 수 있음을 나타내는 증거가 있다.
뉴로트로핀은 중추 및 말초 신경계 (각각 CNS 및 PNS)의 발달, 유지 및 기능을 조절하는 내인성 성장 인자이다. 신경 성장 인자 (NGF) 패밀리의 리간드는 주로 고친화도 Trk 수용체 [NGF를 위한 TrkA, BDNF (뇌 유래 신경영양 인자) 및 NT-4 (뉴로트로핀 4, NT-4/5)를 위한 TrkB, NT-3 (뉴로트로핀 3)을 위한 TrkC]를 통해 및 또한 저친화도 pan-뉴로트로핀 수용체 p75NTR에 결합함으로써 신호전달한다. Trk 수용체를 통한 신호 전달은 통상적으로 세포 생존을 증강시키고, 반면 Trk 수용체의 부재 하에 p75NTR을 통한 뉴로트로핀의 신호전달은 일반적으로 아폽토시스를 가능하게 한다.
시험관내 및 생체내 둘 다에서 CNS 뉴런의 생존 및 기능을 촉진하는데 있어서의 BDNF-TrkB 경로의 역할을 지지하는 전임상 증거가 있다. 추가로, BDNF를 사용한 4차례의 임상 시험이 ALS에 대해 수행된 바 있다. 추가로, TrkB 효능제 항체를 피하 주사하는 건강한 지원자를 대상으로 한 상 I, 이중-맹검, 위약-대조 단일 상승 용량 연구 (임상 시험 NCT01262690, 스폰서: 화이자(Pfizer))는 감각 증상의 안전성 우려가 알려져 종료되었다 (연구 결과는 공개되지 않았음).
요약하면, TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 및 다른 장애의 치료가 여전히 필요하다.
본 발명은 TrkB의 BDNF-유도된 및/또는 NT-4-유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 TrkB의 D5 도메인의 베타 시트 A 및 G, 및 베타 시트 A와 A' 사이의 영역 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "에피토프"는 TrkB 결합 단백질과 접촉하는 항원 (TrkB)의 부분, 예를 들어 TrkB 결합 단백질에 4.5 Å 이하로 접근하는 TrkB의 부분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 TrkB 결합 효능제는 BDNF와 경쟁하지 않는다. TrkB의 이러한 영역에 결합하는 효능제는:
a) 인간 TrkB의 하기 잔기: Thr290, Glu293, Ser294, Asp358, Ser375, Lys372, Gln373, Glu341 중 1개 이상과 상호작용할 수 있거나;
b) T288, I289, T290, F291, L292, E293, S294, K308, D358, E371, K372, Q373, I374 및 S375로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TrkB로부터의 잔기에 4.5 Å 이하로 접근할 수 있거나;
c) 하기 군: E210, F285, T288, T290, F291, E293, D370 및 K372로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB와 비교하여 변경된 친화도로 결합할 수 있거나;
d) 인간 TrkB에 결합할 수 있고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 284-291 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
e) 서열식별번호: 71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 TrkB의 막근접 영역 (W381-H430) 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "에피토프"는 TrkB 결합 단백질과 접촉하는 항원 (TrkB)의 부분, 예를 들어 TrkB 결합 단백질에 4.5 Å 이하로 접근하는 TrkB의 부분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 TrkB 결합 효능제는 BDNF와 경쟁하지 않는다. 이러한 영역에 결합하는 효능제는:
a) 하기 군: N389, D394, V395, I396, Y397, E398, D399, Y400 및 T402로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하거나;
b) 인간 TrkB에 결합하고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 385-398 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
c) 서열식별번호: 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합한다.
본 발명은 또한 TrkB에의 결합을 위해 (a) 서열식별번호: 27의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 28의 경쇄 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 30의 경쇄 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 31의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 32의 경쇄 서열을 갖는 참조 항체와 경쟁하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 TrkB 결합 효능제는 BDNF와 경쟁하지 않는다. 본 발명은 또한 세포 표면 상의 TrkB의 수준을 유지하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 효능제는 BDNF의 부재 하에 TrkB를 활성화시킨다.
본 발명은 또한 (i) 서열식별번호: 27로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 28로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 CDR 중 어느 하나 또는 그의 조합; 또는 (ii) (i)의 CDR 변이체로서, 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 특정한 CDR은 서열식별번호: 27 또는 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같고, 반면 다른 CDR은 서열식별번호: 27 또는 서열식별번호: 28에 존재하는 것들의 변이체이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다:
(a) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(b) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
(c) 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
본 발명은 또한 하기 CDR: (a) 서열식별번호: 6의 CDRH1; (b) 서열식별번호: 7의 CDRH2; (c) 서열식별번호: 8의 CDRH3; (d) 서열식별번호: 3의 CDRL1; (e) 서열식별번호: 4의 CDRL2; 및/또는 (f) 서열식별번호: 5의 CDRL3 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 서열식별번호: 40의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열식별번호: 41의 서열과 적어도 76% 동일한 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 서열식별번호: 42와 적어도 90% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 (b) 서열식별번호: 43과 적어도 85% 동일한 경쇄 (LC) 서열을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 핵산 서열을 포함하는 1개 이상의 발현 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 핵산 서열 또는 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열 또는 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제의 생산 방법으로서, 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 상기 핵산 서열 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 발현되고 정제된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 결합 효능제, 및 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 중 하나 또는 그의 조합을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 치료를 필요로 하는 대상체에게, 또는 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 신경계 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 치료를 필요로 하는 대상체에게, 또는 치료 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제의 치료 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 신경계 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제의 치료 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 신경계 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제를 제공한다.
본 발명은 또한 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료에 사용하기 위한 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제를 제공한다.
본 발명은 또한 신경계 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 신경계 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 치료가 세포 생존 및/또는 뉴런 복구 및/또는 뉴런 가소성의 증강을 포함하는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법, TrkB 결합 효능제 또는 용도를 제공한다.
도 1a: 시간 경과에 따른 래트 피질 뉴런에서의 BDNF 및 1G11 유도된 TrkB 인산화 및 TrkB 하류 신호전달 및 TrkB의 세포 표면 수준의 웨스턴 블롯. 배양물 (시험관내에서 7일) 중의 래트 피질 뉴런을 37℃에서 나타낸 바와 같이 0.8 nM BDNF 또는 7.3 nM 1G11로 처리하였다. 세포 용해물 (30 μg 단백질)을 환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에서 용해시키고, 나타낸 바와 같이 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)를 내부 대조군으로서 사용하였다. TrkB의 세포 표면 수준을 측정하기 위해, 1G11 처리 후의 래트 피질 뉴런을 빙상에서 1시간 동안 술포-NHS-비오틴으로 처리한 다음, 용해시키고, 스트렙타비딘 아가로스 비드를 사용하여 비오티닐화된 단백질을 단리하였다. 단리된 단백질을 용해시키고, 항-TrkB 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 주: Ctrl, 배지 변화가 있는 비처리된 0시간 대조군.
도 1b: 시간 경과에 따른 총 세포 TrkB에 대한 비율로서의 TrkB의 BDNF 및 1G11 유도된 세포 표면 수준. 배양물 (시험관내에서 7일) 중의 래트 피질 뉴런을 37℃에서 나타낸 바와 같이 0.8 nM BDNF 또는 7.3 nM 1G11로 처리하였다. 총 TrkB와 비교된 TrkB의 상대 표면 수준을 밀도측정 분석에 의해 결정하였다. 표면 TrkB 대 총 TrkB의 비가 0 시점에서의 비처리된 대조군과 비교하여 배수 변화로서 제시되어 있다.
도 2: 상이한 특성을 갖는 TrkB 효능제 항체를 제시하는 대표적인 데이터 - 강화제 및 비-경쟁자 (3A3, 1G11, 8E5), 경쟁자 (5D11), 비-경쟁자 (2A1, 3A4, 5C7). 100% 활성은 포화 농도의 BDNF, 즉 10nM EC100에서의 TrkB 활성화를 나타낸다.
도 3: 공개된 구조에 기초한, 다양한 2차 구조 (베타 시트, 루프, N-말단 "Nt" 및 C-말단 "Ct")를 제시하는 BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 사이의 구조적 상호작용.
도 4: BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 및 1G11 사이의 구조적 상호작용. 알라닌 스캐닝에 의해 확인된 잔기는 도 4a에 제시되어 있고, 공-결정 X선 결정학에 의해 확인된 잔기는 도 4b에 제시되어 있다.
도 5: BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 및 1G11의 추가의 구조적 분석은 NT-4/BDNF의 N-말단이 잠재적으로 TrkB와 1G11 Fab의 중쇄 사이의 공간으로 돌출됨을 제시한다.
도 6: BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 및 1G11의 구조적 분석에 대한 분자 표면의 부가는 Vκ CDR L1 및 L3, 및 CDRH3이 TrkB와 밀접하게 상호작용하고, TrkB와 CDR H1 및 H2 사이에 간극이 있으며, 이는 잠재적으로 BDNF의 N-말단을 수용하는 것으로 고려될 수 있음을 제시한다.
도 7: BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 및 3A3 사이의 구조적 상호작용. 알라닌 스캐닝에 의해 확인된 잔기가 제시되어 있으며, 이들은 모두 JM 영역 (D5 도메인에 대해 C-말단이고 막횡단 영역에 대해 N-말단)에 존재한다. JM 잔기는 베타-가닥 기하구조를 사용하여 연장되었다.
도 8: BDNF/NT-4 동종이량체 및 2개의 TrkB D5 도메인 및 5D11 사이의 구조적 상호작용. 알라닌 스캐닝에 의해 확인된 잔기가 제시되어 있으며, 이들은 리간드 결합 부위에 존재한다.
도 9는 단독으로 또는 1G11과의 복합체로 MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His로부터 유래된 TrkB 펩티드 사이의 중수소 업데이트에서의 분율 차이를 제시한다.
도 10은 단독으로 또는 3A3과의 복합체로 MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His로부터 유래된 TrkB 펩티드 사이의 중수소 업데이트에서의 분율 차이를 제시한다.
본원에 사용된 "TrkB"는 자연 발생하는, 내인성 또는 재조합 TrkB 단백질을 지칭한다. TrkB는 리간드 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 또는 뉴로트로핀 - 4 (NT-4 / NT-4/5)를 위한 수용체이다. BDNF 및 NT-4는 둘 다 TrkB에 결합할 수 있으며, 많은 공통적인 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 비-공유 동종이량체 리간드 BDNF 또는 NT-4는 수용체 티로신 키나제인 TrkB를 활성화시킨다. 활성화된 TrkB는 (a) 세포 생존, (b) 뉴런 복구 및/또는 (c) 뉴런 가소성을 조절할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, TrkB-BDNF 신호전달은 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)에서 세포의 생존, 복구 및 가소성을 촉진하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 대부분의 신경계 장애에서의 원인 인자/메카니즘이 상이하지만, 변성을 겪을 수 있는 상이한 유형의 세포의 생존 및 기능은 효율적인 BDNF-TrkB 신호전달 메카니즘에 의존한다. 따라서, 효능제를 사용하여 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것은 세포 생존, 뉴런 복구 및 뉴런 가소성을 촉진하여, 장애에 대한 차별화된 치료를 제공할 것으로 예상된다. TrkB의 활성화는 중추 및 말초 작용 메카니즘을 둘 다 매개할 수 있다.
BDNF 수준은 많은 신경계 및 병리생리학적 질환에서 감소되는 것으로 보고된 바 있으며, 표현형/결손이 이러한 감소에 기인할 수 있다. TrkB 수용체 수준이 변경 없이 유지되는 BDNF 결손 병리생리학적 병태 하에, 투여되는 치료제가 (i) TrkB를 활성화시킬 수 있고/거나 (효능작용), (ii) 감소된 수준의 BDNF와 경쟁하지 않을 수 있고/거나, (iii) 감소된 생리학적 수준의 BDNF에 의해 유도된 세포 신호전달을 강화할 수 있고/거나, (iv) 그렇지 않으면 잠재적으로 치료제에 대한 일시적 탈감작을 야기할 수 있는, TrkB의 세포 표면 수준을 유지할 수 있다면, 생리학적 세포/전신 반응이 여전히 도출될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "TrkB 결합 효능제"는 BDNF 또는 NT-4의 부재 하에 인간 전장 TrkB (서열식별번호: 2에 기재된 서열을 가짐)에 대해 효능작용하거나 또는 그를 활성화시키는 분자를 지칭한다. TrkB 결합 효능제는 수용체에 결합 시 천연 리간드 BDNF/NT-4와 유사한 생물학적 효과를 발생시킬 수 있다. TrkB는 수용체 티로신 키나제이며, 따라서 다수의 세포 신호전달 경로를 도출한다. TrkB의 증가된 인산화 수준 (pTrkB), Akt의 증가된 인산화 수준 (p-Akt), Erk의 증가된 인산화 수준 (p-Erk), 및/또는 Creb의 증가된 인산화 수준 (p-Creb)을 측정하는 것을 포함하여, TrkB의 활성화에 의해 효능작용이 측정될 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 BDNF 또는 NT-4의 부재 하에 TrkB 수용체를 활성화시켜, BDNF 최대 반응 (100%로 설정됨) 대비 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60%의 pTrkB 수준을 야기할 수 있다. 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 BDNF 또는 NT-4의 부재 하에 TrkB 수용체를 활성화시켜, NT-4 최대 반응 (100%로 설정됨) 대비 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60%의 pTrkB 수준을 야기할 수 있다.
친화도는 단일 결합 부위에서의 하나의 분자, 예를 들어 TrkB 결합 효능제의 또 다른 분자, 예를 들어 그의 표적 항원에 대한 결합 강도이다. TrkB 결합 효능제의 TrkB에 대한 결합 친화도는 평형 방법 (예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)) 또는 동역학법 (예를 들어 비아코어(BIACORE)™ 분석)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1.1 (및 표 1의 데이터)에 기재된 비아코어™ 방법이 결합 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 TrkB 결합 효능제는 인간 TrkB 또는 인간 TrkB ECD에 대해 100 nM 이하, 50nM 이하, 25nM 이하, 또는 10 nM 이하의 평형 해리 상수 (KD)를 나타낸다. KD 수치가 작을수록, 결합은 더 강하다. KD의 역수 (즉 1/KD)는 M-1 단위를 갖는 평형 회합 상수 (KA)이다. 통상의 기술자라면 KA 수치가 클수록, 결합이 더 강함을 인지할 것이다. 해리 속도 상수 (kd) 또는 "koff"는 TrkB 결합 효능제 : TrkB 복합체의 안정성, 즉 초당 붕괴되는 복합체의 분율을 기재한다. 예를 들어, 특정 TrkB 효능제와 인간 TrkB 또는 인간 TrkB ECD 사이의 해리 속도 상수 koff는 10x10-4/s 이하, 9x10-4/s 이하, 8x10-4/s 이하, 7x10-4/s 이하, 6x10-4/s 이하, 5x10-4/s 이하, 또는 4x10-4/s 이하이다. 회합 속도 상수 (ka) 또는 "kon"은 TrkB 결합 효능제 : TrkB 복합체의 형성 속도를 기재한다. 예를 들어, 특정 TrkB 효능제와 인간 TrkB 또는 인간 TrkB ECD 사이의 회합 속도 상수 kon은 3x104/Ms 이상, 4x104/Ms 이상, 5x104/Ms 이상, 6x104/Ms 이상, 또는 7x104/Ms 이상이다.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 전장 인간 TrkB에 특이적으로 결합하며, 인간 TrkA 또는 인간 TrkC 또는 인간 p75NTR에는 결합하지 않는다. 용어 "특이적으로 결합한다"는 TrkB 결합 효능제가 다른 (예를 들어, 관련되지 않은) 단백질에의 결합을 전혀 갖지 않거나 또는 유의하지 않게 가지면서 TrkB에 결합함을 의미한다. 본원에 기재된 TrkB 결합 효능제는 이들이 TrkA, TrkC 및/또는 p75NTR에 결합하는 것보다 적어도 10, 25, 50, 100 또는 1000배 더 큰 친화도로 TrkB에 결합할 수 있다. 이로 인해 이들 TrkB 결합 효능제가, TrkB 및 p75NTR (세포 사멸을 가능하게 함)을 둘 다 활성화시킬 수 있는 BDNF와 구별되는 것으로 인지될 것이다.
본 발명의 특정 TrkB 효능제는 BDNF-유도된 및/또는 NT-4-유도된 TrkB 효능작용을 강화한다. "강화한다"는 본원에서 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용 및/또는 NT-4-유도된 효능작용이 TrkB 효능제의 존재 하에 보다 효과적임을 의미하기 위해 사용된다. BDNF-유도된 효능작용은 TrkB의 활성화, 예를 들어 세포 신호전달을 평가함으로써 측정될 수 있다. BDNF 또는 NT-4의 포화 농도 (즉 EC100)는 TrkB 결합 효능제의 부재 하에 각각의 리간드에 대해 TrkB의 100% 활성화를 벤치마킹하는데 사용될 수 있다. BDNF-유도된 효능작용의 강화는 TrkB 결합 효능제 및 포화 농도 (EC100)의 BDNF의 존재 하에 100% 초과의 TrkB의 BDNF-유도된 활성화로서 정의될 수 있다. 사용가능한 BDNF의 포화 농도는 10nM (EC100)이다. 한 예에서, TrkB의 100% 활성화는 BDNF를 10nM EC100에서 사용하는 TrkB 활성화를 나타낸다. NT-4-유도된 효능작용의 강화는 TrkB 결합 효능제 및 포화 농도 (EC100)의 NT-4의 존재 하에 100% 초과의 TrkB의 NT-4-유도된 활성화로서 정의될 수 있다. TrkB의 활성화는 TrkB의 인산화의 수준 (pTrkB)을 결정함으로써 측정될 수 있다. 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 TrkB의 인산화는 TrkB 결합 효능제의 부재 하의 100%와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 존재 하에 적어도 110%일 수 있다. 예를 들어, 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 TrkB의 인산화는 TrkB 결합 효능제의 부재 하의 100%와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 존재 하에 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 또는 적어도 150%일 수 있다. pTrkB 수준은 TrkB 결합 효능제의 존재 하 및 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 약 130%일 수 있다. pTrkB 수준은 TrkB 결합 효능제의 존재 하 및 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 약 160%일 수 있다. pTrkB 수준은 TrkB 결합 효능제의 존재 하 및 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 약 120%일 수 있다.
강화 효과가 단지 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 시험관내에서 측정될 수 있지만, BDNF의 이러한 포화 농도는 임상 세팅에서 필수적인 것으로 생각되지는 않음을 주목하여야 한다. TrkB 결합 효능제의 강화 효과는 BDNF의 임의의 농도에서 존재하여야 하는 것으로 가정된다. TrkB 수용체 수준이 변경 없이 유지되는 BDNF 결손 병리생리학적 병태 하에, TrkB 결합 효능제가 감소된 생리학적 수준의 BDNF에 의해 유도된 세포 신호전달을 강화할 수 있다면, 생리학적 반응은 유익할 것이다.
본 발명의 특정 TrkB 효능제는 세포 표면 상의 TrkB 수준을 유지한다. 활성화된 티로신 키나제 수용체는 전형적으로 세포내이입에 이어 분해를 겪으면서, 세포 표면 수용체의 하향 조절을 야기하고, 이에 의해 세포 항상성을 유지하기 위해 리간드에 일시적으로 비-반응성이 되는데, 이것이 TrkB에 대한 BDNF의 활성화 효과이다. TrkB 결합 효능제는 효능제의 존재 하에 시간 경과에 따른 TrkB의 세포 표면 수준을 유지할 수 있다. 예를 들어, TrkB의 세포 표면 수준은 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 또는 적어도 10시간 동안 유지될 수 있다. TrkB 결합 효능제는 효능제의 존재 하에 시간 경과에 따른 TrkB의 세포 표면 수준을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, TrkB의 세포 표면 수준은 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 또는 적어도 25시간 동안 증강될 수 있다. TrkB 결합 효능제는 효능제에 의해 활성화될 TrkB의 이용가능한 세포 표면 수준을 증가시킬 수 있고/거나; (b) 활성화된 TrkB 수용체 세포내이입 및 분해를 억제할 수 있다. TrkB 수용체 수준이 변경 없이 유지되는 BDNF 결손 병리생리학적 병태 하에, 치료용 TrkB 결합 효능제가 그렇지 않으면 잠재적으로 TrkB 효능제에 대해 일시적 탈감작을 야기할 수 있는, TrkB의 세포 표면 수준을 변경시키지 않으면서 TrkB를 활성화시킬 수 있다면, 생리학적 반응은 유익할 것이다.
특정 TrkB 결합 효능제는 TrkB에의 결합을 위해 BDNF 및/또는 NT-4와 경쟁하지 않는다. TrkB 결합 효능제와 BDNF 또는 NT-4 사이의 경쟁은 TrkB의 활성화를 평가하기 위한 기능적 검정에 의해, 예를 들어 BDNF 또는 NT-4의 존재 및 부재 둘 다의 경우에서 TrkB에 대한 TrkB 결합 효능제의 활성화 효과를 TrkB 인산화에 의해 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, BDNF와 경쟁하지 않는 TrkB 결합 효능제는 포화 BDNF 농도 (예를 들어 10nM, EC100)의 존재 하에 효능제의 농도가 증가함에 따라 TrkB 인산화에서의 변화를 유발하지 않을 것이다. BDNF와 경쟁하는 TrkB 결합 효능제는 포화 BDNF 농도 (예를 들어 10nM, EC100)의 존재 하에 효능제의 농도가 증가함에 따라 감소된 TrkB 인산화를 유발할 것이다. 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 BDNF와 비-경쟁적이며, 여기서 효능제 및 포화 농도 (EC100) BDNF의 존재 하의 인산화된 TrkB의 총 수준은 단독으로 포화 농도의 BDNF의 존재 하의 인산화된 TrkB의 수준과 유사한데, 즉 총 pTrkB (EC100BDNF + 효능제)
Figure pct00001
총 pTrkB (EC100BDNF)이다. 유사하게, 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 NT-4와 비-경쟁적이며, 여기서 효능제 및 포화 농도 (EC100) NT-4의 존재 하의 인산화된 TrkB의 총 수준은 단독으로 포화 농도의 NT-4의 존재 하의 인산화된 TrkB의 수준과 유사한데, 즉 총 pTrkB (EC100NT-4 + 효능제)
Figure pct00002
총 pTrkB (EC100NT-4)이다. 인산화된 TrkB의 수준은, 효능제 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB가 어떤 범위 (포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB ± 3 표준 편차) 내에 있는 경우에 유사한 것으로 간주된다. 한 실시양태에서, 효능제 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB는 어떤 범위 (포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB ± 2 표준 편차) 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 효능제 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB는 어떤 범위 (포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB ± 1 표준 편차) 내에 있다. 상기 실시양태에서, 인산화된 pTrkB의 평균 총 수준은 적어도 3개의 판독치에 기초하여 계산되며, 2개의 표준 편차 (즉 효능제의 존재 하에 계산된 표준 편차 및 효능제의 부재 하에 계산된 표준 편차) 중 보다 큰 것이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 인산화된 TrkB의 수준은, 효능제 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB가 10% 미만의 차이가 있는 경우에 유사한 것으로 간주된다. 또 다른 실시양태에서, 인산화된 TrkB의 수준은, 효능제 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB 및 포화 수준의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 측정된 평균 총 pTrkB가 5% 미만의 차이가 있는 경우에 유사한 것으로 간주된다. TrkB에의 결합을 위해 BDNF 또는 NT-4와 경쟁하지 않는 TrkB 결합 효능제는, TrkB 효능제가 TrkB를 활성화시키며 감소된 수준의 BDNF (또는 NT-4)와 경쟁하지 않을 수 있기 때문에, 임상 세팅에서 유익하다. 따라서, BDNF 및 NT-4는 TrkB 결합 효능제에 추가하여, 생리학적 역할을 계속해서 할 수 있다.
대안적으로, TrkB 결합 효능제와 BDNF 또는 NT-4 사이의 경쟁은 TrkB 결합 효능제 및 BDNF가 동일하거나 또는 중복되는 에피토프에 결합하는지, 결합의 입체적 억제가 존재하는지, 또는 제1 분자의 결합이 제2 분자의 결합을 방지하거나 또는 감소시키는 TrkB에서의 입체형태적 변화를 유도하는지를 시험하기 위해 설계된 경쟁 ELISA, FMAT 또는 비아코어 검정에 의해 결정될 수 있다. TrkB에의 결합을 위한 TrkB 결합 효능제와 BDNF 또는 NT-4 사이의 경쟁은 없거나 또는 최소 (즉 부분적)일 수 있다. 한 실시양태에서, TrkB-ECD를 칩 표면 상에 고정화시키고, BDNF 또는 NT-4를 유동 셀에 주입할 수 있다. 이어서, TrkB 결합 효능제를 주입하고, BDNF 또는 NT-4의 존재 하에 TrkB-ECD에 대한 그의 결합 능력을 평가하였다. 경쟁은 하기와 같이 분류될 수 있다: TrkB 효능제의 20% 미만의 결합은 "없음"; TrkB 효능제의 20-60% 결합은 "부분적"; 및 TrkB 효능제의 60% 초과의 결합은 "있음".
본 발명의 특정 TrkB 결합 효능제는 인간 TrkB와 또 다른 종으로부터의 TrkB 사이에 교차-반응성을 제시할 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 인간, 뮤린, 래트 및 시노몰구스 TrkB에 특이적으로 결합한다. 약물 개발은 전형적으로 약물을 인간에서 시험하기 전에 마우스 시스템에서의 선두 약물 후보의 시험을 요구하기 때문에, 이는 특히 유용하다. 인간, 뮤린, 래트 및 시노몰구스 종에 결합할 수 있는 약물의 제공은 동일한 약물을 사용하여 이들 시스템에서 결과를 시험하고 데이터의 병치 비교를 실시할 수 있도록 한다. 이는 예를 들어 마우스 TrkB에 대해 작용하는 약물 및 인간 TrkB에 대해 작용하는 별개의 약물을 찾아야 하는 필요성의 문제를 피하고, 또한 비-동일 약물을 사용하여 결과를 비교해야 하는 필요성을 피한다. 특정 TrkB 결합 효능제는 인간 및 래트 TrkB의 인산화에서 EC50의 5배 미만의 차이 또는 2배 미만의 차이를 나타낸다. 특정 TrkB 결합 효능제는 인간 및 마우스 TrkB의 인산화에서 EC50의 5배 미만의 차이 또는 2배 미만의 차이를 나타낸다. 특정 TrkB 결합 효능제는 인간 및 시노몰구스 TrkB의 인산화에서 EC50의 5배 미만의 차이 또는 2배 미만의 차이를 나타낸다. 한 실시양태에서, EC50 값은 적어도 3개의 실험의 평균이다.
TrkB 결합 효능제는 TrkB의 BDNF 결합 부위에 매우 근접해 있는, 특히 리간드의 N-말단에 결합하는 특이성 패치에 근접해 있는 TrkB 에피토프에 결합할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 TrkB에 결합하여 BDNF와 TrkB 사이의 결합을 추가로 증강 또는 안정화시킬 수 있다 (효능제:리간드:수용체의 삼량체 복합체). TrkB 결합 효능제는 BDNF와 비-경쟁적인 TrkB-BDNF 강화제일 수 있다. TrkB 결합 효능제는 TrkB의 D5 도메인 및/또는 TrkB의 막근접 (JM) 영역 내에 포함된 특이적 에피토프에 결합할 수 있고/거나; TrkB에의 결합을 위해 참조 항체와 경쟁할 수 있다. 이들 에피토프에의 결합이 활성 입체형태의 TrkB를 안정화시킬 수 있다. TrkB 효능제는 (a) TrkB의 이용가능한 세포 표면 수준을 증가시킬 수 있고/거나; (b) 활성화된 TrkB 수용체 세포내이입 및 분해를 억제할 수 있다.
따라서, (i) BDNF의 부재 하에 TrkB를 활성화시키고/거나, (ii) BDNF와 경쟁하지 않고/거나, (iii) TrkB의 BDNF-유도된 또는 NT-4-유도된 효능작용을 강화하고/거나, (iv) TrkB의 세포 표면 수준을 유지하는 TrkB 결합 효능제가 기재되어 있다.
TrkB 1차 아미노산 서열은 마우스, 래트, 시노몰구스 및 인간 중에서 고도로 보존되며 (전장 서열에 걸쳐 95%), 세포외 도메인 (TrkB-ECD)에서 특히 보존된다. TrkB-ECD는 5개의 도메인 (D1 - D3: C32-C194; D4: G195-V283; D5: H284-G380) 및 짧은 막근접 JM 영역 (W381-H430)을 포함한다. TrkB의 D5 도메인은 리간드 (BDNF/NT-4)에의 결합에 있어서 전장 TrkB를 대체할 수 있다. TrkB의 리간드 결합 도메인 (LBD) 내에 2개의 접촉 영역이 존재한다: "보존 패치" 및 "특이성 패치". 보존 패치 내의 TrkB D5의 접촉 잔기는 D5 도메인의 AB, C'D 및 EF 베타 시트 사이의 루프 및 C-말단에 있다. TrkB의 보존 패치는 리간드 (BDNF/NT-4)의 가닥에 결합한다. 특이성 패치 내의 TrkB D5의 접촉 잔기는 ABED 베타 시트의 외측 면에 있다. TrkB의 특이성 패치는 리간드 결합되지 않은 형태일 때는 불규칙적이고 TrkB에 결합 시 규칙적이 되는 리간드 (BDNF/NT-4)의 N-말단에 결합한다.
용어 "에피토프"의 대부분의 정의는 에피토프가 결합 단백질, 예컨대 TrkB 효능제와 접촉 상태에 있는 항원의 일부임을 명시한다 (예를 들어, 문헌 [Essential Immunology, Sixth Edition, Blackwell Scientific Publishing, 1988, Ed. Roitt, Chapter 4] 참조). 다른 정의는 결합 단백질에 의해 결합되는 항원의 일부를 지칭한다. 용어 "접촉" 및 "결합"은 에피토프가 단지 적절하게 비-공유 상호작용 예컨대 정전기 (수소 결합, 이온), 반데르발스 힘, π-효과 및 소수성 결합을 통해 항체 또는 단편과 직접적으로 상호작용하는 잔기로 이루어져야 함을 암시할 수 있다. 이러한 엄격한 해석에서, 에피토프는 상호작용하지는 않지만, 다른 방식으로 항원과 결합 단백질 사이의 상호작용을 위해 중요한 잔기를 포함하지 않을 것이다. 예를 들어, 항원에서의 특정 잔기는 항원의 다른 잔기와 항체 (또는 단편) 사이의 직접적 상호작용을 가능하게 하기 위해 요구되는 근접 상호작용을 허용하기 위해 매우 작아야 할 필요가 있을 수 있다 (예를 들어 글리신). 유사하게, 특정 잔기 (예를 들어 프롤린)는 항원 서열이 결합을 허용하기 위한 정확한 입체형태를 채택하도록 요구할 수 있다.
실제로, "에피토프" 정보를 확인하기 위해 전형적으로 수행되는 기술의 대부분은 상호작용하는 잔기와 다른 방식으로 중요한 잔기를 구별하지 않는다 (또한 구별할 수 없다). 하기 기술이 통상적으로 사용된다:
1. 항체 또는 그의 단편의 항원으로부터 유래된 펩티드에의 결합 (여기서 유의한 결합을 나타내는 펩티드가 "에피토프"를 함유하는 것으로 간주됨).
2. 수소 중수소 교환 (여기서 복합체를 형성하지 않은 항원과 비교하여 중수소 혼입에 대해 저항성이 있는 복합체 형성된 항원으로부터 유래된 펩티드가 "에피토프"를 함유하는 것으로 간주됨)
3. 돌연변이유발 연구 (예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 여기서 결합 단백질에의 결합을 유의하게 변경시키는 항원에서의 돌연변이된 위치가 "에피토프"의 일부를 형성하는 것으로 간주됨).
통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, 원자 수준 해상도를 갖는 기술 (예를 들어 X선 결정학, NMR, 전자 현미경검사)만이 상호작용하는 잔기와 다른 방식으로 중요한 잔기를 구별할 수 있다. 그러나, 이들이 엄격한 정의에 따라 에피토프에 관한 정보를 제공할 수 있는 유일한 기술임에도 불구하고, 다른 기술도 표적에의 결합을 위해 중요한 잔기/서열에 관한 유용한 정보를 제공하는 것으로 언급된다.
실시예에 기재된 TrkB 결합 효능제 1G11은 하기와 같은 여러 바람직한 특성을 갖는다:
1. BDNF-유도된 및 NT-4-유도된 효능작용을 강화함
2. TrkB의 세포 표면 수준을 유지함
3. 시노몰구스 TrkB와의 교차 반응성
1G11은 X선 결정학에 의해 잔기 T288, F291, K372 및 E293에 근접 접근하는 것으로 제시된 바 있다. T288 및 T291은 D5 베타 시트 A에 위치하고; E293은 D5 베타 시트 A와 A' 사이에 위치하고; K372는 D5 베타 시트 G에 위치한다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 잔기 T288, F291, K372, E293, F285, T290 및 D370을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. F285 및 T290은 D5 베타 시트 A에 위치한다. D370은 D5 베타 시트 G에 위치한다. 따라서, "에피토프"는 TrkB의 D5 도메인의 베타 시트 A 및 G, 및 베타 시트 A와 A' 사이의 영역 내에 포함된 것으로 보인다. 이러한 동일한 "에피토프"에 접촉하는 다른 TrkB 결합 효능제는 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 예상될 수 있다. 이러한 결합 단백질은 매우 바람직할 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는:
a) 인간 TrkB의 하기 잔기: Thr290, Glu293, Ser294, Asp358, Ser375, Lys372, Gln373 및 Glu341 중 1개 이상과 상호작용할 수 있거나;
b) T288, I289, T290, F291, L292, E293, S294, K308, D358, E371, K372, Q373, I374 및 S375로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TrkB로부터의 잔기에 4.5 Å 이하로 접근할 수 있거나;
c) 하기 군: E210, F285, T288, T290, F291, E293, D370 및 K372 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합할 수 있거나;
d) 인간 TrkB에 결합할 수 있고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 284-291 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
e) 서열식별번호: 71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 인간 TrkB의 하기 잔기: Thr290, Glu293, Ser294, Asp358, Ser375, Lys372, Gln373 및 Glu341 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상과 상호작용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 Glu293 및 임의로 Thr290, Ser294, Asp358, Ser375, Lys372, Gln373, Glu341로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상 또는 2개 이상의 추가의 잔기와 상호작용하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Thr290 및 Glu 293, 또는 Glu293 및 Ser 294, 또는 Thr290, Glu293 및 Ser294와 상호작용하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
상기 실시양태에서, 상호작용은 직접적 상호작용 또는 물을 통한 간접적 상호작용일 수 있다. 한 실시양태에서, 상호작용은 직접적 상호작용이다. 본 발명의 문맥에서, 직접적 상호작용은 TrkB 결합 효능제와 전장 인간 TrkB의 명명된 잔기(들) 사이의 수소 결합이다. 그러나, 상호작용하는 잔기에 관한 정보는 전장 인간 TrkB로부터 유래될 필요가 없음을 주목하여야 한다. 예를 들어, 인간 TrkB 세포외 도메인 또는 인간 TrkB의 D5-JM 도메인이 사용될 수 있다. 상호작용하는 잔기는 원자 수준 해상도가 가능한 임의의 기술에 의해 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 상호작용하는 잔기는 X선 결정학에 의해 확인된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 T288, I289, T290, F291, L292, E293, S294, K308, D358, E371, K372, Q373, I374 및 S375로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TrkB로부터의 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 잔기에 4.5 Å 이하로 접근하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 Glu293 및 임의로 T288, I289, T290, F291, L292, S294, K308, D358, E371, K372, Q373, I374 및 S375로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상 또는 2개 이상의 추가의 잔기에 4.5 Å 이하로 접근하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 Thr290 및 Glu 293, 또는 Glu293 및 Ser 294, 또는 Thr290, Glu293 및 Ser294에 4.5 Å 이하로 접근하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 상기 실시양태에서, 근접성 분석은 원자 수준 해상도가 가능한 임의의 기술, 예를 들어 X선 결정학에 의해 확인된 구조에 대해 수행될 수 있다. TrkB의 잔기는 전장 인간 TrkB에서와 같이 넘버링된다. 그러나, TrkB 결합 효능제에 대한 근접성에 관한 정보는 전장 인간 TrkB로부터 유래될 필요가 없음을 주목하여야 한다. 예를 들어, 인간 TrkB 세포외 도메인 또는 인간 TrkB의 D5-JM 도메인이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: E210, F285, T288, T290, F291, E293, D370 및 K372 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: E210, T288, F291, E293, D370 및 K372로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: F291 및 E293으로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 SPR 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다. TrkB는 결합 검정을 가능하게 하기 위해 태그부착 (예를 들어 비오티닐화)될 수 있지만, 그의 서열은 추가의 아미노산에 의해 연장될 수 없다. 용어 "변경된 친화도"는 TrkB 결합 효능제가 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인과 비교 시 돌연변이된 형태에 대해 실질적으로 감소된 또는 실질적으로 증가된 친화도를 나타내는 상황을 지칭한다. 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 1 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 2 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 추가 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 3 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 낮은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 낮은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 낮은 경우이다. 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 1 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 2 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 추가 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 3 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 높은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 높은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 높은 경우이다. 한 실시양태에서, 변경된 친화도는 감소된 친화도를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 TrkB에 결합하고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 284-291 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하는 TrkB 결합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 중수소 혼입에 대한 저항성은 중수소화 완충제로의 희석 후 15 내지 300초의 시점에서 (예를 들어 15, 60 또는 300초 중 하나의 시점에서) 평가된다.
알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 X선 결정학으로부터의 데이터가 1G11에 대한 불연속 에피토프를 가리키지만, 대부분의 상호작용이 이러한 불연속 에피토프의 가장 N-말단 부분에 존재하는 것으로 보임을 주목한다. 이는 또한 수소 중수소 교환으로부터 가장 강력하게 보호되는 부분이다. 이러한 이유로, 1G11의 에피토프의 이러한 N-말단 영역에 바로 결합하는 결합 단백질은 1G11과 유사한 특성을 가질 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (항체 1G11의 불연속 에피토프의 N-말단 영역을 포함하는 펩티드)에 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "결합한다"는 인간 TrkB 세포외 도메인으로부터 유래된 등가의 길이의 임의의 비-중복 펩티드에 대해 관찰되는 것보다 실질적으로 더 큰 결합 반응을 요구한다. 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 펩티드는 결합 검정을 가능하게 하기 위해 태그부착 (예를 들어 비오티닐화)될 수 있지만, 서열은 추가의 아미노산에 의해 연장될 수 없다. 명시된 서열을 갖는 펩티드에 결합한다는 요건이, "전부 또는 전무" 결합 반응이 달성된다는 전제 하에, 결합 단백질이 이러한 서열 외의 잔기와 상호작용할 수 없거나 또는, 예를 들어, 이들을 예를 들어 중수소 흡수로부터 보호할 수 없음을 반드시 의미하는 것은 아님을 주목하여야 한다 (즉 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 갖는 펩티드에 의해 달성되는 결합 수준이 다른, 비-중복 TrkB 펩티드에 의해 달성되는 수준보다 실질적으로 더 높음). 본 발명의 문맥에서 실질적으로 더 큰 결합 반응은 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 1 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하인 상황을 지칭한다. 한 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 2 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하이다. 추가 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 3 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하이다. 한 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 71에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 낮다.
유사한 에피토프에 결합하는 1G11 및 TrkB 결합 효능제는 TrkB D5 도메인 상에서 BDNF/NT4 "보존 패치" 리간드 결합 부위 (D5 도메인의 AB, C'D 및 EF 베타 시트 사이의 루프 및 C-말단)에 인접하여, 또한 BDNF/NT4 "특이성 패치" 리간드 결합 부위 (ABED 베타 시트의 외측 면)에 근접하여 위치해 있는 에피토프에 결합할 수 있다. BDNF의 N-말단은 잠재적으로 TrkB와 이들 TrkB 결합 효능제 사이의 공간으로 돌출된다. 이러한 TrkB 결합 효능제는 TrkB에의 결합에 추가하여, BDNF의 N-말단과 상호작용하면서, 아마도 3원 복합체를 안정화시켜 BDNF 기능적 반응의 강화를 유도할 수 있다. 대안적으로, 이러한 TrkB 결합 효능제는 리간드 결합 도메인에서가 아니라, 그에 근접하여 결합함으로써 TrkB와 BDNF 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있다.
실시예에 기재된 TrkB 결합 효능제 3A3 및 8E5도 또한 BDNF-유도된 효능작용을 강화할 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 3A3 결합을 위해 중요한 TrkB 내의 특정 잔기를 확인한다. 3A3 및 8E5가 특정 특성을 공유하고 TrkB에의 결합을 위해 경쟁하기 때문에, 이들은 중복 "에피토프"를 가질 수 있는 것으로 생각된다. 3A3에 대한 데이터에 기초하여, "에피토프"는 잔기 E398, Y397, D399, Y400, D394 및 I396을 포함한다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 잔기 E398, Y397, D399 및 Y400을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 잔기 E398, Y397, D399, Y400, D394, I396, V395, N389 및 T402를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들 잔기는 막근접 (JM) 영역 (W381-H430)에 속한다. JM 영역은, 임의의 결정 구조의 부재 하에, 긴 가요성 링커 영역인 것으로 추정된다. JM 영역이 또한 리간드에의 결합을 위해 중요할 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 동일한 "에피토프"에 접촉하는 다른 TrkB 결합 효능제는 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 예상될 수 있다. 이러한 결합 단백질은 매우 바람직할 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는:
a) 하기 군: N389, D394, V395, I396, Y397, E398, D399, Y400 및 T402로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합할 수 있거나;
b) 인간 TrkB에 결합할 수 있고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 385-398 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
c) 서열식별번호: 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: N389, D394, V395, I396, Y397, E398, D399, Y400 및 T402 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: D394, I396, Y397, E398, D399 및 Y400으로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군: Y397, E398, D399 및 Y400으로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 SPR 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다. TrkB는 결합 검정을 가능하게 하기 위해 태그부착 (예를 들어 비오티닐화)될 수 있지만, 그의 서열은 추가의 아미노산에 의해 연장될 수 없다. 용어 "변경된 친화도"는 TrkB 결합 효능제가 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인과 비교 시 돌연변이된 형태에 대해 실질적으로 감소된 또는 실질적으로 증가된 친화도를 나타내는 상황을 지칭한다. 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 1 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 2 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 추가 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD - 3 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이하인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 낮은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 낮은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 증가는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 낮은 경우이다. 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 1 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 2 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 추가 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD + 3 표준 편차 (야생형 또는 돌연변이된 형태에 대한 표준 편차 중 보다 큰 것이 사용되어야 함) 이상인 경우이다. 한 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 높은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 높은 경우이다. 또 다른 실시양태에서, 친화도의 실질적인 감소는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 돌연변이된 형태에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 인간 야생형 TrkB 세포외 도메인에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 높은 경우이다. 한 실시양태에서, 변경된 친화도는 감소된 친화도를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 TrkB에 결합하고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 385-398 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하는 TrkB 결합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 중수소 혼입에 대한 저항성은 중수소화 완충제로의 희석 후 15 내지 60초의 시점에서 (예를 들어 15 또는 60초 중 하나의 시점에서) 평가된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 항체 3A3에의 결합을 위해 중요한 것으로 확인된 모든 잔기를 함유하는 막근접 영역 내의 펩티드)에 결합하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "결합한다"는 인간 TrkB 세포외 도메인으로부터 유래된 등가의 길이의 임의의 비-중복 펩티드에 대해 관찰되는 것보다 실질적으로 더 큰 결합 반응을 요구한다. 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 펩티드는 결합 검정을 가능하게 하기 위해 태그부착 (예를 들어 비오티닐화)될 수 있지만, 서열은 추가의 아미노산에 의해 연장될 수 없다. 한 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 70에 제시된 서열을 가질 수 있다 (알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 항체 3A3에의 결합을 위해 중요한 것으로 확인된 잔기를 여전히 함유하는, 보다 작은 펩티드). 명시된 서열을 갖는 펩티드에 결합한다는 요건이, "전부 또는 전무" 결합 반응이 달성된다는 전제 하에, 결합 단백질이 이러한 서열 외의 잔기와 상호작용할 수 없거나 또는, 예를 들어, 이들을 예를 들어 중수소 흡수로부터 보호할 수 없음을 반드시 의미하는 것은 아님을 주목하여야 한다 (즉 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 갖는 펩티드에 의해 달성되는 결합 수준이 다른, 비-중복 TrkB 펩티드에 의해 달성되는 수준보다 실질적으로 더 높음). 본 발명의 문맥에서 실질적으로 더 큰 결합 반응은 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD가 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 1 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하인 상황을 지칭한다. 한 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 2 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하이다. 추가 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD - 3 표준 편차 (임의의 펩티드에 대해 관찰된 최대 표준 편차가 사용됨) 이하이다. 한 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 3배 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 5배 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 판독치에 기초한 서열식별번호: 69 (또는 70)에 제시된 서열을 함유하는 펩티드에 대한 평균 KD는 적어도 3개의 판독치에 기초하여 측정된 비-중복 TrkB 펩티드에 대한 평균 KD보다 적어도 10배 더 낮다.
TrkB JM 영역 에피토프는 TrkB D5 에피토프와 구별되는 것으로 보이지만, TrkB 결합 효능제 1G11, 3A3 및 8E5가 TrkB에의 결합을 위해 서로와 (적어도 부분적으로) 경쟁할 수 있고, 따라서 에피토프가 중복될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 막근접 (JM) 영역의 긴 가요성 링커는 실제로 D5 베타 시트 A 및 G, 및 베타 시트 A와 A' 사이의 영역에 매우 근접해 있을 수 있는 것이 가능하다. JM 영역 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제의 경우에, 이는 BDNF와의 약간의 추가의 상호작용 (예를 들어 리간드의 N-말단을 통해)을 가지고/거나 유사하게 수용체 + 리간드 + 효능제의 3원 복합체를 안정화시키는 것이 가능하다. 흥미롭게도, 막근접 영역 내의 잔기 D394, I396 및 Y400은 이들 잔기가 래트 TrkB에서와 상이하기 때문에 (각각 Glu, Leu, Trp) 인간 TrkB 수용체 특이성을 부여한다. 동일한 영역에 결합하지만, 상이한 접촉을 갖는 다른 TrkB 결합 효능제는 교차 반응성을 나타낼 수 있는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, TrkB 상의 TrkB 결합 효능제 에피토프는 BDNF 리간드 결합 도메인 (LBD)과 중복되지 않는다. TrkB 결합 효능제는 BDNF의 TrkB에의 결합을 허용하는 TrkB 상의 에피토프에 결합하여, 3원 복합체 (TrkB 효능제 결합 효능제 + TrkB + BDNF)를 형성할 수 있다.
TrkB 상의 특정 TrkB 결합 효능제 에피토프는 참조 항체가 결합하는 TrkB 상의 에피토프와 중복될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 TrkB에의 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 TrkB에의 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하며, TrkB에의 결합을 위해 BDNF와 경쟁하지 않는다. 참조 항체는 (a) 서열식별번호: 27의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 28의 경쇄 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 30의 경쇄 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 31의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 32의 경쇄 서열을 가질 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 TrkB의 세포 신호전달에 대해 효능작용하여 (a) 세포 생존, (b) 뉴런 복구 및/또는 (c) 뉴런 가소성을 증강시킬 수 있다. 증강은 효능제의 부재와 비교하여 효능제의 존재 하에 개선된 생물학적 기능 또는 반응이다.
"세포 생존"은 TrkB가 발현되는 세포의 성장을 유지 또는 촉진하는 것을 포함한다. TrkB는 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS) 둘 다에서 발현된다. CNS에서, 높은 수준의 TrkB가 뇌 피질, 해마, 시상, 맥락총, 및 소뇌, 뇌간, 망막 및 척수의 과립 층에서 발현된다. PNS에서, TrkB는 두개 신경절, 전정계, 악하선 및 후근 신경절에서 발현된다. TrkB는 태아 뇌에서 광범위하게 발현된다. TrkB는 또한 다른 조직 예컨대 골격근, 신장 및 췌장에서도 발현된다. TrkB는 또한 마이스너 소체에서도 발현된다. 중추 신경계 (CNS) 및 골격근의 신경근육 계면에서의 TrkB의 활성화는 뇌 및 척수 운동 뉴런 생존 및 전구 근육 세포 분화를 조절할 수 있다. 한 예에서, 세포 생존은 뉴런 세포 생존을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 TrkB 결합 효능제는 뉴런 생존, 예를 들어 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포주의 생존을 촉진할 수 있다. TrkB 결합 효능제 1G11, 인간화 1G11, 8E5 및 3A3은 농도-의존성 방식으로 0.006 - 0.025 nM의 평균 EC50으로 세포의 생존을 촉진할 수 있다 (인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포주에서).
TrkB 결합 효능제는 래트 뇌 및/또는 척수 유래된 뉴런, 마우스 뇌 유래된 뉴런에서 내인성으로 발현된 TrkB 수용체 및/또는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 시노몰구스 TrkB를 활성화시킬 수 있다.
TrkB는 축삭 재생 및 성장, 신경돌기 생장, 신경 수초화의 속도 및 범위, 및 근육 재생을 포함한, 뉴런 복구를 조절할 수 있다. 복구는 항상성을 유지하기 위한 (즉 생물학적 인풋에 반응하여 균형을 유지하기 위한), 또는 손상 및/또는 상해의 결과로서의 생리학적 복구일 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 신경돌기 생장, 예를 들어 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포주에서 신경돌기 생장을 유도할 수 있다. TrkB 결합 효능제 1G11, 인간화 1G11 및 8E5는 농도-의존성 방식으로 0.07 - 1.58 nM의 평균 EC50으로 신경돌기 생장을 유도하였다 (인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포주에서).
TrkB는 시냅스 가소성 및 비-시냅스 가소성을 둘 다 포괄하여, 뉴런 가소성 (신경가소성)을 조절할 수 있다. 뉴런 가소성은 행동, 환경, 신경 프로세스, 사고, 감정에서의 변화, 및 손상 및/또는 상해에 기인한 변화로 인한 신경 경로 및 시냅스에서의 변화를 지칭한다. 예를 들어, TrkB는 시냅스 가소성 기능을 조절할 수 있다. 중추 신경계 (CNS) 및 골격근의 신경근육 계면에서의 TrkB의 활성화는 신경근육 접합부 (NMJ)를 안정화시키며, NMJ에서의 아세틸 콜린 (ACh) 전달을 조절할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 압타머 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 항원 결합 단백질이다. 본원에 사용된 용어 "항원 결합 단백질"은 항체 및 TrkB에 결합할 수 있는 대안적 항체 포맷을 지칭한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 이뮤노글로불린-유사 도메인 (예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)을 갖는 분자를 지칭하기 위해 사용되며, 모노클로날, 재조합, 합성, 폴리클로날, 키메라, 인간, 인간화, 이중특이적 항체를 포함한 다중특이적 항체 및 이종접합체 항체; 상기 중 임의의 것의 단일 가변 도메인, 항원 결합 항체 단편 (예를 들어 Fab, F(ab')2, Fv, 디술피드 연결된 Fv, 단일 쇄 Fv, 디술피드-연결된 scFv, 디아바디, TANDAB™ 등) 및 변형된 형태를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG 또는 IgA 스캐폴드를 갖는다. 한 실시양태에서, 항체는 4쇄 또는 2쇄 항체일 수 있는 IgG 스캐폴드를 갖는다. IgG 스캐폴드는 항체의 도메인 (즉 CH1, CH2, CH3, VH, VL)을 일부 또는 모두 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgG4PE로부터 선택되는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 IgG1일 수 있다. 스캐폴드는 항체 의 Fc 영역 또는 그의 일부로 이루어질 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 불능화된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역은 돌연변이 L235A 및 G237A (EU 넘버링)로 변형될 수 있다. Fc 영역의 이러한 변형은 Fcγ 수용체 및 C1q에의 항체 결합을 감소시키고, 따라서 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 TrkB 양성 세포의 고갈을 유도하는 항체의 잠재력을 감소시킨다. 이는 통상적으로 Fc-불능화라 기재된다. Fc 이펙터 기능은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 기능에 있어서 중요하지 않음을 주목하여야 한다.
용어 "도메인"은 폴딩된 단백질 구조로서, 그 단백질의 나머지와 관계없이 그의 3차 구조를 유지하는 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로 도메인은 단백질의 구별되는 기능적 특성을 담당하며, 다수의 경우에서 단백질의 나머지 및/또는 도메인의 기능 상실 없이 다른 단백질에 부가, 제거 또는 전달될 수 있다. 용어 "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 지칭한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 예컨대 VH, VHH 및 VL, 및 변형된 항체 가변 도메인, 예를 들어 1개 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징적이지 않은 서열에 의해 대체된 것, 또는 말단절단되었거나 또는 N- 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 상이한 가변 영역 또는 도메인과 관계없이 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 단일 가변 도메인은 "도메인 항체" 또는 " dAb(™)"라 지칭될 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 단일 가변 도메인일 수 있지만, 또한 다른 종으로부터의 단일 가변 도메인 예컨대 설치류, 너스 상어 및 낙타류 VHH dAb™를 포함한다. 낙타류 VHH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 구아나코를 포함한 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이며, 이는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산한다. 이러한 VHH 도메인은 관련 기술분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 "단일 가변 도메인"으로 간주된다. 본원에 사용된 VH는 낙타류 VHH 도메인을 포함한다.
대안적 항체 포맷은 TrkB 결합 효능제의 CDR이 적합한 비-이뮤노글로불린 단백질 스캐폴드 또는 골격 상에 배열된 것들이다. 비-이뮤노글로불린 스캐폴드는 CTLA-4, 리포칼린, 단백질 A 유래된 분자 예컨대 단백질 A의 Z-도메인 (아피바디, SpA), A-도메인 (아비머/맥시바디); 열 쇼크 단백질 예컨대 GroEl 및 GroES; 트랜스페린 (트랜스-바디); 안키린 반복 단백질 (DARPin); 펩티드 압타머; C-유형 렉틴 도메인 (테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴 (아필린); PDZ 도메인; LDL 수용체 클래스 A 도메인; EGF 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소 쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴/애드넥틴으로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다.
1G11 TrkB 결합 효능제의 HC 및 LC 도메인은 각각 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28에 기재되어 있다. 인간화 1G11 TrkB 결합 효능제의 VH 및 VL 도메인은 각각 서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 41에 기재되어 있다.
"CDR"은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 이들은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역이다. 이뮤노글로불린의 가변 부분에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다.
서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 41의 CDR 영역은 임의의 넘버링 규정, 예를 들어 카바트, 코티아, AbM 및 컨택트 규정에 의해 정의될 수 있다. 각각의 방법에 의해 정의된 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 41의 CDR 영역이 표 1에 기재되어 있다. 컨택트 방법에 의해 정의된 CDRH2를 제외하고는, 마우스 1G11 및 인간화 1G11의 CDR 서열은 동일함을 주목한다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 아미노산 잔기는 카바트 넘버링 규정에 따라 넘버링된다.
표 1
Figure pct00003
1G11 TrkB 결합 효능제 파라토프 및 아마도 인간화 1G11 TrkB 결합 효능제 파라토프 내의 주요 결합 잔기는 CDR L1 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: RASQ R I S N N LH/서열식별번호: 3), L3 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: QQS NS WPLT/서열식별번호: 5) 및 H3 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: R G YE GALDY/서열식별번호: 8) 내에 존재한다. CDRH2에서는 단지 2개의 잔기가 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하며, 단지 1개의 직접적 상호작용이 있다 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: R IAPGNTYYNEIFKG/서열식별번호: 7). CDRH1에서는 단지 단일 잔기가 에피토프에 접근하거나 또는 (간접적으로) 접촉하고 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: SYYIN/서열식별번호: 6), CDRL2에서는 단일 잔기가 에피토프에 접근한다 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: YVSQSIS/서열식별번호: 4). 따라서, 순위를 정하는 관점에서 보면, CDR L1, L3 및 H3이 결합을 위해 가장 중요하고, 그 다음은 CDRH2, 그 다음은 CDRL2 및 CDRH1이다.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 (a) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; (b) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및 (c) 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 66에 존재하는 바와 같거나 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 66의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 3에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRL1 내의 변형은 잔기 R28, S30 및 N32 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-변형 R28, S30 및 N32에 추가하여, CDRL1 내의 변형은 잔기 I29 및/또는 잔기 N31 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 66에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 3에 존재하는 바와 같다.
한 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 68에 존재하는 바와 같거나 또는 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 68의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 5에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRL3 내의 변형은 잔기 N92 및 S93 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-변형 N92 및 S93에 추가하여, CDRL3 내의 변형은 잔기 S91 및 W94 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 68에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRL3은 서열식별번호: 5에 존재하는 바와 같다.
한 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 65에 존재하는 바와 같거나 또는 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 65의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 8에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRH3 내의 변형은 잔기 R97, Y99 및 E100 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 65에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 8에 존재하는 바와 같다.
한 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 CDRL1, CDRL3 및 CDRH3을 포함하는 것에 추가하여, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체이거나, 또는 서열식별번호: 40에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체인 CDRH2를 추가적으로 포함하며, 여기서 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63 또는 서열식별번호: 64에 존재하는 바와 같거나, 또는 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63 또는 서열식별번호: 64의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRH3은 서열식별번호: 7에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRH2 내의 변형은 잔기 R50 및/또는 잔기 Y57 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63 또는 서열식별번호: 64에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 7에 존재하는 바와 같다.
TrkB 결합 효능제는 CDRL1 (서열식별번호: 3), CDRL3 (서열식별번호: 5) 및 CDRH3 (서열식별번호: 8)을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 CDRL1 (서열식별번호: 3), CDRL3 (서열식별번호: 5), CDRH2 (서열식별번호: 7) 및 CDRH3 (서열식별번호: 8)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 CDRL1, CDRL3, CDRH3 및 CDRH2를 포함하는 것에 추가하여, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체, 및 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체를 추가적으로 포함하며, 여기서 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다.
한 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 67에 존재하는 바와 같거나 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 67의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 4에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRL2 내의 변형은 잔기 Y50 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 67에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 4에 존재하는 바와 같다.
한 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 60 또는 서열식별번호: 62에 존재하는 바와 같거나 또는 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 60 또는 서열식별번호: 62의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 추가 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 6에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이다. 한 실시양태에서, CDRH1 내의 변형은 잔기 Y33 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-변형 Y33에 추가하여, CDRH1 내의 변형은 잔기 S31 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는다. 한 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 60 또는 서열식별번호: 62에 존재하는 바와 같다. 한 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 6에 존재하는 바와 같다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 6의 CDRH1; 서열식별번호: 7의 CDRH2; 서열식별번호: 8의 CDRH3; 서열식별번호: 3의 CDRL1; 서열식별번호: 4의 CDRL2; 및 서열식별번호: 5의 CDRL3을 포함할 수 있다.
상기 실시양태에서, 특정 CDR은 3개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체 서열일 수 있다. 각각의 변형은 독립적으로 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 1개의 부가, 1개의 결실 및 1개의 치환을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 변이체 서열은 1개의 아미노산 변형을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 변이체 서열은 2개 이하의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이며, 예를 들어 표 2에 제시된 바와 같다.
표 2:
Figure pct00004
CDR L1, L2, L3, H1 및 H2는 구조적으로 유한한 개수의 주쇄 입체형태 중 하나를 나타내는 경향이 있다. CDR의 특정한 정규 구조 클래스는 CDR의 길이 및 루프 패킹 둘 다에 의해 정의되며, 이는 CDR 및 프레임워크 영역 (구조적 결정 잔기 또는 SDR) 둘 다에서의 주요 위치에 위치하는 잔기에 의해 결정된다. 클러스터 분석을 사용하여 CDR 세트에 대한 정규 클래스가 정의되고, 이어서 정규 주형이 매립된 소수성, 수소-결합 잔기 및 보존된 글리신 및 프롤린을 분석함으로써 확인된다. 항체 서열의 CDR은 서열을 주요 잔기 주형과 비교하고 각각의 주형을 동일성 또는 유사성 매트릭스를 사용하여 스코어링함으로써 정규 클래스에 지정될 수 있다.
CDR당, 가변 영역당, 중쇄 또는 경쇄당 다수의 변이체 CDR 정규 위치가 존재할 수 있고, 따라서 치환의 임의의 조합이 TrkB 결합 효능제에 존재할 수 있으며, 단 CDR의 정규 구조는 효능제가 TrkB에 결합할 수 있도록 유지된다.
TrkB 결합 효능제 CDR 변이체는 하기를 포함할 수 있다:
(a) I, H, F, T, N, C, E 또는 D에 의해 치환된 Y32; V, M 또는 W에 의해 치환된 I34; 및 H, E, Q, S, Y 또는 T에 의해 치환된 N35 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 CDRH1의 변이체; 및/또는
(b) L, V, T, S 또는 N에 의해 치환된 I51을 갖는 CDRH2의 변이체; 및/또는
(c) H, V, I, S, D 또는 G에 의해 치환된 Y102를 갖는 CDRH3의 변이체; 및/또는
(d) M, V, I 또는 F에 의해 치환된 L33; 및 A, G, N, S, V 또는 F에 의해 치환된 H34 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 CDRL1의 변이체; 및/또는
(e) A, T 또는 G에 의해 치환된 V51을 갖는 CDRL2의 변이체; 및/또는
(f) S, G, F 또는 L에 의해 치환된 Q89; H 또는 N에 의해 치환된 Q90; P, Y, R, I, W 또는 F에 의해 치환된 L96 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 CDRL3의 변이체.
TrkB 결합 효능제는 인간화 VH 영역 또는 인간화 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 인간화 VL 영역 또는 인간화 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 VH 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및/또는 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VL 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 VH 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VL 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체 VH 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 VL 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 HC 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및/또는 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 LC 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 HC 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 LC 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체 HC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 LC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
VH, VL, HC 및 LC에서의 변형은 독립적으로 임의의 특정한 변이체 서열이 치환, 부가 및 결실을 함유할 수 있도록 하는 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 전형적으로, 변이는 치환, 특히 보존적 치환이며, 예를 들어 상기 표 2에 제시된 바와 같다.
특정 실시양태에서, VH, VL, HC 및 LC에서의 변형(들)은 CDR이 무손상이고 변이가 VH, VL, HC 또는 LC 서열의 나머지 부분에 존재하도록 하는 CDR을 제외할 수 있다. 변이체 서열은 변형되지 않은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 특징을 실질적으로 유지한다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 40의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열식별번호: 41의 서열과 적어도 76% 동일한 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, VH 영역은 서열식별번호: 40의 서열과 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VL 영역은 서열식별번호: 41의 서열과 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
TrkB 결합 효능제는 위치 47이 Cys 또는 Ser인 VH 영역을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 위치 47이 Cys, Ser, Gly, Ala, Val, Thr 또는 Asn인 VH 영역을 포함할 수 있다.
질의 서열과 대상 서열 사이의 "퍼센트 동일성"은 쌍별 BLASTP 정렬이 수행된 후 대상 아미노산 서열이 질의 아미노산 서열과 100% 질의 적용범위를 갖는 경우에 BLASTP 알고리즘에 의해 계산된, 백분율로 표현되는 "동일성" 값을 사용하여 계산될 수 있다. 질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 이러한 쌍별 BLASTP 정렬은 국립 생명공학 연구 센터의 웹사이트 상에서 이용가능한 BLASTP 알고리즘의 디폴트 세팅을 사용하여, 낮은 복잡성 영역에 대한 필터를 꺼둔 채로 수행될 수 있다.
질의 서열은 대상 서열과 100% 동일할 수 있거나, 또는 대상 서열과 비교 시 % 동일성이 상기 제시된 바와 같은 100% 미만이도록 하는 특정 정수 개수 이하의 아미노산 또는 뉴클레오티드 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 적어도 1개의 아미노산 결실, 치환 (보존적 및 비-보존적 치환 포함), 또는 삽입을 포함하며, 여기서 상기 변경은 질의 서열에 아미노산 또는 뉴클레오티드가 개별적으로 또는 질의 서열 내에 1개 이상의 인접한 그룹으로 점재되면서, 질의 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치 사이의 임의의 곳에서 발생할 수 있다.
% 동일성은 CDR을 포함하는 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 대안적으로, % 동일성은 CDR을 제외할 수 있는데, 예를 들어 CDR이 대상 서열과 100% 동일하면, % 동일성 변이는 질의 서열 (즉 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 41)의 나머지 부분에 존재하여, CDR 서열이 고정/무손상이다. 대안적으로, CDR 서열은 임의의 상기 실시양태에 제시된 바와 같고, % 동일성 변이는 질의 서열의 나머지 부분에 걸쳐 계산된다. 변이체 서열은 변형되지 않은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 특징을 실질적으로 유지한다.
본 발명은 또한 (a) 서열식별번호: 40의 VH 영역; 및/또는 (b) 서열식별번호: 41의 VL 영역을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 40의 VH 영역; 및 (b) 서열식별번호: 41의 VL 영역을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 서열식별번호: 42와 적어도 90% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 (b) 서열식별번호: 43과 적어도 85% 동일한 경쇄 (LC) 서열을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, HC는 서열식별번호: 42의 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LC는 서열식별번호: 42의 서열과 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
TrkB 결합 효능제는 위치 47이 Cys 또는 Ser인 HC 영역을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 위치 47이 Cys, Ser, Gly, Ala, Val, Thr 또는 Asn인 HC 영역을 포함할 수 있다.
"퍼센트 동일성"은 상기 기재된 바와 같이 계산된다. 다시, % 동일성은 CDR을 포함하는 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 대안적으로, % 동일성은 CDR을 제외할 수 있는데, 예를 들어 CDR이 대상 서열과 100% 동일하면, % 동일성 변이는 질의 서열 (즉 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 41)의 나머지 부분에 존재하여, CDR 서열이 고정/무손상이다. 대안적으로, CDR 서열은 임의의 상기 실시양태에 제시된 바와 같고, % 동일성 변이는 질의 서열의 나머지 부분에 걸쳐 계산된다. 변이체 서열은 변형되지 않은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 특징을 실질적으로 유지한다.
본 발명은 또한 (a) 서열식별번호: 42의 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 (b) 서열식별번호: 43의 경쇄 (LC) 서열을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 42의 중쇄 (HC) 서열; 및 (b) 서열식별번호: 43의 경쇄 (LC) 서열을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다.
3A3 TrkB 결합 효능제의 HC 및 LC 도메인은 각각 서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30에 기재되어 있다. 인간화 3A3 TrkB 결합 효능제의 VH 및 VL 도메인은 각각 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47에 기재되어 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 29로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 30으로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 CDR 중 어느 하나 또는 그의 조합; 또는 CDR 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 변이체는 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 29로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 30으로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR; 또는 CDR 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 변이체는 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 특정한 CDR은 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같고, 반면 다른 CDR은 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 30에 존재하는 것들의 변이체이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 CDR 중 1개 이상을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다:
(a) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(b) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(c) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(d) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(e) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
(f) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 하기 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 적어도 3개의 CDR, 적어도 4개의 CDR, 또는 적어도 5개의 CDR, 또는 모든 6개의 CDR을 포함한다:
(a) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(b) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(c) 서열식별번호: 30에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(d) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(e) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
(f) 서열식별번호: 29에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
3A3과 관련된 실시양태에서, 특정 CDR은 3개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체 서열일 수 있다. 각각의 변형은 독립적으로 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 1개의 부가, 1개의 결실 및 1개의 치환을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 변이체 CDR은 1개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 변이체 서열은 2개 이하의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이며, 예를 들어 상기 표 2에 제시된 바와 같다.
TrkB 결합 효능제는 하기 CDR: 서열식별번호: 12의 CDRH1; 서열식별번호: 13의 CDRH2; 서열식별번호: 14의 CDRH3; 서열식별번호: 9의 CDRL1; 서열식별번호: 10의 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 11의 CDRL3 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 12의 CDRH1; 서열식별번호: 13의 CDRH2; 서열식별번호: 14의 CDRH3; 서열식별번호: 9의 CDRL1; 서열식별번호: 10의 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 11의 CDRL3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 12의 CDRH1; 서열식별번호: 13의 CDRH2; 서열식별번호: 14의 CDRH3; 서열식별번호: 9의 CDRL1; 서열식별번호: 10의 CDRL2; 및 서열식별번호: 11의 CDRL3을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 인간화 VH 영역 또는 인간화 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 인간화 VL 영역 또는 인간화 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 VH 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및/또는 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VL 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 VH 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VL 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체 VH 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 VL 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 HC 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및/또는 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 LC 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 HC 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및 서열식별번호: 43에 제시된 바와 같은 LC 영역 또는 그의 변이체로서, 10개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체 HC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 LC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 갖는다.
VH, VL, HC 및 LC에서의 변형은 독립적으로 임의의 특정한 변이체 서열이 치환, 부가 및 결실을 함유할 수 있도록 하는 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 전형적으로, 변이는 치환, 특히 보존적 치환이며, 예를 들어 상기 표 2에 제시된 바와 같다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 46의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열식별번호: 47의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, VH 영역은 서열식별번호: 46의 서열과 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VL 영역은 서열식별번호: 47의 서열과 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 46의 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 47의 VL 영역을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 46의 VH 영역; 및 서열식별번호: 47의 VL 영역을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 48과 적어도 80% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 서열식별번호: 49와 적어도 80% 동일한 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, HC는 서열식별번호: 48의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LC는 서열식별번호: 49의 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 48의 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 서열식별번호: 49의 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 48의 중쇄 (HC) 서열; 및 서열식별번호: 49의 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다.
3A3과 관련된 실시양태에서, "퍼센트 동일성"은 상기 기재된 바와 같이 계산된다. 다시, % 동일성은 CDR을 포함하는 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 대안적으로, % 동일성은 CDR을 제외할 수 있는데, 예를 들어 CDR이 대상 서열과 100% 동일하면, % 동일성 변이는 질의 서열 (즉 서열식별번호: 46, 47, 48 또는 49)의 나머지 부분에 존재하여, CDR 서열이 고정/무손상이다. 대안적으로, CDR 서열은 3A3과 관련된 임의의 상기 실시양태에 제시된 바와 같고, % 동일성 변이는 질의 서열의 나머지 부분에 걸쳐 계산된다. 변이체 서열은 변형되지 않은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 특징을 실질적으로 유지한다.
8E5 TrkB 결합 효능제의 HC 및 LC 도메인은 각각 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 32에 기재되어 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 31로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 32로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 CDR 중 어느 하나 또는 그의 조합; 또는 CDR 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 변이체는 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 31로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 32로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR; 또는 CDR 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 변이체는 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 특정한 CDR은 서열식별번호: 31 또는 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같고, 반면 다른 CDR은 서열식별번호: 31 또는 서열식별번호: 32에 존재하는 것들의 변이체이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 CDR 중 1개 이상을 포함하는 TrkB 결합 효능제를 제공한다:
(a) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(b) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(c) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(d) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(e) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
(f) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 하기 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 CDR, 적어도 3개의 CDR, 적어도 4개의 CDR, 또는 적어도 5개의 CDR, 또는 모든 6개의 CDR을 포함한다:
(a) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(b) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(c) 서열식별번호: 32에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(d) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
(e) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
(f) 서열식별번호: 31에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
8E5와 관련된 실시양태에서, 특정 CDR은 3개 이하의 아미노산 변형을 갖는 변이체 서열일 수 있다. 각각의 변형은 독립적으로 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 1개의 부가, 1개의 결실 및 1개의 치환을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 변이체 CDR은 1개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 변이체 서열은 2개 이하의 아미노산 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이며, 예를 들어 상기 표 2에 제시된 바와 같다.
TrkB 결합 효능제는 하기 CDR: 서열식별번호: 18의 CDRH1; 서열식별번호: 19의 CDRH2; 서열식별번호: 20의 CDRH3; 서열식별번호: 15의 CDRL1; 서열식별번호: 16의 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 17의 CDRL3 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 18의 CDRH1; 서열식별번호: 19의 CDRH2; 서열식별번호: 20의 CDRH3; 서열식별번호: 15의 CDRL1; 서열식별번호: 16의 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 17의 CDRL3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 18의 CDRH1; 서열식별번호: 19의 CDRH2; 서열식별번호: 20의 CDRH3; 서열식별번호: 15의 CDRL1; 서열식별번호: 16의 CDRL2; 및 서열식별번호: 17의 CDRL3을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 인간화 VH 영역 또는 인간화 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 인간화 VL 영역 또는 인간화 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 31과 적어도 80% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 서열식별번호: 32와 적어도 80% 동일한 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, HC는 서열식별번호: 48의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LC는 서열식별번호: 49의 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 31의 중쇄 (HC) 서열; 및/또는 서열식별번호: 32의 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 서열식별번호: 31의 중쇄 (HC) 서열; 및 서열식별번호: 32의 경쇄 (LC) 서열을 포함할 수 있다.
8E5와 관련된 실시양태에서, "퍼센트 동일성"은 상기 기재된 바와 같이 계산된다. 다시, % 동일성은 CDR을 포함하는 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 대안적으로, % 동일성은 CDR을 제외할 수 있는데, 예를 들어 CDR이 대상 서열과 100% 동일하면, % 동일성 변이는 질의 서열 (즉 서열식별번호: 31 및 32)의 나머지 부분에 존재하여, CDR 서열이 고정/무손상이다. 대안적으로, CDR 서열은 8E5와 관련된 임의의 상기 실시양태에 제시된 바와 같고, % 동일성 변이는 질의 서열의 나머지 부분에 걸쳐 계산된다. 변이체 서열은 변형되지 않은 TrkB 결합 효능제의 생물학적 특징을 실질적으로 유지한다.
TrkB 결합 효능제는 다수의 통상적인 기술 중 임의의 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, TrkB 결합 효능제는 이들을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제될 수 있거나 (예를 들어, 항체는 그를 생산하는 하이브리도마로부터 정제될 수 있음), 또는 재조합 발현 시스템에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 목적하는 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다.
TrkB 결합 효능제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 서열이 또한 기재되어 있다. 1G11과 관련된 실시양태에서, 단일 핵산 서열은 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 44; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 45, 또는 서열식별번호: 44를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 44를 포함하는 핵산; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 45를 포함하는 별개의 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 단일 핵산 서열은 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 50; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 51을 포함할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 50을 포함하는 핵산; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 51을 포함하는 별개의 핵산을 제공한다.
TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 또한 기재되어 있다. 핵산 서열 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 또한 기재되어 있다. 숙주 세포는 단리된 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 통상적으로 다세포 유기체 (예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니다. 숙주 세포는 비-인간 숙주 세포일 수 있다. 원핵생물 (그람 음성 또는 그람 양성 박테리아, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스(Bacilli) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종 포함), 효모 (예를 들어 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 진균 (예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus) 종)을 포함한 진핵생물, 또는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 세포주 (예를 들어, CHO, Perc6, HEK293, HeLa, NS0)를 포함한 고등 진핵생물을 포함한 매우 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 포유동물 세포 예컨대 CHO (예를 들어 CHOK1 및 CHO-DG44)를 포함한다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터 및 클로닝 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
숙주 세포를 핵산 서열 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, TrkB 결합 효능제의 생산 방법이 기재되어 있다. 한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 정제된다 (예를 들어 통상적인 단백질 정제 절차에 의해). 이러한 방법에 의해 생산된 TrkB 결합 효능제가 또한 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 오염 물질을 실질적으로 함유하지 않는, 실질적으로 동종인 TrkB 결합 효능제의 집단을 제공한다.
TrkB 결합 효능제의 발현 및 생산 시, 번역후 변형이 발생할 수 있다. 이는 특정 리더 서열의 절단, 다양한 당 모이어티의 다양한 글리코실화 패턴으로의 부가, 탈아미드화 (예를 들어 아스파라긴 또는 글루타민 잔기에서), 산화 (예를 들어 메티오닌, 트립토판 또는 유리 시스테인 잔기에서), 디술피드 결합 스크램블링, 이성질체화 (예를 들어 아스파르트산 잔기에서), C-말단 리신 클리핑 (예를 들어 1개 또는 둘 다의 중쇄로부터) 및 N-말단 글루타민 고리화 (예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄에서)를 포함할 수 있다. TrkB 효능제는 1개 이상의 번역후 변형에 적용된 바 있거나 또는 겪은 바 있을 수 있다. 변형은 CDR, 가변 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 발생할 수 있다. 변형은 분자의 전하에서의 변화를 야기할 수 있다.
탈아미드화는 주로 아스파라긴 (N)을 대략 3:1 비로 이소-아스파르트산 (이소-아스파르테이트) 및 아스파르트산 (아스파르테이트) (D)으로 전환시키는 효소적 반응이다. 따라서, 이러한 탈아미드화 반응은 아스파르테이트 (D)의 이소-아스파르테이트로의 이성질체화와 관련된다. 아스파라긴의 탈아미드화 및 아스파르테이트의 이성질체화는 둘 다 중간체 숙신이미드를 수반한다. 훨씬 더 적은 정도로, 탈아미드화는 글루타민 잔기에서도 유사한 방식으로 발생할 수 있다. 탈아미드화는 CDR, Fab (비-CDR 영역), 또는 Fc 영역에서 발생할 수 있다.
산화는 생산 및 저장 동안 발생할 수 있으며 (즉 산화 조건의 존재 하에), 반응성 산소 종에 의해 직접적으로 또는 산화성 스트레스의 2차 부산물과의 반응에 의해 간접적으로 유도되는 단백질의 공유 변형을 야기한다. 산화는 주로 메티오닌 잔기에서 일어나지만, 트립토판 및 유리 시스테인 잔기에서도 발생할 수 있다. 산화는 CDR, Fab (비-CDR) 영역, 또는 Fc 영역에서 발생할 수 있다.
디술피드 결합 스크램블링은 생산 및 염기성 저장 조건 동안 발생할 수 있다. 특정 상황 하에, 디술피드 결합은 파괴되거나 또는 부정확하게 형성되어, 쌍형성되지 않은 시스테인 잔기 (-SH)를 생성할 수 있다. 이들 유리 (쌍형성되지 않은) 술프히드릴 (-SH)은 셔플링을 촉진할 수 있다.
중쇄 및/또는 경쇄에서 N-말단 글루타민 (Q) 및 글루타메이트 (글루탐산) (E)는 고리화를 통해 피로글루타메이트 (pGlu)를 형성할 가능성이 있다. 대부분의 pGlu 형성은 생산 생물반응기에서 일어나지만, 프로세싱 및 저장 조건의 pH 및 온도에 따라 비-효소적으로 형성될 수도 있다. N-말단 Q 또는 E의 고리화는 통상적으로 천연 인간 항체에서 관찰된다.
C-말단 리신 클리핑은 카르복시펩티다제에 의해 촉매되는 효소적 반응이며, 통상적으로 재조합 및 천연 인간 항체에서 관찰된다. 이러한 프로세스의 변이체는 재조합 숙주 세포로부터의 세포 효소로 인해 1개 또는 둘 다의 중쇄로부터의 리신의 제거를 포함한다. 인간 대상체/환자에게의 TrkB 결합 효능제의 투여는 인간 신체 내의 임의의 잔류하는 C-말단 리신의 제거를 야기할 가능성이 있다.
본 발명에서, 상기 기재된 1차 아미노산 서열에서의 번역후 변형 및 변화는 전형적으로 항원 결합 친화도, 생물학적 활성, PK/PD, 응집, 면역원성 또는 Fc 수용체에의 결합에서 유의한 변화를 야기하지 않는다.
TrkB 결합 효능제는 인간 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물에 혼입될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제 및/또는 희석제와 임의로 조합된 TrkB 결합 효능제를 포함한다. 제약 조성물의 예는 완충제(들), 염(들), 아미노산(들), 폴리올(들), 당(들), 계면활성제(들), 디터전트(들), 항산화제(들) 및/또는 킬레이트화제(들) 중 하나 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 볼루스로서 또는 간헐적으로 (예를 들어 주사에 의해 또는 지속 방출 제제의 사용에 의해) 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 정맥내, 척수강내, 복강내, 피내, 피하, 국소, 경고실, 와우내, 안내, 유리체내, 근육내 및 문맥내를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약 조성물은 국소 투여 (표피, 흡입, 비강내 또는 안구 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 경장 투여 (경구 또는 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 적합할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정맥내 또는 척수강내 투여에 적합하다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 유리체내 투여에 적합하다.
제약 조성물은 1mg 내지 10g의 TrkB 결합 효능제, 예를 들어 5 mg 내지 1 g의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 5 mg 내지 500 mg, 예를 들어 5 mg 내지 50 mg을 포함할 수 있다.
TrkB 결합 효능제를 투여하는데 있어서 유효 용량 및 치료 레지멘은 환자의 연령, 체중 및 건강 상태 및 치료될 질환과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 제약 제제는 즉시 방출 제제 및 지속 방출 제제일 수 있다. 지속 방출 제제는 경고실 및 와우내 전달에 특히 바람직하다.
제약 조성물은 다른 의약과 함께 TrkB 결합 효능제의 부분들의 키트를, 임의로 사용에 대한 지침서와 함께 포함할 수 있다. 편의상, 키트는 미리 결정된 양의 시약을, 사용에 대한 지침서와 함께 포함할 수 있다.
용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 한 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대 영장류, 예를 들어 시노몰구스, 마모셋 또는 원숭이이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
TrkB 결합 효능제는 또한 요법, 예를 들어 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있다. 치료는 장애의 적어도 한 측면 또는 증상 또는 생물학적 징후의 완화 또는 감소 또는 치유를 포괄한다.
예를 들어, 치료는 (1) 장애의 생물학적 징후 중 1종 이상의 호전, (2) (a) 장애로 이어지거나 또는 그의 원인이 되는 생물학적 캐스케이드에서의 1개 이상의 지점 또는 (b) 장애의 생물학적 징후 중 1종 이상의 간섭, (3) 장애와 연관된 증상 또는 효과 중 1종 이상의 완화, (4) 장애 또는 장애의 생물학적 징후 중 1종 이상의 진행 늦춤, 및/또는 (5) 장애 또는 장애의 생물학적 징후의 중증도 가능성 감소를 포함한다.
예방은, 예를 들어 장애로 이어지거나 또는 그의 원인이 되는 생물학적 캐스케이드에서의 1개 이상의 지점의 간섭에 의해 장애 또는 그의 생물학적 징후의 개시 가능성을 감소시키거나 또는 개시를 지연시키기 위한 약물의 예방적 투여를 포함한다.
TrkB 결합 효능제는 기재된 방법을 위해 유효량으로 사용된다. TrkB 결합 효능제의 치료 유효량은 장애의 1종 이상의 증상을 호전 또는 감소시키거나, 또는 장애를 예방 또는 치유하는데 유효한 양이다.
TrkB 효능제는 CNS에서 중추적으로 및 PNS에서 말초적으로 둘 다의 경우에서 세포 생존 및/또는 뉴런 복구 및/또는 뉴런 가소성을 증강시키는데 사용될 수 있다.
TrkB 효능제는 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. BDNF-TrkB 경로의 작용 메카니즘 및 TrkB가 CNS 및 PNS에서 광범위하게 발현되는 것을 고려하면, TrkB 결합 효능제는 신경계 장애, 신경변성 장애, 발달 장애 및 다른 장애를 갖는 대상체에게 요법을 제공할 수 있다. 이들은 TrkB 효능작용이 유익할 것으로 예상되는 장애이다.
예를 들어, TrkB 결합 효능제는 신경근육 접합부 (NMJ)에서의 TrkB 세포 신호전달에 대해 효능작용하며 NMJ 발달, 안정성 및 유지를 증강시킬 수 있다. TrkB 결합 효능제는 골격근에서의 TrkB 세포 신호전달에 대해 효능작용하며 골격근 전구 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 이는, 예를 들어, 근육 손상 및 변성 후에 유익할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 슈반 세포에서의 TrkB 세포 신호전달에 대해 효능작용하며 축삭 재생 및 성장을 증강시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, 신경 손상 및 변성 후에 유익할 수 있다.
장애는 질환, 병태, 증후군, 증상 및 징후를 포함한다. 신경계 장애는 신경계 질환, 병태, 증후군, 증상 및 징후를 포함한다. 신경계 장애는 뇌, 척수, 두개 신경, 말초 신경, 신경근, 자율 신경계, 신경근육 접합부 및/또는 근육을 포함한, 중추 및 말초 신경계의 구성요소(들)의 구조 또는 기능에서의 파괴가 있는 것들을 포함할 수 있다. 신경계 장애는 표현형상으로 이종성일 수 있으며, 종종 알려지지 않은 병인을 갖는다. 여러 메카니즘 및 경로가 신경계 장애 예컨대 신경계 질환에 연루되어 왔다. 이들 질환에서, 특정한 증상 및 구조/기능 관계는 기저 병인의 이해로 이어졌다.
장애는 또한 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 이들 장애는 TrkB를 발현하는 세포의 변성 또는 기능장애를 수반한다.
TrkB 결합 효능제는 본원에 기재된 장애의 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, TrkB 결합 효능제는 본원에 기재된 장애의 치료 방법에 사용될 수 있다. 장애는 신경변성 질환, 시신경병증 및 망막 변성 병태, 청각 상실 장애, 정신 장애, 신경발달 장애, 체중 조절의 장애, 근육 장애 및 다른 CNS 장애를 포함한다.
신경변성 질환은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅톤병 (HD), 알츠하이머병 (AD), 운동 뉴런 질환 (진행성 근육 위축 포함), 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD)을 포함한 프리온 질환, 루이 소체 질환, 척수성 근육 위축, 다계통 위축, 치매 (전두측두엽 치매 포함) 및 타우병증을 포함한다. 보다 특정한 신경변성 장애는 ALS, 헌팅톤병 및 운동 뉴런 질환을 포함한다.
한 예에서, ALS의 치료는 운동 뉴런 생존 및 기능을 촉진하는 것을 포함한다. TrkB 결합 효능제는 신경보호 및/또는 신경-복구 효과를 가질 수 있다.
한 예에서, 치매 또는 알츠하이머병과 관련하여 치료는 인지 기능 저하의 진행을 늦추는 것을 의미한다. TrkB 결합 효능제는 세포 생존을 증강시킬 수 있고/거나, 신경돌기 생장을 촉진할 수 있고/거나, 시냅스 가소성을 조절할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 알츠하이머병 및 다른 치매에서의 뉴런 기능장애를 예방 또는 지연시킬 수 있다.
한 예에서, 헌팅톤병과 관련하여 치료는 인지 기능 저하의 진행을 늦추는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 질환 진행을 늦추는 것을 의미한다. TrkB 결합 효능제는 세포 생존을 증강시킬 수 있고/거나, 신경돌기 생장을 촉진할 수 있고/거나, 시냅스 가소성을 조절할 수 있다. TrkB 결합 효능제는 헌팅톤병에서의 뉴런 기능장애를 예방 또는 지연시킬 수 있다.
시신경병증은 예를 들어 망막 신경절 세포 (RGC) 및/또는 시신경에 영향을 주는 병태를 포함한다. 특정한 시신경병증은 녹내장 (예를 들어 개방각 녹내장, 광각 녹내장, 폐쇄각 녹내장 (급성 및 만성), 정상 안압 녹내장), 전방 허혈성 시신경병증 (AION) (예를 들어, 비동맥염성 허혈성 시신경병증 (NAION)), 후방 허혈성 시신경병증, 방사선 시신경병증, 압박성 시신경병증 (예를 들어, 시신경유두부종), 침윤성 시신경병증, 외상성 시신경병증, 미토콘드리아 시신경병증, 독성 시신경병증, 유전성 시신경병증 (예를 들어, 상염색체 우성 시신경 위축 (ADOA; 케제르형 시신경 위축), 레베르 유전성 시신경병증, 로젠버그 추토리안 증후군, 볼프람 증후군, 시신경 저형성증), 시신경염 (예를 들어, 시신경척수염, 유두염)을 포함한다. 망막 변성 장애는 유전성 이영양증 (예를 들어 색소성 망막염) 또는 연령-관련 황반 변성 (습성 및 건성)을 포함한 후천성 병태를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 시신경병증은 예를 들어 망막 신경절 세포 (RGC) 및/또는 시신경에 영향을 주는 병태를 포함한다. 특정한 시신경병증은 녹내장 (예를 들어 개방각 녹내장, 광각 녹내장, 원발성 폐쇄각 녹내장, 정상 안압 녹내장), 전방 허혈성 시신경병증 (AION), 비동맥염성 허혈성 시신경병증 (NAION), 외상성 시신경병증 및 레베르 유전성 시신경병증을 포함한다. 망막 변성 장애는 유전성 또는 연령-관련 황반 변성 (습성 및 건성)을 포함한 후천성 병태를 포함할 것이다.
청각 상실 장애는 감각신경성 청각 상실 (SNHL) (양측성, 일측성 및 상세불명) 및 복합성 청각 상실 (감각신경성 및 전음성 상실 요소가 존재함; 양측성, 일측성 및 상세불명)을 포함한다. 감각신경성 청각 상실은 감각성 (와우 관련) 또는 신경성 (제8 신경 관련) 청각 상실을 포함한다. 감각신경성 청각 상실은 종말 기관 병변으로부터 유래할 수 있다. 감각신경성 청각 상실과 연관된 종말 기관 병변은 음향 외상 (예를 들어 85 데시벨 (db) 초과의 소음으로 인한 것), 바이러스성 내림프 미로염, 메니에르병, 제8 신경의 소뇌교뇌각 종양, 제8 신경 신경절의 박테리아 또는 바이러스 감염, (예를 들어 이성 대상 포진), 급성 중이염, 화농성 수막염, 만성 중이염에서 비롯되는 화농성 미로염, 바이러스 기원의 난청, 예를 들어 볼거리, 홍역, 인플루엔자, 수두, 단핵구증 및 아데노바이러스를 포함한 바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 내림프 미로염 및 일과성 허혈성 난청을 포함한 돌발성 난청, 중이 내로 연장되며 고막 및 아마도 이소골연쇄를 파열시키는 측두골의 골절, 와우에 영향을 주는 골절, 및 일반적으로 제8 신경의 청각 또는 전정 갈래에서 비롯되는 슈반 세포 기원의 종양인 청신경초종을 포함한다. 종말 기관 병변 청각 상실은 선천성, 예컨대 풍진, 출산 시 무산소증, 분만 시 외상으로 인한 내이 출혈, 모체에 투여된 이독성 약물, 태아 적모구증에 의해 유발되는 것, 및 바르덴부르크 증후군 및 후를러 증후군을 포함한 유전성 병태일 수 있다. 감각신경성 청각 상실은 그렇지 않으면 연령과 관련될 수 있는데, 그 예로는 노화의 정상적인 부분으로서 발생하는 감각신경성 청각 상실인 노인성 난청 (노년 난청 포함)이 있다. 감각신경성 청각 상실은 이독성 청각 상실 (내이의 청각 부분, 특히 코르티 기관에 영향을 주는 이독성 약물 (예를 들어 특정 항생제, 특정 화학요법제, 특정 살리실레이트 화합물 -특히 아스피린 - 특정 이뇨제 - 통상적인 루프 이뇨제- 및 특정 퀴닌)에 기인하는 청각 상실)일 수 있다. 돌발성 감각신경성 청각 상실, 숨겨진 청각 상실 (내이에서의 시냅스 및 청각 섬유 상실에 기인하는 것으로 생각됨) 및 이명 (아마도 코르티 기관에 대한 상해에 기인함)이 또한 포함된다.
정신 장애는 불안, 기분 장애, 우울증 (주요 우울 장애 포함), 공황 장애, 외상후 스트레스 장애 (PTSD), 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 양극성 장애 및 정신분열증을 포함한다.
신경발달 장애는 안젤만 증후근, 프라더-윌리 증후군, 자폐 장애 및 레트 증후군을 포함한다.
에너지 균형은 섭식 행동을 제어하는 2개의 중앙 회로의 조절에 좌우된다: 중추 신경계 (CNS)는 식욕, 음식을 원하는 행동 및 체온조절을 조정하며 통합해야 하고; 포만감 (예를 들어, 장으로부터) 및 전체 에너지 균형에 관련된 신호가 말초에 전달되어 CNS에 피드백을 주어야 한다. 따라서, 체중 조절의 장애는 신경성 식욕부진, 악액질, 원치 않는 체중 감소 (암 치료와 관련되고/거나 그에 의해 유발된 원치 않는 체중 감소 포함), 근육감소증, 비만 및 오피오이드-유도된 구토를 포함한다.
근육 장애는 근육감소증을 포함한다.
다른 CNS 장애는 당뇨병성 신경병증, 간질, 다발성 경화증, 편두통, 신경 손상 (외상성 뇌 손상 (TBI), 척수 손상 및 말초 신경 손상 포함), 말초 신경병증, 신경근육 질환 (중증 근무력증 및 근무력 증후군 포함), 수면 장애 및 졸중을 포함한다. 한 예에서, 말초 신경병증은 화학요법 유도된 말초 신경병증 (CIPN)을 포함한다. CIPN은 많은 항암 약물의 주요 용량-제한 부작용이다.
TrkB 결합 효능제는 유의하게 장애의 진행을 늦추고/정지시키고/지연시키며, 일상 생활 기능을 향상시키고, 대상체의 수명을 증가시킬, 신경계 장애 및 다른 장애에 대한 치료로서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 하기 장애: 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅톤병 (HD), 졸중, 척수 손상, 알츠하이머병 (AD), 운동 뉴런 장애, 외상성 뇌 손상 (TBI), 치매, 타우병증, 말초 신경병증, 신경 손상, 말초 신경 손상, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD)을 포함한 프리온 질환, 정신 장애, 정신분열증, 다발성 경화증, 레트 증후군, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 중증 근무력증, 당뇨병성 신경병증, 망막 변성, 녹내장, 청각 상실, 체중 조절, 신경성 식욕부진, 악액질, 신경근육 질환, 기분 및 우울 장애, 외상후 스트레스 장애, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 양극성 장애, 불안, 자폐 장애, 통증, 체중 조절을 수반한 장애, 신경성 식욕부진, 악액질, 원치 않는 체중 감소 및 오피오이드-유도된 구토 중 어느 하나의 치료를 위해 사용된다.
상기 기재된 장애의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 경우에, TrkB 결합 효능제는 1종 이상의 활성제, 예를 들어 특정한 장애의 치료 또는 예방에서의 사용에 대해 승인된 활성제 및 보다 특히 현행 표준 관리를 구성하는 것으로 간주되는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 조합 요법이 고려되는 경우에, 활성제는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 1종 이상의 제약 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명의 TrkB 결합 효능제가 알츠하이머병의 치료를 위해 사용되는 실시양태에서, 이는 콜린에스테라제 억제제 및/또는 메만틴과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 TrkB 결합 효능제가 ALS의 치료를 위해 사용되는 실시양태에서, 이는 릴루졸과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 TrkB 결합 효능제가 녹내장의 치료를 위해 사용되는 실시양태에서, 이는 프로스타글란딘 유사체, 베타 차단제, 알파 효능제 및 탄산 안히드라제 억제제 중 1종 이상과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 TrkB 결합 효능제가 녹내장의 치료를 위해 사용되는 또 다른 실시양태에서, 이는 선택적 레이저 섬유주 성형술 (SLT) 및 아르곤 레이저 섬유주 성형술 (ALT)과 조합되어 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 TrkB 결합 효능제는 감각신경성 청각 상실을 치료하기 위해 공동-요법으로서 인공 와우와 조합되어 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 TrkB 결합 효능제는 감각신경성 청각 상실을 치료하기 위해 스테로이드와 조합되어 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 TrkB 결합 효능제는 감각신경성 청각 상실을 치료하기 위해 유전자 요법, 예를 들어 ATOH1 유전자 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
하나의 특정한 실시양태에서, TrkB 결합 효능제는 이독성 작용제와 조합되어 투여된다. 통상의 기술자라면 이독성 작용제에 기인하는 청각 장애를 예방할 수 있으며, 추가로 이독성 작용제의 보다 고용량이 환자에게 투여되도록 할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명은 또한 하기 실시양태를 갖는다:
실시양태 1. TrkB의 BDNF-유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 효능제가 TrkB에의 결합을 위해 BDNF와 경쟁하지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화 효과가 TrkB 결합 효능제의 부재와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 존재 하에 포화 농도의 BDNF의 존재 하의 TrkB의 증가된 활성화에 의해 측정되는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, TrkB의 증가된 활성화가 TrkB의 인산화의 증가된 수준에 의해 측정되는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 포화 농도의 BDNF의 존재 하의 TrkB의 인산화가 TrkB 결합 효능제의 존재 하의 적어도 110%와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 부재 하에 100%인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 6. 실시양태 4 또는 5에 있어서, 포화 농도의 BDNF의 존재 하의 TrkB의 인산화가 TrkB 결합 효능제의 존재 하의 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 또는 적어도 150%와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 부재 하에 100%인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 7. TrkB에의 결합을 위해 BDNF와 경쟁하지 않으며, TrkB의 D5 도메인의 베타 시트 A 및 G, 및 베타 시트 A와 A' 사이의 영역 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 8. 실시양태 7에 있어서, 에피토프가 잔기 T288, F291, K372 및 E293을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 9. TrkB에의 결합을 위해 BDNF와 경쟁하지 않으며, TrkB의 막근접 영역 (W381-H430) 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 에피토프가 잔기 E398, Y397, D399 및 Y400을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 11. TrkB에의 결합을 위해 BDNF와 경쟁하지 않으며, TrkB에의 결합을 위해 (a) 서열식별번호: 27의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 28의 경쇄 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 30의 경쇄 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 31의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 32의 경쇄 서열을 갖는 참조 항체와 경쟁하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 12. 실시양태 7 내지 11 중 어느 하나에 있어서, TrkB의 BDNF 유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 13. BDNF의 부재 하에 TrkB를 활성화시키며, 세포 표면 상의 TrkB 수준을 유지하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, TrkB의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 15. 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
(a) (i) 서열식별번호: 27로부터의 CDRH1, CDRH2, CDRH3 및/또는 서열식별번호: 28로부터의 CDRL1, CDRL2, CDRL3으로부터 선택되는 CDR 중 어느 하나 또는 그의 조합; 또는
(ii) (i)의 CDR 변이체로서, 각각의 CDR에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 또는
(b) 서열식별번호: 40의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열식별번호: 41의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL 영역.
실시양태 16. 하기 CDR 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함하는 TrkB 결합 효능제:
(a) 서열식별번호: 6의 CDRH1;
(b) 서열식별번호: 7의 CDRH2;
(c) 서열식별번호: 8의 CDRH3;
(d) 서열식별번호: 3의 CDRL1;
(e) 서열식별번호: 4의 CDRL2; 및/또는
(f) 서열식별번호: 5의 CDRL3.
실시양태 17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 결합 효능제가 CDRL1, CDRL3 및 CDRH3을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, 결합 효능제가 CDRH2를 추가적으로 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 19. 실시양태 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 결합 효능제가 하기를 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제:
(a) 인간화 VH 영역 또는 인간화 중쇄 (HC) 서열; 및/또는
(b) 인간화 VL 영역 또는 인간화 경쇄 (LC) 서열.
실시양태 20. 실시양태 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, VH 위치 47이 Cys, Ser, Gly, Ala, Val, Thr 또는 Asn인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 21. 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
(a) 서열식별번호: 40의 VH 영역; 및/또는
(b) 서열식별번호: 41의 VL 영역.
실시양태 22. 실시양태 15 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 결합 효능제가 하기를 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제:
(a) 서열식별번호: 42와 적어도 80% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는
(b) 서열식별번호: 43과 적어도 80% 동일한 경쇄 (LC) 서열.
실시양태 23. 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
(a) 서열식별번호: 42의 중쇄 (HC) 서열; 및/또는
(b) 서열식별번호: 43의 경쇄 (LC) 서열.
실시양태 24. 실시양태 15 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 인간 TrkB 수용체에 대해 효능작용하고, BDNF와 경쟁하지 않으며, TrkB의 BDNF-유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 25. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역이 불능화되는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 26. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 결합 효능제가 합성 서열, 인간화 서열 또는 키메라 서열을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 27. 상기 실시양태 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 핵산 서열.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 서열이 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 44; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 45를 포함하는 것인 핵산 서열.
실시양태 29. 실시양태 27 또는 28에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 30. 실시양태 27 또는 28에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 실시양태 29에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제의 생산 방법으로서, 제30항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 상기 핵산 서열 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 배양하며, 이에 의해 TrkB 결합 효능제가 발현되고 정제되는 것을 포함하는 방법.
실시양태 32. 실시양태 31의 방법에 의해 생산되는 TrkB 결합 효능제.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 26 및 실시양태 32 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제, 및 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 중 하나 또는 그의 조합을 포함하는 제약 조성물.
실시양태 34. 실시양태 1 내지 26 및 실시양태 32 및 실시양태 33 중 어느 하나에 있어서, 요법에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
실시양태 35. 실시양태 1 내지 26 및 실시양태 32 및 실시양태 33 중 어느 하나에 있어서, 신경계 장애의 치료에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
실시양태 36. 실시양태 1 내지 26 및 실시양태 32 및 실시양태 33 중 어느 하나에 있어서, TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
실시양태 37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 장애가 신경변성 질환, 시신경병증, 망막 변성 병태, 청각 상실을 수반한 장애, 정신 장애, 신경발달 장애, 체중 조절의 장애, 근육 장애 및 또 다른 CNS 장애인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 장애가 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅톤병 (HD), 알츠하이머병 (AD), 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 프리온 질환, 루이 소체 질환, 척수성 근육 위축, 다계통 위축, 치매 및 타우병증, 녹내장, 전방 허혈성 시신경병증 (AION), 비동맥염성 허혈성 시신경병증 (NAION), 외상성 시신경병증, 레베르 유전성 시신경병증, 연령-관련 황반 변성, 신경성 난청, 와우 난청, 이명, 감각신경성 청각 상실, 복합성 청각 상실, 불안, 기분 장애, 우울증, 공황 장애, 외상후 스트레스 장애 (PTSD), 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 양극성 장애, 정신분열증, 안젤만 증후근, 프라더-윌리 증후군, 자폐 장애, 레트 증후군, 신경성 식욕부진, 악액질, 원치 않는 체중 감소, 근육감소증, 비만, 오피오이드-유도된 구토, 근육감소증, 당뇨병성 신경병증, 간질, 다발성 경화증, 편두통, 신경 손상, 말초 신경병증, 신경근육 질환, 수면 장애 및 졸중인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 39. 실시양태 34, 35, 36, 37 및 38 중 어느 하나에 있어서, 치료가 세포 생존 및/또는 뉴런 복구 및/또는 뉴런 가소성의 증강을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제.
실시양태 40. 요법에 사용하기 위한 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용의 강화제.
실시예
1. TrkB 효능제
TrkB 수용체에 대한 마우스 모노클로날 항체를, HEK293-6E 세포주 발현 및 정제를 사용하여 생성된 재조합 인간 TrkB 세포외 도메인 (이하, TrkB-ECD라 지칭됨, 서열식별번호: 1, D1-D2-D3-D4-D5-JM, C32-H430, 399개 아미노산)으로의 Balb/c 마우스의 면역화에 의해 생성하였다. 면역화를 위해 사용되는 TrkB-ECD는 GSA 링커를 통해 FLAG 태그부착되었고, C-말단에서 His 태그 (5개의 His 잔기)를 가졌다 (FLAG 태그-GSA-C32-H430-His5). (i) 직접적 항원 ELISA (즉 TrkB-ECD에의 결합) 및 (ii) TrkB 활성화-의존성 NFAT 프로모터 구동 리포터 검정 (즉 TrkB의 효능제) 사이의 상관관계를 제시하는 클론을 선택함으로써 하이브리도마 융합 클론의 스크리닝 (~3000개 웰)을 수행하였다. 이러한 선택 기준은 뮤린 효능제 항체 1G11, 3A3 (3B3과 동일한 항체 서열), 8E5, 5D11 (3E10과 동일), 5C7 (5E6과 동일한 항체 서열), 3A4 및 2A1을 발현하는 다수의 하이브리도마 클론의 확인으로 이어졌다.
1.1 친화도
1G11은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정 시, ~42 nM의 친화도 (kon = 5.66 x 104/Ms, koff = 0.00239/s)로 인간 TrkB-ECD에 결합함을 나타냈다. 1G11의 친화도는, 확인된 다른 효능제 항체의 친화도와 함께 표 3에 제시되어 있다.
1.2 수용체 선택성
TrkA 또는 TrkB 또는 TrkC를 발현하는 CHO-K1 세포에서 Trk 활성화 의존성 NFAT 프로모터 구동 리포터 검정을 사용하여 Trk 패밀리의 수용체에 대한 1G11 선택성을 평가함으로써, 1G11이 시험된 농도 (0.00006-125nM)에서 TrkA 또는 TrkC 수용체 발현 세포에서가 아니라, TrkB 수용체를 발현하는 세포에서 리포터 유전자 발현을 선택적으로 유도하였음을 밝혀내었다. 대조군으로서, 동족 리간드 (TrkA를 위한 NGF, TrkB를 위한 BDNF 및 TrkC를 위한 NT-3)는 상응하는 Trk 수용체 발현 세포에서 유사한 수준의 리포터 유전자 발현을 유도하였다. 1G11을 또한 pan-뉴로트로핀 수용체 p75NTR에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 세포 기반 결합 검정은 1G11의 p75NTR 수용체에의 검출가능한 결합을 제시하지 않았다. TrkB 효능제의 수용체 선택성은 표 3에 요약되어 있다.
1.3 교차 종 반응성
1G11은 설치류 (뮤린, 래트), 시노몰구스 및 인간 TrkB 수용체에 결합하고 이들을 활성화시킨다. 2A1 및 5D11은 또한 래트, 마우스 및 인간 TrkB 수용체를 활성화시킨다. 흥미롭게도, 3A3 및 8E5는 단지 인간 TrkB 수용체를 활성화시키며, 설치류 TrkB 수용체는 활성화시키지 않는다. 종 교차-반응성을 상응하는 종 또는 인간 iPSC 유래된 세포로부터 유래된 이종 세포주 또는 1차 세포에서 재조합적으로 발현된 TrkB 수용체를 사용하여 시험하였다. TrkB 효능제의 종 선택성은 표 3에 요약되어 있다.
1.4 TrkB의 활성화
인간 전장 TrkB 수용체 (서열식별번호: 2)를 안정적으로 발현하는 CHO-K1은 1G11로 처리되었을 때 TrkB의 인산화 수준 (pTrkB, Y515)에 의해 측정 시, 3.1 ± 2.1 nM (평균 ± S.D., n = 8)의 평균 EC50으로 TrkB 활성화를 유도하였다. TrkB 효능제의 TrkB 활성화 효과는 표 3에 요약되어 있다. 1G11은 단독으로 동족 리간드 BDNF (뿐만 아니라 NT-4) 최대 반응의 약 30-40%까지 TrkB 수용체를 활성화시켰다.
1G11은 래트 피질 뉴런에서 TrkB 및 그의 하류 신호전달 경로의 지속적인 활성화 (최대 24시간)를 유도하였으며, 이는 1G11이 TrkB에 노출되었을 때 BDNF와 비교하여, 장기간 동안 수용체를 활성화된 상태로 유지할 수 있음을 나타낸다 (도 1a 참조). 역학적으로, 1G11 유도된 TrkB 활성화는 BDNF와 상이하다. 활성화된 티로신 키나제 수용체는 전형적으로 세포내이입에 이어 분해를 겪으면서, 세포 표면 수용체의 하향 조절을 야기하고, 이에 의해 세포 항상성을 유지하기 위해 리간드에 일시적으로 비-반응성이 된다. 흥미롭게도, 세포 표면 비오티닐화에 의해 측정 시, 1G11이 최대 4시간까지는 래트 피질 뉴런에서 TrkB의 표면 수준을 변경시키지 않았지만, 24시간에는 TrkB 수용체의 총 세포 수준의 감소에도 불구하고 비처리된 대조군과 비교하여 수준이 증가하였다 (도 1b 참조).
1.5 BDNF 경쟁
TrkB 수용체에 대한 1G11의 활성화 효과를 BDNF의 존재 및 부재 둘 다의 경우에서 TrkB 인산화에 의해 결정하였다. BDNF의 존재 하의 TrkB 효능제의 경쟁적 효과는 감소된 TrkB 인산화로서 규정되었다. 전장 TrkB 수용체를 과다발현하는 CHO 세포에서 포화 BDNF 농도 (10nM, EC100)의 존재 하에 TrkB 인산화에 대한 상이한 농도의 1G11의 효과를 평가함으로써, 1G11이 TrkB에 대해 BDNF와 경쟁하지 않음을 밝혀내었다. BDNF와 경쟁하는 것으로 확인된 유일한 TrkB 효능제는 BDNF-유도된 TrkB 인산화를 ~50% 감소시킨 5D11이었다. TrkB 효능제의 BDNF 경쟁 결과는 표 3에 요약되어 있다.
1.6 TrkB 효능제 경쟁 검정
TrkB 효능제 mAb의 에피토프 결합 특성을 분석하기 위해, 어떤 TrkB 효능제가 서로와 경쟁하는지를 결정하여, TrkB 상의 유사하거나 또는 중복되는 에피토프(들)에 결합되는 것들을 함께 그룹화하기 위한 경쟁 검정을 설정하였다. TrkB-ECD를 칩 표면 상에 고정화시키고, 단일 TrkB 효능제 mAb를 TrkB에의 결합을 위해 유동 셀에 주입하였다. 이어서, 제2 TrkB 효능제 mAb를 주입하고, 제1 TrkB 효능제 mAb의 존재 하에 TrkB-ECD에의 그의 결합 능력을 평가하였다. 경쟁은 하기와 같이 분류되었다: 제2 TrkB 효능제의 20% 미만의 결합은 "없음"; 제2 TrkB 효능제의 20-60% 결합은 "부분적"; 및 제2 TrkB 효능제의 60% 초과의 결합은 "있음". 따라서, 제2 TrkB 효능제의 결합 "없음"은 경쟁이 없는 것으로, 따라서 2종의 TrkB 효능제가 비-중복 에피토프에 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 제1 TrkB 효능제의 결합이 TrkB-ECD 입체형태를 제2 TrkB 효능제가 결합할 수 없도록 하는 방식으로 변경시키는 것으로 결론지었다. "부분적" 및 "있음"은 TrkB 상의 유사하거나 또는 중복되는 에피토프(들)에의 결합을 위한 2종의 TrkB 효능제의 경쟁으로 결론지었다.
TrkB 효능제 경쟁 결과는 표 3에 요약되어 있다 (1G11 또는 3A3 또는 8E5와의 경쟁). 표 2는 1G11, 3A3 및 8E5가 TrkB 상의 유사하거나 또는 중복되는 에피토프(들)에의 결합을 위해 서로와 경쟁하는 TrkB 효능제로서 함께 그룹화될 수 있음을 제시한다.
1.7 BDNF 강화
BDNF의 존재 하의 TrkB 인산화 수준 (pTrkB, Y515)을 측정함으로써 TrkB의 BDNF-유도된 효능작용에 대한 1G11의 강화 효과를 평가하였다. 전장 TrkB 수용체 (서열식별번호: 2)를 과다발현하는 CHO 세포에서 포화 BDNF 농도 (10nM, EC100)의 존재 하에 TrkB에 대한 상이한 농도의 1G11의 효과를 평가하면, 도 2에 제시된 바와 같이, 처리 후 30분에 최대 반응 (BDNF - 100%; BDNF+1G11 - ~100%-145%)으로 반영된 바와 같은 TrkB 활성화의 정상 상태 수준의 증강이 야기되었다.
포화 BDNF 농도의 존재 하에 다른 TrkB 효능제를 평가함으로써, 3A3 및 8E5가 또한 도 2에 제시된 바와 같이, TrkB 수용체 활성화를 강화하였음을 밝혀내었다 (각각 ~100-165% 및 ~100-120%). 이들 결과는 표 3에 요약되어 있다.
흥미롭게도, 클론 5C7, 5E6, 3A4 및 2A1은 BDNF 매개된 TrkB 수용체 활성화에 있어서 경쟁하지도 강화하지도 않았는데, 이는 (a) 모든 효능제 항체가 강화 특성을 보유하지는 않을 것이고, (b) 모든 리간드 비-경쟁적 항체가 강화제인 것은 아닐 것임을 나타낸다.
도 2는 TrkB 항체에 대한 대표적인 데이터를 제시한다 - 강화제 및 비-경쟁자 (3A3, 1G11, 8E5), 경쟁자 (5D11), 비-경쟁자 (2A1, 3A4, 5C7). 100% 활성은 포화 농도의 BDNF, 즉 10nM EC100에서의 TrkB 활성화를 나타낸다. BDNF 수준은 대부분의 신경계 및 병리생리학적 질환에서 감소되는 것으로 보고된 바 있으며, 표현형/결손이 이러한 감소에 기인하였다. TrkB 수용체 수준이 변경 없이 유지되는 BDNF 결손 병리생리학적 병태 하에, 투여되는 치료용 TrkB 효능제가 (i) TrkB 수용체를 활성화시킬 수 있고 (예를 들어 1G11, 3A3, 8E5, 5D11, 5C7, 5E6, 3A4 및 2A1), (ii) 감소된 수준의 BDNF와 경쟁하지 않을 수 있고 (예를 들어 1G11, 3A3, 8E5, 5C7, 5E6, 3A4 및 2A1), (iii) 감소된 생리학적 수준의 BDNF에 의해 유도된 세포 신호전달을 강화할 수 있으면서 (예를 들어 1G11, 3A3, 8E5), (iv) 그렇지 않으면 잠재적으로 TrkB 효능제에 대한 일시적 탈감작을 야기할 수 있는, TrkB의 세포 표면 수준을 변경시키지 않을 수 있으면 (예를 들어 1G11), 생리학적 세포/전신 반응이 여전히 도출될 수 있다. 이러한 데이터도 또한 표 3에 요약되어 있다.
1.8 NT-4 강화
유사하게, 1G11은 NT-4와 경쟁하지 않으며, 포화 수준의 NT-4의 존재 하에 TrkB의 NT-4-유도된 효능작용에 대해 "강화" 효과를 나타냈다 (NT-4 - 100%; NT-4+1G11 - ~130%; 표 3). 따라서, 3A3 및 8E5도 또한 TrkB의 NT-4 유도된 효능작용에 대해 강화 효과를 가질 것으로 예상된다.
1.9 세포 생존 및 복구
1G11은 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포주에서 농도-의존성 방식으로, 각각 0.025 ± 0.01 nM 및 0.19 ± 0.06 nM의 평균 EC50으로 생존을 촉진하고 신경돌기 생장을 유도하였다. 1G11은 래트 뇌 및 척수 유래된 뉴런, 마우스 뇌 유래된 뉴런에서 내인성으로 발현된 TrkB 수용체, 및 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 시노몰구스 TrkB를 활성화시켰다.
유사하게 8E5 및 3A3은 각각 0.09±0.06nM (평균±SD) 및 0.006 ± 0.001 nM (평균±SD)의 EC50으로 세포 생존을 증강시켰다.
8E5는 농도-의존성 방식으로 1.58 ± 0.34 nM (평균±SD)의 EC50으로 신경돌기 생장을 유도하였지만, 3A3은 항체 농도가 증가함에 따라 이상성 신경돌기 생장 반응을 일관되게 나타내어, 정확한 EC50의 추론을 어렵게 만들었다.
표 3
Figure pct00005
Figure pct00006
ND: 결정되지 않음
2. 1G11, 3A3 및 5D11의 서열분석
TrkB 효능제를 통상적인 기술에 의해 서열분석하였다. CDR은 카바트에 의해 결정되었으며, 표 4에 1G11, 3A3, 8E5 및 5D11에 대해 제시되어 있다 (상이한 넘버링 규정에 의해 결정된 1G11의 CDR 영역이 표 1에 제시되어 있음을 주목함). 1G11 (서열식별번호: 27 및 28), 3A3 (서열식별번호: 29 및 30), 8E5 (서열식별번호: 31 및 32) 및 5D11 (서열식별번호: 33 및 34) 각각의 전장 뮤린 서열 (중쇄 및 경쇄)이 또한 표 4에 언급된다.
표 4:
Figure pct00007
Figure pct00008
2. 에피토프
TrkB 1차 아미노산 서열은 마우스, 래트, 시노몰구스 및 인간 중에서 고도로 보존되며 (전장 서열에 걸쳐 95%), 실시예 1에서 확인된 모든 TrkB 효능제가 결합하는 세포외 도메인에서 특히 보존된다. TrkB 상의 결합 에피토프를 결정하기 위해, 에피토프 맵핑 연구를 TrkB ECD (서열식별번호: 1)를 사용하여 도메인 결실 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (표면 플라즈몬 공명 사용), 뿐만 아니라 X선 결정학 연구에 의해 수행하였다. TrkB ECD는 5개의 도메인 (D1 - D3: C32-C194; D4: G195-V283; D5: H284-G380) 및 짧은 막근접 JM 영역 (W381-H430)을 포함한다. 에피토프 맵핑 연구를 위해 사용되는 TrkB-ECD는 GSA 링커를 통해 FLAG 태그부착되었고, C-말단에서 His 태그 (5개의 His 잔기)를 가졌다 (FLAG 태그-GSA-C32-H430-His5).
결실 도메인 변이체를 생성하는데: D1-D3 도메인 변이체는 C32-L196 (서열식별번호: 35)을 포함하고; D4-D5-JM 도메인 변이체는 P197-H430 (서열식별번호: 36)을 포함하며, D5-JM 도메인 변이체는 H284-H430 (서열식별번호: 37)을 포함하였다.
알라닌 스캐닝 돌연변이유발 연구 (2.2, 2.3 및 2.5)를 위해, TrkB-ECD (서열식별번호: 1)에서 단일 점 돌연변이체를 열거된 바와 같이 제조하였다:
N193A; S198A; N200A; L206A; E210A; K212A; S213A; T215A; S217A; D223A; N227A; Y229A; D231A; N234A; V236A; H239A; S244A; T246A; S249A; R251A; Q263A; L271A; Q276A; T288A; F291A; E293A; T296A; D298A; H299A; K308A; K312A; F318A; N325A; K328A; K333A; H335A; H343A; N350A; M354A; K364A E366A E371A K372A Q373A H377A M379A W381A D385A N389A D394A E398A T402A; D406A; T410A; N415A; T420A; D424A; R428A; F285A; T290A; S294A; H300A; S327A; Y329A; C331A; Q347A; D349A; T352A; D370A; D386A; N391A; Y392A; V395A; I396A; Y397A; D399A; Y400A; N405A; D358A; 또는 S375A.
2.1 TrkB와 BDNF 사이의 결합
TrkB의 D5 도메인 (잔기 286-384)은 리간드 (BDNF/NT-4)에의 결합에 있어서 전장 TrkB를 대체할 수 있는 것으로 공지되어 있다. TrkB의 리간드 결합 부위 내에 2개의 접촉 영역이 존재한다: "보존 패치" 및 "특이성 패치". 보존 패치 내의 TrkB D5의 접촉 잔기는 D5 도메인의 AB, C'D 및 EF 베타 시트 사이의 루프 및 C-말단에 있다. TrkB의 보존 패치는 리간드 (BDNF/NT-4)의 가닥에 결합한다. 특이성 패치 내의 TrkB D5의 접촉 잔기는 ABED 베타 시트의 외측 면에 있다. TrkB의 특이성 패치는 리간드 결합되지 않은 형태일 때는 불규칙적이고 TrkB에 결합 시 규칙적이 되는 리간드 (BDNF/NT-4)의 N-말단에 결합한다. BDNF/NT-4 동종이량체와 2개의 TrkB D5 도메인 사이의 구조적 상호작용은 도 3에 요약되어 있다.
2.2 1G11의 에피토프
상이한 TrkB 도메인 결실 변이체를 이용한 1G11의 초기 표면 플라즈몬 공명 결합 분석은 1G11이 TrkB-ECD (C32-H430), D4-D5 도메인 변이체 (P197-H430) 및 D5 도메인 변이체 (H284-H430)에 결합하며, D1-D3 도메인 변이체 (C32-L196)에는 결합하지 않음을 밝혀내었다.
TrkB-ECD에서, 대부분은 D4-D5-JM 도메인에서의 ~80개의 단일 점 알라닌 돌연변이체를 이용한 1G11의 표면 플라즈몬 공명 결합 분석은, 그 정도가 다르긴 하지만 결합을 위해 중요한 잔기로서 8개의 아미노산을 확인하였으며, 가장 중요한 것을 먼저 제시하면 하기와 같다: F291, E293 > K372, E210, T288, D370 > F285, T290. 모든 잔기는 D4 도메인에 존재하는 E210을 제외하고는, TrkB의 D5 도메인의 것이다.
TrkB의 D5-JM 도메인 (서열식별번호: 37)과 복합체 형성된 1G11 키메라 Fab1 [인간 IgG1로부터의 불변 영역과 융합된 1G11로부터의 가변 영역] (서열식별번호: 38 및 39)의 2.3 Å 해상도에서의 공-결정 구조는 IG11에 근접 접근하는 (4.5 Å의 거리 컷오프 사용) TrkB의 D5-JM 도메인 상의 14개의 잔기를 밝혀내었다. 확인된 14개의 잔기는 알라닌 스캐닝 분석에 의해서도 확인되는 것들 (T288, F291, K372, E293); 뿐만 아니라 단지 X선 결정학에 의해서만 확인되는 매우 근접해 있는 다른 아미노산 잔기 (I289, T290, L292, S294, K308, D358, E371, Q373, I374, S375)를 포함하였다. 2.3 Å 해상도에서 3.5 Å의 거리 컷오프를 사용하면 7개의 잔기 (290, 293, 294, 372, 373, 374, 375)가 확인되었다.
에피토프에 수반되는 상호작용을 CCG (케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group)) MOE v2015.1001 (Molecular Operating Environment)을 사용하여 규정하였다. TrkB의 D5-JM 도메인 상의 1G11 키메라 Fab1의 7Å 내의 단백질 잔기를 선택하여, 이어서 디폴트 파라미터를 갖는 "리간드 상호작용" 툴을 사용하여 이들 잔기와 상호작용하고 있는 것으로 간주되는 물 분자 또는 상호작용 분자로부터의 잔기를 확인하였다. 이 툴은 단백질 잔기보다는 소분자 리간드 상호작용을 규정하기 위해 설계되었기 때문에, 각각의 선택된 잔기의 "리간드 상호작용"이 개별적으로 계산되었음을 주목한다. MOE에 의해 규정된 상호작용을 엑셀(Excel)로 임의의 쇄내 상호작용을 삭제하고, 2개의 쇄 사이에 가교를 형성한 것들을 제외한 모든 물 상호작용을 삭제하도록 편집하였다. 남은 상호작용 잔기는 하기와 같다:
o 1G11 키메라 Fab1 잔기와의 직접적 상호작용
Thr290, Glu293, Ser294, Asp358, Ser375
o 1G11 키메라 Fab1 잔기와의 직접적 상호작용 및 물을 통한 간접적 상호작용
Lys372, Gln373
o 단지 물을 통한 간접적 상호작용
Glu341
공-결정 구조 및 알라닌 스캔 돌연변이유발의 분석은 서로를 보완하며 확증하고, TrkB 효능제와 상호작용하거나 또는 구조적 상호작용을 통해 결합에 간접적으로 영향을 주는 TrkB의 D5-JM 도메인 내의 잔기를 확인한다.
알라닌 스캐닝 데이터 및 X선 데이터를 사용하면, 최소한 K372 및 E293이 1G11이 결합하는 TrkB 에피토프의 일부인 것으로 보인다. 이러한 데이터는 표 5에 요약되어 있다.
E293은 D5 베타 시트 A와 A' 사이에 위치하고; K372는 D5 베타 시트 G에 위치한다. 잔기 T288 및 T291 (알라닌 스캐닝 및 근접성 분석에 의해 확인되었음)은 D5 베타 시트 A에 위치한다.
알라닌 스캐닝에 의해 확인된 잔기는 도 4a에 제시되어 있으며, 공-결정 X선 결정학 근접성 분석에 의해 확인된 잔기는 도 4b에 제시되어 있다. 도 4에서, 1G11 Fab와 관련하여 TrkB의 리간드에의 결합을 배향시키기 위해 TrkB D5에 결합된 1G11 Fab의 공-결정 구조로부터의 D5 TrkB 도메인을 NT-4 동종이량체에 결합된 인간 TrkB 도메인 D5의 공개된 공-결정 구조로부터의 동일한 TrkB 도메인과 중첩시켰다. 인간 BDNF/NT-4 이종이량체로부터의 BDNF 쇄를 후속적으로 중첩시켜 BDNF 상의 TrkB의 잠재적 결합 부위를 제시하였다. NT-4 동종이량체에 결합된 인간 TrkB 도메인 D5의 공개된 공-결정 구조로부터의 TrkB D5의 C-말단을 베타-가닥 기하구조를 사용하여 연장하여 막근접 (JM) 영역 및 막횡단 영역까지 연결함으로써 공개된/이용가능한 결정 구조 데이터의 부족으로 인한 이러한 누락 영역의 잠재적 길이를 나타냈다. 구조를 리본 카툰 포맷을 사용하여 나타냈고, 잠재적 TrkB 에피토프로서 나타내어진 잔기에 대해서는 구조 상에 원자로 나타냈다.
1G11의 에피토프는 TrkB D5 도메인 상에서 BDNF/NT4 "보존 패치" 리간드 결합 부위 (D5 도메인의 AB, C'D 및 EF 베타 시트 사이의 루프 및 C-말단)에 인접하여, 또한 BDNF/NT4 "특이성 패치" 리간드 결합 부위 (ABED 베타 시트의 외측 면)에 근접하여 위치함을 도 4a 및 4b로부터 알 수 있다. 보다 특히, TrkB 도메인 5 상의 1G11 에피토프는 D5 베타 시트 A, D5 베타 시트 A와 A' 사이의 영역 및 D5 베타 시트 G를 따라, 특이성 패치의 ABED 베타 시트의 외측 면에 근접하여 존재하는 것으로 보인다. TrkB 상의 1G11 에피토프가 BDNF/NT4 리간드 결합 부위와 직접적으로 중복되지 않는다는 사실은 아마도 1G11이 TrkB에 결합하고, 또한 TrkB가 BDNF/NT-4에 결합하여, 3원 복합체 "TrkB 효능제 + TrkB + 리간드"를 형성하도록 한다.
1G11, TrkB, BDNF/NT-4 구성요소의 중첩의 추가의 분석은 NT-4/BDNF의 N-말단이 잠재적으로 TrkB와 1G11 Fab의 중쇄 사이의 공간으로 돌출됨을 제시한다 (도 5 참조). 중첩에 대한 분자 표면의 부가는 Vκ CDR L1 및 L3, 및 CDRH3이 TrkB와 밀접하게 상호작용하고, TrkB와 CDR H1 및 H2 사이에 간극이 있으며, 이는 잠재적으로 BDNF의 N-말단을 수용하는 것으로 고려될 수 있음을 제시한다 (도 6 참조). 따라서, BDNF의 존재 하에 1G11의 TrkB에의 결합은 또한 BDNF의 N-말단에의 결합을 포함할 수 있고, 이러한 결합은 아마도 3원 복합체를 안정화시켜 BDNF 기능적 반응의 강화를 유도한다. 따라서, 1G11은, TrkB에 추가하여, 또한 리간드 (BDNF/NT-4)의 N-말단과도 상호작용할 수 있다. 대안적으로, 1G11은 리간드 결합 부위에서가 아니라, 그에 근접하여 결합함으로써 TrkB와 리간드 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있다.
파라토프에 수반되는 잔기를 근접성 분석 (4.5 Å의 거리 컷오프 사용)에 의해 공-결정 구조를 분석하고, CCG (케미칼 컴퓨팅 그룹) MOE v2015.1001 (Molecular Operating Environment)을 사용하여 에피토프와 상호작용하는 잔기를 규정함으로써 확인하였다. 파라토프 내의 주요 결합 잔기는 CDR L1 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: RASQ R I S N N LH/서열식별번호: 3), L3 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: QQS NS WPLT/서열식별번호: 5) 및 H3 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: R G YE GALDY/서열식별번호: 8) 내에 존재한다. CDRH2에서는 단지 2개의 잔기가 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하며, 단지 1개의 직접적 상호작용이 있다 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: R IAPGNTYYNEIFKG/서열식별번호: 7). CDRH1에서는 단지 단일 잔기가 에피토프에 접근하거나 또는 (간접적으로) 접촉하고 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: SYYIN/서열식별번호: 6), CDRL2에서는 단일 잔기가 에피토프에 접근한다 (볼드체 잔기는 4.5 Å 내로 에피토프에 접근하는 것들을 나타내고, 밑줄 친 잔기는 직접적으로 또는 간접적으로 (물을 통해) 에피토프와 상호작용하는 것들을 나타냄: YVSQSIS/서열식별번호: 4). 따라서, 순위를 정하는 관점에서 보면, CDR L1, L3 및 H3이 결합을 위해 가장 중요하고, 그 다음은 CDRH2, 그 다음은 CDRL2 및 CDRH1이다.
2.3 3A3의 에피토프
TrkB-ECD에서, 대부분은 D4-D5-JM 도메인에서의 ~80개의 단일 점 알라닌 돌연변이체를 이용한 3A3의 표면 플라즈몬 공명 결합 분석은, 그 정도가 다르긴 하지만 결합을 위해 중요한 잔기로서 9개의 아미노산을 확인하였다 (E398, Y397, D399, Y400 > D394, I396 > V395, N389, T402). 이러한 데이터는 표 5에 요약되어 있다. 이들 잔기는 모두 TrkB의 D5 도메인에 대해 C-말단이며 막횡단 영역에 대해 N-말단인 JM 영역에 존재한다 (도 7 참조 - JM 잔기는 베타-가닥 기하구조를 사용하여 연장되었음). 이러한 막근접 (JM) 영역은, 임의의 결정 구조의 부재 하에, 긴 가요성 링커 영역인 것으로 추정된다. JM 영역은 또한 리간드에의 결합을 위해 중요할 수 있는 것으로 생각된다.
3A3이 결합하는 TrkB 에피토프가 1G11을 위한 에피토프와 구별되는 것으로 보이지만, 3A3은 TrkB에의 결합을 위해 1G11 (및 8E5)과 경쟁하며, 따라서 에피토프가 어떤 방식으로든 중복될 수 있거나 (상기 실시예 1.6 참조) 또는 JM 또는 D5 도메인에의 결합이 다른 항체를 위한 결합 에피토프를 변경시키는 입체형태적 변화를 야기할 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 막근접 (JM) 영역의 긴 가요성 링커는 실제로 D5 베타 시트 A, B 및 G에 매우 근접해 있을 수 있는 것이 가능하다.
3A3은 또한 TrkB의 BDNF 유도된 효능작용의 강화를 제시한다 (상기 실시예 1.7 참조). 따라서, 3A3이 TrkB에 결합할 때, 이 또한 BDNF/NT-4와의 약간의 추가의 상호작용을 가질 수 있고/거나 (예를 들어 리간드의 N-말단을 통해), 유사하게 수용체 + 리간드의 복합체를 안정화시킬 가능성이 있다.
흥미롭게도, 본 연구는 막근접 영역 내의 잔기 D394, I396 및 Y400이 이들 잔기가 래트 TrkB에서와 상이하기 때문에 (각각 Glu, Leu, Trp) 인간 TrkB 수용체 특이성을 부여하고, 3A3은 래트 TrkB를 활성화시키지 않음을 밝혀내었다.
2.4 8E5의 에피토프
8E5를 위한 결합 에피토프를 결정하기 위한 알라닌 스캔 돌연변이유발 또는 결정학 연구를 수행하지 않았다. 그러나, 8E5는 TrkB에의 결합을 위해 1G11 (및 3A3)과 경쟁하며, 따라서 에피토프가 어떤 방식으로든 중복될 수 있거나 (상기 실시예 1.6 참조) 또는 JM 또는 D5 도메인에의 결합이 다른 항체를 위한 결합 에피토프를 변경시키는 입체형태적 변화를 야기할 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 8E5는 또한 TrkB의 BDNF 유도된 효능작용의 강화를 제시한다 (상기 실시예 1.7 참조). 8E5가 3A3과 유사하게 인간 TrkB 특이적이라는 사실은, 에피토프가 3A3과 유사하게 JM 영역에 존재할 가능성이 있음을 암시하며, 여기서 서열은 설치류와 인간 사이에 다르다 (표 5 참조).
2.5 5D11의 에피토프
TrkB-ECD에서, 대부분은 D4-D5-JM 도메인에서의 ~80개의 단일 점 알라닌 돌연변이체를 이용한 5D11의 표면 플라즈몬 공명 결합 분석은, 그 정도가 다르긴 하지만 결합을 위해 중요한 잔기로서 6개의 아미노산을 확인하였다 (N350>H299, D349>H300, K328, K333). 이러한 데이터는 표 5에 요약되어 있다. 도 8은 5D11을 위한 에피토프가 리간드 결합 부위 (D5 도메인의 AB, C'D 및 EF 베타 시트 사이의 루프; 및 D 베타 시트)에 존재함을 제시한다. 이는 TrkB 인산화 검정에서 측정된 바와 같이 5D11이 BDNF와 경쟁한다는 사실과 전적으로 일치한다.
표 5: 에피토프 요약
Figure pct00009
ND: 결정되지 않음
2.6 강화 항체
실시예 1 및 2로부터의 결과에 기초하면, (i) TrkB의 BDNF 결합 부위에 매우 근접해 있는, 특히 리간드의 N-말단에 결합하는 특이성 패치에 근접해 있는 TrkB 에피토프에 결합하고, BDNF/NT-4의 존재 하에 TrkB에의 결합이 증강 또는 안정화되도록 하는 TrkB 효능제: 이들은 TrkB-BDNF 강화제임; (ii) 리간드 결합 부위 내에 또는 그에 매우 근접하여 결합하고, 수용체와 리간드 사이의 상호작용을 탈안정화시키는 TrkB 효능제: 이들은 BDNF 경쟁자임; 및 (iii) 어떤 강화 기능도 갖지 않는 단순한 효능제로서, BDNF 결합 부위로부터 멀리 있는 에피토프에 결합하는 TrkB 효능제가 존재한다.
1G11, 3A3 및 8E5는 BDNF와 비-경쟁적이며, 2개의 에피토프에 결합하는 것으로 보이는 (8E5 에피토프는 아직 결정되지 않았음) 강화제의 전형이다. 이들 에피토프에의 결합은 BDNF의 존재 하에 활성 입체형태의 TrkB 수용체를 안정화시키며, 또한 (a) 항체에 의해 활성화될 TrkB의 이용가능한 세포 표면 수준을 증가시키고/거나; (b) 활성화된 TrkB 수용체 세포내이입 및 분해를 억제하는 것이 가능하다.
SEC-MALS를 수행하여, TrkB의 ECD (TrkB_H284-H430 ECD-6H)의 가용성 말단절단된 형태의 3A3 또는 1G11 또는 BDNF와의 2원 복합체의 형성을 평가하였다. 2원 복합체의 존재는 모든 경우에 검출될 수 있었다. SEC-MALS는 또한 TrkB의 BDNF와의 이러한 구축물과 3A3 사이에, 및/또는 TrkB, BDNF 및 1G11 사이에 3원 복합체가 형성되었는지를 평가하는 데에도 사용되었다. TrkB, BDNF 및 3A3 실험은 3원 복합체의 존재에 관한 명백한 증거를 제공하지 않았다. 이 실험에서는 2원 또는 3원 복합체가 검출될 수 없었는데, 이는 복잡한 용액 거동 및 SEC-MALS에 의해 가시적이지 않은 보다 고급 종의 형성 가능성을 시사한다. TrkB, BDNF 및 1G11 실험으로부터의 데이터는 또한 단순한 2원 복합체보다 고급 복합체의 형성을 시사하였다. 이러한 경우에 단순한 2원 종보다 고급인 이들 중 일부가 검출될 수 있었다. 그러나, 이들 고분자량 종의 구성성분은 정확하게 결정될 수 없었다. 따라서, 이들 항체 둘 다에 의한 강화가 3원 복합체의 형성으로부터 유래될 수 있을 가능성이 여전히 있다.
2.6 수소 중수소 교환
HDX-MS를 사용하여, 수많은 다른 잠재적 단백질 파트너의 존재 또는 부재 하에 His 태그부착된 D5-JM TrkB의 교환 속도를 모니터링하였다. 하기 단백질 용액을, 개별 구성요소를 50 mM Na 포스페이트, 150 mM NaCl pH 7.0의 비-중수소화 H2O 완충제로 희석하여 제조하였다:
Figure pct00010
TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM)
Figure pct00011
TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM); 1G11 mAb (40 μM; 모든 TrkB가 2원 복합체로 존재하도록 보장하기 위해)
Figure pct00012
TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM); 3A3 mAb (40 μM; 모든 TrkB가 2원 복합체로 존재하도록 보장하기 위해)
Figure pct00013
TrkB_ MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM) ; BDNF (40 μM; 모든 TrkB가 2원 복합체로 존재하도록 보장하기 위해)
Figure pct00014
TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM); 1G11 mAb (20 μM); BDNF (20 μM)
Figure pct00015
TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His (20 μM); 3A3 mAb (20 μM); BDNF (20 μM)
HDX 표지 반응을 표준 HDX 방법을 사용하여, 주위 온도에서 비-중수소화물로부터 중수소화 완충제 (D2O 중 50 mM Na 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 6.6)로의 20배 희석으로 수행하였다. 교환 샘플 (1-3개의 복제물)을 4개의 시점에서 취하였다: 0초 (즉 비-중수소화 완충제로의 희석 시점), 15초; 60초 및 300초. 샘플을 예냉된 저 pH 및 변성 켄칭 완충제 (400 mM 소듐 포스페이트, 8 M 구아니딘 HCl, 500 mM (트리스(2-카르복시에틸)포스핀), pH 2.2)로 4℃에서 켄칭하였다.
변성되고 켄칭된 샘플을 15℃에서 240초의 소화 시간, 100 μl/분의 칼럼 유량으로, 0.2% 수성 포름산의 소화 완충제를 갖는 고정화된 펩신 소화 칼럼 (워터스 엔자이메이트 BEH(Waters Enzymate BEH), 2.1 mm X 30mm, 부품 번호: 186007233) 상에 주입하였다. 유리된 펩티드를 UPLC-MS에 의해 0℃에서, 전형적으로 15분의 전개 시간으로, 40 μl/분의 유량으로 이동상 A: H2O/포름산 (99.8:0.2 v/v ) 및 이동상 B: ACN/포름산 (99.8:0.2 v/v )과 함께 1.0 x 100 mm UPLC BEH C18 칼럼 (부품 번호 186002346)을 사용하는 액퀴티(Acquity) UPLC 시스템 상에서 분석하였다.
비-중수소화된 단백질의 단백질분해에 의해 생산된 펩티드를 단지 관심 단백질 서열만을 함유하는 데이터베이스와 대조적으로, 프로틴링크스글로벌(ProteinLynxGlobal) 서버 (http://www.waters.com/waters/en_GB/ProteinLynx-Global-SERVER %28PLGS%29/nav.htm?cid=513821&locale=en_GB), 또는 마스코트(Mascot) 검색 엔진을 사용하여 확인하였다. 각각의 시점 및 상태에서의 중수소 혼입을 다이남엑스(DynamX) 분석 소프트웨어 v 3.0 (또는 HD 이그재미너(Examiner))을 사용하여 PLGS에서 가져온 비-중수소화된 펩티드 목록을 중수소화된 샘플에 대해 획득된 데이터와 비교함으로써 계산하였다1.
각각의 펩티드에 대한 중수소화 데이터를 수동으로 평가하여, 불량한 품질의 데이터를 제공하는 전하 상태 또는 펩티드를 분석에서 제거하였다.
결과
1G11의 존재 하의 TrkB는 TrkB 펩티드에 대해 관찰되는 중수소 교환 속도의 프로파일에서 유의한 변화를 제시하였다. 분율 중수소화 업데이트 차이 플롯 (도 9)은 TrkB 펩티드 영역 284-291에서 가장 강력한 중수소화 보호를 제시한다. 이는 조사된 모든 시점에 걸쳐 강력하게 보호된 상태로 남아있는데, 이는 이 영역이 TrkB의 1G11과의 상호작용에 있어서 중요한 것일 가능성이 있음을 시사한다. 보다 감지하기 힘든 교환 보호가 TrkB의 중앙 영역 대략 316-380에 걸쳐 확인되었는데, 이는 여기에서의 추가의 잔기가 상호작용에서 어떤 역할을 할 수 있음을 시사한다.
3A3의 존재 하의 TrkB는 단지 15 및 60초의 초기 교환 시점에서만, TrkB 펩티드에 대해 관찰되는 중수소 교환 속도의 프로파일에서 유의한 변화를 제시하였다. 분율 중수소화 업데이트 차이 플롯 (도 10)은 영역 385-398을 함유하는 TrkB 펩티드에서 가장 강력한 중수소화 보호를 제시한다. 그러나 이러한 보호는 300초의 교환 시점에서 상실되었다. TrkB의 이 영역의 매우 급속한 중수소화와 함께, 이러한 데이터는 이 영역이 용매-노출될 수 있으며 급속히 중수소화되고; 3A3과의 상호작용을 통한 중수소화로부터의 보호가 불완전하며, 속도가 느려지지만, 심지어 이러한 느려진 속도에서도 포화 중수소화가 300초 내에 달성되도록 함을 시사한다.
BDNF의 존재 하의 TrkB 단독; TrkB-3A3 mAb; TrkB-1G11 mAb. TrkB 단독이든 또는 TrkB-mAb 복합체이든, BDNF의 첨가는 TrkB 중수소화에서 뚜렷한 변화를 제공하지 않았으므로, TrkB-mAb-BDNF 3원 복합체의 존재 또는 부재를 제시하는 것이 불가능하였다.
3. 인간화 1G11, 3A3, 5D11
3.1 인간화
1G11, 3A3 및 5D11을 인간화하였다. 서열은 하기와 같다:
인간화 1G11 가변 중쇄 (VH) 영역 - 서열식별번호: 40; 가변 경쇄 (VL) 영역 - 서열식별번호: 41; 중쇄 (HC) - 서열식별번호: 42; 경쇄 (LC) - 서열식별번호: 43; HC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 44; LC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 45.
인간화 3A3 가변 중쇄 (VH) 영역 - 서열식별번호: 46; 가변 경쇄 (VL) 영역 - 서열식별번호: 47; 중쇄 (HC) - 서열식별번호: 48; 경쇄 (LC) - 서열식별번호: 49; HC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 50; LC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 51.
인간화 5D11 가변 중쇄 (VH) 영역 - 서열식별번호: 52; 가변 경쇄 (VL) 영역 - 서열식별번호: 53; 중쇄 (HC) - 서열식별번호: 54; 경쇄 (LC) - 서열식별번호: 55; HC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 56; LC를 코딩하는 DNA - 서열식별번호: 57.
중쇄 및 경쇄의 뮤린 CDR을 관련 기술분야에서의 표준 절차: 인간 V 유전자 배선 데이터베이스 상의 CDR-마스킹 가변 (V) 영역 서열의 검색, 서열 유사성에 기초하여 선택된 V 및 J 유전자 주형 서열을 사용하여 적합한 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅하였다. 잠재적 복귀-돌연변이를 인간과 마우스 사이의 비교에 기초하여 확인하였다.
1G11의 중쇄의 뮤린 CDR을 IGHV1_69 중쇄 프레임워크 상에 그라프팅하고, 3개의 인간화 중쇄 변이체를 생성하였다: CDR의 그라프팅 곧바로의 하나의 변이체 (H0), 카바트 위치 47에서의 복귀 돌연변이 (W47C)가 포함된 제2 변이체 (H4) 및 위치 47에서 세린 잔기 (W47S)를 포함하는 제3 변이체 (H7).
1G11의 경쇄의 뮤린 CDR을 IGKV3_11 인간 프레임워크 상에 (Lo1); 및 카바트 위치 49에 있는 티로신의 리신으로의 단일 복귀-돌연변이 (Y49K)를 갖는 IGKV3D-15 인간 프레임워크 상에 (Ln1) 그라프팅하였다.
1G11의 인간화 변이체를 생성하여, TrkB-ECD에의 결합에 대해 다양한 기능적 검정에서 시험하였다. Ln1 변이체는 Lo1 변이체와 비교하여 결합에 있어서 유의한 차이를 제시하지 않았다.
그러나, CDRH2 직전에, 중쇄의 카바트 위치 47에서 인간 프레임워크 잔기 트립토판 (W47)을 갖는 변이체는 TrkB에의 결합의 유의한 상실을 보였다. 중쇄의 카바트 위치 47에 있는 트립토판은 인간 항체에서 100% 보존되며, 중쇄-경쇄 계면에 존재한다. W47C/S 복귀-돌연변이가 도입되었을 때, TrkB에의 결합이 회복되었다. 시스테인 및 세린은 유사한 크기의 아미노산이고, 돌연변이체는 둘 다 뮤린 모 1G11의 것과 유사한 인간화 1G11의 결합 및 기능적 특성을 유지하였다. 따라서, 중쇄의 위치 47에서의 다른 유사한 크기의 아미노산도 또한 결합 및 기능을 유지할 것으로 예상된다. 예를 들어, 다른 가능한 치환은 Gly, Ala, Val, Thr 또는 Asn을 포함한다. 또한, 트립토판이 중쇄의 위치 47에서 유지되었다면, 중쇄-경쇄 계면 구조를 회복하고, 따라서 TrkB에의 결합을 회복할 다른 프레임워크 변화가 있을 수 있는 것으로 예상된다.
인간화 1G11은 가변 중쇄의 카바트 위치 47에서 세린 돌연변이가 포함된 인간 프레임워크 상의 1G11 CDR의 곧바로의 그라프팅체이다 (H7, Lo1). 인간화 1G11은 돌연변이 L235A 및 G237A (EU 넘버링)로 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 함유한다. IgG1 Fc 영역의 이러한 변형은 Fcγ 수용체 및 C1q에의 mAb 결합을 감소시키고, 따라서 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 TrkB 양성 세포의 고갈을 유도하는 mAb의 잠재력을 감소시킨다. 이는 통상적으로 Fc-불능화라 기재된다.
인간화 1G11을 C1q 및 다양한 인간 및 시노몰구스 원숭이 Fc 수용체 (FcRn, FcγR I, FcγR IIaH, FcγR IIaR, FcγR IIb, FcγR IIIaV 및 FcγR IIIaF)에 결합하는 그의 능력에 대해 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 결과는, 예상한 대로, 중쇄에서의 Fc 불능화 L235A 및 G237A 돌연변이의 도입이 인간화 1G11의 FcRn에의 결합에는 영향을 주지 않았지만, C1q, FcγR I, FcγR IIaH, FcγR IIaR, FcγR IIb, FcγR IIIaV 및 FcγR IIIaF에의 결합은 감소시켰음을 나타냈다.
인간화 1G11은 Fc-불능화되고, 반면 뮤린 1G11은 그렇지 않음을 주목하여야 한다. Fc 이펙터 기능은 이러한 TrkB 효능제의 생물학적 기능에 있어서 중요하지 않다.
3.2 인간화 항체 특성
인간화 1G11을 항체의 TrkB에 대한 결합 친화도를 측정하기 위한 표면 플라즈몬 공명, 뿐만 아니라 TrkB 인산화 검정을 포함한 다수의 검정에서 뮤린 1G11과 비교하였다. 이들 검정에서 인간화 1G11은 1G11과 유사하였으며, 이는 인간화가 성공적이었음을 확인해준다. 인간화 1G11은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정 시, 재조합 인간 및 시노몰구스 TrkB-ECD에 1:1 결합 모드로 각각 ~55 nM 및 ~60 nM의 친화도로 결합하였다. 인간화 1G11은 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 과다발현하는 CHO-K1 세포에서 인간 TrkB 수용체를, 인산화된 TrkB의 수준을 측정함으로써 결정된 0.65 ± 0.14 nM (평균±SD, n = 3)의 EC50으로 활성화시켰다. 인간화 1G11은 인간 TrkA 또는 TrkC 수용체가 아니라, 인간 TrkB 수용체를 선택적으로 활성화시켰고; 또한 설치류 (뮤린, 래트), 시노몰구스 및 인간 TrkB 수용체와 교차-반응하며 이들을 활성화시켰다.
인간화 1G11은 BDNF와 경쟁하지 않았고; CHO-K1 세포에서 인간 TrkB를 0.65 ± 0.14 nM (평균±SD, n = 3)의 EC50으로 활성화시켰으며; 강화 특성 (~120% vs BDNF)을 유지하였는데, 즉 포화 농도의 BDNF의 존재 하에 TrkB 활성화 수준을 증강시켰다.
시험관내에서, 인간화 1G11은 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 래트 PC12 신경모세포종 세포에서 TrkB 매개된 세포 생존을, 농도-의존성 방식으로 0.007 ± 0.003 nM (평균 ± S.D.; 1G11 = 0.025 ± 0.01 nM)의 평균 EC50으로 증강시켰다. 인간 전장 TrkB 수용체를 안정적으로 발현하는 동일한 래트 PC12 신경모세포종 세포에서, 인간화 1G11은 TrkB 매개된 신경돌기 생장을 농도-의존성 방식으로 0.07 ± 0.02 nM (평균 ± S.D.; 1G11 = 0.19 ± 0.06 nM)의 평균 EC50으로 증강시켰다.
4. 생체내 효과
뉴런 생존의 SRA 래트 모델
뉴런 생존에 대한 1G11의 생체내 효과를 결출 (일측성) 유도된 척수 운동 뉴런 변성의 래트 모델에서 평가하였다. 간략하게 설명하면, 요수 4 (L4)로부터의 복근을 수술에 의해 어린 성체 스프라그-돌리 래트에서 결출하고, 1주 동안 회복하도록 둔 다음, 1G11을 정맥내로 (단일 볼루스로서) 또는 척수강내로 (연속적) 개입하였다. 연속적 척수강내 주입을 위해, 카테터를 L4-L5 사이의 추간공을 통해 지주막하강 내에 삽입하고, 다른 쪽 단부는 목 뒤쪽에 피하로 이식된 알젯(alzet) 2002 미니삼투 펌프에 연결하였다. 항체 개입까지, 비히클 제제를 펌프에 로딩하고 0.5μl/시간의 유량으로 전달하였다.
2주 동안 래트 SRA 모델에서 2개의 상이한 용량의 1G11 (60 μg 또는 240 μg/일) 또는 BDNF (양성 대조군; 12μg/일)의 연속적 척수강내 주입은 비히클 처리된 그룹과 비교하여 구별되는 용량-의존성 반응 없이 유사한 정도로 (즉 반대측과 비교하여) ChAT 발현 뉴런 (항-ChAT 항체로 염색됨)의 생존을 증강시켰지만, 비히클 제제 (음성 대조군)는 그렇지 않았다. 신경근 결출 후 1주에 1G11 (0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 30 mg/kg) 또는 BDNF (양성 대조군; 12μg/일)의 정맥내 투여는 ChAT 염색에 의해 가시화된 바와 같이 척추 뉴런 생존의 노출-의존성 증강을 제시하였지만, 이소형 대조군 (IgG1, 3 mg/kg) 또는 비히클 제제 (음성 대조군)는 그렇지 않았다. 1G11은 ≤ 0.3 mg/kg에서는 무시할 수 있는 정도의 효과를 나타내면서, 1, 3 및 30 mg/kg에서 상이한 정도로 ChAT+ 뉴런을 구출할 수 있었다.
요약하면, 1G11은, 단일 볼루스 정맥내 꼬리 정맥 주사로서 또는 연속적 척수강내 주입에 의해 투여되었을 때, 일측성 (L4 복근) 결출된 래트에서 손상 후 7일에 척수 ChAT+ 뉴런의 생존을 증강시켰다.
보행 기능 (hSOD1G93A 마우스)
뉴런 생존에 대한 1G11의 효과 (상기 기재된 바와 같음)에 추가하여, 1G11의 기능적 효과를 유사유전자형 B6Cg-Tg(hSOD1G93A)1Gur/J 트랜스제닉 마우스에서 조사하였다. hSOD1 Tg 마우스는 질환이 발병하고 진행됨에 따라 다양한 보행 파라미터에서 장애를 나타낸다. 비히클 제제 (음성 대조군)와 달리, 1G11 (0.3 mg/kg)은 암컷 (~3.5월령)의 코호트에서 28일 동안 2주마다 (개입 기간 동안 2회) 꼬리 정맥 볼루스 주사를 통해 투여되었을 때 hSOD1 마우스에서 hSOD1-비히클 대조군과 비교하여 상이한 정도로 보행 특색을 유의하게 개선시켰다: 야생형 한배새끼의 것과 거의 유사한 달리기 속도, 분속수 (걸음 수/초), 걸음 시간 및 입각기 시간; 걸음 길이에 대해서는 상대적으로 중간 정도의 효과; 및 유각기 속도에 대해서는 훨씬 감소된 효과. 이들 결과는 1G11이 정맥내로 투여되었을 때 hSOD1G93A 트랜스제닉 마우스의 보행 결손을 호전시킬 수 있음을 나타낸다.
보행 및 신경학적 점수에 대한 1G11의 효과를 추가로 평가하기 위해, 마우스 (수컷 및 암컷, 대략 3.5월령, 연구를 시작할 때 그룹당 각 성별마다 적어도 16마리의 마우스)에 표 6에 따라 투여하였다. 실험은 무작위화, 위약 및 이소형 대조, 및 이중 맹검 방식으로 수행하였다.
표 6
Figure pct00016
비히클 = 20 mM 포스페이트 완충제, 130 mM NaCl pH 6.0, 및 0.005% 폴리소르베이트 20
iv = 정맥내, ip = 복강내
동물을 설치류 캣워크 시스템(CatWalk System)을 사용하여 8개 시점에서 보행 분석에 적용하였다: 제97일 (기준선), 제99일 (제1 투여 후 1일), 제111일 (제1 투여 후 13일), 제113일 (제2 투여 후 1일), 제125일 (제2 투여 후 13일), 제139일 (제3 투여 후 13일), 제146일 (제4 투여 후 7일) 및 제153일 (제4 투여 후 13일). 분석을 위해 6 종류의 보행 파라미터 (달리기 속도, 걸음 길이, 입각기 시간, 걸음 시간, 분속수 및 유각기 속도)를 선택하였다. 결과는 1G11이 hSOD1-G93A 마우스에서 양쪽 성별 둘 다에 대해 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 보행 특색을, 특히 제125일 및 제139일에 유의하게 개선시켰음을 제시하였다. 평균적으로, 저용량 그룹과 비교하여 고용량 그룹에서 보행 특색의 보다 우수한 개선이 있었다.
신경학적 점수를 전체 연구 시간 기간에 걸쳐 모든 hSOD1-G93A 동물에 대해 모니터링하였다. 로그-순위 검정은 1gG1 이소형 대조군에 비해, 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 1G11이 둘 다 암컷 마우스에서 반수 사망 시간을 현저히 지연시켰음을 제시하였다. 수컷 마우스의 경우에는, IgG1 이소형 대조군에 비해, 0.3 mg/kg의 hSOD1- 1G11 그룹은 반수 사망 시간을 현저히 지연시켰고, 반면 1 mg/kg의 hSOD1-1G11 그룹은 큰 개선을 제시하지 않았다. 윌콕슨 검정은 암컷 마우스의 경우에, 1 mg/kg 1G11이 IgG1 이소형 대조군에 비해 반수 진전 개시 시간을 현저히 지연시켰지만, 0.3 mg/kg 1G11은 그렇지 않았음을 제시하였다. 수컷 마우스에서 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 1G11은 둘 다 IgG1 이소형 대조군에 비해 반수 진전 개시 시간을 미미하게 지연시켰다.
요약하면, 이들 결과는 1G11이 정맥내로 투여되었을 때 hSOD1-G93A 트랜스제닉 마우스의 양쪽 성별 둘 다에서 보행 결손을 호전시키고, 양쪽 성별 둘 다에서 진전 개시를 지연시키며, hSOD1-G93A 트랜스제닉 마우스의 단지 암컷에서만 전반적 '생존'을 개선시킬 수 있었음을 나타낸다.
운동 뉴런 생존 (hSOD1G93A 마우스 )
척수 ChAT 양성 뉴런에 대한 1G11의 효과를 평가하기 위해, 수컷 마우스 (대략 50일령, 연구를 시작할 때 그룹당 12마리의 마우스)에 표 7에 따라 투여하였다. 실험은 무작위화, 위약 및 이소형 대조, 및 이중 맹검 방식으로 수행하였다.
표 7
Figure pct00017
비히클 = 20 mM 포스페이트 완충제, 130 mM NaCl pH 6.0, 및 0.005% 폴리소르베이트 20
iv = 정맥내, ip = 복강내
투여 기간이 종료될 때, 마우스를 이소플루란으로 깊게 마취시켰다. 혈액을 빼내기 위해 마우스를 빙냉 0.9% 염수 (120 mL)로 경심 관류시킨 다음, 60 mL의 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 관류시켰다. 척수를 수집하여, 4℃에서 4% PFA로 24시간 동안 후-고정시켰다. 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT)의 면역조직화학법 (IHC)을 IHC 자동염색기 (미국 로슈(Roche) 벤타나 디스커버리 울트라(Ventana Discovery Ultra)) 상에서 수행하였다. 전체 슬라이드 영상을 스캔스코프(ScanScope) XT (미국 레이카 바이오시스템즈(Leica Biosystems))에 의해 캡처하였다.
요추 척수의 L3-L5에서의 ChAT 양성 세포를 정량화하고 분석하였다. 뉴런을 정확하게 계수하기 위해, 헤마톡실린 채널을 DAB (이미지스코프(ImageScope), 버전 11, 레이카 바이오시스템즈)로부터 분리한 다음, 세포 정량화를 위해 전체 복측 척수를 포함하는 DAB 영상 (10x)만을 취하였다. ChAT 양성 MN 뉴런을 맹검 방식으로 독립 관찰자가 수동으로 계수하였다. 편의성을 제거하고 일관성을 보장하기 위해, 영상 정량화는 또 다른 독립 조사자가 품질에 대해 무작위로 조사하였다.
ChAT 면역염색에 의한 요추 척수 (L3-L5) 분석은 비히클 처리된 야생형 마우스와 비교하여, 비히클 처리된 hSOD1-G93A 트랜스제닉 마우스에서 ChAT 양성 운동 뉴런의 매우 유의한 감소를 제시하였다 (35% 감소, p<0.0001). 이들 데이터는 야생형 마우스와 비교하여, hSOD1-G93A 마우스의 척수에서의 운동 뉴런의 명백한 변성을 나타낸다. 마우스 IgG1 (172.6±31.10) 및 1G11 처리 그룹은 비히클 대비 통계적 유의성을 나타내지 않았다 (0.3 mg/kg: 169.1±17.25; 1 mg/kg: 160.1±28.12).
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited <120> BINDING AGONIST FOR TREATMENT OF NEUROLOGICAL AND OTHER DISORDERS <130> PB65743 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human TrkB-Extracellular Domain <400> 1 Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp 1 5 10 15 Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val 20 25 30 Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn 50 55 60 Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu 85 90 95 Thr Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile 115 120 125 Lys Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr 130 135 140 Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile 145 150 155 160 Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr 165 170 175 Val Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp 180 185 190 Pro Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His 195 200 205 Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile 210 215 220 Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu 225 230 235 240 Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro 245 250 255 Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile 260 265 270 Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr 275 280 285 Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His 290 295 300 Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro 305 310 315 320 Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr 325 330 335 Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly 340 345 350 Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp 355 360 365 Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn 370 375 380 Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His 385 390 395 <210> 2 <211> 822 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp 1 5 10 15 Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro 35 40 45 Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp 50 55 60 Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu 65 70 75 80 Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu 100 105 110 Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr 115 120 125 Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys 145 150 155 160 Thr 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gtgttcatct tcccccccag cgatgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgt 420 ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg 480 cagagcggca acagccagga gagcgtgacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540 ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgt 600 gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaaccg gggcgagtgc 660 <210> 52 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanised 5D11 VH <400> 52 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanised 5D11 VL <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Phe Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanised 5D11 Heavy chain <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 55 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanised 5D11 Light Chain <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Phe Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 56 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding humanised 5D11 Heavy chain <400> 56 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtcaagaagc ccggcagctc cgtgaaggtg 60 agctgcaaag ccagcggcta cgccttcacc aactacctga tcgagtgggt gaggcaggct 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggagtg atcaatcccg gcagcggcgg caccaactac 180 aacgacaagt tcaagggcag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac actgccgtgt actattgcgc caggggcggg 300 aacgattacg gcgactactg gggccagggc acactagtga ccgtgtccag cgccagcacc 360 aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420 gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgaaccgg tgaccgtgtc ctggaacagc 480 ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgt 600 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660 gacaagaccc acacctgccc cccctgccct gcccccgagc tggccggagc ccccagcgtg 720 ttcctgttcc cccccaagcc taaggacacc ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggatgtgag ccacgaggac cctgaggtga agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagccca gagagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gcagagatga gctgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gatggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcagatg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 1320 ctgagcctgt cccctggcaa g 1341 <210> 57 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding humanised 5D11 Light chain <400> 57 gacatcgtga tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60 attaactgca gggccagcca gagcgtgagc accagcttct actcctacat gcactggtac 120 cagcagaaac ccggccagcc ccccaaggtg ctgatcaaat acgccagcaa cctccagagc 180 ggcgtgcccg acaggttcag cggctcaggc tccggcaccg acttcacact gaccatcagc 240 agcctgcagg cagaggacgt ggccgtctac tactgccagc acagctggga gatcccctgg 300 accttcggcc agggaaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 360 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480 ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH1 (Chothia) <400> 58 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH2 (Chothia) <400> 59 Ala Pro Gly Asn 1 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH1 (AbM) <400> 60 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH2 (AbM) <400> 61 Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH1 (Contact) <400> 62 Thr Ser Tyr Tyr Ile Asn 1 5 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 CDRH2 (Contact) <400> 63 Cys Ile Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanised 1G11 CDRH2 (Contact) <400> 64 Ser Met Gly Arg Ile Ala Pro Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRH3 <400> 65 Ala Arg Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Leu Asp 1 5 10 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRL1 (Contact) <400> 66 Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRL2 (Contact) <400> 67 Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile 1 5 10 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1G11 and humanised 1G11 CDRL3 (Contact) <400> 68 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 1 5 <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from human TrkB <400> 69 Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn 20 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from human TrkB <400> 70 Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr Gly Thr 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from human TrkB <400> 71 His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 283-291 <400> 72 Gly His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 284-291 <400> 73 His Phe Ala Pro Thr Ile Thr Phe 1 5 <210> 74 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 292-316 <400> 74 Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro Phe Thr Val 1 5 10 15 Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln 20 25 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 316-324 <400> 75 Gln Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 317-324 <400> 76 Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 318-324 <400> 77 Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu 1 5 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 347-361 <400> 78 Gln Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu 1 5 10 15 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 349-358 <400> 79 Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp 1 5 10 <210> 80 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 351-368 <400> 80 Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu 1 5 10 15 Tyr Gly <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 363-378 <400> 81 Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe 1 5 10 15 <210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 377-395 <400> 82 His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Val <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 379-385 <400> 83 Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp 1 5 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 379-395 <400> 84 Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 379-396 <400> 85 Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp 1 5 10 15 Val Ile <210> 86 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 379-397 <400> 86 Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp 1 5 10 15 Val Ile Tyr <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 379-398 <400> 87 Met Gly Trp Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp 1 5 10 15 Val Ile Tyr Glu 20 <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TrkB_MPLLLLLPLLWAGALAG_H284-H430(D5-JM)-5His peptide from 418-435 <400> 88 Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His His His His 1 5 10 15 His His

Claims (55)

  1. TrkB의 BDNF-유도된 및/또는 NT-4 유도된 효능작용을 강화하는 TrkB 결합 효능제.
  2. 세포 표면 상의 TrkB 수준을 유지하는 TrkB 결합 효능제.
  3. TrkB의 D5 도메인의 베타 시트 A 및 G, 및 베타 시트 A와 A' 사이의 영역 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제.
  4. a) 인간 TrkB의 하기 잔기: Thr290, Glu293, Ser294, Asp358, Ser375, Lys372, Gln373 및 Glu341 중 1개 이상과 상호작용하거나;
    b) T288, I289, T290, F291, L292, E293, S294, K308, D358, E371, K372, Q373, I374 및 S375로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TrkB로부터의 잔기에 4.5 Å 이하로 접근하거나;
    c) 하기 군: E210, F285, T288, T290, F291, E293, D370 및 K372 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하거나;
    d) 인간 TrkB에 결합하고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 284-291 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
    e) 서열식별번호: 71에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합하는
    TrkB 결합 효능제.
  5. TrkB의 막근접 영역 (W381-H430) 내에 포함된 에피토프에 결합하는 TrkB 결합 효능제.
  6. a) 하기 군: N389, D394, V395, I396, Y397, E398, D399, Y400 및 T402로부터 선택되는 잔기가 돌연변이되어 있는 인간 TrkB 세포외 도메인에, 돌연변이가 없는 인간 TrkB 세포외 도메인과 비교하여 변경된 친화도로 결합하거나;
    b) 인간 TrkB에 결합하고, 복합체를 형성하지 않은 인간 TrkB로부터 유래된 상응하는 펩티드와 비교하여 중수소 혼입에 대해 더 저항성인 잔기 385-398 (전장 인간 TrkB에 따른 넘버링)로부터의 서열의 일부 또는 전체를 함유하는 인간 TrkB로부터 유래된 펩티드를 생성하거나; 또는
    c) 서열식별번호: 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합하는
    TrkB 결합 효능제.
  7. TrkB에의 결합을 위해 하기를 갖는 참조 항체와 경쟁하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 27의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 28의 경쇄 서열; 또는
    (b) 서열식별번호: 29의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 30의 경쇄 서열; 또는
    (c) 서열식별번호: 31의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 32의 경쇄 서열.
  8. 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
    (b) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
    (c) 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
  9. 제8항에 있어서, 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 3에 존재하는 바와 같은 CDRL1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체;
    (b) 서열식별번호: 5에 존재하는 바와 같은 CDRL3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체; 및
    (c) 서열식별번호: 8에 존재하는 바와 같은 CDRH3 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, CDRL1 내의 변형을 잔기 R28, S30 및 N32 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않고, CDRL3 내의 변형을 잔기 N92 및 S93 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않으며, CDRH3 내의 변형을 잔기 R97, Y99 및 E100 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  11. 제10항에 있어서, CDRL1 내의 변형을 잔기 I29에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  12. 제10항에 있어서, CDRL1 내의 변형을 잔기 N31에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  13. 제10항에 있어서, CDRL3 내의 변형을 잔기 S91 및 W94에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  14. 제9항에 있어서, 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 3에 존재하는 바와 같은 CDRL1;
    (b) 서열식별번호: 5에 존재하는 바와 같은 CDRL3; 및
    (c) 서열식별번호: 8에 존재하는 바와 같은 CDRH3.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 효능제가, 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체이거나, 또는 서열식별번호: 40에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체인 CDRH2를 추가적으로 포함하며, 여기서 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 것인 TrkB 결합 효능제.
  16. 제15항에 있어서, CDRH2가 서열식별번호: 7에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체인 TrkB 결합 효능제.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, CDRH2 내의 변형을 잔기 R50 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  18. 제17항에 있어서, CDRH2 내의 변형을 잔기 Y57 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  19. 제16항에 있어서, CDRH2가 서열식별번호: 7에 존재하는 바와 같은 것인 TrkB 결합 효능제.
  20. 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 효능제가 하기를 추가적으로 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 28에 존재하는 바와 같은 CDRL2 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체, 및
    (b) 서열식별번호: 27에 존재하는 바와 같은 CDRH1 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체.
  21. 제20항에 있어서,
    (a) CDRL2가 서열식별번호: 4에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체이고;
    (b) CDRH1이 서열식별번호: 6에 존재하는 바와 같거나 또는 그의 변이체로서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 갖는 변이체인
    TrkB 결합 효능제.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, CDRL2 내의 변형을 잔기 Y50 (서열식별번호: 28로부터의 넘버링)에서 갖지 않고, CDRH1 내의 변형을 잔기 Y33 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, CDRH1 내의 변형을 잔기 S31 (서열식별번호: 27로부터의 넘버링)에서 갖지 않는 것인 TrkB 결합 효능제.
  24. 제21항에 있어서,
    (a) CDRL2가 서열식별번호: 4에 존재하는 바와 같고;
    (b) CDRH1이 서열식별번호: 6에 존재하는 바와 같은 것인
    TrkB 결합 효능제.
  25. 서열식별번호: 40의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열식별번호: 41의 서열과 적어도 76% 동일한 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 TrkB 결합 효능제.
  26. 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 42와 적어도 90% 동일한 중쇄 (HC) 서열; 및/또는
    (b) 서열식별번호: 43과 적어도 85% 동일한 경쇄 (LC) 서열.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열식별번호: 40 또는 서열식별번호: 42에 상응하는 위치 47이 Cys, Ser, Gly, Ala, Val, Thr 또는 Asn인 TrkB 결합 효능제.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 서열이 제8항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 TrkB 결합 효능제.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 서열이 제8항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같으며, 여기서 백분율 동일성은 CDR을 제외한 서열에 대해 계산되는 것인 TrkB 결합 효능제.
  30. 제25항에 있어서, 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 40의 VH 영역; 및/또는
    (b) 서열식별번호: 41의 VL 영역.
  31. 제26항에 있어서, 하기를 포함하는 TrkB 결합 효능제:
    (a) 서열식별번호: 42의 중쇄 (HC) 서열; 및/또는
    (b) 서열식별번호: 43의 경쇄 (LC) 서열.
  32. 제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, TrkB에의 결합을 위해 BDNF 및/또는 NT-4와 경쟁하지 않는 TrkB 결합 효능제.
  33. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 TrkB의 BDNF-유도된 및/또는 NT-4 유도된 효능작용을 강화하는 것인 TrkB 결합 효능제.
  34. 제1항 또는 제33항에 있어서, TrkB의 BDNF-유도된 또는 NT-4 유도된 효능작용의 강화 효과가 TrkB 결합 효능제의 부재와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 존재 하에 포화 농도의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하의 TrkB의 증가된 활성화에 의해 측정되는 것인 TrkB 결합 효능제.
  35. 제34항에 있어서, TrkB의 증가된 활성화가 TrkB의 인산화의 증가된 수준에 의해 측정되는 것인 TrkB 결합 효능제.
  36. 제35항에 있어서, 포화 농도의 BDNF 또는 NT-4의 존재 하의 TrkB의 인산화가 TrkB 결합 효능제의 존재 하의 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 또는 적어도 150%와 비교하여, TrkB 결합 효능제의 부재 하에 100%인 TrkB 결합 효능제.
  37. 제1항 및 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 상의 TrkB 수준을 유지하는 TrkB 결합 효능제.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및 시노몰구스 TrkB의 인산화에서 5배 이하의 EC50의 차이를 나타내는 TrkB 결합 효능제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 서열.
  40. 제39항에 있어서, 중쇄를 코딩하는 서열식별번호: 44; 및/또는 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 45를 포함하는, TrkB 결합 효능제를 코딩하는 1개 이상의 핵산 서열.
  41. 제39항 또는 제40항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 핵산 서열을 포함하는 1개 이상의 발현 벡터.
  42. 제39항 또는 제40항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 핵산 서열 또는 제41항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  43. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제의 생산 방법으로서, 제42항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 상기 핵산 서열 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는 생산 방법.
  44. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제, 및 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 중 하나 또는 그의 조합을 포함하는 제약 조성물.
  45. 제1항 내지 제38항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
  46. 제1항 내지 제38항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 신경계 장애의 치료에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
  47. 제1항 내지 제38항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료에 사용하기 위한 TrkB 결합 효능제 또는 제약 조성물.
  48. 치료 유효량의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 제44항에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 신경계 장애를 치료하는 방법.
  49. 치료 유효량의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제 또는 제44항에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애를 치료하는 방법.
  50. 신경계 장애의 치료를 위한 제44항에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 제조에서의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제의 용도.
  51. TrkB를 활성화시킴으로써 BDNF-TrkB 경로를 회복 또는 증강시키는 것이 유익할 수 있는 신경계 장애 또는 다른 장애의 치료를 위한 제44항에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 제조에서의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TrkB 결합 효능제의 용도.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 장애가 신경변성 질환, 시신경병증, 망막 변성 병태, 청각 상실을 수반한 장애, 정신 장애, 신경발달 장애, 체중 조절의 장애, 근육 장애 및 또 다른 CNS 장애인 TrkB 결합 효능제, 방법 또는 용도.
  53. 제52항에 있어서, 장애가 시신경병증인 TrkB 결합 효능제, 방법 또는 용도.
  54. 제52항에 있어서, 장애가 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅톤병 (HD), 알츠하이머병 (AD), 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 프리온 질환, 루이 소체 질환, 척수성 근육 위축, 다계통 위축, 치매 및 타우병증, 녹내장, 전방 허혈성 시신경병증 (AION), 후방 허혈성 시신경병증, 방사선 시신경병증, 압박성 시신경병증, 미토콘드리아 시신경병증, 독성 시신경병증, 외상성 시신경병증, 유전성 시신경병증, 시신경염, 연령-관련 황반 변성, 색소성 망막염, 신경성 난청, 와우 난청, 이명, 감각신경성 청각 상실, 복합성 청각 상실, 불안, 기분 장애, 우울증, 공황 장애, 외상후 스트레스 장애 (PTSD), 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 양극성 장애, 정신분열증, 안젤만 증후근, 프라더-윌리 증후군, 자폐 장애, 레트 증후군, 신경성 식욕부진, 악액질, 원치 않는 체중 감소, 근육감소증, 비만, 오피오이드-유도된 구토, 근육감소증, 당뇨병성 신경병증, 간질, 다발성 경화증, 편두통, 신경 손상, 말초 신경병증, 신경근육 질환, 수면 장애 및 졸중인 TrkB 결합 효능제, 방법 또는 용도.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 세포 생존 및/또는 뉴런 복구 및/또는 뉴런 가소성의 증강을 포함하는 것인 TrkB 결합 효능제, 방법 또는 용도.
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